JPS63185374A - ヒト−ヒトハイブリド−マ作製用親細胞株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ヒトＢ又はＴ　リンパ球との融合能を有し、
高頻度にヒトーヒトノ・イブリドーマを作製し得る親細
胞株に関するものである。

従来の技術及び発明が解決しようとする問題点ハイプリ
ドーマ法によるモノクローナル抗体、リンフ才力イン等
の有用物質産生糸の特徴は、これら生体内の微量物質を
生体外で大量に且つ繰り返し得ることができることにあ
る。例えば、異物抗原に対する抗体を生体により産生ず
る場合には、量的に限界がある。しかし、異物抗原に対
するモノクローナル抗体を産生ずるハイプリドーマを用
い抗体産生を行った場合には、生体外でノ・イブリドー
マを大量培養することにより大量の抗体を産生ずること
ができる。また、リンフ才力イン等の微量生体成分につ
いても、ハイプリドーマ法により大量生産が可能となる
。

ハイプリドーマ法は、１９７５年にに６ｈｌｅｒとＭｉ
　１ｓｔｅｉｎ　（ＮａｔＬＬｒｅ　、　　２５６巻、
４９５−４９７頁）により確立された。彼らはマウス牌
細胞とマウス骨ｍ１１１ｆｌｌｊ１３）（ヒボキサンチ
ン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーセ（以
下ＨＧＰＲＴという）欠損株〕とをポリエチレングリコ
ール（以下ＰＥＧという）存在下で融合しハイプリドー
マを得た。以来、動物牌ａ３胞と動物骨髄腫細胞とのハ
イプリドーマに関し数多くの報告がなされているが、は
とんどがマウス−マウスハイプリドーマである。しかし
、マウス−マウスハイプリドーマにより産生されるマウ
ス型抗体は、ヒトにとって異物であるため、Ｒ■−イメ
ージング等のヒトの病気の診断又はその治療への応用に
は限界がある。また、１９７７球により産生されるリン
フ才力イン等についても、マウス−マウスハイプリドー
マにより産生されるマウス型リンフ才力イン等は、その
応用に限界がある。

このためヒト型のモノクローナル抗体、リンフ才力イン
等が必要となる。これらのヒト型有用物質を得るために
は、有用物質産生性ヒトＢ又は１９７７球と、ヒト骨髄
１康＋１ｌｆｌ胞のように永続的に増殖可能な親細胞株
とが必要となる。これらをＰＥＧ存在下で融合すること
により、永続的に増殖可能な有用物質産生性ヒト−ヒト
ハイブリドーマを得ることができる。しかし、現在まで
種々の親細胞株が報告されているが、いずれも融合効率
が低く、マウス−マウスハイプリドーマの出現率に到達
していない。例えば、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ　２（
αＨａｒｅ、Ｍ、Ｊ、ら、Ｐｒｏｔｉｄｅｓ　ｏｆ　Ｂ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌＦｌｕ＋ｄＳ＋　３０巻、２６５−
２６８頁ｒ　Ｐｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｑｘｆｏｒｄ、　１９８２年）　、　５ＫＯ−００７（
Ｏｌｓｓｏｎ、Ｌ、　及びＫａｐｌａｎ、Ｈ，Ｓ、　、
　ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ　、　　ＵＳ
Ａ＋７７巻、５４２７−５４３）頁、１９８０年）、０
Ｍ４６７２　（Ｃｒｏｃｅ、Ｃ，Ａ、ら、Ｎａｔｕｒｅ
、　　２８８巻、４８８−４８９頁、１９８０年）及び
ＵＣ７２９−６（Ｇｌａｓｓｙ。

Ｍ、ｃ、ら、ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、、Ｓｃｉ
、　ＵＳＡ、　８０巻。

６３２７−６３３）頁、１９８３年）の親細胞株の融合
効率は、高いものでも１０リンパ節リンパ球当たり１つ
のハイプリドーマを与える程度である。末梢血リンパ球
を用いた場合には、融合効率は更に低くなる。一方、マ
ウス−マウスハイブリドーマにおいては、例えば、Ｐ３
−ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１　（Ｋδ旧ｅｒ、Ｇ、及びＭ
ｉｌｓｔｅｉｎ、Ｃ，、Ｅｔｂｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ
、。

−！− ６巻、５１１−５１６頁、１９７６年）及びＰ３−Ｘ６
３−Ａｇ　８−Ｕｌ　（Ｙｅｌｔｏｎ、Ｄ、Ｅ、　　ら
、Ｃｔｂｒｒ、Ｔｏｐ、　ＭｉｃｒｏｂｉｏＬ、Ｉｍｍ
ｔＬｎｏｌ、　、　８１巻、１−１３頁、１９７８年）
は１０マウスリンパ球当たり数個のハイプリドーマを与
える。従って、ヒト−ヒトハイブリドーマは、マウス−
マウスハイブリドーマに比べ、その出現率は／□０以下
である。更に、ヒト−ヒトハイブリドーマの場合には染
色体が不安定であり、次第に有用物質を産生じなくなる
場合が多くみられる。また、ヒト型親細胞株は、はとん
どが抗体産生性細胞株であることから、特にモノクロー
ナル抗体産生性ハイプリドーマの作製には不利であった
。

