JP2016103994A5 - - Google Patents

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環境ストレス耐性を付䞎する遺䌝子及びその利甚
本明现曞は、環境ストレス耐性を付䞎可胜な遺䌝子及びその利甚に関する。
怍物は、その繁殖ず生育ずが保護管理され、䜜物ずしお蟲業に利甚されおいる。䜜物の収量や品質は、気候倉動によっお倧きな圱響を受ける。近幎、気候の倉動芁因が地球芏暡で増倧しおきおおり、気候倉動にかかわらず安定した食糧䟛絊を確保するこずが求められおいる。
気候倉動に起因しうる各皮のストレスずしおは、䟋えば、高枩、䜎枩、也燥、冠氎、塩分等が挙げられる。
こうしたストレスに耐性のある怍物ずしおは、䟋えば、耐塩性を発珟させた圢質転換怍物䜓が開瀺されおいる特蚱文献。たた、也燥ストレス耐性を発珟させた圢質転換怍物䜓も開瀺されおいる特蚱文献。
䞀方、怍物がなんらかのストレスを受けた際、誘導される怍物ホルモンの䞀぀ずしおゞャスモン酞がある。
特開2004−329210号公報 特衚2014−520527号公報
気候倉動の予枬はある皋床可胜であるものの完党に予想するこずは極めお困難である。たた、実際の䜜物の栜培においおは、耇数の環境ストレスに同時に曝されるこずが倚い。そうするず、䜜物は、䞀぀のストレスのみならず耇数のストレスに察する耐性を備えおいる必芁がある。しかしながら、こうした耇数のストレスに耐性を備える怍物の䜜補は困難ず考えられおおり、実珟した䟋は極めお少ない。
たた、本発明者らによれば、埓来の汎甚されおいる実隓宀内レベルのストレス耐性の評䟡結果は、必ずしも実際のストレス耐性ず盞関しおいるわけではなかった。すなわち、実隓宀レベルの評䟡で肯定的評䟡が埗られたずしおも、さらに実甚レベルの評䟡では逆の評䟡結果が埗られるこずもあった。
さらに、ゞャスモン酞はストレス時に誘導されるものの、ゞャスモン酞及びその共圹䜓のストレス時における圹割はよくわかっおいない。
本明现曞は、怍物䜓に察しおより実甚的な環境ストレス耐性を付䞎可胜な遺䌝子及びその利甚を提䟛する。
本発明者らは、むネ完党長cDNAの個別過剰発珟FOXむネ系統を利甚しお、耐塩性等を瀺す耇数のFOXむネ系統に導入されおいる耇数の遺䌝子を新たに同定した。さらに、本発明者らは、これらの耐塩性候補遺䌝子に察するFOXむネ系統を甚いた各皮ストレス耐性詊隓の結果、より実甚的なレベルでの塩ストレス耐性に寄䞎し、あるいは他の環境ストレスにも耐性を瀺しうる遺䌝子を特定できた。本明现曞は、こうした知芋に基づき、以䞋の手段を提䟛する。
Os12g0150200遺䌝子、Os01g0858350遺䌝子、Os05g0445100遺䌝子、Os11g0151400遺䌝子、AT3G48520遺䌝子、及びAT2G27690遺䌝子、䞊びにこれらのいずれかの遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子からなる第の遺䌝子のサブグルヌプず、Os04g0584800遺䌝子及びこの遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子からなる第の遺䌝子のサブグルヌプずからなる遺䌝子グルヌプから遞択される第の遺䌝子からなる矀から遞択される皮又は皮以䞊の遺䌝子の発珟が増匷されおいる怍物䜓。
環境ストレス耐性が増匷された、に蚘茉の怍物䜓。
塩ストレス耐性が増匷された、に蚘茉の怍物䜓。
さらに、他の環境ストレス耐性が増匷された、に蚘茉の怍物䜓。
前蚘第の遺䌝子の発珟が増匷された、〜のいずれかに蚘茉の怍物䜓。
前蚘第の遺䌝子は、少なくずも配列番号で衚されるOs12g0150200及びこの遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子からなる矀から遞択される、に蚘茉の怍物䜓。
前蚘第の遺䌝子の発珟が増匷されおいる、〜のいずれかに蚘茉の怍物䜓。
少なくずも配列番号で衚されるOs04g0584800遺䌝子の発珟が増匷されおいる、に蚘茉の怍物䜓。
タンパク質をコヌドする栞酞が導入された、又は該栞酞の発珟が増匷された怍物䜓であっお、
該タンパク質が、以䞋の〜のいずれかである怍物䜓。
配列番号、、、、、及びのいずれかで衚されるアミノ酞配列を含むタンパク質
配列番号、、、、、及びのいずれかで衚されるアミノ酞配列においお、又は耇数個のアミノ酞が欠倱、眮換、付加又は挿入されたアミノ酞配列を含み、か぀掻性型ゞャスモン酞を䞍掻性型ゞャスモン酞に倉換する掻性、又は怍物の環境ストレス耐性を増匷させる掻性を有するタンパク質
配列番号、、、、、及びのいずれかで衚されるアミノ酞配列ず90以䞊の同䞀性を有するアミノ酞配列を含み、か぀掻性型ゞャスモン酞を䞍掻性型ゞャスモン酞に倉換する掻性、又はii怍物の環境ストレス耐性を増匷させる掻性を有するタンパク質
配列番号、、、、、及びのいずれかで衚される塩基配列からなるポリヌクレオチドによっおコヌドされるタンパク質
配列番号、、、、、及びのいずれかで衚される塩基配列ず90以䞊の同䞀性を有するポリヌクレオチドによっおコヌドされ、か぀掻性型ゞャスモン酞を䞍掻性型ゞャスモン酞に倉換する掻性、又は怍物の環境ストレス耐性を増匷させる掻性を有するタンパク質又は
配列番号、、、、、及びのいずれかで衚される塩基配列又は盞補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに察しおストリンゞェントな条件䞋においおハむブリダむズするポリヌクレオチドによっおコヌドされ、か぀掻性型ゞャスモン酞を䞍掻性型ゞャスモン酞に倉換する掻性、又は怍物の環境ストレス耐性を増匷させる掻性を有するタンパク質。
タンパク質をコヌドする栞酞が導入又は該栞酞の発珟が増匷された怍物䜓であっお、
該タンパク質が、以䞋の〜のいずれかに蚘茉のタンパク質である怍物䜓。
配列番号で衚されるアミノ酞配列を含むタンパク質
配列番号で衚されるアミノ酞配列においお、又は耇数個のアミノ酞が欠倱、眮換、付加又は挿入されたアミノ酞配列を含むタンパク質
配列番号で衚されるアミノ酞配列ず90以䞊の同䞀性を有するアミノ酞配列を含むタンパク質
配列番号で衚される塩基配列からなるポリヌクレオチドによっおコヌドされるタンパク質
配列番号で衚される塩基配列ず90以䞊の同䞀性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドによっおコヌドされるタンパク質又は
配列番号で衚される塩基配列又は盞補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに察しおストリンゞェントな条件䞋においおハむブリダむズするポリヌクレオチドによっおコヌドされるタンパク質。
環境ストレス耐性が増匷された、に蚘茉の怍物䜓。
双子葉怍物であるこずを特城ずする、〜のいずれかに蚘茉の怍物䜓。
ダむズであるこずを特城ずする、に蚘茉の怍物䜓。
単子葉怍物であるこずを特城ずする〜のいずれかに蚘茉の怍物䜓。
むネ科怍物であるこずを特城ずするに蚘茉の怍物䜓。
むネであるこずを特城ずするに蚘茉の怍物䜓。
サトりキビであるこずを特城ずするに蚘茉の怍物䜓。
トりモロコシであるこずを特城ずする、に蚘茉の怍物䜓。
怍物䜓に察しお環境ストレス耐性を付䞎するための発珟ベクタヌであっお、
Os12g0150200遺䌝子、Os01g0858350遺䌝子、Os05g0445100遺䌝子、Os11g0151400遺䌝子、AT3G48520遺䌝子、及びAT2G27690遺䌝子、䞊びにこれらのいずれかの遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子からなる第の遺䌝子のサブグルヌプず、Os04g0584800遺䌝子及びこの遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子からなる第の遺䌝子のサブグルヌプずからなる遺䌝子グルヌプから遞択される皮又は皮以䞊の遺䌝子を含む、ベクタヌ。
以䞋の〜からなる矀より遞択されるいずれかの遺䌝子を含むベクタヌ
配列番号、、、、、、及びのいずれかで衚されるアミノ酞配列を含むタンパク質をコヌドする遺䌝子
配列番号、、、、、、及びのいずれかで衚されるアミノ酞配列においお、又は耇数個のアミノ酞が欠倱、眮換、付加又は挿入されたアミノ酞配列を含み、か぀怍物の環境ストレス耐性を増匷させる掻性を有するタンパク質をコヌドする遺䌝子
配列番号、、、、、、及びのいずれかで衚されるアミノ酞配列ず90以䞊の同䞀性を有するアミノ酞配列を含み、か぀怍物の環境ストレス耐性を増匷させる掻性を有するタンパク質をコヌドする遺䌝子
配列番号、、、、、、及びのいずれかで衚される塩基配列からなる遺䌝子
配列番号、、、、、、及びのいずれかで衚される塩基配列ず90以䞊の同䞀性を有するポリヌクレオチドからなり、か぀怍物の環境ストレス耐性を増匷させる掻性を有するタンパク質をコヌドする遺䌝子又は
配列番号、、、、、、及びのいずれかで衚される塩基配列又は盞補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに察しおストリンゞェントな条件䞋においおハむブリダむズするポリヌクレオチドからなり、か぀怍物の環境ストレス耐性を増匷させる掻性を有するタンパク質をコヌドする遺䌝子。
又はに蚘茉の発珟ベクタヌを含む、圢質転換䜓。
又はに蚘茉の発珟ベクタヌを含む、圢質転換怍物。
Os12g0150200遺䌝子、Os01g0858350遺䌝子、Os05g0445100遺䌝子、Os11g0151400遺䌝子、AT3G48520、及びAT2G27690遺䌝子、䞊びにこれらのいずれかの遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子からなる第の遺䌝子のサブグルヌプず、Os04g0584800遺䌝子及びこの遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子からなる第の遺䌝子のサブグルヌプずからなる遺䌝子グルヌプから遞択される皮又は皮以䞊の遺䌝子であっお、内圚性又は倖来性の遺䌝子を増匷する工皋、
を備える、怍物䜓ぞの環境ストレス耐性の付䞎方法。
怍物においお、以䞋の〜からなる矀より遞択されるいずれかの遺䌝子の発珟を増倧させる工皋を含む、環境ストレス耐性が増匷した怍物の䜜成方法
配列番号、、、、、及びのいずれかで衚されるアミノ酞配列を含むタンパク質をコヌドする遺䌝子
配列番号、、、、、及びのいずれかで衚されるアミノ酞配列においお、又は耇数個のアミノ酞が欠倱、眮換、付加又は挿入されたアミノ酞配列を含み、か぀掻性型ゞャスモン酞を䞍掻性型ゞャスモン酞に倉換する掻性、又は怍物の環境ストレス耐性を増匷させる掻性を有するタンパク質をコヌドする遺䌝子
配列番号、、、、、及びのいずれかで衚されるアミノ酞配列ず90以䞊の同䞀性を有するアミノ酞配列を含み、か぀掻性型ゞャスモン酞を䞍掻性型ゞャスモン酞に倉換する掻性、又は怍物の環境ストレス耐性を増匷させる掻性を有するタンパク質をコヌドする遺䌝子
配列番号、、、、、及びのいずれかで衚される塩基配列からなる遺䌝子
配列番号、、、、、及びのいずれかで衚される塩基配列ず90以䞊の同䞀性を有するポリヌクレオチドからなり、か぀掻性型ゞャスモン酞を䞍掻性型ゞャスモン酞に倉換する掻性、又は怍物の環境ストレス耐性を増匷させる掻性を有するタンパク質をコヌドする遺䌝子又は
配列番号、、、、、及びのいずれかで衚される塩基配列又は盞補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに察しおストリンゞェントな条件䞋においおハむブリダむズするポリヌクレオチドからなり、か぀掻性型ゞャスモン酞を䞍掻性型ゞャスモン酞に倉換する掻性、又は怍物の環境ストレス耐性を増匷させる掻性を有するタンパク質をコヌドする遺䌝子。
Os12g0150200遺䌝子、Os01g0858350遺䌝子、Os05g0445100遺䌝子、Os11g0151400遺䌝子、AT3G48520遺䌝子、及びAT2G27690遺䌝子、䞊びにこれらのいずれかの遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子からなる第の遺䌝子のサブグルヌプず、Os04g0584800遺䌝子及びこの遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子からなる第の遺䌝子のサブグルヌプずからなる遺䌝子グルヌプから遞択される皮又は皮以䞊の遺䌝子であっお、内圚性又は倖来性の遺䌝子を増匷する工皋、
を備える、怍物䜓の生産方法。
怍物においお、以䞋の〜からなる矀より遞択されるいずれかの遺䌝子の発珟を増倧させる工皋を含む、環境ストレス耐性が増匷した怍物の䜜成方法
配列番号で衚されるアミノ酞配列を含むタンパク質をコヌドする遺䌝子
配列番号で衚されるアミノ酞配列においお、又は耇数個のアミノ酞が欠倱、眮換、付加又は挿入されたアミノ酞配列を含み、か぀怍物の環境ストレス耐性を増匷させる掻性を有するタンパク質をコヌドする遺䌝子
配列番号で衚されるアミノ酞配列ず90以䞊の同䞀性を有するアミノ酞配列を含み、か぀怍物の環境ストレス耐性を増匷させる掻性を有するタンパク質をコヌドする遺䌝子
配列番号で衚される塩基配列からなる遺䌝子
配列番号で衚される塩基配列ず90以䞊の同䞀性を有するポリヌクレオチドからなり、か぀怍物の環境ストレス耐性を増匷させる掻性を有するタンパク質をコヌドする遺䌝子又は
配列番号で衚される塩基配列又は盞補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに察しおストリンゞェントな条件䞋においおハむブリダむズするポリヌクレオチドからなり、か぀怍物の環境ストレス耐性を増匷させる掻性を有するタンパク質をコヌドする遺䌝子。
Os12g0150200遺䌝子、Os01g0858350遺䌝子、Os05g0445100遺䌝子、Os11g0151400遺䌝子、AT3G48520遺䌝子、及びAT2G27690遺䌝子、䞊びにこれらのいずれかの遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子からなる第の遺䌝子のサブグルヌプず、Os04g0584800遺䌝子及びこの遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子からなる第の遺䌝子のサブグルヌプずからなる遺䌝子グルヌプから遞択される皮又は皮以䞊の遺䌝子の発珟を指暙ずしお亀配による怍物䜓を遞抜する工皋、
を備える、怍物䜓の生産方法。
䜜物の生産方法であっお、〜のいずれかに蚘茉の怍物䜓である䜜物を栜培する工皋、を備える方法。
Os12g0150200遺䌝子、Os01g0858350遺䌝子、Os05g0445100遺䌝子、Os11g0151400遺䌝子、AT3G48520遺䌝子及びAT2G27690遺䌝子䞊びにこれらのいずれかの遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子からなる第の遺䌝子のサブグルヌプず、Os04g0584800遺䌝子及びこの遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子からなる第の遺䌝子のサブグルヌプずからなる遺䌝子グルヌプから遞択される皮又は皮以䞊の遺䌝子の発珟を指暙ずしお、又は以䞊の怍物䜓をスクリヌニングする工皋ず、
前蚘皮又は皮以䞊の遺䌝子の発珟レベルの高い前蚘怍物䜓の耐塩性を評䟡する工皋ず、
を備える、怍物䜓のスクリヌニング方法。
以䞋の〜からなる矀より遞択されるいずれかの遺䌝子の発珟を指暙ずしお、又は以䞊の怍物䜓をスクリヌニングする工皋ず、
圓該遺䌝子の発珟レベルの高い前蚘怍物䜓の耐塩性を評䟡する工皋ず、
を備える、怍物䜓のスクリヌニング方法
配列番号、、、、、、及びのいずれかで衚されるアミノ酞配列を含むタンパク質をコヌドする遺䌝子
配列番号、、、、、、及びのいずれかで衚されるアミノ酞配列においお、又は耇数個のアミノ酞が欠倱、眮換、付加又は挿入されたアミノ酞配列を含み、か぀怍物の環境ストレス耐性を増匷させる掻性を有するタンパク質をコヌドする遺䌝子
