JP6232907B2 - 融合細胞およびその作製方法 - Google Patents

Description

本発明は、融合細胞およびその作製方法に関する。

現在までに、高いタンパク質生産能を有する細胞株の開発を目的とする多くの研究が行われている。特に、高品質タンパク質（例、抗体等のタンパク質医薬）の商業生産のための汎用細胞（例、ＣＨＯ細胞）を利用して、このような細胞株を開発することが求められている。例えば、このような細胞株を作製するため、特殊な発現ベクターを利用する技術などが開発されている（特許文献１）。
ところで、タンパク質の生産能の向上を目的としたものではないものの、他の細胞改変技術も知られている。このような技術としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いた細胞融合が知られている（非特許文献１）。

特開２０１１−１５２１１７号公報

Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｖｏｌ．１，Ｎｏ．４，１９７５，ｐｐ３９７−４００

上述したとおり、高いタンパク質生産能を有する細胞株の開発が行われているが、高いタンパク質生産能を有する細胞株の出現頻度は実際には低く、また、初期には高いタンパク質生産能を有していた細胞株も、数回の継代後には、高いタンパク質生産能を保持しなくなることが多い。したがって、高いタンパク質生産能を安定的に保持する細胞株の樹立は困難であった。
また、タンパク質の大量生産では、細胞の浮遊培養が採用されており、それ故、浮遊培養用に樹立された細胞株が適宜用いられている。これは、タンパク質の大量生産では、できるだけ多くの細胞を、限られた敷地面積において効率良く培養することが求められているためである。したがって、タンパク質の大量生産では、通常、細胞の接着培養は採用されておらず、接着培養に適した細胞株の開発は行われていない。
さらに、上述したタンパク質の大量生産に用いられている、浮遊培養用に樹立された細胞株は、血清含有培地を含む巨大な培養槽中で培養されており、それにより、高いタンパク質生産能を実現している。したがって、タンパク質を従来法で大量生産するためには、血清含有培地からタンパク質を精製する必要がある。タンパク質（例、抗体等のタンパク質医薬）の大量生産では、スケール・メリットの観点より、血清含有培地からタンパク質を精製する負担を軽減し得るが、種々のタンパク質を小規模で個別に生産することが求められる場合には、血清含有培地からのタンパク質の精製は、過度の負担になり、コストの上昇を招き易い。血清は高価であり、またロット間の品質の差異も大きいため、血清の使用の回避も求められている。したがって、無血清培地中で良好に培養可能な細胞株の開発が求められている。しかしながら、無血清培地中で浮遊・増殖する細胞は報告されているものの、無血清培地中で良好に接着・増殖する細胞は知られていない。

本発明者は、鋭意検討した結果、所定の特性を有する細胞がタンパク質生産能に優れることを見出した。本発明者はまた、同調化された細胞を人為的に融合させることにより、そのような特性を有する細胞を作製できることを見出した。本発明者は、驚くべきことに、同調融合により作製された融合細胞が、そのような特性およびタンパク質の高い生産能を、継代後も安定的に保持し続けることなどをさらに見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕同調化された細胞を人為的に融合させることを含む、融合細胞の作製方法。
〔２〕細胞を同調化させることをさらに含む、〔１〕の方法。
〔３〕細胞の同調化が、細胞周期のＭ期で細胞を停止させることにより行われる、〔２〕の方法。
〔４〕細胞の同調化が微小管阻害剤を用いて行われる、〔２〕または〔３〕の方法。
〔５〕微小管阻害剤がチューブリン重合阻害剤である、〔４〕の方法。
〔６〕以下の特性を有する、融合細胞：
ａ）融合に用いられた元の細胞に比し１．３倍のサイズ；
ｂ）融合に用いられた元の細胞に比し１．３倍複雑な細胞内構造；および
ｃ）融合に用いられた元の細胞に比し向上したタンパク質生産能。
〔７〕融合細胞が哺乳動物由来である、〔６〕の融合細胞。
〔８〕融合細胞が、無血清培地中で培養したときに扁平状に伸展した接着細胞として増殖する能力を有する細胞である、〔６〕または〔７〕の融合細胞。
〔９〕扁平状に伸展した接着細胞の長径が７０μｍ以上である、〔８〕の融合細胞。
〔１０〕融合細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞またはその亜株由来である、〔６〕〜〔９〕のいずれかの融合細胞。
〔１１〕タンパク質の発現ベクターを含む、〔６〕〜〔１０〕のいずれかの融合細胞。
〔１２〕同調化された細胞を人為的に融合させることにより得られる細胞である、〔６〕〜〔１１〕のいずれかの融合細胞。
〔１３〕〔６〕〜〔１２〕のいずれかの融合細胞を培地中で培養することを含む、タンパク質の製造方法。
〔１４〕タンパク質が抗体である、〔１３〕の方法。
〔１５〕培地が無血清培地である、〔１３〕または〔１４〕の方法。

本発明の方法は、タンパク質の高い生産能を有する細胞、および分泌タンパク質の高い分泌能を有する細胞などの作製に有用である。
本発明の方法はまた、細胞融合の材料として接着細胞を用いた場合には、接着培養に適した細胞の作製に有用である。
本発明の方法はさらに、無血清培地中で良好に培養できる細胞、特に無血清培地中で良好に接着培養できる細胞の作製に有用である。