ヒト−ヒトハイブリドーマを生体外で培養し、ヒト型モ
ノクローナル抗体を産生ずる場合には、培地として無血
清培地を用いる。それは牛胎児血清（以下ＦＣ８という
）等の血清培地を用いた場合には、抗体の精製が困難と
なるからである。更に、血清は高価であること、ロット
差が大きいこと等の不利な点を持っている。また、生体
外で免＝　乙− 疫を施したリンパ球からハイプリドーマを作製する場合
には、芽球化したリンパ球が血清添加のノ・イブリドー
マ選択培地では死滅せず、ハイプリドーマの出現率が低
下することがあるが、無血清培地を用いた場合には芽球
化したリンパ球が死滅し、ハイプリドーマのみを選択で
きる。従って、無血清培地で増殖が可能であり、高い融
合効率でヒト−ヒトハイブリドーマを与える抗体非産生
型の親細胞株が待望されていた。

また、ハイプリドーマは遺伝子を放出したり、性質が変
化する場合がある。従って、ハイプリドーマヲクローニ
ングすることにより、目的とするハイプリドーマを選択
する必要がある。

従来の親細胞株から得たハイプリドーマはフィーダー細
胞を用いなくてはクローニングを行うことができない。

しかし、フィーダー細胞を用いる方法は繁雑であり、培
地交換を頻繁に行わなくてはならない。そこでフ（−ダ
ー細胞を用いずにクローニングが可能なハイプリドーマ
を与える増殖能の優れた親細胞株が必要となった。

この発明は、このような問題点を解決しようとして行わ
れたものである。

問題点を解決するための手段 本発明に係る新規な親細胞株は、リンパ芽球細胞株（Ｗ
ＩＬ２−ＮＳ）の突然変異細胞で、１（ＧＰＲＴ欠損株
である。この親細胞株はＨＯ−３２３（Ｏｈａｓｈｉ＋
Ｈ，ら、　Ｃｅ１ｌ　　Ｂｉｏｌ、Ｉｎｔｅｒｎ、Ｒｅ
ｐｏｒｔｓ、１９巻、７７−８３頁、１９８６年）を更
に種々の処理をし、融合効率を上げた抗体非産生性ａ胞
株でありＨＯ−３２３−ＭＯ７（以下）（０ＭＯ７とい
う）と命名した。

このｌ−１１−１Ｏを工業技術院微生物工業技術研究所
に寄託する手続きを行ったが、その受託を拒否されてい
る（通知書の通知番号６２微寄文第５４号）。

本発明に用いたＷＩＬ２−ＮＳ＋＋４Ｂ胞はヒト　Ｂ　
リンパ芽球訓胞株であり、広く入手可能な細胞である。

例えば大日本製薬から入手できる。

本発明において親細胞株の選択は以下に示すように行っ
た。

ハイプリドーマは、１個の細胞からでも増殖可能でなく
てはならない。このような増殖能が優れたハイプリドー
マを得るためには、親細胞株も増殖能の高い且つ強い細
胞株が必要であると考えられる。

このような親細胞株を得るため、１ウ工ル中１個の細胞
から増殖可能な細胞を選択する、軟寒天で増殖可能な細
胞を選択する、無血清培地で増殖してくる細胞を選択す
る、大量の死細胞の混入した培地でも増殖可能な細胞を
選択する等を行う。

これらの選択に先たち、紫外線照射、薬剤処理等により
細胞に突然変異を起こさせた。

符に、モノクローナル抗体産生性ハイプリドーマを作製
する場合の親細胞株は抗体非産生型の細胞が望ましい。

そこで上記の種々の処理を行った細胞から、更に抗体非
産生性の細胞を選択する。

ＨＧＰＲＴ欠損株を得るため、３０．ａｆ／％ｌの濃度
の６−チオグアニン又は１００μｆ／ｍｌ　　の８−ア
ザグアニン添加培地で増殖可能な細胞を選択する。

融合効率の高い親細１抱株を得るため、実際にヒトリン
パ球との融合を行い、融合効率の高い株を一ター 選択する。

これらの選択の個々の条件及びこれら選択操作の回数、
順序等を、所望の細胞株が得られるように適宜変化させ
ることにより、融合効率が高く、抗体非産生性で、無血
清培養可能な、増殖力の強い融合細胞作製用親細胞株が
得られる。

