CN115516098A - 与改进的氮利用效率有关的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了用于改进烟草植物(包括例如白肋烟)中的氮利用效率的产品、组合物和方法。本公开还提供用于跟踪烟草植物中增强的氮利用效率表型和用于将增强的氮利用效率表型基因渗入到烟草植物中的遗传标记物。本公开还提供包含增强的氮利用效率的烟草植物和产生包含增强的氮利用效率的烟草植物的方法。

Description

与改进的氮利用效率有关的方法和组合物
相关申请的交叉引用以及序列表的并入
本申请要求于2020年1月17日提交的美国临时申请第62/962,380号的权益，其以其全文通过引用并入本文。为188,388字节(在
Figure BDA0003795246920000011
中测量)并于2021年1月15日创建的包含在名为“P34788WO00_SL.TXT”的文件中的序列表以电子方式提交并通过引用以其整体并入。
技术领域
本公开提供了用于制备和鉴定烟草植物的组合物和方法，该烟草植物包含通过例如育种、基因编辑、转基因途径和顺化基因途径改进的氮利用效率。
背景技术
不同的烟草品种需要不同水平的氮肥，以使每个品种实现最大产量。白肋烟需要大量添加氮肥以提供最佳产量。另一方面，马里兰烟需要通常用于栽培白肋烟的约25％的氮肥水平。肥料是烟草栽培品种中的主要投入成本，并且高水平的氮可导致植物组织中含氮组分如生物碱和烟草特异性亚硝胺(TSNA)的增加。
不同烟草品种中的改进氮利用效率(NUE)将增加每单位输入氮肥的烟草可收获产量。氮利用效率的提高还允许降低农场投入成本，减少对氮肥生产所需的不可再生能源的使用和依赖，并减少氮肥制造和农业应用的总体环境影响。
发明概述
在一个方面，本说明书提供并包括包含增强的NUE的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物包含YB1基因座的至少一个功能性等位基因，并且还包含至少一个与增强的NUE相关的等位基因，所述等位基因位于选自SEQ ID NO：57-64的一个或更多个分子标志物处，其中增强的NUE是相对于不具有YB1基因座的至少一个功能性等位基因的对照烟草植物而言。
在一个方面，本说明书提供并包括包含增强的NUE的烟草植物或其部分，其中烟草植物包含YB1基因座的至少一个功能性等位基因，并且还包含至少一个与增强的NUE相关的等位基因，所述等位基因位于选自SEQ ID NO：57-64的序列的20cM内的一个或更多个分子标志物处。
在一个方面，本说明书提供并包括包含增强的NUE的烟草植物或其部分，其中烟草植物包含YB1基因座的至少一个功能性等位基因，并且还包含至少一个与增强的NUE相关的等位基因，所述等位基因位于选自SEQ ID NO：57-64的序列的5,000,000个核苷酸内的一个或更多个分子标志物处。
在一个方面，本说明书提供并包括烟草植物或其部分，所述烟草植物或其部分相对于对照植物包含一种或更多种选自以下的性状：当以180磅(lbs)氮/英亩的推荐白肋烟施肥率生长时从植物的顶部到底部表现出更加一致的叶等级、来自植物下半部的叶中增加的叶等级指数、增加的氮利用效率、增加的氮利用效率、降低的叶硝态氮(NO3-N)、降低的TSNA水平和缺乏叶绿素缺乏表型。
在一个方面，本说明书提供并包括熟化烟草材料或包含由烟草植物制成的熟化烟草材料的烟草产品，所述烟草植物包含YB1基因座的至少一个功能性等位基因和至少一个与增强的NUE相关的等位基因，所述等位基因选自SEQ ID NO：57-64的一个或更多个分子标志物处。
在一个方面，本说明书提供并包括产生包含增强的NUE的烟草植物或烟草植物群体的方法，所述方法包括针对在与包含选自SEQ ID NO：57-64的序列的增强的NUE相关的等位基因的20cM内一个或更多个分子标志物的存在对具有至少一种增强的NUE性状的第一烟草植物群体进行基因分型和选择，对包含YB1基因座的至少一种功能性等位基因的第二烟草植物群体进行基因分型和选择，和将第一群体的至少一种植物与第二群体的至少一种植物杂交以产生后代烟草植物或烟草种子，所述后代烟草植物或烟草种子包含增强的NUE性状、与增强的NUE相关的一个或更多个分子标志物和YB1基因座的至少一种功能性等位基因。
在一个方面，本说明书提供并包括产生包含增强的NUE的烟草植物或烟草植物群体的方法，所述方法包括针对在与包含选自SEQ ID NO：57-64的序列的增强的NUE相关的等位基因的5,000,000个核苷酸内一个或更多个分子标志物的存在对具有至少一种增强的NUE性状的第一烟草植物群体进行基因分型和选择，对包含YB1基因座的至少一种功能性等位基因的第二烟草植物群体进行基因分型和选择，和将第一群体的至少一种植物与第二群体的至少一种植物杂交以产生后代烟草植物或烟草种子，所述后代烟草植物或烟草种子包含增强的NUE性状、与增强的NUE相关的一个或更多个分子标志物和YB1基因座的至少一种功能性等位基因。
在一个方面，本说明书提供并包括产生包含增强的NUE的烟草植物或烟草植物群体的方法，所述方法包括针对在与包含选自SEQ ID NO：57-64的序列的增强的NUE相关的等位基因的20cM内一个或更多个分子标志物的存在对具有至少一种增强的NUE性状的第一烟草植物群体进行基因分型和选择，和将第一群体的至少一种植物与不包含至少一种增强的NUE性状的第二烟草植物群体的至少一种植物杂交以产生包含增强的NUE性状的后代烟草植物或烟草种子，所述后代烟草植物或烟草种子包含增强的NUE性状、与增强的NUE相关的一个或更多个分子标志物和YB1基因座的至少一种功能性等位基因。
在一个方面，本说明书提供并包括产生包含增强的NUE的烟草植物或烟草植物群体的方法，所述方法包括针对在与包含选自SEQ ID NO：57-64的序列的增强的NUE相关的等位基因的5,000,000个核苷酸内一个或更多个分子标志物的存在对具有至少一种增强的NUE性状的第一烟草植物群体进行基因分型和选择，和将第一群体的至少一种植物与不包含至少一种增强的NUE性状的第二烟草植物群体的至少一种植物杂交以产生包含增强的NUE性状的后代烟草植物或烟草种子，所述后代烟草植物或烟草种子包含增强的NUE性状、与增强的NUE相关的一个或更多个分子标志物和YB1基因座的至少一种功能性等位基因。
在一个方面，本说明书提供并包括选择包含增强的NUE性状的烟草植物的方法，所述方法包括从至少一种烟草植物分离核酸并测定位于选自SEQ ID NO：57-64的与增强的NUE相关的一个或更多个等位基因的20cM内的一个或更多个分子标志物和YB1基因座的至少一个功能性等位基因，以及选择包含增强的NUE性状、与增强的NUE相关的一个或更多个等位基因和YB1基因座的至少一个功能性等位基因的烟草植物。
在一个方面，本说明书提供并包括选择包含增强的NUE性状的烟草植物的方法，所述方法包括从至少一种烟草植物分离核酸并测定位于选自SEQ ID NO：57-64的与增强的NUE相关的一个或更多个等位基因的5,000,000个核苷酸内的一个或更多个分子标志物和YB1基因座的至少一个功能性等位基因，以及选择包含增强的NUE性状、与增强的NUE相关的一个或更多个等位基因和YB1基因座的至少一个功能性等位基因的烟草植物。
序列简要说明
SEQ ID NOs:1-8是与根组织、叶组织或两者中的增强的NUE正相关的基因的氨基酸序列。
SEQ ID NOs:9-16是与根组织、叶组织或两者中的增强的NUE正相关的基因的核苷酸序列。
SEQ ID NOs:17-19是具有叶优选表达的基因的启动子区域的核苷酸序列。
SEQ ID NOs:20-24是具有根优选表达的基因的启动子区域的核苷酸序列。
SEQ ID NOs:25-40是与根组织、叶组织或两者中的增强的NUE负相关的基因的氨基酸序列。
SEQ ID NOs:41-56是与根组织、叶组织或两者中的增强的NUE负相关的基因的核苷酸序列。
SEQ ID NOs:57-64是包含与增强的NUE相关的多态性的SNP标志物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:65是表达载体p45-2-7的骨架序列。
各种序列包括核苷酸序列中的“N”或氨基酸序列中的“X”。“N”可以是任何核苷酸，例如A、T、G、C，或一个或更多个核苷酸的缺失或插入。在一些情况中会显示一串“N”。“N”的数目不一定与该位置上未确定的核苷酸的实际数目相关。实际的核苷酸序列可以长于或短于所示的“N”片段。类似地，“X”可以是任何氨基酸残基或一个或更多个氨基酸的缺失或插入。同样，“X”的数目不一定与该位置上未确定的氨基酸的实际数目相关。实际的氨基酸序列可以长于或短于所示的“X”片段。尽管在描述序列表中的任何SEQ ID时使用A、T、G、C(与A、U、G、C相比)，但取决于SEQ ID被提及的上下文，该SEQ ID也可以指RNA序列。
附图简要说明
图1描绘了与烟草基因组中的NUE相关的四个基因簇。表明了具有NUE代谢物指纹图谱的在植物的低氮和正常氮之间的条件下差异表达的基因(相关基因)。还表明了差异表达基因(DEG)的总数，而与NUE代谢指纹图谱无关。
图2描绘了被超级支架1覆盖的烟草染色体11的2兆碱基区域。超级支架1是支架A和B的重叠群。位于该区域的79个表达基因中，有56个基因被差异表达。
图3描绘了与烟草染色体11上的NUE相关的23个白肋和6个马里兰品种的等位基因组成。品系1、2和3是在SEQ ID NO:58处包含有利的马里兰等位基因的白肋品系，且品系4是在SEQ ID NO:58处包含不利的白肋等位基因的标准白肋品系。
图4描绘了如图3所示的品系1-4和MD609对照(C)的叶绿素损失、生长和产量。品系1、2和3是在SEQ ID NO:58处包含有利的马里兰等位基因的白肋品系，且品系4是在SEQ IDNO:58处包含不利的白肋等位基因的标准白肋品系。
图5描绘了在氮胁迫下过表达与产量增加呈正相关的基因的温室生长的T1植物的产量(克鲜重/每株植物)。显示了基于每个样品9株植物的平均值和标准偏差。
图6描绘了收获后两个独立田间生长的F4品系(NUE-2和NUE-3)的产量(磅/英亩)。如所描述，从MD609与白肋TN90的杂交产生测试品系。提供了与对照TN90白肋烟相比的平均值和标准偏差。
图7描绘了两个独立田间生长的双单倍体品系yb1/yb2和Yb1/yb2在施用60磅/英亩(lbs/ac)氮时收获后的产量(磅/英亩)。如所述从MD609与白肋TN90杂交产生双单倍体品系。提供与对照TN90白肋烟相比的平均值和标准偏差。
图8描绘了四个独立的双单倍体品系yb1/B11、yb1/M11、Yb1/B11和Yb1/M11在施用60磅/英亩(lbs/ac)氮时收获后的产量(磅/英亩)。如所述从MD609与白肋TN90杂交产生双单倍体品系。
图9描绘了与白肋TN90相比，在施用90或180lbs/ac氮时生长的两个独立田间生长的F4品系(NUE-4和NUE-5)在收获后的产量(磅/英亩)。如所述从MD609与白肋TN90的杂交产生测试品系。
图10描绘了与白肋TN90相比，在施用40、90或180lbs/ac氮时生长的两个独立田间生长的F4品系(NUE-4和NUE-5)在收获后以磅/英亩计的总茎、以及上茎和下茎部分的产量的平均等级指数(GI)。如所述从MD609到白肋TN90的杂交产生测试品系。对于每组三个条状物，左条状物是总茎(对角线模式)，中条状物是下茎(水平模式)，右条状物是上茎(棋盘模式)。误差条代表95％置信区间。
图11描绘了与白肋TN90和MD609相比，来自两个双单倍体品系Ds1532和Ds1563的代表性图像。如所述从MD609与白肋TN90杂交产生双单倍体品系。示例性的双单倍体植物表型上类似白肋烟，并且具有比马里兰烟更接近白肋烟的吸烟特征。
发明详述
除非另有定义，否则所使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。当术语以单数形式提供时，发明人还预期由该术语的复数描述的本公开的各方面。当通过引用并入的参考文献中使用的术语和定义存在差异时，本申请中使用的术语应具有本文给出的定义。所使用的其他技术术语在使用它们的领域中具有其普通含义，如各种特定领域的词典中所例证，例如“The American
Figure BDA0003795246920000071
Science Dictionary”(美国传统词典的编辑,2011,Houghton Mifflin Harcourt,Bostonand New York)、“McGraw-Hill Dictionary of Scientific and Technical Terms”(第6版,2002,McGraw-Hill,New York)或“Oxford Dictionary of Biology”(第6版,2008,Oxford University Press,Oxford and New York)。
本文引用的任何参考文献(例如，所有专利、公开的专利申请和非专利出版物)的全文通过引用并入本文。
当呈现替代方案分组时，具体预期构成该替代方案分组的成员的任何和所有组合。例如，如果项目选自由A、B、C和D组成的组，则本发明人具体预期每个单独的替代方案(例如，单独的A、单独的B等)，以及组合如A、B和D；A和C；B和C等。当在两个或更多个项目的列表中使用时，术语“和/或”是指所列项目中的任一个本身或与其它所列项目中的任一个或更多个的组合。例如，表述“A和/或B”旨在表示A和B之一或两者—即，单独的A、单独的B、或组合的A和B。表述“A、B和/或C”旨在表示单独的A、单独的B、单独的C、组合的A和B、组合的A和C、组合的B和C、或组合的A、B和C。
当本文提供数值范围时，该范围应理解为包括该范围的端点以及该范围的限定端点之间的任何数值。例如，“1-10”包括1-10之间的任何数字，以及数字1和数字10。
当使用术语“约”时，应理解为意指±10％。例如，“约100”将包括90-110。
如本文所用，单数形式“一”、“一个”和“所述”包括复数指代，除非上下文另有明确说明。例如，术语“化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括其混合物。
为了避免任何疑问，本文使用的术语或短语如“约”、“至少”、“至少约”、“至多”、“小于”、“大于”、“之内”等，当后面跟着一系列百分比数列表时，此类术语或短语被认为修饰所述系列或列表中的每个百分比数，而不管副词、介词或其它修饰短语是否在各个和每个成员之前再现。
如本文所用，术语“黄白肋烟1”或“YB1”是指烟草基因组的染色体24上的基因。YB1基因是拟南芥属乙烯依赖性向重力缺陷型和黄绿样(EGY)的预测同源物。参见Edwards etal.(2017)BMC Genomics,18:448。由于YB1基因座的突变，黄白肋烟1基因座在商业白肋烟品种中是无功能的。参见Lewis et al.(2012)J.Agric.Food Chem.,60,6454-6461andYafei Li,et al.(2018)Sci.Rep.,8:13300。预测YB1中的突变导致白肋烟草品种中存在的记载的低氮利用效率、高硝酸盐水平和较低碳水化合物含量。预测YB2中的突变导致白肋烟草品种中存在的记载的低氮利用效率、高硝酸盐水平和较低碳水化合物含量。本公开首次证明YB1的至少一个功能性等位基因与染色体11上增强的NUE等位基因组合提供了与目前本领域中的商业白肋品种相比协同且增强的氮利用效率。
如本文所用，术语“黄白肋烟2”或“YB2”是指烟草基因组的染色体5上的基因。YB2基因是拟南芥属乙烯依赖性向重力缺陷型和黄绿样(EGY)的预测同源物。参见Edwards etal.(2017)BMC Genomics,18:448。由于YB2基因座的突变，黄白肋烟2基因座在商业白肋烟品种中是无功能的。预测YB2中的突变导致白肋烟草品种中存在的记载的低氮利用效率、高硝酸盐水平和较低碳水化合物含量。参见Lewis et al.(2012)J.Agric.Food Chem.,60,6454-6461and Yafei Li,et al.(2018)Sci.Rep.,8:13300。
本文所用的术语“非功能性等位基因”是指不能产生功能性基因产物，例如功能性蛋白质的基因或开放阅读框。非功能性等位基因可以存在于野生型基因组中，例如白肋品种的yb1或yb2等位基因，或者其可以通过任何形式的诱变或基因编辑产生。突变类型和基因编辑方法是本领域已知的并在下文描述。如果相关基因或开放阅读框不能产生功能性基因产物，则不同品种的天然变异可自发产生非功能性等位基因。非功能性蛋白质通常会产生类似于相应非功能性等位基因的表型，但可通过转录后或翻译后修饰(如沉默或甲基化)而产生。
如本文所用，关于YB1或YB2基因座的术语“功能性等位基因”是指从YB1或YB2基因座产生的功能性基因产物。该术语与已知存在于商业白肋品种中的YB1或YB2的非功能性等位基因相对使用。不同品种之间的天然变异可导致许多不同的核苷酸序列，它们都可产生功能性基因产物或蛋白质。
如本文所用，“基因座”是多态性核酸、性状决定簇、基因或标志物所在的染色体区域。本公开的基因座包含群体中的一种或更多种多态性；例如，一些个体中存在替代等位基因。如本文所用，“等位基因”是指特定基因座处的替代核酸序列。等位基因的长度可以小至1个核苷酸碱基，但典型地更大。例如，第一等位基因可以出现在一条染色体上，而第二等位基因出现在第二条同源染色体上，例如，对于在杂合个体的不同染色体，或者在群体中不同的纯合或杂合个体之间出现。如本文所用，当仅存在一个基因座拷贝时，二倍体植物中的染色体是“半合子的”。例如，当插入的转基因仅插入一条姐妹染色体时(即，第二条姐妹染色体不含插入的转基因)，插入的转基因是半合子的。
如本文所用，“增强的NUE基因座”描述与目前公开的烟草基因组中与增强的NUE相关的四个基因簇中的任一个的基因组位置中的任一个连接的任何一个或更多个基因座。与增强的NUE相关的四个基因簇可称为数量性状基因座。本文公开了用于绘制和跟踪增强的NUE基因座的渗入的标志物。可以使用本领域已知的技术进行用于跟踪本文鉴定的基因组位置中的任何基因座的额外标志物的产生。
在一个方面，本文提供的烟草植物是双单倍体植物。通常，植物的单倍体细胞，如植物中的花药或花粉粒，被诱导使其遗传内容物或染色体数目加倍。这产生二倍体细胞，其中每个同源染色体对是相同的。因此，如本文所用，“双单倍体植物”是包含遗传上相同的同源染色体的植物。产生双单倍体植物的方法是本领域已知的(参见例如Salej,(2013)“Plant Breeding”,Blackwell publishing,Vol132.6,764-771,and Touraev(1999)“Methods in Molecular Biology”,Humana Press,Vol.111,281-291)。
一方面，改性的植物、种子、植物组分、植物细胞或植物基因组对于本文提供的转基因是纯合的。另一方面，改性的植物、种子、植物组分、植物细胞或植物基因组对于本文提供的转基因是杂合的。一方面，改性的植物、种子、植物组分、植物细胞或植物基因组对于本文提供的转基因是半合子的。一方面，改性的植物、种子、植物组分、植物细胞或植物基因组对于本文提供的突变是纯合的。另一方面，改性的植物、种子、植物组分、植物细胞或植物基因组对于本文提供的突变是杂合的。一方面，改性的植物、种子、植物组分、植物细胞或植物基因组对于本文提供的突变是半合子的。可以使用本领域已知的方法将本发明的任何植物诱导成为双单倍体植物。
如本文所用，“基因渗入”是指将遗传基因座的所需等位基因从一个遗传背景传递至另一个遗传背景。
如本文所用，“杂交”是指通过受精产生后代(例如细胞、种子或植物)，并且包括不同植物之间的杂交(有性)和自体受精(自交)。
如本文所用，“回交”是指后代植物与其亲本之一重复杂交的过程。在回交方案中，“供体”亲本是指具有待渗入的所需基因或基因座的亲本植物。“受体”亲本(使用一次或多次)或“轮回”亲本(使用两次或更多次)是指基因或基因座被渗入其中的亲本植物。最初的杂交产生F1代。术语“BC1”是指第二次使用轮回亲本，“BC2”是指第三次使用轮回亲本，依此类推。一方面，重复进行回交，每个连续回交代的后代个体自身与相同的亲本基因型回交。
如本文所用，“优良品种”是指由于优异的农学性能从育种和选择产生的任何品种。
如本文所用，在育种背景下的“选择”是指基于某些预定标准通常从群体挑选或选择期望个体的行为。
如本文所用，在两个多核苷酸或多肽序列的上下文中，术语“序列一致性”或“一致性”是指当在指定的比较窗口上比对最大对应性时两个序列中的残基相同。当对蛋白质使用序列一致性百分比时，认识到不相同的残基位置通常通过保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基被具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基取代，因此不会改变分子的功能特性。当序列在保守取代上不同时，可以向上调整序列一致性百分比以校正取代的保守性质。通过这种保守取代而不同的序列称为具有“序列相似性”或“相似性”。可以使用任何合适的计算机程序进行两个或更多个序列的比对。例如，用于进行行序列比对的一种广泛使用并认可的计算机程序是CLUSTALW v1.6(Thompson,et al.(1994)Nucl.Acids Res.,22:4673-4680)。
如本文所用，关于核酸分子的术语“互补”是指核苷酸碱基的配对，使得腺嘌呤与胸腺嘧啶或尿嘧啶互补，而鸟嘌呤与胞嘧啶互补。两个互补核酸分子能够彼此杂交。例如，双链DNA的两条链彼此互补。
长度至少为三个核苷酸的特定多核苷酸可以被称为“寡核苷酸”。本文提供的核酸分子包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)及其功能类似物，例如互补DNA(cDNA)。本文提供的核酸分子可以是单链或双链的。核酸分子包含核苷酸碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)。尿嘧啶(U)替代RNA分子中的胸腺嘧啶。符号“R”可用于代表嘌呤(例如，A或G)核苷酸碱基。符号“Y”可用于代表嘧啶(例如，C或T)核苷酸碱基。符号“W”可用于代表A或T核苷酸碱基。符号S可用于代表G或C核苷酸碱基。符号“M”可用于代表A或C核苷酸碱基。符号“K”可用于表示G或T核苷酸碱基。符号“B”可用于代表G、C或T核苷酸碱基。符号“H”可用于代表A、C或T核苷酸碱基。符号“D”可用于代表A、G或T核苷酸碱基。符号“V”可用于代表A、G或C核苷酸碱基。符号“N”可用于代表任何核苷酸碱基(例如，A、G、C、T或U)。
术语“多核苷酸”的使用不旨在将本公开限制于包含DNA的多核苷酸。本领域普通技术人员将认识到，多核苷酸和核酸分子可包含核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合。这种脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸均包括天然存在的分子和合成的类似物。本公开的多核苷酸还涵盖所有形式的序列，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹、茎环结构等。
如本文所用，术语“多肽”是指至少两个共价连接的氨基酸的链。多肽可以由本文提供的多核苷酸编码。
本文提供的核酸分子、多肽或蛋白质可以是分离的或基本纯化的。“分离的”或“纯化的”核酸分子、多肽、蛋白质或其生物活性部分实质上或基本上不含通常与其天然存在的环境中发现的多核苷酸或蛋白质相伴或相互作用的组分。例如，当通过重组技术产生时，分离的或纯化的多核苷酸或蛋白质基本上不含其他细胞物质或培养基，或当化学合成时，基本上不含化学前体或其他化学品。一方面，本文提供的分离的多核苷酸可以包含少于10000个核苷酸、少于5000个核苷酸、少于4000个核苷酸、少于3000个核苷酸、少于2000个核苷酸、少于1000个核苷酸、少于500个核苷酸或少于100个核苷酸的核酸序列，所述核酸序列天然地位于从其衍生多核苷酸的细胞的基因组DNA中的多核苷酸侧翼。一方面，本文提供的分离的多核苷酸可包含100-10000个核苷酸、500-10000个核苷酸、1000-10000个核苷酸、2000-10000个核苷酸、3000-10000个核苷酸、4000-10000个核苷酸、1-500个核苷酸、1-1000个核苷酸、1-2000个核苷酸、1-3000个核苷酸、1-4000个核苷酸、1-5000个核苷酸、1-10000个核苷酸、100-500个核苷酸、100-1000个核苷酸、100-2000个核苷酸、100-3000个核苷酸或100-4000个核苷酸的核酸序列，所述核酸序列天然地位于从其衍生多核苷酸的细胞的基因组DNA中的多核苷酸侧翼。在另一方面，本文提供的分离的多肽在制剂中基本上不含细胞物质，所述制剂的化学前体或非目标蛋白化学品的含量小于30％、小于20％、小于10％、小于5％、或小于1％(干重)。所公开的多核苷酸和由其编码的多肽的片段也涵盖在本发明中。多核苷酸片段可以编码保留天然多肽的生物活性的多肽片段。或者，使用本领域已知的方法用作杂交探针或PCR引物的多核苷酸片段通常不编码保留生物活性的片段多肽。取决于所需的结果，本文提供的多核苷酸片段可以为至少20个核苷酸、至少50个核苷酸、至少70个核苷酸、至少100个核苷酸、至少150个核苷酸、至少200个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸，并且直至编码本发明多肽的全长多核苷酸。
可以使用本领域的常规技术分离核酸。例如，可以使用任何方法分离核酸，包括但不限于重组核酸技术和/或聚合酶链式反应(PCR)。例如，通常的PCR技术描述于PCRPrimer:Laboratory Manual,Dieffenbach&Dveksler,Eds.,Cold Spring HarborLaboratory Press,1995。例如，重组核酸技术包括限制性酶消化和连接，其可用于分离核酸。分离的核酸也可以作为单个核酸分子或作为一系列寡核苷酸被化学合成。可以通过已知方法(例如DEAE离子交换、凝胶过滤和羟基磷灰石层析)从天然来源(例如生物样品)中纯化多肽。例如，也可以通过在表达载体中表达核酸来纯化多肽。另外，可以通过化学合成获得纯化的多肽。可以使用任何合适的方法测量多肽的纯度，例如柱色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析。
一方面，本公开提供了检测植物细胞中的重组核酸和多肽的方法。非限制性地，也可以使用杂交检测核酸。核酸之间的杂交详细讨论于Sambrook等(1989),MolecularCloning:Laboratory Manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY)。
可以使用抗体检测多肽。使用抗体检测多肽的技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western印迹、免疫沉淀和免疫荧光。本文提供的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。可以使用本领域熟知的方法制备对本文提供的多肽具有特异性结合亲和力的抗体。可以使用本领域已知的方法将本文提供的抗体附着于固体支持物，如微量滴定板。
可以使用可检测标签进行检测(例如，扩增产物、杂交复合物、多肽)。术语“标签”旨在涵盖使用直接标签以及间接标签。可检测标签包括酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。
如本文所用，短语“与……相关”或“与……关联”是指两个实体之间的可识别和/或可测定的关系。例如，短语“与增强的NUE相关”是指性状、基因座、基因、等位基因、标志物、表型等，或其表达，其存在或不存在能够影响具有增强的NUE性状的植物或其感兴趣部分的范围、程度和/或速率。因此，当标志物与性状关联时，并且当标志物的存在是指示所需性状或性状形式是否和/或在何种程度上将在包含所述标志物的植物/种质中发生的指示剂时，该标志物与性状“相关”。类似地，当标志物与等位基因关联时，并且当标志物的存在是指示等位基因是否存在于包含该标志物的植物/种质中的指示剂时，该标志物与等位基因“相关”。例如，“与增强的NUE等位基因相关的标志物”是指其存在或不存在可用于预测植物是否以及在何种程度上显示增强的NUE表型的标志物。
如本文所用，“异源”是指序列源自外来物种，或者，如果源自相同物种，则通过有意的人为干预实质上改变它在组合物和/或基因组位点中的天然形式。该术语也适用于核酸构建体，在本文中也称为“多核苷酸构建体”或“核苷酸构建体”。以这种方式，“异源”核酸构建体旨在表示构建体源自外来物种，或者，如果源自相同物种，则通过有意的人为干预实质上改变它在组合物和/或基因组位点中的天然形式。例如，异源核酸构建体包括但不限于通过转化方法或随后用另一种目标植物育种转基因植物而已经被引入植物或其植物部分的重组核苷酸构建体。
如本文所用，“厘摩”(cM)是两个基因座之间的重组频率和遗传距离的度量单位。一个cM等于一个基因座中的标志物由于在一代中发生杂交而与第二个基因座的标志物分离的机会为1％。
如本文所用，“紧密连接”是指标志物或基因座在另一个标志物或基因座的约20cM、15cM、10cM、5cM、4cM、3cM、2cM、1cM、0.5cM或小于0.5cM内。例如，20cM是指在标志物和基因座之间以等于或小于约20％的频率发生重组。
如本文所用，“植物”是指整株植物。衍生自植物的细胞或组织培养物可包含任何植物成分或植物器官(例如叶、茎、根等)、植物组织、种子、植物细胞和/或它们的后代。后代植物可以来自任何子代，例如F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7等。植物细胞是植物的生物细胞，取自植物或通过培养取自植物的细胞而衍生。
如本文所用，烟草植物可以来自红花烟草(Nicotiana tabacum)属的任何植物，包括但不限于红花烟草(Nicotiana tabacum tabacum)；抱茎烟草(Nicotiana tabacumamplexicaulis),PI 271989；本塞姆氏烟草(Nicotiana tabacum benthamiana)PI555478；毕基劳式烟草(Nicotiana tabacum bigelovii)PI 555485；迪勃纳氏烟草(Nicotiana tabacum debneyi)；高烟草(Nicotiana tabacum excelsior)PI 224063；粘烟草(Nicotiana tabacum glutinosa)PI 555507；古特斯比氏烟草(Nicotiana tabacumgoodspeedii)PI 241012；哥西氏烟草(Nicotiana tabacum gossei)PI 230953；西烟草(Nicotiana tabacum hesperis)PI271991；奈特氏烟草(Nicotiana tabacum knightiana)PI 555527；海滨烟草(Nicotiana tabacum maritima)PI 555535；特大管烟草(Nicotianatabacum megalosiphon)PI 555536；裸茎烟草(Nicotiana tabacum nudicaulis)PI555540；圆锥烟草(Nicotiana tabacum paniculata)PI555545；蓝茉莉叶烟草(Nicotianatabacum plumbaginifolia)PI 555548；残波烟草(Nicotiana tabacum repanda)PI555552；黄花烟草(Nicotiana tabacum rustica)；香甜烟草(Nicotiana tabacumsuaveolens)PI 230960；林烟草(Nicotiana tabacum sylvestris)PI555569；绒毛烟草(Nicotiana tabacum tomentosa)PI 266379；绒毛状烟草(Nicotiana tabacumtomentosiformis)；和三角叶烟草(Nicotiana tabacum trigonophylla)PI 555572。
一方面，本文提供的植物组分包括但不限于叶、茎、根、种子、花、花粉、花药、胚珠、花梗、果实、分生组织、子叶、下胚轴、荚、胚、胚乳、外植体、愈伤组织、组织培养物、嫩芽、细胞和原生质体。在其他方面，本公开提供了不是繁殖材料并且不介导植物的天然繁殖的烟草植物细胞、组织和器官。另一方面，本公开还提供是繁殖材料并介导植物的天然繁殖的烟草植物细胞、组织和器官。另一方面，本公开提供了不能通过光合作用维持自身的烟草植物细胞、组织和器官。另一方面，本公开提供了体细胞烟草植物细胞。与生殖细胞相反，体细胞不介导植物繁殖。
所提供的细胞、组织和器官可以来自种子、果实、叶、子叶、下胚轴、分生组织、胚、胚乳、根、嫩芽、茎、荚、花、花序、叶柄、花梗、花柱、柱头、花托、花瓣、萼片、花粉、花药、花丝、子房、胚珠、果皮、韧皮部和维管组织。另一方面，本公开提供烟草植物叶绿体。在进一步的方面，本公开提供表皮细胞、气孔细胞、叶毛(毛状体)、根毛或贮藏根。在另一方面，本公开提供烟草原生质体。
技术人员理解，烟草植物通过种子自然繁殖，而不是通过无性繁殖或营养繁殖。一方面，本公开提供烟草胚乳。另一方面，本公开提供烟草胚乳细胞。在进一步的方面，本公开提供雄性或雌性不育的烟草植物，其在没有人为干预的情况下不能繁殖。
在烟草中，当茎生长时形成新的叶子。因此，最年轻的叶子是茎上最上面的叶子，而最老的叶子是茎上最下面的叶子。与深色烟草品种不同，常规白肋烟草品种在成熟过程中呈黄色。当白肋烟打顶时，一些较低(较老)的叶子可能已经开始变黄。常规白肋烟在打顶后将从底部到顶部继续变成黄色。
一方面，本公开提供了与改性烟草植物、种子、植物组分、植物细胞和由改性烟草植物、种子、植物部分和植物细胞制成的产品有关的方法和组合物。一方面，本文提供的改性种子产生本文提供的改性植物。一方面，本文提供的改性植物、种子、植物组分、植物细胞或植物基因组包含本文提供的重组DNA构建体。另一方面，本文提供的熟化烟草材料或烟草制品包含本文提供的改性烟草植物、植物组分、植物细胞或植物基因组。
在进一步的方面，本说明书的改性烟草种子或烟草植物包含编码与选自下组的序列至少70％一致或相似的多肽的编码区：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，改性烟草种子或烟草植物包含编码与选自下组的序列至少75％一致或相似的多肽的编码区：SEQ IDNOs:1-8。在进一步的方面，改性烟草种子或烟草植物包含编码与选自下组的序列至少80％一致或相似的多肽的编码区：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，改性烟草种子或烟草植物包含编码与选自下组的序列至少85％一致或相似的多肽的编码区：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，改性烟草种子或烟草植物包含编码与选自下组的序列至少90％一致或相似的多肽的编码区：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，改性烟草种子或烟草植物包含编码与选自下组的序列至少95％一致或相似的多肽的编码区：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，改性烟草种子或烟草植物包含编码与选自下组的序列至少96％一致或相似的多肽的编码区：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，改性烟草种子或烟草植物包含编码与选自下组的序列至少97％一致或相似的多肽的编码区：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，改性烟草种子或烟草植物包含编码与选自下组的序列至少98％一致或相似的多肽的编码区：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，改性烟草种子或烟草植物包含编码与选自下组的序列至少99％一致或相似的多肽的编码区：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，改性烟草种子或烟草植物包含编码与选自下组的序列100％一致的多肽的编码区：SEQ ID NOs:1-8。
在进一步的方面，本说明书的改性烟草种子或烟草植物包含编码与选自下组的序列至少70％一致或相似的多肽的编码区：SEQ ID NOs:9-16。在进一步的方面，改性烟草种子或烟草植物包含编码与选自下组的序列至少75％一致或相似的多肽的编码区：SEQ IDNOs:9-16。在进一步的方面，改性烟草种子或烟草植物包含编码与选自下组的序列至少80％一致或相似的多肽的编码区：SEQ ID NOs:9-16。在进一步的方面，改性烟草种子或烟草植物包含编码与选自下组的序列至少85％一致或相似的多肽的编码区：SEQ ID NOs:9-16。在进一步的方面，改性烟草种子或烟草植物包含编码与选自下组的序列至少90％一致或相似的多肽的编码区：SEQ ID NOs:9-16。在进一步的方面，改性烟草种子或烟草植物包含编码与选自下组的序列至少95％一致或相似的多肽的编码区：SEQ ID NOs:9-16。在进一步的方面，改性烟草种子或烟草植物包含编码与选自下组的序列至少96％一致或相似的多肽的编码区：SEQ ID NOs:9-16。在进一步的方面，改性烟草种子或烟草植物包含编码与选自下组的序列至少97％一致或相似的多肽的编码区：SEQ ID NOs:9-16。在进一步的方面，改性烟草种子或烟草植物包含编码与选自下组的序列至少98％一致或相似的多肽的编码区：SEQ ID NOs:9-16。在进一步的方面，改性烟草种子或烟草植物包含编码与选自下组的序列至少99％一致或相似的多肽的编码区：SEQ ID NOs:9-16。在进一步的方面，改性烟草种子或烟草植物包含编码与选自下组的序列一致的多肽的编码区：SEQ ID NOs:9-16。
