JP6037308B2

JP6037308B2 - 植物バイオマスの増産方法

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Publication number: JP6037308B2
Application number: JP2013049689A
Authority: JP
Inventors: 伸彦村本; 広樹杉本; 典宏光川; 邦史太田; 和人久郷
Original assignee: University of Tokyo NUC; Toyota Central R&D Labs Inc
Current assignee: University of Tokyo NUC; Toyota Central R&D Labs Inc
Priority date: 2013-03-12
Filing date: 2013-03-12
Publication date: 2016-12-07
Anticipated expiration: 2033-03-12
Also published as: US9902968B2; US20140273126A1; JP2014171466A

Description

本明細書は、植物バイオマスの増産に関する。

人口が増大する一方、環境汚染や温暖化等により、地球規模での食糧危機が問題となってきている。こうした中、植物のバイオマス量増産の必要性が高まってきている。また、植物の有する温室効果ガス排出低減の効果により、地球温暖化防止を図る上でも、植物のバイオマス量増産は重要である。

植物の初期生長の促進は、雑草との競合に優位となり、多量の収穫物を得るために重要な形質である。雑草に覆われることなく、速やかに葉の受光面積を拡大できれば、光合成量の増加に繋がり生育が促進される。

例えば、「もやし」のような胚軸の伸長には、エンドリデュプリケーションによる倍数性の増加と細胞の大型化が深く関与している。エンドリデュプリケーションとは、細胞周期の１つであり、細胞分裂を伴わないＤＮＡの複製をいう。そこで、植物個体全身又は組織特異的にエンドリデュプリケーションを誘発することで植物の初期生長を促進することが試みられている（特許文献１、非特許文献１，２，３）。

特許文献１、非特許文献１、３では、エンドリデュプリケーション誘発効果のある遺伝子を開示し、非特許文献２では、欠損によりエンドリデュプリケーションを誘発できる遺伝子を特定している。

一方、例えば、特許文献１では、エンドリデュプリケーションの誘発により、根の長さ、子葉のサイズ、胚軸長が増大しているが、本葉展開後は、生長が阻害され、バイオマスは減少している。非特許文献１〜３においても、エンドリデュプリケーションが誘発されると植物体が矮化し、根が短くなることが開示されている。

国際公開第２００８／１２０４１０号

Lieven De Veylderら, The EMBO Journal Vol. 21 No. 6 pp. 1360-1368. Takashi Ishidaら, The Plant Cell, Vol. 21 2284-2297. Keiko Sugimotoら, PNAS., 102(51):18736-41.

以上のように、エンドリデュプリケーションを誘発する手段は種々検討されていた。しかしながら、エンドリデュプリケーションは植物体の初期生長は促進するが、植物体の矮化を生じていた。このため、エンドリデュプリケーションによる植物バイオマスの増大は未だ現実的ではなかった。
本明細書は、植物バイオマス量の増産に有効な遺伝子及びその利用を提供する。

本発明者らは、植物細胞に導入することによりエンドリデュプリケーションを誘発し、しかもバイオマス量を増大させるのに好適な遺伝子を探索した。膨大な実験及び解析の結果、本発明者らは、ＴａｑＩ遺伝子による形質転換植物体において、エンドリデュプリケーションが誘発されるとともに、しかもバイオマス量が増大するという知見を得た。本明細書の開示によれば、これらの知見に基づき、以下の手段が提供される。

（１）ＤＮＡ二本鎖切断を促進する外来遺伝子を保持した植物細胞を有する植物体を育成する工程を備え、前記植物体のバイオマス量を増大させる、植物バイオマスの生産方法。
（２）本葉展開後の前記植物体のバイオマス量を増大させる、（１）に記載の生産方法。
（３）前記外来遺伝子は、植物細胞中でＤＮＡ二本鎖切断活性を有するタンパク質の産生を促進する、（１）又は（２）に記載の生産方法。
（４）前記外来遺伝子は、ＤＮＡ二本鎖切断活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である、（１）〜（３）のいずれかに記載の生産方法。
（５）前記外来遺伝子は、エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子である、（１）〜（４）のいずれかに記載の生産方法。
（６）前記外来遺伝子は、配列番号２で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有し、ＤＮＡ二本鎖切断活性を有するタンパク質をコードする、（１）〜（５）のいずれかに記載の生産方法。
（７）前記外来遺伝子は、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター又はシロイヌナズナＳＩＧ２プロモーターによって作動可能に備えられる、（１）〜（６）のいずれかに記載の生産方法。
（８）前記植物細胞におけるＲＡＤ５１のオルソログ遺伝子の発現量が、宿主細胞である前記植物細胞の２倍未満である、（１）〜（７）のいずれかに記載の生産方法。
（９）ＤＮＡ二本鎖切断を促進する外来遺伝子を植物細胞に導入して、形質転換植物細胞を取得する工程と、前記形質転換植物細胞からバイオマス増大能を取得した植物体を取得する工程と、を備える、植物体の生産方法。
（１０）ＤＮＡ二本鎖切断を促進する外来遺伝子を保持し倍数性が増大された植物細胞を有する、形質転換植物体。
（１１）ＤＮＡ二本鎖切断を促進する外来遺伝子を保持し倍数性が増大された形質転換植物体を親植物体とする、交配によって得られる植物体。
（１２）（１０）又は（１１）の植物体の種子。
（１３）（１０）又は（１１）に記載の植物体である第１の植物体と第２の植物体とを用いて交配によりバイオマス増大能を有する植物体を取得する、バイオマス量の増大能を有する植物体の生産方法。
（１４）（１０）又は（１１）の植物体のバイオマスを原料として発酵する工程を備える、有用物質の生産方法。
（１５）ＤＮＡ二本鎖切断活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む、植物バイオマス増大剤。

ＡｔＳＩＧ２：ＴａｑＩ−ＮＬＳ遺伝子導入系統におけるバイオマス量を示す。３５Ｓ：ＴａｑＩ−ＮＬＳ遺伝子導入系統におけるバイオマス量を示す。３５Ｓ：ＴａｑＩ−ＮＬＳ遺伝子導入系統における根の長さを示す。ＡｔＳＩＧ２：ＴａｑＩ−ＮＬＳ遺伝子導入系統における倍数性レベルを示す。ＡｔＳＩＧ２：ＴａｑＩ−ＮＬＳ遺伝子導入系統におけるバイオマス量とエンドリデュプリケーションレシオとの相関を示す。３５Ｓ：ＴａｑＩ−ＮＬＳ遺伝子導入系統における倍数性レベルを示す。３５Ｓ：ＴａｑＩ−ＮＬＳ遺伝子導入系統におけるバイオマス量とエンドリデュプリケーションレシオとを示す。３５Ｓ：ＴａｑＩ−ＮＬＳ遺伝子導入系統におけるＴａｑＩ遺伝子の発現量を示す。３５Ｓ：ＴａｑＩ−ＮＬＳ遺伝子導入系統におけるＲＡＤ５１遺伝子の発現量を示す。

本明細書は、植物バイオマスの増産に有効な遺伝子及びその利用に関連する。本明細書は、本発明者らが、ＤＮＡ二本鎖切断を促進する外来遺伝子を植物細胞に導入し、その植物の育成に成功し、かつバイオマスを増大させたことに基づいている。

本発明者らは、細胞周期の１つであるエンドリデュプリケーションに着目した。エンドリデュプリケーションを誘発させるため、本発明者らは、ＤＮＡ二本鎖切断促進する遺伝子に着目し、本遺伝子の一例である、ＴａｑＩタンパク質をコードするＤＮＡを植物細胞に導入した。さらに、本発明者らは、当該細胞を有する植物体を育成することにより、バイオマス量の増大した個体を得ることに成功した。

