DE69835672T2

DE69835672T2 - Methoden zur pflanzentransformation

Info

Publication number: DE69835672T2
Application number: DE69835672T
Authority: DE
Inventors: Geneviève Durham HANSEN
Original assignee: Syngenta Participations AG
Current assignee: Syngenta Participations AG
Priority date: 1997-06-02
Filing date: 1998-05-29
Publication date: 2007-08-16
Anticipated expiration: 2018-05-30
Also published as: HU226212B1; HUP0002903A3; BR9809899B1; KR20010013310A; BRPI9816263B1; MX9911116A; EP0986299B1; CN1150320C; HUP0002903A2; ZA984681B; IL132768A; IL132768A0; TR199902941T2; RU2226549C2; MX257801B; UA72443C2; BRPI9809899B8; JP2002502252A; AU8535598A; ATE336890T1

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zum Transformieren von Pflanzen unter Anwendung von Agrobacterium durch Ausführen der Transformation in Gegenwart eines Mittels bzw. Agens, das durch Agrobacterium induzierte Nekrose inhiziert, und/oder unter Anwendung eines Stammes von Agrobacterium, der keine Nekrose induziert.
Das erste Verfahren und immer noch eines der am häufigsten verwendeten Verfahren für die Einführung von genetischem Fremdmaterial in Pflanzen nutzt das natürliche Transformationssystem von Agrobacterium spp. unter Anwendung von rekombinanten Ti- (tumorinduzierenden) oder Ri- (wurzelinduzierenden) Plasmiden, wobei die T-DNA ein Gen von Interesse umfasst. Das Gen von Interesse wird in das genetische Pflanzenmaterial durch den gleichen Mechanismus eingebaut, wie er in dem natürlichen System verwendet wird, um die Onkogene einzubauen, oder Opin-Biosynthesegene.
Obwohl Agrobacterium-Transformation gut bei Pflanzen funktioniert, die durch Agrobacterium in der Wildform natürlich infiziert und transformiert werden, um Tumore und/oder Haarwurzeln zu bilden, funktioniert sie nicht gut bei anderen Pflanzen. Beispielsweise sind Mitglieder der Gräserfamilie (Gramineae), wie Mais, dafür bekannt, Tumore nach Agrobacterium-Exposition zu bilden, und haben allgemein gezeigt, dass sie gegen Agrobacterium-Transformation sehr resistent sind. Ishida et al., Nature Biotechnology (1996) 14: 745-750, haben über eine Transformation von Embryonen aus einer bestimmten Maislinie (A188) und ihren Hybriden unter Anwendung von Agrobacterium mit „superbinären" Vektoren berichtet, jedoch ist die Reproduzierbarkeit dieser Ergebnisse und die Anwendbarkeit dieses Systems auf andere Maislinien und/oder Anwen dung von Agrobacterium mit anderen Vektoren unklar. Es gab auch Berichte über Agrobacterium-Transformation von Mais unter Anwendung von apicalem Meristem als Zielgewebe, jedoch die geringe Wirksamkeit von apicalem Meristem als Zielgewebe verglichen mit beispielsweise embryogenem Kallus lässt diesen Ansatz als weniger optimal erscheinen. Selbst einige zweikeimblättrige Pflanzen, wie Wein, Sojabohnen oder Paprika, die für Agrobacterium-Infektionen und Tumorbildung in der Wildnis anfällig sind, haben sich im Labor trotzdem als schwierig zu transformieren erwiesen, weil das für die Transformation und Regenerierung bevorzugte Zielgewebe schlecht auf Agrobacterium-Exposition zu reagieren scheint. Mangelndes Verständnis über den Mechanismus der Resistenz von Agrobacterium-Infektion und Tumorbildung hat sich als ein Hindernis erwiesen, um eine Lösung dafür zu entwickeln oder um gar das Problem von Agrobacterium-Transformation bei Pflanzen, die gegen Agrobacterium-Transformation resistent sind, wie Gramineae, geeignet zu bewerten.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass Agrobacterium in der Lage ist, in Pflanzenzellen, insbesondere in der Familie Gramineae, beispielsweise Mais, apoptotische Nekrose zu induzieren. Verfahren zur Selektion und Erzeugung von Agrobacterium, welche weniger kompetent sind, um Nekrose zu induzieren, wurden gefunden, wie auch Verfahren zum Inhibieren der Nekrosereaktion in zu transformierenden Zellen.
Die in Gramineaezellkultur nach Exposition von Agrobacterium beobachtete Nekrose ist ein programmierter Zelltod, durch den die Zelle scheinbar durch einen Signalleitungsmechanismus ihren eigenen Tod einrichtet. Er ist verschieden vom passiven Zelltod, d.h. Nekrose, die Zerfall von Membranintegrität und anschließendes Quellen beinhaltet, welches Lyse ergibt, beispielsweise wie nach Exposition von verschiedenen Toxinen beobachtet. Zellen, die programmiertem Zelltod unterliegen, zeigen charakteristische morphologische Veränderungen und DNA-Fragmentierung, was insgesamt den Vorgang von Apoptose definiert, und durch einen Mechanismus, der de-novo- Genexpression beinhaltet, implementiert werden. Die stereotypen Eigenschaften von in Tierzellen beschriebener Apoptose sind Schrumpfung, Verlust von Zelle-zu-Zelle-Kontakt in organisierten Geweben, Kondensation von Nukleus und Chromatin, Fragmentierung von DNA (DNA-„Laddering") und Kern- und Membranblasenbildung. Wir haben gezeigt, dass gemeinsame Kultivierung von Agrobacterium mit Mais oder Weizengeweben ein Verfahren ergibt, das zu Apoptose in Tierzellen sehr analog ist, wobei Zelltod durch DNA-Spaltung in oligonukleosomale Fragmente charakterisiert ist und definierte morphologische Veränderungen. In Maiszellen, die Agrobacterium exponiert sind, erzeugt Ca²⁺ die Intensität von DNA-Fragmentierung, wohingegen Zn²⁺ die entgegengesetzte Wirkung aufweist, welche parallel der Wirkung von diesen zweiwertigen Kationen auf endogene Endonukleasen ist, die für DNA-Spaltung während Apoptose in Tierzellen verantwortlich ist. Diese Fragmentierung sinkt auch durch Zusatz von Cycloheximid, was ein Nachweis ist, dass das Verfahren de-novo-Genexpression erfordert. Über programmierten Zelltod in Reaktion auf eine Exposition von Agrobacterium wurde bislang nicht berichtet.
Es wurde weiterhin gefunden, dass diese Agrobacterium induzierte Nekrose (AIN), die bei Gramineaen beobachtet wurde, durch die Verwendung von AIN inhibierenden Mitteln, entweder chemischen Verbindungen, wie Silbernitrat, oder AIN inhibierenden Nukleotidsequenzen stabil integriert oder transient operativ in der zu transformierenden Zelle inhibiert wird. Es wurde ebenfalls durch Screeningsammlungen von Agrobacterium gefunden, dass Agrobacterium-Stämme in ihrer Fähigkeit, Nekrose zu induzieren, so variieren, dass die Stämme, die zum Transformieren von resistenten Pflanzen, wie Gramineae, geeignet sind, selektiert werden könnten.
Folglich schließen die verschiedenen erfindungsgemäßen Ausführungsformen das Nachstehende ein: ein Verfahren zum Transformieren einer Pflanzenzelle nach Anspruch 1.
Auch offenbart wird ein Verfahren zum Transformieren einer Pflanzenzelle mit einem Gen von Interesse, das Exponie ren der Pflanzenzelle Agrobacterium unter Bedingungen umfasst, die AIN inhibieren, wobei die Bedingungen gemeinsames Aktivieren einer Pflanzenzelle nach Wärmeschockbehandlung umfassen, wobei das Agrobacterium ein oder mehrere Plasmide (Vektoren) umfasst, die ein oder mehrere Gene von Interesse umfassen.

1.1. In einer Ausführungsform des vorangehenden Verfahrens ist das AIN inhibierende Mittel ein chemischer Inhibitor. Der chemische Inhibitor ist vorzugsweise eine Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ethyleninhibitoren (beispielsweise 2,5-Norbornandien, Norbornen, Silberthiosulfat und Silbernitrat), Ethylensyntheseinhibitoren (beispielsweise Aminoethoxyvinylglycin (AVG), Kobaltsalze, Acetylsalicylsäure oder Salicylsäure), Gibberelinantagonisten (beispielsweise Abscisinsäure (ABA)) und Phosphataseinhibitoren (beispielsweise Okadasäure). Am meisten bevorzugt ist der chemische Inhibitor ein Ethyleninhibitor, vorzugsweise Silbernitrat. Proteine und Peptide können als chemische Inhibitoren ebenso gut wirken. Beispiele sind natürlich vorkommende Proteine, wie DAD-1, die Baculovirusinhibitoren von Apoptose (IAPs), Baculovirus p35 oder synthetische Peptidanaloge von Caspasen, die Apoptose auslösen können. Ein chemischer Inhibitor liegt geeigneterweise in einer wirksamen Konzentration, beispielsweise für Silbernitrat in einer Konzentration von 0,1 bis 20 mg/l, vorzugsweise 1 bis 10 mg/l, vor.
1.2.1. In einer alternativen Ausführungsform von diesem Verfahren ist das AIN inhibierende Mittel eine Nucleotidsequenz. Die AIN inhibierende Nucleotidsequenz kann AIN direkt oder durch Codieren einer AIN inhibierenden mRNA, die für ein AIN inhibierendes Protein codiert, inhibieren. Beispielsweise kann sie ein Antisense-Oligonucleotid oder ein Gen, das Antisense-mRNA codiert, sein, das Antisense zu einem Gen ist, das ein Nekrose-assoziiertes Enzym (beispielsweise Protease, Kinase oder Phosphatase) oder regulatorisches Protein codiert. Alternativ kann sie umfassen, die codierende Region eines Gens, das in der Lage ist, Apoptose unter Steue rung eines Promotors zu inhibieren, der in Pflanzen exprimieren kann, beispielsweise eine Codierungsregion von einem Säuger-bcl-1-Gen unter Steuerung eines Promotors, der in Pflanzen exprimieren kann, eine Codierungsregion von einem Apoptose-inhibierenden Gen aus einem Baculovirus, wie p35 oder pIAP, oder ein Gen, das Krankheitsreaktion in Pflanzen unterdrücken kann, beispielsweise nahG, dad-1 oder mio. Eine AIN inhibierende Nukleotidsequenz, die ein AIN inhibierendes Protein exprimiert, kann gegebenenfalls zur Expression in der Wirtspflanze durch Erzeugen einer synthetischen Nukleotidsequenz, die das gleiche Protein codiert, jedoch unter Anwendung von Codonen, die von der Wirtspflanze bevorzugt werden, und unter Vermeiden von Nukleotidsequenzen, beispielsweise Polyadenylierungssignale oder Spaltstellen innerhalb der Codierungsregion, die optimale Expression in der Wirtspflanze beeinträchtigen können, analog zu den in US-5380831 oder US-5610042 beschriebenen Verfahren, angepasst werden.
1.2.2. Die AIN inhibierende Nukleotidsequenz kann stabil in das Genom der zu transformierenden Pflanze eingebaut werden oder kann nur transient vorliegen oder operabel, beispielsweise bei oder um die Zeit, wo die Zelle dem Agrobacterium exponiert ist. Transiente Expression kann erhalten werden, beispielsweise unter Anwendung eines Agroinfektionssystems, worin die T-DNA zwei Geminiviren im Tandem trägt, sodass ein virales Replikon, das die AIN inhibierende Nukleotidsequenz trägt, in der Zelle repliziert werden kann. In diesem System wird das Virus typischerweise nicht in das Pflanzengenom integriert, wird sich jedoch zu einer hohen Kopiezahl vervielfältigen und einen hohen Anteil an transienter Expression bereitstellen. So geprimte Zellen können dann, um resistent gegen Nekrose zu sein, unter Anwendung von Agrobacterium mit Ti-Plasmiden, die das Gen von Interesse umfassen, transformiert werden, welche in das Genom eingebaut werden, obwohl das Virus durch Regenerierung verdünnt ist, und werden nicht zu dem Saatgut überführt. Somit werden die Nachkommen und Deszendenten der infizierten Pflanze stabil mit dem Gen von Interesse transformiert, jedoch nicht mit der AIN inhibierenden Nukleotidsequenz. Transiente Expression kann alternativ durch Einführen von kurzen AIN inhibierenden Oligonukleotidsequenzen in die Pflanze, beispielsweise Antisensesequenzen, erhalten werden.
1.3. In einer weiteren alternativen Ausführungsform wird AIN durch Wärmeschockbehandlung des vor der gemeinsamen Kultivierung mit Agrobacterium zu transformierenden Pflanzengewebes vermindert oder inhibiert. Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren wie vorstehend beschrieben bereit, wobei die Wärmeschockbehandlung bei 40 bis 50°C, vorzugsweise bei 42 bis 48°C, wobei 45°C eine bevorzugte Temperatur für Mais ist, ausgeführt werden. Die Behandlung dauert zwei bis zehn Minuten und vorzugsweise vier bis acht Minuten. Die Erfindung stellt auch ein Verfahren nach Anspruch 7 bereit. Ebenfalls offenbart wird ein Verfahren zur Herstellung einer fertilen transgenen Pflanze, die Transformieren von Pflanzengewebe durch das vorstehende Verfahren von 1 und Regenerieren des so transformierten Gewebes umfasst. Vorzugsweise ist das Gewebe ausgewählt aus unreifen Embryonen oder embryogenen Kalli, beispielsweise Maiskallus Typ I. Wenn das Gewebe unreifer Embryo ist, umfasst das Verfahren vorzugsweise weiterhin Anordnen des Embryonen auf Kallus Startmedium entweder vor oder nach Exposition von Agrobacterium und Regenerieren der Pflanze aus dem so erhaltenen embryogenen Kallus. Vorzugsweise ist das Gen von Interesse (oder eines von ihnen) ein selektierbarer oder bonitierbarer Marker, der Selektion oder Identifikation von transformierten Zellen, transformierten Geweben und/oder regenerierten transformierten Pflanzen erlaubt.
3. Die Verwendung eines AIN inhibierenden Mittels, beispielsweise ein chemischer Inhibitor von AIN (beispielsweise ein Ethyleninhibitor, zum Beispiel Silbernitrat) oder eine AIN inhibierende Nukleotidsequenz (beispielsweise eine, die für eine AIN inhibierende mRNR oder Protein codiert) in einem Verfahren zur Agrobacterium-Transformation in einer Pflanze oder Gewebe oder Zelle davon oder einem Verfahren zur Herstellung einer fertilen transgenen Pflanze, beispielsweise ein Verfahren nach 1 oder 2 vorstehend.
4. Eine transgene Pflanze, die durch das Verfahren von 2 vorstehend hergestellt wurde, oder Samen oder Nachkommenschaft davon.
5. Eine Pflanze, Pflanzengewebe oder Pflanzenzelle, die eine Nukleotidsequenz von heterologem Ursprung umfasst, welche AIN inhibiert, beispielsweise eine synthetische Nukleotidsequenz oder eine Nukleotidsequenz, die von dem Genom von einer verschiedenen Spezies von Organismus abgeleitet ist.
6. Eine Kultur von Pflanzenzellen oder Geweben, beispielsweise zur Verwendung bei der Transformation von Gramineae, umfassend a) einen chemischen Inhibitor von AIN, b) ein Agrobacterium, umfassend ein Plasmid, das ein Gen von Interesse umfasst, und c) Wasser und essenzielle Salze. Der chemische Inhibitor liegt geeigneterweise in einer Nekrose-inhibierenden Konzentration vor. Der chemische Inhibitor ist vorzugsweise eine Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ethyleninhibitoren (beispielsweise 2,5-Norbornadien, Norbornen, Silberthiosulfat und Silbernitrat), Ethylensyntheseinhibitoren (beispielsweise Aminoethoxyvinylglycin (AVG), Kobaltsalze, Acetylsalicylsäure oder Salicylsäure), Gibberelinantagonisten (beispielsweise Abscisinsäure (ABA)) und Phosphataseinhibitoren (beispielsweise Okadinsäure). Am meisten bevorzugt ist der chemische Inhibitor Silbernitrat, beispielsweise in einer Konzentration von 0,1 bis 20 mg/l, vorzugsweise 1 bis 10 mg/l. Die optimale Zusammensetzung und Konzentration von essentiellen Salzen sind wie auf dem Fachgebiet bekannt und können in Abhängigkeit von den Arten, Typ und Entwicklungsstufe der Zellen oder Gewebe etwas variieren, sind jedoch im Allgemeinen derart, dass die Ionen- und Nährmittelkonzentrationen des Mediums (beispiels weise Konzentrationen von Nitraten, Kaliumionen, Phosphaten, Calciumionen, Magnesiumionen, Natriumionen und Chlorionen) bei Anteilen gehalten werden, die von den Pflanzenzellen und dem Agrobacterium gut toleriert werden. Das Kulturmedium kann gegebenenfalls weiterhin geeignete Nährmittel (beispielsweise Zucker, wie Saccharose), Vitamine, Aminosäuren, Hormone und andere Komponenten (beispielsweise 2,4-D), wie auf dem Fachgebiet von Pflanzenzelle und Gewebskultur bekannt, umfassen. Die Pflanze ist vorzugsweise von der Familie Gramineae, beispielsweise Mais. Die Zellen oder Gewebe umfassen vorzugsweise embryogenen Kallus, beispielsweise Kallus Typ I oder Typ II.
7. Ein Verfahren zum Transformieren einer totipotenten Zelle von einer Pflanze der Familie Gramineae, umfassend Exponieren einer Population von totipotenten Zellen oder Gewebe, das totipotente Zellen umfasst, dem Agrobacterium, das ein oder mehrere Plasmide umfasst, die ein oder mehrere Gene von Interesse umfassen, worin das Agrobacterium von einem Stamm ist, der keine signifikanten Anteile von Nekrose in der Population bei einer Expositionsdauer und Konzentration induziert, die ausreichend ist, um Transformation der Zelle zu erreichen. Das Gewebe ist vorzugsweise von apikalen Meristem verschieden, beispielsweise vorzugsweise undifferenziertes Gewebe, beispielsweise plattierte zygotische Embryonen oder embryogener Kallus, vorzugsweise embryogener Kallus während der Anfangsphase (beispielsweise bis zu 28 Tage, vorzugsweise bis zu 14 Tage von Plattieren auf Anfangsmedium) oder seriell vermehrungsfähiger embryogener Kallus, beispielsweise Kallus Typ I oder Typ II.
8. Ein Verfahren zum Bestimmen der Eignung von einem Agrobacterium-Stamm zur Verwendung in der Transformation einer regenerierbaren Zelle einer Pflanze der Familie Gramineae, die Exponieren einer Population von den regenerierbaren Zellen der Pflanze auf den Agrobacterium-Stamm und Beobachten oder Bestimmen der Menge an Nekrose in der Zellpopulation umfasst.
9. Ein Agrobacterium-Stamm, der genetisch modifiziert wurde, um Expression von dem Agrobacterium-Nekrosefaktor oder einem Derivat von einem solchen modifizierten Stamm zu vermindern oder zu entfernen.