このようにして得られるヒト型親細胞株ＨＯＭＯ７は新
規の細胞株であり、水代培養でき、また永久的に凍結保
存可能である。

本発明の親細胞株１（０ＭＯ７の培養は、無血清培地及
び血清培地で行い得る。無血清培地としては、例えば１
０　ｐ９／ｍｌインシーリン、３５　ｐｙ／ｍｌ　ト７
ンスフェリン、１０μＭエタノールアミン及び２゜’ｆ
、ｎＭセレニウム添加基礎培地（以下ＩＴＥ８培地とい
う、Ｍｕｒａｋａｍｉ　、Ｈ，ら、ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
５Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　、　　７９巻、１．
１５８−１１６２頁、１９８２年）に５μグ／−１卯黄
リポタンパク質（特開昭６１−４７１８３号）又は１ｍ
グ／−１ヒト血清アルブミンを加えた培地を用いる。血
清培地としては、例えば１０％ＦＣ８添加基礎培地を用
いる。基礎培地ｉｏ− としては、例えばＭＥＭダルベツコ培地、ハムＦ−１２
培地、ＤＦ培地（ＭＥＭダルベツコ培地及びハムＦ−１
２培地を１：１で混合した培地）、ＲＤＦ培地（ＤＦ培
地及びＲＰＭ１１６４０培地を１：１で混合した培地）
等が例示できる。

ＨＯＭＯ７０通常の培養には、上記各種培地に３０μ９
／−１の６−チオグアニンを添加したものを用いること
が好ましい。培養条件は通常の動物細胞培養を行う条件
でよい。一般には３７°Ｃの５％ＣＯ２インキ−ベータ
ー内で培養を行う。２−４日ごとに培地交換を行うこと
により、細胞全良好に増殖させることができる。

本発明のＨＯＭＯ７はヒトＢ及び１９７７球との細胞融
合用親細胞として利用できる。細胞融合において利用で
きるヒトＢ及び１９７７球には特に制限はなく、例えば
リンパ節、末梢血、扁桃腺、牌臓等に由来するリンパ球
を例示できる。これらリンパ球は通常用いられる各種の
分離手段により単離され、本発明の親細胞との融合に供
し得る。

本発明の）１０Ｍ０７　と上記ヒトリンパ球との融合反
応は、基本的には公知の細胞融合方法と同様であり、融
合促進剤の存在下において適当な培地中で行われる。融
合促進剤としては、例えばＰＥＧが有利に用い得る。Ｐ
ＥＧとしては、平均分子量１０００−４０００程度のも
のが好ましく、培地中に３０−５０％（Ｗ／Ｖ）の磯度
で添加されるのが適当である。また、培地としては、Ｈ
ＯＭＯ７の培養に用いられる基礎培地、ＭＥＭダルベツ
コ培地、ハムＦ−１２培地、Ｄ　Ｆ培地、ＲＤＦ’培地
等の各種培地を利用できる。また、上記細胞融合用培地
には融合効率金高めるための補助剤として例えばジメチ
ルスルホキシド等を添加してもよい。

細胞融合に用いるＨＯＭＯ７とヒトリンパ球との細胞数
の比は、通常１−１１−１Ｏに対し１−５倍のリンパ球
を用いるが、２倍程度が望ましい。

細ｌｌ１８２融合は例えば次のように行う。ｌ−１０Ｍ
Ｏ７とリンパ球とを基礎培地中で混合し、遠沈する。

得られた細胞ペレットに、３７°Ｃに加温したＰＥＧ溶
液を添加する。添加終了後、基礎培地を少しずつ加えＰ
　ＨＧ　ｒｔＥｋ　Ｋ　ｋ下ける。これを遠沈し、得ら
れた細胞ペレットにハイプリドーマ選別用培地を加え、
ハイプリドーマの分離を行う。選別用培地は、親細胞は
死滅しハイブリドーマのみが増殖し得る培地であり、通
常ＨＡＴ（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン
）培地を例示できる。

なお、リンパ球は生体外では長時間生存することも、増
殖することもできない。親細胞株）１０ＭＯ７は）ＩＧ
ＰＲＴ欠損株、すなわち核酸合成のサルベージ回路欠損
株であるため、ＨＡＴ培地中のアミノプテリンにより核
酸の主合成回路が阻害された場合には生育できない。そ
のＨＡＴ培地としては、１００μＭヒポキサンチン、０
．４μＭアミノプテリン及び１６μＭチミジンを添加し
た無血清培地又は血清培地が用いられる。無血清培地と
しては」二記の培地のほか市販のＧＩＴＩＩＩ光純薬工
業株式会社）、ＨＢ　１０４　（Ｈａｎａ　Ｂｉｏｌｏ
ｇｉｅｓ　Ｉｎｃ、）等を用いることもできる。血清培
地としては１５−２０％　ＦＣ８添加培地を例示できる
。ＨＡＴ培地での細胞の培養は、ハイプリドーマ以外の
細胞が死滅するのに十分な、２−４週間程度行われる。

