DE69034190T2 - Molekulare verfahren zur vermehrung von hybriden saaten - Google Patents

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Description

  • TECHNISCHES GEBIET
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erzeugen von männlich sterilen Pflanzen und hybriden Saaten, genetisches Material, das verwendet wird, um das Merkmal der männlichen Sterilität zu verleihen, und neue Produkte, die sich durch dieses Verfahren herstellen lassen, nämlich genetisch transformierte Pflanzen, die das Merkmal der männlichen Sterilität tragen, männlich sterile Pflanzen und hybrides Saatgut, das durch Bestäuben dieser Pflanzen mit Pollen von männlich befruchtungsfähigen Pflanzen erzeugt wurde.
  • HINTERGRUND-TECHNOLOGIE
  • Die Erzeugung von hybridem Saatgut für kommerziellen Verkauf ist eine große Industrie. Hybride Pflanzen, die aus hybriden Saaten gezüchtet wurden, profitieren von den heterotischen Effekten beim Kreuzen von zwei genetisch unterschiedlichen Zuchtlinien. Die agronomische Leistung dieser Nachkommen ist der beider Eltern überlegen, typischerweise bezüglich Widerstandsfähigkeit, Ausbeute und Uniformität. Die bessere Leistung von hybriden Saatgut-Varietäten im Vergleich zu offen bestäubten Varietäten macht das hybride Saatgut für Bauern für das Säen oder Pflanzen attraktiver und erreicht daher Höchstpreise im Markt.
  • Um hybrides Saatgut zu erzeugen, das nicht mit selbstbestäubten Samen kontaminiert ist, müssen Verfahren zum Kontrollieren der Bestäubung eingeführt werden, um Kreuz-Bestäubung und keine Selbst-Bestäubung sicherzustellen. Kontrollmechanismen für die Bestäubung können mechanisch, chemisch oder genetisch sein.
  • Ein einfaches mechanisches Verfahren zur Erzeugung von hybridem Saatgut kann verwendet werden, wenn die fragliche Pflanzen-Spezies räumlich getrennte männliche und weibliche Blüten oder getrennte männliche und weibliche Pflanzen aufweist. Die Maispflanze beispielsweise besitzt Pollen erzeugende männliche Blüten in einem Blütenstand am Apex der Pflanze und weibliche Blüten in den Blattachseln entlang des Stengels. Das Kreuzen wird durch mechanisches Befreien der weiblichen Pflanzen von den Fäden sichergestellt, um die Selbst-Bestäubung zu verhindern.
  • Die meisten interessierenden kultivierbaren Pflanzen besitzen jedoch sowohl funktionelle männliche als auch solche weibliche Organe innerhalb derselben Blüte, und deshalb ist die Beseitigung der männlichen Fortpflanzungsfähigkeit kein einfaches Verfahren. Es ist möglich, von Hand die pollenbildenden Organe zu entfernen, bevor sich die Pollen verbreiten, doch ist diese Form der Erzeugung von hybridem Saatgut extrem arbeitsaufwendig und daher sehr teuer. Saatgut erzeugt man auf diese Weise, wenn der Wert und die Menge der gewonnenen Samen den Aufwand rechtfertigen.
  • Ein zweites allgemeines Verfahren zum Erzeugen von hybridem Saatgut ist der Einsatz von Chemikalien, die lebensfähige Pollen abtöten oder deren Bildung hemmen. Diese Chemikalien, die als Gametozide bezeichnet werden, werden verwendet, um vorübergehend männliche Sterilität zu verleihen. Die kommerzielle Produktion von hybridem Saatgut unter Verwendung von Gametoziden ist durch die Kosten und die Verfügbarkeit der Chemikalien und die Zuverlässigkeit und Wirkungsdauer der Anwendungen beschränkt. Diese Chemikalien kann man für Feldfrüchte mit längerer Blütenperiode nicht einsetzen, da sich neue Blüten bilden, die nicht beeinträchtigt werden. Eine wiederholte Anwendung von Chemikalien ist wegen der Kosten nicht praktikabel.
  • Viele der derzeit gängigen, kommerziellen Produktionssysteme für hybrides Saatgut von bzw. für kultivierbare Pflanzen stützen sich auf ein genetisches Verfahren zur Steuerung der Pollenbildung. Pflanzen, die in ihrer weiblichen Form eingesetzt werden, sind entweder nicht in der Lage, Pollen zu produzieren oder zu verbreiten, oder sie erzeugen Pollen, die aus biochemischen Gründen nicht in der Lage sind, Selbstbestäubung zu bewirken. Pflanzen, die (mit Hilfe unterschiedlicher Mittel) aus biochemischen Gründen unfähig zur Selbstbestäubung sind, werden als selbstinkompatibel bezeichnet. Mit dem Einsatz von Selbstinkompatibilitäten verbundene Schwierigkeiten sind: Verfügbarkeit und Vermehrung der selbstinkompatiblen weiblichen Linie und Stabilität der Selbstinkompatibilität. In manchen Fällen kann die Selbstinkompatibilität chemisch wieder beseitigt werden, oder es können unreife Knospen per Hand bestäubt werden, bevor der biochemische Mechanismus, der die Pollen unfruchtbar macht, aktiviert wird. Desaktivierbare selbstinkompatible Systeme sind gegenüber belastenden klimatischen Bedingungen häufig sehr empfindlich; letztere zerstören oder verringern die Wirksamkeit der biochemischen Hemmung der Selbstbestäubung.
  • Von weiter verbreitetem Interesse für die kommerzielle Erzeugung von Saatgut sind Systeme, bei denen die Steuerung der Pollenbildung auf genetischen Mechanismen basiert, die männliche Sterilität verursachen. Zwei allgemeine Arten dieser Systeme existieren: (a) genomische männliche Sterilität, die das Unvermögen einer Pollenbildung aufgrund eines oder mehrerer nuklearer Gene ist, oder (b) cytoplasmatisch-genetische männliche Sterilität (im allgemeinen als cytoplasmatische männliche Sterilität oder CMS bezeichnet), bei der die Pollenbildung aufgrund eines Defekts in einer cytoplasmatischen Organelle (dem Mitochondrion) gehemmt oder unterbrochen ist.
  • Nukleare (genbedingte bzw. genomische) Sterilität kann entweder dominant oder rezessiv sein. Dominante Sterilität kann nur dann für die Erzeugung von hybridem Saatgut eingesetzt werden, wenn die Fortpflanzung der weiblichen Linie unkritisch ist und wenn die Vermehrung der weiblichen Linie möglich ist (z. B. durch klonale Fortpflanzung bzw. Vermehrung oder durch den Einsatz eines selektierbaren Markers, der eng an das Sterilitätsgen gekoppelt ist).
  • Viele erfolgreiche Hybridisierungs-Schemata nutzen die Verwendung von CMS. In diesen Systemen kann eine spezifische Mutation im cytoplasmatisch lokalisierten Mitochondrion bei geeignetem nuklearem Hintergrund zu einem Unvermögen der Bildung reifer Pollen führen. In einigen anderen Fällen kann der nukleare Hintergrund die cytoplasmatische Mutation kompensieren, und es erfolgt eine normale Pollenbildung. Das nukleare Merkmal, das in Pflanzen mit CMS-Mitochondrien die Pollenbildung ermöglicht, wird als Wiederherstellung bezeichnet und ist eine Eigenschaft spezifischer "Wiederherstellungsgene". Im allgemeinen erfordert die Verwendung von CMS für die kommerzielle Saatgutproduktion den Einsatz von drei Zuchtlinien, nämlich der männlich sterilen Linie (weibliches Elternteil), einer Weiterführungslinie, die mit der männlich sterilen Linie isogen ist, aber voll funktionsfähige Mitochondrien besitzt, und der männliche Elternlinie.
  • Die männliche Elternlinie kann die spezifischen "Wiederherstellungsgene" tragen (und wird üblicherweise als Wiederherstellungslinie bezeichnet), was dem hybriden Saatgut dann Fertilität verleiht. Für Feldfrüchte (z.B. Gemüse), für die die Gewinnung von Samen aus der Hybride unbedeutend ist, könnte ein CMS-System ohne Wiederherstellung verwendet werden. Für Anbauarten, für die die Früchte oder die Samen der Hybriden die in den Handel gelangenden Produkt sind, muß die Fertilität des hybriden Saatguts durch spezifische Wiederherstellungsgene im männlichen Elternteil jeweils wiederhergestellt werden, oder die männlich sterile Hybride muß bestäubt werden. Die Bestäubung von nicht-wiederhergestellten Hybriden kann dadurch erreicht werden, dass man den Hybriden einen kleinen Prozentsatz an männlich fertilen Pflanzen beimischt, um die Bestäubung zu bewirken. In den meisten Arten wird das CMS-Merkmal über die mütterliche Linie vererbt (da der Erbgang aller cytoplasmatischen Organellen ausschließlich über die Eizelle erfolgt), was die Verwendung des Systems beschränken kann.
  • Bei einer vorliegend besonders interessierenden Feldfrucht, der Ölsaat der Spezies Brassica napus oder Brassica campestris, üblicherweise als Canola bezeichnet, ist es bis heute nicht gelungen, ein kommerzielles Hybridsystem zu perfektionieren. Mechanisches Beseitigen der männlichen Fortpflanzungsorgane von Blüten ist für die Erzeugung von hybridem Saatgut in jeder möglichen Größenordnung inpraktikabel. Die Verwendung von derzeit verfügbaren Gametoziden ist wegen der ungewissen Natur der Blütenbildung nicht praktikabel. Wiederholte Anwendung von Chemikalien ist teuer, und es kommt bei den Verfahren leicht zu einer Kontamination mit selbstbestäubten Samen.
  • Gene, die zu Selbstinkompatibilität führen, sind in Brassica-Sorten sehr verbreitet, und man hat selbstinkompatible Hybridsysteme für die Erzeugung von hybridem Saatgut von Gemüsepflanzen verwendet. Größere Schwierigkeiten sind mit der Vermehrung und Fortpflanzung der weiblichen Linien und der Zerstörung von Selbstinkompatibilitäten unter belastenden Bedingungen verbunden. Die Adaption dieser Systeme auf Brassica-Ölsaaten ist durch die Kosten der Vermehrung der weiblichen Linien und durch die Verfügbarkeit geeigneter selbstinkompatibler Gene in der dominanten Canola-Sorte, Brassica napus, beschränkt.
  • In Brassica-Sorten sind mehrere Quellen für männliche Sterilität verfügbar. Sowohl rezessive als auch dominante genomische Systeme sind beschrieben worden; ihre Verwendung ist jedoch beschränkt, da eine groß angelegte in-vitro-Vermehrung oder das Aussortieren weiblicher Linien in den meisten Fällen für die Samenproduktion in großem Maßstab nicht praktikabel ist.
  • Darüber hinaus wurde eine Reihe von CMS-Systemen in Brassica-Sorten beschrieben. Vier dieser Systeme wurden als mögliche Vehikel bei der Erzeugung von hybridem Saatgut untersucht: pol, nap, anand und ogu. Das Polima-System (pol) wurde ausführlich untersucht; es ist wahrscheinlich dasjenige, das einer kommerziellen Verwendung am nächsten ist. Man hat eine gute Wiederherstellung und Weiterführung von pol CMS erzielt, aber das System leidet unter der potentiellen Instabilität des CMS bei hohen Temperaturen, einer Reduktion des heterotischen Effekts beim Kreuzen unterschiedlicher Linien (wegen der defekten Mitochondrien) und einer Verminderung des Ölgehalts in den hybriden Samen. Der Einsatz anderer CMS-Systeme ist ebenfalls wegen Wärmempfindlichkeit (nap), Schwierigkeiten bei der Wiederherstellung der Fertilität (ogu, anand), Schwierigkeiten bei der Aufrechterhaltung der Sterilität (nap) und mit dem sterilen Cytoplasma assoziierter Niedertemperatur-Chlorose (ogu) beschränkt. Die Verbesserung dieser Systeme ist Gegenstand eines bemerkenswerten Forschungsumfangs; alle diese Systeme besitzen jedoch gewisse inhärente Schwächen, die ihre Anwendung begrenzen.
  • EP 344 029 A1 beschreibt Pflanzen mit modifizierten Staubgefäß-Zellen und Verfahren zum Erzeugen von männlich sterilen Pflanzen, basierend auf Konstrukten, die Verbindungen exprimieren, welche die Pollenbildung direkt (zum Beispiel cytotoxische Verbindungen) oder indirekt (anti-sense) in einer staubgefäß-/pollenspezifischen Art zum Abbruch bringen. In Beispiel 5 werden eine chimäre DNA-Sequenz einer Promotor-Kassette ("PTA 29") und ein Glucuronidase-Gen beschrieben, wobei das Glucuronidase-Gen ausschließlich als Marker-Gen zum Untersuchen des Expressionsmusters der eingesetzten Promotoren dient.
  • EP 198 288 A2 ist auf die Erzeugung von Pflanzen gerichtet, die ein Marker-Gen in großer Nähe verknüpft an einen Zielort besitzen, insbesondere an einen nuklearen Zielort für männliche Sterilität, der in diesen Pflanzen natürlicherweise vorkommen kann, oder der durch Züchten oder Mutagenese eingeführt wurde. Die Arten an Marker-Genen umfassen übliche Expressionsmarker, das heißt deren Gegenwart in der Pflanze nach Aufbringen einer chemischen Substanz detektierbar ist. Ein Beispiel sind dominante lethale Marker, deren Gen-Produkte einen Vorläufer in ein Phytotoxin, beispielsweise Indol-essigsäure, umwandeln können. EP 198 288 A2 beschäftigt sich demnach ausschließlich mit Toxizität für gesamte Pflanzen.
  • Es ist offensichtlich, dass ein ideales System für die Produktion von hybridem Saatgut in beliebigen kultivierbaren Pflanzen eine Form genomischer männlicher Sterilität wäre, die sich regulieren oder beseitigen ließe, um eine männliche Fertilität für die Fortpflanzung oder Vermehrung der weiblichen Linien oder die Fruchtbarkeit von Hybriden zu ermöglichen. Diese Erkenntnis hat die Forschung hinsichtlich des Einsatzes molekularer Systeme zur Bewirkung genetisch männlicher Sterilität, die zur Erzeugung von hybridem Saatgut eingesetzt werden könnten, beflügelt. Zusätzlich eröffnet das Aufkommen und die weite Verbreitung von rekombinanten DNA-Methodologien einen Mechanismus zum Einführen neuer DNA-Sequenzen in eine große Vielzahl von unterschiedlichen Feldfrucht-Spezies, was mit den begrenzten geschlechtlichen Methoden des geschlechtlichen Austauschs zwischen unterschiedlichen Spezies nicht möglich ist. Der molekulare Ansatz hat den Vorteil, dass das Hybridisierungs-System auf alle Zuchtlinien oder Kultivationen einer gegebenen Feldfrucht übertragen werden kann, ohne dass es nötig wäre, aufwendiges Rückkreuzen zu betreiben und etablierte Zuchtlinien zu unterbrechen, was zu der schnellen Erzeugung männlich steriler Linien mit gut charakterisierter und überlegener agronomischer Leistung führt.
