ES2335097T3 - Generacion de plantas con resistencia a patogenos mejorada. - Google Patents
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Abstract
Una planta transgénica que comprende un vector de transformación de planta que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o que es complementaria a una secuencia que codifica un polipéptido de PPR2, donde dicho polipéptido de PPR2 es una proteína de PPR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2, o un fragmento, variante u ortólogo de la misma, donde dicho fragmento, variante u ortólogo comprende una secuencia polipeptídica con una identidad de secuencia de al menos el 50% con el dominio SANT de la SEC ID Nº: 2, donde dicho polipéptido de PPR2 provoca un fenotipo de resistencia a patógeno aumentada y donde dicha planta transgénica tiene resistencia aumentada a P. parasitica con respecto a plantas de control, donde dicha secuencia de nucleótidos no es una secuencia de nucleótidos idéntica a G1789, como se describe por el documento WO 03/013227.
Description
Generación de plantas con resistencia a
patógenos mejorada.
El control de infección por patógenos de
plantas, que puede inhibir la producción de frutas, semillas,
follaje y flores y provocar reducciones en la calidad y cantidad de
los cultivos recolectados, es de importancia económica
significativa. Los patógenos provocan anualmente daños por miles de
millones de dólares en los cultivos a nivel mundial (Baker et
al. 1997, Science 276: 726-733). Por
consiguiente, se ha dedicado una cantidad creciente de
investigación a desarrollar métodos novedosos para controlar
enfermedades de plantas. Tales estudios se han centrado en la
capacidad innata de la planta de resistir la invasión por patógenos
en un esfuerzo de reforzar las propias defensas de la planta para
hacer frente a los ataques de los patógenos (Staskawicz et
al. 1996, Science 268: 661-667; Baker et
al. anteriormente).
Aunque la mayoría de los cultivos se tratan con
agentes agrícolas anti-fúngicos,
anti-bacterianos y/o agentes pesticidas, el daño
por infección patógena todavía da como resultado pérdidas de
ingresos en la industria agrícola con una base regular. Además,
muchos de los agentes usados para controlar tal infección o
infestación provocan efectos secundarios adversos en la planta y/o
el entorno. Las plantas con resistencia aumentada a infección por
patógenos disminuirían o eliminarían la necesidad de aplicación de
agentes químicos anti-fúngicos,
anti-bacterianos y/o pesticidas.
Ha habido un interés significativo en el
desarrollo de plantas transgénicas que muestren resistencia
aumentada a una amplia variedad de patógenos (Stuiver y Custers,
2001, Nature 411: 865-8; Melchers y Stuiver, 2000,
Curr Opin Plant Biol 3: 147-52; Rommens y Kishore,
2000, Curr Opin Biotechol 11: 120-5; Mourgues et
al. 1998, Trends Biotechnol 16: 203-10). La
interacción entre Arabidopsis y el oomiceto Peronospora
parasítica (mildiú) proporciona un sistema de modelo atractivo
para identificar componentes moleculares del hospedador que se
requieren para el reconocimiento del parásito fúngico (Parker et
al., 1996 Plant Cell 8: 2033-46). Varios genes
cuya expresión errónea está asociada con resistencia alterada a
P. parasítica, así como otros patógenos, se han identificado
en Arabidopsis. La sobre-expresión del gen de
NPR1 otorga resistencia a infección por P. parasitica así
como el patógeno bacteriano Pseudomonas syringae (Cao et
al., 1998 Proc Natl Acad Sic U S A 95:
6531-6536). CPR6 es la mutación semidominante
implicada en múltiples rutas de defensa (Clarke et al. 1998,
Plant Cell 10: 557-569). Lsd6 y Lsd7 son mutaciones
dominantes que provocan enfermedad aumentada y dan como resultado
el desarrollo de lesiones necróticas espontáneas y niveles elevados
de ácido salicílico (Weymann et al. 1995 Plant Cell 7: 2013-
2022). Varias mutaciones recesivas otorgan resistencia a P.
parasítica, incluyendo ssi2, en el gen SS12 que codifica una
estearoil-ACP desaturasa (Kachroo et al. 2001
Proc Natl Acad Sci U S A 98: 9448-9453), mpk4, en
un gen de MAP cinasa (Petersen et al. 2000, Cell 103:
111-20) y pmr4 (Vogel y Somerville 2000 Proc Natl
Acad Sci USA 97: 1897-1902). Las mutaciones
recesivas cpr5 y cprl también otorgan resistencia a P.
syringae y provocan un fenotipo enano (Bowling et al.
1997 Plant Cell 9: 1573-1584; Bowling et
al., 1994 Plant Cell 6: 1845-1857). El documento
WO 03/013227, que se publicó el 20 de febrero del 2003, describe la
producción de una planta transgénica que comprende una secuencia de
nucleótidos G1789 que codifica una proteína idéntica a la SEC ID
Nº: 12. Dicha secuencia de nucleótidos G1789 es la
siguiente:
siguiente:
El marcado de activación en plantas se refiere a
un método para generar mutaciones aleatorias por inserción de una
construcción de ácido nucleico heterólogo que comprende secuencias
reguladoras (por ejemplo, un potenciador) en un genoma vegetal. Las
secuencias reguladoras pueden actuar aumentando la transcripción de
uno o más genes de planta nativos; por consiguiente, el marcado de
activación es un método fructífero para generar mutantes de
ganancia de función, generalmente dominantes (véase, por ejemplo,
Hayashi et al., Science (1992) 258:
1350-1353; Weigel et al., Plant Physiology
(2000) 122: 1003-1013). La construcción insertada
proporciona un marcador molecular para la identificación rápida de
la planta nativa cuya expresión errónea provoca el fenotipo mutante.
El marcado de activación también puede provocar fenotipos de
pérdida de función. La inserción puede dar como resultado la
alteración de un gen de planta nativa, en cuyo caso, el fenotipo
generalmente es recesivo.
El marcado de activación se ha usado en diversas
especies, que incluyen tabaco y Arabidopsis, para identificar
muchos tipos diferentes de fenotipos mutantes y los genes asociados
con estos fenotipos (Wilson et al., Plant Cell (1996) 8:
659-671, Schaffer et al., Cell (1998) 93:
1219-1229; Fridborg et al., Plant Cell (1999)
11: 1019-1032; Kardailsky et al., Science
(1999) 286: 1962-1965); Christensen S et al.,
9th International Conference on Arabidopsis Research. Univ. de
Wisconsin-Madison, junio 24-28,
1998. Resumen 165). En un ejemplo, el marcado de activación se usó
para identificar mutantes con resistencia alterada a enfermedad
(Weigel et al., anteriormente).
En un primer aspecto, la invención proporciona
una planta transgénica que comprende un vector de transformación de
planta que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o que
es complementaria a una secuencia que codifica un polipéptido de
PPR2, donde dicho polipéptido de PPR2 es una proteína de PPR2 que
comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2, o un
fragmento, variante u ortólogo de la misma, donde dicho fragmento,
variante u ortólogo comprende una secuencia polipeptídica con una
identidad de secuencia de al menos el 50% con el dominio SANT de la
SEC ID Nº: 2, donde dicho polipéptido de PPR2 provoca un fenotipo de
resistencia a patógenos aumentada y donde dicha planta transgénica
tiene resistencia aumentada a P. parasítica con respecto a
plantas de control, donde dicha secuencia de nucleótidos no es una
secuencia de nucleótidos idéntica a G1789, como se describe por el
documento WO 03/013227. La planta transgénica se caracteriza por
tener resistencia aumentada a P. parasítica.
El vector de transformación puede comprender un
promotor constitutivo que controla la expresión del polipéptido de
PPR2.
La planta transgénica del primer aspecto puede
codificar un ortólogo de PPR2 que comprende una secuencia de
aminoácidos seleccionada entre una cualquiera de las SEC ID Nº:
3-14.
En un segundo aspecto, la invención proporciona
una planta transgénica que comprende un vector de transformación de
planta que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o que
es complementaria a una secuencia que codifica un polipéptido de
PPR2, donde dicho polipéptido de PPR2 es una proteína de PPR2 que
comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2, o un
fragmento, variante u ortólogo de la misma, donde dicho fragmento,
variante u ortólogo comprende una secuencia polipeptídica con una
identidad de secuencia de al menos el 50% con el dominio SANT de la
SEC ID Nº: 2, donde dicho polipéptido de PPR2 provoca un fenotipo de
resistencia a patógenos aumentada y donde dicha planta transgénica
tiene resistencia aumentada a P. parasítica con respecto a
plantas de control, donde el vector de transformación comprende un
promotor inducible por patógenos que controla la expresión del
polipéptido de PPR2.
En un tercer aspecto, la invención proporciona
una parte de planta obtenida de la planta transgénica del primer
aspecto, donde la parte de planta comprende dicha secuencia de
nucleótidos que codifica o es complementaria a una secuencia que
codifica dicho polipéptido de PPR2.
