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TECHNISCHES GEBIET
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Die
vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen die Molekularbiologie
der Pflanzen.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Die
Zellteilung spielt eine wichtige Rolle während aller Phasen der Pflanzenentwicklung.
Die Fortsetzung der Organogenese und Wachstumsantworten auf eine
sich ändernde
Umgebung erfordern eine präzise
räumliche,
zeitliche und Entwicklungs-bedingte Regulation der Zellteilungsaktivität in Meristemen
(und in Zellen mit der Fähigkeit,
neue Meristeme, wie z.B. bei der lateralen Wurzelbildung, auszubilden).
Eine derartige Kontrolle der Zellteilung ist außerdem in den Organen selbst
wichtig (d.h. getrennt von Meristemen per se), beispielsweise bei
Blattexpansion, Sekundärwachstum
und Endoreduplikation.
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Ein
komplexes Netzwerk kontrolliert die Zellproliferation in Eukaryoten.
Verschiedene regulatorische Wege teilen Beschränkungen durch die Umgebung,
wie z.B. Nährstoffverfügbarkeit,
mitogene Signale, wie z.B. Wachstumsfaktoren oder Hormone, oder
Entwicklungssignale, wie z.B. den Übergang von vegetativ zu reproduzierend,
mit. Letztlich kontrollieren diese regulatorischen Wege das Timing,
die Häufigkeit
(Rate), die Ebene und Position der Zellteilungen.
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Pflanzen
haben einzigartige Entwicklungseigenschaften, die sie von anderen
Eukaryoten unterscheiden. Pflanzenzellen migrieren nicht und folglich bestimmen
nur Zellteilung, Expansion und programmierter Zelltod die Morphogenese.
Organe werden durch die gesamte Lebensspanne der Pflanzen hindurch
aus spezialisierten Regionen gebildet, die man Meristeme nennt.
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Ferner
haben viele differenzierte Zellen das Potential, sowohl zu entdifferenzieren
als auch wieder in den Zellzyklus einzutreten. Außerdem gibt
es zahlreiche Beispiele von Pflanzenzelltypen, die Endoreduplikation
durchmachen, einen Prozess, der Kernmultiplikation ohne Cytokinese
beinhaltet. Das Studium von Kontrollgenen des Pflanzenzellzyklus soll
zum Verständnis
dieser einzigartigen Phänomene
beitragen. O. Shaul et al., Regulation of Cell Division in Arabidopsis,
Critical Reviews in Plant Sciences, 15(2): 97–112 (1996).
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Trotz
weltweiter Zunahmen beim Ertrag und der Erntefläche wird vorhergesagt, dass über die nächsten zehn
Jahre eine zusätzliche
20%ige Zunahme gegenüber
gegenwärtiger
Produktion erforderlich sein wird, um die Nachfrage nach Mais zu
erfüllen
(Dowswell, C.R., Paliwal, R.L., Cantrell, R.P., 1996, Maize in the
Third World, Westview Press, Boulder, CO).
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Die
am häufigsten
mit Maisproduktivität
assoziierten Komponenten sind Kornertrag oder Gesamtpflanzenernte
für Tierfutter
(in den Formen von Silage, Grobfutter oder Futterstroh). Folglich
könnte das
relative Wachstum der vegetativen oder reproduktiven Organe, abhängig von
der ultimativen Verwendung der Ernte, bevorzugt sein. Ob die Gesamtpflanze
oder die Ähren
geerntet werden, der Gesamtertrag wird stark von Vigor und Wachstumsrate
abhängen.
Deshalb wäre
es wertvoll, neue Verfahren zu entwickeln, die zum Erhöhen des
Ernteertrags beitragen.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren zur Erhöhung des
Ernteertrags bereitzustellen.
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Folglich
stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung des
Ernteertrags durch verstärkte
Endoreduplikation, umfassend Einführen eines viralen Replikase-Polynucleotids, das
funktionell an einen Promotor gebunden ist, der eine Expression in
der Pflanzenzelle steuert, in eine Pflanzenzelle unter Erhalt einer
transformierten Pflanzenzelle, und Wachsen der transformierten Pflanzenzelle
unter Bedingungen, die ausreichen, um eine regenerierte Pflanze
zu erzeugen, die Zellen hat, welche eine verstärkte Endoreduplikation aufweisen,
bereit.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Endoreduplikation
ist ein Prozess, der eine oder mehrere Runde(n) von Kern-DNA-Replikation in Abwesenheit
chromosomaler und cellulärer
Teilung einschließt
und zur Polyploidie führt.
Bis jetzt deuteten Hinweise darauf hin, dass die Regulation dieses Prozesses
in Pflanzen und Tieren ähnlich
ist; und dass ein gewisser Faktor (bis jetzt nicht identifiziert) die
Kinaseaktivität
des methodischen CDK/Cyclin-Komplexes inhibiert, während die
Zellzykluskomponenten, die den G1/S-Phase-Übergang und DNA-Replikation
fördern,
zur Funktion beitragen (Grafi, G. und B.A. Larkins, 1995, Endoreduplication in
maize endosperm: Involvement of M phase-promoting factor inhibition
and induction of S phase-related kinases, Science 269:1262-1264).
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Endoreduplikation
ist unter Eukaryoten weit verbreitet, wobei sie an zahlreichen biologischen Prozessen,
wie z.B. Zelldifferenzierung, Zellexpansion und Metabolitakkumulation
beteiligt ist (siehe Trass et al., 1998, Endoreduplication and development:
rule without dividing, Current Opinion in Plant Biol. 1:498–503). Im
Allgemeinen glaubt man, dass Endoreduplikation einen Mechanismus
bereitstellt, um Zellvergrößerung und
Zunahmen bei der Organmasse unterzubringen und hohe metabolische
Aktivität,
assoziiert mit Speichergeweben, aufrecht zu erhalten. Folglich wäre es wünschenswert,
diesen Prozess durch transgene Manipulation zu modulieren. Beispielsweise
würde eine
Verstärkung
der Endoreduplikation im Samen in vergrößerter Samengröße und Biomasseakkumulation
resultieren. Gleichermaßen
könnte
die Stimulierung von Endoreduplikation in vegetativen Teilen der
Pflanze in größeren Organen
und vergrößerter Biomasse
resultieren.
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DEFINITIONEN
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Der
Ausdruck „isoliert" bezieht sich auf
Material, wie z.B. eine Nukleinsäure
oder ein Protein, die/das: (1) im Wesentlichen oder prinzipiell
frei von Komponenten ist, die das Material, wie gefunden in seiner
natürlich
vorkommenden Umgebung, begleiten oder damit wechsel wirken, ist oder
(2) falls das Material sich in seiner natürlichen Umgebung befindet,
das Material durch vorsätzliche
menschliche Intervention zu einer Zusammensetzung verändert worden
ist, und/oder in der Zelle an einen Ort platziert ist, der sich
von dem für
das Material nativen Ort unterscheidet.
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Wie
hierin verwendet, bezieht sich „virales Replikase-Polypeptid" auf Polypeptide,
die Retinoblastom(Rb)-Bindungsfunktion aufweisen. Die Polypeptide
schließen
funktionelle Varianten oder Derivate viraler Proteine und/oder funktionelle
Homologe ein. Die Polypeptide schließen Proteine, codiert von Genen
im viralen Genom, ein, die im Allgemeinen als „Replikationsproteine", „Replikations-assoziierte
Proteine" oder „Replikationsinitiierungsproteine" bezeichnet werden.
Das virale Replikase-Polypeptid schließt Proteine von Viren ein,
bei denen all die „Replikations-assoziierten" oder „Replikations"-Funktionen als ein
einzelnes Protein codiert sind, und jenen, bei denen diese Funktionen
von mehr als einem Protein durchgeführt werden, unabhängig davon,
ob ordnungsgemäßes oder „unangebrachtes" Spleißen vor der
Translation stattgefunden hat (was folglich sowohl „Rep"- als auch „RepA"-Formen einschließt).
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Wie
hierin verwendet, bezieht sich „virales Replikase-Polypeptid" auf Polynucleotide,
die für
ein virales Replikase-Polypeptid, einschließlich funktioneller Varianten
oder funktioneller Derivate viraler Replikasen oder funktioneller
Homologe charakterisierter viraler Replikase-Polynucleotide codieren.