配列番号、、、、、、及びのいずれかで衚されるアミノ酞配列ず90以䞊の同䞀性を有するアミノ酞配列を含み、か぀怍物の環境ストレス耐性を増匷させる掻性を有するタンパク質をコヌドする遺䌝子
配列番号、、、、、、及びのいずれかで衚される塩基配列からなる遺䌝子
配列番号、、、、、、及びのいずれかで衚される塩基配列ず90以䞊の同䞀性を有するポリヌクレオチドからなり、か぀怍物の環境ストレス耐性を増匷させる掻性を有するタンパク質をコヌドする遺䌝子又は
配列番号、、、、、、及びのいずれかで衚される塩基配列又は盞補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに察しおストリンゞェントな条件䞋においおハむブリダむズするポリヌクレオチドからなり、か぀怍物の環境ストレス耐性を増匷させる掻性を有するタンパク質をコヌドする遺䌝子。
〜のいずれかに蚘茉の怍物䜓の埌代、子孫、又はクロヌン。
に由来する繁殖材料。
皮子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、及びプロトプラストからなる矀から遞択される、に蚘茉の繁殖材料。
シロむヌナズナのCYP94C1(AT2g27690)ずむネのホモログの分子系統暹䞊ずアミノ酞配列アラむメント䞋を瀺す図である。 シロむヌナズナのCYP94C1(AT2g27690)ずむネのホモログであるOs12g0150200のアミノ酞配列のアラむメントを瀺す図である。 皮々のむネ完党長cDNA過剰発珟FOXむネ系統の耐塩性評䟡結果を瀺す図である。 野生型、CYP94C2b FOXむネ系統系統名FE047、及び別途䜜出した系統のCYP94C2b過剰発珟むネ系統の耐塩性評䟡結果を瀺す図である。 野生型及びCYP94C2b過剰発珟系統むネFE047の耐塩性評䟡結果ダメヌゞ床を瀺す図である。 野生型及びCYP94C2b過剰発珟系統むネFE047の耐塩性評䟡結果生存率を瀺す図である。 野生型及びCYP94C2b過剰発珟系統むネFE047の耐塩性評䟡結果皔実数を瀺す図である。 CYP94C2b過剰発珟系統むネFE047の耐塩性評䟡結果倖芳を瀺す図である。 傷凊理埌に誘導されるゞャスモン酞、掻性型ゞャスモン酞及び䞍掻性型ゞャスモン酞の蓄積量の倉化を瀺す図である。 野生型及びFE047系統のゞャスモン酞に察する応答シュヌト長を瀺す図である。 野生型及びFE047系統のゞャスモン酞に察する応答根の䌞長を瀺す図である。 野生型及びFE047系統のコロナチンCORに察する応答シュヌト長を瀺す図である。 野生型及びFE047系統のコロナチンCORに察する応答根の䌞長を瀺す図である。 野生型及びFE047系統ぞの傷凊理埌のJA応答性遺䌝子JAmybの発珟量を瀺す図である。 野生型及びFE047系統ぞの傷凊理埌のJA応答性遺䌝子JAZ11の発珟量を瀺す図である。 塩ストレスによっお野生型及びFE047系統に誘導される葉の老化セネッセンス、倖芳の評䟡結果を瀺す図である。 塩ストレスによっお野生型及びFE047系統に誘導される葉の黄化セネッセンスの床合いを、葉の色緑色濃グレヌで衚瀺、黄緑色グレヌ、黄色〜耐色薄いグレヌで評䟡した結果を瀺す図である。 塩ストレスによっお野生型及びFE047系統に誘導される葉の黄化セネッセンス、䞊老化ストレスマヌカヌ遺䌝子SGR遺䌝子、䞋サむトカむニン応答性マヌカヌ遺䌝子OsRR10遺䌝子の評䟡結果を瀺す図である。 野生型、FE047系統T2䞖代及び別途䜜出したCYP94C2b過剰発珟むネ系統におけるCYP94C2bの発珟レベルず耐塩性の評䟡結果を瀺す図である。個䜓生存胜Viabilityはが生存、−が枯死を瀺す。 野生型、FE047系統T2及び独立過剰発珟系統におけるCYP94C2bの発珟レベルず耐塩性の評䟡結果発珟レベルのランク付けず生存率ずの関係を瀺す図である。 cDNAの過剰発珟により高い耐塩性を付䞎するむネ遺䌝子の同定結果を瀺す図である。 Os12g0150200遺䌝子ずOs04g0584800遺䌝子の過剰発珟による耐塩性の付䞎を瀺す図である。 Os12g0150200遺䌝子ずOs04g0584800遺䌝子の過剰発珟による高枩ストレス耐性の付䞎を瀺す図である。 Os04g0584800遺䌝子の過剰発珟による高浞透圧ストレス耐性およびむオンストレス耐性の付䞎を瀺す図である。 暙準むネ品皮Nipponbare及び耐塩性むネ品皮Heitai, Pokkaliに぀いおの耐塩性詊隓の結果実隓宀内及び枩宀内及びOs12g0150200遺䌝子の発珟量を瀺す図である。
本明现曞の開瀺は、その発珟を増匷するこずで環境ストレス耐性を付䞎する遺䌝子及びその利甚に関する。本開瀺は、その発珟を増匷するこずで新たな塩ストレス耐性に寄䞎する遺䌝子同定に成功したこずに基づいおいる。
本発明者らは、環境ストレス耐性の評䟡にあたり、その評䟡手法䞊の問題点に着目した。すなわち、䞊行的な皮類の評䟡手法に基づいお、実甚レベルにおいおより高い確床で優れた環境ストレス耐性を付䞎できる遺䌝子を探玢した。その結果、意倖にも、実隓レベルで明確な耐性を瀺さないが、実甚レベルでより高いあるいは倚様性のある環境ストレス耐性を発揮する遺䌝子を芋出した。
たた、本開瀺においお特定された遺䌝子は、いずれも、2皮以䞊の環境ストレスに察しお耐性を発揮するこずができ、自然環境で発生し埗る耇合的な環境ストレスに察応しやすくなっおいるこずも芋出された。こうした遺䌝子を甚いれば、皮類の遺䌝子の高発珟により皮以䞊の環境ストレス耐性を付䞎できるので、耇数のストレスに感受性の怍物に、適切なストレス耐性遺䌝子を遞択しお導入か぀過剰発珟させるこずで、環境ストレス耐性に優れる怍物䜓を創出するこずができる。
たた、本発明者らは、本開瀺においお特定された遺䌝子、䟋えば、Os12g0150200で特定される遺䌝子が、既存の耐塩性むネ品皮の非ストレス条件䞋においおもその発珟レベルが増匷されおいるこずを確認した。すなわち、本発明者らが特定した遺䌝子は、その発珟の増匷による怍物䜓ぞの悪圱響を回避又は抑制しお、耐塩性などの環境ストレス耐性に優れる怍物䜓を創出できる。
なお、本明现曞においお、遺䌝子の発珟が増匷されおいるずは、遺䌝子の発珟量が増倧しおいるほか、圓該遺䌝子がコヌドするタンパク質が増匷されおいる䟋えば、タンパク質量が増倧又はそのタンパク質の掻性が向䞊するこずを含むこずができる。したがっお、倖来性の遺䌝子ずしお特定遺䌝子を導入しお増匷するほか、内圚性の遺䌝子のプロモヌタヌ等の発珟調節領域を改倉した圓該発珟調節遺䌝子により圓該内圚性の遺䌝子の発珟を増匷しおもよい。
以䞋、本明现曞の開瀺に関し、環境ストレス耐性を付䞎する遺䌝子、発珟ベクタヌ、怍物䜓、怍物䜓の生産方法、䜜物の生産方法等に぀いお順次説明する。
環境ストレス耐性を付䞎可胜な遺䌝子
環境ストレス耐性を付䞎可胜な遺䌝子は、Os12g0150200で特定される遺䌝子本明现曞においお、単に、Os12g0150200遺䌝子ずいう。、Os05g0445100遺䌝子、Os11g0151400遺䌝子、Os01g0858350遺䌝子、AT3G48520遺䌝子及びAT2G27690遺䌝子䞊びにこれらのいずれかの遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子からなる第の遺䌝子サブグルヌプず、Os04g0584800遺䌝子及びこの遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子からなる第の遺䌝子サブグルヌプずからなる遺䌝子グルヌプから遞択される皮又は皮以䞊の遺䌝子である。以䞋、第の遺䌝子サブグルヌプ及び第の遺䌝子サブグルヌプに぀いお順次説明する。
第の遺䌝子サブグルヌプ及び構成遺䌝子第の遺䌝子
第の遺䌝子は、Os12g0150200遺䌝子、Os05g0445100遺䌝子、Os11g0151400遺䌝子、Os01g0858350遺䌝子、AT3G48520遺䌝子及びAT2G27690遺䌝子䞊びにこれらのいずれかの遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子からなる第の遺䌝子サブグルヌプから遞択されうる。第の遺䌝子サブグルヌプは、以䞋に説明するように、ゞャスモン酞䞍掻性化掻性を有するタンパク質をコヌドしおいる。
Os01g0858350遺䌝子、Os05g0445100遺䌝子、Os11g0151400遺䌝子、Os12g0150200遺䌝子、AT3G48520遺䌝子及びAT2G27690遺䌝子の各遺䌝子産物は、チトクロヌムP450酵玠ファミリヌであるCYP94ファミリヌに属しおいるず掚定されおいる。より具䜓的には、図の分子系統暹及びアラむメントに瀺すように、Os01g0858350, Os05g0445100、Os11g0151400、Os12g0150200の各遺䌝子は、AT2G27690によっおコヌドされるタンパク質であるシロむヌナズナのCYP94C1タンパク質及びそのむネOryza sativaのホモログオル゜ログであるず考えられる。たた、Os01g0858350、Os05g0445100、Os11g0151400、Os12g0150200は、互いにホモログパラログであるず考えられる。
図に瀺す分子系統暹及びアラむメントは、Os01g0858350遺䌝子、Os05g0445100遺䌝子、Os11g0151400遺䌝子、Os12g0150200遺䌝子がコヌドするタンパク質およびシロむヌナズナのCYP94C1(AT2g27690)のアミノ酞配列比范をCLUSTALWMultiple Sequence Alignmenthttp://www.genome.jp/tools/clustalw/)により行ったものである。
たた、AT3G48520がコヌドするタンパク質も、チトクロヌムP450酵玠ファミリヌであるCYP94ファミリヌに属すず掚定されおいる。
シロむヌナズナのCYP94C1タンパク質は、掻性型ゞャスモン酞、すなわち、7-む゜ゞャスモノむルむ゜ロむシンの12䜍の炭玠に氎酞基を導入しお、䞍掻性型ゞャスモン酞ずしお埗られた12-ヒドロキシ-7-む゜ゞャスモノむルむ゜ロむシンを酞化しお12-カルボキシル-7-む゜ゞャスモノむルむ゜ロむシンに倉換する掻性以䞋、ゞャスモン酞䞍掻性化掻性ずもいう。を有しおいるず考えられるHeitz, T., et al., 2012, J. Biol. Chem., 287: 6296-6306、Kitaoka, N., et al., 2011, Plant Cell Physiol., 52: 1757-1765、Koo, A.J., et al., 2011, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 108: 9298-9303。
たた、本発明者らは、Os12g0150200を増匷した圢質転換䜓においお、傷凊理によっお誘導されたゞャスモン酞及びその掻性型が枛少し、䞍掻性型が増倧するこずを確認しおいる。さらに、図に瀺すように、AT2G27690のアミノ酞配列ずOs01g0858350, Os05g0445100、Os11g0151400、Os12g0150200の各アミノ酞配列ずのアラむメントによれば、シロむヌナズナのCYP94C1タンパク質における基質結合サむトSRS、ヘム結合領域、ERRトラむアドサむト、酞玠結合サむト、及び掻性化サむトがいずれも保存されおいる。したがっお、これらの遺䌝子がコヌドするタンパク質もゞャスモン酞䞍掻性化掻性を有しおいるずいえる。
たた、シロむヌナズナのAT3G48520の産物も、ゞャスモン酞䞍掻性化掻性を有しおいるこずが既に知られおいる。
以䞊のこずから、第の遺䌝子は、いずれも、掻性型ゞャスモン酞を䞍掻性型ゞャスモン酞に倉換する掻性を有するタンパク質酵玠をコヌドするず考えられる。
なお、第の遺䌝子のうちのOs01g0858350遺䌝子、Os05g0445100遺䌝子、Os11g0151400遺䌝子、Os12g0150200遺䌝子の各コヌド領域の塩基配列は、AT2G27690遺䌝子のコヌド領域の塩基配列に察しお54〜58の同䞀性を有しおいる。たた、第の遺䌝子のうちのOs01g0858350遺䌝子, Os05g0445100遺䌝子、Os11g0151400遺䌝子、Os12g0150200遺䌝子の各コヌド領域の塩基配列によっおコヌドされるアミノ酞配列は、AT2G27690のコヌド領域の塩基配列によっおコヌドされるアミノ酞配列に察しお53〜57の同䞀性を有しおいる。
第の遺䌝子は、䞊蚘で特定された遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子も包含する。かかる機胜的に等䟡な遺䌝子は、䞊蚘で特定された遺䌝子のホモログパラログ、オル゜ログを含むほか、起源に䟝存するこずなく、ゞャスモン酞䞍掻性化掻性を有するタンパク質をコヌドする遺䌝子を包含するこずができる。第の遺䌝子は、䞻ずしお怍物界に由来するこずが奜たしい。ダむズなどのマメ科怍物を包含する双子葉怍物、むネ、トりモロコシ、サトりキビ等を含むむネ科怍物を包含する単子葉怍物に由来するものであっおもよい。
䟋えば、特定の遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子ずしおは、NCBINational Center for Biotechnology Informationhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov等のデヌタベヌスを甚いお圓該遺䌝子の塩基配列又は圓該遺䌝子がコヌドするタンパク質のアミノ酞配列をク゚リ配列ずしお怜玢を行い、高い同䞀性を有する遺䌝子に぀き、圓該遺䌝子ず機胜的に等䟡であるかどうか、䟋えば、本開瀺においおは、圓該遺䌝子が掻性型ゞャスモン酞を䞍掻性型ゞャスモン酞に倉換する掻性を有するタンパク質酵玠をコヌドしおいるか吊かを評䟡するこずによっお埗るこずができる。
第の遺䌝子は、圢質転換しようずする怍物䜓に応じお適宜遞択される。䟋えば、ダむズにおけるOs12g0150200遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子ずしおは、cytochrome P450 94A1-like [Glycine max]をコヌドする遺䌝子アクセッション番号、塩基配列XM_006592251.1配列番号、アミノ酞配列: XP_006592314.1配列番号、cytochrome P450 94A2-like [Glycine max]をコヌドする遺䌝子アクセッション番号、塩基配列XM_003538086.2配列番号、アミノ酞配列XP_003538134.1配列番号及びcytochrome P450 94A1-like [Glycine max]をコヌドする遺䌝子アクセッション番号、塩基配列XM_006577004.1配列番号、アミノ酞配列XP_006577067.1配列番号等が挙げられる。䞊蚘぀の遺䌝子は、それぞれOs12g0150200遺䌝子がコヌドするタンパク質のアミノ酞配列ずの同䞀性及びAT2G27690遺䌝子によっおコヌドされるタンパク質であるシロむヌナズナのCYP94C1タンパク質のアミノ酞配列ずの同䞀性が、それぞれ、56.863.4、57.859.9、53.857.8であった。
たた、䟋えば、トりモロコシにおいおOs12g0150200遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子ずしおは、機胜未知のタンパク質をコヌドする遺䌝子アクセッション番号、塩基配列BT086294.1配列番号、アミノ酞配列: ACR36647.1配列番号、cytochrome P450 CYP94C20をコヌドする遺䌝子アクセッション番号、塩基配列EU956091.1配列番号、アミノ酞配列ACG28209.1配列番号及びcytochrome P450 CYP94D27をコヌドする遺䌝子アクセッション番号、塩基配列EU975752.1配列番号、アミノ酞配列ACG47870.1配列番号等が挙げられる。䞊蚘぀の遺䌝子は、Os12g0150200遺䌝子がコヌドするタンパク質のアミノ酞配列ずの同䞀性及びAT2G27690によっおコヌドされるタンパク質であるシロむヌナズナのCYP94C1タンパク質のアミノ酞配列ずの同䞀性が、それぞれ、81.253.9、82.154.3、43.842.6であった。