本明細書によれば、ＤＮＡ二本鎖切断促進する遺伝子を保持した植物細胞を有する植物体を育成することにより、バイオマス量を増大させることができる。

この生産方法は、特に農業分野、バイオマスを原料とするエネルギー分野及び化学工業分野に有用である。

なお、本明細書において、エンドリデュプリケーションとは、細胞周期の１つであり、細胞分裂を伴わないＤＮＡの複製をいう。また、本明細書において、倍数性とは、細胞の核内にゲノムを複数保持している性質のことをいう。ゲノムとは、生物が生存するための必要最小限の遺伝子を有する染色体のセットである。ゲノム１セットのＤＮＡ量をＣと表すことで、ゲノムを２セット保持する二倍体は、２Ｃと表すことができる。同様に、四，八，十六，三二倍体をそれぞれ４Ｃ，８Ｃ，１６Ｃ，３２Ｃと表すことができる。エンドリデュプリケーションの結果、植物細胞の倍数性が増大する傾向がある。

倍数性の評価は、フローサイトメトリを用いた測定により行うことができる。具体的には、植物体の葉を切り取り、核の抽出とゲノムＤＮＡのＤＡＰＩ染色を行う。次いで、ゲノムＤＮＡ染色後の核をフローサイトメトリに供することにより、葉細胞の倍数性レベルを測定する。

例えば、エンドリデュプリケーションは細胞ごとに独立して行われるために、細胞ごとの倍数性は異なっている。エンドリデュプリケーションにより生じた倍数性の大小を以下の式で表されるエンドリデュプリケーションレシオで評価することが好ましい。
エンドリデュプリケーションレシオ＝（８Ｃ＋１６Ｃ＋３２Ｃ）／（２Ｃ＋４Ｃ＋８Ｃ＋１６Ｃ＋３２Ｃ）×１００
（ただし、２Ｃ、４Ｃ等、倍数体の数値は、それぞれ当該倍数性の細胞数を表す。）

以下、本明細書の開示に関し、ＤＮＡ二本鎖切断を促進する遺伝子、形質転換植物体、植物バイオマス増大剤、植物バイオマスの生産方法等について順次説明する。なお、説明の都合上、生産方法より先に遺伝子について説明する。

（ＤＮＡ二本鎖切断を促進する遺伝子）
本明細書は、ＤＮＡ二本鎖切断を促進する遺伝子を開示する。本遺伝子は、ＤＮＡ二本鎖切断促進するタンパク質の産生を促進し、又は該タンパク質をコードする遺伝子であってもよい。また、本遺伝子はエンドヌクレアーゼをコードする遺伝子であってもよい。エンドヌクレアーゼは、ホスホジエステル結合を加水分解することにより、核酸を分解する酵素である。エンドヌクレアーゼは制限酵素であってもよい。エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子は、動物、植物のほか微生物においても広く存在しており、公知のエンドヌクレレアーゼをコードする遺伝子から適宜選択して用いることができる。

本遺伝子の一例として、配列番号１で表される塩基配列を有するＴａｑＩ遺伝子がある。ＴａｑＩ遺伝子は、制限酵素であるＴａｑＩタンパク質をコードするＤＮＡである。

さらに、ＴａｑＩ遺伝子はThermus thermophilusをはじめとするThermus属の細菌などの微生物に広く存在すると考えられるため、本遺伝子には、種々のThermus属の細菌などの微生物に存在する相同遺伝子も含まれる。ここで「相同遺伝子」とは、種々の植物において、ＴａｑＩタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子を意味している。このようなタンパク質には、例えば、該タンパク質の変異体、アレル、バリアント、ホモログ、該タンパク質の部分ペプチド、または、他のタンパク質との融合タンパク質などが挙げられるが、これらに限定されない。なお、各々のタンパク質の詳細については後述する。

（ＲＡＤ５１遺伝子の発現促進の抑制）
ＲＡＤ５１遺伝子及びそのオルソログ遺伝子の発現量が、宿主細胞の３倍未満であることが好ましい。ＲＡＤ５１遺伝子がコードするＲＡＤ５１は、ＤＮＡ二本鎖が切断された場合に、ＤＮＡの損傷を修復する機能を有することが知られている。即ち、本遺伝子によってＤＮＡ二本鎖が切断された場合に、ＤＮＡは修復されにくくなる。好ましくは２倍未満であり、さらに好ましくは１．５倍未満である。

一般に、ＤＮＡ二本鎖切断はＲＡＤ５１の発現量を上昇させるが、細胞のチェックポイント機能が働き、細胞分裂は阻害される。細胞分裂は本葉展開後の植物体の生長において重要であり、それが阻害されると植物体が矮小化されると考えられる。

ＲＡＤ５１等の発現促進を抑制するには、本遺伝子としてＲＡＤ５１遺伝子及びそのＲＡＤ５１オルソログ遺伝子の発現量を転写レベルで誘導しない遺伝子を用いることが好ましい。この場合、ＲＡＤ５１遺伝子及びそのオルソログ遺伝子の発現量について、転写レベルにおいて、宿主細胞の３倍未満であることが好ましい。より好ましくは２倍未満であり、さらに好ましくは１．５倍未満であり、一層好ましくは１．２倍未満であり、より一層好ましくは１．１倍未満である。このような遺伝子として、例えば、ＴａｑＩ遺伝子が挙げられる。

ＲＡＤ５１遺伝子及びそのＲＡＤ５１オルソログ遺伝子の発現量を転写レベルで誘導せずに、ＤＮＡ二本鎖切断を促進する方法は、遺伝子を用いない方法であってもよい。例えば、弱いレベルのガンマ線、Ｘ線、重イオンビームなどの放射光を人為的に照射させてもよいし、プレオマイシン、ゼオマイシンなどのＤＮＡ二本鎖切断を誘発する化合物を細胞に作用させてもよい。

（植物体）
対象となる植物、換言すると変異体植物のもととなる植物としては、特に限定されないが、例えば、双子葉植物、単子葉植物、例えばアブラナ科、イネ科、ナス科、マメ科、ヤナギ科等に属する植物（下記参照）が挙げられる。
アブラナ科：シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、アブラナ（Brassica rapa、Brassica napus）、キャベツ(Brassica oleracea var. capitata)、ハクサイ（Brassica rapa var. pekinensis）、チンゲンサイ（Brassica rapa var. chinensis）、カブ（Brassica rapa var. rapa）、ノザワナ（Brassica rapa var. hakabura）、ミズナ（Brassica rapa var. lancinifolia）、コマツナ（Brassica rapa var. peruviridis）、パクチョイ（Brassica rapa var. chinensis）、ダイコン（Brassica Raphanus sativus）、ワサビ（Wasabia japonica）など。
ナス科：タバコ（Nicotiana tabacum）、ナス(Solanum melongena)、ジャガイモ（Solaneum tuberosum）、トマト（Lycopersicon lycopersicum）、トウガラシ（Capsicum annuum）、ペチュニア（Petunia）など。
マメ科：ダイズ(Glycine max)、エンドウ（Pisum sativum）、ソラマメ（Vicia faba）、フジ（Wisteria floribunda）、ラッカセイ（Arachis. hypogaea）、ミヤコグサ（Lotus corniculatus var. japonicus）、インゲンマメ（Phaseolus vulgaris）、アズキ（Vigna angularis）、アカシア（Acacia）など。
キク科：キク（Chrysanthemum morifolium）、ヒマワリ（Helianthus annuus）など。
ヤシ科：アブラヤシ（Elaeis guineensis、Elaeis oleifera）、ココヤシ（Cocos nucifera）、ナツメヤシ（Phoenix dactylifera）、ロウヤシ（Copernicia）など。
ウルシ科：ハゼノキ（Rhus succedanea）、カシューナットノキ（Anacardium occidentale）、ウルシ（Toxicodendron vernicifluum）、マンゴー（Mangifera indica）、ピスタチオ（Pistacia vera）など。
ウリ科：カボチャ（Cucurbita maxima、Cucurbita moschata、Cucurbita pepo）、キュウリ（Cucumis sativus）、カラスウリ（Trichosanthes cucumeroides）、ヒョウタン（Lagenaria siceraria var. gourda）など。
バラ科：アーモンド（Amygdalus communis）、バラ（Rosa）、イチゴ（Fragaria）、サクラ（Prunus）、リンゴ（Malus pumila var. domestica）など。
ナデシコ科：カーネーション（Dianthus caryophyllus）など。
ヤナギ科：ポプラ(Populus trichocarpa、Populus nigra、Populus tremula)など。
イネ科：トウモロコシ(Zea mays)、イネ(Oryza sativa)、オオムギ（Hordeum vulgare）、コムギ（Triticum aestivum）、タケ（Phyllostachys）、サトウキビ（Saccharum officinarum）、ネピアグラス（Pennisetum pupureum）、エリアンサス（Erianthus ravenae）、ミスキャンタス（ススキ）（Miscanthus virgatum）、ソルガム（Sorghum）スイッチグラス（Panicum）など。
ユリ科：チューリップ（Tulipa）、ユリ（Lilium）など。
フトモモ科：ユーカリ（Eucalyptus camaldulensis、Eucalyptus grandis）など。

