CN114085275A

CN114085275A - 一种mate家族基因及其编码蛋白在增强植物百草枯抗性的应用

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Publication number: CN114085275A
Application number: CN202010755769.XA
Authority: CN
Inventors: 向成斌; 夏金球
Original assignee: University of Science and Technology of China USTC
Current assignee: University of Science and Technology of China USTC
Priority date: 2020-07-31
Filing date: 2020-07-31
Publication date: 2022-02-25

Abstract

本发明涉及一种与百草枯抗性相关基因及编码蛋白AT2G04100/AtDTX6的应用。实验表明，本发明涉及的AtDTX6基因为MATE基因家族(Multidrug and Toxic Compound Extrusion Family)成员，其编码一类外排型转运蛋白，该蛋白的高表达能显著提高植物对百草枯的抗性；另外，该蛋白质氨基酸序列第311位由甘氨酸到谷氨酸(G331E)的突变能够显著增强其功能，显著提高拟南芥对百草枯的抗性。通过基因序列比对分析发现，在水稻、玉米、棉花、西红柿、葡萄等多个作物都存在其同源基因，可考虑通过转基因技术和基因编辑技术，提高不同作物对百草枯抗性，可以为培育抗百草枯作物新品种提供新思路和理论依据。

Description

一种MATE家族基因及其编码蛋白在增强植物百草枯抗性的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一类MATE外排型转运蛋白家族基因及编码蛋白在增强植物对百草枯抗性相关方面的应用。

背景技术

拟南芥(Arabidopsis thaliana)，双子叶植物纲、十字花科植物，主要分布在欧、亚及北美洲等地区。拟南芥因其基因组小、生长周期短、结实高及易人工培养等特点，被作为一种模式植物，广泛用于植物科学领域研究。通过对该模式植物的研究，可为培育其他作物优良性状提供理论依据。

百草枯(paraquat，缩写PQ)，又名甲基紫晶(methyl viologen，MV)，一种良好的广谱触杀型非选择性除草剂。百草枯能够快速有效的杀灭数百种杂草，遇土壤易快速钝化、无残留，其主要通过破坏光合电子传递链，产生超氧自由基中断光合作用、破坏叶绿素合成，快速杀灭植物，在农业生产上作为一种良好的除草剂而广泛应用。

目前，尽管已经有一些关于植物百草枯耐受相关报道，但其作用机制仍然不是很清楚。我们通过甲基磺酸乙酯(Ethylmethylsulfone，简称EMS)诱变创制拟南芥突变体库，然后通过对百草枯耐受突变体的筛选，获得了百草枯耐受突变体pqt15-5，通过mutmap基因定位发现该基因为一个由单碱基突变导致一个氨基酸的改变，进而增强其基因编码蛋白外排百草枯的能力，提高植物百草枯抗性。此外，通过基因功能验证发现，高表达该基因同样能够增强植物对百草枯的抗性。因此，通过单碱基突变增强蛋白功能或者通过高/超表达该基因来提高植物抗逆性的方式，可以为培育植物耐逆作物新品种提供新思路。

发明内容

本发明目的在于找到一类MATE外排型转运蛋白家族基因及编码蛋白，该基因高/超表达能够显著提高拟南芥对百草枯抗性；另外，该基因其中一个位点发生替换突变最终也能增强植物对百草枯抗性。

本发明中所提及的除草剂百草枯抗性表型，主要表现为：

第一、在一定浓度百草枯处理条件下，种子萌发阶段相比对照组(野生型)具有更高的存活率；

第二、在苗期生长过程中喷洒一定浓度的百草枯，幼苗相比对照组具有更高的耐受能力，存活率更高。

具体而言，本发明通过下述技术方案实现了本发明的目的。

1.一种分离的蛋白质，其与如SEQ ID NO:2所示的拟南芥野生型MATE外排型转运蛋白相比具有在第311位的突变，优选311E突变，更优选G311E，或者与来自其他物种的野生型MATE外排型转运蛋白相比具有与第311位的突变，优选311E突变，更优选G311E相同或相应的突变，或者所述分离的蛋白质通过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸得到的蛋白质或者与所述分离的蛋白质具有至少80％同一性，优选至少85％、86％、87％、87％、88％、89％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的蛋白质，其中所述蛋白质在植物中表达或过表达时能够增强所述植物对除草剂百草枯的抗性。

2.如项目1所述的蛋白质，其包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或由其组成。

3.一种分离的核酸分子，其编码项目1-2任一项所述的蛋白质。

4.项目3所述的核酸分子，包含SEQ ID NO:3所示的核酸序列或由SEQ ID NO:3所示的核酸序列组成，或者在严谨条件下与SEQ ID NO:3所示的核酸序列的互补序列杂交或者与SEQ ID NO:3所示的核酸序列具有至少80％同一性，优选至少85％、86％、87％、87％、88％、89％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性。

5.一种重组构建体，其包含项目3-4任一项所述的核酸分子。

6.一种重组表达载体，其包含一个或多个项目3-4所述的核酸分子或项目5所述的重组构建体。

7.一种制备抗百草枯植物的方法，其包括在向植物或植物细胞中引入项目3-4所述的核酸分子、项目5所述的重组构建体或项目6所述的重组表达载体，并将所述植物细胞培养为植物。

