DE69815837T2

DE69815837T2 - Methoden zur pflanzentransformation und - regeneration

Info

Publication number: DE69815837T2
Application number: DE69815837T
Authority: DE
Inventors: G. Peggy LEMAUX; Myeong-Je Cho
Original assignee: University of California; University of California Berkeley
Current assignee: University of California; University of California Berkeley
Priority date: 1997-04-29
Filing date: 1998-04-13
Publication date: 2004-05-06
Anticipated expiration: 2018-04-14
Also published as: AU6965898A; CA2287942A1; US6235529B1; JP2001521391A; EP0979031B1; EP0979031A1; US6541257B2; ATE243410T1; AU727873B2; DE69815837D1; WO1998048613A1; US20010031496A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gegenstand der Erfindung sind Verfahren zur Kultur, Transformation und Regeneration von Pflanzen in vitro.
Die Fähigkeit, Pflanzen-Spezies zur Verbesserung der Leistung und Schädlingsresistenz oder zur Förderung alternativer Verwendungszwecke genetisch zu manipulieren, wurde behindert, weil Verfahren zur Kultur, Transformation und Regeneration von Modellkultivaren in vitro mit rekalzitranten, kommerziellen Kultivaren weniger wirksam sind.
So sind zum Beispiel veröffentlichte Verfahren zur Generierung von hoch embryogenem Kallus von Gerste (Hordeum vulgare L.) und Regeneration grüner Pflanzen von begrenztem Nutzen gewesen, wenn sie in Transformationsverfahren für kommerziell wichtige Gerste-Genotypen verwendet wurden. Diese Verfahren wurden durch einen allmählichen Verlust der embryogenen Kapazität und Regenerationsfähigkeit von Kallusgewebe und einer Zunahme von Albinopflanzen (Chlorophyll-defizienten Pflanzen) während der verlängerten Perioden, die zur Selektion transformierter Gewebe benötigt werden, erschwert. So führten zum Beispiel von den unabhängig transformierten Kalluslinien, die durch ein Transformationsverfahren für den Gerste-Genotyp Golden Promise generiert wurden, nur 51% der transformierten Linien zu grünen Pflanzen, und einige dieser Linien regenerierten nur eine kleine Anzahl grüner Pflanzen (Wan und Lemaux, 1994; Lemaux et al., 1996). Wenn das gleiche Verfahren an den kommerziellen Gerste-Genotypen Moravian III und Galena angewendet wurde, führten keine der resultierenden transformierten Linien zu grünen Pflanzen.
Ebenso bestand ein Mangel an reproduzierbaren und effizienten Verfahren zur Transformation und Regeneration rekalzitranter, kommerziell wichtiger Weizen-Kultivare (Triticum aestivum L.). Verfahren zur Transformation bestimmter Weizen-Kultivare, einschließlich Verfahren, welche der Mikroprojektil-Beschuss und Agrobacterium tumefaciens einsetzten, wurden berichtet. Die Anwendung dieser Verfahren auf kommerziell wichtiges Keimplasma war jedoch begrenzt.
US 5,641,664 betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer transformierten Pflanze, das die Induktion von Nukleinsäure in Kallusgewebe und danach Kultivieren des Kallus auf ersten und zweiten Medien, gefolgt von Kultivieren auf einem Regenerationsmedium zur Herstellung einer transformierten Pflanze beinhaltet, es ist jedoch nicht klar, woraus sich das erste und zweite Medium zusammensetzte.
Folglich besteht ein Bedarf an effizienten Verfahren zur Transformation und Regeneration, die mit vielen verschiedenen Gerste-Genotypen, einschließlich, kommerziell wichtiger Genotypen verwendet werden können.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Wir haben verbesserte Verfahren und Zusammensetzungen zur Transformation und Regeneration von Pflanzen entwickelt. Die nachstehenden Beispiele detaillieren die Anwendung dieser Verfahren und Zusammensetzungen auf verschiedene Gerste-Genotypen, einschließlich kommerziell wichtiger Genotypen, von denen sich herausgestellt hat, dass sie durch zuvor verfügbar gewesene Verfahren, schwer oder überhaupt nicht transformiert und regeneriert werden konnten. Diese verbesserten Verfahren., wenn auf Gerste angewendet, resultieren in einer signifikant höheren Regenerationsfrequenz, reduzieren die somaklonale Variation und verbessern die Inzidenz fertiler, grüner transformierter Pflanzen. Die erfindungsgemäßen Verfahren sind jedoch nicht auf Gerste beschränkt, sondern können auch zur Transformation und Regeneration anderer Pflanzenspezies eingesetzt werden.
Ein erfindungsgemäßer Aspekt umfasst Verfahren zur Herstellung einer transformierten Pflanze, die einen Zwischeninkubationsschritt einschließt, der die Frequenz, mit der transformierte Pflanzen aus unabhängigen Transformationsereignissen erhalten werden, verbessert. Im Einzelnen umfassen diese Verfahren die Schritte von:

(1) Transformation einer Zelle von einem Zielpflanzengewebe (z. B. einem immaturen Embryo, Kallus, von Mikrosporen-abgeleiteten Embryo usw.) zur Herstellung einer transformierten Zelle;
(2) Kultivieren der transformierten Zelle auf einem Kallus-Induktionsmedium (CIM), das ein Auxin zur Förderung der Proliferation der transformierten Zelle und die Bildung eines transformierten Kallus einschließt, d. h. wobei ein Kallus aus dem initialen Transformationsereignis entsteht (in einigen Ausführungsformen enthält das CIM auch eine niedrige Konzentration eines Cytokinins und eine hohe Kupferkonzentration);
(3) Kultivieren des transformierten Kallus auf einem Intermediär-Inkubationsmedium (IIM); das ein Auxin und ein Cytokinin zur Förderung der fortgesetzten Proliferation von Zellen, die aus dem initialen Transformationsereignis entstehen und Bildung einer regenerationsfähigen Struktur, d. h. einer multizellulären Struktur, die regenerationskompetent ist, einschließt; und
(4) Kultivieren der regenerationsfähigen Struktur auf einem Regenerationsmedium (RM; d. h. Sprossungs- und/oder Bewurzlungsmedium) zur Herstellung einer transformierten Pflanze.