−／３一 本発明の親細胞株ＨＯＭＯ７は無血清培地で増殖可能な
細胞であるため、そのハイブリドーマも無血清培地で増
殖できる。従って、ＨＡＴ培地によるハイブリドーマの
選択は、通常用いられている血清培地のほか無血清培地
でも行い得る。ＨＡＴ添加無血清培地を用いることによ
るハイブリドーマの選択の利点を以下に列挙する。

（ａ）　　ハイブリドーマの出現率が数倍上昇する。

（ｂ）　　親細胞株ＨＯＭＯ７の死滅が早期に起こる。

（Ｃ）　　リンパ球の死滅が早期に起こる。

（ｄ）　　生体外で免疫し芽球化したリンパ球を用いた
場合でもリンパ球が早期に死滅する。

（ｅ）　　コストが安い。

ＨＡＴ培地により選択されたハイブリドーマは、ヒポキ
サンチン及びチミジン添加培地で１週間程度培養した後
、上記無血清又は血清培地で培養する。本発明のＨＯＭ
Ｏ７全用いたヒト−ヒトハイブリドーマは染色体の脱落
がほとんど起こらず、安定なハイブリドーマを与える。

このような方法により融合を行い、その融合効−／≠− 率の測定を行った。本発明のＨＯＭＯ７と、ヒトリンパ
球との融合により作製されたハイプリドーマは２−４週
間後には肉眼で観察できる程度の大きなコロニーを形成
する。一方、親細胞株ＨＯＭ０７及びリンパ球は１週間
以内に死滅する。ハイプリドーマの出現頻度は、Ｂリン
パ球１０６個当たり１０個以上であり、上記のＬＩＣＲ
−ＬＯＮ−ＨＭ、２．５ＫＯ−００７，０Ｍ４６７２、
ＵＣ７２９−６又は発明者らが既に公表しているＮＡＴ
−３０（特開昭６０−１４１２８５号、　　Ｍｕｒａｋ
ａｍｉ、Ｈ，ら、Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｃｅ１ｌ、　Ｄｅ
ｖｅｌｏｐ、Ｂｉａｓ、　、　２１巻、５９３−５９６
頁、１９８５年）より数倍以上高く、また、ＨＯ−３２
３より３倍程度高い。これはマウス−マウスハイプリド
ーマの出現頻度に匹敵する高い頻度である。また、１９
７２球を用いた場合でも同程度の出現頻度が得られ、Ｈ
ＯＭＯ７は非常に優れた親細胞株であるといえる。更に
、リンパ球として、従来融合効率の低いと言われていた
末梢血由来リンパ球を用いた場合にも、同程度の高い融
合効率が得られた。従って、本発明の）１０ＭＯ７は、
ハイプリドーマ作製用親細胞株として従来のものより非
常に優れた細胞株であるといえる。更に、ＨＯＭＯ７は
ＨＯ−３２３等と違い抗体非産生性親細胞株である。ま
た、ＨＯＭＯ７から得たハイプリドーマは、フィーダー
細胞を用いなくても、クローニングを行うことができる
。

ＨＡＴ培地において生育する細胞は、ＨＯＭ０７とヒト
リンパ球とのハイプリドーマができたことを示している
。このほかハイプリドーマが作製されたことを示す事項
としては、ハイプリドーマはＨＯＭＯ７より明らかに染
色体数が増加していたこと、ＨＯＭＯ７は抗体非産生性
細胞株であるがＢリンパ球とのハイプリドーマは抗体を
産生じていたこと、ＨＯＭＯ７はＥ（ヒツジ赤血球とロ
ゼツトを形成しない）であるが’ｌ’　リンパ球とのハ
イプリドーマはＥ＋（ヒツジ赤血球とロゼツトを形成す
る）であったこと等が挙げられる。ＨＯＭ０７の染色体
数は４６−１であるのに対し、ハイプリドーマの染色体
数は８８−５．９２−８．５４±３．６８６等であり、
明らかに増加していた。Ｂリンパ球由来のハイプリドー
マは９０％以上の確率で抗体を産生じた。また、Ｔリン
パ球由来のハイプリドーマは７０％以上の確率でＥ＋で
あった。以上のことから、リンパ球からハイプリドーマ
が作製されていることは明らかであり、本発明のＨＯＭ
Ｏ７が優れた親細胞株であるといえる。

本発明のＨＯＭＯ７は、上記のように無血清培地で良好
に増殖し、そのハイプリドーマも同様の無血清培地で良
好に増殖した。また、抗体等の有用物質産生も無血清培
地と血清培地との間で差異が認められなかった。更に、
無血清培地によりハイプリドーマの大葉培養が可能なこ
とから、ＨＯＭＯ７を親細胞として用いれば、従来のよ
うに血清培養した培地から有用物質を精製するのに比べ
、非常に容易に且つ安価に有用物質をｓ製することが可
能である。

