BRPI9816263B1 - método de transformação de uma célula vegetal com um gene de interesse e de preparação de uma planta transgênica fértil - Google Patents

Abstract

método de transformação de uma célula vegetal com um gene de interesse e de preparação de uma planta transgênica fértil. a presente invenção refere-se a um método aperfeiçoado de transformação de plantas com agrobacterium, particularmente gramineae, utilizado condições capazes de inibir a necrose induzida por agrobacterium e a um método de preparação de uma planta transgênica fértil.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO DE TRANSFORMAÇÃO DE UMA CÉLULA VEGETAL COM UM GENE DE INTERESSE E DE PREPARAÇÃO DE UMA PLANTA TRANSGÊNICA FÉRTIL".

Dividido do PI 9809899-3, depositado em 29.05.1998.

Esta invenção refere-se a um método de transformação de plantas usando Agrobacterium, mediante a realização da transformação na presença de um agente que iniba a necrose induzida por Agrobacterium, e/ou usando uma cepa de Agrobacterium que não induza necrose. O primeiro método, e ainda um dos métodos mais amplamente usados, para a introdução de material genético estranho em plantas explora o sistema de transformação natural de Agrobacterium spp. usando plasmí-dios Ti (indutor de tumor) ou Ri (indutor de raiz) recombinantes, em que o T-DNA compreende um gene de interesse. O gene de interesse é incorporado no material genético da planta pelo mesmo mecanismo que é usado no sistema natural para incorporar oncogenes ou genes da biossíntese de opina.

Embora a transformação com Agrobacterium funcione bem para plantas que sejam naturalmente infectadas e transformadas por Agrobacterium na natureza para formar tumores e/ou raízes pilosas, não funciona bem para outras plantas. Por exemplo, sabe-se que elementos da família da grama (Gramineae), como o milho, não formam tumores após a exposição a Agrobacterium e geralmente se mostram extramemente recalcitrantes à transformação com Agrobacterium. Ishida et al., Nature Biotechnoiogy (1996) 14:745-750, relataram a transformação de embriões de uma linhagem de milho particular (A188) e seus híbridos usando Agrobacterium com vetores "superbinários", mas a reprodutibilidade desses resultados e a aplicabilidade desse sistema a outras linhagens de milho ou o uso de Agrobacterium com outros vetores não está claro. Também houve relatos de transformação com Agrobacterium do milho usando o meristema apical como tecido alvo, mas a baixa eficiência do meristema apical como tecido alvo em comparação com, por exemplo, o calo embriogênico, tornam essa abordagem menos que ótima. Mesmo algumas plantas dicotiledôneas, como uvas, soja ou pi- menta, que são suscetíveis à infecção por Agrobacterium e formação de tumor na natureza, se mostraram, todavia, difíceis de transformar no laboratório, porque os tecidos alvos preferidos para transformação e regeneração parecem responder de maneira ruim à exposição a Agrobacterium. A falta de entendimento quanto aos mecanismos de resistência à infecção por Agrobacterium e formação de tumor se mostraram um obstáculo para se projetar uma solução ou mesmo avaliar apropriadamente o problema da transformação com Agrobacterium em plantas recalcitrantes à transformação com A-grobacterium, como Gramineae.

Verificou-se agora, surpreendentemente, que Agrobacterium é capaz de induzir necrose apoptótica em células vegetais, particularmente da família Graminieae, por exemplo, milho. Métodos de seleção e geração de Agrobacterium que seja menos competente para induzir necrose foram descobertos, assim como métodos de inibição da resposta necrótica em células a serem transformadas. A necrose observada em culturas de células de Gramineae após exposição a Agrobacterium é uma morte celular programada, pela qual a célula, aparentemente mediante um mecanismo de transdução de sinal, dirige sua própria morte. É distinta da morte celular passiva, isto é, necrose envolvendo rompimento da integridade da membrana e subseqüente incha-mento, que resulta em lise, por exemplo, conforme se observa após exposição a várias toxinas. Células que sofrem morte celular programada mostram alterações morfológicas características e fragmentação do DNA que, coletivamente, definem o processo da apoptose e são implementadas por um mecanismo que envolve expressão de gene de novo. As características estere-otípicas da apoptose descritas em células animais são encolhimento, perda de contato célula a célula em tecidos organizados, condensação do núcleo e cromatina, fragmentação do DNA ("segmentação" do DNA) e formação de vesículas nucleares e na membrana. Demonstra-se que o co-cultivo de A-grobacterium com tecidos de milho ou trigo resulta em um processo intimamente análogo à apoptose em células animais, em que a morte celular se caracteriza por divagem do DNA em fragmentos oligonucleossômicos e alte- rações morfológicas definidas. Em células de milho expostas a Agrobacteri-um, o Ca2+ aumenta a intensidade da fragmentação do DNA, ao passo que Zn2+ tem o efeito oposto, o que corresponde ao efeito desses cátions diva-lentes nas endonucleases endógenas responsáveis pela divagem de DNA durante a apoptose em células animais. Essa fragmentação também é diminuída pela adição de cicloheximida, o que evidencia que o processo requer expressão de gene de novo. A morte celular programada em resposta à exposição a Agrobacterium não havia sido anteriormente relatada.

Também se descobriu que essa necrose induzida por Agrobacterium (AIN) observada e Gramineae pode ser inibida com o uso de agentes inibidores de AIN, quer compostos químicos, como nitrato de prata, quer se-qüências de nucleotídeos inibidoras de AIN integradas de maneira estável ou transitoriamente operacionais na célula a ser transformada. Também se descobriu, por triagem de coleções de Agrobacterium, que as cepas de A-grobacterium variam em sua capacidade de induzir necrose, de modo que se podem selecionar cepas que sejam adequadas para transformação de plantas recalcitrantes, como Gramineae.