8.一种制备抗百草枯植物的方法，其包括通过基因编辑技术向野生型植物或植物细胞中MATE外排型转运蛋白的编码核酸序列中引入一个或多个碱基替换，使其编码的蛋白质具有一个或多个氨基酸改变，培养所述植物或植物细胞并筛选出与野生型植物相比具有增强的百草枯抗性的植物。

9.项目3-4所述的核酸分子、项目5所述的重组构建体、项目6所述的重组表达载体在制备与野生型植物相比具有增强的百草枯抗性的植物中的应用。

10.项目1所述的蛋白质、项目7-8任一项所述的方法或项目9所述的应用，其中所述植物为双子叶或单子叶植物。

11.项目1所述的蛋白质、项目7-8任一项所述的方法或项目9所述的应用，其中所述植物为拟南芥、水稻、玉米、棉花、西红柿、葡萄、小麦或大豆。

附图说明

图1(A)拟南芥pqt15-5突变体百草枯耐受示意图；(B)检测pqt15-5突变体与Col-0回交F1代种子百草枯耐受示意图；(C)Mutmap重测序对pqt15-5突变体基因定位示意图；(D)AT2G04100/AtDTX6基因示意图及突变位点示意图。

图2AtDTX6/dtx6-D基因通过重组入pET28a载体在大肠杆菌rosetta菌株中异源表达，检测其百草枯耐受性示意图。

图3(A)AtDTX6基因敲除突变体株系KO-3和KO-8突变后基因序列示意图；(B)AtDTX6基因过表达株系OE-9、OE-13和OE-17表达量检测示意图。

图4(A)RT-PCR检测不同组织部位AtDTX6基因表达量示意图；(B)qRT-PCR检测不同组织部位AtDTX6基因表达量示意图。

图5(A)不同百草枯浓度处理条件下，AtDTX6基因敲除、过表达以及诱变突变体等各株系在种子萌发阶段百草枯耐受示意图；(B)不同百草枯浓度处理条件下，AtDTX6基因敲除、过表达以及诱变突变体等各株系在种子萌发阶段存活率统计示意图。

图6(A)土壤条件生长条件下，百草枯喷洒处理，AtDTX6基因敲除、过表达以及诱变突变体等各株系在种子萌发阶段百草枯耐受示意图；(B)土壤条件生长条件下，百草枯喷洒处理，AtDTX6基因敲除、过表达以及诱变突变体等各株系在种子萌发阶段百草枯耐受示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。

术语“野生型”、“对照”或“参照”可互换使用，并可以是未根据本发明所述方法进行修饰或处理的细胞或生物部分(例如细胞器，如叶绿体)或组织或生物，特别是植物。因此，用作野生型、对照或参照的细胞或生物部分(例如细胞器，如叶绿体)或组织或生物(特别是植物)尽可能地与该细胞、生物、植物或其部分一致，并且在除本发明方法之结果以外的任何其他方面均尽可能地与本发明的主题相同。因此，相同或尽可能相同地处理所述野生型、对照或参照，即，仅有不影响测试特性的品质的条件或特性可以不同。

本文中所用的术语“植物”指的是处于任何发育阶段的植物，以及可附着于或脱离整个完整植物的植物的任一部分或多个部分。此类植物部分包括但不限于植物的器官、组织和细胞。特定植物部分的例子包括茎、叶、根、花序、花、小花、果实、花梗、花序梗、雄蕊、花药、柱头、花柱、子房、花瓣、萼片、心皮、根尖、根冠、根毛、叶毛、种毛、花粉粒、小孢子、子叶、胚轴、上胚轴、木质部、韧皮部、薄壁组织、胚乳、伴细胞、保卫细胞、及任何其它已知的植物器官、组织、和细胞。此外，种子是植物这一点是公认的。

在本说明书中使用时，术语“包含”或“包括”应理解为指存在所述特征、整数、步骤或组分或其组，但不排除存在或添加一种或多种其他特征、整数、步骤、组分或其组。

除非另外指明，否则术语“多核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在本文中可互换使用。除非另外指明，否则术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用。术语“序列”可涉及多核苷酸、核酸、核酸分子、肽、多肽和蛋白质，这取决于使用术语“序列”的上下文。本文使用的术语“基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸分子”指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)聚合形式。该术语仅涉及分子的一级结构。

因此，本文使用的术语“基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸分子”包括双链或单链的DNA和/或RNA。它们还包括已知类型的修饰，例如甲基化、“加帽”、将一个或多个天然核苷酸替换为类似物。优选地，所述DNA或RNA序列包含编码本文所述多肽的编码序列。

“编码序列”是核苷酸序列，其转录成RNA，例如调节性RNA(例如miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、RNAi、核酶等)，或者转录成mRNA，其在置于适当调节序列控制下时翻译成多肽。编码序列的边界由5’端的翻译起始密码子和3’端的翻译终止密码子决定。三联体taa、tga和tag代表可互换的(常见)终止密码子。编码序列可包括但不仅限于mRNA、cDNA、重组核苷酸序列或基因组DNA，在某些情况下也可存在内含子。