  • Die Entwicklung des molekularen Ansatzes basiert auf der Unterbrechung eines beliebigen einer Anzahl von Entwicklungsschritten, die in spezifischer Weise für die Erzeugung von funktionsfähigen Pollen innerhalb der Mikrospore oder für die Entwicklung eines beliebigen somatischen Gewebes, das die Mikrospore hält oder stützt, erforderlich ist.
  • OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
  • Eine Aufgabe der hier beanspruchten Erfindung ist es, ein Verfahren zum Erzeugen genomischer männlicher Sterilität in Pflanzen bereitzustellen. Es ist außerdem eine Aufgabe der hier beanspruchten Erfindung, ein Verfahren zum Erzeugung genomischer männlicher Sterilität bereitzustellen, das leicht an die Erzeugung von hybridem Saatgut einschließlich von solchem hybriden Saatgut angepasst werden kann, welches männlich fertil ist.
  • Bei bestimmten interessierenden Feldpflanzen, beispielsweise Gemüse, gelangen nur die Blätter, Stengel oder Wurzeln in den Handel. Obwohl das Merkmal der männlichen Sterilität in der hybriden Pflanze vererbt und exprimiert werden kann, ist es deshalb nicht notwendig, die männliche Fertilität in den Samen der hybriden Pflanzen zu beseitigen oder wiederherzustellen. Bei anderen Pflanzen sind Gegenstand des Handels dagegen die Samen oder die Früchte, die von der hybriden Pflanze hervorgebracht werden. Für den optimalen Einsatz der Hybride im Handel ist es daher wünschenswert, dass die Hybride selbstbefruchtend sind. Für diesen Zweck ist es bei aus- oder fremdgekreuzten Spezies ausreichend, dass das hybride Saatgut eine Mischung aus männlich sterilen und männlich fertilen Samen aufweist.
  • Darüber hinaus erfordert die Verwendung von genomisch männlich sterilen Pflanzen für die Erzeugung von kommerziellem Saatgut eine Vermehrung der Samen der genomisch männlich sterilen Linie (häufig als Weiterführung oder Aufrechterhaltung bezeichnet). Die Erfindung berücksichtigt diese Anforderung.
  • Wir stellen ein Verfahren zum Erzeugen einer männlich sterilen Pflanze oder einer Pflanze, die das Merkmal für männliche Sterilität trägt, bereit, bei welchem ein auf einen Pollen zielendes oder ausgerichtetes rekombinantes DNA-Molekül, das selektiv die Entwicklung von funktionsfähigen Pollenkörnern hemmt oder das sich entwickelnde Pollenkörner empfindlich gegenüber einem chemischen Mittel oder physiologischer Belastung macht, in das Genom dieser Pflanze integriert wird. Ein auf einen Pollen zielendes oder gerichtetes rekombinantes Molekül, wie es vorliegend verwendet wird, ist ein rekombinantes DNA-Molekül, das selektiv in Geweben exprimiert wird, die für die Pollenbildung und -funktion(sfähigkeit) wesentlich oder entscheidend sind, einschließlich in Pollen selbst.
  • Gewebe, die für die Pollenbildung oder -funktion(sfähigkeit) wesentlich oder entscheidend sind, können auch Gewebe sein, die im Zusammenhang mit dem Wachstum und der Entwicklung von Mikrosporen oder der Funktion von Mikrosporen stehen, beispielsweise das Filament (die Staubfäden), das Tapetum und die Staubgefäßwand, ohne dass sie darauf beschränkt wären.
  • Gemäß einer Reihe von Ausführungsformen der Erfindung, die unten näher erläutert werden, kann ein auf einen Pollen zielendes oder ausgerichtetes rekombinantes DNA-Molekül eingesetzt werden, um selektiv die Erzeugung von funktionsfähigen Pollenkörnern zu blockieren oder sich entwickelnde Pollenkörner empfindlich gegenüber einem chemischen Mittel oder physiologischer Belastung zu machen. Es umfasst den Einsatz eines auf einen Pollen ausgerichteten Promotors zur Regulierung der Expression eines Gens, das für ein Molekül codiert, welches ein nicht-toxisches Molekül cytotoxisch macht.
  • Wir stellen Verfahren zur Erzeugung von hybridem Saatgut durch Bestäubung der genannten männlich sterilen Pflanze mit einer geeigneten männlich fertilen Pflanze bereit.
  • Wir stellen außerdem Verfahren zur Erzeugung von hybridem Saatgut bereit, bei welchem die das männlich sterile Merkmal tragende Pflanze zu einem Zeitpunkt bestäubt wird, wenn das männlich sterile Merkmal exprimiert wird, wobei diese Pflanze mit einer geeigneten männlich fertilen Pflanze bestäubt wird.
  • Wir stellen außerdem Verfahren zum Erzeugen von fertilem hybridem Saatgut durch Kompensieren (Wiederherstellen) der Genfunktion, die wie oben diskutiert beeinträchtigt war, oder durch Rückgängigmachen der Störung, die an den für die Pollenbildung oder -funktion(sfähigkeit) entscheidenden Geweben bewirkt worden war, bereit.
  • Wir erarbeiten außerdem Verfahren zur Erzeugung von hybridem Saatgut, bei welchen spezifische Wiederherstellungsmethoden nicht notwendig sind.
  • Insbesondere ist es möglich, ein Verfahren zum Erzeugen von hybridem Saatgut durch Kreuzen einer genetisch transformierten weiblichen Elternpflanze mit einer geeigneten männlich fertilen männlichen Elternpflanze bereitzustellen, wobei die genetisch transformierte weibliche Elternpflanze eine rekombinante DNA-Sequenz mit einem Sense- oder Antisense-Gen aufweist, das, wenn es exprimiert wird, die Erzeugung von Geweben blockiert, die wesentlich bzw. entscheidend für die Pollenbildung oder -funktion(sfähigkeit) sind oder diese Gewebe empfindlich gegenüber einem chemischen Mittel oder physiologischer Belastung macht, das/die die Funktionsfähigkeit dieser Gewebe blockiert, wobei die geeignete männlich fertile männliche Elternpflanze bei Bedarf eine rekombinante DNA-Sequenz aufweist, die die zuvor beeinträchtigte Gen-Funktion wiederherstellt (kompensiert) oder die die an den für die Pollenbildung oder -funktion(sfähigkeit) in dieser genetisch transformierten weiblichen Elternpflanze wesentlichen oder entscheidenden Geweben bewirkte Zerstörung oder Unterbrechung negiert.
  • Gemäß einer Ausgestaltung dieses Verfahrens kann genomische männliche Sterilität hervorgerufen werden, indem Pflanzenzellen, die in der Lage sind, sich in eine differenzierte ganze Pflanze zu regenerieren, mit einem rekombinanten DNA-Molekül ("Antisense-Gen") transformiert werden, das für eine RNA codiert, die komplementär zu der RNA ist, die durch ein Sense-Gen codiert wird, und mit dieser hybridisieren kann, wodurch die Expression des Sense-Gens verhindert wird.
  • Das Sense-Gen ist ein Gen, das in für die Pollenbildung oder -funktion(sfähigkeit) wesentlichen Geweben exprimiert wird, oder es ist ein Gen, das für die richtige Entwicklung oder Funktion einer Vielzahl von Geweben, darunter Geweben, die für die Bildung oder Funktionsfähigkeit von Pollen entscheidend sind, benötigt wird. Wenn das Sense-Gen ausschließlich in Geweben exprimiert wird, die für die Bildung oder Funktionsfähigkeit) von Pollen entscheidend oder wesentlich sind, dann kann ein Promotor für die Konstruktion eines Antisense-Gens verwendet werden, der in allen, vielen oder verschiedenen Zelllarten funktionsfähig ist, einschließlich in Geweben, die für die Pollenbildung oder -funktion(sfähigkeit) entscheidend oder wesentlich sind. Ein Beispiel für einen solchen konstitutiven Promotor ist CaMV 35S oder vorzugsweise HP 101, den wir wie weiter unten beschrieben aus Brassica napus isoliert und identifiziert haben. In dieser Art von Konstrukt kann der eingesetzte Promotor in konstitutiver Weise aktiv in allen oder vielen Zellarten sein, aber er beeinträchtigt ausschließlich die Entwicklung oder Funktionsfähigkeit) von Pollen, da Gewebe, die für die Bildung oder Funktionsfähigkeit von Pollen wesentlich oder entscheidend sind, die einzigen Zellen sind, die die in Rede stehende Sense-Gen-RNA produzieren. Wie weiter nachstehend diskutiert wird, ist es auch möglich, einen induzierbaren Promotor wie auch einen Pollen spezifischen Promotor einzusetzen.
  • Alternativ muss dann, wenn das Sense-Gen ein Gen ist, das für die Entwicklung oder Funktionsfähigkeit aller Zellen oder einer Vielzahl von Zellen einschließlich von Zellen, die für die Pollenbildung oder Funktionsfähigkeit entscheidend oder wesentlich sind, benötigt wird, der zur Expression des Antisense-Gens eingesetzte Promotor ein Promotor sein, der nur in Geweben aktiv ist, die für die Pollenbildung oder -funktion(sfähigkeit) wesentlich oder entscheidend sind.
  • Das Antisense-Gen ist eine DNA-Sequenz, die erzeugt wird, wenn das Sense-Gen im Verhältnis zu seiner normalen Anordnung für die Transkription umgedreht und strangabwärts eines Promotors eingesetzt wird. Das Antisense-Gen kann in einer Anzahl von verschiedenen Arten und Weisen konstruiert werden, vorausgesetzt, dass es in der Lage ist, in RNA umgeschrieben zu werden, die komplementär zu der vom Sense-Gen produzierten RNA ist und deren Translation blockieren kann. Es sollte klar sein, dass es zur Regulation der Expression eines Sense-Gens ausreichend ist, ein Antisense-Gen zu produzieren, das im Ganzen oder in wesentlichen Teilen komplementär zu dem Sense-Gen ist, das reguliert werden soll.
  • Das Antisense-Gen wird vorzugsweise dadurch konstruiert, dass der codierende Bereich des Sense-Gens relativ zu seiner normalen Präsentation für die Transkription umgedreht wird, damit es möglich wird, sein Komplement zu transkribieren, also die Komplementarität der von diesen DNA's codierten entsprechenden RNA's. Um die Produktion von durch das Sense-Gen erzeugter mRNA zu blockieren, muss der Zeitpunkt der Expression des Antisense-Gens derart passen, dass die Antisense-RNA zu derselben Zeit wie die mRNA aus dem fraglichen Sense-Gen vorhanden ist. Die zeitlich übereinstimmende Expression von Sense- und Antisense-Gen kann auf verschiedenen Wegen erreicht werden, indem Kombinationen von konstitutiven, induzierbaren und organ-spezifischen Promotoren verwendet werden; sie kann jedoch leicht dadurch erreicht werden, dass die Expression des Antisense-Gens mit demselben Promotor reguliert wird, der das Sense-Gen kontrolliert, was bewirkt, das beide im selben Zeitrahmen transkribiert werden. Das Konzept der Regulation von Genexpression unter Verwendung von Antisense-Genen ist bei Weintraub, H. et al., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews-Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986 beschrieben.
  • Dementsprechend können verschiedene Arten von Sense- und Antisense-Genen und Promotoren eingesetzt werden, um spezifische Ausführungsformen dieser Erfindung auszuführen. Diesbezüglich bestimmt das Gen, das Ziel der Inaktivierung ist, den Promotor, der zur Ausführung der Erfindung benötigt wird.
  • Dementsprechend kann ein Verfahren zum Erzeugen einer männlich sterilen Pflanze aus einer Pflanze bereitgestellt werden, die unter denjenigen Arten pollenproduzierender Pflanzen ausgewählt ist, die sich genetisch transformieren lassen, wird aber vorliegend nicht beansprucht, wobei das Verfahren umfasst:
    • (a) Identifizieren und Isolieren eines Sense-Gens, das für die Pollenbildung oder -funktion(sfähigkeit) in dieser Pflanze wesentlich ist, vorzugsweise aus der genannten pollenproduzierenden Pflanze;
    • (b) Insertieren eines Gens, umfassend:
    • (i) eine DNA-Sequenz, die für RNA codiert, welche zu der durch das genannte Sense-Gen codierten RNA-Sequenz komplementär ist;
    • (ii) einen Promotor, der in der genannten Pflanze funktionsfähig ist, wobei er die Transkription der genannten DNA-Sequenz in RNA zu der oder zu ungefähr derselben Zeit bewirkt, in der das genannte Sense-Gen transkribiert wird, und vorzugsweise
    • (iii) eine Terminator-Sequenz, die ein Terminations-Signal während der Transkription der genannten DNA-Sequenz definiert, in das Genom einer Pflanzenzelle der genannten Pflanze, aus der eine differenzierte ganze Pflanze regeneriert werden kann,
    • (c) Gewinnen einer transformierten Pflanzenzelle dieser Pflanze; und
    • (d) Regenerieren einer männlich sterilen, genetisch transformierten Pflanze aus der genannten transformierten Pflanzenzelle.
  • Da das in Rede stehende Sense-Gen anfänglich in seiner nativen Form isoliert würde, sollte klar sein, dass der Ausdruck "Sense-Gen" in der vorliegend benutzten Form sich auf einen oder mehrere Teile des Gens, einschließlich 5'-untranslatierter Führungs-Sequenzen, codierender Sequenzen, Promotor-Sequenzen, Intron-Sequenzen und untranskribierter 3'-Sequenzen, oder auf jedes beliebige substantielle Fragment dieser Sequenzen beziehen kann. Es kann wünschenswert sein, den Promotor in einem solchen Fall zu isolieren, in welchem derselbe Promotor verwendet wird, um das Antisense-Gen zu steuern.
  • Es sollte außerdem klar sein, dass es nicht wesentlich ist, das Sense-Gen de novo zu identifizieren und zu isolieren. Stattdessen kann das Sense-Gen auf beliebige Weise erhalten worden sein (beispielsweise: wie in der Literatur beschrieben oder kommerziell erhältlich).
  • Es ist möglich, dass die aus dem Antisense-Gen transkribierte RNA auch dann wirksam die Translation der vom Sense-Gen codierten RNA blockiert, wenn eine Terminator-Sequenz nicht von diesem rekombinanten DNA-Molekül, dass das Antisense-Gen enthält, codiert wird.
  • Es sollte klar sein, dass das rekombinante DNA-Molekül vorzugsweise ein Gen umfasst, das der Pflanzenzelle der genannten Pflanze Resistenz gegenüber einem chemischen Agens oder physiologischer Belastung verleiht, derart, dass die transformierten Pflanzenzellen leicht selektioniert werden können.