本遺伝子は、バイオマス増大能を有するタンパク質をコードしうるものであれば、その形態に特に制限はなく、本遺伝子は、ゲノムＤＮＡの他、ｃＤＮＡ、化学合成ＤＮＡなども含まれる。また、本遺伝子は、後述する本タンパク質をコードするものであれば、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するＤＮＡが含まれる。

（植物細胞）
植物細胞として、例えば、単子葉植物及び双子葉植物由来の植物細胞を用いることができる。また、穀物植物由来の細胞であってもよい。植物細胞としては、例えば、上記した各種植物体の細胞が挙げられる。また、植物細胞には、懸濁培養細胞等の培養細胞の他、プロトプラスト、カルスも含まれる。また、植物細胞には、苗条原基、多芽体、毛状根などのほか、葉の切片等の植物体中の細胞も含まれる

（植物体及び植物体のバイオマス量）
植物体とは、植物の葉、茎、花、子実、根茎部を含む。本明細書において、バイオマス量の増大とは、植物体の重量が増加することをいう。重量は、乾燥重量であってもよく、湿潤重量であってもよい。また、重量は、植物体全体の重量であってもよく、葉のみ、葉と茎のみ、子実のみ、あるいは、根のみのように、植物体の一部の重量であってもよい。例えば、トウモロコシからバイオマスエタノールを得ることを目的としている場合、トウモロコシのバイオマス量は、子実であることが好ましく、葉と茎であってもよい。また、植物バイオマス増大能を有するとは、本遺伝子が発現していない植物体と比較して、好ましくは２％以上、より好ましくは５％以上、一層より好ましくは１０％以上、一層より好ましくは２０％以上、一層より好ましくは３０％以上、一層より好ましくは３５％、一層より好ましくは４０％以上、一層より好ましくは４５％以上、最も好ましくは５０％以上、バイオマス量が増大していることを意味している。

（本葉展開後の植物体）
植物の種子の中の胚にすでに存在する葉を子葉という。種子が発芽すると、最初に子葉が出現する。続いて生長の過程で本葉が出現する。即ち、本葉とは子葉以外の通常の葉である。播種後に本葉が展開するまでの日数は、植物によって異なり、例えば、シロイヌナズナは７日程度で本葉が展開する。上述したように、従来技術では、エンドリデュプリケーションの誘発によって、本葉展開後の生長が阻害され、バイオマス量は減少している（特許文献１）。これに対して、本明細書で開示する技術では、本葉展開後においてバイオマス量を増大させることができる。

（ＤＮＡ二本鎖切断促進するタンパク質）
上述のように、ＤＮＡ二本鎖切断促進する遺伝子は、ＤＮＡ二本鎖切断促進するタンパク質の産生を促し、又は該タンパク質をコードするものが含まれる。ＤＮＡ二本鎖切断促進するタンパク質（以下、本タンパク質ともいう。）とは、核酸分解酵素のうち、ＤＮＡ二本鎖が切断可能な酵素である。例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡを分解可能なヌクレアーゼと、ＤＮＡを分解可能で、かつ、ＲＮＡを分解不可能なデオキシリボヌクレアーゼがある。切断形態による分類では、エンドヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼとがある。エンドヌクレアーゼは、核酸の内部を切断する酵素であり、例えば、哺乳類由来デオキシリボヌクレアーゼ、マイクロコッカルヌクレアーゼがある。エキソヌクレアーゼは、核酸の末端からヌクレオチドを１個ずつ外す酵素であり、例として、Ｂａｌ３１ヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、λエキソヌクレアーゼがある。切断形態の相違を考慮すると、エンドヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼに比べ、ＤＮＡ修復を促進しやすく、結果として、植物細胞の倍数性をより増大させ、植物体のバイオマスを増大させると考えられる。さらに、エンドヌクレアーゼは、制限酵素であってもよい。制限酵素には、認識する塩基の数が４〜８塩基のいずれであってもよい。また、ＤＮＡ２本鎖をまっすぐ平滑末端で切断する制限酵素であっても、１本鎖が突出した粘着末端で切断する制限酵素であってもよい。制限酵素の例として、ＴｓｐＲＩ、Ｔｓｐ４５Ｉ，Ｓｓｅ９Ｉ，ＭｓｅＩ，ＣｖｉＡＩＩ等が挙げられる。好ましくはＭｓｐＩ，ＤｐｎＩ，ＨａｅＩＩＩ，ＡｖａＩＩ，ＥｃｏＲＩ，ＥｃｏＲＩＩ，ＨｉｎｆＩ，ＸｂａＩ，ＨｐａＩ，ＮｏｔＩ，ＳｗａＩ，ＳｇｒＡＩであり、さらに好ましくはＴａｑＩである。さらに、ＴａｑＩ遺伝子がコードするＴａｑＩタンパク質も、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する制限酵素である。ＴａｑＩタンパク質は、５‘−ＴＣＧＡ−３’の４塩基配列を認識すると、ＴとＣの間に切れ目を入れ、粘着末端でＤＮＡ二本鎖を切断する。ＴａｑＩタンパク質の態様としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質のみならず、その変異体を含む。

制限酵素遺伝子としては、植物細胞におけるゲノムDNA中の所定の配列箇所に二本鎖切断を導入することができる制限酵素をコードするものであれば、如何なる制限酵素遺伝子も使用することができる。例えば、制限酵素としては、４塩基〜６塩基の認識配列を持つものが好ましく、さらに好ましくは、４塩基〜５塩基の認識部位を持つ酵素であり、最も好ましくは４塩基の認識部位を持つ酵素である。

また、制限酵素としては、植物細胞の培養条件とは異なる条件下で活性化する制限酵素を使用することが好ましい。「通常の培養条件とは異なる条件」とは、当業者において選択可能な条件であれば如何なる条件でもよいが、例えば、用いた制限酵素の活性化に必要とされる物質（例えば、金属イオンなど）を添加した条件、又は制限酵素の活性化に必要な温度条件などを挙げることができる。特に、制限酵素としては、好熱菌由来の制限酵素であって、植物細胞の培養温度よりも高温領域に至適温度を有する制限酵素を使用することがより好ましい。例えば、TaqI及びTsp45Iの指摘温度は65℃であり、Sse9Iの至適温度は55℃である。

このように、植物細胞の培養条件とは異なる条件下で活性化する制限酵素を使用した場合には、植物細胞中において制限酵素遺伝子を発現させた後、当該条件下にて制限酵素を活性化するか、当該条件としないことで制限酵素を低活性の状態とするか選択することができる。例えば、植物細胞において制限酵素遺伝子を発現させた結果、当該制限酵素の活性が高すぎて植物細胞が死滅するような場合、上記条件とすることなく制限酵素を低活性に維持し、植物細胞の死滅を回避することができる。

本タンパク質としては、ＤＮＡ二本鎖切断活性を有するタンパク質であって、エンドリデュプリケーションにより植物バイオマスを増大させることができるものであればよい。典型的には、後述する好ましいエンドリデュプリケーションレシオを発現させるタンパク質が挙げられる。本タンパク質の一態様としては、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質であって、ＴａｑＩタンパク質と機能的に同等なタンパク質が挙げられる。なお、配列番号２で表されるタンパク質を基準としたとき、他方のタンパク質は基準としたタンパク質の変異体であるといえる。