図１は、目的タンパク質を少量生産する能力を有するＣＨＯ細胞株の染色体核酸量を、ＦＣＭ解析（ゲート細胞％ ｖｓ．蛍光強度）により示す図である。コントロールとして、通常のＣＨＯ細胞を同様に解析した。目的タンパク質を少量生産する能力を有するＣＨＯ細胞株（ＶＤＳＣ４２Ｍ／ＣＨＯ）および通常のＣＨＯ細胞は、約２００の蛍光強度に、ほぼ重なったシャープな主要ピークを示した。 図２は、目的タンパク質を大量に生産する能力を有するＣＨＯ細胞株の染色体核酸量を、ＦＣＭ解析（ゲート細胞％ ｖｓ．蛍光強度）により示す図である。コントロールとして、通常のＣＨＯ細胞を同様に解析した。目的タンパク質を大量に生産する能力を有する安定な２種のＣＨＯ細胞株のうち、ＶＤＳＣ１Ｍ／ＣＨＯは、約３００の蛍光強度にシャープな主要ピークを示し、ＶＤＳＣ４６Ｍ／ＣＨＯは、約３５０の蛍光強度にブロードなピークを示した。通常のＣＨＯ細胞は、約２００の蛍光強度にシャープな主要ピークを示した。 図３は、目的タンパク質を少量生産する能力を有するＣＨＯ細胞株のサイズ（表面積）を、ＦＣＭ解析（ゲート細胞％ ｖｓ．前方散乱）により示す図である。コントロールとして、通常のＣＨＯ細胞を同様に解析した。目的タンパク質を少量生産する能力を有するＣＨＯ細胞株（ＶＤＳＣ４２Ｍ／ＣＨＯ）および通常のＣＨＯ細胞は、約２００のＦＳに、ほぼ重なったシャープな主要ピークを示した。 図４は、目的タンパク質を大量に生産する能力を有するＣＨＯ細胞株のサイズを、ＦＣＭ解析（ゲート細胞％ ｖｓ．前方散乱）により示す図である。コントロールとして、通常のＣＨＯ細胞を同様に解析した。目的タンパク質を大量に生産する能力を有する安定な２種のＣＨＯ細胞株のうち、ＶＤＳＣ１Ｍ／ＣＨＯは、約３００のＦＳに高い主要ピーク（約０．６のゲート細胞％）を示し、ＶＤＳＣ４６Ｍ／ＣＨＯは、約３００のＦＳに低いピーク（約０．４のゲート細胞％）を示し、これらのピークは重なっていた。通常のＣＨＯ細胞は、約２００のＦＳにシャープな主要ピークを示した。 図５は、目的タンパク質を少量生産する能力を有するＣＨＯ細胞株の細胞内構造の複雑さを、ＦＣＭ解析（ゲート細胞％ ｖｓ．側方散乱）により示す図である。コントロールとして、通常のＣＨＯ細胞を同様に解析した。目的タンパク質を少量生産する能力を有するＣＨＯ細胞株（ＶＤＳＣ４２Ｍ／ＣＨＯ）は、約１８０のＳＳにおいてシャープな主要ピークを示した。通常のＣＨＯ細胞は、約１９０のＳＳにおいてシャープな主要ピークを示した。 図６は、目的タンパク質を大量に生産する能力を有するＣＨＯ細胞株の細胞内構造の複雑さを、ＦＣＭ解析（ゲート細胞％ ｖｓ．側方散乱）により示す図である。コントロールとして、通常のＣＨＯ細胞を同様に解析した。目的タンパク質を大量に生産する能力を有する安定な２種のＣＨＯ細胞株のうち、ＶＤＳＣ１Ｍ／ＣＨＯは、約３００のＳＳに主要ピークを示し、ＶＤＳＣ４６Ｍ／ＣＨＯは、約４００のＳＳを中心として非常にブロードな存在を示した。通常のＣＨＯ細胞は、約１９０のＳＳにシャープな主要ピークを示した。 図７は、融合細胞の染色体核酸量を、ＦＣＭ解析（ゲート細胞％ ｖｓ．蛍光強度）により示す図である。コントロールとして、細胞融合に用いられた元のＣＨＯ細胞を同様に解析した。ＣＨＯ細胞では、約２００および約３７０の蛍光強度に、シャープなピークが認められた。前者のピークは、非分裂期の細胞に対応し、後者のピークは、分裂期の細胞（細胞分裂のため、染色体数が２倍に増幅中）に対応すると考えられる。一方、融合細胞では、約４００の蛍光強度に、主要ピークが認められた。また、蛍光強度の値は染色体核酸量と比例し得ることから、約４００の蛍光強度に対応する融合細胞の染色体核酸量は、元のＣＨＯ細胞の染色体核酸量に比し、約２倍であると見積られた。また、約６００の蛍光強度でも約０．１４のゲート細胞（％）が認められた。約６００の蛍光強度に対応する融合細胞の染色体核酸量は、元のＣＨＯ細胞の染色体核酸量に比し、約３倍であると見積られた。 図８は、融合細胞のサイズを、ＦＣＭ解析（ゲート細胞％ ｖｓ．前方散乱）により示す図である。コントロールとして、細胞融合に用いられた元のＣＨＯ細胞を同様に解析した。ＣＨＯ細胞では、約２００のＦＳに、シャープなピークが認められた。一方、融合細胞では、約３００のＦＳに、ブロードなピークが認められた。また、ＦＳの値は細胞サイズと比例し得ることから、約３００のＦＳに対応する融合細胞のサイズは、元のＣＨＯ細胞のサイズに比し、約１．５倍であると見積られた。また、約４００および約６００のＦＳでも一定のゲート細胞（％）が認められた。約４００および約６００のＦＳに対応する融合細胞のサイズは、それぞれ、元のＣＨＯ細胞のサイズに比し、約２倍および約３倍であると見積られた。 図９は、融合細胞の細胞内構造の複雑さを、ＦＣＭ解析（ゲート細胞％ ｖｓ．側方散乱）により示す図である。コントロールとして、細胞融合に用いられた元のＣＨＯ細胞を同様に解析した。ＣＨＯ細胞では、約１８０のＳＳに、シャープなピークが認められた。一方、融合細胞では、約４００のＳＳに、ブロードなピークが認められた。また、ＳＳの値は細胞内構造の複雑さと比例し得ることから、約４００のＳＳに対応する融合細胞の細胞内構造の複雑さは、元のＣＨＯ細胞の細胞内構造の複雑さに比し、約２．２倍であると見積られた。また、約６００および約８００のＳＳでも一定のゲート細胞（％）が認められた。約６００、約８００および約１０００のＳＳに対応する融合細胞の細胞内構造の複雑さは、それぞれ、元のＣＨＯ細胞の細胞内構造の複雑さに比し、約３．３倍、約４．４倍および約５．６倍であると見積られた。 図１０は、血清含有培地または無血清培地中に蒔いて２日間培養されたＣＨＯ細胞および融合細胞（樹立後約２ヶ月経過）の顕微鏡図を示す図である。 図１１は、外来タンパク質（ｈＭＧＦＰ）発現ベクターが導入されたＣＨＯ細胞および融合細胞により発現される外来タンパク質量の相対的な比較を、ＦＣＭ解析（ゲート細胞％ ｖｓ．蛍光強度）により示す図である。 図１２は、外来タンパク質（ｈＭＧＦＰ）発現ベクターが導入されたＣＨＯ細胞により発現される外来タンパク質量を、ＦＣＭ解析（ゲート細胞％ ｖｓ．蛍光強度）により、相対的に示す図である（ＧＦＰ：ｈＭＧＦＰ）。表１もまた参照のこと。 図１３は、外来タンパク質（ｈＭＧＦＰ）発現ベクターが導入された融合細胞により発現される外来タンパク質量を、ＦＣＭ解析（ゲート細胞％ ｖｓ．蛍光強度）により、相対的に示す図である（ＧＦＰ：ｈＭＧＦＰ）。表２もまた参照のこと。 図１４は、ニワトリＩｇＭ発現ベクターが導入されたＣＨＯ細胞および融合細胞によるニワトリＩｇＭ分泌レベルを示す図である。 図１５は、マウスＩｇＧ発現ベクターが導入されたＣＨＯ細胞および融合細胞によるマウスＩｇＧ分泌レベルを示す図である。