  • Gemäß dem voranstehenden Verfahren richtet sich die Erfindung auch auf eine Pflanzenzelle, die mit einem rekombinanten DNA-Molekül wie in Schritt (b) definiert transformiert wurde und die in der Lage ist, in eine männlich sterile Pflanze regeneriert zu werden.
  • Die Erfindung richtet sich auch auf die Verwendung der genannten männlich sterilen Pflanze bei einer Hybrid-Kreuzung.
  • Um hybrides Saatgut in kommerziellem Maßstab zu erzeugen, können verschiedene Verfahren zum Vermehren männlich steriler Pflanzen eingesetzt werden wie nachstehend diskutiert. Gemäß einem Schema kann das Antisense-Gen mit einem Gen verknüpft werden, das Resistenz gegenüber einem selektiven Agens verleiht. Nach diesem Schema ist es möglich, eine männlich sterile Linie durch Kreuzen der genetisch transformierten Pflanze (männlich steril) mit einer geeigneten nicht-transformierten männlich fertilen Pflanze zu erzeugen und das genannte selektive Agens dazu zu verwenden, unter Pflanzen, die aus dem Saatgut einer solchen Kreuzung gezüchtet wurden, auf Pflanzen, die das Antisense-Gen enthalten, zu selektionieren. Theoretisch könnte jedes beliebige wirksame selektive Agens, für das man ein Resistenz-Gen identifiziert hat, im Rahmen dieser Ausgestaltung der Erfindung eingesetzt werden, einschließlich Genen, die für die Resistenz gegenüber Herbiziden, Antibiotika, toxischen Elementen und Pflanzenkrankheiten codieren. Solch ein selektionierendes Agens könnte man als in zwei breite, sich wechselseitig nicht ausschließende Kategorien fallend definieren, nämlich ein chemisches Agens und physiologische Belastung oder physiologischen Stress. Ein chemisches Agens, beispielsweise ein Herbizid, könnte zur Erzeugung männlich steriler Pflanzen in handelsüblichem Maßstab verwendet werden. Beispiele für Herbizide, für die ein Resistenz-Gen identifiziert wurde, sind Glyphosat (beschrieben in Comai, L., Facciotti, D., Hiatt, W. R., Thompson, G., Rose, R. E., Stalker, D. M., 1985, Nature, Band 317, Seiten 741–744), Chlorsulfuron (beschrieben in Haughn, G. W., und Somerville, C. R., 1986, Mol. Gen. Genet., Band 210, Seiten 430–434) und Phosphinotricin (Murakami T., el. al., Mol Gen. Genet. 205: 42–50, 1986).
  • Gemäß einem anderen Schema kann die Anzahl der männlich sterilen Pflanzen durch klonale Vermehrung unter Verwendung von Gewebeausschnitten oder durch andere in vitro erfolgende Propagations-Techniken vermehrt werden.
  • Andere Schemata sollten für Fachleute offensichtlich sein. Deshalb sollte klar sein, dass die Ausführungsformen verschiedener hier definierter Ausgestaltungen der Erfindung unter Einsatz einer beliebigen unter einer Mehrzahl solcher Methoden durchgeführt werden können.
  • Demzufolge kann ein Verfahren zum Erzeugen von hybridem Saatgut aus Pflanzen, die unter denjenigen Arten pollenproduzierender Pflanzen ausgewählt wurden, die genetisch transformierbar sind, bereitgestellt werden, wird vorliegend aber nicht beansprucht, umfassend die folgenden Schritte:
    • (a) Erzeugen einer genetisch transformierten Pflanze, die männlich steril ist, durch:
    • (i) Identifizieren und Isolieren eines Sense-Gens, das für die Pollenbildung oder -funktion(sfähigkeit) in dieser Pflanze wesentlich ist, vorzugsweise aus der genannten pollenproduzierenden Pflanze;
    • (ii) Insertieren eines Gens, das der Pflanze Resistenz gegenüber einem chemischen Agens oder physiologischer Belastung verleiht, und verknüpft mit diesem Gen eines Gens, umfassend:
    • (A) eine DNA-Sequenz, die für RNA codiert, welche zu der durch das genannte Sense-Gen codierten RNA-Sequenz komplementär ist;
    • (B) einen Promotor, der in der genannten Pflanzenzelle funktionsfähig ist, wobei er die Transkription der genannten DNA-Sequenz in RNA zu ungefähr derselben Zeit bewirkt, in der die durch das genannte Sense-Gen codierte RNA transkribiert wird; und vorzugsweise
    • (C) eine Terminator-Sequenz, die ein Terminations-Signal für die Transkription der genannten DNA-Sequenz definiert; in das Genom einer Pflanzenzelle der genannten Pflanze, aus der eine differenzierte ganze Pflanze regeneriert werden kann;
    • (iii) Gewinnen einer transformierten Pflanzenzelle aus dieser Pflanze; und
    • (iv) Regenerieren einer mit den in Schritt (a) ii) oben beschriebenen Genen genetisch transformierten Pflanze aus der genannten transformierten Pflanzenzelle; und
    • (b) Vergrößern der Anzahl genetisch transformierter Pflanzen durch:
    • (i) klonales Vermehren unter Verwendung von Gewebeausschnitten daraus oder anderen in vitro erfolgenden Propagations-Techniken; oder
    • (ii)
    • A) Kreuzen der in Schritt (a) iv) oben beschriebenen genetisch transformierten Pflanze mit einer geeigneten männlich fertilen Pflanze;
    • B) Verwenden desselben chemischen Agens' oder derselben physiologischen Belastung zur Beseitigung von Pflanzen, die die oben in Stufe (a) ii) beschriebenen Gene nicht enthalten, unter Pflanzen, die aus den durch eine solche Kreuzung erzeugten Samen gezogen wurden; und
    • C) Wiederholen einer solchen Kreuzung mit den wie in Schritt (b) ii) oben erhaltenen Pflanzen in Gegenwart des genannten chemischen Agens' oder dieser physiologischer Belastung über mehrere Generationen hinweg, um die Anzahl der männlich sterilen Pflanzen zu erhöhen;
    • c) Bewirken einer Hybrid-Kreuzung durch Bestäuben der genannten männlich sterilen Pflanzen mit Pollen von geeigneten männlich fertilen Pflanzen.
  • Durch das voranstehende Verfahren erzeugtes Saatgut kann wegen der eine Aufspaltung (Segregation) der männliche Sterilität verursachenden rekombinanten DNA eine Mischung aus sterilen hybriden Samen und fertilen hybriden Samen enthalten. Bei fremd- oder auskreuzenden Spezies erlauben die vorhandenen fertilen Pflanzen eine vollständige Bestäubung der männlich sterilen Hybride.
  • Es sollte klar sein, dass die Eignung für den Zweck der Erzeugung von hybridem Saatgut durch Standard-Kreuzen verschiedener Linien unter nachfolgender Analyse der Nachkommen und Selektion einer Linie mit überlegenen Kombinationsfähigkeiten und gewünschten agronomischen Merkmalen bestimmt wird. Die Eignung einer männlich fertilen Pflanze zum Zwecke des Kreuzens mit einer männlich sterilen Pflanze zum Vergrößern der Anzahl an männlichen Sterilen bedeutet den Einsatz einer Pflanze der gleichen Zuchtlinie, aus der die männlich sterile Pflanze stammt, ohne auf deren Verwendung beschränkt zu sein. In manchen Fällen, auf die weiter unten Bezug genommen wird, kann die Weiterführung der männlich sterilen Linie einfach durch Selbstbestäubung in Isolation erzeugt werden.
  • Gemäß dem voranstehenden Verfahren ist die Erfindung außerdem auf eine Pflanzenzelle, die mit wie in Schritt (a) ii) oben definierten Genen transformiert wurde und aus der eine männlich sterile Pflanze regeneriert werden kann, sowie auf Pflanzen und hybride Saaten gerichtet, die die in (a) ii) oben definierten Gene enthalten.
  • In einer Anordnung zur Erzeugung von hybridem Saatgut, in der sich Reihen männlich steriler Pflanzen und männlich fertiler Pflanzen abwechseln, kann es einfacher sein, obwohl es nicht entscheidend ist, die abschließende Selektion der männlich sterilen Pflanzen im Feld entlang der männlich fertilen Donorpflanzen vorzunehmen. Deshalb ist es wünschenswert, dass die geeigneten männlich fertilen Donorpflanzen zuvor so transformiert wurden, dass sie gegenüber dem selektiven Agens resistent sind, um zu vermeiden, dass das genannte Agens selektiv auf die Reihen der männlich sterilen Pflanzen aufgebracht werden muss. Schritt (c) könnte man daher ausführen, indem man Samen, die aus einer Kreuzung zwischen den selektionierten genetisch transformierten Pflanzen und geeigneten männlichen fertilen Donorpflanzen erzeugt wurden, neben Samen von geeigneten männlich fertilen Donorpflanzen heranzieht, die zuvor gegenüber dem genannten chemischen Agens oder der physiologischen Belastung (dem selektionierenden Agens) resistent gemacht worden sind.
  • Wenn das Sense-Gen, das identifiziert und isoliert wurde, Sequenzen aufweist, die transkribiert, aber nicht translatiert werden, ist es möglich, hybrides Saatgut mit wiederhergestellter Fertilität zu erzeugen, indem das Sense-Gen unter Verwendung eines Antisense-Gens für diese Sequenzen inaktiviert wird, um männlich sterile Pflanzen zu erzeugen, und die Funktion des Sense-Gens in einer Erneuerungslinie wieder hergestellt wird. Die Erneuerungslinie würde Pflanzen umfassen, die genetisch mit einer modifizierten Form des Sense-Gens transformiert wurden, das die Bereiche, die komplementär zu dem Antisense-Gen sind, nicht enthält und daher nicht der Antisense-Regulation unterliegt.
  • Die genannte transkribierte, aber untranslatierte Sequenz kann eine untranslatierte 5'-Leader-Sequenz, zwischenliegende Sequenzen und eine untranslatierte 3'-Sequenz oder ein beliebiges substantielles Fragment dieser Sequenzen umfassen. Es sollte klar sein, dass diese Sequenzen oder Fragmente davon natürlich auftreten können oder künstlich eingeführt werden können.
  • Demzufolge kann ein Verfahren zum Erzeugen einer männlich sterilen Pflanze aus Pflanzen, die unter denjenigen Pollen produzierender Pflanzen ausgewählt sind, die genetisch transformierbar sind, bereit gestellt werden, wird jedoch hier nicht beansprucht, umfassend die Schritte:
    • (a) Erzeugen einer männlich sterilen Pflanze durch:
    • (i) Identifizieren und Isolieren eines Sense-Gens, das eine codierende Sequenz, die für die Pollenbildung oder -funktion(sfähigkeit) wesentlich oder entscheidend ist, und eine transkribierte, jedoch untranslatierte Sequenz umfasst, vorzugsweise aus der genannten pollenproduzierenden Pflanze;
    • (ii) Insertieren eines Gens, das der Pflanze Resistenz gegenüber einem chemischen Agens oder einer natürlich auftretenden oder künstlich induzierten physiologischen Belastung verleiht, und verknüpft mit diesem eines rekombinanten DNA-Moleküls, umfassend:
    • (A) eine DNA-Sequenz, die komplementär zu der genannten transkribierten, aber untranslatierten Sequenz ist;
    • (B) einen Promotor, der in der genannten Pflanze funktionsfähig ist, wobei er die Transkription der DNA-Sequenz in RNA während oder ungefähr während der Zeit bewirkt, in der das Sense-Gen in sich entwickelnden Pollen transkribiert wird; und vorzugsweise
    • (C) eine Terminator-Sequenz, die ein Terminations-Signal für die Transkription der genannten DNA-Sequenz definiert; in das Genom einer Pflanzenzelle der genannten Pflanze, aus der eine differenzierte ganze Pflanze regeneriert werden kann;
    • (iii) Gewinnen einer transformierten Pflanzenzelle dieser Pflanze; und
    • (iv) Regenerieren einer Pflanze aus der genannten transformierten Pflanzenzelle, die mit den (a) (ii) oben beschriebenen DNA-Sequenzen genetisch transformiert wurde und die männlich steril ist.
  • Demzufolge kann ein Verfahren zum Erzeugen von hybridem Saatgut mit wiederhergestellter Befruchtungsfähigkeit aus Pflanzen, die unter denjenigen Arten Pollen produzierender Pflanzen ausgewählt sind, die genetisch transformierbar sind, bereit gestellt werden, wird hier jedoch nicht beansprucht, umfassend die Schritte:
    • (a) Erzeugen einer männlich sterilen Pflanze durch:
    • (i) Identifizieren und Isolieren eines Sense-Gens, das eine codierende Sequenz, die für die Pollenbildung oder -funktion(sfähigkeit) entscheidend ist, und eine transkribierte, jedoch untranslatierte Sequenz umfasst, vorzugsweise aus der genannten pollenproduzierenden Pflanze;
    • (ii) Insertieren eines Gens, das der Pflanze Resistenz gegenüber einem chemischen Agens oder einer natürlich auftretenden oder künstlich induzierten physiologischen Belastung verleiht, und verknüpft mit diesem eines rekombinanten DNA-Moleküls, umfassend:
    • (A) eine DNA-Sequenz, die komplementär zu der genannten transkribierten, aber untranslatierten Sequenz ist;
    • (B) einen Promotor, der in der genannten Pflanze funktionsfähig ist, wobei er die Transkription der DNA-Sequenz in RNA während oder ungefähr während der Zeit bewirkt, in der das Sense-Gen in sich entwickelnden Rollen transkribiert wird; und vorzugsweise
    • (C) eine Terminator-Sequenz, die ein Terminations-Signal für die Transkription der genannten DNA-Sequenz definiert; in das Genom einer Pflanzenzelle der genannten Pflanze, aus der eine differenzierte ganze Pflanze regeneriert werden kann;
    • (iii) Gewinnen einer transformierten Pflanzenzelle dieser Pflanze; und
    • (iv) Regenerieren einer Pflanze aus der genannten transformierten Pflanzenzelle, die mit den (a) (ii) oben beschriebenen DNA-Sequenzen genetisch transformiert wurde und die männlich steril ist; und
    • (b) Vergrößern der Anzahl genetisch transformierter, männlich steriler Pflanzen durch:
    • (i) klonales Vermehren der genannten, in Schritt (a) beschriebenen, genetisch transformierten männlich sterilen Pflanze unter Verwendung von Gewebsausschnitten davon, oder mit Hilfe anderer in vitro erfolgender Propagations-Techniken; oder
    • (ii) Kreuzen der genannten genetisch transformierten männlich sterilen Pflanze mit einer geeigneten männlich fertilen Pflanze;
    • (iii) Verwenden des chemischen Agens' oder der physiologischen Belastung zur Eliminierung von Pflanzen, die die in (a) (ii) definierte DNA-Sequenz nicht enthalten, unter Pflanzen, die aus dem durch eine solche Kreuzung gewonnenen Saatgut gezüchtet wurden; und
    • (iv) Wiederholen einer solchen Kreuzung über mehrere Generationen hinweg mit den wie in Schritt (b) (iii) oben gewonnen Pflanzen in Gegenwart des genannten chemischen Agens' oder der physiologischen Belastung, um die Anzahl der männlich sterilen Pflanzen zu erhöhen;
    • (c) Erzeugen einer männlich fertilen Wiederherstellungs-Pflanze durch:
    • (i) Insertieren eines Gens, das Resistenz gegenüber einem chemischen Agens oder einer natürlich auftretenden oder artifiziell induzierten physiologischen Belastung verleiht, verknüpft mit einer rekombinanten DNA-Sequenz, umfassend:
    • (A) ein rekombinantes DNA-Molekül, das eine modifizierte Form des genannten Sense-Gens aufweist, die diejenigen Regionen, die komplementär zum genannten Antisense-Gen sind, nicht enthält;
    • (B) einen Promotor, der in der genannten Pflanze derart funktionsfähig ist, dass er die Transkription der genannten modifizierten DNA-Sequenz zu einer Zeit bewirkt, die die Funktion des Sense-Gens wieder herstellt, vorzugsweise zu der oder ungefähr zu der Zeit, in der das Antisense-Gen aktiv ist; und vorzugsweise
    • (C) eine Terminator-Sequenz, die ein Terminations-Signal für die Transkription der genannten DNA-Sequenz definiert; in das Genom einer Pflanzenzelle einer geeigneten männlichen Elternpflanze, aus der eine differenzierte ganze Pflanze regeneriert werden kann;
    • (d) Vergrößern der Anzahl genetisch transformierter Pflanzen durch Auswahl einer Pflanze, die für das genannte Wiederherstellungs-Merkmal homozygot ist, und Selbstbestäubung in Isolation;
    • (e) Bewirken einer Hybrid-Kreuzung durch Bestäuben der genannten männlich sterilen Pflanzen mit Pollen aus den genannten, männlich fertilen Wiederherstellungs-Pflanzen.