変異するアミノ酸数は特に制限されないが、通常、２０アミノ酸以内であり、好ましくは１０アミノ酸以内であり、より好ましくは６アミノ酸以内であり、さらに好ましくは３アミノ酸以内であり、一層好ましくは２アミノ酸以内である。変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい（これは、保存的アミノ酸置換として知られている）。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）および親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）の二種類に大別することができる。また、その側鎖の構造に基づいて、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）などのようにアミノ酸を分類することもできる。さらに、例えば、変異マトリクス（ｍｕｔａｔｉｏｎａｌｍａｔｒｉｘ）によってアミノ酸を分類することも周知である（Taylor 1986, J, Theor. Biol. 119, 205-218; Sambrook, J. et al., Molecular Cloning 3rd ed. A7.6-A7.9, Cold Spring HarborLab. Press, 2001）。この分類を以下に要約すると、脂肪族アミノ酸（Ｌ、Ｉ、Ｖ）、芳香族アミノ酸（Ｈ、Ｗ、Ｙ、Ｆ）、荷電アミノ酸（Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ）、正荷電アミノ酸（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、負荷電アミノ酸（Ｄ、Ｅ）、疎水性アミノ酸（Ｈ、Ｗ、Ｙ、Ｆ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｋ）、極性アミノ酸（Ｔ、Ｓ、Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｗ、Ｙ）、小型アミノ酸（Ｐ、Ｖ、Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｓ、Ｎ、Ｄ）、微小アミノ酸（Ａ、Ｇ、Ｓ）および大型（非小型）アミノ酸（Ｑ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｗ、Ｙ、Ｆ、Ｍ、Ｌ、Ｉ）が挙げられる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。

あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはよく知られている。
本タンパク質の他の一態様としては、例えば、配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるタンパク質であって、ＴａｑＩタンパク質と機能的に同等なタンパク質が挙げられる。このようなＤＮＡは、典型的には、配列番号１で表される塩基配列と、塩基配列全体での同一性が、少なくとも３０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上であり、より一層好ましくは８５％以上であり、さらに一層好ましくは９０％以上であり、より一層好ましくは９５％以上であり、さらに一層好ましくは９８％以上であり、さらにまた一層好ましくは９９％以上である。

さらに、本タンパク質他の一態様としては、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であって、ＴａｑＩタンパク質と機能的な同等なタンパク質が挙げられる。同一性は少なくとも３０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上であり、さらに好ましくは８０％以上であり、より一層好ましくは８５％以上であり、さらに一層好ましくは９０％以上であり、より一層好ましくは９５％以上であり、さらに一層好ましくは９８％以上であり、さらにまた一層好ましくは９９％以上である。

本明細書において、「機能的に同等」とは、対象となるタンパク質が、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質（ＴａｑＩ）等と同等の生物学的機能や生化学的機能を有することを指す。ＴａｑＩの生物学的機能や生化学的機能としては、例えばＤＮＡ二本鎖切断を促進する機能を挙げることができる。また、同種材料について同種方法で本タンパク質をコードするＤＮＡを導入して形質転換植物体を得たとき、既述のエンドリデュプリケーションレシオを同一条件で測定したとき、１２．５％以上であることが好ましい。より好ましくは、１３．０％以上であり、さらに好ましくは１５．０％以上であり、一層好ましくは２０．０％以上であり、さらにまた好ましくは２５．０％以上であり、より好ましくは４０．０％以上である。

相同遺伝子等を単離するための当業者によく知られた方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Southern, E. M., Journal of Molecular Biology, Vol. 98, 503, 1975）やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Saiki, R. K., et al. Science, vol. 230, 1350-1354, 1985, Saiki, R. K. et al. Science, vol.239, 487-491,1988）が挙げられる。即ち、当業者にとっては、配列番号１で表される塩基配列もしくはその一部をプローブとして、またＴａｑＩ遺伝子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、種々の植物からＴａｑＩ遺伝子の相同遺伝子を単離することは通常行いうることである。

相同遺伝子をコードするＤＮＡを単離するためには、通常、ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は当業者であれば、適宜選択することができる。一例を示せば、２５％ホルムアミド、より厳しい条件では５０％ホルムアミド、４ｘＳＳＣ、５０ｍＭＨｅｐｅｓｐＨ７．０、１０×デンハルト溶液、２０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液中、４２℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、４２℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後の洗浄における洗浄液および温度条件は、「１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度で、より厳しい条件としては「０．５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度で、さらに厳しい条件としては「０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度で実施することができる。このようにハイブリダイゼーションの洗浄の条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するＤＮＡの単離を期待しうる。但し、上記ＳＳＣ、ＳＤＳおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。

単離されたＤＮＡの同一性は、アミノ酸配列全体で、少なくとも５０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列の同一性を有する。配列の相同性は、ＢＬＡＳＴＮ（核酸レベル）やＢＬＡＳＴＸ（アミノ酸レベル）のプログラム（Altschul et al. J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990）を利用して決定することができる。該プログラムは、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993）に基づいている。ＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。また、ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997）に記載されているように行うことができる。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。

（ベクター）
本明細書のベクターは、上記ＤＮＡを含むことができる。本ベクターは、上記ＤＮＡのほか、植物細胞内で本ＤＮＡの発現を増強するためのベクターとすることができる。本ベクターは、宿主細胞（植物細胞）内の染色体上の内在性の本遺伝子の有無に関わらず、本遺伝子を外来性ＤＮＡとして導入して、結果として、本遺伝子の発現を増強することを意図することができる。特に、配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡを含むベクターは、このＤＮＡの発現を増強するような、具体的には発現量を増大させるようなプロモーターの制御可能にプロモーターの下流域に連結されていることが好ましい。なお、本ベクターが、相同組換え等により、植物細胞内の染色体上の内在性の本遺伝子の発現を増強するように意図されることを排除するものではない。

本ベクターが、植物細胞に、外来性ＤＮＡとして本遺伝子を導入し発現させることを意図するとき、植物細胞で転写可能なプロモーターと当該プロモーターの制御下に作動可能に連結された本遺伝子とを備えることができる。さらに、ポリＡを含むターミネーターを含めることもできる。こうしたプロモーターとしては、例えば、本遺伝子を恒常的または誘導的に発現させるためのプロモーターが挙げられる。恒常的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター（Odell et al. 1985 Nature 313:810）、イネのアクチンプロモーター（Zhang et al.1991 Plant Cell 3:1155）、トウモロコシのユビキチンプロモーター（Cornejo et al. 1993 Plant Mol.Biol. 23:567）などが挙げられる。また、本遺伝子を、誘導的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば糸状菌・細菌・ウイルスの感染や侵入、低温、高温、乾燥、紫外線の照射、特定の化合物の散布などの外因によって発現することが知られているプロモーターなどが挙げられる。このようなプロモーターとしては、例えば、イネキチナーゼ遺伝子のプロモーター（Xu et al. 1996 Plant Mol.Biol.30:387）やタバコのＰＲタンパク質遺伝子のプロモーター（Ohshima et al. 1990 Plant Cell 2:95）、イネの「ｌｉｐ１９」遺伝子のプロモーター（Aguan et al. 1993 Mol.GenGenet. 240:1）、イネの「ｈｓｐ８０」遺伝子と「ｈｓｐ７２」遺伝子のプロモーター（Van Breusegem et al. 1994 Planta 193:57）、シロイヌナズナの「ｒａｂ１６」遺伝子のプロモーター（Nundy et al. 1990 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1406）、パセリのカルコン合成酵素遺伝子のプロモーター（Schulze-Lefert et al. 1989 EMBO J. 8:651）、トウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター（Walker et al. 1987 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:6624）などが挙げられる。その他に、シロイヌナズナのＳＩＧ２プロモーターが挙げられる。

本ベクターは、本タンパク質を組換えタンパク質として、大腸菌、酵母、動植物細胞、昆虫細胞等の細胞の宿主細胞に生産させることを意図するものであってもよい。この場合には、本ベクターは、適当な宿主細胞で作動可能なプロモーターの制御下に本遺伝子を備えることができる。

本ベクターは、当業者であれば、例えば、当業者に公知の各種プラスミドなど商業的に入手可能な材料を利用して構築することができる。例えば、プラスミド「ｐＢＩ１２１」、「ｐＢＩ２２１」、「ｐＢＩ１０１」（いずれもＣｌｏｎｔｅｃｈ社製）などのほか、形質転換植物体作製のために植物細胞内で本遺伝子を発現させるベクターを用いて構築することができる。本ベクターの植物細胞への導入については後述する。