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Wie
hierin verwendet sind „funktionelle
Variante" oder „funktionelles
Derivat" in der
gleichen Bedeutung verwendet. Wie auf Polypeptide angewendet, ist
die funktionelle Variante oder das funktionelle Derivat ein Fragment,
ein modifiziertes Polypeptid oder ein synthetisches Polypeptid,
das DNA-Replikation auf eine den Wildtyp-Genprodukten, Rep und Rep-A ähnliche
Weise stimuliert.
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Wie
hierin verwendet, werden „Polypeptid" und „Protein" austauschbar verwendet
und bedeuten Proteine, Proteinfragment, modifizierte Proteine, Aminosäuresequenzen
und synthetische Aminosäuresequenzen.
Das Polypeptid kann glykosiliert sein oder nicht.
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Wie
hierin verwendet, schließt „Pflanze" Pflanzenzellen,
Pflanzengewebe und Pflanzensamen ein, ist aber nicht darauf limitiert.
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Die
vorliegende Erfindung stellt neue Verfahren zum Verwenden viraler
Replikase-Polypeptide und
-Polynucleotide in Verfahren zur Erhöhung des Ernteertrags durch
Modulieren von Endoreduplikation bereit.
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Virale
Replikase-Polynucleotide, funktionelle Varianten und/oder funktionelle
Homologe von einem beliebigen Virus können in den erfindungsgemäßen Verfahren
verwendet werden, solange die exprimierten Polypeptide Rb-Bindungsfunktion
aufweisen und/oder DNA-Replikation
stimulieren.
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Beispiele
geeigneter Pflanzenviren schließen
Weizenverzwergungsvirus, Maisstrichelvirus, Tabakgelbverzwergungsvirus,
Tomatengoldmosaikvirus, Abutilonmosaikvirus, Manniokmosaikvirus,
Rübenteufelschopfvirus,
Bohnenverzwergungsmosaikvirus, Bohnengold mosaikvirus, streifiges
Chlorismosaikvirus, Digitariastrichelvirus, Miscanthusstrichelvirus,
Maisstrichelvirus, Panicumstrichelvirus, Kartoffelgelbmosaikvirus,
Kürbisblattkräuselvirus,
Zuckerrohrstrichelvirus, Tomatengoldmosaikvirus, Tomatenblattkräuselvirus,
Tomatenscheckungsvirus, Tabakgelbverzwergungsvirus, Virus der gelben
Kräuselblättrigkeit
der Tomate, afrikanisches Manniokmosaikvirus und das Bohnengelbverzwergungsvirus
ein.
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Andere
Viren, die Rb binden, schließen
tierische DNA-Tumorviren, wie z.B. SV40-T-Antigen, Adenovirus Typ 5 E1A und humanes
Papillomavirus Typ 16 E7-Proteine, ein. Die Replikase aus dem Weizenverzwergungsvirus
ist sequenziert und funktionell charakterisiert worden und ist deshalb
bevorzugt. Die Replikase bindet an ein gut charakterisiertes Bindungsmotiv
auf dem Rb-Protein (Xie et al., The EMBO Journal, Bd. 14, Nr. 16,
Seiten 4073–4082, 1995;
Orozco et al., Journal of Biological Chemistry, Bd. 272, Nr. 15,
Seiten 9840–9846,
1997; Timmermans et al., Annual Review Plant Physiology. Plant Mol.
Biol. 45:79–112,
1994; Stanley, Genetics and Development 3:91–96, 1996; Davies et al., Geminivirus
Genomes, Kapitel 2, und Gutierrez, Plant Biology 1:492–497, 1998).
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WO98/56811
beschreibt das Einführen
eines Weizenverzwergungsvirus RepA, funktionell gebunden an den
CaMV 35S-Promotor, in eine Weizenzelle mit Inhibition des nativen
GRAB (Geminivirus RepA-Bindungs)-Proteins. Außerdem sind transgene Pflanzen
beschrieben, die mit derartigen Polynucleotiden transformiert sind.
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Qi
Xie et al. (EMBO J., Bd. 15, Nr. 18:4900–4908) haben außerdem das
Einführen
von Weizenverzwergungsvirus-Replikase(RepA)-Polynucleotid, funktionell
gebunden an den CaMV 35S-Promotor, der die Expression des Polynucleotids
in der Weizenzelle steuert, in eine Weizenzelle beschrieben.
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In
der vorliegenden Erfindung verwendbare virale Nukleinsäuren können unter
Verwendung von (a) rekombinanten Standardverfahren, (b) synthetischen
Techniken oder Kombinationen davon erhalten werden.
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In
der Erfindung verwendbare virale Replikase-Polynucleotide und funktionelle
Varianten können unter
Verwendung von Primern erhalten werden, die unter stringenten Bedingungen
selektiv hybridisieren. Primer sind im Allgemeinen wenigstens 12
Basen lang und können
bis zu 200 Basen lang sein, werden aber im Allgemeinen 15 bis 75,
vorzugsweise 15 bis 50, Basen lang sein. Funktionelle Fragmente
können unter
Verwendung einer Vielfalt von Techniken, wie z.B. Restriktionsanalyse,
Southern-Analyse, Primer-Verlängerungsanalyse
und DNA-Sequenzanalyse,
identifiziert werden.
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Varianten
der Nukleinsäuren
können
bei durch Oligonukleotid gerichtete Mutagenese, Linker-Scanning-Mutagenese,
Mutagenese unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion und dergleichen
erhalten werden. Siehe beispielsweise Ausubel, Seiten 8.0.3 – 8.5.9.
Außerdem
siehe im Allgemeinen McPherson (Hrsg.), DIRECTED MUTAGENESIS: A
Practical Approach, (IRL Press, 1991). Folglich umfasst die vorliegende
Erfindung außerdem
DNA-Moleküle, die
Nucleotidsequenzen umfassen, die substantielle Sequenzähnlichkeit
mit den erfinderischen Sequenzen aufweisen. Konservativ modifizierte
Varianten sind bevorzugt.
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Nukleinsäuren, die
durch Sequenz-Durcheinandermischen („sequence shuffling") viraler Replikase-Polynucleotide
hergestellt sind, können
außerdem
verwendet werden. Sequenz-Durcheinandermischen
ist in WO97/20078 beschrieben. Siehe außerdem Zhang, J.-H., et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504–4509 (1997).
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Außerdem sind
5'- und/oder 3'-UTR-Regionen zur
Modulation der Translation heterologer codierender Sequenzen verwendbar.
Positive Sequenzmotive schließen
translationale Initiierungs-Konsensussequenzen (Kozak, Nucleic Acids Res.
15:8125 (1987)) und die 7-Methylguanosin-Cap-Struktur
(Drummond et al., Nucleic Acids Res. 13:7375 (1985)) ein. Negative
Elemente schließen
stabile intramolekulare 5'-UTR-Stem-Loop-Strukturen
(Muesing et al, Cell 48:691 (1987)) und AUG-Sequenzen oder kurze
offene Leserahmen, denen ein geeignetes AUG in der 5'-UTR vorangeht, ein
(Kozak a.a.O., Rao et al., Mol. and Cell. Biol. 8:284 (1988)).
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Ferner
können
die Polypeptid-codierenden Segmente der Polynucleotide modifiziert
werden, um die Codonverwendung („codon usage") zu verändern. Die
Codonverwendung in den codierenden Regionen der Polynucleotide der
vorliegenden Erfindung können
unter Verwendung kommerziell verfügbarer Software-Pakete, wie
z.B. „Codon
Preference", erhältlich von
der University of Wisconsin Genetics Computer Group (siehe Devereaux
et al., Nucleic Acids Res. 12: 387–395 (1984)) oder MacVector
4.1 (Eastman Kodak Co., New Haven, Conn.) statistisch analysiert
werden.
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Beispielsweise
können
die Polynucleotide für
verstärkte
oder supprimierte Expression in Pflanzen optimiert werden. Siehe
beispielsweise EPA0359472; WO91/16432; Perlak et al. (1991) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 88:3324–3328;
und Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477–498. Auf diese
Weise können
die Gene unter Verwendung Arten-bevorzugter Codons synthetisiert
werden. Siehe beispielsweise Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res.
17:477–498.
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Die
Nukleinsäuren
können
in geeigneter Weise eine Multi-Clonierungsstelle umfassen, die eine
oder mehrere Endonukleasenrestriktionsstelle(n) umfasst, die in
die Nukleinsäure
eingefügt ist/sind,
um bei der Isolierung des Polynucleotids zu helfen. Außerdem können translatierbare
Sequenzen eingefügt
werden, um bei der Isolierung des translatierten Polynucleotids
der vorliegenden Erfindung zu helfen. Beispielsweise stellt eine
Hexahistidin-Markersequenz ein geeignetes Mittel bereit, um die
Proteine der vorliegenden Erfindung zu reinigen.