Agrobacterium-Nekrosefaktor ist der wärmelabile Faktor, der in konzentriertem Überstand beobachtet wird, der Nekrose induzieren kann, beispielsweise programmierter Zelltod in Maisembryonen.
Die Unverträglichkeit zwischen Agrobacterium und Maiszellen beinhaltet wahrscheinlich einige genetische Komponenten. Die vorliegende Erfindung beschreibt drei Gene von Agrobacterium, die in die Zelltodreaktion von Maisgeweben einbezogen sind. Sie werden durch Screening einer BAC-Library von Agrobacterium identifiziert. Drei unabhängige BAC werden gefunden, um Zelltod auszulösen, und zeigen Homologie mit xylA-xylB, virB1 und acvB. Es ist möglich, dass die angeführten Gene nur ein Beginn der Gene sind, die für die Unverträglichkeit von Agrobacterium mit Maisgeweben verantwortlich sind. Die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Pflanzenzelle ist vorzugsweise von einer Pflanzenspezies oder Art, die keine Gallen oder Haarwurzeln nach Agrobacterium-Transformation erzeugt. Vorzugsweise ist die Pflanzenspezies ein Mitglied der Gräserfamilie (Gramineae), besonders bevorzugt Mais oder Weizen, insbesondere Mais. Die Pflanzenzelle ist vorzugsweise eine totipotente Zelle, d.h. eine Zelle, die sich selbst in einer Pflanze, vorzugsweise einer fertilen Pflanze, regererieren kann. Totipotente Zellen liegen beispielsweise in unreifen Embryonen und embryogenen Kalli vor. Das Zielgewebe ist vorzugsweise von apikalem Meristem verschieden. Bevorzugter umfasst das Zielgewebe undifferenziertes Gewebe, beispielsweise plattierte zygotische Embryonen oder embryogenen Kallus. Der embryogene Kallus kann mit dem Embryo während der Kallusstartphase (beispielsweise der Zeitraum bis zu 28 Tage, vorzugsweise bis zu 14 Tage vom Plattieren des unreifen Embryonen auf Startmedium) assoziiert sein oder kann seriell vermehrungsfähiger embryogener Kallus, bei spielsweise Kallus Typ I oder Typ II, sein. Maiskallus Typ I ist ein bevorzugtes Gewebe, das totipotente Zellen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfasst. Das Agrobacterium ist vorzugsweise ausgewählt aus A. tumefaciens und A. rhizogenes. Vorzugsweise ist der Agrobacterium-Stamm ein A. tumefaciens Stamm, besonders bevorzugt ein Nopalin anwendender Stamm. Wenn der Agrobacterium-Stamm ein A. rhizogenes Stamm ist, ist er vorzugsweise ein Agropine oder Mannopine anwendender Stamm. Besonders bevorzugt ist das Agrobacterium ein Agrobacterium, das keine Nekrose in Gramineae induziert, beispielsweise ein Agrobacterium, ausgewählt aus A. tumefacies Stämmen A und B. Agrobacterium-Stämme A und B wurden bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852/USA, unter ATCC-Bezeichnungsnummern 55964 bzw. 55965 am 2. Mai 1997 gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt.
Das Gen von Interesse ist vorzugsweise ein Gen für Herbizidresistenz, Krankheitsresistenz und Insektenresistenz oder ist ein selektierbarer oder bonitierbarer Marker und umfasst einen pflanzenoperablen Promotor, eine Codierungsregion und eine 3'-Terminatorregion. Herbizidresistenzgene schließen das AHAS-Gen für Resistenz auf Imidazolidinon oder Sulfonylharnstoffherbizide, das Pat- oder Bargen für Resistenz auf Bialaphos oder Glufosinat, EPSP-Synthasegen für Resistenz auf Glyphosat usw. ein. Krankheitsresistenzgene schließen Gene für antibiotische synthetische Enzyme, beispielsweise für Pyrolnitrin-synthetische Enzyme, Fflanzen-abgeleitete Resistenzgene und dergleichen ein. Insektenresistenzgene schließen Gene für insektizide Proteine von Bazillus thuringiensis ein. Selektierbare Marker schließen herbizide Resistenzgene und antibiotische (beispielsweise Hygromycin oder Kanamycin) Resistenzgene sowie mögliche selektierbare Marker, wie das Gen für Mannosephosphatisomerase, ein. Bonitierbare Marker schließen Gene für leicht bonitierbare Enzyme, wie das gus-Gen und das cat-Gen, ein. Das Plasmid kann mehr als ein Gen von Interesse umfassen und/oder das Agrobacterium kann ver schieden Plasmide mit verschiedenen Genen von Interesse umfassen.
Der wie hierin verwendete Begriff Agrobacterium induzierte Nekrose (AIN) bezieht sich auf beliebigen Agrobacterium vermittelten Pflanzenzelltod, schließt jedoch insbesondere Agrobacterium induzierten programmierten Zelltod ein.
BEISPIELE
Beispiel 1 – Mechanismus der Wirkung von Nekrose auf Mais, exponiert auf Agrobacterium.
a. Aufzeigen von Nekrose von Mais, jedoch nicht Tabak, in Gegenwart von Agrobacterium
Maisembryogene Kalli und Embryonen haben sich für die Transformation durch Agrobacterium als besonders schwierige Gewebe erwiesen. Die nachstehenden Versuche wenden Mais-Inzuchtlinien (Zea mays L.) HE/89 an, und eine Linie hier bezeichnet als Elite 1. Staubartig zerfallender embryogener Kallus von der Maislinie HE/89 wurde von Gunther Donn bereitgestellt. HE/89 wird in Mórocz, S., Donn, G., Németh, J. und Dudits, D. (1990), Theor. Appl. Genet.80: 721-726) beschrieben. Elite 1 ist eine von Novartis eingetragene Elitelinie, verwandt zu B73. Die Suspensionskultur von Elite 1 wird von staubartig zerfallendem embryogenem Kallus, ausgewählt aus unreifen Embryonen, gestartet. Die HE/89-Linie wird in einem modifizierten flüssigen N6-Medium, das mit 500 mg/l Bactotrypton, 30 g/l Saccharose und 0,5 mg/l 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) (N6M) ergänzt wurde, wachsen lassen. Die Elite-1-Linie wird in flüssigem N6-Medium (Chu et al., 1975), ergänzt mit 30 g/l Saccharose und 2 mg/l 2,4-D (2N63S), wachsen lassen. Die Nikotiana-Tabakzelllinie NT-1, gewachsen in Murashige- und Skoog-Medium, ergänzt mit 2 mg/l 2,4-D und Saccharose (30 g/l) (MS3S), wird als eine Agrobacterium anfällige Kontrolle verwendet. Suspensionskulturen werden in flüssigem Medium an einem Rotationsschüttler (120 U/min) gehalten und alle sieben Tage subkultiviert.
Bakterien werden in YP-Medium (5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l Pepton, 5 g/l NaCl, pH 6,8) für 24 h bei 28°C wachsen lassen. Bakterien werden zentrifugiert und in dem geeigneten Pflanzenmedium resuspendiert. Für die Inokulation von Elite-1-HE/89- und NT-1-Pflanzenzellen werden Bakterien in 2N63SM-, N6M- bzw. MS3S-flüssigem Medium resuspendiert.
Bald nach Inokulation von embryogenem Maiskallus ändern sich viele der Zellen nach nekrotisch (Tabelle 1). Nekrose wird auch nach dem Transfer der behandelten embryogenen Kalli zu einem bakterienfreien Cefotaxim enthaltenden Medium beobachtet. Gemeinsame Kultivierung von Maiszellen mit sehr verdünnten Kulturen von Agrobacterium für eine sehr kurze Zeit ist ausreichend, um nekrotische Reaktion oder Inhibierung des Wachstums von Maisinzucht-Elite-1 zu induzieren. Für embryogene HE/89 Kalli vermindert eine kurze Zeit von gemeinsamer Kultivierung nekrotische Veränderung in gewissem Ausmaß, verhindert jedoch keine vollständige Nekrose. In Kontrollversuchen verursacht Cefotaxim nicht, dass das Maisgewebe zu nekrotisch wird. Somit scheint es, dass der nekrotische Effekt eine Folge der Wechselwirkung zwischen Agrobacterium und Maiskalli ist. Als eine Kontrolle werden NT1-Tabakzellen auch mit Agrobacterium inokuliert, und keine Nekrogenese wird beobachtet.
Tabelle 1: Gemeinsame Kultivierung von Pflanzensuspensionszellen mit LBA4404
Staubartig zerfallender bzw. zerreibbarer embryogener Kallus von HE/89 Mais und von einem wachsenden Eliteinzuchtmais, gehalten in flüssigem Medium, werden mit Agrobacterium 10 min, 1 h, 24 h oder 48 h vorher inkubiert, um zu Cefotaxim-enthaltendem Medium zu übertragen. 50 ml von Bakterien bei einer angezeigten optischen Dichte (OD = 600 nm) werden zu 10 ml Gewebskulturmedium, das 1 ml gepacktes Zellvolumen enthält, gegeben. Wenn die Kultur länger als zwei Tage inkubiert werden soll, werden Bakterien abgewaschen und Pflanzenzellen in dem gleichen Medium, ergänzt mit Cefotaxim (250 mg/l), resuspendiert. Die Gegenwart oder Abwesenheit von Nekrose wird 2, 4 und 7 Tage nach Inokulation bonitiert und die relative Intensität der Nekrose wird wie nachstehend ausgedrückt: + seltene Bildung von Nekrose, ++ schwache Nekrose, +++ starke Nekrose, ++++ sehr starke Nekrose
b. Nachweis für programmierten Zelltod
Um den Mechanismus von Zelltod, der durch Agrobacterium in Maisgeweben induziert wurde, zu bestimmen, wird genomische DNA aus Pflanzensuspensionszellen, geerntet 24 oder 48 Stunden nach Inokulation mit Agrobacterium, extrahiert. Die Exposition von Agrobacterium veranlasst DNA-Fragmentierung in beiden Maislinien mit einem Muster, das für internukleosomale Fragmentierung charakteristisch ist, was als ein frühes Zeichen von programmiertem Zelltod betrachtet wird. Kontrollmaiszellen und Tabakzellen, die in Kulturmedium allein gehalten werden, zeigen unter diesen Bedingungen keine DNA-Fragmentierung. Inokulation von Maiszellen mit E. coli oder mit Autoklaven behandelten Agrobakterienzellen verursacht keine DNA-Fragmentierung. Weiterhin könnten Maiszellen, die programmiertem Zelltod unterliegen, keinen Zelltod von frischen embryogenen Maisgeweben induzieren.
Ein weiterer Nachweis für Agrobacterium induzierende DNA-Fragmentierung wird durch Untersuchen der Empfindlichkeit des Verfahrens auf Zn²⁺ oder Ca²⁺ erhalten. In der Zelllinie HE/89 erhöhte Ca²⁺ die Intensität der DNA-Leitern, wohingegen Zn²⁺ bemerkenswert die genomische Fragmentierung verminderte. Diese Merkmale stimmen vollständig mit der Wirkung von diesen zweiwertigen Kationen auf die endogenen Endonukleasen, die für DNA-Spaltung während Apoptose im Tiersystem verantwortlich sind, überein. Die Intensität der Leiter wird auch durch Zusatz von Cycloheximid erhöht, ein Nachweis, dass das Verfahren de-novo-Genexpression erfordert. Diese Ergebnisse zeigen an, dass der Kontakt von Agrobacterium mit Maiszellen für den Zelltod von Maisgeweben verantwortlich ist. Fragmentierung von DNA während Apoptose wird auch in situ durch Reagenzien nachgewiesen, die mit den exponierten Hydroxylen an den Nukleosomeinheiten reagieren. 12 Tage alte Maisembryonen von einer Wachstumsinzuchtlinie von Lancaster-Abstammung werden mit LBA4404 inokuliert und auf DG4-Medium, ergänzt mit Chloramben, plattiert. Koziel, M. G. et al. 1993, Bio/Technology 11: 194-200. Apoptotische Zellen werden durch In-situ-Anfärben mit TACS-1-Kit (Trevigen) nachgewiesen, was endmarkierende DNA-Fragmente durch das Klenow-Enzym unter Verwendung von dNTP, konjugiert durch einen nachweisbaren Marker, beinhaltet, was einen dunklen unlöslichen Niederschlag ergibt, der auf genomische Fragmentierung hinweist. Cullivier, O., Pirianov, G., Kleuser, B., Vanek, P. G., Coso, O. A., Gutking, J. S. und Spiegel, S. (1996), Nature 381, 800-803. Embryonen werden in 3,7 %iger Formaldehydlösung eingeweicht und wie durch den Hersteller beschrieben verarbeitet. Um genomische DNA-Spaltung in situ nachzuweisen, werden fixierte Embryonen mit dem TACS-1-Kit behandelt. Fixierte Querschnitte werden zuerst mit Proteinase K für 5 Minuten bei Raumtemperatur behandelt und dann für 5 Minuten in 2 %iges Wasserstoffperoxid getaucht, um endogene Peroxidase zu entfernen. Nach einer kurzen Waschung mit Klenow-Puffer wurden Gewebe dann für 1 h bei 37°C mit dem Klenow-Enzym inkubiert, das exogen modifiziertes Desoxynucleotid an den 5'-Termini der gespaltenen Fragmente einbauen kann. Ein dunkler unlöslicher Nieder schlag ist hinweisend für Apoptose, die in der einzelnen Zelle erscheint, was mit einem Mikroskop nachweisbar ist.
Agrobacterium behandelte Zellen werden dunkel und in der Form nach 48 h Exposition verzerrt. Kontrollembryonen, gehalten in Kulturmedium allein oder inokuliert mit E. coli, zeigen unter diesen Bedingungen keinen Niederschlag. Es wird ebenfalls gefunden, dass nicht alle Maisgewebe ähnlich auf eine Agrobacterium-Infektion reagieren: Schösslinge bleiben intakt, während Embryonen wiederum nekrotisch sind. DNA-Fragmentierung wird auch mit Agrobacterium-Stämmen beobachtet, die von dem pathogenen Plasmid gehärtet wurden (Stämme A13b und LBA4402), was vermuten lässt, dass der programmierten Zelltod induzierende Faktor mit dem Plasmid nicht in Beziehung steht. Programmierter Zelltod wird auch beobachtet, wenn Maisembryonen 20 Minuten mit Überstand, konzentriert 20fach, von einem Zelltod induzierenden Agrobacterium (Stamm LBA 4404) inkubiert werden, jedoch nicht, wenn Embryonen mit Überstand, der in der gleichen Weise aus E. coli hergestellt wurde, in Kontakt gebracht werden. Programmierter Zelltod tritt auch nicht auf, wenn der konzentrierte Agrobacterium-Überstand 20 Minuten auf 100°C Celsius vor der Inkubation erhitzt wird.
Embryogene Maiskalli enthalten häufig Flächen von Zellen, die noch scheinbar am Leben sind, und andere Flächen, die nekrotisch sind. Die Tatsache, dass nur begrenzte Flächen sterben auch in Situationen, worin Zellen außerhalb der entsprechenden Fläche gleichzeitig dem Stimulus exponiert sind, lässt vermuten, dass temporäre oder permanente Verschiedenheit in Elementen, die die Reaktion von einzelnen Zellen auf verschiedene Stimuli in organisierten Geweben steuern, vorliegt. Die Anzahl an Zellen in einem organisierten Gewebe, die programmiertem Zelltod unterliegen, kann klein sein, verglichen mit der Gesamtmasse und das Verfahren kann asynchron sein. Die Einführung von PCD in eine oder einige Zellen als eine gegebenen Fläche oder Gewebe kann den schnellen Tod der umgebenden Zellen, wie beobachtet in Tierzellen, auslösen und die letzteren Zellen können nicht den programmierten Zelltodphenotyp zeigen, sterben jedoch trotzdem.
Beispiel 2: Inhibierung von Agrobacterium induziertem programmiertem Zelltod
Herstellung von Geweben zur Inokulation mit Agrobacterium:
Unreife Embryonen (1,2 bis 2,2 mm in der Länge) werden aseptisch 14 bis 15 Tage nach Pollenübertragung aus oberflächensterilisierten, im Gewächshaus gewachsenen Ähren entfernt und das Scutellum auf Kallus Startmedium 2DG4 + 5 mg/l Chloramben (2DG4-5Chl) plattiert. 2DG4-Medium ist Duncan's-Medium, das so modifiziert wurde, dass es 20 mg/l Saccharose enthält.
Embryonen mit Kallus Reaktion:
Unreife Embryonen werden, wie vorstehend beschrieben, sterilisiert und auf Kallus Startmedium (2DG4-5Chl) plattiert und darin 1 bis 7 Tage kultiviert. Das erhaltene Gewebe wird als Proben zur Inokulation verwendet.
Kallus Jungtyp I:
Auf Kallus Startmedium (2DG4 + 5 Chloramben) für 7 bis 20 Tage plattierte Embryonen ergeben Kallus. Diese Kalli sind typische Kalli Typ I für den verwendeten Inzuchtmais, die kompakt und relativ gut organisierte Zellcluster sind. Erhaltener embryogener Kallus wird von den Embryonen herausgeschnitten und zu Kallus Erhaltungsmedium 2DG4 + 0,5 mg/l (2,4-Dichlorphenoxy)essigsäure (2,4-D) transferiert und als Proben zur Inokulation verwendet.
Kallus Typ I:
Durch das vorstehend beschriebene Verfahren erhaltener Kallus Typ I kann auf dem Erhaltungsmedium (2DG4 + 2,4 D 0,5 mg/l) gehalten und alle zwei Wochen subkultiviert werden.
Agrobacterium:
Stamm-A-Tumefaziens LBA4404 (pAL4404, pSB1) wird in diesen Versuchen verwendet. pAL4404 ist ein unschädlich gemachtes Helferplasmid. pSB1 ist ein Plasmid von breitem Wirtsbereich, das eine Region von Homologie zu pGIGUP und ein 15,2 kB KpnI Fragment von der Virulenzregion von pTiBo542 enthält (Ishida et al., 1996; High efficiency transformation of maize (Zea mays L.), vermittelt von Agrobacterium tumefaciens, Nature Biotechnology 14, 745-750). Die Einführung von dem Plasmid pGIGUP durch Elektroporation in LBA4404 (pAL4404, pSB1) ergibt eine Co-Integration von pGIGUP und pSB1. Die T-DNA von diesem Plasmid enthält ein Pflanzenexprimierbares Patgen, das von dem Upiquitinpromotor gesteuert wird, um Resistenz auf Phosphinotrizin bereitzustellen, und ein Gen für GUS mit einem Intron in dem endterminalen Codon der Codierungssequenz, die durch den Galvinpromotor betrieben wird. Dieses Intron-GUS-Gen exprimiert GUS-Aktivität in der Pflanzenzelle, jedoch nicht in Agrobacterium.
Bakterielles Wachstum (Züchtung):
Agrobacterium wird drei Tage in YP-Medium (5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l Pepton, 5 g/l NaCl, 15 g/l Agar, pH 6,8), ergänzt mit 50 mg/l Spectinomycin und 10 mg/l Tetracyclin, wachsen lassen. Bakterien werden in einer Schleife gesammelt und in flüssigem N6-Medium bei einer Dichte im Bereich von 10⁹ bis 5 × 10⁹ Zellen/ml suspendiert. Agrobacterium-Zellen können auch von einer Übernachtkultur YP-Medium gesammelt und in flüssigem N6-Medium resuspendiert werden.
Die gemeinsame Kultivierung in Gegenwart oder Abwesenheit von Silbernitrat:
Maisgewebe, hergestellt wie vorstehend beschrieben, werden mit Agrobacterium inokuliert. Maisgewebe werden in der bakteriellen Suspension für 5 bis 10 Minuten eingeweicht und dann auf Medium mit oder ohne Silbernitrat (1 bis 10 mg/l) plattiert. Gewebe werden auch mit einem 5 Mikroliter Tropfen 10⁹ bis 5 × 10⁹ Zellen/l von einer Agrobacterium-Suspension, die oben auf das Gewebe gegeben wurde, inokuliert. Nach Inokulation werden Maisgewebe im Dunkeln bei 25°C mit oder ohne Silbernitrat in dem Medium (1 bis 10 mg/l) kultiviert. 2 oder 3 Tage nach Inokulation werden Gewebe auf das gleiche Medium, ergänzt mit Cefotaxim (250 mg/l), mit oder ohne Silbernitrat transferiert.
Ergebnisse:
Die Empfindlichkeit von Maisembryonen und embryogenen Maiskalli auf Agrobacterium.
Embryogene Kalli können sich aus Maisembryonen entwickeln, wenn auf Kallus Startmedium plattiert wird. Die aus Embryonen entwickelte Zelllinie bleibt stark embryogen, wenn sie auf 2,4-D enthaltendem Medium gehalten wird. Die Empfindlichkeit von diesen embryogenen Kalli und Embryonen von einer Maisinzuchtlinie auf Agrobacterium LBA4404 wird bonitiert. Ein bemerkenswertes Bräunen des Gewebes wird nach gemeinsamer Kultivierung von Agrobacterium und Maisgeweben beobachtet. Diese Reaktion wird auch mit von pathogenem Plasmid geheilten LBA4402 beobachtet.
Kontrollembryonen und embryogene Kalli, die gemeinsam mit Escherichia coli kultiviert und den gleichen Verfahren unterzogen wurden, zeigen keinen Zelltod oder signifikantes Bräunen. Somit erscheint es, dass der Zelltod eine Folge der Wechselwirkung zwischen Maiszellen und Agrobacterium ist. Es scheint, dass Embryonen nicht auf Agrobacterium empfindlicher sind als embryogener Kallus. Eine Konzentration von 10⁹ Zellen/ml ist ausreichend, um Zelltod zu induzieren. Weiterhin ist eine kurze Exposition (5 min) ausreichend, um diese Reaktion zu induzieren.
Der Effekt des Zusetzens von Silbernitrat zu dem gemeinsamen Kultivierungsmedium und zu dem Kallus Startmedium wird bestimmt. Die Zugabe von Silbernitrat erlaubt die Gewinnung von gesunden Geweben (Tabellen 2 und 3) . Etwa 50 % der Embryonen, die auf Silbernitrat enthaltendem Medium plattiert werden, können embryogene Kalli erzeugen. Der optimale Effekt wird mit Embryonen, plattiert auf Kallus Startmedium für mindestens zwei Tage vor Inokulation mit Agrobacterium, erhalten. Es wurde gefunden, dass die Kombination von diesen zwei Faktoren die Nekrose von embryogenen Maiskalli nach gemeinsamer Agrobacterium Kultivierung stark verhindert.
Das verminderte Bräunen der embryogenen Kalli korreliert mit Kallusstart und Überleben des Gewebes nach Agrobacterium-Inokulation. Etwa 80 % Kontrollembryonen, die nicht mit Agrobacterium behandelt wurden, ergeben embryogene Kalli.
Die Wirkung von Silbernitrat wird auch mit Kalli Typ I, die mit Agrobacterium inokuliert wurden, beobachtet (Tabelle 3). Es scheint, dass eine junge Linie resistenter gegen Agrobacterium-Inokulation ist und eine Vorbehandlung mit Silbernitat die Gewinnung von gesunden Geweben verbessert.
Um zu verifizieren, dass das Vorliegen von Silbernitrat während der gemeinsamen Kultivierung nicht Agrobacterium-Virulenz vermindert, werden Tabakblattscheiben mit LBA4404 (GIGUP) bei einer Konzentration von 10⁹ Zellen/ml inokuliert. Keine signifikante Absenkung der GUS-Aktivität wird in Tabakblättern beobachtet.
Tabelle 2: Inokulation von Maisembryonen mit LBA4404
Embryonen und Embryonen mit embryogenen Kallusreaktionen werden mit Agrobacterium LBA4404 (GIGUP) (10⁹ Zellen/ml) inokuliert. Das Grundmedium ist 2 DG4 + 5 Chloramben (2DG4). Alle Behandlungen werden an etwa 80 bis 100 Embryonen ausgeführt und zweimal wiederholt. Kallusstart wird zwei Wochen nach Inokulation bonitiert.
Tabelle 3: Inokulation von Maiskallus Typ I
Kalli Typ I werden mit Agrobacterium LBA4404 (GIGUP) (10⁹ Zellen/ml) inokuliert. Das in diesen Versuchen verwendete Grundmedium ist 2DG4 + 0,5 2,4D (2DG4) mit oder ohne Silbernitrat (AgNO₃) . Alle Versuche werden auf etwa 150 Stücken Kallus Typ I ausgeführt. Das Überleben von Geweben wird zwei Wochen nach Inokulation bonitiert.
Beispiel 3: Transformation durch Agrobacterium von unreifen zygotischen Embryonen und Isolierung von transformiertem Kallus mit der Verwendung von Phosphinothricin, Hygromycin oder Mannose als ein Selektionsmittel
Unreife Embryonen werden ungefähr 10 bis 14 Tage nach Selbstbestäubung erhalten. Die unreifen zygotischen Embryonen werden unter verschiedenen Platten, die Medium, welches embryogene Kallusbildung bei etwa 25 unreifen Embryonen pro Platte induzieren und tragen kann, enthalten, aufgeteilt.
Die unreifen Embryonen werden entweder auf der Platte oder in Flüssigkeit, wie in Beispiel 2 ausgewiesen, mit Agrobacterium mit einem Ti-Plasmid, das ein selektierbares Markergen umfasst, inokuliert. Durch eine Reihe von Versuchen werden optimierte Bedingungen für unreife Embryonen entwickelt. In einer optimierten Bedingung werden die unreifen Embryonen auf Kallusstartmedium, das Silbernitrat (10 mg/l) enthält, entweder vor oder unmittelbar nach Inokulation mit Agrobacterium plattiert. Ungefähr 25 unreife Embryonen werden auf jeder Platte platziert. 16 bis 72 Stunden nach Inokulation werden unreife Embryonen auf Kallusstartmedium mit Silbernitrat und Cefotaxim transferiert. Die Selektion von transformierten Zellen wird wie nachstehend ausgeführt:

a. PPT-resistenter Marker: Transformation wird unter Verwendung eines Agrobacterium-Stamms, der ein Plasmid mit einem Gen beherbergt, welches für Resistenz auf Phosphinothricin an der T-DNA-Region codiert, ausgeführt. Transformierte Zellen werden in vitro durch Auftragung von Phosphinothricin mit einer Konzentration von 3 mg/l 2 bis 20 Tage nach Inokulation und Halten für insgesamt zwei bis zwölf Wochen ausgewählt. Der so erhaltene embryogene Kallus wird in Gegenwart oder Abwesenheit von Phosphinothricin auf Regenerationsstandardmedium regeneriert. Alle Pflanzen werden durch den Chlorphenol-Rot-(CR)-Test auf Resistenz gegen PPT getestet. Dieses Assay wendet einen pH-Wert-empfindlichen Indikatorfarbstoff an, um zu zeigen, welche Zellen in Gegenwart von PPT wachsen. Zellen, die wachsen, erzeugen eine pH-Wert-Änderung in dem Medium und wiederum dem Indikator Chlorphenol rot-gelb (von rot). Pflanzen, die das Resistenzgen auf PPT exprimieren, werden in diesem Test leicht identifiziert. Pflanzen, die durch den CR-Test positiv sind, werden durch PCR auf das Vorliegen des PAT-Gens bonitiert. Pflanzen, die für den PCR-Test positiv sind, werden durch Southern Blot analysiert.
b. Hygromycin-Resistenzmarker: Transformation wird unter Verwendung eines Agrobacterium-Stamms, der ein Plasmid mit einem Gen (hpt, Hygromycin-B-Phosphotransferase) beherbergt, das auf Resistenz gegen Hygromycin an der T-DNA-Region codiert, ausgeführt. Transformierte Zellen werden unter Verwendung von Hygromycin bei einer Konzentration von 3 mg/l 2 bis 20 Tage nach Inokulation ausgewählt und für insgesamt zwei bis zwölf Wochen gehalten. Der so erhaltene embryogene Kallus wird in Gegenwart oder Abwesenheit des selektierbaren Mittels auf Standardmedium von Regeneration regeneriert. Alle Pflanzen werden auf Resistenz gegen Hygromycin getestet. Pflanzen, die das Resistenzgen auf Hygromycin exprimieren, werden leicht in diesem Test identifiziert. Durch diesen Test positive Pflanzen werden durch PCR auf das Vorliegen des hpt-Gens bonitiert. Pflanzen, die durch PCR-Test positiv sind, werden durch Southern Blot analysiert.
c. Positive Selektion mit Mannose: Transformation wird unter Anwendung eines Agrobacterium-Stamms, der ein Plasmid mit einem Gen (Mannosphosphatisomerase) beherbergt, das für Toleranz auf Mannose an der T-DNA-Region codiert, ausgeführt, wobei Mannose verwendet wird, um transformierte Zellen in vitro auszuwählen. Diese Selektion kann von nur 1 g/l 2 bis 20 Tage nach Inokulation angewendet werden und für insgesamt zwei bis zwölf Wochen gehalten werden. Der so erhaltene embryogene Kallus kann in Gegenwart oder Abwesenheit von Mannose auf Regenerationsstandardmedium regeneriert werden.