（形質転換植物細胞及び形質転換植物体）
本明細書の開示によれば、本ベクターが導入されて、本遺伝子を保持する形質転換細胞も提供される。本明細書に開示される形質転換植物体は、こうした形質転換細胞を含んでいる。本形質転換体は、形質転換前に比較して本遺伝子の発現が増強されている。増強される本遺伝子は、植物体に内在する遺伝子であってもよいし、外来性の遺伝子であってもよい。これらの双方であってもよい。また、遺伝子の発現が増強されているとは、遺伝子の発現量（本遺伝子の一次転写産物の量ほか、本遺伝子がコードするタンパク質の生産量）が形質転換前よりも増大しているか、あるいは当該タンパク質の活性が形質転換前よりも増大していることを意味している。本遺伝子の発現の増強の結果、本遺伝子の発現量が増大するとともに本タンパク質の活性自体が増大していてもよい。

本遺伝子の発現の増強の態様は、特に限定されない。例えば、植物細胞で作動可能なプロモーターと当該プロモーターによって作動可能に結合された本遺伝子とが、外来性ＤＮＡとして、植物細胞の染色体又は染色体外に保持される態様が挙げられる。プロモーターに連結される本遺伝子は、植物細胞に内在性のものであっても外来性のものであってもよい。なお、内在性の本遺伝子のプロモーターの活性を向上させるために、染色体上のそのプロモーター領域の全体又はその一部を置換等する態様、内在性遺伝子とともにプロモーター領域を置換する態様も挙げられる。

本形質転換植物体は、本形質転換細胞から植物体を再生させることにより得ることができる。植物細胞へのベクターの導入は、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法など当業者に公知の種々の方法を用いることができる。例えば、ポリエチレングリコールによるプロトプラストへ遺伝子導入（Datta,S.K. (1995) In Gene Transfer To Plants(Potrykus I and Spangenberg Eds.) pp66-74）、電気パルスによるプロトプラストへ遺伝子導入（Toki et al. (1992) Plant Physiol. 100, 1503-1507）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入（Christou et al. (1991) Bio/technology, 9: 957-962.）およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入（Hiei et al. (1994) Plant J. 6: 271-282.）等の各種方法が挙げられる。また、転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である（Toki et al. (1995) Plant Physiol. 100:1503-1507参照）。例えば、シロイヌナズナであればＡｋａｍａら（Plant Cell Reports12:7-11 (1992)）の方法が挙げられ、イネであればＦｕｊｉｍｕｒａら（Plant Tissue Culture Lett. 2:74 (1995)）の方法が挙げられ、トウモロコシであればＳｈｉｌｌｉｔｏら（Bio/Technology 7:581 (1989)）の方法やＧｏｒｄｅｎ−Ｋａｍｍら（Plant Cell 2:603(1990)）が挙げられる。

形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である（Toki et al. (1995) Plant Physiol. 100:1503-1507参照）。例えば、イネにおいては、形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（インド型イネ品種が適している）を再生させる方法（Datta,S.K. (1995) In Gene Transfer To Plants(Potrykus I and Spangenberg Eds.) pp66-74)、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（日本型イネ品種が適している）を再生させる方法(Toki et al. (1992) Plant Physiol. 100, 1503-1507)、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法(Christou et al. (1991) Bio/technology, 9: 957-962.)およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法(Hiei et al. (1994) Plant J. 6: 271-282.)など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。

該形質転換植物体の形質転換植物細胞では、ＤＮＡ二本鎖切断に伴い、エンドリデュプリケーションが生じ得る。エンドリデュプリケーションでは、ＤＮＡが複製されるが、細胞分裂は起こらない。そのため、植物細胞の倍数性は増大する。

こうして得られる本形質転換植物体は、本外来遺伝子を保持し倍数性が増大された植物細胞を有することができる。ここで倍数性が増大されているとは、植物体又はその一部（例えば、葉部など目的とするバイオマス等の部位に応じて決定される。）のエンドリデュプリケーションレシオが、１２．５％以上であることが好ましい。こうしうた植物体は、野生株に対して倍数性が増大しており、植物細胞の増大が期待あれる。より好ましくは、１３．０％以上であり、さらに好ましくは１５．０％以上であり、一層好ましくは２０．０％以上であり、さらにまた好ましくは２５．０％以上であり、より好ましくは４０．０％以上である。

ゲノム上に本遺伝子が組み込まれた形質転換植物体が得られれば、後述するように、該植物体の交配によって植物体を得ることが可能である。また、該植物体や交配によって得られた植物体あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。本明細書の開示には、既に説明した（１）本遺伝子を保持し、倍数性が増大された植物細胞、（２）該細胞を有する植物体のほか、（３）該植物体の交配によって得られた植物体およびクローン、並びに（４）該植物体、その子孫、およびクローンの繁殖材料が含まれる。さらに、本明細書は、（１）又は（３）の植物体の種子を開示している。

このようにして作出された形質転換植物体は、バイオマス増大能が付与又は向上され、バイオマス量が増大したものとなっている。

（植物バイオマスの生産方法）
本明細書に開示される植物バイオマスの生産方法は、ＤＮＡ二本鎖切断を促進する外来遺伝子を保持した植物細胞を有する植物体を育成する工程を備えることができる。本明細書の生産方法によれば、バイオマス量を増大させることができ、バイオマス量の大きな植物体を得ることができる。特に、本葉展開後においてバイオマス量が増大した植物体を得ることができ、増大した植物バイオマスを得ることができる。育成工程は、当業者であれば、本植物体の種類に応じて適宜設定することができる。本生産方法で育成対象となる植物体は、本形質転換植物体又は当該植物体から交配により取得した植物体が挙げられる。

本生産方法においては、例えば、本タンパク質がＴａｑＩのごとく活性化温度が高い場合には、そのタンパク質の活性化温度よりも低い温度で植物体を育成して、植物バイオマスを得ることもできる。こうすることで、本タンパク質を適度に作用させて、エンドリデュプリケーションを誘発して、バイオマスを増大させることができる。

本生産方法は、植物体が保持する植物細胞におけるＲＡＤ５１のオルソログ遺伝子の発現量が、宿主細胞である前記植物細胞の２倍未満であることが好ましい。こうした植物細胞であれば、ＲＡＤ５１タンパク質は、ＤＮＡ二本鎖が切断された場合に、ＤＮＡの損傷を修復する機能を有する。したがって、当該タンパク質の発現量が大きすぎると、本遺伝子の導入増強によるエンドリデュプリケーション誘発効果が抑制されるからである。ＲＡＤ５１のオルソログ遺伝子の発現量は、タンパク質のほかｍＲＮＡ等によって当業者であれば適宜検出できる。

（植物体の生産方法）
本明細書に開示される植物体の生産方法は、ＤＮＡ二本鎖切断を促進する外来遺伝子を植物細胞に導入して、形質転換植物細胞を取得する工程と、前記形質転換植物細胞からバイオマス増大能を取得した植物体を取得する工程と、を備えることができる。形質転換細胞の取得及び植物体の取得については既に説明したとおりである。バイオマス増大能を獲得した植物体は、再生植物体の大きさ、本遺伝子の発現量、ＲＡＤ５１遺伝子の発現量、倍数性（エンドリデュプリケーションレシオ）の評価によって適宜選択することができる。

本生産方法においては、例えば、本タンパク質がＴａｑＩのごとく活性化温度が高い場合には、そのタンパク質の活性化温度よりも低い温度で形質転換細胞を培養しあるいは植物体を育成して植物体を得ることができる。こうすることで、本タンパク質を適度に作用させて、エンドリデュプリケーションを誘発して、バイオマスを増大させることができる。したがって、本生産方法によれば、低い栽培温度であっても、効率的にバイオマス増大能を備える植物体を得ることができる。