En un cuarto aspecto, la invención proporciona
un método para producir resistencia a patógenos aumentada en una
planta, comprendiendo dicho método:
- a.
- introducir en células progenitoras de la planta un vector de transformación de planta que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o que es complementaria a una secuencia que codifica un polipéptido de PPR2, donde dicho polipéptido de PPR2 es una proteína de PPR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 o un fragmento, variante u ortólogo de la misma, donde dicho fragmento, variante u ortólogo comprende una secuencia polipeptídica con una identidad de secuencia de al menos el 50% con el dominio SANT de la SEC ID Nº: 2 y donde dicho polipéptido de PPR2 provoca un fenotipo de resistencia a patógenos aumentada para P. parasítica; y
- b.
- cultivar las células progenitoras transformadas para producir una planta transgénica, donde dicha secuencia polinucleotídica se expresa y dicha planta transgénica muestra resistencia aumentada a P. parasítica con respecto a plantas de control.
\vskip1.000000\baselineskip
En un quinto aspecto, la invención proporciona
un método para generar una planta que tiene un fenotipo de
resistencia al patógeno P. parasítica aumentada que comprende
identificar una planta que tiene un alelo en su gen de PPR2 que da
como resultado una resistencia a patógenos aumentada en comparación
con plantas que carecen del alelo y que genera una progenie de
dicha planta identificada, donde la progenie generada hereda el
alelo y tiene el fenotipo de resistencia a patógeno aumentada; donde
dicho alelo comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un
polipéptido de PPR2, donde dicho polipéptido de PPR2 es una proteína
de PPR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº:
2, o un fragmento, variante u ortólogo de la misma, donde dicho
fragmento, variante u ortólogo comprende una secuencia polipeptídica
con una identidad de secuencia de al menos el 50% con el dominio
SANT de la SEC ID Nº: 2 y donde dicho polipéptido de PPR2 provoca un
fenotipo de resistencia aumentada a P. parasítica.
Dicho método puede emplear metodología de gen
candidato/QTL.
El método puede emplear metodología de
TILLING.
En una realización, el polipéptido de PPR2 tiene
una identidad de secuencia de al menos el 80% o el 90% con o tiene
la secuencia de aminoácidos presentada en la SEC ID Nº: 2.
Al menos que se indique de otro modo, todos los
términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el
mismo significado que tendrían para un especialista en la técnica de
la presente invención. Los practicantes se dirigen particularmente
a Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual
(Segunda Edición), Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., 1989
y Ausubel FM et al., Current Protocols in Molecular Biology,
John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y., 1993, para definiciones y
términos de la técnica. Se debe entender que esta invención no se
limita a la metodología, protocolos y reactivos particulares
descritos, ya que estos pueden variar.
Como se usa en este documento, el término
"vector" se refiere a una construcción de ácido nucleico
diseñada para la transferencia entre diferentes células
hospedadoras. Un "vector de expresión" se refiere a un vector
que tiene la capacidad de incorporar y expresar fragmentos de ADN
heterólogos en una célula extraña. Muchos vectores de expresión
procariotas y eucariotas están disponibles en el mercado. La
selección de vectores de expresión apropiados pertenece al
conocimiento de los especialistas en la técnica.
Una construcción o secuencia de ácido nucleico
"heterólogo" tiene una porción de la secuencia que no es nativa
a la célula vegetal en la que se expresa. Heteróloga, con respecto
a una secuencia de control, se refiere a una secuencia de control
(es decir, promotor o potenciador) que no funciona en la naturaleza
regulando el mismo gen cuya expresión actualmente está regulando.
Generalmente, las secuencias de ácido nucleico heterólogo no son
endógenas de la célula o parte del genoma en las que están presentes
y se han añadido a la célula por infección, transfección,
microinyección, electroporación o similares. Una construcción de
ácido nucleico "heterólogo" puede contener una combinación de
secuencia de control/secuencia codificante de ADN que es la misma o
diferente de una combinación de secuencia de control/secuencia
codificante de ADN encontrada en la planta nativa.
Como se usa en este documento, el término
"gen" significa el segmento de ADN implicado en producir una
cadena polipeptídica, que puede incluir o no regiones que preceden
y siguen a la región codificante, por ejemplo, secuencias no
traducidas 5' (UTR 5') o "líder" y secuencias UTR 3' o
"remolque" así como secuencias intermedias (intrones) entre
segmentos codificantes individuales (exones) y la secuencia
reguladora no transcrita.
Como se usa en este documento,
"recombinante" incluye referencia a una célula o vector que se
ha modificado por la introducción de una secuencia de ácido
nucleico heterólogo o que la célula se ha obtenido de una célula
modificada de este modo. Por tanto, por ejemplo, las células
recombinantes expresan genes que no se encuentran de forma idéntica
dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula o expresan
genes nativos que de otro modo se expresan de forma anormal, se
sub-expresan o no se expresan como resultado de
intervención humana intencionada.
Como se usa en este documento, la expresión
"expresión génica" se refiere al proceso por el que se produce
un polipéptido basándose en la secuencia de ácido nucleico de un
gen. El proceso incluye tanto transcripción como traducción; por
consiguiente, la "expresión" puede referirse a una secuencia
polinucleotídica o polipeptídica o a ambas. A veces, la expresión
de una secuencia polinucleotídica no conducirá a la traducción de la
proteína. La "sobre-expresión" se refiere a la
expresión aumentada de una secuencia polinucleotídica y/o
polipeptídica con respecto a su expresión en una planta de tipo
silvestre (u otra de referencia [por ejemplo, no transgénica]) y
puede referirse a una secuencia de origen natural o que no es de
origen natural. "Expresión ectópica" se refiere a la expresión
en un momento, lugar y/o nivel aumentado que no tiene lugar de
formar natural en la planta no alterada o de tipo silvestre.
"Sub-expresión" se refiere a la expresión
disminuida de una secuencia polinucleotídica y/o polipeptídica,
generalmente de un gen endógeno, con respecto a su expresión en una
planta de tipo silvestre. Las expresiones "expresión errónea"
y "expresión alterada" abarcan sobre-expresión,
sub-expresión y expresión ectópica.
El término "introducido" en el contexto de
insertar una secuencia de ácido nucleico en una célula quiere decir
"transfección" o "transformación" o "transducción" e
incluye referencia a la incorporación de una secuencia de ácido
nucleico en una célula eucariota o procariota donde la secuencia de
ácido nucleico se puede incorporar en el genoma de la célula (por
ejemplo, cromosoma, plásmido, plástido o ADN mitocondrial),
convertir en un replicón autónomo o expresar de forma transitoria
(por ejemplo, ARNm introducido por transfección).
Como se usa en este documento, una "célula
vegetal" se refiere a cualquier célula procedente de una planta,
incluyendo células de tejido indiferenciado (por ejemplo, callo) así
como semillas, polen, propágulos y embriones de plantas.
Como se usa en este documento, las expresiones
"nativo" y "tipo silvestre" con respecto a un rasgo o
fenotipo de planta dado se refiere a la forma en la que ese rasgo o
fenotipo se encuentra en la misma variedad de planta en la
naturaleza.
Como se usa en este documento, el término
"modificado" con respecto a un rasgo de planta se refiere a un
cambio en el fenotipo de una planta transgénica con respecto a la
planta no transgénica similar. Un "fenotipo (rasgo)
interesante" con referencia a una planta transgénica se refiere a
un fenotipo observable o medible demostrado por una planta de
generación T1 y/o posterior, que no se presenta por la no
transgénica correspondiente (es decir, una planta genotípicamente
similar que se ha generado o ensayado en condiciones similares). Un
fenotipo interesante puede representar una mejora en la planta o
puede proporcionar un medio para producir mejoras en otras plantas.
Una "mejora" es una característica que puede potenciar la
utilidad de una especie o variedad vegetal proporcionando a la
planta una cualidad única y/o novedosa.
Un "fenotipo de resistencia a patógeno
alterada" se refiere a un cambio detectable en la respuesta de
una planta modificada genéticamente a infección patógena, en
comparación con la planta similar pero no modificada. El fenotipo
puede ser evidente en la propia planta (por ejemplo, en crecimiento,
viabilidad o morfología de tejido particular de la planta) o puede
ser evidente en la capacidad del patógeno para proliferar en y/o
infectar la planta. Como se usa en este documento, "resistencia a
patógeno mejorada" se refiere a resistencia aumentada a un
patógeno.
