DE60028548T2

DE60028548T2 - Verfahren zur vewendung von viralen replicase-polynukleotiden und polypeptiden

Info

Publication number: DE60028548T2
Application number: DE60028548T
Authority: DE
Inventors: Keith S. Johnston LOWE; Matthew A. Des Moines BAILEY; Carolyn A. Clive GREGORY; George J. Des Moines HOERSTER; Brian A. Tucson LARKINS; Brian R. Tucson DILKES; Ronald Bethlehem BURNETT; Young Min Tucson WOO; William J. Urbandale GORDON-KAMM
Original assignee: Arizona Board of Regents of University of Arizona; Pioneer Hi Bred International Inc; University of Arizona
Current assignee: Arizona Board of Regents of University of Arizona; Pioneer Hi Bred International Inc; University of Arizona
Priority date: 1999-02-25
Filing date: 2000-02-23
Publication date: 2007-05-31
Anticipated expiration: 2020-02-24
Also published as: EP1155135A2; WO2000050614A3; DE60028548D1; US6284947B1; WO2000050614A2; US20030093831A1; AU3602200A; US6452070B1; CA2369057A1; US20050125857A1; EP1155135B1; CA2369057C; US7309813B2; AU747844B2; ATE329042T1; WO2000050614A9

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung bezieht sich generell auf Pflanzenmolekularbiologie.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Zellteilung spielt während allen Phasen der Pflanzenentwicklung eine entscheidende Rolle. Die Fortführung der Organogenese und Wachstumsreaktionen auf eine sich ändernde Umwelt erfordern präzise räumliche, zeitliche und entwicklungsgemäße Regulation der Zellteilungsaktivität in Meristemen (und in Zellen mit der Fähigkeit, neue Meristeme, wie in der Bildung von Seitenwurzeln, zu bilden). Solche Steuerung der Zellteilung ist auch in Organen selbst wichtig (d.h., separat für Meristemen per se), z.B. in Blattentfaltung und sekundärem Dickenwachstum.
Ein komplexes Netzwerk steuert Zellproliferation in Eukaryonten. Verschiedene regulatorische Pfade übermitteln umweltbezogene Randbedingungen, wie Verfügbarkeit von Nährstoffen, mitotische Signale, wie Wachstumsfaktoren oder Hormone, oder Entwicklungshinweise, wie den Übergang von vegetativ zu reproduktiv. Schlussendlich steuern diese regulatorischen Pfade die Zeitabstimmung, Frequenz (Rate), Ebene und Position von Zellteilungen.
Pflanzen haben einzigartige Entwicklungsmerkmale, die sie von andern Eukaryonten unterscheiden. Pflanzenzellen wandern nicht, und deshalb bestimmen nur Zellteilung, Entfaltung und programmierter Zelltod die Morphogenese. Während der gesamten Lebensdauer der Pflanze werden Organe aus Meristeme genannten, spezialisierten Regionen gebildet.
Zusätzlich haben viele differenzierte Zellen das Potential, sich sowohl zu entdifferenzieren, als auch den Zellzyklus wieder zu betreten. Es wird erwartet, dass die Untersuchung von Steuerungsgenen des Pflanzenzellzyklus zum Verständnis dieser einzigartigen Phänomene beiträgt. O. Shaul et al., Regulation of Cell Division in Arabidopsis, Critical Reviews in Plant Sciences, 15(2): 97–112 (1996).
Gegenwärtige Transformationstechnologie bietet eine Gelegenheit, Pflanzen mit gewünschten Merkmalen zu konstruieren. Über die letzten paar Jahre haben sich bedeutende Fortschritte in der Pflanzentransformation ereignet. Dennoch bestehen noch bei vielen bedeutenden Nutzpflanzen erhebliche Genotyp-Beschränkungen. Transformation von einigen ackerbaulich wichtigen Nutzpflanzen bleibt weiterhin sowohl schwierig, als auch zeitaufwändig.
Es ist z.B. schwierig, eine Kulturreaktion von einigen Mais-Varietäten zu erhalten. Üblicherweise ist eine geeignete Kulturreaktion durch Optimieren von Bestandteilen des Mediums und/oder Explantatmaterial und -quelle erreicht worden. Dies hat in einigen Genotypen zum Erfolg geführt. Während Transformation von Modell-Genotypen effizient ist, ist das Verfahren des Einkreuzens von Transgenen in durch Inzucht erzeugte Produktionspflanzen arbeitsaufwändig, teuer und zeitaufwändig. Es würde beträchtlich Zeit und Geld sparen, wenn Gene in kommerzielle Hybride eingeführt und direkt darin bewertet werden könnten.
Vieles weist darauf hin, dass Zellen in der Teilung sein müssen, damit Transformation erfolgt. Es ist auch beobachtet worden, dass sich teilende Zellen nur einen Anteil der Zellen darstellen, die ein Transgen vorübergehend exprimieren. Es ist darüber hinaus wohl dokumentiert worden, dass das Vorhandensein von beschädigter DNA in Nicht-Pflanzensystemen (ähnlich zu DNA, die durch eine Partikelkanone oder andere physikalische Mittel eingeführt wurde) rasches Anhalten des Zellzyklus induziert (W. Siede, Cell cycle arrest in response to DNA damage: lessons from yeast, Mutation Res. 337(2: 73–84)). Verfahren zum Steigern der Anzahl sich teilender Zellen würden daher wertvolle Werkzeuge zum Steigern der Transformationseffizienz bereitstellen.
Gegenwärtige Verfahren für genetisches Engineering von Mais erfordern einen spezifischen Zelltyp als den Empfänger neuer DNA. Diese Zellen werden in relativ undifferenzierten, rasch wachsenden Meristemen, in Kallus, in Suspensionskulturen oder auf der Schildchen-Oberfläche des unreifen Embryos (die zum Kallus führt) gefunden. Ungeachtet des gegenwärtig angewandten Zuführungsverfahrens wird DNA buchstäblich in Tausende von Zellen eingeführt, Transformanten werden jedoch bei Häufigkeiten von 10^–5, bezogen auf vorübergehend exprimierende Zellen, gewonnen.
Dieses Problem wird dadurch erschwert, dass das Trauma, das DNA-Einführung begleitet, Empfängerzellen in das Anhalten des Zellzyklus führt, und sich häufende Hinweise legen nahe, dass viele dieser Zellen in Apoptose oder programmierten Zelltod geführt werden (Referenz Bowen et al., Tucson International Mol. Biol. Meetings). Deshalb wäre es wünschenswert, verbesserte Verfahren bereitzustellen, die fähig sind, Transformationseffizienz in einer Anzahl von Zelltypen zu steigern.
Trotz Steigerungen von Ertrag und Ernteflächen weltweit wird vorhergesagt, dass über die nächsten zehn Jahren hinweg eine Befriedigung der Nachfrage an Mais eine zusätzliche 20%ige Steigerung über gegenwärtige Produktion erfordern wird (Dowswell, C.R., Paliwal, R.L., Cantrell, R.P. 1996. Maize in the Third World, Westview Press, Boulder, CO).
Die am häufigsten mit Mais-Ertragsleistung assoziierten Komponenten sind Kornertrag oder Ganzpflanzenernte für Tierfutter (in den Formen von Silage, (Rau-)Futter oder Futterstroh). Abhängig von der endgültigen Verwendung der Nutzpflanze, könnte daher das relative Wachstum der vegetativen oder reproduktiven Organe bevorzugt sein. Ob die ganze Pflanze oder die Ähre geerntet wird, der Gesamtertrag wird stark von Wuchsstärke und Wachstumsrate abhängen. Es wäre daher nützlich, neue Verfahren zu entwickeln, die zur Steigerung des Ernteertrags beitragen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, Verfahren zum Modulieren der DNA-Replikation in einer transgenen Pflanze bereitzustellen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Erhöhen der Anzahl von Zellen, die Zellteilung durchmachen, bereitzustellen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Erhöhen des Ernteertrags bereitzustellen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Verbessern von Transformationshäufigkeiten bereitzustellen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Verbessern der Transformationseffizienz in Zellen aus unterschiedlichen Quellen bereitzustellen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Bereitstellen eines positiven Wachstumsvorteils in einer Pflanze bereitzustellen.
Deshalb stellt die vorliegende Erfindung unter einem Gesichtspunkt ein Verfahren zum Erhöhen von Pflanzentransformationshäufigkeiten, umfassend das Einführen eines isolierten Pflanzen-Geminivirus-Replikase-Polynucleotids in Kombination mit einem interessierenden Polynucleotid in eine Zielpflanzenzelle, wobei jedes Polynucleotid funktionell verknüpft ist mit einem Promotor, der Expression in der Wirtspflanzenzelle steuert, bereit.
Unter einem weiteren Gesichtspunkt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen des Ernteertrags, umfassend das Einführen eines isolierten Pflanzen-Geminivirus-Replikase-Polynucleotids, funktionell verknüpft mit einem Promotor, der Expression in der Pflanzenzelle steuert, in eine Pflanzenzelle, bereit.
Unter einem weiteren Gesichtspunkt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Bereitstellen eines positiven Wachstumsvorteils in einer Zielpflanzenzelle, umfassend Einführen eines isolierten Pflanzen-Geminivirus-Replikase-Polynucleotids, funktionell verknüpft mit einem Promotor, der Expression in der Zielpflanzenzelle steuert, in die Zielpflanzenzelle, bereit.
Unter einem weiteren Gesichtspunkt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Modulieren von Zellteilung einer Zielpflanzenzelle, umfassend Einführen eines isolierten Pflanzen-Geminivirus-Replikase-Polynucleotids in Sinn-Orientierung ("sense orientation"), funktionell verknüpft mit einem Promotor, der Expression in Pflanzenzellen steuert, in die Zielpflanzenzelle, bereit.
Unter einem weiteren Gesichtspunkt stellt die Erfindung ein Verfahren zum vorübergehenden Modulieren der Zellteilung von Zielpflanzenzellen, umfassend Einführen eines isolierten Pflanzen-Geminivirus-Replikase-Polynucleotids in Sinn-Orientierung ("sense orientation"), funktionell verknüpft mit einem Promotor, der Expression in Pflanzenzellen steuert, in die Zielpflanzenzelle, bereit.
Unter einem weiteren Gesichtspunkt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Bereitstellen eines Mittels positiver Selektion, umfassend: (a) Einführen eines isolierten Pflanzen-Geminivirus-Replikase-Polynucleotids, funktionell verknüpft mit einem Promotor, der Expression in der Zielpflanzenzelle steuert, in eine Zielpflanzenzelle; und (b) Selektieren bzw. Auswählen nach Zellen, die positiven Wachstumsvorteil aufweisen, bereit.
Die Erfindung stellt ebenfalls bereit:

– Verwendung eines Pflanzen-Geminivirus-Replikase-Polynucleotids, um den Ernteertrag von Pflanzen zu erhöhen;
– Verwendung eines Pflanzen-Geminivirus-Replikase-Polynucleotids, um einen positiven Wachstumsvorteil in einer Zielpflanzenzelle bereitzustellen;
– Verwendung eines Pflanzen-Geminivirus-Replikase-Polynucleotids in Sinn-Orientierung ("sense orientation") oder eines isolierten Pflanzen-Geminivirus-Replikase-Polypeptids, um Zellteilung einer Zielpflanzenzelle zu modulieren;
– Verwendung eines Pflanzen-Geminivirus-Replikase-Polynucleotids in Sinn-Orientierung ("sense orientation"), um Zellteilung von Zielpflanzenzellen vorübergehend zu modulieren;
– Verwendung eines Pflanzen-Geminivirus-Replikase-Polynucleotids, um ein Mittel der positiven Selektion von Zielpflanzenzellen bereitzustellen, die einen positiven Wachstumsvorteil, folgend auf das Einführen des Polynucleotids oder Polypeptids in die Zellen, aufweisen;
– transgene Nutzpflanze mit erhöhter Ausbeute aufgrund des Einführens eines Pflanzen-Geminivirus-Replikase-Polynucleotids, funktionell verknüpft mit einem Promotor, der Expression in den Zellen der Pflanze steuert;
– transgene Pflanzenzelle, die aufgrund des Einführens eines Pflanzen-Geminivirus-Replikase-Polynucleotids, funktionell verknüpft mit einem Promotor, der Expression in der Zelle steuert, in die Pflanzenzelle einen positiven Wachstumsvorteil aufweist;
– transgene Pflanzenzelle, deren Teilung aufgrund des Einführens eines Pflanzen-Geminivirus-Replikase-Polynucleotids in Sinn-Orientierung ("sense orientation"), funktionell verknüpft mit einem Promotor eines Pflanzen-Geminivirus-Replikase-Polypeptids, der Expression in der Pflanzenzelle steuert moduliert ist.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
1: Vergleich vorübergehender GUS-Expression mit und ohne eine Rep-Expressionskassette.
2: Mikrophotographie-Vergleich von GFP-Fluoreszenz in Zellen, die mit und ohne eine(r) Rep-Expressionskassette bombardiert wurden.
3: Vergleich des Zellzyklusprofils in Kallus, der mit und ohne eine(r) Rep-Expressionskassette transformiert wurde.
DEFINITIONEN
Der Begriff "isoliert" bezieht sich auf Material, wie Nucleinsäure oder ein Protein, das (1) im Wesentlichen oder tatsächlich frei von Bestandteilen ist, die das Material, wie es in seiner natürlicherweise auftretenden Umgebung gefunden wird, normalerweise begleiten oder mit ihm wechselwirken, oder (2) falls das Material in seiner natürlichen Umgebung ist, das Material durch absichtlichen menschlichen Eingriff in eine Zusammensetzung und/oder Stellen an einem Ort in der Zelle, der ein anderer als der natürliche Ort des Materials ist, geändert worden ist.
Wie hierin verwendet, werden "Polypeptid" und "Protein" austauschbar verwendet und bedeuten Proteine, Proteinfragmente, modifizierte Proteine, Aminosäuresequenzen und synthetische Aminosäuresequenzen. Das Polypeptid kann glykosyliert sein, muss aber nicht.