Die Selektion für transformierte Zellen kann unmittelbar nach der Einführung von DNA in eine Zelle beginnen. Als Alternative kann die Selektion später, z. B. während der Kallusinduktion, beginnen, um ausreichend Zeit für die initiale Zeltproliferation bei Abwesenheit des Selektivmittels bereitzustellen. Die Selektion wird im Allgemeinen während des Zwischeninkubationsschrittes aufrechterhalten, und kann abhängig von dem Selektivmittel auch während des Regenerationsschrittes aufrechterhalten werden.
Ein anderer erfindungsgemäßer Aspekt umfasst optimierte Pflanzenkulturmedien und die Verwendung dieser Medien für Pflanzenzell- und Gewebekulturen. Diese optimierten Medien schließen Phytohormone und Kupfer (z. B Kupfer(II)-sulfat) ein, welche die Kallusqualität während der Initiierung verbessern, die Regenerationsfähigkeit des Gewebes fördern und die Albinismus-Inzidenz während der Periode der Kalluserhaltung und -regeneration reduzieren. Die Medien schließen auch übliche Pflanzennährstoffe ein und können außerdem eine Kohlenstoffquelle, wie zum Beispiel Maltose (die für die Initiierung einiger Spezies, einschließlich Gerste, Weizen und Reis besser ist als Saccharose) einschließen.
In bevorzugten Ausführungsformen schließt das CIM ein Auxin (z. B. 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure oder Dicamba), zum Beispiel in einer Konzentration von ca. 0,1, mg/l bis ca. 5,0 mg/l, bevorzugt ca. 1,0 mg/l bis ca. 2,5 mg/l, ein. Das CIM kann auch ein Cytokinin (z. B. 6-Benzylaminopurin, Zeatin und Kinetin) z. B. in einer Konzentration von ca. 0,01 mg/l bis ca. 0,5 mg/l für die initiale Kallusinduktion und ca. 0,1 mg/l bis ca. 2,0 mg/l zur Erhaltung des Kallus und der grünen Gewebe einschließen.
In bevorzugten Ausführungsformen enthält das IIM ein Auxin, z. B. in einer Konzentration von ca. 0,1 mg/l bis ca. 5,0 mg/l, bevorzugt ca. 0,5 mg/l bis ca. 2,5 mg/l und ein Cytokinin, z. B. in einer Konzentration von ca. 0,1 mg/l bis ca. 5,0 mg/l, bevorzugt ca. 0,1 mg/l bis ca. 2,0 mg/l.
Das CIM und IIM schließen bevorzugt auch Kupfer, z. B. in einer Konzentration von ca. 0,1 μM bis ca. 50 μM ein.
Ein anderer erfindungsgemäßer Aspekt umfasst die Verwendung von Schwachlicht-Bedingungen während der frühen Selektionsphasen. Schwachlicht-Bedingungen ermöglichen, dass der Kallus grün wird und reduzieren die Inzidenz der Regeneration fertiler grüner Pflanzen und können die Regenerationsfähigkeit des Kallusgewebes verbessern. Schwachlicht-Bedingungen erlauben auch, auf grüne Abschnitte des Kallus (für Gerste zum Beispiel; gelb-grüne Abschnitte für Weizen) zu screenen, die mit höherer Wahrscheinlichkeit regenerationsfähig sind. Grüner Kallus ist als Zielpflanzengewebe zur Transformation, z. B. durch Mikroprojektil-Beschuss oder Infektion mit Agrobacterium nützlich. In Schwachlicht auf einem CIM gezüchteter Kallus entwickelt regenerationsfähige Strukturen oder erhält sie aufrecht und kann zum Beispiel für die Gerste-Genotypen Golden Promise, Galena und Harrington, in diesem Zustand mindestens zehn Monate und für Morex mindestens vier bis sechs Monate aufrechterhalter werden.
Ein anderer erfindungsgemäßer Aspekt ist die Verwendung des Mikroprojektil-Beschusses zur Pflanzentransfonnation, worin der Beschuss unter 1300 psi, z. B. bei 450–900 psi durchgeführt wird. Die Senkung des Berstdruckes und folglich der Geschwindigkeit der Mikroprojektilen verringert die Schädigung des Zielgewebes und resultiert in weniger Belastung für die transformierten Zellen.
Ein anderer erfindungsgemäßer Aspekt umfasst transformierte Pflanzen und Pflanzenkulturmedien wie hierin beschrieben.
Vorstehendes und andere erfindungsgemäße Aspekte werden besser aus der nachstehenden ausführlichen Beschreibung erkannt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A zeigt die relative Wachstumsrate (g/g Frischgewicht/Tag) von Kallus des Gerste-Genotyps Golden Promise, der auf vierzehn verschiedenen Medien gezüchtet wurde. (Die Auxin- und Cytokinin-Konzentrationen der Medien sind aus Tabelle 1 ersichtlich).
1B zeigt die relative Wachstumsrate (g/g Frischgewicht/Tag) von Kallus des Gerste-Genotyps Galena (B), der auf vierzehn verschiedenen Medien gezüchtet wurde. (Die Auxin- und Cytokinin-Konzentrationen der Medien sind aus Tabelle 1 ersichtlich.)
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Wir haben verbesserte Verfahren zur Transformation und Regeneration von Pflanzen und für diese Verfahren nützliche Zusammensetzungen entwickelt. Obwohl diese Verfahren im Allgemeinen auf Gerstenvarietäten, einschließlich rekalzitranter Genotypen anwendbar sind, sind sie auch auf andere Pflanzenspezies anwendbar.
DEFINITIONEN UND VERFAHREN
Sofern nicht anderweitig angemerkt, sind die Begriffe vom Durchschnittsfachmann gemäß dem üblichen Gebrauch zu verstehen. Außer den Defmitionen der nachstehend bereitgestellten Begriffe, können Defmitionen der in der Molekularbiologie üblichen Begriffe auch in Rieger et al., 1991; und Lewis, 1994, eingesehen werden.
TRANSFORMATION UND REGENERATION VON PFLANZEN
„Transformiert"; „transgen". Eine Zelle, ein Gewebe, Organ oder Organismus, in die/das/den eine Fremdnukleinsäure, wie zum Beispiel ein rekombinanter Vektor, eingeführt wurde, wird wie auch die Nachkommen davon, in denen die Fremdnukleinsäure anwesend ist, als „transformiert" oder „transgen" erachtet.
„Fremd"-Nukleinsäuren sind Nukleinsäuren, die normalerweise nicht in der Wirtszelle anwesend sind, insbesondere Nukleinsäuren, die durch rekombinante DNA-Techniken modifiziert wurden. Der Begriff „Fremd"-Nukleinsäuren schließt auch Wirtsgene ein, die unter die Kontrolle einer neuen Promotor oder Terminatorsequenz, wie zum Beispiel mittels üblicher Verfahren hergestellt werden.
TRANSFORMATION DURCH PARTIKELBESCHUSS. Partikelbeschuss wurde zur Transformation einer Anzahl von Pflanzenspezies, einschließlich Gerste (siehe z. B. Wan und Lemaux, 1994 und Bio-Rad Technical Bulletin 2007) und Mais (siehe z. B. Gordon-Kamm et al., 1990) eingesetzt. Die erfolgreiche Transformation mittels Partikelbeschusses erfordert, dass sich die Zielzellen aktiv teilen, für Mikroprojektile zugänglich sind, in vitro kultivierbar und totipotent sind, d. h. zur Regeneration fähig sind, um mature fertile Pflanzen zu produzieren.
Zielgewebe zum Mikroprojektil-Beschuss schließen immature Embryos, jungen embryogenen Kallus aus immaturen Embryos, Mikrosporen, Mikrosporen abgeleitete Embryos und apikales Meristem-Gewebe ein. Wir haben auch gefunden, dass grüne Kallusgewebe nützliche Ziele zum wie nachstehend besprochenen Beschuss darstellen.
Zuvor wurde der Beschuss von Gerstengewebe, wie zum Beispiel immaturer zygotischer Embryos oder von jungem Kallusgewebe im Allgemeinen bei 1100 psi durchgeführt. Wir haben ermittelt, dass ein Berstdruck unter 1100 psi, bevorzugt weniger als 1000 psi, bevorzugter ca. 600 bis 900 psi, in einer höheren Kallus-Induktionsfrequenz und einer höheren Frequenz regenerationsfähiger Strukturen in Galena resultierte, zum Beispiel, möglicherweise aufgrund der reduzierten Schädigung für das Zielgewebe (obwohl die Frequenz von Golden Promise unbeeinflusst blieb).
GRÜNE GEWEBE ALS EIN ZIEL ZUM PARTIKELBESCHUSS. Gerste-Kallusgewebe, das nicht der Lichteinwirkung ausgesetzt wird, wird durch Selektion so schnell wie möglich weitergeführt, da längere Kulturzeiten in geringerer Regenerationsfähigkeit und einer höheren Inzidenz für Albinismus resultieren (Lemaux et al., 1996). Wir haben entdeckt, dass grünes Kallusgewebe mehr als 10 Monate (z. B. die Gerste-Genotypen Golden Promise, Galena, Harrington und Salome) auf einem IIM (wird nachstehend ausführlicher besprochen) erhalten werden und anschließend bei hoher Frequenz regenerieren kann, wenn es an ein Regenerationsmedium überführt wird. Die Verwendung von grünen Geweben als ein Ziel für die Transformation durch Mikroprojektil-Beschusss erlaubt die Langzeitkultur, wobei die Notwendigkeit zur Erhaltung qualitätsmäßig hochwertiger Spenderpflanzen das ganze Jahr über reduziert wird. Sie kann auch die Notwendigkeit zur Rückkreuzung von Transformanten reduzieren, da das grüne Kallusgewebe höher differenziert ist als Gewebe, das nicht der Lichteinwirkung ausgesetzt wurde und kann eine geringere Frequenz induzierter Mutation und mit einer geringeren Wahrscheinlichkeit somaklonale Variation aufweisen. Darüber hinaus ist im Vergleich zu im Dunkeln gewachsenem Gewebe auch die Inzidenz für Albinismus signifikant reduziert.
ANDERE PFLANZENTRANSFORMATIONSVERFAHREN. Jedwedes übliche Verfahren kann zur Transformation von Pflanzen, d. h. zum Einführen von Fremd-DNA in eine Pflanzenzelle eingesetzt werden. Die Entwicklung stabiler Transformanten und fertiler transgener Pflanzen wurde zum Beispiel in einer Reihe verschiedener dikotyledoner Pflanzen und in solchen Getreidesorten wie Reis, Mais, Weizen und Hafer durch eine Reihe verschiedenster Verfahren erreicht.
Außer dem Partikelbeschuss schließen übliche Verfahren zur Pflanzenzelltransformation folgende ein, sind aber nicht darauf beschränkt: (1) Agrobacterium-vermittelte Transformation, (2) Mikroinjektion, (3) Polyethylenglycol-Verfahren (PEG-Verfahren), (4) Liposom-vermittelte DNA-Aufnahme, (5) Elektroporation und (6) Vortexen mit Silikatglasfasern.
REGENERATION TRANSFORMIERTER PFLANZENZELLEN. Transformierte Pflanzenzellen werden auf Regenerationsmedium zur Veranlassung der Differenzierung des Gewebes zur Herstellung einer fertilen transgenen Pflanze kultiviert.
Es ist bevorzugt, dass die Kallusinduktion und Pflanzenregeneration in drei Stufen erreicht werden, wobei auf jeder transformierte Zellen oder Gewebe auf einem Medium beteiligt sind, welches die auf jeder Stufe gewünschten biologischen Ereignisse unterstützt: Kallusinduktion, Zwischeninkubation und Regeneration.
„Kallus-Induktionsmedium" (CIM) fördert bevorzugt eine schnelle Wachstumsrate, ohne eine erhebliche Differenzierung des Pflanzengewebes in organisierte Strukturen zu erlauben. Eine aus der Einführung von Fremd-DNA in eine Zelle entstehende transformierte Zelle wird auf CIM für eine ausreichende Zeit zur Proliferation der Zelle inkubiert, damit ausreichendes Kallusgewebe zur Gewährleistung gebildet wird, dass eine ausreichende Anzahl von Nachkommen-Zellen aus einer einzelnen transformierten Zelle zur Bildung zahlreicher somatischer Embryos produziert werden, die bei Regeneration zu zahlreichen transformierten Pflanzen führen. Aus diesem Grund schließt das CIM zur Förderung einer raschen Zellteilung bevorzugt ein Auxin (z. B. ca. 0,5 mg/l bis ca. 5,0 mg/l 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure [2,4-D] oder Dicamba) ein. Die Cytokinin-Konzentrationen werden für die meisten Genotypen zur initialen Kallusinduktion, insbesondere für rekalzitrante Genotypen (wie zum Beispiel die Gerste-Genotypen Galena, Morex oder Harrington) niedrig gehalten, weil hohe Cytokinin-Konzentrationen die initiale Wachstumsrate des Kallus vermindern (hohe Cytokinine greifen auch störend in die Selektion unter Verwendung von Bialaphos ein, obwohl nicht dann, wenn Hygromycin oder G418 verwendet wird). Ein Cytokinin verbessert jedoch die Kallusqualität und Regenerationsfähigkeit und kann die Inzidenz für Albinismus reduzieren (d. h. es induziert das Wachstum von mehr grünen regenerationsfähigen Geweben). Deshalb können niedrige Konzentrationen eines Cytokinins in das CIM eingeschlossen werden, wie z. B. 6-Benzylaminopurin (BAP), Zeatin, Kinetin, etc., bevorzugt BAP oder Kinetin bei Konzentrationen von ca. 0,01 mg/l bis ca. 1,0 mg/l für die initiale Kallusinduktion, ca. 0,1 mg/l bis ca. 2,0 mg/l für die Kalluserhaltung. Die optimale Cytokinin-Konzentration hängt vom Genotyp ab. CIM enthält bevorzugt auch Kupfer (ca. 0,1 μM bis ca. 50 μM).
Kallusgewebe wird in kleinere Stücke unterteilt (z. B. für Gerste sind Stücke von ca. 3 bis 5 mm bevorzugt) und subkultiviert, d. h. in regelmäßigen Abständen in frisches Medium transferiert, um optimale Wachstumsraten zu fördern. Für Gerste werden die Gewebe in einem Intervall von ca. 2–3 Wochen subkultiviert, wenn eine geringere Konzentration (ca. 0,01 mg/l) BAP verwendet wird und ca. 3–4 Wochen, wenn höhere BAP-Konzentrationen verwendet werden (ca. 0,1 mg/l bis ca. 0,5 mg/l).
Die Gewebe werden bevorzugt initial ohne Selektion kultiviert. In Beispiel 4 nachstehend wurde eine Selektion zum Beispiel nicht unmittelbar nach dem Beschuss angewendet, um die Proliferation der transformierten Zellen in Abwesenheit toter oder sterbender Zellen zu erlauben, die aus der Verwundung oder Selektion resultieren (ca. 1–2 Wochen, wenn immature Embryos als eine Zielquelle verwendet werden und 3–4 Wochen, wenn grüne Gewebe verwendet werden). Nach dieser Zeitspanne wird Selektion zum Selektieren transformierter Zellen angewendet. Die Selektion kann durch Zufügen eines Selektivmittels zum Kulturmedium begleitet sein, wofür die Fremd-DNA in transformierten Zellen Resistenz verleiht (vorausgesetzt, dass ein selektierbarer Marker an der Fremd-DNA eingeschlossen ist) Vermutliche Transformanten werden im Vergleich zu nicht transformiertem Gewebe anhand ihres schnelleren Wachstums auf dem Selektivmedium identifiziert. Screenbare Marker (z. B. grünes fluoreszierendes Protein) können auch zur Identifikation von transformiertem Gewebe verwendet werden.
Transformierte Gewebe werden bevorzugt initial auf CIM im Dunkeln erhalten (z. B. wie in Beispiel 3 für ca. 3–4 Wochen auf CIM), dann unter Schwachlicht-Bedingungen (für Gerste ca. 10 bis 30 μE) kultiviert. Es wurde gefunden, dass die Verwendung von Schwachlicht-Bedingungen die Regeneration von Albinogerstenflanzen (wie in Wan und Lemaux, 1994, beobachtet) reduziert oder eliminiert.
Für Gerste erscheinen embryogene Strukturen als schnell wachsende glänzende, leicht braunfarbene, noduläre, kompakte Strukturen. Unter Schwachlicht erscheinen diese Strukturen oft als multiple Meristem-ähnliche Strukturen mit kleinen grünen Sprossen. Im Gegensatz dazu fehlen bei nicht transformierten Geweben im Allgemeinen die nodulären Strukturen, und sie sehen wässrig, lose und brüchig oder rund und langsam wachsend aus. Nachdem embryogene Strukturen in dem vermutlich transformierten Gewebe beobachtet werden, wird das Gewebe an ein „Intermediär-Inkubationsmedium" (IIM) überführt. Die Inkubation des Gewebes auf einem IIM erlaubt fortgesetztes rasches Wachstum, wenngleich auch langsamer als auf CIM. Die Inkubation auf einem IIM verbessert die Wahrscheinlichkeit der Bildung regenerationsfähiger Strukturen und die Kompetenz zur Regeneration durch Förderung des Übergangs vom Entwicklungsweg eines Pflanzengewebes von einer embryogenen zu einer organogenen Route.
IIM supprimiert die Verlängerung von Sprossen und kann zur Erhaltung und Proliferation grüner Sektoren oder grüner vegetativer Strukturen über lange Zeitspannen verwendet werden, bis sie Größen und Zahlen erreicht haben, die für die Regeneration angemessen sind (mit Gerste können beispielsweise grüne Regenerationsgewebe bestimmter Genotypen länger als zehn Monate auf DBC2-Medium (dessen Zusammensetzung nachstehend angegeben wird), mindestens ca. acht Monate für Golden Promise, Galena und Harrington und mindestens ca. vier bis sechs Monate für Morex erhalten werden).
IIM schließt zur fortgesetzten Zellproliferation bevorzugt ein Auxin (ca. 0,5 mg/l bis ca. 2,5 mg/l 2,4-D oder Dicamba) ein. IIM schließt bevorzugt auch hohe Cytokinin-Konzentrationen (z. B. ca. 0,1 mg/l bis ca. 2,0 mg/l BAP) und höhere Kupfer-Konzentrationen (z. B. ca. 0,1 μM bis ca. 50 μM, bevorzugt ca. 5 bis ca. 30 μM) ein. Die höhere Cytokinin-Konzentration reduziert die Zellteilungsrate, fördert aber die Progression zur Regenerationskompetenz und könnte die Albinismus-Inzidenz reduzieren.
Die Kupfer-Konzentrationen im IIM sind bevorzugt mindestens so hoch wie die Konzentrationen in MS-Medium (0,1 μM, Murashige und Skoog, 1962), bevorzugt mindestens um das 5 fache höher, bevorzugter mindestens um das 10 fache, noch bevorzugter mindestens um das 20 fache, am bevorzugtesten mindestens um das 50 fache höher. Optimale Kupfer-Konzentrationen variieren mit dem Genotyp und der Spezies. Höhere Kupfer-Konzentrationen fördern eine verbesserte Kallusqualität und Regenerationsfähigkeit ohne Reduktion der Kallus-Induktionsfrequenz oder der initialen Kalluswachstumsrate. Hohe Kupfer-Konzentrationen könnten eine geringere Wirkung oder keine Wirkung haben, wenn sie im Regenerationsmedium enthalten sind.
Der Begriff „Kupfer" soll hierin jegliche bekannten Kupfer-Nährstoffquellen für Pflanzenkulturmedien, wie z. B. Kupfer(II)-sulfat, einschließen.
Die Wirkungen von Kupfer und BAP auf die Regenerationsfähigkeit tramsformierter Gerstengewebe scheint mehr als additiv zu sein, d. h. es scheint eine synergistische Wirkung vorzuliegen, wenn das IIM sowohl hohe Kupfer- als auch hohe BAP-Konzentationen einschließt.
Es ist aufgrund der transkriptionalen und translationalen Inaktivierungsphänomene und der somaklonalen Variation wünschenswert, eine große Anzahl von Pflanzen aus einer einzelnen unabhängig transformierten Kalluslinie zu generieren. In kommerziellen Getreidesorten hat sich beispielsweise die Anzahl der Transformanten, die aus üblichen Transformationsprotokollen resultiert, bei den Bemühungen als limitierend erwiesen, genetische Manipulation zum Erlangen der Fruchtverbesserung einzusetzen. Die Inkubation von transformiertem Kallus auf einem IIM vor dem Transfer an ein Regenerationsmedium maximiert die Frequenz, bei der individuelle Transformationsereignisse Anlass zu transformierten Pflanzenlinien geben. Die Verwendung eines Zwischeninkubationsschrittes erhöhte die Regenerationsfrequenz für Golden Promise bis zu mindestens 65% und resultierte in einer Zunahme der Anzahl der pro Kallusstück produzierten transformierten Pflanzen bis zum 11,4fachen.
Transformiertes Gewebe kann vom IIM an Bewurzlungs- oder Regenerationsmedium überführt werden, wenn embryogene Strukturen beobachtet werden (für Gerste in Abhängigkeit von dem Genotyp und der Wachstumsrate nach ca. 3 bis 4 Subkultivierungsrunden oder ca. 9–16 Wochen nach Beschuss). Die Selektionsperiode sollte nicht länger sein, wenn BAP in CIM und IIM verwendet wird (ca. 3–4 Monate für Golden Promise und ca. 4–6 Monate für Galena).
"Regenerationsmedium" (RM) fördert die Differenzierung totipotenter Planzengewebe in Sprosse, Wurzeln und andere organisierte Strukturen und schließlich in Pflänzchen, die in Erde transferiert werden können. Es ist häufig bevorzugt, ein Sprossungsmedium zur Förderung der Sprossregeneration aus embryogenen Strukturen und ein getrenntes Bewurzlungsmedium zur Förderung der Wurzelbildung einzusetzen. In Abhängigkeit vom Genotyp stellen verschiedene Auxin-Konzentrationen (z. B. 2,4-D) und ein Cytokinin (z. B. BAP) optimale Ergebnisse bereit. Für viele Gerste-Genotypen enthält RM BAP (ca. 0–8 mg/l) ohne Auxin. Die Regeneration von Morex wird jedoch durch den Zusatz von Auxin (2,4-D) zum RM verbessert. Als Regenerationsmedien werden übliche Sprossungs- und Bewurzlungsmedien angesehen.
Jedwedes bekannte Regenerationsmedium kann zur praktischen Ausführung der erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Für Gerste ist das FHG-Medium (Hunter, 1988, und in Kasha et al., 1990, beschrieben) bevorzugt.