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Die
Polynucleotide können
an einen Vektor, Adapter, Promotor, ein Transitpeptid oder einen
Linker zur Clonierung und/oder Expression eines Polynucleotids der
vorliegenden Erfindung befestigt werden. Zusätzliche Sequenzen können an
derartige Clonierungs- und/oder Expressionssequenzen angefügt werden,
um ihre Funktion bei der Clonierung und/oder Expression zu optimieren,
um bei der Isolierung des Polynucleotids zu helfen oder um das Einführen des
Polynucleotids in eine Zelle zu verbessern. Die Verwendung von Clonierungsvektoren,
Expressionsvektoren, Adaptoren und Linkern ist im Fachgebiet gut
bekannt und ausführlich
be schrieben. Für
eine Beschreibung derartiger Nukleinsäuren siehe beispielsweise Stratagene
Cloning Sytems, Kataloge 1995, 1996, 1997 (La Jolla, CA); und Amersham Life
Sciences, Inc., Katalog '97
(Arlington Heights, IL).
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Um
genomische Bibliotheken zu erstellen, werden große Segmente genomischer DNA
durch Zufallsfragmentierung erzeugt. Beispiele geeigneter molekularbiologischer
Techniken und Instruktionen werden in Sambrook et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory,
Bd. 1–3,
(1989), Methods in Enzymology, Bd. 152: Guide to Molecular Cloning
Techniques, Berger und Kimmel, Hrsg., San Diego; Academic Press,
Inc. (1987), Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et
al., Hrsg., Greene Publishing und Wiley-Interscience, New York (1995);
Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Clark, Hrsg., Springer-Verlag,
Berlin (1997) gefunden. Kits zum Erstellen von genomischen Bibliotheken
sind auch kommerziell erhältlich.
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Die
genomische Bibliothek kann unter Verwendung einer Sonde, basierend
auf der Sequenz einer in der vorliegenden Erfindung verwendeten
Nukleinsäure,
durchgemustert werden. Der Fachmann wird verstehen, dass verschiedene
Grade an Hybridisierungsstringenz in dem Assay eingesetzt werden können; und
entweder das Hybridisierungs- oder das Waschmedium kann stringent
sein. Der Grad an Stringenz kann durch Temperatur, Ionenstärke, pH und
die Anwesenheit eines partiell denaturierenden Solvens, z.B. Formamid,
kontrolliert werden.
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Typischerweise
werden stringente Hybridisierungsbedingungen jene sein, bei denen
die Salzkonzentration weniger als etwa 1,5 M Na-Ion, typischerweise
etwa 0,01 bis 1,0 M Na-Ionenkonzentration
(oder andere Salze) bei pH 7,0 bis 8,3 ist, und die Temperatur wenigstens
etwa 30°C
für kurze
Sonden (z.B. 10 bis 50 Nucleotide) und wenigstens etwa 60°C für lange
Sonden (z.B. größer als
50 Nucleotide) ist. Stringente Bedingungen können außerdem durch die Zugabe von
destabilisierenden Mitteln, wie z.B. Formamid, erreicht werden.
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Vorzugsweise
wird die Hybridisierung unter Niedrigstringenzbedingungen durchgeführt, welche Hybridisierung
mit einer Pufferlösung
von 30% Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS (Natriumdodecylsulfat) bei 37°C und ein
Waschen in 1X bis 2X SSC (20X SSC = 3,0 M NaCl/0,3 M Trinatriumcitrat)
bei 50°C einschließen. Stärker bevorzugt
wird die Hybrdisierung unter moderaten Stringenzbedingungen durchgeführt, welche
Hybridisierung in 40% Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS bei 37°C und ein
Waschen in 0,5X bis 1X SSC bei 55°C
einschließen.
Am stärksten
bevorzugt wird die Hybridisierung unter Hochstringenzbedingungen
durchgeführt,
welche Hybridisierung in 50% Formamid, 1 M NaCl, 1 % SDS bei 37°C und ein Waschen
in 0,1X SSC bei 60°C
einschließen.
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Einen
ausführlichen
Leitfaden zur Hybridisierung von Nukleinsäuren findet man in Tijssen,
Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization
with Nucleic Acid Probes, Teil I, Kapitel 2 „Overview of principles of
hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New York
(1993); und Current Protocols in Molecular Biology, Kapitel 2, Ausubel,
et al., Hrsg., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995).
Oft werden cDNA-Bibliotheken normalisiert werden, um die Repräsentanz
relativ seltener cDNAs zu erhöhen.
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Die
Nukleinsäuren
können
aus Nukleinsäureproben
unter Verwendung von Amplifikationstechniken amplifiziert werden.
Beispielsweise kann die Polymerase-Ketten-Reaktion(PCR)-Technologie verwendet
werden, um die Sequenzen von Polynucleotiden der vorliegenden Erfindung
und in Beziehung dazu stehenden Genen direkt aus genomischer DNA oder
aus Bibliotheken zu amplifizieren. PCR und andere in vitro-Amplifikationsverfahren
können
außerdem
nützlich
sein, um beispielsweise Nukleinsäuresequenzen
zu klonieren, die für
zu exprimierende Proteine codieren, um Nukleinsäuren zur Verwendung als Sonden
zum Nachweisen der Anwesenheit der erwünschten mRNA in Proben herzustellen,
zum Nukleinsäuresequenzieren
oder für
andere Zwecke nützlich
sein.
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Beispiele
von Techniken, die für
in vitro-Amplifikationsverfahren nützlich sind, findet man bei Berger,
Sambrook und Ausubel, sowie Mullis et al., U.S. Patent Nr. 4,683,202
(1987); und PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Innis
et al., Hrsg., Academic Press Inc., San Diego, CA (1990). Kommerziell
verfügbare
Kits zur genomischen PCR-Amplifikation
sind im Fachgebiet bekannt. Siehe z.B. Advantage-GC Genomic PCR
Kit (Clontech). Das T4-Gen 32-Protein (Boehringer Mannheim) kann verwendet
werden, um die Ausbeute langer PCR-Produkte zu verbessern.
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Auf
PCR basierende Durchmusterungsverfahren sind auch beschrieben worden.
Wilfinger et al. beschreiben ein auf PCR basierendes Verfahren,
bei dem die längste
cDNA im ersten Schritt identifiziert wird, so dass unvollständige Klone
aus der Studie ausgeschlossen werden können. BioTechniques, 22(3):481–486 (1997).
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Die
Nukleinsäuren
können
außerdem
durch direkte chemische Synthese durch Verfahren, wie z.B. das Phosphotriesterverfahren
von Narang et al., Meth. Enzymol. 68:90–99 (1979); das Phosphodiesterverfahren
von Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109–151 (1979); das Diethylphosphoamiditverfahren
von Beaucage et al., Tetra. Lett. 22:1859–1862 (1981); das Festphasenphosphoramidittriesterverfahren,
beschrieben durch Beaucage und Caruthers, Tetra. Letts. 22(20):
1859–1862 (1981),
z.B. unter Verwendung eines automatisierten Synthetisierers, z.B.
wie beschrieben in Needham-VanDevanter et al., Nucleic Acids Res., 12:6159–6168 (1984);
und das Verfahren mit festem Träger
(„solid
support method")
aus U.S. Patent Nr. 4,458,066 hergestellt werden.
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Eine
Expressionskassette zur erfindungsgemäßen Verwendung wird typischerweise
ein Polynucleotid umfassen, das funktionell an regulatorische Transkriptionsinitiierungssequenzen
gebunden ist, die die Transkription des Polynucleotids in der beabsichtigten
Wirtszelle, wie z.B. den Geweben einer transformierten Pflanze,
leiten werden.
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Die
Konstruktion von Expressionskassetten, die in Verbindung mit der
vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, ist im Licht der vorliegenden Offenbarung
dem Fachmann gut bekannt. Siehe z.B. Sambrook et al.; Molecular
Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, New York; (1989);
Gelvin, et al.; Plant Molecular Biology Manual; (1990); Plant Biotechnology:
Commercial Prospects and Problems, Hrsg. Prakash, et al.; Oxford & IBH Publishing Co.;
New Delhi, India; (1993); und Heslot, et al.; Molecular Biology
and Genetic Engineering of Y easts; CRC Press, Inc., USA; (1992);
jede in ihrer Gesamtheit hierin durch Referenz eingeschlossen.