Wie hier verwendet, werden "Polynucleotid" und "Nucleinsäure" austauschbar verwendet. Ein Polynucleotid kann in voller Länge oder ein Fragment sein und schließt Polynucleotide ein, die zur Stabilität modifiziert worden sind. Soweit nicht anders angezeigt, schließt der Begriff Bezugnahme auf eine spezifische Sequenz oder ihr Komplement ein.
Wie hierin verwendet, werden "funktionelle Variante" oder "funktionelles Derivat" oder "funktionelles Fragment" austauschbar verwendet. Auf Polypeptide angewandt, ist die (das) funktionelle Variante oder Derivat ein Fragment, ein modifiziertes Polypeptid oder synthetisches Polypeptid, das DNA-Replikation in einer zu den Wildtyp-Genprodukten Rep und RepA ähnlichen Weise stimuliert.
Wie hierin verwendet, bezieht sich "virale Replikase-Polypeptide" auf Polypeptide, die zum Stimulieren der DNA-Replikation fähig sind. Es ist beabsichtigt, dass Polypeptide funktionelle Varianten, Fragmente und Derivate einschließen. Die Polypeptide weisen die Funktion der Bindung an die Familie der Retinoblastom-(Rb)Proteine oder Rb-assoziierte Proteine oder funktionelle Rb-Homologe auf. Die Polypeptide schließen funktionelle Varianten oder Derivate von viralen Replikase-Proteinen und/oder funktionelle Homologe ein. Die Polypeptide schließen Proteine ein, die von Genen im viralen Genom codiert werden, auf die üblicherweise als "Replikationsproteine", "Replikations-assozierie Proteine" oder "Replikations-Initiations-Proteine" Bezug genommen wird. Die Polypeptide schließen Proteine aus Viren ein, in denen alle "Replikations-assoziierten" oder "Replikations-"Funktionen als ein einzelnes Protein codiert sind, und jene, in denen diese Funktionen durch mehr als ein Protein ausgeführt werden, ungeachtet dessen, ob einwandfreies oder "ungeeignetes Spleißing vor der Translation aufgetreten ist (deshalb sind sowohl das durch den offenen Leserahmen C1 codierte Polypeptid, als auch das durch die C1-C2-Fusion oder einwandfrei gespleißte C1-C2 codierte Polypeptid eingeschlossen).
Wie hierin verwendet, bezieht sich "virales Replikase-Polynucleotid" auf für ein virales Replikase-Polypeptid codierende Polynucleotide, einschließlich funktioneller Varianten, Derivate, Fragmente oder funktioneller Homologe der charakterisierten viralen Replikase-Polynucleotide.
Wie hierin verwendet, schließt "Pflanze" Pflanzenzellen, Pflanzengewebe und Pflanzensamen ein, ist aber nicht darauf beschränkt.
Die vorliegende Erfindung stellt neue Verfahren zur Verwendung von Pflanzen-Geminivirus-Replikase-Polypeptiden und -Polynucleotiden bereit. Eingeschlossen sind Verfahren zum Erhöhen von Transformationshäufigkeiten, Erhöhen des Ernteertrags, Bereitstellen eines positi ven Wachstumsvorteils, Modulieren der Zellteilung, vorübergehendem Modulieren der Zellteilung und zum Bereitstellen eines Mittels der positiven Selektion.
Virale Replikase-Polynucleotide, funktionelle Varianten und/oder funktionelle Homologe aus jedem beliebigen Virus können in den Verfahren der Erfindung verwendet werden, solange die exprimierten Polypeptide Rb-Bindungsfunktion aufweisen und/oder DNA-Replikation stimulieren.
Beispiele geeigneter Pflanzenviren schließen Weizen-Verzwergungsvirus, Mais-Strichelvirus, Tabak-Gelbverzwergungsvirus, Tomaten-Goldmosaikvirus, Abutilon-Mosaikvirus, Cassava-Mosaikvirus, Rübenkräuselvirus, Bohnen-Verzwergungsmosaikvirus, Bohnen-Goldmosaikvirus, Chloris-Strichelmosaikvirus, Digitaria-Strichelvirus, Miscanthus-Strichelvirus, Mais-Strichelvirus, Panicum-Strichelvirus, Kartoffel-Gelbmosaikvirus, Kürbis-Blattkräuselvirus, Zuckerrohr-Strichelvirus, Tomaten-Goldmosaikvirus, Tomaten-Blattkräuselvirus, Tomaten-Scheckungsvirus, Tabak-Gelbverzwergungsvirus, Tomaten-Gelb-Blattkräuselvirus, afrikanisches Cassava-Mosaikvirus und den Bohnen-Gelverzwergungsvirus ein.
Andere virale Proteine, die Rb-verwandte Peptide binden, schließen das große T-Antigen von SV40, Adenovirus-Typ 5-E1A-Protein und humanes Papillom-Virus-Typ 16-E7 ein. Replikase aus dem Weizenverzwergungsvirus ist sequenziert und funktionell charakterisiert worden und ist daher bevorzugt. Replikase bindet an ein gut charakterisiertes Bindungsmotiv auf dem Rb-Protein (Xie et al., The EMBO Journal Bd. 14, Nr. 16, S. 4073–4082, 1995; Orozco et al., Journal of Biological Chemistry Bd. 272, Nr. 15, S. 9840–9846, 1997; Timmermans et al., Annual Review Plant Physiology, Plant Mol. Biol, 45: 79–112, 1994; Stanley, Genetics and Development 3: 91–96, 1996; Davies et al., Geminivirus Genomes, Kapitel 2, und Gutierrez, Plant Biology 1: 492–497, 1998). Die Offenbarungen dieser Artikel gelten hierin durch Literaturverweis als aufgenommen.
Pflanzen-Geminivirus-Replikase-Polynucleotide, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, können unter Verwendung von (a) Standard-Rekombinationsverfahren, (b) Syntheseverfahren oder Kombinationen davon erhalten werden.
Pflanzen-Geminivirus-Replikase-Polynucleotide und funktionelle Varianten, die in der Erfindung nützlich sind, können unter Verwendung von Primern, die selektiv unter stringenten Bedingungen hybridisieren, erhalten werden. Primer sind üblicherweise mindestens 12 Basen lang und können bis zu 200 Basen lang sein, werden aber üblicherweise zwischen 15 und 75, bevorzugt 15 bis 50, Basen lang sein. Funktionelle Fragmente können unter Verwendung einer Vielzahl von Techniken, wie Restriktionsanalyse, Southern-Analyse, Primer-Extensionsanalyse und DNA-Sequenzanalyse identifiziert werden.
Varianten der Nucleinsäuren können z.B. durch Oligonucleotid-gerichtete Mutagenese, Linker-Scanning-Mutagenese, Mutagenese unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion und dergleichen erhalten werden. Siehe z.B. Ausubel, Seiten 8.0.3–8.5.9. Siehe allgemein auch McPherson (Hrsg.), DIRECTED MUTAGENESIS: A Practical approach, (IRL Press. 1991).
Deshalb umfasst die vorliegende Erfindung auch DNA-Moleküle, die Nucleotidsequenzen umfassen, die substantielle Sequenzähnlichkeit mit den erfindungsgemäßen Sequenzen haben. Konservativ modifizierte Varianten sind bevorzugt.
Nucleinsäuren, die durch Sequenz-Shuffling von Pflanzen-Geminivirus-Replikase-Polynucleotiden hergestellt wurden, können ebenfalls verwendet werden. Sequenz-Shuffling ist in der PCT-Publikation Nr. 96/19256 beschrieben. Siehe auch Zhang, J.-H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4504–4509 (1997).
Für Modulation der Translation heterologer codierender Sequenzen sind auch 5'- und/oder 3'-UTR-Regionen nützlich. Positive Sequenzmotive schließen translationale Initiations-Konsensussequenzen (Kozak, Nucleic Acids Res. 15: 8125 (1987)) und die 7-Methylguanosin-Kappenstruktur (Drummond et al., Nucleic Acids Res. 13: 7375 (1985)) ein. Negative Elemente schließen stabile intramolekulare 5'-UTR-Stamm-Schleife-Strukturen (Muesing et al., Cell 48: 691 (1987)) und AUG-Sequenzen oder kurze Leserahmen 5' des entsprechenden AUG in der 5'-UTR (Kozak, supra, Rao et al., Mol and Cell. Biol. 8: 284 (1988)) ein.
Weiterhin können die Polypeptid-codierenden Segmente der Polynucleotide modifiziert werden, um die Codon-Usage zu verändern. Codon-Usage in den codierenden Regionen der Polynucleotide der vorliegenden Erfindung kann unter Verwendung kommerziell erhältlicher Software-Pakete, wie "Codon Preference", erhältlich von der University of Wisconsin Genetics Computer Group (siehe Devereaux et al., Nucleic Acids Res. 12: 387–395 (1984)), oder Mac-Vector 4.1 (Eastman Kodak Co., New Haven, Conn.) statistisch analysiert werden.
Die Polynucleotide können z.B. hinsichtlich verstärkter oder supprimierter Expression in Pflanzen optimiert werden. Siehe z.B. EPA0359472; WO91/16432; Perlak et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3324–3328; und Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 477–498. Auf diese Weise können die Gene unter Verwendung Spezies-bevorzugter Codons synthetisiert werden. Siehe z.B. Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 477–498, dessen Offenbarung hierin durch Literaturverweis eingeschlossen ist.
Die Nucleinsäuren können in geeigneter Weise eine Mehrfachklonierungsstelle, umfassend eine oder mehrere Endonuclease-Restriktionsschnittstellen, die in die Nucleinsäure insertiert sind, um bei der Isolation des Polynucleotids zu helfen, umfassen. Auch translatierbare Sequenzen können insertiert werden, um bei der Isolation des translatierten erfindungsgemäßen Polynucleotids zu helfen. Z.B. stellt eine Hexahistidin-Markierungssequenz ein zweckmäßiges Mittel zum Reinigen der erfindungsgemäßen Proteine bereit.
Die Polynucleotide können an ein(en) Vektor, Adapter, Promotor, Transitpeptid oder Linker zur Klonierung und/oder Expression eines erfindungsgemäßen Polynucleotids angeheftet sein. Zu solchen Klonierungs- und/oder Expressionssequenzen können zusätzliche Sequenzen hinzugefügt werden, um ihre Funktion in Klonierung und/oder Expression zu optimieren, um bei der Isolation der Polynucleotide zu helfen oder um die Einführung des Polynucleotids in eine Zelle zu verbessern. Verwendung von Klonierungsvektoren, Expressionsvektoren, Adapto ren und Linkern ist gut bekannt und im Fachgebiet ausgiebig beschrieben. Für eine Beschreibung solcher Nucleinsäuren siehe, z.B., Stratagene Cloning Systems, Kataloge 1995, 1996, 1997 (La Jolla, CA); und Amersham Life Sciences, Inc., Katalog '97 (Arlington Heights, IL).
Um genomische Bibliotheken zu konstruieren, werden große Segmente genomischer DNA durch Zufallsfragmentierung erzeugt. Beispiele entsprechender molekularbiologischer Techniken und Anleitungen sind zu finden in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Bände 1–3 (1989), Methods in Enzymology, Bd. 152: Guide to Molecular Cloning Techniques, Berger und Kimmel, Hrsg., San Diego: Academic Press, Inc. (1987), Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Hrsg., Greene Publishing und Wiley-Interscience, New York (1995); Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Clark, Hrsg., Springer-Verlag, Berlin (1997). Kits zur Konstruktion von genomischen Bibliotheken sind auch kommerzielle erhältlich.
Die genomische Bibliothek kann unter Verwendung einer auf der Sequenz einer in der vorliegenden Erfindung verwendeten Nucleinsäuresequenz basierenden Sonde durchsucht werden. Die Fachleute werden erkennen, dass verschiedene Grade der Stringenz der Hybridisierung im Assay eingesetzt werden können, und dass entweder die Hybridisierung oder das Wasch-Medium stringent sein können. Der Grad der Stringenz kann durch Temperatur, Ionenstärke, pH und Anwesenheit eines teilweise denaturierenden Lösungsmittels, wie Formamid, gesteuert werden.
Üblicherweise werden stringente Hybridisierungsbedingungen jene sein, in denen die Salzkonzentration weniger als etwa 1,5 M Na-Ion-, üblicherweise etwa 0,01 bis 1,0 M Na-Ion-Konzentration (oder andere Salze) bei pH 7,0 bis 8,3 ist und die Temperatur mindestens etwa 30°C für kurze Sonden (z.B. 10 bis 50 Nucleotide) und mindestens etwa 60°C für lange Sonden (z.B. größer als 50 Nucleotide) ist. Stringente Bedingungen können auch durch die Zugabe destabilisierender Wirkstoffe, wie Formamid, erhalten werden.
Die Hybridisierung wird bevorzugt unter Bedingungen niedriger Stringenz durchgeführt, die Hybridisierung mit einer Pufferlösung aus 30% Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS (Natriumdodecylsulfat) bei 37°C und einem Waschschritt in 1X bis 2X SSC (20X SSC = 3,0 M NaCl/0,3 M Trinatriumcitrat) bei 50°C einschließen. Die Hybridisierung wird bevorzugt unter Bedingungen moderater Stringenz durchgeführ, die Hybridisierung in 40% Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS bei 37°C und einen Waschschritt in 0,5X bis 1X SSC bei 55°C einschließen. Die Hybridisierung wird insbesondere vorzugsweise unter Bedingungen hoher Stringenz durchgeführt, die Hybridisierung in 50% Formamid, 1M NaCl, 1% SDS bei 37°C und einen Waschschritt in 0,1X SSC bei 60°C einschließen.