本発明は、融合細胞の作製方法を提供する。本発明の方法は、同調化された細胞を人為的に融合させることを含む。同調化された細胞の融合は、人為的に行われる。換言すれば、同調化された細胞の融合は、インビボでは行われず、代表的にはインビトロで行われる。したがって、融合に用いられる細胞は、単離または精製された細胞であり得る。

本発明の方法において材料として用いられる細胞は、細胞核を有する真核細胞である。細胞核を有する真核細胞が細胞融合可能であることは、当該技術分野における技術常識である。このような真核細胞としては、単細胞生物（例、酵母）、多細胞生物由来の細胞が挙げられる。多細胞生物由来の細胞としては、例えば、昆虫細胞、植物細胞、鳥類（例、ニワトリ）細胞、および哺乳動物等の動物の細胞が挙げられる。哺乳動物としては、例えば、霊長類（例、ヒト、サル、チンパンジー）、げっ歯類（例、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ）、愛玩動物（例、イヌ、ネコ）、家畜または使役動物（例、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ）が挙げられる。

細胞が動物細胞に由来する場合、動物細胞は、任意の組織に由来し得る。このような組織としては、例えば、呼吸器系組織（例、肺、気管、気管支、咽頭、鼻腔、副鼻腔）、消化器系組織（例、胃、小腸、大腸、直腸）、膵臓、腎臓、肝臓、胸腺、脾臓、心臓、甲状腺、副腎、前立腺、卵巣、子宮、脳、皮膚、筋肉、血管、および血液組織（例、骨髄、末梢血）が挙げられる。細胞はまた、上記組織以外の組織に存在する細胞であり得る。このような細胞としては、例えば、腺細胞（例、肺腺細胞、乳腺細胞）、上皮細胞、内皮細胞（例、動脈および静脈等の血管内皮）、表皮細胞、間質細胞、繊維芽細胞、脂肪細胞、メサンギウム細胞、膵β細胞、神経細胞、グリア細胞、および血球細胞が挙げられる。細胞はまた、正常細胞または癌細胞であり得る。細胞はさらに、接着細胞または浮遊細胞であり得る。細胞はまた、初代培養細胞または細胞株であり得る。細胞はまた、分化細胞（例、終末分化細胞）であり得る。細胞はまた、幹細胞（例、ｉＰＳ等の人工多能性幹細胞、胚性幹細胞および体性幹細胞等の天然多能性幹細胞）等の未分化細胞またはその分化細胞であり得る。

細胞融合では、少なくとも２つの細胞が融合される。ここで、２つの細胞は、同種であっても異種であってもよい。用語「異種」とは、細胞種が異なることを意味する。本発明の方法では、細胞融合に用いられる細胞の由来が異なることを意味し、代表的には、異なる動物種由来の細胞、および同一の動物種由来の異なる組織等に由来する細胞が意図される。異種細胞の融合により作製される細胞としては、ハイブリドーマが有名である。好ましくは、融合される少なくとも２つの細胞は互いに同種である。

特定の実施形態では、細胞融合に用いられる細胞は、高品質タンパク質（例、抗体等のタンパク質医薬）の商業生産のために汎用されている細胞であってもよい。このような細胞としては、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびその亜株（例、ＣＨＯ−Ｋ１、ＤＧ４４）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞およびその亜株が挙げられる。

細胞融合法としては、種々の方法が知られている。このような方法としては、例えば、電気刺激法、センダイウイルス等のウイルスを用いる方法、ポリアルキレングリコール（例、ポリエチレングリコール）等のアルキレングリコール重合体を用いる方法が挙げられる。本発明では、これらの既知の方法を用いることができるが、アルキレングリコール重合体を用いる方法が好ましい。