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Beispielsweise
können
Pflanzen-Expressionskassetten (1) eine virale Replikase-Nukleinsäure unter
der transkriptionellen Kontrolle von 5'- und 3'-regulatorischen Sequenzen und (2) einen
dominanten selektierbaren Marker einschließen. Derartige Pflanzen-Expressionskassetten
können
außerdem,
falls gewünscht,
eine regulatorischer Promotorregion enthalten (z.B. eine, die induzierbare,
konstitutive Umwelt- oder Entwicklungs-regulierte oder Zell- oder
Gewebe-spezifische/selektive Expression verleiht), eine Transkriptionsinitiierungsstartstelle, eine
Ribosomenbindungsstelle, ein RNA-Prozessierungssignal, eine Transkriptionsterminationsstelle und/oder
ein Polyadenylierungssignal enthalten.
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Konstitutive,
Gewebe-bevorzugte oder induzierbare Promotoren können verwendet werden. Beispiele
konstitutiver Promotoren schließen
die Blumenkohlmosaikvirus (CaMV, „cauliflower mosaic virus")-35S-Transkriptionsinitiierungsregion,
den 1'- oder 2'-Promotor, abgeleitet
von T-DNA von Agrobacterium tumefaciens, den Ubiquitin-1-Promotor, den
Smas-Promotor, den
Zimtalkoholdehydrogenase-Promotor (U.S. Patent Nr. 5,683,439), den Nos-Promotor, den pEMU-Promotor,
den Rubisco-Promotor, den GRP1-8-Promotor und andere Transkriptionsinitiierungsregionen
aus verschiedenen Pflanzengenen, die dem Fachmann bekannt sind,
ein.
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Beispiele
induzierbarer Promotoren sind der Adh1-Promotor, der durch Hypoxie
oder Kältestress induzierbar
ist, der Hsp70-Promotor, der durch Hitzestress induzierbar ist,
und der PPDK-Promotor, der durch Licht induzierbar ist. Außerdem sind
Promotoren verwendbar, die chemisch induzierbar sind.
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Beispiele
von Promotoren unter Entwicklungskontrolle schließen Promotoren
ein, die eine Transkription vorzugsweise in bestimmten Geweben, wie
z.B. Blättern,
Wurzeln, Frucht, Samen oder Blüten,
initiieren. Ein beispielhafter Promotor ist der Anthere-spezifische
Promotor 5126 (U.S. Patent Nrn. 5,689,049 und 5,689,051). Beispiele
von Samen-bevorzugten Promotoren schließen ein, sind aber nicht limitiert
auf, 27 kD gamma-Zein-Promotor und Wachs-Promotor, Boronat, A., Martinez, M.C.,
Reina, M., Puigdomenech, P. und Palau, J; Isolation and sequencing
of 28 kD glutelin-2 gene from maize; Common elements in the 5' flanking regions
among zein and gluteliln genes; Plant Sci., 47, 95–102 (1986)
und Reina, M., Ponte, I., Guillen, P., Boronat, A. und Palau, J.,
Sequence analysis of a genomic clone encoding a Zc2 protein from
Zea mays W64 A, Nucleic Acids Res. 18(21), 6426 (1990). Siehe die
folgende Stelle, was den Wachspromotor betrifft: Kloesgen, R.B.,
Gierl, A., Schwarz-Sommer, ZS. und Saedler, H., Molecular analysis
of the waxy locus in Zea mays, Mol. Gen. Genet. 203, 237–244 (1986).
Promotoren, die im Embryo, Pericarp und Endosperm exprimieren, sind
in U.S. Anmeldungs Ser. Nrn. 60/097,233, eingereicht am 20. August
1998, und 60/098,230, eingereicht am 28. August 1998 (die WO 0011177 bzw.
WO 0012733 entsprechen) offenbart.
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Sowohl
heterologe als auch nicht-heterologe (d.h. endogene) Promotoren
können
eingesetzt werden, um die Expression der Nukleinsäuren der
vorliegenden Erfindung zu leiten.
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In
der erfindungsgemäßen Praxis
ist es im Allgemeinen wünschenswert,
eine Polyadenylierungsregion am 3'-Ende einer Polynucleotid-codierenden
Region einzuschließen.
Die Polyadenylierungsregion kann von dem natürlichen Gen, von einer Vielfalt
von anderen Pflanzengenen oder von T-DNA abgeleitet sein. Die zu
addierende Sequenz am 3'-Ende
kann beispielsweise von den Nopalin-Synthase- oder Octopin-Synthase-Genen
oder alternativ von einem anderen Pflanzengen oder weniger bevorzugt
von irgendeinem anderen eukaryotischen Gen abgeleitet sein.
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Eine
Intron-Sequenz kann an die 5'-nicht-translatierte
Region oder die codierende Sequenz der partiellen codierenden Sequenz
angefügt werden,
um die Menge der reifen Nachricht, die sich anhäuft, zu vergrößern. Siehe
beispielsweise Buchman und Berg, Mol. Cell. Biol. 8:4395–4405 (1988); Callis
et al., Genes Dev. 1:1183–1200
(1987). Die Verwendung von Mais-Intronen
Adh1-S-Intron 1, 2 und 6, dem Bronze-1-Intron sind im Fachgebiet
bekannt. Siehe in The Maize Handbook, Kapitel 116, Freeling und
Walbot, Hrsg., Springer, New York (1994).
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Der
die für
die vorliegende Erfindung verwendbaren Polynucleotidsequenzen umfassende Vektor
wird typischerweise ein Markergen umfassen, das Pflanzenzellen einen
selektierbaren Phänotyp verleiht.
Im Allgemeinen wird das selektierbare Markergen für Antibiotikum- oder Herbizid-Resistenz
codieren. Geeignete Gene schließen
jene, die für
Resistenz gegen das Antibiotikum Spectinomycin oder Streptomycin
(z.B. das Aada-Gen) codieren, das Streptomycin-Phosphotransferase(SPT)-Gen,
das für
Streptomcycin-Resistenz codiert, das Neomycin-Phosphotransferase(NPTII)-Gen, das für Kanamycin-
oder Geneticin-Resistenz codiert, und das Hygromycin-Phosphotransferase(HPT)-Gen,
das für Hygromycin-Resistenz
codiert, ein.
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Geeignete
Gene, die für
Resistenz gegen Herbizide codieren, schließen jene ein, die wirken, indem
sie die Wirkung von Aceto-Lactat-Synthase (ALS), insbesondere die
Herbizide vom Sulfonylharnstoff-Typ (z.B. das Aceto-Lactat-Synthase(ALS)-Gen,
das Mutationen enthält,
die zu derartiger Resistenz führt,
insbesondere die S4- und/oder Hra-Mutationen) inhibieren, jene,
die wirken, um die Wirkung von Glutaminsynthase zu inhibieren, wie z.B.
Phosphinotrizin oder Basta (z.B. das bar-Gen) oder andere derartige
Gene, die im Fachgebiet bekannt sind. Das bar-Gen codiert für Resistenz
gegen das Herbizid Basta und das ALS-Gen codiert für Resistenz
gegen das Herbizid Chlorsulfuron.
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Typische,
für die
Expression von Nukleinsäure
in höheren
Pflanzen verwendbare Vektoren sind im Fachgebiet gut bekannt und
schließen
Vektoren ein, die von dem Tumorinduzierenden(Ti)-Plasmid von Agrobacterium
tumefaciens, beschrieben von Rogers et al., Meth. in Enzymol., 153:253–277 (1987),
abgeleitet sind. Exemplarische A. tumefaciens-Vektoren, die hierin verwendbar sind,
sind Plasmide pKYLX6 und pKYLX7 von Schardl et al., Gene, 61:1–11 (1987)
und Berger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:8402–8406 (1989).
Ein anderer, hierin verwendbarer Vektor ist Plasmid pBI101.2, welches
von Clontech Laboratories, Inc., (Palo Alto, CA) erhältlich ist.
Eine Vielfalt von Pflanzenviren, die als Vektoren eingesetzt werden
können,
sind im Fachgebiet bekannt und schließen Blumenkohlmosaikvirus (CaMV),
Geminivirus, Trespenmosaikvirus und Tabakmosaikvirus ein.
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In
der vorliegenden Erfindung verwendbare Proteine schließen Proteine
ein, die vom nativen Protein durch Deletion (sogenannte Trunkierung),
Addition oder Substitution einer oder mehrerer Aminosäure(n) an
einer oder mehreren Stelle(n) im nativen Protein abgeleitet sind.