Andere CIM-, IIM- und RM-Beispiele gehen aus den nachstehenden Beispielen hervor.
Wie hierin verwendet verweist "Pflanzenkulturmedium" auf jedwedes Medium, das im Fach zur Unterstützung der Lebensfähigkeit und des Wachstums einer Pflanzenzelle oder -gewebes oder zum Wachstum ganzer Pflanzenexemplare verwendet wird. Solche Medien schließen im Allgemeinen definierte Komponenten ein, einschließlich, aber nicht beschränkt darauf Makronährstoffverbindungen, die Nährstoffquellen aus Stickstoff, Phosphor, Kalium, Schwefel, Calcium, Magnesium und Eisen Mikronährstoffe, wie zum Beispiel Bor, Molybdän, Mangan, Kobalt, Zink, Kupfer, Chlor und Iod Kohlenhydrate (bevorzugt Maltose für Gerste, obwohl Saccharose für einige Spezies besser rein könnte Vitamine; Phytohormone, Selektionsmittel (für transformierte Zellen oder Gewebe, z. B. Antibiotika oder Herbizide) und Geliermittel (z. B. Agar, Bactoagar, Agarose, Phytagel, Gelrite usw.) ein und können nicht definierte Komponenten einschließen, einschließlich, aber nicht beschränkt darauf Kokosnussmilch Caseinhydrolysat, Hefeextrakt und Aktivkohle. Das Medium kann entweder fest oder flüssig sein, obwohl festes Medium bevorzugt ist.
Jedwedes übliche Pflanzenkulturmedium kann, wenn angemessen ergänzt, als eine Basis für die Formulierung von CIM, IIM und RM verwendet werden. Außer den in den nachstehenden Beispielen besprochenen Medien (z. B. MS-Medium und FHG-Medium) sind eine Anzahl dieser Basalpflanzenkulturmedien kommerziell von Sigma (St. Louis, MO) und anderen Anbietern in einer trockenen (pulverigen) Form zur Rekonstitution beispielsweise mit Wasser erhältlich.
Jedwedes bekannte Auxin oder Cytokinin kann bei der erfindungsgemäßen. praktischen Ausführug verwendet werden. Auxine schließen 2,4-D, Dicamba, Indolessigsäure und Naphthalinessigsäure ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Cytokinine schließen BAP, Kinetin, Zeatin, Zeatinribosid und N⁶-(2-Isopentenyl)adenin (2iP) ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Wie aus den nachstehenden Beispielen hervorgeht, kann ein bestimmter Genotyp oder eine Spezies optimal auf ein spezifisches Phytohormon ansprechen.
ALBINISMUS. Albinismus stellt in der Gerstengewebekultur ein häufiges Problem dar (Kaff und Kasha, 1984; Kasha et al., 1990; Jähne et al., 1991). Albinismus wird von einer Anzahl von Faktoren, einschließlich des genetischen Hintergrunds (Foroughi-Wehr et al., 1982), des physiologischen Zustandes der Spenderpflanzen (Goldenstein und Kronstadt, 1986), der Bialaphos-Exposition (Wan und Lemaux, 1994), der Länge der Zeit in Kultur (Bregitzer et al., 1995) und der Kulturbedingungen (Kao et al., 1991) beeinflusst.
Wan und Lemaux (1994) berichteten, dass von 91 transgenen Kalluslinien, die durch Partikelbeschuss verschiedener Zielgewebe generiert wurden, 36 Linien grüne Pflanzen und 41 nur Albinopflanzen ergaben. Lemaux et al. (1996) berichteten, dass von 73 durch Partikelbeschuss generierten transgenen Kalluslinien 37 Linien grüne Pflanzen und 20 nur Albinopflanzen ergaben.
Die hierin besprochenen verbesserten Verfahren reduzieren signifikant die Albinismus-Inzidenz unter zuvor berichtete Grade. Der prozentuale Anteil vermutlicher Transformationsereignisse, die zur Produktion grüner transformierter Gerstenpflanzen (und nicht Albinopflanzen) regenerieren, d. h. die Anzahl der Transformationsereignisse, die grüne Pflanzen ergeben, dividiert durch die Gesamtzahl der Transformationsereignisse, die grüne und Albinopflanzen ergeben × 100%, beträgt mindestens ca. 60%, bevorzugt mindestens ca. 75% und am bevorzugtesten mindestens ca. 90%.
Die hierin beschriebenen Verfahren vermindern auch die mit der induzierten erblichen Mutation und somaklonalen Variation einhergehenden Probleme, die aus der Langzeiterhaltung von Pflanzengewebe in Kultur resultieren können.
„PFLANZE". Der Begriff „Pflanze" umfasst transformierte Pflanzen, Nachkommen von diesen transformierten Pflanzen und Teile von Pflanzen, einschließlich Reproduktionseinheiten einer Pflanze. Frucht, Blüten, Samen, Pollen usw. Die erfindungsgemäßen Transformationsverfahren und Zusammensetzungen sind auf jeden Genotyp der Gerste (z. B. Morex, Harrington, Crystal, Stander, Moravian III, Galena, Salome, Steptoe, Klages, Baronesse usw.), des Weizens (z. B. Bobwhite, Anza und Yecora Rojo), des Hafers (GAF-30/Park) und des Rasen-/Futtergrases (z. B. Flechtstraußgras, Wiesenrispe, Ausläufer-Rotschwingel, Rohrschwingel und Knaulgras usw.) sowie andere Spezies monokotyledoner Pflanzen (z. B. Mais, Reis usw.) oder dikotyledoner Pflanzen (z. B. Tomaten, Kartoffel, Sojabohnen, Baumwolle, Tabak usw.) anwendbar.
Eine „Reproduktionseinheit" einer Pflanze ist jedweder totipotente Teil oder jedwedes Gewebe der Pflanze, aus dem ein Nachkomme der Pflanze erhalten werden kann, einschließlich zum Beispiel Samen, Ableger, Knollen, Knospen, Zwiebeln, somatische Embryos, Mikrosporen, kultivierte Zellen (z. B. Kallus- oder Suspensionskulturen) usw.
NUKLEINSÄUREN
„ISOLIERT". Eine „isolierte" Nukleinsäure ist eine, die weitgehend von anderen Nukleinsäuresequenzen in der Zelle des Organismus, in der die Nukleinsäure natürlich vorkommt, d. h. anderer chromosomaler und extrachromosomaler DNA oder RNA, abgetrennt oder gereinigt ist. Der Begriff umfasst auch rekombinante Nukleinsäuren und chemisch synthetisierte Nukleinsäuren.
„FUNKTIONSFÄHIG VERKNÜPFT". Nukleinsäuren können in Pflanzen oder Pflanzenzellen unter Kontrolle eines funktionsfähig verknüpften Promotors, der zum Antreiben der Expression in einer Zelle einer bestimmten Pflanze fähig ist, exprimiert werden. Eine erste Nukleinsäuresequenz ist „funktionsfähig" mit einer zweiten Nukleinsäuresequenz verknüpft, wenn die erste Nukleinsäuresequenz in eine funktionelle Beziehung mit der zweiten Nukleinsäuresequenz gebracht wird. So ist zum Beispiel ein Promotor funktionsfähig an eine Codierungssequenz gebunden, wenn sich der Promotor auf die Transkription oder Expression der Codierungssequenz auswirkt. Im Allgemeinen folgen funktionsfähig, verknüpfte DNA-Sequenzen unmittelbar aufeinander und gegebenenfalls, um zwei Proteincodierungsregionen zur Herstellung eines Hybridenproteins zu verbinden.
„REKOMBINANT". Eine „rekombinante" Nukleinsäure wird durch eine artifizielle Kombination aus zwei anderweitig getrennten Sequenzsegmenten, z. B. durch chemische Synthese oder durch Manipulation isolierter Nukleinsäuresegmente durch übliche genetische Manipulationsverfahren, hergestellt.
VEKTOREN, TRANSFORMATION, WIRTSZELLEN. Nukleinsäuren können in rekombinante Nukleinsäurekonstrukte, in der Regel DNA-Konstrukte, eingebaut werden, die dazu fähig sind, in eine Wirtszelle eingeführt zu werden und darin zu replizieren. Ein derartiges Konstrukt ist bevorzugt ein Vektor, der Sequenzen einschließt, die zur Transkription und Translation einer Polypeptid-kodierenden Sequenz in einer bestimmten Wirtszelle fähig sind (und kann ein Replikationssystem einschließen, obwohl dies für die Monokotyledonen-Transformation üblicherweise verwendete direkte DNA-Einführungsverfahren nicht erforderlich ist).
Für die erfindungsgemäße praktische Ausführung werden übliche Zusammensetzungen und Verfahren zur Herstellung und Verwendung von Vektoren und Wirtszellen, wie u.a. in Sambrook et al., 1989, oder Ausubel et al., 1992, besprochen, eingesetzt.
Eine zur stabilen Transformation von Pflanzenzellen oder für die Etablierung transgener Pflanzen geeignete Anzahl von Vektoren wurde z. B. in Pouwels et al., 1987, Weissbach und Weissbach, 1989, und Gelvin et al., 1990, beschrieben. Pflanzenexpressionsvektoren schließen typischerweise zum Beispiel ein oder mehrere klonierte Pflanzengene unter der transkriptionalen Kontrolle von 5'- und 3'-Regulationssequenzen und einen dominanten selektierbaren Marker ein. Solche Pflanzenexpressionsvektoren können auch eine Promotor-Regulationsregion (z. B. eine Regulationsregion kontrollierende, induzierbare oder konstitutive umwelt- oder entwicklungsregulierte oder zell- oder gewebespezifische Expression), einen Startort zur Transkriptionsinitiierung, einen Ribosomenbindungsort, ein RNA-Processing-Signal, einen Transkriptionsterminierungsort und/oder ein Polyadenylierungssignal enthalten.
Beispiele konstitutiver Pflanzenpromotoren, die zur Expression von Genen in Pflanzenzellen nützlich sind, sind der Blumenkohl-Mosaikvirus (CaMV)-35S-Promotor, Mais-Ubiquitin-(Ubi-1)-Promotor, Reis-Actin-(Act)-Promotor, Nopalinsynthase-Promotor und der Octopinsynthase-Promotor, sind aber nicht beschränkt darauf. Eine Reihe verschiedener Pflanzengen-Promotoren, die als Antwort auf Umwelt-, hormonale, chemische und/oder Entwicklungssignale reguliert werden, können auch zur Expression von Fremdgenen in Pflanzenzellen, einschließlich Promotoren, die durch Hitze (z. B. Hitzeschock-Promotoren), Licht (z. B. Erbsen-rbcS-3A- oder Mais-rbcS-Promotoren oder den Chlorophyll-a/b-Bindungsprotein-Promotor); Phytohormonen, wie zum Beispiel Abscisinsäure; Verwendung (z. B. Wunl); Anaerobiose (z. B. Adh); und Chemikalien, wie zum Beispiel Methyljasminat, Salicylsäure oder Safeners, verwendet werden. Es kann zum Beispiel auch vorteilhaft sein, bekanntee organspezifische Promotoren, wie zum Beispiel Endosperm-,Embryo-, Wurzel-, Phloem- oder Trichom-spezifische Promotoren einzusetzen.
Pflanzenexpressionsvektoren schließen optional RNA-Processing-Signale, wie zum Beispiel Introns ein, die ober- oder unterstromig von einer Polypeptid-kodierenden Sequenz im Transgen positioniert sein können. Die Expressionsvektoren können außerdem auch zusätzliche regulatorische Sequenzen aus der 3'-untranslatierten Region von Pflanzengenen, wie z. B. eine 3'-Terminatorregion zur Erhöhung der mRNA-Stabilität der mRNA, wie zum Beispiel die PI-II-Terminatorregion von Kartoffeln oder die Octopin- oder Nopalinsynthase-3'-Terminatonegionen, einschließen.
Diese Vektoren schließen im Allgemeinen auch ein oder mehrere dominante selektierbare Marker-Gene, einschließlich der Antibiotikaresistenz kodierenden Gene (z. B. Hygromycin-, Kanamycin-, Bleomycin-, G418-, Streptomycin-, Paromomycin- oder Spectinomycin-Resistenz) und Herbizid-Resistenz-Gene (z. B. Resistenz gegen Phosphinothricin-Acetyltransferase oder Glyphosat) ein, um die Manipulation in Bakteriensystemen zu fördern und auf transformierte Pflanzenzellen zu selektieren.
Screenbare Marker, einschließlich Farbmarker, wie zum Beispiel Gene, die β-Glucuronidase (gus) kodieren, oder Anthocyanin-Produktion oder Fluoreszenz-Marker, wie zum Beispiel die Luciferase oder grünes Fluoreszenzprotein (GFP) kodierenden Gene werden auch zur Pflanzenzelltransformation verwendet. Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, die lediglich zur Erläuterung des besten nunmehr bekannten Modus zur erfindungsgemäßen praktischen Ausführung beabsichtigt sind, besser verstanden werden. Der erfindungsgemäße Umfang ist nicht als einschränkend hierfür anzusehen.
BEISPIELE
BEISPIEL 1: VERBESSERUNG DER KALLUSQUALITÄT UND REGENERATIONSFÄHIGKEIT IN DEN GERSTE-GENOTYPEN GOLDEN PROMISE UND GALENA
MATERIALIEN UND VERFAHREN
PFLANZENMATERIAL. Spenderpflanzen für immature Embryos wurden in Erde unter kontrollierten Bedingungen in Wachstumskammern wie beschrieben gezüchtet (Wan und Lemaux, 1994; Lemaux et al., 1996).
Wie in anderen nachstehenden Beispielen angemerkt wird, wurden Pflanzen im Gewächshaus gezüchtet (immature Embryos, die in den Wachstumskammern gezogen werden, sind für die grüne Gewebekultur bevorzugt). Das Gewächshaus hatte eine zusätzliche Beleuchtung, die eine 14-stündige Fotoperiode mit Temperaturen von 15 bis 18°C bereitstellte. Zusätzliche 1000-Watt-Metallhalogenleuchten wurden eingeschaltet, wenn der Lichtgrad im Gewächshaus weniger als 1000 μE/ms betrug. Das Dach wurde mit Jalousien abgedeckt, wenn die Außenlichtgrade über 7000 μE/ms anstiegen.
Frühjahrsgerste-Kultivare (Hordeum vulgare L.), Golden Promise und Galena, wurden als Spendenpflanzen verwendet. Galena-Samen wurde von B. Treat, Coors Brewing Company, Golden, CO, bezogen. Golden Promise-Samen wurde von P. Bregitzer, USDA-ARS Small Grains Germplasm Center, Aberdeen, ID, bezogen.
MEDIEN. Kallus-Induktionsmedium (CIM) ist MS-Medium (Murashige und Skoog, 1962} ergänzt mit 30 g/l Maltose, 1,0 mg/l Thiamin-HCl, 0,25 g/l Myoinositol, 1,0 g/l Caseinhydrolysat, 0,69 g/l Prolin und verfestigt mit 3,5 g/l Phytagel (Sigma, St. Louis, MO). CIM wurde mit vierzehn verschiedenen Kombinationen aus zwei Auxinen (Dicamba und 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure [2,4-D]) und zwei Cytokininen (6-Benzylaminopurin [BAP] und Zeatin), wie aus Tabelle 1 ersichtlich ist, verwendet, und das ergänzte Medium wurde auf Kallusinduktion, Kallusqualität, Wachstumsrate und Regenerationsfähigkeit getestet.
Regenerationsmedium (RM) ist FHG-Medium (Hunter, 1988; Kasha et al., 1990), ein modifiziertes MS-Medium mit weniger NHN₄O₃ und hohem Glutamin, ergänzt mit 1 mg/l BAP und mit 3,0 g/l Phytagel verfestigt. Die Zusammensetzung des FHG-Mediums beträgt 165 mg/l NHN₄O₃, 1,90 g/l KNO₃, 440 mg/l CaCl₂·2H₂O, 370 mg/l MgSO₄·7H₂O, 170 mg/l KH₂PO₄, 16,9 mg/l MnSO₄·H₂O, 8,6 mg/l ZnSO₄·7H₂O, 6,2 mg/l H₃BO₃, 0,83 mg/l KI, 0,25 mg/l NaMo₂O₄·2H₂O. 25 μg/l CuSO₄·5H₂O, 25 μg/l CoCl₂·6H₂O, 0,4 mg/l Thiamin-HCl, 100 mg/l Inositol, 730 mg/l Glutsunin, 62 g/l Maltose, 27,8 mg/l FeSO₄·7H₂O, 33,5 mg/l Na₂EDTA, 1,0 mg/l BAP, 3 g/l Phytagel, pH 5,6.
KALLUSINDUKTION UND SCORING. Immature Embryos (ca. 1,5–2,5 mm groß) wurden aus ca. 3 Monate alten Spikes entnommen, die 7 min in 20 Vol-% Bleiche (5,25% Natriumhypochlorit) oberflächensterilisiert wurden, dreimal 5 min mit sterilem Wasser gewaschen, längs halbiert und auf CIM gegeben wurden. Zehn Halbembryos wurden auf CIM, ergänzt mit jeweils jeder der vierzehn Phytohormon-Kombinationen, getestet; jede Behandlung wurde in Dreifachbestimmung durchgeführt. (Ganzembryos können auch verwendet werden.) Die Kallus-Induktionsfrequenz wurde durch Zählen der Anzahl der Halbembryos, die sich einer Kallusinduktion unterzogen, unter einem Lichtmikroskop 2 bis 3 Wochen nach der initialen Kultivierung gemessen.
Es wurden zwei Embryogrößen getestet: Kleine (0,5 – 1,5 mm) und große (1,5 – 2,0 mm). Golden Promise ist bei der Kallusinduktion mit Embryos sowohl kleiner als auch großer Größe gut, die Kallusinduktion ist jedoch mit Embryos kleiner Größe von Galena sehr schlecht.
KALLUSWACHSTUMSRATE. Zur Bestimmung der Kalluswachstumsraten wurden zehn Halbembryos mit der Scutellum-Seite nach unten auf eine Petrischale mit jedem Medium gebracht; jede Behandlung wurde in Dreifachbestimmung durchgeführt. Alle 2 bis 3 Wochen wurden Kallusstücke gewogen, und die Kalluswachstumsrate wurde durch Wiegen der Platte mit den Kallusstücken vor dem Trans er (W₁) und nach dem Transfer des gesamten Gewebes (W₂) bestimmt. Das relative Wachstum des Kallus wurde als die Gewichtsveränderung (W) des Kallus (W = W₁ – W₂) dividiert durch das Gewicht des ursprünglich ausplattierten Gewebes (W₁) und der Anzahl der Kulturtage (g/g Frischgewicht/Tag) berechnet. Ab dem dritten Transfer wurden drei Stücke der höchsten Qualität anstelle aller Kalli von jedem Embryo auf frisches Medium überführt. Alle Kalli, die nicht überführt wurden, wurden aus der Platte entfernt, um W₂ zu erhalten.
KALLUSQUALITÄT. Die Kallusqualität (Morphologie und Farbe) wurde 2 bis 3 Wochen nach der initialen Kallusinduktion mikroskopisch beurteilt. Für die Morphologie wurde ein Score von + + + + (höchste Qualität) an glänzenden, kompakten, nodulären Kallus vergeben; ein Score von + (geringste Qualität) wurde an weichen, brüchigen Kallus vergeben. Die Farbe wurde von leicht braunfarbenem Kallus (+ + + +) bis weiß (+) beurteilt.
REGENERATION. Zum Testen der Regeneration wurden zehn Kallusstücke der höchsten Qualität (8 bis 11 mg pro Stück) aus jeder Behandlung an RM in Dreifachbestimmung zu verschiedenen Zeiten während der Kulturperiode überführt. Die Platten wurden bei 24 ± 1°C unter Fluoreszenzleuchten (45 bis 55 μE, 16 h hell/8 h dunkel) gebracht. Die Zahl der Sprosse pro Kallusstück wurde über 22–25 Tage nach dem Transfer gezählt. (Ein Blatt oder mehrere Blätter von der gleichen grünen Gewebebasis wurden als ein Spross erachtet.)
ERGEBNISSE
INDUKTIONSFREQUENZ, RELATIVE WACHSTUMSRATE UND QUALITATIVES AUSSEHEN DES KALLUS. Zur Untersuchung der Wirkungen verschiedener Konzentrationen und Auxin- und Cytokinintypen auf die Kallus-Induktionsfrequenz, Qualität und relative Wachstumsrate wurden 14 verschiedene Medien getestet (Tabelle 1, linke zwei Spalten). Auf den meisten Medien waren die Kallus-Induktionsfrequenzen für Golden Promise und Galena statistisch nicht unterschiedlich; Dicamba und 2,4-D allein und Dicamba mit Zeatin bei allen Konzentrationen resultierten in fast 100% Induktionsfrequenzen für beide Genotypen. Golden Promise wies eine signifikant höhere Kallus-Induktionsfrequenz als Galena auf 3 der 14 getesteten Medien auf: Dicamba + 0,1 mg/l BAP, Dicamba + 0,5 mg/l BAP und 2,4-D + 0,5 mg/l BAP. Galena wies eine signifikant höhere Kallus-Induktionsfrequenz als Golden Promise auf nur einem Medium, 2,4-D + 0,01 mg/l Zeatin, auf. Mit Galena führten höhere BAP-Konzentrationen in Kombination mit 2,4-D oder signifikanter in Kombination mit Dicamba, zu niedrigeren Kallus-Induktionsfrequenzen.
Die Kallusinduktion aus Embryos von Golden Promise trat über den größten Teil der Oberfläche des Scutellums auf, während der Kallus von Galena aus einem viel kleineren Bereich des Embryos produziert wurde.
Die Farbbeurteilungen der beiden Genotypen auf dem gleichen Medium waren identisch. Im Allgemeinen war jedoch die Kallus-Morphologie von Golden Promise besser als die von Galena auf fast allen getesteten Medien (Tabelle 1). Gewisse Trends in der Morphologie wurden für beide Genotypen erkannt. Erstens, Kultivieren auf Medium, das BAP in Kombination mit entweder 2,4-D oder Dicamba enthält, produzierte eine bessere Kallus-Morphologie als Kultivieren auf Medium, das Zeatin mit entweder 2,4-D oder Dicamba enthält (Tabelle 1). Zweitens, die Kallus-Farbe in beiden Genotypen wurde vom Cytokinintyp dramatisch beeinflusst (Tabelle 1). Zunehmende BAP-Konzentrationen (mit dem einen oder anderen Auxin) führte zur Bildung von einem schwächer braunfarbenen Kallus, wohingegen Yeatin in allen Konzentrationen (mit dem einen oder anderen Auxin) zur Bildung eines weißen Kallus von schlechter Qualität führte (Tabelle 1). Drittens, Medium, das höhere BAP-Konzentrationen (0,1 bis 0,5 mg/l mit 2,4-D) enthielt, schien die Produktion von Kallus einer höheren Qualität (Morphologie und Farbe) zu unterstützen, als dies mit der niedrigeren BAP-Konzentration (0,01 mg/l) mit beiden Genotypen der Fall war (Tabelle 1).