Ein umfangreicher Leitfaden zur Hybridisierung von Nucleinsäuren ist zu finden in Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Teil I, Kapitel 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevir, New York (1993); und Current Protocols in Molecular Biology, Kapitel 2, Ausubel et al., Hrsg., Greene Publishing und Wiley-Interscience, New York (1995). cDNA-Bibliotheken werden oft normalisiert, um die Vertretung relativ seltener cDNAs zu erhöhen.
Die Nucleinsäuren können aus Nucleinsäureproben unter Verwendung von Amplifikationstechniken amplifiziert werden. Beispielsweise kann Polymerase-Kettenreaktions-(PCR)Technologie verwendet werden, um die Sequenzen erfindungsgemäßer Polynucleotide und verwandter Gene direkt aus genomischer/genomischen DNA oder Bibliotheken zu amplifizieren. PCR und andere in vitro-Amplifikationsverfahren können auch nützlich sein, um, z.B., Nucleinsäuresequenzen, die für zu exprimierende Proteine codieren, zu klonieren, um Nucleinsäuren zum Verwenden als Sonden zum Nachweisen der gewünschten mRNA in Proben herzustellen, für Nucleinsäuresequenzierung oder für andere Zwecke.
Beispiele von für in vitro-Amplifikationsverfahren nützlichen Techniken sind zu finden in Berger, Sambrook und Ausubel, wie auch Mullis et al., US-Patent Nr. 4 683 202 (1987); und PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Innis et al., Hrsg., Academic Press Inc., San Diego, CA (1990). Kommerziell erhältliche Kits für genomische PCR-Amplifikation sind im Fachgebiet bekannt. Siehe z.B. Advantage-GC Genomic PCR Kit (Clontech). Das T4-Gen-32-Protein (Boehringer Mannheim) kann verwendet werden, um die Ausbeute an langen PCR-Produkten zu verbessern.
PCR-basierte Screening-Verfahren sind ebenfalls beschrieben worden. Wilfinger et al. beschreiben ein PCR-basiertes Verfahren, in dem im ersten Schritt die längste cDNA identifiziert wird, so dass unvollständige Klone aus der Untersuchung ausgeschlossen werden können. BioTechniques, 22(3): 481–486 (1997).
Die Nucleinsäuren können auch durch direkte chemische Synthese durch Verfahren, wie dem Phosphotriester-Verfahren von Narang et al., Meth. Enzymol. 68: 90–99 (1979); dem Phosphodiester-Verfahren von Brown et al., Meth. Enzymol. 68: 109–151 (1979); dem Diethylphosphoramidit-Verfahren von Beaucage et al., Tetra. Lett. 22: 1859–1862 (1981); dem Festphasen-Phosphoramidittriester-Verfahren, beschrieben von Beaucage und Caruthers, Tetra. Letts. 22(20): 1859–1862 (1981), z.B. unter Verwendung eines automatisierten Synthesizers, wie z.B. beschrieben in Needham-VanDevanter et al., Nucleic Acids Res., 12: 6159–6168 (1984); und dem Feststoff-Trägerverfahren von U.S.-Patent No. 4 458 066 hergestellt werden.
Expressionskassetten, die die isolierten viralen Replikase-Nucleinsäuren umfassen, werden ebenfalls bereitgestellt. Eine Expressionskassette wird üblicherweise ein Polynucleotid umfassen, das funktionell verknüpft ist mit Transkriptionsinitiations-regulatorischen Sequenzen, die die Transkription des Polynucleotids in der beabsichtigten Wirtszelle, wie Geweben einer transformierten Pflanze, leiten werden.
Die Konstruktion von Expressionkassetten, die in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden kann, ist Fachleuten angesichts der vorliegenden Offenbarung gut bekannt. Siehe, z.B., Sambrook et al.; Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, New York, (1989); Gelvin et al.; Plant Molecular Biology Manual; (1990); Plant Biotechnology: Commercial Prospects and Problems, Hrsg. Prakash et al.; Oxford & IBH Publishing Co.; New Delhi, India, (1993); und Heslot et al.; Molecular Biology and Genetic Engineering of Yeasts; CRC Press, Inc., USA; (1992); jede davon ist hierin in ihrer Gesamtheit durch Literaturverweis eingeschlossen.
Zum Beispiel können Pflanzen-Expressionskassetten einschließen (1) eine virale Replikase-Nucleinsäure unter der Transkriptionskontrolle 5'- und 3'-regulatorischer Sequenzen, und (2) einen dominanten selektierbaren Marker. Solche Pflanzen-Expressionskassetten können auch, falls gewünscht, eine Promotor-Regulatorregion (z.B. eine, die induzierbare, konstitutive, Umwelt- oder entwicklungsgemäß regulierte, oder Zell- oder Gewebe-spezifisch/selektive Expression verleiht), eine Transkriptionsinitiations-Startstelle, eine Ribosomen-Bindestelle, ein RNA-Reifungssignal, eine Transkriptionsterminationsstelle und/oder ein Polyadenylierungssignal enthalten.
Konstitutive, Gewebe-bevorzugte oder induzierbare Promotoren können eingesetzt werden. Beispiele konstitutiver Promotoren schließen die Blumenkohl-Mosaikvirus-(CaMV)35S-Transkriptionsinitiationsregion, den von T-DNA von Agrobacterium tumefaciens abgeleiteten 1'- oder 2'-Promotor, den Ubiquitin 1-Promotor, den Smas-Promotor, den Cinnamylalkoholdehydrogenase-Promotor (U.S. Patent No. 5 683 439), den Nos-Promotor, den pEmu-Promotor, den Rubisco-Promotor, den GRP1-8-Promotor und andere Transkriptionsinitiationsregionen aus verschiedenen Pflanzen ein, die Fachleuten bekannt sind.
Beispiele induzierbarer Promotoren sind der Adh1-Promotor, der durch Hypoxie oder Kältestress induzierbar ist, der Hsp70-Promotor, der durch Hitzestress induzierbar ist, und der PPDK-Promotor, der durch Licht induzierbar ist. Promotoren, die chemisch induzierbar sind, sind ebenfalls nützlich.
Beispiele von Promotoren unter Entwicklungskontrolle schließen Promotoren ein, die Transkription, vorzugsweise in bestimmten Geweben, wie Blättern, Wurzeln, Frucht, Samen oder Blüten, initiieren. Ein beispielhafter Promotor ist der Antheren-spezifische Promotor 5126 (US-Patent Nrn. 5 689 049 und 5 689 051). Beispiele Samen-bevorzugter Promotoren schließen 27 kD-gamma-Zein-Promotor und Waxy-Promotor (Boronat, A., Martinez, M.C., Reina, M., Pugdomenech, P. und Palau, J.; Isolation and sequencing of a 28 kD glutelin-2-gene from maize: Common elements in the 5' flanking regions among zein and glutelin genes; Plant Sci. 47, 95–102 (1986) und Reina, M., Ponte, I., Guillen, P., Boronat, A. und Palau, J., Sequence analysis of a genomic clone encoding a Zc2 protein from Zea mays W64 A, Nucleic Acids Res. 18 (21), 6426 (1990)), ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Siehe folgende, sich auf den Waxy-Promotor beziehende Stelle: Kloesgen, R.B., Gierl, A., Schwarz-Sommer, ZS. und Saedler, H., Molecular analysis oft the waxy locus of Zea mays, Mol. Gen. Genet. 203, 237–244 (1986). Promotoren, die im Embryo, Pericarp und Endosperm exprimieren, sind offenbart in US-Anmeldungen Ser. Nos. 60/097 233, eingereicht am 20. August 1998, und 60/098 230, einge reicht am 28. August 1998. Jede dieser Offenbarungen ist hierin durch Literaturverweis in ihrer Gesamtheit eingeschlossen.
Um Expression der erfindungsgemäßen Nucleinsäuren zu regeln, können entweder heterologe oder nicht-heterologe (d.h. endogene) Promotoren eingesetzt werden. Diese Promotoren können z.B. auch in Expressionskassetten verwendet werden, um Expression von Antisense-Nucleinsäuren zum Verringern, Erhöhen oder Ändern der Konzentration und/oder Zusammensetzung der erfindungsgemäßen Proteine in einem gewünschten Gewebe zu steuern.
Falls Polypeptidexpression erwünscht ist, ist es allgemein wünschenswert, eine Polyadenylierungs-Region am 3'-Ende einer codierenden Polynucleotid-Region einzuschließen. Die Polyadenylierungsregion kann vom natürlichen Gen, von einer Vielfalt anderer Pflanzengene oder von T-DNA abgeleitet sein. Die anzufügende 3'-Endsequenz kann von, z.B., den Nopalin-Synthase- oder Octopin-Synthase-Genen oder alternativ von einem weiteren Pflanzengen, oder, weniger bevorzugt, von einem beliebigen anderen eukaryotischen Gen abgeleitet sein.
Zu der 5'-nicht-translatierten Region oder der codierenden Sequenz der teilweise codierenden Sequenz kann eine Intron-Sequenz hinzugefügt werden, um die Menge der reifen Botschaft, die akkumuliert, zu erhöhen. Siehe z.B. Buchman und Berg, Mol. Cell Biol. 8: 4395–4405 (1988); Callis et al., Genes Dev. 1: 1183–1200 (1987). Im Fachgebiet ist die Verwendung der Mais-Introns Adh1-S-Intron 1, 2 und 6 und des Bronze-1-Introns wohlbekannt. Siehe allgemein The Maize Handbook, Kapitel 116, Freeling and Walbot, Hrsg., Springer, New York (1994).
Der die in der vorliegenden Erfindung nützlichen Polynucleotidsequenzen umfassende Vektor wird üblicherweise ein Markergen umfassen, das Pflanzenzellen einen selektierbaren Phänotyp verleiht. Üblicherweise wird das selektierbare Markergen Antibiotika- oder Herbizid-Resistenz codieren. Geeignete Gene schließen jene, die für Resistenz gegen das Antibiotikum Spectinomycin oder Streptomycin (z.B. das aada-Gen) codieren, das Streptomycin-Phosphotransferase-(SPT)Gen, codierend für Streptomycin-Resistenz, das Kanamycin oder Geneticin-Resistenz codierende Neomycin-Phosphotransferase-(NPTII)Gen, das Hygromycin-Phosphotransferase-(HPT)Gen, codierend für Hygromycin-Resistenz, ein.
Geeignete Gene, die für Resistenz gegenüber Herbiziden codieren, schließen jene, die wirken, um die Wirkung von Acetolactat-Synthase (ALS), insbesondere die Sulfonylharnstoff-Typ-Herbizide (z.B. das Acetolactat-Synthase-(ALS)-Gen, das Mutationen enthält, die zu solcher Resistenz führen, insbesondere die S4- und/oder Hra-Mutationen) hemmen, jene, die wirken, um die Wirkung von Glutamin-Synthase zu hemmen, wie Phosphinothricin oder Basta (z.B. das bar-Gen), oder andere solche Gene, die im Fachgebiet bekannt sind, ein. Das bar-Gen codiert Resistenz gegen das Herbizid Basta und das ALS-Gen codiert Resistenz gegen das Herbizid Chlorsulfuron.
Typische Vektoren, die für Expression von Nucleinsäuren in höheren Pflanzen verwendbar sind, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und schließen Vektoren ein, die abgeleitet sind von Tumor-induzierendem (Ti) Plasmid von Agrobacterium tumefaciens, beschrieben von Rogers et al., Meth. In Enzymol., 153: 253–277 (1987). Hierin verwendbare beispielhafte A. tumefaciens-Vektoren sind Plasmide pKYLX6 und pKYLX7 von Schardl et al., Gene, 61: 1–11 (1987), und Berger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86: 8402–8406 (1989). Ein weiterer hierin verwendbarer Vektor ist Plasmid pBI101.2, das von Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA) erhältlich ist. Ein Vielfalt von Pflanzenviren, die als Vektoren eingesetzt werden können, sind auf dem Fachgebiet bekannt und schließen Blumenkohl-Mosaikvirus (CaMV), Geminivirus, Crespen-Mosaikvirus und Tabak-Mosaikvirus ein.
Das Pflanzen-Geminivirus-Polynucleotid kann, wie gewünscht, entweder in Sinn- ("sense") oder Gegensinn-Orientierung ("anti-sense orientation") exprimiert werden. In Pflanzenzellen wurde gezeigt, dass Gegensinn-RNA Genexpression durch Verhindern der Akkumulation von mRNA, die das interessierende Enzym codiert, hemmt, siehe z.B. Sheehy et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 85: 8805–8809 (1988); und Hiatt et al., US-Patent No. 4 801 340.
Ein weiteres Verfahren der Suppression ist Sinn-Suppression ("sense suppresion"). Für ein Beispiel der Verwendung dieses Verfahrens zum Modulieren der Expression endogener Gene siehe Napoli et al., The Plant Cell 2: 279-289 (1990), und US-Patent No. 5 034 323. Ein weiteres Verfahren zur Herabregulierung des Proteins umfasst Verwenden von PEST-Sequenzen, die ein Ziel für Abbau des Proteins bereitstellen.
Katalytische RNA-Moleküle oder Ribozyme können auch verwendet werden, um Expression von Pflanzengenen zu hemmen. Der Einschluss von Ribozym-Sequenzen in Gegensinn-RNAs überträgt ihnen RNA-Spaltungsaktivität, wodurch die Aktivität der Konstrukte erhöht wird. Der Entwurf und Verwendung von Ziel-RNA-spezifischen Ribozymen ist in Haseloff et al., Nature 334: 585–591 (1988), beschrieben.