例えば抗原特異的モノクローナル抗体（ＩｇＭクラス）
産生性とトーヒトハイプリドーマを無血清培地である卵
黄リポタンパク質添加ＩＴＥＳ培地で培養した場合の培
養上清中の抗体の純度は約１０％と高純度であり、血清
培地である１０％ＦＣ８添加培地を用いた場合の１００
倍以上の純度を示した。ＩｇＭクラスのモノクローナル
抗体の無血清培養上清からの精製は、ノ・イドロキシア
ノ（タイト及びアガロースＡ−１５ｍの２つのカラムク
ロマトグラフィーの簡単な操作のみで行い得る。その純
度は９５％以上である。一方、血清培地を用いた場合に
は、この２つの操作で１０％以下の純度である。これら
のことから無血清培地で増殖するヒト−ヒトハイブリド
ーマを作製することが、いかに重要であるか明らかであ
り、本発明のｌ−１０ＭＯ７は有用物質産生性ヒト−ヒ
ト／・イブリドーマ作製用親細胞株として優れた株であ
るということができる。

従来のほとんどの親細胞株は抗体産生性であるため、ハ
イプリドーマが産生ずる抗体はＢリンパ球由来の抗体と
親細胞株由来の抗体との複雑な混合状態の抗体となる。

従って、その特異性も複雑であり、目的とする抗原特異
的モノクローナル抗ｉｒ− 体を得ることが難しい。本発明の親細胞株ＨＯＭ０７は
抗体非産生性の細胞であるから、ヒトＢリンパ球との融
合を行った場合のヒト−ヒトハイブリドーマが産生ずる
抗体は、Ｂリンパ球に由来する抗体であると考えられる
。従って、ＨＯＭＯ７を用いることにより特異性の明ら
かな、目的とする抗原特異的モノクローナル抗体を容易
に得ることができる。

本発明のＨＯＭＯ７は高い融合効率を示す。任意の抗原
に対して生体外で免疫したＢリンパ球を融合に用いるこ
とによシ、任意の抗原に対するヒト型モノクローナル抗
体産生性ヒト−ヒトハイブリドーマが得られる状態にあ
る。

本発明のＨＯＭＯ７とヒトＴリンパ球と全融合し作製し
たヒト−ヒトハイブリドーマの一部のクローンは、リン
パ球細胞株を増殖させる因子を産生じていることが明ら
かとなった。また、１９７７球はリンフ才力イン、イン
ターフェロン等の種々の有用物質を産生じている。従っ
て、ＨＯＭＯ７を用い１９２７球由来のヒトーヒトノ・
イブリド−マを、高率に作製することにより、１９２７
球由来の種々の有用物質の産生が可能になる。

発明の効果 本発明者らは、以下の特徴を持つ親細胞株ＨＯＭＯ７を
作製することができた。

（ａ）　　抗体非産生性親、１４１１Ｉ胞株である。

（ｂ）Ｂリンパ球との融合効率が高い。

（Ｃ）Ｔ１７７７球との融合効率が高い。

（ｄ）　　無血清培地で培養可能なハイプリドーマが得
られる。

（ｅ）　　クローニング効率が高いハイブリドーマが得
られる。

これらハイブリドーマにより産生された有用物質を用い
ることにより、健康の維持、病気の予防、診断、治療が
できるようになる可能性が高い。

次に実施例により本発明を更に詳細に説明する。

実施例１　ヒト−ヒトハイブリドーマ作製用親細胞株Ｈ
ＯＭＯ７の作製 まずヒトＢリンパ芽球細胞株ＷＩＬ２−ＮＳ　　（大日
本製薬）を１０μ９／−１インシーリン、２５μ７／毒
ｌラクトフエリン、１０μＭエタノールアミン及び２．
５ｎＭセレニウム添加ＲＤＦ培地で２週間培養した。増
殖してきた細胞’！−０，２４％軟寒天添加１０％ＦＣ
８培地でクローニングし、抗体非分泌性クローンを選択
した。更に、３０μグ／ｎｌ　６−チオグアニン添加１
０％ＦＣ８培地で培養し、６−チオグアニン耐性株１０
株を得た。このうち、アミノプテリン感受性、融合効率
及び増殖速度の最も高い株がＨＯ−３２３である。しか
し、ＨＯ−３２３はリンパ球との融合を高率で行い得る
が、増殖せず死滅する場合が多い。そこで、ハイブリド
ーマの出現率を更に上昇させるために、増殖能の高い細
胞株を作製した。まず、ＨＯ−３２３に０゜５−２秒間
クリーンベンチ内の紫外線ランプを用い紫外線照射した
後、増殖してきた細胞を上記軟寒天法によりクローニン
グした。増殖速度の速いクローン２０株を無血清培地で
ある卵黄リポタンパク質（５μ７／毒ｌり添加Ｉ　’Ｉ
”　Ｅ　８培地（以下ＹＬＰ／ＩＴＥＳ培地という）で
徐々にスケールアンプしつつ培養し、１０個程朋の細側
會得た。それ−一ノー ぞれのクローンについて３Ｘ１０　個の細胞を残し、そ
の他の細胞を上記無血清培地１５ｍ１！に浮遊させ、−
５°Ｃで凍結、室温で融解するという凍結・融解を数回
繰り返し細胞を死滅させた。この死滅細胞を含む培地５
　ｆｉｇを３枚ずつの５ｃｍデイッシーに移し、上記の
残しておいた細胞をそれぞれ１ｘｉｏ’間ずつまき込ん
だ。これを４日間培養することにより、死滅した細胞中
でも増殖可能な細胞を選択した。増殖した細′Ｊ＠を軟
寒天法によりクローニングし、増殖速度の速いクローン
を９６株ずつ９６ウエルプレートにまき込み、無血清培
地で１週間培養した。これらの細胞に３０μ！／ｍｌ　
６−チオグアニン添加無血清培地を加え、培養し、６−
チオグアニン耐性株を得た。これらの耐性株のうち、増
殖速度が速い８２株について抗体の非産生性を調べた。

ｉ＠養上清中の抗体量の測定は酵素抗体法により行い、
１１ａ胞中の抗体の測定は間接螢光抗体法により行った
。その結果、すべてのクローンについて培養上清中の抗
体は検出されなかった。また、細胞中の抗体についても
検出されないクロー７３株を得た。これら３株を用いヒ
ト−ヒトハイブリドーマを作製し、最も高い融合効率を
示した株を８０ＭＯ７と命名した。

この株は３０μ９／−１の６−チオグアニンを添加した
無血清培地及び血清培地で強い増殖能を有し、それらの
培地で継代培養により維持できる（第１図）。

また、２０％ＦＣ８及び５−１０％ジメチルスルホキシ
ド添加ＲＤＦ培地中で液体窒素により凍結保存すること
ができ、半永久的に保存できる。

実施例２　　ＨＯＭＯ７細胞とヒトリンパ節リンパ球と
の細胞融合 ８０ＭＯ７を用いて細胞融合を行った。ＨＯＭ０７は融
合１週間前から６−チオグアニンを添加していない上記
無血清培地又は血清培地で培養し、毎日又は１日おきに
培地交換を行い「生きがよい」状態とした。

ヒトリンパ球は肺がん患者から摘出したリンパ節をＲＤ
Ｆ培地中で細切し、それらを２枚のスライドガラスの間
で押しつぶすことにより得た。これをプラスチックディ
ツシュ中で１時間、３７Ｃの５％ＣＯ□インキーベータ
ーで培養し、ディツシュに接着したマクロファージを除
去した。

ＲＤＦ培地で２回洗浄したＨＯＭ０７１×１０７個及び
リンパ球２Ｘ１０　個を用いて細胞融合を行った。まず
、これらの細胞を５０　ｍｌ！の遠心管に移し、混合し
、１２００ｒｐｍで７分間遠心した。

得られた細胞ペレットをほぐした後、これに３７゜Ｃの
５０％ＰＥＧ（平均分子量４０００）ｌｆｉｆを１分間
かけて添加した。更に１分間３７°Ｃでゆるやかに振盪
した後、３７°ＣのＲＤＦ培地を４分間かけて９　ｍｌ
　添加した。次いで１５００ｒｐｍで７分間遠心し、細
胞ペレットを得た。得られた細胞ペレットをＹＬＰ／Ｉ
ＴＥＳ培地で懸濁し、９６ウ工ルプレート１０枚に１ウ
エル轟たりリンパ球２×１０　個ずつまき込み、３７°
Ｃの７％０２７８８％空気１５％Ｃ０２インキネベータ
ーで培養した。翌日、２倍濃度の）ＩＡＴ　（２００μ
Ｍヒポキサンチン、０．８μＭアミノプテリン及び３２
μＭチミジン）添加ＹＬＰ／Ｉ’Ｉ’ｌ：：Ｓ培地を前
日と同量各ウェルに添加した。以後、３日ごとに半分の
培地を新しいＨＡＴ添加培地と交換し、４週間培養を行
った。

第１表は種々の親細胞株と、上記のようにして得た同一
のヒトリンパ球とを融合した場合の、ハイプリドーマの
出現頻度を示す。ＨＯＭＯ７’！−用いた場合の出現頻
度は１０６　リンパ球当たり１０個以上であり、他のヒ
ト親細胞株より数倍以上高く、マウス親細胞株を用いた
場合に匹敵した。

