JP6449138B2 - 遺伝的組換えを誘発する方法及びその利用 - Google Patents
遺伝的組換えを誘発する方法及びその利用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6449138B2 JP6449138B2 JP2015236072A JP2015236072A JP6449138B2 JP 6449138 B2 JP6449138 B2 JP 6449138B2 JP 2015236072 A JP2015236072 A JP 2015236072A JP 2015236072 A JP2015236072 A JP 2015236072A JP 6449138 B2 JP6449138 B2 JP 6449138B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- eukaryotic
- genome
- eukaryotic organism
- strain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8213—Targeted insertion of genes into the plant genome by homologous recombination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
- A01H1/06—Processes for producing mutations, e.g. treatment with chemicals or with radiation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8262—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield involving plant development
- C12N15/827—Flower development or morphology, e.g. flowering promoting factor [FPF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Description
真核生物体が本来的に有する倍数性を超える倍数体である真核生物体の細胞内においてDNA二本鎖切断活性を有するタンパク質を作用させる工程、
を備える、方法。
(2)前記遺伝的組換えは、1又は2以上の塩基の置換、挿入及び欠失による遺伝子突然変異並びに染色体の逆位、不等交叉、交叉、転座、重複、欠失、サイズコピー数の低下、コピー数の増大、染色体倍数化及び染色体異数化からなる群から選択される1種又は2種以上である、(1)に記載の方法。
(3)前記真核生物体は4倍数性以上の倍数体である、(1)又は(2)に記載の誘発方法。
(4)前記遺伝的組換えは、染色体異数化を含む、(1)〜(3)のいずれかに記載の誘発方法。
(5)前記遺伝的組換えは、ゲノムサイズの低下又は増加を含む、(1)〜(4)のいずれかに記載の誘発方法。
(6)前記遺伝的組換えは、染色体の一部に欠失又は重複を含む、(1)〜(5)のいずれかに記載の誘発方法。
(7)前記改変工程は、前記タンパク質の前記DNA二本鎖切断活性を人為的に活性化する工程である、(1)〜(6)のいずれかに記載の誘発方法。
(8)前記改変工程は、前記タンパク質の前記DNA二本鎖切断活性についての至適温度より低い温度で作用させる工程である、(1)〜(7)のいずれかに記載の誘発方法。
(9)前記改変工程は、前記タンパク質をコードする外来遺伝子の発現によって得られる前記タンパク質を用いる工程である、(1)〜(8)のいずれかに記載の誘発方法。
(10)前記タンパク質は多頻度制限酵素である、(1)〜(9)のいずれかに記載の誘発方法。
(11)前記多頻度制限酵素は、好熱菌由来の制限酵素である、(10)に記載の誘発方法。
(12)前記多頻度制限酵素は、TaqIである、(11)に記載の誘発方法。
(13)前記真核生物体は、植物体である、(1)〜(12)のいずれかに記載の誘発方法。
(14)前記真核生物体は、微生物である、(1)〜(13)のいずれかに記載の誘発方法。
(15)前記改変工程に先立って、人為的にゲノムサイズ増大操作によって親真核生物体を取得する倍数化工程を備える、(1)〜(14)のいずれかに記載の誘発方法。
(16)前記倍数化工程は、倍化誘発剤を用いる、(15)に記載の誘発方法。
(17)前記倍数化工程は、細胞融合を用いる、(14)に記載の誘発方法。
(18)改変された真核生物体の生産方法であって、
真核生物体が本来的に有する倍数性を超える倍数体である親真核生物体の細胞内においてDNA二本鎖切断活性を有するタンパク質を作用させる改変工程、
を備える、方法。
(19)さらに、任意の指標に基づいて意図する真核生物体を選抜する工程、
を備える、(18)に記載の生産方法。
(20)真核生物体集団の生産方法であって、
本来的に有する倍数性を超える倍数体である親真核生物体の細胞内においてDNA二本鎖切断活性を有するタンパク質を作用させて親真核生物体のゲノムセットを改変する改変工程を備え、
改変されたゲノムセットを保持する真核生物体の集団を取得する、生産方法。
を備える、生産方法。
