KR100505910B1 - 식물 형질전환 방법 - Google Patents

식물 형질전환 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR100505910B1
KR100505910B1 KR19997011305A KR19997011305A KR100505910B1 KR 100505910 B1 KR100505910 B1 KR 100505910B1 KR 19997011305 A KR19997011305 A KR 19997011305A KR 19997011305 A KR19997011305 A KR 19997011305A KR 100505910 B1 KR100505910 B1 KR 100505910B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
agrobacterium
callus
cells
corn
medium
Prior art date
Application number
KR19997011305A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20010013310A (ko
Inventor
한센제너비브
Original Assignee
신젠타 파티서페이션즈 아게
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 신젠타 파티서페이션즈 아게 filed Critical 신젠타 파티서페이션즈 아게
Publication of KR20010013310A publication Critical patent/KR20010013310A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100505910B1 publication Critical patent/KR100505910B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/582—Recycling of unreacted starting or intermediate materials

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

본원에는, 아그로박테리움-유도된 괴사를 억제할 수 있는 조건을 이용하는, 식물, 특히 그라미네아에의 개선된 아그로박테리움 형질전환 방법이 제공된다.

Description

식물 형질전환 방법{Plant transformation methods}
본 발명은 아그로박테리움(Agrobacterium)-유도된 괴사를 억제하는 제제의 존재하에서 아그로박테리움을 사용하여 형질전환을 수행하고/하거나 괴사를 유도하지 않는 아그로박테리움 종을 사용하여 형질전환을 수행하여, 식물을 형질전환시키는 방법에 관한 것이다.
외래 유전자 물질을 식물에 도입하는 방법중 최초의 방법으로서 여전히 가장 널리 사용되는 방법중의 하나는, T-DNA가 목적 유전자를 포함하고 있는 재조합 Ti(종양-유도) 또는 Ri(근-유도) 플라스미드를 사용하는, 아그로박테리움 종의 천연 형질전환 시스템을 이용하는 것이다. 천연 시스템이 발암유전자 또는 오핀 생합성 유전자를 도입하는데 사용하는 것과 동일한 기작을 사용하여 목적 유전자를 식물의 유전자 물질에 도입한다.
야생의 아그로박테리움에 의해 천연적으로 감염되거나 형질전환되어 종양 및/또는 뿌리털을 형성하는 식물의 경우, 아그로박테리움 형질전환이 잘 이루어지지만, 다른 식물의 경우 아그로박테리움 형질전환이 잘 이루어지지 않는다. 예를 들면, 옥수수와 같은 볏과(그라미네아에:Gramineae)의 일원은 아그로박테리움에 노출되어도 종양을 형성하지 않는 것으로 알려져 있으며, 아그로박테리움 형질전환에 대해 극히 거부적인 것으로 입증되었다. 문헌[Ishida, et al. Nature Biotechnology (1996) 14: 745-750]에는 특정 옥수수 계통(A188) 및 이의 잡종의 배아를 "우수한-이원성(super-binary)" 벡터를 지닌 아그로박테리움을 사용하여 형질전환시켰다고 보고 되어 있으나, 이들 결과의 재현성 및 다른 옥수수 계통에 대한 상기 시스템의 적용가능성, 및/또는 다른 벡터를 지닌 아그로박테리움을 사용한 경우의 적용가능성은 불분명하다. 표적 조직으로서 정단 분열조직을 사용한 옥수수의 아그로박테리움 형질전환도 또한 보고 되었으나, 예컨대 배형성 유합조직에 비해 정단 분열조직이 표적 조직으로서 효율이 낮기 때문에 이 방법이 최선의 방법은 못된다. 또한, 야생에서 아그로박테리움 감염 및 종양 형성에 민감한 일부 쌍자엽 식물, 예를 들면 포도, 대두 또는 후추나무는 실험실에서 형질전환시키기 곤란한 것으로 입증되었는데, 이는 형질전환 또는 재생에 바람직한 표적 조직이 아그로박테리움 노출에 대해 거의 반응하지 않는 것으로 보이기 때문이다. 아그로박테리움 감염 및 종양 형성에 대한 내성 기작에 대한 이해가 부족한 것이 아그로박테리움 형질전환에 거부적인 식물, 예를 들면 그라미네아에에서 아그로박테리움-형질전환시키는 문제에 대한 해결책을 고안하는데 있어 장해가 되거나 심지어 상기 문제를 적절히 평가하는데 있어 장해가 됨이 입증되었다.
본 발명에 이르러, 아그로박테리움이, 특히 그라미네아에 과(예: 옥수수)의 식물 세포에서 아폽토시스성(apoptotic) 괴사를 유도할 수 있다는 것이 발견되었다. 괴사를 유도하는데 덜 적격인 아그로박테리움을 선별하고 생산하는 방법 및 형질전환된 세포에서 괴사 반응을 억제하는 방법이 발견되었다.
아그로박테리움에 노출시 그라미네아에 세포 배양에서 나타나는 괴사는 분명히 신호 전달 기작을 통해 세포가 그 자신의 사멸을 지시하는 예정된 세포 사멸이다. 이는 수동적인 세포 사멸, 즉 예를 들어 각종 독소에 대한 노출시 보여지는 것과 같은 막 통합성의 파손 및 이에 따른 세포용해를 초래하는 팽윤을 수반하는 괴사이다. 예정된 세포 사멸이 진행중인 세포는, 총칭하여 아폽토시스(apoptosis) 과정이라 정의되는 특징적인 형태학적 변화 및 DNA 단편화를 나타내며, 이는 신생(de novo) 유전자 발현을 수반하는 기작에 의해 이루어진다. 동물 세포에서 기술된 아폽토시스의 전형적 특징은 수축, 조직화된 조직에서의 세포-세포 접촉의 상실, 핵 및 염색질의 응축, DNA의 단편화(DNA "래더링(laddering)") 및 핵 및 막의 블레빙(blebbing)이다. 본 발명자들은, 아그로박테리움과 옥수수 또는 밀 조직과의 공동배양은 동물 세포에서의 아폽토시스와 매우 유사한 과정을 초래한다는 것을, 즉 세포 사멸은 올리고뉴클레오솜 단편으로의 DNA 절단 및 정의된 형태학적 변화라는 특징을 보인다는 것을 알았다. 아그로박테리움에 노출된 옥수수 세포에서, Ca2+는 DNA 단편화의 강도를 증가시키는 반면, Zn2+는 상반된 효과를 나타내므로, 이들 2가 양이온이 동물 세포에서 아폽토시스 동안 DNA 절단에 관여하는 내생 엔도뉴클레아제에 미치는 효과는 서로 병행한다. 또한, 이러한 단편화는 사이클로헥시미드를 가함으로써 감소되는데, 이는 상기 과정이 신생 유전자 발현을 요구한다는 증거이다. 아그로박테리움에 대한 노출에 반응하는 예정된 세포 사멸은 이제까지 보고된 적이 없다.
또한, 그라미네아에에서 관찰된 이러한 아그로박테리움-유도된 괴사(AIN)는 AIN-억제제, 즉 질산은과 같은 화학적 화합물, 또는 형질전환될 세포에 안정하게 통합되거나 일시적으로 작용할 AIN-억제 뉴클레오티드 서열을 사용함으로써 억제될 수 있다는 것이 발견되었다. 또한, 아그로박테리움의 수집물을 스크리닝함으로써, 그라미네아에와 같은 형질전환 거부 식물에 적합한 균주가 선별될 수 있을 정도로, 아그로박테리움 균주가 괴사 유도력에 있어 매우 다양하다는 것이 발견되었다.
따라서, 본 발명의 여러 양태는 다음을 포함한다:
1. AIN-억제제 또는 열 충격 처리의 존재와 같이 AIN을 억제하는 조건하에서, 하나 이상의 목적 유전자를 포함하는 하나 이상의 플라스미드(벡터)를 포함하는 아그로박테리움에 식물 세포를 노출시킴을 포함하여, 목적 유전자로 식물 세포를 형질전환시키는 방법.
1.1 상기 방법의 구체적 양태에서, AIN-억제제는 화학적 억제제이다. 화학적 억제제는 바람직하게는 에틸렌 억제제(예: 2,5-노르보르나디엔, 노르보르넨, 티오황산은 및 질산은), 에틸렌 합성 억제제(예: 아미노에톡시비닐글리신(AVG), 코발트 염, 아세틸 살리실산 또는 살리실산), 지베렐린 갈항제(예: 아브스시스 산(ABA) 및 포스파타제 억제제(예: 오카다 산)으로 구성된 그룹중에서 선택된 화합물이다. 가장 바람직하게는, 화학적 억제제는 에틸렌 억제제, 바람직하게는 질산은이다. 단백질 및 펩티드도 역시 화학적 억제제로서 작용할 수 있다. 예로는 천연 단백질, 예를 들면 DAD-1, 바쿨로바이러스 아폽토시스 억제제(IAP: Inhibitor of Apoptosis), 바쿨로바이러스 p35, 또는 아폽토시스를 촉진할 수 있는 카스파제의 합성 펩티드 동족체를 들 수 있다. 화학적 억제제는 유효 농도로 적당히, 예를 들면 질산은의 경우 0.1 내지 20mg/l, 바람직하게는 1 내지 10mg/l로 존재한다.
1.2.1. 상기 방법의 또 다른 양태에서, AIN-억제제는 뉴클레오티드 서열이다. AIN-억제 뉴클레오티드 서열은 직접적으로, 또는 AIN-억제 단백질을 암호화하는 AIN-억제 mRNA를 암호화함으로써 AIN을 억제할 수 있다. 예를 들면, 이는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 안티센스 mRNA를 암호화하는 유전자일 수 있으며, 이는 괴사-관련된 효소(예: 프로테아제, 키나제 또는 포스파타제) 또는 조절 단백질을 암호화하는 유전자에 대해 안티센스이다. 달리, 이는 식물에서 발현할 수 있는 프로모터의 조절하에 아폽토시스를 억제할 수 있는 유전자의 암호 영역, 예를 들면 식물에서 발현할 수 있는 프로모터의 조절하의 포유동물의 bcl-1 유전자의 암호 영역, p35 또는 pIAP와 같은 바쿨로바이러스 기원의 아폽토시스 억제 유전자의 암호 영역, 또는 식물에서 질병 반응을 억제할 수 있는 유전자(예: nagG, dad-1 또는 mlo)을 포함한다. AIN-억제 단백질을 발현하는 AIN-억제 뉴클레오티드 서열은, 예를 들면 미국 특허 제5,380,831호 또는 미국 특허 제5,610,042호에 기술된 방법과 유사하게, 숙주 식물에서 최적 발현에 영향을 줄 수 있는 뉴클레오티드 서열(예: 폴리아데닐화 시그날 또는 스플라이스 부위)를 암호 영역으로부터 피하고 숙주 식물에 의해 선호되는 코돈을 사용하면서 동일한 단백질을 암호화하는 합성 뉴클레오티드 서열을 제조함으로써 숙주 식물에서 발현하기에 적합하도록 변형될 수 있다.
1.2.2. AIN-억제 뉴클레오티드 서열은 형질전환될 식물의 게놈에 안정하게 통합될 수 있거나, 또는 단지 세포가 아그로박테리움에 노출될 당시 또는 그 즈음에만 일시적으로 존재하여 작용할 수 있다. AIN-억제 뉴클레오티드 서열을 수반하는 바이러스 레플리콘이 세포에서 복제될 수 있도록 T-DNA가 두 쌍의 바이러스를 일렬로 포함하는 아그로인펙션(agroinfection) 시스템을 사용함으써 일시적인 발현을 얻을 수 있다. 이러한 시스템에서, 바이러스는 전형적으로 식물 게놈내로 통합되지는 않으나 고복제수로 복제되어 고수준의 일시적 발현을 제공할 것이다. 이어서, 괴사에 내성을 갖도록 준비된 세포를, 목적 유전자를 포함하는 Ti 플라스미드를 지닌 아그로박테리움을 사용하여 형질전환시키면, 상기 유전자는 게놈내로 통합될 것이고, 반면에 상기 바이러스는 재생 과정을 거치면서 희석되어 종자(seed)에 전달되지 않을 것이다. 따라서, 감염된 식물의 자손 및 후손은 목적 유전자로 안정하게 형질전환될 것이나, AIN-억제 뉴클레오티드 서열로는 형질전환되지 않을 것이다. 달리, 일시적인 발현을, 예를 들면 식물의 안티센스 서열에 짧은 AIN-억제 뉴클레오티드 서열을 도입함으로써 수득할 수 있다.
1.3. 또 다른 구체적 양태에서, 아그로박테리움과 공동 배양하기에 앞서 형질전환시킬 식물 조직에 열-충격 처리를 가함으로써 AIN을 감소시키거나 억제한다. 열-충격 처리는 40 내지 50℃, 바람직하게는 42 내지 48℃, 45℃(옥수수의 경우 바람직함)에서 수행한다. 이러한 처리는 2 내지 10분, 바람직하게는 4 내지 8분간 지속한다.
2. 식물 조직을 상기 1의 방법으로 형질전환시킨 후, 이렇게 형질전환된 조직을 재생시킴을 포함하여, 생식능이 있는 형질전환 식물(transgenic plant)을 제조하는 방법. 바람직하게는, 상기 조직을 미성숙 배아 또는 배형성 유합조직(예: 옥수수 제1형 유합조직)중에서 선택한다. 조직이 미성숙 배아인 경우, 상기 방법은 바람직하게는 상기 배아를 아그로박테리움에 노출시키기 전 또는 후에 유합조직 개시 배지에 놓은 후, 수득된 배형성 유합조직으로부터 식물을 재생시키는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 목적 유전자(또는 이들중의 하나)는 선별가능한 또는 기록가능한 마커이므로, 형질전환된 세포, 형질전환된 조직 및/또는 형질전환된 재생 식물을 선별하거나 동정할 수 있도록 한다.
3. 식물 또는 조직 또는 이의 세포의 아그로박테리움 형질전환 방법 또는 생식능이 있는 형질전환 식물의 제조 방법, 예를 들면 상기 1 또는 2의 방법에서, AIN-억제제, 예를 들면 AIN의 화학적 억제제(예컨대, 에틸렌 억제제, 예: 질산은) 또는 AIN-억제 뉴클레오티드 서열(예: AIN-억제 mRNA 또는 단백질을 암호화하는 서열)의 용도.
4. 상기 2의 방법에 의해 생산된 형질전환 식물, 또는 이의 종자 또는 자손.
5. AIN을 억제하는 이종 기원의 뉴클레오티드 서열, 예를 들면 합성 뉴클레오티드 서열 또는 상이한 종의 유기체의 게놈으로부터 유래된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 식물, 식물 조직 또는 식물 세포.
6. 예를 들면, 그라미네아에의 형질전환에 사용하기 위한, a) AIN의 화학적 억제제, b) 목적 유전자를 포함하는 플라스미드를 포함하는 아그로박테리움, 및 c) 물 및 필수 염을 포함하는 식물 세포 또는 조직의 배양물.
화학적 억제제는 괴사 억제 농도에서 안정하게 존재한다. 화학적 억제제는 바람직하게는 에틸렌 억제제(예: 2,5-노르보르나디엔, 노르보르넨, 티오황산은 및 질산은), 에틸렌 합성 억제제(예: 아미노에톡시비닐글리신(AVG), 코발트 염, 아세틸 살리실산 또는 살리실산), 지베렐린 갈항제(예: 아브스시스 산(ABA) 및 포스파타제 억제제(예: 오카다 산)으로 구성된 그룹중에서 선택된 화합물이다. 가장 바람직하게는, 화학적 억제제는, 예를 들면 0.1 내지 20mg/l, 바람직하게는 1 내지 10mg/l 농도의 질산은이다. 필수 염의 최적 조성 및 농도는 당업계에 공지되어 있고, 세포 또는 조직의 종, 유형 및 발생 단계에 따라 다소 달라질 수 있으나, 일반적으로 배지의 이온 및 영양소의 농도(예: 질산염, 칼륨 이온, 인산염, 칼슘 이온, 마그네슘 이온, 나트륨 이온 및 염소 이온의 농도)는 식물 세포 및 아그로박테리움이 잘 견딜 수 있는 수준에서 유지된다. 임의로, 배양 배지는 적당한 영양소(예: 당류, 예컨대 슈크로즈), 비타민, 아미노산, 호르몬 및 식물 세포 또는 조직 배양 분야에서 공지된 기타 성분(예:2,4-D)를 추가로 포함할 수 있다. 식물은 바람직하게는 그라미네아에 과(예: 옥수수)이다. 세포 또는 조직은 바람직하게는 배형성 유합조직, 예를 들면 제I형 또는 제II형 유합조직을 포함한다.
7. 전능성(totipotent) 세포군 또는 전능성 세포를 포함하는 조직을 하나 이상의 목적 유전자를 포함하는 하나 이상의 플라스미드를 포함하는 아그로박테리움(여기서, 아그로박테리움은 상기 세포의 형질전환을 달성하기에 충분한 노출 기간 및 농도에서 상기 집단에서 유의 수준의 괴사를 유도하지 않는 균주이다)에 노출시킴을 특징으로 하여, 그라미네아에 과 식물의 전능성 세포를 형질전환시키는 방법. 상기 조직은 바람직하게는 정단 분열조직이외의 것, 예를 들면 바람직하게는 미분화된 조직, 예를 들어 플레이팅된 접합 배아 또는 배형성 유합조직, 바람직하게는 개시기(예컨대, 개시 배지상에서의 플레이팅으로부터 28일 이하, 바람직하게는 14일 이하) 동안의 배형성 유합조직, 또는 연속적으로 증식가능한 배형성 유합조직, 예를 들어 제I형 또는 제II형 유합조직이다.
8. 식물의 재생가능한 세포군을 아그로박테리움 균주에 노출시키고 이러한 세포군에서의 괴사의 수준을 관찰하거나 측정함을 포함하여, 그라미네아에 과 식물의 재생가능한 세포의 형질전환에 사용하기 위한 아그로박테리움 균주의 적합성을 판정하는 방법.