第の遺䌝子は、䞊蚘のようなゞャスモン酞䞍掻性化掻性を有するタンパク質をコヌドする限り、倩然から調補されたものでも人工的に調補されたものでもよい。したがっお、䞊蚘した各皮遺䌝子ほか、圓該遺䌝子に人工的に倉異を導入したものであっおもよい。たた、遺䌝子ずしおは、ゲノムDNAのほか、cDNA等であっおもよい。
第の遺䌝子は、各遺䌝子のコヌド領域及び又は圓該コヌド領域によっおコヌドされるアミノ酞配列を有するタンパク質によっおも特定されうる。第の遺䌝子、及びそれにコヌドされるタンパク質に関する情報は、圓業者であれば、NCBINational Center for Biotechnology Informationhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov等のにアクセスするこずにより適宜入手できる。第の遺䌝子によっおコヌドされるタンパク質は、䞻ずしお怍物界に由来するこずが奜たしい。双子葉怍物、単子葉怍物に由来するものであっおもよいし、特に、むネ科怍物に由来するものであっおもよい。以䞋、第の遺䌝子がコヌドするタンパク質以䞋、第のタンパク質ずもいう。に぀いお説明する。
第のタンパク質の䞀態様ずしお、Os12g0150200遺䌝子がコヌドする配列番号で衚されるアミノ酞配列を含むタンパク質が挙げられる。たた、本タンパク質の他の態様は、ゞャスモン酞䞍掻性化掻性を有する限りにおいお、配列番号のほか、Os12g0150200遺䌝子のコヌド領域の塩基配列である配列番号、等の公知の配列情報ず䞀定の関係を有するタンパク質であっおもよい。
第のタンパク質の他の䞀態様ずしおは、配列番号で衚されるアミノ酞配列においおたたは耇数のアミノ酞が眮換、欠倱、付加、およびたたは挿入されたアミノ酞配列を有し、ゞャスモン酞䞍掻性化掻性を有するタンパク質が挙げられる。
配列番号で衚されるアミノ酞配列Os12g0150200は、図に瀺すような2箇所の基質認識郚䜍SRS121アミノ酞及びSRS420アミノ酞を有しおいる。
ゞャスモン酞䞍掻性化掻性は、掻性型ゞャスモン酞を基質ずしお、䞍掻性型ゞャスモン酞を生成する反応の觊媒掻性を怜出するこずで埗るこずができる。なお、ゞャスモン酞䞍掻性化掻性を有しおいるずは、圓該掻性を有しおいる限りのその皋床は問うものではない。
配列番号で衚されるアミノ酞配列に察するアミノ酞の倉異は、すなわち、欠倱、眮換、付加及び挿入のうちいずれか1皮類であっおもよいし、2皮類以䞊が組み合わされおいおもよい。たた、これらの倉異の総数は、特に限定されないが、奜たしくは、1個以䞊20個以䞋であり、より奜たしくは1個以䞊10個以䞋皋床である。より奜たしくは、1個以䞊5個以䞋である。さらに奜たしくは1個以䞊4個以䞋、より䞀局奜たしくは1個以䞊3個以䞋である。
アミノ酞眮換の䟋ずしおは、保存的眮換が奜たしく、具䜓的には以䞋のグルヌプ内での眮換が挙げられる。グリシン、アラニンバリン、む゜ロむシン、ロむシンアスパラギン酞、グルタミン酞アスパラギン、グルタミンセリン、トレオニンリゞン、アルギニンフェニルアラニン、チロシン。
なお、配列番号で衚されるアミノ酞配列に察する倉異は、配列番号で衚されるアミノ酞配列においお、基質識別郚䜍以倖においお存圚するこずが奜たしい。換蚀すれば、倉異䜓であっおも、2぀の基質識別郚䜍においおは、AT2G27690ず高い同䞀性を有しおいるこずが奜たしい。すなわち、図における各基質認識郚䜍においおアミノ酞配列の同䞀性は80以䞊であるこずが奜たしく、より奜たしくは85以䞊であり、さらに奜たしくは90以䞊であり、䞀局奜たしくは95以䞊である。たた、各基質認識郚䜍においおOs12g0150200及びAT2G27690ずの間においお、同䞀アミノ酞残基で瀺されるアミノ酞配列郚分SRS1に぀いお17アミノ酞、SRS4に぀いお18アミノ酞に぀いおは、1〜4個以䞋が保存的眮換によるアミノ酞であるこずが奜たしく、より奜たしくは1〜2個以䞋が保存的眮換によるアミノ酞であるこずが奜たしく、さらに奜たしくは党お同䞀である。
第のタンパク質の他の䞀態様ずしおは、配列番号で衚されるアミノ酞配列に察しお60以䞊の同䞀性を有するアミノ酞配列を有し、か぀ゞャスモン酞䞍掻性化掻性を有するタンパク質が挙げられる。同䞀性は奜たしくは70以䞊であり、より奜たしくは80以䞊であり、さらに奜たしくは85以䞊であり、䞀局奜たしくは、90䜍䞊であり、より䞀局奜たしくは95以䞊であり、さらに奜たしくは98以䞊である。
本明现曞においお同䞀性又は類䌌性ずは、圓該技術分野で知られおいるずおり、配列を比范するこずにより決定される、2以䞊のタンパク質あるいは2以䞊のポリヌクレオチドの間の関係である。圓該技術分野で"同䞀性"ずは、タンパク質たたはポリヌクレオチド配列の間のアラむメントによっお、あるいは堎合によっおは、䞀続きのそのような配列間のアラむメントによっお決定されるような、タンパク質たたはポリヌクレオチド配列の間の配列䞍倉性の皋床を意味する。たた、類䌌性ずは、タンパク質たたはポリヌクレオチド配列の間のアラむメントによっお、あるいは堎合によっおは、䞀続きの郚分的な配列間のアラむメントによっお決定されるような、タンパク質たたはポリヌクレオチド配列の間の盞関性の皋床を意味する。より具䜓的には、配列の同䞀性ず保存性配列䞭の特定アミノ酞又は配列における物理化孊特性を維持する眮換によっお決定される。なお、類䌌性は、埌述するBLASTの配列盞同性怜玢結果においおSimilarityず称される。同䞀性及び類䌌性を決定する方法は、察比する配列間で最も長くアラむンメントするように蚭蚈される方法であるこずが奜たしい。同䞀性及び類䌌性を決定するための方法は、公衆に利甚可胜なプログラムずしお提䟛されおいる。䟋えば、AltschulらによるBLAST (Basic Local Alignment Search Tool)プログラムたずえば、Altschul S.F., et al., 1990, J. Mol. Biol., 215: 403-410、Altschyl S.F., et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402)を利甚し決定するこずができる。BLASTのような゜フトりェアを甚いる堎合の条件は、特に限定するものではないが、デフォルト倀を甚いるのが奜たしい。
なお、配列番号で衚されるアミノ酞配列又は圓該アミノ酞配列ず䞊蚘のように䞀定の関連性のあるアミノ酞配列をコヌドする塩基配列は、遺䌝暗号の瞮重に埓い、タンパク質のアミノ酞配列を倉えるこずなく所定のアミノ酞配列をコヌドする塩基配列の少なくずも぀の塩基を他の皮類の塩基に眮換するこずができる。埓っお、本遺䌝子は、遺䌝暗号の瞮重に基づく眮換によっお倉換された塩基配列をコヌドする遺䌝子も包含する。
第のタンパク質は、たた、配列番号で衚される塩基配列を含むポリヌクレオチドによっおコヌドされるタンパク質でもある。さらに他の䞀態様ずしお、配列番号で衚される塩基配列からなるポリヌクレオチドず盞補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドずストリンゞェントな条件でハむブリダむズするポリヌクレオチドによっおコヌドされ、ゞャスモン酞䞍掻性化掻性を有するタンパク質が挙げられる。
なお、ストリンゞェントな条件ずは、たずえば、いわゆる特異的なハむブリッドが圢成され、非特異的なハむブリッドが圢成されない条件をいう。䟋えば、塩基配列の同䞀性が高い栞酞、すなわち配列番号で衚わされる塩基配列ず60以䞊、奜たしくは70以䞊、より奜たしくは80以䞊、䞀局奜たしくは85以䞊、より䞀局奜たしくは90以䞊、さらに奜たしく95以䞊、最も奜たしくは98以䞊の同䞀性を有する塩基配列からなるDNAの盞補鎖がハむブリダむズし、それより盞同性が䜎い栞酞の盞補鎖がハむブリダむズしない条件が挙げられる。より具䜓的には、ナトリりム塩濃床が15〜750mM、奜たしくは50〜750mM、より奜たしくは300〜750mM、枩床が25〜70℃、奜たしくは50〜70℃、より奜たしくは55〜65℃、ホルムアミド濃床が0〜50、奜たしくは20〜50、より奜たしくは35〜45での条件をいう。さらに、ストリンゞェントな条件では、ハむブリダむれヌション埌のフィルタヌの掗浄条件が、通垞はナトリりム塩濃床が15〜600mM、奜たしくは50〜600、より奜たしくは300〜600mM、枩床が50〜70℃、奜たしくは55〜70℃、より奜たしくは60〜65℃である。
さらに具䜓的なストリンゞェントな条件ずは、䟋えば、45℃、6×SSC塩化ナトリりムク゚ン酞ナトリりムでのハむブリダむれヌション、その埌の50〜65℃、0.2〜1×SSC、0.1SDSでの掗浄が挙げられ、あるいはそのような条件ずしお、65〜70℃、1×SSCでのハむブリダむれヌション、その埌の65〜70℃、0.3×SSCでの掗浄を挙げるこずができる。ハむブリダむれヌションは、J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 10 Skyline Drive Plainview, NY (1989)に蚘茉されおいる方法等、埓来公知の方法で行うこずができる。
なお、以䞊のこずから、さらなる他の䞀態様ずしお、配列番号で衚される塩基配列ず70以䞊、奜たしくは80以䞊、より奜たしくは85以䞊、より䞀局奜たしくは90以䞊、さらに奜たしく95以䞊、最も奜たしくは98以䞊の同䞀性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドによっおコヌドされ、ゞャスモン酞䞍掻性化掻性を有するタンパク質が挙げられる。
さらに、他の第の遺䌝子、すなわち、Os05g0445100遺䌝子、Os11g0151400遺䌝子、Os01g0858350遺䌝子、AT3G48520遺䌝子及びAT2G27690遺䌝子等に぀いおも、Os12g0150200に぀いお説明したのず同様の圢態の第のタンパク質の各皮態様が適甚され、それにより、第の遺䌝子のさらなる態様が特定される。Os05g0445100遺䌝子、Os11g0151400遺䌝子、Os01g0858350遺䌝子、AT3G48520遺䌝子及びAT2G27690遺䌝子の各遺䌝子のコヌド領域の塩基配列及びアミノ酞配列は、それぞれ、配列番号及び、配列番号及び配列番号及び、配列番号及び䞊びに配列番号及びで衚される。
䞊蚘各皮態様の第のタンパク質をコヌドする第の遺䌝子は、䟋えば、配列番号等の配列に基づいお蚭蚈したプラむマヌを甚いお、むネ科怍物等から抜出したDNA、各皮cDNAラむブラリ又はゲノムDNAラむブラリ等由来の栞酞を鋳型ずしたPCR増幅を行うこずにより、栞酞断片ずしお埗るこずができる。たた、䞊蚘ラむブラリ等由来の栞酞を鋳型ずし、本遺䌝子の䞀郚であるDNA断片をプロヌブずしおハむブリダむれヌションを行うこずにより、栞酞断片ずしお埗るこずができる。あるいは本遺䌝子は、化孊合成法等の圓技術分野で公知の各皮の栞酞配列合成法によっお、栞酞断片ずしお合成しおもよい。
たた、䞊蚘各皮態様の第のタンパク質をコヌドする第の遺䌝子は、䟋えば、配列番号で衚されるアミノ酞の配列をコヌドするDNAたずえば、配列番号で衚される塩基配列からなるを、慣甚の突然倉異誘発法、郚䜍特異的倉異法、゚ラヌプロヌンPCRを甚いた分子進化的手法等によっお改倉するこずによっお取埗するこずができる。このような手法ずしおは、Kunkel法又は Gapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法が挙げられ、䟋えば郚䜍特異的突然倉異誘発法を利甚した倉異導入甚キット䟋えばMutant-K (TAKARA Bio瀟補)やMutant-G (TAKARA Bio瀟補)などを甚いお、あるいは、TAKARA Bio瀟のLA PCR in vitro Mutagenesis シリヌズキットを甚いお倉異が導入される。
そのほか、圓業者であれば、前述したSambrook J.らのMolecular Cloning 1989等を参照するこずにより、䟋えば、配列番号又は等の公知配列に基づいお、各皮態様の第のタンパク質をコヌドする第の遺䌝子を取埗するこずができる。
第の遺䌝子サブグルヌプ及び構成遺䌝子第の遺䌝子
第の遺䌝子は、Os04g0584800遺䌝子及びこの遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子からなる第の遺䌝子サブグルヌプから遞択されうる。Os04g0584800遺䌝子がコヌドするタンパク質の機胜は䞍明であるが、末端偎にRAS/GTP結合ドメむンを有し末端偎にAdaptin結合ドメむン配列番号を備えるタンパク質である。Os04g0584800遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子は、末端偎にRAS/GTP結合ドメむンを有し、末端偎にAdaptin結合ドメむンを備えるタンパク質であっお、Os04g0584800遺䌝子のアミノ酞配列ず䞀定以䞊の同䞀性を有するタンパク質をコヌドする遺䌝子が挙げられる。
なお、䞊蚘したホモログほか、人工的に倉異を導入したものであっおもよい。なお、遺䌝子ずしおは、ゲノムDNAのほか、cDNA等であっおもよい。
Os04g0584800遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子ずは、圓該遺䌝子の発珟を増匷したずきに、怍物䜓の塩ストレスに察する耐性を増匷するこずができる遺䌝子である。換蚀すれば、圓該遺䌝子の発珟を増匷したずき、怍物䜓の塩ストレスに察する耐性を増匷する掻性を有するタンパク質をコヌドする遺䌝子である。
Os04g0584800遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子ずしおは、䟋えば、シロむヌナズナAT5G65960遺䌝子、ペヌロッパブドりのLOC100266179遺䌝子、ポプラの1皮であるコットンりッドのPOPTR_0002s17770g遺䌝子、ダむズのLOC100813911 [Glycine max]遺䌝子が挙げられる。さらに、オオムギのpredicted protein [Hordeum vulgare subsp. vulgare]をコヌドする遺䌝子が挙げられる。
第の遺䌝子であるオオムギpredicted proteinをコヌドする遺䌝子のコヌド領域の塩基配列は、Os04g0584800のコヌド領域の塩基配列に察しお83の同䞀性を有しおいる。単子葉怍物にはこのように高い同䞀性をも぀塩基配列があるが、それ以倖の怍物皮の遺䌝子は、Os04g0584800のコヌド領域の塩基配列に察しお57-64の同䞀性を瀺す。たた、これらの遺䌝子が含むコヌド領域の塩基配列によっおコヌドされるアミノ酞配列は、Os04g0584800のコヌド領域の塩基配列によっおコヌドされるアミノ酞配列に察しお48〜77の同䞀性を有しおいる。
第の遺䌝子は、第の遺䌝子ず同様、各遺䌝子のコヌド領域及び又は圓該コヌド領域によっおコヌドされるアミノ酞配列を有するタンパク質によっお特定されうる。第の遺䌝子は、怍物䜓においお増匷されたずき、塩ストレスに察する耐性を増匷する掻性を有するタンパク質をコヌドする限り、倩然から調補されたものでも人工的に調補されたものでもよい。
第の遺䌝子ずしおは、Os04g0584800の遺䌝子のコヌド領域の塩基配列及びタンパク質のアミノ酞配列は、それぞれ、配列番号NM_001060207及び配列番号NP_001053672で衚される。同様に、シロむヌナズナのAT5G65960はそれぞれ配列番号、NM_125993、NP_569023、ペヌロッパブドりのLOC100266179は、それぞれ配列番号、XP_002276437、XM_002276401、ポプラの1皮であるコットンりッドの POPTR_0002s17770gはそれぞれ配列番号、XP_002302663、XM_002302627、オオムギのpredicted protein [Hordeum vulgare subsp. vulgare]をコヌドする遺䌝子は、それぞれ配列番号、BAJ96675、AK365472で衚され、ダむズのLOC100813911 [Glycine max]は、それぞれ配列番号XP_003534231、XM_003534183で衚される。
第の遺䌝子は、第の遺䌝子においお説明した各皮態様を、第の遺䌝子がコヌドするタンパク質に応じお採るこずができる。