Como se usa en este documento, una secuencia
polinucleotídica o gen "mutante" difiere de la secuencia
polinucleotídica o gen de tipo silvestre correspondiente en
términos de secuencia o expresión, donde la diferencia contribuye a
un fenotipo o rasgo vegetal modificado. Con respecto a la planta o
línea de planta, el término "mutante" se refiere a una planta
o línea de planta que tiene un fenotipo o rasgo de planta
modificado, donde el fenotipo o rasgo modificado está asociado con
la expresión modificada de una secuencia polinucleotídica o gen de
tipo silvestre.
Como se usa en este documento, el término
"T1" se refiere a la generación de plantas de la descendencia
de plantas T0. La generación T1 es el primer conjunto de plantas
transformadas que se puede seleccionar por aplicación de un agente
de selección, por ejemplo, un antibiótico o herbicida, para el que
la planta transgénica contiene el gen de resistencia
correspondiente. El término "T2" se refiere a la generación de
plantas por auto-fertilización de las flores de
plantas T1, seleccionadas previamente como transgénicas.
Como se usa en este documento, la expresión
"parte vegetal" incluye cualquier órgano o tejido vegetal,
incluyendo, sin limitación, semillas, embriones, regiones
meristemáticas, tejido calloso, hojas, raíces, vástagos,
gametofitos, esporofitos, polen y microsporas. Se pueden obtener
células vegetales de cualquier órgano o tejido vegetal y cultivos
preparados a partir de los mismos. Las clases de plantas que se
pueden usar en los métodos de la presente invención generalmente
son tan amplias como la clase de plantas superiores susceptible a
técnicas de transformación, incluyendo plantas tanto
monocotiledóneas como dicotiledóneas.
Como se usa en este documento, "planta
transgénica" incluye referencia a una planta que comprende dentro
de su genoma un polinucleótido heterólogo. El polinucleótido
heterólogo se puede integrar de forma estable en el genoma o puede
ser extra-cromosómico. Preferiblemente, el
polinucleótido de la presente invención se integra de forma estable
en el genoma de tal forma que el polinucleótido se pasa a
generaciones sucesivas. Una célula, tejido, órgano vegetal o planta
en el que se han introducido los polinucleótidos heterólogos se
consideran "transformado", "transfectado" o
"transgénico". La progenie directa e indirecta de plantas o
células vegetales transformadas que también contienen el
polinucleótido heterólogo también se considera transgénica.
Se usó una selección por marcado de activación
de Arabidopsis para identificar la asociación entre el gen
que se ha determinado "PPR2 (por Resistente a P. parasitica)," que se ha predicho que codifica una
proteína relacionada con myb, y un fenotipo de resistencia a
patógeno alterada, específicamente, resistencia aumentada al
patógeno fúngico P. parasitica (mildiú). En resumen, y como
se describe adicionalmente en los Ejemplos, un gran número de
plantas de Arabidopsis se mutó con el vector pSKI015, que
comprende un ADN-T del plásmido Ti de
Agrobacterium tumefaciens, un elemento potenciador vírico, y
un gen marcador de selección (Weigel et al., anteriormente).
Cuando el ADN-T se inserta en el genoma de plantas
transformadas, el elemento potenciador puede provocar la regulación
positiva de genes en la vecindad, generalmente en el intervalo de
aproximadamente 10 kilobases (kb) de la inserción. Las plantas T1
se expusieron al agente selectivo para recuperar específicamente
plantas transformadas que expresaban el marcador de selección y, por
lo tanto, albergaban inserciones de ADN-T. Se
plantaron muestras de aproximadamente 18 descendencias T2, se
desarrollaron hasta plantas y se inocularon con esporas de P.
parasitica. Los síntomas de enfermedad en plantas individuales
se puntuaron basándose en el número de conidióforos que surgieron.
Por consiguiente, las plantas en las que estaba reducido el
crecimiento de conidióforos se identificaron como resistentes a
patógenos.
Se identificó una línea de Arabidopsis
que mostró resistencia aumentada a infección por P.
parasitica. La asociación del gen PPR2 con el fenotipo de
resistencia a patógenos se descubrió por análisis de la secuencia
de ADN genómico que flanqueaba la inserción de ADN-T
en la línea identificada. Por consiguiente, se pueden emplear genes
y/o polipéptidos de PPR2 en el desarrollo de plantas modificadas
genéticamente que tienen un fenotipo de resistencia a patógeno
modificada. Los genes PPR2 se pueden usar en la generación de
cultivos y/u otras especies de plantas que tienen resistencia
mejorada a infección por P. parasitica y otros oomicetos y
también pueden ser útiles para la generación de planta con
resistencia mejorada a patógenos fúngicos, bacterianos y/u otros.
La expresión errónea de genes PPR2, por tanto, puede reducir la
necesidad de fungicidas y/o pesticidas. El fenotipo de resistencia
a patógenos modificada puede mejorar adicionalmente la salud global
de la planta.
La secuencia de ácido nucleico (codificante) de
PPR2 de Arabidopsis se proporciona en la SEC ID Nº: 1 y en
la entrada de Genbank GI 12331602, nucleótidos
20955-21335 (denominados F22H5.3 y Atlg75250). La
secuencia proteica correspondiente se proporciona en la SEC ID Nº:
2 y en GI 10092271.
Como se usa en este documento, el término
"polipéptido de PPR2" se refiere a una proteína de PPR2 de
longitud completa o un fragmento, derivado (variante) u ortólogo de
la misma que es "funcionalmente activa", queriendo decir que
el fragmento, derivado u ortólogo de proteína muestra una o más de
las actividades funcionales asociadas con el polipéptido de la SEC
ID Nº: 2. Un polipéptido de PPR2 funcionalmente activo provoca un
fenotipo de resistencia a patógeno alterada cuando se expresa de
forma errónea en una planta. En una realización preferida, la
expresión errónea del polipéptido de PPR2 funcionalmente activo
provoca resistencia aumentada a P. parasitica y/u otros
oomicetos. En otra realización, un polipéptido de PPR2
funcionalmente activo es capaz de rescatar la actividad de PPR2
endógena defectuosa (incluyendo deficiente) cuando se expresa en una
planta o en células vegetales; el polipéptido de rescate puede ser
de la misma especie o de una diferente de la que tiene actividad
defectuosa. En otra realización, un fragmento funcionalmente activo
de un polipéptido de PPR2 de longitud completa (es decir, un
polipéptido nativo que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 2 o un
ortólogo de origen natural del mismo) conserva una o más de las
propiedades biológicas asociadas con el polipéptido de PPR2 de
longitud completa, tales como actividad de señalización, actividad
de unión, actividad catalítica o actividad de localización celular
o extra-celular. Algunos polipéptidos de PPR2
preferidos presentan actividad de unión a ADN. Un fragmento de PPR2
comprende preferiblemente un dominio de PPR2, tal como un dominio C-
o N-terminal o catalítico, entre otros, y comprende
preferiblemente al menos 10, preferiblemente al menos 20, más
preferiblemente al menos 25 y mucho más preferiblemente al menos 50
aminoácidos contiguos de una proteína de PPR2. Se pueden
identificar dominios funcionales usando el programa PFAM (Bateman A
et al., 1999 Nucleic Acids Res 27: 260-262;
sitio web en pfam.wustl.edu). Un fragmento de PPR2 preferido
comprende un dominio SANT (SM00395) identificado por PFAM, en
aproximadamente los aminoácidos 8-60. Las variantes
funcionalmente activas de polipéptidos de PPR2 de longitud completa
o fragmentos de los mismos incluyen polipéptidos con inserciones,
deleciones, o sustituciones de aminoácidos que conservan una o más
de las propiedades biológicas asociadas con el polipéptido de PPR2
de longitud completa. En algunos casos, se generan variantes que
cambian el procesamiento post-traduccional de un
polipéptido de PPR2. Por ejemplo, las variantes pueden tener
características de transporte de proteína o localización de
proteína alteradas o semi-vida de proteína alterada
en comparación con el polipéptido nativo.
Como se usa en este documento, la expresión
"ácido nucleico de PPR2" incluye ácidos nucleicos con la
secuencia proporcionada en o complementaria a la secuencia
proporcionada en la SEC ID Nº: 1, así como fragmentos, derivados u
ortólogos funcionalmente activos de la misma. Un ácido nucleico de
PPR2 de esta invención puede ser ADN, obtenido de ADN genómico o
ADNc, o ARN.
En una realización, un ácido nucleico de PPR2
funcionalmente activo codifica o es complementario a un ácido
nucleico que codifica un polipéptido de PPR2 funcionalmente activo.
En esta definición se incluye ADN genómico que sirve como un molde
para un transcrito de ARN primario (es decir, un precursor de ARNm)
que requiere procesamiento, tal como corte y empalme, antes de
codificar el polipéptido de PPR2 funcionalmente activo. Un ácido
nucleico de PPR2 puede incluir otras secuencias no codificantes,
que se pueden o no transcribir; tales secuencias incluyen UTR 5' y
3, señales de poliadenilación y secuencias reguladoras que controlan
la expresión génica, entre otras, como se conoce en la técnica.