(21)本来的に有する倍数性を超える倍数性を有し、DNA二本鎖切断活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を発現可能に保持する、真核生物体である育種材料。
(22)育種材料の生産方法であって、
本来的に有する倍数性を超える倍数体である真核生物体に対して人為的なゲノム増大操作を1回又は2回以上繰り返して、所望の倍数性の真核生物体を得る工程と、
前記所望の倍数性の真核生物体をDNA二本鎖切断活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を発現可能に形質転換する工程と、
を備える、方法。
(23)育種材料の生産方法であって、
本来的に有する倍数性を超える倍数体である真核生物体をDNA二本鎖切断活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を発現可能に形質転換する工程と、
形質転換された前記真核生物体に対して人為的なゲノム増大操作を1回又は2回以上繰り返して、所望の倍数性の形質転換された真核生物体を得る工程と、
を備える、方法。
本開示の遺伝的組換えの誘発方法(以下、単に、誘発方法という。)は、真核生物体の固有倍数性を超える倍数体である真核生物体の細胞内においてDNA二本鎖切断活性を有するタンパク質(以下、本タンパク質という。)を作用させて真核生物体のゲノムセットを改変する改変工程、を備えることができる。本誘発方法は、このような改変工程を備えることにより、個々の真核生物体において種々の遺伝的組換えが許容され、その結果、改変されたゲノムセットを保持する真核生物体集団を取得することができる。すなわち、元々は単一組成のゲノムセットを備える親真核生物体の細胞内において本タンパク質を作用させると、ゲノムセット組成及び形質に関して多様性に富む複数の真核性物体からなる集団を得ることができる。
(真核生物体)
本誘発方法は、任意の真核細胞生物体に適用可能である。本誘発方法に適用される真核生物体としては、動物、植物、真核性微生物が挙げられる。動物としては特に限定しないで、哺乳動物及び各種の魚類などの非哺乳動物が挙げられる。また、本誘発方法に適用される動物としては、動物に由来するものであればよく、細胞、組織、器官、受精卵などいずれの形態であってもよい。受精卵など、完全な動物に再生する能力を保持しているものであれば、改変した動物を得るのに都合がよい。
ナス科:タバコ(Nicotiana tabacum)、ナス(Solanum melongena)、ジャガイモ(Solaneum tuberosum)、トマト(Lycopersicon lycopersicum)、トウガラシ(Capsicum annuum)、ペチュニア(Petunia)など。
マメ科:ダイズ(Glycine max)、エンドウ(Pisum sativum)、ソラマメ(Vicia faba)、フジ(Wisteria floribunda)、ラッカセイ(Arachis. hypogaea)、ミヤコグサ(Lotus corniculatus var. japonicus)、インゲンマメ(Phaseolus vulgaris)、アズキ(Vigna angularis)、アカシア(Acacia)など。
キク科:キク(Chrysanthemum morifolium)、ヒマワリ(Helianthus annuus)など。
ヤシ科:アブラヤシ(Elaeis guineensis、Elaeis oleifera)、ココヤシ(Cocos nucifera)、ナツメヤシ(Phoenix dactylifera)、ロウヤシ(Copernicia)など。
ウルシ科:ハゼノキ(Rhus succedanea)、カシューナットノキ(Anacardium occidentale)、ウルシ(Toxicodendron vernicifluum)、マンゴー(Mangifera indica)、ピスタチオ(Pistacia vera)など。
ウリ科:カボチャ(Cucurbita maxima、Cucurbita moschata、Cucurbita pepo)、キュウリ(Cucumis sativus)、カラスウリ(Trichosanthes cucumeroides)、ヒョウタン(Lagenaria siceraria var. gourda)など。
バラ科:アーモンド(Amygdalus communis)、バラ(Rosa)、イチゴ(Fragaria)、サクラ(Prunus)、リンゴ(Malus pumila var. domestica)など。
ナデシコ科:カーネーション(Dianthus caryophyllus)など。
ヤナギ科:ポプラ(Populus trichocarpa、Populus nigra、Populus tremula)など。
イネ科:トウモロコシ(Zea mays)、イネ(Oryza sativa)、オオムギ(Hordeum vulgare)、コムギ(Triticum aestivum)、タケ(Phyllostachys)、サトウキビ(Saccharum officinarum)、ネピアグラス(Pennisetum pupureum)、エリアンサス(Erianthus ravenae)、ミスキャンタス(ススキ)(Miscanthus virgatum)、ソルガム(Sorghum)スイッチグラス(Panicum)など。
ユリ科:チューリップ(Tulipa)、ユリ(Lilium)など。