In der ersten Wachstumsperiode wurde die Bestimmung der Wachstumsrate durch die rasche Zunahme des Frischgewichts des Ausgangsmaterials aufgrund der Imbibition des Embryos erschwert. Beim dritten Transfer nahm die relative Wachstumsrate rasch zu, wobei sie ihr Maximum erreichte (1). Die Wachstumsraten fielen nach der vierten Wachstumsperiode signifikant ab. Für beide Genotypen waren die Wachstumsraten auf Medien mit BAP im Allgemeinen langsamer als in Abwesenheit von BAP oder in Anwesenheit von Zeatin. Golden Promise schien auf Medien, die Dicamba plus BAP und 2,4-D +/– BAP enthielten, schneller zu wachsen als Galena. Beide Genotypen wuchsen schneller auf Medium, das 2,4-D plus BAP enthielt, als auf Medium, das Dicamba plus BAP enthielt (außer Galena bei 0,5 mg/l BAP). Auf Medium, das 2,4-D oder Dicamba in Kombination mit Zeatin enthielt, schien bezüglich der Wachstumsrate wenig Variation zwischen Genotypen vorzuliegen. Die Verwendung niedriger Zeatin-Konzentrationen (0,01 oder 0,1 mg/l) in Kombination mit Dicamba oder 2,4-D schien die Kallus-Wachstumsrate von Golden Promise im Vergleich zum Wachstum auf Dicamba oder 2,4-D allein nicht zu inhibiern, und die Kombination niedriger Zeatin-Konzentrationen mit 2,4-D schien die Kallus-Wachstumsrate von Galena bis zur vierten Wachstumsperiode im Vergleich zu 2,4-D allein zu steigern (1).
PFLANZENREGENERATION. Die auf den vierzehn verschiedenen Medien gezüchteten Kalli von Golden Promise und Galena wurden auf ihre Fähigkeit, Pflanzen zu regenerieren, getestet. Im Allgemeinen produzierte Golden Promise zu den meisten Zeitpunkten, auf den meisten Medien eine höhere Anzahl grüner Kalli (NC) und grüner Sprosse (NS) pro 10 initiale Kallusstücke als Galena (vergleiche Tabellen 2 und 3). Außerdem schien Kallus von Galena die Regenerationsfähigkeit bei einer schnelleren Rate zu verlieren als Golden Promise, außer auf Kallus-Induktionsmedien, die BAP in Kombination mit 2,4-D enthalten, in welchem Fall Galena bei allen BAP-Konzentrationen günstiger als Golden Promise ansprach.
Für Golden Promise (Tabelle 2) produzierten alle Behandlungen bis zum fünften Transfer vergleichbare Anzahlen grüner Kalli, während 2,4-D plus 0,01 und 0,5 mg/l BAP die höchsten Sprosszahlen zu ergeben schienen. In den meisten Fällen nahmen die Sprosszahlen und grünen Kalli nach entweder dem fünften oder siebten Transfer dramatisch ab. Einer der dramatischsten Verluste trat bei dem siebten Transfer mit der Verwendung von Dicamba allein auf, indem keine grünen Kalli beobachte wurden. Wenige Medien unterstützten die Regeneration von Pflanzen beim neunten Transfer. Nur Dicamba und 2,4-D plus 0,1 mg/l BAP und 2,4-D plus 0,5 mg/l Zeatin unterstützten die Langzeitregenerationsfähigkeit von Sprossen in Golden Promise.
Für Galena (Tabelle 3) auf Medium, das entweder (1) Dicamba oder 2,4-D mit Zeatin oder (2) Dicamba in Kombination mit BAP enthielt, ging die Fähigkeit zum Generieren grüner Sprosse schneller als bei Golden Promise verloren. Die einzigen Medien, welche die Langzeiterhaltung des Grünens und der Regeneration von Pflanzen (7. Transfer und darüber hinaus) unterstützen, war 2,4-D plus BAP bei allen Konzentrationen. Medien, die 0,1 mg/l BAP enthielten, schienen zum letzten Zeitpunkt optimal zu sein und unterstützten eine schnellere Kallus-Wachstumsrate als Dicamba plus einer vergleichbaren BAP-Konzentration (1).
Für beide Genotypen unterstützte Medium, das BAP in Kombination mit 2,4-D enthielt (und in einem geringeren Ausmaß Dicamba), die Entwicklung multipler Sprosse aus den glänzendem, kompakten Kallusgeweben (Tabellen 1–3), während sich wenige oder keine Sprosse auf einem Medium entwickelten, das 2,4-D allein enthielt.
DISKUSSION
In diesen Experimenten waren die Zusammensetzung des Mediums und die Phytohormontypen und -Konzentrationen wichtige Faktoren bei der Bestimmung der Gewebekulturreaktionen. Gewisse Verallgemeinerungen können bezüglich der Wirkungen verschiedener Cytokinine auf die Eigenschaften des proliferierten Kallus gemacht werden. Obwohl Zeatin enthaltendes Medium schnellere Wachstumsraten zu unterstützen schien, produzierte Medium, das Zeatin (plus 2,4-D oder Dicamba) enthielt, auch Kallus von geringerer Qualität (weich, hellfarbig) im Vergleich zu Medium, das BAP (plus 2,4-D oder Dicamba) enthielt (Tabelle 1).
Die nachteiligen Wirkungen von Zeatin können auch durch Vergleich des Regenerationspotenzials von Kalli von beiden Genotypen gesehen werden, das auf Medium, das eines von beiden, BAP oder Zeatin, enthielt, gezüchtet wurde. Kalli, die auf Medium gezüchtet wurden, das Zeatin (von 0,01 bis 0,5 mg/l) enthielt, waren weniger regenerationsfähig als Kalli, die auf Medium gezüchtet wurden, das BAP enthielt, und sich auf dem gleichen RM regenerierten (Tabellen 2 und 3). Dieser Befund steht im Gegensatz zu dem von Lürz und Lörz (Theor. Appl. Genet. 75: 16–25, 1987), die zeigten, dass IAA in Kombination mit Zeatin und Zeatinribosid (0,05 mg/l) die Regenerationsfrequenz somatischer Embryos aus den Gerste-Genotypen Golden Promise und Dissa erhöhten, während höhere Konzentrationen die Regeneration reduzierten. Es wurde gezeigt, dass andere Cytokinine, wie zum Beispiel BAP, Kinetin und 2iP, eine Verbraunung des Kallus und Nekrose der somatischen Embryos verursachten. Es wurde auch gezeigt, dass Medien, die IAA und Zeatin enthielten, die Regenerationsfähigkeit von immaturen Embryos hergeleitetem Kallus von Hordeum spontaneum und H. bulbosum verbesserte (Breimann, Plant Cell Rep., 4: 161–163, 1985). Die Tatsache, dass wir keine positive Wirkung von Zeatin auf diese Gewebekulturreaktion von Golden Promise und Galena beobachteten, kann auf die speziellen Gerste-Genotypen, die verschiedenen Auxine (Dicamba und 2,4-D), die wir einsetzten, oder andere Modifikationen in unseren Kulturverfahren zurückzuführen sein.
Im Gegensatz zu Zeatin verminderte der Zusatz von BAP zu 2,4-D-enthaltendem Medium das Wachstum des weichen, brüchigen Kallus und erhöhte die Frequenz von embryogenem, glänzendem; kompaktem und leicht braunfarbenem Kallus, der höher regenerationsfähig war (Tabelle 1). In vielen Fällen ergaben Kalli, die auf Medien gezüchtet wurden, die niedrige BAP-Konzentrationen (0,01 oder 0,1 mg/l) in Kombination mit 2,4-D enthielten, die größten Anzahlen regenerierter Sprosse für einen speziellen Genotyp; mit Galena verlängerte 2,4-D + BAP die Regenerationsperiode für grüne Pflanzen. Das Auxin 2,4-D wird am häufigsten für die embryogene Kallusbildung in Getreidepflanzen verwendet, der Zusatz von Cytokinin zu dem 2,4-D kann, abhängig von der Pflanzenspezies und den Genotypen, signifikant sein (Übersicht von Bhaskaran und Smith, Crop Sci., 30: 1328–1336, 1990). In jüngerer Zeit wurden multiple Sprosse aus exzidierten apikalen Spross-Meristemen in Mais (Zhong et al., Planta, 187: 483–489, 1992) und Hafer (Zhang et al., J. Plant Physiol., 148: 667–671, 1996) differenziert, die auf BAP und 2,4-D kultiviert wurden. Diese Wirkung von BAP auf die Regeneration von Sprossen ist auch konsistent mit vorherigen Beobachtungen an Wiesenrispe (Griffin und Dibble, Plant Cell Rep., 14: 721–724, 1995) und Flechtstraußgras (Zhong et al., Plant Cell Rep., 10: 453–456, 1991), bei denen höhere Frequenzen der Sprossregeneration aus sich von Samen herleitendem Kallus erreicht wurden, wenn Auxin (Dicamba oder 2,4-D) und BAP für Auxin allein substituiert wurden.
In unserer Studie spiegelte sich die positive Wirkung von BAP in Kombination mit 2,4-D auch in der Kallusqualität (Tabelle 1) wider. Glänzender, kompakter und leicht braunfarbener Kallus produzierte grüne Pflanzen. Kompakter, hellfarbener Kallus war regenerationsfähig, produzierte aber im Allgemeinen Albinopflanzen. Weicher, brüchiger Kallus war nicht regenerationsfähig. Sowohl für Golden Promise als auch Galena verminderte die Zugabe von BAP (in Kombination mit entweder 2,4-D oder Dicamba) das Wachstum des weichen, brüchigen, weißen Kallus und erhöhte den Anteil von kompaktem, leicht braunfarbenem regenerationsfähigem Kallus in Bezug auf kein Cytokinin oder vergleichbare Zeatin-Konzentrationen (Tabelle 1).
Kalli von Golden Promise, die auf Medium gezüchtet wurden, das 0,01 mg/l BAP in Kombination mit 2,4-D enthielt, regenerierte fast die größten (vierten/siebten Transfers) oder äquivalente (fünfte) Zahlen grüner Sprosse in Bezug auf die anderen Medien (Tabelle 2). Kalli, die auf Medium gezüchtet wurden, das 0,1 mg/l BAP mit 2,4-D enthielt, produzierten weniger (und kürzere) grüne Sprosse als Medien mit 0,01 mg/l bei allen außer den dritten und neunten Transfers (Tabelle 2). Für Galena produzierte das Wachstum auf Medium, das 2,4-D mit 0,1 mg/l BAP enthält, Kallus, der die meisten grünen Pflanzen bei allen Transferzeiten außer der dritten ergab (Tabelle 3). Wenn Kalli mit kleinen, grünen, kompakten Sprossen zum zweiten Mal aus Medium, das 2,4-D und 0,1 mg/l BAP enthielt, auf frisches Regenerationsmedium überführt wurde, wurde mehr Gewebe mit multiplen Sprossen gesehen, als wenn 0,01 mg/l BAP verwendet wurde. Es ist möglich, dass das BAP-enthaltende Medium das Kallusgewebe veranlasste, über verlängerte Perioden in einem regenerationsfähigen Zustand zu proliferieren.
Die negativen Wirkungen der Länge der Zeit in Kultur auf das Regenerationspotenzial wird auch in dieser Studie dokumentiert. Auf allen Medien produzierten immature Embryos von Golden Promise schnell wachsenden, embryogenen Kallus, der bei hohen Frequenzen über Zeitspannen von bis zu zwei Monaten (fünfter Transfer) nach der initialen Kallusinduktion zu grünen Pflanzen führte (Tabelle 1 und 2; 1). Nach dem fünften Transfer begannen die Kalli von Golden Promise ihr Regenerationpotenzial zu verlieren (Tabelle 2). Galena verlor auf allen getesteten Medien, außer den Medien, die 2,4-D plus BAP enthielten (Tabelle 3) die Regenerationsfähigkeit viel rascher als Golden Promise, wobei die Regenerationsfähigkeit auf den meisten Medien nach dem vierten Transfer abnimmt. Deshalb führten längere Zeitspannen des Kultivierens im Dunkeln zu einer niedrigeren Gesamtzahl regenerierter grüner Pflanzen von Golden Promise wie auch Galena (Tabellen 2 und 3), wobei die Verluste bei Galena ausgeprägter sind.
Die Kulturzeit schien sich auch auf den Albinismus auszuwirken. Im Vergleich zu Golden Promise traten kleinere Anzahlen grüner Kalli in Galena-Kulturen zu späteren Zeitpunkten (siebten, neunten) auf den meisten Medien auf (Tabellen 2 und 3). Einige Albinopflanzen wurden bei späteren Transferzeiten aus Golden Promise produziert. Wenn Galena jedoch auf dem gleichen Medium für die gleiche Zeitdauer kultiviert wurde, produzierte es größere Anzahlen an Albinopflanzen. Die Neigung von Galena zu Albinismus wird auch anhand der während der Regenerationstests erhobenen Daten von 1 Monat alten Kalli von Golden Promise und Galena, die auf 2,4-D (2,5 mg/l) in Kombination mit BAP (0,1 mg/l) gezüchtet wurden, gestützt. Aus diesem Material wurden 70 bis 80% der GP-Zellen unter Schwachlicht-Bedingungen (10 bis 20 μE) grün, wohingegen weniger als 20% der Zellen aus einer vergleichsweise gealterten Galena-Kultur Grünungspotenzial aufwiesen.
Folglich weisen die Zeitdauer in Kultur und genotypischen Unterschiede dramatische Wirkungen auf den Albinismus und daher auf die Fähigkeit zur Regeneration grüner Pflanzen auf.
Die Embryogröße stellt einen anderen wichtigen Faktor dar, der sich auf die Kallus-Induktionsfrequenzen auswirkt. Die optimale Embryogröße variiert mit dem Genotyp. Die Verwendung von Embryogrößen größer als 2,5 mm von beiden Genotypen resultierte in geringen Kallus-Induktionsfrequenzen. Galena-Embryos einer Größe von 0,5 bis 1,2 mm wiesen sehr geringe Kallus-Induktionsfrequenzen (< 20%) auf, während Embryos von Golden Promise der gleichen Größe eine Frequenz von über 90% aufwiesen. Die höchsten Kallus-Induktionsfrequenzen mit Golden Promie wurden mit von 0,5 bis 2,0 mm großen Kalli in Verbindung gebracht, während die optimale Größe für Galena 1,5 bis 2,0 mm betrug. Die Wirkung der Größe auf die Kallus-Induktionsfrequenz ist möglicherweise auf die Wirkungen der exogen angewendeten Hormone auf die Entwicklungskaskaden zurückzuführen, die bei einem immaturen Embryo einer bestimmten Größe und der Entwicklungsflexibilität des bestimmten Genotyps getriggert werden.
Die Induktionsfrequenz, Qualität und Regenerationsfähigkeit von Kallus in Gerste werden von einer Reihe verschiedener Faktoren, wie zum Beispiel der Zusammensetzung der Medien (Bregitzer, 1992; Dahleen, 1995; Handel et al., 1985; Lürz und Lörz, 1987), Phytohormone (Hagio et al., 1995; Ziauddin und Kasha, 1990; Lürz und Lörz, 1987), der Zeitdauer in Kultur (Lürz und Lörz, 1987; Bregitzer et al., 1995), der Embryogröße (Baillie et al., 1993; Ziauddin und Kahsa, 1990; Dale und Dambrogio, 1979) und dem Genotyp (Dahleen, 1996; Baillie et al., 1993; Bregitzer, 1992; Lürz und Lörz, 1987; Goldenstein und Kronstadt, 1986; Handel et al., 1985) ab. Wir haben diese Beobachtungen bestätigt und auf das transformierbare Gerste-Kultivar, Golden Promise, und eine rekalzitrante kommerzielle Gerstenvarietät, Galena, erweitert.
Unter Verwendung eines zuvor veröffentlichten Transformationsprotokolls, das ein Medium mit 2,5 mg/l Dicamba und keinem Cytokinin einsetzte (Wan und Lemaux, 1994) erhielten wir mit Galena große Anzahlen transformierter Zelllinien, alle Linien ergaben jedoch nur Albinopflanzen. Wir haben optimale Kombinationen und Auxin- und Cytokinin-Konzentrationen zur Herstellung von regenerationsfähigem Kallus der höchsten Qualität von Golden Promise und Galena während verlängerter Gewebekulturperioden erhalten. Für beide Genotypen wurde ermittelt, dass 2,4-D in Kombination mit BAP (zwischen ca. 0,01 und ca. 0,1 mg/l) zur Verlängerung der Regenerationsfähigkeit und der Herstellung der höchsten Anzahlen grüner Kalli und Sprosse optimal sind. Diese Phytohormon-Bedingungen können zwecks optimaler Ergebnisse mit anderen Gerste-Genolypen sowie für andere Pflanzen-Spezies angepasst werden.
BEISPIEL 2: HOCHFREQUENZ-PFLANZENREGENERATION AUS TRANSGENEN UND NICHT TRANSGENEN KALLUSGEWEBEN VON GERSTE
MATERIALIEN UND VERFAHREN
KALLUSINDUKTION UND -ERHALTUNG. Die Kallusinduktion wurde wie vorstehend beschrieben unter Verwendung von CIM mit 2,5 mg/l 2,4-D oder Dicamba (kein Cytokinin) durchgeführt. Nach dreiwöchiger Inkubation bei 24 ± 1°C im Dunkeln wurde der Kallus in kleine Stücke (ca. 3 bis 4 mm) zerschnitten, dann auf dem gleichen Medium mit dem Anlegen vom Subkulturen in dreiwöchentlichen Intervallen erhalten.
PLASMIDE. Das Plasmid ppGlbGus-6 (Liu, 1994) enthält das uidA-(gus)-Reportergen unter der Kontrolle des Maisembryo-spezifischen Globulin-(Glbl)-Promotors (enthaltend 1,38 kb oberstromig vom Transkriptionsstartort) und terminiert durch das Nopalinsynthase-3'-Polyadenylierungssignal (nos) von Agrobacterium tumefaciens. Das Plasmid pdGlbGUS-6 wurde durch (1) Aufschließen von ppGlb1GUS mit EcoRI zur Erhaltung eines 2,54-kb-Fragmentes mit 0,37 kb des Globulin-Promotors, uidA-Reportergens und nos-Terminators und (2) Ligieren des 2,54-kb-Fragmentes in den Vektor pUC19 konstruiert. Plasmid pAHC20 enthält das bar-Gen von Streptomyces hygroscopicus unter der Kontrolle des Mais-Ubiquitin-Ubil-Promotors und ersten Introns (Christensen und Quail, 1996) und gefolgt von der 3'-untranslatierten Region und nos.
MIKROPROJEKTIL-BESCHUSS UND TRANSFORMATION. Die Gerste-Transforrnation über den Mikropartikel-Beschuss wurde wie beschrieben durchgeführt (Wan und Lemaux, 1994).
REGENERATION ÜBER EINEN ZWISCHENINKUBATIONSSCHRITT. Zehn zwei Monate alte nicht transgene Kalli, die auf CIM, ergänzt mit entweder 2,4-D oder Dicamba im Dunkeln gezüchtet wurden, wurden entweder direkt oder nach der Inkubation auf einem IIM an RM überführt.
Es wurden zwei verschiedene IIM, DBC2 und DBC3, verwendet. DBC2-Medium ist CIM mit 2,5 mg/l 2,4-D, 0,1 mg/l BAP und 5,0 μM Kupfer (Kupfer(II)-sulfat). DBC3-Medium ist CIM mit 1,0 mg/l 2,4-D, 0,5 mg/l BAP und 5,0 μM Kupfer. Nach dem 3- bis 4-wöchigen Züchten von Kalli auf diesen Medien unter Schwachlicht-Bedingungen (20 bis 30 μE; 16 h hell/8 h dunkel) wurde die Anzahl von Kalli gezählt, die grüne Sektoren oder grüne regenerationsfähige Strukturen produzieren. Grüne Sektoren und kleine grüne regenerationsfähige Strukturen wurden darin an frisches RM überführt und unter höherer Lichtintensität (45–55 μE) gezüchtet. Nach 3–4 Wochen wurden die Anzahlen grüner Sprosse pro Kallusstück gezählt. Für die Regeneration transgener Zelllinien wurden sieben bis zehn transgene Kallistücke entweder direkt an jedes Medium (mit 4–5 mg/l Bialaphos) überführt oder nach einer Inkubation auf ein IIM überführt, dann unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend für nicht transgene Kalli beschrieben gezüchtet. Jede Behandlung schloss Vierfachbestimmungen des Regenerationstests für nicht transgene Kalli, aber nur eine Wiederholungsbestimmung für transgene Kalli ein.
ERGEBNISSE
Die auf CIM mit bzw. ohne Bialaphos gezüchteten transgenen und nicht transgenen Kalli, wurden entweder direkt oder nach Inkubation auf einem IIM auf RM überführt. Es lag kein signifikanter Unterschied unter den Behandlungen hinsichtlich der Anzahlen nicht transgener und transgener Kalli von Golden Promise vor, die 3–4 Wochen nach dem Transfer grüne Sektoren produzierten (Tabellen 4 und 6).
Multiple grüne Sprosse wurden sowohl aus transgenen als auch nicht transgenen Kalli induziert, wenn entweder DBC2 oder DBC3 als ein IIM verwendet wurde. Die Inkubation auf einem IIM resultierte in multiplen grünen Strukturen von 2,4-D und BAP und noch mehr Strukturen aus der Behandlung, einschließlich erhöhter Kupferkonzentrationen. Kalli auf entweder DBC2 oder DBC3 bildeten multiple grüne Sprosse aus den Meristem-ähnlichen Strukturen; es wurden keine Albinopflanzen beobachtet. Die meisten der grünen Sektoren, die direkt auf RM ohne Zwischeninkubationsschritt entstanden, regenerierten weniger als zwei Sprosse pro grünen Sektor, während grüne Sektoren, die auf einem IIM wuchsen, 2–5 Sprosse pro grünen Sektor produzierten (Tabelle 4). CIM mit 2,4-D war bei der Regeneration grüner Sprosse besser als Kallus aus Medium mit Dicamba (Tabelle 4). Die Frequenz der Spross-Regeneration war um das 5,6 fache bis 6,4 fache für nicht transgene Kalli erhöht, die auf BCI-DM (Gerstenkallus-Induktionsmedium [Wan und Lemaux, 1994] mit 2,5 mg/l Dicamba) unter Verwendung eines Zwischeninkubationsschrittes initiiert und erhalten wurden (Tabelle 4). Auf BCI-2,4-D (Gerstenkallus-Induktionsmedium [Wan und Lemaux, 1994) mit 2,5 mg/l 2,4-D) gezüchtete Kalli wiesen eine Spross-Regenerationsfrequenz auf, die um das ca. 2,3fache bis 3,4fache bezüglich des Ansprechens auf den Zwischeninkubationsschritt erhöht waren. Die direkt auf RM regenerierten Pflänzchen wuchsen jedoch schneller als Pflänzchen, die mit einem Zwischeninkubationsschritt gezüchtet wurden.
In der vierten bis sechsten Selektionsrunde wurden fünf unabhängige transgene Linien auf Regeneration grüner Sprosse mit oder ohne einen Zwischeninkubationsschritt getestet (Tabelle 6). Die transgenen Linien wurden auf Selektionsmedium (BCI-DM plus 5 mg/l Bialaphos) erhalten, dann auf FHG (+4 mg/l Bialaphos) mit oder ohne einen Zwischenschritt, erhalten. Nach 3–4 Wochen wurden die Anzahlen grüner Flecke gezählt, und die regenerationsfähigen Gewebe wurden auf frisches FHG-Medium (+4 mg/l Bialaphos) überführt. Nach weiteren drei Wochen wurden die Anzahlen grüner Sprosse gezählt. Die Regenerationsfähigkeit grüner Sprosse variierte in Abhängigkeit von der transgenen Linie; die Frequenz der Regeneration grüner Sprosse aus transgenen Kalli, die mit einem Zwischeninkubationsschritt kultiviert wurden, nahm um das 2,8- bis 11,4 fache zu (Tabelle 6). Nur die Linie GPGlbGUS-13 produzierte keine grünen Pflanzen, selbst nicht mit einem Zwischeninkubationsschritt.