第１表　ハイプリドーマの出現頻度 ヒト　８０ＭＯ７９４６３４２１７，１ＬＩＣＲ−Ｌｏ
ｎ−ＨＭｙ２　９５１　　　　？　　　　０，４ＮＡＴ
−３０９６０４６２，３ ＨＯ−３２３９６０１３２６，６ マウス　Ｘ６３，６，５．３　　　　’１６０　　　２
４１　　　　　１２．ｌＮＳ−１　　　　　　　　　　
９５６　　　　　１２　　　　　　　０．６２５一 実施例３　　ＨＯＭＯ７細胞とヒトＢ及び１９７７球と
の細胞融合 ヒトリンパ球として末梢血リンパ球を用いハイプリドー
マを作製した。第２表から明らかなように、末梢血リン
パ球を用いた場合でもハイプリドーマの出現率は１０　
リンパ球当たり１０個以上であり、リンパ節リンパ球を
用いた場合（実施例２参照）と同程にであった。従来の
親細胞株では、末梢血リンパ球を用いた場合には、リン
パ節リンパ球を用いた場合の１／１ｏ程度の出現率であ
ることから、８０ＭＯ７は優れた親細胞株であると考え
られる。

また、末梢血ｆ　Ｐｅｒｃｏｌ　１　（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ　）　　勾配により、Ｂ及びＴ　１７７７球に分離
した。これらを用いハイプリドーマを作製した。第２表
に示したように、Ｂ及びＴ　１７７７球はいずれも高い
出現率を示した。従って、ｆ（０ＭＯ７はＢ及びＴ　１
７７７球由来のヒト−ヒトハイブリドーマを高い融合効
率で作製可能とする親細胞株であると考えられる。

−λｔ− 第２表　末梢血リンパ球由来のヒトーヒトノ・イブリド
ーマの出現頻度 末梢血リンパ球　１　　９５１　　　　　２１１　　　
　　　　１０．６２　　　９５５　　　　　２２３　　
　　　　　１１．２Ｂリンパ球　１　　９４５　　　　
２３２　　　　　１１，６２　　　９５８　　　　　２
１５　　　　　　　１０．８Ｔリンパ球　１　　９３０
　　　　２５３　　　　　１２，７２　　　９５２　　
　　　２１２　　　　　　　１０．６実施例４　抗体産
生性ヒト−ヒトハイブリドーマ実施例２と同様の方法で
肺がん患者由来のハイプリドーマを作製した。得られた
ハイプリドーマを無血清培地ＹＬＰ／ＩＴＥ８培地で培
養し、培養上清中の抗体量を通常の酵素抗体法により測
定した。その結果、ハイプリドーマの約４０％が抗体を
産生じた（第３表）。抗体のクラスはＩｇＭが最も多（
、ＩｇＧｌｌｇＡの順であった。

また、これらの抗体の肺がん細胞株ＰＣ−８に対する反
応性を酵素抗体法により調べたところ、抗体産生性ハイ
プリドーマの約３％がＰＣ−８，！：反応性をもつ抗体
を産生した。

第３表　ヒト−ヒトハイブリドーマの抗体産生能 （個）　　　　（ｆｌＩＩｔ）　　　ＩｇＡ　　ＩｇＧ
　ＩｇＭ　　計　　　（個）実施例３の方法で１９７７
球由来のノ・イブリドーマを作製した。得られた・・イ
ブリドーマをＹＬＰ　／　Ｉ　Ｔ　Ｅ　８培地で培養し
、培養上清のリンパ球細胞株ＣＥＭに対する増殖促進活
性を調べた（第４表）。その結果、約１０％が増殖促進
活性を示した。

また、・・イブリドーマの７０％以上がＥ　＋　＜ヒツ
ジ赤血球とロゼツトを形成する）であることから、１９
７７球由来のハイプリドーマであることが明らかとなっ
た。

第４表　ヒト−ヒトハイブリドーマ培養上清の増殖促進
活性 実施例６　生体外で免疫したリンパ球由来のヒト−ヒト
ハイブリドーマ 末梢血リンパ球を肺がん細胞株ＰＣ−８でＰ。

ｋｅｗｅｅｄ　Ｍｉｔｏｇｅｎ　　（以下ＰＷＭという
）（Ｇｉｂｃｏ　Ｌａｂ、）存在下、４日間処理するこ
とにより免疫した。ＰＣ−８は３０秒間紫外線照射する
ことにより死滅させた細胞を用いた。免疫したリンパ球
音ＨＵＭＯ７と融合し、ハイプリドーマを作製−コター した。

ＨＡＴ添加培地として無血清培地（ＹＬＰ／ＩＴＥＳ培
地）及び血清培地（１０％ＦＣ８添加培地）を用いた。

第５表から明らかなように、血清培地を用いた場合には
ハイプリドーマの出現率は低かった。しかし、無血清培
地を用いた場合には高いハイプリドーマの出現率が得ら
れた。これはＰＷＭ処理によりリンパ球が芽球化したた
め、血清培地を用いた場合にはリンパ球が容易に死滅せ
ず、栄養成分を多量に消費したことによると考えられる
。