9. 유전학적으로 변형시켜 아그로박테리움 괴사 인자의 발현을 감소시키거나 제거한 아그로박테리움 균주 또는 이러한 변형된 균주의 유도체. 아그로박테리움 괴사 인자는 옥수수 배아에서 괴사, 예를 들면 예정된 세포 사멸을 유도할 수 있는, 농축된 상층액에서 관찰된 열-불안정성 인자이다. 아그로박테리움과 옥수수 세포간의 비적합성은 어떤 유전자 성분과 관련이 있다. 본 발명은 옥수수 조직의 세포 사멸 반응과 관련된, 아그로박테리움 유래의 3종의 유전자를 기술한다. 이들은 아그로박테리움의 BAC 라이브러리를 스크리닝함으로써 확인된다. 3개의 독립적인 BAC가 세포 사멸을 유도하는 것으로 밝혀졌고, xy/A-xy/B, virB1 및 acvB와의 상동성을 보여 주었다. 보고된 유전자가 아그로박테리움과 옥수수 조직간의 비적합성의 원인이 되는 유전자의 서브셋트이다. 본 발명의 방법에서 사용된 식물 세포는 바람직하게는 아그로박테리움 형질전환시 식물혹 또는 뿌리털을 생성하지 않는 식물 종 또는 변종으로부터의 세포이다. 바람직하게는, 상기 식물종은 볏과(그라미네아에)의 일원, 가장 바람직하게는 옥수수 또는 밀, 특히 옥수수이다. 상기 식물 세포는 바람직하게는 전능성 세포, 즉 식물, 바람직하게는 생식능이 있는 식물로 자신을 재생시킬 수 있는 세포이다. 전능성 세포는 예를 들면 미성숙 배아 및 배형성 유합조직에 존재한다. 표적 조직은 바람직하게는 정단 분열조직이외의 것이다. 보다 바람직하게는, 표적 조직은 미분화 조직, 예를 들면 플레이팅된 접합 배아 또는 배형성 유합조직을 포함한다. 배형성 유합조직은 유합조직 개시기(예를 들면, 개시 배지상에서 미성숙 배아의 플레이팅으로부터 28일 이하, 바람직하게는 14일 이하의 기간) 동안의 배아와 관련이 있을 수 있거나, 연속적으로 증식가능한 배형성 유합조직, 예를 들면 제I형 또는 제II형 유합조직일 수 있다. 옥수수 제I형 유합조직은 본 발명에 사용하기 위한 전능성 세포를 포함하는 바람직한 조직이다. 아그로박테리움은 바람직하게는 아그로박테리움 튜메파시엔스(A. tumefaciens) 및 아그로박테리움 리조게네스(A. rhizogenes)중에서 선택된다. 바람직하게는 아그로박테리움 균주는 아그로박테리움 튜메파시엔스 균주, 가장 바람직하게는 노팔린-이용 균주이다. 아그로박테리움 균주가 아그로박테리움 리조게네스 균주인 경우, 이는 바람직하게는 아그로핀- 또는 만노핀-이용 군주이다. 가장 바람직하게는, 아그로박테리움은 그라미네아에에서 괴사를 유도하지 않는 아그로박테리움, 예를 들면 아그로박테리움 튜메파시엔스 균주 A 및 B 중에서 선택되는 아그로박테리움이다. 아그로박테리움 균주 A 및 B는, 부다페스트 조약하에 미국 메릴랜드 20852 록크빌 파크론 드라이브 12301에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)에 1997년 5월 2일자로, ATCC 기탁 번호 제55964호 및 제55965호로 각각 기탁되었다.
목적 유전자는 바람직하게는 제초제 내성, 질병 내성 또는 해충 내성의 유전자이거나, 선별가능하거나 기록가능한 마커이고, 식물-작동성 프로모터, 암호 영역, 및 3' 말단 영역을 포함한다. 제초제 내성 유전자에는 이미다졸리논 또는 설포닐 우레아 제초제에 대한 내성을 위한 AHAS 유전자, 비알라포스 또는 글루포시네이트에 대한 내성을 위한 pat 또는 bar 유전자, 글리포세이트에 대한 내성을 위한 EPSP 신타제 유전자 등이 포함된다. 질환 내성 유전자에는 항생제 합성 효소, 예를 들면 피롤니트린 합성 효소에 대한 유전자, 식물-유래된 내성 유전자 등이 포함된다. 해충 내성 유전자에는 바실루스 튜린기엔시스(Bacillus thuringiensis)로부터의 살충성 단백질에 대한 유전자가 포함된다. 선별가능한 마커에는 제초제 내성 유전자 및 항셍제(예: 하이그로마이신 또는 가나마이신) 내성 유전자는 물론, 양성 선별가능한 마커, 예를 들면 만노즈 포스페이트 이소모라제에 대한 유전자가 포함된다. 기록가능한 마커에는 용이하게 분석가능한 효소에 대한 유전자, 예를 들면 gus 유전자 및 cat 유전자가 포함된다. 플라스미드는 하나 이상의 목적 유전자를 포함하고/하거나, 아그로박테리움은 상이한 목적 유전자를 지닌 상이한 플라스미드를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 아그로박테리움-유도된 괴사(AIN)란 용어는 모든 아그로박테리움-매개된 식물 세포 사멸을 의미하고, 특히 아그로박테리움 유도된 예정된 세포 사멸을 포함한다.
실시예
실시예 1
아그로박테리움에 노출된 옥수수에서 괴사 작용의 기작
a. 아그로박테리움의 존재하에서 담배가 아닌 옥수수에서의 괴사의 증명
옥수수 배형성 유합조직 및 배아는 아그로박테리움으로 형질전환시키기에 특히 곤란한 조직임이 입증되었다. 하기의 실험은 옥수수 근친교배 계통(Zea mays L.) HE/89 및 본원에서 Elite 1으로 명명된 계통을 사용한다. HE/89 옥수수 계통의 무른 배형성 유합조직은 Gundter Donn에 의해 제공된다. HE/89는 문헌[Morocz, S., Donn, G., Nemeth, J. and Dudits, D.(1990) Theor. Appl. Genet. 80:721-726]에 기술되어 있다. Elite 1은 B73과 관련된 노바티스 소유의 엘리트 계통이다. Elite 1의 현탁액 배양을 미성숙 배아로부터 선택된 무른 배형성 유합조직으로부터 개시한다. HE/98 계통을, 박토 트립톤 500mg/l , 슈크로즈 30g/l 및 2,4-디클로로페녹시 아세트산(2,4-D) 0.5mg/l이 보충된 액체 N6 배지(N6M)에서 성장시킨다. Elite 1 계통을 슈크로즈 30g/l 및 2,4-D 2mg이 보충된 N6 액체 배지(2N63S)(Chu et al., 1975)에서 성장시킨다. 2,4-D 2mg/l 및 슈크로즈 30g/l이 보충된 Murashige 및 Skoog 배지(MS3S)에서 성장시킨 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 세포주 NT-1을 아그로박테리움-감수성 대조군으로서 사용한다. 현탁액 배양을 회전 진탕기(120rpm)상의 액체 배지에서 유지시키고, 7일 마다 계대배양시킨다.
세균을 YP 배지(효모 추출물 5g/l, 펩톤 10g/l, NaCl 5g/l, pH 6.8)에서 24시간 동안 28℃에서 성장시킨다. 세균을 원심분리시키고 적당한 식물 배지에서 재현탁시킨다. Elite 1, HE/89 및 NT-1 식물 세포의 접종을 위해, 세균을 2N63SM, N6M 및 MS3S 액체 배지에 각각 재현탁시킨다.
옥수수 배형성 유합조직의 접종 후 곧, 다수의 세포가 괴사된다(표 1). 괴사는 처리된 배형성 유합조직을 세균-부재-, 세포탁심-함유 배지에 옮긴 후에도 관찰된다. 옥수수 세포를 아그로박테리움의 매우 희석된 배양물과 매우 단시간 동안 공동배양하는 것만으로 충분히 옥수수 근친교배 Elite 1의 성장 억제 또는 괴사 반응을 유도할 수 있다. HE/89 배형성 유합조직의 경우, 단기간의 공동배양이 어느 정도 괴사성 변화를 감소시키지만, 괴사를 완전히 방지하지는 못한다. 대조군 실험에서, 세포탁심이 옥수수 조직의 괴사를 야기하지는 않는다. 따라서, 괴사 효과는 아그로박테리움과 옥수수 유합조직간의 상호작용의 결과이다. 대조군으로서, NT1 담배 세포를 아그로박테리움으로 접종한 경우, 괴사발생이 관찰되지 않는다.
식물 현탁액 세포와 LBA4404와의 공동배양
HE/89 Elite
2 일 4 일 7일 2 일 4 일 7 일
아그로박테리움 부재 - - - - - -
OD= 0.2
10 분 - - + - + +
1 시간 - - + + + ++
24 시간 - + + + + ++
48 시간 + + ++ + ++ +++
OD=1
10 분 - + + + + +
1 시간 - + + + + ++
24 시간 + + ++ + ++ ++++
48 시간 + + ++ ++ +++ ++++
액체 배지에서 유지된 HE/89 옥수수의 무른 배형성 유합조직 및 독점적 엘리트 근친교배 옥수수의 무른 배형성 유합조직을, 세포탁심-함유 배지로 옮기기 전에 아그로박테리움과 10분, 1시간, 24시간 또는 48시간 동안 배양시킨다. 지시된 광학 밀도(OD=600nm)에서 세균 50㎕를 충진된 세포 용적 1ml를 포함하는 조직 배양 배지 10ml에 가한다. 상기 배양물을 2일 이상 배양하는 경우, 세균을 세척하고, 식물 세포를 세포탁심(250mg/l)이 보충된 동일한 배지에 재현탁시킨다. 괴사의 존제 또는 부재를 접종후 2, 4 및 7일 경과시 기록하고, 괴사의 상대 강도를 다음과 같이 나타낸다: +: 드물게 일어나는 괴사, ++: 약한 괴사, +++: 강한 괴사, ++++: 매우 강한 괴사.
b. 예정된 세포 사멸에 대한 증거
옥수수 조직에서 아그로박테리움에 의해 유도된 세포 사멸의 기작을 측정하기 위하여, 게놈 DNA를 아그로박테리움으로 접종한지 24 또는 48시간 후 수거한 식물 현탁액 세포로부터 추출한다. 아그로박테리움에 대한 노출은 특징적인 뉴클레오좀간 단편화의 패턴으로, 옥수수 계통 둘다에서 DNA 단편화를 야기시키며, 이는 예정된 세포 사멸의 초기 특징으로 여겨진다. 단독의 배양 배지에서 유지시킨 대조군 옥수수 세포 및 담배 세포는 상기 조건하에서 DNA 단편화를 나타내지 않는다. 이. 콜라이 또는 오토클레이빙한 아그로박테리움 세포로 옥수수 세포를 접종한 경우 DNA 단편화가 야기되지 않았다. 또한, 예정된 세포 사멸이 진행중인 옥수수 세포는 신선한 옥수수 배형성 조직의 세포 사멸을 유도하지 않았다.
아그로박테리움이 DNA 단편화를 유도하는 것에 대한 추가적인 증거는 당해 과정의 Zn2+ 및 Ca2+에 대한 민감성을 조사함으로써 구해졌다. HE/89 세포주에서, Ca2+은 DNA 래더의 강도를 증가시키는 반면, Zn2+는 게놈 단편화를 현저하게 감소시킨다. 이러한 특징은 상기 2가 양이온이 동물 시스템에서 아폽토시스 동안 DNA 절단에 관여하는 내생 엔도뉴클리아제에 미치는 효과와 완전히 일치한다. 또한, 래더의 강도는 사이클로헥시미드를 가함으로써 감소되며, 이는 상기 과정이 신생 유전자 발현을 요구한다는 증거이다. 이러한 결과는, 아그로박테리움과 옥수수 세포의 접촉이 옥수수 조직의 세포 사멸의 원인이 된다는 것을 가리킨다. 또한, 아폽토시스 동안의 DNA의 단편화는 뉴클레오좀 단위상의 노출된 하이드록실과 반응하는 시약에 의해 원 위치(in situ)에서 검출된다. 란칸스터(Lancaster) 태생의 독점적 엘리트 계통으로부터의 12일생 옥수수 배아를 LBA4404로 접종하고 클로람벤이 보충된 DG4 배지상에 플레이팅시킨다[Koziel. M.G., & al. 1993. Bio/Technology 11: 194-200]. 아폽토시스 상태의 세포는 TACS-1 키트(Trevigen)으로 원 위치 염색시킴으로써 검출되며, 이는 검출성 마커에 접합된 dNTP를 사용하여 클레노우(klenow) 효소로 DNA 단편을 말단 표지하는 것과 관련이 있으며, 이 경우 게놈 단편화를 표시해주는 암색의 불용성 침전물이 생성된다[Cullivier, O., Pirianov, G., Kleuser, B., Vanek, P.G., Coso, O.A., Gutking, J.S. and Spiegel, S. (1996) Nature 381, 800-803]. 배아를 3.7% 포름알데하이드 용액에 침지시키고, 제조자에 기술된 바 대로 처리한다. 원 위치에서 게놈 DNA 절단을 검출하기 위하여, 고정된 배아를 TACS-1 키트로 처리한다. 고정된 횡단면을 먼저 프로테인아제 K로 5분간 실온에서 처리한 후, 5분간 2% 과산화수소에 침지시켜 내생 퍼옥시다제를 제거한다. 클레노우 완충액으로 단시간 세척한 후, 조직을, 변형된 외생 데옥시뉴클레오티드를 절단된 단편의 5'말단에 삽입시킬 수 있는 클레노우 효소와 1 시간 동안 37℃에서 배양한다. 각각의 세포에서 나타나는 아폽토시스를 지시하는 암색의 불용성 침전물을 현미경으로 검출할 수 있다.
아그로박테리움-처리된 세포는 노출한지 48 시간 후 암색화되고 형상이 변형된다. 배양 배지 단독에서 또는 이.콜라이를 접종한 배양 배지에서 유지시킨 대조군 배아의 경우, 상기 조건하에서 어떠한 침전물도 나타나지 않았다. 또한, 모든 옥수수 조직이 아그로박테리움 감염에 유사하게 반응하는 것은 아니라는 것이 밝혀졌다: 새순(shoot)은 온전하게 유지되었으나, 배아는 괴사되었다. 또한, 병원성 플라스미드를 제거한 아그로박테리움 균주(A136 및 LBA4402 주)를 사용하는 경우, DNA 단편화가 관찰되었는데, 이는 예정된 세포 사멸을 유도하는 인자가 상기 플라스미드와 관련이 없음을 제시한다. 옥수수 배아를 세포 사멸 유도-아그로박테리움(균주 LBA 4404)을 20배 농축시킨 상층액과 20분간 배양하는 경우 예정된 세포 사멸이 관찰되었지만, 배아를 이. 콜라이로부터 동일한 방법으로 제조한 상층액과 접촉시킨 경우에는 예정된 세포 사멸이 관찰되지 않았다. 농축된 아그로박테리움 상층액을 배양하기에 앞서 20분간 100℃에서 가열한 경우, 예정된 세포 사멸은 일어나지 않는다.
종종, 옥수수 배형성 유합조직은 여전이 분명히 살아있는 세포 영역 및 괴사된 다른 영역을 포함한다. 반응 영역외의 세포가 자극에 동시에 노출된 상황에서도 단지 제한된 영역만이 사멸한다는 사실은 일시적 또는 영구적 다양성이 조직화된 조직에서 상이한 자극에 대한 각각의 세포의 반응을 조절하는 요소에 존재한다는 것을 제시한다. 예정된 세포 사멸이 진행중인 조직화된 조직에서의 세포의 수는 총 질량에 비해 적고, 이러한 과정은 불균형일 수 있다. 소정 영역 또는 조직내의 하나 또는 몇몇 세포에서 PCD의 유도는 동물 세포에서 관찰된 바와 같이 주변 세포의 급속한 사멸을 촉진할 것이며, 후자의 세포는 예정된 세포 사멸 표현형을 나타내지는 않음에도 불구하고, 사멸할 것이다.
실시예 2
아그로박테리움-유도된 예정된 세포 사멸의 억제
아그로박테리움으로 접종하기 위한 조직의 제조
미성숙 배아(1.2 내지 2.2mm의 길이)를, 수분한지 14 내지 15일 후, 표면-멸균된, 온실-재배된 이삭으로부터 무균적으로 절라내어, 배반이 위로 향하도록 유합조직 개시 배지(2DG4 + 5mg/l 클로람벤(2DG4-5Chl)]상에 플레이팅시킨다. 2DG4 배지는 슈크로즈 20mg/l를 함유하는 변형된 Duncan 배지이다.
유합조직 반응을 나타내는 배아
미성숙 배아를 상기한 바와 같이 멸균시키고 유합조직 개시 배지(2DG4-5Chl)상에 플레이팅시키고, 상기 배지에서 1 내지 7 일간 배양한다. 생성된 조직을 접종을 위한 샘플로서 사용한다.
어린 제I형 유합조직:
유합조직 개시 배지(2DG4 + 5 클로람벤)상에 7 내지 20일간 플레이팅시킨 배아는 유합조직을 발생시킨다. 이러한 유합조직은 사용된 근친교배 옥수수에 대한 전형적인 제I형 유합조직이며, 이는 조밀하고 비교적 잘 조직화된 세포 덩어리이다. 생성된 배형성 유합조직을 배아로부터 잘라내어 유합조직 유지 배지[2DG4 + 0.5mg/l (2,4-디클로로페녹시)아세트산(2,4-D)]로 옮기고, 접종을 위한 샘플로서 사용한다.
제I형 유합조직:
상기 방법에 의해 수득된 제I형 유합조직을 상기 유지 배지(2DG4 + 2,4-D 0.5mg/l)에서 유지시킬 수 있고, 2주 마다 계대배양시킨다.
아그로박테리움:
상기 실험에서 아그로박테리움 튜메파시엔스 LBA4404(pAL4404, pSB1) 균주를 사용한다. pAL4404는 무해하게된(disarmed) 헬퍼 플라스미드이다. pSB1은 pGIGUP와 상동성인 영역 및 pTiBo542의 독성 영역으로부터의 15.2kb KpnI 단편을 포함하는, 다양한 숙주 범위의 플라스미드이다[참조: Ishida et al., 1996; High efficiency transformation of maize(Zea mays L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens, Nature Biotechnology 14, 745-750]. 플라스미드 pGIGUP를 전기천공으로 LBA4404(pAL4404, pSB1)에 도입하면, pGIGUP 및 pSB1의 공동통합이 일어난다. 상기 플라스미드의 T-DNA는 포스피노트리신에 내성을 제공하는 유비퀴틴 프로모터에 의해 유도된 식물 발현성 PAT 유전자, 및 Gelvin 프로모터에 의해 유도된 암호서열의 N-말단 코돈중의 인트론을 지닌 GUS에 대한 유전자를 포함한다. 상기 인트론-GUS 유전자는 식물 세포에서 GUS 활성을 발현하지만, 아그로박테리움에서는 발현하지 않는다.