本文使用的“核酸分子”还可包括位于编码基因区3’和5’末端的非翻译序列，例如编码区5’末端上游的至少500个、优选200个、特别优选100个核苷酸的序列，以及编码基因区3’末端下游至少100个、优选50个、特别优选20个核苷酸的序列。对于例如反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶等技术的情况，可以有利地使用编码区以及5’和/或3’区。

“同一性”：在比较两个或多个核酸或氨基酸分子使用时，“同一性”意指所述分子的序列共有某种程度的序列相似性，即所述序列是部分相同的。

为确定两个氨基酸序列或两个核酸分子的同一性(同源性在本文可互换地使用)百分数，将所述序列以一个序列在另一个序列下的方式书写以最佳比较(例如，可以将空位插入蛋白质的序列或核酸的序列，旨在与另一种蛋白质或另一种核酸产生最佳比对)。

随后在对应氨基酸位置或核苷酸位置处比较氨基酸残基或核酸分子。当一个序列中的位置由另一个序列中对应位置处的相同氨基酸残基或相同核酸分子占据时，则所述分子在这个位置处是同源的(即，如本上下文中所用的氨基酸或核酸“同源性”对应于氨基酸或核酸“同一性”。这两个序列之间的同一性百分数是所述序列共有的相同位置的数值的函数(即同源性百分数＝相同位置的数值/位置总数×100)。术语“同源性”和“同一性”因而视为同义词。

为确定两个或多个氨基酸序列或两个或多个核苷酸序列的同一性百分数，已经开发了几个计算机软件程序。两个或更多序列的同一性可以用例如软件fasta计算，其中软件fasta已经以fasta 3版本使用(W.R.Pearson和D.J.Lipman,PNAS 85,2444(1988)；W.R.Pearson,Methods in Enzymology 183,63(1990)；W.R.Pearson和D.J.Lipman,PNAS85,2444(1988)；W.R.Pearson,Enzymology 183,63(1990))。用于计算不同序列的同一性的另一种有用程序是标准blast程序，其中该程序包含于Biomax pedant软件(联邦德国慕尼黑Biomax)中。不幸地，该程序有时产生次优结果，因为blast不总是包含主题和查询对象的完整序列。然而，由于该程序非常高效，因而它可以用于庞大数目序列的比较。以下设置通常用于这样的序列比较：

-p程序名称[字符串]；-d数据库[字符串]；默认＝nr；-i查询文件[File In]；默认＝stdin；-e期望值(E)[Real]；默认＝10.0；-m比对浏览选项：0＝配对；1＝查询-比上区域(query-anchored)，显示同一性；2＝查询-比上区域，不显示同一性；3＝查询-比上区域的屏文形式，显示同一性；4＝查询-比上区域的屏文形式，不显示同一性；5＝查询-比上区域，不显示同一性和突然结束；6＝查询-比上区域的屏文形式，不显示同一性和突然结束；7＝XML Blast输出；8＝TAB格式输出；9带注释行的TAB格式输出[整数]；默认＝0；-o BLAST报告输出文件[File Out]任选；默认＝stdout；-F过滤软件查询序列(DUST用blastn，SEG用其他方法)[字符串]；默认＝T；-G空位开口成本(零激发默认行为)[整数]；默认＝0；-E开口延伸成本(零激发默认行为)[整数]；默认＝0；-X X空位比对的下降值(比特)(零激发默认行为)；blastn 30，megablast 20，tblastx 0，全部其他方法15[整数]；默认＝0；-I在定义行中显示GI’[T/F]；默认＝F；-q核苷酸错配罚分(仅blastn)[整数]；默认＝-3；-r核苷酸匹配回报(仅blastn)[整数]；默认＝1；-v显示对(V)的单-线描述的数据库序列数[整数]；默认＝500；-b显示对(B)的比对结果的数据库序列数[整数]；默认＝250；-f延伸命中的阈值，若为零，则默认；blastp11，blastn 0，blastx 12，tblastn 13；tblastx 13，megablast 0[整数]；默认＝0；-g执行空位比对(对tblastx不可用)[T/F]；默认＝T；-Q查询使用的遗传密码[整数]；默认＝1；-D DB遗传密码子(仅用于tblast[nx])[整数]；默认＝1；-a使用的处理器数目[整数]；默认＝1；-O SeqAlign文件[File Out]任选；-J相信查询定义行[T/F]；默认＝F；-M矩阵[字符串]；默认＝BLOSUM62；-W字大小，如果为零，则默认(blastn 11，megablast28，全部其他方法3)[整数]；默认＝0；-z数据库的有效长度(对于真实大小，使用零)[Real]；默认＝0；-K来自保持区域的最佳命中数(默认关闭；若使用，则推荐值为100)[整数]；默认＝0；-P 0用于多重命中；1用于单一命中[整数]；默认＝0；-Y搜索空间的有效长度(对真实大小，使用零)[Real]；默认＝0；-S针对数据库搜索的查询链(对于blast[nx]和tblastx)；3用于两者，1是顶端，2是底部[整数]；默认＝3；-T产生HTML输出结果[T/F]；默认＝F；-l限制数据库搜索至GI’s列表[字符串]任选；-U使用FASTA序列的较低事件过滤作用[T/F]任选；默认＝F；-y无空位延伸的X下降值(比特)(0.0激发默认行为)；blastn 20，megablast 10，全部其他方法7[Real]；默认＝0.0；-Z最终空位比对的X下降值(比特)(0.0激发默认行为)；blastn/megablast50，tblastx 0，全部其他方法25[整数]；默认＝0；-RPSI-TBLASTN检查点文件[File In]任选；-n MegaBlast搜索[T/F]；默认＝F；-L查询序列上的位置[字符串]任选；-A多重命中窗口大小，如果为零，则默认(blastn/megablast 0，全部其他方法40[整数]；默认＝0；-w移码罚分(OOF算法用于blastx)[整数]；默认＝0；-t允许tblastn中用于联系HSP的最大内含子的长度(0取消连接联系)[整数]；默认＝0。