フトモモ科:ユーカリ(Eucalyptus camaldulensis、Eucalyptus grandis)など。
本誘発方法においては、固有倍数性を超える倍数体である真核生物体を用いる。なお、遺伝的組換えを誘発させる、固有倍数性を超える倍数体である真核生物体を、親真核生物体ということもできる。こうした倍数体を親真核生物体として用いることで、DNA二本鎖切断による種々の遺伝的組換えを許容し、飛躍的かつ効率的にゲノムセット組成及び形質の多様性に富む集団を構築できる。
本工程では、親真核生物体の細胞内において、本タンパク質、すなわち、DNA二本鎖切断活性を有するタンパク質を作用させる。本タンパク質としては、特に限定しないが、典型的には、公知のDNA二本鎖切断酵素を用いることができる。本誘発方法では、固有倍数性を超える倍数性の親真核生物体を用いて、大規模なゲノム再編が許容されることから、本タンパク質のDNA二本鎖切断活性の特性(認識部位(すなわち、頻度)等)の影響が回避又は抑制されており、公知のDNA二本鎖切断酵素から適宜選択して用いることができる。
親真核生物体としては、本タンパク質をコードする遺伝子を保持して発現可能である親真核生物体を用いることができる。この場合には、所望の倍数性を備える親真核生物体候補に、こうした遺伝子を導入し形質転換して所望の倍数性を備える親真核生物体を得ることができる。かかる所望の倍数性を備える親真核生物体候補は、固有倍数性を超える倍数性を有する真核生物体に対して人為的なゲノム増大操作を1回又は2回以上繰り返すことで得るようにしてもよい。
次いで、親真核生物体の細胞内において本タンパク質を作用させる態様について説明する。以下の説明において、親真核生物体の細胞内というときには、親真核生物体の態様は特に限定するものではない。例えば、親真核生物体が植物体の場合には、植物体の態様は問わないで、植物個体の一部としての細胞、組織、器官のほか、種子、幼苗、あるいはその後の成長した植物個体のほか、カルスにおける細胞内を意味している。また、親真核生物体が、酵母など微生物の場合には、その細胞内で本タンパク質を作用させることを意味する。
本明細書に開示される改変された真核生物体の生産方法は、固有倍数性を超える倍数体である真核生物体の細胞内においてDNA二本鎖切断活性を有するタンパク質を作用させて、前記真核生物体のゲノムセットを改変する改変工程と、前記ゲノムセットを保持する真核生物体の集団から、任意の指標に基づいて意図する真核生物体を選抜する工程と、を備えることができる。本方法によれば、多様性に優れる真核生物体の集団から意図した1又は2以上の真核生物体を選抜するため、効率的に意図した真核生物体を得ることができる。また、本方法によれば、選抜した真核生物体を利用して効率的な育種が可能である。したがって、本生産方法は、植物体や酵母などの真核生物体の育種方法としても実施することができる。なお、有用な植物や酵母などが得られた後のさらに後代の育種については、従来公知の育種技術を適用することができる。
TaqI遺伝子植物発現用ベクターとして、特開2011-160798号公報(段落0121〜0142)に開示された方法により、カリフラワーモザイクウィルス35Sプロモーターの下流にTaqI遺伝子を配置したpBI 35S:TaqI-NLSおよび、シロイヌナズナシグマ因子AtSIG2プロモーターの下流にTaqI遺伝子を配置したpBI AtSIG2:TaqI -NLSを構築した。また、このプラスミドには、TaqIのコード領域のC末端側には核移行シグナル(NLS)を備えている。
pBI 35S:TaqI-NLSを保持するアグロバクテリウム(C58C1株)を特開2011-160798号公報に準じて作製した。このアグロバクテリウムを用いてシロイヌナズナ1406株(EMBO Journal (2006) 25, 5579-5590)に35S:TaqI遺伝子を導入した。1406株はInverted repeat 構造をもつGUSレポーター遺伝子が野生型シロイヌナズナ エコタイプCol-0株に導入されており、GUS遺伝子内で相同組み換えが生じるとGUS遺伝子が発現するように構築されている。この仕組みにより相同組換えの定量解析に利用されている。
本実施例では、コルヒチンを用いてゲノム増大操作を行い、4倍数体及び8倍数体植物を得た。
発芽後3週間の植物体のロゼット葉または、抽台した花茎の茎生葉を切除し、CyStain UV 植物用DNA試薬キット(Partec社)の核抽出液と核染色溶液の混合液400 μl中にロゼット葉を浸し、剃刀により細かく切断した(約100回切断/cm2)。その後抽出液中の植物細胞残渣をCellTrics(登録商標)50 μm(Partec社)用いて除去した。得られた核溶液をCell Lab Quanta SC MPL(ベックマン社)を用いて測定した。
pBI AtSIG2:TaqI-NLSを保持するアグロバクテリウムを用いて実施例3で作製したCol-0_P4株にSIG2:TaqI遺伝子を導入した。形質転換方法としては、実施例2と同様にインプランタ法を用いて行った。アグロバクテリウムの感染後取得した種子を、カナマイシンを含むMS寒天培地(ムラシゲスクーグ無機塩, 1% ショ糖, 0.05% MES, 0.8% Agar, 50mg/l硫酸カナマイシン)に播種した。22℃、16時間明期8時間暗期、光強度約30〜50μmol/m2/secの人工気象室で2週間生育後、カナイマイシン耐性個体を選抜し形質転換体TS3055を得た。