세균 성장:
아그로박테리움을 스펙티노마이신 50mg/l 및 테트라사이클린 10mg/l이 보충된 YP 배지(효모 추출물 5g/l, 펩톤 10g/l, NaCl 5g/l, 한천 15g/l, pH 6.8)상에서 3일간 성장시킨다. 세균을 루프로 수집하고 N6 액체 배지에 109 내지 5 x 109세포/ml의 밀도로 현탁시킨다. 또한, 아그로박테리움 세포를 YP 배지에서 밤새 배양하여 수집하고 N6 액체 배지에 재현탁시킬 수 있다
질산은의 존재 또는 부재하에서의 공동-배양:
상기와 같이 제조된 옥수수 조직을 아그로박테리움으로 접종시킨다. 옥수수 조직을 세균 현탁액에 5 내지 10분간 침지시킨 후, 질산은(1 내지 10mg/l)을 포함하거나 포함하지 않은 배지상에 플레이팅한다. 또한, 조직의 상단에 위치하는 아그로박테리움 현탁액(109 내지 5 x 109세포/ml)의 액적 5㎕으로 조직을 접종시킨다. 접종 후, 배지내에 질산은(1 내지 10mg/l)을 포함하거나 포함하지 않는 암실(25℃)에서 옥수수 조직을 배양한다. 접종한지 2 또는 3일 후, 질산은을 포함하거나 포함하지 않으면서, 세포탁심(250mg/l)이 보충된 동일한 배지로 조직을 옮긴다.
결과:
아그로박테리움에 대한 옥수수 배아 및 옥수수 배형성 유합조직의 민감성
배형성 유합조직은 유합조직 개시 배지상에 플레이팅한 옥수수 배아로부터 발생할 수 있다. 배아로부터 발생한 세포주는, 2,4-D 함유-배지에서 유지되는 경우, 고도로 배형성적 특성을 유지한다. 이러한 배형성 유합조직 및 옥수수 근친교배 계통으로부터의 배아의 아그로박테리움 LBA4404에 대한 민감성을 평가한다. 아그로박테리움과 옥수수 조직의 공동 배양 후, 조직의 뚜렷한 갈색화가 관찰된다. 이러한 반응은 병원성 플라스미드를 제거한 LBA4402를 사용하여도 관찰된다. 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)와 공동 배양하고 동일한 과정을 적용한 대조군 배아 및 배형성 유합조직은 세포 사멸 또는 뚜렷한 갈색화를 나타내지 않는다. 따라서, 세포 사멸은 옥수수 세포와 아그로박테리움간의 상호작용의 결과라는 것을 알 수 있다. 배아는 배아형성 유합조직보다 아그로박테리움에 더 민감한 것으로 나타났다. 109 세포/ml의 농도는 세포 사멸을 유도하기에 충분하다. 더욱이, 짧은 노출(5 분)도 이러한 반응을 유도하기에 충분하다.
질산은을 공동-배양 배지 및 유합조직 개시 배지에 각각 첨가한 효과를 측정한다. 질산은의 첨가는 건강한 조직의 회수를 가능케한다(표 2 및 3). 질산은을 포함하는 배지상에 플레이팅된 배아의 약 50%는 배형성 유합조직을 발생시킬 수 있다. 아그로박테리움으로 접종하기에 앞서 2일 이상 동안 유합조직 개시 배지상에서 플레이팅한 배아를 사용하는 경우 최적 효과가 얻어진다. 이들 두 인자의 조합이, 아그로박테리움 공동-배양 후 옥수수 배형성 유합조직의 괴사를 현격하게 방지한다는 것이 밝혀졌다.
배형성 유합조직의 감소된 갈색화는 아그로박테리움 접종 후 유합조직의 개시 및 조직의 생존과 관련이 있다. 아그로박테리움으로 처리되지 않은 대조군 배아의 약 80%가 배형성 유합조직을 발생시킨다.
아그로박테리움으로 접종한 제I형 유합조직을 사용한 경우의 질산은의 효과를 관찰한다(표 3). 어린 계통이 아그로박테리움에 대해 더 내성적이며, 질산은에 의한 예비처리가 건강한 조직의 회수를 향상시킨다는 것으로 여겨진다.
공동-배양 동안의 질산은의 존재가 아그로박테리움 독성을 감소시키지 않는다는 것을 입증하기 위하여, 담배 잎 디스크를 109세포/ml의 농도로 LBA4404(GIGUP)로 접종시킨다. GUS 활성의 현저한 감소가 담배 잎에서는 전혀 관찰되지 않는다.
하기 표 2의 경우, 배아 및 배형성 유합조직 반응을 나타내는 배아를 아그로박테리움 LBA4404(GIGUP)(109 세포/ml)로 접종시킨다. 염기성 배지는 2DG4 + 5클로람벤(2DG4)이다. 모든 처리를 약 80 내지 100개의 배아에 대해 수행하고, 2회 반복한다. 유합조직 개시를 접종한지 2주 후 기록한다.
LBA4404를 사용한 옥수수 배아의 접종
예비처리 공동-접종 배지 전달 기록
예비처리하지 않음 2DG4 2DG4 + Cef 1%
예비처리하지 않음 2DG4 2DG4 + AgNO3+ Cef 30%
예비처리하지 않음 2DG4 + AgNO3 2DG4 + AgNO3+ Cef 55%
2DG4 + AgNO3(1 일) 2DG4 + AgNO3 2DG4 + AgNO3+ Cef 43%
2DG4 + AgNO3(4 일) 2DG4 + AgNO3 2DG4 + AgNO3+ Cef 27%
2DG4 (6일) 2DG4 + AgNO3 2DG4 + AgNO3+ Cef 65%
2DG4(6 일) + [2DG4 + AgNO3](1 일) 2DG4 + AgNO3 2DG4 + AgNO3+ Cef 88%
하기 표 3의 경우, 제I형 유합조직을 아그로박테리움 LBA4404(GIGUP)(109세포/ml)로 접종시킨다. 이들 실험에 사용된 염기성 배지는 질산은(AgNO3)을 포함하거나 포함하지 않는 2DG4 + 0.5 2,4D(2DG4)이다. 모든 실험은 제I형 유합조직의 약 150개의 단편에서 수행한다. 조직의 생존을 접종한지 2주 후 기록한다.
옥수수 제I형 유합조직의 접종
제I형 유합조직 예비처리 공동-접종 전달 기록
1/2개월생 2DG4 2DG4 + AgNO3 2DG4 + AgNO3+ Cef 75%
2DG4 + AgNO3 2DG4 2DG4 + AgNO3 2DG4 2DG4 + AgNO3+ Cef2DG4 + Cef 95%22%
10개월생 2DG4 2DG4 + AgNO3 2DG4 + AgNO3+ Cef 55%
2DG4 + AgNO3 2DG4 + AgNO3 2DG4 + AgNO3+ Cef 66%
2DG4 2DG4 2DG4 + Cef 12%
실시예 3
미성숙 접합 배아의 아그로박테리움에 의한 형질전환 및 선별제로서 포스피노트리신, 하이그로마이신 또는 만노즈를 사용한 형질전환된 유합조직의 분리
미성숙 배아를 자가-수분한지 약 10 내지 14일 후 수득한다. 미성숙 접합 배아를 배형성 유합조직 형성을 유도하고 유지할 수 있는 배지를 함유하는 상이한 플레이트에 플레이트당 약 25개의 미성숙 배아로 나눈다.
미성숙 배아를, 선별가능한 마커 유전자를 포함하는 Ti 플라스미드를 지닌 아그로박테리움으로 플레이트상에서 또는 실시예 2에 지시된 바와 같이 액체중에 접종시킨다. 일련의 실험을 통하여, 미성숙 배아를 위한 최적 조건을 개발한다. 최적 조건하에서, 미성숙 배아를, 아그로박테리움으로 접종하기 전 또는 직후에, 질산은(10mg/l)을 포함하는 유합조직 개시 배지상에 플레이팅한다. 약 25개의 미성숙 배아를 각각의 플레이트상에 놓는다. 접종한지 16 내지 72 시간 후, 미성숙 배아를 질산은 및 세포탁심을 포함하는 유합조직 개시 배지로 옮긴다. 형질전환된 세포의 선별은 하기와 같이 수행한다:
a. PPT 내성 마커:
포스피노트리신에 대한 내성을 암호화하는 유전자를 T-DNA 영역상에 지닌 플라스미드를 포함하는 아그로박테리움 균주를 사용하여 형질전환을 수행한다. 형질전환된 세포를, 접종한지 2 내지 20일 후 3mg/l의 농도로 포스피노트리신을 적용하여 시험관내에서 선별하고, 총 2 내지 12 주 동안 유지한다. 이와 같이 수득된 배형성 유합조직을 포스피노트리신의 존재 또는 부재하에서 재생의 표준 배지상에서 재생시킨다. 모든 식물을 PPT에 대한 내성을 측정하기 위한 클로로페놀 레드(CR) 테스트로 시험한다. 이러한 분석은, 어떠한 세포가 PPT의 존재하에서 성장하고 있는 지를 보여주는 pH 민감성 지시 염료를 사용한다. 성장하는 세포는 배지의 pH를 변화시키고, 지시제인 클로로페놀 레드를 (적색으로부터) 황색으로 바꾼다. PPT에 대한 내성 유전자를 발현하는 식물은 상기 시험에서 용이하게 식별된다. CR 시험에 양성인 식물을 PCR로 PAT 유전자의 존재에 대해 분석한다. PCR 시험에 대해 양성인 식물을 서던 블롯팅으로 분석한다.
b. 하이그로마이신 내성 마커:
하이그로마이신에 대한 내성을 암호화하는 유전자(hpt, 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제)를 T-DNA 영역상에 지닌 플라스미드를 포함하는 아그로박테리움 균주를 사용하여 형질전환을 수행한다. 형질전환된 세포를, 접종한지 2 내지 20일 후 3mg/l의 농도로 하이그로마이신을 사용하여 선별하고 총 2 내지 12 주 동안 유지한다. 이와 같이 수득된 배형성 유합조직을 선별제의 존재 또는 부재하에서 재생의 표준 배지상에서 재생시킨다. 모든 식물을 하이그로마이신에 대한 내성에 대해 시험한다. 하이드로마이신에 대한 내성 유전자를 발현하는 식물은 상기 시험에서 용이하게 식별된다. 상기 시험에 양성인 식물을 PCR로 hpt 유전자의 존재에 대해 분석한다. PCR 시험에 대해 양성인 식물을 서던 블롯팅으로 분석한다.
c. 만노즈를 사용한 양성 선별:
만노즈에 대한 내성을 암호화하는 유전자(만노즈 포스페이트 이소머라제)를 T-DNA 영역상에 지닌 플라스미드를 포함하는 아그로박테리움 균주를 사용하여 형질전환을 수행하고, 만노즈를 사용하여 시험관내에서 형질전환된 세포를 선별한다. 이러한 선별은 접종한지 2 내지 20일 후 1g/l의 저농도에서도 적용될 수 있고 총 2 내지 12주 동안 유지될 수 있다. 이와 같이 수득된 배형성 유합조직을 만노즈의 존재 또는 부재하에서 재생의 표준 배지상에서 재생시킨다. 모든 식물을 만노즈에 대한 내성을 측정하기 위해 클로로페놀 레드(CR) 시험으로 시험한다. 이러한 분석은, 어떠한 세포가 만노즈의 존재하에서 성장하고 있는지를 보여주는 pH 민감성 지시 염료를 사용한다. 성장하는 세포는 배지의 pH를 변화시키고, 표시제인 클로로페놀 레드를 적색으로부터 황색으로 바꾼다. 만노즈에 대한 내성을 발현하는 식물은 상기 시험에서 용이하게 식별된다. CR 테스트에 양성인 식물을 PCR로 만노즈 유전자의 존재에 대해 분석한다. PCR 시험에 대해 양성인 식물을 서던 블롯팅으로 분석한다.
실시예 4
미성숙 접합 배아로부터 유도된 유합조직의 아그로박테리움에 의한 형질전환 및 선별제로서 포스피노트리신, 하이그로마이신 및 만노즈를 사용한 형질전환된 유합조직의 분리
제I형 유합조직을 표준 배양 기술을 사용하여 미성숙 접합 배아로부터 수득한다. 제I형 유합조직의 약 25개 단편을, 아그로박테리움으로 접종하기 전 또는 후에 질산은을 포함하는 유지 배지상에 놓는다. 접종은 실시예 2에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다. 접종한지 약 16 내지 72 시간 후, 유합조직을 질산은 및 세포탁심을 함유하는 표준 배양 배지로 옮긴다. 선별은 상기 배지로 옮긴 직후 또는 1 내지 20일 후 이루어질 수 있다. 이어서, 유합조직을 약 2 내지 12주 동안 선별을 위해 계대배양한 후, 생존하여 성장하는 유합조직을 식물 생산용 표준 재생 배지로 옮긴다. 포스피노트리신 내성, 하이그로마이신 내성 또는 만노즈 포스페이트 이소머라제에 대한 유전자로 형질전환된 세포에 대한 선별을 앞의 실시예와 같이 수행한다.
실시예 5
아그로박테리움 접종에 의한 옥수수의 제I형 유합조직의 형질전환 및 선별제로서 포스피노트리신, 하이그로마이신 및 만노즈를 사용한 형질전환된 유합조직의 분리
유합조직은 엘리트 유전자형의 미성숙 배아를 플레이팅시킴으로써 유도된다. 배양물을 유지 배지(2DG4 + 0.5mg/1 2,4-D)상에서 2개월 마다 계대배양하고, 계대배양한지 2 내지 3일 후 세포 덩어리를 채취하고 2DG4 배지상에 놓는다. 아그로박테리움으로 접종하기 전 또는 후에, 세포 덩어리를 질산은을 포함하는 2DG4 배지상에 놓는다. 아그로박테리움에 의한 접종은 실시예 2에 기술된 바와 같이 수행한다. 접종한지 16 내지 72 시간 후, 유합조직을 세포탁심 및 질산은을 함유하는 신선한 유지 배지로 옮긴다. 선별제를 사용하여 총 약 2 내지 12주 동안 선별을 위해 유합조직을 계대배양한 후, 생존하여 성장하는 유합조직을 식물 생산용 표준 재생 배지로 옮긴다. 포스피노트리신 내성, 하이그로마이신 내성 또는 만노즈 포스페이트 이소머라제에 대한 유전자로 형질전환된 세포에 대한 선별을 앞의 실시예와 같이 수행한다.
실시예 6
열 충격 처리는 아그로박테리움에 의해 촉진된 아폽토시스를 방지한다.
미성숙 배아:
옥수수 근친교배 계통을 온실에서 재배한다. 미성숙 배아(0.8 내지 2.2mm의 길이)를, 환경 인자에 따라 수분한지 8 내지 15일 후, 표면-멸균된 이삭으로부터 무균적으로 절라낸다. 배아를 배반이 위로 향하도록 유합조직 개시 배지에 플레이팅시킨다. 대부분의 근친교배 계통의 경우, 배아를 LS 배지(Linsmaier and Skoog, Physiol. Plant. 18: 100-127, 1965)상에 플레이팅시킨다. CG00526의 배아를 2DG4 + 5mg/l 클로람벤(2DG4-5Chl)에 플레이팅시킨다. 2DG4 배지는 슈크로즈 20mg/l를 함유하는 변형된 Duncan 배지이다[Koziel et al., Bio/Technology 11: 194-200, 1993].
제I형 유합조직:
미성숙 배아를 상기한 바와 같이 멸균시키고 유합조직 개시 배지(2DG4-5Chl)상에 플레이팅시키고, 상기 배지에서 1 내지 7 일간 배양한다. 유합조직 개시 배지(2DG4-5Chl)에서 7 내지 20일간 플레이팅된 배아는 유합조직을 발생시킨다. 이들 유합조직이 전형적인 제I형 유합조직이다. 제I형 유합조직은 비교적 잘 조직화된 세포의 조밀한 덩어리이다. 생성된 배형성 유합조직을 배아로부터 잘라내어, 유합조직 유지 배지[2DG4 + 0.5mg/l 2,4-디클로로페녹시 아세트산(2,4-D)]로 옮긴 후, 접종을 위해 사용한다. 상기 방법으로 수득된 제I형 유합조직을 유지 배지(2DG4 + 2,4-D 0.5mg/l)상에서 유지하고, 약 2주마다 계대배양한다.
아그로박테리움:
사용된 균주는 아그로박테리움 튜메파시엔스 LBA4404(pAL4404, pSB1)이다. pAL4404는 무해하게된 헬퍼 플라스미드이다[Ooms et al., 7: 15-29, 1982]. pSB1은 pGIGUP에 대한 상동성 영역 및 pTiBo542의 독성 영역으로부터의 15.2kb KpnI 단편을 포함하는, 다양한 숙주 범위의 플라스미드이다[Ishida et al., Nature Biotechnology 14: 745-750, 1996]. 플라스미드 pGIGUP를 전기천공으로 LBA4404(pAL4404, pSB1)에 도입하면, pGIGUP와 pSB1이 공동통합된다. pGIGUP는, 포스피노트리신에 대한 내성을 제공하기 위한, 옥수수 유비퀴틴 프로모터에 의해 유도된 식물 발현성 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제(PAT) 유전자를 포함한다[Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18: 675-689, 1992]. 이는 또한 옥토핀과 만노핀 신타제 유전자로부터 유래된 키메라 프로모터(만노핀 신타제 프로모터의 도메인과 옥토핀 신타제 프로모터 상류 활성화 서열의 3량체, 참조문헌: Ni et al., Plant J., 7:661-676, 1995)에 의해 유도된 암호 서열의 N-말단 코돈중에 인트론을 지닌 β-글루쿠로니다제 발현 유전자(GUS)를 포함한다. 이러한 인트론-GUS 유전자는 식물 세포에서는 GUS 활성을 발현하지만, 아그로박테리움에서는 발현하지 않는다. 아그로박테리움을, 스펙티노마이신 50mg/l 및 테트라사이클린 10mg/l이 보충된 YP 배지(효모 추출물 5g/l, 펩톤 10g/l, NaCl 5g/l, 한천 15g/l, pH 6.8)에서 3일간 성장시킨다. 세균을 루프로 수집하고 N6 액체 배지에 109 내지 5x109 세포/ml 범위의 밀도로 현탁시킨다. 달리, 아그로박테리움을 YP 배지에서 밤새 배양하여 수집하고 N6 액체 배지중에 재현탁시킬 수 있다. 또한, 이를 아그로박테리움 유도 배지[AIM; K2HPO4, 10.5g; K2HPO4, 4.5g; (NH4)2SO4, 1.0g; Na 시트레이트 ·2H2O, 0.5g; MgSO4.H2O(1M), 1.0ml; 글루코즈, 2.0g; 글리세롤, 5.0ml; MES(10ml); 아세토시린곤(50 내지 100μM); pH5.6]에서 4 내지 6시간 동안 예비-유도할 수 있다.