Beim Konstruieren von Varianten des interessierenden Proteins werden
Modifikationen so gemacht werden, dass die Varianten weiterhin die
gewünschte
Aktivität
besitzen.
-
Beispielsweise
können
Aminosäuresequenzvarianten
des Polypeptids durch Mutationen in der klonierten DNA-Sequenz,
die das native interessierende Protein codiert, erstellt werden.
Mutageneseverfahren und Nucleotidsequenzänderungen sind im Fachgebiet
gut bekannt. Siehe beispielsweise Walker und Gaastra, Hrsg. (1983)
Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York);
Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488–492; Kunkel et al. (1987)
Methods Enzymol. 154:367–382;
Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold
Spring Harbor, New York); U.S. Patent Nr. 4,873,192; und die hierin
zitierten Referenzen; hierin durch Referenz eingeschlossen. Anleitung
bezüglich
geeigneter Aminosäuresubstitutionen,
die die biologische Aktivität
des interessierenden Proteins nicht beeinflussen, kann in dem Modell
von Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure
(Natl. Biomed. Res. Found, Washington, D.C.), hierin durch Referenz
aufgenommen, gefunden werden. Konservative Substitutionen, wie z.B.
der Austausch einer Aminosäure
mit einer anderen, die ähnliche
Eigenschaften aufweist, kann bevorzugt sein.
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Die
vorliegende Erfindung beinhaltet katalytisch aktive Polypeptide
(d.h. Enzyme). Katalytisch aktive Polypeptide werden im Allgemeinen
eine spezifische Aktivität
von wenigstens 20%, 30% oder 40% und vorzugsweise wenigstens 50%,
60% oder 70% und am stärksten
bevorzugt wenigstens 80%, 90% oder 95% von der des nativen (nicht-synthetischen) endogenen
Polypeptids aufweisen. Ferner ist die Substratspezifität (kcat/Km) wahlweise
im Wesentlichen ähnlich
zu dem nativen (nicht-synthetischen) endogenen Polypeptid. Typischerweise
wird der Km wenigstens 30%, 40% oder 50%
von dem des nativen (nicht-synthetischen) endogenen Polypeptids, und
stärker
bevorzugt wenigstens 60%, 70%, 80% oder 90% sein. Verfahren zum
Analysieren und Quantifizieren von Maßgrößen für enzymatische Aktivität und Substratspezifität (kcat/Km) sind dem
Fachmann gut bekannt.
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Die
Verfahren der vorliegenden Erfindung können mit einer beliebigen Pflanzenzelle
verwendet werden. Die transformierten Pflanzenzellen produzieren
virales Replikaseprotein. Typischerweise wird eine Zwischenwirtszelle
in der Praxis dieser Erfindung verwendet werden, um die Kopienzahl
des Klonierungsvektors zu erhöhen.
Mit einer erhöhten
Kopienzahl kann der die interessierende Nukleinsäure enthaltende Vektor in signifikanten
Mengen zum Einführen
in die gewünschten
Pflanzenzellen isoliert werden. Wirtszellen, die in der Praxis dieser
Erfindung verwendet werden können,
schließen
Prokaryoten einschließlich
bakterieller Wirte, wie z.B. Escherichia coli, Salmonella typhymurium
und Serratia marcescens, ein. Eukaryotische Wirte, wie z.B. Hefe oder
Fadenpilze, können
außerdem
in dieser Erfindung verwendet werden. Es ist bevorzugt, Pflanzenpromotoren
zu verwenden, die in Bakterien die Expression des Polypeptids nicht
verursachen.
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Gewöhnlich verwendete
prokaryotische Kontrollsequenzen schließen Promotoren, wie z.B. die beta-Lactamase(Penicillinase)-
und Lactose(lac)-Promotorsysteme (Chang et al., Nature 198:1056
(1977), (das Tryptophan(trp)-Promotorsystem Goeddel et al., Nucleic
Acids Res. 8:4057 (1980)) und den von lambda stammenden P-L-Promotor
und die N-Gen-Ribosomenbindungsstelle (Shimatake
et al., Nature 292:128 (1981)), ein. Das Einschließen von
Selektionsmarkern in DNA-Vektoren, die in E. coli transfiziert werden,
ist außerdem nützlich.
Beispiele derartiger Marker schließen Gene ein, die Resistenz
gegen Ampicillin, Tetracyclin und Chloramphenicol spezifizieren.
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Der
Vektor wird ausgewählt,
um Einführen
in die geeignete Wirtszelle zu erlauben. Bakterielle Vektoren haben
typischerweise Plasmid- oder Phagen-Ursprung. Expressionssysteme
zum Exprimieren eines Proteins der vorliegenden Erfindung sind verfügbar unter
Verwendung von Bacillus sp. und Salmonella (Palva et al., Gene 22:229–235 (1983); Mosbach,
et al., Nature 302:543–545
(1983)).
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Man
erwartet, dass Exprimieren viraler Replikase-Polypeptide den Ernteertrag
erhöht.
Ferner erwartet man, dass Expression viraler Replikase-Polynucleotide
die Endoreduplikation verstärken
wird. Man erwartet, dass Endoreduplikation die Größe der Samen,
die Größe des Endosperms
und die Proteinmenge im Samen erhöhen wird. Ähnlich erwartet man, dass Endoreduplikation
die Größe einer
beliebigen Pflanzenzelle relativ zu benachbarten nicht-endoreduplizierten
Zellen erhöhen
wird.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
kann die Erfindung in einem weiten Bereich von Pflanzen, wie z.B.
Monocotylen und Dicotylen, praktiziert werden. In einer besonders
bevorzugten Ausführungsform
werden die Verfahren der vorliegenden Erfindung in Mais, Sojabohne,
Sonnenblume, Safflor, Kartoffel, Tomate, Sorghum, Canola, Weizen,
Alfalfa, Baumwolle, Reis, Gerste und Hirse eingesetzt.
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Das
Transformations/Transfektions-Verfahren ist für die Erfindung nicht kritisch;
verschiedene Transformationsverfahren oder Transfektionsverfahren
sind derzeit verfügbar.
So wie neuere Verfahren zur Transformation von Wirtszellen verfügbar sind, können diese
direkt angewendet werden. Dementsprechend ist eine große Vielfalt
von Verfahren entwickelt worden, um eine DNA-Sequenz in das Genom einer
Wirtszelle einzufügen,
um die Transkription und/oder Translation der Sequenz zu erhalten,
um in dem Organismus phänotypische Änderungen
zu bewirken. Folglich kann ein beliebiges Verfahren verwendet werden,
das für
effiziente Transformation/Transfektion sorgt.
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Eine
DNA-Sequenz, die für
das gewünschte Polynucleotid
codiert, das in der vorliegenden Erfindung verwendbar ist, beispielsweise
eine cDNA, RNA oder eine genomische Sequenz, wird verwendet werden,
um eine Expressionskassette zu konstruieren, die in die gewünschte Pflanze
eingeführt werden
kann. Isolierte Nukleinsäuren
der vorliegenden Erfindung können
in Pflanzen gemäß im Fachgebiet
bekannter Techniken eingeführt
werden. Im Allgemeinen werden Expressionskassetten wie oben beschrieben
und geeignet zur Transformation von Pflanzenzellen, erstellt.
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Verfahren
zum Transformieren verschiedener Wirtszellen sind in Klein et al., „Transformation
of microbes, plants and animals by particle bombardement", Bio/Technol., New
York, N.Y., Nature Publishing Company, März 1992, Bd. 10(3), S. 286–291, offenbart.
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Techniken
zum Transformieren einer großen Vielfalt
höherer
Pflanzenarten sind gut bekannt und in der technischen, wissenschaftlichen
und Patentliteratur beschrieben. Siehe beispielsweise Weising et al.,
Ann. Rev. Genet. 22:421–477
(1988). Zum Beispiel kann das DNA-Konstrukt unter Verwendung von Techniken,
wie z.B. Elektroporation, PEG-vermittelte Transfektion, Partikelbeschuss,
Silikonfaser-Abgabe oder Mikroinjektion von Pflanzenzellprotoblasten oder
embryogenem Callus direkt in die genomische DNA der Pflanzenzelle
eingeführt
werden. Siehe beispielsweise Tomes, et al., Direct DNA Transfer
into Intact Plant Cells Via Microprojectile Bombardement, S. 197–123, in
Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Fundamental Methods, Hrsg.