Algunos polipéptidos requieren acontecimientos de procesamiento,
tales como escisión proteolítica, modificación covalente, etc.,
para convertirse en completamente activos. Por consiguiente, los
ácidos nucleicos funcionalmente activos pueden codificar el
polipéptido de PPR2 maduro o el pre-procesado o una
forma intermedia. Un polinucleótido de PPR2 también puede incluir
secuencias codificantes heterólogas, por ejemplo, secuencias que
codifican un marcador incluido para facilitar la purificación del
polipéptido fusionado o un marcador de transformación.
En otra realización, un ácido nucleico de PPR2
funcionalmente activo es capaz de ser usado en la generación de
fenotipos de resistencia a patógeno de pérdida de función, por
ejemplo, mediante supresión antisentido,
co-supresión, etc.
En una realización preferida, un ácido nucleico
de PPR2 usado en los métodos de esta invención comprende una
secuencia de ácido nucleico que codifica o es complementaria a una
secuencia que codifica un polipéptido de PPR2 que tiene una
identidad de secuencia de al menos el 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%,
90%, 95% o más con la secuencia polipeptídica presentada en la SEC
ID Nº: 2.
En otra realización, un polipéptido de PPR2 para
el uso en la invención comprende una secuencia polipeptídica con
una identidad de al menos el 50% o el 60% con la secuencia
polipeptídica de PPR2 de la SEC ID Nº: 2, y puede tener una
identidad de secuencia de al menos el 70%, 80%, 85%, 90% o el 95% o
más con la secuencia polipeptídica de PPR2 de la SEC ID Nº: 2. En
otra realización, un polipéptido de PPR2 comprende una secuencia
polipeptídica con una identidad de secuencia de al menos el 50%,
60%, 70%, 80%, 85%, 90% o el 95% o más con un dominio SANT del
polipéptido presentado en la SEC ID Nº: 2. En otra realización más,
un polipéptido de PPR2 comprende una secuencia polipeptídica con
una identidad de al menos el 50%, 60%, 70%, 80% o el 90% con la
secuencia polipeptídica de la SEC ID Nº: 2 a lo largo de toda su
longitud y comprende un dominio SANT.
En otro aspecto, una secuencia polinucleotídica
de PPR2 es al menos del 50% al 60% idéntica a lo largo de toda su
longitud con la secuencia de ácido nucleico de PPR2 presentada como
la SEC ID Nº: 1, o secuencias de ácido nucleico que son
complementarias a tal secuencia de PPR2, y puede comprender una
identidad de secuencia de al menos el 70%, 80%, 85%, 90% o el 95% o
más con la secuencia de PPR2 presentada como SEC ID Nº: 1 o un
fragmento funcionalmente activo de la misma o secuencias
complementarias.
Como se usa en este documento, "porcentaje (%)
de identidad de secuencia" con respecto a una secuencia sujeto
especificada, o una porción especificada de la misma, se define como
el porcentaje de nucleótidos o aminoácidos en la secuencia derivada
candidata idénticos a los nucleótidos o aminoácidos en la secuencia
sujeto (o porción especificada de la misma), después de alinear las
secuencias e introducir huecos, si es necesario para conseguir el
máximo porcentaje de identidad de secuencia, como se genera por el
programa WU-BLAST-2.0a19 (Altschul
et al., J. Mol. Biol. (1990) 215: 403-410;
sitio web en blast.wustl.edu/blast/README.html) con los parámetros
de búsqueda ajustados a valores por defecto. Los parámetros HSP S y
HSP S2 son valores dinámicos y se establecen por el propio programa
dependiendo de la composición de la secuencia particular y la
composición de la base de datos particular frente a la que se está
explorando la secuencia de interés. Un "valor de % de
identidad" se determina por el número de nucleótidos o
aminoácidos idénticos coincidentes dividido por la longitud de
secuencia para la que se está describiendo el porcentaje de
identidad. El "porcentaje (%) de similitud de secuencia de
aminoácidos" se determina realizando el mismo cálculo que para
determinar el % de identidad de secuencia de aminoácidos, pero
incluyendo sustituciones de aminoácidos conservativas además de
aminoácidos idénticos en el cálculo. Una sustitución de aminoácidos
conservativa es una en la que un aminoácido se sustituye por otro
aminoácido que tiene propiedades similares, de tal forma que el
plegamiento o la actividad de la proteína no se ve afectada
significativamente. Los aminoácidos aromáticos que se pueden
sustituir entre sí son fenilalanina, triptófano y tirosina; los
aminoácidos hidrófobos intercambiables son leucina, isoleucina,
metionina y valina; los aminoácidos polares intercambiables son
glutamina y asparagina; los aminoácidos básicos intercambiables son
arginina, lisina e histidina; los aminoácidos ácidos intercambiables
son ácido aspártico y ácido glutámico; y los aminoácidos pequeños
intercambiables son alanina, serina, treonina, cisteína y
glicina.
Las moléculas de ácido nucleico derivadas de las
moléculas de ácido nucleico sujeto incluyen secuencias que hibridan
con la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 1. La
rigurosidad de la hibridación se puede controlar por temperatura,
fuerza iónica, pH y la presencia de agentes desnaturalizantes tales
como formamida durante la hibridación y el lavado. Las condiciones
usadas rutinariamente se conocen bien (véase, por ejemplo, Current
Protocol in Molecular Biology, Vol. 1, Cáp. 2.10, John Wiley &
Sons, Publishers (1994); Sambrook et al., anteriormente). En
algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico de la
invención es capaz de hibridar con una molécula de ácido nucleico
que contiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 1 en
condiciones de hibridación rigurosas que comprenden:
pre-hibridación de filtros que contienen ácido
nucleico durante 8 horas a durante una noche a 65ºC en una solución
que comprende citrato de concentración única (SSC) 6X (IX SSC es
NaCl 0,15 M, citrato de Na 0,15 M; pH 7,0), solución de Denhardt 5X,
pirofosfato sódico al 0,05% y 100 \mug/ml de ADN de esperma de
arenque; hibridación durante 18-20 horas a 65ºC en
una solución que contiene SSC 6X, solución de Denhardt 1X, 100
\mug/ml de ARNt de levadura y pirofosfato sódico al 0,05%; y
lavado de los filtros a 65ºC durante 1 h en una solución que
contiene SSC 0,2X y SDS (dodecil sulfato sódico) al 0,1%. En otras
realizaciones, se usan condiciones de hibridación moderadamente
rigurosas que comprenden: pre-tratamiento de
filtros que contienen ácido nucleico durante 6 h a 40ºC en una
solución que contiene formamida al 35%, SSC 5X,
Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), EDTA 5 mM, PVP al 0,1%,
Ficoll al 0,1%, BSA al 1% y 500 \mug/ml de ADN de esperma de
salmón desnaturalizado; hibridación durante 18-20 h
a 40ºC en una solución que contiene formamida al 35%, SSC 5X,
Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), EDTA 5 mM, PVP al 0,02%,
Ficoll al 0,02%, BSA al 0,2%, 100 \mug/ml de ADN de esperma de
salmón y sulfato de dextrano al 10% (p/vol) seguido del lavado dos
veces durante 1 hora a 55ºC en una solución que contiene SSC 2X y
SDS al 0,1%. Alternativamente, se pueden usar condiciones de baja
rigurosidad que comprenden: incubación durante 8 horas a durante una
noche a 37ºC en una solución que comprende formamida al 20%, SSC 5
x, fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), solución de Denhardt 5X, sulfato
de dextrano al 10% y 20 \mug/ml de ADN de esperma de salmón
cortado desnaturalizado; hibridación en el mismo tampón durante 18
a 20 horas; y lavado de los filtros en SSC 1 x a aproximadamente
37ºC durante 1 hora.
Como resultado de la degeneración del código
genético, se pueden producir varias secuencias polinucleotídicas
que codifican un polipéptido de PPR2. Por ejemplo, se pueden
seleccionar codones para aumentar la velocidad a la que tiene lugar
la expresión del polipéptido en especies hospedadoras particulares,
de acuerdo con el uso de codón óptimo dictado por el organismo
hospedador particular (véase, por ejemplo, Nakamura Y et al.,
Nucleic Acids Res (1999) 27: 292). Tales variantes de secuencia se
pueden usar en los métodos de esta invención.