なお、本明现曞における「怍物䜓においお増匷されたずき、塩ストレスに察する耐性を増匷する掻性」ずは、䟋えば、実斜䟋に開瀺されるように野生型怍物に察しお第の遺䌝子を増匷したずきにおいお、少なくずも塩ストレスに察する耐性が野生型怍物よりも増匷する掻性をいう。ここで野生型怍物は、兞型的には、O. sativaの日本晎ずするこずができる。第の遺䌝子は、アグロバクテリりム経由で怍物に導入しお発珟を増匷するこずができる。第及び第の遺䌝子の発珟を制埡するプロモヌタヌは、恒垞的発珟プロモヌタヌを甚いるこずが奜たしい。なお、第の遺䌝子に぀いおは、必芁に応じお発珟レベルが適切に調節されるこずが奜たしい。さらに、塩ストレスに察する耐性は、兞型的には、実甚レベルでの評䟡ずしお実斜䟋に開瀺される評䟡手法を甚いお評䟡するこずができる。
䟋えば、Os12g0150200遺䌝子など第の遺䌝子に぀いおは、その怍物䜓の野生型䟋えば、むネなら日本晎が盞圓する。における発珟量の5倍以䞊150倍以䞋の発珟レベルずするこずができる。かかる発珟レベルは10倍以䞊であっおもよいし、20倍以䞊であっおもよいし、30倍以䞊であっおもよい。たた、かかる発珟レベルは、100倍以䞋であっおもよいし、80倍以䞋であっおもよいし、70倍以䞋であっおもよいし、60倍以䞋であっおもよいし、50倍以䞋であっおもよい。発珟レベルは、公知の手法、䟋えば、第の遺䌝子の発珟産物であるmRNA量等で評䟡するこずができる。
たた、第の遺䌝子によっおコヌドされるタンパク質は、第の遺䌝子ず同様、䞻ずしお怍物界に由来するこずが奜たしい。双子葉怍物、単子葉怍物に由来するものであっおもよいし、特に、むネ科怍物に由来するものであっおもよい。こうした遺䌝子及びタンパク質に関する情報は、圓業者であれば、NCBINational Center for Biotechnology Informationhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov等のHPにアクセスするこずにより適宜入手できる。
怍物䜓に環境ストレス耐性を付䞎又は増匷するには、これら第の遺䌝子及び又は第の遺䌝子を甚いればよい。第の遺䌝子のみであっおもよいし、第の遺䌝子のみであっおもよい。第の遺䌝子は又は以䞊甚いるこずができるし、第の遺䌝子も又は以䞊甚いるこずができる。
第の遺䌝子は、塩ストレスに察する良奜な耐性を付䞎するこずができる以䞋、ストレス耐性の良吊は日本型むネであるO. sativaの日本晎の野生型を察照ずしお説明しおいる。。特に、第の遺䌝子は、塩ストレスに察する高い耐性を付䞎するこずができる。したがっお、高床な塩ストレスが予枬される怍物䜓には、第の遺䌝子を適甚するこずが奜たしい。さらに、第の遺䌝子は、高枩ストレスに察する良奜な耐性を付䞎するこずができる。したがっお、第の遺䌝子は、塩ストレスず高枩ストレスずの双方のストレスが予枬される環境䞋にある怍物䜓に適甚するこずが奜たしい。
䞀方、第の遺䌝子は、塩ストレスに察する良奜な耐性を付䞎するこずができる。たた、さらに、第の遺䌝子は、むオンストレスに察する良奜な耐性も付䞎するこずができる。したがっお、第の遺䌝子は、塩ストレスずむオンストレスずが予枬される怍物䜓に適甚するこずが奜たしい。さらにたた、第の遺䌝子は、高枩ストレス及び又は高浞透圧ストレスに察しおも良奜な耐性を付䞎するこずができる。したがっお、第の遺䌝子は、塩ストレス及び又はむオンストレスのほか、高枩ストレス及び又は高浞透圧ストレスが予枬される環境䞋の怍物䜓に適甚するこずが奜たしい。
なお、本明现曞においお、塩ストレスは、囜際むネ研究所IRRIの耐塩性詊隓ず同様の塩氎ストレス耐性詊隓閉鎖系枩宀で評䟡される塩ストレスをいう。すなわち、Thomson M. L., et al., 2010, Characterizing the Saltol Quantitative Trait Locus for Salinity Tolerance in Rice. Rice 3: 148-160の蚘茉に基づいお、以䞋の氎耕栜培詊隓を行い、評䟡される塩ストレスをいう。発芜した幌怍物䜓を網付きフロヌトに浮かべお3日間玔氎で育おた埌、さらにYoshida培地で氎耕栜培する。氎耕培地の電気䌝導床(EC) は最初の3日間は6 dS m-1に調敎し、その埌はNaClを溶解させるこずで12 dS m-1に合わせる。この際、培地のECおよびpHは2〜3日ごずに氎やNaOHを添加するこずで調敎する。2週間埌、塩ストレスによっお匕き起こされた城候を䞊述のThomsonら2010の評䟡スコアを甚いお評䟡する。
なお、本明现曞においお、高浞透圧ストレスは、玔氎で3日間、Yoshida培地で15日間氎耕栜培した怍物䜓を、26ポリ゚チレングリコヌルPEG4000を含んだ培地に7日間及びPEG4000を含たない培地に4日間おいた堎合の生存率同条件䞋での野生型の生存率ず察比しおもよい。で評䟡するこずができる。
本明现曞においお、高枩ストレスは、玔氎で3日間、さらにYoshida培地で17日間、28℃で氎耕栜培した怍物䜓を、42℃に7日間、28℃に戻しお7日間おいた堎合の生存率同条件䞋での野生型の生存率ず察比しおもよい。で評䟡するこずができる。
本明现曞においお、むオンストレスは、MurashigeずSkoogMS培地にお7日間生育させた怍物䜓の地䞊郚4 cm長を切り出し、40 mM LiClを含むMS培地に移怍し、2週間生育させたずきの生存率同条件䞋での野生型の生存率ず察比しおもよい。で評䟡するこずができる。
第の遺䌝子及び第の遺䌝子は、怍物䜓においおその発珟を増匷するこずで、いずれも、塩ストレスに耐性を付䞎できるほか、さらなる環境ストレスに耐性を付䞎するこずができる。
発珟ベクタヌ
本明现曞の開瀺の発珟ベクタヌは、怍物现胞内で第の遺䌝子及び又は第の遺䌝子の発珟させるための発珟ベクタヌずするこずができる。本開瀺のベクタヌは、第の遺䌝子及び又は第の遺䌝子を備えるこずができる。本ベクタヌは、宿䞻现胞怍物现胞内の染色䜓䞊の内圚性の本遺䌝子の有無に関わらず、本遺䌝子を倖来性DNAずしお導入しお、結果ずしお、本遺䌝子の発珟を増匷するこずを意図するこずができる。なお、本ベクタヌが、盞同組換え等により、怍物现胞内の染色䜓䞊の内圚性の本遺䌝子の発珟を増匷するように意図されるこずを排陀するものではない。
怍物现胞ずしおは特に制限はなく、䟋えば、シロむヌナズナ、ダむズ、むネ、トりモロコシ、ゞャガむモ、タバコなどの现胞が挙げられるが、奜たしくは、単子葉怍物であり、さらに奜たしくはむネ科怍物である。むネ科怍物ずしおは、むネ、コムギ、オオムギ、トりモロコシ、゜ルガム、サトりキビ等が挙げられる。たた、怍物现胞には、懞濁培逊现胞等の培逊现胞の他、プロトプラスト、カルスも含たれる。たた、怍物现胞には、苗条原基、倚芜䜓、毛状根などのほか、葉の切片等の怍物䜓䞭の现胞も含たれる。
本ベクタヌが、怍物现胞に、倖来性DNAずしお本遺䌝子を導入し発珟させるこずを意図するずき、怍物现胞で転写可胜なプロモヌタヌず圓該プロモヌタヌの制埡䞋に䜜動可胜に連結された本遺䌝子ずを備えるこずができる。さらに、ポリ付加シグナルを含むタヌミネヌタヌを含めるこずもできる。こうしたプロモヌタヌずしおは、䟋えば、本遺䌝子を恒垞的たたは誘導的に発珟させるためのプロモヌタヌが挙げられる。恒垞的に発珟させるためのプロモヌタヌずしおは、䟋えば、カリフラワヌモザむクりむルスの35S RNAのプロモヌタヌOdell, et al., 1985, Nature, 313:810、むネのアクチン1遺䌝子のプロモヌタヌZhang, et al., 1991, Plant Cell, 3:1155、トりモロコシのポリナビキチン1遺䌝子のプロモヌタヌCornejo, et al., 1993, Plant Mol. Biol., 23:567などが挙げられる。たた、本遺䌝子を誘導的に発珟させるためのプロモヌタヌずしおは、䟋えば糞状菌・现菌・りむルスの感染や䟵入、䜎枩、高枩、也燥、玫倖線の照射、特定の化合物の散垃などの倖因によっお発珟するこずが知られおいる遺䌝子のプロモヌタヌなどが挙げられる。このようなプロモヌタヌずしおは、䟋えば、むネキチナヌれ遺䌝子のプロモヌタヌXu, et al., 1996, Plant Mol. Biol., 30: 387やタバコのPRタンパク質遺䌝子のプロモヌタヌOhshima, et al., 1990, Plant Cell, 2:95、むネの「lip19」遺䌝子のプロモヌタヌAguan, et al., 1993, Mol. Gen. Genet., 240:1、むネの「hsp80」遺䌝子ず「hsp72」遺䌝子のプロモヌタヌVan Breusegem et al., 1994, Planta, 193:57、シロむヌナズナの「rab16」遺䌝子のプロモヌタヌMundy, et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:1406、パセリのカルコン合成酵玠遺䌝子のプロモヌタヌSchulze-Lefert, et al., 1989, EMBO J., 8:651、トりモロコシのアルコヌルデヒドロゲナヌれ遺䌝子のプロモヌタヌWalker, et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:6624などが挙げられる。
本ベクタヌは、たた、第のタンパク質及び又は第のタンパク質を組換えタンパク質ずしお、倧腞菌、酵母、動怍物现胞、昆虫现胞等の现胞の宿䞻现胞に生産させるこずを意図するものであっおもよい。この堎合には、本ベクタヌは、適圓な宿䞻现胞で䜜動可胜なプロモヌタヌの制埡䞋に本遺䌝子を備えるこずができる。
本ベクタヌは、圓業者であれば、䟋えば、圓業者に公知の各皮プラスミドなど商業的に入手可胜な材料を利甚しお構築するこずができる。䟋えば、プラスミド「pBI121」、「pBI221」、「pBI101」いずれもClontech瀟補などのほか、圢質転換怍物䜓䜜補のために怍物现胞内で本遺䌝子を発珟させるベクタヌを甚いお構築するこずができる。
本明现曞の開瀺によれば、こうした発珟ベクタヌが導入された怍物现胞等の宿䞻现胞も提䟛される。たた、第の遺䌝子及び又は第の遺䌝子を有効成分ずする、怍物䜓の環境ストレス耐性を改善する薬剀も提䟛されうる。本薬剀においおは、第の遺䌝子及び又は第の遺䌝子ずしお本ベクタヌを有効成分ずしお含んでいおもよい。
怍物䜓
本明现曞に開瀺される怍物䜓は、圢質転換怍物䜓ほか亀配や突然倉異による怍物䜓が包含される。本明现曞に開瀺される怍物䜓は、第の遺䌝子及び又は第の遺䌝子の発珟が増匷されおいる。圢質転換怍物䜓においお、増匷される第の遺䌝子及び又は第の遺䌝子は、怍物䜓の圢態によっおも異なるが、怍物䜓に内圚する遺䌝子であっおもよいし、倖来性の遺䌝子であっおもよい。これらの双方であっおもよい。
たた、遺䌝子の発珟が増匷されおいる、ずは、遺䌝子の発珟量遺䌝子の䞀次転写産物の量ほか、遺䌝子がコヌドするタンパク質の生産量が圢質転換前よりも増倧しおいるか、あるいは圓該タンパク質の掻性が圢質転換前よりも増倧しおいるこずを意味しおいる。遺䌝子の発珟の増匷の結果、遺䌝子の発珟量が増倧するずずもに本タンパク質の掻性自䜓が増倧しおいおもよい。なお、これらの遺䌝子の発珟量は、公知の方法、すなわち、これら遺䌝子の転写産物又は翻蚳産物の量を指暙ずしお評䟡するこずができる。
圢質転換怍物䜓
本明现曞に開瀺される圢質転換怍物䜓は、第の遺䌝子及び又は第の遺䌝子の発珟が増匷されおいる。圢質転換怍物䜓においお、増匷される第の遺䌝子及び又は第の遺䌝子は、怍物䜓に内圚する遺䌝子であっおもよいし、倖来性の遺䌝子であっおもよい。これらの双方であっおもよい。
たた、圢質転換怍物䜓においお遺䌝子の発珟が増匷されおいる態様は、特に限定されない。䟋えば、怍物现胞で䜜動可胜なプロモヌタヌず圓該プロモヌタヌによっお䜜動可胜に結合された本遺䌝子ずが、倖来性DNAずしお、怍物现胞の染色䜓又は染色䜓倖に保持される態様が挙げられる。プロモヌタヌに連結される遺䌝子は、怍物现胞に内圚性のものであっおも倖来のものであっおもよい。なお、内圚性の本遺䌝子のプロモヌタヌの掻性を向䞊させるために、染色䜓䞊のそのプロモヌタヌ領域の党䜓又はその䞀郚を眮換等する態様、内圚性遺䌝子ずずもにプロモヌタヌ領域を眮換する態様も挙げられる。
圢質転換怍物䜓は、兞型的には、怍物现胞に遺䌝子を導入し発珟させるこずを意図する本明现曞に開瀺のベクタヌが導入された怍物现胞を含んでいる。
本圢質転換怍物䜓は、本明现曞の開瀺のベクタヌを導入しお圢質転換した怍物现胞から怍物䜓を再生させるこずにより埗るこずができる。
怍物现胞ぞのベクタヌの導入は、ポリ゚チレングリコヌル法、電気穿孔法゚レクトロポヌレヌション、アグロバクテリりムを介する方法、パヌティクルガン法など圓業者に公知の皮々の方法を甚いるこずができる。䟋えば、ポリ゚チレングリコヌルによるプロトプラストぞ遺䌝子導入Datta, S.K., 1995, In Gene Transfer To Plants (Potrykus, I. and Spangenberg, G. Eds.) pp66-74、電気パルスによるプロトプラストぞ遺䌝子導入Toki, et al., 1992, Plant Physiol., 100: 1503-1507、パヌティクルガン法により现胞ぞ遺䌝子を盎接導入Christou, et al., 1991, Bio/Technology, 9: 957-962およびアグロバクテリりムを介しお遺䌝子を導入Hiei, et al., 1994, Plant J., 6: 271-282; Toki, et al., 2006, Plant J., 47: 969-976等の各皮方法が挙げられる。たた、怍物圢質転換现胞からの怍物䜓の再生は、怍物现胞の皮類に応じお圓業者に公知の方法で行うこずが可胜であるToki, et al., 1992, Plant Physiol., 100: 1503-1507参照。䟋えば、むネであればFujimuraらPlant Tissue Culture Lett., 2:74の方法が挙げられ、トりモロコシであればShillitoら1989, Bio/Technology, 7:581の方法やGorden-Kammら1990, Plant Cell, 2:603が挙げられ、ゞャガむモであればVisserら1989, Theor. Appl. Genet., 78:594の方法が挙げられ、タバコであればNagataずTakebe1971, Planta, 99:12の方法が挙げられ、シロむヌナズナであればAkamaら1992, Plant Cell Rep., 12:7-11の方法が挙げられる。
圢質転換怍物现胞からの怍物䜓の再生は、怍物现胞の皮類に応じお圓業者に公知の方法で行うこずが可胜であるToki, et al., 1992, Plant Physiol., 100: 1503-1507参照。䟋えば、むネの圢質転換怍物䜓を䜜出する手法は、ポリ゚チレングリコヌルPEGによりプロトプラストぞ遺䌝子導入し、怍物䜓むンド型むネ品皮が適しおいるを再生させる方法Datta, S.K., 1995, In Gene Transfer To Plants (Potrykus, I. and Spangenberg, G. Eds.) pp66-74、電気パルスによりプロトプラストぞ遺䌝子導入し、怍物䜓日本型むネ品皮が適しおいるを再生させる方法Toki, et al., 1992, Plant Physiol., 100: 1503-1507、パヌティクルガン法により现胞ぞ遺䌝子を盎接導入し、怍物䜓を再生させる方法Christou, et al., 1991, Bio/technology, 9: 957-962およびアグロバクテリりムを介しお遺䌝子を導入し、怍物䜓を再生させる方法Hiei, et al., 1994, Plant J., 6: 271-282; Toki, et al., 2006, Plant J., 47: 969-976など、いく぀かの技術が既に確立し、本願発明の技術分野においお広く甚いられおいる。本発明においおは、これらの方法を奜適に甚いるこずができる。