Alle Pflanzen werden durch Chlorphenol-Rot(CR)-Test auf Toleranz gegen Mannose getestet. Dieses Assay wendet einen pH-Wert-empfindlichen Indikatorfarbstoff an, um zu zeigen, welche Zellen in Gegenwart von Mannose wachsen. Wachsende Zellen erzeugen eine pH-Wert-Änderung in den Medien und ändern den Indikator Chlorphenol-Rot gelb von rot. Pflanzen, die die Toleranz auf Mannose exprimieren, werden in diesem Test leicht identifiziert. Pflanzen, die durch den CR-Test positiv sind, werden durch PCR auf die Gegenwart des Mannose gens bonitiert. Pflanzen, die positiv für den PCR-Test sind, werden durch Southern Blot analysiert.
Beispiel 4: Transformation von Agrobacterium von Kallus, abgeleitet von unreifen zygotischen Embryonen, und Isolierung von transformiertem Kallus mit der Verwendung von Phosphinothricin, Hygromycin und Mannose als selektierbare Mittel
Kallus Typ I wird aus unreifen zygotischen Embryonen unter Anwendung von Standardkulturtechniken erhalten. Ungefähr 25 Stücke Kallus Typ I werden auf Erhaltungsmedium, das Silbernitrat enthält, entweder vor oder nach Inokulation mit Agrobacterium platziert. Die Inokulation kann wie in Beispiel 2 beschrieben ausgeführt werden. Ungefähr 16 bis 72 Stunden nach Inokulation wird der Kallus zu Standardkulturmedium, das Silbernitrat und Cefotaxim enthält, transferiert. Die Selektion kann unmittelbar nach Transfer auf dieses Medium oder ein oder 20 Tage danach ausgeführt werden. Der Kallus wird dann bei Selektion für ungefähr zwei bis zwölf Wochen subkultiviert, wonach überlebender und wachsender Kallus zu Standardregenerationsmedium für die Erzeugung von Pflanzen transferiert wird. Die Selektion wird wie in dem vorangehenden Beispiel für Zellen, die mit Genen auf Phosphinotricinresistenz, Hygromyzinresistenz oder Mannosephosphatisomerase transformiert wurden, ausgeführt.
Beispiel 5: Transformation von Kallus Typ I von Mais durch Inokulation mit Agrobacterium und Isolierung von transformiertem Kallus mit der Verwendung von Phosphinothricin, Hygromycin und Mannose als selektierbare Mittel
Kallus wird vom Plattieren von unreifen Embryonen vom Elitegentyp abgeleitet. Kulturen werden zweimonatlich auf Erhaltungsmedium (2DG4 + 0,5 mg/l 2,4-D) subkultiviert und Zellklumpen, 2 bis 3 Tage nach Subkultur genommen, werden auf 2DG4-Medium platziert. Nach oder vor Inokulation mit Agrobacterium werden Zellklumpen auf 2DG4-Medium, das Silbernitrat enthält, plattiert. Inokulation mit Agrobacterium kann wie in Beispiel 2 beschrieben, ausgeführt werden. Nach 16 bis 72 Stunden Inkubation wird der Kallus zu frischem Erhaltungsmedium, das Cefotaxim und Silbernitrat enthält, transferiert. Der Kallus wird bei Selektion für insgesamt ungefähr 2 bis 12 Wochen mit dem selektierbaren Mittel subkultiviert, wonach überlebender und wachsender Kallus zu Standardregenerationsmedium für die Herstellung von Pflanzen transferiert wird. Die Selektion wird wie in dem vorangehenden Beispiel für Zellen, die mit Genen auf Phosphinothricinresistenz, Hygromycinresistenz oder Mannosephosphatisomerase transformiert wurden, ausgeführt.
Beispiel 6: Wärmeschockbehandlung verhindert durch Agrobacterium ausgelöste Apoptose
Unreife Embryonen:
Maisinzuchtlinien werden im Gewächshaus wachsen lassen. Unreife Embryonen (0,8 bis 2,2 mm in der Länge) werden von den oberflächensterilisierten Ähren zwischen 8 und 15 Tage nach Bestäubung in Abhängigkeit von Umweltfaktoren entfernt. Embryonen werden Scutellum auf Kallus Startmedium plattiert. Für die meisten der Inzuchtlinien werden die Embryonen auf LS-Medium (Linsmaier und Skoog, Physiol. Plant. 18: 100-127, 1965) plattiert. Embryonen von CG00526 werden auf 2DG4 + 5 mg/l-Chloramben (2DG4-5Chl) plattiert. 2DG4-Medium ist Duncan's Medium, modifiziert, um 20 mg/l Saccharose zu enthalten (Koziel et al., Bio/Technology 11: 194-200, 1993).
Kallus Typ I:
Unreife Embryonen werden wie vorstehend beschrieben sterilisiert und auf Kallusstartmedium (2DG4-5Chl) plattiert und darin für 1 bis 7 Tage kultiviert. Auf Kallusstartmedium (2DG4 + 5 Chl) für 7 bis 20 Tage plattierte Embryonen ergeben Kallus. Diese Kalli sind typische Kalli Typ I. Kalli Typ I sind kompakte Cluster von relativ gut organisierten Zellen.
Erhaltener embryogener Kallus wird aus den Embryonen geschnitten und auf Kallushaltemedium 2DG4 + 0,5 mg/l 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) transferiert und zur Inokulation verwendet. Durch das vorstehend beschriebene Verfahren erhaltener Kallus Typ I kann auf dem Erhaltungsmedium (2DG4 + 2,4 D 0,5 mg/l) gehalten werden und ungefähr alle zwei Wochen subkultiviert werden.
Agrobacterium:
Der verwendete Stamm ist A. tumefaziens LBA4404 (pAL4404, pSB1). pAL4404 ist ein unschädlich gemachtes Helferplasmid (Ooms et al., 7: 15-29, 1982). pSB1 ist ein Wide-Host-Range-Plasmid, das eine Region mit Homologie zu pGIGUP und ein 15,2 kB KpnI Fragment von der Virulenzregion von pTiBo542 enthält (Ishida et al, Nature Biotechnology 14: 745- 750, 1996). Die Einführung des Plasmids pGIGUP durch Elektroporation in LBA4404 (pAL4404, pSB1) ergab eine gemeinsame Integration von pGIGUP und pSB1. pGIGUP enthält ein Pflanzen exprimierbares Phosphinothricinacetyltransferase(PAT)gen, das durch den Mais-Ubiquitin-Promotor betrieben wird, um Resistenz auf Phosphinothricin bereitzustellen (Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18: 675-689, 1992). Es enthält auch ein Gen für β-Glucuronidaseexpression (GUS) mit einem Intron in dem N-terminalen Codon der codierenden Sequenz, das durch einen chimären Promotor gesteuert wird, der von den Octopin- und Mannopin-Synthasegenen abgeleitet ist (ein Trimer von der Octopinsynthasepromotor stromaufwärts aktivierenden Sequenz mit einer Domäne von einem Mannopinsynthasepromotor, Ni et al., Plant J., 7: 661-676, 1995).
Dieses Intron GUS-Gen exprimiert GUS-Aktivität in der Pflanzenzelle, jedoch nicht in Agrobacterium. Agrobacterium wird 3 Tage auf YP-Medium (5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l Pepton, 5 g/l NaCl, 15 g/l Agar, pH 6,8), ergänzt mit 50 mg/l Spectinomycin und 10 mg/l Tetracyclin, wachsen lassen. Bakterien werden mit einer Schleife gesammelt und in flüssigem N6-Medium bei einer Dichte im Bereich von 10⁹ bis 5 × 10⁹ Zel len/ml suspendiert. Agrobacterium kann alternativ von einer Übernachtkultur in YP-Medium und resuspendiert in flüssigem N6-Medium gesammelt werden. Es kann auch für 4 bis 6 h in Agrobacterium-Induktionsmedium (AIM, K₂HPO₄, 10,5 g; KH₂PO₄, 4,5 g; (NH₄)₂SO₄, 1,0 g; NaCitrat·2 H₂O, 0,5 g; MgSO₄·H₂O (1 M), 1,0 ml; Glucose, 2,0 g; Glycerin, 5,0 ml; MES (10 mM); Acetosyringon (50-100 μm); pH 5,6) vorinduziert werden.
Wärmeschockbehandlung von Geweben:
Vor der Co-Maissamenkultivierung werden Maisgewebe in einem Eppendorf-Röhrchen in flüssigem N6-Medium angeordnet und 4 Minuten bei 45°C in einem Wasserbad inkubiert. Das Medium wird dann durch eine wie vorstehend beschrieben hergestellte Agrobacterium-Suspension ersetzt. Nach 5 Minuten bei Raumtemperatur werden die Gewebe auf geeignetem festem Medium plattiert. 3 Tage nach gemeinsamer Inokulation werden die Gewebe entweder mit X-Glu angefärbt, um GUS-Aktivität nachzuweisen, oder auf Medium mit Cefotaxim (250 mg/l) plattiert. Maisgewebe werden dann geprüft, um Kallusreaktion nachzuweisen, die den Prozentsatz an Geweben überlebender Agrobacterium-Inokulation anzeigen.
Gemeinsame Kultivierung:
Wie vorstehend beschrieben hergestellte Maisgewebe werden mit Agrobacterium inokuliert. Sie werden in der Bakteriensuspension für 5 bis 10 Minuten eingeweicht und dann auf festem Medium plattiert. Nach Inokulation wurden Maisgewebe im Dunkeln bei 25°C kultiviert. 2 oder 3 Tage nach Inokulation werden Gewebe auf das gleiche Medium, ergänzt mit Cefotaxim (250 mg/l), transferiert.
In-situ-Nachweis von DNA-Fragmentierung:
Embryonen werden in einer 3,7 %igen Formaldehydlösung eingeweicht und wie durch die Hersteller (Trevigen) beschrieben verarbeitet. Um genomische DNA-Spaltung in situ nachzuweisen, werden fixierte Embryonen mit dem TACS-1-Kit behan delt (Cullivier et al., Nature 381: 800-803, 1996). Fixierte Querschnitte werden zuerst mit Proteinase K für 5 Minuten bei Raumtemperatur behandelt und dann 5 Minuten in 2 %iges Wasserstoffperoxid getaucht, um endogene Peroxidase zu entfernen. Nach einer kurzen Waschung mit Klenow-Puffer werden Gewebe für 1 h bei 37°C mit dem Klenow-Enzym inkubiert, das endogen modifizierte Desoxynucleotide an den 5'-Termini der geschnittenen Fragmente einbauen kann. Ein dunkler unlöslicher Niederschlag, der auf Apoptose hinweist, die in der jeweiligen Zelle auftritt, ist mit einem Mikroskop nachweisbar.
Ergebnisse:

– Ein Hauptbräunungsphänomen wurde nach gemeinsamer Kultivierung von Agrobacterium und Maisgeweben beobachtet und eine Konzentration von 10⁹ Zellen/ml könnte Zelltod induzieren. Embryonen schienen empfindlicher auf Agrobacterium als embryogener Kallus.
– Embryonen und Kallus Typ I werden wärmegeschockt und dann mit Agrobacterium bei einer Konzentration von 10⁹ Zellen/ml inokuliert. Nach 3 Tagen gemeinsamer Kultivierung und Kultur für eine Woche werden Gewebe geprüft. Schutzgrad, der durch die Wärmeschockvorbehandlung verliehen wird, wird durch Zählen der Anzahl Gewebe, die die Inokulation überleben, quantifiziert.

Alle Embryonen, die mit Agrobacterium nach einer Wärmeschockvorbehandlung inokuliert wurden, zeigen Kallusinitiierung, wohingegen aus Embryonen, die nicht schockbehandelt werden, kein Kallus auftaucht (Tabelle 4).
Tabelle 4:
Embryonen werden mit 10⁹ Zellen/ml Agrobacterium LBA4404 (pGIGUP) inokuliert und dann auf Kallusstartmedium plattiert. Das Grundmedium ist 2DG4 + 5Chl (2DG4). Alle Behandlungen werden an etwa 80 bis 100 Embryonen ausgeführt und zweimal wiederholt. Kallusstart wird zwei Wochen nach Inokulation bonitiert.
Der gleiche hilfreiche Effekt von Wärmeschockbehandlung wird für Kallus beobachtet (Tabelle 5).
Tabelle 5:
Kallus Typ I wird mit 10⁹ Zellen/ml Agrobacterium LBA4404 (pGIGUP) inokuliert. Das angewendete Grundmedium ist 2DG4 + 0,5 2,4D (2DG4). Alle Versuche werden an ungefähr 1000 Stücken Kallus Typ I ausgeführt. Das Überleben der Gewebe wird zwei Wochen nach Inokulation bonitiert.
Der nach Wärmeschockvorbehandlung beobachtete Schutz scheint mit Wärmeschock verbunden zu sein, weil Hauptwärmeschockproteine durch RT-PCR verstärkt werden können.

– Keine DNR-Fragmentierung wird in Embryonen nachgewiesen, die einer Wärmeschockvorbehandlung unterzogen wurden.
– Embryonen aus verschiedenen Maislinien werden mit Agrobacterium-Stamm LBA4404 (GIGUP), induziert in AIM-Lösung mit oder ohne eine Wärmeschockvorbehandlung, inokuliert. Nach 3 Tagen gemeinsamer Kultivierung werden die Embryonen auf GUS-Aktivität angefärbt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 6 wiedergegeben. Es scheint, dass eine Wärmeschockvorbehandlung ein hilfreicher Effekt auf transiente Expression ist.

– kein Wärmeschock.
HS: Wärmeschock
* GUS-Prozentsätze basieren auf einer Probengröße von ungefähr 50 unreifen Embryonen.
** GUS-Bonitierungen basieren auf einer 0- bis 5-Skale (0 = keine GUS-Anfärbung, 1 = 1 bis 5 Flecken / Embryo, 2 = 5 bis 15 Flecken, 3 = 15 bis 30 Flecken, 4 = rund 25 der Embryooberfläche mit GUS angefärbt und 5 = rund 50 % der Embryooberfläche mit GUS angefärbt.

Beispiel 7: Agrobacterium-Transformation von Weizen
Unreife zygotische Embryonen (0,75 mm bis 1,25 mm) werden entfernt und auf MS basierendem Medium mit 3 mg/l 2,4-D, 300 mg/l Glutamin, 150 mg/l Asparagin und 3 % Saccharose (3MS3S) für 0, 3, 4, 5, 6, 7, 8 oder 21 Tage vor Inokulation mit Agrobacterium plattiert. Mit 21 Tagen erzeugen die Explantate eine embryogene Masse, die als 3-Wochen-Kallus bezeichnet wird.
Gemeinsame Kultivierung:
Weizengewebe werden mit den in Beispiel 6 beschriebenen Agrobakterien inokuliert. Weizengewebe werden in der bakteriellen Suspension 5 bis 10 Minuten eingeweicht und dann auf festes Medium plattiert, Nach Inokulation werden Weizengewebe im Dunkeln bei 25°C kultiviert, 2 oder 3 Tage nach Inokulation werden Gewebe auf das gleiche Medium, ergänzt mit Cefotaxim (250 mg/l), transferiert.
Die Explantate werden, ohne eine Vorbehandlung zu erfahren, inokuliert oder sie werden wärmegeschockt bei 42 bis 48°C für 4 bis 8 Minuten. Die Wärmeschockbehandlung wird vor Inokulation ausgeführt. Embryonen können in 3 MS inf oder AIM mit 100 mM AS-Flüssigkeit wärmegeschockt werden, wohingegen Kalli „trocken" wärmegeschockt werden.
Inokulation:
Explantate werden in entweder Eppendorf-Röhrchen oder auf Platten inokuliert. Beim Inokulieren in Röhrchen wird 1 ml der Agrobacterium-Lösung in das Röhrchen pipettiert, Finger-Vortex-behandelt oder geschüttelt und 5 bis 15 Minuten absetzen lassen. Die Agrobacterium-Lösung und Explantatmaterial wird auf eine Platte von 3MS3S mit 100 mM AS gegossen und die Flüssigkeit wird mit einer wegwerfbaren Übertragungspipette mit enger Spitze entfernt. Wenn Inokulation auf Platten ausgeführt wird, wird das Agrobacterium direkt auf die Explantate pipettiert und 5 bis 15 Minuten später entfernt. Embryonen werden derart angeordnet, dass die embryogenen Achsen in Kontakt mit dem Medium sind.
Kallusstart, Selektion und Regeneration:
Embryonen werden auf Kallusinduktionsmedium (3MS3S) mit Antibiotikum für 3 Wochen wachsen lassen. Die embryogenen Kalli werden herausgeschnitten und auf MS3S (kein 2,4-D) mit 5 mg/l GA3 und 1 mg/l NAA mit dem Selektionsmittel und Antibiotikum für zwei Wochen angeordnet, dann entfernt zu MS3S mit Antibiotikum und einer höheren Konzentration an Selektionsmittel für ungefähr 4 Wochen. Die Plättchen werden dann auf Magentaboxen mit ½ MS-Salzen und 0,5 mg/l NAA transferiert unter Halten der Konzentration des Selektionsmittels bei derselben wie in dem letzten Step-up. Für Kalli ist die Selektion und das Regenerationssystem das Gleiche, ausgenommen, dass die Kalli nur für ein Maximum von sechs Wochen vom Embryoplattieren wachsen lassen wurden, d.h., 3 Wochen alte Kalli werden inokuliert, gemeinsam kultiviert und für maximal 3 weitere Wochen vor Selektion und Regenerationsbeginn wachsen lassen.
Ergebnisse:

– DNA-Fragmentierung wird in Embryonen untersucht, die mit Agrobacterium, wie in Beispiel 6 beschrieben, inokuliert wurden. Keine DNA-Fragmentierung wird in Embryonen nachgewiesen, die einer Wärmeschockvorbehandlung unterzogen wurden.
– Wärmeschockvorbehandlung vor Agrobacterium-Inokulation kann den Beginn von Apoptose verhindern.