Portanto, as várias modalidades da invenção incluem as seguintes: 1. Um método de transformação de uma célula vegetal com um gene de interesse, compreendendo a exposição da dita célula vegetal a A-grobacterium sob condições que inibam AIN, como a presença de um agente inibidor de AIN ou um tratamento de choque térmico, em que o dito Agrobacterium compreende um ou mais plasmídios (vetores) compreendendo um ou mais genes de interesse. 1.1. Em uma modalidade do método precedente, o agente inbi-dor de AIN é um inibidor químico. O inibidor químico é, de preferência, um composto selecionado no grupo que consiste em inibidores de etileno (por exemplo, 2,5-norbornadieno, norborneno, tiossulfato de prata e nitrato de prata), inibidores da síntese de etileno (por exemplo, aminoetoxivinilglicina (AVG), sais de cobalto, ácido acetil salicílico ou ácido salicílico), antagonistas da giberelina (por exemplo, ácido abscísico ABA)) e inibidores da fosfa- tase (por exemplo, ácido ocadáico). Mais preferivelmente, o inibidor químico é um inibidor de etileno, de preferência nitrato de prata. Proteínas e peptí-dios também podem agir como inibidores químicos. Os exemplos são proteínas de ocorrência natural, como DAD-1, os inibidores de bacilovírus da a-poptose (lAPs), bacilovírus p35, ou análogos peptídicos sintéticos de caspa-ses capazes de desencadear a apoptose. O inibidor químico está adequadamente presente em uma concentração eficaz, por exemplo, para o nitrato de prata, em uma concentração de 0,1 a 20 mg/l, de preferência de 1 a 10 mg/l. 1.2.1. Em uma modalidade alternativa desse método, o agente inibidor de AIN é uma sequência de nucleotídeos. A seqüência de nucleotí-deos inibidora de AIN pode inibir a AIN diretamente ou por codificação de uma mRNA inibidor de AIN que codifica uma proteína inibidora de AIN. Por exemplo, pode ser um oligonucleotídeo anti-sentido ou um gene que codifique mRNA anti-sentido, que seja anti-sentido com relação a um gene que codifique uma enzima associada à necrose (por exemplo, protease, quinase ou fosfatase) ou proteína reguladora. Alternativamente, pode compreender a região codificadora de um gene capaz de inibir a apoptose sob o controle de um promotor capaz de expressão em plantas, por exemplo, uma região codificadora de um gene bcl-1 de mamífero sob o controle de um promotor capaz de expressão em plantas, uma região codificadora de um gene inibidor da apoptose de um bacilovírus, como p35 ou plAP, ou um gene capaz de suprimir a resposta de doença em plantas, por exemplo, nahG, dad-1 ou mio. Uma seqüência de nucleotídeos inibidora de AIN que expresse uma proteína inibidora de AIN pode ser opcionalmente adaptada para expressão na planta hospedeira formando-se uma seqüência de nucleotídeos síntese que codifique a mesma proteína, mas usando códons que sejam preferidos pela planta hospedeira e evitando seqüências de nucleotídeos, por exemplo, sinais de poliadenilação ou sítios de junção dentro da região codificadora, que possam afetar a expressão ótima na planta hospedeira, por exemplo, de maneira análoga aos métodos descritos na US 5.380.831 ou US 5.610.042. 1.2.2. A seqüência de nucleotídeos inibidora de AIN pode ser incorporada de maneira estável no genoma da planta a ser transformada ou pode estar apenas transitoriamente presente e operacional, por exemplo, no ou próximo ao momento em que a célula é exposta a Agrobacterium. A expressão transitória pode ser obtida, por exemplo, usando-se um sistema de agroinfecção, em que o T-DNA traz dois vírus gêmeos em tandem, de modo que um replicon viral que traga a seqüência de nucleotídeos inibidora de AIN possa se replicar na célula. Nesse sistema, o vírus tipicamente não se integrará ao genoma da planta, mas se replicará em elevado número de cópias e proporcionará um alto nível de expressão transitória. Células assim ativadas para serem resistentes à necrose podem ser, então, transformadas u-sando-se Agrobacterium com plasmídios Ti compreendendo o gene de interesse, queserá incorporado no genoma, ao passo que o vírus é diluído mediante regeneração e não será transmitido à semente. Assim, a descendência e os descendentes da planta infectada são transformados de maneira estável com o gene de interesse, mas não com a seqüência de nucleotídeos inibidora de AIN. A expressão transitória pode ser alternativamente obtida por introdução de seqüências de oligonucleotídeos inibidores de AIN curtas na planta, por exemplo, seqüências anti-sentido. 1.3. Em uma modalidade alternativa adicional, a AIN é reduzida ou inibida por tratamento com choque térmico do tecido vegetal a ser transformado antes do co-cultivo com Agrobacterium. O tratamento de choque térmico é efetuado a 40 - 50-C, de preferência a 42 - 48eC, 45QC sendo uma temperatura preferida para o milho. O tratamento dura 2-10 minutos e, de preferência, 4-8 minutos. 2. Um método de preparação de uma planta transgênica fértil compreendendo a transformação de tecido vegetal pelo método 1 acima e regeneração do tecido assim transformado. De preferência, o tecido é selecionado dentre embriões imaturos ou calos embriogênicos, por exemplo, calo do tipo I do milho. Quando o tecido é um embrião imaturo, o método também compreende, de preferência, a colocação dos embriões em meio de iniciação de calo antes ou depois da exposição a Agrobacterium e a regeneração da planta a partir do calo embriogênico assim obtido. De preferência, o gene de interesse (ou um deles) é um marcador selecionável ou identificável, permitindo a seleção ou identificação das células transformadas, tecido transformado e/ou plantas transformadas regeneradas. 3. O uso de um agente inibidor de AIN, por exemplo, um inibidor químico de AIN (por exemplo, um inibidor de etileno, por exemplo, nitrato de prata) ou uma seqüência de nucleotídeos inibidora de AIN (por exemplo, uma que codifique um mRNA ou proteína inibidora de AIN) em um método de transformação com Agrobacterium de uma planta ou seu tecido ou célula, ou um método de preparação de uma planta transgênica fértil, por exemplo, um método de acordo com 1 ou 2 acima. 4. Uma planta transgênica produzida pelo método de 2 acima, ou sua semente ou descendência. 5. Uma planta, tecido vegetal ou célula vegetal compreendendo uma seqüência de nucleotídeos de origem heteróloga, que iniba AIN, por exemplo, uma seqüência de nucleotídeos sintética ou uma seqüência de nucleotídeos derivada do genoma de uma espécie de organismo diferente. 6. Uma cultura de células ou tecidos vegetais, por exemplo, para uso na transformação de Gramineae, compreendendo a) um inibidor químico de AIN, b) um Agrobacterium compreendendo um plasmídio que compreenda um gene de interesse, e c) água e sais essenciais. O inibidor químico está adequadamente presente em uma concentração inibidora de necrose. O inibidor químico é, de preferência, um composto selecionado no grupo que consiste em inibidores de etileno (por exemplo, 2,5-norbornadieno, norborneno, tiossulfato de prata e nitrato de prata), inibidores da síntese de etileno (por exemplo, aminoetoxivinilglicina (AVG), sais de cobalto, ácido acetil salicílico ou ácido salicílico), antagonistas da giberelina (por exemplo, ácido abscísico ABA)) e inibidores da fosfa-tase (por exemplo, ácido ocadáico). Mais preferivelmente, o inibidor químico é nitrato de prata, por exemplo, em uma concentração de 0,1 a 20 mg/l, de preferência de 1 a 10 mg/l. A composição e a concentração ótimas de sais essenciais são as conhecidas na técnica e podem variar ligeiramente dependendo da espécie, tipo e estágio de desenvolvimento das células ou tecido, mas são genericamente suficientes para que as concentrações de íons e nutrientes do meio (por exemplo, concentrações de nitratos, íons de potássio, fosfatos, íons de cálcio, íons de magnésio, íons de sódio e íons de cloro) sejam mantidas em níveis que sejam bem tolerados pelas células vegetais e pelo Agrobacterium. O meio de cultura também pode compreender, opcionalmente, nutrientes adequados (por exemplo, açúcares, por exemplo, saca-rose), vitaminas, aminoácidos, hormônios e outros componentes (por exemplo, 2,4-D) conhecidos na técnica de cultura de células ou tecidos vegetais. A planta é, de preferência, da família Gramineae, por exemplo, milho. As células ou tecidos compreendem, de preferência, calos embriogênicos, por exemplo, calos do Tipo I ou do Tipo II. 7. Método de transformação de uma célula totipotencial de uma planta da família Gramineae, compreendendo a exposição de uma população de células totipotenciais ou tecido compreendendo células totipotentes a Agrobacterium compreendendo um ou mais plasmídios compreendendo um ou mais genes de interesse, em que o Agrobacterium é de uma cepa não induza níveis significativos de necrose na dita população a uma duração de exposição e a uma concentração suficientes para se conseguir a transformação das ditas células. O tecido é, de preferência, diferente do meristema apical, por exemplo, de preferência um tecido não diferenciado, por exemplo, embriões zigóticos ou calos embriogênicos plaqueados, de preferência calos embriogênicos durante a fase de iniciação (por exemplo, até 28 dias, de preferência até 14 dias após o plaqueamento em meio de iniciação), ou calos embriogênicos propagados em série, por exemplo, calos do Tipo I ou do Tipo II. 8. Método para a determinação da adequabilidade de uma cepa de Agrobacterium para uso na transformação de uma célula regenerável de uma planta da família Gramineae, compreendendo a exposição de uma população das ditas células regeneráveis da planta à cepa de Agrobacterium e observação ou determinação da quantidade de necrose na dita população de células. 9. Cepa de Agrobacterium que tenha sido geneticamente modificada para reduzir ou eliminar a expressão do fator de necrose de Agrobacterium ou um derivado dessa cepa modificada. O fator de necrose de Agrobacterium é o fator termicamente lábil observado no sobrenadante concentrado capaz de induzir a necrose, por exemplo, morte celular programada, em embriões de milho. A incompatibilidade entre Agrobacterium e células de milho provavelmente envolve alguns componentes genéticos. A presente invenção descreve três genes de Agrobacterium envolvidos na resposta de morte celular de tecidos de milho. Eles são identificados por triagem de uma biblioteca BAC de Agrobacterium. Verificou-se que 3 BAC independentes provocam morte celular e mostram homologia com xylA-xylB, virB1 e acvB. É possível que os genes relatados sejam apenas um subconjunto dos genes responsáveis pela incompatibilidade de Agrobacterium com tecidos de milho. A célula vegetal usada nos métodos da invenção é, de preferência, de uma espécie ou variedade de planta que não produza cecídios ou raízes pilosas após a transformação com Agrobacterium. De preferência, a espécie de planta é um elemento da família das gramas (Gramineae), mais preferivelmente milho ou trigo, particularmente milho. A célula vegetal é, de preferência, uma célula totipotente, isto é, uma célula que seja capaz de se regenerar em uma planta, de preferência uma planta fértil. Células totipotentes estão presentes, por exemplo, em embriões imaturos e calos embriogênicos. O tecido alvo é, de preferência, diferente do meristema apical. Mais preferivelmente, o tecido alvo compreende tecido não diferenciado, por exemplo, embriões zigóticos ou calos embriogênicos plaqueados. Os calos embriogênicos podem ser associadas ao embrião durante a fase de iniciação do calo (por exemplo, o período até 28 dias, de preferência até 14 dias, após o plaqueamento do embrião imaturo no meio de iniciação), ou podem ser calos embriogênicos pro-pagáveis em série, por exemplo, calos do Tipo I ou do Tipo II. O calo do Tipo I de milho é um tecido preferido, compreendendo células totipotentes para uso na presente invenção. O Agrobacterium é selecionado, de preferência, dentre A. tumefaciens e A. rhizogenes. De preferência, a cepa de Agrobacte- rium é uma cepa de A. tumefaciens, mais preferivelmente uma cepa que utilize nopalina. Quando a cepa de Agrobacterium é uma cepa de A. rhizoge-nes, é, de preferência, uma cepa que utilize agropina ou manopina. Mais preferivelmente, o Agrobacterium é um Agrobacterium que não induza ne-crose em Gramineae, por exemplo, um Agrobacterium selecionado dentre A. tumefaciens cepas A e B. Agrobacterium cepas A e B foram depositadas na Coleção Americana de Cultura de Tipo (ATCC) 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852/USA, sob os números de Designação ATCC 55964 e 55965, respectivamente, em 2 de maio de 1997, de acordo com o Tratado de Budapeste. O gene de interesse é, de preferência, um gene para resistência a herbicidas, resistência a doenças ou resistência a insetos, ou é um marcador selecionável ou identificável, e compreende um promotor operacional na planta, uma região codificadora e uma região terminadora 3’. Genes de resistência a herbicidas incluem o gene AHAS para resistência a herbicidas de imidazolinona ou sulfonil uréia, o gene pat ou bar para resistência a bialafos ou glifosinato, o gene da EPSP sintase para resistência a glifosato, e outros. Genes de resistência a doenças incluem genes para enzimas para síntese de antibióticos, por exemplo, para enzimas para síntese de pirolnitrina, genes de resistência derivados de plantas, e outros. Genes de resistência a insetos incluem genes para proteínas inseticidas de Bacillus thuringiensis. Marcadores selecionáveis incluem genes de resistência a herbicidas e genes de resistência a antibióticos (por exemplo, higromicina ou canamicina), assim como marcadores selecionáveis positivos, como o gene para manose fosfato isomerase. Marcadores identificáveis incluem genes para enzimas prontamente ensaiáveis, como o gene gus e o gene cat. O plasmídio pode compreender mais de um gene de interesse e/ou o Agrobacterium pode compreender diferentes plasmídios com diferentes genes de interesse. O termo necrose induzida por Agrobacterium (AIN), conforme aqui usado, refere-se a qualquer morte de célula vegetal mediada por Agrobacterium, mas inclui, particularmente, a morte celular programada induzida por Agrobacterium.

Exemplos Exemplo 1 - Mecanismo de ação da necrose em milho exposto a Agrobacterium a. Demonstração da necrose do milho, mas não de tabaco na presença de Agrobacterium Calos embriogênicos e embriões de milho se mostraram tecidos particularmente difíceis para a transformação por Agrobacterium. Os experimentos a seguir empregam linhagens cruzadas de milho (Zea mays L.) HE/89 e uma linhagem aqui designada como Elite 1. O calo embriogênico friável do milho linhagem HE/89 foi fornecido por Gunter Donn. HE/89 é descrito em Mórocz, S., Donn, G., Németh, J. e Dudits, D. (1990) Theor. Appl. Genet. 80:721-726. Elite 1 é uma linhagem de elite de propriedade da Novar-tis relacionada à B73. A cultura em suspensão de Elite 1 é iniciada a partir de um calo embriogênico friável selecionado dentre embriões imaturos. A linhagem HE/89 é cultivada em um meio N6 líquido modificado, acrescentado de 500 mg/l de Bacto triptona, 30 g/l de sacarose e 0,5 mg/l de ácido 2,4-diclorofenóxi acético (2,4-D) (N6M). A linhagem Elite 1 é cultivada em meio líquido N6 (Chu et al., 1975) suplementado com 30 g/l de sacarose e 2 mg/l de 2,4-D (2N63S). A linhagem celular de Nicotiana tabacum NT-1 cultivada em meio Murashige e Skoog suplementado com 2 mg/l de 2,4-D e sacarose (30 g/í) (MS3S) é usada como um controle suscetível a Agrobacterium. As culturas em suspensão são mantidas em meio líquido em um agitador rotativo (120 rpm) e sua subcultivadas a cada 7 dias.

As bactérias são cultivadas em meio YP (5 g/l de extrato de levedura, 10 g/l de peptona, 5 g/l de NaCI, pH 6,8) durante 24 h a 28-C. As bactérias são centrifugadas e ressuspendidas no meio para plantas apropriado. Para a inoculação de células vegetais Elite 1, HE/89 e NT-1, as bactérias são ressuspendidas, respectivamente, em meio líquido 2N63SM, N6M e MS3S.

Logo após a inoculação do calo embriogênico de milho, muitas das células se tornam necróticas (Tabela 1). A necrose é observada mesmo após a transferência dos calos embriogênicos tratados para um meio livre de bactérias e contendo cefotaxima. O co-cultivo de células de milho com culturas muito diluídas de Agrobacterium durante um tempo muito curto é suficiente para induzir uma resposta necrótica ou inibição do crescimento do milho cruzado Elite 1. Para calos embriogênicos de HE/89, um curto tempo de co-cultivo reduz a alteração necrótica em alguma medida, mas não evita completamente a necrose. Em experimentos de controle, a cefotaxima não faz com que o tecido de milho se torne necrótico. Assim, parece que o efeito necrótico é uma conseqüência da interação entre Agrobacterium e calos de milho. Como controle, células de tabaco NT-1 também são inoculadas com Agrobacterium e nenhuma necrogênese é observada.

Tabela 1: Co-cultivo de células vegetais em suspensão com LBA4404 Calos embriogênicos friáveis de milho HE/89 e de um milho cruzado de elite registrado mantidos em meio líquido são incubados com Agrobacterium durante 10 min, 1 h, 24 h ou 48 h antes da transferência para o meio contendo cefotaxima. 50 μΙ de bactérias, à densidade óptica indicada (OD = 600 nm), são adicionados a 10 ml de meio de cultura de tecido contendo 1 ml de volume de células compactado. Se a cultura tiver de ser incubada durante mais do que dois dias, as bactérias são lavadas e as células vegetais são ressuspendidas no mesmo meio, suplementado com cefotaxi-ma (250 mg/l). A presença ou ausência de necrose é avaliada 2, 4 e 7 dias após a inoculação, e a intensidade relativa da necrose é expressada da seguinte maneira: +, formação rara de necrose; ++, necrose fraca; +++, necrose forte; ++++, necrose muito forte. b. Evidência de morte celular programada Para se determinar o mecanismo de morte celular induzido por Agrobacterium em tecidos de milho, DNA genômico é extraído de células vegetais em suspensão colhidas 24 ou 48 horas após a inoculação com A-grobacterium. A exposição a Agrobacterium causa fragmentação do DNA em ambas as linhagens de milho, com um padrão característico de fragmentação internucleossômica, o que é considerado uma indicação precoce de morte celular programada. Células de milho e células de tabaco de controle, mantidas apenas em meio de cultura, não mostram fragmentação de DNA sob essas condições. A inoculação de células de milho com E. coli ou com células de Agrobacterium autoclavadas não causa fragmentação de DNA. Além disso, células de milho que sofreram morte celular programada não puderam induzir a morte celular de tecidos embriogênicos de milho frescos.