조직의 열 충격 처리:
공동 배양전에, 옥수수 조직을 N6 액체 배지에서 에펜도르프(Eppendorf) 튜브내에 넣고 4분간 45℃의 수조에서 배양한다. 이어서, 상기 배지를 상기한 바와 같이 제조된 아그로박테리움 현탁액으로 교체한다. 실온에서 5분 후, 조직을 적당한 고체 배지에 플레이팅시킨다. 공동-배양한지 3일 후, 조직을, X-Glu로 염색하여 GUS 활성을 검출하거나, 또는 세포탁심(250mg/l)을 포함하는 배지상에 플레이팅시킨다. 이어서, 옥수수 조직을 검사하여, 아그로박테리움 접종으로부터 생존하는 조직의 %를 나타내는 유합조직 반응을 검출한다.
공동배양:
상기와 같이 수득된 옥수수 조직을 아그로박테리움으로 접종시킨다. 이들을 세균 현탁액에 5 내지 10분간 침지시킨 후, 고체 배지상에 플레이팅시킨다. 접종 후, 옥수수 조직을 25℃의 암실에서 배양한다. 접종한지 2 또는 3일 후, 조직을 세포탁심(250mg/l)이 보충된 동일한 배지로 옮긴다.
DNA 단편화의 원 위치 검출:
배아를 3.7% 포름알데히드 용액에 침지시키고 제조자(Trevigen)에 의해 기술된 바와 같이 처리한다. 원 위치에서 게놈 DNA 절단을 검출하기 위하여, 고정된 배아를 TACS-1 키트(Culliver et al., Nature 381: 800-803, 1996)로 처리한다. 고정된 횡단면을 먼저 프로테인아제 K로 5분간 실온에서 처리한 다음, 5분간 2% 과산화수소에 침지시켜 내생 퍼옥시다제를 제거한다. 클레노우 완충액으로 잠시 동안 세척한 후, 조직을, 변형된 외생적 데옥시뉴클레오티드를 절단된 단편의 5'말단에 삽입시킬 수 있는 클레노우 효소와 함께 1시간 동안 37℃에서 배양한다. 각각의 세포에서 나타나는 아폽토시스를 표시하는 암색의 불용성 침전물을 현미경으로 검출할 수 있다.
결과:
아그로박테리움과 옥수수 조직의 공동배양 후, 주요 갈색화 현상이 관찰되고, 109 세포/l의 농도가 세포 사멸을 유도할 수 있다. 배아는 배형성 유합조직보다 아그로박테리움에 더 민감한 것으로 보인다.
배아 및 제I형 유합조직에 열-충격을 준 후, 109 세포/l 농도의 아그로박테리움으로 접종시킨다. 3일간의 공동배양 및 1주일간의 배양 후, 조직을 검사한다. 열 충격 예비처리에 의해 부여된 보호 수준을, 접종으로부터 생존한 조직의 수를 계수하는 방법으로 정량화한다.
열-충격 예비처리 후, 아그로박테리움으로 접종한 모든 배아는 유합조직 개시를 보이는 반면, 열 충격을 주지 않은 배아로부터는 유합조직이 발생하지 않았다(표 4).
하기 표 4의 경우, 배아를 109 세포/l의 아그로박테리움 LBA4404(pGIGUP)으로 접종시킨 다음, 유합조직 개시 배지상에 플레이팅시킨다. 염기성 배지는 2DG4 + 5Chl(2DG4)이다. 모든 처리를 약 80 내지 100개의 배아에 대해 수행하고 2회 반복한다. 유합조직 개시를 접종한지 2주 후 기록한다.
예비처리 유합조직 반응을 보이는 배아/접종된 배아
대조군` 137/150(91%)
열 충격 비적용 + Agro 3/150(2%)
열 충격 적용 + Agro 112/150(75%)
열 충격 처리에 따른 동일하게 유익한 효과가 유합조직에 대해 관찰된다(표 5).
하기 표 5의 경우, 제I형 유합조직을 109 세포/ml의 아그로박테리움 LBA4404(pGIGUP)로 접종시킨다. 사용된 염기성 배지는 2DG4 + 0.5 2,4D(2DG4)이다. 모든 실험을 제I형 유합조직의 약 1000개의 단편에 대해 수행한다. 생존 조직을 접종한지 2주 후 기록한다.
예비처리 생존 기록
3개월생 제I형 유합조직 계통
아그로박테리움 0/1000
Agro + 열 충격 1000/1000
10개월생 제I형 유합조직 계통
아그로박테리움 0/1000
Agro + 열 충격 1000/1000
주요 열 충격 단백질이 RT-PCR에 의해 증폭될 수 있기 때문에, 열 충격 예비처리 후 관찰된 보호는 열 충격과 관련이 있는 것으로 여겨진다.
열 충격 예비처리를 적용한 배아에서 DNA 단편화가 검출되지 않았다.
다양한 옥수수 계통으로부터의 배아를, 열 충격 예비처리를 하거나 하지 않은 AIM 용액에서 유도된 아그로박테리움 균주 LBA4404(GIGUP)로 접종시킨다. 3일간의 공동-배양 후, 배아를 염색하여 GUS 활성을 측정한다. 결과는 표 6에 제시되어 있다. 열 충격 예비처리시, 일시적인 발현에 대한 유리한 효과가 나타나는 것으로 여겨진다.
계통 처리 전체중의 GUS pos.% * GUS 평가 **
OF502 -HS 1574 0.31.8
FNU007 -HS 9096 2.03.4
HAF031 -HS 067 0.00.9
2N217A -HS 1346 0.10.4
1NJ20 -HS 538 0.10.4
JEF091 -HS 5981 1.21.4
-: 열 충격 비적용
HS: 열 충격
*GUS %는 약 50개의 미성숙 배아의 샘플 크기를 토대로 한다.
**GUS 평가는 0 내지 5 스케일(0=GUS 염색 없음, 1= 1 내지 5개의 반점/배아, 2= 5 내지 15개의 반점, 3= 15 내지 30개의 반점, 4= GUS에 대해 배아 표면의 약 25% 염색, 5= GUS에 대해 배아 표면의 약 50% 염색)을 토대로 한다.
실시예 7
밀의 아그로박테리움 형질전환
미성숙 접합 배아(0.75mm 내지 1.25mm)를 잘라내어, 아그로박테리움으로 접종하기 0, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 21일전에, 2,4-D 3mg/l, 글루타민 300mg/l, 아스파라긴 150mg/l 및 3% 슈크로즈를 포함하는 MS-계 배지(3MS3S)상에 플레이팅한다. 21일째까지, 이식체는 3주 유합조직에 해당하는 배형성 덩어리를 생성시킨다.
공동배양:
밀 조직을 실시예 6에 기술된 아그로박테리움으로 접종시킨다. 밀 조직을 세균 현탁액중에 5 내지 10분간 침지시킨 후, 고체 배지상에 플레이팅시킨다. 접종 후, 밀 조직을 25℃의 암실에서 배양한다. 접종한지 2 또는 3일 후, 조직을 세포탁심(250mg/l)이 보충된 동일한 배지로 옮긴다. 이식체를 예비처리 없이 접종하거나, 또는 이들에 4 내지 8분간 42 내지 48℃로 열-충격을 가한다. 열 충격 처리는 접종하기전에 수행한다. 100mM AS 액체를 포함하는 AIM 또는 3MS inf에서 배아를 열 충격 처리하는 반면, 유합조직을 "건식" 상태로 열-충격 처리한다.
접종:
이식물을 에펜도르프 튜브중에서 또는 플레이트상에서 접종시킨다. 튜브에서 접종하는 경우, 아그로박테리움 용액 1ml을 피펫으로 튜브에 가하여, 손으로 와동시키거나 진탕시킨 후, 5 내지 15분간 정치시킨다. 이어서, 아그로박테리움 용액 및 이식 물질을 100mM AS를 포함하는 3MS3S의 플레이트상에 붓고, 액체를 끝이 좁은 1회용 전달 피펫으로 제거한다. 접종을 플레이트상에서 수행하는 경우, 아그로박테리움을 피펫으로 직접 이식물에 가하고, 5 내지 15분 후 제거한다. 배축이 배지와 접하도록 배아를 배열한다.
유합조직 개시, 선별 및 재생:
배아를 항생제를 포함하는 유합조직 유도 배지(3MS3S)에서 3 주간 성장시킨다. 배형성 유합조직을 잘라내어, GA3 5mg/l 및 NAA 1mg/l와 함께 선별제 및 항생제를 포함하는 MS3S(2,4-D 비함유)에 2주간 놓은 후, 항생제 및 고농도의 선별제를 포함하는 MS3S로 약 4주간 이동시킨다. 이어서, 모종을 1/2 MS 염 및 NAA 0.5mg/l를 포함하는 Magenta 박스로 옮기면서, 선별제의 농도를 마지막 단계까지 동일하게 유지한다. 유합조직의 경우, 선별 및 재생 시스템은 유합조직을 배아 플레이팅으로부터 최대 6주간 성장시키는 점을 제외하고는 동일한데, 즉 3주 유합조직을 접종시키고, 공동-배양하고, 선별 및 재생을 시작하기 전에 최대 3주 이상 동안 성장시킨다.
결과:
DNA 단편화를 실시예 6에 기술된 바와 같이 아그로박테리움으로 접종시킨 배아에서 연구한다. 열 충격 예비처리를 적용한 배아에서는 DNA 단편화가 검출되지 않는다.
아그로박테리움 접종전의 열 충격 예비처리는 아폽토시스의 개시를 방지할 수 있다.
실시예 8
p35 및 iap에 의한 옥수수 세포에서의 아그로박테리움-유도된 아폽토시스의 억제
바이오리스틱(biolistic) 형질전환용 벡터:
바이오리스틱 장치로 옥수수를 형질전환시키는데 사용되는 벡터는 모든 pUC 유도체이다. pUbiPAT(PAT)는 옥수수 우비퀴틴 프로모터[Christensen et al., 1992]에 의해 유도된 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제(PAT)를 암호화하는 식물 발현성 bar 유전자를 포함하여, 포스피노트리신(PPT)에 대한 내성을 제공한다. p35, iap 및 dad-1의 암호 영역을 옥수수 메틸로티오네인-유사 유전자 프로모터(MTL)[de Framond, 1991]의 조절하에 클로닝한다. p35 및 iap는 루이스 밀러(Lois Miller; University of Georgia, Athens, Georgia)에 의해 제공된다. 암호 영역을 포함하는 p35 Pstl-EcoRI-단편을 pHSP35VI+[Clem and Miller, 1994]으로부터 절단해 내고, pBluescript(제조원: Stratagene, La Jolla, CaliFornia)의 상응하는 부위에 클로닝시킨 다음, PstI-Asp718 단편으로서 pMTL의 상응하는 부위에 클로닝시킨다. pMTL은 MTL 프로모터 및 CaMV35S 터미네이터를 포함한다. pHSCplAPVl+(Clem and Miller, 1994)로부터의 iap의 암호 영역을 포함하는 Sall-Spel 단편을 pMTL의 Xhol-Spel 부위에 클로닝시킨다. dad-1의 암호 영역을 아라비도프시스(Arabidopsis) cDNA 클론 12T7(University of Michigan)으로부터의 SalI-XbaI로서 클로닝한다.
아그로박테리움 형질전환용 벡터:
MTL 프로모터에 의해 유도된 p35, iap 및 dad-1 암호화 영역을 경계(border) 서열 사이에서 우수한 이원성 벡터 pSB11내로 클로닝시킨다. 암호 서열의 N-말단 코돈중에 인트론를 지닌 β-글루쿠로니다제 유전자(GUS)를, 옥토핀과 만노핀 신타제 유전자로부터 유래된 키메라 프로모터(mas; 만노즈 신타제 프로모터의 도메인과 옥토핀 신타제 프로모터 상류 활성화 서열의 3량체; Ni et al., 1995)에 의해 유도한다. 식물 세포에서는 GUS 활성을 발현하지만 아그로박테리움에서는 발현하지 않는 Mas-GUS를 pSB11에 클로닝시켜 pMasGUS를 수득한다.
이어서, 이들 벡터를 0.2cm Bio-Rad 큐벳(전기장의 세기, 2kV/cm; 저항, 600 Ω; 전기용량, 25μF)을 이용하여 전기천공시켜 LBA4404(pAL4404, pSB1)에 도입한다. pSB1은 pSB11에 상동성인 영역 및 pTiBo542(Ishida et al., 1996)의 독성 영역으로부터의 15.2kb KpnI 단편을 포함하는, 다양한 숙주 범위의 플라스미드이다. 플라스미드 pSB11을 전기천공으로 LBA4404(pAL4404, pSB1)에 도입하면, pSB11과 pSB1이 공동통합된다.
아그로박테리움에 의한 옥수수 배아의 접종:
미성숙 배아(0.8 내지 2.5mm)를, 수분한지 12 내지 15일 후, 무균적으로 절라내어, 배반이 위로 향하도록 유합조직 개시 배지(2DG4 + 5클로람벤; Duncan etal., 1985)에 플레이팅시킨다. 배아를 109 세포/ml의 밀도로 5분간 아그로박테리움으로 접종시킨 후, 유합조직 개시 배지에서 3일간 배양한다. 이어서, 조직을 세포탁심(250mg/l)이 보충된 동일한 배지로 옮긴다. 조직의 생존을 접종한지 2주 후에 기록한다.
제I형 유합조직의 개시:
유합조직 개시 배지에서 7 내지 20일간 플레이팅한 배아는 유합조직을 발생시킨다. 이들 유합조직은 전형적인 제I형 유합조직으로서, 이는 비교적 잘 조직화된 세포의 조밀한 덩어리이다[참조: Suttie et al., 1994]. 생성된 배형성 유합조직을 배아로부터 잘라내어, 유합조직 유지 배지[2DG4 + 0.5mg/l (2,4-디클로페녹시)아세트산(2,4-D)]로 옮긴다. 상기 방법으로 수득된 제I형 유합조직을 유지 배지(2DG4 + 2,4 D 0.5mg/l)상에서 유지하고 약 2주마다 계대배양시킨다. 제I형 유합조직을, 아그로박테리움을 이용한 접종 실험 및 바이오리스틱 장치에 의한 형질전환에 사용한다.
형질전환 실험:
플라스미드 DNA를 듀퐁 바이오리스틱(DuPont Biolistic) 매뉴얼에 기술된 바와 같이 0.3 내지 0.1 ㎛의 금 미세담체 상에 침전시킨다. 항-아폽토시스성 유전자 2㎍ 및 pUbiPAT 2㎍을 미세담체 50㎕당 사용한다. 플레이트당 제I형 유합조직의 16개 단편을 PDS-1000/He 바이오리스틱 장치(DuPont)을 사용하여 충격을 가한다. 조직을 정지 스크린 선반 하부 8cm의 선반에 놓고, 10x10㎛ 스테인레스 강 스크린을 650 psi 값의 파열 디스크와 함께 사용한다. 충격을 가한 후, 조직을 1일간 25℃의 암실에서 배양한 후, 유합조직 유지 배지(2DG4 + 0.5mg/l 2,4-D)로 옮긴다. 10일 후, 조직을 PPT 100mg/l이 보충된 동일한 배지로 옮긴다. 6 내지 8주 후, 조직을 40mg/l의 PPT로 옮긴다. 이어서, 조직의 일부를 접종 실험에 사용하고, 이의 일부를 재생 배지(3% 슈크로즈, 안시미톨 0.25mg/l 및 키네틴 5mg/l를 포함하는 Murashige 및 Skoog)로 옮겨, 1일당 16시간의 빛을 제공한다. 형질전환된 식물을 클로로페놀 레드(CR) 분석을 이용하여 식별하여 PPT에 대한 내성[참조: Cramer et al., 1993]에 대해 시험한 후, PCR로 확인한다.
아그로박테리움에 의한 형질전환 제I형 유합조직의 접종:
상기한 바와 같이 수득된 형질전환 제I형 유합조직을 아그로박테리움으로 접종시킨다. 옥수수 조직을 세균 현탁액에 5 내지 10분간 침지시킨다. 접종 후, 옥수수 조직을 2DG4 + 0.5mg/l 2,4-D 배지상에서 25℃의 암실에서 배양한다. 접종한지 2 또는 3일 후, 조직을 세포탁심(250mg/l)이 보충된 동일한 배지로 옮긴다.
형질전환 물질의 분석:
게놈 DNA를 Isoquick 키트(Microprobre, CA)을 사용하여 유합조직 100mg으로부터 추출하고 물 200㎕에 재현탁시킨다. 1㎕을 PCR 반응에 사용한다. PCR 반응을, 1x PCR 완충액, AmpliTaq 0.5단위, 각각의 dNTP 200μM, 각각의 프라이머 0.2μM을 사용하는 반응물 25㎕에서 Perkin-Elmer 열 순환기로 수행한다. 조직중의 pat 유전자의 존재를 검출하기 위하여, PCR 반응을 55℃의 어닐링 온도에서 PAT 프라이머를 사용하여 수행한다. 형질전환 조직에서 iap, p35 및 dad-1 유전자를 검출하기 위하여, 각각의 반응에 사용된 프라이머는 각각의 어닐링 온도 55℃, 55℃, 48℃에서 P 및 I, P 및 35, P 및 D이다.
PAT1: 5'-TGTCTCCGGAGAGGAGACC-3'(서열 1)
PAT2: 5'-CCAACATCATGCCATCCACC-3'(서열 2)
MTL(P): 5'-AGGTGTCCATGGTGCTCAAG-3'(서열 3)
iap(I): 5'-ACAATCGAACCGCACACGTC-3'(서열 4)
p35(35): 5'-CCAGGTAGCAGTCGTTGTGT-3'(서열 5)
dad-1(D): 5'-CCTTGTTTCCTTTGTTCACT-3'(서열 6)
p35 및 iap RT-PCR:
총 RNA를 Tripure 분리 시약(제조원: Boehringer Mannheim)을 사용하여 형질전환 유합조직으로부터 추출하고, RNase 비함유 DNase로 처리하고, 유리한 RT-PCR(Clontech) 및 올리고-dT 프라이머를 이용하는 cDNA 합성을 위해 0.5μg을 채취한다. 제2의 쇄가 합성된 후, 이 반응물의 1/20을 PCR 반응의 주형으로서 이용하여 Taq DNA 폴리머라제로 PCR을 수행한다. RT-PCR에 사용된 p35 프라이머는 다음과 같다:
300bp의 전사체를 증폭시키는, 5'-GGTCCTATACGAAGCGTTAC-3'(서열 7) 및 5'-CCACGTAGCAGTCGTTGTGT-3'(서열 8).
RT-PCR에 사용된 iap 프라이머는 다음과 같다:
248bp의 전사체를 증폭시키는, 5'-CATGTCTGACTTGCGATTGG-3'(서열 9) 및 5'-ACAATCGAACCGCACACGTC-3'(서열 10).