35S:TaqI遺伝子を有する4倍体系統であるTCL878_P4C2系統について、発芽後1週間の幼植物体を37℃1日間熱処理し、その後生育し種子を採種した。得られたTCL878_P4C2系統後代種子およびコントロール株として1406_P4株を播種・生育し形態を観察した。結果を図2に示す。
シロイヌナズナのタイリングアレイはアジレント社のeArrayシステムを用いて設計した。381815個の鎖超60 merプローブをシロイヌナズナゲノム上に平均空間解像度は約314 ntに配置したAt_tilling_400K_v3.2を設計した。また同様に177170個の鎖超60 merプローブをシロイヌナズナゲノム上に平均空間解像度は約677ntに配置したAt_tilling_180K_v4を設計した。タイリングアレイはアジレント社プロトコールに従い行った。タイリングアレイのスキャニングはAgilent G2565CA マイクロアレイスキャナ(アジレント社)を用いて行った。蛍光シグナルの抽出と数値化はFeature Extractionソフトウェアを用いて行った。Relative levelは以下の計算式で求め(Relative level = Log10(Cy5(サンプル)/Cy3(コントロール))、さらに染色体上の連続する20プローブのRelative levelの平均値を求め、図示した。
プロモーターの異なる4倍体植物での効果を確認するために、SIG2:TaqI遺伝子を有する4倍体系統であるTS3055系統を用いて実施例5と同様に形態変化を観察した。実施例4で取得したSIG2:TaqI遺伝子を有する4倍体系統であるTS3055系統の形質転換体のT2世代の植物を生育し、コントロール株としてCol-0_P4株と形態を比較した。結果を図4に示す。
実施例2で選抜したTaqI遺伝子導入シロイヌナズナ2倍体系統(TCL878)、実施例3で選抜した4倍体系統(PCL878_P4)およびコントロール2倍体系統(1406)、4倍体系統(1406_P4)を播種後1週間目に1日間37℃の熱処理を行い、その後14週栽培を継続し乾燥重量を測定した。結果を図5に示す。
TaqI遺伝子の発現によるDNA二本鎖鎖切断の誘発が、植物体の倍数性に与える影響を調べるために、Col-0、Col-0_P4、1406、TCL878、TS3055、TCL878_P4(ぞれぞれについての発芽後1週間37℃1日間熱処理したものの後代)について植物体の倍数性を実施例3と同様にフローサイトメーターによる方法で測定し、ヒストグラムを作成した。結果を、図6に示す。
実施例3で選抜したTaqI遺伝子導入シロイヌナズナ8倍体系統の花茎に結実した種子を播種、生育させた。これらの植物につき、生育状態を観察するとともに、各植物の倍数性および14週栽培後の乾燥重量を測定した。また、倍数性を、実施例2と同様にフローサイトメーターにより測定した。8倍体系統後代の1つであるTCL878_P8-5#3株について、実施例5と同様にしてタイリングアレイを用いて遺伝子のコピー数を調べた。これらの結果を図7〜図9に示す。
TaqI遺伝子酵母発現用ベクターとして、図10に示すように、ガラクトース誘導型プロモーター(pGAL1)の下流に酵母コドンに最適化したTaqI遺伝子(TtTaqI opt)、Saccharomyces cerevisiae由来DIT1タンパク質の3’UTR(tDIT1)を配置したpORF-pGAL1-TtTaqI-tDIT1(AUR)を用いた。
図11に示すように、ゲノム再編効率を評価するGF-FPレポーター遺伝子は、緑色蛍光蛋白質(GFP)のN末端側約600 bpとC末端側600 bpで抗生物質Nourseothricin耐性マーカー(nat1)を挟むようにデザインされている。このカセットを用いることで、TaqIによる二本鎖DNA切断により、GF-FP間で相同組換えが起こり、完全長のGFP遺伝子が再構築された場合、酵母が緑色蛍光を発するため、フローサイトメーター等を用いる事でゲノム再編を検出することが出来る(図12参照)。
実施例10で作製したTaqI遺伝子酵母発現用ベクター、pORF-pGAL1-TtTaqIopt-tDIT1(AUR)を実施例11で作製したBY4741+GFP(HIS)株へ形質転換した(BY4741+GFP(HIS)+TaqI)。グルコースを糖源とするYPD培地(10 g/L Yeast extract、20 g/L Peptone、20 g/L Glucose)+0.5 mg/L オーレオバシジンA(AbA)を用いて、30℃で終夜培養後、ガラクトースを糖源とするYPG(10 g/L Yeast extract、20 g/L Peptone、20 g/L Galactose)+0.5 mg/L AbA培地に培地交換し、20、22.5、25、27.5、30℃で終夜培養することで、TaqIの発現誘導を行った。各温度でのTaqI発現量を測定するために、菌体量を揃えてSDS-PAGEを行い、抗TaqI抗体を用いて、ウエスタンブロッティングを行った。結果を図13に示す。
BY4741+GFP(HIS)+TaqI株を用いて、実施例12と同様に20℃でTaqIの発現誘導を行った。42℃で30分間、または60分間熱処理する事で、一過的にTaqIの活性化を促した後、フローサイトメーターで1×105細胞中のGFP蛍光を持つ細胞の割合を測定することでゲノム再編効率を算出した。結果を図14Aに示す。その結果、ゲノム再編効率は0.03〜0.04%だった。一方、図14Bに示すように、熱処理後にYPD培地に培地交換し、回復培養を18時間行った場合、ゲノム再編効率は0.06〜0.07%に上昇した。