Los métodos de la invención pueden usar
ortólogos del PPR2 de Arabidopsis. Los métodos para
identificar los ortólogos en otras especies vegetales se conocen en
la técnica. Normalmente, los ortólogos en diferentes especies
conservan la misma función, debido a la presencia de uno o más
motivos proteicos y/o estructuras tridimensionales. En la
evolución, cuando un acontecimiento de duplicación génica sigue a la
formación de especies, un único gen en una especie, tal como
Arabidopsis, puede corresponderse a múltiples genes
(parálogos) en otra. Como se usa en este documento, el término
"ortólogos" incluye parálogos. Cuando están disponibles datos
de secuencia para una especie vegetal particular, los ortólogos se
identifican generalmente por análisis de homología de secuencia,
tal como análisis BLAST, usando habitualmente secuencias cebo de
proteína. Las secuencias se asignan como un ortólogo potencial si
la secuencia de mejor coincidencia del resultado BLAST directo
recupera la secuencia buscada original en el BLAST inverso (Huynen
MA y Bork P, Proc Natl Acad Sci (1998) 95:
5849-5856; Huynen MA et al., Genome Research
(2000) 10: 1204-1210). Se pueden usar programas para
alineamiento de secuencia múltiple, tales como CLUSTAL (Thompson JD
et al., 1994, Nucleic Acids Res 22:
4673-4680) para resaltar regiones conservadas y/o
restos de proteínas ortólogas y para generar árboles filogenéticos.
En un árbol filogenético que representa múltiples secuencias
homólogas de diversas especies (por ejemplo, recuperadas mediante
análisis BLAST), las secuencias ortólogas de dos especies aparecen
generalmente más cercanas en el árbol con respecto a todas las
demás secuencias de estas dos especies. El enhebrado estructural u
otro análisis de plegamiento de proteína (por ejemplo, usando
software de ProCeryon, Biosciences, Salzburg, Austria) también puede
identificar potenciales ortólogos. También se pueden usar métodos
de hibridación de ácido nucleico para encontrar genes ortólogos y
se prefieren cuando no están disponibles datos de secuencia. La PCR
degenerada y la exploración de genotecas de ADNc o ADN genómico son
métodos comunes para encontrar secuencias génicas relacionadas y se
conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook,
anteriormente; Dieffenbach y Dveksler (Eds.) PCR Primer: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989).
Por ejemplo, se describen métodos para generar una genoteca de ADNc
de la especie vegetal de interés y sondar la genoteca con sondas
génicas parcialmente homólogas en Sambrook et al. Se puede
usar una porción altamente conservada de la secuencia codificante
de PPR2 de Arabidopsis como una sonda. Los ácidos nucleicos
ortólogos de PPR2 pueden hibridar con el ácido nucleico de la SEC
ID Nº: 1 en condiciones de rigurosidad alta, moderada o baja.
Después de la amplificación o el aislamiento de un segmento de un
supuesto ortólogo, ese segmento se puede clonar y secuenciar
mediante técnicas convencionales y utilizar como una sonda para
aislar un clon de ADNc o genómico completo. Alternativamente, es
posible iniciar un proyecto de EST para generar una base de datos de
información de secuencia para la especie vegetal de interés. En
otra estrategia, se usan anticuerpos que se unen específicamente a
polipéptidos de PPR2 conocidos para el aislamiento de ortólogo. El
análisis de transferencia de Western puede determinar que está
presente un ortólogo de PPR2 (es decir, una proteína ortóloga) en un
extracto en bruto de una especie vegetal particular. Cuando se
observa la reactividad, la secuencia que codifica el ortólogo
candidato se puede aislar mediante la exploración de genotecas de
expresión que representan la especie vegetal particular. Se pueden
construir genotecas de expresión en una diversidad de vectores
disponibles en el mercado, que incluyen lambda gt11, como se
describe en Sambrook, et al., anteriormente. Una vez que se
identifican el ortólogo o los ortólogos candidatos mediante
cualquiera de estos medios se usa la secuencia ortóloga candidata
como cebo (la "búsqueda") para el BLAST inverso frente a
secuencias de Arabidopsis u otras especies en las que se han
identificado secuencias de ácido nucleico y/o polipeptídicas de
PPR2.
Se pueden obtener ácidos nucleicos y
polipéptidos de PPR2 usando cualquier procedimiento disponible. Por
ejemplo, en la técnica se conocen bien técnicas para aislar
secuencias de ADNc o ADN genómico de interés explorando genotecas
de ADN o mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR), como se ha descrito previamente. Alternativamente, se puede
sintetizar una secuencia de ácido nucleico. Se puede usar cualquier
método conocido, tal como mutagénesis dirigida (Kunkel TA et
al., Methods Enzymol. (1991) 204: 125-39), para
introducir cambios deseados en un ácido nucleico clonado.
En general, los métodos de la invención implican
incorporar la forma deseada del ácido nucleico de PPR2 en un vector
de expresión de planta para la introducción por transformación en
células vegetales y el polipéptido de PPR2 se expresa en la planta
hospedadora.
Una molécula de ácido nucleico de PPR2 aislada
es diferente que en la forma o el entorno en el que se encuentra en
la naturaleza y se identifica y separa de al menos una molécula de
ácido nucleico contaminante con la que normalmente se asocia en la
fuente natural del ácido nucleico de PPR2. Sin embargo, una molécula
de ácido nucleico de PPR2 aislada incluye moléculas de ácido
nucleico de PPR2 contenidas en células que expresan normalmente
PPR2, donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una
localización cromosómica diferente de la de células naturales.
Se pueden usar ácidos nucleicos y polipéptidos
de PPR2 en la generación de plantas modificadas genéticamente que
tienen un fenotipo de resistencia a patógeno modificada; en general,
son de interés fenotipos de resistencia mejorada. La infección por
patógeno puede afectar a semillas, frutos, flores, follaje, tallos,
tubérculos, raíces, etc. Por consiguiente, se puede observar
resistencia en cualquier parte de la planta. La expresión alterada
del gen de PPR2 en una planta se usa para generar plantas con
resistencia aumentada a P. parasitica. En una realización
preferida, las plantas que expresan erróneamente PPR2 también pueden
presentar resistencia alterada a otros patógenos. Otros patógenos
oomicetos de interés incluyen Pythium spp, Phytophthora spp,
Bremia lactucae, Perono-sclerospora spp.,
Pseudoperonospora. Sclerophthora macrospora, Sclerospora
graminicola, Plasmopara viticola y Albugo candidia. Los
patógenos fúngicos de interés incluyen Alternaría brassicicola,
Botrytis cinerea, Erysiphe cichoracearum, Fusarium oxysporum,
Plasmodiophora brassica, Rhizoctonia solani, Colletotrichum coccode,
Sclerotinia spp., Aspergillus spp., Penicillium spp., Ustilago spp.
y Tilletia spp. Los patógenos bacterianos de interés incluyen
Agrobacterium tumefaciens, Erwinia tracheiphila, Erwinia
stewartii, Xanthomonas phaseoli, Erwinia amylovora, Erwinia
carotovora, Pseudomonas syringae, Pelargonium spp, Pseudomonas
cichorii, Xanthomonas fragariae, Pseudomonas morsprunorum,
Xanthomonas campestris.
Los métodos descritos en este documento
generalmente se pueden aplicar a todas las plantas. Aunque el
marcado de activación y la identificación génica se realizan en
Arabidopsis, el gen de PPR2 (o un ortólogo, variante o
fragmento del mismo) se puede expresar en cualquier tipo de planta.
En realizaciones preferidas, la invención se refiere a cultivos que
incluyen maíz, semilla de soja, algodón, arroz, trigo, cebada,
tomate, colza, hierba para césped y lino. Otros cultivos incluyen
alfalfa, tabaco y otros cultivos forrajeros. La invención también
se puede referir a plantas que llevan frutas y verduras, plantas
usadas en la industria de flor cortada, plantas productoras de
grano, plantas productoras de aceite y plantas productoras de
nueces, entre otras.
El especialista reconocerá que existe una amplia
diversidad de técnicas de transformación en la técnica y
continuamente se están poniendo a disposición nuevas técnicas.
Cualquier técnica que sea adecuada para la planta hospedadora diana
se puede emplear dentro del alcance de la presente invención. Por
ejemplo, las construcciones se pueden introducir en una diversidad
de formas que incluyen, pero sin limitación, como una cadena de ADN,
en un plásmido o en un cromosoma artificial. La introducción de las
construcciones en las células vegetales diana se puede conseguir
mediante una diversidad de técnicas, que incluyen, pero sin
limitación, transformación mediada por Agrobacterium,
electroporación, microinyección, bombardeo con microproyectiles,
co-precipitación del ADN con fosfato cálcico o
transformación mediada por liposomas de un ácido nucleico
heterólogo. La transformación de la planta es preferiblemente
permanente, es decir, por integración de las construcciones de
expresión introducidas en el genoma vegetal hospedador, de tal
forma que las construcciones introducidas se pasan a generaciones
de plantas sucesivas. Dependiendo del uso deseado, una construcción
de ácido nucleico heterólogo que comprende un polinucleótido de
PPR2 puede codificar toda la proteína o una porción biológicamente
activa de la misma.
