JPS6152287A - 細胞融合方法 - Google Patents
細胞融合方法Info
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- JPS6152287A JPS6152287A JP17040084A JP17040084A JPS6152287A JP S6152287 A JPS6152287 A JP S6152287A JP 17040084 A JP17040084 A JP 17040084A JP 17040084 A JP17040084 A JP 17040084A JP S6152287 A JPS6152287 A JP S6152287A
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- phase
- colcemid
- fusion
- cells
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
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- Microbiology (AREA)
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- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は細胞融合法に関し、特に高い効率で雑種細胞株
を得る方法に関する。
を得る方法に関する。
更に詳しくは、細胞株間又は細胞株と正常細胞とを融合
させて高い効率でハイブリドーマ（雑種細胞株）を得る
に際し、少なくとも一方の細胞が分裂期（Ｍ期）にある
様に調整した後に融合を行うことによって、高い効率で
雑ｓｉ細胞株を得る方法に関するものである。
させて高い効率でハイブリドーマ（雑種細胞株）を得る
に際し、少なくとも一方の細胞が分裂期（Ｍ期）にある
様に調整した後に融合を行うことによって、高い効率で
雑ｓｉ細胞株を得る方法に関するものである。
また、本発明では、融合させる細胞株の少なくとも一方
をコルセミド（白血病治療に用いられるアルカロイドの
１種→処理によってきわめて容易に分裂期に調整するも
のである。
をコルセミド（白血病治療に用いられるアルカロイドの
１種→処理によってきわめて容易に分裂期に調整するも
のである。
本発明でいう細胞株とは、動物細胞が試験管内で無限の
増殖をしうる状態になったものである。
増殖をしうる状態になったものである。
正常細胞とは、２倍体の染色体本数を有し試験管内では
有限の増殖をするか全く増殖しえない細胞である。
有限の増殖をするか全く増殖しえない細胞である。
Ｋ６ｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ （１９７５年； Ｎ
ａｔｕｒｅ２５６ ４９５〜４９７）が、免疫したマウ
スの肺臓細胞とマウス骨髄腫細胞をセイダイウイルス（
）ＩＶＪ）を用いて融合させて、単一の抗体を永続的に
産生ずる細胞を得て以来、細胞融合により種々の単一ク
ローン性抗体が作製されてきた。更に、細胞融合の技術
を改良して、より高い効率でハイプリドーマを得ようと
する研究は多くなされている。
ａｔｕｒｅ２５６ ４９５〜４９７）が、免疫したマウ
スの肺臓細胞とマウス骨髄腫細胞をセイダイウイルス（
）ＩＶＪ）を用いて融合させて、単一の抗体を永続的に
産生ずる細胞を得て以来、細胞融合により種々の単一ク
ローン性抗体が作製されてきた。更に、細胞融合の技術
を改良して、より高い効率でハイプリドーマを得ようと
する研究は多くなされている。
ｔす）
しかしながら細胞融合によるノ・イブリドーマの形成率
は一般的に低く、容易に多量のノ・イブリドーマを生成
させる技術は未だ確立されていない。
は一般的に低く、容易に多量のノ・イブリドーマを生成
させる技術は未だ確立されていない。