게놈 DNA의 오염을 배제하기 위하여, 역전사효소가 제거된 대조군 cDNA 반응물을 동시에 제조한다.
결과:
- 배아 및 배형성 유합조직의 대부분은 아그로박테리움에 의한 접종으로부터 생존하지 못한다. 짧은 노출(5분)도 이러한 반응을 유도하기에 충분하다. 에스케리키아 콜라이와 공동배양하면서, 동일한 과정을 적용한 조직은 어떠한 손상도 나타내지 않았다.
- p35, iap 및 dad-1을 T-DNA의 경계 서열 사이에서 식물 발현 카셋트내로 클로닝시킨다. T-DNA가 이러한 항-아폽토시스성 유전자를 보유하므로, 이들은 접종시에 옥수수 세포로 전달되어진다. 옥수수 조직을 세포 사멸 억제 유전자(브래킷 사이)를 포함하거나 포함하지 않는 아그로박테리움 LBA4404(109세포/ml)으로 접종시킨다. 공동배양 후, 옥수수 배아 또는 제I형 유합조직을 검사하여, 항-아폽토시스성 유전자의 발현에 의해 부여된 보호의 수준의 표시로서 조직의 생존을 정량화한다. 모든 처리를 약 50 내지 80개의 옥수수 이식체에 대해 수행하고 2회 반복한다. 조직을 접종한지 3일 후 세포탁심을 포함하는 동일한 배지로 옮긴다. 아그로박테리움의 효과를 접종한지 2주 후 기록한다. 이 결과는 표 7 및 표 8에 각각 제시되어 있다.
배아의 경우
반응을 나타내는 조직의 수/시험한 조직의 수(%)
실험 #1 실험 #2
세균 부재 52/63(82%) 25/31(80%)
LBA4404 2/55(3%) 3/89(3%)
LBA4404(p35) 19/75(25%) 18/74(24%)
LBA4404(iap) 22/89(24%) 21/75(28%)
LBA4404(dad-1) 4/48(8%) 10/66(15%)
제I형 유합조직의 경우
반응을 나타내는 조직의 수/시험한 조직의 수(%)
실험 #1 실험 #2
세균 부재 76/80(95%) 72/80(90%)
LBA4404 8/80(10%) 6/80(7.5%)
LBA4404(p35) 23/80(29%) 27/80(33%)
LBA4404(iap) 25/80(31%) 30/80(37%)
LBA4404(dad1) 15/80(18%) 13/80(16%)
아그로박테리움으로 처리하지 않은 경우, 약 80%의 배아가 배형성 유합조직을 발생시킨다. p35 또는 iap를 포함하는 아그로박테리움으로 처리한 배아의 약 25%가 배형성 유합조직을 발생시키는 반면, 아그로박테리움으로 접종한 배아의 약 3%만이 유합조직 개시를 나타냈다. 유사한 효과가 p35 또는 iap를 포함하는 아그로박테리움으로 접종한 제I형 유합조직에서 관찰되었다(표 2). dad-1은 모든 시스템에서 낮은 수준의 보호만을 제공하였다.
p35 및 iap의 일시적 발현은 조직의 갈색화를 어느 정도 감소시키지만, 상기 현상을 완전히 억제하지 않는것으로 보인다. 이는 옥수수 세포내로 T-DNA가 낮은 효율로 전달되는 것에 의해 설명될 수 있다. GUS에 의한 일시적 발현으로 판단하건대, 표적 조직은 균일하게 형질전환되지 않는것으로 여겨진다. 이는 극히 적은 수의 세포가 T-DNA의 수용체라는 표시일 수 있다.
p35 또는 iap를 포함하는 아그로박테리움으로 접종한 배아로부터 발생하는 배형성 유합조직의 구조는 대조군의 구조만큼 조밀하지는 않다. 이는 항-아폽토시스성 유전자를 포함하는 T-DNA를 제공받은 세포만이 생존하고, 각각의 형질전환된 세포가 그 신호를 인접 세포로 반드시 전달하지는 않는다는 사실에 의해 설명될 수 있다. 이러한 유형의 조직 성장은 세포 사멸 억제 유전자가 사멸될 세포를 매우 효과적으로 구조하지만 이들의 단기간의 발현은 아그로박테리움 효과에 대해 충분한 보호를 제공하지 않는다는 증거일 수 있다.
p35, iap 및 dad-1로 형질전환된 배형성 유합조직은, 미세투사체 충격법(microprojectile bombardment)을 이용하여 식물 발현성 프로모터의 조절하에 상기 유전자를 제I형 유합조직내로 전달시킴으로써 생성된다. 작제물을 bar 유전자로 공동-충격을 가하고, 조직을 PPT에 대해 선별하며, 이들 유합조직의 형질전환된 상태를 PCR로 먼저 확인한다(표 9).
형질전환 실험 # PCR+
UbiPAT 5PAT+
MTLp35, UbiPAT 9PAT+, 3p35+
MTLiap, UbiPAT 7PAT+, 5iap+
MTLdad, UbiPAT 11PAT+, 4dad-1+
이어서, 아그로박테리움 접종에 대한 민감성을 독립적인 시험으로 분석한다. 유합조직을 아그로박테리움 LBA4404(109 세포/ml)으로 접종한다. 2개의 독립적인 형질전환 유합조직 계통을 시험한다. 모든 처리를 2회 반복한다. 조직을 접종한 지 3일 후 세포탁심을 함유하는 동일한 배지로 옮긴다. 옥수수 조직의 생존성을 아그로박테리움으로 접종한 지 2주 후 기록한다(표 10).
형질전환 실험 LBA4404에 대한 내성 유합조직의 수
계통 1 계통 2
UbiPAT 1/24(4%) 1/32(3%)
MTLp35, UbiPAT 22/25(88%) 25/28(89%)
MTLiap, UbiPAT 20/22(90%) 19/25(76%)
MTLdad, UbiPAT 12/27(44%) 9/22(41%)
p35 및 iap로 형질전환된 배형성 유합조직은, 아그로박테리움에 적용한 경우 세포 사멸을 나타내지 않은 반면, 주요 갈색화 현상은 공동배양 후의 대조군 조직에서 관찰된다. dad-1 유전자의 존재는 아폽토시스의 개시를 지연시키지만, iap 및 p35와 마찬가지로 세포 사멸을 차단하지는 않는다. 그 결과는 수개의 독립적인 실험에서 재현될 수 있다.
또한, p35 및 iap의 보호 효과는 올리고뉴클레오좀 DNA 단편을 전기영동으로 측정하는 경우 입증된다.
조직에서 안정하게 발현되는 경우에는 dad-1의 효과가 더욱 명백한 것 같다.
항-아폽토시스성 유전자의 발현과 세포 사멸의 부재 사이에는 명백한 상관관계가 있다. 역-전사-PCR(RT-PCR)에 의해 판단하건대, p35 및 iap 유전자는 형질전환 유합조직에서 발현된다. 대조군은 균일하게 음성이다.
실시예 9
옥수수 세포에서 세포 사멸을 유도하지 않는 아그로박테리움 균주의 스크리닝 및 동정
잘 연구된 옥수수 계통(A188) 및 독점적 엘리트 계통(Elite 2)의 배형성 유합조직과 배아의 각종 아그로박테리움 균주에 대한 민감성을 40개의 아그로박테리움 야생형 균주의 패널을 사용하여 시험한다. 이들 균주를 먼저 A188 및 Elite 2 배형성 유합조직 및 배아와의 적합성에 대해 시험한다. 이들 가운데, 40개 균주중 6개 균주는 옥수수 조직의 성장을 완전히 차단하지는 않으며, 유합조직 개시 배지상에 플레이팅되어 109 세포/ml의 농도로 접종된 Elite 2 배아에 대해 추가로 시험한다. 유합조직 개시는 접종한지 2주 후 기록하고, 반응을 나타내는 배아의 비율(%)로서 나타낸다.
또한, 이들 균주를 호르몬 비함유 배지상에 플레이팅된 담배 잎 디스크에 대한 이들의 독성에 대해 시험하고, 옥수수 세포에서 예정된 세포 사멸을 유도하는 균주의 능력은 독성과 무관함을 알 수 있다. 표 11의 비율(%)은 종양을 갖는 잎 디스크의 수를 나타낸다.
비-괴사발생 균주의 독성 비교
균주 공급원 오핀 담배에 대해 시험된 독성(%) 2DG4-5ChI(%)
1 장미 ? 100 37
2 복숭아 노팔린 82 25
3 실버 포플라 아그로파인 66 50
4 국화 L,L 사프 100 63
A 장미 노팔린 92 66**
B 버드나무 노팔린 76 58**
** 우수한 제I형 유합조직
아그로박테리움 균주 A 및 B는 부다페스트 조약하에 1997년 5월 2일자로 각각 기탁번호 제55964호 및 제55965호로서 ATCC에 기탁되었다.
실시예 10
옥수수 세포에서 아폽토시스를 촉진하는 아그로박테리움 유전자
BAC 라이브러리(세균 인공 염색체)를 약 100 내지 200kb의 아그로박테리움 게놈 DNA 단편으로 작제하여 옥수수 배형성 조직에서 세포 사멸 반응에 관여하는 유전 요소를 동정한다. 라이브러리를 에스케리키아 콜라이내로 도입한다. 이러한 배경이 BAC 라이브러리를 스크리닝하는데 적합한지의 여부를 검사하기 위해, BIBAC 벡터만을 함유하는 이. 콜라이를 옥수수 배아에 접종시킨다. 이. 콜라이는 특징적인 아폽토시스 반응을 유도하지 않는 것으로 밝혀졌다.
150 내지 200kb의 삽입체를 갖는 약 25 내지 30개 BAC 클론이 아그로박테리움의 전체 게놈을 포함하기에 충분한 것으로 판단되므로, 아그로박테리움의 게놈 크기가 이. 콜라이의 게놈 크기(4.6×106bp)와 거의 동일한 것으로 추정된다. 비교적 다수의 클론(200개)을 아그로박테리움 염색체 프로브(chvD)와 하이브리드화시켜, 이. 콜라이에서 제조된 BAC 라이브러리가 아그로박테리움 게놈을 명백히 나타내는지의 여부를 시험한다. 시험된 200개 클론 중에서, 5개 클론이 chvD 프로브에 의해 명백해진다(데이타는 도시하지 않음).
한가지 가능성은 아그로박테리움으로부터의 유전자 성분이 이. 콜라이에서 발현되지 않을 수도 있다는 것이다. 더욱이, 식물체 및/또는 아그로박테리움으로부터의 또다른 인자가 상기 클론의 발현에 필수적일 수도 있다. 따라서, BAC 벡터는 아그로박테리움에서 작용하는 복제 기원을 함유하며, 상기 시나리오에 의해 아그로박테리움내로 용이하게 형질전환될 수 있다.
세균 성장:
아그로박테리움을 필요한 경우 가나마이신 100mg/l가 보충된 YP 배지(효모 추출물 5g/l, 펩톤 10g/l, NaCl 5g/l, 한천 15g/l, pH 6.8)상에서 3일 동안 성장시킨다. 세균을 루프로 수집하고, 109 내지 5×109 세포/ml 범위의 밀도로 N6 액체 배지에 현탁시킨다. 또한, 아그로박테리움 세포를 YP 배지에서 밤새 배양하여수집하고, N6 액체 배지에 재현탁시킬 수 있다.
이. 콜라이 DH10B를 LB 배지(1% 박토-트립톤, 0.5% 박토-효모 추출물, 170mM NaCl, pH 7.0)에서 성장시킨다. 형질전환 후, 이를 SOC 용액(2% 박토 트립톤, 0.5% 박토 효모 추출물, 10mM NaCl, 2.5mM KCl, 10mM MgCl2, 10mM MgSO4, 20mM 글루코즈, pH 7.0)에서 성장시킨다.
아그로박테리움으로부터 게놈 DNA의 제조
LBA4404 균주를 라이브러리의 작제에 사용한다. 사용된 프로토콜, 재료 및 시약은 Imbed 키트(Biolabs, USA)로부터 입수한다. 아그로박테리움 배양물 4×10ml를 28℃에서 밤새 성장시킨다. 수거하기 1시간 전에, 클로람페니콜 180mg/ml를 가하여 염색체를 정렬시킨다. 세포를 4℃에서 15분 동안 800g로 원심분리하고, 펠렛을 공기 건조시킨다. 세포를 세포 현탁액 (10mM 트리스-HCl, 20mM NaCl, 100mM EDTA, pH 7.2) 0.5ml에서 42℃로 예비-가온한 다음 아가로즈속에 매몰시킨다. 아그로박테리움 세포를 아가로즈 로드(rod)속에 매몰시켜, DNA의 절단을 피하면서 세포벽의 분해 및 탈단백질화를 수행한다. 아가로즈 로드에 세포를 매몰시키기 위해, 세포를 42℃로 냉각시킨 ddH2O중의 동일한 용적의 1% 저융점 아가로즈와 혼합한 다음 겔 시린지(Gel Syringe) 주형에서 경화시킨다. 아가로즈를 고형화시킨 후, 플러그를 3용적의 리소자임 용액(리소자임 1mg/ml, 10mM 트리스-HCl, 50mM NaCl, 100mM EDTA, 0.2% 나트륨 데옥시콜레이트, 0.5% N-라우릴사르코신, pH 7.2)으로 옮기고, 약하게 진탕하면서 2시간 동안 37℃에서 항온처리한다. 리소자임 용액을 제거하고, 상기 로드를 1회에 15분 동안 세척액 3ml로 2회 세척한다. 이어서, 로드를 약하게 진탕하면서, 프로테인아제 K 용액 3ml(프로테인아제 K 1mg/ml, 100mM EDTA, 1% N-라우릴사르코신, 0.2% 나트륨 데옥시콜레이트, pH 8.0)에서 20시간 동안 42℃에서 항온처리한다. 프로테인아제 K 용액을 흡인에 의해 제거하고, 상기 로드를 15분 동안 세척액 (20mM 트리스-HCl, 50mM EDTA, pH 8.0) 5ml에 대해 2회 투석한 후 1시간 동안 PMSF 용액 (20mM 트리스-HCl, 50mM EDTA, 1mM 페닐 메틸 설포닐 플루오라이드, pH 8.0) 3mL에 대해 투석한 다음, 세척액으로 2회 세척한다. 이어서, 로드를 15분 동안 저장액 5ml(2mM 트리스-HCl, 5mM EDTA, pH 8.0)로 2회 세척하고, 겔 시린지 내로 재충전한다. 1mm 길이의 샘플(10 내지 20mL)를 레이저 블레이드로 잘라 내어, 4℃에서 30분 동안 NotI 제한 엔도뉴클레아제 완충액(Biolabs, USA)에 대해 투석한다. 제한 엔도뉴클레아제 완충액을 신선한 완충액으로 교체하고, NotI 효소 20단위(Biolabs, USA)와 함께 37℃에서 밤새 항온처리한다. 아그로박테리움 DNA의 부분 분해는 희귀한 절단 효소인 NotI을 사용하여 수행한다. 이론상, NotI은 전체 분해 후에 18kb 길이의 단편을 생성시키는데, 이때 아그로박테리움 게놈은 60%의 G/C 함량을 갖는 것으로 추정된다(상이한 아그로박테리움 유전자로부터 추정된 결과). 이어서, 분취액을 끝이 절단된 피펫으로 적하한다. 6V/cm에서 32시간 동안 Bio-Rad CHEF Mapper를 사용하여 14℃에서 0.5×TBE중의 1% 아가로즈 겔상에서 펄스장 겔(PFG) 전기영동에 의해 DNA를 분리한다. 겔을 1mg/ml EtBr ddH2O 욕중에서 20분 동안 염색시키고, 100 내지 200Kp에 상응하는 단편을 함유하는 아가로즈 박편을 겔로부터 잘라낸다. 아가로즈 박편을 1시간 동안 4℃에서 TE에 대해 2회 투석하고 1시간 동안 4℃에서 아가라제 완충액(Biolabs, USA)에 대해 2회 투석하고, 65℃에서 10분 동안 용융시킨 후, 아가로즈 100mg당 아가라제 1단위(Biolabs, USA)로 분해한다. DNA 농도를 DyNA Quant 200(Hoefer, USA)를 사용하여 형광성 측정으로 평가한다.
BIBAC 벡터의 제조
BIBAC 벡터는 Carol M. Hamilton 박사(Cornell University, Ithaca)가 친절하게 제공하였다[참조: Hamilton et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) 93, 9975-9979, 1996]. BIBAC는 이. 콜라이 및 아그로박테리움 둘다에서 복제되도록 설계되었고, 이는 또한 sacBII 유전자를 함유하므로, 수크로즈 배지상에서 클로닝된 삽입체를 직접 선별할 수 있다. 또한, BIBAC 벡터는 F-인자 에피좀 기원을 포함하는데, 이 F-인자 에피좀 기원은 300kb 이하의 삽입체를 갖는 세포당 하나 또는 두개의 복사체를 안정하게 유지시킨다[참조: Shizuya et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89, 8794-8797, 1992]. 플라스미드를 WizardR과 Maxiprep 키트(Promega, USA)를 사용하여 분리한다. 이소프로판올 침전 전에, 페놀-클로로포름 추출을 수행한다. 플라스미드를 NotI로 분해하고, 1시간 동안 37℃에서 새우 알칼리 포스파타제(제조원: Boerhinger Mannheim) 1단위로 탈인산화시킨다. 아그로박테리움 DNA 150ng을, T4 DNA 리가제 400단위(제조원: Boerhinger) 및 절단 벡터 17ng(과량의 벡터와의 추정 몰비 10:1)과 함께 17℃에서 밤새 항온처리하여 40ml에서 연결을 수행한다. 형질전환시키기 전에, 연결물을 4℃에서 2시간 동안 Micro-Collodion 백(Sartorius, Germany)중의 TE 및 1/10 TE에 대해 투석한다.
pBAC 라이브러리를 사용한 DH10B의 형질전환
컴피턴트(competent) 이. 콜라이 DH10B 세포(F-, rec A1; ElectroMax, Gibco-BRL, USA)의 형질전환을, 하기 세팅을 이용하여 Gene PulserTM(Bio-Rad, USA)로 예비-냉각된 유전자 펄서(Gene Pulser) 큐벳(Bio-Rad, USA)에서 천기천공에 의해 수행한다: 전압 2.5kV, 전기용량 25mF 및 저항 200W. 컴피턴트 세포 25ml를 각각의 전기천공을 위해 연결 용액 1ml와 혼합한다. 전기천공 후, 세포를 SOC 용액 0.5ml로 옮기고, 45분 동안 회전 휠(wheel)에서 37℃로 배양한다. 세포 분취액 150mg를 가나마이신(40mg/ml) 및 슈크로즈(5%)를 함유하는 LB 배지상에 플레이팅한다.
BAC DNA의 분리 및 BAC 클론의 DNA 삽입체 크기의 측정