本発明の方法では、同調化された細胞が用いられる。細胞の同調化とは、細胞における細胞周期の期（ｐｈａｓｅ）を合わせることをいう。このような期としては、例えば、静止期（Ｇ０期）、間期におけるＧ１期、Ｓ期およびＧ２期、ならびに細胞分裂期（Ｍ期）が挙げられる。細胞周期の特定期の研究目的のため、種々の方法が、細胞周期の同調化に汎用されており、例えば、低分子有機化合物、抗体および核酸分子（例、ｓｉＲＮＡ）等の細胞周期停止剤を用いる方法、ならびに特殊な細胞処理等の方法が知られている。本発明では、このような手法を利用することができる。汎用される細胞周期停止剤としては、例えば、Ｓ期停止剤（例、高濃度チミジン、アフィディコリン）、およびＭ期停止剤が挙げられる。Ｍ期停止剤としては、例えば、微小管阻害剤（例、チューブリン重合阻害剤およびチューブリン脱重合阻害剤）が挙げられる。チューブリン重合阻害剤としては、例えば、ノコダゾール、コルヒチン、コルセチン、コルセミド、ビンカアルカロイド（例、ビンブラスチン、ビンクリスチン）、グリセオフルビン、２−メトキシエストラジオール、リゾキシン、５ＨＰＰ−３３が挙げられる。チューブリン脱重合阻害剤としては、例えば、タキサン化合物（例、パクリタキセル、ドセタキシル）が挙げられる。また、細胞分裂期には器壁から細胞が剥がれ易くなる性質を利用して、物理的刺激を加えて分裂期の細胞を特異的に回収する方法も知られている。したがって、トリプシン等のペプチダーゼを使用せず、物理刺激を加えて細胞を回収することにより、分裂期の細胞を特異的に回収することができる。好ましくは、細胞の同調化は、細胞周期停止剤を用いて、細胞を細胞周期の特定期に停止させることにより行われる。

本発明はまた、融合細胞を提供する。本発明の融合細胞は、単離または精製されていてもよい。あるいは、本発明の融合細胞は、複数の細胞の集団の形態で提供されてもよい。本発明の融合細胞が複数の細胞の集団の形態で提供される場合、当該複数の細胞は、後述する種々の特性を平均値として有する（例えば、融合に用いられた元の細胞に比し平均１．３倍のサイズ、融合に用いられた元の細胞に比し平均１．３倍複雑な細胞内構造、および融合に用いられた元の細胞に比し、平均的に向上したタンパク質生産能）。

本発明の融合細胞は、細胞核を有する複数（例、２個または３個）の真核細胞の融合により得られる、正常数（２倍体）を超える染色体数を有する細胞である。例えば、融合細胞は、３倍体〜８倍体の染色体数を有する。染色体数が大きくなると、細胞の増殖が遅くなり、細胞分裂速度の低下に伴い生産されるタンパク質の総量も低下し得ることから、染色体数は、好ましくは、６倍体以下である。より好ましくは染色体数は、４倍体である。本発明の融合細胞の染色体数は、例えば、実施例中に開示されるように、ヨウ化プロピジウム染色後にフローサイトメーターを用いて染色体核酸量を測定することにより、評価することができる。本発明の融合細胞は、例えば、上述した本発明の方法により得ることができる。

本発明の融合細胞は、本発明の方法において材料として用いられる細胞の種類に応じて、単細胞生物（例、酵母）、または多細胞生物由来の細胞に由来し得る。多細胞生物由来の細胞としては、例えば、昆虫細胞、植物細胞、鳥類（例、ニワトリ）細胞、および哺乳動物等の動物の細胞が挙げられる。哺乳動物としては、例えば、霊長類（例、ヒト、サル、チンパンジー）、げっ歯類（例、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ）、愛玩動物（例、イヌ、ネコ）、家畜または使役動物（例、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ）が挙げられる。

本発明の融合細胞が動物細胞に由来する場合、動物細胞は、任意の組織に由来し得る。このような組織としては、例えば、呼吸器系組織（例、肺、気管、気管支、咽頭、鼻腔、副鼻腔）、消化器系組織（例、胃、小腸、大腸、直腸）、膵臓、腎臓、肝臓、胸腺、脾臓、心臓、甲状腺、副腎、前立腺、卵巣、子宮、脳、皮膚、筋肉、血管、および血液組織（例、骨髄、末梢血）が挙げられる。本発明の融合細胞はまた、上記組織以外の組織に存在する細胞に由来する細胞であり得る。このような細胞としては、例えば、腺細胞（例、肺腺細胞、乳腺細胞）、上皮細胞、内皮細胞（例、動脈および静脈等の血管内皮）、表皮細胞、間質細胞、繊維芽細胞、脂肪細胞、メサンギウム細胞、膵β細胞、神経細胞、グリア細胞、および血球細胞（例、Ｂ細胞、Ｔ細胞）が挙げられる。本発明の融合細胞はまた、正常細胞または癌細胞（例、ミエローマ）に由来し得る。本発明の融合細胞はさらに、接着細胞または浮遊細胞であり得る。本発明の融合細胞はまた、初代培養細胞または細胞株に由来し得る。本発明の融合細胞はまた、分化細胞（例、終末分化細胞）であり得る。本発明の融合細胞はまた、幹細胞（例、ｉＰＳ等の多能性人工幹細胞、胚性幹細胞、体性幹細胞）等の未分化細胞またはその分化細胞に由来し得る。本発明の細胞はまた、同種細胞または異種細胞由来の細胞であり得るが、好ましくは同種細胞由来の細胞であり得る。

特定の実施形態では、本発明の融合細胞は、高品質タンパク質（例、抗体等のタンパク質医薬）の商業生産のために汎用されている細胞に由来する細胞であってもよい。高品質タンパク質（例、抗体等のタンパク質医薬）の商業生産のために汎用されている細胞は、上述したとおりである。

本発明の融合細胞はまた、例えば、融合に用いられた元の細胞に比し、サイズ（表面積）が大きいことによって特徴付けることができる。本発明の融合細胞は、融合に付される細胞（異種細胞が融合に用いられ、かつ異種細胞のサイズが異なる場合、異種細胞のうちより大きい細胞を基準とする）よりも大きなサイズを有する限り特に限定されないが、このような融合細胞のサイズは、融合に用いられた元の細胞のものに比し、例えば約１．３倍以上、好ましくは約１．５倍以上、より好ましくは約１．７倍以上、さらにより好ましくは約２．０倍以上、特により好ましくは約２．５倍以上、約２．７倍以上または約３．０倍以上である。このような融合細胞のサイズはまた、融合に用いられた元の細胞のものに比し、例えば約５倍以下、約７倍以下、約１０倍以下、約１５倍以下または約２０倍以下であってもよい。融合に用いられた元の細胞に対する本発明の融合細胞のサイズは、例えば、実施例中に開示されるように、フローサイトメーターを用いて前方散乱（ＦＳ）を測定することにより、評価することができる。