Evidências adicionais de que Agrobacterium induz fragmentação de DNA são obtidas investigando-se a sensibilidade do processo a Zn2+ e Ca2+. Na linhagem celular HE/89, Ca2+ aumentou a intensidade de fragmentos de DNA, ao passo que Zn2+ reduziu acentuadamente a fragmentação genômica. Essas características são totalmente consistentes com o efeito desses cátions divalentes nas endonucleases endógenas responsáveis pela divagem do DNA durante a apoptose em sistemas animais. A intensidade da fragmentação também é diminuída pela adição de cicloheximida, evidência de que o processo requer expressão de gene de novo. Esses resultados indicam que o contato de Agrobacterium com células de milho é responsável pela morte celular de tecidos de milho. A fragmentação do DNA durante a apoptose também é detectada in situ por reagentes que reagem com as hi-droxilas expostas nas unidades nucleossômicas. Embriões de milho de 12 dias de idade de uma linhagem de elite registrada descendente da Lancaster são inoculados com LBA4404 e plaqueados em meio DG4 suplementado com cloramben. Koziel, M. G., etal., 1993, Bio/Technology 11:194-200. Células apoptóticas são detectadas por coloração in situ com o kit TACS-1 (Trevigen), que envolve a marcação da extremidade dos fragmentos de DNA pela enzima Klenow usando dNTP conjugado a um marcador detectável, fornecendo um precipitado insolúvel escuro, indicativo de fragmentação ge-nômica. Cullivier, O., Pirianov, G., Kleuser, B., Vanek, P. G., Coso, O. A., Gutking, J. S. e Spiegel, S. (1996) Nature 381, 800-803. Os embriões são embebidos em solução de formaldeído a 3,7% e processados conforme descrito pelo fabricante. Para detectar a divagem de DNA genômico in situ, embriões fixados são tratados com o kit TACS-1. Seções transversais fixadas são primeiro tratadas com proteinase K durante 5 min à temperatura ambiente e, então, meruglhadas durante 5 min em peróxido de hidrogênio a 2% para remover a peroxidase endógena. Após uma breve lavagem com tampão de Klenow, os tecidos foram, então, incubados durante 1 h a 37-C com a enzima Klenow, que pode incorporar desoxinucleotídeos modificados exó-genos nas terminações 5’ dos fragmentos clivados. Um precipitado insolúvel escuro, indicativo de apoptose, que aparece na célula individual é detectável com um microscópio. Células tratadas com Agrobacterium se tornam escurecidas e de formato distorcido após 48 h de exposição. Embriões de controle, mantidos em meio de cultura apenas ou inoculados com E. coli, não mostram nenhum precipitado sob essas condições. Também se verificou que nem todos os tecidos de milho reagem de maneira igual a uma infecção por Agrobacterium: rebentos permanecem intactos, ao passo que embriões se tornam ne-cróticos. A fragmentação do DNA também é observada com cepas de Agrobacterium curaóas do plasmídio patogênico (cepas A136 e LBA4402), sugerindo que o fator que induz a morte celular programada não está relacionado ao plasmídio. A morte celular programada também é observada quando embriões de milho são incubados durante 20 minutos com sobrenadante concentrado 20 vezes de um Agrobacterium indutor de morte celular (cepa LBA 4404), mas não quando os embriões são contactados com sobrenadante preparado da mesma maneira com E. coli. A morte celular programada também não ocorre se o sobrenadante de Agrobacterium concentrado for aquecido durante 20 minutos a 100eC antes da incubação.

Calos embriogênicos de milho freqüentemente contêm áreas de células ainda aparentemente vivas e outras áreas que estão necróticas. O fato de apenas áreas limitadas morrerem, mesmo em situações em que células fora da área responsiva sejam simultaneamente expostas ao estímulo, sugere que existe uma diversidade temporal ou permanente nos elementos que controlam a resposta de células individuais a diferentes estimulas em tecidos organizados. O número de células em um tecido organizado que sofrem morte celular programada pode ser pequeno em comparação com a massa total, e o processo pode ser assíncrono. A indução de PCD em uma ou algumas poucas células em uma dada área ou tecido pode desencadear a rápida morte de células circundantes, conforme observados em células animais, e estas últimas células podem não mostrar o fenótipo de morte celular programada, mas, todavia, morrerem.

Exemplo 2: Inibição da morte celular programada induzida por Agrobacterium Preparação de tecidos para inoculação com Agrobacterium·.

Embriões imaturos (1,2 a 2,2 mm de comprimento) são assepti-camente excisados 14-15 dias após a polinização de espigas cultivadas em estufa e com a superfície esterilizada e plaqueados com o escutelo para cima em meio de iniciação de calo, 2DG4 + 5 mg/l de cloramben (2DG4-5Chl). O meio 2DG4 é o meio de Duncan modificado para conter 20 mg/l de saca rose.

Embriões com resposta de calo: Embriões imaturos são esterilizados conforme acima descrito, e plaqueados em meio de iniciação de calo (2DG4-5Chl) e aí cultivados durante 1 a 7 dias. O tecido resultante é usado como amostra para inoculação. Calo do tipo I jovem: Embriões plaqueados em meio de iniciação de calo (2DG4 + 5 Cloramben) durante 7 a 20 dias dão origem a calos. Esses calos são calos do tipo I típicos para o milho cruzado usado, que são aglomerados compactos e relativamente bem organizados de células. Os calos embriogênicos resultantes são cortados dos embriões e transferidos para meio de manutenção de calo, 2DG4 + 0,5 mg/l de ácido (2,4-diclorofenóxi) acético (2,4-D) e usados como amostras para inoculação.

Calo do Tipo I: O calo do tipo I obtido pelo método acima descrito pode ser mantido no meio de manutenção (2DG4 + 2,4 D a 0,5 mg/l) e subcultivados a cada 2 semanas.

Agrobacterium: A. tumefaciens cepa LBA4404 (pAL4404, pSB1) é usado nesses experimentos. pAL4404 é um plasmídio auxiliador desarmado. pSB1 é um plasmídio de ampla gama de hospedeiros, que contém uma região de homo-logia com pGIGUP e um fragmento Kpnl de 15,2 kb da região de virulência do pTiBo542 (Ishida et al., 1996; High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens, Nature Biotechno-logy 14, 745-750). A introdução do plasmídio pGIGUP por eletroporação em LBA4404 (pAL4404, pSB1) resulta em uma co-integração de pGIGUP e pSB1. O T-DNA desse plasmídio contém um gene PAT expressável em plantas acionado pelo promotor da ubiquitina, para conferir resistência a fos-finotricina, e um gene para GUS com um íntron no códon N terminal da se-qüência de codificação acionada pelo promotor Gelvin. Esse gene íntron-GUS expressa atividade GUS na célula vegetal, mas não em Agrobacterium. Crescimento bacteriano: Agrobacterium é cultivado durante 3 dias em meio YP (5 g/l de extrato de levedura, 10 g/l de peptona, 5 g/l de NaCI, 15 g/l de ágar, pH 6,8) suplementado com 50 mg/l de espectinomicina e 10 mg/l de tetraciclina. As bactérias são coletadas com uma alça e postas em suspensão em meio líquido N6, a uma densidade que varia de 109 a 5 x 109 células/ml. As células de Agrobacterium também podem ser coletadas de uma cultura de uma noite em meio YP e ressuspendidas em meio líquido N6.

Co-cultivo na presença ou ausência de nitrato de prata: Tecidos de milho preparados conforme acima descrito são ino-culados com Agrobacterium. Tecidos de milho são embebidos na suspensão bacteriana durante 5-10 min e, então, plaqueados em meio com ou sem nitrato de prata (1 a 10 mg/l). Os tecidos também são inoculados com uma gota de 5 μΙ com 109 a 5 x 109 células/ml de uma suspensão de Agrobacterium colocada em cima do tecido. Após a inoculação, os tecidos de milho são cultivados no escuro a 259C, com ou sem nitrato de prata no meio (1 a 10 mg/l). 2 ou 3 dias após a inoculação, os tecidos são transferidos no mesmo meio, suplementado com cefotaxima (250 mg/l) com ou sem nitrato de prata. Resultados: Sensibilidade de embriões de milho e calos embriogênicos de milho a Agrobacterium.

Calos embriogênicos podem se desenvolver a partir de embriões de milho quando plaqueados em meio de iniciação de calo. A linhagem celular desenvolvida a partir de embriões permanece altamente embriogênica quando mantida em meio contendo 2,4-D. Avalia-se a sensibilidade desses calos embriogênicos e embriões de uma linhagem cruzada de milho a Agrobacterium LBA4404. A formação de uma acentuada cor marrom no tecido é observada após o co-cultivo de Agrobacterium e tecidos de milho. Essa reação também é observada com LBA4402 que tenha sido curado de seu plas-mídio patogênico. Embriões de controle e calos embriogênicos que são co-cultivados com Escherichia coli e submetidos aos mesmos procedimentos não exibem morte celular ou coloração marrom significativa. Assim, parece que a morte celular é uma conseqüência da interação entre células de milho e Agrobacterium. Parece que os embriões são mais sensíveis a Agrobacterium do que calos embriogênicos. Uma concentração de 109 células/ml é suficiente para induzir a morte celular. Além disso, uma curta exposição (5 min) é suficiente para induzir essa reação.

Determina-se o efeito da adição de nitrato de prata ao meio de co-cultivo e ao meio de iniciação de calo. A adição de nitrato de prata permite a recuperação de tecidos saudáveis (Tabelas 2 e 3). Cerca de 50% dos embriões plaqueados em meio contendo nitrato de prata são capazes de produzir calos embriogênicos. O efeito ótimo é obtido com embriões plaque-ados em meio de iniciação de calo durante pelo menos 2 dias antes da ino-culação com Agrobacterium. Verificou-se que a combinação desses dois fatores previne drasticamente a necrose de calos embriogênicos de milho após co-cultivo com Agrobacterium. A coloração marrom reduzida dos calos embriogênicos se correlaciona com a iniciação do calo e sobrevivência do tecido após inoculação com Agrobacterium. Cerca de 80% dos embriões de controle não tratados com Agrobacterium dão origem a calos embriogênicos. O efeito do nitrato de prata também é observado com calos do tipo I inoculados com Agrobacterium (Tabela 3). Parece que uma linhagem jovem é mais resistente à inoculação com Agrobacterium, e um pré-tratamento com nitrato de prata melhora a recuperação de tecidos saudáveis.

Para se verificar que a presença do nitrato de prata durante o co-cultivo não reduz a virulência do Agrobacterium, discos de folhas de tabaco são inoculados com LBA4404 (GIGUP) a uma concentração de 109 células/ml. Nenhuma diminuição significativa da atividade de GUS é observada nas folhas de tabaco.

Tabela 2: Inoculação de embriões de milho com LBA4404 Embriões e embriões com respostas de calo embriogênico são inoculados com Agrobacterium LBA4404 (GIGUP) (109 células/ml). O meio básico é 2DG4 + 5 Cloramben (2DG4). Todos os tratados são feitos com cerca de 80 a 100 embriões e repetidos duas vezes. A iniciação do calo é avaliada duas semanas aDÓs a inoculação.