BAC 클론을, 계속하여 교반하면서 가나마이신(50mg/ml)를 포함하는 10ml LB에서 밤새 성장시킨다. DNA를 하기와 같이 변형된 알칼린 용해 방법[참조: Sambrook et al., 1989]에 따라 추출한다: RNAse 30mg/ml를 재현탁액에 가하고, 이소프로판올 침전 전에 페놀-클로로포름 정제를 1회 수행한다. 핵산의 펠렛을 ddH2O 50ml에 용해시킨다. DNA를, 6V/cm에서 32시간 동안 Bio-Rad CHEF Mapper을 이용하여 14℃에서 0.5×TBE중의 1% 아가로즈 겔상에서 PFG 전기천공에 의해 분리한다.
아그로박테리움에 의한 옥수수 배아의 접종
미성숙 배아(0.8 내지 2.5mm)를 수분한지 12 내지 15일 후 무균적으로 잘라내어, 배반이 위로 향하도록 유합조직 개시 배지(2DG4 + 5 클로람벤)(글루코즈를 포함하는 Duncan "D" 배지: N6 다량, B5 소량, MS 철, 슈크로즈 20g/l, 클로람벤 5mg/l, 정제된 한천 8g/l, G4 첨가 및 글루코즈 10mg/l, pH 5.8)(Duncan et al., 1985)상에 플레이팅한다. 세균 세포를 2N63SM(N6 염 3.97g/l, N6 비타민, 슈크로즈 30g/l, 2,4-D 2mg/l, 정제된 한천 8g/l, pH 5.8)에 재현탁시킨다. 배아를 5분 동안 109 세포/ml의 밀도로 아그로박테리움 또는 이. 콜라이로 접종시키고, 3일 동안 유합조직 개시 배지에서 배양한다. 이어서, 조직을 세포탁심(250mg/l)이 보충된 동일한 배지로 옮긴다. 조직 생존은 접종한지 2주 후 기록한다.
아그로박테리움의 형질전환
전기장 세기 10kV/cm(2.00kV), 전기용량 25mF 및 저항 600Ω에서 Gene PulserTM(Bio-Rad, USA)를 이용하여 0.2cm 전기천공 큐벳(Bio-Rad Laboratories Ltd., USA)에서 상기된 바와 같이 아그로박테리움 형질전환을 수행한다[참조: Wen-Jun and Forde, Nucleic. Acids Research 20: 8385, 1989].
바이오리스틱 형질전환용 벡터
바이오리스틱 장치로 옥수수를 형질전환시키는데 사용된 벡터는 pUC의 모든 유도체이다. pMTL은 옥수수 메탈로티오네인-유사 유전자 프로모터(MT-L)를 포함하는 식물 형질전환 벡터이다[참조: de Framond, 1991]. virB1의 암호 영역을 하기 프라이머와 함께 균주 A로부터의 BAC 클론을 주형으로서 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 증폭시킨다: 5'-GGAGAGGCGGTGTTAGTT-3'(서열 11); 5'-CATCATCGCATTCGAGAG-3'(서열 12). PCR 반응은 1×PCR 완충액, 0.5단위의 AmpliTaq, 각각의 200μM dNTP, 각각의 0.2μM 프라이머를 갖는 25㎕ 반응물에서 Perkin-Elmer 열 순환기로 55℃의 어닐링 온도에서 수행한다. PCR 생성물을 먼저 TA 클로닝용 pCR2.1 벡터(제조원: Invitrogen, San Diego, USA)내로 클로닝시킨다. 이어서, 이를 XbaI-SpeI 이중 분해에 의해 잘라낸 다음 pMTL 벡터의 XbaI 부위에 센스 및 안티센스 배향으로 클로닝시켜 각각 pMTL-virB1 및 pMTL-virB1as을 제조한다. 유사하게, 균주 A로부터 증폭시킨 PCR 생성물을 pMTL에 센스 및 안티센스 배향으로 클로닝시켜 각각 pMTL-virB1A 및 pMTL-virB1Aas를 제조한다.
acvB를 pMTL 센스 및 pMTL 안티센스의 XbaI-XhoI 부위에 클로닝시켜 pMTL-acvB 및 pMTL-acvBas를 제조한다.
pGUS는 암호 서열의 N-말단 코돈내에 인트론을 갖는 β-글루쿠로니다제 유전자(GUS)를 포함하며, 옥토핀 및 만노핀 신타제 유전자로부터 유래된 키메라 프로모터(옥토핀 신타제 프로모터 상류 활성화 서열과 만노핀 신타제 프로모터와의 삼합체)에 의해 유도된다[참조: Ni et al, 1995].
옥수수 현탁액 세포
옥수수(Zea Mays cv Black Mexican Sweet;BMS)의 현탁 배양액을 N6 배지(Chu et al., 1975)에서 유지시키고, 슈크로즈 30g/l 및 2,4-디클로로페녹시 아세트산(2,4-D)(2N63S) 2mg/l를 보충한다. 충격 실험에 사용된 옥수수 세포 현탁액을 3일간 빠르게 성장한 배양물로부터 채취한다. 충격을 가하기 전에, 충진된 용적 세포 약 0.5ml를 7cm 필터(Whatman, N˚4)상으로 진공 여과시킨다. 플레이팅된 세포를 슈크로즈 120g/l를 함유하는 식물성한천-고형화된 2N6 배지상에서 4시간 동안 25℃에서 유지시킨후 충격을 가한다.
식물 세포의 충격
플라스미드의 혼합물이 침전되어 있는 금 미세투사체로 조직에 충격을 가한다. pGUS 플라스미드 DNA를 일시적인 발현 연구에 있어서 내부 대조군으로서 사용한다. 공동-형질전환 실험의 경우, 금 입자는 동일한 질량의 모든 플라스미드 DNA(표적 플레이트당 각 플라스미드 0.5㎍)을 포함한다. 적당량의 각각의 DNA를 전체 용적 10㎕로 혼합하고, 0.3㎛ 금 미세담체 50㎕(60mg/ml)상에서 2.5M CaCl2 50㎕ 및 0.1M 스페르미딘-비함유 염기 20㎕로 침전시킨다. 미세투사체 충격을, 샘플이 정지 스크린 선반의 하부 8cm에 위치하는 1100psi 파열 디스크를 사용하여 PDS-1000 He 바이오리스틱 장치(DuPont)로 수행한다.
일시적 발현 분석
β-글루쿠로니다제 활성을, GUS-Light 키트(Tropix)를 사용한 화학발광 분석으로 측정한다. β-글루쿠로니다제 활성은 25℃에서 10초에 걸쳐 적용된 Analytical Luminescence 모델 2001 발광측정기로 측정된 광선 단위로 표시된다.
콜로니 하이브리드화
1일 경과한 BAC 클론을 방사성 표지된 아그로박테리움- 유래된 프로브로 하이브리드화하기 위해 나일론 필터(Hybond-N, Amersham Life Sciences, UK)상에 위치시킨다. DNA 프로브를 파마시아(Pharmacia)사의 올리고 표지 키트를 사용하여 [a-32P]dCTP로 표지한다. chvG 프로브 및 virD1 프로브는 PCR 증폭된 단편에 상응한다. 라이브러리 필터를 하이브리드화 용액에서 2시간 동안 65℃로 예비-하이브이리드화시킨다(5×SSPE, 5×덴하르트 용액, 0.5% SDS 0.1mg/ml 연어 정자 DNA). 하이브리드화를 동일한 완충액에서 65℃로 밤새 수행한다. 필터를 15분 동안 65℃에서 1×SSC, 0.1% SDS로 세정한 다음, 15분 동안 65℃에서 0.1×SSC, 0.1% SDS에서 항온처리한다. 필터를 단시간 블롯팅 건조시키고, 필름을 증감 스크린을 사용하여 -70℃에서 밤새 노출시킨다.
PCR 증폭의 경우, LBA4404의 루프를 ddH2O에 재현탁시키고, 95℃에서 15분 동안 가열시키며, 원심분리한 다음 1ml를 하기 조건하에 PCR 반응에 사용한다: 95℃에서 5분, 및 이어서 95℃에서 45초, 55℃에서 45초 및 72℃에서 45초의 30사이클.
결과
약 20개의 옥수수 배아를 BAC 라이브러리로부터의 하나의 클론으로 접종하고, 유합조직 개시 배지상에 플레이팅한다. 공동-배양한 후, 배아를 세포탁심 250mg/ml가 보충된 동일한 배지상으로 옮긴다. 이어서, 배아를 검사하여 재조합 세균에 의해 유발된 손상을 평가한다. 스크리닝된 160개의 클론중에서 4개의 독립적인 BAC 클론을 동정한다(BAC1, BAC2, BAC3, BAC4).
옥수수 조직의 세포 사멸에 관여하는 BAC 클론상에 상기 영역을 위치시키기 위해, BAC 클론의 HindIII 단편을 bluescript 벡터내로 서브클로닝한다. 각각의 이들 클론을 옥수수 조직상에서 시험하여 세포 사멸 유도 능력의 보유 여부를 판정한다.
DNA 서열을 아클론 및 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 판정한다. BAC1-2, BAC2-2 및 BAC3-2의 서열은 각각 virB1, xylA-xylB 및 acvB와의 상동성을 나타낸다. BAC-4는 BAC3-2와 동일하다.
acvB(BAC3 및 BAC4), virB1(BAC1) 및 xylA-xylB(BAC2)를 포함하는 BAC 클론을 균주 A에 도입하여 균주 A(acvB), A(virB1) 및 A(xylA)를 수득한다. 이들 균주를 사용하여 옥수수 조직을 접종한다. LBA4404로 접종된 조직은 전형적인 세포 사멸 패턴을 나타내는 반면, 균주 A에 의한 감염은 이들 징후를 나타내지 않는다. A(acvB), A(virB1) 및 A(xylA)는 상이한 수준에서 세포 사멸을 유도하는데, A(acvB)가 가장 강력하다. 따라서, 이들 유전자의 존재는 균주 A와 옥수수와의 상호작용을 변화시켜, 옥수수 조직이 감염에 대해 더욱 민감하도록 한다(표 12).
균주 실험 1 실험 2 실험 3
세균 부재 19/22(86%) 15/18(83%) 16/18(88%)
LBA4404 2/20(10%) 1/17(6%) 3/20(15%)
이. 콜라이 17/20(85%) 16/19(84%) 17/21(81%)
균주 A 19/20(95%) 17/21(81%) 17/20(85%)
이. 콜라이(BAC1) 5/20(25%) 5/17(30%) 4/18(22%)
이. 콜라이(BAC2) 10/19(52%) 10/20(50%) 9/19(47%)
이. 콜라이(BAC3) 3/18(16%) 4/17(24%) 3/20(15%)
이. 콜라이(BAC4) 4/19(21%) 3/19(16%) 2/21(9%)
균주 A(BAC1) 5/19(26%) 6/17(35%) 8/25(32%)
균주 A(BAC2) 9/22(41%) 10/23(43%) 8/19(42%)
균주 A(BAC3) 3/20(15%) 2/18(11%) 3/21(14%)
균주 A(BAC4) 2/20(10%) 3/19(16%) 4/20(20%)
서던 분석에 있어서, 아그로박테리움 균주 A136, LBA4404, LBA4402, A 및 B로부터의 게놈 DNA의 HindIII-분해 단편을 xylA 또는 acvB를 포함하는 단편을 사용하여 적당히 엄격한 조건하에 프로빙한다. xylA에 대한 상동성 단편은 시험된 모든 균주내에 존재한다. acvB와 하이브리드화되는 서열은 옥수수 세포에서 세포 사멸을 유도하는 LBA4404, LBA4402 및 A136에서 발견된다. 중요하게는, 아그로박테리움 균주 A 및 B에서는 acvB가 결실되어 있다. 따라서, acvB는 이의 분포가 제한된다. 상기 보고된 바와 같이, acvB는 비교적 소수의 아그로박테리움 균주에 존재한다[참조: Wirawan et al., Biosci. Biotech. Biochem. 60: 44-49, 1993]. Ti 플라스미드는 xylA 및 acvB를 포함하지 않는데, 이는 xylA 및 acvB가 Ti-제거된 균주 LBA4402상에 존재하기 때문이다.
옥수수 세포내의 acvB 및 virB1의 발현이 치명적인지의 여부를 측정하기 위해, 이들 유전자를 식물 발현 벡터내로 클로닝하고, β-글루쿠로니다제(GUS)를 발현하는 pGUS 벡터로 공동-형질전환시킨다. 시험 유전자가 치명적인 경우에, GUS 활성이 감소되거나 제거된다[참조: Mindrinos et al., 1994]. 2개 유전자의 암호 영역을, MTL 프로모터를 함유하는 식물 발현 벡터내로 센스 및 안티센스 배향으로 서브클로닝하고, 벡터 pGUS와 함께 옥수수 세포내로 바이오리스틱 장치로 전달한다. 30시간 후, GUS의 활성을 옥수수 세포에서 평가한다. 결과는 표 13에 제시되어 있다. GUS 활성은, virB1이 pGUS와 공동-충격을 가한 경우에 약 2배 감소한다. acvB 및 pGUS로 공동-충격을 가한 옥수수 세포에서는 일관되게 GUS 활성이 35배 감소된다. 이는 옥수수 세포에서 고수준의 acvB 발현이 유해하다는 것을 나타낸다.
하기 표의 경우, 플라스미드 작제물을 바이오리스틱 장치로 옥수수 세포에 전달한다. 30시간 동안 항온처리한 후, 조직을 파쇄하고, GUS 활성을 측정한다. 활성은 광선 단위/단백질 ㎍으로 표시한다. 독립적인 충격을 분석하여, 데이타를 5회 반복 시험의 평균값±SD로서 제시한다.
플라스미드+pGUS 평균±SD(광선 단위/단백질 ㎍)
pUC 2082±199
pMTL-virB1 1014±106
pMTL-virB1as 2543±176
pMTL-virB1K6 1738±330
pMTL-virB1K6as 2168±282
pMTL-acvB 61±19
pMTL-acvBas 2378±292
<110> Novartis AG <120> Plant transformation methods <130> 5-1998-060300-2 <150> US 08/867,869 <151> 1997-06-02 <160> 12 <170> KOPATIN 1.5 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> single, linear, genome; hypothetical: no; antisense: no; immediate source: clone: PAT1 <400> 1 tgtctccgga gaggagacc 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> single, linear, genome; hypothetical: no; antisense: no; immediate source: clone: PAT2 <400> 2 ccaacatcat gccatccacc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> single, linear, genome; hypothetical: no; antisense: no; immediate source: clone: MTL (P) <400> 3 aggtgtccat ggtgctcaag 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> single, linear, genome; hypothetical: no; antisense: no; immediate source: clone: iap (I) <400> 4 acaatcgaac cgcacacgtc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> single, linear, genome; hypothetical: no; antisense: no; immediate source: clone: p35 (35) <400> 5 ccaggtagca gtcgttgtgt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> single, linear, genome; hypothetical: no; antisense: no; immediate source: clone: dad-1 (D) <400> 6 ccttgtttcc tttgttcact 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> single, linear, genome; hypothetical: no; antisense: no <400> 7 ggtcctatac gaagcgttac 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> single, linear, genome; hypothetical: no; antisense: no <400> 8 ccacgtagca gtcgttgtgt 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> single, linear, genome; hypothetical: no; antisense: no <400> 9 catgtctgac ttgcgattgg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> single, linear, genome; hypothetical: no; antisense: no <400> 10 acaatcgaac cgcacacgtc 20 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> single, linear, genome; hypothetical: no; antisense: no <400> 11 ggagaggcgg tgttagtt 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> single, linear, genome; hypothetical: no; antisense: no <400> 12 catcatcgca ttcgagag 18