DISKUSSION
Zwei verschiedene Medien, DBC2 und DBC3, wurden für einen Zwischeninkubationsschritt zur Verbesserung der Regenerationsfähigkeit transgener und nicht transgener Kallusgewebe von Golden Promise verwendet. Es wurden unter den Behandlungen hinsichtlich der Anzahlen transgener und nicht transgener Kalli, die grüne Sektoren produzieren, kein signifikanter Unterschied nachgewiesen (Tabellen 4 und 6). Der Transfer von Gewebe auf DBC2 oder DBC3 induzierte jedoch die Bildung multipler grüner Strukturen, was letztendlich in einer größeren Anzahl von Pflanzen aus jedem Stück resultierte.
Auf Kallus-Induktionsmedium mit Auxin allein (entweder 2,4-D oder Dicamba) gezüchtete Kalli produzieren grüne Sektoren oder grüne Strukturen aus nur kleinen Bereichen von jeder Kalluskultur. In vielen Fällen generieren diese grünen Sektoren auf RM keine Pflänzchen, möglicherweise aufgrund ungenügender auf RM generierter Zellzahlen, um Anlass zu ganzen Pflänzchen zu geben. Wenn ein Zwischeninkubationsschritt verwendet wird, ist die Anzahl grüner Sektoren oder Strukturen, die Pflänzchen generieren, erhöht. Die Verwendung von 2,4-D in Kombination mit BAP in dem Zwischenschritt könnte die Regeneration durch Ermöglichung der Proliferation grüner, totipotenter Zellen, die zur Bildung von Pflanzen fähig sind, verbessern.
Nicht transgener Gerstenkallus, der auf Kallus-Induktionsmedium mit 2,4-D oder Dicamba allein gezüchtet wurde und transgener Kallus, der auf CIM mit Dicamba und Bialaphos selektiert wurde, produzieren multiple Spross-Meristem-ähnliche Strukturen, wenn sie anschließend auf Intermediär-Inkubationsmedium mit BAP, 4-D und Kupfer (50x) unter Schwachlicht-Bedingungen überführt wurden (Tabellen 4 und 6). Diese Meristem-ähnlichen Strukturen produzieren in der Folge multiple Sprosse. Im Gegensatz dazu produziert Medium mit BAP allein nur einen oder wenige Sprosse pro grünen Sektor. Folglich fördert ein IIM mit einem geeigneten Auxin, BAP, und Kupfer zur Behandlung des Kallus die Produktion multipler grüiner Meristem-ähnlicher Strukturen und daraus resultierender Pflänzchen.
Zwischen DBC2 und DBC3 (Tabellen 4 und 6) wird kein signifikanter Unterschied bezüglich der Regenerationsfähigkeit beobachtet; die Kallusstruktur bestimmte vielmehr selbst das Outcome. Im Allgemeinen ist DBC2-Medium geeigneter für Kallus mit grünen Sektoren kleinerer Größe als DBC3-Medium. DBC-Medium inhibiert das Wachstum von Sprossen, grüne Sektoren oder grüne Strukturen können jedoch erhalten werden und proliferierten auf diesem Medium für eine lange Zeitdauer, bis sie eine Größe erreicht haben, die zur Regeneration geeignet ist. Grüne Gewebe von beispielsweise Goldene Promise, Galena, Harrington und Salome können zum Beispiel länger als 10 Monate (länger als 4–6 Monate für Morex) erhalten werden. Diese Gewebe produzieren multiple grüne Sprosse mit einer-Reihe von 9–17 Sprossen pro grünes Gewebestück, das 4–6 mm groß ist. Wenn keimende Gewebe nach 3–4 Wochen auf RM in 3–4 Stücke zerbrochen und auf frisches Medium überführt wurden, wurde eine noch größere Anzahl von Sprossen aus den kleinen embryogenen Strukturen, in denen sich bisher noch keine Sprosse gebildet hatten, produziert.
Obwohl die Verwendung des Zwischeninkubationsschrittes die Regenerationsfähigkeit erhöhte, lagen noch Transformationsereignisse vor, die nicht regenerierbar waren. So produzierte zum Beispiel die GPGlbGUS-13-transgene Linie, möglicherweise aufgrund der Transformation einer einzelnen ursprünglich nicht regenerierbaren Zelle oder des frühen Verlustes der Regenerationsfähigkeit während des Kultivierens des Kallus, keinerlei grüne Pflanzen. Die Verwendung eines Zwischeninkubationsschrittes so früh wie möglich während des Regenerationsverfahrens reduzierte auch die Albinismus-Inzidenz. Durch Anwendung dieses Zwischeninkubationsschrittes in früheren Selektionsstufen erhielten wir grüne, transgene Pflanzen aus einem rekalzitranten kommerziellen als Galena bezeichneten Kultivar, ein Ergebnis, das unter Verwendung veröffentlichter Verfahren nicht erreichbar war.
Im Vergleich zu früheren Verfahren (Wan und Lemaux, 1994) erhöhte die Verwendung eines Zwischeninkubationsschrittes die Frequenz der Sprossregeneration um ca. das 2,3 fache bis ca. 11,4 fache für nicht transgene und transgene Kalli von Golden Promise und verbesserte die Kultivierungs- und Regenerationsfähigkeit anderer rekalzitranter kommerziell wichtiger Genotypen, wie zum Beispiel der nordamerikanischen Mälzungskultivare, Harrington und Morex (sieh Tabelle 5).
TABELLE 4. Regeneration nicht transgener Kallusgewebe von Golden Promise
TABELLE 5. Regeneration nicht transgener Kallusgewebe von Morex
TABELLE 6. Regeneration transgener Kallusgewebe von Golden Promise
BEISPIEL 3: REDUKTION DER GENOTYP-BEGRENZUNG UND DES ALBINISMUS: TRANSFORMATION DES GERSTE-GENTOYPS GOLDEN PROMISE UND DES REKALZITRANTEN GERSTE-GENOTYPS GALENA
MATERIALIEN UND VERFAHREN
PFLANZENMATERIAL. Spendenpflanzen für immature Embryos wurden in Erde unter kontrollierten Bedingungen in Wachstumskammern wie beschrieben (Wan und Lemaux, 1994; Lemaux et al., 1996) oder, wie vorstehend angemerkt wurde, im Gewächshaus gezüchtet (in den Wachstumskammern gezüchtete immature Embryos sind für grüne Gewebekulturen bevorzugt, obwohl die Verwendung von im Gewächshaus gezüchtetem Pflanzenmaterial nicht notwendig ist).
Das Gewächshaus verfügte über zusätzliche Beleuchtung, die eine 14-stündige Fotoperiode mit Temperaturen von 15 bis 18°C bereitstellte. Zusätzliche 100-Watt-Metallhalogenleuchten wurden eingeschaltet, wenn der Lichtgrad im Gewächshaus weniger als 1000 μE/ms betrug. Dachjalousien bedeckten das Dach, wenn die Außenlichtgrade über 7000 μE/ms anstiegen.
KALLUSINDUKTION UND GRÜNE EMBRYOGENE GEWEBEPRODUKTION. Immature zygotische, ca. 1,5 bis 2,5 mm große Embryos wurden präpariert und intakt unter einem Präparationsmikroskop aus Samen, die 10 min in 20 Vol-% Bleiche (5,25% Natriumhypochlorit) oberflächensterilisiert wurden, gefolgt von dreimaligem Waschen in sterilem Wasser, isoliert. Die Embryos wurden mit der Scantellumseite nach unten auf CIM gebracht.
Zum Testen der Kallus-Induktionsfrequenzen und Kallusqualität wurden sechs verschiedene CIM verwendet. Die CIM wiesen respektive unterschiedliche Konzentrationen auf von: 2,4-D (1,0 und 2,5 mg/l), BAP (0,01, 01 und 0,5 mg/l) und Kupfer(II)-sulfat (CuSO₄: 0,01 und 5,0 μM), wie aus Tabelle 7 ersichtlich ist.
DBC1-Medium, bei dem es sich um CIM mit 2,5 mg/l 2,4-D, 0,01 mg/l BAP und 5,0 μM CuSO₄ handelt, wurde für die initiale Kallus-Induktionsperiode mit Golden Promise verwendet. DBC2-Medium wurde für die initiale Kallus-Induktionsperiode mit Galena und Salome verwendet.
Fünf bis sieben Tage nach der Kallusinitiierung wurden keimende Sprosse und Wurzeln aus dem kallusbildenden Scutellum mittels manueller Exzision entfernt. Nach 3- bis 4-wöchiger initialer Inkubation im Dunkeln bei 24 ± 1°C wurde embryogener Kallus aus dem Scutellum in kleine Stücke (ca. 3–4 mm) zerschnitten, an frisches DBC2-Medium (Golden Promise und Galena) überführt und unter Schwachlicht-Bedingungen (ca. 10 bis 20 μm 16 h Licht) gezüchtet. Nach weiteren drei Wochen (beim zweiten Transfer) wurden grüne kallusbildende Sektoren selektiert, in zwei bis drei Stücke zerbrochen (jedes jeweils 3–4 mm groß) und an frisches DBC2-Medium überführt.
Grüne regenerationsfähige Gewebe von Golden Promise und Salome wurden auf DBC2-Medium, von dem in drei- bis vierwöchentlichen Intervallen Subkulturen angelegt wurden, erhalten.
DBC3-Medium wurde aus dem zweiten Transfer für Galena verwendet, und das Anlegen von Subkulturen fand in drei- bis vierwöchentlichen Intervallen statt.
PFLANZENREGENERATION. Sieben Stücke von vier Monate altem grünem regenerationsfähigem Gewebe (ca. 4–6 mm) wurde auf festes RM ausplattiert und einer Lichtintensität von ca. 30 bis 50 μE ausgesetzt. Nach 25 Tagen wurden die Anzahl grüner Gewebe, die Sprosse produzierten und die Anzahl der Sprosse pro grünes Gewebestück gezählt. Eine einzelne Basis grünen Gewebes mit mehr als einem Blatt wurde als ein Spross erachtet.
Regenerierte Sprosse wurden an Bewurzlungsmedium (CI-Medium ohne Hormone) in Magenta^®-Kasten (Magenta Corporation, Chicago, IL) überführt. Wenn der Spross den oberen Teil des Kastens erreichte (ca. 3–4 Wochen) wurden die Pflänzchen in 6-Inch-Töpfe, die Supersoil^TM enthielten (R. McClellan, S., San Francisco, CA), überführt, schrittweise akklimatisiert und bis zur Maturität im Gewächshaus gezüchtet.
PLASMID. Das Plasmid pAHC25 schließt das uidA-(gus)-Reportergen und ein selektierbares Gen, nos, jedes jeweils unter der Kontrolle des Mais-Ubiquitin-Ubil-Promotors und Introns 1 und durch nos terminiert ein (Christensen und Quail, 1996).
DNA-PARTIKELBESCHUSS. Intakte Gerstenembryos wurden oberflächensterilisiert, mit der Scutellumseite nach unten platziert und auf CIM, entweder ergänzt mit 2,5 mg/l 2,4-D und 5,0 μM CuSO₄ (DC-Medium) oder ergänzt mit 2,5 mg/l 2,4-D und 0,1 μM CuSO₄ (D-Medium) gezüchtet.
Einen Tag nach der Exzision von Galena-Embryos bei 24 ± 1°C im Dunkeln wurden die Embryos mit der Scutellumseite nach oben zur osmotischen Vorbehandlung auf CIM, das keine Maltose enthielt, aber 0,2 M Mannitol und 0,2 M Sorbitol einschloss, überführt. Vier Stunden nach der Behandlung mit dem Osmotikum wurden die Embryos, wie beschrieben, beschossen (Lemaux et al., 1996). In Kürze zusammengefasst beinhaltete dies die Beschichtung von 1 μm großen Goldpartikeln (Analytical Scientific Instruments, Alameda, CA) mit Plasmid-DNA, gefolgt vom Beschuss unter Verwendung eines PDS-1000/He Biolistic-Systems (Bio-Rad, Inc., Hercules, CA) bei 900 psi. 16–18 Stunden nach dem Beschuss wurden die Embryos mit der Scutellumseite nach unten auf DC-Medium (kein Bialaphos) gegeben und bei 24 ± 1°C 10 bis 14 Tage im Dunkeln gezüchtet.
SELEKTION UND REGENERATION VON TRANSFORMIERTEM GEWEBE. Nach einer initialen 10-bis 14-tägigen Kultivierungsperiode wurde jeweils jeder kallusbildende Embryo, abhängig von der Kallusgröße, in zwei oder drei Stücke (jedes jeweils in ca. 4–5 mm) zerbrochen, an DBC2-Medium, ergänzt mit 4 mg/l Bialaphos überführt und im Dunkeln inkubiert. Zwei Wochen nach dem zweiten Transfer (Selektion der ersten Runde) wurde Kallus an neues DBC2-Medium mit 4 mg/l Bialaphos überführt, und 7 bis 14 Tage später wurden Kalli in Schwachlicht-Bedingungen (ca. 10 μE, 16 h Licht) gebracht. Die Kalli wurden bis zum vierten Transfer auf dem gleichen Medium erhalten. Beim fünften Transfer wurden die Kalli an DBC3-Medium, ergänzt mit 4 mg/l Bialaphos gebracht. Von den Kulturen wurden in zweiwöchentlichen Intervallen auf DBC3-Medium mit 4 mg/l Bialaphos Subkulturen angelegt, bis die Bildung grüner Strukturen auftrat, zu welchem Zeitpunkt sie auf festes RM mit 3 mg/l Bialaphos zur Regeneration ausplattiert und einer höheren Lichtintensität (ca. 30–50 μE) ausgesetzt wurden. Nach 3–4 Wochen auf RM wurden die regenerierten Sprosse an Magenta^®-Kasten mit Bewurzlungsmedium (CI-Medium mit 0,1 μM Kupfer ohne Hormone), ergänzt mit 2–3 mg/l Bialaphos überführt. Wenn die Sprossen den oberen Teil des Kastens erreichten, wurden die Pflänzchen wie vorstehend beschrieben behandelt.
HISTOCHEMISCHER GUS-ASSAY. Die GUS-Aktivität wurde histochemisch wie beschrieben bestimmt (Jefferson et al., 1987).
PCR-ASSAY. Die Polymerase-Kettenreaktionsanalyse (PCR-Analyse) wurde unter Verwendung von aus Kalli oder Blättern extrahierter genomischer DNA durchgeführt. Zur Bestätigung der Anwesenheit des bar-Gens, Bar5F und Bar1R, wurden zwei Primer-Sets verwendet (Lemaux et al., 1996). Ein anderer Primer-Set wurde zur Bestätigung der Anwesenheit des gus-Gens, uidA1 und uidA2R, verwendet (Cho et al., 1996). Amplifikationen wurden in einem 25-μl-Reaktionsvolumen mit 10x PCR-Puffer, 25 mM MgCl₂, 2,5 mM dNTPs, 20 μM von jedem Primer mit 0,25 μl Taq-DNA-Polymerase (Promega) durchgeführt. Das Zyklieren wurde durch einen mit den folgenden Bedingungen programmierten Thermocycler kontrolliert: 1 min Denaturierungsschritt bei 94°C; 10 Zyklen bei: 94°C für 45 sec., 60°C für 0,1–0,5 min/Zyklus, 72°C für 1 min und 26 Zyklen bei: 94°C für 45 sec., 55°C für 1 min, 72°C für 1 min. Für den abschließenden Zyklus betrug die Dauer des Extensionsschrittes 7 min bei 72°C. 25 μl des PCR- Produktes mit Loading-Farbstoff wurde auf einem 0,8%igen Agarosegel mit Ethidiumbromid elektrophoriert und mittels UV-Licht nachgewiesen.
DNA-HYBRIDISIERUNGSANALYSE. Aus Blattgewebe einer nicht transformierten Kontrollpflanze isolierte genomische DNA und T₀ und T₁-Pflanzen von transgenen Linien wurden mit Xbal und entweder Sacl oder Pstl aufgeschlossen. Der Aufschluss mit Xbal und Sacl setzt ein intaktes 1,8 kb-uidIA-(gus)-Fragment frei; der Aufschluss mit Xbal und Pstl setzt ein intaktes 0,6 kb bar-Fragment frei. Für die Geletektrophorese wurde jede Lane mit 10 μg von jedem Aufschluss beladen. Nach dem Southern-Transfer wurde der resultierende Blot mit einer mit ³²P-markierten uidA- oder bar-Sonde beladen.
ERGEBNISSE
INITIALE KALLUSINDUKTION UND WACHSTUM. Die initiale Kallus-Induktionsfrequenz wurde unter Verwendung von CIM in verschiedenen Zusammensetzungen bestimmt. Zehn immature Embryos von den Gerste-Genotypen Golden Promise und Galena wurden auf das jeweilige CIM überführt. Jedes CIM enthielt die folgenden Hormon- und Kupferkonzentrationen: D: 2,5 mg/l 2,4-D und 0,1 μM CuSO₄; DC: 2,5 mg/l 2,4-D und 5,0 μM CuSO₄; DB: 2,5 mg/l 2,4-D, 0,1 mg/l BAP, 0,1 μM CuSO₄; DBC1: 2,5 mg/l 2,4-D, 0,01 mg/l BAP und 5,0 μ/l CuSO₄; DBC2: 2,5 mg/l 2,4-D, 0,1 mg/l BAP und 5,0 μM, CuSO₄; DBC3: 1,0 mg/l 2,4-D, 0,5 mg/l BAP und 5,0 μM CuSO₄. Die Kallusqualität wurde mikroskopisch beurteilt und auf einer Skala bewertet, wobei + + + + + die höchste Qualität und + die geringste Qualität kennzeichnet. Die Werte wurden drei Wochen nach der initialen Kallusinduktion gemessen und stellen Mittelwerte von Dreifachbestimmungen für jede Behandlung dar. Golden Promise wies ungeachtet der CIM-Zusammensetzung eine hohe Kallus-Induktionsfrequenz auf (>87%, Tabelle 7). Galena wies auf CIM ohne BAP eine hohe Kallus-Induktionsfrequenz (>90%) auf. Die Gewebequalität war auf CIM mit BAP drei Wochen nach der Induktion schlecht, verbesserte sich aber nach zwei bis drei Transfers auf diesem Medium. Nur eine Fraktion aus Scutellar-Geweben auf immaturen Galena-Embryos bildeten Kallus, während der größte Teil der Scutellar-Oberfläche auf immaturen Embryos von Golden Promise Kallus hoher Qualität bildete.
Galena wies eine ähnliche oder geringgradig höhere initiale Kalluswachstumsrate im Vergleich zu Golden Promise auf, wenn es auf D-Medium (CIM mit 2,4-D allein) oder DC-Medium (CIM mit 2,4-D und erhöhten Kupferkonzentrationen) gezüchtet wurde (Tabelle 7). Die Steigerung der Kupferkonzentrationen auf 5,0 μM (50x) änderte die Kallus-Induktionsfrequenz oder die initiale Kalluswachstumsrate in dem einen oder anderen Genotyp nicht, die Kallusqualität verbesserte sich jedoch, besonders in Golden Promise. Im Vergleich zu Galena produzierten immature Embryos von Golden Promise Kallus mit einer größeren Anzahl distinkter embryogener Strukturen.
Das Zufügen von BAP zum CIM reduzierte die Kallus-Induktionsfrequenz und inhibierte das Kalluswachstum für beide Genotypen, produzierte aber Kallus einer höheren Qualität, der glänzend und kompakt war und hoch regenerationsfähige Strukturen mit multiplen Spross-Meristemen enthielt (Tabelle 7). Galena machte eine höhere BAP-Konzentration (0,1 mg/l) als Golden Promise (0,01 mg/l BAP) erforderlich, um Kallus von hoher Qualität zu erhalten (Tabelle 7). Die höhere Kupferkonzentration (50x) in Kombination mit BAP resultierte in mehr regenerationsfähigen Strukturen aus Kallus, vier eine leicht bräunliche Farbe aufweist. Wenn DBC3-Medium, das eine höhere BAP-Konzentration (0,5 mg/l) und eine niedrigere 2,4-D-Konzentration (1,0 mg/l) enthält, für die initiale Kallusinduktion verwendet wurde, trat eine hohe Rate der Embryo-Keimung und Produktion eines Kallus von schlechter Qualität mit einer langsamen Wachstumsrate auf (Tabelle 7).
PRODUKTION UND ERHALTUNG GRÜNER REGENERATIONSFÄHIGER GEWEBE. 5–20 Tage, nachdem 3–4 Wochen alter Kallus Schwachlicht ausgesetzt wurde, wurden grüne embryogene Strukturen beobachtet. Durch Kallus von Golden Promise wurde ein höherer Prozentsatz grüner Sektoren produziert als von Galena-Kallusgewebe. Sobald ein Kallus mit der entsprechenden Morphologie unter Schwachlicht-Bedingungen identifiziert wurde (grün, glänzend, nodulär, kompakt), konnten die Sektoren leicht von dem übrigen Kallus getrennt und auf entweder DBC2- oder DBC3-Medium erhalten werden. Ca. 6 bis 8 Wochen nach der Initiierung auf DBC2-Medium enthielt das Gewebe von Golden Promise einige grüne Sprosse mit multiplen Spross-Meristem-ähnlichen Strukturen, doch waren die meisten Gewebe grün, glänzend, nodulär und kompakt. Für Galena war jedoch das DBC3-Medium zur Erhaltung grüner regenerationsfähiger Gewebe optimal. Auf DBC3-Medium waren Gewebe von Golden Promise weicher und produzierten multiple Spross-Meristeme; die Keimung einiger Sprosse wurde als Ansprechen auf eine höhere BAP-Konzentration induziert. Galena-Gewebe produzierten multiple Spross-Meristeme, die auf DBC3-Medium kompakter als Gewebe von Golden Promise waren.
Folglich benötigt Galena eine höhere BAP-Konzentration (0,5 mg/l) für die Kallusinduktion und Erhaltung von grünen regenerationsfähigen Geweben von hoher Qualität als Golden Promise (0,1 mg/l). Es sollte zur Kenntnis genommen werden, dass in diesen Experimenten das verwendete Kallus-Induktionsmedium keine hohe Kupferkonzentration enthält. Die Kallusmorphologie war mit 0,1 mg/l BAP sehr gut, die Wachstumsrate hingegen sehr langsam. Wenn 50x Kupfer zugefügt wurde, schien es die Wachstumsrate zu beschleunigen. Im Vergleich zu Kallus-Induktionsmedium mit 1x Kupfer wurde eine höhere BAP-Konzentration in Kallus-Induktionsmedium, das 50x Kupfer enthält, für das optimale Wachstum von Geweben benötigt.
REGENERATION FERTILER PFLANZEN AUS GRÜNEN REGENERATIONSFÄHIGEN GEWEBEN. Sieben Stücke von grünen embryogenen Geweben, 4–6 mm groß, von jedem Genotyp wurden an RM (FHG-Medium) überführt, und nach 25 Tagen wurde die Anzahl regenerierter Sprosse gezählt. Jedes Stück ergab multiple grüne Sprosse. Nach 2–3 Wochen auf RM produzierten grüne Strukturen (4–6 mm groß) aus beiden Genotypen ca. 9–17 grüne Sprosse pro Stück auf entweder RM (Tabelle 8) oder hormonfreiem Bewurzlungsmedium. Wenn keimende Gewebe nach 3–4 Wochen in Kultur auf RM in Stücke zerbrochen und an frisches Medium überführt wurden, wurde eine noch größere Anzahl von Sprossen aus den kleinen grünen Strukturen produziert. Alle auf Regeneration getesteten vier Monate alten grünen Strukturen produzierten multiple grüne Sprosse; es wurden keine Albinopflanzen beobachtet (Tabelle 8). Regenerierte Sprosse wurden auf Bewurzlungsmedium in Magenta^®-Kasten überführt und bewurzelte Pflanzen wurden in Erde überführt und bis zur Maturität im Gewächshaus gezüchtet.