Tabela 3: Inoculação de calo do tipo I de milho Calos do tipo I são inoculados com Agrobacterium LBA4404 (GIGUP) (109 células/ml). O meio básico usado nesses experimentos é 2DG4 + 0,5 2,4D (2DG4), com ou sem nitrato de prata (AgN03). Todos os experimentos são feitos com cerca de 150 pedaços de calos do tipo I. A sobrevivência dos tecidos é avaliada 2 semanas aDÓs a inoculacão.

Exemplo 3: Transformação por Agrobacterium de embriões zigó-ticos imaturos e isolamento de calos transformados com o uso de fosfinotri-cina, higromicina ou manose como agente de seleção.

Embriões imaturos são obtidos aproximadamente 10 a 14 dias após a autopolinização. Os embriões zigóticos imaturos são divididos entre diferentes placas contendo meios capazes de induzir e sustentar a formação de calo embriogênico, a cerca de 25 embriões imaturos por placa.

Os embriões imaturos são inoculados na placa ou em líquido, conforme indicado no exemplo 2, com Agrobacterium com um plasmídio Ti compreendendo um gene marcador selecionável. Mediante uma série de experimentos, desenvolvem-se condições otimizadas para embriões imaturos. Em uma condição otimizada, os embriões imaturos são plaqueados em meio de iniciação de calo contendo nitrato de prata (10 mg/l), antes ou imediatamente após a inoculação com Agrobacterium. Aproximadamente 25 embriões imaturos são colocados em cada placa. 16 a 72 horas após a inoculação, os embriões imaturos são transferidos para meio de iniciação de calo com nitrato de prata e cefotaxima. A seleção de células transformadas é realizada da seguinte maneira: a. Marcador resistente a PPT: a transformação é realizada u-sando-se uma cepa de Agrobacterium portadora de um plasmídio com um gene que codifica a resistência a fosfinotricina na região de T-DNA. As células transformadas são selecionadas in vitro por aplicação de fosfinotricina a uma concentração de 3 mg/l 2 a 20 dias após a inoculação e mantidas durante um total de 2 - 12 semanas. O calo embriogênico assim obtido é regenerado na presença ou ausência de fosfinotricina em meio de regeneração padrão. Todas as plantas são testadas pelo teste com vermelho clorofenol (CR) quanto à resistência a PPT. Esse ensaio utiliza um corante indicador sensível a pH para mostrar quais células estão crescendo na presença de PPT. As células que crescem produzem uma alteração de pH no meio e tornam o indicador Vermelho Clorofenol amarelo (de vermelho). Plantas que expressam o gene de resistência a PPT são facilmente identificadas nesse teste. Plantas positivas pelo teste com CR são ensaiadas por PCR quanto à presença do gene PAT. Plantas que sejam positivas para o teste PCR são analisadas por transferência Southern. b. Marcador de resistência à higromicina: a transformação é realizada usando-se uma cepa de Agrobacterium portadora de um plasmídio com um gene (hpt, higromicina B fosfotransferase) que codifica a resistência à higromicina na região de T-DNA. As células transformadas são selecionadas usando-se higromicina a uma concentração de 3 mg/l 2 a 20 dias antes da inoculação e mantidas durante um total de 2 - 12 semanas. O calo embriogênico assim obtido é regenerado na presença ou ausência do agente selecionável em meio padrão de regeneração. Todas as plantas são testadas quanto à resistência à higromicina. Plantas que expressam o gene de resistência à higromicina são facilmente identificados nesse teste. Plantas positivas por esse teste são ensaiadas por PCR quanto à presença do gene hpt. Plantas que sejam positivas pelo teste PCR são analisadas por transferência Southern. c. Seleção positiva com manose: a transformação é realizada usando-se uma cepa de Agrobacterium portadora de um plasmídio com um gene (manose fosfato isomerase) que codifica a tolerância à manose na região de T-DNA, a manose é usada para selecionar células transformadas in vitro. Essa seleção pode ser aplicada a tão baixo quanto 1 g/l 2 a 20 dias após a inoculação e mantida durante um total de 2 - 12 semanas. O calo embriogênico assim obtido pode ser regenerado na presença ou ausência de manose em meio padrão de regeneração. Todas as plantas são testadas pelo teste de vermelho clorofenol (CR) quanto à tolerância à manose. Esse ensaio utiliza um corante indicador sensível a pH para mostrar quais células estão crescendo na presença de manose. As células que crescem produzem uma alteração de pH no meio e tornam o indicador Vermelho Clorofenol de vermelho em amarelo. Plantas que expressam tolerância a manose são facilmente identificadas nesse teste. Plantas positivas pelo teste de CR são ensaiadas por PCR quanto à presença do gene de manose. Plantas que sejam positivas para o teste de PCR são analisadas por transferência Southern.

Exemplo 4: Transformação por Agrobacterium de calos derivados de embriões zigóticos imaturos e isolamento de calos transformados com o uso de fosfinotricina, higromicina e manose como agentes selecionáveis. O calo do tipo I é obtido a partir de embriões zigóticos imaturos usando-se técnicas de cultura padronizadas. Aproximadamente 25 pedaços de calo do tipo I são colocados em meio de manutenção contendo nitrato de prata, antes ou após a inoculação com Agrobacterium. A inoculação pode ser efetuada conforme descrito no exemplo 2. Aproximadamente 16-72 horas após a inoculação, o calo é transferido para meio de cultura padrão contendo nitrato de prata e cefotaxima. A seleção pode ser aplicada imediatamente após a transferência para esse meio ou 1 a 20 dias depois. O calo é, então, subcultivado em seleção durante aproximadamente 2 a 12 semanas, após as quais calos sobreviventes e em crescimento são transferidos para meio de regeneração padronizado para a produção de plantas. A seleção é realizada como no exemplo precedente para células transformadas com genes para resistência a fosfinotricina, resistência a hi-gromicina ou manose fosfato isomerase.

Exemplo 5: Transformação de calos do tipo I de milho por inocu-lação com Agrobacterium e isolamento de calos transformados com o uso de fosfinotricina, higromicina e manose como agentes selecionáveis. O calo é derivado do plaqueamento de embriões imaturos do genotipo elite. As culturas são subcultivadas bimensalmente em meio de manutenção (2DG4 + 0,5 mg/l de 2,4-D), e os grumos de células colhidos 2 - 3 dias após a subcultura são colocados em meio 2DG4. Depois ou antes da inoculação com Agrobacterium, os grumos de células são plaqueados em meio 2DG4 contendo nitrato de prata. A inoculação com Agrobacterium pode ser efetuada conforme descrito no exemplo 2. Após 16 a 72 horas de incubação, o calo é transferido para meio de manutenção fresco contendo cefo-taxima e nitrato de prata. O calo é subcultivado em seleção durante um total de aproximadamente 2-12 semanas com o agente selecionável, após as quais calos sobreviventes e em crescimento são transferidos para meio de regeneração padronizado para a produção de plantas. A seleção é realizada como no exemplo precedente para células transformadas com genes para resistência a fosfinotricina, resistência a higromicina ou manose fosfato isomerase.

Exemplo 6: O tratamento com choque térmico evita a apoptose desencadeada por Agrobacterium Embriões imaturos: Linhagens cruzadas de milho são cultivadas em estufa. Embriões imaturos (0,8 a 2,2 mm de comprimento) são assepticamente excisados de espigas de superfície esterilizada entre 8 e 15 dias após a polinização, dependendo de fatores ambientais. Os embriões são plaqueados com o es-cutelo para cima em meio de iniciação de calo. Para a maioria das linhagens cruzadas, os embriões são plaqueados em meio LS (Linsmaier e Skoog, Physioi. Plant. 18: 100-127, 1965). Os embriões de CG00526 são plaqueados em 2DG4 + 5 mg/l de cloramben (2DG4-5Chl). O meio 2DG4 é o meio de Duncan modificado para conter 20 mg/l de sacarose (Koziel et al., Bi-o/Technology 11:194-200, 1993).

Calo do tipo I: Embriões imaturos são esterilizados conforme acima descrito e plaqueados em meio de iniciação de calo (2DG4-5Chl) e aí cultivados durante 1 a 7 dias. Embriões plaqueados em meio de iniciação de calo (2DG4 + 5 Chi) durante 7 a 20 dias dão origem a calos. Esses calos são calos do tipo I típicos. Calos do tipo I são aglomerados compactos de células relativamente bem organizadas. O calo embriogênico resultante é cortado dos embriões e transferido para meio de manutenção de calo, 2DG4 + 0,5 mg/l de ácido 2,4-diclorofenóxi acético (2,4-D), e usado para inoculação. O calo do tipo I obtido pelo método acima descrito pode ser mantido no meio de manutenção (2DG4 + 2,4 D a 0,5 mg/l) e subcultivado aproximadamente a cada 2 semanas.

Agrobacterium: A cepa usada é A. tumefaciens LBA4404 (pAL4404, pSB1). pAL4404 é um plasmídio auxiliador desarmado (Ooms et al., 7:15-29, 1982). pSB1 é um plasmídio de ampla gama de hospedeiros contendo uma região de homologia com pGIGUP e um fragmento Kpnl de 15,2 kb da região de virulência do pTiBo542 (Ishida et al., Nature Biotechnology 14:745-750, 1996). A introdução do plasmídio pGIGUP por eletroporação em LBA4404 (pAL4404, pSB1) resultou em uma co-integração de pGIGUP e pSB1. O pGIGUP contém uma gene de fosfinotricina acetil transferase (PAT) expres-sável, acionado pelo promotor da ubiquitina de milho, para conferir resistência a fosfinotricina (Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18:675-689, 1992). Também contém um gene para expressão de β-glicuronidase (GUS) com um íntron no códon N terminal da seqüência de codificação acionada por um promotor quimérico derivado dos genes da octopina e manopina sintase (um trímero da seqüência de ativação a montante do promotor da octopina sinta- se com um domínio do promotor da manopina sintase, Ni et al., Plant J., 7:661-676, 1995). Esse gene íntron-GUS expressa atividade de GUS na célula vegetal, mas não em Agrobacterium. O Agrobacterium é cultivado durante 3 dias em meio YP (5 g/l de extrato de levedura, 10 g/l de peptona, 5 g/l de NaCI, 15 g/l de ágar, pH 6,8) suplementado com 50 mg/l de espectinomi-cina e 10 mg/l de tetraciclina. As bactérias são coletadas com uma alça e postas em suspensão em meio líquido N6, a uma densidade que varia de 109 a 5 x 109 células/ml. Agrobacterium pode ser alternativamente coletado de uma cultura de uma noite em meio YP e ressuspendido em meio líquido N6. Também pode ser pré-induzido durante 4 a 6 h em Meio de Indução de Agrobacterium (AIM; K2HP04, 10,5 g; KH2P04, 4,5 g; (NH4)2S04, 1,0 g; Ci-trato de Na.2H20, 0,5 g; MgS04.H20 (1 M), 1,0 ml; Glicose, 2,0 g; Glicerol, 5,0 ml; MÊS (10 mM); Acetossiringona (50- 100 μΜ); pH 5,6).

Tratamento de tecidos com choque térmico: Antes do co-cultivo, os tecidos de milho são colocados em um tubo Eppendorf em meio líquido N6 e incubados durante 4 min a 45-C em um banho de água. O meio é, então, substituído por uma suspensão de A-grobacterium preparada conforme acima descrito. Após 5 min à temperatura ambiente, os tecidos são plaqueados em meio sólido apropriado. 3 dias após a co-inoculação, os tecidos são tingidos com X-Glu para se detectar atividade de GUS ou plaqueados em meio com cefotaxima (250 mg/l). Os tecidos de milho são, então, examinados para se detectar a resposta de calo, que indica a porcentagem de tecidos que sobrevivem à inoculação com Agrobacterium.