本発明の融合細胞はまた、例えば、融合に用いられた元の細胞に比し、細胞内構造が複雑であること（オルガネラの発達度合い）によって特徴付けることができる。本発明の融合細胞は、融合に付される細胞（異種細胞が融合に用いられ、かつ異種細胞の細胞内構造の複雑さが異なる場合、異種細胞のうちより複雑な細胞内構造を有する細胞を基準とする）よりも複雑な細胞内構造を有する限り特に限定されないが、このような融合細胞の細胞内構造の複雑さは、融合に用いられた元の細胞のものに比し、例えば約１．３倍以上、好ましくは約１．５倍以上、より好ましくは約２．０倍以上、さらにより好ましくは約２．５倍以上、特により好ましくは約３．０倍以上、約３．５倍以上、約４．０倍以上または約４．５倍以上である。このような融合細胞のサイズはまた、融合に用いられた元の細胞のものに比し、例えば約５倍以下、約７倍以下、約１０倍以下、約１５倍以下または約２０倍以下であってもよい。融合に用いられた元の細胞に対する本発明の細胞内構造の複雑さは、例えば、実施例中に開示されるように、フローサイトメーターを用いて側方散乱（ＳＳ）を測定することにより、評価することができる。

本発明の融合細胞はさらに、例えば、融合に用いられた元の細胞に比し、タンパク質生産能が向上したことによって特徴付けることができる。タンパク質は、内因性タンパク質（即ち、融合に付される細胞が元々生産していたタンパク質）または外来性タンパク質（例、発現ベクターの導入により生産可能になる外来タンパク質）である。本発明の融合細胞は、融合に付される細胞（異種細胞が融合に用いられ、かつ異種細胞のタンパク質生産能が異なる場合、異種細胞のうちより高い生産能を有する細胞を基準とする）よりも向上したタンパク質生産能を有する限り特に限定されないが、このような融合細胞のタンパク質生産能は、融合に用いられた元の細胞のものに比し、例えば約１．３倍以上、好ましくは約１．５倍以上、より好ましくは約２．０倍以上、さらにより好ましくは約２．５倍以上、特により好ましくは約３．０倍以上、約３．５倍以上、約４．０倍以上、約４．５倍以上または約５．０倍以上である。このような融合細胞のタンパク質生産能はまた、融合に用いられた元の細胞のものに比し、例えば約１０倍以下、約２０倍以下、約３０倍以下、約４０倍以下、約５０倍以下または約１００倍以下であってもよい。融合に用いられた元の細胞に対する本発明のタンパク質生産能は、例えば、測定の簡便さの観点から、実施例中に開示されるように、蛍光タンパク質の発現ベクターを細胞に導入し、次いでフローサイトメーターを用いて蛍光タンパク質が発するシグナルを測定することにより、評価することができる。

特定の実施形態では、本発明の融合細胞は、血清含有培地および無血清培地の双方において良好な接着性を示し得る。例えば、本発明の接着融合細胞は、無血清培地中で培養したときであっても、扁平状に伸展した接着細胞として増殖する能力を有し得る。本発明の接着融合細胞は、融合に付される細胞（異種細胞が融合に用いられ、かつ異種細胞の接着性が異なる場合、異種細胞のうちより高い伸展接着性を有する細胞を基準とする）よりも、接着したときに大きなサイズを有する限り特に限定されない。例えば、本発明の接着融合細胞のサイズは、伸展方向（長軸方向）において、例えば約６０μｍ以上、好ましくは約７０μｍ以上、より好ましくは約８０μｍ以上、さらにより好ましくは約９０μｍ以上、特に好ましくは約１００μｍ以上、約１１０μｍ以上、約１２０μｍ以上、または約１３０μｍ以上である。本発明の接着融合細胞のサイズは、伸展方向（長軸方向）において、例えば約１５０μｍ以下、約２００μｍ以下、約３００μｍ以下、約４００μｍ以下、約５００μｍ以下または１０００μｍ以下であってもよい。本発明の接着融合細胞のサイズはまた、伸展方向と直行する方向（培養ディッシュの平面上における短軸方向）において、例えば約１５μｍ以上、好ましくは約２０μｍ以上、より好ましくは約２５μｍ以上、さらにより好ましくは約３０μｍ以上、特に好ましくは約４５μｍ以上、約５０μｍ以上、約５５μｍ以上または約６０μｍ以上である。本発明の接着融合細胞のサイズは、伸展方向と直行する方向において、例えば約８０μｍ以下、約１００μｍ以下、約２００μｍ以下、約３００μｍ以下または約４００μｍ以下であってもよい。本発明の接着融合細胞のサイズは、例えば、実施例中に開示されるように、培養中の接着融合細胞の顕微鏡写真を撮影し、そのサイズを、伸展方向およびその直行方向において計測することにより、評価することができる。

別の特定の実施形態では、本発明の融合細胞は、上記特徴を安定的に保持することができる。例えば、本発明の融合細胞は、例えば約５回、好ましくは約１０回、より好ましくは約１５回、さらにより好ましくは約２０回であっても、上記特徴を安定的に保持し得る。本発明の融合細胞はまた、例えば約６回、好ましくは約１３回、より好ましくは約２０回、さらにより好ましくは約２６回の細胞分裂後であっても、上記特徴を安定的に保持し得る。本発明の融合細胞は、接着細胞または浮遊細胞として、血清含有培地または無血清培地のいずれかにおいて、上記継代後または上記細胞分裂後に、上記特徴を安定的に保持し得る。

本発明の融合細胞には、発現ベクター等のベクターが導入されていても、導入されていなくてもよい。本発明の融合細胞に導入され得るベクターとしては、例えば、プラスミド、ウイルスベクター（例、アデノウイルス、レトロウイルス）、人工染色体、および組込型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクター（例、レトロウイルス）が挙げられる。発現ベクターはまた、一過的発現または恒常的（すなわち、安定的）発現のためのベクターである。発現ベクターは、好ましくはタンパク質発現ベクターである。タンパク質は、種々のカテゴリーに属するタンパク質を用いることができる。このようなタンパク質としては、例えば、抗体等の分泌因子、増殖因子、酵素、受容体（例、細胞膜受容体）、リガンド、アダプター、細胞接着因子、細胞外マトリクス、輸送体、および核内タンパク質（例、転写因子）が挙げられる。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＹ等のいずれのアイソタイプであってもよい。抗体はまた、モノクローナル抗体（例、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体）であってもよい。抗体はさらに、全長抗体または抗体断片（例、単鎖抗体）であってもよい。