ゲノム䞊に本遺䌝子が組み蟌たれた圢質転換怍物䜓が埗られれば、該怍物䜓から有性生殖たたは無性生殖により子孫を埗るこずが可胜である。たた、該怍物䜓やその子孫あるいはクロヌンから繁殖材料䟋えば、皮子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等を埗お、それらを基に該怍物䜓を量産するこずも可胜である。本明现曞の開瀺には、既に説明した本遺䌝子が導入された怍物现胞、該现胞を含む怍物䜓のほか、該怍物䜓の子孫およびクロヌン、䞊びに該怍物䜓、その子孫、およびクロヌンの繁殖材料が含たれる。
なお、圢質転換にあたっおは甚いる第の遺䌝子及び第のの遺䌝子は、皮々の由来ずするこずができ、圢質転換察象怍物䜓ず同皮の怍物䜓に由来するこずを限定するものではく、分類を超えた適甚も可胜である。しかしながら、察象怍物䜓が単子葉怍物の堎合には、単子葉怍物由来の遺䌝子が奜たしく、より奜たしくは同科、同皮由来の遺䌝子である。たた、双子葉怍物の堎合にも同様である。
亀配や突然倉異による怍物䜓
本明现曞に開瀺される怍物䜓の他の圢態は、亀配や突然倉異による怍物䜓である。亀配による怍物䜓は、第の遺䌝子及び又は第の遺䌝子を、これら遺䌝子の本来的な染色䜓䞊の遺䌝子座又は圓該遺䌝子座に盞圓する䜍眮に保持しうる。ここで遺䌝子の本来的な染色䜓䞊の遺䌝子座ずは、怍物䜓が本遺䌝子又はそのホモログを本来的に有する堎合においお、その遺䌝子が座乗する染色䜓䞊の遺䌝子座である。たた、本来的な染色䜓䞊の遺䌝子座に盞圓する䜍眮ずは、遺䌝子座に完党に䞀臎はしないが、圓該遺䌝子の前埌の塩基配列から、遺䌝子座の近傍に、第のの本遺䌝子の発珟増倧掻性を劚げるこずなく䜍眮されおいる堎合が該圓する。こうした怍物䜓は、予め、内圚性の本遺䌝子を染色䜓䞊に備える怍物䜓であるこずが奜たしい。
抂しお、亀配や突然倉異によっお、第の遺䌝子及び又は第の遺䌝子の発珟が増匷された怍物䜓は、亀配や突然倉異などの育皮プロセスにおいお、第の遺䌝子及び又は第の遺䌝子における、突然倉異による倚型等の倉異や、コヌド領域や制埡領域の゚ピゞェネティックな倉異メチル化を含む等により取埗するこずができる。又は、そうした芪怍物本明现曞に開瀺された圢質転換䜓であっおもよい。を甚いるこずで埗るこずができる。
第の遺䌝子及び又は第の遺䌝子の発珟が増匷された怍物䜓は、第の遺䌝子及び又は第の遺䌝子の発珟レベルを指暙ずしお通垞の育皮プロセスからスクリヌニングし、さらに環境ストレス耐性を評䟡するこずで取埗できる。育皮プロセスにおいお、怍物䜓が、第の遺䌝子及び又は第の遺䌝子を備えおいるかどうかは、これらを含むDNA領域に察するPCRを行っお増幅産物の有無や、その長さ等を怜出するこずにより確認するこずができる。たた、こうしたDNA領域が、その遺䌝子座に存圚するかどうかは、公知の塩基配列決定法により確認できる。
䟋えば、亀配によれば、䟋えば、第の遺䌝子及び又は第の遺䌝子の発珟が増匷されおいる芪怍物䜓ず他の怍物䜓ずの受粟時の盞同組換えにより、遺䌝子の本来的な染色䜓䞊の䜍眮又は圓該䜍眮に盞圓する䜍眮に、これら遺䌝子を保持するF1䞖代を埗るこずができる。F2䞖代や、戻し亀配等を利甚するこずにより、第の遺䌝子及び又は第の遺䌝子のアリル察立遺䌝子に関しホモ䜓を埗るこずができる。なお、怍物䜓は、第及び又は第の遺䌝子に関し、本DNA領域を含むアリルに関しヘテロであっおもよいが、ホモであるこずが奜たしい。
本明现曞に開瀺の第の遺䌝子及び又は第の遺䌝子を適甚する怍物䜓、換蚀するず環境ストレス耐性を向䞊させる怍物ずしおは、特に限定されない。すなわち、䞊蚘遺䌝子の発珟を増匷させるこずによっお、あらゆる怍物䜓に぀いお環境ストレス耐性向䞊効果を期埅するこずができる。察象ずなる怍物ずしおは、䟋えば、双子葉怍物、単子葉怍物、䟋えばアブラナ科、むネ科、ナス科、マメ科、ダナギ科等に属する怍物䞋蚘参照が挙げられるが、これらの怍物に限定されるものではない。
アブラナ科シロむヌナズナArabidopsis thaliana、アブラナBrassica rapa、Brassica napus、Brassica campestris、キャベツBrassica oleracea var. capitata、ハクサむBrassica rapa var. pekinensis、チンゲンサむ、パクチョむBrassica rapa var. chinensis、カブBrassica rapa var. rapa、ノザワナBrassica rapa var. hakabura、ミズナBrassica rapa var. lancinifolia、コマツナBrassica rapavar. peruviridis、ダむコンRaphanus sativus、ワサビWasabia japonicaなど。ナス科タバコNicotiana tabacum、ナスSolanum melongena、ゞャガむモSolaneum tuberosum、トマトSolanum lycopersicum、トりガラシCapsicum annuum、ペチュニアPetunia hybridaなど。マメ科ダむズ(Glycine max)、゚ンドりPisum sativum、゜ラマメVicia faba、フゞWisteria floribunda、ラッカセむArachis hypogaea、ミダコグサLotus corniculatus var. japonicus、むンゲンマメPhaseolus vulgaris、アズキVigna angularis、アカシアAcaciaなど。キク科キクChrysanthemum morifolium、ヒマワリHelianthus annuusなど。ダシ科アブラダシElaeis guineensis、Elaeis oleifera、ココダシCocos nucifera、ナツメダシPhoenix dactylifera、ロりダシCoperniciaなど。りルシ科ハれノキRhus succedanea、カシュヌナットノキAnacardium occidentale、りルシToxicodendron vernicifluum、マンゎヌMangifera indica、ピスタチオPistacia veraなど。りリ科カボチャCucurbita maxima、Cucurbita moschata、Cucurbita pepo、キュりリCucumis sativus、カラスりリTrichosanthes cucumeroides、ヒョりタンLagenaria siceraria var. gourdaなど。バラ科アヌモンドAmygdalus communis、バラRosa、むチゎFragaria、サクラPrunus、リンゎMalus pumila var. domesticaなど。
ナデシコ科カヌネヌションDianthus caryophyllusなど。ダナギ科ポプラPopulus trichocarpa、Populus nigra、Populus tremulaなど。むネ科トりモロコシZea mays、むネOryza sativa、オオムギHordeum vulgare、コムギTriticum aestivum、タケPhyllostachys、サトりキビSaccharum officinarum、ネピアグラスPennisetum purpureum、゚リアンサスErianthus ravennae、ミスキャンタスススキMiscanthus virgatum、゜ルガムSorghum、スむッチグラスPanicumなど。ナリ科チュヌリップTulipa、ナリLiliumなど。
なかでも、むネ科、マメ科などの食甚䜜物を察象ずするこずが奜たしい。こうした食甚䜜物が気候倉動の圱響を受けずに安定しお栜培、収穫できるこずによっお、安定した食糧䟛絊が可胜ずなる。たた、サトりキビやトりモロコシ、ナタネ、ヒマワリ等のバむオ燃料の原料ずなりうる゚ネルギヌ䜜物を察象ずするこずも奜たしい。゚ネルギヌ䜜物の環境ストレス耐性を向䞊させるこずによっお、圓該゚ネルギヌ䜜物の栜培範囲や栜培条件を倧幅に拡匵するこずができる。すなわち、野生型では栜培が䞍可胜であった土地や環境芁因䞋䟋えば平均気枩や、土壌に含たれる塩濃床等においおも、゚ネルギヌ䜜物を栜培するこずが可胜ずなり、バむオ゚タノヌル、バむオディヌれル、バむオメタノヌル、バむオDME、バむオGTL(BTL)及びバむオブタノヌル等のバむオ燃料の䜎コスト化を実珟できるからである。
以䞊説明したように、本明现曞に開瀺される怍物䜓は、人工的な遺䌝子改倉の他、埓来の亀配による育皮によっおも取埗できる。本明现曞に開瀺される怍物䜓は、又は以䞊の環境ストレス耐性が向䞊し、より実甚的なレベルで環境ストレスに耐性を備えたものずなっおいる。
怍物䜓ぞの環境ストレス耐性の付䞎方法及び怍物䜓の生産方法
本明现曞に開瀺される怍物䜓ぞの環境ストレス耐性の付䞎方法及び環境ストレス耐性が付䞎された怍物䜓の生産方法は、第の遺䌝子及び又は第の遺䌝子であっお内圚性又は倖来の遺䌝子を増匷する工皋を備えるこずができる。この増匷工皋は、既述のように、察象怍物䜓に察する圢質転換及び又は亀配や突然倉異などの育皮プロセスを組み合わせるこず実斜できる。特に、亀配による怍物䜓の生産にあたっおは、第の遺䌝子及び又は第の遺䌝子の発珟を指暙ずしお亀配による怍物䜓を遞抜する工皋を備えるこずが奜たしい。各皮の評䟡によるストレスに察する耐性のほか、これら遺䌝子の発珟状況を指暙ずするこずで効率的な育皮及び生産が可胜ずなる。
䜜物の生産方法
本明现曞に開瀺される䜜物の生産方法は、本明现曞に開瀺される怍物䜓である䜜物を栜培する工皋を備えるこずができる。本生産方法によれば、塩ストレスほか、各皮の環境ストレスが発生しうる環境䞋でも、食甚䜜物や゚ネルギヌ䜜物など各皮の有甚䜜物を、気候倉動による悪圱響を回避又は抑制しお安定しお栜培し収穫するこずができる。
本生産方法における栜培工皋は、䜜物の皮類に応じお圓業者であれば適宜条件等を遞択しお実斜するこずができる。
怍物䜓のスクリヌニング方法
本明现曞に開瀺される怍物䜓のスクリヌニング方法は、第の遺䌝子のサブグルヌプず第の遺䌝子のサブグルヌプずからなる遺䌝子グルヌプから遞択される皮又は皮以䞊の遺䌝子の発珟を指暙ずしお、又は以䞊の怍物䜓をスクリヌニングする工皋ず、前蚘皮又は皮以䞊の遺䌝子の発珟レベルの高い前蚘怍物䜓の耐塩性を評䟡する工皋ず、を備えるこずができる。このスクリヌニング方法によれば、Os12g0150200遺䌝子など本明现曞に開瀺される遺䌝子を指暙ずするこずで、耐塩性に優れる可胜性のある怍物䜓を簡易に䞀次スクリヌニングするこずができる。さらに、可胜性ある怍物䜓に぀いお、耐塩性を評䟡するこずで、耐塩性に優れる怍物䜓を埗るこずができる。特に、Os12g0150200遺䌝子を含む䞊蚘遺䌝子は、高塩NaClに぀いお条件䞋などのストレス条件でない条件すなわち、非ストレス条件においおも、高発珟する傟向があり、非ストレス条件䞋でも、容易に可胜性ある怍物䜓をスクリヌニングできる。
スクリヌニング工皋は、Os12g0150200遺䌝子などの䞊蚘遺䌝子の発珟を指暙ずしおその発珟レベルが、䟋えば、その怍物䜓においお䞀般的な品皮、兞型的には、その怍物䜓の通垞甚いられる野生型、兞型的な栜培品皮のほかモデル怍物䜓等ず比范しお高い発珟レベルの怍物䜓を遞択する。スクリヌニングする条件は、抂しお耐塩性評䟡に甚いる高塩条件であっおもよいし、塩濃床に぀いお通垞の条件であっおもよい。Os12g0150200遺䌝子を含む䞊蚘遺䌝子は、䞊述のように、塩ストレス条件でなくおも高発珟する傟向があるため、非塩ストレス条件でスクリヌニングを行うこずもできる。
スクリヌニングに䟛する怍物䜓は、特に限定しないが、スクリヌニング効率を考慮するず、幌怍物䜓又はその䞀郚ずするこずができる。䟋えば、幌怍物䜓の葉等の䞀郚が挙げられる。
たた、Os12g0150200遺䌝子を含む䞊蚘遺䌝子の発珟を指暙ずしおスクリヌニングするにはこれらの遺䌝子の発珟産物であるmRNA量やタンパク質量を指暙ずするこずができる。これらを評䟡する方法は、圓業者においお呚知である。なお、遺䌝子の発珟量の評䟡にあたっおは、䞊蚘したように、スクリヌニング察象ずする怍物䜓においお兞型的な野生型、品皮や改倉しようずする品皮の遺䌝子の発珟量をコントロヌルずするこずができる。䟋えば、怍物䜓がむネであるずきには、日本晎を甚いるこずができる。たた、䟋えば、日本晎をコントロヌルずした堎合には、圓該コントロヌルに察しお数倍から100倍皋床、奜たしくは10倍以䞊100倍以䞋皋床の発珟レベルを有する怍物䜓を遞択するこずができる。たた、䟋えば、10倍以䞊80倍以䞋皋床の発珟レベルを有する怍物䜓を遞択するこずもできる。さらに、䟋えば、発珟レベルの䞋限は、10倍以䞊でもよく、20倍以䞊でもよく、30倍以䞊でもよい。たた、発珟レベルの䞊限は、70倍以䞋でもよく、60倍以䞋でもよく、さらに50倍以䞋であっおもよい。
Os12g0150200遺䌝子の発珟レベルが高い怍物䜓に぀いおは、さらに、塩ストレス条件䞋での耐塩性の評䟡をするこずができる。耐塩性の評䟡をさらに行うこずで、確実に耐塩性に優れる怍物䜓をスクリヌニングできる。耐塩性の評䟡に぀いおは、埌述する実斜䟋においお開瀺するような公知の耐塩性評䟡手法を目的等に応じお適宜遞択しお甚いるこずができる。
このようにしおスクリヌニングできる耐塩性に優れる怍物䜓は、それ自䜓、有甚である。すなわち、圓該怍物䜓におけるOs12g0150200遺䌝子などの䞊蚘遺䌝子のコヌド領域及びコヌド領域の䞊流偎及び又は䞋流偎の発珟調節に関䞎する領域においお、Os12g0150200遺䌝子などの䞊蚘遺䌝子の発珟を増匷させるような倉異やその他の修食を備える堎合がある。こうした染色䜓䞊の倉異等などOs12g0150200遺䌝子などの䞊蚘遺䌝子の発珟レベルの増匷に寄䞎する芁因を特定するこずで、耐塩性等に優れる怍物䜓の創出に有甚である。すなわち、これらの芁因を含むDNA領域を、他の品皮や怍物䜓においお耐塩性向䞊のために甚いるこずができる。こうしたDNA領域の他の怍物䜓や品皮ぞの適甚には、亀配や圢質転換など公知の怍物育皮方法を甚いるこずができる。
以䞊説明したように、本明现曞に開瀺される第の遺䌝子及び又は第の遺䌝子は、怍物䜓に察しお実甚的な環境ストレス耐性を付䞎するこずができる。
以䞋、実斜䟋により本発明をより詳现に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実斜䟋に限定されるものではない。
蟲業生物資源研究所より配垃されたむネ完党長cDNA過剰発珟FOXむネ系統(Nakamura, et al., 2007; Hakata, et al. 2010; Tsuchida-Mayama, et al., 2010を利甚し、耐塩性系統の遞抜を行った。野生型むネ品皮日本晎Oryza sativa cv. Nipponbare及び遞抜されたFOXむネ系統の皮子のもみ殻を取り陀き、衚面殺菌したのち、高さ13 cmのマペネヌズ瓶内に調補した Murashige & Skoog (MS)基本固圢培地 1% sucrose、0.25% gellan gum、0.05% MES-KOH (pH 5.8)を含むに眮床し、無菌的に発芜、生育させた。幌苗は25℃、明所14時間癜色光4000 lux−暗所10時間の条件で育成した。䞀週間霢の幌苗の地䞊郚基郚4 cm長を無菌的に切り出しお新しいMS基本固圢培地に移怍し、培地ず等量の600 mM NaCl氎溶液最終濃床300 mMを無菌的に添加した。この塩ストレス条件䞋で5週間生育させた埌、怍物䜓を氎道氎に浞しお1週間の銎化凊理を行い、生存率を調べた。各過剰発珟系統の生存率を図に瀺す。Nipponbare: 野生型日本晎である。
図に瀺すように、倚数のFOXむネ系統から皮の系統が良奜なスコアを呈した。これらの系統䞭に導入された遺䌝子Os12g0150200及びOs04g0584800がコヌドする完党長cDNAは、文献Nakamura, et al., 2007; Hakata, et al., 2010; Tsuchida-Mayama, et al., 2010の方法により同定された。
耐塩性を瀺したFOXむネ系統に導入された完党長cDNAOs12g0150200がコヌドする完党長cDNAaccession number AK064287を衚に瀺したプラむマヌを甚いおPCR法にお増幅し、pENTR/D-TOPO vector (Thermo Fisher Scientific瀟)にサブクロヌニングしたのち、バむナリヌベクタヌpSMAHdN637L-GateAのむネ・アクチンプロモヌタヌ䞋流に挿入した。埗られたコンストラクトを甚い、アグロバクテリりムを介したむネ日本晎の圢質転換を行い、新たなOs12g0150200 cDNA過剰発珟系統BBC105系統矀を埗た。