Eine Vielfalt von Vernetzungsmitteln, Alkylierungsmitteln und Radikal-bildender Spezies als Seitengruppen an erfindungsgemäßen Polynucleotiden kann verwendet werden, um Nucleinsäuren zu binden, markieren, detektieren und/oder spalten. Z.B. beschreiben Vlassov, V.V., et al., Nucleic Acids Res (1986) 14: 4065–4076, kovalente Bindung eines einzelsträngigen DNA-Fragments mit alkylierenden Derivaten von zu Zielsequenzen komplementären Nucleotiden. Ein Bericht ähnlicher Arbeit durch die gleiche Gruppe ist der von Knorre, D.G., et al., Biochimie (1985) 67: 785–789. Iverson und Dervan zeigten ebenfalls Sequenz-spezifische Spaltung einzelsträngiger DNA, vermittelt durch ein modifiziertes Nucleotid, das fähig war, Spaltung zu aktivieren (J Am Chem Soc (1987) 109: 1241–1243). Meyer, R.B., et al., J Am Chem Soc (1989) 111: 8517–8519, bewirken kovalente Querverknüpfung mit einem Ziel-Nucleotid unter Verwendung eines Alkylierungsmittels, das komplementär zur einzelsträngigen Ziel-Nucleotidsequenz ist. Eine durch Psoralen vermittelte, nicht-aktivierte Querverknüpfung einzelsträngiger Nucleotide wurde von Lee, B.L., et al., Biochemistry (1988) 27: 3197–3203, offenbart. Verwendung von Querverknüpfung in Triple-Helix-bildenden Sonden wurde auch offenbart von Home et al., J Am Chem Soc (1990) 112: 2435–2437. Verwendung von N4, N4- Ethanocytosin als ein Alkylierungsmittel zum Vernetzen einzelsträngiger Oligonucleotide ist auch beschrieben worden von Webb und Matteucci, J Am Chem Soc (1986) 108: 2764–2765; Nucleic Acids Res (1986) 14: 7661–7674; Feteritz et al.; J. Am. Chem. Soc. 113: 4000 (1991). Auf dem Fachgebiet sind zahlreiche Verbindungen zum Binden, Detektieren, Markieren und/oder Spalten von Nucleinsäuren bekannt. Siehe, z.B., US-Patente Nrn. 5 543 507, 5 672 593, 5 484 908, 5 256 648 und 5 681 941.
Proteine, die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, schließen Proteine ein, die von nativen Proteinen durch Deletion (sogenannte Trunkierung), Hinzufügung oder Ersetzung einer oder mehrerer Aminosäuren an einer oder mehreren Stellen im nativen Protein abgeleitet sind. Beim Konstruieren von Varianten der interessierenden Proteine werden Modifikationen so durchgeführt werden, dass Varianten weiterhin die gewünschte Aktivität besitzen.
Beispielsweise können Aminosäuresequenz-Varianten des Polypeptids durch Mutationen in der klonierten DNA-Sequenz, die das native interessierende Protein codiert, hergestellt werden. Verfahren zur Mutagenese und Nucleotidsequenz-Änderungen sind im Fachgebiet gut bekannt. Siehe, z.B., Walker und Gaastra, Hrsg. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York); Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488–492; Kunkel et al. (1987) Methods Enzymol. 154: 367–382; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York); US-Patent No. 4 873 192; und die darin zitierten Literaturverweise; hierin durch Literaturverweis eingeschlossen. Im Modell von Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequences and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), das hierin durch Literaturverweis eingeschlossen ist, kann Anleitung zu geeigneten Aminosäure-Ersetzungen, die biologische Aktivität des interessierenden Proteins nicht beeinträchtigen, gefunden werden. Konservative Ersetzungen, wie Austauschen einer Aminosäure mit einer anderen, die ähnliche Eigenschaften hat, können bevorzugt sein.
Die vorliegende Erfindung schließt katalytisch aktive Polypeptide (d.h. Enzyme) ein. Katalytisch aktive Polypeptide werden im Allgemeinen eine spezifische Aktivität von mindestens 20%, 30% oder 40%, und bevorzugt mindestens 50%, 60% oder 70%, und besonders bevorzugt mindestens 80%, 90% oder 95% der des nativen (nicht-synthetischen), endogenen Polypeptids haben. Weiterhin ist die Substratspezifität (k_cal/K_m) wahlweise im Wesentlichen gleich der des nativen (nicht-synthetischen), endogenen Polypeptids. Kennzeichnenderweise wird K_m mindestens 30%, 40% oder 50% der des nativen (nicht-synthetischen), endogenen Polypeptids sein; und besonders bevorzugt mindestens 60%, 70%, 80% oder 90%. Verfahren zum analysierenden und quantifizierenden Messen der enzymatischen Aktivität und Substratspezifität (k_cal/K_m) sind Fachleuten gut bekannt.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung werden bei Pflanzenzellen verwendet. Die transformierten Zellen produzieren virales Replikase-Protein.
Kennzeichnenderweise wird eine intermediäre Wirtszelle in der Anwendung dieser Erfindung verwendet werden, um die Kopienzahl des Klonierungsvektors zu erhöhen. Mit einer erhöhten Kopienzahl kann der die interessierende Nucleinsäure enthaltende Vektor in signifikanten Mengen zur Einführung in die gewünschten Pflanzenzellen isoliert werden. Wirtszellen, die in der Anwendung dieser Erfindung verwendet werden können, schließen Prokaryonten, einschließlich bakterieller Wirtszellen, wie Escherichia coli, Salmonella typhimurium und Serratia marcescens, ein. Eukaryontische Wirte, wie Hefen oder filamentöse Pilze, können auch in dieser Erfindung verwendet werden. Es ist bevorzugt, Pflanzen-Promotoren zu verwenden, die keine Expression des Polypeptids in Bakterien bewirken.
Allgemein verwendete prokaryontische Kontrollsequenzen schließen Promotoren, wie die beta-Lactamase-(Penicillase) und Lactose-(lac)-Promotorsysteme (Chang et al., Nature 198: 1056 (1977)), das Tryptophan-(trp)Promotorsystem (Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8: 4057 (1980)) und den lambda-abgeleiteten PL-Promotor und N-Gen-Ribosomen-Bindestelle (Shimatake et al., Nature 292: 128 (1981)) ein. Der Einschluss von Selektionsmarkern in in E. coli transfizierte DNA-Vektoren ist ebenfalls hilfreich. Beispiele solcher Marker schließen Gene ein, die Resistenz gegenüber Ampicillin, Tetrazyklin oder Chloramphenicol spezifizieren.
Der Vektor ist ausgewählt, um Einführung in die geeignete Wirtszelle zu erlauben. Bakterielle Vektoren haben kennzeichnenderweise Plasmid- oder Phagen-Herkunft. Expressionssysteme zum Exprimieren eines erfindungsgemäßen Poteins sind verfügbar unter Verwendung von Bacillus sp. und Salmonella (Palva et al., Gene 22: 229–235 (1983); Mosbach et al., Nature 302: 543–545 (1983)).
Pflanzen-Geminivirus-Replikase-Proteine können in eine Zelle eingeführt werden, um Zellteilung zu erhöhen. Synthese heterologer Proteine in Hefe ist gut bekannt. Siehe Sherman, F., et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1982). Zwei weithin verwendete Hefen zur Produktion eukaryontischer Proteine sind Saccharomyces cerevisiae und Pichia pastoris. Vektoren, Stämme und Protokolle für Expression in Saccharomyces und Pichia sind im Fachgebiet bekannt und von kommerziellen Lieferanten erhältlich (z.B. Invitrogen). Geeignete Vektoren haben üblicherweise Expressions-Kontrollsequenzen, wie Promotoren, einschließlich 3-Phosphoglyceratkinase oder Alkoholoxidase, und einen Replikationsstartpunkt, Terminationssequenzen und dergleichen, wie gewünscht.
Das Protein kann aus Hefe durch Lysieren der Zellen und Anwenden von Standard-Proteinisolations-Techniken auf die Lysate isoliert werden. Die Überwachung des Reinigungsprozesses kann durch Western-Blot-Techniken oder Radioimmunassay oder andere Standard-Immunassay-Techniken erreicht werden.
Die Proteine können auch unter Verwendung nicht-zellulärer Syntheseverfahren aufgebaut werden. Techniken zur Festphasen-Synthese sind beschrieben in Barany und Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis, S. 3–284, in The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Bd. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part A.; Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc. 85: 2149– 2156 (1963), und Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Aufl., Pierce Chem. Co., Rockford, III. (1984). Proteine größerer Länge können durch Kondensation der Amino- und Carboxytermini kürzerer Fragmente synthetisiert werden. Verfahren der Bildung von Peptidbindungen durch Aktivierung eines Carboxy-terminalen Endes (z.B. durch Verwendung des Kupplungsreagens N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid) sind Fachleuten bekannt.
Das Protein kann durch im Fachgebiet gut bekannte Standardtechniken, einschließlich Detergens-Solubilisierung, selektive Präzipitation mit solchen Substanzen, wie Ammoniumsulfat, Säulenchromatographie, Immun-Reinigungsverfahren, und andere, zu stofflicher Reinheit gereinigt werden. Siehe, z.B., R. Scopes, Protein Purification: Principles and Practise, Springer Verlag: New York (1982); Deutscher, Guide to Protein Purification, Academic Press (1990). Beispielsweise können Antikörper gegen die hierin beschriebenen Proteine hergestellt werden. Reinigung aus E. coli kann gemäß den in US-Patent No. 4 511 503 beschriebenen Prozeduren erreicht werden. Detektion des exprimierten Proteins wird durch im Fachgebiet bekannte Verfahren erreicht, z.B. Radioimmunassays, Western-Blotting-Techniken oder Immunopräzipitation.
Es wird erwartet, dass Exprimieren von Pflanzen-Geminivirus-Replikase-Polypeptiden einen positiven Wachstumsvorteil bereitstellt und den Ernteertrag erhöht.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Erfindung in einem weiten Bereich von Pflanzen, wie Monokotylen und Dikotylen, angewendet werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Verfahren in Mais, Sojabohne, Sonnenblume, Saflor, Kartoffel, Tomate, Sorghum, Canola bzw. Rapssorten, Weizen, Alfalfa, Baumwolle, Reis, Gerste und Hirse eingesetzt.
Das Verfahren der Transformation/Transfektion ist für die Erfindung nicht kritisch; verschiedene Verfahren der Transformation oder Transfektion sind gegenwärtig verfügbar. Da neuere Verfahren zum Transformieren von Wirtszellen verfügbar sind, können sie direkt angewendet werden. Dementsprechend ist eine große Vielfalt von Verfahren entwickelt worden, um eine DNA-Sequenz in das Genom einer Wirtszelle zu inserieren, um die Transkription und/oder Translation der Sequenz zu erreichen, um phänotypische Änderungen im Organismus zu bewirken. Deshalb kann jedes Verfahren, das effiziente Transformation/Transfektion gewährleistet, eingesetzt werden.
Eine DNA-Sequenz, die für das in der vorliegenden Erfindung verwendbare Polynucleotid codiert, z.B. eine cDNA-, RNA- oder eine genomische Sequenz, werden verwendet werden, um eine Expressionskassette zu konstruieren, die in die gewünschte Pflanze eingeführt werden kann. Isolierte Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung können in Pflanzen gemäß im Fachgebiet bekannter Techniken eingeführt werden. Allgemein werden Expressionskassetten, wie oben beschrieben, und geeignet zur Transformation von Pflanzenzellen, hergestellt.
Verfahren zum Transformieren verschiedener Wirtszellen sind in Klein et al., "Transformation of microbes, plants and animals by particle bombardment", Bio/Technol. New York, N.Y., Nature Publishing Company, März 1992, v. 10 (3), S. 286–291, offenbart.
Techniken zum Transformieren einer großen Vielfalt höherer Pflanzenarten sind gut bekannt und in der technischen, wissenschaftlichen und Patent-Literatur beschrieben. Siehe, z.B., Weising et al., Ann. Rev. Genet. 22: 421–477 (1988). Beispielsweise kann das DNA-Konstrukt direkt in die genomische DNA der Pflanzenzelle eingeführt werden, indem Techniken, wie Elektroporation, PEG-vermittelte Transfektion, Partikel-Bombardierung, Siliciumfaser-Lieferung bzw. Zufuhr (delivery) oder Mikroinjektion von Pflanzenzell-Protoplasten oder embryogenem Kallus verwendet werden. Siehe, z.B., Tomes et al., Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment, S. 197–213, in Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Fundamental Methods, Hrsg. O.L. Gamborg und G.C. Phillips, Springer-Verlag Berlin, Heidelberg, New York, 1995. Alternativ können die DNA-Konstrukte mit geeigneten T-DNA-flankierenden Regionen kombiniert werden und in einen konventionellen Agrobacterium tumefaciens-Wirtsvektor eingeführt werden. Die Virulenzfunktionen des Agrobacterium tumefaciens-Wirts werden die Insertion des Konstrukts und benachbarter Marker in die Pflanzenzell-DNA leiten, wenn die Zelle durch das Bakterium infiziert ist. Siehe U.S.-Patent No. 5 591 616.
Die Polyethylenglykol-Präzipitation verwendende Einführung von DNA-Konstrukten ist beschrieben in Paszkowski et al., Embo J. 3: 2717–2722 (1984). Elektroporations-Techniken sind beschrieben in Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 5824 (1985). Ballistische Transformationstechniken sind beschrieben in Klein et al., Nature 327: 70–73 (1987).
Agrobacterium tumefaciens-vermittelte Transformationstechniken sind in der wissenschaftlichen Literatur gut beschrieben. Siehe z.B. Horsch et al., Science 233: 496–498 (1984), und Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 4803 (1983). Agrobacterium-Transformation von Mais ist z.B. beschrieben in U.S.-Patent No. 5 550 318.
Andere Verfahren der Transformation schließen ein (1) Agrobacterium rhizogenes-vermittelte Transformation (siehe z.B. Lichtenstein und Fuller, in: Genetic Engineering, Bd. 6, PWJ Rigby, Hrsg., London, Academic Press, 1987; und Lichtenstein, C.P., und Draper, J., in: DNA Cloning, Bd. II, D.M. Glover, Hrsg., Oxford, IRI Press, 1985), Anmeldung PCT/US87/02512 (WO 88/02405, publiziert am 7. April 1988), beschreibt die Verwendung von A. rhizogenes-Stamm A4 und seines Ri-Plamids zusammen mit A. tumefaciens-Vektoren pARC8 oder pARC16, (2) Liposom-vermittelte DNA-Aufnahme (siehe, z.B., Freeman et al., Plant Cell Physiol. 25: 1353, 1984), (3) das Vortexing-Verfahren (siehe, z.B., Kindle, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1228 (1990)).
DNA kann in Pflanzen auch durch direkten DNA-Transfer in Pollen eingeführt werden, wie beschrieben von Zhou et al., Methods in Enzymology, 101: 433 (1983); D. Hess, Intern Rev. Cytol., 107: 367 (1987); Luo et al., Plane Mol. Biol. Reporter, 6: 165 (1988). Expression von Polypeptid-codierenden Nucleinsäuren kann durch Injektion der DNA in Fortpflanzungs organe einer Pflanze erhalten werden, wie von Pena et al., Nature, 325.: 274 (1987), beschrieben. DNA kann auch direkt in die Zellen unreifer Embryonen und die Rehydration entwässerter Embryonen injiziert werden, wie von Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet., 75: 30 (1987); und Benbrook et al., in Proceedings Bio Expo 1986, Butterworth, Stoneham, Mass., S. 27–54 (1986), beschrieben.
Tierische und niedrige eukaryontische (z.B. Hefe) Wirtszellen sind kompetent oder werden durch verschiedene Mittel für Transfektion kompetent gemacht. Es gibt etliche gut bekannte Verfahren des Einführens von DNA in Tierzellen. Diese schließen ein: Calciumphosphat-Präzipitation, Fusion der Empfängerzellen mit bakteriellen Protoplasten, die die DNA enthalten, Behandlung der Empfängerzellen mit Liposomen, die die DNA enthalten, DEAE-Dextran, Elektroporation, Gentransfer mit der Partikelkanone und Mikroinjektion der DNA direkt in die Zellen. Die transfizierten Zellen werden durch im Fachgebiet bekannte Mittel kultiviert. Kuchler, R.J., Biochemical Methods in Cell Culture and Virology, Dowden, Hutchinson und Ross, Inc. (1977).
Transformierte Pflanzenzellen, die durch eine beliebige der obenstehenden Transformationstechniken erlangt wurden, können kultviert werden, um eine ganze Pflanze zu regenerieren, die den transformierten Genotyp besitzt. Solche Regenerationstechniken beruhen oft auf Manipulation gewisser Phytohormone in einem Gewebekultur-Wachstumsmedium, kennzeichnenderweise beruhend auf einem Biozid- und/oder Herbizid-Marker, der zusammen mit einem erfindungsgemäßen Polynucleotid eingeführt worden ist. Für Transformation und Regeneration von Mais siehe Gordon-Kamm et al., The Plant Cell, 2: 603–618 (1990).
Mit einem Pflanzen-Expressionsvektor transformierte Pflanzenzellen können z.B. aus einzelnen Zellen, Kallus-Gewebe oder Blattscheiben gemäß Standard-Pflanzengewebekultur-Techniken regeneriert werden. Es ist im Fachgebiet gut bekannt, dass verschiedene Zellen, Gewebe und Organe von nahezu jeder beliebigen Pflanze erfolgreich kultiviert werden können, um eine vollständige Pflanze zu regenerieren. Pflanzen-Regeneration aus kultivierten Protoplasten ist beschrieben in Evans et al., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, Macmillan Publishing Company, New York, S. 124–176 (1983); und Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, CRC Press, Boca Raton, S. 21-73 (1985).
Die Regeneration von Pflanzen, enthaltend das durch Agrobacterium eingeführte, fremde Gen, kann, wie von Horsch et al., Science, 227: 1229–1231 (1985), und Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 4803 (1983), beschrieben, erreicht werden. Diese Prozedur bildet kennzeichnenderweise innerhalb von zwei bis vier Wochen Schösslinge, und diese Transformanten-Schösslinge werden dann auf ein geeignetes Wurzel-induzierendes Medium transferiert, das den selektiven Wirkstoff und ein Antibiotikum zum Verhüten bakteriellen Wachstums enthält. Erfindungsgemäße transgene Pflanzen können fruchtbar oder steril sein.
Regeneration kann auch aus Pflanzenkallus, Explantaten, Organen oder Teilen davon erhalten werden. Solche Regenerationstechniken sind allgemein beschrieben in Klee et al., Ann. Rev. of Plant Phys. 38: 467–486 (1987). Die Regeneration von Pflanzen aus entweder einzelnen Pflanzenprotoplasten oder zahlreichen Explantaten ist im Fachgebiet gut bekannt. Siehe, z.B., Methods for Plant Molecular Biology, A. Weissbach und H. Weissbach, Hrsg., Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (1988). Für Mais-Gewebekultur und Regeneration siehe allgemein The Maize Handbook, Freeling und Walbot, Hrsg., Springer, New York (1994); Corn and Corn Improvement, 3. Auflage, Sprague and Dudley Hrsg., American Society of Agronomy, Madison, Wisconsin (1988).
Ein Fachmann wird erkennen, dass, nachdem die Expressionskassette stabil in transgene Pflanzen eingeführt ist und bestätigt ist, dass sie funktionsfähig ist, sie in andere Pflanzen durch sexuelle Kreuzung eingeführt werden kann. Eine beliebige einer Anzahl von Standard-Züchtungstechniken kann, abhängig von der zu kreuzenden Art, verwendet werden.
Bei vegetativ vermehrten Nutzpflanzen können reife transgene Pflanzen durch das Nehmen von Stecklingen oder durch Gewebekulturtechniken vermehrt werden, um mehrere identische Pflanzen herzustellen. Selektion wünschenswerter Transgene wird durchgeführt, und neue Varietäten werden erhalten und vegetativ für kommerzielle Verwendungen vermehrt. In Samen-vermehrten Nutzpflanzen können reife transgene Pflanzen selbst-gekreuzt werden, um eine homozygote Inzuchtpflanze herzustellen. Die Inzuchtpflanze produziert Samen, der die neu eingeführte heterologe Nucleinsäure enthält. Diese Samen können angebaut werden, um Pflanzen herzustellen, die den ausgewählten Phänotyp bilden würden.
Von der regenerierten Pflanze erhaltene Teile, wie Blüten, Samen, Blätter, Zweige, Früchte und dergleichen, sind in die Erfindung eingeschlossen, vorausgesetzt, dass diese Teile Zellen umfassen, die die isolierte Pflanzen-Geminivirus-Replikase-Nucleinsäure umfassen. Nachkommenschaft und Varianten und Mutanten der regenerierten Pflanzen sind ebenfalls in den Bereich der Erfindung eingeschlossen, vorausgesetzt, dass diese Teile die eingeführten Nucleinsäuresequenzen umfassen.
Einen selektierbaren Marker exprimierende transgene Pflanzen können z.B. durch Standard-Immunoblot und DNA-Nachweistechniken auf die Übertragung der Pflanzen-Geminivirus-Replikase-Nucleinsäure durchsucht werden. Transgene Linien werden auch kennzeichnenderweise bezüglich der Expressionslevel der heterologen Nucleinsäure bewertet. Anfangs kann Expression auf der RNA-Ebene bestimmt werden, um Expressions-positive Pflanzen zu identifizieren und quantitativ zu bestimmen. Standardtechniken zur RNA-Analyse können eingesetzt werden und schließen PCR-Amplifikations-Assays, die Oligonucleotid-Primer, die entworfen wurden, um nur die heterologen RNA-Templates zu amplifizieren, und Lösungs-Hybridisierungsassays, die heterologe Nucleinsäure-spezifische Sonden verwenden, ein. Die RNA-positiven Pflanzen können dann durch Western-Immunoblot-Analyse unter Verwendung der erfindungsgemäßen, spezifisch reaktiven Antikörper auf Protein-Expression untersucht werden. Zusätzlich können unter Verwendung von für die heterologe Nucleinsäure-spezifischen Polynucleotid-Sonden und Antikörpern in situ-Hybridisierung und Immunozytochemie gemäß Standardprotokollen gemacht werden, um Expressionsorte im transgenen Gewebe zu lokalisieren. Im Allgemeinen wird normalerweise eine Anzahl transgener Linien bezüglich der aufgenommenen Nucleinsäure durchsucht, um Pflanzen mit den geeignetsten Expressionsprofilen zu identifizieren und zu selektieren.
Pflanzen, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, können weithin variieren und schließen monokotyle und dikotyle Pflanzen ein. Bevorzugte Pflanzen schließen Mais, Sojabohne, Sonnenblume, Sorghum, Canola bzw. Rapssorten, Weizen, Alfalfa, Baumwolle, Reis, Gerste, Kartoffel, Tomate und Hirse ein.
Samen, die von Pflanzen stammen, die aus transformierten Pflanzenzellen, Pflanzenteilen oder Pflanzengeweben regeneriert wurden oder von der regenerierten transformierten Pflanze abgeleitete Nachkommenschaft können direkt als Futter oder Nahrung verwendet werden, oder weitere Bearbeitung kann vorkommen.
Es wird erwartet, dass Expression der Pflanzen-Geminivirus-Replikase-Nucleinsäure in Pflanzen, wie Mais, Wachstum und Biomasse-Akkumulation, verstärkt. Auf der Ebene der ganzen Pflanze bestehen andere, spezialisiertere Anwendungen für diese Nucleinsäuren.
Die vorliegende Erfindung wird weiterhin unter Bezugnahme auf die folgenden detaillierten Beispiele beschrieben werden.
BEISPIELE
Beispiel 1. Replikase-Konstrukte
Das Replikase-Gen wurde von Joachim Messing im Vektor pWI-11 erhalten und wurde mit P100 neu benannt. Unter Verwendung von P100 als Quelle wurde das Replikase-Strukturgen in einen Zwischenvektor kloniert, der den 35S-Promotor und eine 35S-3'-Sequenz enthält (für Expressionsstudien in dikotylen Arten, wie Tabak; bezeichnet P101, hergestellt im Larkins-Labor, Univ. Arizona). Aus diesem Zwischenplasmid wurden das RepA-Strukturgen und die 35S-3'-Sequenz unter Verwendung der Restriktionsenzyme NcoI und PstI ausgeschnitten und in P101 (gamma-Zein-Promotor::uidA::Gamma-Zein-3'-Region; nach der Entfernung des GUS-Strukturgens aus P101 unter Verwendung von NcoI/PstI) kloniert. Dies ergab ein endgültiges Konstrukt, enthaltend eine Expressionskassette mit einer Mais-gamma-Zein-Promotor-Sequenz (GZ), der RepA-codierenden Sequenz, einem 35S-Terminator und einer gamma-Zein-3'-Sequenz (GZ'). Die Expressionskassette hatte daher die Konfiguration GZ::RepA::35S::GZ'P102.
Vom Messing-Labor wurde auch ein Abkömmling des pWI-11-Vektors bereitgestellt (pWI-GUS), bei dem sowohl iudA-(GUS-Expression codierend) als auch rep-Genexpression durch die bidirektionalen Promotor-Elemente in der WDV-langen intergenischen Region (WDV long intergenic region) (WDV-LIR) angetrieben wird.
Beispiel 2. Replikase bewirkt erhöhte vorübergehende Expression mitgelieferter Transgene (co-delivered transgenes)
Die in untenstehender Tabelle I aufgelisteten Plasmide wurden verwendet, um den Einfluss von Rep auf vorübergehende Expression mitgelieferter Transgene zu bewerten. Der SuperMAS-Promotor ist der von Ni et al., 1996, Sequence-specific interactions of woundinducible nuclear factors with mannopine synthase 2' promoter wound responsive elements, Plant Mol. biol. 30: 77–96, beschriebene. Die sichtbaren Marker-Gene, GUS (b-Glucoronidase; Jefferson R.A., Plant Mol. Biol. Rep. 5: 387, 1987) und GFP (green fluorescent protein; Chalfie et al., Science 263: 802, 1994) sind, wie auch das Mais-optimierte GFP (GFPm; siehe gleichzeitig anhängige US-Patentanmeldung WO 97/41228), beschrieben worden. Der Ubiquitin-Promotor ist beschrieben worden (Christensen et al., Plant Mol. Biol. 12: 619–632 (1989), und Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18: 675–689 (1992)), ebenso wie die pinII-(An et al., 1989, Plant Cell 1: 115–122) und 35S (Odell et al., 1985, Nature 313: 810–812) 3'-Regionen, die in diesen Expressionskassetten verwendet wurden.
Tabelle I. Konstrukte, die verwendet wurden, um die Wirkung von Replikase-Expression auf vorübergehende Expression mitgelieferter Transgene zu bewerten.
GFP-Expression in Mais
Transformation der Rep-Plasmid-DNA, P100, in die Pioneer Hi-Bred Int'l Inc.-eigene Inzucht N38, folgte einem gut etablierten Bombardierungs-Transformationsprotokoll, das zum Einführen von DNA in das Schildchen unreifer Mais-Embryonen verwendet wurde (Songstad, D.D., et al., In Vitro Cell Dev. Biol. Plant 32: 179–183, 1996). Es ist festzustellen, dass jedes beliebige geeignete Transformationsverfahren, wie Agrobacterium-vermittelte Transformation und etliche andere Verfahren, verwendet werden können. Zellen wurden durch Kultivieren unreifer Mais-Embryonen (ungefähr 1–1,5 mm Länge) auf N6-Salze, Erikkson's Vitamine, 0,69 g/l Prolin, 2 mg/l 2,4-D und 3% Saccharose enthaltendem Medium transformiert. Nach 4–5 Tagen der Inkubation im Dunkeln bei 28°C wurden Embryos vom ersten Medium entfernt und auf gleichem, 12% Saccharose enthaltendem Medium kultiviert. Es wurde Embryonen erlaubt, sich für 3 Stunden vor Transformation an dieses Medium zu gewöhnen. Die Schildchenoberfläche der unreifen Embryonen wurde unter Verwendung von Partikel-Bombardierung mit entweder einem UBI::GFPm::pinII-Plasmid + einem UBI::Mais-optimierten PAT::pinII-Plasmid (P105, Kontrollbehandlung) oder mit einer Kombination aus dem UBI::GFPm::pinII-Plasmid P104+, das Replikase-Plasmid P100 zum Ziel genommen. Embryonen wurden unter Verwendung der PDS-1000 Helium Gun von Bio-Rad bei einem Schuss pro Probe unter Verwendung von 650PSI-Berstscheiben transformiert. Pro Schuss gelieferte DNA war im Durchschnitt 0,0667 μg. Eine gleiche Anzahl Embryonen pro Ähre wurde entweder mit der Kontroll-DNA-Mischung oder der Rep-GFP-DNA-Mischung bombardiert. Anschließend an Bombardierung wurden alle Embryonen auf Standard-Maiskulturmedium (N6-Salze, Erikkson's Vitamine, 0,69 g/l Prolin, 2 mg/l 2,4-D, 3% Saccharose) für 2–3 Tage gehalten und dann hinsichtlich transienter GFP-Expression bewertet.
In beiden Experimenten exprimierten größere Anzahlen von Zellen auf der Schildchen-Oberfläche vorübergehend GFP in der Replikase-enthaltenden Behandlung. In Experiment #1 mit Genotyp N38 exprimierten eine mittlere Zahl von nur 12 Zellen pro Embryo vorübergehend GFP in der Behandlung ohne Replikase, wohingegen gegen in den Replikase-behandelten Embryonen die mittlere Zahl GFP-exprimierender Zellen fast 20-fach größer war (siehe Tabelle II unten). Im zweiten Experiment (Tabelle III unten) war vorübergehende GFP-Expression in den Replikase-enthaltenden Behandlungen ungefähr 6,5-fach größer als in den Kontrollbehandlungen (keine Replikase).
Tabelle II. Mais-Experiment #1: Vorübergehende GFP-Expression wird durch Replikase stimuliert
Tabelle III. Mais-Experiment #2: Vorübergehende GFP-Expression wird durch Replikase stimuliert

* die Anzahl GFP-exprimierender Zellen pro Embryo wurde über alle 25 Embryonen auf der Platte gemittelt.

Sojabohne
Gewebe wurde aus Keimblättern ausgeschnitten und auf MS-basiertem Medium platziert. Eine Mischung von Plasmid-DNA, enthaltend gleiche Mengen eines SuperMas::GUS::pinII-Plasmids (P103) und des WDV-LIR::Replikase-Plasmids (P100), wurde in Zellen auf der Oberfläche der Keimblattexplantate unter Verwendung Partikel-vermittelter Abgabe, die gleich zu der für Mais oben beschriebenen war, zugeführt. Als eine Kontrolle wurde SuperMas::GUS::pinII-Plasmid (P103) + UBI::moPAT::CaMV35S (P105) unter Verwendung einer gleichen Anzahl von Keimblattgewebestücken eingeführt.
In der Replikase-Behandlung wurden größere Zahlen vorübergehend exprimierter Zellen auf dem Keimblatt nach GUS-Färbung (vergleiche die Kontrollbehandlung in 1a mit der Replikase-Behandlung in 1b) beobachtet. Zusätzlich schien bei Zellen, die vorübergehende Genexpression aufweisen, der Expressionslevel, wie durch relative Intensität histochemischer Färbung beurteilt, in Replikase-behandelten Geweben (verglichen mit Kontrollen) größer zu sein.
Beispiel 3. RepA erhöht Wachstumsraten in sich früh entwickelnden, stabilen Mais-Transformanten
Transformation der RepA-Plasmid-DNA (P102), P102 in Hi-II folgte dem Standard-Hi-II-Bombardierungs-Transformationsprotokoll (Songstad D.D. et al., In Vitro Cell Dev. Biol. Plant 32: 179–183, 1996). Zellen wurden transformiert durch Kultivieren unreifer Maisembryonen (ungefähr 1–1,5 mm Länge) auf 560P-Medium, enthaltend N6-Salze, Erikkson's Vitamine, 0,69 g/l Prolin, 2 mg/l 2,4-D und 3% Saccharose. Nach 4–5 Tagen der Inkubation im Dunkeln bei 28°C wurden Embryonen vom 560P-Medium entfernt und, Schildchen oben, auf 560Y-Medium, das zu 560P gleichwertig ist, aber 12% Saccharose enthält, kultiviert. Es wurde den Embryonen erlaubt, sich für 3 h vor Transformation an dieses Medium zu gewöhnen. Die Schildchen-Oberfläche der unreifen Embryonen wurde unter Verwendung von Partikel-Bombardierung, entweder mit einem UBI::moPAT~GFPm::pinII-Plasmid (P106 alleine als eine Kontrollbehandlung) oder mit einer Kombination des UBI::moPAT~GFPm::pinII-Plasmids (P106) + des GZ::RepA::35S:GZ'-Plasmids (P102) zum Ziel genommen. Embryonen wurden unter Verwendung der PDS-1000 Helium Gun von Bio-Rad bei einem Schuss pro Probe unter Verwendung von 650PSI-Berstscheiben transformiert. Pro Schuss gelieferte DNA war im Mittel bei 0,0667 μg. Eine gleiche Anzahl Embryonen pro Ähre wurde entweder mit der Kontroll-DNA (PAT~GFP) oder der RepA-PAT~GFP-DNA-Mischung bombardiert. Anschließend an die Bombardierung wurden alle Embryonen auf 560L-Medium (N6-Salze, Eriksson's Vitamine, 0,5 mg/l Thiamin, 20 g/l Saccharose, 1 mg/l 2,4-D, 2,88 g/l Prolin, 2,0 g/l Gelrite und 8,5 mg/l Silbernitrat) gehalten. Nach 2–7 Tagen nach Bombardierung wurden alle Embryonen aus beiden Behandlungen auf N6-basiertes Medium, enthaltend 3 mg/l Bialaphos, transferiert (oben beschriebenes Pioneer 560P-Medium ohne Prolin und mit 3 mg/l Bialaphos). Platten wurden bei 28°C im Dunklen gehalten und wurden hinsichtlich Kolonie-Erholung beobachtet, wobei Über impfungen auf frisches Medium alle 2 Wochen geschahen. Zwei Wochen nach DNA-Abgabe wurde der sich neu bildende Kallus unter Verwendung von Epifluoreszenz unter dem Präpariermikroskop (unter Verwendung kommerziell erhältlicher Filterkombinationen für GFP-Anregung und -Emission) untersucht.
Bei 2 Wochen nach Bombardierung exprimierten zahlreiche Zellen auf der Oberfläche des Schildchen-abgeleiteten Gewebes GFP in der Kontrollbehandlung (kein RepA), aber alle exprimierenden Foci bestanden aus einzelner Zelle (siehe 2a). In der Kontrolle wurden keine mehrzelligen GFP-exprimierenden Cluster beobachtet. An diesem gleichen Zeitpunkt, 2 Wochen nach DNA-Abgabe, wurde die gleiche Sprenkelung einzelliger GFP-exprimierender Foci auf der Oberfläche des Gewebes, das die RepA/PAT~GFP-Mischung erhalten hatte, beobachtet. Jedoch waren auch zahlreiche makroskopische GFP-exprimierende mehrzellige Cluster sichtbar (siehe 2b, beide 2a und 2b sind mit der gleichen Vergrößerung gezeigt). Bei vielen Embryonen wurden sich auf der Oberfläche entwickelnde mehrfache transgene Mikrokalli beobachtet, wobei bis zu 7 scheinbar unabhängige Transformanten aus einem einzelnen Embryo zu wachsen begannen (dies ist vorher nie für Partikel-Bombardierung von Mais berichtet worden).
Nach 3 Wochen konnten GFP-exprimierende Einzelzellen noch in beide Behandlungen beobachtet werden, obwohl die Häufigkeit abgenommen hatte. In der Kontrollbehandlung beobachteten wir, dass sich eine einzelne GFP-exprimierende mehrzellige Kolonie auf einem Embryo (von ingesamt 50) entwickelte. Die Wachstumsrate der sich entwickelnden transgenen Kalli blieb in den RepA-behandelten Embryonen sehr rasch. Viele der multiplen Kolonien, die anscheinend aus einzelnen Embryonen wuchsen, waren bereits in der Gefahr der Vermischung durch Zusammenwachsen zu einer einzigen Masse. Viele Kolonien wurden von den Embryonen abgeimpft, um sie separat zu ziehen. Bei 5 Wochen nach Bombardierung wuchsen viele RepA-Kolonien weiterhin rasch (einige können zu klein gewesen sein, um unabhängig zu überleben). Während sie rasch wuchsen, behielten diese RepA-behandelten transgenen Kalli einen gesunden embryogenen Charakter.
Beispiel 4. RepA erhöht Zellteilungsraten in Tabak-Suspensionskultur-Zellen.
Für Tabak BY-2-Suspensionskultur-Zellen wurde das folgende Konstrukt verwendet; 35S-Promotor::RepA::35S-3'-Region (P101). Suspensionszellen wurden gezüchtet in einem Medium, umfassend Murashige- und Skoog-Salze (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY), 100 mg/l Inositol, 1 mg/l Thiamin, 180 mg/l KH2PO4, 30 g/l Saccharose und 2 mg/l 2,4-D, alle 7–10 Tage subkultiviert und auf einem Gyrator-Schüttler bei 150 U/min gezüchtet, 24°C im Dunkeln. Drei Tage nach Subkultivierung wurden Zellen auf verfestigtes Agar-Medium zur Bombardierung pipettiert und für 24 Stunden im Dunkeln gelassen. Bombardierung wurde ausgeführt unter Verwendung einer BioRad PDS-1000, unter Verwendung von Helium bei 650 PSI und 25 Zoll Hg, mit 8 cm Abstand zwischen der Stoppplatte und der Petrischale. Alle Zellen wurde einmal mit 500 ng Gold und 0,5 μg DNA beschossen. Alle behandelten Zellen erhielten ein eine 35S::GFP::35S-Expressionskassette enthaltendes Plasmid (P108), wobei die Hälfte ein zusätzliches Plasmid, enthaltend die 35S::RepA::35S-Kassette, erhielt. Nach Bombardierung wurden die Zellen auf GFP-Expression und Zellteilung überwacht.
Nach 24 Stunden wurden GFP-exprimierende Zellen als nicht-teilend (einzelne fluoreszierende Zellen) oder als sich während der dazwischengeschalteten 24-Stunden-Periode geteilt habend beurteilt (d.h., GFP-exprimierende Dubletten mit den charakteristischen neugebildeten Teilungsplatten zwischen den zwei fluoreszierenden Tochterzellen). Bei der Kontrollbehandlung (GFP alleine) hatten 37,5% (mit einem Standardfehler von 1,8, berechnet für drei Wiederholungen) der Gesamtzahl GFP-exprimierender Zellen während dieser Periode Teilung durchgemacht. In der Behandlung, in der GFP + RepA-Expressionskassetten gleichzeitig eingeführt wurden, hatte sich der Prozentsatz GFP-exprimierender Zellen, die die Teilung durchgemacht hatten, grundlegend auf 45,7 erhöht (SE = 5,7).
Beispiel 5. RepA erhöht Mais-Transformationshäufigkeit
Für Transformationsexperimente wurde ein Konstrukt verwendet, in dem die RepA-codierende Sequenz in eine Mais-Expressionskassette (P102, oben beschrieben) kloniert war. Unter Verwendung von Partikel-Bombardierung wurde eine Abgabe des RepA-Gens in einer geeigneten Pflanzen-Expressionskassette (z.B. in einem GZ::RepA::35S:GZ-enthaltenden Plasmid) zusammen mit Markergenkassetten erreicht. DNA wurde in Maiszellen eingeführt, die zum Wachstum auf geeignetem Mais-Kulturmedium fähig waren (frisch isolierte reife Embryonen). Für Behandlungen siehe Tabelle IV unten. Als das Ziel für die Co-Abgabe von Plasmiden wurden unreife Embryonen des HiII-Genotyps verwendet. Wachstum Bialaphos-resistenter Kolonien auf Selektivmedium war ein zuverlässiger Assay, um den Effekt von Transgen-Integration zu beurteilen. Die Embryonen wurden innerhalb von 1–7 Tagen nach DNA-Einführung auf 3 mg/l des selektiven Wirkstoffs Bialaphos enthaltendes Kulturmedium gebracht. Embryonen, und später Kallus, wurden alle 2 Wochen auf frische Selektionsplatten transferiert. Vier bis sechs Wochen nach Bombardierung wurden Bialaphos-resistente Kalli ausgezählt und auf separate Platten transferiert, um die Vermischung von Transformanten zu verhüten, wenn sie weiter wachsen. Expression des sichtbaren zählbaren Markers (GUS oder GFP) wurde verwendet, um Transformation zu bestätigen. In den RepA-behandelten Embryonen wurden höhere Anzahlen stabiler Transformanten gewonnen (wahrscheinlich ein direktes Ergebnis erhöhter Integrationsfrequenzen).
Tabelle IV. Experimenteller Entwurf zum Beurteilen des Einflusses von RepA-Expression auf Gewinnung stabiler Maistransformanten.
Experiment #1. Dieses Experiment wurde ursprünglich entworfen, um RepA-Expression im Endosperm zu untersuchen. Wir verwendeten deshalb alle Embryonen von den verfügbaren Hi-II-Ähren an diesem Tag, um RepA zusammen mit den Markergenen (P107, das Konstrukt, das Enhanced-35S-Promotor::bar::pinII und UBI::GUS::pinII enthält) zu induzieren. Die Häufigkeiten für HiII-Transformation unter Verwendung von P107 alleine (E35S::bar::pinII + UBI::GUS::pinII) während dieser Periode waren durchschnittlich zwischen 2–3%, stellten eine gute Vergleichsbasis dar. In diesem Experiment war unsere Transformationsfrequenz mit P107 + GZ::RepA (P102) 8,8% (33 Transformanten/375 Startembryonen).