  • Die Selektion auf eine Pflanze, die homozygot für das genannte Wiederherstellungs-Merkmal ist, kann durchgeführt werden, indem man eine Staubgefäß-Zellkultur oder eine Kultur isolierter Mikrosporen der genetisch transformierten, das Wiederherstellungs-Merkmal tragenden Pflanze durchführt oder vorzugsweise, indem man diese Pflanze vor der Selektion in Isolation selbst bestäubt.
  • Es ist besonders wünschenswert, die Fertilität wie oben diskutiert wieder herzustellen, wenn die ins Auge gefasste Pflanzenart oder -sorte nicht fremd- oder auskreuzt. Wenn die ins Auge gefasste Pflanzenspezies fremdkreuzt, ist es bevorzugt, aber nicht notwendig, eine Wiederherstellungs-Linie wie in den Schritten (c) und (d) oben beschrieben zu erzeugen. Das Kreuzen mit einer geeigneten männlich fertilen Pflanze führt zu einem hybriden Saatgut, das wegen der Segregation der männliche Sterilität verursachenden, rekombinanten DNA eine Mischung aus sterilen hybriden Samen und fertilen hybriden Samen umfasst. Die fertilen Pflanzen, die vorhanden sind, ermöglichen eine vollständige Bestäubung der männlich sterilen Hybride.
  • Die Expression des Wiederherstellungs-Gens kann durch einen beliebigen Promotor angeschaltet werden, der eine Transkription während der Zeit erlaubt, in der die Entwicklung des Pollens ansonsten unterbrochen oder gestört würde. Es ist bevorzugt, dass das Wiederherstellungs-Gen von demselben Promotor, der zum Anschalten des Antisense-Gens eingesetzt wird, oder von einem beliebigen Promotor angetrieben wird, der in Geweben hochaktiv ist, die für die Pollenbildung oder -funktion(sfähigkeit) entscheidend sind.
  • Gemäß dem voranstehenden Verfahren ist es auch möglich, Folgendes bereit zu stellen:
    • (i) eine Pflanzenzelle, die mit einem in den Schritten (a) (ii) oder (c) (i) des oben beschriebenen rekombinanten DNA-Molekül transformiert wurde und in der Lage ist, sich zu einer Pflanze zu entwickeln, die das männlich sterile Merkmal trägt;
    • (ii) eine Pflanze, die mit einem in den Schritten (a) (ii) oder (c) (i) oben beschriebenen rekombinanten DNA-Molekül transformiert wurde; und
    • (ii) hybrides Saatgut, das mit einem in den Schritten (a) (ii) und (c) (i) oben beschriebenen rekombinanten DNA-Molekül transformiert wurde.
  • Weiterhin ist es möglich, hier jedoch nicht beansprucht, die Expression der codierenden Region des Antisense-Gens durch Verwenden eines induzierbaren Promotors zu regulieren. Nach diesem Schema kann der Promotor während der gesamten Pollenbildung oder mindestens für einen Zeitraum, der den Zeitraum der Transkription des Sense-Gens überspannt, in einem induzierten Zustand belassen bleiben. Ein Promotor, der durch ein einfaches chemisches Agens induzierbar ist, ist besonders geeignet, da die männlich sterile Pflanze leicht durch Selbstbestäubung weitergeführt werden kann, wenn sie in Abwesenheit dieses chemischen Agens gezüchtet wird. Die Wiederherstellung ist durch Vererbung vorhanden, wenn Pflanzen aus hybridem Saatgut in Abwesenheit dieses Induktionsmittels gezüchtet werden.
  • Demzufolge ist es möglich, hier jedoch nicht beansprucht, ein Verfahren zum Erzeugen von hybridem Saatgut mit wiederhergestellter Fertilität aus Pflanzen bereit zu stellen, die unter denjenigen Arten Pollen produzierender Pflanzen ausgewählt wurden, die genetisch transformierbar sind, umfassend die Schritte:
    • (a) Erzeugen einer genetisch transformierten Pflanze, die das Merkmal der männlichen Sterilität trägt, durch
    • i) Identifizieren und Isolieren eines Sense-Gens, das für die Pollenbildung oder -funktionsfähigkeit in dieser Pflanze wesentlich ist, vorzugsweise aus der genannten pollenproduzierenden Pflanze;
    • ii) Insertieren eines rekombinanten DNA-Moleküls, umfassend:
    • (A) ein Antisense-Gen, das für RNA codiert, die ganz oder teilweise zu der durch das Sense-Gen codierten RNA-Sequenz komplementär ist;
    • (B) einen induzierbaren Promotor, der in der genannten Pflanzenzelle funktionsfähig ist, wobei er die Transkription der genannten DNA-Sequenz in RNA zu der Zeit bewirkt, zu der das Sense-Gen oder die codierende Sequenz transkribiert wird; und vorzugsweise
    • (C) eine Terminator-Sequenz, die ein Terminations-Signal für die Transkription der genannten DNA-Sequenz definiert, in das Genom einer Pflanzenzelle der genannten Pflanze, aus der eine differenzierte ganze Pflanze regeneriert werden kann;
    • iii) Gewinnen einer transformierten Pflanzenzelle dieser Pflanze; und
    • iv) Regenerieren einer Pflanze aus der genannten transformierten Pflanzenzelle, die mit dem oben unter (ii) beschriebenen DNA-Molekül genetisch transformiert ist und die durch das genannte Induktionsmittel männlich steril gemacht werden kann;
    • (b) Vergrößern der Anzahl genetisch transformierter Pflanzen durch:
    • (i) klonale Vermehrung der in Schritt (a) beschriebenen genetisch transformierten Pflanze unter Verwendung von Gewebeausschnitten daraus, oder andere in vitro erfolgende Propagations-Techniken; oder
    • (ii) Selbstbestäubung der genetisch transformierten Pflanze, die das in (a) beschriebene induzierbare männlich sterile Merkmal trägt, Auswählen einer Pflanze, die für das induzierbare männlich sterile Merkmal homozygot ist, und Vermehren dieser Pflanze durch Selbstbestäubung in Isolation über eine Anzahl von Generationen hinweg in Abwesenheit des Induktionsmittels, um die Anzahl genetisch transformierter Pflanzen zu steigern;
    • (c) Bewirken einer Hybrid-Kreuzung zwischen den genannten genetisch transformierten Pflanzen, die in Gegenwart des genannten Induktionsmittels gezogen wurden, und geeigneten männlich fertilen Pflanzen.
  • Gemäß Schritt (a) des voranstehenden Verfahrens kann ein Verfahren zum Erzeugen einer Pflanze bereitgestellt werden, die das männlich sterile Merkmal trägt.
  • Gemäß dem voranstehenden Verfahren kann auch eine Pflanzenzelle bereit gestellt werden, die mit einem rekombinanten DNA-Molekül transformiert wurde, das der oben in Schritt (a) (ii) gegebenen Definition entspricht, wobei die Pflanzenzelle in einer Pflanze regeneriert werden kann, die das männlich sterile Merkmal trägt.
  • Gemäß dem voranstehenden Verfahren ist es auch möglich, eine Pflanze bereitzustellen, die ein rekombinantes DNA-Molekül aufweist, umfassend:
    • (a) eine DNA-Sequenz, die für RNA codiert, die komplementär zu derjenigen RNA-Sequenz ist, welche durch ein Sense-Gen codiert wird, das für die Pollenbildung oder -funktion(sfähigkeit) in dieser Pflanze wesentlich oder entscheidend ist;
    • (b) einen induzierbaren Promotor, der in der genannten Pflanze funktionsfähig ist, wobei er die Transkription der genannten DNA-Sequenz in RNA während des Zeitraums bewirkt, in der das genannte Gen transkribiert wird; und
    • (c) eine Terminator-Sequenz, die ein Terminations-Signal für die Transkription der genannten DNA-Sequenz definiert.
  • Gemäß den voranstehenden Verfahren ist es auch möglich, hybrides Saatgut bereitzustellen, das ein rekombinantes DNA-Molekül enthält, umfassend:
    • (a) Eine DNA-Sequenz, die für RNA codiert, die komplementär zu derjenigen RNA-Sequenz ist, welche durch ein Sense-Gen codiert wird, das für die Pollenbildung oder -funktion(sfähigkeit) in einer aus diesem Saatgut gewachsenen Pflanze entscheidend ist;
    • (b) einen induzierbaren Promotor, der in der genannten Pflanze funktionsfähig ist, wobei er die Transkription der genannten DNA-Sequenz in RNA während des Zeitraums bewirkt, in der das genannte Gen transkribiert wird; und
    • (c) eine Terminator-Sequenz, die ein Terminations-Signal für die Transkription der genannten DNA-Sequenz definiert.
  • Gemäß einer Ausgestaltung der Erfindung wie beansprucht stellen wir codierende DNA-Sequenzen bereit, isoliert aus einer Pflanze der Art bzw. Sorte Brassica napus ssp oleifera w Westar, die nur in Mikrosporen exprimiert werden und deren Expression für die Entwicklung von Mikrosporen entscheidend ist. Eine schematische Darstellung der Restriktionskarten und der codierenden Bereiche von mikrosporenspezifischen Genen, die mit L4, L10, L16 und L19 bezeichnet werden, sind vorliegend dargestellt. Die vollständige Nukleotid-Sequenz der Klone L4 und relevanter Sequenzen von L10, L16 und L19 werden hier ebenfalls vorgestellt. Die Nukleotid-Sequenzen isolierter cDNA-Klone, die den Genen oder verwandten Gen-Familienmitgliedern innerhalb der Klone L4, L10 und L19 entsprechen, werden hier ebenfalls vorgestellt.
  • Es ist davon auszugehen, dass DNA-Sequenzen, die mit den hier beschriebenen identisch oder zu ihnen homolog sind, in den Pollen anderer Spezies von pollentragenden Pflanzen, insbesondere von Pflanzenarten innerhalb des Geschlechts Brassica und der Familie Cruciferae (auch bekannt als Brassicaceae) und ganz besonders anderen Kulturvarietäten von Brassica napus gefunden werden können und ausschließlich darin exprimiert werden.
  • Das Vorkommen dieser Sequenz in anderen Arten pollentragender Pflanzen kann mit Hilfe bekannter Hybridisierungstechniken routinemäßig festgestellt werden. Es ist anzunehmen, dass es die Ähnlichkeit von Pflanzengenen zwischen den Sorten oder Arten untereinander möglich macht, dass die voranstehenden Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung unter Verwendung des genannten DNA-Fragments in einer beliebigen Anzahl Pollen tragender Pflanzensorten oder -arten, die genetisch transformierbar sind, ausgeführt werden können. Die Universalität von Pflanzengenen ist in der Literatur in großem Umfang dokumentiert worden, und homologe Pflanzengene wurden für Pflanzen-Actine (Shah, D. M. et. al., J. Mol. Appl. Genet. 2: 111–126, 1983), Phytochrom (Hershey, H. P. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 2332–2337, 1984), Speicherproteine (Singh, H. K. et. al., Plant Mol. Biol. 11: 633–639, 1988), Enzyme wie Glutamin-Synthase (Lightfoot, D. A. et. al., Plant Mol. Biol. 11: 191–202, 1988, und darin genannte Referenzen) und Nitrat-Reductase (Cheng, C. et. al., EMBO Jour. 7: 3309–3314) beschrieben. Diese und andere Beispiele aus der Literatur zeigen deutlich, dass viele Pflanzengene in hohem Maße konserviert sind. Außerdem ist klar, dass diese Konservierung nicht nur auf strukturelle Proteine zutrifft, sondern auch auf enzymatische Proteine, die für die zelluläre Physiologie wichtig sind. Deshalb ist anzunehmen, dass das genannte DNA-Fragment, wenn es in einer anderen Pflanzenart gefunden wird, für die Entwicklung der Mikrosporen wesentlich oder entscheidend ist und dass man es dazu verwenden kann, die vorliegende Erfindungen in solchen Arten oder Sorten auszuführen.
  • Es konnte auch gezeigt werden, dass Antisense-RNA-Sequenzen, die von einer Pflanzenart oder -sorte stammen, wirksam die Expression von homologen DNA-Sequenzen in einer anderen Art oder Sorte inhibieren können (Van der Krol et. al., 1988, Nature 333: 866–869). Deshalb ist zu erwarten, dass Antisense-RNA, die insgesamt oder teilweise aus Pollen spezifischen DNA-Sequenzen von Brassica stammt, in anderen Pflanzen funktionsfähig sein wird.
  • Darüber hinaus sollte klar sein, dass eine beliebige Anzahl unterschiedlicher Gene, die für die Mikrosporenentwicklung oder für ausschließlich bei der Mikrosporenentwicklung benötigte und hierfür wesentliche Gewebe unverzichtbar sind, gemäß den voranstehend beschriebenen Verfahren isoliert und eingesetzt werden könnten.