一般的に、細胞の有糸分裂周期は分裂期（Ｍ期）と開門
（）口ｔｅｒｐｌ＋ａｓｅ ）の２期に大別される。そ
して、分裂期は更に前期（ｐｒｏｐｈａｓｅ ）、中期
（ｍｅｔａｐｈａｓｅ ） 、後期（ａｎａｐｈａｓｅ
）終期（ｔｅｌｏｐｈａｓｅ ）の４期に区別される
。
（）口ｔｅｒｐｌ＋ａｓｅ ）の２期に大別される。そ
して、分裂期は更に前期（ｐｒｏｐｈａｓｅ ）、中期
（ｍｅｔａｐｈａｓｅ ） 、後期（ａｎａｐｈａｓｅ
）終期（ｔｅｌｏｐｈａｓｅ ）の４期に区別される
。
Ｍ期は指標となるような明瞭な形態所見を欠くので５代
シに、生化学的区分が為されている。一般にＭ期の一定
時期に起るＤＮＡ合成を指標として前合成期（Ｇ＋期）
、合成期（８期）、及び前分裂期（０２期）の６期区分
が広く用いられる。
シに、生化学的区分が為されている。一般にＭ期の一定
時期に起るＤＮＡ合成を指標として前合成期（Ｇ＋期）
、合成期（８期）、及び前分裂期（０２期）の６期区分
が広く用いられる。
従って、細胞の増殖周期は、便宜的に、ＤＮＡ合成前期
（Ｇ１期）、ＤＮＡ合成期（８期）、ＤＮＡ合成後期（
０２期）及び分裂期（Ｍ期）に区別することができる。
（Ｇ１期）、ＤＮＡ合成期（８期）、ＤＮＡ合成後期（
０２期）及び分裂期（Ｍ期）に区別することができる。
従来、細胞周期を利用して、高い効率で雑種法を得る方
法としては、細胞増殖の０１期に融合させる方法が知ら
れている。（特開昭５９−５１７９１ ）（ろ） しかし、００期による細胞融合によっても満足すべき量
のハイブリドーマを得ることは困難であった。
法としては、細胞増殖の０１期に融合させる方法が知ら
れている。（特開昭５９−５１７９１ ）（ろ） しかし、００期による細胞融合によっても満足すべき量
のハイブリドーマを得ることは困難であった。
本発明者らは、より高い融合の細胞周期を求めて研究し
たところ、細胞周期を分裂期（Ｍ期）に調整して、細胞
融合すれば、細胞融合の効率を高めることができること
を見出したのである、本発明は、細胞株間もしくは細胞
株と正常細胞から細胞融合法により雑種細胞株を作成す
るに際して、少なくとも一方の細胞株の細胞周期を分裂
期（Ｍ期）に調整し、分裂期の間に細胞融合せしめるこ
とを特徴とする細胞融合方法である。
たところ、細胞周期を分裂期（Ｍ期）に調整して、細胞
融合すれば、細胞融合の効率を高めることができること
を見出したのである、本発明は、細胞株間もしくは細胞
株と正常細胞から細胞融合法により雑種細胞株を作成す
るに際して、少なくとも一方の細胞株の細胞周期を分裂
期（Ｍ期）に調整し、分裂期の間に細胞融合せしめるこ
とを特徴とする細胞融合方法である。
また、本発明においては、細胞株間もしくは細胞株と正
常細胞から細胞融合法により雑種細胞株を作成するに際
して、少なくとも一方の細胞株をコルセミド処理をして
分裂期に調整するのが好ましい。
常細胞から細胞融合法により雑種細胞株を作成するに際
して、少なくとも一方の細胞株をコルセミド処理をして
分裂期に調整するのが好ましい。
本発明においては、細胞株間もしくは細胞株と正常細胞
が融合させられるものである。
が融合させられるものである。
融合させられる細胞株又は正常細胞は一般に有用物質な
どを生産するものから選択される。
どを生産するものから選択される。
細胞株としては、各種有用物質を生産するガン化細胞が
あげられる。
あげられる。
まだ、正常細胞としては免疫したマウスの肺臓細胞、ガ
ラス器内で抗原感作しだ肺臓細胞あるいは末梢血リンパ
球のような細胞などが用いられる。
ラス器内で抗原感作しだ肺臓細胞あるいは末梢血リンパ
球のような細胞などが用いられる。
一方、融合に用いる細胞株としては骨髄腫由来の細胞株
でヒボキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランス
フェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損のものが多用される。Ｈ
ＧＰＲＴ欠損の骨髄腫細胞はアミノプテリン存在下では
増殖できないが、正常細胞と融合した・・１プリドーマ
は正常細胞由来のＨＧＰＲＴによレヒボキサンチンとチ
シジンがあればアミノプテリン存在下でも増殖可能にな
るので、その性質を利用してノ１イブリドーマの選別を
容易にするものである。
でヒボキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランス
フェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損のものが多用される。Ｈ
ＧＰＲＴ欠損の骨髄腫細胞はアミノプテリン存在下では
増殖できないが、正常細胞と融合した・・１プリドーマ
は正常細胞由来のＨＧＰＲＴによレヒボキサンチンとチ
シジンがあればアミノプテリン存在下でも増殖可能にな
るので、その性質を利用してノ１イブリドーマの選別を
容易にするものである。
本発明は、細胞株間まだは正常細胞と細胞株を融合させ
て、ハイブリドーマを作製する際に少なくともどちらか
一方の細胞株を分裂期（Ｍ期）に調整することを特徴と
している。細胞周期の調整方法としては一般に知られて
いる同調方法（例えば黒田行昭編果「培養細胞遺伝学実
験法」１０章、共立出版（１９８１年）参照）などのい
ずれを用いることもできる。
て、ハイブリドーマを作製する際に少なくともどちらか
一方の細胞株を分裂期（Ｍ期）に調整することを特徴と
している。細胞周期の調整方法としては一般に知られて
いる同調方法（例えば黒田行昭編果「培養細胞遺伝学実
験法」１０章、共立出版（１９８１年）参照）などのい
ずれを用いることもできる。
また、細胞株又は正常細胞を分裂期（Ｍ期）に調整する
のはコルセミド処理法によるのが最も簡便である。コル
セミドの替りにコルヒチンを使用してもよいが、毒性が
強いためコルセミドの方が適当である。
のはコルセミド処理法によるのが最も簡便である。コル
セミドの替りにコルヒチンを使用してもよいが、毒性が
強いためコルセミドの方が適当である。
また、細胞の融合は、ポリエチレングリコールによるの
が最も一般的であるが、センダイウィルス（ＨＶＪ）や
、強い電気的パルスも用いられる。
が最も一般的であるが、センダイウィルス（ＨＶＪ）や
、強い電気的パルスも用いられる。
次にマウスミエローマとマウス肺臓細胞とによる雑種細
胞のコロニー形成を例にとり、コルセミド処理と細胞融
合の実施方法の具体例を示す。この方法は他の細胞株間
もしくは細胞株と正常細胞の細胞融合にも同様に使用す
ることができるものである。
胞のコロニー形成を例にとり、コルセミド処理と細胞融
合の実施方法の具体例を示す。この方法は他の細胞株間
もしくは細胞株と正常細胞の細胞融合にも同様に使用す
ることができるものである。
コルセミド処理の実施にあたっては、１０μ９／プのコ
ルセミド水溶液を作製したのち０．２μｍｒ１程度の孔
径フィルターで濾過滅菌する。この溶液は０〜４℃の低
温で保存すれば６ケ月以上使用可能である。
ルセミド水溶液を作製したのち０．２μｍｒ１程度の孔
径フィルターで濾過滅菌する。この溶液は０〜４℃の低
温で保存すれば６ケ月以上使用可能である。
ミエローマはプラスチックシー（・−レもしくは培養フ
ラスコを用いて増殖させるが、上ａピコルセミド溶液を
培地容量の１／１０［１０〜１／１００ 程度の割合
で添加し充分に振盪して培地と混和してから培養を継続
する。添加時期はミエローマを収穫する２〜４時間前が
良い。
ラスコを用いて増殖させるが、上ａピコルセミド溶液を
培地容量の１／１０［１０〜１／１００ 程度の割合
で添加し充分に振盪して培地と混和してから培養を継続
する。添加時期はミエローマを収穫する２〜４時間前が
良い。
また、免疫されたマウスからの肺臓細胞の調製、および
ミエローマとの融合はポリエチレングリコールを用いて
一般に行なわれている方法（例えばＧ、 Ｇａ１ｆｒｅ
＆ Ｃ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ （Ｊ、 Ｊ、 Ｌａｎｇｏｎ
ｅ、 Ｈ，Ｖａｎ Ｖｕｎａｋｉｓ編）７６巻６−４６
ページ、（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ。
ミエローマとの融合はポリエチレングリコールを用いて
一般に行なわれている方法（例えばＧ、 Ｇａ１ｆｒｅ
＆ Ｃ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ （Ｊ、 Ｊ、 Ｌａｎｇｏｎ
ｅ、 Ｈ，Ｖａｎ Ｖｕｎａｋｉｓ編）７６巻６−４６
ページ、（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ。
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 （１９８１年）あるいは岩崎他の
「単クローン抗体ハイブリドーマとＥＬＩＳＡＪｉｉ社
（１９８３年））で行なえば良い。
「単クローン抗体ハイブリドーマとＥＬＩＳＡＪｉｉ社
（１９８３年））で行なえば良い。
ミエローマを収集してから肺臓細胞と混オロさせ、ポリ
エチレングリコール溶液を加えるに至るまで細胞を懸濁
させておく溶液に０．０１−０．１μＶｔＬｔのコルセ
ミドを加えることにより更に、細胞融合の効率を高める
ことができるが、この段階でのコルセミド添加は省略し
ても充分に良い結果が得られる。
エチレングリコール溶液を加えるに至るまで細胞を懸濁
させておく溶液に０．０１−０．１μＶｔＬｔのコルセ
ミドを加えることにより更に、細胞融合の効率を高める
ことができるが、この段階でのコルセミド添加は省略し
ても充分に良い結果が得られる。
この結果は、実施例４０表１に示される。
このようなコルセミド処理により雑種細胞株のコロニー
形成率は顕著に増加する。免疫されたマウスの肺臓細胞
をミエローマ細胞を融合させた場合の、特異抗体を産生
し且つ無限増殖可能な細胞株のコロニー形成率の増加は
コルセミド処理によって更に顕著でよシコルセミド処理
なしでは抗体産生ハイブリドーマの作製の不可能ｆＡ場
合すらある。
形成率は顕著に増加する。免疫されたマウスの肺臓細胞
をミエローマ細胞を融合させた場合の、特異抗体を産生
し且つ無限増殖可能な細胞株のコロニー形成率の増加は
コルセミド処理によって更に顕著でよシコルセミド処理
なしでは抗体産生ハイブリドーマの作製の不可能ｆＡ場
合すらある。
本発明においては分裂期（Ｍ期）に細胞融合するもので
あるが、分裂期（Ｍ期）細胞株又は細胞が細胞融合に適
していることの理論的説明は未だ充分になしえないが、
恐らく分裂期同志以外の組み合せでの細胞融合では早期
染色体凝縮がおこ）やすく、染色体が損傷を受けるため
雑種細胞株の形成率が低いものと推定される。従って細
胞株間もしくは細胞株と正常細胞の間で細胞融合をさせ
るにあたって、両方の細胞を分裂期に調整することによ
り更なる融合効率の向上が期待できる。
あるが、分裂期（Ｍ期）細胞株又は細胞が細胞融合に適
していることの理論的説明は未だ充分になしえないが、
恐らく分裂期同志以外の組み合せでの細胞融合では早期
染色体凝縮がおこ）やすく、染色体が損傷を受けるため
雑種細胞株の形成率が低いものと推定される。従って細
胞株間もしくは細胞株と正常細胞の間で細胞融合をさせ
るにあたって、両方の細胞を分裂期に調整することによ
り更なる融合効率の向上が期待できる。
次に本発明の実施例を示す。
実施例１
１２週齢の雄のＢ Ａ Ｌ Ｂ ／ ｃ系マウスに対し
て、４０μｇのニワトリコネクチンと０．３７ ｍ９の
水酸化アルミニウムを含む抗原溶液を６週間と２週間の
間隔をおいて３回腹腔に注射した。最終免疫はその２週
間後に６０μｇのニワ） ｌ）コネクチン（アジュバン
トを含まない抗原）を注射することにより行なった。最
終注射の３日後にマウスから肺臓細胞を調製しマウスミ
エローマとの融合に用いた。
て、４０μｇのニワトリコネクチンと０．３７ ｍ９の
水酸化アルミニウムを含む抗原溶液を６週間と２週間の
間隔をおいて３回腹腔に注射した。最終免疫はその２週
間後に６０μｇのニワ） ｌ）コネクチン（アジュバン
トを含まない抗原）を注射することにより行なった。最
終注射の３日後にマウスから肺臓細胞を調製しマウスミ
エローマとの融合に用いた。
マウスミエローマ（Ｘ６３−Ａｇ８−４５．５゜）は融
合の２日前に直径１５０ｍｍのプラスチックシャーレに
５０ｍＡ’の１０チ牛脂児血清を含むＲＰＭ１１６４０
培地とともに７Ｘ１０’細胞を播種し、５チ炭酸ガス／
９５チ空気の雰囲気で３７℃でインキュベートしたもの
を使用した。マウスミエローマ（９）
＋＋Ａｘのコルセミド処理は０．０４μｇ／
ｍｌの濃度で、２．５時間行なった。
合の２日前に直径１５０ｍｍのプラスチックシャーレに
５０ｍＡ’の１０チ牛脂児血清を含むＲＰＭ１１６４０
培地とともに７Ｘ１０’細胞を播種し、５チ炭酸ガス／
９５チ空気の雰囲気で３７℃でインキュベートしたもの
を使用した。マウスミエローマ（９）
＋＋Ａｘのコルセミド処理は０．０４μｇ／
ｍｌの濃度で、２．５時間行なった。
マウスミエローマとマウス肺臓細胞の混合割合は、コル
セミド処理しないマウスミエローマ１に対してマウス肺
臓細胞１ｏ、コルセミド処理をしたマウスミエローマ１
に対してマウス肺臓細胞１゜の比率で、ともにイーグル
の最少必要培地（ＭＥＭ）中で混合してから２００Ｘｉ
で１０分間遠心した。
セミド処理しないマウスミエローマ１に対してマウス肺
臓細胞１ｏ、コルセミド処理をしたマウスミエローマ１
に対してマウス肺臓細胞１゜の比率で、ともにイーグル
の最少必要培地（ＭＥＭ）中で混合してから２００Ｘｉ
で１０分間遠心した。
得られたスレッドに３７℃にあたためた５ｏチのＰＥＧ
４０００ （オロ光純薬）のＭＥＭ溶液を加えた。約
１分間撹拌してからよく振）まぜながら６０秒おきに１
ｍｌのＭＥＭを１０回で計ｉｏｙ加えた。遠心してポリ
エチレングリコールを除き１゜チの牛脂児血屑を含むＲ
ＰＭＩ １６４０培地に懸濁してから約１４０１ｉＡ！
（２滴、ｉ ｏ’個の肺臓細胞を含む）を９６穴の培養
プレート（コースタ−社；３５９６）の各穴に分配した
。２４時間後、約１４０μｌのＨＡＴ培地を加えた。培
地交換はその飲、１日おきに２回、それ以降は６日おき
に半量をＨＡＴ培地で交換することにより行なった。
４０００ （オロ光純薬）のＭＥＭ溶液を加えた。約
１分間撹拌してからよく振）まぜながら６０秒おきに１
ｍｌのＭＥＭを１０回で計ｉｏｙ加えた。遠心してポリ
エチレングリコールを除き１゜チの牛脂児血屑を含むＲ
ＰＭＩ １６４０培地に懸濁してから約１４０１ｉＡ！
（２滴、ｉ ｏ’個の肺臓細胞を含む）を９６穴の培養
プレート（コースタ−社；３５９６）の各穴に分配した
。２４時間後、約１４０μｌのＨＡＴ培地を加えた。培
地交換はその飲、１日おきに２回、それ以降は６日おき
に半量をＨＡＴ培地で交換することにより行なった。
コロニーの観察を融合の８日後に行なった一コルセミド
処理しない場合の平均のコロニー数が１穴あだ、！ｌ）
１．７２であるのに対してコルセミド処理した場合の
値は２．２８であった、コルセミド処理した場合９５優
のウェルにコロニーが見られたのに対照では８６チのウ
ェルにしかコロニーが形成しなかった。酵素免疫定量に
より抗原に特異的な抗体の産生を調べた結果、閾値をＡ
４．。−０，１とした場合、コルセミド処理群では６９
ウエル中９ウエルで抗体（ＩｇＭないしはＩｇＧ ）の
産生が認められだのに対して対照（４７ウエル）では全
く抗体の産生が認められなかった。
処理しない場合の平均のコロニー数が１穴あだ、！ｌ）
１．７２であるのに対してコルセミド処理した場合の
値は２．２８であった、コルセミド処理した場合９５優
のウェルにコロニーが見られたのに対照では８６チのウ
ェルにしかコロニーが形成しなかった。酵素免疫定量に
より抗原に特異的な抗体の産生を調べた結果、閾値をＡ
４．。−０，１とした場合、コルセミド処理群では６９
ウエル中９ウエルで抗体（ＩｇＭないしはＩｇＧ ）の
産生が認められだのに対して対照（４７ウエル）では全
く抗体の産生が認められなかった。
実施例２
７週齢の雌のＢ Ａ Ｌ Ｂ ／ ｃ系マウスに１′５
μｇのボウズ株メラノーマの組織型ゾラズミノーゲン活
性化因子（ＰＡ）と０．１ ｖｔフロイント完全アジュ
バントを含む０．２ ｒａｔの抗原を腹腔に６週間の間
隔で２回注射した。更に２週間後に１６μｇのＰＡＯ，
３７ｍ９水酸化アルミニウムとともに腹腔に注射した。
μｇのボウズ株メラノーマの組織型ゾラズミノーゲン活
性化因子（ＰＡ）と０．１ ｖｔフロイント完全アジュ
バントを含む０．２ ｒａｔの抗原を腹腔に６週間の間
隔で２回注射した。更に２週間後に１６μｇのＰＡＯ，
３７ｍ９水酸化アルミニウムとともに腹腔に注射した。
６日後に牌ｍＭＢ胞を調製し、コルセミド処理（５０ｎ
ｊ！／ＩＬｌ、２，５時間）したミエローマ２．４×１
０７細胞に２．４Ｘ１０ｇの肺臓細胞、コルセミド処理
しないミエローマ１．９ Ｘ １０’ ａ胞Ｋ １９
ｘ１０′１の肺臓細胞を混ぜて実施例１と同様に細胞融
合を行なった。コロニーの観察は融合後８日目に行なっ
た。対照、コルセミド処理群ともすべてのウェルにコロ
ニーの形成が認められた。各ウェルの平均のコロニー数
は対照が５．６７であったのに対してコルセミド処理群
ではＺ１６であった。
ｊ！／ＩＬｌ、２，５時間）したミエローマ２．４×１
０７細胞に２．４Ｘ１０ｇの肺臓細胞、コルセミド処理
しないミエローマ１．９ Ｘ １０’ ａ胞Ｋ １９
ｘ１０′１の肺臓細胞を混ぜて実施例１と同様に細胞融
合を行なった。コロニーの観察は融合後８日目に行なっ
た。対照、コルセミド処理群ともすべてのウェルにコロ
ニーの形成が認められた。各ウェルの平均のコロニー数
は対照が５．６７であったのに対してコルセミド処理群
ではＺ１６であった。
酵素免疫定量により抗原に特異的な抗体の産生を調べた
ところすべてのウェルが陽性であった。閾値をＡ４１０
＝ １．０として、抗体活性の強いものを数えたとこ
ろ、コルセミド処理群の９５ウエル中１２ウエルでね、
。〉１．０であったのに対して対照群ではＡ４１０ ＞
１． ［］であるものは９５ウェル中８ウェルしかな
かった。抗体活性の高いものから順に限界希釈法を用い
てクローニングを行なった。
ところすべてのウェルが陽性であった。閾値をＡ４１０
＝ １．０として、抗体活性の強いものを数えたとこ
ろ、コルセミド処理群の９５ウエル中１２ウエルでね、
。〉１．０であったのに対して対照群ではＡ４１０ ＞
１． ［］であるものは９５ウェル中８ウェルしかな
かった。抗体活性の高いものから順に限界希釈法を用い
てクローニングを行なった。
多くのクロー皇ングが急速に抗体生産能あるいは増殖能
を失った。コルセミド処理群では６ウエルをクローニン
グしてＦＡに特異的なＩｇＧ、を産生する株が２つとｒ
ｇＭを産生ずる株が１つ得られ友のに対して、対照群で
は１３ウエルをクローニングして１個のＩｇＧ２ａ生産
株が得られたにすぎなかった。
を失った。コルセミド処理群では６ウエルをクローニン
グしてＦＡに特異的なＩｇＧ、を産生する株が２つとｒ
ｇＭを産生ずる株が１つ得られ友のに対して、対照群で
は１３ウエルをクローニングして１個のＩｇＧ２ａ生産
株が得られたにすぎなかった。
実施例６
８週齢の−のＢ Ａ Ｌ Ｂ ／ ｃ系マウスに３週間
の間隔で２回、５００単位のヒト繊毛性ゴナドトロピン
（ＨＣＧ ）と５０係の７０インドの完全アジュバント
を含む０．２ ｍｌの抗原を注射した。更に２週間後、
５００単位のＨＣＧと５０チのフロイントの不完全アジ
ュバントを含む０．２１１！ｌ／の抗原を腹腔内に注射
し最終免疫とした。６日後にこの免疫したマウスから肺
臓細胞を調製し、０．０５μｆｌ／ｍｌのコルセミドで
６時間処理したミエローマないしは、コルセミド処理し
ないミエローマとの融合を実施例１と同様に行なった。
の間隔で２回、５００単位のヒト繊毛性ゴナドトロピン
（ＨＣＧ ）と５０係の７０インドの完全アジュバント
を含む０．２ ｍｌの抗原を注射した。更に２週間後、
５００単位のＨＣＧと５０チのフロイントの不完全アジ
ュバントを含む０．２１１！ｌ／の抗原を腹腔内に注射
し最終免疫とした。６日後にこの免疫したマウスから肺
臓細胞を調製し、０．０５μｆｌ／ｍｌのコルセミドで
６時間処理したミエローマないしは、コルセミド処理し
ないミエローマとの融合を実施例１と同様に行なった。
コロニーの観察を融合後９日目に行なった。コルセミド
処理群、対照群それぞれ１９０ウエルのうち対照群では
４０ウエル（２１％）がコロニー陽性であったのに対し
て、コルセミド処理群では１４６ウエル（７７％）がコ
ロニー陽性であった。
処理群、対照群それぞれ１９０ウエルのうち対照群では
４０ウエル（２１％）がコロニー陽性であったのに対し
て、コルセミド処理群では１４６ウエル（７７％）がコ
ロニー陽性であった。
また、コルセミド処理群では１ウエルあた）平均１．７
５個のコロニーが生成したのに対して、対照群では１ウ
エルあたＤｏ、２６個のコロニーしか生成しなかった。
５個のコロニーが生成したのに対して、対照群では１ウ
エルあたＤｏ、２６個のコロニーしか生成しなかった。
２融合後１５日目に行なった抗原結合マイクロタイター
プレートを用いた酵素免疫定量１０．２以上の吸光度を
与えるウェルはコルセミド処理群では１３個あったのに
対して、対照群では１個しかなかった。
プレートを用いた酵素免疫定量１０．２以上の吸光度を
与えるウェルはコルセミド処理群では１３個あったのに
対して、対照群では１個しかなかった。
実施例４
６週齢の雌のＢ Ａ Ｌ Ｂ ／ ｃ系マウスに６週間
の間隔で２回１５μｙのニワトリコネクチンと５０チの
７０インドの完全アジュバントを含む０．２１１の抗原
を腹腔内に注射した。更に２週間後５０μｙのニワトリ
コネクチンを含む抗原の０．５ Ｍ ＮａＣ１溶液を０
．２１ｎｌ！腹腔内に注射した。６日後に肺臓細胞を調
製し、実施例１と同様にミエローマとの細胞融合を行な
った。ミエローマの３７℃でのコルセミド処理は５０
ｎｌｌ ／ ”Ａ’で６時間行なった。また、ミエロー
マを収横してから、肺臓細胞と混和し、ポリエチレング
リコールを加えるに至るまで細胞を懸濁しておくＭＥＭ
にも、場合によっては５０ Ｊ ／ ｍｌのコルセミド
を加えてその影響を調べた。融合後１６日目にコロニー
数を数えた。また融合後１８日目に抗原に特異的抗体の
酵素免疫定ｔ（ＦｉＩ、ｌ５Ａ）をパーオキシダーゼ標
識抗マウスＩｇＧ、ＩｇＭを用いて行なった。コロニー
数と、閾値をＡｌ５ｏ ＝ ０．０５とした時のｌ（Ｉ
、ＩＳＡ陽性のウェル数に関する結果を表１に示す。
の間隔で２回１５μｙのニワトリコネクチンと５０チの
７０インドの完全アジュバントを含む０．２１１の抗原
を腹腔内に注射した。更に２週間後５０μｙのニワトリ
コネクチンを含む抗原の０．５ Ｍ ＮａＣ１溶液を０
．２１ｎｌ！腹腔内に注射した。６日後に肺臓細胞を調
製し、実施例１と同様にミエローマとの細胞融合を行な
った。ミエローマの３７℃でのコルセミド処理は５０
ｎｌｌ ／ ”Ａ’で６時間行なった。また、ミエロー
マを収横してから、肺臓細胞と混和し、ポリエチレング
リコールを加えるに至るまで細胞を懸濁しておくＭＥＭ
にも、場合によっては５０ Ｊ ／ ｍｌのコルセミド
を加えてその影響を調べた。融合後１６日目にコロニー
数を数えた。また融合後１８日目に抗原に特異的抗体の
酵素免疫定ｔ（ＦｉＩ、ｌ５Ａ）をパーオキシダーゼ標
識抗マウスＩｇＧ、ＩｇＭを用いて行なった。コロニー
数と、閾値をＡｌ５ｏ ＝ ０．０５とした時のｌ（Ｉ
、ＩＳＡ陽性のウェル数に関する結果を表１に示す。