また、本生産方法は、形質転換植物体を第１の植物体とし、他の植物体を第２の植物体として、これらを用いて交配によりバイオマス増大能を有する植物体を取得してもよい。さらに、本生産方法は、形質転換体から交配により得られた植物体を第１の植物体とし、他の植物体を第２の植物体として、これらを用いて交配によりバイオマス増大能を有する植物体を取得してもよい。こうした方法によれば、ゲノムのＤＮＡ二本鎖切断を促進する外来遺伝子を保持し倍数性が増大された形質転換植物体を親植物体とする、交配によって得られる植物体が提供される。好ましい形質を得るための交配技術は、当業者であれば適宜取得し、実施可能である。交配は人工授粉によって行うことができる。人工授粉の例として、一方の植物体の花を切り取り、その花粉を他方の植物体の花に振り掛ける方法、一方の植物体の花粉を採取し、他方の植物体の花に吹きかける方法が挙げられる。

本形質転換植物体やその交配体から得られた植物体は、本外来遺伝子を保持し倍数性が増大された形質転換植物体を親植物体とする、交配によって得られる植物体。

（有用物質の生産方法）
本明細書に開示される有用物質の生産方法は、本植物体のバイオマスを原料として発酵する工程を備えることができる。有用物質の例として、エタノールやブタノールなどのバイオ燃料、工業用原料、食品等が挙げられる。発酵に用いる微生物及び発酵条件は、当業者であれば適宜設定できる。微生物は、大腸菌などの前核微生物、カビや酵母などの真核微生物などを用いることができ、好ましくは，Saccharomyces cerevisiaeなどの酵母である。

（バイオマス量の調節方法）
本明細書の開示によれば、植物体において、本遺伝子の発現を調節することを特徴とする、バイオマス量の増大量を調節する方法が提供される。本明細書に開示の調節方法によれば、本遺伝子の導入量を調節することで、バイオマス量の増大の程度を調節することができる。植物体において本遺伝子の導入量を調節することには、既に説明したように、遺伝子工学的にあるいは交配によりかかる特性を有する植物体を作製することが含まれる。また、本遺伝子を有していないあるいは本遺伝子が機能していない植物体と交配させることもできる。

（植物バイオマス増大能の判定方法）
本明細書の開示によれば、植物バイオマス増大能を判定する方法が提供される。すなわち、被検植物体又はその一部における本遺伝子の発現解析を実施する工程を備えることを特徴とする、方法が提供される。「植物バイオマス増大能を判定する」とは、既存品種におけるバイオマス増大能の判定のみならず、交配や遺伝子組換え技術による新しい品種における植物バイオマス増大能の判定も含まれる。また、被検植物体の一部としては、植物の器官、組織及び細胞であってもよい。

本判定方法によれば、例えば、植物の交配による品種改良を行なう場合において特に利点を有する。食部体の植物バイオマス増大能の有無や程度を、その表現型により判断することに比して、遺伝子レベルで判断することは簡便で確実であるため、本判定方法は、植物の品種改良において大きく貢献し得る。

本遺伝子の発現解析は当業者において周知の方法で実施することができる。例えば、被検植物体又はその繁殖材料からＲＮＡを含むＲＮＡ試料を調製し、この試料のうち、ｍＲＮＡについて、定量的リアルタイムＰＣＲで定量し、得られたｍＲＮＡ量に基づいて発現量を評価することができる。本遺伝子の発現又はその発現量の多さによって、その被検植物体は、植物バイオマス増大能を有しているあるいは増強されている、と判定できる。

発現解析には、例えば、上記したプローブやプライマーを用いたＤＮＡマイクロアレイやリアルタイムＰＣＲなど公知の発現解析手法を適宜用いることができる。

（植物バイオマス増大剤）
本明細書の開示によれば、ＤＮＡ二本鎖切断活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む植物バイオマス増大剤が提供される。なお、本タンパク質については既に説明したとおりである。また、ＴａｑＩタンパク質は、ＤＮＡ二本鎖切断活性を有するタンパク質の一例である。

以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。

（ＴａｑＩ遺伝子の取得）
出芽酵母用プラスミドｐＨＳ１４１（特許第４１５８９２０）を鋳型として、ＰＣＲ法によってＴａｑＩ遺伝子を増幅した。ＰＣＲ反応は、制限酵素サイト（ＢａｍＨＩ，ＳａｃＩ）を付加したプライマー（ＢａｍＨＩ−ＴａｑＩ−Ｆ（配列番号３），ＴａｑＩ−ＳｃａＩ−Ｒ（配列番号４））とを用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＨＳＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）により行った。さらに、増幅したＴａｑＩ遺伝子をＴＯＰＯＴＡＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、ＴＡ−Ｃｌｏｎｉｎｇ用ｐＣＲ２．１にサブクローニングした。

（ＴａｑＩ−ＮＬＳ遺伝子の作製）
得られたＴａｑＩ遺伝子を用いたＰＣＲ法によってＴａｑＩ−ＮＬＳ遺伝子を作製した。ＰＣＲ反応は、ＮＬＳ配列を付加したプライマーＴａｑ−ＮＬＳ−ＳａｃＩ−Ｒ（配列番号５）を用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＨＳＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅにより行った。さらに、増幅したＴａｑＩ−ＮＬＳ遺伝子をＴＯＰＯＴＡＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、ＴＡ−Ｃｌｏｎｉｎｇ用ｐＣＲ２．１にサブクローニングした。

（ＡｔＳＩＧ２プロモーターの取得）
シロイヌナズナ幼葉を液体窒素凍結下で粉砕したものと、ＤＮｅａｓｙＰｌａｎｔＭｉｎｉＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）とを用いて、ゲノムＤＮＡを調製した。調製したゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲ法によってシロイヌナズナのＳＩＧ２（ＳＩＧＭＡＳＵＢＵＮＩＴＯＦＣＨＬＯＲＯＰＬＡＳＴＲＮＡＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ）（Ａｔ１ｇ０８５４０）のプロモーター部分（ＡｔＳＩＧ２プロモーター）を増幅させた。ＰＣＲ反応には、制限酵素サイト（ＳａｌＩ、ＢａｍＨＩ）を付加したプライマー（ＳａｌＩ−ＡｔＳＩＧ２−Ｆ（配列番号６）、ＡｔＳＩＧ２−ＢａｍＨＩ−Ｒ（配列番号７））を用いた。

（プロモータークローニング用ベクターｐＢＩ１０１Ｎ２の作製）
植物発現用ベクターｐＢＩ１２１（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで処理した。次に、オリゴヌクレオチド（Ｌｉｎｋｅｒ−Ｆ２（配列番号８）、Ｌｉｎｋｅｒ−Ｒ２（配列番号９））を等量混合し、９６℃で１０ｍｉｎ、その後室温に２時間静置した。静置後のオリゴヌクレオチド混合物と、上記制限酵素処理したｐＢＩ１２１と、ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔ＜ＭｉｇｈｔｙＭｉｘ＞（タカラバイオ社製）と、によりライゲーション反応を行い、プロモータークローニングベクターｐＢＩ１０１Ｎ２を作製した。

（プロモータークローニング用ベクターｐＢＩＴａｑＩ−ＮＬＳの作製）
作製したプロモータークローニングベクターｐＢＩ１０１Ｎ２に、作製したＴａｑＩ−ＮＬＳ遺伝子をサブクローニングし、プロモータークローニング用ベクターｐＢＩＴａｑＩ−ＮＬＳを作製した。

（植物発現用ベクターｐＢＩ３５Ｓ：ＴａｑＩ−ＮＬＳの作製）
植物発現用ベクターｐＢＩ１２１（プロモーターとして、ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ（ＣａＭＶ）３５ｓｐｒｏｍｏｔｅｒを含む）に、作製したＴａｑＩ−ＮＬＳ遺伝子をサブクローニングし、植物発現用ベクターｐＢＩ３５Ｓ：ＴａｑＩ−ＮＬＳを作製した。

（植物発現用ベクターｐＢＩＡｔＳＩＧ２：ＴａｑＩ−ＮＬＳの作製）
作製したプロモータークローニング用ベクターｐＢＩＴａｑＩ−ＮＬＳに、取得したＡｔＳＩＧ２プロモーターをサブクローニングし、植物発現用ベクターｐＢＩＡｔＳＩＧ２：ＴａｑＩ−ＮＬＳを作製した。