  • Gemäß einer Ausführungsform in einer anderen Ausgestaltung der Erfindung stellen wir pollenspezifische Promotor-Sequenzen und Transformations-Vektoren, die diese Sequenzen wie hier vorgestellt enthalten, bereit. Diese Sequenzen können eingesetzt werden, um die Expression einer beliebigen DNA-Sequenz auf Pollengewebe und auf einen Zeitraum während der Pollenbildung zu beschränken, und deshalb sind sie als Bestandteil des rekombinanten DNA-Moleküls wie in Anspruch 1 beansprucht hilfreich. Der pollenspezifische Promotor kann verwendet werden, um die Expression der in seiner Nachbarschaft befindlichen DNA-Sequenzen sowohl in der Solanacae- als auch in der Cruciferae-Familie auf Pollengewebe zu beschränken, wie es in den spezifischen Beispielen dargestellt ist, und es besteht die feste Überzeugung, dass diese DNA-Fragmente oder funktionelle Fragmente davon in einer Vielzahl wenn nicht in allen Pollen tragenden Pflanzenarten oder -sorten, die genetisch transformiert werden können, als pollenspezifische Promotoren funktionsfähig sind.
  • Diese pollenspezifischen Promotoren können in Kombination mit hier beschriebenen natürlich auftretenden flankierenden codierenden oder transkribierten Sequenzen oder mit jeder beliebigen anderen codierenden Sequenz verwendet werden, die für die Pollenbildung oder -funktion(sfähigkeit) wesentlich ist, um die voranstehenden Aspekte und Ausführungsformen dieser Erfindung auszuführen.
  • Es ist festzustellen, dass der Grad der DNA-Sequenzhomologie zwischen den nativen pollenspezifischen Promotoren aus den L4-, L10- und L19-Klonen nicht hoch ist. Test-Daten haben ergeben, dass der Zeitpunkt und das Ausmaß der Expression dieser Gene in den Pollen nicht identisch ist, aber dass sie bezüglich ihrer Aktivität zu einem bestimmten Zeitpunkt alle überlappen. Dies zeigt auf, dass es in Brassica napus voneinander abweichende Gen-Sequenzen gibt, die jedoch alle als pollenspezifische Promotoren fungieren.
  • Es ist zu erwarten, dass man eine beliebige Anzahl von unterschiedlichen pollenspezifischen Promotoren verwenden kann, um die voranstehend erwähnten Ausgestaltungen dieser Erfindung sowie weitere Ausgestaltungen der Erfindung, die nachstehend diskutiert werden sollen, auszuführen. Es ist oft schwierig, a priori zu bestimmen, welcher pollenspezifische Promotor verwendet werden könnte, um ein Gen zu inhibieren, das für die Pollenentwicklung oder dessen zelluläre Funktion und Entwicklung wesentlich oder entscheidend ist, aber bestimmte Bedingungen müssen eingehalten werden.
  • Der eingesetzte pollenspezifische Promotor sollte ein Promotor oder eine Abwandlung des Promotors sein, der während des geeigneten Zeitraums aktiv ist, um ausreichende Mengen an transkribierter RNA zu produzieren, damit die Erfindung ausgeführt werden kann. Pollenspezifische Promotoren, die aus pollenspezifischen Klonen stammen, werden vorliegend offenbart, und diese sind in einem frühen Stadium bei der Entwicklung von Mikrosporen aktiv, so dass eine Gen-Expression sowohl während als auch nach der meiotischen als auch der mitotischen Teilung von Pollenmutterzellen stattfindet. Die Aktivität dieser Promotoren wird daher durch Segregation (biologische Aufspaltung) nicht beschränkt.
  • Es ist anzumerken, das die Identifizierung einer Promotor-Region üblicherweise eher durch die Funktion als durch eine gegebene DNA-Sequenz definiert wird. Gerade einmal 200 Basen oder noch weniger können eine ausreichende DNA-Sequenz sein, die immer noch die Promotor-Funktion besitzt. Es sollte auch wahrgenommen werden, das manche strangaufwärts gelegene DNA-Sequenzen in umgekehrter Orientierung angeordnet werden können und immer noch eine beschleunigte Promotor-Funktion beibehalten oder zeigen. Darüber hinaus können auch "verstärkerartige" DNA-Sequenzen, bei denen es sich üblicherweise um kleine, konservierte DNA-Sequenzen in einem Größenbereich von unter 10 Nukleotiden bis zu deutlich größeren Nukleotidzahlen handelt, in Promotor-Regionen eingesetzt werden, um die Expression zu verstärken.
  • Es kann auch wünschenswert sein, die eine oder andere Intron-Sequenz in die Promotor-Konstrukte einzuarbeiten, weil gezeigt werden konnte, dass der Einschluss von Intron-Sequenzen in den codierenden Bereich zu einer verstärkten Expression und Spezifität führen kann. Daher kann es vorteilhaft sein, die zu exprimierenden DNA-Fragmente an ein Promotor-Fragment zu koppeln, das die ersten Intron- und Exon-Sequenzen eines pollenspezifischen Gens enthält.
  • Zusätzlich können Bereich eines (bestimmten) Promotors mit Bereichen eines anderen Promotors verknüpft werden, um die gewünschte Promotor-Aktivität zu erhalten. Spezifische Beispiele für chimäre Promotor-Konstrukte werden offenbart, die eingesetzt werden können, um Ausgestaltungen dieser Erfindung auszuführen.
  • In Ausführungsformen der Beschreibung, die hier nicht beansprucht sind, könnte der pollenspezifische Promotor auch die Funktion besitzen, ausreichende Mengen an Antisense-RNA zu produzieren, so dass die Mengen an Sense-Genprodukt verringert werden. Untersuchungen des Mechanismus' einer Antisense-RNA-Inhibierung der Gen-Expression in Modellsystemen haben es nahegelegt, dass gleiche oder mehr als gleiche Mengen Antisense-RNA nötig sein können, um eine bemerkenswerte Verringerung der Sense-Gen-Aktivität zu beobachten. In manchen Fällen kann man jedoch beobachten, dass bereits geringe Mengen an Antisense-RNA eine spezifische Verringerung der Aktivität des Sense-Gens bewirken. Deshalb kann es manchmal der Fall sein, dass dann, wenn das Gen, das das Ziel der Inaktivierung durch Antisense-RNA bildet, ein so genanntes "housekeeping"-Gen oder ein Gen ist, das in allen Zellarten in geringer Menge exprimiert wird, ein Überschuss an Antisense-RNA für die Inhibierung nicht nötig ist. Darüber hinaus kann weniger als die vollständige Reduktion der Genaktivität mehr als ausreichend sein, um die Pollenentwicklung zu unterbrechen, die als sehr empfindlich gegenüber vielen belastenden Bedingungen bekannt ist. Deshalb wird vorgeschlagen, dass der einzusetzende pollenspezifische Promotor basierend auf der Beobachtung ausgewählt wird, dass der pollenspezifische Promotor die Funktion besitzt, die Expression beliebiger, ihm benachbarter Sequenzen zu bewirken, die zu einer Zeit transkribiert werden sollen, die parallel zu dem Zeitabschnitt verläuft oder mit ihm überlappt, zu dem das zu inaktivierende Sense-Gen exprimiert wird, und dass die Mengen an durch das Antisense-Gen exprimierter Antisense-RNA ausreichend sein sollten, um die Expression des Sense-Gens zu inhibieren, was üblicherweise bedeutet, dass sie größer als oder gleich groß wie die Mengen an Sense-RNA sein sollten.
  • Es ist auch verständlich, dass die erfolgreiche Transformation und Gewinnung einer Pflanze, die diese rekombinanten Sequenzen enthält, nicht immer zu einer angemessenen pollenspezifischen Expression führt. Das Transformationsverfahren führt zu einer ungeordneten Insertion fremder DNA, so dass so genannte Positionseffekte überwiegen und die Aktivität gegebenenfalls eingeführter DNA unterdrücken können. Es ist daher ratsam, eine Anzahl individuell transformierter Pflanzen mit einem beliebigen rekombinanten Konstrukt zu generieren, um Individuen zu gewinnen, die frei von möglicherweise vorhandenen beschränkenden Positionseffekten sind. Es kann auch bevorzugt sein, auf Pflanzen zu selektionieren, die mehr als eine Kopie des eingeführten Antisense-Genkonstrukts besitzen, so dass hohe Expressionsraten erhalten werden.
  • Die Festlegung des wahrscheinlichsten Entwicklungsstadiums, in dem das Sense-Gen ein Ziel für die Inaktivierung bildet, kann dadurch erfolgen, dass eine Zeit im Entwicklungsmuster der Pollenbildung gewählt wird, zu der das Sense-Gen maximal exprimiert wird, und dass ein pollenspezifischer Promotor verwendet wird, der ein ähnliches Entwicklungsmuster zeigt.
  • Wir diskutieren nun weitere Ausgestaltungen des Antisense-Gen-Verfahrens, das einen pollenspezifischen Promotor benötigt.
  • Wenn ein pollenspezifischer Promotor für die Regulation der Expression des Antisense-Gens eingesetzt wird, kann in jeder beliebigen Pflanzen in die normale Mikrosporen-Bildung eingegriffen werden, ohne dass zuerst ein Gen aus der genomischen DNA dieser Pflanze isoliert werden muss, das für ein entwicklungsreguliertes Protein codiert, welches für die Mikrosporen-Entwicklung wesentlich oder entscheidend ist. Wir beschreiben nun ein Verfahren zum Erzeugen einer männlich sterilen Pflanze, bei dem das Sense-Gen, auf dessen Inaktivierung gezielt wird, ein Gen ist, das für die zelluläre Funktion oder Entwicklung wesentlich oder entscheidend ist und das in metabolisch kompetenten Zelltypen exprimiert wird. Um eine männlich sterile Pflanze zu erzeugen, wird ein solches Gen spezifisch in Pollen inaktiviert, indem man einen pollenspezifischen Promotor verwendet, um die Transkription seines Antisense-DNA-Komplements auf Pollengewebe zu beschränken.
  • Wir beschreiben außerdem ein Verfahren zum Erzeugen einer männlich sterilen Pflanze, in welchem das Sense-Gen, auf dessen Inaktivierung gezielt werden soll, ein natives oder fremdes Gen ist, das der Pflanze Resistenz gegenüber einem chemischen Agens oder einer natürlicherweise auftretenden oder künstlich induzierten physiologischen Belastung verleiht. Wenn dieses Gen ein fremdes Gen ist, kann es vor, nach oder gleichzeitig mit dem Antisense-Gen in das Genom der Pflanze insertiert werden. Man kann eine männlich sterile Pflanze erzeugen, indem man eine Pflanze in Gegenwart einer solchen Belastung während der Pollenbildung heranzieht und ein den genannten pollenspezifischen Promotor umfassendes Antisense-Gen verwendet, um spezifisch in Pollen, während der Pollenbildung, ein Gen zu inaktivieren, das den übrigen Teilen der Pflanze Resistenz gegenüber dieser Belastung verleiht. Jede beliebige Belastung, die in großem Maßstab angemessen kontrolliert werden kann und für die man ein Resistenz-Gen gefunden hat, kann theoretisch bei dieser Anordnung eingesetzt werden, einschließlich möglicherweise, aber nicht beschränkt auf Herbicide, pathogene Organismen, eine Reihe von Antibiotika und toxische Substanzen. Gemäß diesem Schema kann eine männlich sterile Pflanzenlinie durch Selbstbestäubung weitergeführt werden, wenn sie in Abwesenheit der biochemischen oder physiologischen Belastung gezüchtet wird. Wiederherstellung ist von Natur aus vorhanden, wenn aus hybridem Saatgut erzeugte Pflanzen in der Abwesenheit der genannten Belastung gezüchtet werden.
  • Es ist daher möglich, ein Verfahren zum Erzeugen einer männlich sterilen Pflanze aus einer Pflanze bereitzustellen, die unter denjenigen pollentragenden Pflanzen ausgewählt ist, die genetisch transformierbar sind, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
    • (a) Identifizieren und Isolieren eines Sense-Gens oder einer codierenden Sequenz, das/die für die zelluläre Funktion oder Entwicklung wesentlich oder entscheidend ist und in metabolisch kompetenten Zelltypen exprimiert wird, vorzugsweise aus der genannten pollenproduzierenden Pflanze;
    • (b) Insertieren eines rekombinanten DNA-Moleküls, umfassend:
    • i) eine DNA-Sequenz, die für RNA codiert, welche zu der durch das genannte Sense-Gen oder die genannte codierende Sequenz codierten RNA komplementär ist;
    • ii) einen pollenspezifischen Promotor, der in der genannten Pflanzenzelle funktionsfähig ist, wobei er die Transkription der genannten DNA-Sequenz in RNA in einem Zeitrahmen bewirkt, der es der genannten RNA ermöglicht, die Funktion der durch das genannte Sense-Gen oder die genannte codierende Sequenz codierten RNA zu hemmen; und vorzugsweise
    • iii) eine Terminator-Sequenz, die ein Terminationssignal für die Transkription der genannten DNA-Sequenz definiert, in das Genom einer Pflanzenzelle;
    • (c) Gewinnen einer Pflanzenzelle, die mit der genannten DNA-Sequenz genetisch transformiert wurde;
    • (d) Regenerieren einer genetisch transformierten Pflanze aus der genannten transformierten Pflanzenzelle, die männlich steril ist.
  • Gemäß dem voranstehenden Verfahren ist die Erfindung auch gerichtet auf:
    • (i) eine Pflanzenzelle, die mit dem wie in Schritt (b) oben definierten rekombinanten DNA-Molekül transformiert wurde und die in der Lage ist, in eine männlich sterile Pflanze regeneriert zu werden; und
    • (ii) eine Pflanze, die mit dem wie in Schritt (b) oben definierten rekombinanten DNA-Molekül transformiert wurde und die männlich steril ist.