Co-cultivo: Tecidos de milho preparados conforme acima descrito são ino-culados com Agrobacterium. São embebidos na suspensão bacteriana durante 5-10 min e, então, plaqueados em meio sólido. Após a inoculação, os tecidos de milho foram cultivados no escuro a 25QC. 2 ou 3 dias após a inoculação, os tecidos são transferidos para o mesmo meio suplementado com cefotaxima (250 mg/l).

Detecção in situ da fragmentação de DNA: Os embriões são embebidos em uma solução de formaldeído a 3,7% e processados conforme descrito pelo fabricante (Trevigen). Para se detectar divagem de DNA genômico in situ, embriões fixados são tratados com o kit TACS-1 (Cullivier et al., Nature 381: 800-803, 1996). Seções transversais fixadas são primeiro tratadas com proteínas K durante 5 min à temperatura ambiente e, então, mergulhadas durante 5 min em peróxido de hidrogênio a 2% para remover a peroxidase endógena. Após uma breve lavagem com tampão de Klenow, os tecidos são incubados durante 1 h a 37QC com a enzima Klenow, que pode incorporar desoxinucleotídeos modificados exógenos nas terminações 5’ dos fragmentos clivados. Um precipitado insolúvel escuro, indicativo de apoptose, que aparece na célula individual é de-tectável com um microscópio.

Resultados: - Um fenômeno de grande coloração marrom foi observado após o co-cultivo de Agrobacterium e tecidos de milho, e uma concentração de 109 células/ml podia induzir a morte celular. Os embriões pareceram ser mais sensíveis a Agrobacterium do que calos embriogênicos. - Embriões e calos do tipo I são submetidos a um choque térmico e, então, inoculados com Agrobacterium a uma concentração de 109 células/ml. Após três dias de co-cultivo e cultura durante uma semana, os tecidos são examinados. O nível de proteção conferido pelo pré-tratamento com choque térmico é quantificado contando-se o número de tecidos que sobrevivem a inoculação.

Todos os embriões inoculados com Agrobacterium após um pré-tratamento com choque térmico mostram iniciação de calo, ao passo que nenhum calo surge em embriões que não sejam submetidos a um choque térmico (Tabela 4).

Tabela 4: Os embriões são inoculados com 109 células/ml de Agrobacterium LBA4404 (pGIGUP) e, então, plaqueados em meio de iniciação de calo. O meio básico é 2DG4+5Chl (2DG4). Todos os tratamentos são feitos com cerca de 80 a 100 embriões e repetidos duas vezes. A iniciação do calo é avaliada duas semanas após a inoculação. O mesmo efeito benéfico do tratamento com choque térmico é observado para o calo (Tabela 5).

Tabela 5: Calo do tipo I é inoculado com 109 células/ml de Agrobacterium LBA4404 (pGIGUP). O meio básico usado é 2DG4 + 0,5 de 2,4D (2DG4). Todos os experimentos são efetuados em aproximadamente 1.000 pedaços de calo do tipo I. A sobrevivência dos tecidos é avaliada 2 semanas após a inoculação.______________________________________________________________ A proteção observada após o pré-tratamento com choque térmico parece estar associada ao choque térmico, porque importantes proteínas de choque térmico podem ser amplificadas por RT-PCR. - Nenhuma fragmentação de DNA é detectada em embriões submetidos a um pré-tratamento de choque térmico. - Embriões de várias linhagens de milho são inoculados com A-grobacterium cepa LBA4404 (GIGUP) induzido em solução de AIM, com ou sem um pré-tratamento de choque térmico. Após três dias de co-cultivo, os embriões são tingidos para atividade de GUS. Os resultados são apresentados na Tabela 6. Parece que um pré-tratamento de choque térmico tem um efeito benéfico na expressão transitória.

Tabela 6: - : Sem choque térmico. HS: choque térmico. *As porcentagens de GUS se baseiam em um tamanho de a-mostra de aproximadamente 50 embriões imaturos. **A classificação de GUS se baseia em uma escala de 0 - 5 (0 = nenhuma coloração para GUS, 1=1-5 pontos/embrião, 2 = 5-15 pontos, 3 = 15-30 pontos, 4 = -25% da superfície do embrião com coloração para GUS, e 5 = -50% da superfície do embrião com coloração para GUS.

Exemplo 7: Transformação com Agrobacterium de trigo Embriões zigóticos imaturos (0,75 mm a 1,25 mm) são excisa-dos e plaqueados em meio à base de MS com 3 mg/l de 2,4-D, 300 mg/l de glutamina, 150 mg/l de asparagina e 3% de sacarose (3MS3S) durante 0, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 21 dias antes da inoculação com Agrobacterium. Em 21 dias, os explantes produzem uma massa embriogênica chamada de calo de 3 semanas.

Co-cultivo: Tecidos de trigo são inoculados com as Agrobacteria descritas no Exemplo 6. Tecidos de trigo são embebidos na suspensão bacteriana durante 5-10 min e, então, plaqueadas em meio sólido. Após a inoculação, os tecidos de trigo são cultivados no escuro a 25eC. 2 ou 3 dias após a inoculação, os tecidos são transferidos para o mesmo meio suplementado com cefotaxima (250 mg/l). Os explantes são inoculados sem receberem um pré-tratamento, ou são submetidos a um choque térmico a 42 - 48QC durante 4 -8 minutos. O tratamento com choque térmico é efetuado antes da inoculação. Os embriões podem ser submetidos ao choque térmico em 3MS inf ou AIM com 100 mM de líquido AS, ao passo que os calos são submetidos ao choque térmico "secos".

Inoculacão: Os explantes são inoculados em tubos eppendorf ou em placas. Quando inoculados em tubos, 1 ml da solução de Agrobacterium é pipetada no tubo, girada ou agitada na mão e deixada em repouso durante 5-15 minutos. A solução de Agrobacterium e o material de explante são, então, vertidos em uma placa de 3MS3S com 100 mM de AS, e o líquido é removido com uma pipeta de transferência de ponta estreita descartável. Quando a inoculação é feita em placas, o Agrobacterium é pipetado diretamente sobre os explantes e removido 5-15 minutos mais tarde. Os embriões são dispostos de modo que os eixos embriônicos estejam em contato com o meio. Iniciação, seleção e regeneração do calo: Os embriões são cultivados em meio de indução de calo (3MS3S) com antibiótico durante 3 semanas. Os calos embriogênicos são dissecados e colocados em MS3S (sem 2,4-D) com 5 mg/l de GA3 e 1 mg/i de NAA com o agente de seleção e antibiótico durante 2 semanas, então, removidos para MS3S com antibiótico e uma concentração mais elevada de agente de seleção durante aproximadamente 4 semanas. As mudas são, então, transferidas para caixas Magenta com 1/2 de sais MS e 0,5 mg/l de NAA, enquanto se mantém a concentração do agente de seleção igual à da última etapa. Para calos, o sistema de seleção e regeneração é o mesmo, exceto que os calos são cultivados apenas durante um máximo de 6 semanas a partir do plaqueamento do embrião, isto é, calos de 3 semanas são inoculados, co-cultivados e cultivados durante um máximo de mais 3 semanas antes de se iniciar a seleção e regeneração.

Resultados: - A fragmentação de DNA é estudada em embriões inoculados com Agrobacterium conforme descrito no Exemplo 6. Nenhuma fragmentação de DNA é detectada em embriões submetidos a um pré-tratamento de choque térmico. - O pré-tratamento com choque térmico antes da inoculação com Agrobacterium pode prevenir o surgimento de apoptose.

Exemplo 8: Supressão de apoptose induzida por Agrobacterium em células de milho por p35 e iap Vetores para transformação biolística: Os vetores usados para transformar milho pelo dispositivo biolís-tico são todos derivados de pUC. pUbiPAT contém um gene bar expressável em plantas que codificam a fosfinotricina acetil transferase (PAT) acionada pelo promotor da ubiquitina do milho (Christensen et al., 1992), para conferir resistência à fosfinotricina (PPT). A região codificadora de p35, iap e dad-1 são clonadas sob o controle do promotor do gene do tipo metalotioneína do milho (MTL) (de Framond, 1991). p35 e iap são fornecidos por Lois Miller (Universidade da Geórgia, Atenas, Geórgia). O fragmento Pstl-EcoRI de p35 que engloba a região codificadora é cortado de pHSP35VI+ (Ciem e Miller, 1994), clonado nos sítios correspondentes de pBluescript (Stratagene, La Jolla, Califórnia) e, então, clonado como um fragmento Pstl-Asp718 nos sítios correspondentes de pMTL. pMTL contém o promotor de MTL e o termi-nador de CaMV35S. O fragmento Sall-Spel que engloba a região codificadora de iap de pHSCplAPVI+ (Ciem e Miller, 1994) é clonado em sítios Xhol-Spel de pMTL. A seqüência de codificação de dad-1 foi clonada como um Sall-Xbal do cDNA de Arabidopsis cone 12T7 (Universidade de Michigan).

Vetores para a transformação de Agrobacterium·.

As regiões codificadoras de p35, iap e dad-1 acionadas pelo promotor de MTL são clonadas entre as seqüências de borda no vetor su-perbinário pSB11. O gene da β-glicuronidase (GUS) com um íntron no códon N terminal da seqüência de codificação é acionado por um promotor quimérico derivado dos genes da octopina e manopina sintase (mas; trímero da seqüência de ativação a montante do promotor da octopina sintase com um domínio do promotor da manopina sintase; Ni et al., 1995). Mas-GUS que expressa atividade de GUS na célula vegetal, mas não em Agrobacterium, é clonado em pSB11 para fornecer pMasGUS.

Esses vetores são, então, introduzidos em LBA4404 (pAL4404, pSB1) por eletroporação com cubetas Bio-Rad de 0,2 cm a uma intensidade de campo de 2 kV/cm, resistores de 600 Ohms e uma capacitância de 25 μ F. pSB1 é um plasmídio de ampla faixa de hospedeiros que contém uma região de homologia com pSB11 e um fragmento Kpnl de 15,2 kb da região de virulência de pTiBo542 (Ishida et al., 1996). A introdução do plasmídio pSB11 por eletroporação em LBA4404 (pAL4404, pSB1) resulta em uma co-integração de pSB11 e pSB1.

Inoculacão de embriões de milho com Agrobacterium·.

Embriões imaturos (0,8 a 2,5 mm) são assepticamente excisa-dos 12 a 15 dias após a polinização e plaqueados com o escutelo para cima em meio de iniciação de calo (2DG4 + 5 Clloramben; Duncan et al., 1985). Os embriões são inoculados com Agrobacterium a uma densidade de 109 células/ml durante 5 min e, então, cultivados no meio de iniciação de calo durante 3 dias. Os tecidos são, então, transferidos para o mesmo meio suplementado com cefotaxima (250 mg/l). A sobrevivência dos tecidos é avaliada 2 semanas após a inoculação.

Iniciação de calo do tipo I: Embriões plaqueados em meio de iniciação de calo durante 7 a 20 dias dão origem a calos. Esses calos são calos do tipo I típicos, que são aglomerados compactos de células relativamente bem organizadas (Suttie et al., 1994). O calo embriogênico resultante é cortado dos embriões e transferido para meio de manutenção de calo, 2DG4 + 0,5 mg/l de ácido (2,4-diclorofenóxi) acético (2,4-D). Calos do tipo I obtidos pelo método acima descrito podem ser mantidos no meio de manutenção (2DG4 + 2,4 D a 0,5 mg/l) e subcultivados a cada 2 semanas aproximadamente. O calo do tipo I é usado para experimentos de inoculação com Agrobacterium e para transformação pelo dispositivo biolístico.