（シロイヌナズナＣｏｌ−０野生株へのＴａｑＩ遺伝子の導入）
作製した植物発現用ベクターｐＢＩＡｔＳＩＧ２：ＴａｑＩ−ＮＬＳをアグロバクテリウム法によって、シロイヌナズナＣｏｌ−０株に導入した。また、作製した植物発現用ベクターｐＢＩ３５Ｓ：ＴａｑＩ−ＮＬＳをアグロバクテリウム法によって、シロイヌナズナ１４０６株に導入した。

各々のシロイヌナズナについて、インプランタ法によって形質転換を行った。具体的には、アグロバクテリウムに感染後の種子を、５０ｍｇ／ｌ硫酸カナマイシンを含むＭＳ寒天培地（ムラシゲスクーグ無機塩、１％ショ糖、０．０５％ＭＥＳ、０．８％Ａｇａｒ）に播種し、２２℃、１６時間明期８時間暗期、光強度約３０〜５０μｍｏｌ／ｍ^２／ｓｅｃの人工気象室で２週間育成後、カナマイシン耐性個体を選抜し、各々のシロイヌナズナの形質転換体を得た。

（ＡｔＳＩＧ２：ＴａｑＩ−ＮＬＳ遺伝子導入系統及び３５Ｓ：ＴａｑＩ−ＮＬＳ遺伝子導入系統におけるバイオマス量）
得られたＡｔＳＩＧ２：ＴａｑＩ−ＮＬＳ遺伝子が導入されたシロイヌナズナの形質変換体を交配し、ＡｔＳＩＧ２：ＴａｑＩ−ＮＬＳ遺伝子がホモに挿入された＃２０１１，＃２０４６，＃２０５９系統を取得した。＃２０１１，＃２０４６，＃２０５９系統、及びＣｏｌ−０野生株の種子をＭＳ寒天培地に播種し、２２℃、１６時間明期８時間暗期、光強度約３０〜５０μｍｏｌ／ｍ^２／ｓｅｃの人工気象室で３週間育成した。この時点において、各々の植物体は、すでに本葉が展開している。得られたそれぞれの系統につき、１０〜１４個の植物体のバイオマス量の測定結果を図１に示す。図１に示すように、＃２０１１，＃２０４６，＃２０５９系統の平均生重量は、それぞれ１９．５ｍｇ，１８．５ｍｇ，１５．６ｍｇであった。一方において、Ｃｏｌ−０野生株の平均バイオマス量は、１１．３ｍｇであった。即ち、＃２０１１，＃２０４６，＃２０５９系統の平均バイオマス量は、Ｃｏｌ−０野生株の平均バイオマス量に対して、それぞれ７３％，６４％，３９％増加していた。バイオマス量が増加した植物体の割合は、＃２０１１系統では１０個体中６個体、＃２０４６系統では１０個体中６個体、＃２０５９系統では１０個体中５個体であった。

上述のＡｔＳＩＧ２：ＴａｑＩ−ＮＬＳ遺伝子導入系統の場合と同様に、得られた３５Ｓ：ＴａｑＩ−ＮＬＳ遺伝子が導入されたシロイヌナズナの形質変換体を交配し、３５Ｓ：ＴａｑＩ−ＮＬＳ遺伝子がホモに挿入された＃８７８系統を取得した。さらに、＃８７８系統及び１４０６野生株の種子を、ＡｔＳＩＧ２：ＴａｑＩ−ＮＬＳ遺伝子導入系統の場合と同一の条件で３週間育成した。この時点において、各々の植物体は、すでに本葉が展開している。＃８７８系統について、１０〜１４個の植物体のバイオマス量の測定結果を図２に示す。図２に示すように、＃８７８系統の平均生重量は、２０．９ｍｇであった。一方において、１４０６野生株の平均バイオマス量は、１２．６ｍｇであった。即ち、＃８７８系統の平均バイオマス量は、１４０６野生株の平均バイオマス量に対して、７３％増加していた。＃８７８系統において、バイオマス量が増加した植物体の割合は、８個体中４個体であった。

以上のことから、ＴａｑＩ遺伝子を保持した植物細胞を有する植物体は、植物バイオマスが増大することがわかった。

（３５Ｓ：ＴａｑＩ−ＮＬＳ遺伝子導入系統における根の伸長促進）
上述の＃８７８系統及び１４０６野生株の種子をＭＳ寒天培地に播種し、２２℃、１６時間明期８時間暗期、光強度約３０〜５０μｍｏｌ／ｍ^２／ｓｅｃの人工気象室で３週間育成した。その際に、ＭＳ寒天培地を縦に置き、植物の根が寒天の表面を這うように生長させた。播種から８，９，１２日後に根の長さを測定し、８個体について平均値を求めた。結果を図３に示す。図３に示すように、＃８７８系統について、８，９，１２日後の平均の根の長さは、それぞれ、１３．５ｍｍ，２０．２ｍｍ，４６．７ｍｍであった。一方において、１４０６野生株について、８，９，１２日後の平均の根の長さは、それぞれ、１０．１ｍｍ，１４．３ｍｍ，３５．１ｍｍであった。即ち、＃８７８系統の平均の根の長さは、１４０６野生株の平均の根の長さに対して、８日後では３４％、９日後では４１％、１２日後では３３％増加していた。即ち、播種から８〜１２日後という初期の段階においても、ＴａｑＩ遺伝子を保持した植物細胞を有する植物体の植物バイオマスが増大している。

（ＡｔＳＩＧ２：ＴａｑＩ−ＮＬＳ遺伝子導入によるエンドリデュプリケーションの誘発）
＃２０１１，＃２０４６，＃２０５９系統、及びＣｏｌ−０野生株ついて、バイオマス量測定後のロゼット葉の第一葉、第二葉を切り取り、ＣｙＳｔａｉｎ（登録商標）ＵＶＰｒｅｃｉｓｅＰキット（ＰＡＲＴＥＣ社製）を用いて核の抽出とゲノムＤＮＡのＤＡＰＩ染色を行った。ゲノムＤＮＡ染色後の核をフローサイトメトリＣｅｌｌＬａｂＱｕａｎｔａＳＣＭＰＬ（ベックマン・コールター社製）に供し、葉細胞の倍数性レベルを測定した。結果を図４に示す。図４によれば、＃２０１１，＃２０４６，＃２０５９系統のそれぞれは、Ｃｏｌ−０野生株と比較して、２Ｃ（二倍体）の量に大きな差はない。４Ｃ（四倍体）の量については、＃２０１１，＃２０４６，＃２０５９系統のそれぞれは、Ｃｏｌ−０野生株より少ない一方、８Ｃ（八倍体），１６Ｃ（十六倍体）の量については、＃２０１１，＃２０４６，＃２０５９系統のそれぞれで、Ｃｏｌ−０野生株より多く存在している。即ち、＃２０１１，＃２０４６，＃２０５９系統の倍数性レベルは、Ｃｏｌ−０野生株の倍数性レベルよりも高い。このことから、ＴａｑＩ遺伝子を保持した植物細胞を有する植物体では、倍数性が増大していることがわかる。

＃２０１１，＃２０４６，＃２０５９系統、及びＣｏｌ−０野生株ついて、バイオマス量とエンドリデュプリケーションの誘発との相関を図５に示す。図５では、エンドリデュプリケーションの誘発の程度を表す指標として、エンドリデュプリケーションレシオを使用している。なお、エンドリデュプリケーションレシオは、その値が大きいほどエンドリデュプリケーションが多く誘発されていることを示す。
エンドリデュプリケーションレシオ＝
（８Ｃ＋１６Ｃ＋３２Ｃ）／（２Ｃ＋４Ｃ＋８Ｃ＋１６Ｃ＋３２Ｃ）×１００
（ただし、２Ｃ、４Ｃ等、倍数体の数値は、それぞれ当該倍数性の細胞数を表す。）

図５に示すように、＃２０１１，＃２０４６，＃２０５９系統の各々で、バイオマス量とエンドリデュプリケーションレシオとが相関していることがわかる。即ち、ＴａｑＩ遺伝子を保持した植物細胞を有する植物体では、倍数性が増大することによって、バイオマス量が増大するといえる。