BY4741+GFP(HIS)+TaqI株を用いて、実施例12と同様にYPG+0.5 mg/L AbA培地に培地交換した後、20、25、30、35℃でTaqIを発現誘導しながら、穏やかにTaqIの活性化を行った。5、23、46時間後に酵母を回収し、実施例13と同様にフローサイトメーターでゲノム再編効率を測定した。結果を図15に示す。
BY4741+GFP(LEU)株とBY4742+GFP(LEU)株、BY4741+GFP(HIS)株とBY4742+GFP(HIS)株を定法に従いそれぞれ接合し、SD-Met-Lys寒天プレートで30℃、5日間培養した。生育したコロニーをシングル化後、フローサイトメーターでゲノムDNA量を測定し、2倍体であることを確認した株をBY4743+GFP(LEU)株、BY4743+GFP(HIS)株とした。
実施例10で作製したTaqI遺伝子酵母発現用ベクター、pORF-pGAL1-TtTaqIopt-tDIT1(AUR)を実施例11、14で作製した各倍加酵母へ形質転換した。形質転換体を用いて、実施例12と同様にYPG+0.5 mg/L AbA培地に培地交換した後、35℃でTaqIを発現誘導しながら、穏やかにTaqIの活性化を行った。22時間後に酵母を回収し、実施例13と同様にフローサイトメーターでゲノム再編効率を測定した。結果を図16に示す。
実施例16と同様に、各倍加酵母を用いて35℃でTaqIを発現誘導しながら、穏やかにTaqIの活性化を行った。0、16、46時間後に酵母を回収し、70%エタノールで固定後、DAPI染色によりゲノムDNAを蛍光染色した。蛍光染色した各倍加酵母を用いてフローサイトメーターで核相解析を行った。結果を図17に示す。図17に示すように、倍加酵母では、倍数性が増加または減少した個体の出現頻度の上昇が認められた。
(OC2−A(CF)株の取得)
ワイン酵母OC-2株にキシロース資化遺伝子を導入したOC2-A株を作製した。すなわち、ワイン酵母OC-2株にキシロース資化遺伝子を導入したOC700株(特開2014-193152)をベースに、ADH2遺伝子を破壊するとともにADH1遺伝子を増強し、mhpF遺伝子(E.coli由来)を導入したOC2-A株を取得した。
OC2−A株を用いて、以下のとおり、ゲノム再編によるキシロース資化能力の進化育種を行った。OC2-A株にKluyveromyces lactis由来のURA3遺伝子を導入したOC2-A(KlURA3)株と、Kluyveromyces marxianus由来のTRP1遺伝子を導入したOC2-A(KmTRP1)株を作製した。両株を用いてプロトプラスト-PEG法による細胞融合を行い、細胞融合株OC2-A(CF)株を作製した。
キシロースを主な糖源とする培地で培養、植え継ぎを繰り返すことで集積培養(35℃)を行った。集積培養を開始後、約300時間までは僅かにグルコースを加えたYPX培地(10g/L Yeast extract、20 g/L Peptone、1 g/L Glucose、20 g/L Xylose)で培養した。その後、キシロースのみを糖源とするYPX培地(10 g/L Yeast extract、20 g/L Peptone、20 g/L Xylose)に変更し、さらに集積培養を約200時間行った。これらの培養工程における菌体量の推移を図18に示す。集積培養後の培養液をYPD寒天プレートにストリークし、シングル化した株をOC2A-C5株とした。
OC2A-C5株のキシロース資化能力を発酵試験により評価した。5%キシロース発酵培地(10 g/L Yeast extract、50 g/L Xylose)にOC2-A株、OC2-A(CF)株、OC2A-C5株をそれぞれOD600 = 1.0で植菌し、32℃で発酵試験を行った。0、16、24、48、72時間でサンプリングを行い、HPLCでキシロース及びエタノールを測定した。結果を図19に示す。
実施例18で作製したOC2A-C5株を用いて、実施例18と同様にしてTaqI処理を行い、ゲノム再編酵母ライブラリーを作製した。次に、YPX培地(10 g/L Yeast extract、20 g/L Peptone、20 g/L Xylose)、39〜41℃で培養、植え継ぎを繰り返すことで集積培養を約500時間行った。集積培養後の培養液をYPD寒天プレートにストリークし、シングル化した株をOC2A-TT株とした。
Claims (19)
- 真核生物体における遺伝的組換えの誘発方法であって、
真核生物体が本来的に有する染色体の倍数性を超える倍数体である真核生物体の細胞(ただし、細胞融合によって得られた細胞を除く。)内において多頻度制限酵素であるDNA二本鎖切断活性を有するタンパク質を作用させる工程、
を備え、
前記真核生物体は、4倍数性以上の倍数体である植物又は真核微生物である、方法。 - 前記タンパク質の作用工程は、前記真核生物体の細胞内において、前記タンパク質を前記染色体に作用させることにより、前記真核生物体における遺伝的組換えの頻度を向上させる工程である、請求項1に記載の方法。