0. L. Gamborg und G.C. Philipps, Springer-Verlag Berlin Heidelberg
New York, 1995. Alternativ können
die DNA-Konstrukte mit geeigneten T-DNA-flankierenden Regionen kombiniert
und in einen konventionellen Agrobacterium tumefaciens Wirtsvektor
eingeführt
werden. Die Virulenzfunktionen des Agrobacterium tumefaciens-Wirts werden
die Insertion des Konstrukts und angrenzendem Marker in die Pflanzenzell-DNA
leiten, wenn die Zelle von den Bakterien infiziert ist. Siehe U.S.
Patent Nr. 5,591,616.
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Das
Einführen
von DNA-Konstrukten unter Verwendung von Polyethylenglykolpräzipitation
ist in Paszkowksi et al., Embo J. 3:2717–2722 (1984) beschrieben. Elektroporationstechniken
sind in Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82:5824 (1985) beschrieben.
Ballistische Transformationstechniken sind in Klein et al., Nature
327: 70–73
(1987) beschrieben.
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Agrobacterium
tumefaciens-vermittelte Transformationstechniken sind in der wissenschaftlichen
Literatur gut beschrieben. Siehe beispielsweise Horsch et al., Science
233:496–498
(1984) und Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80:4803 (1983).
Agrobacterium-Transformation von Mais ist beispielsweise in U.S.
Patent Nr. 5,550,318 beschrieben.
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Andere
Verfahren der Transformation schließen ein: (1) Agrobacterium
rhizogenesvermittelte Transformation (siehe z.B. Lichtenstein und
Fuller in: Genetic Engineering, Bd. 6, PWJ Rigby, Hrsg, London,
Academic Press, 1987; und Lichtenstein, C. P., und Draper, J. in:
DNA Cloning, Bd. II, D. M. Glover, Hrsg, Oxford, IRI Press, 1985);
WO 88/02404, veröffentlicht
am 7. April 1988, beschreibt die Verwendung des A. rhizogenes-Stamms
A4 und seines Ri-Plasmids
zusammen mit A. tumefaciens-Vektoren pACRC8 oder PADRC16 (2) Liposomen vermittelte DNA-Aufnahme
(siehe beispielsweise Freeman et al., Plant Cell Physiol. 25:1353,
1984), (3) das Vortex-Verfahren (siehe z.B. Kindle, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 87:1228, (1990).)
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DNA
kann außerdem
in Pflanzen durch direkten DNA-Transfer in Pollen eingeführt werden,
wie beschrieben durch Zhou et al., Methods in Enzymology, 101:433
(1983); D. Hess, Intern Rev. Cytol., 107:367 (1987); Luo et al.,
Plane Mol. Biol. Reporter, 6:165 (1988). Expression Polypeptid-codierender Nukleinsäuren kann
durch Injektion der DNA in reproduktive Organe einer Pflanze erhalten
werden, wie beschrieben durch Pena et al., Nature 325:274 (1987).
DNA kann außerdem
direkt in die Zellen unreifer Embryonen injiziert werden und die
Rehydrierung getrockneter Embryos, wie beschrieben durch Neuhaus
et al., Theor. Appl. Genet., 75:30 (1987); und Benbrook et al.,
in Proceedings Bio Expo 1986, Butterworth, Stoneham, Mass., S. 27–54 (1986).
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Transformierte
Pflanzenzellen, die durch irgendwelche der obigen Transformationstechniken abgeleitet
sind, können
kultiviert werden, um eine ganze Pflanze zu regenerieren, die den
transformierten Genotyp besitzt. Derartige Regenerationstechniken
beruhen oft auf Manipulation gewisser Phytohormone in einem Gewebekultur-Wachstumsmedium und
beruhen typischerweise auf einem Biozid- und/oder Herbizid-Marker,
der zusammen mit einem Polynucleotid der vorliegenden Erfindung
eingeführt worden
ist. Für
Transformation und Regeneration von Mais siehe Gordon-Kamm et al.,
The Plant Cell, 2:603–618
(1990).
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Mit
einem Pflanzen-Expressionsvektor transformierte Pflanzenzellen können beispielsweise
von Einzelzellen, Callus-Gewebe oder Blattscheiben („leaf discs") gemäß Standard-Pflanzengewebekulturtechniken
regeneriert werden. Es ist im Fachgebiet gut bekannt, dass verschiedenen
Zellengewebe und Organe von so gut wie jeder Pflanze erfolgreich kultiviert
werden können,
um eine ganze Pflanze zu regenerieren. Pflanzenregeneration von
kultivierten Protoblasten ist in Evans et al., Protoplasts Isolation and
Culture, Handbook of Plant Cell Culture, Macmillan Publishing Company,
New York, S. 124–176 (1983);
und Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, CRC Press,
Boca Raton. S. 21–73 (1985)
beschrieben.
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Transformierte
Pflanzenzellen, -calli oder -explantat können auf Regenerationsmedium
im Dunkeln mehrere Wochen lang, im Allgemeinen etwa 1 bis 3 Wochen,
kultiviert werden, um den somatischen Embryos zu erlauben, zu reifen.
Bevorzugte Regenerationsmedien schließen Medien ein, die MS-Salze
enthalten, wie z.B. PHI-E- und PHI-F-Medien. Die/das Pflanzellen,
-calli oder -explantat werden dann typischerweise auf Bewurzelungsmedium („rooting
medium") in einem
Hell/Dunkelzyklus kultiviert, bis sich Schößlinge und Wurzeln entwickeln. Verfahren
zur Pflanzenregeneration sind im Fachgebiet bekannt und bevorzugte
Verfahren sind durch Karno et al., (Bot. Gaz. 146(3):324–334, 1985),
West et al., (The Plant Cell5:1361–1369, 1993) und Duncan et
al., (Planta 165:322–332,
1985) bereitgestellt.
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Kleine
Pflänzchen
können
dann in Röhren transferiert
werden, die Bewurzelungsmedium enthalten, und ihnen kann ungefähr eine
weitere Woche lang erlaubt werden, zu wachsen und mehr Wurzeln zu
entwickeln. Die Pflanzen können
dann in eine Erdmischung in Töpfen
im Gewächshaus
umgepflanzt werden.
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Das
Regenerieren von Pflanzen, die das Fremdgen enthalten, das durch
Agrobacterium eingeführt
worden ist, kann wie von Horsch et al., Science, 227:1229–1231 (1985)
und Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:4803 (1983) beschrieben, erreicht
werden. Diese Prozedur produziert typischerweise Schößlinge innerhalb
von zwei bis vier Wochen und diese Transformanten-Schößlinge werden
dann auf ein geeignetes Wurzel-induzierendes Medium transferiert,
enthaltend den Selektivwirkstoff und ein Antibiotikum, um Bakterienwachstum
zu verhindern. Transgene Pflanzen der vorliegenden Erfindung können fruchtbar
oder steril sein.
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Regeneration
kann außerdem
von Pflanzencallus, -explantaten, -organen oder -teilen davon erhalten
werden. Derartige Regenerationstechniken sind allgemein in Klee
et al., Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467–486 (1987) beschrieben. Die
Regeneration von Pflanzen aus entweder Einzelpflanzen-Protoblasten
oder verschiedenen Explantaten ist im Fachgebiet gut bekannt. Siehe
beispielsweise Methods for Plant Molecular Biology, A. Weissbach
und H. Weissbach, Hrsg., Academic Press, Inc., San Diego, Kalifornien
(1988). Für
Maiszellkultur und -regeneration siehe allgemein The Maize Handbook,
Freeling und Walbot, Hrsg., Springer, New York (1994); Corn und Corn
Improvement, 3. Auflage, Sprague und Dudley Hrsg., American Society
of Agronomy, Madison, Wisconsin (1988).
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Ein
Fachmann wird erkennen, dass, nachdem die Expressionskassette stabil
in transgene Pflanzen eingebaut ist und bestätigt wurde, dass sie funktionsfähig ist,
kann diese durch sexuelles Kreuzen in andere Pflanzen eingeführt werden.
Eine beliebige von einer Anzahl von Standardzüchtungstechniken kann, abhängig von
der zu kreuzenden Art, verwendet werden.
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Bei
vegetativ propagierten Nutzpflanzen können reife transgene Pflanzen
durch das Nehmen von Schnittlingen oder durch Gewebekulturtechniken propagiert
werden, um viele identische Pflanzen zu erzeugen. Selektion wünschenswerter
Transgene wird durchgeführt
und neue Varietäten
werden erhalten und vegetativ zur kommerziellen Verwendung propagiert.