TRANSFORMATION VON GALENA. Das vorstehend beschriebene In-vitro-Kultursystem resultiert in multiplen grünen Sprossen aus immaturem, sich von Embryos herleitendem Kallus, wobei folglich die Basis für eine erfolgreiche Transformation des rekalzitranten kommerziellen Genotyps, Galena, bereitgestellt wird.
Zur Transformation wurden die Scutella von immaturen Embryos von Galena mit anschließender Kultivierung der Embryos auf DC-Medium bei Abwesenheit von Selektion beschossen. Ab dem zweiten Transfer wurden Kalli auf Selektionsmedium erhalten; in der Mitte des Transfers in der dritten Runde wurden die Kalli in Schwachlicht gebracht. Medien, die höhere BAP-Konzentrationen, niedrigere 2,4-D-Konzentrationen und 50x Kupfer (DBC3-Medium) enthalten, wurden ab dem fünften Transfer zur Selektion und Erhaltung verwendet. Im Allgemeinen wurden beim vierten bis zum fünften Transfer Bialaphos-resistente Kalli mit grünen Sektoren beobachtet. Kalli mit grünen Sektoren wurden erhalten und proliferierten, bis die grünen Sektoren vollständig entwickelte regenerationsfähige Strukturen bildeten. In den meisten Fällen, wenn sich grüne Sektoren in schnell wachsendem Kallus entwickelten, konnten vollständig entwickelte grüne regenerationsfähige Strukturen erhalten werden.
Für Galena war die Embryogröße für die Kallusinduktion sehr wichtig. Kleinere Embryos als ca. 1,2 mm resultierten in sehr schlechter Kallusinduktion (weniger als 20%). Immature Embryos, ca. 1,5 mm bis 2,0 mm groß, wiesen die höchste Kallus-Induktionsfrequenz (>90%) auf.
Dieses Verfahren zum Generieren grüner Strukturen, die multiple grüne Sprosse ergeben, wurden zur Verbesserung der Regenerationsfähigkeit transgener Kalli verwendet, die auf CM mit entweder Dicamba oder 2,4-D selektiert wurden. Grüne Sektoren wurden unter Selektion regeneriert, und die Pflänzchen wurden ca. drei Wochen nach dem Transfer an Bewurzlungsmedium in Erde überführt. Unter Verwendung dieses Transformationsprotokolls erhielten wir sechs unabhängige mit pAHC25 transformierte Galena-Linien. Drei Linien produzierten grüne Sektoren, waren regenerierbar und produzieren multiple grüne Sprosse. T₀- und T₁-Pflanzen enthielten DNA-Sequenzen, die an bar und uidA hybridisierten und das uidA-(GUS)-Reportergen und das Herbizid-Resistenz-Gen bar, wie anhand der Resistenz gegen Basta^TM beurteilt, funktionell exprimierten.
DISKUSSION
Wir haben ein sehr effizientes, reproduzierbares System zur Herstellung von hoch regenerationsfähigem Kallus entwickelt, das über sehr lange Zeitspannen hinweg zu multiplen grünen Sprossen führt (Tabelle 8), wobei das Albinismus-Problem eliminiert wird. Dieses System kann erfolgreich zur Transformation und Regenration zuvor rekalzitrant gewesener Genotypen verwendet werden.
Erstens, wir haben die Phytohormonbehandlung während der Kallus-Initiierung und -Proliferation verbessert. Immature Embryos aus Galena benötigten zur Produktion von grünem, regenerationsfähigem Gewebe von hoher Qualität höhere BAP-Konzentrationen als Golden Promise, vielleicht aufgrund von Unterschieden zwischen den beiden Genotypen in endogenen Phytohormon-Konzentrationen. Das Zufügen von BAP zu CIM mit 2,4-D verminderte die Wachstumsrate des sich von immaturen Embryos herleitendem Kallus von beiden Genotypen, verbesserte aber seine Qualität und Regenerationsfähigkeit (Tabelle 7). Es ist möglich, dass der fehlende Albinismus in dieser Studie mindestens teilweise der Verwendung von BAP zuschreibbar war.
Vor kurzem wurden In-vitro-Kultursysteme, die sich 2,4-D und BP zunutze machen, zur Differenzierung multipler Sprosse aus exzidierten apikalen Meristemen von Sprossen aus Mais (Zhong et al., 1992) und Hafer (Zhang et al., 1996) entwickelt. Wir fanden, dass die Sektoren von regenerationsfähigen Gerstenkalli von Golden Promise und Galena, die auf CIM mit 2,4-D oder Dicamba gezüchtet wurden, multiple Spross-Meristem-ähnliche Strukturen produzierten, wenn sie anschließend an ein Intermediär-Inkubationsmedium mit 2,4-D und BAP unter Schwachlicht-Bedingungen überführt wurden. Die Verwendung von 2,4-D in Kombination mit BAP stellte eine verlängerte Regenerationsfähigkeit bereit und war für andere Genotypen anwendbarer als Dicamba in Kombination mit BAP.
Andere Veränderungen der Kulturbedingungen verbesserten signifikant die Manipulation in vitro. Im Vergleich zum D-Medium verbesserte DC-Medium, das erhöhte Kupferkonzentrationen (5,0 μM, eine 50 fache Erhöhung verglichen mit dem MS-Medium) enthielt, die Kallusqualität (Tabelle 7), ohne die Kallus-Induktionsfrequenzen oder die initiale Kallus-Wachstumsrate zu verändern. Dies stellte Material von höherer Qualität aus dem initialen Selektionsschritt bereit, das zu erhöhter Regenerationsfähigkeit in transformierten Geweben führte. Außerdem resultierte die Verwendung von DBC2-Medium beim zweiten Transfer von Galena in Gewebe von höherer Qualität, das multiple Spross-Meristem-ähnliche Strukturen produzierte.
Diese Ergebnisse waren konsistent mit Studien, die erkennen ließen, dass 50 μM Kupfer (500x) für die Regenerationsfähigkeit der Gerstenvarietät Hector optimal ist, während 5,0 μM für die Regenerationsfähigkeit der Gerstenvarietät Excel optimal ist (Dahleen, 1996). Ähnliche Ergebnisse wurden für Weizen berichtet, worin die Regeneration Berichten zufolge auf Medium mit 10 μM CuSO₄ (100x) höher war als auf MS (0,1 μM Cu²⁺) (Purnhauser, 1991). In einer noch anderen Studie resultierte eine erhöhte Kupferkonzentration in mehr somatischen Embryoiden aus Antheren von tetraploidem Weizen; (Ghaemi et al., 1994).
Die Exposition von Gewebe gegenüber Licht frühzeitig im Selektionsverfahren reduzierte wahrscheinlich auch durch Induktion biosynthetischer Chlorophyllenzyme die Albinismus-Inzidenz (Holtorf et al., 1995). Das Vorliegen grüner, regenerationsfähiger Sektoren stellt sicher, dass grüne Pflanzen generiert werden, wodurch folglich die Regeneration von Albinopflanzen, wie in Wan und Lemaux (1994) beobachtet, vermindert oder eliminiert wird.
2–3 Wochen nach Inkubation von Embryos im Dunkeln auf CIM wurden glänzende, kompakte, leicht braunfarbene Kalli mit hoch regenerationsfähigen Strukturen erhalten. Für beide Genotypen wurden die Kalli an frisches Medium mit BAP, 2,4-D und Kupfer überführt, und 5–14 Tage nach der Exposition gegenüber Schwachlicht wurden grüne embryogene Strukturen gebildet. Alle vier Monate alten regenerationsfähigen Strukturen, sowohl von Golden Promise als auch Galena, regenerierten multiple grüne Sprosse (ca. 11–17 grüne Sprosse pro Kallusstück, Tabelle 8) und keine Albinopflanzen. Im Gegensatz dazu produzierte vier Monate alter Kallus von Golden Promise und Galena, der auf CIM mit entweder mg/l 2,4-D oder Dicamba allein erhalten wurde, keine grünen Sprosse (Beispiel 1); selbst zwei Monate alter Kallus von Golden Promise, der auf CIM mit 2,4-D oder Dicamba allein erhalten wurde, produzierte nur 0,35 bzw. 1,15 grüne Sprosse pro Kallusstück (Beispiel 2). Diese regenerationsfähigen Strukturen konnten auf 2,4-D, BAP und Kupfer länger als zehn Monate in diesem Zustand erhalten werden und konnten regeneriert werden, um multiple fertile grüne Pflanzen mit beiden Genotypen zu geben. Die Morphologie der durch unser Protokoll generierten grünen Gewebe war ähnlich der multiplen grünen Meristem-Wölbungen, die aus apikalen Meristemen von Sprossen nach der Kultur auf 2,4-D und BAP differenziert wurden, war aber, möglicherweise aufgrund der inhärenten Unterschiede der Gewebequelle oder der Verwendung höherer Konzentrationen von 2,4-D, kompakter.
Es wurde berichtet, dass die Kallusqualität und Kallus-Induktionsfrequenz von der Selektion entsprechend bemessener Embryos und Optimierung des physiologischen Zustandes der Spenderpflanzen abhängt (Dale und Dambrogio, 1979; Goldenstein und Kronstadt, 1986; Lürz und Lörz, 1987; Wan und Lemaux, 1994). Die grünen regenerationsfähigen Gewebe, die unter Verwendung unseres Protokolls produziert wurden, können jedoch aus einem weiteren Bereich von Embryogrößen und aus Pflanzen erhalten werden, die in entweder der Wachstumskammer oder dem Gewächshaus gezüchtet wurden; sobald grüne Gewebe aus jedweder Quelle generiert werden, können sie wie beschrieben proliferiert werden. Eine kleine Embryogröße (<1,0 mm) war bei der Kallusinduktion für golden Promise, Morex und Salome besser, Galena erforderte jedoch Embryos einer größeren Größe (1,5 bis 2,0 mm) für eine höhere Kallus-Induktionsfrequenz.
Viele Gerste-Genotypen weisen eine sehr geringe Kallus-Induktionsfrequenz auf (Lürz und Lörz, 1987; Dahleen, 1996), und das Erscheinen von Albinopflanzen und eine geringe Regenerationsfähigkeit treten innerhalb von 2,5 Monaten nach der Kallusinduktion auf (Bregitzer et al., 1995). Diese Merkmale begrenzen die Anwendbarkeit von Gerste-Transformationsverfahren für viele moderne kommerzielle Genotypen.
Frühere Bemühungen um die Transformation der kommerziellen Varietäten Moravian III und Galena produzierten große Anzahlen unabhängig transformierter Linien, ergaben aber nur nach der Regeneration Albinopflanzen. Die Veränderung der Selektionskonzentration (auf 1 mg/l Bialaphos) oder, die Verkürzung der Selektionszeit (von >5 Runden auf 3 Runden) führte zur Regeneration grüner Pflanzen, von denen gefunden wurde, dass sie nicht transformiert waren.
Die hierin beschriebenen Verfahren umgehen die Albinismus-Probleme, denen mit verlängerten Kulturperioden begegnet wird; in dieser Studie konnten Galena und Golden Promise regeneriert werden, um mehr als 10 Monate fertile grüne Pflanzen zu geben. Außerdem verbessert die Verwendung von entweder DBC2 oder DBC3 in einem Zwischenregenerationsschritt sehr weitgehend die Frequenz der Sprossregeneration von transgenem oder nicht transgenem Kallus aus Golden Promise, der auf 2,4-D oder Dicamba initiiert wurde (Beispiel 2).
Veränderungen der Partikelbeschuss-, Selektions- und Kultivierungsbedingungen trug unter anderem auch zu unserem Transformationserfolg mit dem zuvor rekalzitranten Genotyp, Galena, bei. Die Beschüsse wurden zuvor bei 1100 psi durchgeführt, was in einer Reduktion der Kallus-Induktionsfrequenz in Galena resultierte, obwohl Golden Promise in seiner Frequenz unbeeinflusst blieb. Es ist möglich, dass die Senkung des Berstdruckes und daher die Geschwindigkeit der Mikroprojektilen die Schädigung am Zielgewebe verminderte. Außerdem wurde die Selektion von Galena zwei Wochen nach dem Beschuss anstelle von einem Tag nach dem Beschuss initiiert (Wan und Lemaux, 1994), um eine bessere Kallusinduktion zu fördern und um aktive Zellteilungen transformierter Zellen ohne die unerwünschten Wirkungen toter oder sterbender Zellen in unmittelbarer Umgebung, die aus der Selektion resultieren, zu ermöglichen. Zudem wurden auch kallusbildende Embryos in große Stücke zerbrochen (4–5 mm), um die potenziellen negativen Verwundungswirkungen auf transformierte Zellen zu vermeiden.
Die hierin detaillierten Ansätze können erfolgreich zur Transformation anderer rekalzitranter kommerzieller Genotypen, wie zum Beispiel der nordamerikanischen Gerste-Kultivare, Harrington, eine zweireihige Varietät, und Morex, eine sechsreihige Varietät, verwendet werden. Unter Verwendung dieser Verfahren produzieren Harrington und Morex grüne regenerationsfähige Strukturen, die multiple Spross-Meristeme ergeben.
Außerdem erlaubt die Fähigkeit, dass grüne regenerationsfähige Strukturen über lange Zeitspannen in Kultur erhalten werden können, die Verwendung dieser Strukturen als Zielgewebe zur Transformation von Kultivaren, die zu Albinismus neigen, wodurch die Notwendigkeit zur Erhaltung von Spenderpflanzen eliminiert und die Probleme des Albinismus und einer schlechten Regenerationsfähigkeit vermindert sowie die induzierte Mutationsfrequenz und die sich daraus ergebende somoklonale Variation reduziert werden.
TABELLE 7. Kallus-Induktionsfrequenz, initiale Kallus-Wachstumsrate und Kallus-Morphologie von Golden Promise (GP) und Galena auf verschiedenen Kallus-Induktionsmedien
TABELLE B. Anzahl der aus grünen embryogenen Geweben von Golden Promiseund Galena regenerierten Sprossen.
BEISPIEL 4: VERWENDUNG GRÜNER REGENERATIONSFÄHIGER GEWEBE VON GERSTE ALS TRANSFORMATIONSZIELE
MATERIALIEN UND VERFAHREN
PLASMIDE. Die Plasmide pAHC20 und pAHC25 werden vorstehend beschrieben. pAHC15 enthält die GUS-Reportergen-Expressionskassette von pAHC25 (Christensen und Quail, 1996).
PUbiINPTII-1 wurde durch Insertion der Neomycin-Phosphotransferase-(NPTII)-kodierenden Sequenz von pCaMVNEO (Fromm et al., 1986) in den BamHI-Ort von pAHC17 konstruiert, der den Mais-Ubiquitin-Ubil-Promotor, Ubil-Intron 1 und den nos-3'-Terminator enthält (Christensen und Quail, 1996).
HERSTELLUNG GRÜNER REGENERATIONSFÄHIGER GEWEBE FÜR DEN DNA-PARTIKELBESCHUSS. Immature zygotische Embryos wurden oberflächensterilisiert, mit der Scutellumseite nach unten auf DBC2-Medium gebracht und bei 24 ± 1°C inkubiert. Regenerationsfähige Gewebe wurden 3–4 Wochen erhalten, dann in kleine Stücke (ca. 3 bis 5 mm) zerschnitten, auf frisches DBC2-Medium überführt und unter Schwachlicht-Bedingungen gezüchtet. Nach weiteren drei Wochen wurden grüne kallusbildende Sektoren in Stücke (ca. 3 bis 5 mm) zerbrochen und auf frisches DBC2-Medium überführt. Grüne regenerationsfähige Gewebe wurden auf DBC2-Medium erhalten, wobei in 3- bis 4-wöchentlichen Intervallen Subkulturen angelegt wurden. CIM mit 2,5 mg/l 2,4-D, 0,1 mg/l BAP und 5,0 μM CuSO₄ (d. h. DBC2-Medium) wurde für die Induktion grüner regenerationsfähiger Gewebe von den anderen Genotypen verwendet.
Zum Beschuss wurden grüne Gewebe (ca. 3 bis 5 mm, vier Monate alt) von Golden Promise und Galena einen Tag ins Dunkle bei 24 ± 1°C gebracht, dann an DBC2-Medium mit 0,2 M Mannitol und 0.2 M Sorbitol überführt. Vier Stunden nach der Behandlung mit dem Osmotikum wurden grüne Gewebe wie beschrieben (Lemaux et al., 1996) mit Goldpartikeln (Analytical Scientific Instruments, Alameda, CA) beschichtet mit pAHC25, einem Gemisch aus pAHC20 und pAHC15 oder einem Gemisch aus pUbiINPTII-1 und pAHC 15 bei 900 oder 1100 psi beschossen. 16–18 Stunden nach dem Beschuss wurden, die grünen Gewebe an DBC2-Medium ohne Osmotikum überführt und bei 24 ±1°C unter Schwachlicht-Bedingungen (ca. 10 μE, 16 h Licht) gezüchtet.
SELEKTION UND REGENERATION VON TRANSFORMIERTEM GEWEBE. Nach einer initialen 3- bis 4-wöchigen Kultivierungsperiode auf nicht selektivem Medium wurde jedes Stück aus grünem Gewebe in 1 bis 2 Stücke (ca. 4 mm bis 5 mm, abhängig von der Größe des Originalgewebestücks), zerbrochen und an DBC2-Medium (Golden Promise oder Galena) oder DBC3-(Galena)-Medium, ergänzt mit 4 bis 6 mg/l Bialaphos zur bar-Selektion oder 40 bis 50 mg/l Geneticin (G418) zur nptII-Selektion überführt. Grüne Gewebe wurden auf DBC2- oder DBC3-Medium selektiert, und 4 mm bis 5 mm Gewebe wurden in 3- bis 4-wöchentlichen Intervallen subkultiviert. Vermutliche grüne Gewebe-Transformanten, die anhand ihres schnellen Wachstumscharakters auf dem Selektivmedium identifiziert wurden, wurden an Magenta-Kasten mit Bewurzlungsmedium, ergänzt mit entweder 4 mg/l Bialaphos zur bar-Selektion oder ohne Selektivmittel zur Regeneration von nptII-Transformanten überführt. Wenn die Sprosse den oberen Teil des Kastens erreichten, wurden die Pflänzchen in 6-Inch-Töpfe mit Supersoil überführt (R. McClellan, S. San Francisco, CA), schrittweise akklimatisiert und bis zur Maturität im Gewächshaus gezüchtet.
ERGEBNISSE UND DISKUSSION
Verschiedene Targets wurden zur Gerste-Transformation verwendet, einschließlich immaturer zygotischer Embryos (Wan und Lemaux, 1994; Hagio et al., 1995), junger Kallus (Wan und Lemaux, 1994), sich von Mikrosporen herleitender Embryos (War und Lemaux, 1994), Mikrosporen (Jähre et al., 1994) und Protoplasten (Funatsuki et al., 1995; Salmenkallio-Marttila et al., 1995). Immature zygotische Embryos sind derzeit das am meisten verwendete und zuverlässigste Zielgewebe zur Gerste-Transformation. Die immaturen Embryos aus den meisten kommerziell wichtigen Gerste-Genotypen weisen jedoch geringe Kallus-Induktionsansprechraten auf (Lürz und Lörz, 1987; Dahleen, 1996). Überdies ist von in vitro hergeleitetes Gewebekulturmaterial hinsichtlich seiner Fähigkeit begrenzt, über verlängere Perioden grüne Pflanzen zu ergeben (Bregitzer et al., 1995). Während des Transformationsverfahrens erforderliche verlängerte Kultivierungsperioden und/oder Selektionsbelastung resultieren in einem großen Anteil von Albinopflanzen (Chlorophyll defizienten Pflanzen) (Foroughi-Wehr et al., 1982; Wan und Lemaux, 1994; Bregitzer et al., 1995). Außerdem erfordert die Verwendung immaturer Embryos und Mikrosporen als Zielgewebe die Erhaltung von Spendenpflanzen das ganze Jahr über, die unter definierten Wachstumsbedingungen gezüchtet werden.
Wir haben ein auf Mikroprojektil-Beschuss grüner Gewebe basierendes reproduzierbares Gerste-Transformationssystem etabliert, das sich ein In-vitro-Kultursystem zur Produktion multipler grüner Sprosse aus sich von immaturem Scutellar-Gewebe herleitendem Kallus zunutze gemacht hat. Die Selektion begann 3–4 Wochen nach dem Beschuss, um den transformierten Zellen zu ermöglichen, in der. Abwesenheit toter oder sterbender Zellen, die aus der Selektion oder Verwendung resultierten, zu proliferieren. Ab dem zweiten Transfer wurde die Selektion unter Verwendung von DBC2-Medium oder DBC3-Medium, das mit entweder Bialaphos zur bar-Selektion oder G418 (Geneticin) zur nprtII-Selektion ergänzt war, begonnen. Vermutliche Transformanten, die nach 3 bis 4 Selektionsrunden identifiziert wurden, wurden an mit Bialaphos ergänztes Bewurzlungsmedium überführt.
Unter Verwendung dieses Transformationsprotokolls haben wir eine bestätigte Golden Promise-Linie erhalten, die mit pAHC20 plus pAHC 15 nach Selektion mit Bialaphos transformiert wurde einschließlich einer vermutlich transformierten Galena-Linie mit pUbiINPTII-1 plus pAHC15 nach G418-Selektion. Beide Linien waren regenerierbar, wobei sie grüne Sprosse und Pflanzen produzierten. Die Transformation wurde mittels PCR-Analyse bestätigt.
Dieses Protokoll reduziert sehr weitgehend Probleme des Albinismus und schlechter Regeneration, die zuvor beobachtet wurden (War und Lemaux, 1994; Foroughi-Wehr et al., 19982; Bregitzer et al., 1995; Koprek et al., 1996; usw.) und kann auch für andere rekalzitrante Gerste-Kultivare, wie zum Beispiel Harrington und Morex angewendet werden.
BEISPIEL 5: KALLUS-MORPHOLOGIE VON WEIZEN AUF VERSCHIEDENEN KALLUSINDUKTIONSMEDIEN
Die vorstehend zum Gebrauch mit Gerste beschriebenen Gewebekulturprotokolle sind auch für eine Reihe anderer Pflanzenspezies, einschließlich verschiedener Monokotyledonen-Spezies nützlich.
Wir haben zum Beispiele gezeigt, dass die Weizen-Varietät Bobwhite auch eine verbesserte initiale Kallusinduktion und Kallus-Morphologie zeigt, wenn sie auf CIM mit hohen Kupfer- und BAP-Konzentrationen getestet wurde. In wie in Beispiel 1 vorstehend (außer wie angemerkt) durchgeführten Experimenten wurden immature ganze Embryos (1–2 mm) von Bobwhite auf sechs verschiedenen CIM getestet, wobei jedes MS-Medium ergänzt mit 39 g/l Maltose, 0,5 mg/l Thiamin-HCl, 150 mg/l Asparagin und verfestigt mit 2,5 g/l Phytagel [pH 5,85] einschloss, und mit Kupfer und Phytohormonen wie folgt ergänzt war:

(1) WD: 2,0 mg/l 2,4-D und 0,1 μM CuSO₄.
(2) WDC: 2,0 mg/l 2,4-D und 5,0 μM CuSO₄.
(3) WDB: 2,0 mg/l 2,4-D, 0,1 mg/l BAP und 0,1 μM CuSO₄.
(4) WDBC1: 2,0 mg/l 2,4-D, 0,01 mg/l BAP und 5,0 μM CuSO₄.
(5) WDBC2: 2,0 mg/l 2,4-D, 0,1 mg/l BAP und 5,0 μM CuSO₄.
(6) WDBC3: 2,0 mg/l 2,4-D, 0,5 mg/l BAP und 5,0 μM CuSO₄.

Der Spross-Apex wurde sieben Tage nach der Kallusinduktion entfernt. Die Morphologie des auf dem Medium induzierten Kallus ist aus Tabelle 9 ersichtlich. TABELLE 9. Kallus-Morphologie von Bobwhite-Weizen auf verschiedenen Kallus-Induktionsmedien

Kallus-Induktionsmedium Kallus-Morphologie

WD ++

WDC ++(+)

WDB +++

WDBC1 +++

WDBC2 ++++

WDBC3 +++++
BEISPIEL 6: REDUKTION DER GENOTYP-BEGRENZUNG BEI DER WEIZEN TRANSFORMATION
Wir haben ein hoch effizientes In-vitro-Kultursystem für Weizen entdeckt, das über erweiterte Zeitspannen in der Generierung multipler grüner Sprosse aus hoch regenerationsfähigen Geweben resultiert, die sich aus Scutellum-Gewebe immaturer zygotischer Embryos (Ies) von drei Weizen-Genotypen herleiteten, einschließlich eines kommerziell wichtigen Kultivars, Yecora Rojo, das zuvor für veröffentlichte Gewebekulturverfahren und Transformationsversuche rekalzitrant war.
MATERIALIEN UND VERFAHREN
PFLANZENMATERIAL. Drei Frühjahrsweizen-Kultivare (Triticam aestivum L.), Bobwhite, Anza und Yecora Rojo wurden in einem Gewächshaus wie zuvor beschrieben gezüchtet (Weeks et a!., 1994; Lemaux et al., 1996).
HERSTELLUNG UND KULTUR VON EXPLANTATEN ZUM BESCHUSS. Ies von ca. 1,0 bis 2,5 mm wurden unter einem Stereo-Präparationsmikroskop aus Samen, die 10 min in 20 Vol-% Bleiche (5,25% Natriumhypochlorit) oberflächensterilisiert wurden, intakt isoliert, gefolgt von dreimaligem Waschen in sterilem Wasser. Ies wurden mit der Scutellumseite nach unten auf drei verschiedenen Kallus-Induktionsmedien, die auf MS basierten (Murashige und Skoog, 1962), ergänzt mit 30 g/l Maltose, 1,0 mg/l Thiamin-HCl, 0,25 g/l Myoinositol, 1,0 g/l Caseinhydrolysat, 0,69 g/l Prolin und verfestigt mit 3,5 g/l Phytagel (Sigma, St. Louis, MO) gezüchtet. Die Medien enthielten drei verschiedene Kombinationen von 2,4-D, BAP und CuSO₄: (1) 2,0 mg/l 2,4-D und 0,1 μM CuSO₄ (worauf hierin nachstehend als auf D' verwiesen wird); (2) 2,0 mg/l 2,4-D, 1,0 mg/l BAP und 5,0 μM CuSO₄ (worauf hierin nachstelend als auf D'BC2 verwiesen wird) und (3) 1,0 mg/l 2,4-D, 0,5 mg/l BAP und 5,0 μM CuSO₄ (worauf hierin nachstehend als auf DBC3 verwiesen wird). In vorläufigen Experimenten wurde für die Weizenzellkultur modifiziertes MS-Medium (Weeks et al., 1993) auch mit den gleichen Kombinationen von 2,4-D, BAP und CuSO₄ getestet.
Fünf bis sieben Tage nach der Initiierung wurden keimende Sprosse und Wurzeln durch manuelle Exzision entfernt. Nach dreiwöchiger Inkubation bei 24 ± 1°C unter Schwachlicht-Bedingungen (ca. 10 bis 30 μE, 16 h Licht) wurden Gewebe der höchsten Qualität aus dem Scutellum aus jedem Medium selektiert, in kleine Stücke (ca. 3 bis 4 mm) zerschnitten und auf frisches Medium überführt. Nach einer zusätzlichen 3- bis 4-wöchigen Inkubation wurden die Gewebe wieder selektiert, in 2 bis 4 Stücke, ca. 3 bis 5 mm groß, zerbrochen und auf frisches Medium überführt. Die Gewebe wurden auf jedem Medium mittels Anlegen von Subkulturen in 3- bis 4-wöchentlichen Intervallen erhalten.
SPROSSREGENERATIONSTEST. Sieben Stücke von vier Monate alten Geweben von Anza und Yecora Rojo, ca. 4 bis 6 mm groß, die auf jedem Medium gezüchtet und erhalten wurden, wurden auf festes Regenerationsmedium (Kallus-Induktionsmedium mit 0,1 μM Kupfer ohne Phytohormone) ausplattiert und einer Lichtintensität von ca. 45 bis 55 μE ausgesetzt; jede Medium-Behandlung wurde in Dreifachbestimmung durchgeführt. Nach vier Wochen auf Regenerationsmedium wurde die Anzahl des Sprosse, die hoch regenerationsfähiges Gewebe produzierten, und die Anzahl von Sprossen pro Stück des hoch regenerationsfähigen Gewebes gezählt. Wenn mehr als ein Blatt aus der gleichen Gewebsbasis hervorging, so wurde es als ein Spross gezählt.
STABILE TRANSFORMATION UNTER VERWENDUNG HOCH REGENERATIONSFÄHIGER GEWEBE. Hoch regenerationsfähige Kulturen wurden durch Kultivieren auf D'BC2-Medium oder DBC3-Medium für 2 bis 7 Monate wie vorstehend beschrieben erhalten. Nur Gewebe guter Qualität wurden zum Beschuss selektiert. Regenerationsfähige Gewebe (3 bis 4 mm groß) wurden zur osmotischen Vorbehandlung an D'BC2- oder DBC2-Medium mit äquimolaren Mannitol- und Sorbitolmengen überführt, um eine Endkonzentration von 0,4 M zu ergeben. Vier Stunden nach der Behandlung mit Osmotikum wurden die Gewebe wie beschrieben beschossen (Wan und Lemaux, 1994; Lemaux et al., 1996). Goldpartikel (1,0 μm) wurden mit 25 μg einer im Molverhältnis von 1 : 1 pAct1IHPT-4 und PAHHC15 oder pActpAct1IHPT-4 und pdBhssWTRN3-8 beschichtet, gefolgt von Beschuss unter Verwendung eines PDS-1000/He Biolistic-Systems (Bio-Rad, Inc. Hercules, CA) bei 600 oder 900 psi. Das Plasmid pAct1IHPT-4 enthält die Hygromycin-Phosphotransferase-(hpt)-Kodierungssequenz unter Kontrolle des Reis-Actin1-Promotors (ActI), sein Intron und den nos-3'-Terminator. Das Plasmid pAHC15 enthält das uidA-(gus)-Gen unter Kontrolle des Mais-Ubiquitin-(Ubil)-Promotors, sein erstes Intron und den nos-3'-Terminator (Christensen und Quail, 1996). Das Plasmid pdBhssWTRN3-8 enthält das Weizen Thioredoxin-h-Gen unter Kontrolle des Gerste-Endosperm-spezifischen B₁-Hordein-Promotors mit seiner Signalpeptidsequenz und den nos-3'-Terminator. Sechzehn bis 18 Stunden nach Beschuss wurden die beschossenen Gewebe auf D'BC2- oder DBC3-Medium ohne Osmotikum gebracht und bei 24 ± 1°C unter Schwachlicht gezüchtet.
Nach der initialen 10- bis 14-tägigen Kultivierungsperiode wurde jedes Regenerationsgewebe, abhängig von der Gewebegröße, in 1 bis 3 Stücke zerbrochen und an D'BC2- oder DBC3-Medium, ergänzt mit 25 mg/l Hygromycin B (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland) überführt. Drei Wochen nach der ersten Selektionsrunde wurden die Kulturen an frisches D'BC2- oder DBC3-Medium mit 30 mg/l Hygromycin B überführt. Ab der dritten Selektionsrunde wurden die Gewebe subkultiviert und auf DBC3-Medium mit 30 mg/l Hygromycin B in 3- bis 4-wöchentlichen Intervallen erhalten. Nach der vierten Selektionsrunde wurden die überlebenden Gewebe an DBC-Medium ohne Selektion überführt. Nach der Identifikation von ausreichend großen grünen regenerationsfähigen Strukturen auf DBC3 wurden die Gewebe ohne Selektion auf festes Regenerationsmedium ausplattiert und Licht von hoher Intensität ausgesetzt (ca. 45–55 μE). Nach vier Wochen auf Regenerationsmedium (Kallus-Induktionsmedium ohne Phytohormone) wurden die regenerierten Sprosse an Magenta-Kasten mit dem gleichen Medium ohne Selektivmittel überführt. Wenn die Sprosse den oberen Teil des Kastens erreichten, wurden die Pflänzchen in die Erde überführt.
ANALYSE TRANSGENER PFLANZEN. Mit einem Gemisch aus PAct1IHPT-4 und pAHC15 transformierte T₀-Pflanzen und T₁-Samen von jeder transgenen Pflanze wurden mittels histochemischer Färbung auf GUS-Aktivität getestet. Die histochemische GUS-Färbung wurde, wie von Jefferson et al., (1987) beschrieben, unter Verwendung von 5-Bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-glucuronsäure (X-gluc) (Gold Biotechnology, Inc. St. Louis, MO), durchgeführt. Die Proben wurden über Nacht bei 37°C in GUS-Assay-Puffer inkubiert. Die genomische Gesamt-DNA aus Blattgeweben unabhängiger Linien wurde wie beschrieben gereinigt (Dellporta, 1993). Zum Testen auf das Vorliegen von uidA in genomischer DNA von vermutlich transformierten Linien wurden 250 ng genomische DNA mittels PCR unter Verwendung des Primer-Sets UIDA1 (5'-agcggccgcaTTACGTCCTGTAGAAACC-3') und UID2R (5'-agagctcTCATTGTTTGCCTCCCTG-3'} amplifiziert. Das Vorliegen von hpt wurde unter Verwendung des Primer-Sets HPT6F (5'-AAGCCTGAACTCACCGCGACG-3') plus HPT5R (5'-AAGACCAATGCGGAGCATATAC-3') getestet (Cho et al., 1997). Die Amplifikationen wurden in einer 25-μl-Reaktion mit Taq-DNA-Polymerase (Promega, Madison, WI), wie oben beschrieben, durchgeführt. Das Vorliegen eines 1,8 kb-Fragments, das auf ein intaktes uidA-Fragment deutete, bzw. ein internes 0,81 kb-Fragment wurden mit hpt-Fragmenten produziert.
ERGEBNISSE
ETABLIERUNG EINES EFFIZIENTEN In-vitro-SYSTEMS. Im Allgemeinen wies Bobwhite eine höhere Kallus-Induktionsfrequenz auf und produzierte, ungeachtet der Medium-Zusammensetzung, einen Kallus von höherer Qualität als Yecora Rojo und Anza, besonders auf D'-Medium mit 2,4-D allein. Yecora Rojo und Anza produzierten auf D'-Medium wässrigen, nicht embryogenen Kallus. Yecora Rojo und Anza produzierten jedoch als Antwort auf D'BC2- oder DBC3-Medium mit 2,4-D, BAP und Kupfer hoch embryogene Gewebe. Alle drei Genotypen produzierten auf D'BC2- oder DBC3-Medium Gewebe von höherer Qualität: Es wurden glänzende, kompakte, hoch regenerationsfähige Gewebe mit multiplen Meristem-ähnlichen Strukturen beobachtet. Ein höherer prozentualer Anteil Kallusgewebe von Bobwhite produzierte auf D'BC2- oder DBC3-Medium hoch regenerationsfähige Strukturen als der von Yecora Rojo und Anza. Sobald das Gewebe identifiziert war, das die entsprechende Morphologie aufwies, um hoch regenerationsfähige Strukturen unter Schwachlicht zu produzieren, konnten die regenerationsfähigen Gewebe leicht von dem übrigen Gewebe getrennt und getrennt auf D'BC2- oder DBC3 erhalten werden. Im Allgemeinen war DBC3 zur Erhaltung hoch regenerationsfähiger Gewebe für alle drei Genotypen optimal.
REGENERATION FERTILER PFLANZEN AUS HOCH REGENERATIONSFÄHIGEN GEWEBEN. Sieben vier Monate alte Gewebestücke von Yecora Rojo und Anza aus DBC3 wurden an Regenerationsmedium überführt. Nach vier Wochen produzierte das hoch regenerationsfähige Gewebe aus D'BC2 oder DBC3 multiple grüne Sprosse auf Regenerationsmedium, mit einem Bereich von 11 bis 17 Sprossen pro grünes Gewebestück (4–6 mm) (Tabelle 10); das Kallusgewebe, das auf D'-Medium mit 2,4-D erhalten wurde, regenerierte jedoch fast keine grüne Pflanzen. Anza war geringgradig regenerationsfähiger als Yecora Rojo (Tabelle 10).
STABILE TRANSFORMATION REKALZITRANTER GENOTYPEN. Eine erfolgreiche Transformation der rekalzitranten Genotypen Yecora Rojo und Anza basierte auf einem System für eine effiziente In-vitro-Kultur, die multiple grüne Sprosse aus sich von immaturem Scutellum-Gewebe herleitenden hoch regenerationsfähigem Gewebe. Die hoch regenerationsfähigen Gewebe von Yecora Rojo und Anza wurden beschossen und für die ersten 10 bis 14 Tage in Abwesenheit von Selektion auf D'BC2- oder DBC3-Medium kultiviert. Für den zweiten Transfer (erste Selektionsrunde) wurde die Selektion auf D'BC2- oder DBC3-Medium, ergänzt mit 25 mg/l Hygromycin B für die hpt-Selektion vorgenommen. Bei der zweiten Selektionsrunde wurde DBC3-Medium mit 30 mg/l Hygromycin B verwendet. Ab dem 4. Transfer (dritte Selektionsrunde) wurde der Selektionsdruck auf der gleichen Höhe aufrechterhalten. Im Allgemeinen wurden in der dritten Selektionsrunde Hygromycin-resistente Gewebe mit einigen grünen Sektoren beobachtet. Vermutliche transgene Kalli mit grünen Sektoren wurden aufrechterhalten und proliferierten auf dem gleichen Medium ohne Selektivmittel nach der vierten Selektionsrunde, bis die grünen Sektoren voll entwickelte regenerationsfähige Strukturen bildeten. Grüne regenerationsfähige Gewebe wurden auf Regenerationsmedium regeneriert, und die Pflänzchen wurden ca. 3 bis 4 Wochen nach dem Wachstum im gleichen Medium in Erde überführt. Wir erhielten 6 unabhängige regenerierbare Bobwhite-Linien, die mit pActIHPT-4 und PAHC15 transformiert wurden und 5 vermutlich transgene Anza- und 5 vermutlich transgene Yecora Rojo-Linien, die mit einem Gemisch aus pAct1IHPT-4 und pAHC15 oder pAct1IHPT-4 und pdBhssWTRN3-8 transformiert wurden (Tabelle 11).
ANALYSE VON T₀ UND T₁-PFLANZEN. Die histochemische Analyse der GUS-Aktivität in vermutlichen transgenen Linien stellte einen positiven Hinweis auf eine erfolgreiche Transformation des Modells (Bobwhite) und rekalzitranten (Anza und Yecora Rojo) Weizen-Genotypen bereit. Eine starke uidA-Expression wurde in Blattgewebe in den transgenen Linien BWHptGus-1, -2, -4 und -6., aber nicht in BWHptGus-3 und -5 nachgewiesen (Tabelle 11). In der negativen Kontrolle wurde, wie erwartet, keine GUS-Expression beobachtet. Um das Vorliegen von einem eingeführten Genen) in Blätter von vermutlich transformierten T₀-Pflanzen zu bestätigen, wurde die PCR durchgeführt. Das Vorliegen einer 0,81 kb-Bande in allen sechs transgenen Bobwhite-Linien (BWHptGus-1 bis -6) bestätigte das Vorliegen von hpt. BWHptGus-1, -2, -4 und -6 zeigten das Vorliegen von uidA mit einer 1,8 kb-Bande, aber nicht BWHptGus-3 oder -5. Eine transgene Anza-Linie, AZHptWtrx-1, und eine transgene Yecora Rojo-Linie, YRHptwtrx-1, enthielten auch ein internes 0,81 kb-hpt-Fragment, aber kein wtrx (Tabelle 11). Vier vermutliche transgene Anza- und vier Yecora Rojo-Linien wurden nicht auf das Vorliegen des eingeführten Gens/der eingeführten Gene getestet.
DISKUSSION
Unsere Ergebnisse zeigen, dass das Zufügen von BAP und einer hohen Kupfer(II)-sulfat-Konzentration zum Kallus-Induktionsmedium mit 2,4-D allein die Qualität und Regenerationsfähigkeit von aus Scutellum-Geweben von Ies induzierenden, in vitro kultivierten Geweben verbesserte. Im Gegensatz dazu produzierte die Verwendung im Kallus-Induktionsmedium von 2,4-D allein wässriges und nicht regenerationsfähiges Gewebe aus rekalzitranten Genotypen.
Glänzender, kompakter, leicht braunfarbener Kallus mit grünen regenerationsfähigen Strukturen wurde 2 bis 3 Wochen nach der Inkubation von Weizenembryos unter Schwachlicht auf Kallus-Induktionsmedium mit 2,4-D, BAP und Kupfer erhalten. Gewebe der höchsten Qualität wurden gescreent und auf dem gleichen Medium erhalten. Das gesamte vier Monate alte hoch regenerationsfähige Gewebe von Anza und Yecora Rojo regenerierte multiple grüne Sprosse (11 bis 16 Sprosse pro Gewebestück) (Tabelle 10). Im Gegensatz dazu produzierte vier Monate alter Kallus von Anza, der auf D'-Medium mit 2,4-D allein erhalten wurde, nur 0,1 grüne Sprosse pro Kallusstück, und es wurden keine grünen Sprosse aus vier Monate altem Kallus von Yecora Rojo generiert (Tabelle 10). Mit beiden Genotypen wurden die grünen regenerationsfähigen Meristem-Gewebe länger als ein Jahr auf Medium erhalten, das 2,4-D, BAP und Kupfer enthielt und regenerierte, um fertile grüne Pflanzen zu ergeben. DBC3-Medium war für die Langzeiterhaltung dieser Gewebe besser als D'BC2-Medium.
Hoch regenerationsfähige Gewebe von Bobwhite, Yecora Rojo und Anza wurde beschossen und auf D'BC2- oder DBC3-Medium für die ersten 10 bis 14 Tage in Abwesenheit von Selektion kultiviert. Für den zweiten Transfer (erste Selektionsrunde) wurde die Selektion auf D'BC2- oder DBC3-Medium, ergänzt mit 25 mg/l Hygromycin für die hpt-Selektion und mit 30 mg/l Hygromycin ab der zweiten Selektionsrunde vorgenommen. Nach drei bis vier Selektionsrunden wurden die meisten nicht transformierten Zellen durch Hygromycin B getötet, obwohl einige Hygromycin-resistente Auswüchse mit grünen Sektoren von den toten Klumpen unterscheidbar waren, die eine weißlich-braune Farbe aufwiesen. Vermutliche transgene Gewebe mit grünen Sektoren wurden erhalten und proliferierten auf dem gleichen Medium ohne Selektion nach der vierten Selektionsrunde, bis die grünen Sektoren regenerationsfähige Strukturen voll entwickelten.
Unter Verwendung dieses Transformationsprotokolls wurden sechs unabhängige regenerierbare Bobwhite-Linien und fünf vermutliche transgene Linien von jeweils Anza und Yecora Rojo erhalten (Tabelle 11). Alle acht unabhängige Linien, einschließlich eine Anza-Linie und eine Yecora Rojo-Linie produzierten multiple grüne Sprosse, und vier Bobwhite-Linien wiesen GUS-Expression auf. Bisher blühen Pflanzen von drei der sechs transgenen Bobwhite-Linien. Die Molekularanalyse der Transgene mittels PCR-Amplifikation von DNA, die aus Blattgewebe extrahiert wurde, ließ erkennen, dass das/die hptund/oder gus-Gene) in allen getesteten transgenen Linien vorhanden waren.
Vorläufige Daten haben darauf hingewiesen, dass dieses System auch an anderen rekalzitranten Weizen-Genotypen angewendet werden konnte. Die Verwendung hoch regenerationsfähiger Gewebe als eine Zielquelle zur Transformation eliminiert die Notwendigkeit zur Aufrechterhaltung von Spenderpflanzen und verbessert die Regenerationsfähigkeit.
BEISPIEL 7: „TOCHTERGEWEBE": EIN NEUES WEIZEN-TRANSFORMATIONSTARGET
Wir haben ein neues Transformationszielgewebe für Weizen entdeckt, das als „Tochtergewebe" bezeichnet wird, das durch immature Embryos von jedem untersuchten Weizen-Genotyp, einschließlich zum Beispiel Bobwhite, Anza, Yecora Rojo und Karl, produziert wird. Tochtergewebe entwickelten sich in hoch regenerationsfähige Strukturen, die multiple grüne Sprosse produzierten und für Langzeitkulturen verwendet werden konnten.
MATERIALIEN UND VERFAHREN
PFLANZENMATERIAL. Drei Frühjahrsweizen-Kultivare (Triticum aestivum L.), Bobwhite, Anza und Yecora Rojo wurden wie zuvor beschrieben in einem Gewächshaus gezüchtet (Weeks et al., 1994; oder Lemaux et al., 1996).
HERSTELLUNG UND KULTUR VON EXPLANTATEN ZUM BESCHUSS. Ies von ca. 1,0 bis 2,5 mm wurden wie in Beispiel 6 besprochen isoliert und auf D', D'BC2 oder DBC3 gezüchtet. Fünf bis sieben Tage nach Initiierung unter Schwachlicht-Bedingungen (ca. 10 bis 30 μE, 16 h Licht), wurden ovale Gewebe mit hoch embryogenen Strukturen (ca. 2 bis 4 mm lang), als „Tochtergewebe" bezeichnet, aus keimenden Ies durch manuelle Exzision isoliert, und jedes wurde an frisches Medium überführt. Nach dreiwöchiger Inkubation bei 24 ± 1°C unter Schwachlicht-Bedingungen wurden Gewebe aus jedem Medium in kleine Stücke zerschnitten (ca. 3 bis 4 mm) und auf frisches Medium überführt. Die Gewebe wurden auf jedem Medium erhalten, wobei in 3- bis 4-wöchentlichen Intervallen Subkulturen angelegt wurden.
SPROSSREGENERATIONSTEST. Sieben Stücke von zwei Monate alten Geweben von Bobwhite, Anza und Yecora Rojo, ca. 4 bis 6 mm groß, die auf jedem Medium gezüchtet und erhalten wurden, wurden auf festes Regenerationsmedium (Kallus-Induktionsmedium mit 0,1 μM Kupfer ohne Phytohormone) ausplattiert und einer Lichtintensität von ca. 45 bis 55 μE ausgesetzt; jede Medium-Behandlung erfolgte in Dreifachbestimmung. Nach vier Wochen auf Regenerationsmedium wurden die Anzahlen hoch regenerationsfähiger Gewebe, die Sprosse produzieren, und die Anzahlen von Sprossen pro Stück von hoch regenerationsfähigem Gewebe gezählt. Wenn aus der gleichen Gewebebasis mehr als ein Blatt entstand, wurde es als ein Spross gezählt.
ERGEBNISSE
ETABLIERUNG EINES SICH VON TOCHTERGEWEBE HERLEITENDEN In-vitro-SYSTEMS.
Nach 3–5 Tagen auf Kallus-Induktionsmedium entstanden an der Basis von keimenden Sprossen oder aus der Außenschicht der weißlichen, weichen Gewebe in der Nähe der Basis keimender Sprosse aus immaturen Embryos von allen drei Weizen-Genotypen Tochtergewebe. Im Allgemeinen werden, ungeachtet des Genotyps, eine höhere Tochtergewebeinduktionsrate und Tochtergewebe von höherer Qualität auf D'BC2- oder DBC3-Medium, die 2,4-D, BAP und Kupfer enthalten, beobachtet, als auf D'-Medium, das nur 2,4-D enthält. Die Tochtergewebe wuchsen schnell und bildeten im Laufe der Zeit kompakte grüne regenerationsfähige Gewebe mit multiplen Meristem-ähnlichen Strukturen auf D'BC2- oder DBC3-Medium, während sie nicht embryogene hellbraune Gewebe langsam proliferieren oder auf D'-Medium nicht wuchsen. Die hoch regenerationsfähigen Gewebe aus Tochtergeweben, die auf D'BC2-Medium oder DBC3-Medium gezüchtet wurden, waren morphologisch denen von immaturen Scutellum-Geweben ähnlich. Im Allgemeinen war DBC3 zur Erhaltung hoch regenerationsfähiger Gewebe für alle drei Genotypen optimal.
REGENERATION FERTILER PFLANZEN. Sieben Stücke von zwei Monate alten Geweben von Yecora Rojo und Anza wurden aus DBC3 an Regenerationsmedium überführt. Nach vier Wochen produzierte das hoch regenerationsfähige Gewebe aus D'BC2 oder DBC3 multiple grüne Sprosse auf Regenerationsmedium mit einem Bereich von 10 bis 18 Sprossen pro Stück grünes Gewebe (4–6 mm); das auf D'-Medium erhaltene Kallusgewebe regenerierte fast keine grünen Pflanzen. Bobwhite war geringgradig regenerierbarer als Anza und Yecoro Rojo.
BEISPIEL 8: HOCHFREQUENZ-TRANSFORMATION VON HAFER
Wir beschreiben hierin ein hoch effizientes Transformationssystem für Hafer unter Verwendung des Mikroprojektil-Beschusses von hoch regenerationsfähigen Kulturen, die sich von embryogenem Kallus herleiten. Unser Protokoll verbessert die Transformationsfrequenz (26%) und die Regenerationsfähigkeit transgener Linien (100%) dramatisch.
MATERIALIEN UND VERFAHREN
PFLANZENMATERIAL. Mature Samen von GAF-30/Park, ein Frühjahrshafer-Kultivar (Avena sativa), wurden 20 min in 20 Vol-% Bleiche (5,25% Natriumhypochlorit) oberflächensterilisiert, gefolgt von dreimaligem Waschen in sterilem Wasser. Die Samen wurden auf zwei verschiedene Kallus-Induktionsmedien, D'BC2 oder DBC3, gebracht. Fünf bis sieben Tage nach der Initiierung wurden die keimenden Sprosse und Wurzeln durch manuelle Exzision entfernt. Nach dreiwöchiger Inkubation bei 24 ± 1°C unter Schwachlicht-Bedingungen (ca. 10 bis 30 μE, 16 h Licht) wurden Gewebe der höchsten Qualität selektiert und auf jedem Medium mit Anlegen von Subkulturen in 3- bis 4-wöchentlichen Intervallen erhalten, um hoch regenerationsfähige Gewebe zu proliferieren.
PARTIKELBESCHUSS UND STABILE TRANSFORMATION. Ca. vier bis fünf Monate alte Kulturen wurden zum Mikroprojektil-Beschuss verwendet. Die Gewebe (3 – 4 mm) wurden zur osmotischen Vorbehandlung an D'BC2 oder DBC3-Medium mit äquimolaren Mengen Mannitol und Sorbitol überführt, um eine Endkonzentration von 0,4 M zu geben. Vier Stunden nach der Behandlung mit Osmotikum wurden die Gewebe wie beschrieben beschossen (Wan und Lemaux, 1994; Lemaux et al., 1996). Goldpartikel (1,0 μm) wurden mit 25 μg eines 1: 1 Molverhältnisses von pAct1IHPT-4 und pAHC15 beschichtet, gefolgt von Beschuss unter Verwendung eines PDS-1000/He Biolistic-Systems (Bio-Rad., Inc., Hercules, CA) bei 900 psi. Sechzehn bis 18 h nach Beschuss wurden die beschossenen Gewebe auf D'BC2- oder DBC3-Medium ohne Osmotikum gebracht und bei 24 ± 1°C unter Schwachlicht gezüchtet.
Nach einer initialen 10- bis 14-tägigen Kultivierungsperiode wurde jedes Regenerationsgewebe, abhängig von der Gewebegröße, in 1 bis 3 Stücke zerbrochen und an D'BC2- oder DBC3-Medium, ergänzt mit 20 mg/l Hygromycin B (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland) überführt. Ab der zweiten Selektionsrunde wurde von den Geweben auf dem gleichen Medium mit 20 mg/l Hygromycin B in 3- bis 4-wöchentlichen Intervallen Subkulturen angelegt. Nach der Identifikation ausreichend großer grüner regenerationsfähiger Strukturen auf jedem Medium wurden die Gewebe auf FHG-Regenerationsmedium ohne Selektion ausplattiert und einer höheren Lichtintensität (ca. 45 – 55 μE) ausgesetzt. Nach vier Wochen auf FHG-Medium wurden die regenerierten Sprosse an Magenta-Kasten, die Bewurzlungsmedium (Kallus- Induktionsmedium ohne Phytohormone) enthielten, ohne Selektion überführt. Wenn die Sprosse den oberen Teil des Kastens erreichten, wurden die Pflänzchen in Erde überführt.
HISTOCHEMISCHER GUS-ASSAY. Mit einem Gemisch aus pAct1IHPT-4 und pAHC15 transformierte T₀-Pflanzen und T₁-Samen aus jeder transgenen Linie wurden mittels histochemischer Färbung, wie vorstehend beschrieben, auf GUS-Aktivität getestet.
GENOMISCHE DNA-ISOLATION, PCR UND DNA-BLOT-HYBRIDISIERUNG. Die genomische Gesamt-DNA aus Blattgeweben unabhängiger Linien wurde wie beschrieben gereinigt (Dellaporta, 1993). Zum Testen auf das Vorliegen von uidA in genomischer DNA von vermutlich transformierten Linien wurden 250 ng genomische DNA mittels PCR unter Verwendung des Primer-Sets UIDA1 und UID2R amplifiziert. Das Vorliegen von hpt wurde unter Verwendung des Primer-Sets HPT6F und HPT5R getestet. Die Amplifikationen wurden wie vorstehend beschrieben durchgeführt. Das Vorliegen eines 1,8-kb-Fragmentes deutete darauf hin, dass ein intaktes uidA-Fragment bzw. ein internes 0,81-kb-Fragment mit hpt-Fragmenten produziert wurde.
Für die DNA-Blot-Hybridisierungsanalyse wurden 10 μg genomische Gesamt-DNA aus Blattgewebe von jeder Linie mit EcoRI und BamHI aufgeschlossen, auf einem 1,0%igen Agarosegel getrennt, an eine Zeta-Sonden-GT-Membran (Bio-Rad, Hercules, CA) überführt und mit einer radioaktiv markierten uidA-spezifischen Sonde nach Anweisung des Herstellers hybridisiert. Das uidA enthaltende 1,8 kb-Xbal-Fragment von pBI221 wurde unter Verwendung eines QIAEX-Gelextraktionskits (QIAGEN, Chatsworth, CA) gereinigt und mit α-³²P-dCTP unter Verwendung von Random-Primern markiert.
ERGEBNISSE
BESCHUSS UND SELEKTION FÜR TRANSGENE KLONE Spross-Meristem-Gewebe wurden 4–5 Monate unter Schwachlicht-Bedingungen auf D'BC2- oder DCB3-Medium initiiert. Zum Beschuss wurden ca. 30 Gewebestücke (3–4 mm groß) auf das gleiche Medium mit Osmotikum-Vorbehandlung gegeben. Sechzehn bis 18 Stunden nach Beschuss wurden die Gewebe an D'BC2- oder DBC3-Medium ohne Osmotikum überführt und 10 bis 14 Tage ohne Selektion kultiviert. Für den zweiten Transfer (erste Selektionsrunde) wurde die Selektion auf D'BC2 oder DBC3-Medium, ergänzt mit 20 mg/l Hygromycin B zur hpt-Selektion vorgenommen. Ab dem dritten Transfer (zweite Selektionsrunde) wurde der Selektionsdruck auf der gleichen Höhe aufrechterhalten. Die Gewebe wurden als Antwort auf die Hygromycin-Selektion allmählich braun. Im Allgemeinen wurden Hygromycin-resistente Gewebe mit multiplen hoch regenerierbaren Strukturen mit einem Aussehen, das dem von Spross-Meristemen ähnlich war, bei der dritten Selektionsrunde beobachtet. Vermutliche transgene Gewebe wurden aufrechterhalten und proliferierten auf dem gleichen Medium nach der vierten Selektionsrunde, bis genug Gewebe zur Regeneration erhalten wurde. Transgene Meristem-Gewebe wurden auf FHG-Medium regeneriert, und die Pflänzchen wurden in Erde überführt und ca. 3–4 Wochen nach dem Wachstum in Bewurzlungsmedium (Kallus-Induktionsmedium ohne Phytohormone) in Magenta-Kasten bis zur Maturität gezüchtet. Bisher wurden unter Verwendung dieses Transformationsprotokolls 84 unabhängige transgene Linien aus 327 Gewebsstücken erhalten, was eine 26%ige Transformationsfrequenz ergibt. Alle transformierten Linien waren regenerierbar.
ANALYSE VON T₀ UND T₁-PFLANZEN. Die histochemische Analyse der GUS-Aktivität in vermutlichen transgenen Linien stellte einen positiven Hinweis auf eine erfolgreiche Transformation bereit. Gus-Expression wurde in vermutlichen transgenen, regenerierbaren Geweben und regenerierten Blattgeweben nachgewiesen. Von den untersuchten 84 unabhängigen Hygromycin-resistenten Linien waren 56 positiv für GUS-Aktivität, was eine 70%ige Coexpressionseffizienz ergibt.
Zur Bestätigung des Vorliegens eines eingeführten/r Gens/e in Blätter von vermutlich transformierten T₀-Pflanzen wurde die PCR durchgeführt. Alle 17 transgene Linien, die als GUS-positive Transformanten nach der Hygromycin-Selektion identifiziert wurden, zeigten nach der PCR sowohl das uidA-1,8-kb-Fragment als auch das 0,81 kb-hpt-Fragment. Weder das eine noch das andere Fragment wurde jedoch in der negativen Kontrolle mit einem der beiden Primer-Sets amplifiziert.
Die Integration des eingeführten uidA-Gens in genomische DNA der transgenen Hafer-Linien wurde weiter durch die DNA-Blot-Hybridisierungsanalyse bestätigt. Genomische DNA von allen acht transformierten Linien, die für GUS-Aktivität positiv waren, und die PCR-Assay-Ergebnisse zeigten Hybridisierung einer uidA-Sonde an das erwartete 1,8-kb-Fragment nach Aufschluss der genomischen DNA mit EcoRI und BamHI. Die Sonde hybridisierte nur an die Fraktion mit hohem Molekulargewicht der nicht aufgeschlossenen genomischen DNA von jeder transgenen Linie, was auf die Integration des Marker-Gens in das Hafer-Genom deutet. Die Anzahl der Kopien des uidA-Gens wie anhand des Aufschlusses von DNA mit EcoRI und BamHi bestimmt, lag in dem Bereich von einer bis zu mehr als 10 Kopien pro Genom.
DISKUSSION
Die 26%ige Transformationsfrequenz (Anzahl von Transformanten/Anzahl von Explantaten), die wir beobachteten (Tabelle 12) war höher als die Hafer-Transformationsfrequenzen, die zuvor unter Verwendung anderer Zielgewebe berichtet wurden. Ein Faktor, der zu diesem Erfolg beitrug, besteht in der Verwendung von hoch regenerierbaren Strukturen als Transformationsziele. Zielgewebe mit einem hohen Prozentsatz kompetenter Zellen sind regenerierbar und proliferieren schnell. Diese Wachstumsmerkmale stellten Zielgewebe einer besseren Qualität zur Transformation von dem initialen Selektionsschritt bereit und minimierten die Länge der Selektionsperiode. Alle transgenen Linien waren regenerierbar und produzierten multiple grüne Sprosse (Tabelle 12). Die Regenerationsfähigkeit der transgenen Linien war auch höher als die von jedem anderen zuvor berichteten System.
BEISPIEL 9: TRANSFORMATION VON RASEN-/FUTTERGRÄSERN
Wir beschreiben hierin ein hoch effizientes In-vitro-Kultursystem für Rasen-/Futtergräser, die in der Generierung multipler grüner Sprosse aus hoch regenerationsfähigen Geweben resultieren, die sich aus maturen Samen und der erfolgreichen Transformation von Flechtstraußgras, Rohrschwingel, Knaulgras und anderen Rasen-/Futtergräsern mit hohen Frequenzen herleiten.
MATERIALIEN UND VERFAHREN
PFLANZENMATERIAL. Mature Samen von fünf Monokotyledonen-Rasen/Futtergräsern, Flechtstraußgras (Puffer), Wiesenrispe (Kenblue), Rotschwingel mit starken Ausläufern (43F-93), Rohrschwingel (Ky31), Knaulgras (Rapido) wurden zur Initiierung der Kultur verwendet.
HERSTELLUNG UND KULTUR VON EXPLANTATEN ZUM BESCHUSS. Mature Samen der fünf Gräser wurden 30 min in 20 Vol-% Bleiche (5,25% Natriumhypochlorit) oberflächensterilisiert, gefolgt von dreimaligem Waschen in sterilem Wasser. Die Samen wurden auf drei verschiedenen Kallus-Induktionsmedien, D', D'BC2 oder DBC3, gezüchtet. Fünf bis sieben Tage nach der Initiierung wurden keimende Sprosse und Wurzeln durch manuelle Exzision entfernt. Nach dreiwöchiger Inkubation bei 24 ± 1°C unter Schwachlicht-Bedingungen (ca. 10 bis 30 μE, 16 h Licht) wurden Gewebe der höchsten Qualität aus dem Scutellum von jedem Medium selektiert, in kleine Stücke (ca. 3–4 mm) zerschnitten und auf frisches Medium überführt. Nach einer zusätzlichen 3- bis 4-wöchigen Inkubation wurden die Gewebe erneut selektiert, in 2–4 Stücke, ca. 3–5 mm groß, zerschnitten und auf frisches Medium überführt. Die Gewebe wurden auf jedem Medium mit dem Anlegen von Subkulturen in 3- bis 4-wöchentlichen Intervallen erhalten.
SPROSSREGENERATIONSTEST. Sieben Stücke von fünf bis sechs Monate alten Geweben, ca. 4 bis 6 mm groß, auf jedem Medium gezüchtet und erhalten, wurden auf festes FHG-Regenerationsmedium mit 1 mg/l BA ausplattiert und einer Lichtintensität von ca. 45 bis 55 μE ausgesetzt; jede Medium-Behandlung wurde in Drei- bis Vierfachbestimmung durchgeführt. Nach drei Wochen auf dem Regenerationsmedium wurden die Anzahlen des hoch regenerationsfähigen Gewebes, das Sprosse produziert, und die Anzahlen der Sprosse pro Stück hoch regeneratinsfähiges Gewebe gezählt. Wenn aus der gleichen Gewebebasis mehr als ein Blatt entstand, wurde es als ein Spross gezählt.
STABILE TRANSFORMATION UNTER VERWENDUNG HOCH REGENERATIONSFÄHIGER GEWEBE. Hoch regenerationsfähige Kulturen wurden durch Kultivieren für vier bis fünf Monate wie vorstehend beschrieben erhalten, und nur Gewebe von guter Qualität wurden zum Mikroprojektil-Beschuss verwendet. Die regenerationsfähigen Gewebe (3–4 mm) wurden zur osmotischen Vorbehandlung an D'-, D'BC2- oder D'BC3-Medium mit äquimolaren Mengen Mannitol und Sorbitol, um eine Endkonzentration von 0,4 M zu geben, überführt. Vier Wochen nach der Behandlung mit Osmotikum wurden die Gewebe wie beschrieben beschossen (Wan und Lemaux, 1994; Lemaux et al., 1996). Goldpartikel (1,0 um) wurden mit 25 μg eines 1 : 1 : 1 Molverhältnisses von pAct1IHPT-4,pAHC15 und pAHC20 beschichtet, gefolgt von Beschuss unter Verwendung eines PDS-100/He Bolistic-Systems (Bio-Rad, Inc., Hercules, CA) bei 900 psi. Sechzehn bis 18 h nach dem Beschuss wurden die beschossenen Gewebe auf D'BC2- oder DBC3-Medium, ergänzt mit 30 mg/l Hygromycin B gebracht. Drei Wochen nach der ersten Selektionsrunde wurden die Kulturen an frisches D'BC2- oder DBC3-Medium. mit 30 mg/l Hygromycin B für Knaulgras und 50 mg/l Hygromycin B für Flechtstraußgras und Rohrschwingel überführt. Aus der zweiten Selektionsrunde wurden von den Geweben auf dem DBC3-Medium mit 30 mg/l Hygromycin B für Knaulgras Subkulturen angelegt und in 3- bis 4-wöchentlichen Intervallen subkultiviert. Für Flechtstraußgras und Rohrschwingel wurden 50–100 mg/l Hygromycin B für die zweite und dritte Selektionsrunde verwendet. Nach der Identifikation von ausreichend großen grünen regenerationsfähigen Strukturen auf DBC3 wurden die Gewebe auf festes Regenerationsmedium mit Selektion ausplattiert und hoher Lichtintensität (ca. 45–55 μE) ausgesetzt. Nach vier Wochen auf Regenerationsmedium (Kallus-Induktionsmedium ohne Phytohormone) wurden die regenerierten Sprosse an Magenta-Kasten mit dem gleichen Medium ohne Selektion überführt. Wenn die Sprosse den oberen Teil des Kastens erreichten, wurden die Pflänzchen in Erde überführt.
ANALYSE TRANSGENER PFLANZEN. T₀-Pflanzen wurden wie vorstehend beschrieben mittels histochemischer Färbung auf GUS-Aktivität getestet.
Die genomische Gesamt-DNA aus Blattgeweben von unabhängigen Linien wurden wie beschrieben gereinigt (Dellporta, 1993). Zum Testen auf das Vorliegen von uidA in genomischer DNA von vermutlich transformierten Linien wurden 250 ng genomische DNA mittels PCR unter Verwendung des Primer-Sets UIDA1 und UID2R amplifiziert. Das Vorliegen von hpt wurde unter Verwendung des Primer-Sets HPT6F und HPT5R getestet. Amplifikationen wurden wie vorstehend besprochen durchgeführt. Das Vorliegen von einem 1,8-kb-Fragment ließ erkennen, dass ein intaktes uidA-Fragment bzw. ein internes 0,81 kb-Fragment mit hpt-Fragmenten produziert wurden.
ERGEBNISSE
ETABLIERUNG EINES EFFIZIENTEN In-vitro-SYSTEMS. Alle fünf Rasen-/Futtergräser produzierten glänzende, kompakte und hoch regenerationsfähige Gewebe von hoher Qualität auf D'BC2- und D'BC3-Medium. Sobald Gewebe identifiziert wurde, das die geeignete Morphologie zur Produktion hoch regenerationsfähiger Strukturen unter Schwachlicht aufwies, konnten die regenerationsfähigen Gewebe leicht von dem übrigen Gewebe getrennt und getrennt auf D'BC2 oder DBC3 erhalten werden.
REGENERATION FERTILER PFLANZEN AUS HOCH REGENERATIONSFÄHIGEN GEWEBEN. Drei Wochen nach dem Transfer von Gewebe an das Regenerationsmedium produzierte das hoch regenerationsfähige Gewebe aus D'BC2 oder DBC3 multiple grüne Sprosse mit einem Bereich von 2,7 bis 7,4 Sprosse pro grünes Gewebestück (4–6 mm) für Rotschwingel und Wiesenrispe (Tabelle 14). Auf D'-Medium erhaltenes Kallusgewebe produzierte jedoch fast keine regenerierten grünen Pflanzen aus Rotschwingel oder Wiesenrispe.
STABILE TRANSFORMATION REKALZITRANTER GENOTYPEN. Die hoch regenerationsfähigen Gewebe von Rohrschwingel, Flechtstraußgras und Knaulgras wurden beschossen und auf D', DBC2 oder D'BC3 kultiviert. Im Allgemeinen wurden Hygromycin-resistente Gewebe mit einigen grünen Sektoren erhalten und proliferierten auf dem gleichen Medium mit Selektion, bis die grünen Sektoren voll entwickelte regenerationsfähige Strukturen bildeten. Grüne regenerationsfähige Gewebe wurden auf Regenerationsmedium regeneriert, und die Pflänzchen wurden ca. 3–4 Wochen nach Wachstum in dem gleichen Medien in Magenta-Kasten in Erde überführt. Tabelle 13 zeigt die Anzahl von aus Geweben von Flechtstraußgras, Rotschwingel und Wiesenrispe unter den getesteten Bedingungen regenerierten Sprossen.
Bisher haben wir 11 unabhängige regenerierbare Knaulgras-Linien, 7 unabhängige Rohrschwingel-Linien und 8 unabhängige Flechtstraußgras-Linien, die mit einem Gemisch aus pAct1IHPT-4, pAHC15 und PAHC20 transformiert wurden, erhalten (Tabelle 14).
ANALYSE VON T₀-PFLANZEN. Die histochemische Analyse der GUS-Aktivität in vermutlichen transgenen Linien stellten einen positiven Hinweis auf eine erfolgreiche Transformation von Rasen-/Futtergräsern bereit. Eine starke uidA-Expression wurde in Blattgewebe in einigen transgenen Linien nachgewiesen (Tabelle 14).
Nach Erläuterung und Beschreibung der erfindungsgemäßen Erkenntnisse sollte von dem Durchschnittsfachmann erkannt werden, dass die Erfindung, ohne von diesen Erkenntnissen abzuweichen, bezüglich der Anordnung und Einzelheiten modifiziert werden kann. Wir erheben Anspruch auf alle Modifikationen, die sich im Erfindungsgedanken und Rahmen der anhängenden Ansprüche befinden.
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Claims