- 前記遺伝的組換えは、1又は2以上の塩基の置換、挿入及び欠失による遺伝子突然変異並びに染色体の逆位、不等交叉、交叉、転座、重複、欠失、サイズコピー数の低下、コピー数の増大、染色体倍数化及び染色体異数化からなる群から選択される1種又は2種以上である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記真核生物体は、同質倍数体である、請求項1〜3のいずれかに記載の誘発方法。
- 前記遺伝的組換えは、染色体異数化を含む、請求項1〜4のいずれかに記載の誘発方法。
- 前記遺伝的組換えは、ゲノムサイズの低下又は増加を含む、請求項1〜5のいずれかに記載の誘発方法。
- 前記遺伝的組換えは、染色体の一部に欠失又は重複を含む、請求項1〜6のいずれかに記載の誘発方法。
- 前記タンパク質の作用工程は、前記タンパク質の前記DNA二本鎖切断活性を人為的に活性化する工程である、請求項1〜7のいずれかに記載の誘発方法。
- 前記タンパク質の作用工程は、前記タンパク質の前記DNA二本鎖切断活性についての至適温度より低い温度で作用させる工程である、請求項1〜8のいずれかに記載の誘発方法。
- 前記タンパク質の作用工程は、前記タンパク質をコードする外来遺伝子の発現によって得られる前記タンパク質を用いる工程である、請求項1〜9のいずれかに記載の誘発方法。
- 前記多頻度制限酵素は、好熱菌由来の制限酵素である、請求項1〜10のいずれかに記載の誘発方法。
- 前記多頻度制限酵素は、TaqIである、請求項11に記載の誘発方法。
- 前記タンパク質の作用工程に先立って、人為的にゲノムサイズ増大操作によって親真核生物体を取得する倍数化工程を備える、請求項1〜12のいずれかに記載の誘発方法。
- 前記倍数化工程は、倍化誘発剤を用いる、請求項13に記載の誘発方法。
- 改変された真核生物体(ただし、ヒト個体を除く。)の生産方法であって、
親真核生物体の細胞(ただし、細胞融合によって得られた細胞を除く。)内において多頻度制限酵素であるDNA二本鎖切断活性を有するタンパク質を作用させて、前記親真核生物体のゲノムセットを改変する改変工程、
を備え、
前記真核生物体は、4倍数性以上の倍数体である植物又は真核微生物である、方法。 - さらに、前記改変されたゲノムセットを保持する真核生物体の集団から、任意の指標に基づいて意図する真核生物体を選抜する工程、
を備える、請求項15に記載の生産方法。 - 真核生物体集団(ただし、ヒト個体を除く。)の生産方法であって、
本来的に有する倍数性を超える倍数体である親真核生物体の細胞(ただし、細胞融合によって得られた細胞を除く。)内において多頻度制限酵素であるDNA二本鎖切断活性を有するタンパク質を作用させて親真核生物体のゲノムセットを改変する改変工程を備え、
前記親真核生物体は、4倍数性以上の倍数体である植物又は真核微生物である、改変されたゲノムセットを保持する真核生物体の集団を取得する、生産方法。 - 育種材料の生産方法であって、
本来的に有する倍数性を超える倍数体である真核生物体に対して人為的なゲノム増大操作を1回又は2回以上繰り返して、所望の倍数性の真核生物体(ただし、細胞融合によって得られた真核生物体を除く。)を得る工程と、
前記所望の倍数性の真核生物体を多頻度制限酵素であるDNA二本鎖切断活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を発現可能に形質転換する工程と、
を備え、
前記真核生物体は、4倍数性以上の倍数体である植物又は真核微生物である、方法。 - 育種材料の生産方法であって、
本来的に有する倍数性を超える倍数体である真核生物体を多頻度制限酵素であるDNA二本鎖切断活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を発現可能に形質転換する工程と、
形質転換された前記真核生物体に対して人為的なゲノム増大操作を1回又は2回以上繰り返して、所望の倍数性の形質転換された真核生物体(ただし、細胞融合によって得られた真核生物体を除く。)を得る工程と、
を備え、
前記真核生物体は、4倍数性以上の倍数体である植物又は真核微生物である、方法。
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US15/740,312 US11464182B2 (en) | 2015-07-02 | 2016-07-01 | Method of inducing genetic recombination, and use therefor |
BR112017028368A BR112017028368A2 (pt) | 2015-07-02 | 2016-07-01 | método de indução de recombinação genética e uso para o mesmo |
PCT/JP2016/069721 WO2017002977A1 (ja) | 2015-07-02 | 2016-07-01 | 遺伝的組換えを誘発する方法及びその利用 |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2015133902 | 2015-07-02 | ||
JP2015133902 | 2015-07-02 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2017012145A JP2017012145A (ja) | 2017-01-19 |
JP6449138B2 true JP6449138B2 (ja) | 2019-01-09 |
Family