Beispiel 8: Unterdrückung von Agrobacterium induzierter Apoptose in Maiszellen durch p35 und iap
Vektoren für biolistische Transformation:
Zum Transformieren von Mais durch eine biolistische Vorrichtung verwendete Vektoren sind alle Derivate von pUC. pUbiPAT enthält ein pflanzenexprimierbares bar-Gen das für die Phosphinothricinacetyltransferase (PAT), gesteuert durch den Mais-Ubiquitin-Promotor (Christensen et al., 1992), codiert, um Resistenz auf Phosphinothricin (PPT) bereitzustellen. Die codierende Region von p35, iap und dad-1 werden unter Steuerung des Maismetallothionein-artigen Genpromotors (MTL) (de Framond, 1991) geklont. p35 und iap werden von Lois Miller (University of Georgia, Athens, Georgia) bereitgestellt.
Das p35-Pstl-EcoRI-Fragment, das die codierende Region umfasst, wird aus pHSP35VI⁺ herausgeschnitten (Clem und Miller, 1994), in die entsprechenden Stellen von pBluescript (Stratagene, La Jolla, Kalifornien) kloniert und dann als ein Pstl-Asp718-Fragment in die entsprechenden Stellen von pMTL geklont. pMTL enthält den MTL-Promotor und den CaMV355-Terminator. Das SalI-spe1-Fragment, das die Codierungsregion von iap von pHSCplAPVI⁺ umfasst (Clem und Miller, 1994) wird in Xhol-SpeI-Stellen von pMTL kloniert. Die Codierungssequenz von dad-1 wurde als SalI-Xbal von Arabidopsis-cDNA-Klon-12T7 (Universität Michigan) kloniert.
Vektoren für Agrobacterium-Transformation:
p35-, iap- und dad-1-codierende Regionen, die durch den MTL-Promotor betrieben werden, werden zwischen den breiteren Sequenzen in den superbinären Vektor pSB11 kloniert.
Das β-Glucuronidasegen (GUS) mit einem Intron in dem N-terminalen Codon der Codierungssequenz wird durch eine chimären Promotor gesteuert, der von den Octopin- und Mannopinsynthasegenen abgeleitet wurde (mas; Trimer von der Octopinsynthasepromotor stromaufwärts aktivierenden Sequenz mit einer Domäne von dem Mannopinsynthasepromotor; Ni et al., 1995). Mas-GUS-exprimierende GUS-Aktivität in der Pflanzenzelle, jedoch nicht in Agrobacterium, wird in pSB11 kloniert, um pMasGUS zu ergeben.
Diese Vektoren werden dann in LBA4404 (pAL4404, pSB1) durch Elektroporation mit 0,2 cm Bio-Rad-Kuvetten bei einer Feldstärke von 2 kV/cm, Widerständen von 600 Ohm und einer Kapazität von 25 μF eingeführt. pSB1 ist ein Plasmid von breitem Wirtsbereich, das eine Region von Homologie auf pSB11 und ein 15,2 kB KpnI Fragment aus der Virulenzregion von pTi-Bo542 enthält (Ishida et al., 1996). Die Einführung des Plasmids pSB11 durch Elektroporation in LBA4404 (pAL4404, pSB1) ergibt eine Co-Integration von pSB11 und pSB1.
Inokulation von Maisembryonen mit Agrobacterium:
Unreife Embryonen (0,8 bis 2,5 mm) werden aseptisch 12 bis 15 Tage nach Bestäubung entfernt und Scuttelum auf Kallusstartmedium (2DG4 + 5 Chloramben; Duncan et al., 1985) plattiert. Embryonen werden mit Agrobacterium bei einer Dichte von 10⁹ Zellen/ml für 5 Minuten inokuliert und dann 3 Tage auf dem Kallusstartmedium kultiviert. Die Gewebe werden dann auf das gleiche Medium, ergänzt mit Cefotaxim (250 mg/l), transferiert. Das Überleben von Gewebe wird 2 Wochen nach Inokulation bonitiert.
Start von Kallus Typ I:
Embryonen, die auf Kallusstartmedium für 7 bis 20 Tage plattiert wurden, ergeben Kallus. Diese Kalli sind typische Kalli Typ I, welche zu Clustern von relativ gut organisierten Zellen verdichten (Suttie et al., 1994). Der erhaltene embryogene Kallus wird aus Embryonen herausgeschnitten und zu Kallushaltemedium 2DG4 + 0,5 mg/l (2,4-Dichlorphenoxy)essigsäure (2,4-D) transferiert. Durch das vorstehend beschriebene Verfahren erhaltener Kallus Typ I kann auf dem Erhaltungsmedium (2DG4 + 2,4 D 0,5 mg/l) gehalten und ungefähr alle zwei Wochen subkultiviert werden. Der Kallus Typ I wird für Inokulationsversuche mit Agrobacterium und zur Transformation durch die biolistische Vorrichtung verwendet.
Transformationsversuche:
Plasmid-DNA wird auf 0,3 bis 1 μm Goldmikroträger, wie in dem DuPont-Biolystic-Handbuch beschrieben, ausgefällt. 2 μg des apoptotischen Gens und 2 μg pUbiPAT werden pro 50 μl Mikroträger verwendet. 16 Stücke Kallus Typ I pro Platte werden unter Anwendung der PDS-1000/He-biolistischen Vorrichtung (DuPont) bombardiert. Gewebe werden auf dem Regal 8 cm unterhalb des Stoppsiebregals angeordnet und ein Edelstahlsieb von 10 × 10 μm wird mit Unterbrecherscheiben von einem Wert von 650 psi verwendet. Nach Bombardement werden Gewebe im Dunkeln für einen Tag bei 25°C kultiviert, dann auf Kallushaltemedium 2DG4 + 0,5 mg/l 2,4-D transferiert. 10 Tage später werden Gewebe auf das gleiche Medium, ergänzt mit 100 mg/l PPT, transferiert. Sechs bis acht Wochen später werden Gewebe auf 40 mg/l PPT transferiert. Einige der Gewebe werden dann für Inokulierungsversuche verwendet und einige von ihnen werden auf Regenerierungsmedium (Murashige und Skoog, das 3 % Saccharose, 0,25 mg/l Ancymitol und 5 mg/l Kinetin enthält) mit 16 Stunden Licht pro Tag transferiert. Transformierte Pflanzen werden unter Anwendung von Chlorphenolrot(CR)assay identifiziert, um auf Resistenz gegen PPT (Cramer et al., 1993) zu testen, und dann durch PCR bestätigt.
Inokulierung von transgenem Kallus Typ I mit Agrobac terium:
Wie vorstehend beschrieben erhaltene transgene Gewebe Typ I werden mit Agrobacterium inokuliert. Maisgewebe werden in der Bakteriensuspension 5 bis 10 Minuten eingeweicht. Nach Inokulation werden Maisgewebe im Dunkeln bei 25°C auf 2DG4 + 0,5 mg/l 2,4-D kultiviert. Zwei oder drei Tage nach Inokulation werden die Gewebe auf das gleiche Medium, ergänzt mit Cefotaxim (250 mg/l), transferiert.
Analyse von transgenem Material:
Genomische DNA wird aus 100 mg Kallus mit dem Isoquick-Kit (Microprobre, CA) extrahiert und in 20 μm/l Wasser resuspendiert. Ein Mikroliter wird zur PCR-Reaktion verwendet. PCR-Reaktionen werden in Perkin-Elmer-Thermal-Cyclern in einer 25-μl-Reaktion unter Verwendung von einmal PCR-Puffer, 0,5 Einheit AmpliTAq, 200 μM jeweils dNTP, 0,2 μM von jedem Primer ausgeführt. Um das Vorliegen des Pat-Gens in Geweben nachzuweisen, werden PCR-Reaktionen mit den Pat-Primern bei einer Annealingtemperatur von 55°C ausgeführt. Für iap-, p35- und dad-1-Gennachweis in transgenen Geweben sind die für jede Reaktion verwendeten Primer P und I, P und 35, P und D bei einer Annealingtemperatur von 55°C, 55°C bzw. 48°C.
PAT1: 5'-TGTCTCCGGAGAGGAGACC-3' (SEQ ID NO: 1)
PAT2: 5'-CCAACATCATGCCATCCACC-3' (SEQ ID NO: 2)
MTL (P): 5'-AGGTGTCCATGGTGGTCAAG-3' (SEQ ID NO: 3)
iap (I): 5'-ACAATCGAACCGCACACGTC-3' (SEQ ID NO: 4)
p35 (35): 5'-CCAGGTAGCAGTCGTTGTGT-3' (SEQ ID NO: 5)
dad-1 (D): 5'-CCTTGTTTCCTTTGTTCACT-3' (SEQ ID NO: 6)
p35- und iap-RT-PCR:
Gesamt-RNA wird aus transgenem Kallus unter Anwendung von Tripure-Isolation-Reagenz (Boehringer Mannheim) extrahiert, mit RNase-freier DNase behandelt und 0,5 μg für cDNA-Synthese unter Anwendung vorher von RT-PCR (Clontech) und Oligo-dT-Primer genommen. Nach der zweiten Strangsynthese wird 1/12 von dieser Reaktion als ein Templat für die PCR-Reaktion mit Taq-DNA-Polymerase verwendet.
p35-Primer, die für RT-PCR verwendet werden, sind:
5'-GGTCCTATACGAAGCGTTAC-3' (SEQ ID Nr. 7) und
5'-CCACGTAGCAGTCGTTGTGT-3' (SEQ ID Nr. 8) verstärkend 300 Bp Transcript.
iap-Primer, die für RT-PCR verwendet werden, sind:
5'-CATGTCTGACTTGCGATTGG-3' (SEQ ID Nr. 9) und
5'-ACAATCGAACCGCACACGTC-3' (SEQ ID Nr. 10)
verstärkend 248 Bp Transcript.
Um Kontamination von genomischer DNA auszuschließen, werden Kontroll-cDNA-Reaktionen, worin Revers-Transkriptase weggelassen wird, parallel hergestellt.
Ergebnisse:

– Die meisten der Embryonen und embryogenen Kalli überleben die Inokulation mit Agrobacterium nicht. Eine kurze Exposition (5 Minuten) ist ausreichend, um diese Reaktion zu induzieren. Gewebe, die gemeinsam mit Escheri chia coli kultiviert und den gleichen Verfahren unterzogen wurden, zeigen keine Schädigung.
– p35, iap und dad-1 wurden in Pflanzenexpressionskassette zwischen den Grenzsequenzen von der T-DNA kloniert. Da diese antiapoptotischen Gene von der T-DNA getragen werden, sollten sie an Maiszellen während der Inokulationszeit abgegeben werden. Maisgewebe werden mit Agrobacterium LBA4404 (10⁹ Zellen/ml) mit oder ohne Zelltod-Supressorgene (zwischen Klammern) inokuliert. Nach gemeinsamer Kultivierung werden Maisembryonen oder Kallus Typ I auf Quantifizierung von Gewebe, das als ein Hinweis des Anteils von Schutz, der durch die Expression der antiapoptotischen Gene geliefert wurde, geprüft. Alle Behandlungen werden an etwa 50 bis 80 Maisexplantaten ausgeführt und zweimal wiederholt. Die Gewebe werden 3 Tage nach Inokulation auf dem gleichen Cefotaxim-enthaltenden Medium transferiert. Die Wirkung von Agrobacterium wird zwei Wochen nach Inokulation bonitiert. Die Ergebnisse werden in Tabelle 7 bzw. 8 wiedergegeben.

Tabelle 7 (Embryonen)
Tabelle 8 (Kallus Typ I)
Etwa 80 % Embryonen ergeben embryogene Kalli, wenn sie nicht mit Agrobacterium behandelt werden. Etwa 25 % Embryonen, die mit Agrobacterium behandelt wurden, welche entweder p35 oder iap beinhalten, ergeben embryogenen Kallus, wohingegen nur 3 % Embryonen, die mit Agrobacterium inkubiert wurden, Kallusstart zeigten. Ein ähnlicher Effekt wird mit Kallus Typ I beobachtet, der mit Agrobacterium inokuliert wurde, welcher p35 oder iap beherbergt (Tabelle 2). dad-1 übertrug nur niedrige Schutzgrade in jedem System.

– Es scheint, dass transiente Expression von p35 und iap das Bräunen von Geweben zu einigem Ausmaß vermindert, jedoch nicht vollständig das Phänomen inhibiert. Dies kann durch eine niedrige Wirksamkeit von T-DNA, in die Maiszellen zu transferieren, erläutert werden. Wie durch transiente Expression mit GUS eingeschätzt, scheint es, dass das Zielgewebe nicht gleichförmig transformiert wird. Dies kann ein Hinweis sein, dass sehr wenige Zellen Rezipienten der T-DNA sind.
– Die Struktur des embryogenen Kallus, der aus Embryonen herauskommt, inokuliert mit Agrobacterium, das p35 oder iap enthält, war nicht so kompakt wie die Kontrollen. Dies kann durch die Tatsache erläutert werden, dass nur Zellen, die T-DNA, welche das antiapoptotische Gen trägt, aufnehmen, überleben und dass einzelne transformierte Zellen nicht notwendigerweise das Signal zu Nachbarzellen übermitteln. Dieser Typ von Gewebewachstum kann ein Nachweis sein, dass die Zelltodsupressorgene eingegangene Zellen sehr wirksam freisetzen, jedoch deren Kurzzeitexpression keinen vollständigen Schutz gegen die Wirkung von Agrobacterium überträgt.
– Embryogene Kalli, die für p35, iap und dad-1 transgen sind, stammen aus der Abgabe von den Genen unter der Kontrolle eines Pflanzen-exprimierbaren Promotors in Kallus Typ I unter Anwendung von Mikroprojektilbombardement. Die Konstrukte werden mit dem bar-Gen gemeinsam bombardiert, Gewebe werden hinsichtlich PPT ausgewählt und der transformierte Status von diesem Kallus wird zuerst durch PCR bestätigt (Tabelle 9).

Tabelle 9
Die Empfindlichkeit auf Agrobacterium-Inokulation wird dann an unabhängigen Ereignissen bonitiert. Kallus wird mit Agrobacterium LBA4404 (10⁹ Zellen/ml) inokuliert. Zwei unabhängige transgene Kalluslinien werden getestet. Alle Behandlungen werden zweifach wiederholt. Gewebe werden 3 Tage nach Inokulation an dem gleichen Medium, das Cefotaxim enthält, transferiert. Überleben von Maisgeweben wird zwei Wochen nach Inokulation mit Agrobacterium bonitiert (Tabelle 10).
Tabelle 10
Embryogene Kalli, die transgen auf p35 und iap sind, zeigen keinen Zelltod, wenn Agrobacterium-Inokulation unterzogen, wohingegen ein Hauptbräunungsphänomen bei Kontrollgeweben nach gemeinsamer Kultivierung beobachtet wird. Das Vorliegen von dad-1-Gen verzögert den Beginn von Apoptose, blockiert jedoch den Zelltod nicht, so wie iap und p35. Die Er gebnisse sind in verschiedenen unabhängigen Versuchen reproduzierbar.