通过使用Needleman和Wunsch或者Smith和Waterman算法获得高质量的结果。因而，优选基于所述算法的程序。有利地，可以用程序PileUp(J.Mol.Evolution.,25,351(1987),Higgins等人，CABIOS 5,151(1989))或优选地用均基于Needleman和Wunsch算法(J.Mol.Biol.48；443(1970))的程序“Gap”与“Needle”和基于Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.2；482(1981))算法的“BestFit”进行序列的比较。“Gap”和“BestFit”是GCG软件包[Genetics Computer Group,575Science Drive,Madison,Wisconsin,USA53711(1991)；Altschul等人(Nucleic Acids Res.25,3389(1997))，“Needle”是欧洲分子生物学开放软件包(The European Molecular Biology Open Software Suite(EMBOSS))的部分(Trends in Genetics 16(6),276(2000))。因而，优选地，用程序“Gap”或“Needle”在所述序列的整个范围内进行确定序列同一性百分数的计算。用于比较核酸序列的以下标准调整用于“Needle”：矩阵：EDNAFULL，空位罚分：10.0，延伸罚分：0.5。用于比较核酸序列的以下标准调整用于“Gap”：空位权重：50，长度权重：3，平均匹配：10.000，平均错配：0.000。

术语“表达”或“基因表达”意指，特定基因(一个或多个)或特定遗传构建体的转录。术语“表达”或“基因表达”特别意指，基因(一个或多个)或遗传构建体转录成结构RNA(rRNA、tRNA)或mRNA，加上或不加上mRNA随后翻译成蛋白质。该过程包括DNA的转录及所得mRNA产物的加工。

如本文所用的术语“超表达”“高表达”或“过表达”意指，超出原始野生型表达水平之外的任何表达形式。用于增加基因或基因产物表达的方法在本领域有充分的文献记载，其包括例如由适当启动子驱动的过表达、使用转录增强子或翻译增强子。可将用作启动子或增强子元件的经分离的核酸引入非异源形式的多核苷酸的适当位置(典型地上游)，以便上调编码目的多肽的核酸的表达。例如，可通过突变、缺失、和/或替换在体内改变内源性启动子(参见Kmiec,US 5,565,350；Zarling等,WO9322443)，或可将经分离的启动子以适当的方向及距本发明基因的距离引入植物细胞中，以控制基因的表达。

如果期望多肽或蛋白质表达，则通常期望在多核苷酸编码区的3'末端包括多聚腺苷酸化区。多聚腺苷酸化区可源于天然基因、来自多种其它植物基因、或来自T-DNA。欲添加的3'端序列可源于例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因，或者可选地源于另一植物基因，或次优选地源于任何其它真核生物基因。

也可以在5’非翻译区(UTR)或部分编码序列的编码序列中加入内含子序列，来增加在胞质中累积的成熟信使的量。已显示，在植物和动物表达构建体的转录单位中纳入可剪接内含子，可以在mRNA和蛋白质水平使基因表达增加高达1000倍(Buchman和Berg(1988)Mol.Cell biol.8:4395-4405；Callis等(1987)Genes Dev.1:1183-1200)。通常内含子放置在转录单位5’末端附近时，增强基因表达的作用最大。玉蜀黍内含子Adh1-S内含子1、2和6，Bronze-1内含子的使用是本领域公知的。一般信息请参见The Maize Handbook,第116章,Freeling和Walbot编辑,Springer,N.Y.(1994)。

本文述及的术语“引入”或“转化”包括将外源多核苷酸转移进宿主细胞，不考虑转移所用的方法。能够随后通过器官发生或者胚胎发生进行克隆增殖的植物组织都可以使用本发明的遗传构建体转化，并从其再生整个植物。具体的组织选择将因可用于和最适于待转化的具体物种的克隆增殖系统而变。示例性的组织靶标包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、雌配子、愈伤组织、既有的分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)，以及诱导的分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。可以将多核苷酸瞬时地或稳定地引入宿主细胞，并且可以，例如作为质粒以非整合的状态维持。可选地，其可以整合进入宿主基因组。得到的转化植物细胞可以接着以本领域技术人员已知的方式再生为转化的植物。