本発明はまた、タンパク質の製造方法を提供する。本発明の方法は、本発明の融合細胞を培地中で培養することを含む。タンパク質は、内因性タンパク質または外来性タンパク質である。具体的には、このようなタンパク質としては、上述したような種々のカテゴリーに属するタンパク質が挙げられるが、抗体が好ましい。抗体としては、例えば、上述した抗体が挙げられる。外来性タンパク質の発現のためには、例えば、上述した発現ベクターを本発明の融合細胞に導入すればよい。

培地は、細胞培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ハム培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、およびこれらの混合培地が挙げられる。培地は、例えば、血清（例、ＦＣＳ）、血清代替物、脂肪酸又は脂質、アミノ酸、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有していてもよいが、好ましくは無血清培地であってもよい。培養温度、ＣＯ_２濃度等の他の培養条件は適宜設定することができる。培養温度は、特に限定されるものではないが、例えば約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。また、ＣＯ_２濃度は、例えば約１〜１０％、好ましくは約５％である。培養のため蒔かれる細胞数、各種因子の濃度等のその他の条件は、適宜設定することができる。培養は、接着培養または浮遊培養のいずれであってもよい。

以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは単なる例に過ぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。

参考例１：タンパク質の高い生産能を有する細胞株（非融合細胞）の解析
抗体を始めとする医薬タンパク質は主に、培養細胞を用いて生産されている。培養細胞によるタンパク質の生産量はコストに与える影響が大きいことから、タンパク質の高い生産能を有する培養細胞（細胞株）の樹立が試みられている。医薬タンパク質の生産では、ＣＨＯ細胞が培養細胞として汎用されているが、ＣＨＯ細胞は、タンパク質の高い生産能を有する細胞株の出現頻度が低い、および無血清培地中での接着培養が困難などの問題があった。そこで、タンパク質の高い生産能を有するＣＨＯ細胞株の解析を行った。

国際公開第２０１３／４２４２６号公報に開示される方法により作製されたニワトリ（ｃｈｉｃｋｅｎ）ＩｇＭ（以下、必要に応じて「目的タンパク質」と称する）の発現ベクターを、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に導入した。得られたＣＨＯ細胞を長期間培養し、培養されたＣＨＯ細胞株のなかから、目的タンパク質を大量に生産する能力を有する安定なＣＨＯ細胞株を２種（ＶＤＳＣ４６Ｍ／ＣＨＯ、およびＶＤＳＣ１Ｍ／ＣＨＯ）、目的タンパク質を少量生産する能力を有する安定なＣＨＯ細胞株を１種（ＶＤＳＣ４２Ｍ／ＣＨＯ）単離した。次いで、これらの細胞株を解析、比較した。コントロールとして、通常のＣＨＯ細胞を解析、比較した。

先ず、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）溶液およびＦｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＦＣＭ）を利用して染色体核酸量を測定した。結果を図１、２に示す。図１、２に示される結果は、目的タンパク質を大量に生産する能力を有するＣＨＯ細胞株の染色体核酸量が、目的タンパク質を少量生産する能力を有するＣＨＯ細胞株および／または元のＣＨＯ細胞の染色体核酸量に比し、多いことを示す。また、蛍光強度の値は染色体核酸量と比例し得ることから、目的タンパク質を大量に生産する能力を有するＣＨＯ細胞株の染色体核酸量は、目的タンパク質を少量生産する能力を有するＣＨＯ細胞株および／または元のＣＨＯ細胞の染色体核酸量に比し、約１．５倍以上であると見積られた（図１、２）。

次いで、ＦＣＭにより前方散乱光（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｓｃａｔｔｅｒｅｄ Ｌｉｇｈｔ：ＦＳ）を測定した。ＦＳの情報は、細胞サイズ（表面積）の指標として利用することができる。結果を図３、４に示す。図３、４に示される結果は、目的タンパク質を大量に生産する能力を有するＣＨＯ細胞株の細胞サイズが、目的タンパク質を少量生産する能力を有するＣＨＯ細胞株および／または元のＣＨＯ細胞の細胞サイズに比し、大きいことを示す。また、ＦＳの値は細胞サイズと比例し得ることから、目的タンパク質を大量に生産する能力を有するＣＨＯ細胞株の細胞サイズは、目的タンパク質を少量生産する能力を有するＣＨＯ細胞株および／または元のＣＨＯ細胞の細胞サイズに比し、約１．５倍以上であると見積られた（図３、４）。

最後に、ＦＣＭにより側方散乱光（Ｓｉｄｅ Ｓｃａｔｔｅｒｅｄ Ｌｉｇｈｔ：ＳＳ）を測定した。ＳＳの情報は、細胞内構造の複雑さ（オルガネラの発達度合い）の指標として利用することができる。結果を図５、６に示す。図５、６に示される結果は、目的タンパク質を大量に生産する能力を有するＣＨＯ細胞株の細胞内構造が、目的タンパク質を少量生産する能力を有するＣＨＯ細胞株および／または元のＣＨＯ細胞の細胞内構造に比し、複雑であることを示す。また、ＳＳの値は細胞内構造の複雑さと比例し得ることから、目的タンパク質を大量に生産する能力を有するＣＨＯ細胞株の細胞内構造は、目的タンパク質を少量生産する能力を有するＣＨＯ細胞株および／または元のＣＨＯ細胞の細胞内構造に比し、約１．５倍以上複雑であると見積られた（図５、６）。

以上より、タンパク質の高い生産能を有する細胞株は、染色体の増幅、大きな細胞サイズ、および複雑な細胞内構造を有していた。したがって、これらの特徴を有する細胞を人工的に樹立することにより、タンパク質の高い生産能を有する細胞株が得られる可能性が示唆された。