En una realización, se pueden usar sistemas de
vector basados en Ti binarios para transferir los polinucleótidos.
Se conocen vectores binarios de Agrobacterium convencionales
por los especialistas en la técnica y muchos están disponibles en
el mercado (por ejemplo, pBI121 Clontech Laboratories, Palo Alto,
CA).
El procedimiento óptimo para la transformación
de plantas con vectores de Agrobacterium variará con el tipo
de planta que se está transformando. Los métodos ilustrativos de la
transformación mediada por Agrobacterium incluyen
transformación de explantes de tejido de hipocótilo, punta de
vástago, tallo u hoja, obtenido de plántulas jóvenes y/o plántulas
estériles. Tales plantas transformadas se pueden reproducir
sexualmente o por cultivo celular o tisular. La transformación con
Agrobacteriumse ha descrito previamente para un gran número
de diferentes tipos de plantas y se pueden encontrar métodos para
tal transformación en la bibliografía científica.
La expresión (incluyendo transcripción y
traducción) de PPR2 se puede regular con respecto al nivel de
expresión, el tipo o los tipos de tejidos en los que tiene lugar la
expresión y/o el estadio de desarrollo de expresión. Están
disponibles varias secuencias reguladoras heterólogas (por ejemplo,
promotores y potenciadores) para controlar la expresión de un ácido
nucleico de PPR2. Estos incluyen promotores constitutivos,
inducibles y regulables, así como promotores y potenciadores que
controlan la expresión de un modo específico de tejido o temporal.
Los promotores constitutivos ilustrativos incluyen el promotor E4 de
frambuesa (Patentes de Estados Unidos Nº 5.783.393 y 5.783.394), el
CaMV de 35S (Jones JD et al., Transgenic Res (1992) 1:
285-297), el promotor de CsVMV (Verdaguer B et
al., Plant Mol Biol (1998) 37: 1055-1067) y el
promotor de actina de melón (solicitud PCT publicada WO0056863).
Los promotores específicos de tejidos ilustrativos incluyen los
promotores E4 y E8 de tomate (Patente de Estados Unidos Nº
5.859.330) y el promotor del gen 2AII de tomate (Van Haaren MJJ
et al., Plant Mol Bio (1993) 21: 625-640). En
una realización preferida, la expresión de PPR2 está bajo el
control de un promotor inducible por patógeno (Rushton et
al., The Plant Cell (2002) 14: 749-762).
En una realización preferida, la expresión de
PPR2 está bajo el control de secuencias reguladoras de genes cuya
expresión está asociada con el promotor de CsVMV.
En otro aspecto más, en algunos casos, puede ser
deseable inhibir la expresión de PPR2 endógeno en una célula
hospedadora. Los métodos ilustrativos para practicar este aspecto de
la invención incluyen, pero sin limitación, supresión antisentido
(Smith, et al., Nature (1988) 334: 724-726;
van der Krol et al., Biotechniques (1988) 6:
958-976); co-supresión (Napoli,
et al., Plant Cell (1990) 2:279-289);
ribozimas (Publicación PCT WO 97/10328); y combinaciones de con
sentido y antisentido (Waterhouse, et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA (1998) 95: 13959-13964). Los métodos para
la supresión de secuencias endógenas en una célula hospedadora
emplean típicamente la transcripción o transcripción y traducción
de al menos una porción de la secuencia a suprimir. Tales secuencias
pueden ser homólogas a regiones codificantes así como no
codificantes de la secuencia endógena. La inhibición antisentido
puede usar toda la secuencia de ADNc (Sheehy et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85: 8805-8809), una
secuencia de ADNc parcial que incluye fragmentos de secuencia
codificante 5', (Cannon et al., Plant Molec. Biol. (1990)
15: 39-47) o secuencias no codificantes 3' (Ch'ng
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86:
10006-10010). Las técnicas de
co-supresión pueden usar todas las secuencias de ADN
(Napoli et al., anteriormente; van der Krol et al.,
The Plant Cell (1990) 2: 291-299) o una secuencia de
ADN parcial (Smith et al., Mol. Gen. Genetics (1990) 224:
477-481).
Se pueden realizar ensayos moleculares y
genéticos convencionales para analizar adicionalmente la asociación
entre un gen y un genotipo observado. Las técnicas ilustrativas se
describen más adelante.
Los patrones de expresión génica específicos de
estadio y tejido en líneas mutantes frente a de tipo silvestre se
pueden determinar, por ejemplo, mediante hibridación in situ.
Se puede realizar el análisis del estado de metilación del gen,
especialmente regiones reguladoras flanqueantes. Otras técnicas
adecuadas incluyen sobre-expresión, expresión
ectópica, expresión en otras especies vegetales y
knock-out génico (genética inversa,
knock-out dirigido, silenciamiento génico inducido
por virus [VIGS, véase Baulcombe D, (1999) Arch Virol Supl. 15:
189-201]).
En una aplicación preferida se usa el perfilado
de expresión, generalmente por análisis de micromatrices, para
medir simultáneamente diferencias o cambios inducidos en la
expresión de muchos genes diferentes. Se conocen bien en la técnica
técnicas para el análisis de micromatrices (Schena M et al.,
Science (1995) 270: 467-470; Baldwin D et
al., Cur Opin Plant Biol. (1999) 2 (2): 96-103;
Dangond F, Physiol Genomics (2000) 2: 53-58; van
Hal NL et al., J Biotechnol (2000) 78:271- -280; Richmond T y
Somerville S, Curr Opin Plant Biol (2000) 3:
108-116). Se puede realizar el perfilado de
expresión de líneas marcadas individuales. Tal análisis puede
identificar otros genes que están regulados de forma coordinada como
una consecuencia de la sobre-expresión del gen de
interés, que puede ayudar a poner un gen desconocido en una ruta
particular.
El análisis de productos génicos puede incluir
expresión de proteína recombinante, producción de antisueros,
inmunolocalización, ensayos bioquímicos para actividad catalítica u
otra, análisis de estado de fosforilación y análisis de interacción
con otras proteínas mediante ensayos de dos híbridos en
levadura.
El análisis de ruta puede incluir poner un gen o
producto génico dentro de una ruta bioquímica, metabólica o de
señalización particular basándose en su fenotipo de expresión
errónea o mediante homología de secuencia con genes relacionados.
Alternativamente, el análisis puede comprender cruces genéticos con
líneas de tipo silvestre y otras líneas mutantes (creando mutantes
dobles) para ordenar el gen en una ruta o determinar el efecto de
una mutación sobre la expresión de genes "indicadores" cadena
abajo en una ruta.
La invención proporciona adicionalmente un
método para identificar plantas que tienen mutaciones en PPR2
endógeno que otorgan resistencia a patógeno aumentada y que generan
progenie resistente a patógenos de estas plantas que no están
modificadas genéticamente. En un método, denominado "TILLING"
(por inducción dirigida de lesiones locales en el genoma (siglas de
"targeting induced local lesions in genomes") se inducen
mutaciones en la descendencia de una planta de interés, por
ejemplo, usando tratamiento con EMS. Las plantas resultantes se
desarrollan y se auto-fertilizan y la progenie se
usa para preparar muestras de ADN. Se usa PCR específica de PPR2
para identificar si una planta mutada tiene una mutación de PPR2.
Después, las plantas que tienen mutaciones de PPR2 se pueden
ensayar para resistencia a patógenos o, alternativamente, las
plantas se pueden ensayar para resistencia a patógenos y después se
usa PCR específica de PPR2 para determinar si una planta que tiene
resistencia a patógenos aumentada tiene un gen de PPR2 mutado. El
TILLING puede identificar mutaciones que pueden alterar la
expresión de genes específicos o la actividad de proteínas
codificadas por estos genes (véase Colbert et al. (2001)
Plant Physiol 126: 480-484; McCallum et al.
(2000) Nature Biotechnology 18: 455-457).
En otro método, se puede usar una estrategia de
gen candidato/Locus de Rasgo Cuantitativo (QTL) en un programa de
mejora genética asistido por marcador para identificar alelos de o
mutaciones en el gen de PPR2 u ortólogos de PPR2 que pueden otorgar
resistencia aumentada a patógenos (véase Foolad et al., Theor
Appl Genet. (2002) 104(6-7):
945-958; Rothan et al., Theor Appl Genet
(2002) 105(1): 145-159); Dekkers y Hospital,
Nat Rev Genet. (2002) Jan; 3(1):22-32). Por
tanto, en un aspecto adicional de la invención, se usa un ácido
nucleico de PPR2 para identificar si una planta que tiene
resistencia a patógenos aumentada tiene una mutación en PPR2
endógeno o tiene un alelo particular que provoca la resistencia a
patógenos aumentada.