Claims (20)

  1. 아그로박테리움-유도된 괴사(AIN)를 억제하는, 식물 세포의 열 충격(heat shock) 처리 후, 또는 p35, iap 및 dad-1으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 유전자 기원의 mRNA 또는 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 존재하에, 목적 유전자를 포함하는 벡터를 포함하는 아그로박테리움과 당해 식물 세포를 공동배양시킴에 의해 목적 유전자로 식물 세포를 형질전환시키는 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 아그로박테리움-유도된 괴사(AIN)를 억제하는, 식물 세포의 열 충격(heat shock) 처리 후, 또는 p35, iap 및 dad-1으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 유전자 기원의 mRNA 또는 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 존재하에, 목적 유전자를 포함하는 벡터를 포함하는 아그로박테리움과 식물 조직을 공동배양시킴에 의해 식물 조직을 형질전환시키는 단계 및 이렇게 형질전환된 조직을 재생시키는 단계를 포함하여, 생식능이 있는 형질전환된 식물을 제조하는 방법.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제1항에 있어서, 열-충격 처리가 40 내지 50℃에서 수행되는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 열-충격 처리가 42 내지 48℃에서 수행되는 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 열-충격 처리가 2 내지 10분동안 지속되는 방법.
  17. 제1항에 있어서, 식물 세포가 그라미네아에(Gramineae) 종 세포인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 식물 세포가 옥수수 또는 밀 세포인 방법.
  19. 제1항의 방법에 따라 제조된 형질전환된 식물 세포.
  20. 제19항에 있어서, 옥수수 또는 밀 세포인 형질전환된 식물 세포.
KR19997011305A 1997-06-02 1998-05-29 식물 형질전환 방법 KR100505910B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US86786997A 1997-06-02 1997-06-02
US08/867,869 1997-06-02
PCT/EP1998/003215 WO1998054961A2 (en) 1997-06-02 1998-05-29 Plant transformation methods