ID=57827441
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015236072A Active JP6449138B2 (ja) | 2015-07-02 | 2015-12-02 | 遺伝的組換えを誘発する方法及びその利用 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11464182B2 (ja) |
JP (1) | JP6449138B2 (ja) |
BR (1) | BR112017028368A2 (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP6888906B2 (ja) | 2015-12-11 | 2021-06-18 | 株式会社豊田中央研究所 | 生物体のゲノムの改変方法及びその利用 |
JP6928416B2 (ja) | 2016-12-27 | 2021-09-01 | 株式会社豊田中央研究所 | Dna二本鎖切断活性を有するタンパク質を用いた真核生物の育種方法 |
JP6874742B2 (ja) * | 2017-12-21 | 2021-05-19 | 株式会社豊田中央研究所 | 細胞質ゲノムを改変するための化合物及びその利用 |
Family Cites Families (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4697546A (en) * | 1986-05-30 | 1987-10-06 | Purdue Research Foundation | Method for production of tetraploid channel catfish |
JP2965338B2 (ja) * | 1990-08-28 | 1999-10-18 | オリエンタル酵母工業株式会社 | 酵母の内容物の漏出法 |
JP2002510964A (ja) | 1997-02-05 | 2002-04-09 | ユタ・ステイト・ユニバーシティ | アポミクト植物の作出方法 |
US7638680B2 (en) | 1997-02-05 | 2009-12-29 | Utah State University | Methods for stabilizing and controlling apomixis |
JP3591250B2 (ja) | 1997-11-20 | 2004-11-17 | トヨタ自動車株式会社 | 耐潮性を有する植物およびその作出方法 |
WO2002098210A2 (en) * | 2001-06-05 | 2002-12-12 | The Curators Of The University Of Missouri | Chromosome doubling method |
JP4158920B2 (ja) | 2004-11-22 | 2008-10-01 | 独立行政法人理化学研究所 | 耐熱性多頻度dna切断酵素の細胞内活性化によるゲノム再編成の誘発方法 |
JP4169213B2 (ja) | 2005-12-27 | 2008-10-22 | 国立大学法人山口大学 | 異種由来単一染色体の次世代伝達能を備えた異種染色体添加植物 |
US8258369B2 (en) | 2006-02-24 | 2012-09-04 | National University Corporation Nagoya University | Method for preparing fish embryos |
CN102239249A (zh) | 2008-10-24 | 2011-11-09 | 威斯康星校友研究基金会 | 通过非病毒重编程获得的多潜能干细胞 |
JP5939985B2 (ja) * | 2009-11-19 | 2016-06-29 | エージェンシー フォー サイエンス,テクノロジー アンド リサーチ | 多能性の増強方法 |
JP5874949B2 (ja) | 2010-01-15 | 2016-03-02 | トヨタ自動車株式会社 | 変異体植物、その製造方法及び遺伝的組換え頻度を上昇させる方法 |
JP5751609B2 (ja) * | 2010-08-24 | 2015-07-22 | 株式会社豊田中央研究所 | 特性が改変された細胞の生産方法 |
JP6037308B2 (ja) * | 2013-03-12 | 2016-12-07 | 株式会社豊田中央研究所 | 植物バイオマスの増産方法 |
JP6232907B2 (ja) * | 2013-10-09 | 2017-11-22 | 富士レビオ株式会社 | 融合細胞およびその作製方法 |
-
2015
- 2015-12-02 JP JP2015236072A patent/JP6449138B2/ja active Active
-
2016
- 2016-07-01 US US15/740,312 patent/US11464182B2/en active Active
- 2016-07-01 BR BR112017028368A patent/BR112017028368A2/pt not_active Application Discontinuation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US11464182B2 (en) | 2022-10-11 |