第５表　免疫したリンパ球を用いた場合のヒト−ヒトハ
イブリドーマの出現率 無血清培地１　４８０　　　　１２５　　　　　　　１
３血清培地１　４８０　　　３２　　　　　３実施例７
　ヒト−ヒトハイブリドーマの無血清培養 実施例１−６で得られたヒト−ヒト・・イブリドーマの
無血清培養を行った。ここで得られたほとんどすべての
ハイプリドーマの無血清培養が可能であった。その１例
を第６表に示した。無血清培地としてはＹＬＰ／ＩＴ］
］８培地、ヒト血清アルブミン添加ＩＴＨ８培地（Ｈ８
Ａ／ＩＴＥ８　）及びＧＩＴ（和光純薬工業株式会社）
を用いた。血清培地としてはｌＯ％ＦＣ８添加培地を用
いた。

第６表から明らかなように、これら無血清培地で良好に
増殖した。特にＹＬＰ／ＩＴＥＳ培地で扁い増殖性を示
した。

（以下余白） 第６表　ヒトーヒトノ・イブリドーマの無血清培養゛） ＨＬ−１７，２６，６６，３）３，３ ５５，７５，８５，１７，６ ８６，３６，２５，４７，７ ２２７，９７，４６，７８，６ ＨＬ−１０９７，８７，７６，３８，４１２７５，２５
，６５，１６，４ １８３６，１６，２５，８７，２ １）１０５個／＠ｔの細胞密度でまき込み、３日間培養
した後細胞密度を測定した。

実施例８　ヒト−ヒトハイブリドーマのクローニング効
率 ＹＬＰ／ＩＴＥ８培地中でフィーダーａ胞を用いること
なく、９６ウエルプレートにより、ＨＯ−３２３及びＲ
ＯＭ０７由来のハイプリドーマのクローニングを行った
。第７表から明らかなようにＲＯＭ０７由来のハイプリ
ドーマは１４０−３２３由来のハイブリドーマより高率
でクローニングが行い得た。これは実施例１に示したよ
うな種々の処理により、ＨＯＭＯ７の増殖能が高くなっ
たためと考えられる。

第７表　ヒト−ヒトハイブリドーマのクローニング効率 ＨＯＭＯ７ＨＬ−１１９６１５８ ＭＬ−１０９１９６１７３ ＨＯ−３２３３Ｌ−５１９６８１ ７Ｌ−４１９６６２ １）１つのフェル当たυ１個の細胞をまき込み、３週間
後に、細胞が増殖してきたつ、ル数を測定した。

【図面の簡単な説明】

第１図は無血清培地（ＹＬＰ／ＩＴＥＳ培地）及び血清
培地（１０％ＦＣ８添加培地）でＨＯＭＯ７細胞を培養
した時の増殖曲線である。 △：無血清培地 ム：血清培地 一３≠−

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒトリンパ芽球細胞株（ＷＩＬ＿２−ＮＳ）のヒ
   ポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェ
   ラーゼ欠損突然変異株であることを特徴とするヒト−ヒ
   トハイブリドーマ作製用親細胞株。
2. （２）抗体を産生しないことを特徴とする特許請求の範
   囲第１項に記載の親細胞株。
3. （３）無血清培地で増殖し得ることを特徴とする特許請
   求の範囲第１項又は第２項に記載の親細胞株。
4. （４）抗体産生細胞（ヒトＢリンパ球）又はヒトＴリン
   パ球を用いた場合、高い融合効率を与えることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項乃至第３項のいずれかに記載
   の親細胞株。
5. （５）抗体産生細胞として、ヒト末梢血から得たＢリン
   パ球を用いた場合にも、高い融合効率を与えることを特
   徴とする特許請求の範囲第１項乃至第３項のいずれかに
   記載の親細胞株。
6. （６）生体外で免疫したヒトＢリンパ球を用いた場合に
   も、高い融合効率を与えることを特徴とする特許請求の
   範囲第１項乃至第３項のいずれかに記載の親細胞株。
7. （７）ヒト末梢血から得たＴリンパ球を用いた場合にも
   、高い融合効率を与えることを特徴とする特許請求の範
   囲第１項乃至第３項のいずれかに記載の親細胞株。
8. （８）ヒト−ヒトハイブリドーマのＨＡＴ培地による選
   択を、無血清培地を用いて行うことを特徴とする特許請
   求の範囲第１項乃至第７項のいずれかに記載の親細胞株
   。
9. （９）ヒト−ヒトハイブリドーマのクローニングを、フ
   ィーダー細胞を用いずに行うことを特徴とする特許請求
   の範囲第１項乃至第８項のいずれかに記載の親細胞株。