Experimentos de transformação: O DNA de plasmídio é precipitado em um microveículo de ouro de 0,3 a 1 pm, conforme descrito no manual Biolistic da DuPont. 2 pg do gene antiapoptótico e 2 μg de pUbiPAT são usados por 50 μΙ de microveículo. 16 pedaços de calo do tipo I por placa são bombardeados usando-se o dispositivo biolístico PDS-1000/He (DuPont). Os tecidos são colocados na prateleira 8 cm abaixo da prateleira de tela de parada, e uma tela de aço inoxidável de 10 x 10 μπι é usada com discos de ruptura com um valor de 47 kg/cm2 (650 psi). Após o bombardeamento, os tecidos são cultivados no escuro durante um dia a 25eC, então, transferidos para meio de manutenção de calo 2DG4 + 0,5 mg/l de 2,4-D. 10 dias mais tarde, os tecidos são transferidos para o mesmo meio suplementado com 100 mg/l de PPT. Seis a oito semanas mais tarde, os tecidos são transferidos para 40 mg/l de PPT. Alguns dos tecidos são, então, usados para experimentos de inoculação, e parte deles é transferida para meio de regeneração (Murashige e Skoog contendo 3% de sacarose, 0,25 mg/l de ancimitol e 5 mg/l de cinetina) com 16 horas de luz por dia. As plantas transformadas são identificadas usando-se o ensaio de vermelho clorofenol (CR) para testar a resistência a PPT (Cramer et al., 1993) e, então, confirmada por PCR.

Inoculação de calo do tipo I transqênico com Agrobacterium·.

Tecidos do tipo I transgênicos, obtidos conforme acima descrito, são inoculados com Agrobacterium. Tecidos de milho são embebidos na suspensão bacteriana durante 5-10 min. Após a inoculação, os tecidos de milho são cultivados no escuro a 25eC em 2DG4 + 0,5 mg/l de 2,4-D. Dois ou três dias após a inoculação, os tecidos são transferidos para o mesmo meio suplementado com cefotaxima (250 mg/l).

Análise do material transqênico: DNA genômico é extraído de 100 mg de calo com o kit Isoquick (Microprobre, CA) e ressuspendido em 20 μΙ de água. 1 μΙ é usado para a reação de PCR. As reações de PCR são efetuadas em cicladores térmicos Perkin-Elmer em 25 μΙ de reação usando 1 x tampão de PCR, 0,5 unidades de AmpliTaq, 200 μΜ cada de dNTPs, 0,2 μΜ de cada primer. Para se detectar a presença do gene pat nos tecidos, as reações de PCR são efetuadas com os primers PAT a uma temperatura de recombinação de 559C. Para a detecção dos genes iap, p35 e dad-1 em tecidos transgênicos, os primers usados para cada reação são P e I, P e 35 e P e D, a uma temperatura de recombinação de 559C, 559C e 489C, respectivamente. PAT1: 5’-TGTCTCCGGAGAGGAGACC-3’ (SEQ ID NO: 1) PAT2: 5’-CCAACATCATGCCATCCACC-3’ (SEQ ID NO: 2) MTL(P): 5’-AGGTGTCCATGGTGCTCAAG-3’ (SEQ ID NO: 3) iap(l): 5’-ACAATCGAACCGCACACGTC-3’ (SEQ ID NO: 4) p35(35): 5’-CCAGGTAGCAGTCGTTGTGT-3’ (SEQ ID NO: 5) dad-1 (D): 5’-CCTTGTTTCCTTTGTTCACT-3’ (SEQ ID NO: 6) RT-PCR com p35 e iap: O RNA total é extraído de calos transgênicos usando Reagente de Isolamento Tripuro (Boehringer Mannheim), tratado com DNase livre de RNase, e 0,5 pg são colhidos para síntese de cDNA usando vantajosamente RT-PCR (Clontech) e primer oligo-dT. Após a síntese do segundo filamento, um vigésimo dessa reação é usado como molde para a reação de PCR com Taq DNA polimerase.

Os primers p35 usados para RT-PCR são: 5’-GGTCCTATACGAAGCGTTAC-3’ (SEQ ID NO: 7) e 5’-CCACGTAGCAGTCGTTGTGT-3’ (SEQ ID NO: 8), amplificando 300 pb de transcrito.

Os primers iap para RT-PCR são: 5’-CATGTCTGACTTGCGATTGG-3’ (SEQ ID NO: 9) e 5’-ACAATCGAACCGCACACGTC-3’ (SEQ ID NO: 10), amplificando 248 pb de transcrito.

Para excluir a contaminação de DNA genômico, reações de cD-NA de controle, em que a transcriptase reversa é omitida, são preparadas em paralelo.

Resultados: - A maioria dos embriões e calos embriogênicos não sobrevivem à inoculação com Agrobacterium. Uma curta exposição (5 min) é suficiente para induzir essa reação. Tecidos que são co-cultivados com Escherichia coli e submetidos aos mesmos procedimentos não exibem nenhuma lesão. - p35, iap e dad-1 foram clonados no cassete de expressão em plantas entre as sequências de borda do T-DNA. Como esses genes antia-poptóticos são trazidos pelo T-DNA, devem ser distribuídos às células de milho no momento da inoculação. Os tecidos de milho são inoculados com Agrobacterium LBA4404 (109 células/ml), com ou sem os genes supressores de morte celular (entre colchetes). Após o co-cultivo, embriões de milho ou calos do tipo I são examinados para se quantificar a sobrevivência do tecido como uma indicação do nível de proteção conferido pela expressão dos genes antiapoptóticos. Todos os tratamentos são feitos com cerca de 50 a 80 explantes de milho e repetidos duas vezes. Os tecidos são transferidos 3 dias após a inoculação para o mesmo meio contendo cefotaxima. O efeito do Agrobacterium é avaliado duas semanas após a inoculação. Os resultados são apresentados nas Tabelas 7 e 8, respectivamente.

Tabela 7 (embriões) Tabela 8 (Calo do tipo I) Cerca de 80% dos embriões dão origem a calos embriogênicos quando não são tratados com Agrobacterium. Cerca de 25% dos embriões tratados com Agrobacterium portador de p35 ou ipa dão origem a calos embriogênicos, ao passo que apenas 3% dos embriões inoculados com Agrobacterium exibiram iniciação de calo. Um efeito similar é observado com calos do Tipo I inoculados com Agrobacterium portando p35 ou iap (Tabela 2). dad-1 conferiu apenas baixos níveis de proteção em qualquer sistema. - Parece que a expressão transitória de p35 e iap reduz a coloração marrom de tecidos em alguma medida, mas não inibe completamente o fenômeno. Isso pode ser explicado por uma baixa eficiência da transferência de T-DNA para as células de milho. Conforme julgado pela expressão transitória com GUS, parece que o tecido alvo não é uniformemente transformado. Isso pode ser uma indicação de que muito poucas células são receptoras de T-DNA. - A estrutura do calo embriogênico que emerge dos embriões inoculados com Agrobacterium contendo p35 ou iap não é tão compacta quanto a do controle. Isso pode ser explicado pelo fato de que apenas células que recebem o T-DNA portador do gene antiapoptótico sobrevivem e de que células transformadas individuais não transmitem necessariamente o sinal para células vizinhas. Esse tipo de crescimento de tecido pode ser evidência de que os genes supressores de morte celular salvam células condenadas muito eficazmente, mas sua expressão de curto prazo não confere proteção total contra o efeito de Agrobacterium. - Calos embriogênicos transgênicos para p35, iap e dad-1 resul- tam da distribuição dos ditos genes sob o controle de um promotor expres-sável em plantas no calo do Tipo I com bombardeamento de microprojéteis. Os construtos são co-bombardeados com o gene bar, os tecidos são selecionados em PPT e o estado transformado desses calos é primeiro confirmado por PCR (Tabela 9).

Tabela 9 Experimento de transformação #PCR + UbiPAT 5 PAT + MTLp35, UbiPAT 9 PAT +, 3 p35 + MTLiap, UbiPAT 7 PAT +, 5 iap + MTLdad, UbiPAT 11 PAT +, 4 dad-1 Ί- Α sensibilidade à inoculação com Agrobacterium é, então, ensaiada em eventos independentes. O calo é inoculado com Agrobacterium LBA4404 (109 células/ml). Duas linhagens de calos transgênicos independentes são testadas. Todos os tratamentos são repetidos duas vezes. Os tecidos são transferidos 3 dias após a inoculação para o mesmo meio contendo cefotaxima. A sobrevivência de tecidos de milho é avaliada duas semanas após a inoculação com Agrobacterium (Tabela 10).

Tabela 10 Experimento de transformação Número de calos resistentes a LBA4404 Linhagem 1 Linhagem 2 UbiPAT 1/24 (4%) 1/32 (3%) MTLp35, UbiPAT 22/25 (88%) 25/28 (89%) MTLiap, UbiPAT 20/22(90%) 19/25(76%) MTLdad, UbiPAT 12/27(44%) 9/22(41%) Calos embriogênicos transgênicos para p35 e iap não exibem morte celular quando submetidos à inoculação com Agrobacterium, ao passo que se observa uma grande coloração marrom em tecidos de controle após o co-cultivo. A presença do gene dad-1 retarda o surgimento de apoptose, mas não bloqueia a morte celular como iap e p35 o fazem. Os resultados são reprodutíveis em vários experimentos independentes. - O efeito protetor de p35 e iap também é evidente quando me- dido por eletroforese de fragmento de DNA oligonucleossômico. - Parece que o efeito do dad-1 é mais óbvio quando expressado de maneira estável nos tecidos. - Há uma clara correlação entre a expressão dos genes antia-poptóticos e a ausência de morte celular. Os genes p35 e iap são expressados em calos transgênicos, conforme julgado por PCR de transcrição reversa (RT-PCR). Os controles foram uniformemente negativos.

Exemplo 9: Triagem e identificação de cepas de Agrobacterium que não induzem morte celular em células de milho A sensibilidade de calos embriogênicos e embriões de uma linhagem de milho bem estudada (A188) e de uma linhagem de elite registrada (Elite 2) a várias cepas de Agrobacterium é testada usando-se um painel de 40 cepas de Agrobacterium do tipo selvagem. Essas cepas são primeiro testadas quanto à sua compatibilidade com calos embriogênicos e embriões A188 e Elite 2. Dentre essas, 6 das 40 cepas não impedem inteiramente o crescimento de tecidos de milho e são adicionalmente testadas em embriões de Elite 2 plaqueados em meio de iniciação de calo e inoculados a uma concentração de 109 células/ml. A iniciação do calo é avaliada 2 semanas após a inoculação e expressada como uma porcentagem de embriões com resposta.

Essas cepas também são testadas quanto à sua virulência em discos de folha de tabaco plaqueados em meio livre de hormônio, e se nota que o potencial das cepas de induzirem morte celular programada em células de milho não se correlaciona com a virulência. A porcentagem na Tabela 11 descreve o número de discos de folha com tumores.

Tabela 1 : Comparação da virulência de cepas não necrogênicas ** Calo do tipo I bom.

As cepas A e B de Agrobacterium foram depositadas na ATCC em 2 de maio de 1997, de acordo com o Tratado de Budapeste, sob os números de designação ATCC 55964 e 55965, respectivamente.

Exemplo 10: Genes de Agrobacterium que desencadeiam apop-tose em células de milho Uma biblioteca BAC (cromossomo artificial bacteriano) é construída com fragmentos de DNA genômico de Agrobacterium de aproximadamente 100 - 200 kb, em um esforço para identificar elementos genéticos responsáveis pela resposta de morte celular em tecidos embriogênicos de milho. A biblioteca é introduzida em Escherichia colia. Para se verificar se essa base é adequada para a triagem da biblioteca BAC, E. coli contendo apenas vetor BIBAC é inoculada em embriões de milho. Verificou-se que E. coli não induz uma resposta apoptótica característica.