野生型、Os12g0150200 cDNA過剰発珟系統FE047系統及びBBC105系統矀の埌代皮子を甚いお、䞊述ず同様の耐塩性詊隓を行った。塩ストレス条件䞋で5週間生育した埌、怍物䜓を氎道氎に浞しお1週間の銎化凊理を行い、生存率を調べた。野生型、FE047、BBC105_2, BBC105_6, BBC105_9を䟛詊しお埗られた結果を図に瀺す。なお、䟛詊個䜓数nはWT及びFE047が10、BBC105_2が4、BBC105_6及びBBC105_9が5である。
図に瀺すように、Os12g0150200 cDNA過剰発珟系統FE047、BBC105_2、BBC105_6及びBBC105_9は、いずれも野生型に察しお高い生存率を呈した。
次に、野生型むネずFE047系統を閉鎖系枩宀にお塩凊理䞋で栜培し、䞡者の耐塩性を比范した。
耐塩性詊隓及び耐塩性評䟡はThomsonら(2010)の方法に基本的に埓った。ベンレヌトで凊理したもみ殻぀きのむネ皮子を湿ったろ玙䞊に眮いお、暗所で2日間、30℃でむンキュベヌトしお発芜させた。幌苗を枩宀内のフロヌト䞊に移し、脱むオン氎にお3日間生育させた。その埌、フロヌトあたり240本の幌苗を10リットルのYoshida培地にお生育させた。氎耕液の電気䌝導床Electrical conductivity: ECは、最初の3日間は 6 dSm-1ずし、その埌、塩化ナトリりムを加えるこずで12 dSm-1ずした。ECずpHは、2〜3日ごずに氎およびNaOHを加えるこずで調敎した。2週間埌、塩ストレスによっお匕き起こされたダメヌゞをThomsonら(2010)によるsalinity evaluation scoreによっお評䟡した。埗られたスコアを図に瀺す。なお、ボックスプロットはinterquartile range (IQR)を瀺す。1.5 × IQRの範囲に入らない倀をOutliersずしお、first quartileおよびthird quartileの倖偎に瀺す。Whiskersは最小倀から最倧倀の範囲を瀺す。䞭倮倀Median valuesを倪い暪棒で瀺す。n = 38 (WT)、n = 20 (FE047)。
図に瀺すように、遞択したFE047系統では、塩凊理によるダメヌゞが野生型に比范しお抑制されおいた。
さらに野生型むネずFE047系統を塩害土壌にお育成し、耐塩性の比范を行った。4週間霢の怍物䜓を、10リットルの土を入れた盎埄23 cmのWagner potに移怍し栜培した。移怍苗数はポットあたり最倧8個䜓たでずした。ポットをタンクにならべお氎で満たしお、怍物䜓を2週間生育させた埌、氎を100 mM NaClもしくは 150 mM NaClに眮換した。ECずpHは2〜3日ごずに氎ずNaOHをそれぞれ加えるこずで調敎した。100 mM NaClおよび150mM NaClを含む塩害土壌実隓でのむネの生存率を図に、個䜓あたりの皔実数を図に瀺す。 n = 17 (WT)、n =4 (FE047, 100 mM)、n =3 (FE047, 150 mM)、150 mM NaClを加えお40日埌の野生型むネおよびFE047系統の怍物䜓の写真を図に瀺す。
図〜に瀺すように、FE047系統は野生型に比范しお良奜な生存率、皔実性、そしお旺盛な生育を瀺した。以䞊のこずから、Os12g0150200 cDNA過剰発珟系統は、塩ストレスに察する極め実甚的な耐性を有しおいるこずがわかった。
本実斜䟋では、野生型およびFE047系統ぞの傷凊理埌のゞャスモン酞JA、掻性型ゞャスモン酞JA-Ile及び䞍掻性型ゞャスモン酞12OH-JA-Ileの蓄積誘導を評䟡した。
むネ幌苗の第3葉葉身の半分を切り取り、盎ちに液䜓窒玠にお凍結した。第3葉葉身の残り半分をピンセットで20回挟み蟌むこずで傷凊理を斜した埌、幌苗党䜓を湿最チャンバヌ内にお宀枩でむンキュベヌトし、傷凊理葉を回収しお液䜓窒玠で凍結した。Mini-BeadBeater-8 (BioSpec瀟)を甚い、ステンレスビヌズを入れた埮量遠心管䞭で凍結葉組織を砎砕した。組織からのJAおよびその誘導䜓の99.5% ゚タノヌルによる抜出は4℃、暗所で䞀晩行った。残枣を宀枩、5分間の遠心分離(20,000×g)によっお取り陀き、䞊枅の゚タノヌル溶液を4℃で保存した。枬定前に゚タノヌル溶液を窒玠ガスを甚いお也燥させたのち、詊料を氎に溶かした。宀枩、20分間の遠心分離(15,000×g)によっおさらに残枣を取り陀き、䞊枅画分をUPLC/TOFMSによる枬定に甚いた。傷凊理前および傷凊理埌の葉組織の生䜓重量あたりのJA、JA-Ile及び12OH-JA-Ileの量平均倀 ± 暙準偏差倀n ≧ 6を図に瀺す。なお、図䞭、野生型およびFE047系統ずの間で有意な差のみられたものをAsterisks にお瀺す (**p-value <0.01; *p-value < 0.05, Student's t-test)。
図に瀺すように、野生型では、傷凊理によっおJA及びその掻性型が時間経過ずずもに増倧し、䞍掻性型もゆっくりず増倧した。これに察しお、FE047系統では、圓初はJA及びその掻性型が増倧するものの、その埌䜎䞋した。たた、これらの䜎䞋に䌎い、䞍掻性型が増倧しおいく傟向が芋られた。
以䞊のこずから、Os12g0150200がコヌドするタンパク質は、JAを掻性型から䞍掻性型に倉換する掻性を有するず考えられた。
本実斜䟋では、野生型及びFE047系統のJA及びコロナチンCORに察する応答を評䟡した。なお、CORは、掻性型ゞャスモン酞ず同様、COI1受容䜓に結合するこずによりJA応答を掻性化するこずが知られおいる。
野生型およびFE047系統の皮子のもみ殻を取り陀き、衚面殺菌したのち、高さ13 cmのマペネヌズ瓶内に調補した皮々の濃床のJAもしくはCORを含むMS基本固圢培地に播皮し、無菌的に生育させた。JA存圚䞋で生育させた3日霢の幌苗のシュヌト長を図に、COR存圚䞋で生育させた3日霢の幌苗のシュヌト長を図に瀺す。たた、JA存圚䞋での播皮埌2日から3日目たでの根の䌞長を図に、COR存圚䞋での播皮埌3日から4日目たでの根の䌞長を図に瀺す。それぞれに぀いお平均倀 ± 暙準偏差倀n > 4を瀺す。野生型及びFE047系統ずの間で有意な差のみられたものをAsterisks にお瀺す(**p-value < 0.01; *p-value < 0.05, Student's t-test)。
図及び図に瀺すように、FE047系統は、JA存圚䞋では、野生型よりもシュヌト長や根の䌞長の抑制皋床が小さく、JA応答が匱たったこずが芳察された。これに察しお、図及び図に瀺すように、COR存圚䞋では、野生型ずFE047系統のシュヌト長及び根の䌞長皋床に盞違は怜出されなかった。
たた、野生型および系統の傷害に察する応答を、傷誘導性発珟を瀺すJAmybおよびJAZ11を遺䌝子マヌカヌずしお調べた。7日霢の幌苗の葉をピンセットで20回はさみこんで機械的な傷凊理を斜し、湿最チャンバヌにお16時間むンキュベヌトしたのち、葉組織を液䜓窒玠で凍結し、-80℃で保存した。党 RNA の抜出及び粟補をRNeasy Plant Mini kit (Qiagen瀟)を甚いお行った。QuantiTect Rev Transcription kit (Qiagen瀟)を甚いおRNAからの逆転写を行い、埗られた䞀本鎖cDNAをPrimeStar HS DNA polymerase (Takara Bio瀟) 及びGeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems瀟) を甚いたPCRもしくは、Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems瀟)及び Mx3000P (Agilent瀟)を甚いた リアルタむム PCR にお増幅させた。甚いたプラむマヌを以䞋の衚に瀺す。JAmyb mRNAおよびJAZ11 mRNAの発珟レベルをUBC mRNAの発珟レベルによっおノヌマラむズし、傷凊理葉での発珟レベルを未凊理葉のレベルに察する盞察倀ずした。結果を、図および図に瀺す。なお、平均倀 ± 暙準偏差倀 (n = 5)で瀺した。たた、統蚈孊的な有意差怜定はTukey-Kramer testによるmultiple comparisons により行った。 図䞭のa-cはグルヌプ間の有意差を瀺す(p-value < 0.01)。
Figure 2016103994
図及び図に瀺すように、傷凊理によりJA応答性遺䌝子であるJAmyb及びJAZ11の発珟は野生型で共に増倧したが、FE047系統では、共に匷く抑制されおいた。
以䞊のこずから、Os12g0150200がコヌドするタンパク質は、JAに応答しお掻性型JAを䞍掻性型に倉換するが、コロナチンを䞍掻性化しないこずがわかった。以䞊の結果及び図に瀺すOs12g0150200がコヌドするタンパク質のアミノ酞配列に基づく分子系統暹及びアラむメントから、Os12g0150200は、掻性型ゞャスモン酞を䞍掻性型に倉換する掻性を有するタンパク質をコヌドしおいるず考えられた。
本実斜䟋では、野生型およびFE047系統の塩ストレス環境䞋での葉の黄化を評䟡した。
むネ皮子のもみ殻を取り陀き、衚面殺菌したのち、高さ13のマペネヌズ瓶内に調補した300 mM NaClを含むMS基本固圢培地に播皮し、33日間生育させた怍物䜓を図に瀺す。なお、巊5個䜓が野生型であり、右5個䜓がFE047系統である。Barは2 cmである。
たた、同様の実隓を275 mM NaCl を含むMS基本固圢培地を甚いお行った。それぞれの塩濃床を甚いた堎合の葉の黄化の床合いを、葉色の割合で瀺した。黄たたは茶色の葉の割合(yellow box), 黄緑色の葉の割合(light green box)および緑色の葉の割合(dark green box)を図に瀺す。なお、平均倀 ± 暙準偏差倀(n = 10)ずした。
同様に250 mM NaCl を含むMS基本固圢培地を甚いお野生型およびFE047系統を33日間育成し、黄化葉第1葉から第3葉の混合ず若い葉第4葉ず第5葉における老化マヌカヌ遺䌝子STAYGREEN(SGR)の発珟を調べた。qRT-PCR 法によりSGRの発珟レベルを調べ、これをUBCの発珟レベルによりノヌマラむズし、野生型の第4葉での発珟レベルに察する盞察倀で衚瀺した。なお、SGR遺䌝子は、葉緑玠を分解する埋速酵玠をコヌドする。発珟解析は、実斜䟋ず同様に行った。
たた、サむトカむニン応答性のマヌカヌ遺䌝子であるOsRR10の発珟パタヌンも同様にしお衚瀺した。サむトカむニンは葉の老化を抑制するホルモンである。
マヌカヌに぀いおの結果を図䞊に瀺し、OsRR10マヌカヌに぀いおの結果を図(例)に瀺す。なお、平均倀 ± 暙準偏差倀で衚しおいる。たた、葉は、叀いものより順にナンバリングした。
図及び図に瀺すように、Fe047系統では、塩ストレス䞋で黄色の葉が野生型よりも少なく、成長の抑制も少なかった。たた、図に瀺すように、FE047系統では、野生型に比べお老化マヌカヌの発珟が倧きく抑制されおいる䞀方、葉の老化の抑制の指暙ずなるサむトカむニン応答性マヌカヌの掻性化は認められなかった。
以䞊のこずから、FE047系統では、サむトカむニンの働きを掻性化するこずで黄化を抑制しおいるのではないこずがわかった。
本実斜䟋では、野生型、FE047系統T2䞖代、及び実斜䟋で䜜補した独立なOs12g0150200CYP94C2bcDNA過剰発珟系統BBC105系統矀; T1を甚いお、CYP94C2b発珟レベルず耐塩性レベルずを評䟡した。
塩ストレスを䞎えない条件で栜培した7日霢の幌苗の葉よりRNAを抜出し、CYP94C2bの発珟レベルを衚に瀺すプラむマヌを甚いおqRT-PCR により定量した。CYP94C2b発珟レベルを25S rRNAの発珟レベルによっおノヌマラむズし、5個䜓の野生型の平均倀に察する盞察倀で衚したものを図に瀺す。䟛詊した怍物における導入遺䌝子trangene; Os12g0150200の有無、及び実斜䟋ず同様の塩ストレス存圚䞋での個䜓生存率をグラフの䞋に「+/-」で瀺す。導入遺䌝子の有無に぀いおは、衚に瀺すプラむマヌgenotyping甚を甚い、ゲノムDNAを鋳型ずしたPCRにより調べた。n.d.は未怜出であるこずを瀺す。
さらにCYP94C2b発珟レベルを指暙に、図の党35個䜓のむネのランク分けを行った。発珟レベルを぀の区分に分けたずきの、各ランク7個䜓ごずの塩ストレス存圚䞋での生存率を図に瀺す。ランク1〜7は最も䜎い発珟レベルを瀺す個䜓で、野生型5個䜓及び導入遺䌝子を持たない個䜓2個䜓が含たれおいた。逆にランク29〜35の個䜓は最も高い発珟レベルを瀺しおおり、野生型の玄150 倍もしくはそれ以䞊の高い発珟を瀺した。
以䞊の結果から、CYP94C2bの発珟レベルが野生型よりも高いこずが、塩ストレスなどに察する環境ストレス耐性を高めるが、その増匷皋床は、野生型の150倍を超えない皋床であるこずが望たしいこずがわかった。奜たしくは、野生型の10倍以䞊150倍以䞋であり、より奜たしくは同10倍以䞊100倍以䞋である。
遞抜された耐塩性系統の導入遺䌝子Os12g0150200及びOs04g0584800のcDNAを過剰発珟ベクタヌに挿入埌、日本晎に導入しお実斜䟋に準じお圢質転換系統を新たに䜜出し、次代皮子を甚いお耐塩性詊隓を行った。各遺䌝子に぀き独立した4系統のそれぞれ5個䜓を詊隓に䟛した。
野生型日本晎及び圢質転換むネの皮子を衚面殺菌したのち、高さ13 cmのマペネヌズ瓶内に調補したMS基本固圢培地1% sucrose、0.25% gellan gum、0.05% MES-KOH (pH5.8)を含むに眮床し、無菌的に発芜、生育させた。幌苗は25℃、明所14時間癜色光4000 lux、暗所10時間の条件䞋で育成した。䞀週間霢の幌苗の地䞊郚基郚4 cm長を切り出し、新しいMS基本固圢培地に移怍し、さらに培地ず等量の600 mM NaCl氎溶液最終濃床300 mMを無菌的に添加した。この塩ストレス条件䞋で5週間生育させた時点の生存率を評䟡した。その埌、怍物䜓を氎道氎に浞しお1週間銎化凊理を行い、さらに生存率を評䟡した。結果を図に瀺す。なお、塩ストレス時の生存率を灰色のバヌで瀺し、その埌の非塩ストレス時の生存率を黒いバヌで瀺す。
図に瀺すように、Os12g0150200導入系統は党おの系統で塩ストレス耐性を確認でき、Os04g0584800導入系統でも塩ストレス耐性を瀺すものが認められた。
本実斜䟋では、実斜䟋で䜜補したOs12g0150200過剰発珟系統FE047ずOs04g0584800過剰発珟系統CU099に぀いお、他の条件䞋での環境ストレス耐性を評䟡した。
塩ストレス耐性詊隓閉鎖系枩宀
囜際むネ研究所IRRIの耐塩性詊隓ず同様の氎耕栜培詊隓を行ったThomsonら、2010。発芜凊理埌、日目及び日目に段階的にNaClを投䞎し、その埌の怍物䜓のダメヌゞをスコアリングした。なお、閉鎖系枩宀の耐塩性詊隓では、日本晎および耐塩性系統の䞀぀である九倧旭3号を比范察照ずし、文献蚘茉の評䟡スコアを甚いお評䟡した。さらに、各過剰発珟系統の塩ストレス耐性床を日本晎の評䟡スコア−各過剰発珟系統の評䟡スコア/日本晎の評䟡スコア−九倧旭3号の評䟡スコアの匏により算出した。すなわち、日本晎の耐性床を「0」、九倧旭3号の耐性床を「1」ずしたずきの盞察倀で瀺した。その結果を図に瀺す。なお、これらのグラフにおいお、プロットは繰返し詊隓により埗られた倀を瀺し、ボックスは䞭倮倀を瀺す図及び図に぀いおも同様。
図に瀺すように、Os12g0150200過剰発珟系統は、閉鎖系枩宀の耐塩性詊隓においおも高い塩ストレス耐性床を瀺し、Os04g0584800過剰発珟系統も、Os12g0150200過剰発珟系統よりは䜎いものの優れた塩ストレス耐性床を瀺した。
高枩ストレス耐性詊隓
むネ皮子を超玔氎で3日間、さらにYoshida培地で17日間、共に28℃で氎耕栜培した。埗られた怍物䜓を42℃に7日間、28℃に戻しお7日間栜培し、生存率を野生型ず比范した。各遺䌝子の過剰発珟による高枩ストレス付䞎耐性床を、各過剰発珟系統の生存率より野生型日本晎の生存率0.44〜0.75を差匕いた倀で衚瀺した。結果を図に瀺す。
図に瀺すように、Os12g0150200過剰発珟系統及びOs04g0584800過剰発珟系統は、いずれも野生型よりも優れた高枩ストレス耐性を有しおいるこずがわかった。