– Die Schutzwirkung von p35 und iap wird auch deutlich, wenn durch oligonucleosomale DNA-Fragmentelektrophorese gemessen.
– Es scheint, dass die Wirkung von dad-1 augenscheinlicher ist, wenn in den Geweben stabil exprimiert wird.
– Es gibt eine klare Korrelation zwischen Expression der antiapoptotischen Gene und der Abwesenheit von Zelltod. p35- und iap-Gene werden in transgenem Kallus, wie durch Reverstranskriptions-PCR (RT-PCR) eingeschätzt, exprimiert. Die Kontrollen waren gleichförmig negativ.

Beispiel 9: Screening und Identifizierung von Agrobacterium-Stämmen, die keinen Zelltod in Maiszellen induzieren
Die Empfindlichkeit von embryogenem Kallus und Embryonen von einer gut untersuchten Maislinie (A188) und einer Stammelitelinie (Elite 2) auf verschiedene Agrobacterium-Stämme wird unter Anwendung einer Gruppe von 40 Wildtypstämmen von Agrobacterium getestet. Diese Stämme werden zuerst auf ihre Verträglichkeit mit A188 und Elite-2 embryogenen Kalli und Embryonen getestet, Unter jenen verhindern 6 von 40 Stämmen nicht vollständig das Wachstum von Maisgeweben und werden weiter an Elite-2-Embryonen, die auf Kallusstartmedium plattiert wurden und bei einer Konzentration von 10⁹ Zellen/ml inokuliert wurden, getestet. Der Kallusstart wird zwei Wochen nach Inokulation bonitiert und als ein Prozentsatz an Embryonen mit Reaktion ausgedrückt.
Diese Stämme werden auch auf ihre Virulenz auf Tabakblattscheiben, die auf hormonfreiem Medium plattiert wurden, getestet, und es wird festgestellt, dass das Potenzial der Stämme, programmierten Zelltod in Maiszellen zu induzieren, nicht mit der Virulenz korreliert. Der Prozentsatz in Tabelle 11 beschreibt die Anzahl an Blattscheiben mit Tumoren. Tabelle 11: Vergleich von Virulenz von nicht nekrogenen Stämmen

** guter Kallus Typ I

Agrobacterium-Stämme A und B wurden mit ATCC am 2. Mai 1997 unter dem Budapester Vertrag unter den ATCC-Bezeichnungsnummern 55964 bzw. 55965 hinterlegt.
Beispiel 10: Agrobacterium-Gene, die Apoptose in Maiszellen auslösen
Eine BAC-Library (bacterial artificial chromosome) wird mit Agrobacterium-genomischen DNA-Fragmenten von ungefähr 100 bis 200 kB konstruiert, in einer Bemühung um genetische Elemente, die für die Zelltodreaktion in embryogenen Maisgeweben verantwortlich sind, zu identifizieren. Die Library wird in Escherichia coli eingeführt. Um zu untersuchen, ob solcher Hintergrund für das Screening der BAC-Library geeignet ist, wird E. coli, das den BIBAC-Vektor allein enthält, auf Mais inokuliert. Von E. coli wird gefunden, dass es keine charakteristische apoptotische Reaktion induziert.
Es wird geschätzt, dass etwa 25 bis 30 BAC-Klone mit 150 bis 200 kB Inserts ausreichend sind, um das vollständige Genom von Agrobacterium zu erfassen, unter der Annahme, dass Agrobacterium eine Genomgröße nahezu äquivalent E. coli (4,6 10⁶ Bp) aufweist. Eine relativ große Anzahl an Klonen (200) wird mit einer Agrobacterium chromosomalen Sonde (chvD) hybridisiert, um zu testen, ob die in E. coli hergestellte BAC-Library eine deutliche Wiedergabe des Agrobacterium-Genoms ist. Unter 200 getesteten Klons hellten sich 5 mit der chVD-Sonde auf (Daten nicht gezeigt).
Eine Herausforderung ist, dass die genomischen Komponenten von Agrobacterium in E. coli still sein könnten. Weiterhin könnten zusätzliche Faktoren von Pflanzen und/oder Agrobacterium für die Expression eines solchen Klons notwendig sein. Deshalb enthält der BAC-Vektor auch einen Ursprung von Replikationsursprung funktionell in Agrobacterium und kann leicht in Agrobacterium in einem solchen Szenario transformiert werden.
Bakterielles Wachstum:
Agrobacterium wird 3 Tage auf YP-Medium (5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l Pepton, 5 g/l NaCl, 15 g/l Agar, pH-Wert 6,8), ergänzt mit 100 mg/l Kanamycin, falls benötigt, wachsen lassen. Bakterien wurden mit einer Schleife gesammelt und in flüssigem N6-Medium mit einer Dichte im Bereich von 10⁹ bis 5 × 10⁹ Zellen/ml gesammelt. Agrobacterium-Zellen können auch aus einer Übernachtkultur in YP-Medium gesammelt werden und in flüssigem N6-Medium resuspendiert werden.
E. coli DH10B wird in LB-Medium (1 % Bacto-Trypton, 0,5 % Bacto-Hefeextrakt, 170 mM NaCl, pH 7,0) wachsen lassen. Nach Transformation wird es in SOC-Lösung (2 % Bacto-Trypton, 0,5 % Bacto-Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM MgSO₄, 20 mM Glukose, pH 7,0) wachsen lassen.
Herstellung von genomischer DNA aus Agrobacterium:
LBA4404-Stamm wird für den Aufbau der Library verwendet. Das Protokollmaterial und verwendete Reagenzien sind von Imbed Kit (Biolabs, USA). 4 × 10 ml Agrobacterium-Kulturen werden über Nacht bei 28°C wachsen lassen. Eine Stunde vor dem Ernten werden 180 mg/ml Chloramphenicol zur Orientierung der Chromosomen zugesetzt. Die Zellen werden bei 800 g bei 4°C für 15 Minuten zentrifugiert und das Pellet wird an der Luft getrocknet. 0,5 ml Zellsuspensionslösung (10 mM Tris-HCl, 20 mM NaCl, 100 mM EDTA, pH 7,2) wird auf 42°C, bevor Agarose eingebettet ist, vorerwärmt. Agrobacterium-Zellen werden in Agarosestäben eingebettet, um den Abbau der Zellwand und Deprotonisierung unter Vermeiden von Scheren der DNA auszuführen. Um die Zellen in Agarosestäbe einzubetten, werden die Zellen mit einem gleichen Volumen von 1 %iger Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt in ddH₂O, heruntergekühlt auf 42°C, vermischt und dann in einer Gelspritzenform härten lassen. Nach Verfestigung der Agarose werden die Pfropfen in drei Volumen Lysozymlösung (1 mg/ml Lysozym, 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 100 mM EDTA, 0,2 % Natriumdesoxycholat, 0,5 % N-Laurylsarcosin, pH 7,2) transferiert und zwei Stunden bei 37°C unter mildem Schütteln inkubiert. Die Lysozymlösung wird entfernt und die Stäbe werden zweimal mit 3 ml Waschlösung für 15 Minuten jeweils gewaschen. Die Stäbe werden dann in 3 ml Proteinase-K-Lösung (1 mg/ml Proteinase K, 100 mM EDTA, 1 N-Laurylsarcosin, 0,2 % Natriumdesoxycholat, pH 8,0) für 20 Stunden bei 42°C unter mildem Schütteln inkubiert. Die Proteinase-K-Lösung wird durch Belüftung entfernt und die Stäbe werden zweimal gegen 5 ml Waschlösung (20 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, pH 8,0) für 15 Minuten dialysiert, dann mit 3 ml PMSF-Lösung (20 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, pH 8,0) für eine Stunde, gefolgt von zwei Waschungen mit Waschlösung. Die Stäbe werden dann zweimal mit 5 ml Lagerungslösung (2 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, pH 8,0) für 15 Minuten gewaschen und dann erneut in Gelspritzen geladen. Proben von 1 mm in der Länge (10 bis 20 ml) werden mit einer Rasierklinge geschnitten und gegen NotI-Restriktionsendonucleasepuffer (Biolabs, USA) für 30 min bei 4°C dialysiert. Der Restriktionsendonucleasepuffer wird mit frischem Puffer ersetzt und die Inkubation wird über Nacht bei 37°C mit 20 Einheiten NotI-Enzym (Biolabs, USA) ausgeführt. Teilverdau der Agrobacterium DNA wird unter Anwendung von NotI, einem raren Schneidenzym, erreicht. NotI erzeugt theoretisch Fragmente von 18 kB in der Länge nach einem Gesamtverdau unter der Annahme, dass Agrobacterium-Genom einen G/C-Gehalt von 60 aufweist (Ergebnisse extrapoliert von verschiedenen Agrobacterium-Genen). Aliquote Mengen werden dann mit einer Pipette beladen, deren Spitze abgeschnitten ist. Die DNA wird durch Pulsfeldgel(PFG)elektrophorese an einem 1 %igen Agarosegel in 0,5 × TBE bei 14°C unter Anwendung von Bio-Rad-CHEF-Mapper bei 6 V/cm für 32 h getrennt. Das Gel wird für 20 Minuten in 1 mg/ml EtBr ddH₂O-Bad angefärbt und Agarosescheiben, die Fragmente entsprechend 100-200 kB enthalten, werden aus dem Gel geschnitten. Die Agarasescheiben werden zweimal gegen TE für eine Stunde bei 4°C und zweimal mit Agarosepuffer (Biolabs, USA) für eine Stunde bei 40°C dialysiert, bei 65°C für 10 min geschmolzen und mit einer Einheit Agarase (Biolabs, USA) pro 100 mg Agarose verdaut. Die DNA-Konzentration wird fluorimetrisch unter Anwendung des DyNA Quant 200 (Hoefer, USA) geschätzt.
Herstellung des BIBAC-Vektors:
Der BIBAC-Vektor wurde freundlicherweise von Dr. Carol M. Hamilton (Cornell University, Ithaca) (Hamilton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 93, 9975-9979, 1996) bereitgestellt. BIBAC ist konstruiert, um sowohl in E. coli als auch Agrobacterium zu replizieren und es enthält das sac-BII-Gen, das direkte Selektion von geklonten Inserts in einem Saccharosemedium erlaubt. Der BIBAC-Vektor beherbergt auch den F-Faktor-Episomenursprung, der stabiles Halten von einer oder zwei Kopien pro Zelle mit bis zu 300 kB Inserts erlaubt (Shizuya et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89, 8794-8797, 1992). Das Plasmid wird unter Anwendung von Wizard^®-P1us-Maxiprep-Kit (Promega, USA) isoliert. Die Phenol-Chloroform-Extraktion wird vor Isopropanolausfällung ausgeführt. Das Plasmid wird mit NotI verdaut und mit einer Einheit von Shrimp-Alkali-Phosphatase (Boehringer Mannheim) bei 37°C für eine Stunde dephosphoryliert. Die Ligierung wird in 40 ml ausgeführt, worin 150 ng Agrobacterium DNA mit 17 g Cut-Vektor (geschätztes Molverhältnis 10 : 1 mit Vektor im Überschuss) mit 400 Einheiten T4-DNA-Ligase (Boehringer) bei 17°C inkubiert werden. Vor der Transformation wird die Ligierung gegen TE und 1/10 TE in Mikrocollodionbags (Sartorius, Germany) bei 4°C für zwei Stunden dialysiert.
Transformation von DH10B mit pBAC-Library
Transformation von kompetenten E. coli-DH10B-Zellen (F, rec A1; ElectroMax, Gibco-BRL, USA) wird durch Elektroporation in vorgekühlten Genpulserküvetten (Bio-Rad, USA) mit Genpulser^TM (Bio-Rad, USA) unter Verwendung der nachstehenden Einstellungen ausgeführt: Spannung 2,5 kV, Kapazität 25 mF und Widerstand 200 Watt. 25 ml kompetente Zellen werden mit 1 ml Legierungslösung für jede Elektroporation vermischt. Nach Elektroporation werden Zellen zu 0,5 ml SOC-Lösung transferiert und bei 37°C in einem rotierenden Rad für 45 min inkubiert. 150 ml Aliquote der Zellen werden auf LB-Medium, das Kanamycin (40 mg/ml) und Saccharose (5 %) enthält, plattiert.
Isolierung von BAC-DNA und Bestimmung von DNA-Insertgröße von BAC-Klonen
BAC-Klone werden über Nacht unter kontinuierlichem Bewegen in 10 ml LB mit Kanamycin (50 mg/ml) wachsen lassen. DNA wird gemäß dem alkalischen Lyseverfahren (Sambrook et al., 1989) mit den nachstehenden Modifizierungen extrahiert. RNAse 30 mg/ml werden zu der Resuspensionslösung gegeben und eine Phenol-Chloroform-Reinigung wird vor Isopropanolausfällung ausgeführt. Das Pellet der Nucleinsäure wird in 50 ml ddH₂O gelöst. Die DNA wird durch PFG-Elektrophorese an einem 1 %igen Agarosegel in 0,5 × TBE bei 14°C unter einer Bio-Rad-CHEF-Mappe bei 6 V/cm für 32 h getrennt.
Inokulation von Maisembryonen mit Agrobacterium:
Unreife Embryonen (0,8 bis 2,5 mm) werden aseptisch 12 bis 15 Tage nach Bestäubung entfernt und. Scutellum auf Kallusstartmedium (2DG4 + 5 Chloramben) (Duncan's „D"-Medium mit Glukose: N6 haupt, B5 neben, MS Eisen, 20 g/l Saccharose, 5 mg/l Chloramben, 8 g/l gereinigter Agar, G4-Zugaben und 10 mg/l Glukose, pH-Wert 5,8) (Duncan et al., 1985) plattiert. Embryonen werden mit Agrobacterium oder mit E. coli bei einer Dichte von 10⁹ Zellen/ml für 5 Minuten inokuliert und dann an dem Kallusstartmedium für 3 Tage kultiviert. Gewebe werden dann auf das gleiche Medium, ergänzt mit Cefotaxim (250 mg/l), transferiert. Überlebende von Geweben werden zwei Wochen nach Inokulation bonitiert.
Transformation von Agrobacterium
Agrobacterium-Transformation wird wie vorstehend beschrieben ausgeführt (Wen-Jun und Forde, Nucleic. Acids Research 20: 8385, 1989) in einer Elektroporationsküvette von 0,2 cm (Bio-Rad Laboratories Ltd., USA) unter Verwendung eines Genpulsers^TM (Bio-Rad, USA) bei einer Feldstärke von 10 kV/cm (2,00 kV), einer Kapazität von 25 mF und einem Widerstand von 600 Ohm.
Vektoren für biolistische Transformation:
Vektoren, die verwendet werden, um Mais durch die biolistische Vorrichtung zu transformieren, sind alle Derivate von PUC. PMTL ist ein Pflanzentransformationsvektor, der den Maismetallothionein-artigen Genpromotor (MT-L) (de Framond, 1991) enthält. Die Codierungsregion von virB1 wird durch Polymerasekettenreaktion mit dem BAC-Klon als einem Templat und von Stamm A mit den nachstehenden Primern vervielfältigt.
5'-GGAGAGGCGGTGTTAGTT-3' (SEQ ID Nr. 11)
5'-CATCATCGCATTCGAGAG-3' (SEQ ID Nr. 12)
PCR-Reaktionen werden in Perkin-Elmer-thermischen Cyclern in einer 25-μl-Reaktion mit 1 × PCR-Puffer, 0,5 Einheit AmpliTaq, 200 μM jeweils dNTP, 0,2 μm von jedem Primer bei einer Annealingtemperatur von 55°C ausgeführt. Das PCR- Produkt wird zuerst in den pCR2.1-Vektor für TA-Klonieren (Invitrogen, San Diego, USA) kloniert. Es wird dann durch XbaI-SpeI-Doppeldigestion entfernt und dann in die XbaI-Stelle von dem pMTL-Vektor in Sense- und Antisense-Orientierung kloniert, was pMTL-virB1 bzw. pMTL-virBlas ergibt. In ähnlicher Weise wird das PCR-Produkt, das aus Stamm A vervielfältigt wird, in pMTL in Sense- und Antisense-Orientierung kloniert, um pMTL-virB1A bzw. pMTL-virB1Aas zu ergeben.
acvB wird in die XbaI-XhoI-Stelle von pMTL-Sense und pMTL-Antisense kloniert, was pMTL-acvB und pMTL-acvBas ergibt.
pGUS enthält das β-Glucuronidasegen (GUS) mit einem Intron in dem N-terminalen Codon von der Codierungssequenz und wird durch einen chimären Promotor gesteuert, der von den Octopin- und Mannopinsynthasegenen abgeleitet ist (Trimer der Octopinsynthasepromotor stromaufwärts aktivierenden Sequenz mit einer Domäne des Mannopinsynthasepromotors) (Ni et al., 1995).
Maissuspensionszellen:
Eine Suspensionskultur von Zea Mays, Sorte Black Mexican Sweet (BMS), wird in N6-Medium (Chu et al., 1975) gehalten und mit 30 g/l Saccharose und 2 mg/l 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) (2N63S) ergänzt. Für die Bombardementversuche verwendete Maiszellsuspensionen werden von 3 Tage alten schnell wachsenden Kulturen genommen. Vor Bombardieren werden ungefähr 0,5 ml gepackte Volumenzellen auf Filtern von 7 cm (Whatman, Nr. 4) vakuumfiltriert. Plattierte Zellen werden 4 Stunden bei 25°C auf Phytagar-verfestigtem 2N6-Medium, das 120 g/l Saccharose enthält, vor dem Bombardement gehalten.
Bombardement von Pflanzenzellen:
Gewebe werden mit Goldmikroprojektilen bombardiert, auf die ein Gemisch von Plasmiden ausgefällt wird. pGUS- Plasmid-DNA wird als eine innere Kontrolle für transiente Expressionsstudien verwendet. Für Co-Transformationsversuche tragen die Goldteilchen eine gleiche Masse vom gesamten Plasmid-DNA (0,5 μg von jeder Plasmid-DNA pro Zielplatte). Geeignete Mengen an jeder DNA werden in einem Gesamtvolumen von 10 μl vermischt und mit 50 μm 2,5 M CaCl₂ und 20 μl 0,1 M Spermidin freier Grundlage auf 50 μl von 0,3 μm Goldmikroträgern (60 mg/ml) ausgefällt. Mikroprojektilbombardement wird mit PDS 1000 He biolistischer Vorrichtung (DuPont) unter Verwendung von Zerfallsscheiben von 1100 psi, wobei die Probe 8 cm unterhalb des Stopping-Screen-Shelf positioniert ist, ausgeführt.
Transiente Expressionsassays:
β-Glucuronidaseaktivität wird durch ein Chemolumineszenzassay mit dem GUS-Licht-Kit (Tropix) bestimmt. β-Glucuronidaseaktivitäten werden als Lichteinheiten, nachgewiesen durch ein analytisches Luminometer Lumineszenzmodell 2001, integriert über 10 Sekunden bei 25°C, ausgedrückt.
Koloniehybridisierung:
Einen Tag alte BAC-Klone werden auf Nylonfiltern (Hybond-N, Amersham Life Sciences, GB) zur Hybridisierung mit radioaktiv markierten Agrobacterium abgeleiteten Proben gegeben. DNA-Proben werden mit [a-³²P]dCTP unter Anwendung des oligomarkierenden Kits von Pharmacia markiert. Die chvG-Probe und virD1-Probe entsprechen einem PCR-verstärkten Fragment. Die Libraryfilter werden in Hybridisierungslösung bei 65°C für 2 Stunden (5 × SSPE, 5 × Denhardt's Lösung, 0,5 % SDS, 0,1 mg/ml Lachsspermien-DNA) vorhybridisiert. Die Hybridisierung wird in dem gleichen Puffer bei 65°C über Nacht ausgeführt. Die Filter werden in 1 × SSC, 0,1 % SDS für 15 Minuten bei 65°C gespült, gefolgt von einer Inkubation in 0,1 × SSC, 0,1 % SDS für 15 min bei 65°C. Die Filter werden kurz trockengetupft und der Film wird über Nacht bei 70°C unter Anwendung eines intensivierenden Siebs exponiert. Für die PCR- Verstärkung wird eine Schleife von LBA4404 in ddH₂O resuspendiert, für 15 min auf 95°C erhitzt, zentrifugiert und 1 ml wird zur PCR-Reaktion mit den nachstehenden Bedingungen verwendet: 5 min bei 95°C und dann 30 Zyklen bei 95°C für 45 Sekunden, bei 55°C für 45 Sekunden und bei 72°C für 45 Sekunden.
Ergebnisse:

– Ungefähr 20 Maisembryonen werden mit einem Klon von der BAC-Library inokuliert und auf ein Kallusstartmedium plattiert. Nach gemeinsamer Kultivierung werden die Embryonen auf das gleiche Medium, ergänzt mit 250 mg/ml Cefotaxim, transferiert. Die Embryonen werden dann geprüft, um Schädigung zu bonitieren, die durch das rekombinante Bakterium verursacht wurde. Unter 160 gescreenten Klonen werden vier unabhängige BAC-Klone identifiziert (BAC1, BAC2, BAC3, BAC4). Um weiterhin die Region an dem BAC-Klon, der für den Zelltod von Maisgeweben verantwortlich ist, zu lokalisieren, werden Hind III Fragmente von BAC Klonen in einem Bluescript-Vektor subkloniert. Jeder von diesen Klonen wird an Maisgeweben getestet, um zu bestimmen, welcher die Fähigkeit, Zelltod auszulösen, beibehält.
– Die DNA-Sequenzen werden unter Anwendung von Subklonen und Oligonukleotiden bestimmt. Die Sequenzen von BAC1-2, BAC2-2 und BAC3-2 zeigen Homologie mit virB1, xylAxylB bzw. acvB. BAC-4 ist identisch mit BAC3-2.
– BAC-Klone, die acvB (BAC3 und BAC4), virB1 (BAC1) und xylA-xylB (BAC2) beherbergen, werden in Stamm A eingeführt, was Stämme A (acvB), A (virB1) und A (xylA) ergibt. Diese Stämme werden verwendet, um Maisgewebe zu inokulieren. Gewebe, die mit LBA4404 inokuliert wurden, zeigen ein typisches Zelltodmuster, wohingegen die Infektion mit Stamm A diese Symptome nicht produziert. A (acvB), A (virB1) und A (xylA) schließt Zelltod mit verschiedenen Anteilen ein, wobei A (acvB) der Stärkste ist. Das Vorliegen von diesen Genen wandelt somit die Wechselwirkung von Stamm A mit Mais um und macht Maisgewebe empfindlicher auf Infektionen (Tabelle 12). Tabelle 12
– In Southern-Analyse wird HindIII verdaute genomische DNA von Agrobacterium-Stämmen A136, LBA4404, LBA4402, A und B unter Bedingungen von moderater Strängigkeit mit jedem Fragment, das xylA oder acvB trägt, zur Probe genommen. Homologe Fragmente von xylA liegen in allen getesteten Stämmen vor. Sequenzen, die acvB hybridisieren, werden in LBA4404, LBA4402 und A136 gefunden, die Zelltod in Maiszellen induzieren. Von Interesse ist acvB, dem es an Agrobacterium-Stämmen A und B mangelt. acvB ist somit in seiner Verteilung begrenzt. Wie vorstehend berichtet, liegt acvB in relativ wenigen Stämmen von Agrobacterium vor (Wirawan et al., Biosci., Biotech., Biochem. 60: 44-49, 1993). xylA und acvB werden nicht durch das Ti-Plasmid ausgeführt, weil sie auf dem Ti-gehärteten Stamm LBA 4402 vorliegen.
– Um zu bestimmen, ob Expression von acvB und virB1 innerhalb Maiszellen letal ist, werden diese Gene in einem Pflanzenexpressionsvektor geklont und Co-transformiert mit dem pGUS-Vektor, der β-Glucuronidase (GUS) exprimiert. In dem Fall, dass das Testgen letal ist, wird die GUS-Aktivität vermindert oder entfernt (Mindrinos et al., 1994). Die Codierungsregion der zwei Gene ist in der Sense- und Antisense-Orientierung in einem Pflanzenexpressionsvektor, der den MTL-Promotor enthält und biolistisch in Maiszellen entlang mit dem Vektor pGUS freisetzt, subgeklont. Nach 30 h wird die Wirksamkeit von GUS in Maiszellen bonitiert. Die Ergebnisse werden in Tabelle 13 gezeigt. Die GUS-Wirksamkeit wird um etwa zweifach vermindert, wenn virB1 gemeinsam mit pGUS bombardiert wird. Maiszellen, gemeinsam bombardiert mit acvB und pGUS, zeigen konsistent eine 35-fache Verminderung in der GUS-Wirksamkeit. Dies weist aus, dass sich die Expression von acvB bei hohen Anteilen innerhalb der Maiszellen verschlechtert hat.

Tabelle 13
Die Plasmidkonstrukte werden an Maizellen durch die biolistische Vorrichtung freigesetzt. Nach Inkubation für 30 h werden Gewebe homogenisiert und GUS-Wirksamkeiten bestimmt.
Die Wirksamkeiten werden als Lichteinheiten/μg Protein ausgedrückt. Unabhängige Bombardements werden analysiert und Daten werden als Mittelwerte von fünf Wiederholungen ± SD wiedergegeben.
SEQUENZLISTING

Claims

Verfahren zum Transformieren einer Pflanzenzelle mit einem Gen von Interesse, umfassend: (a) Co-Kultivieren der Pflanzenzelle mit Agrobacterium unter Bedingungen, die Agrobacterium induzierte Nekrose (AIN) inhibieren, wobei das Agrobacterium einen Vektor umfasst, der das Gen von Interesse umfasst und wobei die Bedingungen Co-Kultivieren der Pflanzenzelle mit Agrobacterium nach Wärmeschockbehandlung der Pflanzenzelle umfassen; und (b) Selektieren der so transformierten Zelle.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Wärmeschockbehandlung bei 40-50°C erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Behandlung bei 42-48°C erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, wobei die Behandlung 2 bis 10 Minuten dauert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Pflanzenzelle eine Zelle einer Graminieae-Art ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Zelle eine Mais- oder Weizen-Zelle ist.
Verfahren zur Erzeugung einer fertilen transgenen Pflanze, umfassend Transformieren von Pflanzengewebe durch Co-Kultivieren des Gewebes mit Agrobacterium unter Bedingun gen, die AIN inhibieren und Regenerieren des so transformierten Gewebes, wobei das Agrobacterium einen Vektor umfasst, der das Gen von Interesse umfasst, und wobei die Bedingungen Co-Kultivieren des Gewebes mit Agrobacterium nach Wärmeschockbehandlung des Gewebes umfassen.