Estima-se que cerca de 25 a 30 clones BAC com enxertos de 150 - 200 kb são suficientes para cobrir todo o genoma de Agrobacterium, considerando-se que o Agrobacterium tenha um tamanho de genoma razoavelmente equivalente ao da E. coli (4,6 x 106 pb). Um número relativamente grande de clones (200) é hibridizado com uma sonda cromossômica de A-grobacterium (chvD) para testar se a biblioteca BAC preparada em E. coli é uma representação clara do genoma de Agrobacterium. Dentre os 200 clones testados, 5 se iluminaram com a sonda chvD (dados não mostrados).

Um desafio é que os componentes genéticos de Agrobacterium poderíam estar silenciosos em E. coli. Além disso, fatores adicionais das plantas e/ou do Agrobacterium poderíam ser necessários para a expressão desse cone. Conseqüentemente, o vetor BAC também contém uma origem de replicação funcional em Agrobacterium e pode ser prontamente transformado em Agrobacterium nesse cenário.

Crescimento bacteriano: Agrobacterium é cultivado durante 3 dias em meio YP (5 g/l de extrato de levedura, 10 g/l de peptona, 5 g/l de NaCI, 15 g/l de ágar, pH 6,8) suplementado com 100 mg/l de canamicina quando necessário. As bactérias são coletadas com uma alça e posta em suspensão em meio líquido N6, a uma densidade que varia de 109 a 5 x 109 cé!ulas/ml. As células de Agrobac-terium também podem ser coletadas de uma cultura de uma noite em meio YP e ressuspendidas em meio líquido N6. E. coli DH10B é cultivada em meio LB (1% de bacto-triptona, 0,5% de bacto-extrato de levedura, 170 mM de NaCI, pH 7,0). Após a transformação, é cultivada em solução SOC (2% de bacto triptona, 0,5% de bacto extrato de levedura, 10 mM de NaCI, 2,5 mM de KCI, 10 mM de MgCI2, 10 mM de MgS04, 20 mM de glicose, pH 7,0).

Preparação de DNA genômico de Agrobacterium: A cepa LBA4404 é usada para a construção da biblioteca. O protocolo, os materiais e os reagentes usados são do kit Imbed (Biolabs, USA). 4 x 10 ml de culturas de Agrobacterium são cultivadas durante uma noite a 28QC. Uma hora antes da colheita, 180 mg/ml de cloranfenicol são adicionados para alinhar os cromossomos. As células são centrifugadas a 800 g a 4-C durante 15 min, e o pellet é seco ao ar. As células são preaquecidas em 0,5 ml de solução de suspensão celular (10 mM de Tris-HCI, 20 mM de NaCI, 100 mM de EDTA, pH 7,2) a 42SC antes de serem incrustadas em agaro-se. As células de Agrobacterium são incrustadas em bastões de agarose para realizar a degradação da parede celular e desproteinização, evitando o cisalhamento do DNA. Para incrustar as células em bastões de agarose, as células são misturadas com um volume igual de agarose de baixo ponto de fusão a 1% em ddH20 resfriada a 42QC e, então, deixadas endurecer em um molde Gel Syringe. Com a solidificação da agarose, os tampões são transferidos para 3 volumes de solução de lisozima (1 mg/ml de lisozima, 10 mM de Tris-HCI, 50 mM de NaCI, 100 mM de EDTA, 0,2% de desoxicolato de sódio, 0,5% de N-laurilsarcosina, pH 7,2) e incubados durante 2 horas a 37eC com agitação suave. A solução de lisozima é removida, e os bastões são lavados duas vezes com 3 ml de solução de lavagem durante 15 min de cada vez. Os bastões são, então, incubados em 3 ml de solução de Proteinase K (1 mg/ml de proteinase K, 100 mM de EDTA, 1% de N-laurilsarcosina, 0,2% de desoxicolato de sódio, pH 8,0), durante 20 horas a 429C com agitação suave. A solução de Proteinase K é removida por aspiração, e os bastões são dialisados duas vezes contra 5 ml de solução de lavagem (20 mM de Tris-HCI, 50 mM de EDTA, pH 8,0) durante 15 min, então, com 3 ml de solução PMSF (20 mM de Tris-HCI, 50 mM de EDTA, 1 mM de fluoreto de fenil metil sulfonila, pH 8,0) durante uma hora, seguido por duas lavagens com solução de lavagem. Os bastões são, então, lavados duas vezes com 5 ml de solução de armazenamento (2 mM de Tris-HCI, 5 mM de EDTA, pH 8,0) durante 15 min e, então, são recarregados em GelSyringes. Amostras com 1 mm de comprimento (10-20 ml) são cortadas com uma lâmina de barbear e diali-sadas contra tampão de endonuclease de restrição Notl (Biolabs, USA) durante 30 min a 49C. O tampão de endonuclease de restrição é substituído por tampão fresco e a incubação é efetuada durante uma noite a 379C com 20 unidades de enzima Notl (Biolabs, USA). A digestão parcial do DNA de Agrobacterium é conseguida usando-se Notl, uma enzima de corte rara. Notl gera, teoricamente, fragmentos de 18 kb de comprimento após uma digestão total, considerando-se que o genoma de Agrobacterium tenha um teor de G/C de 60% (resultados extrapolados de diferentes genes de Agrobacterium). As alíquotas são, então, carregadas com uma pipeta cuja ponta é cortada. O DNA é separado por eletroforese em gel com campo de pulso (PFG) em um gel de agarose a 1%, em 0,5 x TBE a 149C, usando um Mapeador CHEF Bio-Rad a 6 V/cm durante 32 h. O gel é tingido durante 20 min em um banho de EtBr ddH20 a 1 mg/ml, e fatias de agarose contendo fragmentos correspondentes a 100 - 200 kb são excisadas do gel. As fatias de agarose são dialisadas duas vezes contra TE durante uma hora a 49C e duas vezes com tampão de agarase (Biolabs, USA) durante uma hora a 4QC, derretidas a 659C durante 10 min e digeridas com uma unidade de agarase (Biolabs, USA) por 100 mg de agarose. A concentração de DNA é estimada fluorome-tricamente usando um DyNA Quant 200 (Hoefer, USA).

Preparação do vetor BIBAC: O vetor BIBAC foi gentilmente fornecido pela Dra. Carol M. Ha- milton (Universidade de Cornell, Ithaca) (Hamilton et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 93, 9975-9979, 1996). O BIBAC é projetado para se replicar tanto em E. coli, quanto em Agrobacterium e também contém o gene sacBII, permitindo uma seleção direta de enxertos clonados em um meio de sacarose. O vetor BIBAC também porta a origem de epissomo de fator F, que permite uma manutenção estável de uma ou duas cópias por célula com enxertos de até 300 kb (Shizuya et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 89, 8794-8797, 1992). O plasmídio é isolado usando-se o kit Wizard® Plus Maxiprep (Pro-mega, USA). Efetua-se uma extração com fenol-clorofórmio antes da precipitação com isopropanol. O plasmídio é digerido com Notl e desfosforilado com 1 unidade de fosfatase alcalina de camarão (Boerhinger Mannheim) a 379C durante uma hora. A ligação é realizada em 40 ml, nos quais 150 ng de DNA de Agrobacterium são incubados com 17 ng de vetor cortado (razão molar estimada de 10:1 com excesso de vetor) com 400 unidades de T4 DNA ligase (Boerhinger) a 17eC durante uma noite. Antes da transformação, a ligação é dialisada contra TE e 1/10 de TE em bolsas Micro-Collodion (Sar-torius, Alemanha), a 4QC durante 2 horas.

Transformação de DH10B com biblioteca pBAC A transformação de células de E. coli DH10B competentes (F', rec A1; ElectroMax, Gibco-BRL, USA) é realizada por eletroporação em cu-betas Gene Pulser pré-resfriadas (Bio-Rad, USA) com Gene Pulser® (Bio-Rad, USA), usando os seguintes ajustes: tensão de 2,5 kV, capacitância de 25 mF e resistência de 200 W. 25 ml de células competentes são misturadas com 1 ml de solução de ligação para cada eletroporação. Após a eletroporação, as células são transferidas para 0,5 ml de solução SOC e incubadas a 37QC em uma roda girando durante 45 min. Alíquotas de 150 ml das células são plaqueadas em meio LB contendo canamicina (40 mg/ml) e sacarose (5%).

Isolamento de DNA de BAC e determinação do tamanho do enxerto de DNA dos clones BAC

Clones BAC são cultivados durante uma noite sob agitação contínua em 10 ml de LB com canamicina (50 mg/ml). O DNA é extraído de a- cordo com o método de lise alcalina (Sambrook et al., 1989) com as seguintes modificações: RNAse a 30 mg/ml é adicionada à solução de ressuspen-são, e uma purificação com fenol-clorofórmio é efetuada antes da precipitação com isopropanol. O pellet de ácido nucléico é dissolvido em 50 ml de ddHaO. O DNA é separado por eletroforese PFG em um gel de agarose a 1% em 0,5 x TBE a 149C, usando-se um Mapeador CHEF Bio-Rad a 6 V/cm durante 32 h.

Inoculacão de embriões de milho com Aarobacterium: Embriões imaturos (0,8 a 2,5 mm) são assepeticamente excisa-dos de 12 a 15 dias após a polinização e plaqueados com o escutelo para cima em meio de iniciação de calo (2DG4 + 5 Cloramben) (meio de Duncan "D" com glicose: N6 principal, B5 menor, MS ferro, 20 g/l de sacarose, 5 mg/l de cloramben, 8 g/l de ágar purificado, adições de G4 e 10 mg/l de glicose, pH 5,8) (Duncan et al., 1985). Células bacterianas são ressuspendidas em 2N63SM (3,97 g/l de sais de N6, vitaminas de N6, 30 g/l de sacarose, 2 mg/l de 2,4-D, 8 g/l de ágar purificado, pH 5,8). Os embriões são inoculados com Agrobacterium ou com E. coli, a uma densidade de 109 células/ml, durante 5 min e, então, cultivados no meio de iniciação de calo durante 3 dias. Os tecidos são, então, transferidos para o mesmo meio suplementado com cefota-xima (250 mg/l). A sobrevivência dos tecidos é avaliada 2 semanas após a inoculação.

Transformação de Agrobacterium A transformação de Agrobacterium é efetuada conforme anteriormente descrito (Wen-Jun e Forde, Nucleic Acids Research 20:8385, 1989) em uma cubeta de eletroporação de 0,2 cm (Bio-Rad Laboratories Ltd., LISA) usando um Gene Pulser® (Bio-Rad, USA), a uma intensidade de campo de 10 kV/cm (2,00 kV), uma capacitância de 25 mF e uma resistência de 600 Ω.