実施例１：同調化された細胞の融合による融合細胞の調製（１）
ＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ ＣＯ_２）でＦ１２培地（１０％ ＦＢＳ添加）にてＣＨＯ細胞を培養した。８０％コンフルエントに到達後、培地をＦ１２培地（１０％ ＦＢＳ、０．１μｇ／ｍＬ ノコダゾール添加）に交換し、さらに３６時間培養することによって細胞周期をＭ期に同調させた。ノコダゾールの使用により、細胞周期を、Ｍ期で停止させることができる。同調させた細胞をＰＢＳ（−）で洗浄した後、ｔｒｙｐｓｉｎ溶液（０．２５％ ｔｒｙｐｓｉｎ １ｍＭ ＥＤＴＡ−４Ｎａ）を添加し、次いでＣＯ_２インキュベーターで２分間放置した後、ＣＨＯ細胞を剥離した。剥離したＣＨＯ細胞をＦ１２培地（１０％ ＦＢＳ添加）１０ｍＬに懸濁し、次いで遠心管に移した。遠心分離（１０００ｒｐｍ，５分）後、上清を除去し、次いで血清不含Ｆ１２培地で2回洗浄した。血清不含Ｆ１２培地１０ｍＬに懸濁したＣＨＯ細胞をカウントした。１ｘ１０^６の細胞を含むＣＨＯ細胞懸濁液を分取し、遠心分離（１０００ｒｐｍ，５分）の後、上清を除去した。
得られた細胞サンプルに、１ｍＬのポリエチレングリコール１５００を混ぜながらゆっくりと添加した。次に、血清不含Ｆ１２培地１３ｍＬを細胞懸濁液と混ぜながらゆっくりと添加した。遠心分離（１０００ｒｐｍ，５分）し、上清を除去した後、１０ｍＬのＦ１２培地（１０％ ＦＢＳ添加）に懸濁し、これを、９６ウェルプレートに１ウェル（１００μＬ）に対して０．５個の細胞が含まれるように蒔いた。３日に一回培地を交換しながら融合細胞を増殖させた。増殖した融合細胞を６ウェルプレートに移し、次いで増殖させた。
次いで、得られた融合細胞を、Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＦＣＭ）により解析した。先ず、融合細胞の一部を採取し、７０％エタノールで２４時間固定した。遠心分離（１０００ｒｐｍ，５分）し、上清を除去した後、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）溶液（４ｍＭ）を２ｍＬ添加し、氷上で２時間染色した。染色した細胞をＦｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＦＣＭ）で解析し、ＤＮＡの増幅について検討した。その結果、増幅した染色体を有する融合細胞の存在を確認することができた（図７）。ＤＮＡの増幅が見られるウェル中の細胞を選択した。ＤＮＡの増幅が認められたウェル中の細胞を、再度１ウェルに対して０．５個の細胞が含まれるように９６ウェルプレートに蒔き、増殖させ、融合細胞を得た。
得られた融合細胞について、ＦＣＭによりＦＳおよびＳＳを測定した。その結果、融合細胞のサイズの拡大および細胞内構造の複雑さを確認することができた（図８、９）。以上より、得られた融合細胞は、染色体の増幅、大きな細胞サイズ、および複雑な細胞内構造を有していた。これらの特徴は概して、参考例１で確認された、タンパク質の高い生産能を有する細胞株（非融合細胞）のものと同様であった。具体的には、融合細胞は、融合に用いられた元のＣＨＯ細胞に比し、約１．５倍以上の染色体の増幅、約１．５倍以上の大きな細胞サイズ、および約１．５倍以上の複雑な細胞内構造を有していた。
なお、樹立された融合細胞を血清含有培地（１０％ ＦＢＳ含有Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２倍地）中で継代培養したところ、融合細胞は、２０回継代した後（２６回の細胞分裂回数に相当）であっても、染色体の増幅、大きな細胞サイズ、および複雑な細胞内構造の特徴を保持していた。

実施例２：無血清培地中での融合細胞の培養
実施例１で得られた融合細胞を、血清含有培地（１０％ ＦＢＳ含有Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２倍地）、および無血清培地（ＡＳＦ 培地１０４Ｎ）中で２日間培養した。コントロールとして、細胞融合に用いた通常のＣＨＯ細胞を同様に培養した。
その結果、ＣＨＯ細胞および融合細胞の双方とも、血清含有培地中では、培養ディッシュ上に良好に接着し、伸展して扁平状の形態を呈した（図１０）。一方、無血清培地中では、ＣＨＯ細胞は、培養ディッシュ上に接触していたものの十分な接着性を示さず、丸い形態を呈した（図１０）。一方、融合細胞は、無血清培地中でも、培養ディッシュ上に良好に接着し、伸展して扁平状の形態を呈した（図１０）。したがって、融合細胞は、血清含有培地および無血清培地の双方において、良好な接着性を有することが示された。
また、接着した融合細胞のサイズは、ＦＣＭ解析の結果と相関するように、血清含有培地中で接着したＣＨＯ細胞のサイズに比し、有意に大きかった（図１０）。接着した融合細胞のサイズは、血清含有培地および無血清培地の双方で、伸展方向（長軸方向）において、多くの細胞が約７０μｍ以上の長さを示したのに対し、血清含有培地中で接着したＣＨＯ細胞のサイズは概ね、伸展方向において、約５０μｍ以下の長さであった（図１０）。接着した融合細胞のサイズは、伸展方向と直行する方向（培養ディッシュの平面上における短軸方向）において、多くの細胞が約１５μｍ以上の長さを示したのに対し、血清含有培地中で接着したＣＨＯ細胞のサイズは概ね、伸展方向と直行する方向において、約１５μｍ未満の長さであった（図１０）。
なお、樹立された融合細胞を上記無血清培地中で継代培養したところ、融合細胞は、２０回継代した後（２６回の細胞分裂回数に相当）であっても、染色体の増幅、大きな細胞サイズ、複雑な細胞内構造の特徴および良好な接着性を保持していた。