  • In vergleichbarer Weise ist es möglich, ein Verfahren zum Erzeugen von hybridem Saatgut aus Pflanzen bereit zu stellen, die unter denjenigen Sorten oder Arten pollenproduzierender Pflanzen ausgewählt wurden, die genetisch transformierbar sind, umfassend die folgenden Schritte:
    • (a) Erzeugen einer männlich sterilen Pflanze durch:
    • i) Identifizieren und Isolieren eines Sense-Gens, das für die zelluläre Funktion oder Entwicklung wesentlich oder entscheidend ist und in metabolisch kompetenten Zelltypen exprimiert wird, vorzugsweise aus der genannten pollenproduzierenden Pflanze;
    • ii) Insertieren eines Gens, das der Pflanze Resistenz gegenüber einem chemischen Agens oder physiologischer Belastung verleiht, und, verknüpft mit diesem Gen, einer rekombinanten DNA-Sequenz, umfassend:
    • (A) eine DNA-Sequenz, die für RNA codiert, welche zu der durch das genannte Sense-Gen codierten RNA komplementär ist;
    • (B) einen pollenspezifischen Promotor, der in der genannten Pflanze funktionsfähig ist, wobei er die Transkription der genannten DNA-Sequenz in RNA zu oder ungefähr zu der Zeit bewirkt, in der das Sense-Gen in für die Pollen-Funktionsfähigkeit oder -bildung wesentlichen oder entscheidenden Geweben transkribiert wird, und vorzugsweise
    • (C) eine Terminator-Sequenz, die ein Terminations-Signal für die Transkription der genannten RNA-Sequenz definiert, in das Genom einer Pflanzenzelle dieser Pflanze, aus der eine differenzierte ganze Pflanze regeneriert werden kann,
    • iii) Gewinnen einer transformierten Pflanzenzelle dieser Pflanze; und
    • iv) Regenerieren einer Pflanze aus der genannten transformierten Pflanzenzelle, die mit den in Schritt (a) (ii) oben beschriebenen Genen genetisch transformiert ist und die männlich steril ist;
    • (b) Vergrößern der Anzahl genetisch transformierter Pflanzen durch:
    • i) klonale Vermehrung unter Verwendung von Gewebeausschnitten daraus, oder eine andere in vitro erfolgende Propagationstechnik, oder
    • ii)
    • A) Kreuzen der in Schritt (a) iv) oben beschriebenen genetisch transformierten Pflanze mit einer geeigneten männlich fertilen Pflanze;
    • B) Verwenden desselben chemischen Agens' oder derselben physiologischen Belastung zur Eliminierung von Pflanzen, die die oben in Stufe (a) ii) beschriebenen Gene nicht enthalten, unter Pflanzen, die aus den durch eine solche Kreuzung erzeugten Samen gezogen wurden; und
    • C) Wiederholen einer solchen Kreuzung über mehrere Generationen hinweg mit den wie in Stufe (b) ii) oben gewonnenen Pflanzen in Gegenwart des genannten chemischen Agens' oder der genannten physiologischen Belastung, um die Anzahl männlich steriler Pflanzen zu erhöhen;
    • (c) Bewirken einer Hybrid-Kreuzung zwischen den genannten genetisch transformierten Pflanzen und geeigneten männlich fertilen Pflanzen.
  • Wie oben diskutiert, kann hybrides Saatgut, das nach dem obigen Verfahren erzeugt wurde, wegen der Segregation (biologischen Aufspaltung) der die männliche Sterilität verursachenden rekombinanten DNA eine Mischung von sterilen hybriden Samen und fertilen hybriden Samen enthalten. In fremd- oder auskreuzenden Arten oder Spezies ermöglichen die vorhandenen fertilen Pflanzen die vollständige Bestäubung der männlich sterilen Hybriden.
  • Hier sollte wiederum klar sein, dass es dann, wenn es wechselnde Reihen von männlich sterilen Pflanzen und männlich fertilen Pflanzen gibt, einfacher sein kann, auch wenn es nicht wesentlich ist, die endgültige Selektion männlich steriler Pflanzen im Feld entlang den männlich fertilen Donor-Pflanzen auszuführen. Deshalb ist es wünschenswert, wenn die geeigneten männlich fertilen Donor-Pflanzen zuvor so transformiert wurden, dass sie gegenüber dem selektiven Agens resistent sind, um es zu vermeiden, dass das genannte Agens selektiv auf die Reihen mit männlich sterilen Pflanzen aufgebracht werden muss.
  • Gemäß dem voranstehenden Verfahren ist es auch möglich, eine Pflanzenzelle bereit zu stellen, die mit einem Gen und einer wie in Schritt (a) (ii) oben definierten rekombinanten DNA-Sequenz transformiert worden ist und zu einer männlich sterilen Pflanze regeneriert werden kann.
  • Gemäß den voranstehenden Ausgestaltungen ist es auch möglich, eine Pflanze und hybrides Saatgut bereitzustellen, umfassend DNA mit einem rekombinanten DNA-Molekül, welches aufweist:
    • (a) eine DNA-Sequenz, die für RNA codiert, welche zu der durch ein für die zelluläre Funktion oder Entwicklung in metabolisch kompetenten Zelltypen wesentliches Gen codierten mRNA komplementär ist;
    • (b) einen auf Pollen zielenden oder darauf ausgerichteten Promotor, der in der genannten Pflanze oder in einer aus dem genannten hybriden Saatgut gezogenen Pflanze funktionsfähig ist, wobei er die Transkription der genannten DNA-Sequenz in RNA innerhalb eines Zeitrahmens bewirkt, der es möglich macht, dass die genannte RNA die Funktion der durch das genannte Gen codierten RNA hemmt; und vorzugsweise
    • (c) eine Terminator-Sequenz, die ein Terminations-Signal für die Transkription der genannten DNA-Sequenz definiert.
  • Es sollte klar sein, dass ein Sense-Gen, das für ein Protein codiert, welches für die zelluläre Funktion oder Entwicklung wesentlich oder entscheidend ist, in der Literatur beschrieben sein kann und sich gemäß den weiter unten beschriebenen Verfahren in einfacher Weise isolieren lässt.
  • Beispiele für solche Proteine sind Proteine wie Actin, Tubulin oder Ubiquitin, drei Proteine, die für das Zellwachstum und die Zellentwicklung wesentlich sind.
  • Sequenzen für aus Pflanzen isolierte Actin-Gene sind publiziert worden (siehe beispielsweise Baird, W. V. und Meagher, R. B., EMBO J. 6: 3223–3231, 1987, oder Shah, D. M., Hightower, R. C. und Meagher, R. B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 1022–1026, 1982), und man weiß von Actin, dass es eine wesentliche oder entscheidende Rolle bei der normalen zellulären Funktion spielt, insbesondere während der Mitose und der Meiose, bei denen Actin einen Teil des zellulären Apparats für die Zellteilung bildet.
  • Die Sequenz für Pflanzen-Tubulin ist ebenfalls beschrieben worden (Raha, D., Sen, K. und Biswas, B. B., Plant. Mol. Biol. 9: 565–571, 1987). Von Tubulin weiß man, dass es wie Actin im Lebenszyklus der Zelle wichtig ist, insbesondere in Bezug auf die Zellform, den Transport und die Spindelbildung während Mitose und Meiose.
  • Auch die DNA-Sequenz für Pflanzen-Ubiquitin ist publiziert (Gausing, K. und Barkardottir, R., Eur. J. Biochem. 158: 57–62, 1986). Ubiquitin ist ein in den Turnover von zellulären Proteinen eingreifendes Protein und spielt als solches eine wesentliche Rolle in der Mengenregulierung spezifischer zellulärer Proteine. Darüber hinaus ist Ubiquitin eines der am stärksten konservierten Proteine in eukaryontischen Zellen. Eine Beeinträchtigung der Ubiquitin-Expression kann Abnormitäten im Metabolismus zellulärer Proteine bewirken.
  • Das Fehlen eines der voranstehend genannten Proteine in der Zelle beeinträchtigt die reguläre Zellfunktion, und die Zelle kann sich nicht richtig entwickeln.
  • Es ist davon auszugehen, dass ein Gen, von dem man weiß, dass es für das Zellwachstum oder die Zellentwicklung in einer Pflanzenart oder -sorte wesentlich ist, in anderen Pflanzensorten oder -arten vergleichbare Gegenstücke hat, da es allgemein anerkannt ist, dass es im Pflanzenreich annähernd identische oder sehr homologe Gene gibt, die in die grundlegenden Prozesse eingebunden sind, die die zelluläre Entwicklung regeln oder deren Ergebnis sind. Es ist weiterhin anzunehmen, dass ein Gen, das die Expression des genannten Gens in einer Pflanzenart oder -sorte beeinträchtigt (d.h. ein Antisense-Gen), diese Fähigkeit auch in anderen Pflanzenarten oder -sorten haben wird.
  • Die Ähnlichkeit und Universalität dieser Gene ist in der Literatur anhand von Beispielen gezeigt worden. Die gewebespezifische und entwicklungsregulierte Expression eines Weizen-Endosperm-Proteins, das in mit diesem Weizen-Gen genetisch transformierten Tabakpflanzen synthetisiert wird, ist beschrieben worden (Flavell, R.B. et al., Second International Congress for Plant Molecular Biology, Abstract #97). In diesem Beispiel war die Funktion des Weizen-Gens in der Tabakpflanze identisch mit der, die das Gen in einer Weizenpflanze ausübt. Andere Literatur zeigt klar, dass die Regulation eines spezifischen Gens, die in vielen Fällen komplex sein kann, in transgenen Pflanzen aufrechterhalten wird. Ein Beispiel hierfür ist die Phytochrom-vermittelte Regulation eines Chlorophyll-a/b-Bindungsproteins aus Weizen in transgenem Tabak (Nagy, F. et al., EMBO Jour. 5: 1119–1124, 1986). In diesem Beispiel blieb die auf Licht reagierende spezifische Regulation des Weizen-Gens in der fremden genetischen Umgebung erhalten. Aber nicht nur Getreidegene fungieren auf konservierte Art, sondern auch Gene aus anderen Pflanzenarten oder -sorten, die enger verwandt sind, behalten ihre Funktionalität in heterologen genetischen Systemen. Erbsensamen-Proteine werden in Tabakpflanzen regulär exprimiert (Higgins, T. J. V. et al., Plant. Mol. Biol. 11: 683–696, 1988), wie auch Sojabohnensamen-Proteine (Barker, S. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 458–462, 1988) und rbcS-Gene aus Erbsen (Nagy, F. et al., EMBO Jour. 4: 3063–3068, 1985). Die wissenschaftliche Literatur liefert zahlreiche andere Beispiele von Genen, die eingesetzt wurden, um Pflanzen genetisch zu transformieren, und diese Gene behalten ihre Fähigkeit, in dieser neuen genetischen Umgebung normal zu funktionieren. Deshalb ist die konservierte Natur dieser Gene in der Pflanzenwelt ähnlich, und zwar nicht nur bezüglich der DNA-Sequenzen, die die Expression dieser Gene steuern, sondern auch bezüglich der tatsächlichen Proteinstrukturen, die durch diese Gene codiert werden.
  • Daraus folgt, dass es möglich sein sollte, die Erzeugung dieser Proteine spezifisch dadurch zu hemmen, dass ein Antisense-Gen, das spezifisch für die durch die veröffentlichten Sequenzen codierten mRNAs ist, und ein pollenspezifischer Promotor in den oben beschriebenen Verfahren eingesetzt werden.
  • Weiterhin ist es möglich, ein Verfahren zum Erzeugen einer ein männlich steriles Merkmal tragenden Pflanze aus einer Pflanze bereit zu stellen, die unter denjenigen pollenproduzierenden Pflanzen ausgewählt ist, die genetisch transformierbar sind, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
    • (a) Transformieren einer Pflanzenzelle dieser Pflanze, aus der eine differenzierte ganze Pflanze regeneriert werden kann, mit einem Sense-Gen, das der genannten Pflanze Resistenz gegenüber einem chemischen Agens oder einer natürlich auftretenden oder künstlich induzierten physiologischen oder chemischen Belastung verleiht;
    • (b) Regenerieren einer genetisch transformierten Pflanze aus der genannten transformierten Pflanzenzelle, die resistent gegenüber dieser selben Belastung ist;
    • (c) Insertieren eines rekombinanten DNA-Moleküls, umfassend
    • i) eine DNA-Sequenz, die für RNA codiert, welche zu der durch das genannte Sense-Gen codierten RNA-Sequenz komplementär ist;
    • ii) einen pollenspezifischen Promotor, der in dieser Pflanzenzelle funktionsfähig ist, wobei er die Transkription der genannten DNA-Sequenz in RNA bewirkt; und vorzugsweise
    • iii) eine Terminator-Sequenz, die ein Terminations-Signal für die Transkription der genannten DNA-Sequenz definiert, in das Genom einer Pflanzenzelle der gegenüber Belastungen widerstandsfähigen Pflanze, aus der eine differenzierte ganze Pflanze regeneriert werden kann;
    • (d) Gewinnen einer Pflanzenzelle der genannten belastungsresistenten Pflanze, die mit dem in Stufe (c) oben beschriebenen Gen transformiert worden ist; und
    • (e) Regenerieren einer Pflanze, die mit den in Stufe (a) und in Stufe (c) oben beschriebenen Genen genetisch transformiert wurde und die durch das genannte chemische Agens oder die genannte Belastung männlich steril gemacht werden kann, aus der genannten transformierten Pflanzenzelle.
  • Gemäß dem vorstehenden Verfahren ist es auch möglich, das Folgende vorzusehen:
    • i) eine Pflanzenzelle, die das in den Schritten (a) und (c) oben definierte Gen enthält und in eine Pflanze regeneriert werden kann, die das männlich sterile Merkmal trägt.
    • ii) eine Pflanze, die das in den Schritten (a) und (c) oben definierte Gen enthält und das männlich sterile Merkmal trägt.
  • Es sollte klar sein, dass die Pflanze, die man männlich steril machen möchte, nicht mit einem Sense-Gen transformiert werden muss, das Resistenz gegenüber einem chemischen Agens oder einer natürlich auftretenden oder künstlich induzierten physiologischen oder chemischen Belastung verleiht, wenn dieses Sense-Gen natürlicherweise in der Pflanze vorhanden ist.
  • Es sollte klar sein, dass die voranstehende Ausgestaltung auch dadurch erhalten werden kann, dass eine Pflanzenzelle gleichzeitig sowohl mit dem in (a) als auch mit dem in (c) oben bezeichneten Gen und damit ohne einen zwischenliegenden Regenerationsschritt (b) transformiert wird.