Vetores para transformação biolística: Os vetores usados para transformar milho pelo dispositivo biolís-tico são todos derivados de pUC. pMTL é um vetor de transformação de plantas contendo o promotor do gene do tipo metalotioneína do milho (MT-L) (de Framond, 1991). A região codificadora de virB1 é amplificada por reação em cadeia de polimerase com o clone BAC como molde e a partir da cepa A com os seguintes primers: 5’-GGAGAGGCGGTGTTAGTT-3’ (SEQ ID NO: 11); 5’-CATCATCGCATTCGAGAG-3’(SEQ ID NO: 12). As reações de PCR são efetuadas em cicladores térmicos Perkin-Elmer, uma reação de 25 μΙ com 1 x tampão de PCR, 0,5 unidades de AmpliTaq, 200 μΜ cada de dNTPs, 0,2 μΜ de cada primer, a uma temperatura de recombinação de 55eC. O produto de PCR é primeiro clonado no vetor pCR2.1 para clonagem de TA (Invitrogen, San Diego, USA). É, então, excisado por uma digestão dupla com Xbal-Spel e, então, clonado no sítio Xbal do vetor pMTL em orientação de sentido e anti-sentido, dando origem a pMTL-virB1 e pMTL-virBIas, respectivamente. De maneira similar, o produto de PCR amplificado a partir da cepa A é clonado em pMTL em orientação de sentido e anti-sentido, dando origem a pMTL-virB1A e pMTL-virB1 Aas, respectivamente. acvB é clonado no sítio Xbal-Xhol de pMTLsentido e pMTLanti-sentido, dando origem a pMTL-acvB e pMTL-acv-Bas. pGUS contém o gene da β-glicuronidase (GUS) com um íntron no códon N terminal da seqüência de codificação e é acionado por um promotor quimérico derivado dos genes da octopina e manopina sintase (um trímero da seqüência de ativação a montante do promotor da octopina sintase com um domínio do promotor da manopina sintase) (Ni et al., 1995). Células de milho em suspensão Uma cultura em suspensão de Zea Mays cv Black Mexican Sweet (BMS) é mantida em meio N6 (Chu et al., 1975) e suplementada com 30 g/l de sacarose e 2 mg/l de ácido 2,4-diclorofenóxi acético (2,4-D) (2N63S). As suspensões de células de milho usadas para experimentos de bombardeamento são tomadas de culturas de rápido crescimento com 3 dias de idade. Antes do bombardeamento, aproximadamente 0,5 ml de volume compactado de células é filtrado a vácuo em filtros de 7 cm (Whatman, ne 4). Células plaqueadas são mantidas 4 horas a 25gC em meio 2N6 solidificado com fitagar contendo 120 g/l de sacarose antes do bombardeamento. Bombardeamento de células vegetais Os tecidos são bombardeados com microprojéteis de ouro, sobre os quais uma mistura de plasmídios foi precipitada. O DNA de plasmídio pGUS é usado como um controle interno em estudos de expressão transitória. Para experimentos de co-transformação, as partículas de ouro trazem uma massa igual de todos os DNAs de plasmídio (0,5 pg de cada DNA de plasmídio por placa alvo). Quantidades apropriadas de cada DNA são misturadas em um volume total de 10 μΙ e precipitadas com 50 μΙ de CaCI2 a 2,5 M e 20 μΙ de base livre de espermidina a 0,1 M sobre 50 μΙ de microveículos de ouro de 0,3 μιτι (60 mg/ml). O bombardeamento de microprojéteis é efetuado com o dispositivo biolístico PDS-1000 He (DuPont), usando discos de ruptura de 77 kg/cm2 (1.100 psi), com a amostra posicionada 8 cm abaixo da prateleira de tela de parada.

Ensaios de expressão transitória A atividade de β-glicuronidase é determinada por um ensaio qui-mioluminescente com o kit GUS-Light (Tropix). As atividades de β-glicuronidase são expressadas como unidades de luz detectadas por um Luminômetro Analítico de Luminescência modelo 2001 integrado durante 10 segundos a 25QC.

Hibridizacão de colônia Clones BAC de um dia de idade são colocados sobre filtros de náilon (Hybond—N, Amersham Life Sciences, UK) para hibridização com sondas derivadas de Agrobacterium radioativamente marcadas. As sondas de DNA são marcadas com [a-32P]dCTP usando o kit de marcação óligo da Pharmacia. A sonda chvG e a sonda virD1 correspondiam a um fragmento amplificado por PCR. Os filtros de biblioteca são pré-hibridizados em solução de hibridização a 65QC durante duas horas (5 x SSPE, 5 x solução de De-nhardt, 0,5% de SDS, 0,1 mg/ml de DNA de esperma de salmão). A hibridização é efetuada no mesmo tampão a 65QC durante uma noite. Os filtros são enxaguados em 1 x SSC, 0,1% de SDS durante 15 min a 659C, seguido por uma incubação em 0,1 x SSC, 0,1% de SDS durante 15 min a 659C. Os filtros são brevemente secos com papel toalha, e a película é exposta durante uma noite a -70QC usando-se uma tela de intensificação.

Para a amplificação por PCR, um laço de LBA4404 é ressus-pendido em ddH20, aquecido a 95SC durante 15 min, centrifugado, e 1 ml é usado para a reação de PCR com as seguintes condições: 5 min a 95QC e, então, 30 ciclos a 95SC durante 45 segundos, a 55SC durante 45 segundos e a 72SC durante 45 segundos.

Resultados - Aproximadamente 20 embriões de milho são inoculados com um clone da biblioteca BAC e plaqueados em um meio de iniciação de calo. Após o co-cultivo, os embriões são transferidos para o mesmo meio suplementado com 250 mg/ml de cefotaxima. Os embriões são, então, examinados para se avaliar a lesão causada pela bactéria recombinante. Dentre 160 clones triados, 4 clones BAC independentes são identificados (BAC1, BAC2, BAC3, BAC4).

Para localizar ainda mais a região no clone BAC responsável pela morte celular dos tecidos de milho, fragmentos Hindlll de clones BAC são subclonados em um vetor bluescript. Cada um desses clones é testado em tecidos de milho para determinar quais retêm a capacidade de provocar morte celular. - As seqüências de DNA são determinadas usando-se subclones e oligonucleotídeos. As seqüências de BAC1-2, BAC2-2 e BAC3-2 revelam homologia com virB1, xylA-xylB e acvB, respectivamente. BAC-4 é idêntico a BAC3-2. - Clones BAC portadores de acvB (BAC3 e BAC4), virB1 (BAC1) e xylA-xylB (BAC2) são introduzidos na cepa A, resultando nas cepas A(acvB), A(virB1) e A(xylA). Essas cepas são usadas para inocular tecidos de milho. Tecidos inoculados com LBA4404 apresentam um padrão de morte celular típico, ao passo que a infecção com cepa A é incapaz de produzir esses sintomas. A(acvB), A(virB1) e A(xylA) induzem morte celular em diferentes níveis, com A(acvB) sendo a mais forte. A presença desses genes converte, portanto, a interação da cepa A com o milho e torna os tecidos de milho mais sensíveis à infecção (Tabela 12).

Tabela 12 ________________________________________________________ - Em análise Southern, DNA genômico digerido com Hindlll de Agrobacterium cepas A136, LBA4404, LBA4402, A e B é sondado sob condições de rigor moderado, com o fragmento portador de xylA ou acvB. Fragmentos homólogos a xylA estão presentes em todas as cepas testadas. Seqüências que se hibridizam com acvB são encontradas em LBA4404, LBA4402 e A136, que induzem morte celular em células de milho. De interesse, acvB não está presente em Agrobacterium cepas A e B. acvB, portanto, está limitado em sua distribuição. Conforme anteriormente relatado, acvB está presente em relativamente poucas cepas de Agrobacterium (Wirawan et ai., Biosci. Biotech. Biochem. 60:44-49, 1993). xylA e acvB não estão presentes no plasmídio Ti, porque estavam presentes na cepa LBA4402 curada de Ti. - Para se determinar se a expressão de acvB e virB1 em células de milho é letal, esses genes são clonados em um vetor de expressão de planta e co-transformados com o vetor pGUS que expressa B-glicuronidase (GUS). No caso do gene de teste ser letal, a atividade de GUS está reduzida ou eliminada (Mindrinos et al., 1994). A região codificadora dos dois genes é subclonada em orientação de sentido e anti-sentido em um vetor de expres- são em plantas contendo o promotor MTL e biolisticamente distribuída a células de milho, juntamente com o vetor pGUS. APós 30 h, a atividade de GUS é avaliada em células de milho. Os resultados são mostrados na Tabela 13. A atividade de GUS é reduzida cerca de duas vezes quando virB1 é co-bombardeado com pGUS. Células de milho co-bombardeadas com acvB e pGUS mostram consistentemente uma redução de 35 vezes na atividade de GUS. Isso indica que a expressão de acvB em altos níveis em células de milho é prejudicial.

Tabela 13 Os construtos de plasmídios são distribuídos a células de milho pelo dispositivo biolístico. Após uma incubação de 30 h, os tecidos são homogeneizados e as atividades de GUS são determinadas. As atividades são expressadas como Unidades de Luz/mg de proteína. Bombardeamentos independentes são analisados, e os dados são apresentados como valores médios de cinco repetições ± DP. ________________________ LISTAGEM DA SEQÜÊNCIA (1) INFORMAÇÕES GERAIS: (i) REQUERENTE: (A) NOME: NOVARTIS AG (B) RUA: Schwarzwaldallee 215 (C) CIDADE: Basiléia (E) PAÍS: Suíça (F) CEP: 4058 (G) TELEFONE: +41 61 324 11 11 (H) TELEFAX: +41 61 322 75 32 (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Métodos de Transformação de Plantas (iii) NÚMERO DE SEQÜÊNCIAS: 10 (iv) FORMA LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disco flexível (B) COMPUTADOR: Compatível com IBM PC

(C) SISTEMA OPERACIONAL: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release n2 1.0, Versão 1.25 (E- PO) (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucléico (C) FILAMENTO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genômico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTI-SENTIDO: NÃO (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: PAT1 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 1: TGTCTCCGGA GAGGAGACC (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucléico (C) FILAMENTO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genômico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTI-SENTIDO: NÃO (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: PAT2 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 2: CCAACATCAT GCCATCCACC (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucléico (C) FILAMENTO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genômico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTI-SENTIDO: NÃO (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: MTL (P) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 3: AGGTGTCCAT GGTGCTCAAG (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucléico (C) FILAMENTO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genômico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTI-SENTIDO: NÃO (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: iap (I) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 4: ACAATCGAAC CGCACACGTC (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucléico (C) FILAMENTO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genômico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTI-SENTIDO: NÃO (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: p35 (35) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 5: CCAGGTAGCA GTCGTTGTGT (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucléico (C) FILAMENTO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genômico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTI-SENTIDO: NÃO (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: dad-1 (D) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 6: CCTTGTTTCC TTTGTTCACT (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucléico (C) FILAMENTO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genômico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 7: GGTCCTATAC GAAGCGTTAC (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucléico (C) FILAMENTO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genômico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 8: CCACGTAGCA GTCGTTGTGT (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucléico (C) FILAMENTO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genômico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 9: CATGTCTGAC TTGCGATTGG (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucléico (C) FILAMENTO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genômico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 10: ACAATCGAAC CGCACACGTC (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucléico (C) FILAMENTO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genômico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 11: GGAGAGGCGG TGTTAGTT (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucléico (C) FILAMENTO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genômico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTI-SENTIDO: NÃO

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 12: CATCATCGCA TTCGAGAG

Claims (6)

1. Método de transformação de uma célula vegetal com um gene de interesse, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) co-cultivo da dita célula vegetal com Agrobacterium sob condições que inibam a necrose induzida por Agrobacterium (AIN), em que o dito Agrobacterium compreende um vetor compreendendo o dito gene de interesse e em que as ditas condições compreendem o co-cultivo da dita célula vegetal com Agrobacterium na presença de um agente de inibição de necrose induzida por Agrobacterium-, e (b) seleção da célula assim transformada, sendo que o dito agente de inibição de necrose induzida por A-grobacterium é um inibidor químico que compreende um inibidor de etileno.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito inibidor de etileno é selecionado do grupo consistindo em 2.5- norbornadieno, norborneno, tiossulfato de prata e nitrato de prata.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a dita célula vegetal é uma célula de Graminieae sp.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a dita célula é uma célula de milho ou de trigo.

5. Método de preparação de uma planta transgênica fértil, caracterizado pelo fato de que compreende a transformação do tecido vegetal a-través do co-cultivo do dito tecido com Agrobacterium sob condições que inibam a AIN, e a regeneração do tecido assim transformado, em que o dito Agrobacterium compreende um vetor compreendendo um gene de interesse e as ditas condições compreendem o co-cultivo da dita célula vegetal com Agrobacterium na presença de um agente de inibição de necrose induzida por Agrobacterium, em que o dito agente de inibição de necrose induzida por Agrobacterium é um inibidor químico que compreende um inibidor de etileno.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o dito inibidor de etileno é selecionado do grupo consistindo em 2.5- norbornadieno, norborneno, tiossulfato de prata e nitrato de prata.