在进一步的方面，改性烟草种子或烟草植物包含叶优选启动子，其由与选自下组的序列至少70％一致的序列或其功能性片段编码：SEQ ID NOs:17-19。在进一步的方面，叶优选启动子由与选自下组的序列至少75％一致的序列或其功能性片段编码：SEQ ID NOs:17-19。在进一步的方面，叶优选启动子由与选自下组的序列至少80％一致的序列或其功能性片段编码：SEQ ID NOs:17-19。在进一步的方面，叶优选启动子由与选自下组的序列至少85％一致的序列或其功能性片段编码：：SEQ ID NOs:17-19。在进一步的方面，叶优选启动子由与选自下组的序列至少90％一致的序列或其功能性片段编码：SEQ ID NOs:17-19。在进一步的方面，叶优选启动子由与选自下组的序列至少95％一致的序列或其功能性片段编码：SEQ ID NOs:17-19。在进一步的方面，叶优选启动子由与选自下组的序列至少96％一致的序列或其功能性片段编码：SEQ ID NOs:17-19。在进一步的方面，叶优选启动子由与选自下组的序列至少97％一致的序列或其功能性片段编码：SEQ ID NOs:17-19。在进一步的方面，叶优选启动子由与选自下组的序列至少98％一致的序列或其功能性片段编码：SEQ IDNOs:17-19。在进一步的方面，叶优选启动子由与选自下组的序列至少99％一致的序列或其功能性片段编码：SEQ ID NOs:17-19。在进一步的方面，叶优选启动子由选自下组的序列或其功能性片段编码：SEQ ID NOs:17-19。
在进一步的方面，改性烟草种子或烟草植物包含根优选启动子，其由与选自下组的序列至少70％一致的序列或其功能性片段编码：SEQ ID NOs:20-24。在进一步的方面，根优选启动子由与选自下组的序列至少75％一致的序列或其功能性片段编码：SEQ ID NOs:20-24。在进一步的方面，根优选启动子由与选自下组的序列至少80％一致的序列或其功能性片段编码：SEQ ID NOs:20-24。在进一步的方面，根优选启动子由与选自下组的序列至少85％一致的序列或其功能性片段编码：SEQ ID NOs:20-24。在进一步的方面，根优选启动子由与选自下组的序列至少90％一致的序列或其功能性片段编码：SEQ ID NOs:20-24。在进一步的方面，根优选启动子由与选自下组的序列至少95％一致的序列或其功能性片段编码：SEQ ID NOs:20-24。在进一步的方面，根优选启动子由与选自下组的序列至少96％一致的序列或其功能性片段编码：SEQ ID NOs:20-24。在进一步的方面，根优选启动子由与选自下组的序列至少97％一致的序列或其功能性片段编码：SEQ ID NOs:20-24。在进一步的方面，根优选启动子由与选自下组的序列至少98％一致的序列或其功能性片段编码：SEQ IDNOs:20-24。在进一步的方面，根优选启动子由与选自下组的序列至少99％一致的序列或其功能性片段编码：SEQ ID NOs:20-24。在进一步的方面，根优选启动子由选自下组的序列或其功能性片段编码：SEQ ID NOs:20-24。
在进一步的方面，本文提供的方法包括包含分子标志物的后代种子。在进一步的方面，本文提供的方法包括包含增强的NUE的后代种子。在进一步的方面，本文提供的方法包括在本文提供的增强的NUE效率基因座的20cM内包含分子标志物的后代种子。在进一步的方面，本文提供的方法包括在本文提供的增强的NUE效率基因座的15cM内包含分子标志物的后代种子。在进一步的方面，本文提供的方法包括在本文提供的增强的NUE效率基因座的10cM内包含分子标志物的后代种子。在进一步的方面，本文提供的方法包括在本文提供的增强的NUE效率基因座的9cM内包含分子标志物的后代种子。在进一步的方面，本文提供的方法包括在本文提供的增强的NUE效率基因座的8cM内包含分子标志物的后代种子。在进一步的方面，本文提供的方法包括在本文提供的增强的NUE效率基因座的7cM内包含分子标志物的后代种子。在进一步的方面，本文提供的方法包括在本文提供的增强的NUE效率基因座的6cM内包含分子标志物的后代种子。在进一步的方面，本文提供的方法包括在本文提供的增强的NUE效率基因座的5cM内包含分子标志物的后代种子。在进一步的方面，本文提供的方法包括在本文提供的增强的NUE效率基因座的4cM内包含分子标志物的后代种子。在进一步的方面，本文提供的方法包括在本文提供的增强的NUE效率基因座的3cM内包含分子标志物的后代种子。在进一步的方面，本文提供的方法包括在本文提供的增强的NUE效率基因座的2cM内包含分子标志物的后代种子。在进一步的方面，本文提供的方法包括在本文提供的增强的NUE效率基因座的1cM内包含分子标志物的后代种子。在进一步的方面，本文提供的方法包括在本文提供的增强的NUE效率基因座的0.5cM内包含分子标志物的后代种子。
一方面，本说明书提供并且包括一种方法，该方法包括提供第一烟草植物群体，针对由选自下组的序列编码的基因座的增强的NUE等位基因的存在对第一烟草植物群体进行基因分型：SEQ ID NOs:9-16；和选择一种或更多种经基因分型的包含增强的NUE等位基因的烟草植物。在进一步的方面，所述方法进一步包括使一种或更多种选择的烟草植物与第二烟草植物杂交；并从杂交获得后代种子。
一方面，本说明书提供并且包括一种将增强的NUE性状基因渗入烟草品种的方法，其包括将包含增强的氮利用效率性状的第一烟草品种与缺乏增强的氮利用效率性状的第二烟草品种杂交，从杂交获得后代种子，针对与增强的氮利用效率性状相关的分子标志物对至少一个后代种子进行基因分型，其中所述分子标志物位于具有选自下组的序列的基因座的20cM内：SEQ ID NOs:9-16，和选择包含增强的氮利用效率性状的后代种子。
一方面，本说明书提供并且包括一种选择具有增强的NUE性状的烟草植物的方法，其包括从烟草种质集合中分离核酸，测定分离的核酸中位于具有选自下组的序列的基因座的20cM内的一个或更多个标志物：SEQ ID NOs:9-16，和选择包含增强的NUE性状的烟草植物。在进一步的方面，所述方法还包括使一种或更多种选择的烟草植物与第二烟草植物杂交；并从杂交种获得后代种子。
一方面，本说明书提供并且包括一种选择具有增强的NUE性状的烟草植物的方法，其包括从烟草种质集合中分离核酸，测定分离的核酸中位于选自下组的标志物的20cM内的一个或更多个标志物：SEQ ID NOs:57-64，和选择包含增强的NUE性状的烟草植物。在进一步的方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中一个或更多个位于选自下组的标志物的15cM内的标志物：SEQ ID NO:58。在进一步的方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中位于选自下组的标志物的10cM内的一个或更多个标志物：SEQ ID NOs:57-64。
在进一步的方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中位于选自下组的标志物的9cM内的一个或更多个标志物：SEQ ID NOs:57-64。在进一步的方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中位于选自下组的标志物的8cM内的一个或更多个标志物：SEQ ID NOs:57-64。在进一步的方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中位于选自下组的标志物的7cM内的一个或更多个标志物：SEQ ID NOs:57-64。在进一步的方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中位于选自下组的标志物的6cM内的一个或更多个标志物：SEQ ID NOs:57-64。在进一步的方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中位于选自下组的标志物的5cM内的一个或更多个标志物：SEQ ID NOs:57-64。在进一步的方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中位于选自下组的标志物的4cM内的一个或更多个标志物：SEQ ID NOs:57-64。在进一步的方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中位于选自下组的标志物的3cM内的一个或更多个标志物：SEQ ID NOs:57-64。在进一步的方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中位于选自下组的标志物的2cM内的一个或更多个标志物：SEQ ID NOs:57-64。在进一步的方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中位于选自下组的标志物的1cM内的一个或更多个标志物：SEQ ID NOs:57-64。在进一步的方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中位于选自下组的标志物的0.5cM内的一个或更多个标志物：SEQ ID NOs:57-64。在进一步的方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中选自下组的标志物：SEQID NOs:57-64。在另一方面，与增强的NUE相关的等位基因在SEQ ID NO:58的第57位包含G核苷酸。在另一方面，与增强的NUE相关的等位基因在SEQ ID NO:58的第117位包含C核苷酸。在另一方面，与增强的NUE相关的等位基因在SEQ ID NO：58的第57位包含G核苷酸，在第117位包含C核苷酸。在另一方面，与增强的NUE相关的等位基因在SEQ ID NO:57的第147位包含T核苷酸。在另一方面，与增强的NUE相关的等位基因在SEQ ID NO:59的第162位包含G核苷酸。在另一方面，与增强的NUE相关的等位基因在SEQ ID NO:60的第36位包含C核苷酸。在另一方面，与增强的NUE相关的等位基因在SEQ ID NO:61的第36位包含T核苷酸。在另一方面，与增强的NUE相关的等位基因在SEQ ID NO:62的第36位包含T核苷酸。在另一方面，与增强的NUE相关的等位基因在SEQ ID NO:63的第36位包含G核苷酸。在另一方面，与增强的NUE相关的等位基因在SEQ ID NO:64的第36位包含T核苷酸。在进一步的方面，可以选择包含与本文公开的增强的NUE相关的等位基因的任何组合的烟草植物。
在一个方面，本说明书提供并包括选择具有增强的NUE性状的烟草植物的方法，其包括从至少一种烟草植物分离核酸，测定分离的核酸中位于选自SEQ ID NO：57-64的与增强的NUE相关的一个或更多个等位基因的20cM内的一个或更多个分子标志物，测定分离的核酸中黄白肋烟1(YB1)基因座的至少一个功能性等位基因，和选择包含增强的NUE性状、与增强的NUE相关的一个或更多个等位基因和YB1基因座的至少一个功能性等位基因的烟草植物。在进一步的方面，还测定烟草植物的黄白肋烟2(YB2)基因座的至少一个功能性等位基因。在另一方面，还针对YB2基因座的至少一个功能性等位基因选择烟草植物。
在进一步的方面，与在相同条件下生长时缺乏顺化基因多核苷酸的未改性烟草植物相比，包含顺化基因多核苷酸的本说明书的改性烟草植物在根组织中包含较高水平的选自下组的代谢物：4-胍基丁酸酯、丁香醛、硫胺和对羟基苯甲醛。
在进一步的方面，与在相同条件下生长时缺乏顺化基因多核苷酸的未改性烟草植物相比，包含顺化基因多核苷酸的本说明书的改性烟草植物在叶组织中包含较高水平的选自下组的代谢物：4-胍基丁酸酯、X-23454、X-23580和X-23852。
在进一步的方面，与在相同条件下生长时缺乏顺化基因多核苷酸的未改性烟草植物相比，包含顺化基因多核苷酸的本说明书的改性烟草植物在根组织中包含较低水平的选自下组的代谢物：X-2357、N-乙酰胞壁酸酯、X-23319、X-23852、X-23330、α-酮戊二酸酯、X-21756、4-羟基-2-酮戊二酸、X-23937、X-23916和1-甲基腺嘌呤。
在进一步的方面，与在相同条件下生长时缺乏顺化基因多核苷酸的未改性烟草植物相比，包含顺化基因多核苷酸的本说明书的改性烟草植物在叶组织中包含较低水平的选自下组的代谢物：X-23453、X-21756、X-11429、X-21796、N’-甲基烟酰胺、可替宁、X-23389、N-乙酰精氨酸、N-23366、N-乙酰苯基丙氨酸和柚皮素。
一方面，本说明书提供并且包括一种重组DNA构建体，其包含与编码多肽的多核苷酸可操作地连接的异源启动子，所述多肽与选自下组的多肽至少70％一致或相似：SEQ IDNOs:1-8。在进一步的方面，重组DNA构建体包含编码与选自下组的多肽至少75％一致或相似的多肽的多核苷酸：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，重组DNA构建体包含编码与选自下组的多肽至少80％一致或相似的多肽的多核苷酸：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，重组DNA构建体包含编码与选自下组的多肽至少85％一致或相似的多肽的多核苷酸：SEQ IDNOs:1-8。在进一步的方面，重组DNA构建体包含编码与选自下组的多肽至少90％一致或相似的多肽的多核苷酸：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，重组DNA构建体包含编码与选自下组的多肽至少95％一致或相似的多肽的多核苷酸：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，重组DNA构建体包含编码与选自下组的多肽至少96％一致或相似的多肽的多核苷酸：SEQ IDNOs:1-8。在进一步的方面，重组DNA构建体包含编码与选自下组的多肽至少97％一致或相似的多肽的多核苷酸：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，重组DNA构建体包含编码与选自下组的多肽至少98％一致或相似的多肽的多核苷酸：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，重组DNA构建体包含编码与选自下组的多肽至少99％一致或相似的多肽的多核苷酸：SEQ IDNOs:1-8。在进一步的方面，重组DNA构建体包含编码与选自下组的多肽100％一致的多肽的多核苷酸：SEQ ID NOs:1-8。
一方面，本说明书提供并且包括熟化烟草材料或包含所述熟化烟草材料的烟草制品，其中所述熟化烟草材料由包含含有与编码区可操作地连接的异源启动子的顺化基因多核苷酸的烟草植物制成，其中与在相同条件下生长时缺乏顺化基因多核苷酸的未改性对照烟草植物相比，所述改性烟草植物包含增强的氮利用效率。
一方面，本说明书提供并且包括包含本文公开的改性烟草种子或植物的温室、生长室或田间。一方面，本说明书提供并且包括使本说明书的烟草植物在温室、生长室或田间中生长的方法。
一方面，本说明书提供并且包括改性烟草种子或由其生长的烟草植物，其在编码选自下组的多肽的内源基因座中包含至少一个突变：SEQ ID NOs:25-40，其中与在相同条件下生长时至少缺乏至少一种突变的未改性对照烟草植物相比，改性烟草种子或烟草植物包含增强的氮利用效率。在进一步的方面，内源基因座中的突变选自下组：插入、缺失、取代和倒置。另一方面，内源基因座中的突变是沉默突变、非沉默突变或无效突变。在进一步的方面，改性烟草种子或改性烟草植物是白肋烟品种。
在进一步的方面，与在相同条件下生长的未改性烟草植物相比，改性烟草植物在根组织中包含较高水平的选自下组的代谢物：4-胍基丁酸酯、丁香醛、硫胺和对羟基苯甲醛。在进一步的方面，与在相同条件下生长的未改性烟草植物相比，改性烟草植物在叶组织中包含较高水平的选自下组的代谢物：4-胍基丁酸酯、X-23454、X-23580和X-23852。在进一步的方面，与在相同条件下生长的未改性烟草植物相比，改性烟草植物在根组织中包含较低水平的选自下组的代谢物：X-2357、N-乙酰胞壁酸酯、X-23319、X-23852、X-23330、α-酮戊二酸酯、X-21756、4-羟基-2-酮戊二酸、X-23937、X-23916和1-甲基腺嘌呤。在进一步的方面，与在相同条件下生长的未改性烟草植物相比，改性烟草植物在叶组织中包含较低水平的选自下组的代谢物：X-23453、X-21756、X-11429、X-21796、N’-甲基烟酰胺、可替宁、X-23389、N-乙酰精氨酸、N-23366、N-乙酰苯基丙氨酸和柚皮素。
一方面，本说明书提供并且包括重组DNA构建体，其包含与向导RNA可操作地连接的异源启动子，该向导RNA包含与编码选自下组的多肽的多核苷酸一致或互补的至少18个连续核苷酸：SEQ ID NOs:25-40。在进一步的方面，向导RNA包含与编码选自下组的多肽的多核苷酸一致或互补的至少19个连续核苷酸：SEQ ID NOs:25-40。在进一步的方面，向导RNA包含与编码选自下组的多肽的多核苷酸一致或互补的至少20个连续核苷酸：SEQ IDNOs:25-40。在进一步的方面，向导RNA包含与编码选自下组的多肽的多核苷酸一致或互补的至少21个连续核苷酸：SEQ ID NOs:25-40。在进一步的方面，向导RNA包含与编码选自下组的多肽的多核苷酸一致或互补的至少22个连续核苷酸：SEQ ID NOs:25-40。在进一步的方面，向导RNA包含与编码选自下组的多肽的多核苷酸一致或互补的至少23个连续核苷酸：SEQ ID NOs:25-40。在进一步的方面，向导RNA包含与编码选自下组的多肽的多核苷酸一致或互补的至少24个连续核苷酸：SEQ ID NOs:25-40。在进一步的方面，向导RNA包含与编码选自下组的多肽的多核苷酸一致或互补的至少25个连续核苷酸：SEQ ID NOs:25-40。在进一步的方面，向导RNA包含与编码选自下组的多肽的多核苷酸一致或互补的至少26个连续核苷酸：SEQ ID NOs:25-40。在进一步的方面，向导RNA包含与编码选自下组的多肽的多核苷酸一致或互补的至少27个连续核苷酸：SEQ ID NOs:25-40。在进一步的方面，向导RNA包含与编码选自下组的多肽的多核苷酸100％一致或互补的至少28个连续核苷酸：SEQ IDNOs:25-40。
一方面，本说明书提供并且包括熟化烟草材料或包含所述熟化烟草材料的烟草制品，其中所述熟化烟草材料由在编码选自下组的多肽的内源基因座中包含至少一种突变的烟草植物制成：SEQ ID NOs:25-40，其中与在相同条件下生长时缺乏所述至少一种突变的未改性对照烟草植物相比，所述改性烟草种子或烟草植物包含增强的NUE。在进一步的方面，烟草植物在编码选自下组的多肽的内源基因座中包含至少两个突变：SEQ ID NOs:25-40。在进一步的方面，烟草植物在编码选自下组的多肽的内源基因座中包含至少三个突变：SEQ ID NOs:25-40。在进一步的方面，烟草植物在编码选自下组的多肽的内源基因座中包含至少四个突变：SEQ ID NOs:25-40。在进一步的方面，烟草植物在编码选自下组的多肽的内源基因座中包含至少五个突变：SEQ ID NOs:25-40。在进一步的方面，烟草植物在编码选自下组的多肽的内源基因座中包含至少六个突变：SEQ ID NOs:25-40。在进一步的方面，烟草植物在编码选自下组的多肽的内源基因座中包含至少七个突变：SEQ ID NOs:25-40。在进一步的方面，烟草植物在编码选自下组的多肽的内源基因座中包含至少八个突变：SEQID NOs:25-40。在进一步的方面，烟草植物在编码选自下组的多肽的内源基因座中包含至少九个突变：SEQ ID NOs:25-40。在进一步的方面，烟草植物在编码选自下组的多肽的内源基因座中包含至少十个突变：SEQ ID NOs:25-40。
一方面，本说明书提供并且包括改性烟草种子或由其生长的烟草植物，其包含含有与编码小RNA(sRNA)的多核苷酸可操作地连接的异源启动子的顺化基因多核苷酸，所述多核苷酸与选自下组的多核苷酸至少85％一致或互补：SEQ ID NOs:41-56，其中与在相同条件下生长时缺乏顺化基因多核苷酸的未改性对照烟草植物相比，所述改性烟草种子或烟草植物包含增强的NUE。在进一步的方面，顺化基因多核苷酸包含编码与选自下组的多核苷酸至少90％一致或互补的sRNA的多核苷酸：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，顺化基因多核苷酸包含编码与选自下组的多核苷酸至少91％一致或互补的sRNA的多核苷酸：SEQ IDNOs:41-56。在进一步的方面，顺化基因多核苷酸包含编码与选自下组的多核苷酸至少92％一致或互补的sRNA的多核苷酸：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，顺化基因多核苷酸包含编码与选自下组的多核苷酸至少93％一致或互补的sRNA的多核苷酸：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，顺化基因多核苷酸包含编码与选自下组的多核苷酸至少94％一致或互补的sRNA的多核苷酸：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，顺化基因多核苷酸包含编码与选自下组的多核苷酸至少95％一致或互补的sRNA的多核苷酸：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，顺化基因多核苷酸包含编码与选自下组的多核苷酸至少96％一致或互补的sRNA的多核苷酸：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，顺化基因多核苷酸包含编码与选自下组的多核苷酸至少97％一致或互补的sRNA的多核苷酸：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，顺化基因多核苷酸包含编码与选自下组的多核苷酸至少98％一致或互补的sRNA的多核苷酸：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，顺化基因多核苷酸包含编码与选自下组的多核苷酸至少99％一致或互补的sRNA的多核苷酸：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，顺化基因多核苷酸包含编码与选自下组的多核苷酸100％一致或互补的sRNA的多核苷酸：SEQID NOs:41-56。在进一步的方面，异源启动子选自下组：组成型启动子、诱导型启动子、组织优选启动子和组织特异性启动子。在进一步的方面，组织优选启动子是叶优选启动子。在进一步的方面，组织优选启动子是根优选启动子。
在进一步的方面，sRNA包含至少18个核苷酸。在进一步的方面，sRNA包含至少19个核苷酸。在进一步的方面，sRNA包含至少20个核苷酸。在进一步的方面，sRNA包含至少21个核苷酸。在进一步的方面，sRNA包含至少22个核苷酸。在进一步的方面，sRNA包含至少23个核苷酸。在进一步的方面，sRNA包含至少24个核苷酸。在进一步的方面，sRNA包含至少25个核苷酸。在进一步的方面，sRNA包含至少26个核苷酸。在进一步的方面，sRNA包含至少27个核苷酸。在进一步的方面，sRNA包含至少28个核苷酸。在进一步的方面，sRNA选自下组：microRNA、小干扰RNA(siRNA)、反式作用siRNA及其前体。在进一步的方面，sRNA下调选自下组的多核苷酸的表达或翻译：SEQ ID NOs:41-56。
一方面，本说明书提供并且包括一种重组DNA构建体，其包含与编码小RNA(sRNA)的多核苷酸可操作地连接的异源启动子，所述多核苷酸与选自下组的多核苷酸至少85％一致或互补：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，重组DNA构建体包含编码与选自下组的多核苷酸至少90％一致或互补的sRNA的多核苷酸：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，重组DNA构建体包含编码与选自下组的多核苷酸至少91％一致或互补的sRNA的多核苷酸：SEQID NOs:41-56。在进一步的方面，重组DNA构建体包含编码与选自下组的多核苷酸至少92％一致或互补的sRNA的多核苷酸：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，重组DNA构建体包含编码与选自下组的多核苷酸至少93％一致或互补的sRNA的多核苷酸：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，重组DNA构建体包含编码与选自下组的多核苷酸至少94％一致或互补的sRNA的多核苷酸：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，重组DNA构建体包含编码与选自下组的多核苷酸至少95％一致或互补的sRNA的多核苷酸：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，重组DNA构建体包含编码与选自下组的多核苷酸至少96％一致或互补的sRNA的多核苷酸：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，重组DNA构建体包含编码与选自下组的多核苷酸至少97％一致或互补的sRNA的多核苷酸：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，重组DNA构建体包含编码与选自下组的多核苷酸至少98％一致或互补的sRNA的多核苷酸：SEQ IDNOs:41-56。在进一步的方面，重组DNA构建体包含编码与选自下组的多核苷酸至少99％一致或互补的sRNA的多核苷酸：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，重组DNA构建体包含编码与选自下组的多核苷酸100％一致或互补的sRNA的多核苷酸：SEQ ID NOs:41-56。
一方面，本说明书提供并且包括熟化烟草材料或包含所述熟化烟草材料的烟草制品，其中所述熟化烟草材料由包含顺化基因多核苷酸的烟草植物制成，所述顺化基因多核苷酸包含与编码sRNA的多核苷酸可操作地连接的异源启动子，所述sRNA与选自下组的多核苷酸至少85％一致或互补：SEQ ID NOs:41-56，并且其中与在相同条件下生长时缺乏所述顺化基因多核苷酸的未改性对照烟草植物相比，所述改性烟草种子或烟草植物包含增强的NUE。在进一步的方面，顺化基因多核苷酸编码与选自下组的多核苷酸至少90％一致或互补的sRNA：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，顺化基因多核苷酸编码与选自下组的多核苷酸至少91％一致或互补的sRNA：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，顺化基因多核苷酸编码与选自下组的多核苷酸至少92％一致或互补的sRNA：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，顺化基因多核苷酸编码与选自下组的多核苷酸至少93％一致或互补的sRNA：SEQ IDNOs:41-56。在进一步的方面，顺化基因多核苷酸编码与选自下组的多核苷酸至少94％一致或互补的sRNA：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，顺化基因多核苷酸编码与选自下组的多核苷酸至少95％一致或互补的sRNA：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，顺化基因多核苷酸编码与选自下组的多核苷酸至少96％一致或互补的sRNA：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，顺化基因多核苷酸编码与选自下组的多核苷酸至少97％一致或互补的sRNA：SEQID NOs:41-56。在进一步的方面，顺化基因多核苷酸编码与选自下组的多核苷酸至少98％一致或互补的sRNA：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，顺化基因多核苷酸编码与选自下组的多核苷酸至少99％一致或互补的sRNA：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，顺化基因多核苷酸编码与选自下组的多核苷酸100％一致或互补的sRNA：SEQ ID NOs:41-56。
一方面，本说明书提供并且包括一种增强烟草植物的NUE的方法，其包括将顺化基因核酸分子引入烟草细胞中，并从所述烟草细胞再生改性烟草植物，其中与缺乏顺化基因核酸分子的烟草植物相比，所述改性烟草植物包含增强的NUE。另一方面，所述方法进一步包括使所述改性烟草植物与第二烟草植物杂交或使所述改性烟草植物自花授粉。
一方面，本说明书提供并且包括一种增强烟草植物的NUE的方法，其包括将对编码具有选自SEQ ID NOs:41-56的序列的基因的核酸分子的改性引入烟草细胞中，并从所述烟草细胞再生改性烟草植物，其中与缺乏改性的烟草植物相比，所述改性烟草植物包含增强的NUE。另一方面，所述方法进一步包括使改性烟草植物与第二烟草植物杂交或使改性烟草植物自花授粉。另一方面，通过包括使用RNA引导的核酸酶的方法引入改性。另一方面，RNA引导的核酸酶选自下组：Cas9核酸酶、Cpf1核酸酶、CasX核酸酶、CasY核酸酶及其功能性同源物。另一方面，改性选自下组：插入、取代、倒置和缺失。
一方面，本说明书提供并且包括一种增强烟草植物的NUE的方法，其包括将编码小RNA(sRNA)的核酸引入烟草细胞中，所述核酸与编码具有选自SEQ ID NOs:41-56的序列的基因的核酸分子的至少18个连续核酸同源，并从所述烟草细胞再生改性烟草植物，其中与缺乏sRNA的烟草植物相比，所述改性烟草植物包含增强的NUE。另一方面，所述方法进一步包括使改性烟草植物与第二烟草植物杂交或使改性烟草植物自花授粉。在进一步的方面，所述方法包括引入选自下组的sRNA：microRNA、小干扰RNA(siRNA)、反式作用siRNA及其前体。
一方面，本说明书提供并且包括一种方法，其包括提供包含增强的NUE的第一烟草植物群体，针对增强的NUE基因座的20cM内是否存在分子标志物对第一烟草植物群体进行基因分型；和选择一种或更多种经基因分型并被发现包含所述分子标志物的烟草植物。在进一步的方面，本文公开的方法包括针对增强的NUE基因座的15cM内是否存在分子标志物对第一烟草植物群体进行基因分型。在进一步的方面，本文公开的方法包括针对增强的NUE基因座的10cM内是否存在分子标志物对第一烟草植物群体进行基因分型。在进一步的方面，本文公开的方法包括针对增强的NUE基因座的9cM内是否存在分子标志物对第一烟草植物群体进行基因分型。在进一步的方面，本文公开的方法包括针对增强的NUE基因座的8cM内是否存在分子标志物对第一烟草植物群体进行基因分型。在进一步的方面，本文公开的方法包括针对增强的NUE基因座的7cM内是否存在分子标志物对第一烟草植物群体进行基因分型。在进一步的方面，本文公开的方法包括针对增强的NUE基因座的6cM内是否存在分子标志物对第一烟草植物群体进行基因分型。在进一步的方面，本文公开的方法包括针对增强的NUE基因座的5cM内是否存在分子标志物对第一烟草植物群体进行基因分型。在进一步的方面，本文公开的方法包括针对增强的NUE基因座的4cM内是否存在分子标志物对第一烟草植物群体进行基因分型。在进一步的方面，本文公开的方法包括针对增强的NUE基因座的3cM内是否存在分子标志物对第一烟草植物群体进行基因分型。在进一步的方面，本文公开的方法包括针对在增强的NUE基因座的2cM内是否存在分子标志物对第一烟草植物群体进行基因分型。在进一步的方面，本文公开的方法包括针对增强的NUE基因座的1cM内是否存在分子标志物对第一烟草植物群体进行基因分型。在进一步的方面，本文公开的方法包括针对增强的NUE基因座的0.5cM内是否存在分子标志物对第一烟草植物群体进行基因分型。在进一步的方面，所述方法包括将一个或更多个选定的烟草植物与第二烟草植物杂交；并从杂交获得后代种子。在进一步的方面，分子标志物选自下组：SNP标志物、INDEL标志物、RFLP标志物、SSR标志物、AFLP标志物和RAPD标志物。
在进一步的方面，本文提供的方法包括包含增强的NUE基因座的烟草植物，所述基因座包含编码与选自下组的多肽至少70％一致或相似的多肽的多核苷酸：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，多核苷酸编码与选自下组的多肽至少75％一致或相似的多肽：SEQ IDNOs:1-8。在进一步的方面，多核苷酸编码与选自下组的多肽至少80％一致或相似的多肽：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，多核苷酸编码与选自下组的多肽至少85％一致或相似的多肽：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，多核苷酸编码与选自下组的多肽至少90％一致或相似的多肽：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，多核苷酸编码与选自下组的多肽至少95％一致或相似的多肽：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，多核苷酸编码与选自下组的多肽至少96％一致或相似的多肽：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，多核苷酸编码与选自下组的多肽至少97％一致或相似的多肽：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，多核苷酸编码与选自下组的多肽至少98％一致或相似的多肽：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，多核苷酸编码与选自下组的多肽至少99％一致或相似的多肽：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，多核苷酸编码与选自下组的多肽100％一致的多肽：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，增强的NUE基因座与选自下组的多核苷酸序列遗传连接：SEQ ID Nos:57-64。在另一方面，增强的NUE基因座与SEQ ID NO:58的第57位的G核苷酸遗传连接。在另一方面，增强的NUE基因座与SEQ ID NO:58的第117位的C核苷酸遗传连接。在另一方面，增强的NUE基因座与SEQ IDNO:58的第57位的G核苷酸和第117位的C核苷酸遗传连接。在另一方面，增强的NUE基因座与SEQ ID NO:57的第147位的T核苷酸遗传连接。在另一方面，增强的NUE基因座与SEQ ID NO:59的第162位的G核苷酸遗传连接。在另一方面，增强的NUE基因座与SEQ ID NO:60的第36位的C核苷酸遗传连接。在另一方面，增强的NUE基因座与SEQ ID NO:61的第36位的T核苷酸遗传连接。在另一方面，增强的NUE基因座与SEQ ID NO:62的第36位的T核苷酸遗传连接。在另一方面，增强的NUE基因座与SEQ ID NO:63的第36位的G核苷酸遗传连接。在另一方面，增强的NUE基因座与SEQ ID NO:64的第36位的T核苷酸遗传连接。
在一个方面，本说明书提供并包括熟化烟草材料或包含熟化烟草材料的烟草产品，其中熟化烟草材料由烟草植物制成，所述烟草植物包含黄白肋烟1(YB1)基因座的至少一个功能性等位基因和与选自SEQ ID NO：57-64的一个或更多个分子标志物处的增强的NUE相关的至少一个等位基因，其中增强的NUE是相对于在相同条件下生长时不具有YB1基因座的至少一个功能性等位基因并且不具有选自SEQ ID NO：57-64的一个或更多个分子标志物的对照烟草植物而言。在另一方面，烟草植物包含至少两种与选自SEQ ID NO：57-64的增强的NUE相关的分子标志物。在另一方面，烟草植物包含至少三种与选自SEQ ID NO：57-64的增强的NUE相关的分子标志物。在另一方面，烟草植物包含至少四种与选自SEQ ID NO：57-64的增强的NUE相关的分子标志物。在另一方面，烟草植物包含至少五种与选自SEQ IDNO：57-64的增强的NUE相关的分子标志物。在另一方面，烟草植物包含至少六种与选自SEQID NO：57-64的增强的NUE相关的分子标志物。在另一方面，烟草植物包含至少七种与选自SEQ ID NO：57-64的增强的NUE相关的分子标志物。在另一方面，烟草植物包含至少八种与选自SEQ ID NO：57-64的增强的NUE相关的分子标志物。在另一方面，烟草植物包含至少九种与选自SEQ ID NO：57-64的增强的NUE相关的分子标志物。在另一方面，烟草植物包含至少十种与选自SEQ ID NO：57-64的增强的NUE相关的分子标志物。在另一方面，分子标志物选自下组：SNP标志物、INDEL标志物、RFLP标志物、SSR标志物、AFLP标志物和RAPD标志物。在另一方面，所述熟化烟草材料或由其衍生的产品还包含YB2基因座的至少一个功能性等位基因。