実施例３：タンパク質の生産能の検討
実施例１で得られた融合細胞によるタンパク質の生産能を検討した。タンパク質としては、融合細胞の内因性タンパク質の代わりに、ＦＣＭでの解析が容易である外来タンパク質ｈＭＧＦＰ（Ｍｏｎｓｔｅｒ ＧＦＰ）を指標とした。通常のＣＨＯ細胞（コントロール）および実施例１で得られた融合細胞にｈＭＧＦＰ発現ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社ｐｈＭＧＦＰ ｖｅｃｔｏｒ：Ｅ６４２１からｈＭＧＦＰをＰＣＲで増幅し、Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のｐｃＤＮＡ３．１（−）：Ｖ７９５−２０に導入したもの）を導入し、Ｇ４１８（３ｍｇ／ｍＬ）入り培地で一週間ｓｅｌｅｃｔｉｏｎをかけたものをＦＣＭで解析し、ｈＭＧＦＰの発現量のパターンを、ＣＨＯ細胞と融合細胞との間で比較した。
その結果、ＣＨＯ細胞は、外来タンパク質の生産能を有する細胞数が少なく、また、陽性細胞の割合も低かった（図１２、１３、表１）。一方、融合細胞は、外来タンパク質の高い生産能を有する細胞数が多く、また、陽性細胞の割合も高かった（図１１、１３、表２）。
以上より、実施例１で得られた融合細胞は、タンパク質の高い生産能を有すること、および外来タンパク質の発現効率が良いことが示された。

実施例４：抗体（ＩｇＭ）の分泌能の検討
実施例１で得られた融合細胞によるニワトリＩｇＭの生産能を検討した。発現ベクターとしては、国際公開第２０１３／４２４２６号公報に開示される方法により作製されたニワトリＩｇＭ軽鎖および重鎖の発現ベクターを利用した。ＣＨＯ細胞（コントロール）および実施例１で得られた融合細胞に発現ベクターを導入し、Ｇ４１８（５００μｇ／ｍＬ）およびハイグロマイシンＢ（５００μｇ／ｍＬ）含有培地で一週間ｓｅｌｅｃｔｉｏｎしたものを限界希釈法にてクローニングし、分泌される抗体をＥＬＩＳＡにより定量した。
その結果、融合細胞は、ＣＨＯ細胞に比し、ＩｇＭの分泌能に優れる割合が高いことが確認された（図１４）。

実施例５：抗体（ＩｇＧ）の分泌能の検討
実施例１で得られた融合細胞によるマウスＩｇＧの生産能を検討した。発現ベクターとしては、国際公開第２０１３／４２４２６号公報に開示される方法により作製されたマウスＩｇＧ軽鎖および重鎖の発現ベクターを利用した。ＣＨＯ細胞（コントロール）および実施例１で得られた融合細胞に発現ベクターを導入し、Ｇ４１８（５００μｇ／ｍＬ）およびハイグロマイシンＢ（５００μｇ／ｍＬ）含有培地で一週間ｓｅｌｅｃｔｉｏｎしたものを限界希釈法にてクローニングし、分泌される抗体をＥＬＩＳＡにより定量した。
その結果、融合細胞は、ＣＨＯ細胞に比し、ＩｇＧの分泌能に優れる割合が高いことが確認された（図１５）。

比較例１：同調化されていない細胞の融合による融合細胞の調製
非同調化された細胞の融合による融合細胞の調製は、同調化剤（ノコダゾール）処理をしなかった点を除き、実施例１と同様にして行った。その結果、得られた融合細胞は当初、染色体の増幅、大きな細胞サイズ、および複雑な細胞内構造を有していたが、血清含有培地（１０％ ＦＢＳ含有Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２倍地）で継代培養したところ、融合細胞は、３回継代した後（約４回の細胞分裂回数に相当）、染色体の増幅、大きな細胞サイズ、複雑な細胞内構造および良好な接着性の特徴を保持できず、通常のＣＨＯ細胞と同様の特徴を示す細胞に復帰した。

実施例６：同調化された細胞の融合による融合細胞の調製（２）
ＣＨＯ細胞以外の細胞を材料として用いて本発明の方法により調製される融合細胞が、上記特徴を有するかどうか、さらに検討した。ＣＨＯ細胞以外の細胞としては、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、およびベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）を用いた。融合細胞の調製は、異なる細胞を材料として用いたこと以外は、実施例１と同様に行った。その結果、本実施例で得られた融合細胞は、実施例１で得られた融合細胞と同様に、染色体の増幅、大きな細胞サイズ、複雑な細胞内構造の特徴、および良好な接着性を有していた。また、融合細胞は、比較例１で行われた継代数を超えた場合であっても、これらの特徴を安定的に保持しており、融合に用いたＨＵＶＥＣおよびＢＨＫと同様の特徴を示す細胞に復帰しなかった。

Claims (8)

1. 以下の特性を有する、チャイニーズハムスター卵巣細胞またはその亜株由来である融合細胞：
   ａ）融合に用いられた元の細胞に比し細胞の表面積が１．３倍以上のサイズ；
   ｂ）融合に用いられた元の細胞に比しフローサイトメーターの側法散乱値が１．３倍以上の複雑な細胞内構造；および
   ｃ）融合に用いられた元の細胞に比し向上した外来タンパク質生産能。
2. 融合細胞が、無血清培地中で培養したときに扁平状に伸展した接着細胞として増殖する能力を有する細胞である、請求項１記載の融合細胞。
3. 扁平状に伸展した接着細胞の長径が７０μｍ以上である、請求項２記載の融合細胞。
4. タンパク質の発現ベクターを含む、請求項１〜３のいずれか一項記載の融合細胞。
5. 同調化された細胞を人為的に融合させることにより得られる細胞である、請求項１〜４のいずれか一項記載の融合細胞。
6. 請求項１〜５のいずれか一項記載の融合細胞を培地中で培養することを含む、タンパク質の製造方法。
7. タンパク質が抗体である、請求項６記載の方法。
8. 培地が無血清培地である、請求項６または７記載の方法。