本文所用的术语“与第311位的突变，优选311E突变，更优选G311E相同或相应的突变”是指来自拟南芥MATE外排型转运蛋白(SEQ ID NO:2所示)与其他物种的MATE外排型转运蛋白相比通过序列比对后在对应于SEQ ID NO:2的311位上的氨基酸突变，优选突变为谷氨酸或者其他氨基酸，更优选G311E突变，其中所述氨基酸突变使得所述MATE外排型转运蛋白在植物中表达或过表达后能够赋予植物增强的百草枯抗性。

本发明中所挖掘的一种MATE外排型转运蛋白家族基因及编码蛋白AT2G04100/AtDTX6来源于拟南芥，主要涉及如下特征：

(1)如SEQ ID NO:1所示的DNA序列，或如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列组成的蛋白质分子；

(2)如SEQ ID NO:1所示的DNA序列第932位发生鸟嘌呤替换为腺嘌呤碱基替换的DNA序列SEQ ID NO:3，或如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列组成的蛋白质分子的氨基酸序列第311位发生甘氨酸替换为谷氨酸氨基酸替换的氨基酸序列SEQ ID NO:4组成的蛋白质分子；

(3)如将SEQ ID NO:1所示DNA序列通过几个碱基的增添、缺失或替换而产生的具有与SEQ ID NO:1所示DNA分子存在相同或相近功能的DNA分子；

(4)如将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列通过几个氨基酸残基的添加、缺失或替换而产生的具有与SEQ ID NO:2所示蛋白具有相同或相似功能活性的衍生蛋白；

(5)其他相同或不同物种中核苷酸序列或氨基酸序列相似性超过50％，具有相同功能的蛋白质分子；

(6)在高严谨条件下能够同权利要求1中DNA序列杂交的核苷酸序列；

上述高严谨条件为：在6×SSC(pH＝7.0)，0.5％SDS溶液中，在65℃条件下杂交，然后用2×SSC(pH＝7.0)，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3所示DNA序列均由1452个核苷酸组成，SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列均由483个氨基酸组成。

一方面，本发明涉及植物百草枯耐受基因AT2G04100/AtDTX6在培育百草枯耐受植物的应用。发明人发现拟南芥中一类MATE外排型转运蛋白家族成员AT2G04100/AtDTX6基因及编码蛋白在增强拟南芥对百草枯耐受相关方面的应用。该基因高/超表达(命名位OE，即过表达)以及该基因编码区第932位鸟嘌呤突变为腺嘌呤(G932A)，会导致其编码蛋白序列第311位氨基酸甘氨酸突变为谷氨酸(G311E)(命名为dtx6-D)均能显著增强植物百草枯耐受。其中，dtx6-D也可以通过基因编辑技术进行单碱基定点突变产生。

另一方面，本发明涉及一类培育提高除草剂百草枯耐受植物品种的新方法。可通过以下方式获得：

(1)选择如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，或编码如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列，将其构建到基因高/超表达载体中，然后将该转化载体导入靶向植物细胞或基因组中，通过抗性筛选和基因表达量检测获得上述核苷酸序列高/超表达基因转基因植株；

(2)选择靶向植物基因组内与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列相似性最高的基因，或编码与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相似性最高的蛋白质分子的核苷酸序列，将其构建到基因高/超表达载体中，然后将该转化载体导入靶向植物细胞或基因组中，通过抗性筛选和基因表达量检测获得上述核苷酸序列过/超表达基因转基因植株；

(3)选择靶向植物基因组内与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列相似性最高的基因，或编码与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相似性最高的蛋白质分子的核苷酸序列，通过与靶向植物基因核苷酸序列或蛋白质分子的氨基酸序列比对，查找与AtDTX6基因编码区G932A核苷酸位点保守的核苷酸类型或与AtDTX6基因编码蛋白G331E氨基酸保守的氨基酸类型，利用基因定向CRISPR-Cas9编辑技术，将其替换位增强基因活性的核苷酸类型或替换为增强蛋白质活性的氨基酸类型，通过抗性筛选和测序鉴定，获得基因编辑植株。

上述方法，可应用的植物为拟南芥、水稻、玉米、棉花、西红柿、葡萄、小麦、大豆等植物。

主要通过以下实施例阐明本发明的发明内容，但本发明内容范畴并不局限于实施例内容。实施例内容如无额外说明，均为常规实验方法。以下实施例中所用实验器材、实验试剂等均可为商用，可通过市场购买获得。