在一个方面，本说明书提供并包括熟化烟草材料或包含熟化烟草材料的烟草产品，其中熟化烟草材料由包含增强的NUE的烟草植物制成，并且其中烟草植物包含YB1基因座的至少一个功能性等位基因，并且在位于选自下组的序列的20cM内的一个或更多个分子标志物处包含与增强的NUE相关的至少一个等位基因：SEQ ID NOs:57、58、59、60、61、62、63和64。在另一方面，烟草植物在位于选自下组的序列的15cM内的一个或更多个分子标志物处包含与增强的NUE相关的至少一个等位基因：SEQ ID NOs:57-64。在另一方面，烟草植物在位于选自下组的序列的10cM内的一个或更多个分子标志物处包含与增强的NUE相关的至少一个等位基因：SEQ ID NOs:57-64。在另一方面，烟草植物在位于选自下组的序列的9cM内的一个或更多个分子标志物处包含与增强的NUE相关的至少一个等位基因：SEQ ID NOs:57-64。在另一方面，烟草植物在位于选自下组的序列的8cM内的一个或更多个分子标志物处包含与增强的NUE相关的至少一个等位基因：SEQ ID NOs:57-64。在另一方面，烟草植物在位于选自下组的序列的7cM内的一个或更多个分子标志物处包含与增强的NUE相关的至少一个等位基因：SEQ ID NOs:57-64。在另一方面，烟草植物在位于选自下组的序列的6cM内的一个或更多个分子标志物处包含与增强的NUE相关的至少一个等位基因：SEQ ID NOs:57-64。在另一方面，烟草植物在位于选自下组的序列的5cM内的一个或更多个分子标志物处包含与增强的NUE相关的至少一个等位基因：SEQ ID NOs:57-64。在另一方面，烟草植物在位于选自下组的序列的4cM内的一个或更多个分子标志物处包含与增强的NUE相关的至少一个等位基因：SEQ ID NOs:57-64。在另一方面，烟草植物在位于选自下组的序列的3cM内的一个或更多个分子标志物处包含与增强的NUE相关的至少一个等位基因：SEQ ID NOs:57-64。在另一方面，烟草植物在位于选自下组的序列的2cM内的一个或更多个分子标志物处包含与增强的NUE相关的至少一个等位基因：SEQ ID NOs:57-64。在另一方面，烟草植物在位于选自下组的序列的1cM内的一个或更多个分子标志物处包含与增强的NUE相关的至少一个等位基因：SEQ ID NOs:57-64。在另一方面，烟草植物在位于选自下组的序列的0.5cM内的一个或更多个分子标志物处包含与增强的NUE相关的至少一个等位基因：SEQ IDNOs:57-64。在另一方面，分子标志物选自下组：SNP标志物、INDEL标志物、RFLP标志物、SSR标志物、AFLP标志物和RAPD标志物。
在另一方面，包含YB1基因座的至少一个功能性等位基因的烟草植物对于YB1基因座的功能性等位基因是纯合的。在另一方面，烟草植物还包含YB2基因座的至少一个功能性等位基因。在另一方面，烟草植物对于YB2基因座的功能性等位基因是纯合的。
在另一方面，本说明书提供并包括熟化烟草材料或包含熟化烟草材料的烟草产品，其中熟化烟草材料由双单倍体烟草植物制成。
在一个方面，本说明书提供并包括熟化烟草材料或包含熟化烟草材料的烟草产品，其中熟化烟草材料由包含增强的NUE的烟草植物制成，并且其中烟草植物包含YB1基因座的至少一个功能性等位基因，并且在位于选自下组的序列的5,000,000个核苷酸内的一个或更多个分子标志物处包含与增强的NUE相关的至少一个等位基因：SEQ ID NOs:57、58、59、60、61、62、63和64。在另一个方面，烟草植物在位于选自下组的序列的2,500,000个核苷酸内的一个或更多个分子标志物处包含与增强的NUE相关的至少一个等位基因：SEQ IDNOs:57-64。在另一个方面，烟草植物在位于选自下组的序列的1,250,000个核苷酸内的一个或更多个分子标志物处包含与增强的NUE相关的至少一个等位基因：SEQ ID NOs:57-64。在另一个方面，烟草植物在位于选自下组的序列的1,000,000个核苷酸内的一个或更多个分子标志物处包含与增强的NUE相关的至少一个等位基因：SEQ ID NOs:57-64。在另一个方面，烟草植物在位于选自下组的序列的500,000个核苷酸内的一个或更多个分子标志物处包含与增强的NUE相关的至少一个等位基因：SEQ ID NOs:57-64。在另一个方面，烟草植物在位于选自下组的序列的400,000个核苷酸内的一个或更多个分子标志物处包含与增强的NUE相关的至少一个等位基因：SEQ ID NOs:57-64。在另一个方面，烟草植物在位于选自下组的序列的300,000个核苷酸内的一个或更多个分子标志物处包含与增强的NUE相关的至少一个等位基因：SEQ ID NOs:57-64。在另一个方面，烟草植物在位于选自下组的序列的200,000个核苷酸内的一个或更多个分子标志物处包含与增强的NUE相关的至少一个等位基因：SEQ ID NOs:57-64。在另一个方面，烟草植物在位于选自下组的序列的100,000个核苷酸内的一个或更多个分子标志物处包含与增强的NUE相关的至少一个等位基因：SEQ IDNOs:57-64。在另一个方面，烟草植物在位于选自下组的序列的80,000个核苷酸内的一个或更多个分子标志物处包含与增强的NUE相关的至少一个等位基因：SEQ ID NOs:57-64。在另一个方面，烟草植物在位于选自下组的序列的60,000个核苷酸内的一个或更多个分子标志物处包含与增强的NUE相关的至少一个等位基因：SEQ ID NOs:57-64。在另一个方面，烟草植物在位于选自下组的序列的40,000个核苷酸内的一个或更多个分子标志物处包含与增强的NUE相关的至少一个等位基因：SEQ ID NOs:57-64。在另一个方面，烟草植物在位于选自下组的序列的20,000个核苷酸内的一个或更多个分子标志物处包含与增强的NUE相关的至少一个等位基因：SEQ ID NOs:57-64。在另一个方面，烟草植物在位于选自下组的序列的10,000个核苷酸内的一个或更多个分子标志物处包含与增强的NUE相关的至少一个等位基因：SEQ ID NOs:57-64。在另一个方面，烟草植物在位于选自下组的序列的5,000个核苷酸内的一个或更多个分子标志物处包含与增强的NUE相关的至少一个等位基因：SEQ ID NOs:57-64。在另一个方面，烟草植物在位于选自下组的序列的2,500个核苷酸内的一个或更多个分子标志物处包含与增强的NUE相关的至少一个等位基因：SEQ ID NOs:57-64。在另一个方面，烟草植物在位于选自下组的序列的1,000个核苷酸内的一个或更多个分子标志物处包含与增强的NUE相关的至少一个等位基因：SEQ ID NOs:57-64。在另一个方面，烟草植物在位于选自下组的序列的800个核苷酸内的一个或更多个分子标志物处包含与增强的NUE相关的至少一个等位基因：SEQ ID NOs:57-64。在另一个方面，烟草植物在位于选自下组的序列的600个核苷酸内的一个或更多个分子标志物处包含与增强的NUE相关的至少一个等位基因：SEQ ID NOs:57-64。在另一个方面，烟草植物在位于选自下组的序列的400个核苷酸内的一个或更多个分子标志物处包含与增强的NUE相关的至少一个等位基因：SEQ IDNOs:57-64。在另一个方面，烟草植物在位于选自下组的序列的200个核苷酸内的一个或更多个分子标志物处包含与增强的NUE相关的至少一个等位基因：SEQ ID NOs:57-64。在另一个方面，烟草植物在位于选自下组的序列的100个核苷酸内的一个或更多个分子标志物处包含与增强的NUE相关的至少一个等位基因：SEQ ID NOs:57-64。在另一方面，分子标志物选自下组：SNP标志物、INDEL标志物、RFLP标志物、SSR标志物、AFLP标志物和RAPD标志物。
在一个方面，本说明书提供并包括产生包含提高的氮利用效率(NUE)的烟草植物或烟草植物群体的方法。在一个方面，所述方法包括提供包含至少一种增强的NUE性状的第一烟草植物群体和缺乏至少一种增强的NUE性状的第二烟草植物群体。在另一个方面，所述方法还包括针对在与包含选自SEQ ID NOs:57、58、59、60、61、62、63和64的序列的增强的NUE相关的等位基因的20cM内一个或更多个分子标志物的存在对第一烟草植物群体进行基因分型。在另一方面，所述方法还包括选择基因分型的第一烟草植物群体的一种或更多种烟草植物，所述基因分型的第一烟草植物群体在与包含选自SEQ ID NO：57-64的序列的增强的NUE相关的等位基因的20cM内包含一个或更多个分子标志物。在另一方面，所述方法还包括对包含黄白肋烟1(YB1)基因座的至少一个功能性等位基因的第二烟草植物群体进行基因分型。在另一方面，所述方法还包括选择包含黄色白肋烟1(YB1)基因座的至少一个功能性等位基因的基因分型的第二烟草植物群体的一种或更多种烟草植物。在另一个方面，所述方法还包括将至少一种选自基因分型的所选的第一群体的植物与至少一种基因分型的所选的第二烟草植物群体的植物杂交，所述第一群体在与包含选自SEQ ID NO：57-64的序列的增强的NUE相关的等位基因的20cM内包含一个或更多个分子标志物，所述第二烟草植物群体包含黄白肋烟1(YB1)基因座的至少一种功能性等位基因。在一个方面，所述方法还包括产生后代烟草植物或烟草种子。在一个方面，所述方法还包括获得包含增强的NUE性状、与增强的NUE相关的一个或更多个分子标志物和YB1基因座的至少一个功能性等位基因的后代植物或后代种子。在另一方面，第一烟草植物群体对于与增强的NUE相关的等位基因是纯合的。在另一方面，第二烟草植物群体对于黄色白肋烟1(YB1)基因座处的功能性等位基因是纯合的。在另一个方面，还测定后代烟草植物的黄白肋烟2(YB2)基因座的至少一个功能性等位基因。在另一方面，还针对YB2基因座的至少一个功能性等位基因选择后代烟草植物。
在一个方面，本说明书提供并包括产生包含提高的氮利用效率(NUE)的烟草植物或烟草植物群体的方法。在一个方面，所述方法包括提供包含至少一种增强的NUE性状的第一烟草植物群体和具有至少一种增强的NUE性状的第二烟草植物群体。在另一个方面，所述方法还包括针对在与包含选自SEQ ID NOs:57、58、59、60、61、62、63和64的序列的增强的NUE相关的等位基因的5,000,000个核苷酸内一个或更多个分子标志物的存在对第一烟草植物群体进行基因分型。在另一方面，所述方法还包括选择基因分型的第一烟草植物群体的一个或更多个烟草植物，所述基因分型的第一烟草植物群体在与包含选自SEQ ID NO：57-64的序列的增强的NUE相关的等位基因的5,000,000个核苷酸内包含一个或更多个分子标志物。在另一方面，所述方法还包括对包含黄白肋烟1(YB1)基因座的至少一个功能性等位基因的第二烟草植物群体进行基因分型。在另一方面，所述方法还包括选择包含黄色白肋烟1(YB1)基因座的至少一个功能性等位基因的基因分型的第二烟草植物群体的一个或更多个烟草植物。在另一个方面，所述方法还包括将至少一种选自基因分型的所选的第一群体的植物与至少一种基因分型的所选的第二烟草植物群体的植物杂交，所述第一群体在与包含选自SEQ ID NO：57-64的序列的增强的NUE相关的等位基因的5,000,000个核苷酸内包含一个或更多个分子标志物，所述第二烟草植物群体包含黄白肋烟1(YB1)基因座的至少一种功能性等位基因。在一个方面，所述方法还包括获得包含增强的NUE性状、与增强的NUE相关的一个或更多个分子标志物和YB1基因座的至少一个功能性等位基因的后代植物或后代种子。在另一方面，第一烟草植物群体对于与增强的NUE相关的等位基因是纯合的。在另一方面，第二烟草植物群体对于黄色白肋烟1(YB1)基因座处的功能性等位基因是纯合的。在另一个方面，还测定后代烟草植物的黄白肋烟2(YB2)基因座的至少一个功能性等位基因。在另一方面，第二烟草植物群体还包含YB2基因座的至少一个功能性等位基因。
在另一方面，本说明书提供并包括产生包含提高的氮利用效率(NUE)的双单倍体烟草植物或双单倍体烟草植物群体的方法。
在一个方面，本说明书提供并包括产生包含提高的氮利用效率(NUE)的烟草植物或烟草植物群体的方法。在一个方面，所述方法还包括提供包含至少一种增强的NUE性状的第一烟草植物群体和缺乏至少一种增强的NUE性状的第二烟草植物群体。在一个方面，所述方法还包括针对在与包含选自SEQ ID NO：57-64的序列的增强的NUE相关的等位基因的20cM内一个或更多个分子标志物的存在对第一烟草植物群体进行基因分型。在一个方面，所述方法还包括选择基因分型的第一烟草植物群体的一种或更多种烟草植物，所述基因分型的第一烟草植物群体在与包含选自SEQ ID NO：57-64的序列的增强的NUE相关的等位基因的20cM内包含一个或更多个分子标志物。在一个方面，所述方法还包括将第一选择的基因分型群体的至少一种植物与不包含所述至少一种增强的NUE性状的第二群体的至少一种植物杂交。在一个方面，所述方法还包括获得包含增强的NUE性状、与增强的NUE相关的一个或更多个分子标志物和黄白肋烟1基因座的至少一个功能性等位基因的后代植物或后代种子。在另一方面，获得的后代植物或种子进一步包含YB2基因座的至少一个功能性等位基因。
在一个方面，本说明书提供并包括产生包含提高的氮利用效率(NUE)的烟草植物或烟草植物群体的方法。在一个方面，所述方法还包括提供包含至少一种增强的NUE性状的第一烟草植物群体和缺乏至少一种增强的NUE性状的第二烟草植物群体。在一个方面，所述方法还包括针对在与包含选自SEQ ID NO：57-64的序列的增强的NUE相关的等位基因的5,000,000个核苷酸内一个或更多个分子标志物的存在对第一烟草植物群体进行基因分型。在一个方面，所述方法还包括选择基因分型的第一烟草植物群体的一种或更多种烟草植物，所述基因分型的第一烟草植物群体在与包含选自SEQ ID NO：57-64的序列的增强的NUE相关的等位基因的5,000,000个核苷酸内包含一个或更多个分子标志物。在一个方面，所述方法还包括将第一选择的基因分型群体的至少一种植物与不包含所述至少一种增强的NUE性状的第二群体的至少一种植物杂交。在一个方面，所述方法还包括获得包含增强的NUE性状、与增强的NUE相关的一个或更多个分子标志物和黄白肋烟1基因座的至少一个功能性等位基因的后代植物或后代种子。在另一方面，获得的后代植物或种子进一步包含YB2基因座的至少一个功能性等位基因。
在一个方面，本说明书提供并包括一种方法，所述方法包括提供包含增强的NUE的第一烟草植物群体，针对增强的NUE基因座的5,000,000个核苷酸内分子标志物的存在对第一烟草植物群体进行基因分型；以及选择经基因分型并发现其包含所述分子标志物的一种或更多种烟草植物。在另一方面，本文公开的方法包括针对增强的NUE基因座的2,500,000个核苷酸内分子标志物的存在对第一烟草植物群体进行基因分型。在另一方面，本文公开的方法包括针对增强的NUE基因座的2,000,000个核苷酸内分子标志物的存在对第一烟草植物群体进行基因分型。在另一方面，本文公开的方法包括针对增强的NUE基因座的1,250,000个核苷酸内分子标志物的存在对第一烟草植物群体进行基因分型。在另一方面，本文公开的方法包括针对增强的NUE基因座的1,000,000个核苷酸内分子标志物的存在对第一烟草植物群体进行基因分型。在另一方面，本文公开的方法包括针对增强的NUE基因座的750,000个核苷酸内分子标志物的存在对第一烟草植物群体进行基因分型。在另一方面，本文公开的方法包括针对增强的NUE基因座的500,000个核苷酸内分子标志物的存在对第一烟草植物群体进行基因分型。在另一方面，本文公开的方法包括针对增强的NUE基因座的400,000个核苷酸内分子标志物的存在对第一烟草植物群体进行基因分型。在另一方面，本文公开的方法包括针对增强的NUE基因座的300,000个核苷酸内分子标志物的存在对第一烟草植物群体进行基因分型。在另一方面，本文公开的方法包括针对增强的NUE基因座的200,000个核苷酸内分子标志物的存在对第一烟草植物群体进行基因分型。在另一方面，本文公开的方法包括针对增强的NUE基因座的100,000个核苷酸内分子标志物的存在对第一烟草植物群体进行基因分型。在另一方面，本文公开的方法包括针对增强的NUE基因座的80,000个核苷酸内分子标志物的存在对第一烟草植物群体进行基因分型。在另一方面，本文公开的方法包括针对增强的NUE基因座的60,000个核苷酸内分子标志物的存在对第一烟草植物群体进行基因分型。在另一方面，本文公开的方法包括针对增强的NUE基因座的40,000个核苷酸内分子标志物的存在对第一烟草植物群体进行基因分型。在另一方面，本文公开的方法包括针对增强的NUE基因座的20,000个核苷酸内分子标志物的存在对第一烟草植物群体进行基因分型。在另一方面，本文公开的方法包括针对增强的NUE基因座的10,000个核苷酸内分子标志物的存在对第一烟草植物群体进行基因分型。在另一方面，本文公开的方法包括针对增强的NUE基因座的5,000个核苷酸内分子标志物的存在对第一烟草植物群体进行基因分型。在另一方面，本文公开的方法包括针对增强的NUE基因座的2,500个核苷酸内分子标志物的存在对第一烟草植物群体进行基因分型。在另一方面，本文公开的方法包括针对增强的NUE基因座的1,000个核苷酸内分子标志物的存在对第一烟草植物群体进行基因分型。在另一方面，本文公开的方法包括针对增强的NUE基因座的800个核苷酸内分子标志物的存在对第一烟草植物群体进行基因分型。在另一方面，本文公开的方法包括针对增强的NUE基因座的600个核苷酸内分子标志物的存在对第一烟草植物群体进行基因分型。在另一方面，本文公开的方法包括针对增强的NUE基因座的400个核苷酸内分子标志物的存在对第一烟草植物群体进行基因分型。在另一方面，本文公开的方法包括针对增强的NUE基因座的200个核苷酸内分子标志物的存在对第一烟草植物群体进行基因分型。在另一方面，本文公开的方法包括针对增强的NUE基因座的100个核苷酸内分子标志物的存在对第一烟草植物群体进行基因分型。
在另一方面，所述方法包括使一种或更多种选择的烟草植物与第二烟草植物杂交；以及从该杂交获得后代种子。在另一方面，分子标志物选自下组：SNP标志物、INDEL标志物、RFLP标志物、SSR标志物、AFLP标志物和RAPD标志物。
在本文提供的方法的另一方面，第一烟草植物群体是马里兰品种。在另一方面，本文提供的方法包括选自下组的马里兰烟草品种的第一烟草植物群体：Md 10,Md 14D2,Md21,Md 40,Md 59,Md 64,Md 201,Md 341,Md 402,Md 601,Md 609,Md 872,Md Mammoth,Banket A1,K326,K346,K358,K394,K399,K730,NC196,NC37NF,NC471,NC55,NC92,NC2326,NC95和NC925。在另一方面，本文提供的方法包括白肋烟品种的第二烟草植物群体。在另一方面，本文提供的方法包括选自下组的品种的第二烟草植物群体：TN86,TN86LC,TN90,TN90LC,TN97,TN97LC。在另一方面，本文提供的方法包括包含TN90植物的野生型白肋烟品种。
在另一方面，本文提供的方法包括含有分子标志物的后代种子。在另一方面，本文提供的方法包括含有增强的NUE的后代种子。在另一方面，本文提供的方法包括后代种子，其包含在本文提供的增强的NUE效率基因座的5,000,000个核苷酸内的分子标志物。另一方面，本文提供的方法包括后代种子，其包含在本文提供的增强的NUE效率基因座的2,500,000个核苷酸内的分子标志物。另一方面，本文提供的方法包括后代种子，其包含在本文提供的增强的NUE效率基因座的1,250,000个核苷酸内的分子标志物。另一方面，本文提供的方法包括后代种子，其包含在本文提供的增强的NUE效率基因座的1,000,000个核苷酸内的分子标志物。另一方面，本文提供的方法包括后代种子，其包含在本文提供的增强的NUE效率基因座的750,000个核苷酸内的分子标志物。另一方面，本文提供的方法包括后代种子，其包含在本文提供的增强的NUE效率基因座的500,000个核苷酸内的分子标志物。另一方面，本文提供的方法包括后代种子，其包含在本文提供的增强的NUE效率基因座的400,000个核苷酸内的分子标志物。另一方面，本文提供的方法包括后代种子，其包含在本文提供的增强的NUE效率基因座的300,000个核苷酸内的分子标志物。另一方面，本文提供的方法包括后代种子，其包含在本文提供的增强的NUE效率基因座的200,000个核苷酸内的分子标志物。另一方面，本文提供的方法包括后代种子，其包含在本文提供的增强的NUE效率基因座的100,000个核苷酸内的分子标志物。另一方面，本文提供的方法包括后代种子，其包含在本文提供的增强的NUE效率基因座的80,000个核苷酸内的分子标志物。另一方面，本文提供的方法包括后代种子，其包含在本文提供的增强的NUE效率基因座的60,000个核苷酸内的分子标志物。另一方面，本文提供的方法包括后代种子，其包含在本文提供的增强的NUE效率基因座的40,000个核苷酸内的分子标志物。另一方面，本文提供的方法包括后代种子，其包含在本文提供的增强的NUE效率基因座的20,000个核苷酸内的分子标志物。另一方面，本文提供的方法包括后代种子，其包含在本文提供的增强的NUE效率基因座的10,000个核苷酸内的分子标志物。另一方面，本文提供的方法包括后代种子，其包含在本文提供的增强的NUE效率基因座的5,000个核苷酸内的分子标志物。另一方面，本文提供的方法包括后代种子，其包含在本文提供的增强的NUE效率基因座的2,500个核苷酸内的分子标志物。另一方面，本文提供的方法包括后代种子，其包含在本文提供的增强的NUE效率基因座的1,000个核苷酸内的分子标志物。另一方面，本文提供的方法包括后代种子，其包含在本文提供的增强的NUE效率基因座的800个核苷酸内的分子标志物。另一方面，本文提供的方法包括后代种子，其包含在本文提供的增强的NUE效率基因座的600个核苷酸内的分子标志物。另一方面，本文提供的方法包括后代种子，其包含在本文提供的增强的NUE效率基因座的400个核苷酸内的分子标志物。另一方面，本文提供的方法包括后代种子，其包含在本文提供的增强的NUE效率基因座的200个核苷酸内的分子标志物。另一方面，本文提供的方法包括后代种子，其包含在本文提供的增强的NUE效率基因座的100个核苷酸内的分子标志物。
在一个方面，本说明书提供并包括选择具有增强的NUE性状的烟草植物的方法，其包括从至少一种烟草植物分离核酸，测定分离的核酸中位于选自SEQ ID NO：57-64的与增强的NUE相关的一个或更多个等位基因的5,000,000个核苷酸内的一个或更多个分子标志物，测定分离的核酸中黄白肋烟1(YB1)基因座的至少一个功能性等位基因，以及选择包含增强的NUE性状、与增强的NUE相关的一个或更多个等位基因和YB1基因座的至少一个功能性等位基因的烟草植物。在另一方面，所选烟草植物还包含YB2基因座的至少一个功能性等位基因。
在一个方面，本说明书提供并包括选择具有增强的NUE性状的烟草植物的方法，其包括从至少一种烟草植物分离核酸，测定分离的核酸中位于选自SEQ ID NO：57-64的与增强的NUE相关的一个或更多个等位基因的5,000,000个核苷酸内的一个或更多个分子标志物，测定分离的核酸中黄白肋烟2(YB2)基因座的至少一个功能性等位基因，以及选择包含增强的NUE性状、与增强的NUE相关的一个或更多个等位基因和YB2基因座的至少一个功能性等位基因的烟草植物。
在另一方面，本文公开的方法包括将包含增强的NUE性状、与增强的NUE相关的一个或更多个等位基因和YB1基因座的至少一个功能性等位基因的所选烟草植物与不包含增强的NUE性状的第二烟草植物杂交，并获得后代植物或后代种子。
在另一方面，本文公开的方法包括将包含增强的NUE性状、与增强的NUE相关的一个或更多个等位基因和YB2基因座的至少一个功能性等位基因的所选烟草植物与不包含增强的NUE性状的第二烟草植物杂交，并获得后代植物或后代种子。
在另一个方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中位于选自SEQ ID NO：57-64的与增强的NUE相关的一个或更多个等位基因的2,500,000个核苷酸内的一个或更多个分子标志物。在另一个方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中位于选自SEQ ID NO：57-64的与增强的NUE相关的一个或更多个等位基因的2,000,000个核苷酸内的一个或更多个分子标志物。在另一个方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中位于选自SEQ IDNO：57-64的与增强的NUE相关的一个或更多个等位基因的1,250,000个核苷酸内的一个或更多个分子标志物。在另一个方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中位于选自SEQID NO：57-64的与增强的NUE相关的一个或更多个等位基因的1,000,000个核苷酸内的一个或更多个分子标志物。在另一个方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中位于选自SEQID NO：57-64的与增强的NUE相关的一个或更多个等位基因的750,000个核苷酸内的一个或更多个分子标志物。在另一个方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中位于选自SEQID NO：57-64的与增强的NUE相关的一个或更多个等位基因的500,000个核苷酸内的一个或更多个分子标志物。在另一个方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中位于选自SEQID NO：57-64的与增强的NUE相关的一个或更多个等位基因的400,000个核苷酸内的一个或更多个分子标志物。在另一个方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中位于选自SEQID NO：57-64的与增强的NUE相关的一个或更多个等位基因的300,000个核苷酸内的一个或更多个分子标志物。在另一个方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中位于选自SEQID NO：57-64的与增强的NUE相关的一个或更多个等位基因的200,000个核苷酸内的一个或更多个分子标志物。在另一个方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中位于选自SEQID NO：57-64的与增强的NUE相关的一个或更多个等位基因的100,000个核苷酸内的一个或更多个分子标志物。在另一个方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中位于选自SEQID NO：57-64的与增强的NUE相关的一个或更多个等位基因的80,000个核苷酸内的一个或更多个分子标志物。在另一个方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中位于选自SEQID NO：57-64的与增强的NUE相关的一个或更多个等位基因的60,000个核苷酸内的一个或更多个分子标志物。在另一个方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中位于选自SEQID NO：57-64的与增强的NUE相关的一个或更多个等位基因的40,000个核苷酸内的一个或更多个分子标志物。在另一个方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中位于选自SEQID NO：57-64的与增强的NUE相关的一个或更多个等位基因的20,000个核苷酸内的一个或更多个分子标志物。在另一个方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中位于选自SEQID NO：57-64的与增强的NUE相关的一个或更多个等位基因的10,000个核苷酸内的一个或更多个分子标志物。在另一个方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中位于选自SEQID NO：57-64的与增强的NUE相关的一个或更多个等位基因的5,000个核苷酸内的一个或更多个分子标志物。在另一个方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中位于选自SEQ IDNO：57-64的与增强的NUE相关的一个或更多个等位基因的2,500个核苷酸内的一个或更多个分子标志物。在另一个方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中位于选自SEQ IDNO：57-64的与增强的NUE相关的一个或更多个等位基因的1,000个核苷酸内的一个或更多个分子标志物。在另一个方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中位于选自SEQ IDNO：57-64的与增强的NUE相关的一个或更多个等位基因的800个核苷酸内的一个或更多个分子标志物。在另一个方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中位于选自SEQ ID NO：57-64的与增强的NUE相关的一个或更多个等位基因的600个核苷酸内的一个或更多个分子标志物。在另一个方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中位于选自SEQ ID NO：57-64的与增强的NUE相关的一个或更多个等位基因的400个核苷酸内的一个或更多个分子标志物。在另一个方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中位于选自SEQ ID NO：57-64的与增强的NUE相关的一个或更多个等位基因的200个核苷酸内的一个或更多个分子标志物。在另一个方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中位于选自SEQ ID NO：57-64的与增强的NUE相关的一个或更多个等位基因的100个核苷酸内的一个或更多个分子标志物。
在一个方面，本说明书提供并包括一种方法，所述方法包括产生或选择烟草植物或烟草植物群体，相对于对照植物或对照植物群体，所述烟草植物或烟草植物群体包含选自下组的一种或更多种性状：(i)当以180lbs氮/英亩的推荐白肋烟施肥率生长时从植物的顶部到底部表现出更加一致的叶等级，(ii)来自植物下半部的叶中增加的叶等级指数；(iii)增加的氮利用效率，(iv)降低的叶硝酸盐氮(NO3-N)，(v)降低的TSNA水平，和(vi)缺乏叶绿素缺陷型表型。在另一方面，所述方法包括产生或选择烟草植物或烟草植物群体，相对于对照植物或对照植物群体，所述烟草植物或烟草植物群体包含选自下组的两种或更多种性状：(i)当以180lbs氮/英亩的推荐白肋烟施肥率生长时从植物的顶部到底部表现出更加一致的叶等级，(ii)来自植物下半部的叶中增加的叶等级指数；(iii)增加的氮利用效率，(iv)降低的叶硝酸盐氮(NO3-N)，(v)降低的TSNA水平，和(vi)缺乏叶绿素缺陷型表型。在另一方面，所述方法包括产生或选择烟草植物或烟草植物群体，相对于对照植物或对照植物群体，所述烟草植物或烟草植物群体包含选自下组的三种或更多种性状：(i)当以180lbs氮/英亩的推荐白肋烟施肥率生长时从植物的顶部到底部表现出更加一致的叶等级，(ii)来自植物下半部的叶中增加的叶等级指数；(iii)增加的氮利用效率，(iv)降低的叶硝酸盐氮(NO3-N)，(v)降低的TSNA水平，和(vi)缺乏叶绿素缺陷型表型。在另一方面，所述方法包括产生或选择烟草植物或烟草植物群体，相对于对照植物或对照植物群体，所述烟草植物或烟草植物群体包含选自下组的四种或更多种性状：(i)当以180lbs氮/英亩的推荐白肋烟施肥率生长时从植物的顶部到底部表现出更加一致的叶等级，(ii)来自植物下半部的叶中增加的叶等级指数；(iii)增加的氮利用效率，(iv)降低的叶硝酸盐氮(NO3-N)，(v)降低的TSNA水平，和(vi)缺乏叶绿素缺陷型表型。
氮利用效率
如本文所用，术语“氮利用效率”(NUE)是指植物吸收、同化和/或使用氮(例如来自土壤、水和/或氮肥)的能力。NUE基因影响产量，并具有改进作物植物中氮利用的功效。增强的氮利用效率可归因于氮肥的吸收和同化和/或随后对积累的氮储量的再流动和再利用的提高，以及植物对胁迫条件(例如低氮环境)的耐受性增加。NUE基因可用于改变植物的遗传组成，使其在当前的肥料施用标准下提高生产率，或在显著减少肥料或减少氮利用率下维持其生产率。
如本文所用，术语“氮利用效率”是指氮利用效率的分量。已经提出，在烟草中，氮利用效率可以测量为等于以千克每公顷计的熟化叶产量除以以千克每公顷计的植物中的总氮累积(参见Lewis et al.(2012)J.Agric.Food Chem.,60,6454-6461)。
白肋烟需要大量添加氮肥以提供最佳产量(例如参见图9，与90lbs N相比，180lbsN下的白肋烟)。另一方面，马里兰烟需要通常用于栽培白肋烟的氮肥水平的约25％。肥料是烟草栽培中涉及的主要成本，并且高水平的氮可导致含氮组分(如生物碱和TSNA)的增加。还发现已知赋予白肋烟其特征性白茎和较低叶绿素含量的两个基因座有助于其较低的氮利用效率、较高的硝酸盐水平、较低的碳水化合物含量和较高的组分水平(Lewis et al.(2012)J.Agric.Food Chem.,60,6454-6461and Yafei Li,et al.(2018)Sci.Rep.,8:13300)。这些基因座命名为黄白肋烟1(YB1)和黄白肋烟2(YB2)。对功能基因作图并发现是拟南芥属乙烯依赖性向重力缺陷型和黄绿样(EGY)基因的同源物，它们在商业白肋烟品系中突变(Edwards et al.(2017)BMC Genomics,18:448)。在染色体5和24上发现了这些基因，它们的位置与先前描述的有助于马里兰NUE表型的基因座不相关。
发现马里兰烟在yb2基因座具有非功能性白肋烟等位基因，而在yb1基因座保留功能性等位基因。令人惊讶地，当与先前在马里兰烟中发现的增强的NUE标志物组合时，发现YB1基因座处野生型等位基因的纯合或杂合的植物显示出增强的NUE表型。示例性实施方案包括产生双单倍体(DH)亲本植物，其在YB1基因座处具有纯合的功能性等位基因(YB1/YB1)、在YB2基因座处具有纯合的非功能性等位基因(yb2/yb2)和在染色体11基因座处具有纯合的马里兰等位基因(MD11/MD11，与在染色体11的白肋等位基因相比，Bu11)。这些植物保留了马里兰NUE性状，而在表型上类似白肋烟。
具有NUE基因型和表型的DH植物用作花粉亲本，用于产生具有可获得的白肋烟雄性不育系的商业杂种，从而产生YB1/yb1、yb2/yb2和MD11/Bu11或MD11/MD11的基因型。这些杂种保持马里兰NUE性状，表型上类似白肋烟草，并且具有比马里兰烟更接近白肋烟的吸烟质量特征。这些新品系代表生产氮效率白肋烟的新进展。本文提供了用于具有改进的NUE的白肋烟的方法和组合物。
尽管已经以各种方式定义了NUE，但是土壤中每单位可获得的氮的产量整合了用于评估作物栽培品种的适应性的所有关键参数，并且其是NUE的常用度量。例如，参见Ladha等，2005.Advances in Agronomy,87:85-156，其全部并入本文。该指标有时称为“农业NUE”。作为NUE的另一种度量，可以测定植物产品(例如烟叶组织)与植物中地上氮的比率(有时称为“生理NUE”)。增强的NUE与三个关键成分有关：1)与在100％正常氮含量下生长的植物相比，当在25％正常氮含量下生长时，产量没有明显差异；2)与不具有增强的NUE的植物相比，叶绿素损失率降低；3)与在100％正常氮含量下生长的植物相比，当在25％正常氮含量下生长时，熟化叶质量没有明显差异。在优选的方面，与在100％正常白肋施肥率下生长的白肋植物相比，当在25％白肋施肥率下生长时，具有增强的NUE的植物能够产生相似的产量和叶质量。
至少五种NUE的途径和指标用于本领域，并在下文讨论。
(1)来自所施用的氮(N)的偏要素生产率(PFP)是对所施用的每单位氮产生多少产量的度量：
PFPN＝产量(千克)/所施用的N(千克)
PFPN＝Y+N/FN
其中Y+N是是产量(千克/公顷；kg/ha)，FN是施肥量(kg/ha)。
(2)所施用的氮(N)的农学效率(AE)是对于所施用的每单位氮产生多少额外产量的度量：
AEN＝产量增加(千克)/所施用的N(千克)
AEN＝(Y+N-Y0N)/FN
其中Y+N是施N处理中的产量(kg/ha)；Y0N是不施N的对照处理的产量(kg/ha)；并且FN是施用的N肥量(kg/ha)。
(3)所施用的氮(N)的回收效率(RE)是对所施用的氮中的多少被作物回收并吸收的度量。
REN＝所吸收的N(千克)/所施用的N(千克)
REN＝(UN+N-UN0N)/FN
其中UN+N是接受以比例FN(kg/ha)施用的地块中处于生理成熟度的地上生物量中测得的植物总N吸收量(kg/ha)；并且UN0N是不添加N的对照地块的总N吸收量。
(4)所施加的氮(N)的生理效率(PE)是每增加一个氮吸收单位产生多少额外产量的度量。
PEN＝产量增加(千克)/所吸收的肥料N(千克)
PEN＝(Y+N-Y0N)/(UN+N-UN0N)
其中Y+N是施N处理中的产量(kg/ha)；Y0N是不施N的对照处理的产量(kg/ha)；UN+N是接受施用肥料N的处理中的总N吸收量(kg/ha)；并且UN0N是不施用肥料N的处理中的总N吸收量(kg/ha)。
(5)氮(N)的内部效率(IE)涉及从肥料和固有(例如土壤)营养来源吸收的每单位N产生多少产量：
IEN＝产量(千克)/所吸收的N(千克)
IEN＝Y/UN
其中Y是产量(kg/ha)；并且UN是总N吸收量(kg/ha)。
氮可以是任何形式，包括有机和/或无机形式。氮的形式包括但不限于硝酸盐(例如硝酸铵、硝酸钙、硝酸钾)、亚硝酸盐、氨、氨水、无水氨、硫酸铵、磷酸二铵、低压氮溶液、无压氮溶液、尿素和尿素-硝酸铵(UAN)。一方面，氮为植物可立即利用的形式(例如，氨和/或硝酸盐)和/或可容易地转化成植物可利用的形式(例如，尿素)。
一方面，与对照烟草植物相比，本文提供的包含增强的NUE的改性烟草植物包含增加的氮吸收。另一方面，与对照烟草植物相比，本文提供的包含增强的NUE的改性烟草植物包含增加的氮同化。在进一步的一方面，与对照烟草植物相比，本文提供的包含增强的NUE的改性烟草植物包含增加的产量。在又另一方面，与对照烟草植物相比，本文提供的包含增强的NUE的改性烟草植物在低氮条件下包含增加的产量。在优选的方面，与本领域技术人员典型地使用的水平相比，在田间使用的低氮条件为约25％的氮。另一方面，与本领域技术人员典型地使用的水平相比，在田间使用的低氮条件为约5％-50％。在温室环境中，低氮条件为约百万分之25(ppm)，并且正常氮条件为约100ppm。另一方面，温室中使用的低氮条件可以为5ppm-50ppm。
一方面，与在类似生长条件下生长的对照烟草植物相比，本文提供的包含增强的NUE和YB1的至少一个功能性等位基因的改性烟草植物包含至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、至少200％、至少300％、至少400％或至少500％的产量增加。一方面，与在类似生长条件下生长的对照烟草植物相比，本文提供的包含增强的NUE的改性烟草植物包含5％-100％、10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-100％、60％-100％、70％-100％、80％-100％、90％-100％、10％-200％、10％-300％、10％-400％、10％-500％或5％-500％的产量增加。
一方面，与在类似生长条件下生长的对照烟草植物群体相比，本文提供的包含增强的NUE和YB1的至少一个功能性等位基因的改性烟草植物群体包含至少0.25kg/ha、至少0.5kg/ha、至少0.75kg/ha、至少1kg/ha、至少2kg/ha、至少3kg/ha、至少4kg/ha、至少5kg/ha、至少6kg/ha、至少7kg/ha、至少8kg/ha、至少9kg/ha、至少10kg/ha、至少15kg/ha、至少20kg/ha、至少25kg/ha、至少30kg/ha、至少35kg/ha、至少40kg/ha、至少45kg/ha、至少50kg/ha、至少75kg/ha、至少100kg/ha、至少200kg/ha、至少300kg/ha、至少400kg/ha、或至少500kg/ha的产量增加。另一方面，与在类似生长条件下生长的对照烟草植物群体相比，本文提供的包含增强的NUE和YB1的至少一个功能性等位基因的改性烟草植物群体包含0.25kg/ha-100kg/ha、0.5kg/ha-100kg/ha、0.75kg/ha-100kg/ha、1kg/ha-100kg/ha、2kg/ha-100kg/ha、3kg/ha-100kg/ha、4kg/ha-100kg/ha、5kg/ha-100kg/ha、6kg/ha-100kg/ha、7kg/ha-100kg/ha、8kg/ha-100kg/ha、9kg/ha-100kg/ha、10kg/ha-100kg/ha、15kg/ha-100kg/ha、20kg/ha-100kg/ha、30kg/ha-100kg/ha、40kg/ha-100kg/ha、50kg/ha-100kg/ha、75kg/ha-100kg/ha、100kg/ha-500kg/ha、100kg/ha-400kg/ha、100-300kg/ha或100kg/ha-200kg/ha的产量增加。如本文所用，烟草植物“群体”可以具有任何大小，例如5、10、15、20、25、30、35、40、50、100、500、1000、5000、10000、25000、50000、100000、500000或更多。群体可以来自单一品种、栽培品种或品系。可以使用本领域已知的任何育种技术来产生群体。
一方面，与在类似生长条件下生长的对照烟草植物相比，本文提供的包含增强的NUE和YB1的至少一个功能性等位基因的改性烟草植物包含的叶片多至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少20或至少25片。另一方面，与在类似生长条件下生长的对照烟草植物相比，本文提供的包含增强的NUE的改性烟草植物包含的叶片多1-25、2-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、11-25、12-25、13-25、14-25、15-25或20-25片。
在一个方面，本文提供的包含增强的NUE和YB1的至少一个功能性等位基因的烟草植物以75-95磅(lbs)氮/英亩的施肥率生长。在另一方面，包含本文提供的增强的NUE的烟草植物以76-95lbs氮/英亩，77-95lbs氮/英亩，78-95lbs氮/英亩，79-95lbs氮/英亩，80-95lbs氮/英亩，81-95lbs氮/英亩，82-95lbs氮/英亩，83-95lbs氮/英亩，84-95lbs氮/英亩，85-95lbs氮/英亩，86-95lbs氮/英亩，88-95lbs氮/英亩，89-95lbs氮/英亩，90-95lbs氮/英亩，91-95lbs氮/英亩，92-95lbs氮/英亩，93-95lbs氮/英亩或94-95lbs氮/英亩的施肥率生长。
在一个方面，本文提供的包含增强的NUE和YB1的至少一个功能性等位基因的烟草植物群体包含1500-3500lbs/ac的产量。在一个方面，本文提供的包含增强的NUE的烟草植物包含1600-3500lbs/ac，1700-3500lbs/ac，1800-3500lbs/ac，1900-3500lbs/ac，2000-3500lbs/ac，2100-3500lbs/ac，2200-3500lbs/ac，2300-3500lbs/ac，2500-3500lbs/ac，2600-3500lbs/ac，2700-3500lbs/ac，2800-3500lbs/ac，2900-3500lbs/ac，3000-3500lbs/ac，3200-3500lbs/ac，3300-3500lbs/ac或3400-3500lbs/ac的产量。
如本文所用，“可比条件”、“类似条件”或“类似生长条件”是指用于生长或熟化烟草并在两种或更多种植物基因型之间进行有意义的比较的类似环境条件、农学实践和/或熟化方法，使得环境条件和农学实践(包括熟化方法)均不会有助于或解释在两种或更多种植物基因型之间观察到的任何差异。例如，环境条件包括光、温度、水、湿度和营养(例如氮和磷)。例如，农学实践包括播种、剪枝、底切、移栽、打顶、分杈和熟化。参见Tobacco,Production,Chemistry and Technology,Davis&Nielsen,eds.,Blackwell Publishing,Oxford(1999),pp.70-103的第4B章和第4C章。在比较中参考对照植物要求对照植物在可比或类似的条件下生长。
一方面，本文提供的改性植物、种子、植物部分或植物细胞包含一种或更多种非天然存在的突变。一方面，本文提供的突变改进植物中的氮利用效率。例如，本文提供的突变类型包括取代(点突变)、缺失、插入、重复和倒位。期望这种突变存在于基因的编码区中；然而，也期望启动子或其他调节区、内含子、内含子-外显子边界或基因的非翻译区中的突变。
一方面，本文提供的方法和组合物包括将一种或更多种多核苷酸引入一种或更多种植物细胞中。一方面，改性本文提供的植物基因组以包括引入的多核苷酸或重组DNA构建体。如本文所用，“植物基因组”是指植物细胞的核基因组、线粒体基因组或质体(例如叶绿体)基因组。另一方面，将本文提供的多核苷酸整合到人工染色体中。一方面，将本文提供的包含多核苷酸的人工染色体整合到植物细胞中。
一方面，本文提供的改性植物、种子、植物组分、植物细胞或植物基因组包含一个或更多个转基因。一方面，本文提供的转基因改进烟草植物中的氮利用效率。如本文所用，“转基因”是指通过本领域已知的任何方法转移到基因组中的多核苷酸。一方面，转基因是外源多核苷酸。一方面，转基因是内源多核苷酸，其被整合到通常其不存在的新基因组位点中。因此，在适当情况下，转基因也可以是顺化基因。
一方面，本文提供的转基因包含重组DNA构建体。一方面，本文提供的重组DNA构建体或表达盒可包含用于选择转基因细胞的选择性标志物基因。选择性标志物基因包括但不限于编码抗生素抗性的基因，例如编码新霉素磷酸转移酶II(NPTII)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予对除草剂化合物，例如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮类、三唑并嘧啶类、磺酰脲类(例如氯磺隆和甲嘧磺隆)和2,4-二氯苯氧基乙酸酯(2,4-D)抗性的基因。其他选择性标志物包括表型标志物，例如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)。
一方面，本文提供的方法和组合物包含载体。如本文所用，术语“载体”或“质粒”可互换使用，是指与染色体DNA物理分离的环状双链DNA分子。一方面，本文使用的质粒或载体能够在体内复制。如本文所用，“转化载体”是能够转化植物细胞的质粒。一方面，本文提供的质粒是细菌质粒。另一方面，本文提供的质粒是土壤杆菌Ti质粒或衍生自土壤杆菌Ti质粒。在又另一方面，本文提供的载体是病毒载体。
一方面，本文提供的质粒或载体是重组载体。如本文所用，术语“重组载体”是指通过基因重组的实验室方法(例如分子克隆)形成的载体。另一方面，本文提供的质粒是合成质粒。如本文所用，“合成质粒”是能够与天然质粒(例如Ti质粒)具有相同功能(例如复制)的人工产生的质粒。不受限制地，本领域技术人员可以通过通过单个核苷酸合成质粒，或通过将来自不同预先存在的质粒的核酸分子剪接在一起来从头产生合成质粒。
载体可商购获得或可通过本领域常规的重组DNA技术制备。一方面，本文提供的载体包含SEQ ID NO:65的全部或部分。含有核酸的载体可以具有与这种核酸可操作地连接的表达元件，并且还可以包括序列(诸如编码可选择标志物的那些(例如抗生素抗性基因))。含有核酸的载体可以编码嵌合或融合多肽(即与异源多肽可操作地连接的多肽，其可以位于多肽的N-末端或C-末端)。代表性的异源多肽是可用于纯化编码多肽的那些(例如，6xHis标签、谷胱甘肽S-转移酶(GST))。
另一方面，可以通过使植物与病毒或病毒核酸接触将本文提供的重组构建体或表达盒引入植物。通常，此类方法涉及将本公开的表达盒整合入病毒DNA或RNA分子中。已经认识到，用于本文提供的表达盒的启动子还涵盖用于通过病毒RNA聚合酶的转录的启动子。用于将多核苷酸(包括病毒DNA或RNA分子)引入植物并表达在其中编码的蛋白质的方法是本领域已知的。例如，参见美国专利号5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367、5,316,931和Porta等(1996)Molecular Biotechnology 5:209-221。
启动子
如本领域中通常理解的，术语“启动子”通常是指包含RNA聚合酶结合位点、转录起始位点和/或TATA框并且辅助或促进相关的可转录的多核苷酸序列和/或基因(或转基因)的转录和表达的DNA序列。启动子可以合成产生、变化或衍生自已知或天然存在的启动子序列或其他启动子序列(例如，如本文所提供)。启动子还可以包括包含两个或更多个异源序列的组合的嵌合启动子。因此，本发明的启动子可以包括组成相似但与本文已知或提供的其他启动子序列不相同或不互补的启动子序列的变体。如本文所用，在DNA构建体的上下文中，“异源启动子”是指：(i)衍生自不同于可操作地连接的结构基因或编码区的来源的启动子，或(ii)衍生自与可操作地连接的结构基因或编码区相同来源的启动子，其中启动子的序列从其原始形式被改性。如本文所用，术语“可操作地连接”是指启动子或其他调控元件与相关的可转录多核苷酸序列或基因(或转基因)的编码序列之间的功能性连接，从而使启动子等以至少在特定组织、发育阶段和/或在某些条件下，执行启动、协助、影响、引起和/或促进相关的编码或可转录的多核苷酸序列的转录和表达。“植物可表达的启动子”是指可用于在植物、植物细胞和/或植物组织中表达与该启动子可操作地连接的相关的编码序列、转基因或可转录的多核苷酸序列的启动子。
启动子可以根据与编码可操作地连接至该启动子的序列或基因(包括转基因)的表达模式有关的多种标准进行分类，例如组成型、发育型、组织特异性、诱导型等。在植物的所有或大多数组织中启动转录的启动子称为“组成型”启动子。在发育的某些时期或阶段启动转录的启动子称为“发育型”启动子。相对于其他植物组织在植物的某些组织中表达增强的启动子称为“组织增强”或“组织优选”启动子。因此，“组织优选”启动子在植物的特定组织中引起相对较高或优先的表达，但在植物的其他组织中引起较低的表达水平。在植物的特定组织中表达而在其他植物组织中很少表达或不表达的启动子称为“组织特异性”启动子。在植物的某种细胞类型中表达的启动子称为“细胞类型特异性”启动子。“诱导型”启动子是响应于环境刺激(例如冷、干旱或光照或其他刺激(例如伤口或化学施加))而启动转录的启动子。启动子也可以按照其来源分类，例如是异源、同源、嵌合、合成等。“异源”启动子是相对于其相关的可转录序列、编码序列或基因(或转基因)具有不同来源的启动子序列和/或不是天然存在于待转化的植物物种中的启动子序列。当自然界中通常不存在这样的组合时，术语“异源的”可以更广泛地指两个或更多个DNA分子或序列的组合。例如，如果两个或更多个DNA分子或序列通常在不同基因组中或在同一基因组中的不同基因座处被发现，或者如果它们在性质上未相同地结合，则彼此之间将是异源的。
示例性组成型启动子包括Rsyn7启动子的核心启动子和美国专利号6,072,050中公开的其它组成型启动子；核心CaMV 35S启动子(Odell等(1985)Nature 313：810-812)；泛素(Christensen等人1989)Plant Mol.Biol.12：619-632和Christensen等(1992)PlantMol.Biol.18：675-689)；pEMU(Last等(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588)；MAS(Velten等(1984)EMBO J 3：2723-2730)；ALS启动子(美国专利号5,659,026)等。
示例性化学诱导型启动子包括由水杨酸活化的烟草PR-1a启动子。其它感兴趣的化学诱导型启动子包括类固醇反应性启动子(例如，参见Schena等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.US88:10421-10425和McNellis等(1998)Plant J.14(2):247-257)中的糖皮质激素诱导型启动子)和四环素诱导型启动子(例如，参见Gatz等(1991)Mol.Gen.Genet.227：229-237和美国专利号5,814,618和5,789,156)。可用于本文的其他示例性启动子是那些负责热调节的基因表达、光调节的基因表达(例如，豌豆rbcS-3A；玉米rbcS启动子；在豌豆中发现的叶绿素alb结合蛋白基因；或者阿拉伯苏启动子)、激素调节的基因表达(例如，来自小麦Em基因的脱落酸(ABA)反应序列；ABA诱导型HVA1和HVA22，以及大麦和拟南芥的rd29A启动子；和伤口诱导的基因表达(例如wunl)、器官特异性基因表达(例如，块茎特异性储存蛋白基因；描述的来自玉米的23kDa玉米醇溶蛋白基因；或法国豆(β-菜豆蛋白基因)或病原体-诱导型启动子(例如，分别是PR-1、prp-1或β-1,3葡聚糖酶启动子、小麦的真菌诱导型wirla启动子，以及线虫诱导型启动子，烟草和欧芹的TobRB7-5A和Hmg-1)。
如本文所用，“叶”启动子包括在衍生自植物的任何部分的叶组织中启动、引起、驱动(等)其相关基因、转基因或可转录DNA序列的转录或表达的任何启动子。该“叶”启动子可以进一步定义为在植物的一个或更多个组织(例如一个或更多个花组织)中启动、引起、驱动(等)其相关基因/转基因或可转录DNA序列的转录或表达。该“叶”启动子可以进一步定义为“叶优选”启动子，其至少优先地或大部分地(如果不是排他性的话)在衍生自植物任何部分的叶组织(与花组织相反)中启动、引起、驱动(等)其相关基因、转基因或可转录DNA序列的转录或表达。然而，“叶”和“叶优选”启动子也可以在植物的一个或更多个细胞或组织，例如一个或更多个营养或生殖组织的生殖阶段或发育阶段期间各自许可、允许、引起、驱动(等)其相关基因、转基因或可转录DNA序列的转录或表达。实际上，“叶”启动子甚至可以在一个或更多个生殖或营养组织中以大于在叶组织中的水平或程度启动、引起、驱动(等)其相关基因、转基因或可转录DNA序列的转录或表达。
如本文所用，“根”启动子包括在衍生自植物的任何部分的根组织中启动、引起、驱动(等)其相关基因、转基因或可转录DNA序列的转录或表达的任何启动子。该“根”启动子可以进一步定义为在植物的一个或更多个组织(例如一个或更多个花组织)中启动、引起、驱动(等)其相关基因/转基因或可转录DNA序列的转录或表达。该“根”启动子可以进一步定义为“根优选”启动子，其至少优先地或大部分地(如果不是排他性的话)在衍生自植物任何部分的根组织(与花组织相反)中启动、引起、驱动(等)其相关基因、转基因或可转录DNA序列的转录或表达。然而，“根”和“根优选”启动子也可以在植物的一个或更多个细胞或组织，例如一个或更多个营养或生殖组织的生殖阶段或发育阶段期间各自许可、允许、引起、驱动(等)其相关基因、转基因或可转录DNA序列的转录或表达。实际上，“根”启动子甚至可以在一个或更多个生殖或营养组织中以大于在根组织中的水平或程度启动、引起、驱动(等)其相关基因、转基因或可转录DNA序列的转录或表达。
其他示例性组织优选的启动子包括在以下中公开的那些：Yamamoto等(1997)Plant J.12(2):255-265；Kawamata等(1997)Plant Cell Physiol.38(7):792-803；Hansen等(1997)Mol.Gen.Genet.254(3):337-343；Russell等(1997)Transgenic Res.6(2):157-168；Rinehart等(1996)Plant Physiol.112(3):1331-1341；VanCamp等(1996)PlantPhysiol.112(2):525-535；Canevascini等(1996)Plant Physiol.112(2):513-524；Yamamoto等(1994)Plant Cell Physiol.35(5):773-778；Lam(1994)Results Probl.CellDiffer.20:181-196；Orozco等(1993)Plant Mol.Biol.23(6):1129-1138；Matsuoka等(1993)Proc Natl.Acad.Sci.US90(20):9586-9590；和Guevara-Garci等(1993)Plant J.4(3):495-505。
熟化/产品
本公开还提供用于育种包含增强的氮利用效率的烟草品系、栽培种或品种的方法。可以通过任何已知的程序进行育种。DNA指纹分析、SNP作图、单倍型作图或类似技术可用于标志物辅助选择(MAS)育种程序，以将期望的性状或等位基因转移或育种到烟草植物中。例如，育种者可以使用本文提供的F1杂交种植物在F2或回交代中产生分离群体，或者进一步使F1杂交种植物与具有农学上期望的基因型的其他供体植物杂交。可以使用本领域已知的或本文列出的技术之一筛选F2或回交代植物的期望的农学性状或期望的化学谱。取决于预期的遗传模式或所使用的MAS技术，可以在每个回交循环之前对所选植物进行自花授粉以帮助鉴定所需的单株植物。可以重复回交或其他育种程序，直到恢复轮回亲本的期望表型。一方面，本公开的轮回亲本可以是烤制熟化品种、白肋品种、深色晾制熟化品种、深色明火烤制熟化品种，或东方品种。另一方面，轮回亲本可以是改性烟草植物、品系或品种。一方面，本文提供的轮回亲本为TN90。另一方面，本文提供的轮回亲本为MD609。例如，其他育种技术可见于Wernsman,E.A.,and Rufty,R.C.1987.Chapter Seventeen.Tobacco.Pages669-698In:Cultivar Development.Crop Species.W.H.Fehr(ed.),MacMillPublishingGo.,Inc.,New York,N.Y.，其全文通过引用并入本文。
使用本文所述的改性烟草植物的植物育种程序的结果包括本公开的有用的品系、栽培种、品种、后代、近交系和杂交种。如本文所用，术语“品种”是指具有将其与相同物种的其他植物分离的恒定特征的植物群体。品种通常是(尽管并不总是)商业销售的。当具有一个或更多个特殊性状，品种的进一步特征是在该品种内个体之间非常小的总体差异。可通过数代自花受粉和选择，或使用组织或细胞培养技术从单个亲本无性繁殖生成“纯系”品种。品种可以基本上衍生自另一个品系或品种。根据国际公约对植物新品种保护的定义(1961年12月2日，于1972年11月10日、1978年10月23日和1991年3月19日在日内瓦修订)，品种“基本上衍生”自初始品种，如果：a)它主要衍生自初始品种，或衍生自主要衍生自初始品种的品种，同时保留由所述初始品种的基因型或基因型组合产生的必要特征的表达；b)它与初始品种有明显区别；c)除了由衍生行为产生的差异，它在由所述初始品种的基因型或基因型组合产生的必要特征的表达中与初始品种相符合。例如，可通过选择天然或诱导的突变体、体细胞无性变体、来自初始品种植物的变异个体、回交或转化获得基本上衍生的品种。认为第一烟草品种和第一品种基本上从其衍生的第二烟草品种具有基本上相同的遗传背景。与品种不同，“品系”最通常是指非商业使用的一组植物，例如用于植物研究。品系典型地在个体间的一个或更多个目标性状上显示非常小的总体差异，尽管在个体间的其他性状上可能存在一些差异。
一方面，本公开提供了一种生产烟草植物的方法，其包括使第一烟草品种的至少一种烟草植物与第二烟草品种的至少一种烟草植物杂交，其中与在可比条件下生长的相同品种的对照烟草植物相比，所述第一烟草品种的至少一种烟草植物表现出增强的氮利用效率；以及选择与在可比条件下生长的相同杂交的对照烟草植物相比，表现出增强的氮利用效率的后代烟草植物。一方面，本文提供的第一烟草品种包含改性烟草植物。另一方面，本文提供的第二烟草品种包含改性烟草植物。一方面，第一或第二烟草品种是雄性不育的。另一方面，第一或第二烟草品种是细胞质雄性不育的。另一方面，第一或第二烟草品种是雌性不育的。一方面，第一或第二烟草品种是优良品种。另一方面，第一或第二烟草品种是杂交种。
一方面，本公开提供了一种将一个或更多个转基因渗入烟草品种的方法，该方法包括：(a)将包含一个或更多个转基因的第一烟草品种与不含所述一个或更多个转基因的第二烟草品种杂交以产生一种或更多种后代烟草植物；(b)对一种或更多种后代烟草植物进行一个或更多个转基因的基因分型；和(c)选择包含一个或更多个转基因的后代烟草植物。另一方面，这些方法进一步包括使所选择的后代烟草植物与第二烟草品种回交。在进一步的方面，这些方法还包括：(d)将选择的后代植物与其自身或与第二烟草品种杂交以产生一种或更多种进一步的后代烟草植物；和(e)选择包含一个或更多个转基因的进一步的后代烟草植物。一方面，第二烟草品种是优良品种。
一方面，本公开提供了一种将一个或更多个突变渗入烟草品种的方法，该方法包括：(a)将包含一个或更多个突变的第一烟草品种与不含所述一个或更多个突变的第二烟草品种杂交以产生一种或更多种后代烟草植物；(b)对一种或更多种后代烟草植物进行一个或更多个突变的基因分型；以及(c)选择包含一个或更多个突变的后代烟草植物。另一方面，这些方法还包括使所选择的后代烟草植物与第二烟草品种回交。在进一步的方面，这些方法还包括：(d)将选择的后代植物与其自身或与第二烟草品种杂交以产生一种或更多种进一步的后代烟草植物；以及(e)选择包含一个或更多个突变的进一步的后代烟草植物。一方面，第二烟草品种是优良品种。
在一个方面，本公开提供了生长包含增强的氮利用效率的烟草植物群体的方法，其中所述方法包括种植包含与增强的NUE相关的一个或更多个分子标志物和黄白肋烟(YB1)基因座的至少一个功能性等位基因的烟草种子群体，其中当在可比条件下生长时，与相同品种的对照烟草植物相比，所述一种或更多种烟草植物表现出增强的氮利用效率。在另一方面，烟草种子群体包含YB2基因座的至少一个功能性等位基因。
在一个方面，本公开提供了用于生产包含增强的NUE性状的种子的方法，其包括将包含与增强的NUE相关的一个或更多个分子标志物的第一植物群体与包含黄白肋烟1(YB1)基因座的至少一个功能性等位基因的第二植物群体杂交，并获得包含增强的NUE性状、与增强的NUE相关的一个或更多个分子标志物和黄白肋烟1(YB1)基因座的至少一个功能性等位基因的后代种子。在另一方面，后代种子包含YB2基因座的至少一个功能性等位基因。
一方面，本文提供的烟草植物是杂交种植物。可以通过以下来生产杂交种：阻止第一品种的雌性亲本植物(例如种子亲本)自花受粉，允许第二品种的雄性亲本植物的花粉受精雌性亲本植物，并允许F1杂交种种子在雌性植物上形成。可以通过在花发育早期将花去雄来阻止雌性植物的自花授粉。或者，可以使用雄性不育的形式阻止在雌性亲本植物上形成花粉。例如，可以通过雄性不育(MS)或其中转基因抑制小孢子发生和/或花粉形成的转基因雄性不育或自交不亲和来产生雄性不育。包含MS的雌性亲本植物特别有用。在雌性亲本植物是MS的方面，可以从雄性可育植物收获花粉，并将其人工授至MS雌性亲本植物的柱头，并收获所得的F1种子。此外，雌性不育植物也可以用于阻止自花授粉。
植物可用于形成单交烟草F1杂交种。将来自雄性亲本植物的花粉人工转移至去雄的雌性亲本植物或雄性不育的雌性亲本植物以形成F1种子。或者，可以进行三向杂交，其中单交F1杂交种用作雌性亲本并与不同的雄性亲本杂交。作为另一种选择，可以产生双交杂交种，其中两个不同单交的F1后代与其自身杂交。当形成双交杂交种时，自交不亲和性可以特别有利地用于阻止雌性亲本的自花授粉。
一方面，本文提供的烟草品种是雄性不育。另一方面，本文提供的烟草品种是细胞质雄性不育(CMS)。可以通过本领域已知的任何方法生产雄性不育的烟草植物。生产雄性不育烟草的方法描述于Wernsman,E.A.,and Rufty,R.C.1987.ChapterSeventeen.Tobacco.Pages 669-698In:Cultivar Development.Crop Species.W.H.Fehr(ed.),MacMillPublishing Go.,Inc.,New York,N.Y.761pp。另一方面，本文提供的烟草品种是雌性不育。作为非限制性的实例，可以通过突变STIG1基因来制备雌性不育植物。例如，参见Goldman等1994,EMBO Journal 13:2976-2984。
一方面，本公开提供并且包括一种测定烟草品系的NUE的方法，其包括从烟草品系的烟草植物获得至少一种代谢物，测定所获得的至少一种代谢物的量，并基于测定的至少一种代谢物的量测定烟草品系的NUE。在进一步的方面，所述至少一种代谢物获自选自下组的植物组织：根组织、叶组织、花组织、分生组织和茎组织。在该方法的进一步的方面，获得至少两种代谢物。在该方法的进一步的方面，获得至少三种代谢物。在该方法的进一步的方面，获得至少四种代谢物。在该方法的进一步的方面，获得至少五种代谢物。在该方法的进一步的方面，获得至少六种代谢物。在该方法的进一步的方面，获得至少七种代谢物。在该方法的进一步的方面，获得至少八种代谢物。在该方法的进一步的方面，获得至少九种代谢物。在该方法的进一步的方面，获得至少十种代谢物。在该方法的进一步的方面，测定至少两种代谢物的量。在该方法的进一步的方面，测定至少三种代谢物的量。在该方法的进一步的方面，测定至少四种代谢物的量。在该方法的进一步的方面，测定至少五种代谢物的量。在该方法的进一步的方面，测定至少六种代谢物的量。在该方法的进一步的方面，测定至少七种代谢物的量。在该方法的进一步的方面，测定至少八种代谢物的量。在该方法的进一步的方面，测定至少九种代谢物的量。在该方法的进一步的方面，测定至少十种代谢物的量。
在本文提供的方法的另一方面，测定了选自下组的代谢物的量：X-2357、N-乙酰胞壁酸酯(N-acetylmuramate)、X-23319、X-23852、X-23330、α-酮戊二酸酯、X-21756、4-羟基-2-酮戊二酸、D-23937、X-23937、X-23916、1-甲基腺嘌呤、4-胍基丁酸酯(guanidinobutanoate)、丁香醛、硫胺、对羟基苯甲醛、X-23453、X-11429、X-21796、N’-甲基烟酰胺、可替宁、X-23389、N-乙酰精氨酸、X-23366、N-乙酰苯基丙氨酸、柚皮素、X-23454、X-23580和X-23852。
在本文提供的方法的另一方面，与包含较少量的至少一种代谢物的烟草植物相比，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含增强的NUE。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含较低量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含较低量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含较低量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含较低量的至少五种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在两个组织中包含较低量的至少一种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少两个组织中包含较低量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少两个组织中包含较低量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少两个组织中包含较低量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少两个组织中包含较低量的至少五种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在三个组织中包含较低量的至少一种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少三个组织中包含较低量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少三个组织中包含较低量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少三个组织中包含较低量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少三个组织中包含较低量的至少五种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在四个组织中包含较低量的至少一种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少四个组织中包含较低量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少四个组织中包含较低量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少四个组织中包含较低量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少四个组织中包含较低量的至少五种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在五个组织中包含较低量的至少一种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少五个组织中包含较低量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少五个组织中包含较低量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少五个组织中包含较低量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少五个组织中包含较低量的至少五种代谢物。
在本文提供的方法的另一方面，与包含较高量的至少一种代谢物的烟草品系相比，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含增强的NUE。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含较高量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含较高量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含较高量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含较高量的至少五种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在两个组织中包含较高量的至少一种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少两个组织中包含较高量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少两个组织中包含较高量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少两个组织中包含较高量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少两个组织中包含较高量的至少五种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在三个组织中包含较高量的至少一种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少三个组织中包含较高量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少三个组织中包含较高量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少三个组织中包含较高量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少三个组织中包含较高量的至少五种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在四个组织中包含较高量的至少一种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少四个组织中包含较高量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少四个组织中包含较高量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少四个组织中包含较高量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少四个组织中包含较高量的至少五种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在五个组织中包含较高量的至少一种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少五个组织中包含较高量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少五个组织中包含较高量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少五个组织中包含较高量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少五个组织中包含较高量的至少五种代谢物。
在本文提供的方法的另一方面，与包含等量的至少一种代谢物的烟草品系相比，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含增强的NUE。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含等量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含等量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含等量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含等量的至少五种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在两个组织中包含等量的至少一种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少两个组织中包含等量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少两个组织中包含等量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少两个组织中包含等量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少两个组织中包含等量的至少五种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在三个组织中包含等量的至少一种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少三个组织中包含等量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少三个组织中包含等量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少三个组织中包含等量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少三个组织中包含等量的至少五种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在四个组织中包含等量的至少一种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少四个组织中包含等量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少四个组织中包含等量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少四个组织中包含等量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少四个组织中包含等量的至少五种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在五个组织中包含等量的至少一种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少五个组织中包含等量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少五个组织中包含等量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少五个组织中包含等量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少五个组织中包含等量的至少五种代谢物。
在本文提供的方法的另一方面，与包含较低量的至少一种代谢物的烟草品系相比，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含降低的NUE。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含较低量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含较低量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含较低量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含较低量的至少五种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在两个组织中包含较低量的至少一种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少两个组织中包含较低量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少两个组织中包含较低量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少两个组织中包含较低量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少两个组织中包含较低量的至少五种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在三个组织中包含较低量的至少一种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少三个组织中包含较低量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少三个组织中包含较低量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少三个组织中包含较低量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少三个组织中包含较低量的至少五种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在四个组织中包含较低量的至少一种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少四个组织中包含较低量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少四个组织中包含较低量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少四个组织中包含较低量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少四个组织中包含较低量的至少五种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在五个组织中包含较低量的至少一种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少五个组织中包含较低量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少五个组织中包含较低量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少五个组织中包含较低量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少五个组织中包含较低量的至少五种代谢物。
在本文提供的方法的另一方面，与包含较高量的至少一种代谢物的烟草品系相比，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含降低的NUE。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含较高量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含较高量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含较高量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含较高量的至少五种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在两个组织中包含较高量的至少一种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少两个组织中包含较高量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少两个组织中包含较高量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少两个组织中包含较高量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少两个组织中包含较高量的至少五种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在三个组织中包含较高量的至少一种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少三个组织中包含较高量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少三个组织中包含较高量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少三个组织中包含较高量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少三个组织中包含较高量的至少五种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在四个组织中包含较高量的至少一种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少四个组织中包含较高量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少四个组织中包含较高量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少四个组织中包含较高量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少四个组织中包含较高量的至少五种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在五个组织中包含较高量的至少一种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少五个组织中包含较高量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少五个组织中包含较高量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少五个组织中包含较高量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少五个组织中包含较高量的至少五种代谢物。
在本文提供的方法的另一方面，与包含等量的至少一种代谢物的烟草品系相比，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含降低的NUE。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含等量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含等量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含等量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含等量的至少五种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在两个组织中包含等量的至少一种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少两个组织中包含等量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少两个组织中包含等量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少两个组织中包含等量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少两个组织中包含等量的至少五种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在三个组织中包含等量的至少一种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少三个组织中包含等量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少三个组织中包含等量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少三个组织中包含等量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少三个组织中包含等量的至少五种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在四个组织中包含等量的至少一种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少四个组织中包含等量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少四个组织中包含等量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少四个组织中包含等量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少四个组织中包含等量的至少五种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在五个组织中包含等量的至少一种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少五个组织中包含等量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少五个组织中包含等量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少五个组织中包含等量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少五个组织中包含等量的至少五种代谢物。
另一方面，本文提供的方法包括使用选自下组的方法测定代谢物的量：液相色谱/质谱法(LC/MS)、高效液相色谱法(HPLC)、超级HPLC(UHPLC)、质谱(MS)、串联质谱(MS/MS)、基质辅助激光解吸/电离质谱(MALDI-MS)、X射线荧光光谱(XRF)、离子色谱(IC)、气相色谱(GC)、气相色谱/质谱(GC/MS)、毛细管电泳/质谱(CE-MS)、离子迁移谱/质谱(IMS/MS)、X射线衍射、核磁共振(NMR)、发射光谱分析、极谱法、紫外-可见光谱法、红外光谱法和薄层色谱法。
一方面，本说明书提供并且包括一种使用代谢物特征测定烟草品系的NUE的方法，其包括从烟草品系的烟草植物分离代谢物特征，测定包括代谢物特征的每种代谢物的量，并且通过将代谢物特征与来自包含已知NUE的对照烟草品系的对照代谢物特征进行比较来测定烟草品系的NUE。在该方法的进一步的方面，与对照烟草品系相比，NUE包含增强的NUE。在该方法的另一方面，从选自下组的植物组织分离代谢物特征：根组织、叶组织、花组织、分生组织和茎组织。
在本文提供的方法的一个方面，代谢物特征包含至少两种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含至少三种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含至少四种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含至少五种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含至少六种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含至少七种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含至少八种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含至少九种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含至少十种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含至少十一种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含至少十二种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含至少十三种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含至少十四种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含至少十五种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含至少二十种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含至少二十五种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含至少三十种代谢物。
在进一步的方面，代谢物特征包含至少三十五种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含至少四十种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含至少四十五种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含至少五十种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含两到五十种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含三到四十五种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含三到四十种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含四到三十五种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含五到三十种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含六到二十五种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含七到二十种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含八到十五种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含九到十四种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含十到十三种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含十到十二种代谢物。
一方面，本说明书提供并且包括一种育种包含与增强的NUE相关的代谢物特征的烟草品系的方法，其包括从第一烟草品系测定第一烟草植物的代谢物特征，其中与缺乏代谢物特征的对照烟草植物相比，第一烟草植物包含增强的NUE，将第一植物与第二烟草品系的第二植物杂交，并从杂交获得至少一粒后代种子，其中从至少一个后代种子生长的后代植物包含代谢物特征，并且其中与缺乏代谢物特征的对照植物相比，后代植物包含增强的NUE。在该方法的进一步的方面，将后代植物与来自第一烟草品系的第三植物杂交。另一方面，第一烟草品系选自下组：MD609、MD601、Banket A1、K326、K346、K358、K394、K399、K730、NC196、NC37NF、NC471、NC55、NC92、NC2326、NC95、NC925。另一方面，第二烟草品系选自下组：TN86、TN86LC、TN90、TN90LC、TN97、TN97LC。另一方面，代谢物特征包含叶代谢物特征。另一方面，代谢物特征包含根代谢物特征。另一方面，与对照烟草植物的代谢物特征相比，代谢物特征包含较高量的4-胍基丁酸酯、丁香醛、硫胺、对羟基苯甲醛、X-23454、X-23580、X-23852或其任何组合。另一方面，与对照烟草植物的代谢物特征相比，代谢物特征包含较低量的X-2357、N-乙酰胞壁酸酯、X-23319、X-23852、X-23330、α-酮戊二酸酯、X-21756、4-羟基-2-酮戊二酸、X-23937、X-23916、1-甲基腺嘌呤、X-23453、X-11429、X-21796、N’-甲基烟酰胺、可替宁、X-23389、N-乙酰精氨酸、N-23366、N-乙酰苯基丙氨酸、柚皮素或其任何组合。
另一方面，本文提供的方法包含含有增强的NUE的烟草植物，其中与在相同条件下生长时缺乏增强的NUE的烟草植物相比，增强的NUE包含增加的偏要素生产率(PFP)。进一步的方面，与在相同条件下生长时缺乏增强的NUE的烟草植物相比，增强的NUE包含增加的农学效率(AE)。进一步的方面，与在相同条件下生长时缺乏增强的NUE的烟草植物相比，增强的NUE包含增加的回收效率(RE)。进一步的方面，与在相同条件下生长时缺乏增强的NUE的烟草植物相比，增强的NUE包含增加的生理效率(PE)。进一步的方面，与在相同条件下生长时缺乏增强的NUE的烟草植物相比，增强的NUE包含增加的内部效率(IE)。
一方面，本说明书提供并且包括一种选择烟草植物的方法，其包括获得烟草植物群体，从来自烟草植物群体的至少一种烟草植物中分离与增强的NUE相关的至少一种代谢物，以及选择与对照烟草植物相比包含较高量的至少一种代谢物的至少一种烟草植物。在该方法的进一步的方面，与对照烟草植物相比，所选的烟草植物包含增强的NUE。在该方法的进一步的方面，至少一种代谢物选自下组：4-胍基丁酸酯、丁香醛、硫胺、对羟基苯甲醛、X-23454、X-23580、X-23852、或其任何组合。在该方法的进一步的方面，从选自下组的植物组织分离代谢物：根组织、叶组织、花组织、分生组织和茎组织。
一方面，本说明书提供并且包括一种选择烟草植物的方法，其包括获得烟草植物群体，从来自烟草植物群体的至少一种烟草植物中分离与增强的NUE相关的至少一种代谢物，以及选择与对照烟草植物相比包含较低量的至少一种代谢物的至少一种烟草植物。在该方法的进一步的方面，与对照烟草植物相比，所选的烟草植物包含增强的NUE。在该方法的进一步的方面，至少一种代谢物选自下组：X-2357、N-乙酰胞壁酸酯、X-23319、X-23852、X-23330、α-酮戊二酸酯、X-21756、4-羟基-2-酮戊二酸、X-23937、X-23916、1-甲基腺嘌呤、X-23453、X-11429、X-21796、N’-甲基烟酰胺、可替宁、X-23389、N-乙酰精氨酸、N-23366、N-乙酰苯基丙氨酸、柚皮素或其任何组合。在该方法的进一步的方面，从选自下组的植物组织分离代谢物：根组织、叶组织、花组织、分生组织和茎组织。
一方面，本说明书提供并且包括一种筛选烟草植物中与增强的NUE相关的第一代谢物特征的方法，其包括从烟草植物中分离第一代谢物特征，测定包含第一代谢物特征的至少一种代谢物的量，将第一代谢物特征与包含已知NUE的对照烟草植物的第二代谢物特征进行比较，以及确定第一代谢物特征是否与增强的NUE相关。
一方面，本说明书提供并且包括一种改性烟草种子或由其生长的烟草植物，其包含含有可操作地连接至编码区的异源启动子的顺化基因多核苷酸，其中与在相同条件下生长时缺乏顺化基因多核苷酸的未改性对照烟草植物相比，所述改性烟草植物包含增强的氮利用效率。进一步的方面，改性烟草种子或烟草植物包含选自下组的异源启动子：组成型启动子、诱导型启动子、组织优选启动子和组织特异性启动子。另一方面，异源启动子包含来自烟草基因组的多核苷酸序列。另一方面，异源启动子包含来自植物基因组的多核苷酸序列。另一方面，组织优选启动子是叶优选启动子。另一方面，组织优选启动子是根优选启动子。进一步的方面，改性烟草种子或烟草植物是白肋烟品种。
在进一步的方面，与在相同条件下生长时缺乏顺化基因多核苷酸的未改性烟草植物相比，本发明的改性烟草种子或烟草植物包含较低量的TSNA。在进一步的方面，与在相同条件下生长时缺乏顺化基因多核苷酸的未改性烟草植物相比，改性烟草种子或烟草植物包含较低量的N'-亚硝基降烟碱(NNN)。在进一步的方面，与在相同条件下生长时缺乏顺化基因多核苷酸的未改性烟草植物相比，改性烟草种子或烟草植物包含较低量的4-甲基亚硝基氨基-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)。在进一步的方面，与在相同条件下生长时缺乏顺化基因多核苷酸的未改性烟草植物相比，改性烟草种子或烟草植物包含较低量的N'-亚硝基新烟草碱(NAT)。在进一步的方面，与在相同条件下生长时缺乏顺化基因多核苷酸的未改性烟草植物相比，改性烟草种子或烟草植物包含较低量的N'-亚硝基假木贼碱(NAB)。在进一步的方面，与在相同条件下生长时缺乏顺化基因多核苷酸的未改性烟草植物相比，改性烟草种子或烟草植物包含较低量的生物碱。在进一步的方面，与在相同条件下生长时缺乏顺化基因多核苷酸的未改性烟草植物相比，改性烟草种子或烟草植物包含较低量的烟碱。在进一步的方面，与在相同条件下生长时缺乏顺化基因多核苷酸的未改性烟草植物相比，改性烟草种子或烟草植物包含较低量的降烟碱。在进一步的方面，与在相同条件下生长时缺乏顺化基因多核苷酸的未改性烟草植物相比，改性烟草种子或烟草植物包含较低量的假木贼碱。在进一步的方面，与在相同条件下生长时缺乏顺化基因多核苷酸的未改性烟草植物相比，改性烟草种子或烟草植物包含较低量的新烟草碱。
叶质量/等级
在一个方面，本公开提供了包含增强的氮利用效率的育种烟草品系、栽培品种或品种，烟草植物或其部分，其包含在一个或更多个增强的NUE基因座、YB1、YB2或其任何组合中或靶向一个或更多个增强的NUE基因座、YB1、YB2或其任何组合的遗传修饰。本公开还提供具有增强的NUE而对其他烟草性状(例如，叶等级指数值)没有负面影响的突变体或转基因烟草植物。在一个方面，本公开的增强的NUE烟草植物提供商业上可接受等级的熟化烟草。
烟草等级的评估基于包括但不限于以下的因素：叶茎位置、叶尺寸、叶颜色、叶均匀性和完整性、成熟度、质地、弹性、光泽(与叶的着色强度和深度以及照耀有关)、吸湿性(烟叶吸收和保留环境水分的能力)以及绿色的细微差别或偏色。例如，可以使用由美国农业部农业市场服务部公布的官方标准等级(7U.S.C.§511)来确定叶等级。例如，参见1990年11月5日生效的白肋烟(Burley Tobacco)(美国31型和外国93型)官方标准等级(55F.R.40645)；1989年3月27日生效的烤制熟化烟草(Flue-Cured Tobacco)(美国11、12、13、14型和外国92型)官方标准等级(54F.R.7925)；1965年1月8日生效的宾夕法尼亚州子叶烟草(Seedleaf Tobacco)(美国41型)官方标准等级(29F.R.16854)；1963年12月8日生效的俄亥俄州雪茄叶烟草(Cigar-Leaf Tobacco)(美国42、43和44型)官方标准等级(28F.R.11719和28F.R 11926)；1969年11月20日生效的威斯康星州雪茄混合型烟草(美国54和55型)官方标准等级(34F.R.17061)；1969年11月20日生效的威斯康星州雪茄混合型烟草官方标准等级(美国54和55型)(34F.R.17061)；1971年4月生效的佐治亚州和佛罗里达州荫下种植雪茄包装烟草(美国62型)的官方标准等级。USDA等级指数值可以根据行业接受的等级指数来确定。例如，参见Bowman等,Tobacco Science,32:39-40(1988)；传统烟草文献图书馆(Bates文件#523267826-523267833，1988年7月1日，拟议的白肋烟等级指数备忘录)；和Miller等,1990,Tobacco Intern.,192:55-57(所有上述参考文献的全部内容通过引用并入本文)。除非另有说明，USDA等级指数以0-100的数字代表接收的联邦等级，并且是所有叶柄位置的加权平均值。等级指数越高表示质量越高。或者，可以通过超光谱成像确定叶等级。例如，参见WO 2011/027315(2011年3月10日公开，并且全部内容通过引用并入本文)。
在一个方面，当熟化时，本文所述的包含增强的NUE的烟草植物能够生产具有选自下组的USDA等级指数值的叶：55或更高、60或更高、65或更高、70或更高、75或更高、80或更高、85或更高、90或更高、95或更高。在另一个方面，当熟化时，烟草植物能够生产USDA等级指数值与在相似条件下生长和熟化的对照植物的USDA等级指数值相当的叶，其中对照植物与烟草植物具有本文公开的增强的NUE基因座、YB1或YB2等位基因的组合之外基本上相同的遗传背景。在进一步的方面，当熟化时，烟草植物能够生产USDA等级指数值为在相似条件下生长的对照植物的USDA等级指数值的至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约98％的叶，其中对照植物与烟草植物具有除赋予低烟碱的突变或转基因之外基本上相同的遗传背景。在进一步的方面，当熟化时，烟草植物能够生产USDA等级指数值为对照植物的USDA等级指数值的65％-130％、70％-130％、75％-130％、80％-130％、85％-130％、90％-130％、95％-130％、100％-130％、105％-130％、110％-130％、115％-130％或120％-130％的叶。在进一步的方面，当熟化时，烟草植物能够生产USDA等级指数值为对照植物的USDA等级指数值的70％-125％、75％-120％、80％-115％、85％-110％或90％-100％的叶。
在另一个方面，当熟化时，包含本文所述的增强的NUE的烟草植物能够生产具有选自下组的USDA等级指数值的叶：55或更高、60或更高、65或更高、70或更高、75或更高、80或更高、85或更高、90或更高、95或更高。在另一个方面，当熟化时，烟草植物能够生产具有选自下组的USDA等级指数值的叶：50-95、55-95、60-95、65-95、70-95、75-95、80-95、85-95、90-95、55-90、60-85、65-80、70-75、50-55、55-60、60-65、65-70、70-75、75-80、80-85、85-90以及90-95。在进一步的方面，当熟化时，烟草植物能够生产USDA等级指数值为在相似条件下生长的对照植物的USDA等级指数值的至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约98％的叶。在进一步的方面，当熟化时，烟草植物能够生产USDA等级指数值为对照植物的USDA等级指数值的65％-130％、70％-130％、75％-130％、80％-130％、85％-130％、90％-130％、95％-130％、100％-130％、105％-130％、110％-130％、115％-130％或120％-130％的叶。在进一步的方面，当熟化时，烟草植物能够生产USDA等级指数值为对照植物的USDA等级指数值的70％-125％、75％-120％、80％-115％、85％-110％或90％-100％的叶。
在一个方面，本公开还提供包含增强的NUE的烟草植物或其部分，其包含选自下组的烟碱或总生物碱含量：低于3％、低于2.75％、低于2.5％、低于2.25％、低于2.0％、低于1.75％、低于1.5％、低于1.25％、低于1％、低于0.9％、低于0.8％、低于0.7％、低于0.6％、低于0.5％、低于0.4％、低于0.3％、低于0.2％、低于0.1％、和低于0.05％，其中当熟化时，该烟草植物能够生产USDA等级指数值为50或更高、55或更高、60或更高、65或更高、70或更高、75或更高、80或更高、85或更高、90或更高以及95或更高的叶。在另一个方面，这种非转基因烟草植物包含低于2.0％的烟碱含量并且当熟化时能够生产USDA等级指数值为70或更高的叶。在进一步的方面，该非转基因烟草植物包含低于1.0％的烟碱含量并且当熟化时能够生产USDA等级指数值为70或更高的叶。
在一个方面，本公开还提供包含增强的NUE的烟草植物或其部分，所述烟草植物的烟碱或总生物碱水平低于在相似生长条件下生长时对照植物的烟碱水平的1％，2％，5％，8％，10％，12％，15％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％或80％，其中当熟化时，该烟草植物能够生产USDA等级指数值与对照植物的USDA等级指数值相当的叶。
化学测量
一方面，本文提供的烟草植物、种子、植物组分、植物细胞和植物基因组来自选自下组的烟草类型：烤制熟化烟草、晒制熟化烟草、晾制熟化烟草、深色晾制熟化烟草和深色明火烤制熟化烟草。另一方面，本文提供的烟草植物、种子、植物组分、植物细胞和植物基因组来自选自下组的烟草类型：白肋烟、马里兰烟、金黄色烟、弗吉尼亚烟、东方烟草、土耳其烟草和
Figure BDA0003795246920000811
烟草。一方面，本文提供的烟草植物或种子是杂交种植物或种子。如本文所用，通过杂交来自不同品种或物种的两种植物产生“杂交种”，使得后代包含来自每个亲本的遗传物质。熟练的技术人员认识到也可以产生更高阶的杂交种。例如，可以通过将品种C与品种D杂交以产生C x D杂交种来制备第一杂交种，并且可以通过将品种E与品种F杂交以产生E x F杂交种来产生第二杂交种。可以进一步杂交第一和第二杂交种以产生包含来自所有四个亲本品种的遗传信息的高阶杂交种(C x D)x(E x F)。
本文还提供本文所述的烟草植物的群体。一方面，本文提供的烟草植物群体的种植密度为每英亩5,000-8000、5,000-7,600、5,000-7,200、5,000-6,800、5,000-6,400、5,000-6,000、5,000-5,600、5,000-5,200、5,200-8,000、5,600-8,000、6,000-8,000、6,400-8,000、6,800-8,000、7,200-8,000、或7,600-8,000株植物。
“生物碱”是天然存在于植物中的复杂的含氮化合物，并且在人和动物中具有药理作用。“烟碱”是商业化卷烟中的主要天然生物碱，其在红花烟草中约占生物碱含量的90％。烟草中的其他主要生物碱包括可替宁、降烟碱、麦斯明烟草碱、二烯烟碱、假木贼碱和新烟草碱。次要的烟草生物碱包括烟碱-n-氧化物、N-甲基新烟草碱、N-甲基假木贼碱、假氧烟碱、2,3-联吡啶等。
在一个方面，本文提供的增强的NUE烟草植物进一步包含遗传修饰，当在相似生长条件下生长时，与不具有遗传修饰的对照烟草植物相比，所述遗传修饰提供较低含量的选自下组的一种或更多种生物碱：可替宁、降烟碱、麦斯明烟草碱、二烯烟碱、假木贼碱和新烟草碱。在一个方面，更低的生物碱或烟碱含量是指生物碱或烟碱含量低于对照烟草植物的生物碱或烟碱含量的1％、2％、5％、8％、10％、12％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％或80％。在其它方面，更低的生物碱或烟碱含量是指生物碱或烟碱含量为对照烟草植物的生物碱或烟碱含量的约0.5％-1％、1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-6％、6％-7％、7％-8％、8％-9％、9％-10％、11％-12％、12％-13％、13％-14％、14％-15％、15％-16％、16％-17％、17％-18％、18％-19％、19％-20％、21％-22％、22％-23％、23％-24％、24％-25％、25％-26％、26％-27％、27％-28％、28％-29％或29％-30％。在进一步的方面，更低的生物碱或烟碱含量是指生物碱或烟碱含量为对照烟草植物的生物碱或烟碱含量的约0.5％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％。
在一个方面，基于干重，本文提供增强的NUE烟草植物进一步包含选自下组的平均烟碱或总生物碱含量：约0.01％、0.02％、0.05％、0.75％、0.1％、0.15％、0.2％、0.3％、0.35％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4％、5％、6％、7％、8％和9％。在另一个方面，基于干重，本文提供的烟草植物包含选自下组的平均烟碱或总生物碱含量：约0.01％-0.02％、0.02％-0.05％、0.05％-0.75％、0.75％-0.1％、0.1％-0.15％、0.15％-0.2％、0.2％-0.3％、0.3％-0.35％、0.35％-0.4％、0.4％-0.5％、0.5％-0.6％、0.6％-0.7％、0.7％-0.8％、0.8％-0.9％、0.9％-1％、1％-1.1％、1.1％-1.2％、1.2％-1.3％、1.3％-1.4％、1.4％-1.5％、1.5％-1.6％、1.6％-1.7％、1.7％-1.8％、1.8％-1.9％、1.9％-2％、2％-2.1％、2.1％-2.2％、2.2％-2.3％、2.3％-2.4％、2.4％-2.5％、2.5％-2.6％、2.6％-2.7％、2.7％-2.8％、2.8％-2.9％、2.9％-3％、3％-3.1％、3.1％-3.2％、3.2％-3.3％、3.3％-3.4％、3.4％-3.5％和3.5％-3.6％。在进一步的方面，基于干重，本文提供的烟草植物包含选自下组的平均烟碱或总生物碱含量：约0.01％-0.1％、0.02％-0.2％、0.03％-0.3％、0.04％-0.4％、0.05％-0.5％、0.75％-1％、0.1％-1.5％、0.15％-2％、0.2％-3％和0.3％-3.5％。
除非另外指明，否则本文提到的烟草植物、品种、栽培种或品系的生物碱、多胺或烟碱含量(或另一片叶的化学或性质表征)或叶等级指数值的测量值是指平均测量值，例如，包括单株植物的多片叶的平均值或来自单个品种、栽培种或品系的烟草植物群体的平均测量值。除非另外指明，本文描述的烟草植物的烟碱、生物碱或多胺含量(或另一片叶化学或性质表征)是在打顶后2周测量打顶后的叶号3、4和5收集的合并叶样本。在另一个方面，烟草植物的烟碱、生物碱或多胺含量(或另一片叶化学或性质表征)在打顶后测量具有最高水平的烟碱、生物碱或多胺(或另一片叶化学或性质表征)的叶。在一个方面，烟草植物的生物碱、多胺或烟碱含量在打顶后测量叶号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30。在另一个方面，烟草植物的烟碱、生物碱或多胺含量(或另一片叶化学或性质表征)是在打顶后测量选自叶号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30的两片或多片具有连续叶号的叶的组。在另一个方面，烟草植物的烟碱、生物碱或多胺含量(或另一片叶化学或性质表征)是在打顶后测量具有选自下组的叶号的叶：1-5、6-10、11-15、16-20、21-25和26-30。在另一个方面，烟草植物的烟碱、生物碱或多胺含量(或另一片叶化学或性质表征)是在打顶后测量具有选自1-5、6-10、11-15、16-20、21-25和26-30的叶号的两片或多片叶的组。在另一个方面，烟草植物的烟碱、生物碱或多胺含量(或另一片叶化学或性质表征)是在打顶后测量具有选自1-5、6-10、11-15、16-20、21-25和26-30的叶号的三片或多片叶的组。
生物碱含量可以通过本领域已知的方法测定，例如基于气相-液相色谱、高效液相色谱、放射性免疫测定和酶联免疫吸附测定进行定量。例如，烟碱生物碱含量可以通过基于CORESTA推荐方法No.7(1987)的GC-FID方法和ISO标准(ISO TC 126N 394E，也可参见Hibiet al.,Plant Physiology 100:826-35(1992))的使用配备有毛细管柱和FID检测器的气相-液相色谱的方法来测量。除非另有说明，否则本文描述的所有生物碱含量均采用根据CORESTA方法No 62的方法，Determination of Nicotine in Tobacco and TobaccoProducts by Gas Chromatographic Analysis,2005年2月，以及疾病控制中心和Prevention’s Protocol for Analysis of Nicotine,Total Moisture and pH inSmokeless Tobacco Products，如联邦公报1999年3月23日第64卷第55期(以及如2009年1月7日第74卷第4期修改)定义的那些测量。
或者，烟草总生物碱可以使用由Skalar Instrument Co(West Chester，PA)改良并且如文献Collins等,Tobacco Science13:79-81(1969)描述的用于分析烟草样品的分段流动比色法测量。简言之，在分析总生物碱和还原糖之前，将烟草样品干燥、研磨并提取。然后，该方法采用乙酸/甲醇/水提取并采用木炭进行脱色。总生物碱的测定基于芳胺存在下氯化氰与烟碱生物碱反应形成在460nm处测量的有色复合物。除非另有说明，否则本文显示的总生物碱含量或烟碱含量是基于干重(例如，总生物碱百分比或烟碱百分比)。
如本文所用，叶片编号基于烟草茎上的叶片位置，其中叶号1是打顶后最老的叶片(在根部)，并且最高的叶片编号被分配给最新的叶片(在尖端)。
用于测定平均测量值(例如生物碱或烟碱水平或叶等级)的烟草植物群或烟草叶集合可以具有任何大小，例如5、10、15、20、25、30、35、40或50。遵循行业认可的标准协议来测定平均测量或等级指数值。
如本文所用，“打顶”是指当烟草植物接近营养生长成熟或在生殖生长开始时去除茎尖，包括SAM、花、并且直至几片相邻的叶。通常，在现蕾期(在花开始出现后不久)将烟草植物打顶。例如，当50％的植物具有至少一朵开放的花时，可以将温室或田间种植的烟草植物打顶。烟草植物的打顶会导致顶端优势丧失，并导致生物碱产量增加。
通常，在打顶后约2周测量烟草植物的烟碱、生物碱或多胺含量(或另一片叶化学或性质表征)。也可以使用其他时间点。在一个方面，在打顶后约1、2、3、4或5周测量烟草植物的烟碱、生物碱或多胺含量(或另一片叶化学或性质表征)。在一个方面，在打顶后约3、5、7、10、12、14、17、19或21天测量烟草植物的烟碱、生物碱或多胺含量(或另一片叶化学或性质表征)。
如本文所用，“相似的生长条件”是指用于生长的相似环境条件和/或农艺实践，其能够在两种或更多种植物基因型之间进行有意义的比较，使得环境条件或农艺实践都不会有助于或解释在两种或更多种植物基因型之间观察到的任何差异。例如，环境条件包括光、温度、水(湿度)和营养(例如，氮和磷)。例如，农艺实践包括播种、修剪、根切、移栽、打顶和分株。参见Tobacco,Production,Chemistry-Technology,Davis&Nielsen,eds.,BlackwellPublishing,Oxford(1999),pp 70-103的第4B章和第4C章。
如本文所用，“可比叶”是指具有相似大小、形状、年龄和/或茎位置的叶。
TSNA
还在另一个方面，本文提供的烟草植物进一步在编码烟碱脱甲基酶(例如CYP82E4、CYP82E5、CYP82E10)的一个或更多个基因座中包含一个或更多个突变，与在编码烟碱脱甲基酶的一个或更多个基因座中缺少一个或更多个突变的对照植物相比，其赋予减少的降烟碱含量(参见美国专利号8,319,011；8,124,851；9,187,759；9,228,194；9,228,195；9,247,706)。在一个方面，当在可比条件下生长和熟化时，与对照植物相比，所描述的改性烟草植物还包含降低的烟碱脱甲基酶活性。在另一个方面，所提供的烟草植物还包含提供升高水平的一种或更多种抗氧化剂的一个或更多个突变或转基因(参见美国专利申请公开号2018/0119163和WO2018/067985)。在另一个方面，所提供的烟草植物还包含提供降低水平的一种或更多种TSNA(例如N'-亚硝基鸟烟碱(NNN)、4-甲基亚硝基氨基-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N'-亚硝基钠(NAB)及其任何组合)的一个或更多个突变或转基因。在一个方面，使用具有串联质谱的液相色谱(LC/MS/MS)基于冷冻干燥的熟化叶样品测量总TSNA或单独TSNA的水平。
香气/风味
在一个方面，当在相似生长条件下生长时，与对照烟草植物相比，本文提供的烟草植物包含相似含量的选自下组的一种或更多种烟草香气化合物：3-甲基戊酸、戊酸、异戊酸、labdenoid、西松烷、糖酯和还原糖。
如本文所用，烟草香气化合物是与烟草烟气的风味和香气相关的化合物。这些化合物包括但不限于3-甲基戊酸、戊酸、异戊酸、西松烷和labdenoid二萜、和糖酯。烟草香气化合物的浓度可以通过本领域中任何已知的代谢物谱分析方法来测量，包括但不限于气相色谱质谱(GC-MS)、核磁共振光谱、液相色谱-质谱联用。参见Weckwerth和Kahl编辑的“TheHandbook of Plant Metabolomics”(Wiley-Blackwell)(2013年5月28日)。
如本文所用，“还原糖”是具有游离的或潜在游离的醛基或酮基的任何糖(单糖或多糖)。通过降低烟气pH并且有效地减少“游离”未质子化烟碱的量，葡萄糖和果糖在香烟烟气中作为烟碱缓冲物。例如，通过改变烟碱和其他烟草生物碱的感官影响，还原糖平衡烟味。已经报道在各种烟草品种间、同一品种内，以及在因种植条件引起的同一株系内，糖含量和生物碱含量之间呈反比关系。还原糖含量可以使用由Skalar Instrument Co(WestChester，PA)改良并如文献Davis,Tobacco Science 20:139-144(1976)描述的用于分析烟草样品的分段流动比色法测量。例如，样品用碳酸钠溶液透析。将铜新亚铜试剂(Copper neocuproin)添加到样品并且加热溶液。在糖存在下，铜新亚铜试剂螯合物被还原，形成在460nm处测量的有色复合物。
烟草类型
在一个方面，所提供的烟草植物来自选自下组的烟草类型：烤制熟化烟草、晾制熟化烟草、深色晾制熟化烟草、深色明火烤制熟化烟草、
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烟草和东方烟草。在另一个方面，所提供的烟草植物来自选自下组的烟草类型：白肋烟、马里兰烟和深色烟。
在一个方面，所提供的烟草植物为烤制熟化烟草背景或表现出本文所述的一种或更多种烤制熟化烟草特性。烤制熟化烟草(也被称为弗吉尼亚或淡色烟)占世界烟草产量的约40％。烤制熟化烟草通常也被称为“淡色烟”，因为它在熟化期间呈现金黄色到深橙色。烤制熟化烟草具有清淡的香气和味道。烤制熟化烟草通常含糖量高且含油量低。主要的烤制熟化烟草种植国为阿根廷、巴西、中国、印度、坦桑尼亚和美国。在一个方面中，本文提供的烟草植物或种子或改性烟草植物或种子是选自由表1中列出的品种和基本上衍生自前述品种中任一种的任何品种组成的群组的烤制熟化烟草品种。参见WO 2004/041006 A1。在进一步的方面中，本文提供的改性烟草植物或种子是选自由K326、K346和NC196组成的群组的烤制熟化烟草品种。
表1.烤制熟化烟草品种
Figure BDA0003795246920000871
Figure BDA0003795246920000881
Figure BDA0003795246920000891
在一个方面，所提供的烟草植物为晾制熟化烟草背景或表现出本文所述的一种或更多种晾制熟化烟草特性。晾制熟化烟草包括“白肋烟”、“马里兰烟”和“深色烟”。连接晾制熟化烟草的共同的因素是熟化主要在没有人为热源和湿度的情况下发生。白肋烟的颜色为从浅色到深棕色，含油量高，且含糖量低。白肋烟通常在烤房里晾制熟化。主要的白肋烟种植国包括阿根廷、巴西、意大利、马拉维和美国。
马里兰烟非常蓬松，具有良好的燃烧特性、低烟碱和中性香气。主要的马里兰烟种植国包括美国和意大利。
在一个方面中，本文提供的烟草植物或种子或改性烟草植物或种子是选自由表2中列出的白肋烟品种和基本上衍生自前述品种中任一种的任何品种组成的群组的烤制熟化烟草品种。在另一方面中，本文提供的改性烟草植物或种子是选自TN90、KT209、KT206、KT212和HB4488的白肋烟品种。
表2.白肋烟品种
Figure BDA0003795246920000892
Figure BDA0003795246920000901
在另一个方面中，本文提供的烟草植物或种子或改性烟草植物或种子是选自由表3中列出的烟草品种和基本上衍生自前述品种中任一种的任何品种组成的群组的马里兰烟品种。
表3.马里兰烟品种
Maryland 10(TC 498) K326
Maryland 14D2(TC 499) K346
Maryland 201(TC 503) K358
Maryland 21(TC 500) K394
Maryland 341(TC 504) K399
Maryland 40 K730
Maryland 402 NC196
Maryland 59(TC 501) NC37NF
Maryland 601 NC471
Maryland 609(TC 505) NC55
Maryland 64(TC 502) NC92
Maryland 872(TC 506) NC2326
Maryland Mammoth(TC 507) NC95
Banket A1 NC925
在一个方面，所提供的烟草植物为深色晾制熟化烟草背景或表现出本文所述的一种或更多种深色晾制熟化烟草特性。深色晾制熟化烟草与其他烟草类型的区别主要在于其熟化过程，该熟化过程使深色晾制熟化烟草具有中棕色至深棕色和独特的香气。深色晾制熟化烟草主要用于生产嚼烟和含烟。在一个方面中，本文提供的改性烟草植物或种子是选自由以下：Sumatra、Jatim、Dominican Cubano、Besuki、One sucker、Green River、Virginia晒烟和Paraguan Passado，和基本上衍生自任何一种前述品种的任何品种组成的群组的深色晾制熟化烟草品种。
在一个方面，所提供的烟草植物为深色明火烤制熟化烟草背景或表现出本文所述的一种或更多种深色明火烤制熟化烟草特性。深色明火烤制熟化烟草通常在封闭的熟化房的地板上用低燃木熏制。深色烤制熟化烟草通常用于制造混合烟斗丝、卷烟、嚼烟、含烟和味道浓烈的雪茄烟。深色明火烤制熟化烟草的主要种植地区是美国田纳西州、肯塔基州和弗吉尼亚州。在一个方面中，本文提供的改性烟草植物或种子是选自表4中列出的烟草品种的深色烤制熟化烟草品种和基本上衍生自前述品种中的任一种的任何品种。
表4.深色明火烤制熟化烟草品种
Figure BDA0003795246920000921
在一个方面，提供的烟草植物为东方烟草背景或表现出本文所述的一种或更多种东方烟草特征。东方烟草也被称为希腊、芳香和土耳其烟，因为它们通常生长在东地中海地区，诸如土耳其、希腊、保加利亚、马其顿、叙利亚、黎巴嫩、意大利和罗马尼亚。东方烟草品种的小植株尺寸和小叶尺寸以及其独特的香气特性是它们适应其中它们发育的贫瘠的土壤和恶劣的气候条件的结果。在一个方面中，本文提供的烟草植物或种子或改性烟草植物或种子是选自由表5中列出的烟草品种和基本上衍生自前述品种中任一种的任何品种组成的群组的东方烟草品种。
表5.东方烟草品种
Figure BDA0003795246920000931
在一个方面中，本文提供的烟草植物或种子或改性烟草植物或种子是选自由表6中列出的烟草品种和基本上衍生自前述品种中任一种的任何品种组成的群组的雪茄烟品种。
表6.雪茄烟品种
Figure BDA0003795246920000932
Figure BDA0003795246920000941
在一个方面中，本文提供的烟草植物或种子或改性烟草植物或种子是选自由表7中列出的烟草品种和基本上衍生自前述品种中任一种的任何品种组成的群组的烟草品种。
表7.其他烟草品种
Chocoa(TI 319)
Hoja Parada(TI 1089)
Hoja Parado(Galpoa)(TI 1068)
Perique(St.James Parrish)
Perique(TC 556)
Perique(TI 1374)
Sylvestris(TI 984)
TI 179
在一个方面，本文所述的改性烟草植物、种子或细胞来自选自由表1、表2、表3、表4、表5、表6和表7中所列的烟草品种组成的组的品种。
在一个方面，低生物碱或低烟碱烟草植物、种子、杂交种、品种或品系基本上衍生自以下品种或是选自以下品种的遗传背景：BU 64、CC 101、CC 200、CC 27、CC 301、CC 400、CC 500、CC 600、CC 700、CC 800、C 900、Coker 176、Coker 319、Coker 371Gold、Coker 48、CU 263、DF911、Galpao烟、GL 26H、GL 350、GL 600、GL 737、GL 939、GL 973、HB 04P、K 149、K 326、K 346、K 358、K394、K 399、K 730、KDH 959、KT 200、KT204LC、KY 10、KY 14、KY 160、KY 17、KY 171、KY 907、KY907LC、KTY14 x L8 LC、Little Crittenden、McNair 373、McNair944、msKY 14xL8、Narrow Leaf Madole、NC 100、NC 102、NC 2000、NC 291、NC 297、NC 299、NC 3、NC 4、NC 5、NC 6、NC7、NC 606、NC 71、NC 72、NC 810、NC BH 129、NC 2002、NealSmith Madole、OXFORD 207、`Perique`烟、PVH03、PVH09、PVH19、PVH50、PVH51、R 610、R630、R 7-11、R 7-12、RG 17、RG 81、RG H51、RGH 4,RGH 51,RS 1410,Speight 168、Speight172、Speight 179、Speight 210、Speight 220、Speight 225、Speight 227、Speight 234、Speight G-28、Speight G-70、Speight H-6、Speight H20、Speight NF3、TI 1406、TI1269、TN 86、TN86LC、TN 90、TN 97、TN97LC、TN D94、TN D950、TR(Tom Rosson)Madole、VA309或VA359、马里兰609、HB3307PLC、HB4488PLC、KT206LC、KT209LC、KT210LC、KT212LC、R610LC、PVH2310、NC196、KTD14LC、KTD6LC、KTD8LC、PD7302LC、PD7305LC、PD7309LC、PD7318LC、PD7319LC、PD7312LC、ShireyLC，或根据本领域已知的标准烟草育种技术的任何商业化烟草品种。
所有前面提及的深色晾制熟化、白肋烟、马里兰烟、深色明火烤制熟化或东方类型的具体品种仅出于示例性目的而列出。在本申请中还涵盖任何其他的深色晾制熟化、白肋烟、马里兰烟、深色明火烤制熟化或东方品种。
本文还提供所描述的烟草植物的群体。在一个方面，烟草植物群体的种植密度为每英亩约5,000至约8000、约5,000至约7,600、约5,000至约7,200、约5,000至约6,800、约5,000至约6,400、约5,000至约6,000、约5,000至约5,600、约5,000至约5,200、约5,200至约8,000、约5,600至约8,000、约6,000至约8,000、约6,400至约8,000、约6,800至约8,000、约7,200至约8,000、或约7,600至约8,000株植物。在另一个方面，烟草植物群体是在具有低至中等肥力的土壤类型中。
本文还提供来自所描述烟草植物的种子的容器。本公开的烟草种子的容器可包含任何数量、重量或体积的种子。例如，容器可以包含至少或大于约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000粒或更多的种子。或者，容器可含有至少或大于约50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000克或更多的种子。烟草种子的容器可以是本领域可用的任何容器。作为非限制性示例，容器可以是盒子、袋子、小包、小袋、带卷、管或瓶子。
突变类型
如本文所用，“遗传修饰”是指植物或植物基因组的遗传组成的改变。可以通过包括但不限于诱变、基因组编辑、遗传转化或其组合的方法引入遗传修饰。遗传修饰包括例如基因中的突变(例如非天然突变)或靶向基因的转基因(例如精氨酸脱羧酶(ADC)转基因靶向ADC基因)。如本文所用，“靶向”是指直接上调或直接下调基因的表达或活性。如本文所用，在影响基因表达或活性的转基因的上下文中，“直接”是指通过基因(例如，启动子区或UTR区)或其中编码的产物(例如，mRNA分子或多肽)与转基因编码的产物(例如，小的非编码RNA分子或蛋白质，如转录因子或显性失活多肽变体)之间的物理接触或化学相互作用对基因施加的影响。在一个方面，转基因影响靶基因的表达或活性而不涉及转录因子(例如，转基因不编码转录因子和/或不抑制转录因子的表达或活性，所述转录因子进而调节靶基因)。
如本文所用，“突变”是指引入基因中以改变由基因的参考序列编码的产物的表达或活性的可遗传的遗传修饰。特定基因中的突变，例如精氨酸脱羧酶(ADC)称为ADC突变体。这样的修饰可以在基因的任何序列区域中，例如在启动子、5'UTR、外显子、内含子、3'UTR或终止子区域中。在一个方面，突变减少、抑制或消除基因产物的表达或活性。在另一方面，突变增加、提高、强化或增大基因产物的表达或活性。一方面，突变不是存在于特定烟草品种或栽培品种中的天然多态性。应当理解，当鉴定突变时，参考序列应当来自相同的烟草品种或背景。例如，如果包含突变的改性烟草植物来自TN90品种，则相应的参考序列应当是内源TN90序列，而不是来自不同烟草品种(例如，K326)的同源序列。在一个方面，突变是“非天然的”或“非天然存在的”突变。如本文所用，“非天然的”或“非天然存在的”突变是指不是并且不对应于在没有人为干预的情况下产生的自发突变的突变。人为干预的非限制性实例包括诱变(例如，化学诱变、电离辐射诱变)和靶向遗传修饰(例如，基于CRISPR的方法、基于TALEN的方法、基于锌指的方法)。非天然突变和非天然发生的突变不包括天然产生的自发突变(例如，通过植物种系中的异常DNA复制)。
在一个方面，本公开提供了在增强的NUE基因座中包含非天然突变的烟草植物或其部分。在一个方面，非天然突变包括选自无义突变、错义突变、移码突变、剪接位点突变及其任何组合的一种或更多种突变类型。如本文所用，“无义突变”是指通过核酸序列将提前终止密码子引入氨基酸序列的核酸序列突变。如本文所用，“错义突变”是指在核酸序列编码的氨基酸序列内引起取代的核酸序列突变。如本文所用，“移码突变”是指核酸序列的插入或缺失，其移码以用于将核酸序列翻译为氨基酸序列。“剪接位点突变”是指核酸序列中的突变，其导致内含子保留用于蛋白质翻译，或可选地，导致外显子从蛋白质翻译中排除。剪接位点突变可引起无义、错义或移码突变。
当突变的信使RNA(mRNA)被翻译成蛋白质或多肽时，基因编码区中的突变(例如外显子突变)可产生截短的蛋白质或多肽。一方面，本公开提供了导致蛋白质或多肽截短的突变。如本文所用，“截短的”蛋白质或多肽与内源对照蛋白质或多肽相比包含至少少一个氨基酸。例如，如果内源蛋白A包含100个氨基酸，蛋白A的截短形式可包含1-99个氨基酸。
不受任何科学理论的限制，引起蛋白质或多肽截短的一种方式是通过在内源基因的mRNA转录物中引入过早终止密码子。在一个方面，本公开提供了导致内源基因的mRNA转录物中提前终止密码子的突变。如本文所用，“终止密码子”是指mRNA转录物中发出蛋白质翻译终止信号的核苷酸三联体。“提前终止密码子”是指在内源mRNA转录物中比正常终止密码子位置更早定位(例如，在5'侧)的终止密码子。不受限制的情况下，本领域已知几种终止密码子，包括“UAG”，“UAA”，“UGA”，“TAG”，“TAA”和“TGA”。
在一个方面，本文提供的突变包括无效突变。如本文所用，“无效突变”是指赋予由包含突变的基因编码的蛋白质完全丧失功能的突变，或者赋予由基因组基因座编码的小RNA完全丧失功能的突变。无效突变可导致mRNA转录产物的缺乏、小RNA转录产物的缺乏、蛋白质功能的缺乏或其组合。
本文提供的突变可以位于内源基因的任何部分。在一个方面，本文提供的突变位于内源基因的外显子内。在另一方面，本文提供的突变位于内源基因的内含子内。在另一方面，本文提供的突变位于内源基因的5'-非翻译区(UTR)内。在另一方面，本文提供的突变位于内源基因的3'-UTR内。在另一方面，本文提供的突变位于内源基因的启动子内。在另一方面，本文提供的突变位于内源基因的终止子内。
在一个方面，与缺乏突变的内源基因相比，内源基因中的突变导致表达水平降低。在另一方面，与缺乏突变的内源基因相比，内源基因中的突变导致表达水平增加。
在一个方面，与对照烟草植物中基因的表达相比，非天然突变导致表达水平降低。一方面，与对照烟草植物中基因的表达相比，非天然突变导致表达水平增加。
在另一方面，与由缺乏突变的内源基因编码的蛋白质或多肽相比，内源基因中的突变导致由具有突变的内源基因编码的蛋白质或多肽的活性水平降低。在另一方面，与由缺乏突变的内源基因编码的蛋白质或多肽相比，内源基因中的突变导致由具有突变的内源基因编码的蛋白质或多肽的活性水平增加。
在一个方面，与由缺乏非天然突变的多核苷酸编码的蛋白质或多肽相比，非天然突变导致由包含非天然突变的多核苷酸编码的蛋白质或多肽的活性水平降低。在另一方面，与缺乏非天然突变的多核苷酸编码的蛋白质或多肽相比，非天然突变导致由包含非天然突变的多核苷酸编码的蛋白质或多肽的活性水平增加。
在一个方面，本文提供的突变提供了激活目的基因(例如一个或更多个增强的NUE基因座)的表达或提高其活性的显性突变体。
本领域常规研究基因表达水平。作为非限制性实例，可以使用定量逆转录酶PCR(qRT-PCR)、RNA测序或Northern印迹测量基因表达。在一个方面，使用qRT-PCR测量基因表达。另一方面，使用Northern印迹测定基因表达。在另一方面，使用RNA测序测量基因表达。
增强的NUE烟草植物可以通过本领域已知的任何方法制备，包括随机或靶向诱变方法。此类诱变方法包括但不限于用甲基硫酸乙酯(EMS)处理种子(Hildering和Verkerk,In,The use of induced mutations in plant breeding.Pergamon press,pp 317-320,1965)或UV-辐射、X-射线和快中子辐照(参见，例如Verkerk,Neth.J.Agric.Sci.19:197-203,1971；和Poehlman,Breeding Field Crops,Van Nostrand Reinhold,New York(3.sup.rd ed),1987)、转座子标签(Fedoroff等人，1984；美国专利号4,732,856和美国专利号5,013,658)以及T-DNA插入法(Hoekema等人，1983；美国专利号5,149,645)。EMS诱导的诱变由在基因组的长度上化学诱导随机点突变组成。快中子诱变包括将种子暴露于中子轰击，其通过双链DNA断裂引起大量缺失。转座子标签包含在内源基因内插入转座子以减少或消除基因的表达。例如，可能存在于烟草基因中的突变的类型包括点突变、缺失、插入、复制和逆转。此类突变期望存在于烟草基因的编码区域中。然而，烟草基因的启动子区、和内含子或非翻译区中的突变也可能是期望的。
此外，用于筛选化学诱导的突变的快速并且可自动化的方法，TILLING(定向诱导基因组局部突变)也适用于本公开，其使用变性HPLC或选择性核酸内切酶消化选择的PCR产物。参见McCallum等人(2000)Nat.Biotechnol.18:455-457。影响基因表达或干扰基因的功能的突变可以使用本领域公知的方法来确定。基因外显子中的插入突变通常导致无效突变体。保守性残基中的突变可以特别有效地抑制蛋白的功能。在一个方面中，烟草植物在美国临时申请第62/616,959和62/625,878号中描述的一个或更多个NCG基因中包含无义(例如，终止密码子)突变，这两个申请通过引用以其整体并入本文。
在一个方面，本公开还提供一种具有增强的NUE同时保持商业上可接受的叶质量的烟草品系。在一个方面，这种品系可以通过经由精确的基因组工程技术将突变引入到一个或更多个增强的NUE基因座中产生，例如转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)、巨核酸酶、锌指核酸酶和成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/Cas9系统、CRISPR/Cpf1系统、CRISPR/Csm1系统及其组合(参见，例如美国专利申请公开2017/0233756)。参见，例如，Gaj等人，Trends in Biotechnology,31(7):397-405(2013)。Anzalone et al.(“Search-and-replace genome editing without double-stranded breaks or donor DNA,”Nature,21October 2019(doi[dot]org/10.1038/s41586-019-1711-4))描述的使用与RNA可编程切口酶(例如，修饰的Cas9)融合的逆转录酶的主要编辑方法也可用于将突变引入一个或更多个增强的NUE基因座。
诱变的烟草植物的筛选和选择可以通过本领域普通技术人员已知的任何方法进行。筛选和选择方法的示例包括但不限于Southern分析、用于检测多核苷酸的PCR扩增、Northern印迹、RNase保护、引物延伸、用于检测RNA转录物的RT-PCR扩增、Sanger测序、下一代测序技术(例如，Illumina、PacBio、Ion Torrent、454)、用于检测多肽和多核苷酸的酶或核酶活性的酶测定，以及蛋白质凝胶电泳、Western印迹、免疫沉淀法以及用于检测多肽的酶联免疫测定法。诸如原位杂交、酶染色和免疫染色的其他技术也可用于检测多肽和/或多核苷酸的存在或表达。用于实施所有引用的技术的方法是已知的。
在一个方面中，本文提供的烟草植物或植物基因组通过选自下组的核酸酶通过基因组编辑技术突变或编辑：巨核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas9核酸酶、CRISPR/Cpf1核酸酶或CRISPR/Csm1核酸酶。
如本文所使用，“编辑”或“基因组编辑”是指内源植物基因组核酸序列的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10个核苷酸的靶向诱变，或内源植物基因组核酸序列的去除或置换。在一个方面中，所提供的编辑的核酸序列与内源核酸序列具有至少99.9％、至少99.5％、至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少94％、至少93％、至少92％、至少91％、至少90％、至少85％、至少80％或至少75％的序列同一性。在一个方面，所提供的编辑的核酸序列与SEQ ID NO：1-8或25-40及其片段具有至少99.9％、至少99.5％、至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少94％、至少93％、至少92％、至少91％、至少90％、至少85％、至少80％或至少75％的序列同一性。
巨核酸酶、ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9、CRISPR/Csm1和CRISPR/Cpf1在基因组序列的靶位点处诱导双链DNA断裂，然后通过同源重组(HR)或非同源末端连接(NHEJ)的自然过程修复。然后，在切割位点发生序列修饰，其可以包括在NHEJ的情况下导致基因破坏的缺失或插入，或通过HR整合供体核酸序列。在一个方面中，所提供的方法包括用提供的核酸酶编辑植物基因组，以通过HR用供体多核苷酸突变植物基因组中的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10或多于10个核苷酸。在一个方面中，所提供的突变由使用核酸酶的基因组编辑引起。在另一个方面中，所提供的突变由非同源末端连接或同源重组引起。
巨核酸酶(其通常在微生物中鉴定)是具有高活性和长识别序列(＞14bp)的独特酶，其导致靶DNA的位点特异性消化。天然存在的巨核酸酶的工程改造版本通常具有延伸的DNA识别序列(例如，14至40bp)。由于巨核酸酶的DNA识别和切割功能在单个结构域中相互交织，因此巨核酸酶的工程改造可能比ZFN和TALEN更具挑战性。诱变和高通量筛选的专门方法已经被用于产生识别独特序列并具有改进的核酸酶活性的新型巨核酸酶变体。
ZFN是由与FokI限制性内切酶的切割结构域融合的工程改造的锌指DNA结合结构域组成的合成蛋白质。ZFN可以被设计成切割几乎任何长度的双链DNA，以用于修饰锌指DNA结合结构域。ZFN从由FokI核酸内切酶的非特异性DNA切割结构域构成的单体形成二聚体，所述结构域与经工程改造以结合靶DNA序列的锌指阵列融合。
ZFN的DNA结合结构域通常由3-4个锌指阵列构成。相对于锌指∞-螺旋起点的-1、+2、+3和+6位置的氨基酸(其有助于与靶DNA的位点特异性结合)可以改变和定制，以适合特定的靶序列。其他氨基酸形成共有骨架(consensus backbone)，以生成具有不同序列特异性的ZFN。用于选择ZFN的靶序列的规则是本领域已知的。
FokI核酸酶结构域需要二聚化以切割DNA，因此需要两个带有C-末端区域的ZFN来结合切割位点的相反DNA链(分开5-7bp)。如果两个ZF结合位点是回文的，则ZFN单体可以修饰靶位点。如本文所使用，术语“ZFN”是广义的，并且包括在没有另一个ZFN的帮助的情况下可以切割双链DNA的单体ZFN。术语ZFN也用于指一对ZFN中的一个或两个成员，它们被工程改造成一起工作以在同一位点切割DNA。
不受任何科学理论的限制，因为锌指结构域的DNA结合特异性原则上可以使用各种方法之一进行重新工程改造，所以理论上可以构建定制的ZFN以靶向几乎任何基因序列。公开可用的用于工程改造锌指结构域的方法包括上下文依赖组装(CoDA)、寡聚体库工程(OPEN)和模块化组装。
TALEN是通过将转录激活子样效应子(TALE)DNA结合结构域与FokI核酸酶结构域融合而产生的人工限制酶。当TALEN对的每个成员与靶位点侧翼的DNA位点结合时，FokI单体二聚并导致在靶位点处双链DNA断裂。如本文所使用，术语TALEN是广义的，并且包括在没有另一个TALEN的帮助下可以切割双链DNA的单体TALEN。术语TALEN也用于指一对TALEN中的一个或两个成员，它们共同作用以在同一位点处切割DNA。
转录激活子样效应子(TALE)可以被工程改造以结合几乎任何DNA序列。TALE蛋白是衍生自黄单胞菌属的各种植物细菌病原体的DNA结合结构域。在感染过程中，黄单胞菌属病原体向宿主植物细胞中分泌TALE。TALE移动至细胞核，在细胞核中识别并结合至宿主基因组中特定基因的启动子区域中特定DNA序列的启动子区域中的特定DNA序列。TALE具有由33-34个氨基酸的13-28个重复单体构成的中央DNA结合结构域。除12和13位的高变氨基酸残基外，每种单体的氨基酸是高度保守的。这两种可变氨基酸被称为重复可变双残基(RVD)。RVD的氨基酸对NI、NG、HD和NN分别优先识别腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤/腺嘌呤，并且RVD的调节可以识别连续的DNA碱基。氨基酸序列与DNA识别之间的这一简单关系允许通过选择含有适当RVD的重复区段的组合来工程改造特异性DNA结合结构域。
除野生型FokI切割结构域外，已经设计了具有突变的FokI切割结构域的变体，以提高切割特异性和切割活性。FokI结构域起二聚体的作用，需要两个具有独特DNA结合结构域的构建体，用于在靶基因组中具有适当取向和间隔的位点。TALEN DNA结合结构域和FokI切割结构域之间的氨基酸残基的数量以及两个单独的TALEN结合位点之间的碱基的数量都是用于实现高水平活性的参数。
TALE结合结构域的氨基酸序列和DNA识别之间的关系允许可设计的蛋白质。诸如DNA Works等软件程序可以用于设计TALE构建体。设计TALE构建体的其他方法是本领域技术人员已知的。参见，Doyle等人，Nucleic Acids Research(2012)40:W117-122；Cermak等人，Nucleic Acids Research(2011).39:e82；以及tale-nt.cac.cornell.edu/about。
CRISPR/Cas9系统、CRISPR/Csm1、CRISPR/Cpf1系统或主要编辑系统(参见Anzalone等人)是基于FokI的方法ZFN和TALEN的替代物。CRISPR系统基于RNA引导的工程改造的核酸酶，其利用互补碱基配对来识别靶位点处的DNA序列。
CRISPR/Cas9、CRISPR/Csm1和CRISPR/Cpf1系统是细菌和古细菌的适应性免疫系统的一部分，通过以序列依赖性方式切割外源DNA来保护它们免受核酸(诸如病毒)的入侵。免疫通过入侵DNA的短片段的整合获得，这些短片段被称为CRISPR基因座的近端处的两个相邻重复序列之间的间隔序列。CRISPR阵列(包括间隔序列)在随后与侵入性DNA相遇时被转录，并被加工成长度约40nt的小干扰CRISPR RNA(cr RNA)，其与反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)结合，以激活和引导Cas9核酸酶。这将切割入侵DNA中被称为原间隔子的同源双链DNA序列。切割的先决条件是在靶DNA的下游存在保守的前间区序列邻近基序(PAM)，其通常具有序列5-NGG-3，但通常NAG较低。特异性由PAM上游约12个碱基的所谓的“种子序列”提供，它必须在RNA和靶DNA之间匹配。Cpf1和Csm1以与Cas9相似的方式起作用，但Cpf1和Csm1不需要tracrRNA。
Anzalone等人描述的主要编辑系统使用与RNA-可编程切口酶融合的逆转录酶和主要编辑延伸的向导RNA(pegRNA)，以将遗传信息从pegRNA直接拷贝到靶基因组基因座中。
如本文所用，“改性”是指经历诱变、基因组编辑、遗传转化或其组合的植物、种子、植物组分、植物细胞和植物基因组。
如本文所用，“同源转基因”或“顺化基因”是指植物、植物细胞或植物基因组的遗传修饰，其中所有组分(例如，启动子、供体核酸、选择基因)仅具有植物来源(即，不使用非植物来源的组分)。一方面，本文提供的改性植物、植物细胞或植物基因组是顺化基因的。本文提供的顺化基因植物、植物细胞和植物基因组可产生即用型烟草品系。另一方面，本文提供的改性烟草植物不包含非烟草的遗传物质或序列。
如本文所用，“功能性片段”或“其功能性片段”是指保留其所指的全长序列的功能的任何大小的核苷酸或氨基酸序列。一方面，功能性片段的长度可以是至少5个、至少10个、至少25个、至少50个、至少75个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个、至少700个、至少800个、至少900个、至少1000个、至少2000个、至少3000个、至少4000个、至少5000或大于5000个核苷酸。一方面，功能性片段的长度可以是至少5个、至少10个、至少25个、至少50个、至少75个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个、至少700个、至少800个、至少900个、至少1000个、至少2000或大于2000个氨基酸。一方面，功能性片段的长度可以是5-5000个核苷酸、10-4000个核苷酸、25-3000个核苷酸、50-2000个核苷酸、75-1000个核苷酸、100-900个核苷酸、150-800个核苷酸、200-700个核苷酸、250-600个核苷酸或300-500个核苷酸。一方面，功能性片段的长度可以是5-2000个氨基酸、10-1000个氨基酸、25-900个氨基酸、50-800个氨基酸、50-800个氨基酸、75-700个氨基酸、100-600个氨基酸、150-500个氨基酸、200-400个氨基酸或250-300个氨基酸。在进一步的方面，将本文描述的多核苷酸以其整体以及作为其任何功能性片段预期。在进一步的方面，将本文所述的多肽以其整体以及作为其任何功能性片段预期。在进一步的方面，将具有SEQ ID NOs:9-24和41-56的序列的多核苷酸以其整体以及作为其任何功能性片段预期。在进一步的方面，将具有SEQ ID NOs:1-8和25-40的序列的多肽以其整体以及作为其任何功能性片段预期。
一方面，可以通过表达本文提供的多核苷酸通过RNA干扰(RNAi)来获得抑制本文提供的一种或更多种多肽的表达。一方面，RNAi包括表达非编码RNA。如本文所用，“非编码RNA”选自下组：microRNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、反式作用siRNA(ta-siRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、内含子、发夹RNA(hpRNA)、包含内含子的发夹RNA(ihpRNA)和向导RNA。一方面，本文提供的单个非编码RNA抑制至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或多于10个多肽的表达。一方面，将本文提供的非编码RNA稳定地转化到植物基因组中。另一方面，将本文提供的非编码RNA瞬时转化到植物基因组中。
如本文所用，术语“下调”和“抑制”定义为本领域已知的或本文所述的降低目标基因产物(例如mRNA、蛋白质、非编码RNA)的表达或功能的任何方法。“抑制”可以在两种植物(例如改性植物VS对照植物)之间进行比较。或者，抑制靶基因产物的表达或功能可以在相同植物内的或不同植物之间的植物细胞、细胞器、器官、组织或植物组分之间进行比较，并且包括在相同植物或植物组分内的或在植物或植物组分之间的发育阶段或时间阶段之间的比较。“抑制”包括目标基因产物的功能或产生的任何相对减少，直至并包括完全消除该基因产物的功能或产生。术语“抑制”涵盖下调靶基因产物的翻译和/或转录或靶基因产物的功能活性的任何方法或组合物。
术语“抑制性序列”涵盖能够抑制植物中基因表达或功能的任何多核苷酸或多肽序列，例如全长多核苷酸或多肽序列、截短的多核苷酸或多肽序列、多核苷酸或多肽序列的片段、多核苷酸或多肽序列的变体、有义方向的核苷酸序列、反义方向的核苷酸序列、有义或反义方向的核苷酸序列的互补序列、核苷酸序列的反向区域、核苷酸序列的发夹、双链核苷酸序列、单链核苷酸序列、其组合等。术语“多核苷酸序列”包括RNA、DNA、化学修饰的核酸、核酸类似物、其组合等的序列。
当在多核苷酸抑制性序列的背景下使用短语“能够抑制”时，意指抑制性序列本身发挥抑制作用；或者，当抑制性序列编码抑制性核苷酸分子(例如发夹RNA、miRNA或双链RNA多核苷酸)或编码抑制性多肽(例如抑制靶基因产物的表达或功能的多肽)时，在其转录后(例如在编码发夹RNA、miRNA或双链RNA多核苷酸的抑制性序列的情况下)或其转录和翻译(在编码抑制性多肽的抑制性序列的情况下)后，转录或翻译产物分别对靶基因产物发挥抑制作用(例如抑制靶基因产物的表达或功能)。
本文提供的抑制性序列可以是通过本领域已知的任何沉默路径或机制触发基因沉默的序列，包括但不限于有义抑制/共抑制、反义抑制、双链RNA(dsRNA)干扰、发夹RNA干扰和包含内含子的发夹RNA干扰、扩增子介导的干扰、核酶、小干扰RNA、人工或合成的microRNA、以及人工反式作用siRNA。取决于所需的结果，抑制性序列可以为至少20个核苷酸、至少50个核苷酸、至少70个核苷酸、至少100个核苷酸、至少150个核苷酸、至少200个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少350个核苷酸、至少400个核苷酸，直至编码本公开蛋白质的全长多核苷酸。一方面，抑制性序列可以是长度为50-400个核苷酸、70-350个核苷酸、90-325个核苷酸、90-300个核苷酸、90-275个核苷酸、100-400个核苷酸、100-350个核苷酸、100-325个核苷酸、100-300个核苷酸、125-300个核苷酸或125-275个核苷酸的片段。
MicroRNA(miRNA)是非蛋白质编码RNA，通常在19-25个核苷酸之间(在植物中通常为20-24个核苷酸)，其引导靶标转录物的反式切割，负调节参与各种调控和发育路径的基因的表达(Bartel(2004)Cell,116:281-297)。在一些情况下，miRNA用于引导siRNA初级转录物的同步加工(参见Allen等(2005)Cell，121：207-221)。
已经鉴定了许多microRNA基因(MIR基因)并可在数据库中公开获得(“miRBase”，在microrna.sanger.ac.uk/sequences可在线获得；还参见Griffiths-Jones等(2003)Nucleic Acids Res.,31:439-441)。据报道，MIR基因出现在基因间区域(在基因组中是分离的且成簇的)，但也可以完全或部分位于其他基因(蛋白质编码和非蛋白质编码)的内含子中。至少在某些情况下，MIR基因的转录可以在MIR基因自身启动子的促进控制下进行。初级转录物，称为“pri-miRNA”，可以是相当大的(几千碱基)并且可以是多顺反子的，包含一个或更多个pre-miRNA(包含茎环排列的折叠结构，其被加工成成熟miRNA)以及mRNA常有的5'“帽”和多腺苷酸化尾。
来自其相应前体(pri-miRNA和pre-miRNA)的成熟miRNA的成熟度在动物和植物之间显著不同。例如，在植物细胞中，microRNA前体分子被认为主要在细胞核中完全加工成成熟miRNA，而在动物细胞中，pri-miRNA转录物在细胞核中由动物特异性酶Drosha加工，然后pre-miRNA被输出到细胞质中，进一步被加工成成熟的miRNA。植物中的成熟miRNA的长度典型地为21个核苷酸。
转基因表达miRNA(无论是天然存在的序列还是人工序列)可用于调节miRNA的一种或更多种靶基因的表达。在转基因表达的转录物中包含miRNA识别位点也可用于调节转录物的表达；例如，参见Parizotto等(2004)Genes Dev.,18:2237-2242。已经在mRNA的所有区域中验证了miRNA的识别位点，包括5'非翻译区、编码区和3'非翻译区，表明miRNA靶位点相对于编码序列的位置可能不一定影响抑制。因为miRNA是真核生物中重要的调控元件，所以miRNA的转基因抑制可用于操纵生物路径和反应。最后，MIR基因的启动子可以具有非常特异的表达模式(例如细胞特异性、组织特异性、时间特异性或可诱导)，因此可用于重组构建体以诱导与它们可操作地连接的DNA序列的这种特异性转录。miRNA、它们的前体、它们的识别位点和它们的启动子的各种用途是已知的。这些用途的非限制性实例包括：(1)表达天然miRNA或miRNA前体序列以抑制靶基因；(2)表达人工miRNA或miRNA前体序列以抑制靶基因；(3)表达具有miRNA识别位点的转基因，其中当表达成熟miRNA时，转基因被抑制；(4)表达由miRNA启动子驱动的转基因。
对于miRNA前体的miRNA茎区中的核苷酸，设计人工miRNA序列可以像替换与预期靶标互补的序列一样简单。用于确定天然miRNA序列中的核苷酸变化以制备工程化miRNA前体的一般方法的一个非限制性实例包括以下步骤：(a)选择靶基因特异性的至少18个核苷酸的独特靶序列，例如通过使用序列比对工具(例如烟草cDNA和基因组DNA数据库的
Figure BDA0003795246920001091
(参见例如，Altschul等(1990)J.Mol.Biol.,215:403-410；Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.,25:3389-3402))，以鉴定靶转录物直系同源物和与无关基因的任何潜在匹配，从而避免非靶标序列的无意沉默；(b)分析不需要的序列的靶基因(例如与来自非靶标物种的序列匹配)，并对每个潜在的19-聚体片段的以下进行评分：GC含量、Reynolds得分(参见Reynolds等(2004)Nature Biotechnol.,22:326-330)和由自由能的负差异表征的功能不对称性(“.DELTA..DELTA.G”或“ΔΔG”)。优选选择具有所有或大多数以下特征的19-聚体：(1)Reynolds得分>4，(2)GC含量为40％-60％，(3)负的ΔΔG，(4)末端腺苷，(5)缺乏连续4个或更多个相同的核苷酸；(6)位于靶基因3'末端附近；(7)与miRNA前体转录物的差异最小。据报道，siRNA中每个第三个核苷酸的位置对影响RNAi效力特别重要，可在rna.chem.tu-tokyo.ac.jp/siexplorer.htm公开获得算法“siExplorer”；(c)确定所选19聚体的反向互补序列以用于制备修饰的成熟miRNA。第20位的其他核苷酸优选与选择的靶序列匹配，并且优选选择第21位的核苷酸不配对以防止沉默在靶转录物上扩散，或选择与靶序列配对以促进沉默在靶序列上扩散；和(d)将人工miRNA转入植物。
一方面，本文提供的人工miRNA降低或消除靶基因的RNA转录或蛋白质翻译。
一方面，本文提供的miRNA或人工miRNA处于组织特异性启动子的控制下。在进一步的方面，本文提供的miRNA或人工miRNA处于组织优选启动子的控制下。在进一步的方面，本文提供的miRNA或人工miRNA处于组成型启动子的控制下。
转基因
本公开还提供在植物中，特别是在烟草属的植物中，包括各种商业品种的烟草植物中用于激活或抑制一种或更多种增强的NUE基因座、YB1或YB2的表达或功能的组合物和方法。
如本文所用，术语“抑制”定义为本领域已知的或本文所述的降低目标基因产物(例如靶基因产物)的表达或功能的任何方法。“抑制”可以在两种植物(例如遗传改变的植物与野生型植物)之间进行比较。或者，抑制靶基因产物的表达或功能可以在相同植物内的植物细胞、细胞器、器官、组织或植物部分之间或不同植物之间进行比较，并且包括在同一植物或植物组分内的发育阶段或时间阶段之间或在植物或植物部分之间的比较。“抑制”包括目标基因产物的功能或产生的任何相对减少，直至并包括完全消除该基因产物的功能或产生。术语“抑制”包括下调靶基因产物的翻译和/或转录或靶基因产物的功能活性的任何方法或组合物。在一个方面，改良植物中的一个或更多个基因的mRNA或蛋白水平低于不是突变体或没有被遗传改造以抑制该基因表达的植物中的同一基因的mRNA或蛋白水平的95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。
术语“多核苷酸”的使用不旨在将本公开限制为包含DNA的多核苷酸。本领域普通技术人员将认识到多核苷酸可以包括核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合。这样的脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成的类似物。本公开的多核苷酸还涵盖所有形式的序列，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹、茎环结构等。
如本文所用，“可操作地连接”是指两个或更多个元件之间的功能性连接。例如，目标多核苷酸和调控序列(例如启动子)之间的可操作地连接是允许目标多核苷酸表达的功能性连接。可操作地连接的元件可以是连续的或非连续的。
如本文所用并且当用于指示序列时，“异源”是指序列源自外来物种，或者，如果源自相同物种，则通过有意的人为干预实质上改变它在组合物和/或基因组位点中的天然形式。该术语也适用于核酸构建体，在本文中也称为“多核苷酸构建体”或“核苷酸构建体”。以这种方式，“异源”核酸构建体旨在表示构建体源自外来物种，或者，如果源自相同物种，则通过有意的人为干预实质上改变它在组合物和/或基因组位点中的天然形式。异源核酸构建体包括但不限于例如通过转化方法或随后用另一种目标植物育种转基因植物而已经引入植物或其植物部分的重组核苷酸构建体。在一个方面，使用的启动子与该启动子驱动的序列是异源的。在另一个方面，使用的启动子是烟草异源的。还在一个方面，使用的启动子对于烟草是天然的。
如本文所用，“基因表达”是指基因产物的生物合成或产生，包括基因产物的转录和/或翻译。
在一个方面，重组DNA构建体或表达盒可包含用于选择转基因细胞的选择性标记基因。选择性标记基因包括但不限于编码抗生素抗性的基因，例如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予对除草剂化合物，例如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮类、和2,4-二氯苯氧基乙酸酯(2,4-D)抗性的基因。其他选择性标记包括表型标记，例如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)。
在一个方面，提供的烟草植物还包括参与烟碱生物合成或运输的基因的增加或减少的活性或表达。参与烟碱生物合成的基因包括但不限于精氨酸脱羧酶(ADC)、甲基腐胺氧化酶(MPO)、NADH脱氢酶、鸟氨酸脱羧酶(ODC)、磷酸核糖基氨基苯甲酸酯异构酶(PRAI)、腐胺N-甲基转移酶(PMT)、喹啉磷酸核糖转移酶(QPT)、S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)。尚未阐明催化烟碱酸衍生物和甲基吡咯啉阳离子之间的缩合步骤的烟碱合成酶，尽管已经提出了两个候选基因(A622和NBB1)。参见US 2007/0240728 A1和US 2008/0120737A1。A622编码异黄酮还原酶样蛋白。另外，几种转运蛋白可能参与烟碱的转运。已经克隆并表征了称为MATE的转运蛋白基因(Morita等,PNAS 106:2447-52(2009))。
在一个方面，与对照烟草植物相比，所提供的烟草植物还包含编码选自PMT、MPO、QPT、ADC、ODC、PRAI、SAMS、BBL、MATE、A622和NBB1产物的一个或更多个基因的升高或降低水平的mRNA、蛋白或两者。在另一个方面，所提供的烟草植物还包含直接抑制编码选自PMT、MPO、QPT、ADC、ODC、PRAI、SAMS、BBL、MATE、A622和NBB1产物的一个或更多个基因的表达的转基因。在另一个方面，所提供的烟草植物还包含抑制编码选自PMT、MPO、QPT、ADC、ODC、PRAI、SAMS、BBL、MATE、A622和NBB1产物的一个或更多个基因的表达或活性的转基因或突变。在另一个方面，所提供的烟草植物还包含过表达编码选自PMT、MPO、QPT、ADC、ODC、PRAI、SAMS、BBL、MATE、A622和NBB1产物的一个或更多个基因的转基因。
还公开了使用本领域已知的任何合适的转化方法用本文所述的重组构建体或表达盒转化烟草植物。将多核苷酸序列引入烟草植物的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。“稳定转化”是指其中引入植物的目标核苷酸构建体整合到植物的基因组中并且能够被其后代继承的转化。“瞬时转化”意指将序列引入植物中并且仅在时间上表达或仅瞬时存在于植物中。
将多核苷酸引入本公开的植物细胞的合适方法包括微注射(Crossway等(1986)Biotechniques 4:320-334)、电穿孔(Shillito等(1987)Meth.Enzymol.153:313-336；Riggs等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.US83:5602-5606)、农杆菌介导的转化(美国专利号5,104,310、5,149,645、5,177,010、5,231,019、5,463,174、5,464,763、5,469,976、4,762,785、5,004,863、5,159,135、5,563,055和5,981,840)、直接基因转移(Paszkowski等(1984)EMBO J.3:2717-2722)和弹道粒子加速(参见例如美国专利号4,945,050、5,141,131、5,886,244、5,879,918和5,932,782；Tomes等(1995)in Plant Cell,Tissue,andOrgCultureFundamental Methods,ed.Gamborg and Phillips(Springer-Verlag,Berlin)；McCabe等(1988)Biotechnology6:923-926)。还可以参见Weissinger等(1988)Ann.Rev.Genet.22:421-477；Christou等(1988)Plant Physiol.87:671-674(soybean)；McCabe等(1988)Bio/Technology6:923-926(soybean)；Finer and McMullen(1991)InVitro CellDev.Biol.27P:175-182(soybean)；Singh等(1998)Theor.Appl.Genet.96:319-324(soybean)；De Wet等(1985)in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues,ed.Chapman等(Longman,N.Y.),pp.197-209(花药)；Kaeppler等(1990)PlantCellReports9:415-418和Kaeppler等(1992)Theor.Appl.Genet.84:560-566(晶须介导的转化)；D'Halluin等(1992)Plant Cell 4:1495-1505(电穿孔)。
在另一个方面，可以通过使植物与病毒或病毒核酸接触将本文提供的重组构建体或表达盒引入植物。通常，此类方法涉及将本公开的表达盒整合入病毒DNA或RNA分子中。已经认识到，用于本文提供的表达盒的启动子还涵盖用于通过病毒RNA聚合酶的转录的启动子。用于将多核苷酸(包括病毒DNA或RNA分子)引入植物并表达在其中编码的蛋白质的方法是本领域已知的。参见例如美国专利号5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367、5,316,931和Porta等(1996)Molecular Biotechnology 5:209-221。
可以用重组构建体或表达盒转化可以使用克隆方法随后繁殖(无论是通过器官发生还是胚胎发生)的任何植物组织。“器官发生”是指从分生组织中心依次发育芽和根的过程。“胚胎发生”是指芽和根从体细胞或配子以协调方式(不是依次)一起发育的过程。适用于本文所述的各种转化方案的示例性组织包括但不限于愈伤组织、已有的分生组织(例如茎尖分生组织、腋芽和根分生组织)和诱导的分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)、下胚轴、子叶、叶盘、花粉、胚等。
实施方案
以下是本文公开的主题的示例性实施方案：
实施方案1：包含增强的氮利用效率(NUE)的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物包含黄白肋烟1(YB1)基因座的至少一个功能性等位基因，并且还包含与选自SEQ ID NO：57、58、59、60、61、62、63和64的一个或更多个分子标志物处的增强的NUE相关的至少一个等位基因，其中所述增强的NUE是相对于不具有所述YB1基因座的至少一个功能性等位基因的对照烟草植物而言。
实施方案2：包含增强的NUE的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物包含YB1基因座的至少一个功能性等位基因，并且还包含与位于选自SEQ ID NO：57、58、59、60、61、62、63和64的序列的20cM内的一个或更多个分子标志物处的增强的NUE相关的至少一个等位基因。
实施方案3：包含增强的NUE的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物包含YB1基因座的至少一个功能性等位基因，并且还包含与位于选自SEQ ID NO：57、58、59、60、61、62、63和64的序列的5,000,000个核苷酸内的一个或更多个分子标志物处的增强的NUE相关的至少一个等位基因。
实施方案4：实施方案1-3中任一项的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物是白肋烟品种。
实施方案5：实施方案1-3中任一项的烟草植物或其部分，其中所述植物对于YB1基因座处的所述功能性等位基因是纯合的。
实施方案6：实施方案1-3中任一项的烟草植物或其部分，其中所述植物对于与增强的NUE相关的所述等位基因是纯合的。
实施方案7：实施方案1-3中任一项的烟草植物或其部分，其中所述与增强的NUE相关的等位基因存在于马里兰烟草品种中。
实施方案8：实施方案7的烟草植物或其部分，其中所述马里兰烟草品种选自下组：Md 10,Md 14D2,Md 21,Md 40,Md 59,Md 64,Md 201,Md 341,Md 402,Md 601,Md 609,Md872,Md Mammoth,Banket A1,K326,K346,K358,K394,K399,K730,NC196,NC37NF,NC471,NC55,NC92,NC2326,NC95和NC925。
实施方案9：实施方案2-3中任一项的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物是白肋烟草植物。
实施方案10：实施方案9的烟草植物或其部分，其中所述白肋烟草植物选自下组：TN86，TN86LC，TN90，TN90LC，TN97和TN97LC。
实施方案11：实施方案1-3中任一项的烟草植物或其部分，其中所述植物是双单倍体植物。
实施方案12：实施方案2-3中任一项的烟草植物或其部分，其中所述分子标志物是单核苷酸多态性(SNP)或突变。
实施方案13：实施方案12的烟草植物或其部分，其中所述突变选自下组：取代、缺失、插入、复制、倒位、沉默突变、非沉默突变和无效突变。
实施方案14：实施方案2-3中任一项的烟草植物或其部分，其中所述分子标志物选自下组：SEQ ID NO：57、58、59、60、61、62、63和64。
实施方案15：实施方案14的烟草植物或其部分，其中所述分子标志物在SEQ IDNO：58的第57位处包含G核苷酸。
实施方案16：实施方案14的烟草植物或其部分，其中所述分子标志物在SEQ IDNO：58的第117位处包含C核苷酸。
实施方案17：实施方案14的烟草植物或其部分，其中所述分子标志物在SEQ IDNO：58的第57位处包含G核苷酸和第117位处包含C核苷酸。
实施方案18：实施方案14的烟草植物或其部分，其中所述分子标志物在SEQ IDNO：57的第147位处包含T核苷酸。
实施方案19：实施方案14的烟草植物或其部分，其中所述分子标志物在SEQ IDNO：59的第162位处包含G核苷酸。
实施方案20：实施方案14的烟草植物或其部分，其中所述分子标志物在SEQ IDNO：60的第36位处包含C核苷酸。
实施方案21：实施方案14的烟草植物或其部分，其中所述分子标志物在SEQ IDNO：61的第36位处包含T核苷酸。
实施方案22：实施方案14的烟草植物或其部分，其中所述分子标志物在SEQ IDNO：62的第36位处包含T核苷酸。
实施方案23：实施方案14的烟草植物或其部分，其中所述分子标志物在SEQ IDNO：63的第36位处包含G核苷酸。
实施方案24：实施方案14的烟草植物或其部分，其中所述分子标志物在SEQ IDNO：64的第36位处包含T核苷酸。
实施方案25：实施方案2的烟草植物或其部分，其中所述一个或更多个分子标志物在选自SEQ ID NO：57-64的序列的10cM内。
实施方案26：实施方案2的烟草植物或其部分，其中所述一个或更多个分子标志物在选自SEQ ID NO：57-64的序列的5cM内。
实施方案27：实施方案2的烟草植物或其部分，其中所述一个或更多个分子标志物在选自SEQ ID NO：57-64的序列的1cM内。
实施方案28.实施方案3的烟草植物或其部分，其中所述一个或更多个分子标志物在选自SEQ ID NO：57-64的序列的2,500,000个核苷酸内。
实施方案29：实施方案3的烟草植物或其部分，其中所述一个或更多个分子标志物在选自SEQ ID NO：57-64的序列的1,250,000个核苷酸内。
实施方案30：实施方案3的烟草植物或其部分，其中所述一个或更多个分子标志物在选自SEQ ID NO：57-64的序列的500,000个核苷酸内。
实施方案31：实施方案3的烟草植物或其部分，其中所述一个或更多个分子标志物在选自SEQ ID NO：57-64的序列的150,000个核苷酸内。
实施方案32：实施方案1-31中任一项的烟草植物或其部分，其中所述其部分是种子。
实施方案33：实施方案32的种子，其中权利要求1-3中任一项的所述烟草植物的所述种子的代表性样品已经以ATCC保藏号PTA-126901或PTA-126902保藏。
实施方案34：实施方案1-3中任一项所述的烟草植物或其部分，其中与在相同条件下生长的缺乏所述增强的NUE性状的烟草植物相比，所述增强的NUE是选自下组的增强的NUE性状：增加的偏要素生产率(PFP)、增加的农学效率(AE)、增加的回收效率(RE)、增加的生理效率(PE)和增加的内部效率(IE)。
实施方案35：实施方案1-3中任一项的烟草植物或其部分，其中与在相同条件下生长的野生型白肋烟草植物相比，所述烟草植物包含增加的产量。
实施方案36：实施方案1-3中任一项的烟草植物或其部分，其中与在相同条件下生长的野生型白肋烟草植物相比，所述烟草植物包含不显著更低的产量。
实施方案37：实施方案1-3中任一项的烟草植物或其部分，其中与在相同条件下生长的野生型白肋烟草植物相比，所述烟草植物包含增加至少25％、35％、45％、55％、65％、75％、85％、95％、105％或115％的产量。
实施方案38：实施方案35-37中任一项的烟草植物或其部分，其中所述产量包含1500-3500磅/英亩(lbs/ac)。
实施方案39：实施方案35-37中任一项的烟草植物或其部分，其中所述野生型白肋烟草植物是TN90植物。
实施方案40：前述实施方案任一项的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物以75-95lbs氮/英亩的施肥率生长。
实施方案41：前述权利要求中任一项的烟草植物或其部分，其中相对于对照植物，所述烟草植物包含选自下组的一种或更多种，两种或更多种，三种或更多种，或四种或更多种性状：(i)当以180lbs氮/英亩的推荐白肋烟施肥率生长时从植物的顶部到底部表现出更加一致的叶等级，(ii)来自植物下半部的叶中增加的叶等级指数；(iii)增加的氮利用效率，(iv)降低的叶硝酸盐氮(NO3-N)，(v)降低的TSNA水平，和(vi)缺乏叶绿素缺陷型表型。
实施方案42：熟化烟草材料，其来自实施方案1-41中任一项的烟草植物。
实施方案43：实施方案42的熟化烟草材料，其中所述熟化烟草材料通过选自烤制熟化、晾制熟化、明火烤制熟化和晒制熟化的熟化方法制备。
实施方案44：烟草掺合物，其包含实施方案42的所述熟化烟草材料。
实施方案45：实施方案44的烟草掺合物，其中所述熟化烟草材料构成所述烟草掺合物中熟化烟草的至少10重量％。
实施方案46：实施方案44的烟草掺合物，其中所述熟化烟草材料构成所述烟草掺合物中熟化烟草的至少10％体积。
实施方案47：烟草产品，其包含实施方案42的所述熟化烟草材料。
实施方案48：实施方案47的烟草产品，其中所述烟草产品选自下组：香烟、小雪茄、不通风过滤嘴香烟、通风过滤嘴香烟、雪茄、鼻烟、烟斗烟丝、雪茄烟叶、卷烟烟叶、嚼烟、叶烟、切碎烟丝(shredded tobacco)和生切烟丝(cut tobacco)。
实施方案49：实施方案47的烟草产品，其中所述烟草产品是无烟烟草产品或加热烟草产品。
实施方案50：实施方案49的无烟烟草产品，其中所述无烟烟草产品选自下组：散叶嚼烟、塞嚼烟、湿鼻烟和鼻烟。
实施方案51：再造烟草，其包含实施方案42的熟化烟草材料。
实施方案52：产生包含增强的氮利用效率(NUE)的烟草植物或烟草植物群体的方法，所述方法包括：
a.提供包含至少一种增强的NUE性状的第一烟草植物群体和第二烟草植物群体；
b.针对在与包含选自SEQ ID NO：57、58、59、60、61、62、63和64的序列的增强的NUE相关的等位基因的20cM内一个或更多个分子标志物的存在对所述第一烟草植物群体进行基因分型；
c.选择在步骤(b)中基因分型的第一烟草植物群体的一种或更多种烟草植物，其包含所述一个或更多个分子标志物；
d.对包含黄白肋烟1(YB1)基因座的至少一个功能性等位基因的第二烟草植物群体进行基因分型；
e.选择在步骤(d)中基因分型的第二烟草植物群体的一种或更多种烟草植物，其包含所述至少一个功能性等位基因；
f.将步骤(c)中选择的所述第一群体的所述至少一种植物与步骤(e)中选择的所述第二群体的至少一种植物杂交以产生后代烟草植物或烟草种子；和
g.从步骤(f)获得后代植物或后代种子，其包含所述增强的NUE性状、与增强的NUE相关的所述一个或更多个分子标志物和YB1基因座的至少一个功能性等位基因。
实施方案53：产生包含增强的氮利用效率(NUE)的烟草植物或烟草植物群体的方法，所述方法包括：
a.提供包含增强的NUE的第一烟草植物群体；
b.针对在与包含选自SEQ ID NO：57、58、59、60、61、62、63和64的序列的增强的NUE相关的等位基因的5,000,000个核苷酸内一个或更多个分子标志物的存在对所述第一烟草植物群体进行基因分型；
c.选择在步骤(b)中基因分型的第一烟草植物群体的一种或更多种烟草植物，其包含所述一个或更多个分子标志物；
d.对包含黄白肋烟草1(YB1)基因座的至少一个功能性等位基因的第二烟草植物群体进行基因分型；
e.选择在步骤(d)中基因分型的第二烟草植物群体的一种或更多种烟草植物，其包含所述至少一个功能性等位基因；
f.将步骤(c)中选择的所述第一群体的所述至少一种植物与步骤(e)中选择的所述第二群体的至少一种植物杂交以产生后代烟草植物或烟草种子；和
g.从步骤(f)获得后代植物或后代种子，其包含所述增强的NUE性状、与增强的NUE相关的所述一个或更多个分子标志物和YB1基因座的至少一个功能性等位基因。
实施方案54：产生包含增强的氮利用效率(NUE)的烟草植物或烟草植物群体的方法，所述方法包括：
a.提供包含至少一种增强的NUE性状的第一烟草植物群体和缺乏所述至少一种增强的NUE性状的第二烟草植物群体；
b.针对在与包含选自SEQ ID NO：57、58、59、60、61、62、63和64的序列的增强的NUE相关的等位基因的20cM内一个或更多个分子标志物的存在对所述第一烟草植物群体进行基因分型；
c.选择在步骤(b)中基因分型的第一烟草植物群体的一种或更多种烟草植物，其包含所述一个或更多个分子标志物；
d.将步骤(c)中选择的所述第一群体的所述至少一种植物与不包含所述至少一种增强的NUE性状的所述第二群体的至少一种植物杂交；和
e.从步骤(d)获得后代植物或后代种子，其包含所述增强的NUE性状、所述与增强的NUE相关的等位基因和黄白肋烟1基因座的至少一个功能性等位基因。
实施方案55：产生包含增强的氮利用效率(NUE)的烟草植物或烟草植物群体的方法，所述方法包括：
a.提供包含增强的NUE的第一烟草植物群体；
b.针对在与包含选自SEQ ID NO：57、58、59、60、61、62、63和64的序列的增强的NUE相关的等位基因的5,000,000个核苷酸内一个或更多个分子标志物的存在对所述第一烟草植物群体进行基因分型；
c.选择在步骤(b)中基因分型的第一烟草植物群体的一种或更多种烟草植物，其包含所述一个或更多个分子标志物；
d.将步骤(c)中选择的所述第一群体的所述至少一种植物与不包含所述至少一种增强的NUE性状的所述第二群体的至少一种植物杂交；和
e.从步骤(d)获得后代植物或后代种子，其包含所述增强的NUE性状、所述与增强的NUE相关的等位基因和黄白肋烟1基因座的至少一个功能性等位基因。
实施方案56：选择包含增强的氮利用效率(NUE)性状的烟草植物的方法，其包括：
a.从至少一种烟草植物中分离核酸；
b.测定所述核酸中位于与选自SEQ ID NO：57、58、59、60、61、62、63和64的增强的NUE相关的一个或更多个等位基因的20cM内一个或更多个分子标志物；
c.测定所述核酸中黄白肋烟1(YB1)基因座的至少一个功能性等位基因；和
d.选择包含所述增强的NUE性状、与增强的NUE相关的所述一个或更多个等位基因和所述YB1基因座的至少一个功能性等位基因的所述烟草植物。
实施方案57：选择包含增强的氮利用效率(NUE)性状的烟草植物的方法，其包括：
a.从至少一种烟草植物中分离核酸；
b.测定所述核酸中位于选自SEQ ID NO：57-64的一个或更多个分子标志物的5,000,000个核苷酸内的一个或更多个分子标志物；
c.测定所述核酸中黄白肋烟1(YB1)基因座的至少一个功能性等位基因；和
d.选择包含所述增强的NUE性状、与选自SEQ ID NO：57、58、59、60、61、62、63和64的增强的NUE相关的所述一个或更多个等位基因和所述YB1基因座的至少一个功能性等位基因的所述烟草植物。
实施方案58：实施方案56-57中任一项的方法，其中所述方法还包括：
e.将步骤(d)中选择的所述烟草植物与不包含增强的NUE性状的第二烟草植物杂交；和
f.从步骤(e)的杂交获得后代植物或后代种子。
实施方案59：实施方案52-57中任一项的方法，其中所述分子标志物物选自下组：SEQ ID NO：57、58、59、60、61、62、63和64。
实施方案60：实施方案59的方法，其中所述分子标志物在SEQ ID NO：58的第57位处包含G核苷酸。
实施方案61：实施方案59的方法，其中所述分子标志物在SEQ ID NO：58的第117位处包含C核苷酸。
实施方案62：实施方案59的方法，其中所述分子标志物在SEQ ID NO：58的第57位包含G核苷酸和第117位包含C核苷酸。