Experiment #2. Die ursprüngliche Absicht dieses Experiments war wiederum, Endosperm-exprimierende RepA-Transformanten zu erzeugen (nicht Transformationshäufigkeiten zu vergleichen). Wie im ersten Experiment war das Ergebnis unerwartet; Transformationshäufigkeit unter Verwendung von P107 + GZ::RepA (P102) war 29,2% (73 Transformanten/250 Startembryonen). Dies stellte ungefähr eine 10-fache Erhöhung gegenüber dem 2–3% Transformationshäufigkeiten, die in anderen Experimenten, die während dieser Periode unter Verwendung gleicher Markergene (das bar-Gen, um Bialaphos-Resistenz zu verleihen, und GUS als ein sichtbarer Marker) durchgeführt wurden, beobachtet wurden, dar.
Experiment #3. In diesem Experiment wurden zahlreiche Ähren verwendet. Unreife Embryonen wurden von jeder Ähre isoliert, auf Platten zufällig angeordnet und dann zwischen jeder der zwei Behandlungen (+/– RepA) aufgeteilt. Dieser Vergleich verwendete eine Gesamtzahl von 725 Embryonen pro Behandlung, geerntet aus einer Gesamtzahl von 29 Ähren (25 Embryonen/Ähre/Behandlung). Transformationshäufigkeiten wurden auf einer Pro-Ähre-Basis berechnet und dann als der Mittelwert ausgedrückt.
Dieses straff kontrollierte Experiment bestätigte die vorläufigen Ergebnisse in Experimenten #1 und #2. Über viele Wiederholungen (an separaten Tagen geerntete einzelne Ähren) war die mittlere Häufigkeit RepA-behandelter unreifer Embryonen über 7,5-fach größer als bei nur mit dem Kontrollplasmid behandelten Embryonen. Dies ist eine bemerkenswerte Verbesserung der Transformationshäufigkeit bei Partikel-vermittelter Transformation von unreifen Hi-II-Embryonen. Die aus den RepA-Behandlungen gewonnenen Kalli wuchsen kräftig, waren embryogen und regenerierten leicht zu Pflanzen. Bis jetzt regenerierte Pflanzen erschienen phänotypisch normal, waren sowohl männlich als auch weiblich fertil und übertrugen die Transgene (und ihre Expression) auf Nachkommenschaft in erwarteten Mendel'schen Verhältnissen.
Beispiel 6. RepA verändert den Zellzyklus-Phänotyp an Zellpopulationen aus transgenen Kalli.
Transformation unreifer Hi-II-Embryonen wurden unter Verwendung des in Beispiel 3 beschriebenen Protokolls durchgeführt. Unter Verwendung Partikel-vermittelter Abgabe wurde eine Mischung von Plasmid-DNA, enthaltend gleiche Mengen eines E35S::bar::pinII + UBI::GUS::pinII-Plasmids (P107) und eines GZ::RepA35S::GZ'-Plasmids (P102), in Schildchen-Zellen der unreifen Embryonen abgegeben. Als eine Kontrolle wurde E35S::bar::pinII + UBI::GUS::pinII-(P107)Plasmid alleine in die gleichen Zielzellen auf der Oberfläche des Schildchens einer gleichen Anzahl Embryonen eingeführt. Nach 6 Wochen wurden stabile Transformanten ausgezählt, und Expression eines zweiten Markergens (GUS) wurde verwendet, um die transgene Natur des Kallus zu bestätigen. bar und GUS alleine exprimierender transgener Kallus (aus der Kontrollbehandlung) oder bar, GUS- und RepA-exprimierender Kallus wurden verwendet, um Zellkerne zu isolieren. Für Extraktion von Zellkernen wurde Kallus mit einer geradkantigen Rasierklinge in einem Puffer, bestehend aus 45 mM CaCl₂, 30 mM Natriumcitrat, 20 mM MOPS-Puffer, 0,1 % V/V Triton X 100, mazeriert. Für jedes Kallus-Ereignis, bei dem Proben genommen wurden, wurde Gewebe (ungefähr 1 cm³) in eine Petrischale transferiert und mit einem kleinen Volumen des Häckselpuffers (chopping buffer) mazeriert. Die resultierende Suspension wurde sequenziell durch 60 μm- und 20 μm-Siebe geleitet und in ein 15 ml-Zentrifugenröhrchen auf Eis transferiert. Röhrchen wurden bei 100 g für 5 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert, die Pellets in ~750 μl Färbelösung resuspendiert (100 μg/ml Propidiumiodid in Häckselpuffer) und in Röhrchen für Analyse im Durchflusszytometer transferiert. Gefärbte Zellkerne wurden auf einem EPICS-XL-MCL-Durchflusszytometer unter Verwendung eines 488 nm-Argon-Lasers zur Anregung und zum Messen der Emission von 500–550 nm untersucht. Sammeln von Propidiumiodid-Fluoreszenzmessungen auf einer Pro-Zellkern-Basis (gleichwertig zum DNA-Gehalt pro Zellkern) ließ die Beurteilung von Zellzyklus-Stufen in der Kallus-Zellpopulation zu.
Das Zellzyklus-Profil aus dem Kontroll-Kallus war typisch für Mais-Kallus-Zellpopulationen, mit einem vorherrschenden G1-Peak (ungefähr 80%), einem niedrigen Prozentsatz der S-Phase (8%) und einem niedrigen Prozentsatz von G2 (ungefähr 12%). In einer RepA-behandelten Kallus-Transformante war das Zellzyklus-Profil dramatisch verschoben, mit ungefähr 7% G1, 8% S-Phase und 85% in der G2-Phase (siehe Figur III).
Beispiel 7. Vorübergehende RepA-Aktivität erhöht Transformationshäufigkeit.
Für diese spezifische Anwendung (Verwenden vorübergehend RepA-vermittelter Zellzyklus-Stimulation, um vorübergehende Integrationshäufigkeiten zu erhöhen) kann es wünschenswert sein, die Wahrscheinlichkeit ektopisch stabiler Expression des RepA-Gens zu verringern. Strategien für nur-vorübergehende (transient-only) Expression können verwendet werden. Dies schließt Zuführung von RNA (vom RepA-Gen transkribiert), chemisch entmodifizierte DNA-Expressionskassetten, die typischerweise nicht integrieren werden, oder RepA-Protein zusammen mit den Transgen-Kassetten, die integriert werden sollen, um Transgen-Integration durch vorübergehende Stimulation der Zellteilung zu erhöhen, ein. Unter Verwendung gut etablierter Verfahren zum Herstellen von HepA-RNA kann diese dann gereinigt und in Maiszellen eingeführt werden, wobei physikalische Verfahren, wie Mikroinjektion, Bombardierung, Elektroporation oder Silicafaser-Verfahren verwendet werden können. Für Proteinzuführung wird das Gen zuerst in einen bakteriellen oder baculoviralen System exprimiert, das Protein wird gereinigt und dann unter Verwendung physikalischer Verfahren, wie Mikroinjektion, Bombardierung, Elektroporation oder Silicafaser-Verfahren in Maiszellen eingeführt. Alternativ werden RepA-Proteine von Agrobacterium tumefaciens in Pflanzenzellen in der Form von Fusionen mit Agrobacterium-Virulenzproteinen geliefert. Fusionen werden zwischen RepA und bakteriellen Virulentproteinen, wie VirE2, VirD2 oder VirF konstruiert, die bekannt dafür sind, direkt in Pflanzenzellen geliefert zu werden. Fusionen werden so konstruiert, dass sie beide dieser Eigenschaften bakterieller Virulenz-Proteine, die erforderlich sind, um Lieferung in Pflanzenzellen zu vermitteln, und die zum Erhöhen von Transgen-Integration erforderliche RepA-Aktivität bewahren. Dieses Verfahren stellt eine hohe Häufigkeit gleichzeitiger Mitlieferung von T-DNA und von funktionellem RepA-Protein in die gleiche Wirtszelle sicher. Die obenstehenden Verfahren stellen zahlreiche Mittel zum Verwenden des RepA-Gens oder seines darin codierten Produkts dar, um vorübergehend DNA-Replikation und Zellteilung zu stimulieren, was wiederum Transgen-Integration durch Bereitstellen einer verbesserten zellulären/molekularen Umgebung für das Auftreten dieses Ereignisses erhöht.
Beispiel 8. Ändern der RepA-Expression stimuliert Zellzyklus und Wachstum.
Expression von RepA-Genen erhöht, beruhend auf unseren Beobachtungen, Zellteilungsraten. Erhöhungen der Teilungsrate werden in einer Anzahl unterschiedlicher Weisen beurteilt, wobei sie widergespiegelt werden in kleinerer Zellgröße, rascherer Aufnahme radioaktiv markierter Nucleotide und schnelleren Wachstum (d.h., mehr Biomasse-Akkumulation). Abgabe des RepA in einer geeigneten Pflanzen-Expressionskassette wird durch zahlreiche gut etablierte Verfahren für Pflanzenzellen bewerkstelligt, einschließlich z.B. Partikel-Bombardierung, Ultraschallbehandlung, PEG-Behandlung oder Elektroporation von Protoplasten, Elektroporation von intaktem Gewebe, Silicafaser-Verfahren, Mikroinjektion oder Agrobacterium- vermittelter Transformation. Das Ergebnis der RepA-Genexpression wird das Stimulieren des G1/S-Übergangs und daher der Zellteilung sein, was die optimale zelluläre Umgebung für Integration eingeführter Gene (wie durch Beispiel 1) bereitstellt. Dies wird eine Zellkultur-Reaktion (Zellteilungen) in Genotypen auslösen, die typischerweise nicht auf konventionelle Kulturtechniken reagieren, oder Wachstum transgenen Gewebes über die normalen, in Wildtyp-(nicht-transgenen)Geweben beobachteten Raten hinaus stimulieren. Um dies zu zeigen, wird das RepA-Gen in eine Kassette mit einem konstitutiven Promotor (d.h., entweder ein starker Mais-Promotor, wie der Ubiquitin-Promotor, einschließlich des ersten Ubiquitin-Introns, oder ein schwacher konstitutiver Promotor, wie nos) kloniert. Es werden entweder Partikel-vermittelte DNA-Abgabe oder Agrobacterium-vermittelte Abgabe verwendet, um das GZ::RepA::35S:GZ-enthaltende Plasmid zusammen mit einem UBI::bar::pinII-enthaltenden Plasmid in Maiszellen einzuführen, die zum Wachstum auf geeignetem Mais-Kulturmedium fähig sind. Solche kompetenten Zellen können aus Mais-Suspensionskultur, Kalluskultur auf festem Medium, frisch isolierten unreifen Embryonen oder Meristemzellen stammen. Unreife Embryonen des Hi-II-Genotyps werden als das Ziel für die Co-Abgabe dieser zwei Plasmide verwendet, und innerhalb von 1–7 Tagen werden die Embryonen auf 3 mg/l des selektiven Wirkstoffs Bialaphos enthaltendes Kulturmedium verbracht. Embryonen, und später Kallus, werden alle 2 Wochen auf frische Selektionsplatten transferiert. Nach 6–8 Wochen werden transformierte Kalli gewonnen. In Behandlungen, bei denen sowohl das bar-Gen als auch das RepA-Gen in unreife Embryonen transformiert wurden, wird eine höhere Anzahl wachsender Kalli auf dem Selektivmedium gewonnen, und Kalluswachstum wird stimuliert (relativ zu Behandlungen mit dem bar-Gen alleine). Wenn das RepA-Gen ohne einen beliebigen zusätzlichen selektiven Marker eingeführt wird, können transgene Kalli durch ihre Fähigkeit, rascher als umgebendes Wildtyp-(nicht-transformiertes)Gewebe zu wachsen, identifiziert werden. Unter Verwendung von PCR mit Southern-Analyse kann transgener Kallus verifiziert werden. Northern-Analyse kann ebenfalls verwendet werden, um zu verifizieren, welche Kalli das bar-Gen exprimieren und welche das Mais-RepA-Gen bei Leveln über denen normaler Wildtypzellen exprimieren (basierend auf Hybridisierung von Sonden mit frisch isolierter mRNA-Population aus den Zellen).
Induzierbare Expression:
Das RepA-Gen kann auch in eine Kassette mit einem induzierbaren Promotor, wie dem Benzolsulfonamid-induzierbaren Promotor, kloniert werden. Der Expressionsvektor wird in Pflanzenzellen mit eingeführt, und die transformierten Zellen werden nach Selektion auf Bialaphos dem Safener (Induktor) ausgesetzt. Diese chemische Induktion der RepA-Expression bewirkt stimulierten G1/S-Übergang und raschere Zellteilung. Die Zellen werden auf die Anwesenheit von RepA-RNA durch Northern oder RT-PCR (unter Verwendung Transgen-sepzifischer Sonden/Oligo-Paare), auf RepA-codiertes Protein unter Verwendung RepA-spezifischer Antikörper in Westerns oder unter Verwendung von Hybridisierung gescreent.
Erhöhte DNA-Replikation wird detektiert unter Verwendung von BrdU-Markierung, gefolgt von Antikörper-Detektion von Zellen, die dieses Thymidin-Analogon eingebaut haben. Desgleichen könnten andere Zellzyklus-Teilungs-Assays, wie oben beschrieben, eingesetzt werden.
Beispiel 9: Steuerung der RepA-Genexpression unter Verwendung Gewebe-spezifischer oder Zell-spezifischer Promotoren stellt einen differentiellen Wachstumsvorteil bereit.
RepA-Genexpression unter Verwendung Gewebe-spezifischer oder Zell-spezifischer Promotoren stimuliert Zellzyklus-Fortschritt in den exprimierenden Geweben oder Zellen. Z.B. wird die Verwendung eines Samen-spezifischen Promotors die Zellteilungsrate stimulieren und erhöhte Samen-Biomasse ergeben. Alternativ wird Steuern der RepA-Expression mit einem Fahnen-spezifischen Promotor die Entwicklung dieser gesamten Fortpflanzungsstruktur verstärken.
Expression von RepA-Genen in anderen Zelltypen und/oder an unterschiedlichen Stufen der Entwicklung wird Zellteilungsraten gleichermaßen stimulieren. Gleich den in Arabidopsis beobachteten Ergebnissen (Doerner et al., 1996) wird Wurzel-spezifische oder Wurzel-bevorzugte Expression von RepA größere Wurzeln und schnelleres Wachstum (d.h., mehr Biomasse-Akkumulation) ergeben.
Beispiel 10. Meristem-Transformation
Meristem-Transformationsprotokolle beruhen auf der Transformation apikaler Initialen oder Zellen, die anschließend an Reorganisation aufgrund von Verletzung oder selektivem Druck apikale Initialen werden können. Die Vorfahren dieser apikalen Initialen differenzieren sich, um die Gewebe und Organe der reifen Pflanzen zu bilden (d.h., Blätter, Stämme, Ähren, Fahnen, etc.). Die Meristeme der meisten Bedecktsamer (Angiospermen) sind geschichtet, wobei jede Schicht ihren eigenen Satz von Initialen hat. Normalerweise mischen sich diese Schichten im Apex des Schösslings selten. In Mais differenziert sich die äußere Schicht des apikalen Meristems, das L1, um die Epidermis zu bilden, wohingegen Nachfahren von Zellen in der inneren Schicht, der L2, zu inneren Pflanzenteilen, einschließlich den Gameten, führen. Die Initialen jeder dieser Schichten sind nur durch Position definiert und können durch benachbarte Zellen ersetzt werden, wenn sie getötet oder beeinträchtigt werden. Meristem-Transformation zielt häufig auf eine Untermenge der Population apikaler Initialen, und die resultierenden Pflanzen sind chimär. Falls z.B. 1 von 4 Initialen in der L1-Schicht des Meristems transformiert wurde, wäre nur 1/4 der Epidermis transformiert. Selektiver Druck kann verwendet werden, um Sektoren zu vergrößern, aber diese Selektion muss nicht-letal sein, da große Gruppen von Zellen für Meristem-Funktion und Überleben erforderlich sind. Transformation eines apikalen Initials mit einer RepA-Expressionskassette unter der Expression eines im apikalen Meristem aktiven Promotors (entweder Meristem-spezifisch oder konstitutiv) würde es den transformierten Zellen erlauben, schneller zu wachsen und Wildtyp-Initiale zu verdrängen, was das Meristem Richtung Homogenität steuert und die chimäre Natur des Pflanzenkörpers minimiert. Um dies zu zeigen, wird das RepA-Gen in eine Kassette mit einem Promotor, der innerhalb des Me ristems aktiv ist (d.h., ein in meristematischen Zellen aktiver Promotor, wie der Mais-Histon-, cdc2- oder Actin-Promotor), kloniert. Embryonen der Coleoptil-Stufe werden isoliert und mit dem Meristem nach oben auf einem hoch-Saccharose-haltigen Reifungsmedium (siehe Lowe et al., 1997) plattiert. Die RepA-Expressionkassette zusammen mit einem Reporter-Konstrukt, wie Ubi:GUS:pinII, kann dann (vorzugsweise 24 Stunden nach Isolation) unter Verwendung konventioneller Partikelkanonen-Transformationsprotokolle in die exponierte apikale Kuppel mit-geliefert werden. Als eine Kontrolle kann das RepA-Konstrukt mit einer gleichwertigen Menge pUC-Plasmid-DNA ersetzt werden. Nach einer Woche bis 10 Tagen der Kultur auf Reifungsmedium können die Embryonen auf ein wenig Saccharose-haltiges Hormon-freies Keimungsmedium transferiert werden. Blätter der sich entwickelnden Pflanzen können für GUS-Färbung geopfert werden. Durch Stimulation des G1→S-Übergangs wird vorübergehende Expression des RepA-Gens in Meristemzellen größere Integrationshäufigkeiten, und deshalb zahlreichere transgene Sektoren ergeben. Integration und Expression des RepA-Gens wird exprimierenden Zellen einen kompetitiven Vorteil verleihen, wobei eine progressive Vergrößerung der transgenen Sektoren bewirkt wird. Aufgrund der verstärkten Wachstumsrate in RepA-exprimierenden Meristemzellen werden sie Wildtyp-Meristemzellen ersetzen, wenn die Pflanze weiterwächst. Das Ergebnis wird sowohl Vergrößerung transgener Sektoren innerhalb einer gegebenen Zellschicht (d.h., periklinale Expansion), als auch in benachbarte Zellschichten hinein (d.h., antiklinale Invasionen) sein. Wenn ein zunehmender großer Anteil des Meristems von RepA-exprimierenden Zellen besetzt ist, geht die Häufigkeit der RepA-Keimbahn-Vererbung entsprechend nach oben.
Beispiel 11. Verwendung des Flp/Frt-Systems, um die RepA-Kassette auszuschneiden.
In Fällen, in denen das RepA-Gen integriert wurde und RepA-Expression in der Gewinnung transgener Maispflanzen nützlich ist, aber schlussendlich im Endprodukt nicht erwünscht ist, kann die RepA-Expressionkassette (oder ein beliebiger Anteil davon, der von geeigneten Frt-Rekombinationssequenzen flankiert ist) unter Verwendung von Flp-vermittelter Rekombination ausgeschnitten werden (siehe gleichzeitig anhängige US-Patentanmeldung US 98/24640).

Claims

Verfahren zum Erhöhen von Pflanzentransformationshäufigkeiten, umfassend das Einführen eines isolierten Pflanzen-Geminivirus-Replikase-Polynucleotids in Kombination mit einem interessierenden Polynucleotid in eine Zielpflanzenzelle, wobei jedes Polynucleotid funktionell verknüpft ist mit einem Promotor, der Expression in der Wirtspflanzenzelle steuert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Polynucleotid für Weizenverzwergungsvirus-Replikase codiert.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Polynucleotid für RepA codiert.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Pflanzenzelle von einer monokotylen oder dikotylen Pflanze ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Pflanzenzelle von Mais, Sojabohne, Sonnenblume, Sorghum, Canola bzw. Rapssorten, Weizen, Alfalfa, Baumwolle, Reis, Gerste, Kartoffel, Tomate oder Hirse ist.
Verfahren zum Erhöhen des Ernteertrags, umfassend das Einführen eines isolierten Pflanzen-Geminivirus-Replikase-Polynucleotids, funktionell verknüpft mit einem Promotor, der Expression in der Pflanzenzelle steuert, in eine Pflanzenzelle.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Polynucleotid wie in Anspruch 2 oder 3 definiert ist.
Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei die Pflanzenzelle wie in Anspruch 4 oder 5 definiert ist.
Verfahren nach Anspruch 6, 7 oder 8, wobei der Promotor induzierbar ist, oder auf eine gewebespezifische Art und Weise reguliert ist, oder entwicklungsreguliert oder zeitlich reguliert ist.
Verfahren zum Bereitstellen eines positiven Wachstumsvorteils in einer Zielpflanzenzelle, umfassend Einführen eines isolierten Pflanzen-Geminivirus-Replikase-Polynucleotids, funktionell verknüpft mit einem Promotor, der Expression in der Zielpflanzenzelle steuert, in die Zielpflanzenzelle.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Polynucleotid wie in Anspruch 2 oder 3 definiert ist.
Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei die Zielpflanzenzelle wie in Anspruch 4 oder 5 definiert ist.
Verfahren nach Anspruch 10, 11 oder 12, wobei der Promotor wie in Anspruch 9 definiert ist.
Verfahren zum Modulieren von Zellteilung einer Zielpflanzenzelle, umfassend Einführen eines isolierten Pflanzen-Geminivirus-Replikase-Polynucleotids in Sinn-Orientierung („sense orientation") funktionell verknüpft mit einem Promotor, der Expression in der Pflanzenzelle steuert, in die Zielpflanzenzelle.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Polynucleotid wie in Anspruch 2 oder 3 definiert ist.
Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, wobei die Zielpflanzenzelle wie in Anspruch 4 oder 5 definiert ist.
Verfahren zum vorübergehenden Modulieren der Zellteilung von Zielpflanzenzellen, umfassend Einführen eines isolierten Pflanzen-Geminivirus-Replikase-Polynucleotids in Sinn-Orientierung („sense orientation") funktionell verknüpft mit einem Promotor, der Expression in den Zielpflanzenzellen steuert, in die Zielpflanzenzellen.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Polynucleotid eine isolierte Pflanzen-Geminivirus-Replikase-DNA oder eine isolierte Pflanzen-Geminivirus-Replikase-RNA ist.
Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, wobei das Polynucleotid wie in Anspruch 2 oder 3 definiert ist.
Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, wobei die Zielzelle wie in Anspruch 4 oder 5 definiert ist.
Verfahren zum Bereitstellen eines Mittels positiver Selektion, umfassend: (a) Einführen eines isolierten Pflanzen-Geminivirus-Replikase-Polynucleotids, funktionell verknüpft mit einem Promotor, der Expression in der Zielpflanzenzelle steuert, in eine Zielpflanzenzelle; und (b) Selektieren bzw. Auswählen nach Zellen, die positiven Wachstumsvorteil aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei das Polynucleotid wie in Anspruch 2 oder 3 definiert ist.
Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, wobei die Zielzelle wie in Anspruch 4 oder 5 definiert ist.
Verwendung eines Pflanzen-Geminivirus-Replikase-Polynucleotids, um Pflanzentransformationshäufigkeiten zu erhöhen.
Verwendung eines Pflanzen-Geminivirus-Replikase-Polynucleotids, um den Ernteertrag von Pflanzen zu erhöhen.
Verwendung eines Pflanzen-Geminivirus-Replikase-Polynucleotids, um einen positiven Wachstumsvorteil in einer Zielpflanzenzelle bereitzustellen.
Verwendung eines Pflanzen-Geminivirus-Replikase-Polynucleotids in Sinn-Orientierung („sense orientation"), um Zellteilung einer Zielpflanzenzelle zu modulieren.
Verwendung eines Pflanzen-Geminivirus-Replikase-Polynucleotids in Sinn-Orientierung („sense orientation"), um Zellteilung von Zielpflanzenzellen vorübergehend zu modulieren.
Verwendung eines Pflanzen-Geminivirus-Replikase-Polynucleotids, um ein Mittel der positiven Selektion von Zielpflanzenzellen bereitzustellen, die einen positiven Wachstumsvorteil, folgend auf das Einführen des Polynucleotids oder Polypeptids in die Zellen, aufweisen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 24 bis 29, wobei das Polynucleotid für Weizenverzwergungsvirus-Replikase codiert.
Verwendung nach einem der Ansprüche 24 bis 30, wobei das Polynucleotid für RepA codiert.
Verwendung nach einem der Ansprüche 24 bis 31, wobei die Pflanze eine monokotyle oder eine dikotyle Pflanze ist, oder wobei die Pflanzenzelle von einer monokotylen oder einer dikotylen Pflanze ist.
Verwendung nach Anspruch 32, wobei die Pflanze Mais, Sojabohne, Sonnenblume, Sorghum, Canola bzw. Rapssorten, Weizen, Alfalfa, Baumwolle, Reis, Gerste, Kartoffel, Tomate oder Hirse ist, oder die Pflanzenzelle von Mais, Sojabohne, Sonnenblume, Sorghum, Canola bzw. Rapssorten, Weizen, Alfalfa, Baumwolle, Reis, Gerste, Kartoffel, Tomate oder Hirse ist.
Transgene Nutzpflanze mit erhöhter Ausbeute aufgrund des Einführens eines Pflanzen-Geminivirus-Replikase-Polynucleotids, funktionell verknüpft mit einem Promotor, der Expression in den Zellen der Pflanze steuert.
Transgene Pflanzenzelle, die aufgrund des Einführens eines Pflanzen-Geminivirus-Replikase-Polynucleotids, funktionell verknüpft mit einem Promotor, der Expression in der Zelle steuert, in die Pflanzenzelle einen positiven Wachstumsvorteil aufweist.
Transgene Pflanzenzelle, deren Teilung aufgrund des Einführens eines Pflanzen-Geminivirus-Replikase-Polynucleotids in Sinn-Orientierung („sense orientation") funktionell verknüpft mit einem Promotor eines Pflanzen-Geminivirus-Replikase-Polypeptids, der Expression in der Pflanzenzelle steuert, moduliert ist.
Transgene Pflanze oder Pflanzenzelle nach Anspruch 34, 35 oder 36, wobei das Polynucleotid für Weizenverzwergungsvirus-Replikase codiert.
Transgene Pflanze oder Pflanzenzelle nach Anspruch 34, 35 oder 36, wobei das Polynucleotid für RepA codiert.
Transgene Pflanze oder Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 34 bis 38, wobei die Pflanze eine monokotyle oder di kotyle Pflanze ist, oder die Pflanzenzelle von einer monokotylen oder einer dikotylen Pflanze ist.
Transgene Pflanze oder Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 34 bis 39, wobei die Pflanze Mais, Sojabohne, Sonnenblume, Sorghum, Canola bzw. Rapssorten, Weizen, Alfalfa, Baumwolle, Reis, Gerste, Kartoffel, Tomate oder Hirse ist, oder die Pflanzenzelle von Mais, Sojabohne, Sonnenblume, Sorghum, Canola bzw. Rapssorten, Weizen, Alfalfa, Baumwolle, Reis, Gerste, Kartoffel, Tomate oder Hirse ist.
Transgene Pflanze oder Pflanzenzelle nach Anspruch 35 oder 36, wobei der Promotor induzierbar ist, oder auf eine gewebespezifische Art und Weise reguliert ist, oder entwicklungsreguliert oder zeitlich reguliert ist.