この結果はミエローマを収集してから肺臓細胞と混和さ
せ、ポリエチレングリコール溶液を加えるに至るまで細
胞を懸濁させておく溶液にコルセミドを加えることによ
り、更に細胞融合の効率を高めることができることを示
している。
せ、ポリエチレングリコール溶液を加えるに至るまで細
胞を懸濁させておく溶液にコルセミドを加えることによ
り、更に細胞融合の効率を高めることができることを示
している。
Claims (2)
- （１）細胞株間もしくは細胞株と正常細胞から細胞融合
法により雑種細胞株を作成するに際して、少なくとも一
方の細胞株の細胞周期を分裂期（Ｍ期）に調整し、分裂
期の間に細胞融合せしめることを特徴とする細胞融合方
法。 - （２）細胞株間もしくは細胞株と正常細胞から細胞融合
法により雑種細胞株を作成するに際して、少なくとも一
方の細胞株をコルセミド処理をして分裂期に調整するこ
とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の細胞融合方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17040084A JPS6152287A (ja) | 1984-08-17 | 1984-08-17 | 細胞融合方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17040084A JPS6152287A (ja) | 1984-08-17 | 1984-08-17 | 細胞融合方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6152287A true JPS6152287A (ja) | 1986-03-14 |
Family
ID=15904222
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17040084A Pending JPS6152287A (ja) | 1984-08-17 | 1984-08-17 | 細胞融合方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6152287A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02231080A (ja) * | 1989-03-03 | 1990-09-13 | Yakult Honsha Co Ltd | 菌類の同質多倍数体の形成方法 |
| JP2010511379A (ja) * | 2006-10-13 | 2010-04-15 | セントコア・オーソ・バイオテック・インコーポレイテッド | 細胞同調を通じたハイブリドーマ融合効率の向上 |
| JP2015073480A (ja) * | 2013-10-09 | 2015-04-20 | 富士レビオ株式会社 | 融合細胞およびその作製方法 |
-
1984
- 1984-08-17 JP JP17040084A patent/JPS6152287A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02231080A (ja) * | 1989-03-03 | 1990-09-13 | Yakult Honsha Co Ltd | 菌類の同質多倍数体の形成方法 |
| JP2010511379A (ja) * | 2006-10-13 | 2010-04-15 | セントコア・オーソ・バイオテック・インコーポレイテッド | 細胞同調を通じたハイブリドーマ融合効率の向上 |
| JP2015073480A (ja) * | 2013-10-09 | 2015-04-20 | 富士レビオ株式会社 | 融合細胞およびその作製方法 |
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