In durch Samen propagierten Nutz- bzw. Kulturpflanzen können reife
transgene Pflanzen selbst gekreuzt werden, um eine homozygote, durch Inzucht
erzeugte Pflanze zu erzeugen. Die durch Inzucht erzeugte Pflanze
produziert Samen, der die neu eingeführte heterologe Nukleinsäure enthält. Diese
Samen können
kultiviert werden, um Pflanzen zu erzeugen, die den ausgewählten Phänotyp produzieren
würden.
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Von
der regenerierten Pflanze erhaltene Teile, z.B. Blüten, Samen,
Blätter, Äste, Frucht
und dergleichen, sind in die Erfindung eingeschlossen, vorausgesetzt,
dass diese Teile Zellen umfassend, die die isolierte virale Replikase-Nukleinsäure umfassen. Nachkommenschaft
und Varianten und Mutanten der regenerierten Pflanzen sind ebenfalls
innerhalb des Bereichs der Erfindung eingeschlossen, vorausgesetzt,
dass diese Teile die eingeführten
Nukleinsäuresequenzen
umfassen.
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Transgene
Pflanzen, die einen selektierbaren Marker exprimieren, können nach
Transmission der viralen Replikase-Nukleinsäure, beispielsweise mit Standard-Immunoblot
und DNA-Detektionstechniken durchgemustert werden. Transgene Linien werden
außerdem
typischerweise auf Expressionslevel der heterologen Nukleinsäure ausgewertet.
Anfänglich
kann die Expression auf dem RNA-Level bestimmt werden, um Expressions-positive
Pflanzen zu identifizieren und quantifizieren. Standard-Verfahren zur
RNA-Analyse können
angewendet werden und schließen
PCR-Amplifikationsassays unter Verwendung von Oligonukleotidprimern,
die entworfen sind, um nur die heterologen RNA-Templates zu amplifizieren,
und Lösungshybridisierungsassays
unter Verwendung heterologer Nukleinsäure-spezifischer Sonden. Die
RNA-positiven Pflanzen
können
dann durch Western-Immunoblot-Analyse unter Verwendung der spezifisch
reaktiven Antikörper
der vorliegenden Erfindung analysiert werden. Ferner können in
situ-Hybridisierung und Immunocytochemie unter Verwendung heterologer
Nukleinsäurespezifischer Polynucleotidsonden
bzw. Antikörper
durchgeführt werden,
um Expressionsstellen innerhalb von transgenem Gewebe zu lokalisieren.
Im Allgemeinen werden für
gewöhnlich
eine Anzahl von transgenen Linien auf die Anwesenheit der eingebauten
Nukleinsäuren
durchgemustert, um Pflanzen mit den am meisten geeigneten Expressionsprofilen
zu identifizieren und zu selektieren.
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Eine
bevorzugte Ausführungsform
ist eine transgene Pflanze, die homozygot für die zugegebene heterologe
Nukleinsäure
ist; d.h. eine transgene Pflanze, die zwei angefügte Nukleinsäuresequenzen, ein
Gen an demselben Locus an jedem Chromosom eines Chromosomenpaars,
enthält.
Eine homozygote transgene Pflanze kann durch sexuelles Kreuzen (Selbstung)
einer heterozygoten transgenen Pflanze, die eine einzelne angefügte heterologe
Nukleinsäure enthält, Auskeimen
eines Teils des produzierten Samens und Analysieren der resultierenden
erzeugten Pflanzen auf veränderte
Zellteilung relativ zu einer Kontrollpflanze (d.h. nativ, nicht-transgen), erhalten werden.
Rückkreuzen
zu einer Elternpflanze und „Auskreuzen" („outcrossing") mit einer nicht-transgenen
Pflanze werden auch in Erwägung
gezogen.
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Pflanzen,
die in erfindungsgemäßen Verfahren
verwendet werden können,
variieren breit und schließen
monocotyledone und dicotyledone Pflanzen ein. Bevorzugte Pflanzen
schließen
Mais, Sojabohne, Sonnenblume, Sorghum, Canola, Weizen, Alfalfa,
Baumwolle, Reis, Gerste, Kartoffel, Tomate und Hirse ein.
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Samen,
die von Pflanzen stammen, die aus transformierten Pflanzenzellen,
Pflanzenteilen oder Pflanzengeweben regeneriert worden sind, oder
von den regenerierten transformierten Pflanzen stammende Nachkommenschaft
kann/können
direkt als Futter oder Nahrung verwendet werden oder es kann eine
weitere Verarbeitung vorkommen.
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Man
erwartet, dass Expression der viralen Replikase-Nukleinsäuren in
Pflanzen, wie z.B. Mais, das Wachstum und die Biomasseakkumulation
aufgrund verstärkter
Endoreduplikation steigert. Andere spezialisiertere Anwendungen
existieren für
diese Nukleinsäuren
auf dem Level der ganzen Pflanze. Es ist gezeigt worden, dass Endoreduplikation
in zahlreichen Zell typen innerhalb von Pflanzen auftritt, aber dies
ist insbesondere in Maisendosperm, dem primären Samenspeichergewebe, vorherrschend.
Unter der Direktive von Endosperm-spezifischen Promotoren wird die
Expression viraler Replikase den Prozess der Endoreduplikation weiter
stimulieren.
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Die
vorliegende Erfindung wird durch Bezugnahme auf die folgenden detaillierten
Beispiele weiter beschrieben werden.
-
BEISPIELE
-
Beispiel 1. Replikasekonstrukte
-
Das
Replikasegen wurde von Joachim Messing in dem Vektor pWI-11 erhalten
und als P100 umbenannt. Unter Verwendung von P 100 als der Quelle wurde
das Replikasestrukturgen in einen Zwischenvektor kloniert, der den
35S-Promotor und eine 35S-3'-Sequenz
(für Expressionsstudien
in dicotyledonen Arten, wie z.B. Tabak; bezeichnet als P101, hergestellt
im Larkins Lab, Univ. of Arizona) enthielt. Von diesem Zwischenplasmid
wurden das RepA-Strukturgen
und die 355-3'-Sequenz
unter Verwendung der Restriktionsenzyme NcoI und PstI ausgeschnitten,
und in P102 kloniert (gamma-Zein-Promotor:uidA::Gamma-Zein-3'-Region; nach dem
Entfernen des GUS-Strukturgens aus P102 unter Verwendung von NcoI/PstI).
Dies resultierte in einem Endkonstrukt, das eine Expressionskassette
mit einer Mais-gamma-Zein-Promotorsequenz
(GZ), der RepA-codierenden Sequenz, einem 35S-Terminator und einer
gamma-Zein-3'-Sequenz
(GZ') enthielt. Folglich
hatte die Expressionskassette die Konfiguration GZ::RepA::35S::GZ'P108.
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Ein
zweites Plasmid, P107, enthielt Gene, die Bailaphos-Resistenz (bar-Gen)
und Expression des sichtbaren Markers, uidA, verleihen, in den folgenden
Expressionskassetten; E35S::bar::pilnII + UBI::uidA::pinII.
-
Beispiel 2. RepA moduliert
Endoreduplikation in Zellpopulationen von transgenen Pflanzen.
-
Auf
die Transformation der Rep-Plasmid-DNA, P 108, in Hi-II-Keimplasma
folgte ein gut etabliertes Beschuss-Transformationsprotokoll, das zum
Einführen
von DNA in das Scutellum unreifer Maisembryos verwendet wird (Songstad
D.D. et al., In Vitro Cell Dev. Biol. Plant 32:179–183, 1996).
Es wird angemerkt, dass irgendeine geeignete Transformationsmethode,
wie z.B. Agrobacterium-vermittelte Transformation, und viele andere
Methoden verwendet werden kann/können.
Zellen wurden transformiert durch Kultivieren unreifer Maisembryos
(ungefähr
1,5–2,0
mm in Länge)
auf Medium, das N6-Salze, Erikksons-Vitamine, 0,69 g/l Prolin, 2
mg/l 2,4-D und 3% Saccharose enthielt. Nach 4 bis 5 Tagen Inkubation
im Dunkeln bei 28°C
wurden die Embryos aus dem ersten Medium entfernt und auf ähnlichem Medium,
das 12% Saccharose enthielt, kultiviert. Man erlaubte den Embryos,
sich 3 h lang vor der Transformation an dieses Medium zu akklimatisieren. Die
scutellare Oberfläche
der unreifen Embryos wurde unter Verwendung von Partikelbeschuss
mit entweder dem E35S::bar::pinII + IBU::GUS::pinII-Plasmid (P107;
Kontrollbehandlung) oder mit einer Kombination von P107 + dem Replikaseplasmid P108
targetiert. Embryos wurden unter Verwendung der PDS-1000-Heliumkanone
von Bio-Rad bei einem Schuss pro Probe unter Verwendung von 650PSI-Rupturscheiben
(„rupture
disks") transformiert.