（３５Ｓ：ＴａｑＩ−ＮＬＳ遺伝子導入によるエンドリデュプリケーションの誘発）
＃８７８系統及び１４０６野生株について、＃２０１１，＃２０４６，＃２０５９系統、及びＣｏｌ−０野生株の場合と同一の手順によって、葉細胞の倍数性レベルを測定した。結果を図６に示す。図６によれば、＃８７８系統は、１４０６野生株と比較して、２Ｃ，４Ｃの量は少ない。一方において、＃８７８系統における８Ｃ，１６Ｃの量は、１４０６野生株より多く存在している。即ち、＃８７８系統の倍数性レベルは、１４０６野生株の倍数性レベルよりも高い。このことからも、ＴａｑＩ遺伝子を保持した植物細胞を有する植物体では、倍数性が増大していることがわかる。

＃８７８系統及び１４０６野生株について、それぞれの個体のバイオマス量とエンドリデュプリケーションレシオを図７に示す。図７に示すように、＃８７８系統について、バイオマス量の大きな個体は、エンドリデュプリケーションレシオも大きい。即ち、このことからも、ＴａｑＩ遺伝子を保持した植物細胞を有する植物体では、倍数性が増大することによって、バイオマス量が増大することがわかる。

（３５Ｓ：ＴａｑＩ−ＮＬＳ遺伝子導入系統における遺伝子発現解析）
上述のＴａｑＩ−ＮＬＳ遺伝子がホモに挿入された＃８７８系統の種子と１４０６野生株の種子とをＭＳ寒天培地に播種し、２２℃、１６時間明期８時間暗期、光強度約３０〜５０μｍｏｌ／ｍ^２／ｓｅｃの人工気象室で２週間育成後、ＲＮｅａｓｙｐｌａｎｔｍｉｎｉｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて、全ＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡのうち、ｍＲＮＡの定量を、ＨＩＧＨＣａｐａｃｉｔｙＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡ^ｔｍＫｉｔ、ＰｏｗｅｒＳＹＢＲＧｒｅｅｎＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ、及びＡＢＩＰＲＩＳＭ７０００（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、定量的リアルタイムＰＣＲによって行った。以下に示すプライマーを用いて、ＴａｑＩ遺伝子、ＲＡＤ５１遺伝子、ＡｔＡＣＴ２遺伝子の、それぞれのｍＲＮＡを定量し、ＴａｑＩ遺伝子の発現量、ＲＡＤ５１遺伝子の発現量について、ＡｔＡＣＴ２遺伝子の発現量に対する相対値を求めた。上述したように、ＲＡＤ５１遺伝子がコードするＲＡＤ５１は、ＤＮＡ二本鎖が切断された場合に、ＤＮＡの損傷を修復するために機能するタンパク質である。図８には、＃８７８系統と１４０６野生株についてのＴａｑＩ遺伝子の発現量の相対値を示す。１４０６野生株では、ＴａｑＩ遺伝子が全く発現していないのに対し、＃８７８系統では、ＴａｑＩ遺伝子が発現していることがわかる。即ち、細胞の倍数性の増大と植物バイオマスの増大とは、ＴａｑＩ遺伝子の発現が原因となっていることが確認された。

TaqI-F QRT: CATTGTCCGGACTCATACCC（配列番号１０）
TaqI-R QRT: TTCTCTTCTCGTGGGCTTGT（配列番号１１）
AtACT2-F RT: CTGTTGACTACGAGCAGGAGATGGA（配列番号１２）
AtACT2-R RT: GACTTCTGGGCATCTGAATCTCTCA（配列番号１３）
RAD51-F RT: CGAGGAAGGATCTCTTGCAG（配列番号１４）
RAD51-R RT: GCACTAGTGAACCCCAGAGG（配列番号１５）

図９には、＃８７８系統、１４０６野生株についてのＲＡＤ５１遺伝子の発現量の相対値を示す。図９に示すように、＃８７８系統と１４０６野生株とでは、ＲＡＤ５１遺伝子の発現量に有意差はない。上述のように、ＤＮＡ二本鎖が切断された場合、通常はＲＡＤ５１遺伝子が発現されるが、＃８７８系統では、ＲＡＤ５１遺伝子の発現量は増加しなかった。それは、＃８７８系統におけるＤＮＡ二本鎖切断の頻度が低いためと考えられる。＃８７８系統はＴａｑＩ遺伝子を保持するものの、ＲＡＤ５１遺伝子の発現量が増加しないため、ＤＮＡの修復は促進しない。即ち、植物細胞にＴａｑＩ遺伝子を導入する方法は、ＤＮＡ二本鎖切断の頻度をより高くする他の方法に比べて、エンドリデュプリケーションの誘発に適しているといえる。

配列番号３〜１５：プライマー

Claims

ＴａｑＩ、Ｔｓｐ４５Ｉ及びＳｓｅ９Ｉからなる群から選択される１又は２以上の制限酵素をコードする外来遺伝子を発現可能に保持した植物細胞を有するバイオマス増大能を取得した植物体を本葉展開後も育成する工程を備え、
前記植物体は、前記外来遺伝子を核内局在化シグナルに連結して備え及び／又は前記外来遺伝子をホモで備え、
前記植物細胞におけるＲＡＤ５１のオルソログ遺伝子の発現量が、宿主細胞である前記植物細胞の２倍未満である、植物バイオマスの生産方法。
前記ＲＡＤ５１のオルソログ遺伝子の発現量が、宿主細胞である前記植物細胞の１．５倍未満である、請求項１に記載の生産方法。
前記ＲＡＤ５１のオルソログ遺伝子の発現量が、宿主細胞である前記植物細胞の１．２倍未満である、請求項２に記載の生産方法。
前記植物体は、前記外来遺伝子を核内局在化シグナルに連結して備えるとともにホモで備える、請求項１〜３のいずれかに記載の植物バイオマスの生産方法。
前記植物体又はその一部におけるエンドリデュプリケーションレシオが１５％以上である、請求項１〜４のいずれかに記載の生産方法。
前記エンドリデュプリケーションレシオが２０％以上である、請求項５に記載の生産方法。
前記外来遺伝子は、配列番号２で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有し、ＤＮＡ二本鎖切断活性を有するタンパク質をコードする、請求項１〜６のいずれかに記載の生産方法。
前記外来遺伝子は、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター又はシロイヌナズナＳＩＧ２プロモーターによって作動可能に備えられる、請求項１〜７のいずれかに記載の生産方法。
ＴａｑＩ、Ｔｓｐ４５Ｉ及びＳｓｅ９Ｉからなる群から選択される１又は２以上の制限酵素をコードする外来遺伝子を植物細胞に導入して形質転換植物細胞を取得する工程と、
前記形質転換植物細胞から前記外来遺伝子を発現可能に保持してバイオマス増大能を取得した植物体を取得する工程と、
を備え、
前記植物体は、前記外来遺伝子を核内局在化シグナルに連結して備え及び／又は前記外来遺伝子をホモで備え、
前記植物細胞におけるＲＡＤ５１のオルソログ遺伝子の発現量が、宿主細胞である前記植物細胞の２倍未満である、植物バイオマスの生産方法。
ＴａｑＩ、Ｔｓｐ４５Ｉ及びＳｓｅ９Ｉからなる群から選択される１又は２以上の制限酵素をコードする外来遺伝子を保持し、
前記外来遺伝子を核内局在化シグナルに連結して備え及び／又は前記外来遺伝子をホモで備え、
倍数性が増大された植物細胞を有してバイオマス増産能を備え、
前記植物細胞におけるＲＡＤ５１のオルソログ遺伝子の発現量が、宿主細胞である前記植物細胞の２倍未満である、植物体。
請求項１０に記載の形質転換植物体を親植物体とする、交配によって得られる植物体。
請求項１０又は１１に記載の植物体の種子。
請求項１０又は１１に記載の植物体である第１の植物体と第２の植物体とを用いて交配によりバイオマス増大能を有する植物体を取得する、バイオマス量の増大能を有する植物体の生産方法。
請求項１０又は１１に記載の植物体のバイオマスを原料として発酵する工程を備える、有用物質の生産方法。