实施例1拟南芥百草枯耐受突变体pqt15-5的获得及基因定位

通过甲基磺酸乙酯(Ethyl methyl sulfonate，简称EMS)诱变拟南芥野生型(Col-0生态型)种子(购于拟南芥生物资源中心(Arabidopsis Biological Resource Center，简称，ABRC))，创制M2代拟南芥诱变突变体库(参考朱健康课题组拟南芥EMS诱变方法,见YongSig Kim,K.S.S.,and Jian-Kang Zhu(2005)."EMS-Mutagenesis-of-Arabidopsis."Methods in Molecular Biology 323.)。将含2uM百草枯的MS(Murashige and Skoog)固体培养基(另含0.6％琼脂粉，1％蔗糖，pH＝5.8，高温蒸汽灭菌，冷却至50-60℃，加入无菌处理的百草枯母液)作为条件筛选百草枯耐受突变体。将经过无菌处理并春化的M2代种子均匀的铺撒在含2uM百草枯的MS固体培养基中，在22℃条件下生长一周，百草枯耐受突变体的种子能够正常萌发、存活，而其他类型的种子则在发芽后快速漂白死亡。通过筛选我们获得了pqt15-5(命名为paraquat tolerance15-5，简称pqt15-5)株系，将其幼苗移至正常土壤条件，待开花期(作为父本)与同期生长的Col-0野生型(作为母本)杂交，获得F1代种子，并收获M3代种子，用于复筛进一步验证其百草枯耐受性(见图1A)。将F1种子用含2uM百草枯的MS培养基处理，F1种子能够萌发、存活(见图1B)，表明pqt15-5突变体为细胞核显性遗传突变体。将F1种子生长自交获得F2种子，用含2uM百草枯的MS培养基处理，耐逆:敏感≈3:1(存活:死亡＝230:88；χ2＝1.07<χ2(0.05)＝3.84)，表明该pqt15-5百草枯耐受突变植株为单基因显性核遗传突变。

将F2群体进行百草枯耐受筛选，选取50株百草枯耐受型突变体用打孔器等量取叶片混合，抽提基因组，通过illumina测序平台mutmap重测序方法测序(合肥微分基因科技有限公司)，并通过一代测序进一步验证该突变基因名称为AT2G04100/AtDTX6(见图1C)，突变位点为编码区+932bp位鸟嘌呤突变为腺嘌呤(G932A)，氨基酸突变位点为311位甘氨酸突变为谷氨酸(G311E)，即ATDTX6-D。

拟南芥生长条件为：22℃，16h光照/8h黑暗。

拟南芥无菌处理条件如下：

10％蓝月亮消毒液，90％ddH2O，摇床250rpm 10-15min，然后在超净工作台用无菌水清洗5遍处理，文中种子消毒方式未额外提及均与此相同。

拟南芥基因组抽提方法如下：

(1)取约100mg拟南芥新鲜叶片于研钵中，加液氮成磨成粉，用移液枪加入400uL植物基因组抽提缓冲液，充分混匀，移液至1.5ml EP管中；

(2)加入1％的RNA消化酶，55-65℃水浴10min；

(3)样品取出，加入等体积酚氯仿，混匀，12000rpm离心机离心10-15min，取上清至新EP管中；

(4)向EP管中依次加入70％上清液体积的异丙醇和10％上清液体积的3M浓度的醋酸钠，12000rpm高速离心10min，去上清；

(5)用70％的酒精清洗基因组沉淀2次，去上清；

(6)室温晾干，然后加入30ul无核酸酶水。

实施例2拟南芥AtDTX6/dtx6-D基因能够增强大肠杆菌rosetta菌株对百草枯耐受

首先，根据T4连接系统设计AtDTX6/dtx6-D基因片段扩增引物，抽提Col-0和pqt15-5株系mRNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板扩增AtDTX6/dtx6-D基因编码序列CDS。用T4连接酶分别将AtDTX6/dtx6-D基因片段连入到pET28a载体(购于淼灵生物公司)，并通过农杆菌热击转化法分别将pET28a、pET28a-AtDTX6和pET28a-dtx6-D质粒导入大肠杆菌rosetta菌株(购于北京华越洋生物科技有限公司)，含pET28a质粒的rosetta菌株(购于北京华越洋公司)作为空对照，挑取阳性单克隆，摇菌至OD＝0.4-0.6，将菌液分别点在含0、400uM和1mM百草枯的LB固体培养基(含胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，1％琼脂粉，高压蒸汽灭菌)，37℃培养过夜，观察(见图2A)。

拟南芥总RNA抽提方法步骤如下：

(1)取约100mg MS培养基生长一周新鲜组织于研钵中，加入液氮，研磨成粉，立即加入1ml TRIZOL试剂(北京全式金生物技术有限公司)，待融化，低温继续充分研磨，移液至1.5ml无菌EP管中；

(2)加入200ul氯仿，反复颠倒数混匀，静置5min，12000rpm4℃条件离心15min；

(3)取200-300ul上清，至新EP管中，加等体积异丙醇，颠倒混匀，静置10min；

(4)12000rpm 4℃离心15min；

(5)取上清200-300ul至新EP管中，用70％的酒精清洗沉淀2次，去上清；

(6)室温晾干，加入20ul DEPC去离子水，溶解。

mRNA反转录方法步骤如下：

采用TAKARA公司(Prime Script RT reagent Kit)反转录试剂盒(20ul反转录体系)：

5×primeScript缓冲液	4μl
		primeScript RT酶混合物I	1μl
50uM Oligo dT引物	1μl
		RNA	总量2ug
不含RNA酶的ddH2O	补足水至20ul