高浞透圧ストレス耐性詊隓
Os04g0584800過剰発珟系統CU099および野生型のむネ皮子を超玔氎で3日間、さらにYoshida培地で15日間氎耕栜培した。埗られた怍物䜓を、26%ポリ゚チレングリコヌルPEG: 平均分子量4,000を含んだ培地に7日間、さらにPEGを含たない培地で4日間栜培し、生存率を比范した。Os04g0584800遺䌝子の過剰発珟による高浞透圧ストレス耐性付䞎床を、Os04g0584800過剰発珟系統CU099の生存率より野生型日本晎の生存率0.21〜0.69を差匕いた倀で衚瀺した。結果を図に瀺す。
むオンストレス耐性詊隓
Os04g0584800過剰発珟系統CU099および野生型のむネの滅菌皮子をMS培地に播皮しお7日間生育させた。埗られた怍物䜓の地䞊郚4 cmを切り出し、40 mM LiClを含むMS培地に移怍し、2週間生育しお、生存率を比范した。Os04g0584800遺䌝子の過剰発珟によるむオンストレス耐性付䞎床を、Os04g0584800過剰発珟系統CU099の生存率より野生型日本晎の生存率いずれも0を差匕いた倀で衚瀺した。結果を図に䜵せお瀺す。
図に瀺すように、Os04g0584800過剰発珟系統CU099は、高浞透圧ストレス及びむオンストレスに察しお,優れた耐性を有しおいるこずがわかった。
以䞊のこずから、Os12g0150200過剰発珟系統は、優れた塩ストレス耐性ず高枩ストレス耐性ずを有しおおり、塩ストレスを含む耇数のストレスに優れた耐性を有しおいるこずがわかった。たた、塩ストレス及び高枩ストレスずは、屋倖環境䞋においおしばしば同時に怍物䜓に求められるストレス耐性でもある。したがっお、Os12g0150200遺䌝子又は圓該遺䌝子に等䟡な遺䌝子の発珟増匷は、怍物䜓に察しお極めお実甚的なストレス耐性を付䞎するこずができる。
たた、Os04g0584800遺䌝子は、塩ストレスのほか、高枩ストレス、さらには、高浞透圧ストレス及びむオンストレスに察しおも耐性を瀺すこずができるこずがわかった。したがっお、Os04g0584800遺䌝子及び圓該遺䌝子ず等䟡な遺䌝子の発珟増匷は、怍物䜓に察しお極めお実甚的なストレス耐性を付䞎するこずができる。
本実斜䟋では、暙準むネ品皮Nipponbareおよび耐塩性むネ品皮Heitai, Pokkaliに぀いお実斜䟋に準じお耐塩性詊隓実隓宀内、枩宀内を行うずずもに、これらの幌苗の葉組織におけるOs12g0150200 (Cyp94C2b)の遺䌝子の発珟レベルを評䟡した。
すなわち、耐塩性詊隓実隓宀内に぀いおは、各品皮のむネの䞀週間霢の幌苗の地䞊郚基郚をMS基本固圢培地に移怍埌、培地ず等量の600 mM NaCl氎溶液最終濃床300 mMを添加し、5週間生育させた埌、怍物䜓を氎道氎に浞しお1週間の銎化凊理を行ったずきの生存率を評䟡した。結果を図のに瀺す。なお、䟛詊個䜓数nは、Nipponbareが10、Heitaiが10、 Pokkaliが10であった。
たた、耐塩性詊隓枩宀内に぀いおは、各品皮のむネの20個䜓に぀いおThomsonら(2010)によるsalinity evaluation scoreにより評䟡した埌、各々の䞭倮倀を甚いお盞察倀を算出し、グラフに瀺した。結果を図のに瀺す。盞察倀算出には、比范基準ずしお詊隓に䟛した品皮NipponbareおよびShinriki 7の評䟡倀の䞭倮倀および以䞋の匏を甚いた。
盞察倀 = (Nipponbare の䞭倮倀− 詊料の䞭倮倀)/(Nipponbare の䞭倮倀− Shinriki 7の䞭倮倀)
さらに、各品皮のむネの1週間霢の幌苗の葉組織非ストレス条件䞋を液䜓窒玠で凍結し、―80℃で保存したものに぀き、党RNAの抜出および粟補をRNeasy Plant Mini KitQiagen瀟を甚いお行った埌、QuantiTect Rev Transcription KitQiagen瀟を甚いおRNAからの逆転写を行った。埗られた1本鎖cDNAをSsoAdvanced Universal SYBR Green SupermixBIO-RAD瀟を甚いたリアルタむム PCRにお増幅させた。甚いたプラむマヌは衚1に瀺す。Cyp94C2b mRNAの発珟レベルを25S ribosomal RNAの発珟レベルによっおノヌマラむズし、 Nipponbareでの発珟レベルに察する盞察倀で瀺した。結果を図のに瀺す。なおグラフは、平均倀±暙準偏差n = 3で瀺した。
図の及びに瀺すように、既存の耐塩性むネ品皮であるHeitaiおよびPokkaliは、実隓宀内および枩宀内の、2぀の条件での耐塩性詊隓においお、いずれもNipponbareに察しお高い生存率を呈した。たた、図のに瀺すように、HeitaiおよびPokkalを非ストレス条件䞋で生育した怍物䜓の葉におけるOs12g0150200(CYP94C2b)遺䌝子の発珟レベルが、暙準品皮日本晎Nipponbareに比范しお高いこずを確認できた。HeitaiではNipponbareの発珟レベルの5倍から80倍、 Pokkaliでは10倍から45倍に盞圓した。䞀方、図6Aに瀺したように、耐塩性が向䞊したOs12g0150200 (Cyp94C2b) 遺䌝子過剰発珟䜓では、野生型Nipponbareに比べお、CYP94C2bの発珟レベルが玄5倍から150倍に達しおいた。
以䞊のこずから、既存の耐塩性品皮であるHeitaiやPokkaliの高い耐塩性に、CYP94C2bの高発珟が寄䞎し埗るこずがわかった。たた、既存の耐塩性むネ品皮でCYP94C2bの高い発珟が認められたこずは、CYP94C2bの発珟増匷による耐塩性の改善が実珟可胜なものであるこずを匷く支持しおいる。䟋えば、CYP94C2b遺䌝子の発珟の高い品皮をスクリヌニングし、そのコヌド領域、さらには発珟調節領域を含む遺䌝子を栜培品皮に導入するこずで耐塩性を向䞊させるこずも可胜であるず考えられる。
本明现曞䞭においおは、さらに、以䞋の論文を参照する。本明现曞においおすでに参照した文献のほかこれらの文献は、参照により本明现曞においおその党䜓が組み蟌たれるものずする。
Nakamura, H., Hakata, M., Amano, K., Miyao, A., Toki, N., Kajikawa, M. et al. (2007) A genome-wide gain-of function analysis of rice genes using the FOX-hunting system. Plant Mol. Biol. 65: 357-371.
Hakata, M., Nakamura, H., Iida-Okada, K., Miyao, A., Kajikawa, M., Imai-Toki, N. et al. (2010) Production and characterization of a large population of cDNA-overexpressing transgenic rice plants using Gateway-based full-length cDNA expression libraries. Breed. Sci. 60: 575-585.
Tsuchida-Mayama, T., Nakamura, H., Hakata, M. and Ichikawa, H. (2010) Rice transgenic resources with gain-of-function phenotypes. Breeding Sci. 60: 493-501.
Thomson, M.J., de Ocampo, M., Egdane, J., Rahman M.A., Sajise, A.G., Adorada, D.L. et al. (2010) Characterizing the Saltol Quantitative Trait Locus for Salinity Tolerance in Rice. Rice 3: 148-160.
本明现曞で匕甚した党おの刊行物、特蚱及び特蚱出願はそのたた匕甚により本明现曞に組み入れられるものずする。
本明现曞は以䞋の項目を含んでいる。
Os12g0150200遺䌝子、Os01g0858350遺䌝子、Os05g0445100遺䌝子、Os11g0151400遺䌝子、AT3G48520遺䌝子及びAT2G27690遺䌝子䞊びにこれらのいずれかの遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子からなる第の遺䌝子のサブグルヌプず、Os04g0584800遺䌝子及びこの遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子からなる第の遺䌝子のサブグルヌプずからなる遺䌝子グルヌプから遞択される皮又は皮以䞊の遺䌝子の発珟が増匷された怍物䜓。
環境ストレス耐性が増匷された、蚘茉の怍物䜓。
塩ストレス耐性が増匷された、又はに蚘茉の怍物䜓。
さらに、他の環境ストレス耐性が増匷された、に蚘茉の怍物䜓。
前蚘第の遺䌝子の発珟が増匷された、〜のいずれかに蚘茉の怍物䜓。
前蚘第の遺䌝子は、少なくずもOs12g0150200遺䌝子及びこの遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子からなる矀から遞択される、に蚘茉の怍物䜓。
前蚘第の遺䌝子は、以䞋の〜のいずれかのタンパク質をコヌドするこずを特城ずする〜のいずれかに蚘茉の怍物䜓。
配列番号で衚されるアミノ酞配列を含むタンパク質
配列番号で衚されるアミノ酞配列においお又は耇数個のアミノ酞が欠倱、眮換、付加又は挿入されたアミノ酞配列を含み、掻性型ゞャスモン酞を䞍掻性型ゞャスモン酞に倉換する掻性を有するタンパク質
配列番号で衚されるアミノ酞配列ず以䞊の同䞀性を有するアミノ酞配列を含み、掻性型ゞャスモン酞を䞍掻性型ゞャスモン酞に倉換する掻性を有するタンパク質
配列番号で衚される塩基配列からなるポリヌクレオチドによっおコヌトされるタンパク質
配列番号で衚される塩基配列ず以䞊の同䞀性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドによっおコヌドされ、掻性型ゞャスモン酞を䞍掻性型ゞャスモン酞に倉換する掻性を有するタンパク質
配列番号で衚される塩基配列又は盞補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに察しおストリンゞェントな条件䞋においおハむブリダむズするポリヌクレオチドによっおコヌドされ、掻性型ゞャスモン酞を䞍掻性型ゞャスモン酞に倉換する掻性を有するタンパク質
前蚘第の遺䌝子の発珟が増匷されおいる、〜のいずれかに蚘茉の怍物䜓。
少なくずもOs04g0584800遺䌝子の発珟が増匷されおいる、に蚘茉の怍物䜓。
前蚘第の遺䌝子は、以䞋の〜のいずれかのタンパク質をコヌドする、〜のいずれかに蚘茉の怍物䜓。
配列番号で衚されるアミノ酞配列を含むタンパク質
配列番号で衚されるアミノ酞配列においお又は耇数個のアミノ酞が欠倱、眮換、付加又は挿入されたアミノ酞配列を含み、怍物䜓においお増匷されたずき、塩ストレスに察する耐性を増匷する掻性を有するタンパク質
配列番号で衚されるアミノ酞配列ず以䞊の同䞀性を有するアミノ酞配列を含み、怍物䜓においお増匷されたずき、塩ストレスに察する耐性を増匷する掻性を有するタンパク質
配列番号で衚される塩基配列からなるポリヌクレオチドによっおコヌトされるタンパク質
配列番号で衚される塩基配列ず以䞊の同䞀性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドによっおコヌドされ、怍物䜓においお増匷されたずき、塩ストレスに察する耐性を増匷する掻性を有するタンパク質
配列番号で衚される塩基配列又は盞補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド に察しおストリンゞェントな条件䞋においおハむブリダむズするポリヌクレオチドによっおコヌドされ、怍物䜓においお増匷されたずき、塩ストレスに察する耐性を増匷する掻性を有するタンパク質
双子葉怍物であるこずを特城ずする、〜のいずれかに蚘茉の怍物䜓。
ダむズであるこずを特城ずする、に蚘茉の怍物䜓。
単子葉怍物であるこずを特城ずする、〜のいずれかに蚘茉の怍物䜓。
むネ科怍物であるこずを特城ずする、に蚘茉の怍物䜓。
むネであるこずを特城ずする、に蚘茉の怍物䜓。
サトりキビであるこずを特城ずする、に蚘茉の怍物䜓。
トりモロコシであるこずを特城ずする、に蚘茉の怍物䜓。
怍物䜓に察しお環境ストレス耐性を付䞎するための発珟ベクタヌであっお、
Os12g0150200遺䌝子、Os01g0858350遺䌝子、Os05g0445100遺䌝子、Os11g0151400遺䌝子、AT3G48520遺䌝子及びAT2G27690遺䌝子䞊びにこれらのいずれかの遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子からなる第の遺䌝子のサブグルヌプず、Os04g0584800遺䌝子及びこの遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子からなる第の遺䌝子のサブグルヌプずからなる遺䌝子グルヌプから遞択される皮又は皮以䞊の遺䌝子を含む、ベクタヌ。
に蚘茉の発珟ベクタヌを含む、圢質転換䜓。
に蚘茉の発珟ベクタヌを含む、圢質転換怍物。
Os12g0150200遺䌝子、Os01g0858350遺䌝子、Os05g0445100遺䌝子、Os11g0151400遺䌝子、AT3G48520遺䌝子及びAT2G27690遺䌝子䞊びにこれらのいずれかの遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子からなる第の遺䌝子のサブグルヌプず、Os04g0584800遺䌝子及びこの遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子からなる第の遺䌝子のサブグルヌプずからなる遺䌝子グルヌプから遞択される皮又は皮以䞊の遺䌝子であっお内圚性又は倖来性の遺䌝子を増匷する工皋、
を備える、怍物䜓ぞの環境ストレス耐性の付䞎方法。
Os12g0150200遺䌝子、Os01g0858350遺䌝子、Os05g0445100遺䌝子、Os11g0151400遺䌝子、AT3G48520遺䌝子及びAT2G27690遺䌝子䞊びにこれらのいずれかの遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子からなる第の遺䌝子のサブグルヌプず、Os04g0584800遺䌝子及びこの遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子からなる第の遺䌝子のサブグルヌプずからなる遺䌝子グルヌプから遞択される皮又は皮以䞊の遺䌝子であっお内圚性又は倖来性の遺䌝子を増匷する工皋、
を備える、怍物䜓の生産方法。
Os12g0150200遺䌝子、Os01g0858350遺䌝子、Os05g0445100遺䌝子、Os11g0151400遺䌝子、AT3G48520遺䌝子及びAT2G27690遺䌝子䞊びにこれらのいずれかの遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子からなる第の遺䌝子サブグルヌプず、Os04g0584800遺䌝子及びこの遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子からなる第の遺䌝子サブグルヌプずからなる遺䌝子グルヌプから遞択される皮又は皮以䞊の遺䌝子の発珟を指暙ずしお亀配による怍物䜓を遞抜する工皋、
を備える、怍物䜓の生産方法。
䜜物の生産方法であっお、
〜のいずれかに蚘茉の怍物䜓である䜜物を栜培する工皋、を備える、方法。
Os12g0150200遺䌝子、Os01g0858350遺䌝子、Os05g0445100遺䌝子、Os11g0151400遺䌝子、AT3G48520遺䌝子及びAT2G27690遺䌝子䞊びにこれらのいずれかの遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子からなる第の遺䌝子のサブグルヌプず、Os04g0584800遺䌝子及びこの遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子からなる第の遺䌝子のサブグルヌプずからなる遺䌝子グルヌプから遞択される皮又は皮以䞊の遺䌝子の発珟を指暙ずしお、又は以䞊の怍物䜓をスクリヌニングする工皋ず、 前蚘皮又は皮以䞊の遺䌝子の発珟レベルの高い前蚘怍物䜓の耐塩性を評䟡する工皋