Aunque la invención se ha descrito con
referencia a métodos y realizaciones específicas, se entenderá que
se pueden realizar diversas modificaciones y cambios sin apartarse
de la invención. Todas las publicaciones citadas en este documento
se citan con el propósito de describir y revelar composiciones y
metodologías que se podrían usar en relación con la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Se generaron mutantes usando el vector
"ACTTAG" de marcado de activación, pSKI015 (GI 6537289; Weigel
D et al., 2000). Se usaron métodos convencionales para la
generación de plantas transgénicas de Arabidopsis y eran
esencialmente como se ha descrito en la solicitud publicada PCT
WO0183697. En resumen, se transformaron plantas de
Arabidopsis T0 (Col-0) con
Agrobacteriumque llevaba el vector pSKI015, que comprende
ADN-T procedente del plásmido Ti de Agrobacterium,
un gen marcador de selección de resistencia a herbicidas y el
elemento potenciador 35S de CaMV 4X. Se seleccionaron las plantas
transgénicas en la generación T1 basándose en la resistencia a
herbicida. La descendencia T2 se recogió de plantas T1 y se almacenó
en una colección catalogada y se accedió a una porción de los
descendientes T2 para la exploración.
Aproximadamente 18 descendientes T2 de cada una
de las más de 40.00 líneas ensayadas se plantaron en tierra. Las
semillas se estratificaron durante tres días y después se cultivaron
en el invernadero durante 7 días. Las plántulas jóvenes se
inocularon con aproximadamente 1x10^{5} conidios por ml de esporas
de P. parasitica y se incubaron en una sala de rocío a 18ºC
y humedad al 100% durante 24 horas. Después, las plantas se
trasladaron a una sala de crecimiento a 20ºC y humedad relativa del
60% con un periodo de luz de 10 horas durante 6 días. Las plantas
individuales se evaluaron para presencia o ausencia de conidióforos
en cotiledones. Las líneas en las que al menos una única planta no
mostró crecimiento de conidióforos se re-ensayaron
en una exploración secundaria liberando tres conjuntos de 18
descendientes y explorando para resistencia a crecimiento de P.
parasitica como anteriormente.
Las líneas en las que un número significativo de
plantas no mostró conidióforos después de la infección se
sometieron a una exploración terciaria. Aproximadamente 54
descendientes T2 se liberaron, se plantaron individualmente y se
infectaron con P. parasitica como anteriormente. Las plantas
se evaluaron para el número de conidióforos que crecían en un único
cotiledón y clasificaron por el siguiente sistema de puntuación: una
puntuación de 0 indica 0 conidióforos por cotiledón, 1 indica
1-5 conidióforos por cotiledón, 2 indica
6-10 conidióforos por cotiledón, 3 indica
11-20 conidióforos por cotiledón y 4 indica más de
20 conidióforos por cotiledón.
La línea ACTTAG denominada WO00058335 se
identificó como que tenía un fenotipo de resistencia aumentada.
Específicamente, el 15,2% de las plantas individuales no mostró
conidióforos en la exploración secundaria. En la exploración
terciaria, 31 plantas se puntuaron como 0 (39,2%), 31 como 1
(39,2%), 4 como 2 (5,1%), 10 como 3 (12,7%) y 3 como 4 (3,8%). Las
plantas Col-0 de tipo silvestre de control eran más
susceptibles; 36 plantas se puntuaron con 0 (7,6%), 21 como 1
(4,4%), 79 como 2 (16,6%), 250 como 3 (52,5%) y 90 como 4
(18,9%).
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizaron análisis moleculares
convencionales esencialmente como se describe en la solicitud de
Patente PCT WO01836 para determinar el sitio de inserción del
ADN-T asociado con el fenotipo de resistencia a
patógeno aumentada. En resumen, se extrajo ADN genómico de plantas
que muestran resistencia a patógeno aumentada. La PCR, usando
cebadores específicos para el vector pSKI015, confirmo la presencia
del potenciador 35S en plantas de la línea WO00058335, y el
análisis de transferencia de Southern verificó la integración
genómica del ADN-T de ACTTAG y mostró la presencia
de una única inserción de ADN-T en la línea
transgénica.
Se usaron rescate de plásmido y PCR inversa para
recuperar el ADN genómico que flanquea la inserción de
ADN-T, que después se sometió a análisis de
secuencia.
La secuencia que flanquea el borde de
ADN-T derecho se sometió a una búsqueda de BLASTN
básica y/o una búsqueda de la base de datos Arabidopsis
Information Resource (TAIR) (disponible en la página web
Arabidopsis.org), que puso de manifiesto una identidad de
secuencia con BAC F22H5, (GI 12331602), mapeado en el cromosoma 1.
La unión del borde izquierdo del ADN-T es en el
nucleótido 20167 de F22H5 y la unión del borde derecho es en el
nucleótido 20229. El análisis de secuencia puso de manifiesto que el
ADN-T se había insertado en la vecindad (es decir,
dentro de aproximadamente 10 kb) del gen cuya secuencia de
nucleótidos se presenta como la SEC ID Nº: 1 y GI 12331602,
nucleótidos 20955-21335, y que se denominó PPR2.
Específicamente, el borde derecho estaba aproximadamente 500 pb
cadena arriba del codón de inicio de la SEC ID Nº: 1.
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de aminoácidos predicha de la
secuencia de ácido nucleico de PPR2 se presenta en la SEC ID Nº: 2
y GI 10092271.
Se realizaron análisis de secuencia con BLAST
(Altschul et al., 1997, J. Mol. Biol.
215:403-410), PFAM (Bateman et al., 1999),
PSORT (Nakai K y Horton P, 1999, Trends Biochem Sci 24:
34-6) y CLUSTALW (Thompson JD et al., 1994,
Nucleic Acids Res 22: 4673-4680), entre otros.
La proteína de PPR2 se ha caracterizado como una
proteína relacionada con myb. El análisis de PFAM indicó un dominio
de unión a ADN SANT aproximadamente en los aminoácidos
8-60.
El oncogen retroviral v-myb y su
equivalente celular c-myb codifican proteínas de
unión a ADN nuclear (Klempnauer y Sippel, 1987, EMBO J. 6: 2719-
2725; Biednkapp et al. 1988, Nature 335:
835-837). Éstas pertenecen a la familia de dominio
SANT que reconocen específicamente la secuencia
YAAC(G/T)G (Aasland et al. 1996, Trends
Biochem. Sci. 21: 87-88). En myb, una de las
regiones más conservadas que consiste en tres repeticiones en
tándem se ha demostrado que está implicada en la unión a ADN.
El análisis usando BLASTP o TBLASTN identificó
varias proteínas relacionadas y proteínas predichas a partir de
secuencias de ácido nucleico (generalmente EST) en otras especies
vegetales. Las secuencias relacionadas, que son ortólogos
candidatos, se presentan en las SEC ID Nº: 3-14 y a
continuación se proporcionan descripciones de GenBank:
- \quad
- traducción de la SEC ID Nº: 3, gi|887283|gb|L38243.1|L38243 BNAF0581E Mustard flower buds Brassica rapa cDNA -ORF 98aa Brassica rapa
- \quad
- traducción de la SEC ID Nº: 4, gi|18459015|gb|BM437293.1|BM437293 WA017C08_54081 An expressed sequence tag database for abiotic st 75aa Vitis vinifera
- \quad
- traducción de la SEC ID Nº: 5, gi|15288211|gb|BI472102.1|BI472102 sah99e03.y1 Gm-c1050 Glycine max cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE 97aa Glycine max
- \quad
- traducción de la SEC ID Nº: 6, gi|15258392|gb|BI433702.1|BI433702 EST536463 P. infestans-challenged leaf Solanum tuberosum cDNA clo 88aa Solanum tuberosum traducción de la SEC ID Nº: 7, gi|14492357|gb|BI071737.1 |BI071737 C063P09U Populus strain T89 leaves Populus tremula x Populus trem 71aa P o
- \quad
- traducción de la SEC ID Nº: 8, gi|7981380|emb|CAB91874.1| (AJ277944) myb- related protein [Lycopersicon esculentum] 88aa Lycopersicon esculentum
- \quad
- SEC ID Nº: 9 gi|5091605|gb|AAD39594.1|AC007858_8 (AC007858) 10A19I.9 [Oryza sativa] 126aa Oryza sativa
- \quad
- SEC ID Nº: 10 gi|5091604|gb|AAD39593.1|AC007858_7 (AC007858) 10A19I.8 [Oryza sativa] 236aa Oryza sativa
- \quad
- SEC ID Nº: 11 gi|18394750|ref|NP_564087.1| (NM_101808) myb-related protein, putative [Arabidopsis thaliana] 92aa Arabidopsis thaliana
- \quad
- SEC ID Nº: 12 gi|15226604|ref|NP_179759.1| (NM_127736) unknown protein [Arabidopsis thaliana]gi|4567225 |gb|AAD236 101aa Arabidopsis thaliana
- \quad
- SEC ID Nº: 13 gi|15234999|ref|NP_195636.1| (NM_120086) putative protein [Arabidopsis thaliana]gi|7487341 |pir||T08 97aa Arabidopsis thaliana
- \quad
- SEC ID Nº: 14 gi|8778436|gb|AAF79444.1|AC025808_26 F18014.26 [Arabidopsis thaliana].
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó análisis por PCR, usando cebadores para
secuencias en pSKI015 o que flanquean el inserto, para detectar
líneas que contienen o que carecen del inserto. Los individuos
WO00058335 analizados en la exploración terciaria se genotiparon.
Los resultados indicaron que las plantas que eran homocigóticas o
hemicigóticas para el inserto eran más resistentes a infección por
P. parasitica que plantas que eran de tipo silvestre
homocigóticas; el 100% de las plantas homocigóticas para el inserto
y el 97% de las plantas hemicigóticas para la inserción recibieron
puntuaciones de resistencia de 0 ó 1 mientras que solamente el 31%
de los segregantes de tipo silvestre puntuaron con 0 ó 1. Estos
resultados sugieren que el rasgo de resistencia a P.
parasitica en WO00058335 está provocado por la
sobre-expresión de PPR2 y se hereda de un
modo dominante.
El análisis de RT-PCR mostró que
el gen de PPR2 estaba sobre-expresado en plantas de
la línea que presenta el fenotipo de resistencia a P.
parasitica. Específicamente, se extrajo ARN de tejidos obtenidos
de plantas que muestran el fenotipo de resistencia y de plantas
COL-0 de tipo silvestre. Se realizó
RT-PCR usando cebadores específicos para la
secuencia presentada como la SEC ID Nº: 1, para otros genes
predichos en la vecindad de la inserción de ADN-T
(Atlg75240, Atlg75260 y Atlg75270) y para una actina expresada
constitutivamente (control positivo). Los resultados mostraron que
las plantas que presentan el fenotipo de PPR2
sobre-expresaron el ARNm para el gen de PPR2,
indicando que la expresión aumentada del gen de PPR2 está
correlacionada con el fenotipo de PPR2.
\vskip1.000000\baselineskip
Las plantas de Arabidopsis del ecotipo Ws
se transforman por transformación mediada por Agrobacterium
con una construcción que contiene las secuencias codificantes del
gen PPR2 (Atlg75250, alias F22H5.3; GI:10092271) detrás del
promotor de CsVMV y delante del terminador nos o un gen de control
no relacionado con resistencia a patógeno. Estas dos construcciones
contienen el gen nptII para otorgar resistencia a kanamicina en
plantas. Se recogen descendientes T1 de las plantas transformadas y
los transformantes se seleccionan germinando semillas en medio de
agar que contiene kanamicina. Los transformantes resistentes a
kanamicina se trasplantan a tierra después de 7 días y se cultivan
durante 4 semanas. Las plantas de control se germinan en medio de
agar sin kanamicina, se trasplantan a tierra después de 7 días y se
cultivan en tierra durante 4 semanas.
\newpage
Para evaluar la resistencia a patógenos, los
transformantes y las plantas de control se pulverizan con una
suspensión de 1 x 10^{5} conidios por ml de P. parasitica,
se incuban con humedad del 100% durante 1 día y se cultivan durante
6 días más en la sala de crecimiento. Después de este periodo de
cultivo, las plantas se clasifican para gravedad de síntomas de la
enfermedad. Una puntuación de 0 significa que las hojas tienen el
0-10% del número de conidióforos creciendo sobre la
superficie de la hoja como una planta completamente susceptible, 1
significa el 10-25% del número de conidióforos, 2
significa el 25-50%, 3 significa el
50-75% y 4 significa el 75-100%.
Las plantas transformadas con PPR2 y las plantas transformadas con
el gen de control se examinan.
Se obtienen puntuaciones de grado de infección
de cada planta ensayada. Como grupo, los transformantes de PPR2 son
más resistentes a infección por P. parasitica que las plantas
de control demostrando que las plantas que
sobre-expresan PPR2 son significativamente más
resistentes a infección por P. parasitica que las plantas de
tipo silvestre.
<110> AGRINOMICS, LLC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> GENERACIÓN DE PLANTAS CON
RESISTENCIA A PATÓGENOS AUMENTADA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
AG03-033C-PC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/375.333
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
24-04-2002
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 381
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 126
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Brassica rapa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Vitis vinifera
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 97
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glycine max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Solanum tuberosum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Populus tremula
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lycopersicon esculentum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 126
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 236
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 97
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 639
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
Claims (9)
1. Una planta transgénica que comprende un
vector de transformación de planta que comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica o que es complementaria a una secuencia que
codifica un polipéptido de PPR2, donde dicho polipéptido de PPR2 es
una proteína de PPR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la
SEC ID Nº: 2, o un fragmento, variante u ortólogo de la misma,
donde dicho fragmento, variante u ortólogo comprende una secuencia
polipeptídica con una identidad de secuencia de al menos el 50% con
el dominio SANT de la SEC ID Nº: 2, donde dicho polipéptido de PPR2
provoca un fenotipo de resistencia a patógeno aumentada y donde
dicha planta transgénica tiene resistencia aumentada a P.
parasitica con respecto a plantas de control, donde dicha
secuencia de nucleótidos no es una secuencia de nucleótidos idéntica
a G1789, como se describe por el documento WO 03/013227.
2. Una planta transgénica de la reivindicación
1, en la que el vector de transformación comprende un promotor
constitutivo que controla la expresión del polipéptido de PPR2.
3. Una planta transgénica que comprende un
vector de transformación de planta que comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica o que es complementaria a una secuencia que
codifica un polipéptido de PPR2, donde dicho polipéptido de PPR2 es
una proteína de PPR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la
SEC ID Nº: 2, o un fragmento, variante, u ortólogo de la misma,
donde dicho fragmento, variante, u ortólogo comprende una secuencia
polipeptídica con una identidad de secuencia de al menos el 50% con
el dominio SANT de la SEC ID Nº: 2, donde dicho polipéptido de PPR2
provoca un fenotipo de resistencia a patógeno aumentada y donde
dicha planta transgénica tiene resistencia aumentada a P.
parasitica con respecto a plantas de control, donde el vector
de transformación comprende un promotor inducible por patógeno que
controla la expresión del polipéptido de PPR2.
4. La planta transgénica de la reivindicación 1,
que codifica un ortólogo de PPR2 que comprende una secuencia de
aminoácidos seleccionada entre una cualquiera de las SEC ID Nº:
3-14.
5. Un método para producir resistencia a
patógeno aumentada en una planta, comprendiendo dicho método:
- a.
- introducir en células progenitoras de la planta un vector de transformación de planta que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o que es complementaria a una secuencia que codifica un polipéptido de PPR2, donde dicho polipéptido de PPR2 es una proteína de PPR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 o un fragmento, variante u ortólogo de la misma, donde dicho fragmento, variante u ortólogo comprende una secuencia polipeptídica con una identidad de secuencia de al menos el 50% con el dominio SANT de la SEC ID Nº: 2, y donde dicho polipéptido de PPR2 provoca un fenotipo de resistencia a patógenos aumentada para P. parasitica; y
- b.
- cultivar las células progenitoras transformadas para producir una planta transgénica, donde dicha secuencia polinucleotídica se expresa y dicha planta transgénica muestra resistencia aumentada a P. parasitica con respecto a plantas de control.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Una parte de planta obtenida de una planta de
acuerdo con la reivindicación 1, donde la parte de planta comprende
dicho vector de transformación de planta que comprende dicha
secuencia de nucleótidos que codifica o que es complementaria a una
secuencia que codifica dicho polipéptido de PPR2.
7. Un método para generar una planta que tiene
un fenotipo de resistencia aumentada al patógeno P.
parasitica que comprende identificar en una planta un alelo del
gen PPR2 que da como resultado una resistencia a patógeno aumentada
en comparación con plantas que carecen del alelo y generar progenie
de dicha planta, donde la progenie generada hereda el alelo y tiene
el fenotipo de resistencia a patógeno aumentada; donde dicho alelo
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido
de PPR2, donde dicho polipéptido de PPR2 es una proteína de PPR2
que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2, o un
fragmento, variante u ortólogo de la misma, donde dicho fragmento,
variante u ortólogo comprende una secuencia polipeptídica con una
identidad de secuencia de al menos el 50% con el dominio SANT de la
SEC ID Nº: 2 y donde dicho polipéptido de PPR2 provoca un fenotipo
de resistencia aumentada a P. parasitica.
8. El método de la reivindicación 7 que emplea
metodología de gen candidato/QTL.
9. El método de la reivindicación 7 que emplea
metodología TILLING.
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