Pro Schuss abgelieferte DNA betrug im Durchschnitt 0,0667 μg. Eine gleiche
Anzahl von Embryos pro Ähre
wurde entweder mit dem Kontroll-DNA-Gemisch oder dem Rep/GFP-DNA-Gemisch
beschossen. Auf den Beschuss folgend wurden alle Embryos auf 560L-Medium
gehalten (N6-Salze, Erikksons-Vitamine, 0,5 mg/l Thiamin, 20 g/l
Saccharose, 1 mg/l 2,4-D, 2,88 g/l Prolinl, 2,0 g/l Gelrite und
8,5 mg/l Silbernitrat). Nach 2–7
Tagen nach dem Beschuss wurden alle Embryos von beiden Behandlungen
auf N6-basiertes Medium transferiert, das 3 mg/l Bialaphos (Pioneer
560P-Medium, oben beschrieben, ohne Prolin und mit 3 mg/l Bialaphos)
enthielt. Platten wurden bei 28°C
in Dunkeln gehalten und wurden auf Kolonie-Isolierung hin beobachtet, wobei alle
zwei Wochen auf frisches Medium transferiert wurde. Nach 6 Wochen
wurden stabile Transformanten ausgezählt und die Expression eines
zweiten Markergens (GUS) wurde verwendet, um die transgene Natur
des Callus zu bestätigen.
Transgene Calli, die bar und GUS alleine exprimierten (von der Kontrollbehandlung)
oder transgene Calli, die bar, GUS und RepA exprimierten, wurden
regeneriert. Transformierte Pflanzenzellen, Calli oder Explantate
wurden auf Regenerationsmedium im Dunkeln für mehrere Wochen, im Allgemeinen
etwa 1 bis 3 Wochen, um den somatischen Embryos zu erlauben, zu
reifen, kultiviert. Bevorzugte Regenerationsmedien schließen Medien,
die MS-Salze enthalten, wie z.B. PHI-M-Medium, welches MS-Salze,
MS-Vitamine, 100 mg/l Myoinositol, 0,5 mg/l Zeatin, 1 mg/l IAA, 10-7
M ABA, 60 g/l Saccharose, 3 g/l Gelrite und 3 mg/l Bialaphos, pH
5,6, enthält,
ein. Die Pflanzenzellen, -calli oder explantate wurden dann typischerweise
auf Bewurzelungsmedium (beispielsweise PHI-E, enthaltend MS-Salze,
MS-Vitamine, 100 mg/l Myoinositol, 40 g/l Saccharose und 1,5 g/l
Gelrite, pH 5,6) in einem Licht/Dunkel-Zyklus (16 Stunden Licht,
100 μE;
8 Stunden dunkel) kultiviert, bis sich Sprosse und Wurzeln entwickelten.
Wenn Pflanzen ungefähr
10 cm lang waren, wurden sie in Boden im Gewächshaus transferiert. Wenn
Pflanzen 1 bis 1,5 Meter groß waren,
wurden Blattproben zur Isolation von Nuclei geerntet. Für die Extraktion
von Nuclei wurde Callus mit einer Rasierklinge mit gerader Kante
in einem Puffer, der aus 45 mM CgCl2, 30
mM Natriumcitrat, 20 mM MOPS-Puffer, 0,1% Vol./Vol. Triton X-100 bestand, maceriert.
Für jedes
als Probe genommene Callus-Ereignis wurde Gewebe (ungefähr 1 cm3) auf eine Petrischale transferiert und
mit einem kleinen Volumen des Spaltpuffers maceriert. Die resultierende
Suspension wurde dann nachfolgend durch 60 μm- und 20 μm-Siebe passiert und auf Eis in ein 15 ml-Zentrifugenröhrchen transferiert.
Röhrchen
wurden bei 100 g 5 Minuten lang bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand
wurde dekantiert, die Pellets in 750 μl-Färbelösung (100 μg/ml Propidiumiodid in Spaltpuffer)
resuspendiert und zur Analyse im Durchflussctyometer in Röhrchen transferiert.
Gefärbte
Kerne wurden an einem EPICS-XL-MCL-Durchflusscytometer
unter Verwendung eines 488 nm-Argonlasers zur Anregung und Messen
der Emission von 500–550
nm analysiert. Das Sammeln von Propidiumiodid- Fluoreszenzmessungen auf einer „Pro-Kern"-Basis (äquivalent
zum DNA-Gehalt pro Kern) erlaubte die Beurteilung von Zellzyklusstadien in
der Callus-Zellpopulation.
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Das
Zellzyklusprofil von Blatt-Nuclei nicht-transformierter Pflanzen
war typisch für Mais-Blattzellpopulationen,
mit einem prädominanten
G1-Peak (ungefähr
80%), einem geringen Prozentsatz von S-Phase (8%) und einem geringen
Prozentsatz von G2 (ungefähr
12%). In einer RepA-behandelten, regenerierten Pflanze war das Zellzyklusprofil
drastisch verschoben. Der Anteil von Zellen im Peak, der normalerweise
mit einer diploiden G2-Phase korrespondiert (4C-DNA-Gehalt), nahm zu und ein neuer Peak,
der Zellen mit einem ungewöhnlich
hohen DNA-Anteil
entsprach, ist leicht ersichtlich geworden (siehe Fig. I). Dieser
dritte Peak wurde sichtbar, um tetraploide Zellen in der G2-Phase
des Zellzyklus mit einem 8C-DNA-Gehalt zu repräsentieren. Folglich enthielt
der Zwischenpeak ein Gemisch von diploiden G2-Zellen und tetraploiden
G1 (beide 4C-DNA-Gehalt und deshalb überlappen diese Peaks und sind
in diesem Assay ununterscheidbar). Dieser Beweis ist mit einer Stimulierung
des endoreduplikativen Zyklus in Blattzellen konsistent, während normalerweise
ein gewisser kleiner Grad von Endoreduplikation in spezialisierten
Blattzellen auftaucht (d.h. manche epidermalen Zellen und Trichome),
ist der in diesem Experiment aufgrund von Endoreduplikation beoachtete
Level von Gesamt-Polyploidie nicht typisch und er zeigt folglich
einen Phänotyp,
bedingt durch Expression des RepA-Proteins.
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Beispiel 3: Kontrolle
von RepA-Genexpression unter Verwendung von gewebespezifischen oder
zellspezifischen Promotoren resultiert in unterschiedlicher Modulation
von Endoreduplikation.
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RepA-Genexpression
unter Verwendung gewebespezifischer oder zellspezifischer Promotoren moduliert
Endoreduplikation in Gen-exprimierenden Geweben oder Zellen. Beispielsweise
wird die Verwendung eines samenspezifischen Promotors Endoreduplikation
stimulieren und in vergrößerter Samenbiomasse
resultieren. Ähnlich
erwartet man, dass Expression von RepA-Genen in anderen Zelltypen und/oder
zu verschiedenen Stadien der Entwicklung die Endoreduplikation moduliert.
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Induzierbare
Expression:
Das RepA-Gen kann außerdem in eine Kassette mit einem
induzierbaren Promotor, wie z.B. dem Benzolsulfonamid-induzierbaren
Promotor, kloniert werden. Der Expressionsvektor wird in Pflanzenzellen
co-eingefügt
und nach Selektion auf Bialaphos werden die transformierten Zellen
einem „Safener" (Induzierer) ausgesetzt.
Diese chemische Induktion von RepA-Expression resultiert in stimuliertem
G1/S-Übergang
und verstärkt
Endoreduplikationsraten. Die Zellen werden auf die Anwesenheit von
RepA-RNA durch Northern Blot-Analyse oder RT-PCR (unter Verwendung
von transgen spezifischen Sonden/Oligopaaren) auf RepA-codiertes
Protein unter Verwendung von RepA-spezifschen Antikörpern in
Western Blots oder unter Verwendung von Hybridisierung durchmustert.
Erhöhte
Level von Endoreduplikation können
unter Verwendung von durchflusscytometrischen Verfahren überwacht
werden.