实施方案63：实施方案59的方法，其中所述分子标志物在SEQ ID NO：57的第147位处包含T核苷酸。
实施方案64：实施方案59的方法，其中所述分子标志物在SEQ ID NO：59的第162位处包含G核苷酸。
实施方案65：实施方案59的方法，其中所述分子标志物在SEQ ID NO：60的第36位处包含C核苷酸。
实施方案66：实施方案59的方法，其中所述分子标志物在SEQ ID NO：61的第36位处包含T核苷酸。
实施方案67：实施方案59的方法，其中所述分子标志物在SEQ ID NO：62的第36位处包含T核苷酸。
实施方案68：实施方案59的方法，其中所述分子标志物在SEQ ID NO：63的第36位处包含G核苷酸。
实施方案69：实施方案59的方法，其中所述分子标志物在SEQ ID NO：64的第36位处包含T核苷酸。
实施方案70：实施方案52-58中任一项的方法，其中从所述后代种子产生双单倍体植物或双单倍体种子。
实施方案71：实施方案52-53中任一项的方法，其中所述第二植物群体对于YB1基因座处的功能性等位基因是纯合的。
实施方案72：实施方案52-57中任一项的方法，其中所述烟草植物对于与增强的NUE相关的所述等位基因是杂合的。
实施方案73：实施方案52-57中任一项的方法，其中所述烟草植物对于与增强的NUE相关的所述等位基因是纯合的。
实施方案74：实施方案52-57中任一项的烟草植物，其中所述分子标志物是单核苷酸多态性(SNP)或突变。
实施方案75：实施方案74的突变，其中所述突变选自下组：取代、缺失、插入、复制、倒位、沉默突变、非沉默突变和无效突变。
实施方案76：实施方案53、55和57中任一项的方法，其中所述一个或更多个分子标志物在选自SEQ ID NO：57-64的序列的2,500,000个核苷酸内。
实施方案77：实施方案53、55和57中任一项的方法，其中所述一个或更多个分子标志物在选自SEQ ID NO：57-64的序列的1,250,000个核苷酸内。
实施方案78：实施方案53、55和57中任一项的方法，其中所述一个或更多个分子标志物在选自SEQ ID NO：57-64的序列的500,000个核苷酸内。
实施方案79：实施方案53、55和57中任一项的方法，其中所述一个或更多个分子标志物在选自SEQ ID NO：57-64的序列的150,000个核苷酸内。
实施方案80：实施方案52、54和56中任一项的方法，其中所述一个或更多个分子标志物在选自SEQ ID NO：57-64的序列的10cM内。
实施方案81：实施方案52、54和56中任一项的方法，其中所述一个或更多个分子标志物在选自SEQ ID NO：57-64的序列的5cM内。
实施方案82：实施方案52、54和56中任一项的方法，其中所述一个或更多个分子标志物在选自SEQ ID NO：57-64的序列的1cM内。
实施方案83：实施方案52-58中任一项的方法，其中与在相同条件下生长的缺乏所述增强的NUE性状的烟草植物相比，所述增强的NUE选自下组：增加的偏要素生产率(PFP)、增加的农学效率(AE)、增加的回收效率(RE)、增加的生理效率(PE)和增加的内部效率(IE)。
实施方案84：实施方案52-57中任一项的方法，其中与在相同条件下生长的野生型白肋烟草植物相比，所述增强的NUE包含增加的产量。
实施方案85：实施方案52-57中任一项的方法，其中与在相同条件下生长的野生型白肋烟草植物相比，所述增强的NUE包含不显著降低的产量。
实施方案86：实施方案52-57中任一项的方法，其中与在相同条件下生长的野生型白肋烟草植物相比，所述增强的NUE包括增加至少25％的产量。
实施方案87：实施方案84-86中任一项的方法，其中所述产量包括1500-3500磅/英亩(lbs/ac)范围。
实施方案88：实施方案84-86中任一项的方法，其中所述野生型白肋烟植物是TN90植物。
实施方案89：实施方案52-55中任一项的方法，其中所述第一烟草植物群体是马里兰烟草品种。
实施方案90：实施方案89的方法，其中所述马里兰烟草品种选自下组：Md 10,Md14D2,Md 21,Md 40,Md 59,Md 64,Md 201,Md 341,Md 402,Md 601,Md 609,Md 872,MdMammoth,Banket A1,K326,K346,K358,K394,K399,K730,NC196,NC37NF,NC471,NC55,NC92,NC2326,NC95和NC925。
实施方案91：实施方案54、55和58中任一项的方法，其中所述第二烟草植物群体是白肋烟草品种。
实施方案92：实施方案91的方法，其中所述白肋烟品种选自下组：TN86，TN86LC，TN90，TN90LC，TN97和TN97LC。
实施方案93：前述实施方案中任一项的方法，其中产生的或选择的烟草植物或群体以75-95lbs氮/英亩的施肥率生长。
实施方案94.前述实施方案中任一项的方法，其中相对于对照植物或群体，产生的或选择的烟草植物或群体包含选自下组的一种或更多种，两种或更多种，三种或更多种，或四种或更多种性状：(i)当以180lbs氮/英亩的推荐白肋烟施肥率生长时从植物的顶部到底部表现出更加一致的叶等级，(ii)来自植物下半部的叶中增加的叶等级指数；(iii)增加的氮利用效率，(iv)降低的叶硝酸盐氮(NO3-N)，(v)降低的TSNA水平，和(vi)缺乏叶绿素缺陷型表型。
实施方案95：实施方案52-54中任一项的方法，其中所述第一烟草植物群体生长自种子，所述第一烟草植物群体的所述种子的代表性样品已经以ATCC登录号PTA-126901或PTA-126902保藏。
具体实施方案
实施例1：田间生产实践
使用标准的田间生产实践产生田间种植的烟草植物。每个测试地块包含最多40排移植的幼苗。移植前，将幼苗在温室中萌发。为了测试NUE的性状，测试地块接受的氮率为60磅氮/英亩。当测试地块中50％的植物到达细长的萌芽阶段(button stage)时，使用标准程序将植物打顶。农药的施用遵循标准方案。成熟时收获叶，并分为每地块3根枝条，每根枝条5棵植物进行熟化。熟化后，将植物从上到下剥离成4个相等的叶位，并通过每个叶位的总重量计算所得的产量。每个单独的叶位由USDA分级员分级，其包括质量等级以及预测的茎位置，所述预测的茎位置与通常存在于该茎位置处的叶片的特征相关。使用本领域已知的常规方法进行生物碱、TSNA和NO3的分析。
实施例2：鉴定与增强的氮利用率相关的代谢物
与白肋烟烟草品种相比，马里兰烟草品种所需氮肥输入量减少约25％。为了鉴定与高氮效率(马里兰烟)和低氮效率(白肋烟)烟草品种相关的代谢物，在马里兰烟草品种MD609和白肋烟烟草品种TN90中检测了代谢物水平的差异。
MD609和TN90幼苗从种子萌发，并且在不添加氮的情况下生长六周。六周后，将每个品种的幼苗分成两组：A组包含提供有0.01％氮或正常温室施肥的植物；并且B组包含提供有25ppm或25％的正常温室施肥率的植物。播种后第10和14周，用甲醇从根叶组织中提取代谢物。
使用三种不同的LC/MS途径(UHPLC-MS/MS(+ESI)、UHPLC-MS/MS(-ESI)和GC-MS(+EI))分析分离的代谢物，以分离和鉴定单个代谢物。通过将获得的质谱与标准光谱数据库(Metabolon Inc,Morrisville,NC)比较来鉴定代谢物。使用曲线下面积定量峰。通过将中位数记录为等于一(1.00)并按比例归一化每个数据点(称为“块校正”)来标定每个化合物。表8中提供了未知代谢物的分子量。表9-12列出了区分性代谢物，以及每个样品的标定测量值。通过考虑所有时间点的TN90和MD609之间的Student t检验比较测定区分性代谢物。将p值小于0.01的代谢物包括在分析中。
表8：未知代谢物化合物的分子质量，以千道尔顿表示
代谢物 质量
X-21756 247.0918
X-21796 138.0566
X-23319 299.0771
X-23330 251.1136
X-23366 189.1023
X-23389 157.0762
X-23453 161.0818
X-23454 319.0933
X-23576 267.1237
X-23580 311.1136
X-23852 374.144
X-23916 395.0291
X-23937 161.0819
表9：当比较播种后第10周和第14周的MD609和TN90烟草品系时，代谢物与根组织中鉴定的增强的氮效率呈负相关。
Figure BDA0003795246920001271
表10：当比较MD609和TN90烟草品系时，代谢物与根组织中鉴定的增强的氮效率呈正相关
Figure BDA0003795246920001272
表11：当比较MD609和TN90烟草品系时，代谢物与叶组织中鉴定的增强的氮效率呈负相关。
Figure BDA0003795246920001273
Figure BDA0003795246920001281
表12：当比较MD609和TN90烟草品系时，代谢物与叶组织中鉴定的增强的氮效率呈正相关
Figure BDA0003795246920001282
实施例3：鉴定与增强的氮利用效率有关的基因表达
还对实施例2中使用的相同植物进行RNA提取以用于RNAseq。播种后第10周和第14周从叶和根组织中提取RNA以用于Illumina测序。根据本领域标准方法分析RNAseq数据。随后，验证候选基因。
发现十七个基因(表13和14)与MD609的增强的氮利用效率表型负相关，并且发现七个基因(表15和16)与MD609的增强的氮利用效率表型正相关。负相关的基因是白肋烟烟草品种中下调的候选基因(通过诱变、顺化基因转化或转基因转化)，并且正相关的基因是白肋烟烟草品种中过表达以改进氮利用效率的候选基因。提供相关的单核苷酸多态性(SNP)标志物用于跟踪每个候选基因(表13-17)。提供与MD609等位基因相关的多态性，因此有利于增强的NUE(表17)。
对每个相关基因的基因组位置的鉴定鉴定了与烟草基因组中增强的NUE相关的四个基因簇(图1)。七个基因类似地位于染色体1上，四个基因类似地位于染色体11上，三个基因类似地位于染色体14上，并且五个基因类似地位于染色体20上(图1)。这四个位置也是低氮和正常氮条件下差异表达基因的热点(图1)。生成SNP标志物以鉴定MD609是特异的，因此对这些位置的每一个鉴定增强的NUE多态性(表13-17)。进一步表征染色体11上的区域，其包含79个总表达基因，并且这些基因中46个是在低氮条件下的差异表达的基因(图2)。
表13：鉴定为与根组织中增强的氮利用效率负相关的基因。
Figure BDA0003795246920001291
表14：鉴定为与叶组织中增强的氮利用效率负相关的基因。
Figure BDA0003795246920001292
表15：鉴定为与根组织中增强的氮利用效率正相关的基因。
Figure BDA0003795246920001301
表16：鉴定为与叶组织中增强的氮利用效率正相关的基因。
Figure BDA0003795246920001302
表17：包含与增强的NUE相关的多态性的SNP标志物
Figure BDA0003795246920001303
实施例4：鉴定烟草叶优选和根优选启动子
从10种组织类型(打顶前的腋芽；打顶后2小时的腋芽；打顶后6小时的腋芽；打顶后24小时的腋芽；打顶后72小时的腋芽；打顶前的根；打顶后24小时的根；打顶后72小时的根；打顶时的幼叶；以及茎尖分生组织)获得来自4周大TN90烟草植物的RNA样品。将得到的RNA样品(每种组织类型三个独立收集的样品)用作Illumina 1x100bp测序的起始材料。
将Illumina读长进行映射(mapping)并用于鉴定表现出高根或叶表达的候选基因列表。表18和19提供了鉴定为具有叶优选或根优选表达的基因的RPKM表达值。这些基因是分别具有叶优选启动子或根优选启动子的候选基因。
表18：具有叶优选表达的基因
Figure BDA0003795246920001321
表19：具有根优选表达的基因
Figure BDA0003795246920001331
实施例5：开发改性植物
将表达载体p45-2-7(SEQ ID NO：65)用作骨架以产生多个转化载体(参见实施例X-Y)。p45-2-7含有CsVMV启动子、NOS终止子和包含与Actin2启动子和NOS终止子可操作地连接的卡那霉素选择标志物(NPT II)的盒。通过农杆菌转化将包含目标转基因的核酸载体引入烟草叶盘。例如，参见Mayo等,2006,Nat Protoc.1:1105-11and Horsch et al.,1985,Science 227:1229-1231。
在MagentaTM GA-7盒中生长TN90烟草植物，切割叶盘并置于培养板中。通过在50mL离心管中以3500RPM离心20mL细胞悬浮液10分钟来收集包含转化载体的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)细胞。除去上清液，将根癌农杆菌细胞沉淀重悬于40mL液体再悬浮培养基中。用#15剃刀刀片将烟草叶切成8个0.6cm的圆盘(避免中脉)，并倒置在培养板中。将具有B5维生素液体再悬浮培养基的薄层Murashige&Skoog添加到培养板中，并用细针均匀地戳叶盘。将约25mL根癌农杆菌悬浮液添加到培养板中，并将叶盘在悬浮液中孵育10分钟。
将叶盘转移至共培养的培养板(1/2MS培养基)中，将圆盘倒置放置，与覆盖在共培养TOM培养基(含有20g/L蔗糖；1mg/L吲哚-3-乙酸和2.5mg/L 6-苄基氨基嘌呤(BAP)的MS培养基)上的滤纸接触。将培养板用封口膜密封，然后在昏暗的光照(60-80mE/ms)中以18小时光照、6小时黑暗的光周期在24℃下孵育6小时，持续3天。孵育后，将叶盘转移至再生/选择TOM K培养基的培养板(TOM培养基加300mg/L卡那霉素)。在昏暗的光照中以18小时光照、6小时黑暗的光周期在24℃下每两周将叶盘传代培养至新鲜的TOM K培养基，直至嫩芽变得可切除。用镊子从叶取出嫩芽，并插入含有100mg/L卡那霉素的MS基础培养基中。在24℃下以18小时光照、6小时黑暗的光周期(高强度光照，6080mE/ms)在含有100mg/L卡那霉素的MS基础培养基上孵育嫩芽，以诱导生根。
当含有嫩芽和根的小植株长得足够大时(例如，达到MagentaTM GA-7盒的大约一半高度)，将它们转移到土壤中。将已建立的幼苗转移到温室中进行进一步分析并结种。通过生长改性植物(T0、T1、T2或更晚代)和对照植物来进行增强的氮利用效率的评估。对照植物是未转化的NLM植物或用空p45-2-7载体转化的NLM植物。
在温室中使用零百万分之零(ppm)氮(无氮)、25ppm氮(低氮)和100ppm氮(正常氮)进行增强的氮利用效率的表型筛选。初步筛选在带有T1植物的温室中进行。然后，在田间使用60磅/英亩化肥(约为白肋烟推荐率的25％)评估纯合T2群体。测量幼苗生长、叶绿素损失和最终产量，并将其与正常氮水平下生长的对照植物比较。
在T1代中，在温室中生长过表达G20580(2个独立转化体)、G42290(4个独立转化体)、G41446(4个独立转化体)、G53261(2个独立转化体)和G30999(3个独立转化体)的植物，以及在相当于60磅氮/英亩的氮限制条件下的对照。每个转化体取样九株植物，并且与对照相比，过表达G41446的品系之一显示产量(鲜重克/植物)的统计学显著增加(参见图5)。
实施例6：产生具有增强的氮利用效率的顺化基因烟草植物
可以通过对涉及在实施例2中鉴定为差异表达的基因的基因表达进行改性来改进氮利用效率。类似地，可以对涉及实施例1中鉴定的代谢物的生物合成或降解的基因进行调节以改进氮利用效率。可以使用一般的过表达启动子或组织优选启动子来过表达与增强的氮利用效率正相关的基因，以在所需组织中过表达该基因。
产生转化载体以过表达与增强的氮利用效率正相关的蛋白质。将包含SEQ IDNOs:9-16之一的单独的转化载体掺入p45-2-7转化载体中。另外，产生包含SEQ ID NOs:9-16之一的转化载体。
根据实施例4，使用这些转化载体产生改性烟草植物。然后，如实施例4所述，表型评估改性烟草植物(T1代)和对照烟草植物。与在相同条件下生长的对照烟草植物相比，改性烟草植物表现出增强的氮利用效率。
实施例7：产生具有增强的氮利用效率的转基因烟草植物
还可通过下调实施例2中鉴定为与氮利用效率负相关的基因的表达来增强氮利用效率。
设计包含RNAi构建体的转化载体以抑制其在实施例2中的表达与氮利用效率负相关的烟草基因。单独的转化载体包含SEQ ID NOs:41-56之一，其被掺入p45-2-7中转化载体中。产生另外的转化载体，其包含SEQ ID NOs:41-56之一。
根据实施例4，使用这些转化载体产生改性烟草植物。然后，如实施例4所述，表型评估改性烟草植物(T1代)和对照烟草植物。与在相同条件下生长的对照烟草植物相比，改性烟草植物表现出增强的氮利用效率。
实施例8：使用基因编辑技术改进氮利用效率的其他方法
使用诸如CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1、CRISPR/CasX、CRISPR/CasY、CRISPR/Csm1、锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)的基因编辑技术来改性与增强的氮利用率负相关的基因编码区，使该基因编码无功能蛋白或低功能蛋白。这些基因编辑技术还用于编辑或替换内源启动子序列，以驱动其在叶或根组织中的同源蛋白质表达，从而改进氮利用效率。例如，将内源性G64360编辑或替换，因此该基因仅在叶组织中表达，在该组织中该基因可起作用以改进植物的氮利用效率。
构建单独的CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1向导RNA以识别并与SEQ ID NOs:9-40中的每一个的启动子序列杂交。将工程化向导RNA和包含选自下组的启动子的供体多核苷酸提供给烟草植物：SEQ ID NOs:17-24，从而允许所选择的启动子替换所选择基因的内源启动子，并根据需要限制对叶或根组织而言内源性的表达。与在相似条件下生长的对照烟草植物相比，经编辑烟草植物表现出增强的氮利用效率。
实施例9：经由随机诱变开发新突变以改进氮利用效率
使用甲磺酸乙酯(EMS)诱变或快中子轰击进行烟草植物的随机诱变。EMS诱变在于化学诱导随机的点突变。快中子诱变在于将种子暴露于中子轰击，其通过双链DNA断裂引起大的缺失。
对于EMS诱变，将1克(约10,000粒种子)白肋烟(品种TN90)种子在0.1％Tween中洗涤15分钟，然后在30mL ddH2O中浸泡2小时。然后，将150μL的0.5％EMS(Sigma，目录号M-0880)混合到种子/ddH2O溶液中并在室温下(RT；约20℃)在罩下孵育8-12小时(以30RPM旋转)。然后，除去种子中的液体，并将其混合到1M NaOH中过夜以进行净化和清除。然后，用100mL ddH2O洗涤种子两次，持续2-4小时。然后，将洗过的种子悬浮于0.1％琼脂溶液中。
将琼脂溶液中的EMS处理的种子以～2000粒/板均匀地涂布在水浸泡的平板中的Carolina's Choice Tobacco Mix(Carolina Soil Company,Kinston,NC)上。然后，用保鲜膜覆盖平板并将其置于生长室中。一旦幼苗从土壤中出来，就会刺破保鲜膜以使湿度逐渐下降。两周后，完全除去保鲜膜。将平板移至温室并用NPK肥料施肥。将幼苗重新插入浮盘中并生长直至移栽大小。随后将植物移植到田地中。在生长期间，植物自花授粉形成M1种子。在成熟阶段，从每株植物收获五粒荚，并对来自每株植物的一组种子单独命名。这形成了M1群体。生长来自每种M0植物的M1种子的复合物，并如实施例4所述，表型评估植物的增强的氮效率。选择表现出增强的氮效率的M1植物，并使用本领域已知的DNA测序和基因映射技术筛选突变。
实施例10：使用育种产生具有增强的氮利用效率的烟草植物
传统育种技术可用于将本文提供的NUE有利的等位基因引入任何烟草品种以增强NUE。可以通过将具有至少一个有利的NUE等位基因(见表10)的烟草植物与缺乏该有利的等位基因的烟草植物杂交来产生烟草植物群体。标志物辅助选择或本领域已知的其他技术(例如直接测序)可用于追踪F1代中有利的等位基因的基因渗入，并可用于测定后续代中的杂合性或纯合性。可以使用本领域已知的或上述方法测定后代植物的增强的NUE。可以将多个不同的NUE有利的等位基因组合到单个品系中。由代谢物特征测定的分子表型可用于追踪育种过程中增强的NUE。可以使用上述方法测定后代植物的代谢物特征。使具有增强的NUE的亲本植物的具有代谢特征的后代植物杂交以产生具有增强的NUE的烟草植物的后续群体。
可以如所述进行将Maryland 609基因座引入可商购白肋烟品种中以开发具有增强的NUE的白肋烟品系。对23个白肋烟和6个MD609品系的筛选鉴定了3个在SNP标志物S451(SEQ ID NO:58)上包含MD609等位基因的白肋烟品系(图3)。测试了三个带有MD609等位基因的白肋烟品系在氮限制条件下的叶绿素损失、生长和产量，并与对照TN90白肋烟品系和对照MD609品系(在SNP标志物S451上带有MD609等位基因的MD609)比较(图4)。带有MD609等位基因的白肋烟品系显示出与马里兰烟对照更为相似(图4)的叶绿素损失、生长和产量。与MD609对照相比，TN90白肋烟对照显示出叶绿素损失增加、生长减少和产量降低(图4)。这些结果表明在SNP标志物S451处引入MD609等位基因可以增强NUE。
为了将MD609等位基因引入白肋烟，将MD609与白肋烟杂交。选择来自该杂交的F1后代，随后自交以生产F2种子。使F2和F3植物生长并自交以产生F4种子。在田间生长和收获来自分别鉴定为NUE-2和NUE-3品系的两个独立杂交方案的胀大的F4种子。对于NUE-2和NUE-3品系的F4种子，测定了SNP标志物S451、S317、S12385、S238、S3894和S2237的基因型(参见表20)。使用实施例1中所述的减少的氮生产方法来种植F4植物。与白肋烟对照TN90相比，NUE-2和NUE-3品系均表现出以磅/英亩表示的增加的产量(参见图6)。
或者，可以使用本文所述的方法产生包含增强的NUE表型的改性烟草植物，并将其与未改性烟草植物杂交以在后续代中繁殖改性。可以使用本领域已知的适当技术来追踪遗传修饰的选择。可以使用本领域已知的或上述方法测定后代植物的增强的NUE。
表20：来自F4 NUE-2和NUE-3品系和TN90的田间生长植物的基因型。MD代表MD609等位基因，白肋烟代表白肋烟等位基因，HET代表杂合MD609/白肋烟。
S451 S317 S12835 S238 S3894 S2237
NUE-2 MD HET MD 白肋烟 白肋烟 MD
NUE-3 MD HET MD 白肋烟 白肋烟 MD
TN90 白肋烟 白肋烟 白肋烟 白肋烟 白肋烟 白肋烟
实施例11：育种双单倍体植物生产
为了将MD609等位基因引入白肋烟，将MD609与BurleyTN90杂交。选择来自该杂交的F1后代并随后自交以产生F2种子。如实施例1所述在田间地块中筛选F2植物群体。将所选植物自交以产生F3种子。生长F3植物并使用如实施例3和10中所述的标志物分析和模拟田间条件的温室标准氮耗尽方案筛选。
氮耗尽方案如下。将幼苗插入21个单元托盘并置于0ppm氮上。在堵塞后1、2和3周使用封闭的RGB相机系统对托盘成像。使用Phenosuite软件(Keygene)分析图像，该软件确定红色/绿色/蓝色的颜色和每种颜色的单个像素的数目。从红色与绿色像素之比(红/绿之比)计算植物的黄度。通过三周内红/绿之比的增加计算叶绿素随时间的损失。植物生长通过总植物面积的增加来计算，所述总植物面积通过每个单元内非黑色像素的数目来计算。土壤记录为黑色。
当认为植物准备好并置于标准的10-10-10肥料掺合物上时，将它们重新放入6英寸盆中，这导致施用100ppm的氮。在两周内，将它们再灌入10英寸盆中并使用以下时间表减少施肥：
a.2周75ppm
b.1周50ppm
c.1周35ppm
对于直到收获的剩余时间，用以半强度混合的10-30-20肥料进行25ppm施用。基于植物健康修改施肥。
根据常规农艺实践将植物打顶，并且在打顶后4周通过称量来自单个植物的叶子来测定产量。
如上所述，还在田间地块中的氮耗尽方案下测试群体。通过选择F3植物并将其与标准白肋烟草(TN90)杂交产生BC1F1种子来启动标准回交方案(BC)。生长BC1F1种子并使用上文实施例10中概述的方法筛选植物。将选择的植物与TN90杂交以产生BC2F1种子，并使用氮耗尽方案再次筛选所得后代。使用所选植物进行第三次回交以产生BC3F1种子。使用上述列出的方法筛选该杂交(BC3)的后代，并将所选植物用作供体植物以发育双单倍体群体。
实施例12：双单倍体群体的产生
将实施例11中描述的供体植物在标准温室条件下在温室中生长。当花芽长12-16mm时，收获它们。取出花药并直接置于陪替氏培养皿中的含有活性炭和1％蔗糖的固体Nitsch培养基(bioWORLD,Mfr.No.30630095,Dublin,OH,USA)用于花药培养，或通过加热诱导小孢子用于小孢子培养。对于花药培养，将花药留在Nitsch培养基上直至小植株开始生长。对于小孢子培养，用玻璃杵浸渍花药(B培养基)，使用60微米过滤器(Millipore Sigma,SCNY00060,Burlington,MA)过滤并以250g离心2分钟。将沉淀重悬于2-4mL B培养基中。为了收集形成的胚性小孢子，将悬浮液以250g离心5分钟。将沉淀重悬于2mL AT3培养基中并以5x 105个小孢子/mL的密度铺板陪替氏培养皿(35mm)上。将板包裹在石蜡膜和铝箔中并在25℃下孵育4-6周。对于这两种方案，将发育的小植株移至琼脂固化的半强度MS培养基中并在光照下孵育。将幼苗用0.2％秋水仙碱溶液在适度搅拌下处理7小时(Sigma Aldrich,C3915)以使染色体加倍，并且随后转移到温室中用于种子收集。从这些植物收集的种子构成第一代双单倍体种子(DH0种子)，其中来自每个个体植物的后代是相同基因型个体的DH1群体。从BC3代产生的示例性DH植物是Ds1532和Ds1563，它们在基因组水平上基因型为89％白肋烟，表型上类似白肋烟草，并且具有比马里兰烟更接近白肋烟的吸烟特征(参见图11)。
实施例13：双单倍体群体的评价
使用60lbs氮肥/英亩生长63个双单倍体群体和两个对照(Maryland 609和TN90)，并在标准烟草管理条件下生长(如实施例1所述)。田间为每一行设置4个复制品。基本上如实施例1所述进行产量和质量测定。作为173,000个SNP的筛选的一部分，测定对黄白肋烟1基因座(YB1)处的突变体等位基因纯合或杂合，黄白肋烟2基因座(YB2)处的纯合突变体且包含对应于染色体11处的MD609的SNP标记(本文称为“M11”基因座，其中马里兰等位基因称为“M11”且白肋烟草等位基因称为“B11”；例如，通过SEQ ID NO：58的基因分型)的植物。
与YB1(yb1/yb2 DH)处的纯合突变体的植物相比，在YB1(Yb1/yb2 DH)处包含杂合突变体等位基因的植物表现出产量增加7％(参见表21和图7)。出乎意料的是，Yb1基因座和M11基因座似乎对NUE发挥协同作用，这通过与仅具有Yb1或M11的双单倍体植物相比Yb1M11双单倍体植物中烟草产量的进一步增加来反映(参见表22和图8，将Yb1/M11与yb1/M11或Yb1/B11进行比较)。
表21：与TN90 Burley相比，双单倍体(DH)品系的产量。产量以磅/英亩表示。Yb1-野生型，yb1-突变体。还参见图7。
Figure BDA0003795246920001421
表22：染色体11标志物的基因型影响双单倍体品系的产量。对于每个指示的基因型显示以磅/英亩计的产量。Yb1-野生型或功能性等位基因，yb1-突变体等位基因，B11-染色体11标志物处的Burley，M11-染色体11标志物处的MD609。还参见图8和11。
Figure BDA0003795246920001422
实施例14：具有增强的NUE的杂交烟草植物的产生
基本上如实施例10所述产生杂交植物。从这些杂交种中鉴定出两个另外的增强的NUE品系，NUE-4和NUE-5，它们在YB1基因座处是杂合的(参见表23)。两者在YB2基因座处是纯合突变体，而NUE-4在M11基因座处包含增强的NUE等位基因，且NUE-5在M11基因座处是杂合的(参见表23)。NUE-4和NUE-5的母本是来自MD609和TN90之间的初始杂交的F4育种品系(参见表24，也参见实施例10)。NUE-4的父本是Banket A1，且NUE-5的父本是Burley L8(见表24)。为了比较在降低的氮下NUE-4和NUE-5的产量(90lbs/英亩对比180lbs/英亩)，使植物生长并与TN90比较(参见图9)。当与以90lbs氮/英亩生长的TN90相比时，NUE-4和NUE-5均表现出产量增加(参见表25，也参见图9)。当与以180lbs氮/英亩生长的TN90相比时，当以90lbs氮/英亩生长时，NUE-5也显示出小的产量增加(参见表25，也参见图9)。重要的是，NUE-4和NUE-5在90lbs氮/英亩下保持产量增加，而在上茎位置和下茎位置的等级指数没有下降(参见表26，也参见图10)。发现当NUE-5以180lbs氮/英亩(用于白肋烟的典型氮水平)生长时，其下茎位置显示平均等级指数的相当大的降低，该降低也导致整个植物的总体等级指数平均值的降低(见图10)。因此，对于杂交植物如NUE-4和NUE-5推荐的氮范围为约75-90lbs/ac。
总之，鉴定了YB1和M11基因座中的等位基因组合以产生具有基本上白肋烟草特征的杂种烟草植物，当以推荐的白肋烟施肥率的50％生长时，所述杂种烟草植物仍可获得与在标准白肋烟施肥率下生长的白肋烟对照植物相似或略好的叶产量。一些杂交植物(例如，具有Yb1/yb1基因型的NUE-5，M11/B11)的过度施肥可导致下茎叶中的叶质量损失。M11基因座与显性Yb1野生型等位基因一起工作以最大化氮效率并以显性方式起作用。
表23：NUE-4和NUE-5杂种及其在Yb1、Yb2和染色体11标志物处的基因型。“Het”代表杂合状态，而所示等位基因代表纯合状态。
Figure BDA0003795246920001431
表24：NUE-4和NUE-5亲本品系的基因型
Figure BDA0003795246920001432
表25：与TN90相比，以90lbs氮肥/英亩生长时NUE-4和NUE-5的产量。
Figure BDA0003795246920001441
表26：使用来自F4 NUE-1和NUE-2品系和TN90的40、90和180lbs氮肥/英亩生长的对照和杂种NUE-4和NUE-5群体的平均产量和等级指数(GI)。还示出了95％置信区间。还参见图10。
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保藏信息
已经在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 University Boulevard,Manassas,VA 20110进行了上述公开的和所附权利要求中记载的专有近交植物品系的保藏。双单倍体品系dS1532和dS1563的保藏日期为2020年12月18日。每种品种2500粒种子的保藏物取自自从本申请提交日之前保存的相同保藏物。在颁布专利后，对保藏物的所有限制将不可撤销地移除，且申请人旨在使保藏物满足37 C.F.R.§1.801 1.809的所有要求。ATCC已发布以下保藏号：dS1532的ATCC保藏号为PTA-126901和dS1563的ATCC保藏号为PTA-126902。这些保藏物将在保藏处保存30年，或在上次请求后保存5年，或在专利的有效期内保存，以较长者为准，并在该期限内根据需要进行更换。申请人不放弃对其在本专利或植物品种保护法(7U.S.C.2321等)下授予的权利的任何侵权。
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Claims (20)

1.包含增强的氮利用效率(NUE)的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物包含黄白肋烟1(YB1)基因座的至少一个功能性等位基因，并且还包含至少一个与增强的NUE相关的等位基因，所述等位基因位于选自SEQ ID NO：57、58、59、60、61、62、63和64的一个或更多个分子标志物处，其中所述增强的NUE是相对于不具有所述YB1基因座的至少一个功能性等位基因的对照烟草植物而言。
2.根据权利要求1所述的烟草植物或其部分，其中所述部分是种子。
3.根据权利要求1所述的烟草植物或其部分，其中与在相同条件下生长的缺乏所述增强的NUE性状的烟草植物相比，所述增强的NUE性状选自下组：增加的偏要素生产率(PFP)、增加的农学效率(AE)、增加的回收效率(RE)、增加的生理效率(PE)和增加的内部效率(IE)。
4.根据权利要求1所述的烟草植物或其部分，其中与在相同条件下生长的野生型白肋烟草植物相比，所述烟草植物包含增加的产量。
5.根据权利要求1所述的烟草植物或其部分，其中相对于对照植物，所述烟草植物包含选自下组的一种或更多种，两种或更多种，三种或更多种，或四种或更多种性状：(i)当以180lbs氮/英亩的推荐白肋烟施肥率生长时从植物的顶部到底部表现出更加一致的叶等级，(ii)来自植物下半部的叶中增加的叶等级指数；(iii)增加的氮利用效率，(iv)降低的叶硝酸盐氮(NO3-N)，(v)降低的TSNA水平，和(vi)缺乏叶绿素缺陷型表型。
6.熟化烟草材料，其来自根据权利要求1所述的烟草植物。
7.烟草产品，其包含根据权利要求6的所述熟化烟草材料。
8.包含增强的NUE的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物包含YB1基因座的至少一个功能性等位基因，并且还包含至少一个与增强的NUE相关的等位基因，所述等位基因位于选自SEQ ID NO：57、58、59、60、61、62、63和64的序列处的与增强的NUE相关的等位基因的10cM内的一个或更多个分子标志物处。
9.根据权利要求8所述的烟草植物或其部分，其中所述部分是种子。
10.根据权利要求8所述的烟草植物或其部分，其中与在相同条件下生长的缺乏所述增强的NUE性状的烟草植物相比，所述增强的NUE是选自下组的增强的NUE性状：增加的偏要素生产率(PFP)、增加的农学效率(AE)、增加的回收效率(RE)、增加的生理效率(PE)和增加的内部效率(IE)。
11.根据权利要求8所述的烟草植物或其部分，其中与在相同条件下生长的野生型白肋烟草植物相比，所述烟草植物包含增加的产量。
12.根据权利要求8所述的烟草植物或其部分，其中相对于对照植物，所述烟草植物包含选自下组的一种或更多种，两种或更多种，三种或更多种，或四种或更多种性状：(i)当以180lbs氮/英亩的推荐白肋烟施肥率生长时从植物的顶部到底部表现出更加一致的叶等级，(ii)来自植物下半部的叶中增加的叶等级指数；(iii)增加的氮利用效率，(iv)降低的叶硝酸盐氮(NO3-N)，(v)降低的TSNA水平，和(vi)缺乏叶绿素缺陷型表型。
13.熟化烟草材料，其来自根据权利要求8所述的烟草植物。
14.烟草产品，其包含根据权利要求13所述的所述熟化烟草材料。
15.产生包含增强的氮利用效率(NUE)的烟草植物或烟草植物群体的方法，所述方法包括：
a.提供包含至少一种增强的NUE性状的第一烟草植物群体和缺乏所述至少一种增强的NUE性状的第二烟草植物群体；
b.针对一个或更多个分子标志物的存在对所述第一烟草植物群体进行基因分型，其中所述分子标志物位于与增强的NUE相关的等位基因的10cM内，所述等位基因位于选自SEQID NO：57、58、59、60、61、62、63和64的序列处；
c.选择在步骤(b)中基因分型的第一烟草植物群体的一种或更多种烟草植物，其包含所述一个或更多个分子标志物；
d.将步骤(c)中选择的所述第一群体的所述至少一种植物与不包含所述至少一种增强的NUE性状的所述第二群体的至少一种植物杂交；和
e.从步骤(d)获得后代植物或后代种子，其包含所述增强的NUE性状、所述与增强的NUE相关的等位基因和黄白肋烟1基因座的至少一个功能性等位基因。
16.根据权利要求15所述的方法，其中从所述后代种子产生双单倍体植物或双单倍体种子。
17.根据权利要求15所述的方法，其中与在相同条件下生长的缺乏所述增强的NUE性状的烟草植物相比，所述增强的NUE性状选自下组：增加的偏要素生产率(PFP)、增加的农学效率(AE)、增加的回收效率(RE)、增加的生理效率(PE)和增加的内部效率(IE)。
18.根据权利要求15所述的方法，其中与在相同条件下生长的野生型白肋烟草植物相比，所述增强的NUE包含增加的产量。
19.根据权利要求15所述的方法，其中相对于对照植物或群体，所述产生的或选择的烟草植物或群体包含选自下组的一种或更多种，两种或更多种，三种或更多种，或四种或更多种性状：(i)当以180lbs氮/英亩的推荐白肋烟施肥率生长时从植物的顶部到底部表现出更加一致的叶等级，(ii)来自植物下半部的叶中增加的叶等级指数；(iii)增加的氮利用效率，(iv)降低的叶硝酸盐氮(NO3-N)，(v)降低的TSNA水平，和(vi)缺乏叶绿素缺陷型表型。
20.根据权利要求15所述的方法，其中所述第一烟草植物群体生长自种子或种子的后代，所述种子的代表性样品已经以ATCC登录号PTA-126901或PTA-126902保藏。
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