US20180184606A1 (en) | 2018-07-05 |
BR112017028368A2 (pt) | 2018-08-28 |
JP2017012145A (ja) | 2017-01-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102027111A (zh) | 使植物的生物量和/或种子量增产的基因及其利用方法 | |
US20090031444A1 (en) | Homologous recombination in plants | |
JP6449138B2 (ja) | 遺伝的組換えを誘発する方法及びその利用 | |
CN107475266B (zh) | 一种水稻胚乳粉质相关基因OscyMDH及其编码蛋白质和应用 | |
CN110468150B (zh) | Rgs1基因作为负调控因子在提高寡照环境下番茄细菌性叶斑病抗性中的应用 | |
CN102575262B (zh) | 能够赋予环境胁迫耐受性至植物的基因和利用该基因的方法 | |
CN114369147B (zh) | Bfne基因在番茄株型改良和生物产量提高中的应用 | |
JP6037308B2 (ja) | 植物バイオマスの増産方法 | |
JP6697250B2 (ja) | ゲノム再編方法及びその利用 | |
WO2017002977A1 (ja) | 遺伝的組換えを誘発する方法及びその利用 | |
CN111334492A (zh) | 西瓜几丁质酶及其编码基因和应用 | |
US20130305411A1 (en) | Method for conferring disease resistance to plant | |
US10745691B2 (en) | Polypeptide for genome shuffling in plants, and use therefor | |
JP7059965B2 (ja) | エピゲノム状態を制御する融合タンパク質及びその利用 | |
JP6888906B2 (ja) | 生物体のゲノムの改変方法及びその利用 | |
JP7145140B2 (ja) | ゲノム再編方法及びその利用 | |
JP6121942B2 (ja) | 植物のバイオマス量を増産させる遺伝子及びその利用方法 | |
JP5212955B2 (ja) | 植物のバイオマス量を増産させる遺伝子及びその利用方法 | |
JP6874742B2 (ja) | 細胞質ゲノムを改変するための化合物及びその利用 | |
WO2023222908A1 (en) | Generation of haploid plants based on novel knl2 | |
Lawrence | Identifying natural modifiers of meiotic crossover frequency in Arabidopsis thaliana | |
Rhee et al. | Induction of virus-induced gene silencing and in planta validation in cucurbits using the CFMMV-Cm vector | |
EP3942053A1 (en) | A method to improve the agronomic characteristics of plants | |
De Villiers | Reverse genetic analysis of gene Pp1s148_40v6 in Physcomitrella patens: An AtMAX2 orthologue? |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20161205 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20171010 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20171211 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20180508 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180808 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20180920 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20181106 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20181113 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20181127 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20181205 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6449138 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |