JP6888906B2 - 生物体のゲノムの改変方法及びその利用 - Google Patents
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Description
生物体の細胞内において、常温域にDNA二本鎖切断活性の至適温度を有するタンパク質を用いて前記生物体のゲノムを改変する改変工程を備える、改変方法。
(2)前記タンパク質は、好熱菌でない細菌由来の制限酵素である、(1)に記載の改変方法。
(3)前記タンパク質の前記DNA二本鎖切断活性の前記至適温度は、25℃以上40℃以下である、(1)又は(2)に記載の改変方法。
(4)前記生物体は、真核生物体である、(1)〜(3)のいずれかに記載の改変方法。
(5)前記改変工程は、20℃以上45℃以下で実施する、(1)〜(4)のいずれかに記載の改変方法。
(6)前記改変工程は、10分以上3時間以下実施する、(5)に記載の改変方法。
(7)前記タンパク質をコードする外来遺伝子の発現によって得られる前記タンパク質を用いる、(1)〜(6)のいずれかに記載の改変方法。
(8)前記改変工程は、前記タンパク質の産生を、前記生物体の生育能を維持しつつ前記ゲノムを改変可能な程度に制御する工程である、(1)〜(7)のいずれかに記載の改変方法。
(9)前記改変工程は、前記外来遺伝子の発現を誘導して前記生物体のゲノムを改変する工程である、(6)に記載の改変方法。
(10)前記改変工程は、前記外来遺伝子の発現を定常的に維持して前記生物体のゲノムを改変する工程である、(8)又は(9)に記載の改変方法。
(11)前記改変工程は、前記タンパク質を前記生物体の細胞に直接供給して作用させる工程である、(1)〜(6)のいずれかに記載の改変方法。
(12)前記タンパク質は、HinP1I、MseI、HaeIII、AluI、MboI、及びHbaIからなる群から選択される1種又は2種以上の制限酵素である、(1)〜(10)のいずれかに記載の改変方法。
(13)前記生物体は、植物体又はその一部である、(1)〜(12)のいずれかに記載の改変方法。
(14)前記植物体又はその一部は、種子、茎頂、側芽、花芽、花粉、子房、胚乳及び胚並びにこれらの一部からなる群から選択される1種又は2種以上である、(13)に記載の改変方法。
(15)前記生物体は、微生物である、(1)〜(12)のいずれかに記載の改変方法。
(16)ゲノムが改変された生物体集団の生産方法であって、
親生物体の細胞内において、常温域にDNA二本鎖切断活性の至適温度を有するタンパク質を作用させて前記親生物体のゲノムを改変する改変工程、
を備える、生産方法。
(17)ゲノムが改変された生物体の生産方法であって、
親生物体の細胞内において、常温域にDNA二本鎖切断活性の至適温度を有するタンパク質を作用させて前記親生物体のゲノムを改変する改変工程と、
改変されたゲノムを保持する真核生物体の集団から、任意の指標に基づいて意図する真核生物体を選抜する工程と、
を備える、生産方法。
(18)育種用材料であって、
常温域に至適温度を呈するDNA二本鎖切断活性を有するタンパク質をコードするコード領域を有するDNAを備え、
前記コード領域は、前記育種材料のホスト内でプロセッシングされないイントロンを含む、育種用材料。
(19)真核生物体用の発現ベクターである、(18)に記載の育種用材料。
(20)前記ホストは、原核生物である、(18)又は(19)に記載の育種用材料。
本開示の生物体のゲノムの改変方法(以下、本改変方法という。)は、生物体の細胞内においてDNA二本鎖切断活性を有するタンパク質(以下、本タンパク質という。)を常温域で作用させて前記生物体のゲノムを改変する改変工程、を備えることができる。
(生物体)
本改変方法は、任意の生物体に適用可能である。生物体としては、真核生物体及び原核生物体が含まれる。真核生物体としては、動物体、植物体、真核性微生物が挙げられる。動物体としては特に限定しないで、哺乳動物及び各種の魚類などの非哺乳動物又はその一部が挙げられる。また、動物又はその一部としては、動物に由来するものであればよく、細胞、組織、器官、未受精卵、受精卵などいずれの形態であってもよい。受精卵など、完全な動物に再生する能力を保持しているものであれば、改変した動物を得るのに都合がよい。
ナス科:タバコ(Nicotiana tabacum)、ナス(Solanum melongena)、ジャガイモ(Solaneum tuberosum)、トマト(Lycopersicon lycopersicum)、トウガラシ(Capsicum annuum)、ペチュニア(Petunia)など。
マメ科:ダイズ(Glycine max)、エンドウ(Pisum sativum)、ソラマメ(Vicia faba)、フジ(Wisteria floribunda)、ラッカセイ(Arachis. hypogaea)、ミヤコグサ(Lotus corniculatus var. japonicus)、インゲンマメ(Phaseolus vulgaris)、アズキ(Vigna angularis)、アカシア(Acacia)など。
キク科:キク(Chrysanthemum morifolium)、ヒマワリ(Helianthus annuus)など。
ヤシ科:アブラヤシ(Elaeis guineensis、Elaeis oleifera)、ココヤシ(Cocos nucifera)、ナツメヤシ(Phoenix dactylifera)、ロウヤシ(Copernicia)など。
ウルシ科:ハゼノキ(Rhus succedanea)、カシューナットノキ(Anacardium occidentale)、ウルシ(Toxicodendron vernicifluum)、マンゴー(Mangifera indica)、ピスタチオ(Pistacia vera)など。
ウリ科:カボチャ(Cucurbita maxima、Cucurbita moschata、Cucurbita pepo)、キュウリ(Cucumis sativus)、カラスウリ(Trichosanthes cucumeroides)、ヒョウタン(Lagenaria siceraria var. gourda)など。
バラ科:アーモンド(Amygdalus communis)、バラ(Rosa)、イチゴ(Fragaria)、サクラ(Prunus)、リンゴ(Malus pumila var. domestica)など。
ナデシコ科:カーネーション(Dianthus caryophyllus)など。
ヤナギ科:ポプラ(Populus trichocarpa、Populus nigra、Populus tremula)など。
イネ科:トウモロコシ(Zea mays)、イネ(Oryza sativa)、オオムギ(Hordeum vulgare)、コムギ(Triticum aestivum)、タケ(Phyllostachys)、サトウキビ(Saccharum officinarum)、ネピアグラス(Pennisetum pupureum)、エリアンサス(Erianthus ravenae)、ミスキャンタス(ススキ)(Miscanthus virgatum)、ソルガム(Sorghum)スイッチグラス(Panicum)など。
ユリ科:チューリップ(Tulipa)、ユリ(Lilium)など。
フトモモ科:ユーカリ(Eucalyptus camaldulensis、Eucalyptus grandis)など。
本改変方法においては、各種生物体又はその一部を用いるが、生物体のゲノムセットの倍数性は特に問わない。すなわち、その生物体の本来の倍数性を備える正倍数体であってもよいし、その生物体の本来の倍数性(正倍数性)を超える倍数体であってもよいし、さらに、その生物体の本来の倍数性を下回る倍数体であってもよい。また、同質倍数体であってもよいし、異質倍数体であってもよい。また、整数倍の倍数体のほか、一部の染色体の数が変異している異数性を備える異数体であってもよい。真核生物体の染色体の倍数性については、従来公知の方法によって決定できるほか、例えば、フローサイトメーターやタイリングアレイなどの方法によって決定することができる。
本工程では、生物体の細胞内において、本タンパク質、すなわち、DNA二本鎖切断活性を有するタンパク質を作用させる。本タンパク質としては、特に限定しないが、典型的には、公知のDNA二本鎖切断酵素又はその変異体を用いることができる。
ホスホジエステル結合数(pmol)=
[2×フォームIIIの線量(cpm)+フォームIIの線量(cpm))/(フォームI、II及びIIIの合計線量(cpm))]×DNA量(pmol)
次いで、生物体の細胞内において本タンパク質を作用させる態様について説明する。以下の説明において、生物体の細胞内というときには、生物体の態様は特に限定するものではない。例えば、生物体が植物体の場合には、植物体の態様は問わないで、植物個体の一部としての細胞、組織、器官のほか、種子、幼苗、あるいはその後の成長した植物個体のほか、カルスにおける細胞内を意味している。また、生物体が、酵母など微生物の場合には、その細胞内で本タンパク質を作用させることを意味する。
生物体の細胞内において常温域にDNA二本鎖切断活性の至適温度を有する1又は2以上のタンパク質を1又は2以上の条件下で作用させる工程と、
前記1又は2以上のタンパク質の前記1又は2以上の条件下での作用状態を前記生物体の生育状態又は前記生物体における遺伝的組換えを指標として前記タンパク質の作用状態を評価する工程と、
を備える、評価方法も提供される。
生物体の細胞内において常温域にDNA二本鎖切断活性の至適温度を有する1又は2以上のタンパク質を1又は2以上の作用条件下で作用させる工程と、
前記1又は2以上のタンパク質の前記1又は2以上の作用条件下での作用状態を前記生物体の生育状態又は前記生物体における遺伝的組換えを指標として前記タンパク質の作用状態を評価する工程と、
を備え、
前記評価に基づいて前記システムに用いるタンパク質及び/又はその作用条件を決定する、方法も提供される。
本明細書の開示の育種材料は、常温域にDNA二本鎖切断活性の至適温度を有するタンパク質をコードするコード領域を有するDNAを備え、前記コード領域は、前記育種材料のホスト内でプロセッシングされないイントロンを含むことができる。かかる育種材料によれば、このイントロンの存在により、DNA二本鎖切断活性を有する成熟タンパク質として合成されない。この結果、成熟タンパク質が発揮するDNA二本鎖切断活性によってこのDNAを保持するホストの生育活性が低下することが抑制又は回避される。
18SrRNA-F:CGGCTACCACATCCAAGGAA(配列番号01)
18SrRNA-R:TGTCACTACCTCCCCGTGTCA(配列番号02)
BRCA1-F:CCATGTATTTTGCAATGCGTG(配列番号03)
BRAC1-R:TGTGGAGCACCTCGAATCTCT(配列番号04)
iHinP1I-F:CATAAAATATTCAGCGAATTGGATCCATGGATTACAAGGACGATGATG(配列番号05)
iHinP1I-R:GATGGTGATGCGATCCTCTCTGCAGTCAACCTCCAACCTTCCTCTTCTT(配列番号06)
iMseI-F:CATAAAATATTCAGCGAATTGGATCCATGGATTACAAGGACGATGATGA(配列番号07)
iMseI -R:GATGGTGATGCGATCCTCTCTGCAGTCAACCTCCAACCTTCCTCTTCTT(配列番号08)
各遺伝子断片を銅イオン添加により発現が誘導されるpORF-CLONEベクター(MoBiTec社)に導入した。作製したプラスミドベクターをpORF-CLONE-FLAG-iHinp1I-NLSおよびpORF-CLONE-FLAG-iMseI-NLSとした。pORF-CLONE-FLAG-iHinp1I-NLSおよびpORF-CLONE-FLAG-iMseI-NLSおよびコントロールとしてpORF-CLONEをYPH499(S288C)株に導入し、pORF-CLONE-FLAG-iHinp1I-NLS/YPH499およびpORF-CLONE-FLAG-iMseI-NLS/YPH499およびpORF-CLONE//YPH499を作製した。形質転換酵母を通常の培養に用いる最少培地(SD-LEU培地(2%グルコース、0.67% yeast nitrogen base、0.69 g/l CSM-LEU))を用いて30℃で24時間培養した。さらに、150・M硫酸銅を加え、30℃で4時間培養することで、FLAG-iHinp1I-NLS遺伝子およびFLAG-iMseI-NLS遺伝子の発現誘導を行った。さらに滅菌MilliQ水で細胞を洗った後、滅菌MilliQ水で5×105 cells/mlとし、30℃または42℃で30分間の加温インキュベートを行った。熱処理後は速やかに氷上に移し、YPDプレートにまき、30℃で2日間培養し生存率を測定した。結果を図11に示す。
NT123: AGATCTATGGATTACAAGGACGATGA(配列番号9)
NT124: GAGCTCTCAACCTCCAACCTTCCTCT(配列番号10)
NT125: GTAAAATCGGTTAATTTCCCCTTTCTTTCTTTTCCTCACTCCGAAGTGTACATACCTTTTCACTCTGAGTCC(配列番号11)
NT127: AGGTCTCAAAAACGTAAATAAACTTAAAAGATAATTAACCACTGAATGAACATACCTTTTCACTCTGAGTCCCTT(配列番号13)
NT123: AGATCTATGGATTACAAGGACGATGA(配列番号9)
NT124: GAGCTCTCAACCTCCAACCTTCCTCT(配列番号10)
NT126: GAAAAGAAAGAAAGGGGAAATTAACCGATTTTACTAACACTGACACTTTGAACAGGTCTGGATCTTCTGATGCTG(配列番号12)
NT128: TAATTATCTTTTAAGTTTATTTACGTTTTTGAGACCTTACTAACGACCAGGATAGGTCTGGATCTTCTGATGCTG(配列番号14)
Claims (14)
- 生物体のゲノムの改変方法であって、
前記生物体は、植物体又は酵母であり、前記生物体の細胞内において、25℃以上40℃以下の温度にDNA二本鎖切断活性の至適温度を有し、4塩基以上5塩基以下の認識部位を有する制限酵素を、25℃以上45℃以下の温度で10分以上3時間以下作用させることにより、前記制限酵素の認識部位に依存して前記生物体のDNA二本鎖を切断するとともに前記切断後の修復によって生じる変異により前記生物体のゲノムを再編成して改変する改変工程、
を備える、改変方法。 - 前記制限酵素は、好熱菌でない細菌由来の制限酵素である、請求項1に記載の改変方法。
- 前記改変工程は、前記制限酵素の作用を、前記生物体の生育能を維持しつつ前記ゲノムを改変可能な程度に制御する工程である、請求項1又は2に記載の改変方法。
- 前記制限酵素をコードするコード領域を有する外来遺伝子の発現によって得られる前記制限酵素を用いる、請求項1〜3のいずれかに記載の改変方法。
- 前記改変工程は、前記外来遺伝子の発現を誘導して前記生物体のゲノムを改変する工程である、請求項4に記載の改変方法。
- 前記改変工程は、前記外来遺伝子の発現を定常的に維持して前記生物体のゲノムを改変
する工程である、請求項4に記載の改変方法。 - 前記制限酵素は、HinP1I、MseI、HaeIII、AluI、MboI、及びHbaIからなる群から選択される1種又は2種以上の制限酵素である、請求項1〜6のいずれかに記載の改変方法。
- 前記生物体は、植物体又はその一部である、請求項1〜7のいずれかに記載の改変方法。
- 前記植物体又はその一部は、種子、茎頂、側芽、花芽、花粉、子房、胚乳及び胚並びにこれらの一部からなる群から選択される1種又は2種以上である、請求項8に記載の改変方法。
- 前記生物体は、酵母である、請求項1〜5のいずれかに記載の改変方法。
- 前記改変工程は、前記制限酵素を前記酵母の細胞に直接導入して作用させる工程である、請求項1〜3のいずれかに記載の改変方法。
- ゲノムが改変された生物体の集団の生産方法であって、
前記生物体は植物体又は酵母であり、前記生物体の親生物体の細胞内において、25℃以上40℃以下の温度にDNA二本鎖切断活性の至適温度を有し、4塩基以上5塩基以下の認識部位を有する制限酵素を、25℃以上45℃以下の温度で10分以上3時間以下作用させることにより、前記制限酵素の認識部位に依存して前記生物体のDNA二本鎖を切断するとともに前記切断後の修復によって生じる変異により前記親生物体のゲノムを再編成して改変する改変工程、
を備える、生産方法。 - ゲノムが改変された生物体の生産方法であって、
前記生物体は植物体又は酵母であり、前記生物体の親生物体の細胞内において、25℃以上40℃以下の温度にDNA二本鎖切断活性の至適温度を有し、4塩基以上5塩基以下の認識部位を有する制限酵素を、25℃以上45℃以下の温度で10分以上3時間以下作用させることにより、前記制限酵素の認識部位に依存して前記生物体のDNA二本鎖を切断するとともに前記切断後の修復によって生じる変異により前記親生物体のゲノムを再編成して改変して、改変されたゲノムを保持する生物体の集団を作製する改変工程と、
前記生物体の集団から、任意の指標に基づいて意図する生物体を選抜する工程と、
を備える、生産方法。 - 請求項1〜10のゲノム改変方法に用いる育種用材料であって、
常温域に至適温度を呈するDNA二本鎖切断活性を有するタンパク質をコードするコード領域を有するDNAを備え、
前記コード領域は、前記育種材料の細胞内でプロセッシングされないイントロンを含む、育種用材料。
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