  • Es ist darüber hinaus möglich, en Verfahren zum Erzeugen von hybridem Saatgut mit wiederhergestellter Fertilität aus Pflanzen herzustellen, die unter denjenigen Arten pollenproduzierender Pflanzen ausgewählt sind, die genetisch transformierbar sind, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:
    • (a) Erzeugen einer Pflanze, die ein Merkmal für männliche Sterilität trägt, durch:
    • i) gleichzeitiges oder unabhängiges Insertieren eines Sense-Gens, das dieser Pflanze Resistenz gegenüber einem chemischen Agens oder einer natürlich auftretenden oder künstlich induzierten physiologischen Belastung verleiht, und eines rekombinanten DNA-Moleküls, umfassend:
    • (A) eine DNA-Sequenz, die für RNA codiert, welche zu der durch das genannte Sense-Gen codierten RNA-Sequenz komplementär ist;
    • (B) einen auf Pollen zielenden oder darauf ausgerichteten Promotor, der in der genannten Pflanzenzelle funktionsfähig ist, wobei er die Transkription der genannten DNA-Sequenz in RNA bewirkt; und vorzugsweise
    • (C) eine Terminator-Sequenz, die ein Terminations-Signal für die Transkription der genannten RNA-Sequenz definiert, in das Genom einer Pflanzenzelle der genannten pollenproduzierenden Pflanze, aus der eine differenzierte ganze Pflanze regeneriert werden kann;
    • ii) Gewinnen einer Pflanzenzelle einer Pflanze, die mit den in Schritt (i) oben beschriebenen Genen transformiert wurde;
    • iii) Regenerieren einer Pflanze, die mit den in Schritt (i) oben beschriebenen Genen genetisch transformiert wurde und die durch das chemische Agens oder die Belastung männlich steril gemacht werden kann, aus der genannten transformierten Pflanzenzelle;
    • (b) Vergrößern der Anzahl genetisch transformierter Pflanzen durch:
    • i) klonale Vermehrung unter Verwendung von Gewebeausschnitten davon oder andere in vitro erfolgende Propagationstechniken;
    • ii)
    • A) Kreuzen der in Schritt (a) iv) oben beschriebenen, genetisch transformierten Pflanze mit einer geeigneten männlich fertilen Pflanze;
    • B) Verwenden desselben chemischen Agens' oder derselben physiologischen Belastung zur Eliminierung von Pflanzen, die die in Schritt (a) ii) oben beschriebenen Gene nicht enthalten, unter Pflanzen, die aus den durch eine solche Kreuzung erzeugten Samen gezogen wurden; und
    • C) Wiederholen einer solchen Kreuzung über mehrere Generationen hinweg mit den wie in Schritt (b) ii) oben erhaltenen Pflanzen in Gegenwart des genannten chemischen Agens' oder dieser physiologischen Belastung zum Vergrößern der Anzahl von männlich sterilen Pflanzen; oder vorzugsweise
    • iii)
    • A) Selbstbestäuben der in (a) beschriebenen, genetisch transformierten Pflanze, die mit Hilfe des genannten chemischen Agens' oder dieser Belastung männlich steril gemacht werden kann, und Auswählen einer Pflanze, die für das männlich sterile Merkmal homozygot ist, aus den Nachkommen dieser Selbstbestäubung;
    • B) Heranziehen der in Schritt (a) (iii) oben beschriebenen genetisch transformierten Pflanze isoliert von dieser selben Belastung oder diesem chemischen Agens unter Erzeugen einer selbstbefruchtenden Pflanze;
    • C) Ermöglichen einer Selbstbefruchtung und
    • D) Ziehen von Saatgut aus dieser selbstbefruchtenden Pflanze über eine Anzahl von Generationen hinweg isoliert gegenüber derselben Belastung oder diesem chemischen Agens zum Vergrößern der Anzahl von genetisch transformierten Pflanzen;
    • (c) Bewirken einer Hybrid-Kreuzung zwischen den genannten genetisch transformierten Pflanzen, die in Gegenwart dieser Belastung oder dieses chemischen Agens herangezogen wurden, die/das während der Pollenbildung anwesend war, und geeigneten männlich fertilen Pflanzen.
  • Wiederum sollte klar sein, dass die Pflanze, die man männlich steril machen möchte, nicht mit einem Sense-Gen transformiert werden muss, das Resistenz gegenüber einem chemischen Agens oder einer natürlich auftretenden oder künstlich induzierten physiologischen oder chemischen Belastung verleiht, wenn dieses Sense-Gen natürlicherweise in der Pflanze vorhanden ist.
  • Gemäß dem voranstehenden Verfahren ist es auch möglich, hybrides Saatgut mit DNA bereitzustellen, die umfasst:
    • (a) ein Sense-Gen, das einer aus diesem Saatgut gezogenen Pflanze Resistenz gegenüber einem chemischen Agens oder einer natürlich auftretenden oder künstlich induzierten physiologischen Belastung verleiht; und
    • (b) ein rekombinantes DNA-Molekül, umfassend:
    • i) eine DNA-Sequenz, die für RNA codiert, welche zu der durch das genannte Sense-Gen codierten RNA-Sequenz komplementär ist;
    • ii) einen pollenspezifischen Promotor, der in der genannten Pflanze funktionsfähig ist, wobei er die Transkription dieser DNA-Sequenz in RNA bewirkt; und
    • iii) eine Terminator-Sequenz, die ein Terminations-Signal für die Transkription der genannten DNA-Sequenz definiert.
  • Weiterhin ist es möglich, ein Verfahren zum Erzeugen einer männlich sterilen Pflanze durch Transformieren einer Pflanze mit einem rekombinanten DNA-Molekül bereitzustellen, das einen pollenspezifischen Promotor und eine DNA-Sequenz umfasst, die für ein cytotoxisches Molekül codiert. Theoretisch kann jedes beliebige toxische Molekül, von dem man weiß, dass es durch eine oder mehrere identifizierbare DNA-Sequenzen codiert wird, im Rahmen dieser Ausgestaltung der Erfindung eingesetzt werden, einschließlich von Ricin und Diphtherie-Toxin, aber nicht darauf beschränkt. Wir stellen ein Verfahren zum Erzeugen von hybridem Saatgut mit wiederhergestellter männlicher Fertilität bereit, in dem die genannte männlich sterile Pflanze mit einer geeigneten männlich fertilen Pflanze gekreuzt wird, die mit einem rekombinanten DNA-Molekül transformiert wurde, welches eine DNA-Sequenz im Gegensinn zur Orientierung der DNA-Sequenz, die für das cytotoxische Molekül codiert, und einen Promotor umfasst, der die genannte Antisense-Sequenz kontrolliert und der bewirkt, dass deren Transkription ungefähr zu dem Zeitpunkt der Transkription der genannten DNA-Sequenz erfolgt, die für das genannte cytotoxische Molekül codiert, wodurch die Expression der genannten, für das cytotoxische Molekül codierenden DNA-Sequenz in der hybriden Pflanze inhibiert wird. Der Promotor, der die Antisense-Sequenz kontrolliert, ist vorzugsweise derselbe pollenspezifische Promotor, der die Produktion des cytotoxischen Moleküls kontrolliert. Induzierbare und konstitutive Promotoren können ebenfalls in vorteilhafter Weise eingesetzt werden, um den Zeitpunkt der Expression der genannten Antisense-Sequenz zu kontrollieren.
  • Dementsprechend ist es möglich, ein Verfahren zum Erzeugen einer männlich sterilen Pflanze aus einer Pflanze bereitzustellen, die unter denjenigen Arten pollenproduzierender Pflanzen ausgewählt wurde, die genetisch transformierbar sind, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
    • (a) Insertieren eines rekombinanten DNA-Moleküls, umfassend:
    • (i) einen pollenspezifischen Promotor;
    • (ii) eine DNA-Sequenz, die für ein cytotoxisches Molekül codiert, und
    • (iii) eine Terminator-Sequenz, die ein Terminations-Signal für die Transkription der genannten DNA-Sequenz definiert, in das Genom einer Pflanzenzelle der genannten Pflanze;
    • (b) Gewinnen einer transformierten Pflanzenzelle; und
    • (c) Regenerieren einer genetisch transformierten, männlich sterilen Pflanze aus der genannten transformierten Pflanzenzelle.
  • Gemäß dem voranstehenden Verfahren ist es auch möglich, folgendes bereitzustellen:
    • (i) eine Pflanzenzelle, die mit einem wie in Schritt (a) oben definierten rekombinanten DNA-Molekül transformiert wurde und die in der Lage ist, in eine männlich sterile Pflanze regeneriert zu werden;
    • (ii) eine Pflanze, die mit einem wie in Schritt (a) oben definierten rekombinanten DNA-Molekül transformiert wurde und die männlich steril ist.
  • Weiterhin ist es möglich, ein Verfahren zum Erzeugen von hybridem Saatgut mit wiederhergestellter männlicher Fertilität aus Pflanzen bereitzustellen, die unter denjenigen Arten pollenproduzierender Pflanzen ausgewählt sind, die genetisch transformierbar sind, umfassend die Schritte:
    • (a) Insertieren eines Gens, das der genannten Pflanze Resistenz gegenüber einem chemischen Agens oder physiologischer Belastung verleiht, und verknüpft mit diesem Gen, eines rekombinanten DNA-Moleküls, umfassend
    • (i) eine DNA-Sequenz, die für ein cytotoxisches Molekül codiert;
    • (ii) einen auf einen Pollen zielenden oder darauf ausgerichteten Promotor, der in der genannten Pflanzenzelle funktionsfähig ist, wobei er die Transkription der genannten DNA-Sequenz bewirkt; und
    • (iii) eine Terminator-Sequenz, die ein Terminations-Signal für die Transkription der genannten DNA-Sequenz definiert, in das Genom einer Pflanzenzelle der genannten pollenproduzierenden Pflanze, aus der eine differenzierte ganze Pflanze regeneriert werden kann;
    • (b) Gewinnen einer transformierten Pflanzenzelle;
    • (c) Regenerieren einer männlich sterilen, genetisch transformierten Pflanze aus der genannten Pflanzenzelle;
    • (d) Vergrößern der Anzahl genetisch transformierter Pflanzen durch:
    • i) Kreuzen der in Schritt (c) oben beschriebenen genetisch transformierten Pflanze mit einer geeigneten männlich fertilen Pflanze;
    • ii) Verwenden eines chemischen Agens' oder von physiologischer Belastung zur Beseitigung von Pflanzen, die die in Schritt (a) oben beschriebenen Gene nicht enthalten, unter Pflanzen, die aus durch eine solche Kreuzung erzeugten Samen gezogen wurden; und
    • iii) Wiederholen einer solchen Kreuzung mit den wie in Schritt (d) ii) oben gewonnenen Pflanzen in Gegenwart des genannten chemischen Agens' oder der physiologischen Belastung über mehrere Generationen hinweg, um die Anzahl der männlich sterilen Pflanzen zu erhöhen;
    • (e) Insertieren eines Gens, das der genannten Pflanze Resistenz gegenüber einem chemischen Agens oder physiologischer Belastung verleiht, und verknüpft mit diesem Gen eines rekombinanten DNA-Moleküls, umfassend:
    • (i) eine DNA-Sequenz, die für RNA codiert, welche zu der für das genannte cytotoxische Molekül codierenden RNA-Sequenz komplementär ist;
    • (ii) einen Promotor, der die Transkription der in Schritt (e) i) oben definierten DNA-Sequenz zeitgleich oder in etwa zeitgleich mit der Transkription der in Schritt (a) (i) definierten DNA-Sequenz bewirkt;
    • (iii) eine Terminator-Sequenz, die ein Terminations-Signal für die Transkription der in Stufe (e) (i) oben beschriebenen DNA-Sequenz definiert; in eine Pflanzenzelle einer geeigneten männlich fertilen Pflanze, ausgewählt unter derselben Art oder Sorte;
    • (f) Gewinnen einer transformierten Pflanzenzelle aus Schritt (d);
    • (g) Regenerieren einer genetisch transformierten männlich fertilen Pflanze aus der genannten, in Schritt (d) oben beschriebenen transformierten Pflanzenzelle;
    • (h) Erzeugen einer Wiederherstellungslinie durch:
    • i) Selbstbestäuben der in (g) beschriebenen genetisch transformierten Pflanze und Auswählen einer für das männliche Wiederherstellungs-Merkmal homozygoten Pflanze aus den Nachkommen dieser Selbstbestäubung;
    • ii) Ermöglichen von Selbstbefruchtung dieser für das männliche Wiederherstellungs-Merkmal homozygoten Pflanze; und
    • iii) Ziehen von Saatgut dieser Pflanze über eine Anzahl von Generationen hinweg, um die Anzahl genetisch transformierter Pflanzen zu erhöhen;
    • (i) Bewirken einer Hybrid-Kreuzung durch Bestäuben der genannten männlich sterilen Pflanzen mit Pollen der genannten genetisch transformierten männlich fertilen Pflanzen.
  • Die Selektion auf eine Pflanze, die für das genannte Wiederherstellungs-Merkmal homozygot ist, kann durchgeführt werden, indem man eine Staubbeutel- oder isolierte Mikrosporen-Kultur der das genannte Wiederherstellungs-Merkmal tragenden, genetisch transformierten Pflanze anlegt, oder vorzugsweise durch Selbstbestäuben dieser Pflanze in Isolation vor der Selektion.
  • Es ist insbesondere dann wünschenswert, die Fertilität wie oben diskutiert wiederherzustellen, wenn die ins Auge gefasste Pflanzen-Spezies sich nicht fremd- oder auskreuzen lässt. Wenn sich die ins Auge gefasste Pflanzenart fremd- bzw. auskreuzen lässt, ist es bevorzugt, aber nicht notwendig, eine Wiederherstellungs-Linie wie in den Schritten (e) bis (h) oben beschrieben zu erzeugen. Das Kreuzen mit einer geeigneten männlich fertilen Pflanze liefert hybrides Saatgut, das wegen der Segregation (der biologischen Aufspaltung) der die männliche Sterilität bewirkenden rekombinanten DNA eine Mischung aus sterilen hybriden Samen und fertilen hybriden Samen aufweist. Die vorhandenen fertilen Pflanzen ermöglichen eine volle Bestäubung der männlich sterilen Hybride.
  • Wie oben diskutiert kann es in einer Anordnung zur Erzeugung von hybridem Saatgut, in der sich Reihen männlich steriler Pflanzen und männlich fertiler Pflanzen abwechseln, bequemer sein, obwohl es nicht wesentlich ist, die abschließende Selektion männlich steriler Pflanzen (Schritt (d) des voranstehenden Verfahrens) im Feld entlang geeigneter männlich fertiler Pflanzen vorzunehmen. Deshalb ist es wünschenswert, dass die geeigneten männlich fertilen Pflanzen zuvor so transformiert wurden, dass sie gegenüber dem selektionierenden Agens resistent sind, um zu vermeiden, dass das genannte Agens selektiv auf die Reihen der männlich sterilen Pflanzen aufgebracht werden muss.
  • Gemäß dem voranstehenden Verfahren ist es auch möglich, Folgendes bereitzustellen:
    • (i) eine Pflanzenzelle, die mit einem wie in Schritt in (e) oben definierten rekombinanten DNA-Molekül transformiert wurde und in der Lage ist, zu einer männlich fertilen Pflanze regeneriert zu werden, die das Wiederherstellungs-Merkmal trägt;
    • (ii) eine Pflanze, die mit einem wie in Schritt in (e) oben definierten rekombinanten DNA-Molekül transformiert wurde und die das Wiederherstellungs-Merkmal trägt;
    • (iii) hybrides Saatgut, das die in den Schritten in (a) und (e) oben beschriebenen Gene enthält.
  • Verbesserungen und weitere Ausführungsformen von pollenspezifische Cytotoxizität betreffenden Verfahren sollen nun diskutiert werden.
  • Eine Verbesserung betrifft die Natur der Moleküle, die das Pollenkorn schädigen oder toxisch dafür sind. Zusätzlich zu zellulären Giften wie Ricin und Diphtherie-Toxin, für die Abrin ein anderes Beispiel ist, umfassen diese Substanzen, ohne darauf beschränkt zu sein, abbauende oder destruktive Enzyme wie Ribonuclease, DNAse, Lipase oder Protease, Moleküle, die die cytoplasmatische Integrität zerstören oder destabilisieren, beispielsweise Polylysin oder Polyprolin, oder Cryptocytotoxine, die in cytotoxische Moleküle zerfallen. Beispiele für Cryptocytotoxine umfassen spaltbare Konjugate von Molekülen, die nach der Spaltung cytotoxisch sind, zum Beispiel ein spaltbares Konjugat von Glucuronat und einem Herbicid (zum Beispiel: Glyphosat), Naphtalin-acetamid und Indol-acetamid. Die vorliegende Erfindung wie in den beigefügten Ansprüche beansprucht richtet sich auf dieses cryptocytotoxische Verfahren, wobei das in Anspruch 1 beanspruchte rekombinante DNA-Molekül eine DNA-Sequenz unter der Kontrolle eines auf Pollen zielenden oder darauf ausgerichteten Promotors umfasst, die für ein Gen-Produkt codiert, das dann, wenn es in einer Zelle/einem Gewebe einer pollenproduzierenden Pflanze erzeugt wird, in der Lage ist, eine nicht-toxische Substanz cytotoxisch gegenüber dieser Zelle/diesem Gewebe zu machen.