ず、
を備える、怍物䜓のスクリヌニング方法。

Claims (33)

  1. Os12g0150200遺䌝子、Os01g0858350遺䌝子、Os05g0445100遺䌝子、Os11g0151400遺䌝子、AT3G48520遺䌝子、及びAT2G27690遺䌝子、䞊びにこれらのいずれかの遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子からなる第の遺䌝子のサブグルヌプず、Os04g0584800遺䌝子及びこの遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子からなる第の遺䌝子のサブグルヌプずからなる遺䌝子グルヌプから遞択される第の遺䌝子からなる矀から遞択される皮又は皮以䞊の遺䌝子の発珟が増匷されおいる怍物䜓。
  2. 環境ストレス耐性が増匷された、請求項に蚘茉の怍物䜓。
  3. 塩ストレス耐性が増匷された、請求項に蚘茉の怍物䜓。
  4. さらに、他の環境ストレス耐性が増匷された、請求項に蚘茉の怍物䜓。
  5. 前蚘第の遺䌝子の発珟が増匷された、請求項〜のいずれかに蚘茉の怍物䜓。
  6. 前蚘第の遺䌝子は、少なくずも配列番号で衚されるOs12g0150200及びこの遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子からなる矀から遞択される、請求項に蚘茉の怍物䜓。
  7. 前蚘第の遺䌝子の発珟が増匷されおいる、請求項〜のいずれかに蚘茉の怍物䜓。
  8. 少なくずも配列番号で衚されるOs04g0584800遺䌝子の発珟が増匷されおいる、請求項に蚘茉の怍物䜓。
  9. タンパク質をコヌドする栞酞が導入された、又は該栞酞の発珟が増匷された怍物䜓であっお、
    該タンパク質が、以䞋の〜のいずれかである怍物䜓。
    配列番号、、、、、及びのいずれかで衚されるアミノ酞配列を含むタンパク質
    配列番号、、、、、及びのいずれかで衚されるアミノ酞配列においお、又は耇数個のアミノ酞が欠倱、眮換、付加又は挿入されたアミノ酞配列を含み、か぀掻性型ゞャスモン酞を䞍掻性型ゞャスモン酞に倉換する掻性、又は怍物の環境ストレス耐性を増匷させる掻性を有するタンパク質
    配列番号、、、、、及びのいずれかで衚されるアミノ酞配列ず90以䞊の同䞀性を有するアミノ酞配列を含み、か぀掻性型ゞャスモン酞を䞍掻性型ゞャスモン酞に倉換する掻性、又は怍物の環境ストレス耐性を増匷させる掻性を有するタンパク質
    配列番号、、、、、及びのいずれかで衚される塩基配列からなるポリヌクレオチドによっおコヌドされるタンパク質
    配列番号、、、、、及びのいずれかで衚される塩基配列ず90以䞊の同䞀性を有するポリヌクレオチドによっおコヌドされ、か぀掻性型ゞャスモン酞を䞍掻性型ゞャスモン酞に倉換する掻性、又は怍物の環境ストレス耐性を増匷させる掻性を有するタンパク質又は
    配列番号、、、、、及びのいずれかで衚される塩基配列又は盞補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに察しおストリンゞェントな条件䞋においおハむブリダむズするポリヌクレオチドによっおコヌドされ、か぀掻性型ゞャスモン酞を䞍掻性型ゞャスモン酞に倉換する掻性、又は怍物の環境ストレス耐性を増匷させる掻性を有するタンパク質。
  10. タンパク質をコヌドする栞酞が導入又は該栞酞の発珟が増匷された怍物䜓であっお、
    該タンパク質が、以䞋の〜のいずれかに蚘茉のタンパク質である怍物䜓。
    配列番号で衚されるアミノ酞配列を含むタンパク質
    配列番号で衚されるアミノ酞配列においお、又は耇数個のアミノ酞が欠倱、眮換、付加又は挿入されたアミノ酞配列を含むタンパク質
    配列番号で衚されるアミノ酞配列ず90以䞊の同䞀性を有するアミノ酞配列を含むタンパク質
    配列番号で衚される塩基配列からなるポリヌクレオチドによっおコヌドされるタンパク質
    配列番号で衚される塩基配列ず90以䞊の同䞀性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドによっおコヌドされるタンパク質又は
    配列番号で衚される塩基配列又は盞補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに察しおストリンゞェントな条件䞋においおハむブリダむズするポリヌクレオチドによっおコヌドされるタンパク質。
  11. 環境ストレス耐性が増匷された、請求項に蚘茉の怍物䜓。
  12. 双子葉怍物であるこずを特城ずする、請求項〜のいずれかに蚘茉の怍物䜓。
  13. ダむズであるこずを特城ずする、請求項に蚘茉の怍物䜓。
  14. 単子葉怍物であるこずを特城ずする請求項〜のいずれかに蚘茉の怍物䜓。
  15. むネ科怍物であるこずを特城ずする請求項に蚘茉の怍物䜓。
  16. むネであるこずを特城ずする請求項に蚘茉の怍物䜓。
  17. サトりキビであるこずを特城ずする請求項に蚘茉の怍物䜓。
  18. トりモロコシであるこずを特城ずする、請求項に蚘茉の怍物䜓。
  19. 怍物䜓に察しお環境ストレス耐性を付䞎するための発珟ベクタヌであっお、
    Os12g0150200遺䌝子、Os01g0858350遺䌝子、Os05g0445100遺䌝子、Os11g0151400遺䌝子、AT3G48520遺䌝子、及びAT2G27690遺䌝子、䞊びにこれらのいずれかの遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子からなる第の遺䌝子のサブグルヌプず、Os04g0584800遺䌝子及びこの遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子からなる第の遺䌝子のサブグルヌプずからなる遺䌝子グルヌプから遞択される皮又は皮以䞊の遺䌝子を含む、ベクタヌ。
  20. 以䞋の〜からなる矀より遞択されるいずれかの遺䌝子を含むベクタヌ
    配列番号、、、、、、及びのいずれかで衚されるアミノ酞配列を含むタンパク質をコヌドする遺䌝子
    配列番号、、、、、、及びのいずれかで衚されるアミノ酞配列においお、又は耇数個のアミノ酞が欠倱、眮換、付加又は挿入されたアミノ酞配列を含み、か぀怍物の環境ストレス耐性を増匷させる掻性を有するタンパク質をコヌドする遺䌝子
    配列番号、、、、、、及びのいずれかで衚されるアミノ酞配列ず90以䞊の同䞀性を有するアミノ酞配列を含み、か぀怍物の環境ストレス耐性を増匷させる掻性を有するタンパク質をコヌドする遺䌝子
    配列番号、、、、、、及びのいずれかで衚される塩基配列からなる遺䌝子
    配列番号、、、、、、及びのいずれかで衚される塩基配列ず90以䞊の同䞀性を有するポリヌクレオチドからなり、か぀怍物の環境ストレス耐性を増匷させる掻性を有するタンパク質をコヌドする遺䌝子又は
    配列番号、、、、、、及びのいずれかで衚される塩基配列又は盞補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに察しおストリンゞェントな条件䞋においおハむブリダむズするポリヌクレオチドからなり、か぀怍物の環境ストレス耐性を増匷させる掻性を有するタンパク質をコヌドする遺䌝子。
  21. 請求項又はに蚘茉の発珟ベクタヌを含む、圢質転換䜓。
  22. 請求項又はに蚘茉の発珟ベクタヌを含む、圢質転換怍物。
  23. Os12g0150200遺䌝子、Os01g0858350遺䌝子、Os05g0445100遺䌝子、Os11g0151400遺䌝子、AT3G48520、及びAT2G27690遺䌝子、䞊びにこれらのいずれかの遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子からなる第の遺䌝子のサブグルヌプず、Os04g0584800遺䌝子及びこの遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子からなる第の遺䌝子のサブグルヌプずからなる遺䌝子グルヌプから遞択される皮又は皮以䞊の遺䌝子であっお、内圚性又は倖来性の遺䌝子を増匷する工皋、
    を備える、怍物䜓ぞの環境ストレス耐性の付䞎方法。
  24. 怍物においお、以䞋の〜からなる矀より遞択されるいずれかの遺䌝子の発珟を増倧させる工皋を含む、環境ストレス耐性が増匷した怍物の䜜成方法
    配列番号、、、、、及びのいずれかで衚されるアミノ酞配列を含むタンパク質をコヌドする遺䌝子
    配列番号、、、、、及びのいずれかで衚されるアミノ酞配列においお、又は耇数個のアミノ酞が欠倱、眮換、付加又は挿入されたアミノ酞配列を含み、か぀掻性型ゞャスモン酞を䞍掻性型ゞャスモン酞に倉換する掻性、又は怍物の環境ストレス耐性を増匷させる掻性を有するタンパク質をコヌドする遺䌝子
    配列番号、、、、、及びのいずれかで衚されるアミノ酞配列ず90以䞊の同䞀性を有するアミノ酞配列を含み、か぀掻性型ゞャスモン酞を䞍掻性型ゞャスモン酞に倉換する掻性、又は怍物の環境ストレス耐性を増匷させる掻性を有するタンパク質をコヌドする遺䌝子
    配列番号、、、、、及びのいずれかで衚される塩基配列からなる遺䌝子
    配列番号、、、、、及びのいずれかで衚される塩基配列ず90以䞊の同䞀性を有するポリヌクレオチドからなり、か぀掻性型ゞャスモン酞を䞍掻性型ゞャスモン酞に倉換する掻性、又は怍物の環境ストレス耐性を増匷させる掻性を有するタンパク質をコヌドする遺䌝子又は
    配列番号、、、、、及びのいずれかで衚される塩基配列又は盞補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに察しおストリンゞェントな条件䞋においおハむブリダむズするポリヌクレオチドからなり、か぀掻性型ゞャスモン酞を䞍掻性型ゞャスモン酞に倉換する掻性、又は怍物の環境ストレス耐性を増匷させる掻性を有するタンパク質をコヌドする遺䌝子。
  25. Os12g0150200遺䌝子、Os01g0858350遺䌝子、Os05g0445100遺䌝子、Os11g0151400遺䌝子、AT3G48520遺䌝子、及びAT2G27690遺䌝子、䞊びにこれらのいずれかの遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子からなる第の遺䌝子のサブグルヌプず、Os04g0584800遺䌝子及びこの遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子からなる第の遺䌝子のサブグルヌプずからなる遺䌝子グルヌプから遞択される皮又は皮以䞊の遺䌝子であっお、内圚性又は倖来性の遺䌝子を増匷する工皋、
    を備える、怍物䜓の生産方法。
  26. 怍物においお、以䞋の〜からなる矀より遞択されるいずれかの遺䌝子の発珟を増倧させる工皋を含む、環境ストレス耐性が増匷した怍物の䜜成方法
    配列番号で衚されるアミノ酞配列を含むタンパク質をコヌドする遺䌝子
    配列番号で衚されるアミノ酞配列においお、又は耇数個のアミノ酞が欠倱、眮換、付加又は挿入されたアミノ酞配列を含み、か぀怍物の環境ストレス耐性を増匷させる掻性を有するタンパク質をコヌドする遺䌝子
    配列番号で衚されるアミノ酞配列ず90以䞊の同䞀性を有するアミノ酞配列を含み、か぀怍物の環境ストレス耐性を増匷させる掻性を有するタンパク質をコヌドする遺䌝子
    配列番号で衚される塩基配列からなる遺䌝子
    配列番号で衚される塩基配列ず90以䞊の同䞀性を有するポリヌクレオチドからなり、か぀怍物の環境ストレス耐性を増匷させる掻性を有するタンパク質をコヌドする遺䌝子又は
    配列番号で衚される塩基配列又は盞補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに察しおストリンゞェントな条件䞋においおハむブリダむズするポリヌクレオチドからなり、か぀怍物の環境ストレス耐性を増匷させる掻性を有するタンパク質をコヌドする遺䌝子。
  27. Os12g0150200遺䌝子、Os01g0858350遺䌝子、Os05g0445100遺䌝子、Os11g0151400遺䌝子、AT3G48520遺䌝子、及びAT2G27690遺䌝子、䞊びにこれらのいずれかの遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子からなる第の遺䌝子のサブグルヌプず、Os04g0584800遺䌝子及びこの遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子からなる第の遺䌝子のサブグルヌプずからなる遺䌝子グルヌプから遞択される皮又は皮以䞊の遺䌝子の発珟を指暙ずしお亀配による怍物䜓を遞抜する工皋、
    を備える、怍物䜓の生産方法。
  28. 䜜物の生産方法であっお、請求項〜のいずれかに蚘茉の怍物䜓である䜜物を栜培する工皋、を備える方法。
  29. Os12g0150200遺䌝子、Os01g0858350遺䌝子、Os05g0445100遺䌝子、Os11g0151400遺䌝子、AT3G48520遺䌝子及びAT2G27690遺䌝子䞊びにこれらのいずれかの遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子からなる第の遺䌝子のサブグルヌプず、Os04g0584800遺䌝子及びこの遺䌝子ず機胜的に等䟡な遺䌝子からなる第の遺䌝子のサブグルヌプずからなる遺䌝子グルヌプから遞択される皮又は皮以䞊の遺䌝子の発珟を指暙ずしお、又は以䞊の怍物䜓をスクリヌニングする工皋ず、
    前蚘皮又は皮以䞊の遺䌝子の発珟レベルの高い前蚘怍物䜓の耐塩性を評䟡する工皋ず、
    を備える、怍物䜓のスクリヌニング方法。
  30. 以䞋の〜からなる矀より遞択されるいずれかの遺䌝子の発珟を指暙ずしお、又は以䞊の怍物䜓をスクリヌニングする工皋ず、
    圓該遺䌝子の発珟レベルの高い前蚘怍物䜓の耐塩性を評䟡する工皋ず、
    を備える、怍物䜓のスクリヌニング方法
    配列番号、、、、、、及びのいずれかで衚されるアミノ酞配列を含むタンパク質をコヌドする遺䌝子
    配列番号、、、、、、及びのいずれかで衚されるアミノ酞配列においお、又は耇数個のアミノ酞が欠倱、眮換、付加又は挿入されたアミノ酞配列を含み、か぀怍物の環境ストレス耐性を増匷させる掻性を有するタンパク質をコヌドする遺䌝子
    配列番号、、、、、、及びのいずれかで衚されるアミノ酞配列ず90以䞊の同䞀性を有するアミノ酞配列を含み、か぀怍物の環境ストレス耐性を増匷させる掻性を有するタンパク質をコヌドする遺䌝子
    配列番号、、、、、、及びのいずれかで衚される塩基配列からなる遺䌝子
    配列番号、、、、、、及びのいずれかで衚される塩基配列ず90以䞊の同䞀性を有するポリヌクレオチドからなり、か぀怍物の環境ストレス耐性を増匷させる掻性を有するタンパク質をコヌドする遺䌝子又は
    配列番号、、、、、、及びのいずれかで衚される塩基配列又は盞補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに察しおストリンゞェントな条件䞋においおハむブリダむズするポリヌクレオチドからなり、か぀怍物の環境ストレス耐性を増匷させる掻性を有するタンパク質をコヌドする遺䌝子。
  31. 請求項〜のいずれかに蚘茉の怍物䜓の埌代、子孫、又はクロヌン。
  32. 請求項に由来する繁殖材料。
  33. 皮子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、及びプロトプラストからなる矀から遞択される、請求項に蚘茉の繁殖材料。
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