将混合好的反应体系，置于37℃水浴2h，即可4℃保存。该样品可作为基因CDS序列扩增和RT-PCR/qRT-PCR反应模板。

pET28a相关载体构建引物如下：

AtDTX6/dtx6-D基因片段扩增引物为：

FP(pET28a-AtDTX6-FP-BamH 1):CGGGATCC ATGGAAGAT CCACTTTTATTGGG(SEQ IDNO:5)

RP(pET28a-AtDTX6-RP-Not 1):ATAAGAATGCGGCCGC TCAA GCAA GTCCATTGCCAAATG(SEQ ID NO:6)

PCR扩增50ul体系：2×KOD buffer 25ul，KOD酶0.4ul，LP(10uM)1ul，RP(10uM)1ul，dNTP(2.5mM)4ul，DNA模板1ul，ddH2O 17.6ul。

PCR扩增条件：第一阶段：94℃3min预变性；第二阶段：98℃10sec变性，56℃30sec退火，68℃1min延伸，40循环；第三阶段：68℃5min延伸。

实施例3拟南芥AtDTX6基因敲除和过表达株系获得

AtDTX6基因敲除株系获得：利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，根据AtDTX6基因编码序列设计基因编辑靶点引物分别针对Target I(AtDTX6-target1-FP:ATTGGTCTTAAGCCGACGCCGACA(SEQ ID NO:7),AtDTX6-target1-RP:AAAC TGTCGGCGTCGGCTTAAGAC(SEQ ID NO:8))和Target II(AtDTX6-target2-FP:ATTG GCTCAAGAACCTCAGCCGCA(SEQ IDNO:9)，AtDTX6-target2-RP:AAAC TGCGGCTGAGGTTCTTGAGC(SEQ ID NO:10))，并参考谢旗课题组基因编辑系统构建pYAO-basedCRISPR/Cas9基因编辑载体。将构建好的基因编辑载体电转导入C58C1农杆菌(该菌株由美国ISU大学Oliver D.J.教授惠赠)，利用农杆菌浸花转化的方法转入到野生型拟南芥中，收获T0代种子。将T0代种子经灭菌、春化后，用含50mg/ml潮霉素抗生素的MS固体培养基筛选获得T1阳性苗，在土壤中种植，并取叶片抽提基因当模板通过PCR反应获得目的片段(测序引物为CRISPR-AtDTX6-FP(TGAAGTCGTGCATTCTCATCT(SEQ ID NO:11))和CRISPR-AtDTX6-RP(TTGTTGCACCGCTTGAGCTAA(SEQ ID NO:12))、送样测序鉴定靶点处是否发生基因编辑，若发生编辑则通常会在靶点处出现双峰，将出现双峰的T1代阳性苗自交获得T2代种子，将T2代种子继续单株种植，取叶片抽提基因组DNA作为模板，PCR测序鉴定，引物分别为：CRISPR-AtDTX6-FP(TGAAGTCGTGCATTCTCATCT(SEQ ID NO:11))和CRISPR-AtDTX6-RP(TTGTTGCACCGCTTGAGCTAA(SEQ ID NO:12))(该引物用于扩增包含两个基因敲除靶点的序列，并测序检测是否发生基因敲除)，获得发生基因编辑的纯合单株，收获T3代纯合基因敲除突变体种子(knockout，简称ko)，分别为ko-3和ko-8(见图3A)。

基因过表达株系获得：根据AtDTX6编码序列设计带全接头(attB)的引物pCB2004-AtDTX6-LP(GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCA GGC T ATGGAAGATCCACT TTTATTGGG(SEQ ID NO:13))和pCB2004-AtDTX6-RP(GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTG GGTTCAAGCAAGTCCATTGCCAAATG(SEQ ID NO:14))，PCR获得该基因目的片段，切胶回收，测序鉴定。通过Invertrogen公司的GatewayTM克隆技术，经BP、LR两步反应，最终将目的片段重组到pCB2004质粒(来自该文献所属实验室惠赠High-throughput Binary Vectors forPlant Gene Function Analysis,Zhi-Yong Lei et al.,Journal of Integrative PlantBiology 2007,49(4):556-567)，并通过测序确定该重组目的片段未发生突变，命名为pCB2004-AtDTX6。通过电转，将pCB2004-AtDTX6质粒导入C58C1农杆菌感受态，浸染野生型花序，收种。用含50mg/L草铵膦(Glufosinate ammonium，简称Glu)的MS培养基筛选转基因T1阳性苗，移植到土壤中种植，单株收T2种。将T2代种再次用含Glu培养基筛选，统计存活比，获得单拷贝转基因株系，种植到土壤中，单株收获T3代转基因种子。将T3代种子进一步用含Glu的培养基筛选，获得纯合转基因过表达株系。选取T3代纯合株系种子在MS培养基上萌发、生长一周，抽提RNA，反转录以及RT/qRT-PCR(正向引物(AtDTX6-qPCR-LP):GACATGGAGGATGAATTTCACG(SEQ ID NO:15)，反向引物(AtDTX6-qPCR-RP):CCGATTTTCGCGTATTGTTTTG(SEQ ID NO:16))检测转基因株系种AtDTX6基因表达量的变化，获得多个AtDTX6纯合过表达株系(overexpression，简称OE)，分别为OE-9、OE-13和OE-17(见图3B)。