Ein Verfahren zur Herstellung einer transformierten Pflanze, umfassend die folgenden Schritte: Einführung einer Nukleinsäure in eine Zelle eines embryogenen Kallus, um eine transformierte Pflanzenzelle herzustellen; Kultivieren der transformierten Pflanzenzelle auf einem Kallus-Induktionsmedium, umfassend ein Auxin, zur Förderung der Proliferation der transformierten Pflanzenzelle, um einen tansformierten Kallus zu produzieren; Kultivieren des transformierten Kallus auf einem Zwischen-Inkubationsmedium, umfassend ein Auxin und ein Cytokinin, zur Förderung weiterführender Proliferation und Bildung einer transformierten Struktur, die befähigt ist zur Regeneration; und Kultivieren der transformierten Struktur auf einem Regenerationsmedium, um die transformierte Pflanze zu produzieren.
Das Verfahren nach Anspruch 1, worin das Auxin ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, Dicamba, Naphthalinessigsäure, Indolessigsäure und Mischungen davon.
Das Verfahren nach Anspruch 1, worin das Cytokinin ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehen aus 6-Benzylaminopurin, Zeatin, Zeatin-Ribosid, Kinetin, 2iP und Mischungen davon.
Das Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin das Kallus-Induktionsmedium das Auxin in einer Konzentration von etwa 0,1 mg/l bis etwa 5 mg/l enthält.
Das Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin das Kallus-Induktionsmedium weiterhin ein Cytokinin in einer Konzentration von etwa 0,01 mg/l bis etwa 2,0 mg/l umfasst.
Das Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin das Zwischen-Inkubationsmedium das Auxin in einer Konzentration von etwa 0,1 mg/l bis etwa 5 mg/l enthält.
Das Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin das Zwischen-Inkubationsmedium ein Cytokinin in einer Konzentration von etwa 0,1 mg/l bis etwa 5 mg/l enthält.
Das Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin das Kallus-Induktionsmedium Kupfer in einer Konzentration von etwa 0,1 μM bis etwa 50 μM enthält.
Das Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin das Zwischen-Inkubationsmedium Kupfer in einer Konzentration von etwa 0,1 μM bis etwa 50 μM enthält.
Das Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin die Kallus-Induktions- und Zwischen-Inkubationsmedien Maltose als eine Zuckerquelle enthalten.
Das Verfahren nach Anspruch 10, worin die Maltose in einer Konzentration von etwa 30 g/l vorhanden ist.
Das Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin das Kultivieren der transformierten Pflanzenzelle auf einem Kallus-Induktionsmedium das Kultivieren der transformierten Pflanzenzelle unter Schwachlicht-Bedingungen umfasst, zur Produktion eines grünen transformierten Kallus.
Das Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin die Einführung der Nukleinsäure den Beschuss des embryogenen Kallus mit Mikroprojektilen einschließt, die mit Nukleinsäure überzogen sind, bei einem Brechdruck von etwa 600 psi bis etwa 900 psi.
Das Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin die Pflanze ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gerste, Weizen, Hafer, Mais, Reis und Rasen- und Futtergräsern.
Das Verfahren nach Anspruch 14, worin die Pflanze eine Gerstenpflanze ist, ausgewählt aus den Genotypen Golden Promise, Galena, Harrington, Morex, Moravian III und Salome.
Das Verfahren nach Anspruch 14, worin die Pflanze eine Weizenpflanze ist, ausgewählt aus den Genotypen Bobwhite, Anza, Karl und Yecora Rojo.
Das Verfahren nach Anspruch 1, worin die Pflanze eine Gerstenpflanze ist; die Nukleinsäure eingeführt wird durch Einführung eines Nukleinsäuremoleküls in die Zellen eines unreifen zygotischen Gerstenembryos durch Mikroprojektil-Beschuss zur Transformation mindestens einiger Zellen des Embryos; die transformierten Zellen kultiviert werden auf Kallus-Induktionsmedium, durch Kultivieren des Embryos im Dunkeln für etwa 10–14 Tage und Überführen des Embryos auf ein Kallus-Induktionsmedium, welches eine Zuckerquelle, ein Auxin in einer Konzentration von etwa 1 mg/l bis etwa 2,5 mg/l, und Kupfer in einer Konzentration von etwa 0,1 μM bis etwa 50 μM enthält, und Inkubation des Embryos im Dunkelnso dass Kallusmaterial erhalten wird; der transformierte Kallus kultiviert wird durch Überführung des Kallusmaterials auf ein Zwischen Inkubationsmedium, welches eine Zuckerquelle, ein Auxin in der Konzentration von etwa 0,1 mg/l bis etwa 5 mg/l, ein Cytokinin in einer Konzentration von 0,1 mg/l bis etwa 5 mg/l und Kupfer in einer Konzentration von etwa 0,1 μM bis etwa 50 μM enthält, und Inkubation solchermaßen, dass grüne Strukturen auf dem Kallusmaterial beobachtet werden; die transformierte Struktur kultiviert wird zur Produktion der transformierten Pflanze durch Überführung des Kallusmaterials, welches die grünen Strukturen umfasst, auf ein Regenerationsmedium und Inkubation, so dass Sprossen erhalten werden; und die Sprossen überführt werden auf ein Bewurzlungsmedium, um transformierte Gerstenpflanzen zu erhalten.
Das Verfahren nach Anspruch 1, worin die Pflanze eine Gerstenpflanze ist; der Kallus produziert wird durch Platzieren eines unreifen zygotischen Gerstenembryos auf ein Kallus-Induktionsmedium, welches eine Zuckerquelle, ein Auxin in einer Konzentration von etwa 0,1 mg/l bis etwa 5 mg/l, ein Cytokinin in einer Konzentration von 0 mg/l bis etwa 5 mg/l und Kupfer in einer Konzentration von etwa 0,1 μM bis etwa 50 μM enthält, und Inkubation unter Schwachlicht-Bedingungen, um so grünes regeneratives Kallusmaterial zu bilden; das Nukleinsäuremolekül eingeführt wird in den Kallus durch Mikroprojektil-Beschuss, um einen transformierten Kallus zu produzieren; der transformierte Kallus kultiviert wird durch Überführen des Kallus in ein Zwischen-Inkubationsmedium, welches eine Zuckerquelle, ein Auxin in einer Konzentration von etwa 0,1 mg/l bis etwa 5 mg/l, ein Cytokinin in einer Konzentration von etwa 0,1 mg/l bis etwa 5 mg/l und Kupfer in einer Konzentration von etwa 0,1 μM bis etwa 50 μM enthält, und Inkubation solchermaßen, dass grüne Strukturen auf dem Kallusmaterial beobachtet werden; die transformierte Pflanze produziert wird durch Überführen des Kallusmaterials, welches die grünen Strukturen umfasst, in ein Regenerationsmedium und Inkubation solchermaßen, das Sprossen erhalten werden und Überführen der Sprossen in Bewurzlungsmedium, um transformierte Gerstenpflanzen zu erhalten.
Das Verfahren nach Anspruch 1, worin die Pflanze eine Weizenpflanze ist; der Kallus produziert wird durch Platzieren eines unreifen zygotischen Weizenembryos auf ein Kallus-Induktionsmedium, welches eine Zuckerquelle, ein Auxin in einer Konzentration von etwa 0,1 mg/l bis etwa 5 mg/l, ein Cytokinin in einer Konzentration von etwa 0 mg/l bis etwa 5 mg/l und Kupfer in einer Konzentration von etwa 0,1 μM bis etwa 50 μM umfasst, und Inkubation unter Schwachlicht-Bedingungen, um so grünes regeneratives Kallusmaterial zu bilden; ein Nukleinsäuremolekül eingeführt wird in den Kallus durch Mikroprojektil-Beschuss, um einen transformierten Kallus zu produzieren; der transformierte Kallus kultiviert wird durch Überführen des Kallus in ein Zwischen Inkubationsmedium, welches eine Zuckerquelle, ein Auxin in einer Konzentration von etwa 0,1 mg/l bis etwa 5 mg/l, ein Cytokinin in einer Konzentration von etwa 0,1 mg/l bis etwa 5 mg/l und Kupfer in einer Konzentration von etwa 0,1 μM bis etwa 50 μM umfasst, und Inkubation, so dass grüne Strukturen auf dem Kallusmaterial beobachtet werden; die transformierte Pflanze produziert wird durch Überführen des Kallusmaterials, welches die grünen Strukturen umfasst, in ein Regenerationsmedium, und Inkubation, so dass Sprossen erhalten werden und Überführen der Sprossen in Bewurzlungsmedium, um transformierte Weizenpflanzen zu erhalten.
Das Verfahren nach Anspruch 1, worin die Pflanze Hafer ist; der Kallus produziert wird durch Platzieren eines Hafer-Samens auf ein Kallus-Induktionsmedium, welches eine Zuckerquelle, ein Auxin in einer Konzentration von etwa 0,1 mg/l bis etwa 5 mg/l, ein Cytokinin in einer Konzentration von 0 mg/l bis etwa 5 mg/l und Kupfer in einer Konzentration von etwa 0,1 μM bis etwa 50 μM enthält, und Inkubation unter Schwachlicht-Bedingungen, um so grünes regeneratives Kallusmaterial zu bilden; ein Nukleinsäuremolekül eingeführt wird in den Kallus durch Mikroprojektil-Beschuss, um einen transformierten Kallus zu produzieren; grüne Strukturen produziert werden auf dem transformierten Kallus durch Überführen des Kallus in ein Zwischen-Indubationsmedium, welches eine Zuckerquelle, ein Auxin in einer Konzentration von etwa 0,1 mg/l bis etwa 5 mg/l, ein Cytokinin in einer Konzentration von etwa 0,1 mg/l bis etwa 5 mg/l und Kupfer in einer Konzentration von etwa 0,1 μM bis etwa 50 μM umfasst, und Inkubation solchermaßen, dass grüne Strukturen auf dem Kallusmaterial beobachtet werden; die transformierte Pflanze produziert wird durch Überführen des Kallusmaterials, welches die grünen Strukturen umfasst, in ein Regenerationsmedium, und Inkubation, so dass Sprossen erhalten werden, und Überführen der Sprossen in Bewurzlungsmedium, um transformierte Haferpflanzen zu erhalten.
Das Verfahren nach Anspruch 1, worin die Pflanze eine Rasen- oder Futtergraspflanze ist; der Kallus produziert wird durch Platzieren eines Rasen- oder Futtergrassamens auf ein Kallus-Induktionsmedium, welches eine Zuckerquelle, ein Auxin in einer Konzentration von etwa 0,1 mg/l bis etwa 5 mg/l, Cytokinin in einer Konzentration von 0 mg/l bis etwa 5 mg/l und Kupfer in einer Konzentration von etwa 0,1 μM bis etwa 50 μM umfasst, und Inkubation unter Schwachlicht-Bedingungen, um so grünes regeneratives Kallusmaterial zu bilden; ein Nukleinsäuremolekül eingeführt wird in den Kallus durch Mikroprojektil-Beschuss, um einen transformierten Kallus herzustellen; der transformierte Kallus kultiviert wird durch Überführen des Kallus in ein Zwischen-Inkubationsmedium, welches eine Zuckerquelle, ein Auxin in einer Konzentration von etwa 0,1 mg/l bis etwa 5 mg/l, ein Cytokinin in einer Konzentration von etwa 0,1 mg/l bis etwa 5 mg/l und Kupfer in einer Konzentration von etwa 0,1 μM bis etwa 50 μM umfasst, und Inkubation solchermaßen, dass grüne Strukturen auf dem Kallusmaterial beobachtet werden; die transformierte Pflanze produziert wird durch Überführen des Kallusmaterials, welches die grünen Strukturen umfasst, in ein Regenerationsmedium, und Inkubation solchermaßen, dass Sprossen erhalten werden, und Überführen der Sprossen in Bewurzlungsmedium, um transformierte Rasen- oder Futtergraspflanzen zu erhalten.
Ein Verfahren zur Produktion von grünem regenerativen Pflanzengewebe, geeignet zur Transformation von einer monokotyledonen Pflanze, umfassend: (a) Abnahme eines unreifen Embryos von der Pflanze; (b) Inkubation des unreifen zygotischen Embryos unter Schwachlicht-Bedingungen auf einem Kallus-Induktionsmedium, welches einen Zucker, ein Auxin in einer Konzentration von etwa 0,1 mg/l bis etwa 5 mg/l, ein Cytokinin in einer Konzentration von etwa 0 mg/l bis etwa 5 mg/l und Kupfer in einer Konzentration von etwa 0,1 μM bis etwa 50 μM enthält, um so Kallusmaterial zu bilden. (c) Überführen des Kallus in ein Zwischen-Inkubationsmedium, welches ein Auxin in einer Konzentration von etwa 0,1 mg/l bis etwa 5 mg/l, ein Cytokinin in einer Konzentration von etwa 0,1 mg/l bis etwa 5 mg/l, eine Zuckerquelle und Kupfer in einer Konzentration von etwa 0,1 μM bis etwa 50 μM umfasst, und Inkubation unter Schwachlicht-Bedingungen, um so grünes regeneratives Pflanzengewebe, welches geeignet ist zur Transformation, zu bilden.
Ein Verfahren zur Produktion einer transformierten Pflanze, umfassend das Einführen eines Nukleinsäuremoleküls in ein grünes regeneratives Pflanzengewebe produziert nach Anspruch 22.
Ein Verfahren zur Erzeugung regenerativen grünen Pflanzengewebes geeignet zur Transformation von einer monokotyledonen Pflanze, umfassend: (a) Inkubation eines Samens der Pflanze unter Schwachlicht-Bedingungen auf einem Kallus-Induktionsmedium, welches eine Zuckerquelle, ein Auxin in einer Konzentration von etwa 0,1 mg/l bis etwa 5 mg/l, ein Cytokinin in einer Konzentration von etwa 0 mg/l bis etwa .50 mg/l und Kupfer in einer Konzentration von etwa 0,1 μM bis etwa 50 μM umfasst, um so Kallusmaterial zu bilden. (b) Überführen des Kallus in ein Zwischen-Inkubationsmedium, welches ein Auxin in einer Konzentration von etwa 0,1 mg/l bis etwa 5 mg/l, ein Cytokinin in einer Konzentration von etwa 0,1 mg/l bis etwa 5 mg/l, eine Zuckerquelle und Kupfer in einer Konzentration von etwa 0,1 μM bis etwa 50 μM umfasst, und Inkubation unter Schwachlicht-Bedingungen, um so grünes regeneratives Pflanzengewebe geeignet zur Transformation zu bilden.
Ein Verfahren zur Produktion einer transformieren Pflanze, welches das Einführen eines Nukleinsäuremoleküls in grünes regeneratives Pflanzengewebe, das nach Anspruch 24 produziert wurde, umfasst.
Das Verfahren zur Produktion grünen regenerativen Pflanzengewebes nach Anspruch 22, worin die Pflanze eine Weizenpflanze ist: worin die Kallus-Materialien hoch embryonale Tochtergewebsstrukturen sind.
Ein Verfahren zur Produktion einer transformierten Pflanze, welches das Einführen eine Nukleinsäuremoleküls in grünes regeneratives Pflanzengewebe, das nach Anspruch 26 produziert wurde; umfasst.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 17–27, worin die Zuckerquelle Maltose umfasst.
Eine transgene Pflanze, produziert durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1–14 oder 17-28.
Eine transgene Pflanze, die ein Nachkomme einer transformierten Pflanze nach Anspruch 29 ist.
Samen einer transgenen Pflanze nach Anspruch 29 oder 30.
Ein Verfahren zur Produktion einer transgenen Pflanze, umfassend: (a) Produktion einer transformierten Pflanze durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1-28. (b) Produktion einer transgenen Pflanze, die ein Nachkomme der transformierten Pflanze ist.