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20010013310A KR20010013310A (ko) 2001-02-26
KR100505910B1 true KR100505910B1 (ko) 2005-08-04

Family

ID=25350632

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR19997011305A KR100505910B1 (ko) 1997-06-02 1998-05-29 식물 형질전환 방법

Country Status (19)

Country Link
EP (1) EP0986299B1 (ko)
JP (1) JP2002502252A (ko)
KR (1) KR100505910B1 (ko)
CN (1) CN1150320C (ko)
AR (1) AR015837A1 (ko)
AT (1) ATE336890T1 (ko)
AU (1) AU735472B2 (ko)
BR (2) BRPI9816263B1 (ko)
CA (1) CA2290863C (ko)
DE (1) DE69835672T2 (ko)
HU (1) HU226212B1 (ko)
IL (2) IL132768A0 (ko)
MX (1) MX257801B (ko)
PL (1) PL336979A1 (ko)
RU (1) RU2226549C2 (ko)
TR (2) TR200402566T2 (ko)
UA (1) UA72443C2 (ko)
WO (1) WO1998054961A2 (ko)
ZA (1) ZA984681B (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100671225B1 (ko) 2005-01-06 2007-01-19 전남대학교산학협력단 글리신-풍부 ｒｎａ-결합 단백질을 암호화하는뉴클레오타이드 서열을 이용하여 식물에 저온 또는 동결내성을 부여하는 방법

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3331367B2 (ja) * 1997-03-11 2002-10-07 独立行政法人農業生物資源研究所 細胞死抑制遺伝子が導入されたストレス抵抗性植物およびその作出方法
AU1241100A (en) * 1998-10-30 2000-05-22 University Of Nebraska-Lincoln Trans-species transfer of apoptotic genes and transgenic plants developed thereby
US6603061B1 (en) * 1999-07-29 2003-08-05 Monsanto Company Agrobacterium-mediated plant transformation method
WO2001044459A2 (en) * 1999-12-15 2001-06-21 Regents Of The University Of Minnesota Method to enhance agrobacterium-mediated transformation of plants
US6570069B1 (en) * 2000-02-10 2003-05-27 Regents Of The University Of California Nucleic acids encoding plant inhibitors of apoptosis and transgenic cells and plants expressing them
US7468475B2 (en) 2000-06-16 2008-12-23 Schmuelling Thomas Method for modifying plant morphology, biochemistry and physiology
DE60041157D1 (de) 2000-08-03 2009-01-29 Japan Tobacco Inc Verfahren zur verbesserung der gentransfer-effizienz in pflanzenzellen
EP1616014A2 (en) 2003-04-11 2006-01-18 CropDesign N.V. Method to increase stress tolerance in plants
GB0525645D0 (en) 2005-12-16 2006-01-25 Plant Bioscience Ltd Methods, means and compositions for enhancing agrobacterium-mediated plant cell transformation efficiency
CN100370016C (zh) * 2006-04-21 2008-02-20 贵州大学 对根癌农杆菌有抑制作用的黑曲霉菌株及其用途
ATE516358T1 (de) 2006-09-25 2011-07-15 Univ Berlin Freie Transkriptionsrepressoren der cytokin- signalgebung und deren verwendung
JP2011120478A (ja) 2008-03-31 2011-06-23 Japan Tobacco Inc アグロバクテリウム菌による形質転換植物の作成方法
US8884101B2 (en) 2009-07-29 2014-11-11 Japan Tobacco Inc. Method of gene introduction into Triticum plant using Agrobacterium, and a method of producing transformed Triticum plant
EP3066915A1 (en) * 2010-07-29 2016-09-14 Dow AgroSciences LLC Strains of agrobacterium modified to increase plant transformation frequency
JP2013212051A (ja) 2010-07-29 2013-10-17 Japan Tobacco Inc アグロバクテリウム菌を用いた、オオムギ属植物へ遺伝子導入を行う方法およびオオムギ属植物の形質転換植物の作成方法
GB201020737D0 (en) 2010-12-08 2011-01-19 Univ Leuven Kath Anti-oxidative stress agents
US10472644B2 (en) * 2011-01-17 2019-11-12 Philip Morris Products S.A. Protein expression in plants
DE102013020605A1 (de) 2013-12-15 2015-06-18 Kws Saat Ag Selektionsmarker-freies rhizobiaceae-vermitteltes verfahren zur herstellung einer transgenen pflanze der gattung triticum
BR102014023930A2 (pt) 2014-09-26 2016-05-17 Ctc Ct De Tecnologia Canavieira S A método para transformar uma célula de planta ou tecido de planta usando agrobacterium, planta transgênica, célula transgênica ou tecido transgênico, meio de cultura, e, uso de um método para transformar uma célula de planta ou tecido de planta

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5380831A (en) 1986-04-04 1995-01-10 Mycogen Plant Science, Inc. Synthetic insecticidal crystal protein gene
US5610042A (en) 1991-10-07 1997-03-11 Ciba-Geigy Corporation Methods for stable transformation of wheat

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100671225B1 (ko) 2005-01-06 2007-01-19 전남대학교산학협력단 글리신-풍부 ｒｎａ-결합 단백질을 암호화하는뉴클레오타이드 서열을 이용하여 식물에 저온 또는 동결내성을 부여하는 방법

Also Published As

Publication number Publication date
MX9911116A (en) 2000-03-31
HU226212B1 (en) 2008-06-30
WO1998054961A3 (en) 1999-03-04
ATE336890T1 (de) 2006-09-15
DE69835672D1 (de) 2006-10-05
CA2290863A1 (en) 1998-12-10
EP0986299A2 (en) 2000-03-22
IL132768A0 (en) 2001-03-19
EP0986299B1 (en) 2006-08-23
TR200402566T2 (tr) 2004-11-22
IL132768A (en) 2007-06-17
JP2002502252A (ja) 2002-01-22
CN1258316A (zh) 2000-06-28
CN1150320C (zh) 2004-05-19
HUP0002903A3 (en) 2002-08-28
ZA984681B (en) 1998-12-02
BR9809899A (pt) 2000-10-17
RU2226549C2 (ru) 2004-04-10
TR199902941T2 (xx) 2000-08-21
BRPI9809899B8 (pt) 2017-03-07
KR20010013310A (ko) 2001-02-26
PL336979A1 (en) 2000-07-31
UA72443C2 (uk) 2005-03-15
BR9809899B1 (pt) 2013-03-19
AU735472B2 (en) 2001-07-12
WO1998054961A2 (en) 1998-12-10
MX257801B (en) 2008-06-10
AU8535598A (en) 1998-12-21
HUP0002903A2 (hu) 2000-12-28
BRPI9816263B1 (pt) 2016-08-16
CA2290863C (en) 2008-09-23
DE69835672T2 (de) 2007-08-16
AR015837A1 (es) 2001-05-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6162965A (en) Plant transformation methods
KR100505910B1 (ko) 식물 형질전환 방법
US20220010320A1 (en) Methods for producing transgenic plants
EP3368676B1 (en) Methods and compositions for rapid plant transformation
Lindsey et al. Transformation of sugarbeet (Beta vulgaris) by Agrobacterium tumefaciens
DE69826596T2 (de) Verbesserte methode zur transformation von pflanzen
AU2009232967B2 (en) Agrobacterium-mediated method for producing transformed plant
Charity et al. Consistent and stable expression of the npt II, uid A and bar genes in transgenic Pinus radiata after Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation using nurse cultures
KrishnaRaj et al. Somatic embryogenesis and Agrobacterium-mediated transformation system for scented geraniums (Pelargonium sp.Frensham')
Fenning et al. Transformation and regeneration of English elm using wild-type Agrobacterium tumefaciens
Konagaya et al. High-efficiency Agrobacterium-mediated transformation of Cryptomeria japonica D. Don by co-cultivation on filter paper wicks followed by meropenem treatment to eliminate Agrobacterium
Wang et al. Improvement of Agrobacterium-mediated transformation and rooting of black cherry
Levenko et al. Herbicide resistant transgenic plants of grapevine
US20020088029A1 (en) Plant transformation methods
CA2291932C (en) A method for producing the transformants of coffee plants and transgenic coffee plants
JP2000023675A (ja) 広範な品種に適応可能なアグロバクテリウムによるトウモロコシの形質転換方法
Degenhardt et al. Transformation of apple (Malus domestica Borkh.) using the phosphomannose isomerase gene as a selectable marker
JP2009523021A (ja) 陽性選択に基づくヒマワリおよび脂肪種子の新規で効果的な形質転換法
WO2016094029A1 (en) Methods of embryogenic tissue preparation for sugar cane transformation
ALI et al. REGENERATION AND TRANSFORMATION SYSTEM IN EGYPTIAN SWEET POTATO (Ipomoea batatas Lam.) CULTIVARS
Ellis Transformation in spruce (Picea species)
Wong et al. Improvements in the efficiency of Agrobacterium-mediated transformation of embryogenic cell suspensions of banana cv.‘Mas’ using a low-antibiotic liquid washing-assisted approach
Plants Production of Genetically Modified Peach (Prunus persica L. Batsch)
Ree EBB1, an AP2/ERF Transcription Factor, Promotes Transgenic Shoot Development in Populus
Chen Genetic Transformation of Perennial Ryegrass for Chemical Induced Elimination

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
N231 Notification of change of applicant
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
LAPS Lapse due to unpaid annual fee