该过表达株系RT-PCR或qRT-PCR表达量检测步骤如下：

RT-PCR检测AtDTX6基因表达量(同实施例2更换为20ul反应体系30个循环)，PCR结束等量加样跑琼脂糖凝胶电泳，拍照观察。

PCR(qRT-PCR)检测AtDTX6基因表达量，使用TaKaRa公司的STBR green试剂盒，利用荧光实时定量PCR仪检测，如下体系(10ul体系)：

SYBR green	5μl
		20μM FP	0.25μl
20μM RP	0.25μl
		模板	1μl
ddH2O	3.5μl

荧光实时定量PCR仪PCR扩增程序为：95℃预变性20sec，95℃变性10sec，60℃退火延伸30sec，共40循环。

实施例4拟南芥AtDTX6基因在不同组织部位表达量检测

野生型拟南芥在土壤条件下正常生长四周，用总RNA抽提试剂盒抽提根、茎、莲台叶、茎生叶、花、果荚和种子等不同组织部位总RNA(参考实施例2)，反转录成cDNA作为模板，通过RT-PCR和qRT-PCR分别检测AtDTX6基因在不同组织部位的表达量差异(见图4A和4B)。

实施例5拟南芥百草枯耐受种子萌发、存活实验

将ko，Col-0，OE以及dtx6-D等株系纯合种子分别无菌处理(同实施例1)，然后4℃黑暗春化处理2-4天。选各株系充实饱满的种子等量均匀点在分别含0uM、1uM、1.5uM和2uM百草枯的MS培养基内培养(培养条件为：22-24℃、16h光照/8h黑暗)生长一周统计种子存活率(见图5A和5B)。

统计结果表明，各株系在MS条件下存活率无明显差异。在含不同浓度百草枯条件下，KO-3/KO-8均表现为较Col-0(对照组)更敏感，而OE-9/OE-13/OE-17株系同dtx6-D株均表现为对百草枯更加耐受。说明AtDTX6基因正向调控拟南芥对百草枯耐受，该基因功能缺失会使拟南芥对百草枯更加敏感，过表达则会增强对百草枯耐受；同时也证明dtx6-D突变株系为基因功能增强型突变。

实施例6拟南芥土壤种植百草枯耐受实验

将KO，Col-0，OE以及dtx6-D等株系纯合种子无菌处理，然后在MS固体培养基垂直生长一周，选取长势相同的幼苗移至正常土壤中(培养条件为：22-24℃、16h光照/8h黑暗)生长3周。均匀喷洒浓度40uM的百草枯，观察莲台叶的变化，3-5天后拍照并统计各株系的存活率(见图6A和图6B)。另外，抽提百草枯处理前莲台叶总RNA，反转录成cDNA，然后通过RT-PCR检测AtDTX6(引物同实施例3中RT-PCR所用引物)基因在莲台叶中的表达量(见图6C)。

统计结果表明，KO-3/KO-8均表现为较Col-0(对照组)对百草枯更敏感，存活率更低，而OE-9/OE-13/OE-17株系则显著比Col-0(对照组)更加耐受，dtx6-D株系相比Col-0同样有较强的耐受。说明AtDTX6基因同样能够正向调控拟南芥苗期对百草枯的耐受能力，并且结合实施例4结果，说明AtDTX6和dtx6-D的表达量与拟南芥对百草枯的抗性呈正相关。在AtDTX6和dtx6-D的表达量相同或相近时，dtx6-D能具有比AtDTX6更强的抗百草枯活性，而当AtDTX6的表达量显著高于dtx6-D时，AtDTX6的剂量效应则更加突出。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

2.如权利要求1所述的蛋白质，其包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或由其组成。

3.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1-2任一项所述的蛋白质。

4.权利要求3所述的核酸分子，包含SEQ ID NO:3所示的核酸序列或由SEQ ID NO:3所示的核酸序列组成，或者在严谨条件下与SEQ ID NO:3所示的核酸序列的互补序列杂交或者与SEQ ID NO:3所示的核酸序列具有至少80％同一性，优选至少85％、86％、87％、87％、88％、89％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性。

5.一种重组构建体，其包含权利要求3-4任一项所述的核酸分子。

6.一种重组表达载体，其包含一个或多个权利要求3-4所述的核酸分子或权利要求5所述的重组构建体。

7.一种制备抗百草枯植物的方法，其包括在向植物或植物细胞中引入权利要求3-4所述的核酸分子、权利要求5所述的重组构建体或权利要求6所述的重组表达载体，并将所述植物细胞培养为植物。

9.权利要求3-4所述的核酸分子、权利要求5所述的重组构建体、权利要求6所述的重组表达载体在制备与野生型植物相比具有增强的百草枯抗性的植物中的应用。

10.权利要求1所述的蛋白质、权利要求7-8任一项所述的方法或权利要求9所述的应用，其中所述植物为双子叶或单子叶植物。

11.权利要求1所述的蛋白质、权利要求7-8任一项所述的方法或权利要求9所述的应用，其中所述植物为拟南芥、水稻、玉米、棉花、西红柿、葡萄、小麦或大豆。