  • Demzufolge ist es möglich, die voranstehenden Verfahren durch Regulieren der Expression eines Gens durchzuführen, das für ein beliebiges der verbesserten Crypto-Cytotoxine codiert, indem ein auf Pollen ausgerichteter oder darauf zielender Promotor eingesetzt wird, um männlich sterile Pflanzen zu erzeugen, und diese männlich sterilen Pflanzen mit beliebigen geeigneten fertilen männlichen Pflanzen gekreuzt werden, um ein Saatgut zu erhalten, das eine Mischung aus männlich sterilen und männlich fertilen Samen aufweist, oder durch Kreuzen dieser männlich sterilen Pflanzen mit einer Wiederherstellungs-Linie, um fertiles hybrides Saatgut zu erhalten.
  • Abwandlungen der Art der Wiederherstellungs-Linie, die eingesetzt werden kann, werden nachstehend diskutiert.
  • Bezüglich der destruktiven Enzyme kann eine geeignete Wiederherstellungs-Linie Wiederherstell-Pflanzen aufweisen, die DNA-Sequenzen enthalten, welche für die Produktion eines spezifischen Enzym-Inhibitors codieren.
  • Im Hinblick auf das cryptocytotoxische Verfahren ist eine Wiederherstellungs-Linie nicht notwendigerweise erforderlich, da die Wiederherstellung durch das Ziehen von Pflanzen in Abwesenheit des cryptocytotoxischen Moleküls erfolgen kann. Wie oben im Hinblick auf beliebige der cytotoxischen Verfahren einschließlich des cryptocytotoxischen Verfahrens diskutiert, ist es nicht wesentlich, eine Wiederherstellungs-Linie einzusetzen, wenn die männlich sterile Linie mit einer geeigneten männlich fertilen Linie gekreuzt wird, so dass man hybrides Saatgut gewinnt, das eine Mischung aus fertilen Samen und sterilen Samen aufweist.
  • Zusammenfassend stellen wir ein Verfahren zum Erzeugen von hybridem Saatgut mit wiederhergestellter männlicher Fertilität aus solchen Arten oder Spezies pollenproduzierender Pflanzen bereit, die genetisch transformierbar sind und in eine differenzierte ganze Pflanze regeneriert werden können, wobei dieses Verfahren umfasst:
    • (a)
    • (i) Insertieren eines Gens, das der genannten Pflanze Resistenz gegenüber einem chemischen Agens oder einer natürlich auftretenden oder künstlich induzierten physiologischen Belastung verleiht, und, verknüpft mit diesem, eines rekombinanten DNA-Moleküls, umfassend:
    • (A) eine DNA-Sequenz, die dann, wenn sie transkribiert und translatiert wird, für ein Molekül codiert, das eine Substanz cytotoxisch macht;
    • (B) einen auf Pollen ausgerichteten Promotor, der in der genannten Pflanze funktionsfähig ist, wobei er die Transkription der genannten DNA-Sequenz in RNA zu der Zeit oder ungefähr zu der Zeit der Transkription des Sense-Gens in sich entwickelnden Pollen bewirkt; und vorzugsweise
    • (C) eine Terminator-Sequenz, die ein Terminations-Signal für die Transkription der genannten DNA-Sequenz definiert, in das Genom einer Pflanzenzelle dieser Pflanze, die in eine differenzierte ganze Pflanze regeneriert werden kann;
    • (iii) Gewinnen einer transformierten Pflanzenzelle dieser Pflanze; und
    • (iv) Regenerieren einer Pflanze aus dieser Pflanzenzelle, die mit den in (a) (ii) oben beschriebenen DNA-Sequenzen genetisch transformiert wurde und männlich steril ist, und
    • (b) Vergrößern der Anzahl genetisch transformierter männlich steriler Pflanzen durch:
    • (i) klonale Vermehrung der genannten, in Schritt (a) oben beschriebenen genetisch transformierten, männlich sterilen Pflanze unter Verwendung von Gewebeausschnitten daraus, oder durch andere in vitro erfolgende Propagationstechniken; oder
    • (ii)
    • A) Kreuzen der in (a) beschriebenen genetisch transformierten männlich sterilen Pflanze mit einer isogenen männlich fertilen Pflanze;
    • B) Verwenden des in (a) (ii) oben definierten chemischen Agens' oder dieser physiologischen Belastung zur Beseitigung von Pflanzen, die die in Schritt (a) (ii) definierte DNA-Sequenz nicht enthalten, unter Pflanzen, die aus durch eine solche Kreuzung erzeugten Samen gezogen wurden; und
    • C) Wiederholen einer solchen Kreuzung mit den wie in Schritt in (b) (iii) oben gewonnen Pflanzen in der Gegenwart des genannten chemischen Agens' oder der entsprechenden physiologischen Belastung über mehrere Generationen hinweg, um die Anzahl der männlich sterilen Pflanzen zu erhöhen;
    • (c) Erzeugen einer männlich fertilen Wiederherstellungs-Pflanze durch:
    • (i) Insertieren eines Gens, das Resistenz gegenüber einem chemischen Agens oder einer natürlich auftretenden oder künstlich induzierten physiologischen Belastung verleiht, verknüpft mit einer rekombinanten DNA-Sequenz, umfassend:
    • (A) ein Gen, das für ein Molekül codiert, welches die Zerstörung ungeschehen macht oder negiert, die an für die Pollenbildung oder -funktionsfähigkeit in der genannten genetisch transformierten weiblichen Elternpflanze wesentlichen Geweben bewirkt wurde;
    • (B) einen Promotor, der in den genannten für die Pollenbildung oder -funktionsfähigkeit wesentlichen oder entscheidenden Geweben funktionsfähig ist, so dass er die Transkription des genannten Gens in RNA zu der oder ungefähr zu der Zeit bewirkt, in der das in (a) (i) beschriebene Sense-Gen aktiv ist, vorzugsweise ein auf Pollen zielender oder ausgerichteter Promotor; und vorzugsweise
    • (C) eine Terminator-Sequenz, die ein Terminations-Signal für die Transkription der genannten DNA-Sequenz definiert, in das Genom einer Pflanzenzelle einer geeigneten männlichen Elternpflanze, aus der eine differenzierte ganze Pflanze regeneriert werden kann;
    • (d) Vergrößern der Anzahl von genetisch transformierten männlich fertilen Wiederherstellungs-Pflanzen durch:
    • (i) Selbstbestäubung der genetisch transformierten Pflanze, die das in (c) beschriebene Wiederherstellungs-Merkmal trägt, und Auswählen einer Pflanze, die für das Wiederherstellungs-Merkmal homozygot ist, und Vermehren dieser Pflanze durch Selbstbestäubung in Isolation; oder
    • (ii) soweit anwendbar, Anlegen einer Staubbeutel- oder isolierten Mikrosporen-Kultur der genetisch transformierten Pflanze, die das in (C) beschriebene Wiederherstellungs-Merkmal trägt, und Auswählen einer Pflanze, die für das Wiederherstellungs-Merkmal homozygot ist, und Vermehren dieser Pflanze durch Selbstbestäubung in Isolation;
    • (e) Bewirken einer Hybrid-Kreuzung durch Bestäuben der in (a) beschriebenen und gemäß (b) vermehrten männlich sterilen Pflanzen in Gegenwart des in (a) (ii) definierten chemischen Agens' oder der entsprechenden physiologischen Belastung (soweit erforderlich) mit Pollen von männlich fertilen Wiederherstellungs-Pflanzen, die wie in (c) beschrieben und gemäß (d) vermehrt worden waren.
  • Es ist wünschenswert, die Fertilität wie oben diskutiert wiederherzustellen, wenn die ins Auge gefasste Pflanzen-Spezies sich nicht fremd- bzw. auskreuzen lässt. Wenn sich die ins Auge gefasste Pflanzenart fremd- oder auskreuzen lässt, ist es bevorzugt, aber nicht notwendig, eine Wiederherstellungs-Linie wie in den Schritten (c) bis (e) oben beschrieben zu erzeugen. Das Kreuzen mit einer geeigneten männlich fertilen Pflanze liefert hybrides Saatgut, das wegen der Segregation (der biologischen Aufspaltung) der die männliche Sterilität bewirkenden rekombinanten DNA eine Mischung aus sterilen hybriden Samen und fertilen hybriden Samen aufweist. Die vorhandenen fertilen Pflanzen ermöglichen eine volle Bestäubung der männlich sterilen Hybride.
  • Wie oben diskutiert, kann eine Wiederherstellung auch für das cryptocytotoxische Verfahren nicht erforderlich sein.
  • Spezifische Ausführungsformen des cryptocytotoxischen Verfahrens werden nachstehend diskutiert.
  • Theoretisch kann im Rahmen der Erfindung jede beliebige Aktivität eingesetzt werden, von der bekannt ist, dass sie durch eine oder mehrere identifizierbare DNA-Sequenzen codiert wird und die eine nicht-toxische in eine toxische Substanz überführen kann. Dies umfasst Verfahren, mit denen die sich entwickelnden Pollen empfänglich für die cytotoxischen Effekte von IAA (Indol-essigsäure) oder NAA (alpha-Naphthalin-essigsäure) gemacht werden, indem Pflanzen mit einem pollenspezifischen rekombinanten DNA-Molekül transformiert werden, das für das Enzym Indol-acetamid-Hydrolase (IaMH) codiert. Eine Quelle für das Enzym IaMH ist das Bakterium Agrobacterium tumefaciens (Inze, D. et. al., 1984, Mol. Gen. Genet. 194: 265–74). Dieses Enzym wandelt nicht-toxisches Indol-acetamid in IAA oder nicht-toxisches Naphthalin-acetamid in toxisches NAA um.
  • Alternativ zieht die vorliegende Erfindung in Betracht, die sich entwickelnden Pollen empfänglich für die cytotoxischen Effekte von Methoxyvinyl-glycin zu machen, indem Pflanzen mit einem pollenspezifischen rekombinanten DNA-Molekül transformiert werden, das für das Enzym Methoxinin-Dehydrogenase (MDH) codiert. Eine Quelle für MDH ist das Bakterium Pseudomonas aeruginosa (Margraff, R. et. al., 1980, Experimentia 36: 486). MDH wandelt nicht-toxische 2-Amino-4-methoxy-buttersäure (Methoxinine) in toxisches Methoxyvinyl-glycin um.
  • Alternativ zieht die vorliegende Erfindung auch in Betracht, die sich entwickelnden Pollen empfänglich für die cytotoxischen Effekte von Rhizobitoxin (2-Amino-4-[2-amino-3-hydroxypropy]-trans-3-buttersäure) zu machen, indem Pflanzen mit einem pollenspezifischen rekombinanten DNA-Molekül transformiert werden, das für das Enzym Rhizobitoxin-Synthase codiert, für welches das Bakterium Rhizobium japonicum (Owens, L. D. et. al., 1973, Weed Science 21: 63–66) eine Quelle ist. Rhizobitoxin-Synthase wandelt 2-Amino-4-methoxy-buttersäure in Rhizobitoxin um.
  • Alternativ zieht die vorliegende Erfindung auch in Betracht, die sich entwickelnden Pollen empfänglich für die toxischen Effekte von Glyphosat (N-[Phosphormethyl]-glycin) zu machen, indem Pflanzen mit einem pollenspezifischen rekombinanten DNA-Molekül transformiert werden, das für das Enzym β-Glucuronidase codiert, das toxisches Glyphosat aus nicht-toxischen Glyphosat-glucuronsäure-Konjugaten freisetzt.
  • Gemäß den voranstehenden Verfahren ist die Erfindung auch auf eine Zelle, die mit rekombinanter DNA wie in den Schritten (a) und/oder (c) oben definiert transformiert wurde, Pflanzen, die die in (a) und/oder (c) oben definierte rekombinante DNA enthalten, und hybrides Saatgut, das die in (a) und (c) oben definierte rekombinante DNA enthält, gerichtet.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 ist eine Darstellung der Konstruktion eines Antisense-Gen-Vektors, der für die Antisense-RNA-Inhibierung der Aktivität des β-Glucuronidase-Gens in transgenen Pflanzen eingesetzt wurde.
  • 2a ist eine schematische Darstellung einer Restriktionskarte und des codierenden Bereichs des Klons mit der Nummer L 4, eines mikrosporen-spezifischen Klons, der aus einer genomischen Bibliothek von Brassica napus isoliert wurde. Der Klon enthält drei ähnliche Kopien eines einzelnen Gens. Diese Gene werden als Bp4A, Bp4B und Bp4C identifiziert. Das erste (Bp4A) und das dritte (Bp4C) Gen sind funktionsfähig, das zweite Gen weist Veränderungen auf, die es wahrscheinlich nicht-funktionsfähig machen. Die Restriktionskarte ist schematischer Natur, wobei die nicht-transkribierten Bereiche als einzelne Linie gezeigt sind, während die transkribierten Bereiche als mit einem Kästchen umgebene Bereiche gezeigt sind. Das zweite Gen (Bp4B) wird auf Basis von Sequenz-Homologie identifiziert und ist als von einem Kästchen umgebener Bereich mit gepunkteter Linie gezeigt. Die Bezeichnung "del 220" bezieht sich auf eine ungefähr 220 Basenpaare lange Deletion/Umordnung, die wahrscheinlich das zweite Gen (Bp4B) in diesem Klon inaktiviert hat. Der Start der Transkription befindet sich ganz links außen in jedem des mit einem Kästchen umgebenen Bereiches (ausgenommen im Falle des Gens Bp4B), und Exon- und Intron-Stellungen sind bezeichnet, indem die Exons schwarz ausgefüllt sind, während die Intron-Positionen ungefüllt geblieben sind. Ein kleiner Pfeilkopf ist am untranskribierten 5'-Bereich eines jeden Gens gezeigt, und dieser Pfeilkopf dient dazu, den Promotor-Bereich eines jeden Gens anzuzeigen. Restriktionsschnittstellen sind so angegeben, das die Nummer des ersten Nucleotids der Restriktionsenzym-Erkennungsstelle gezeigt ist. Nicht alle Restriktionsschnittstellen sind gezeigt, sondern solche, die für die nachstehend beschriebenen Konstruktionen relevant sind. Die Gene sind mit dem 5'-Ende auf der linken Seite und dem 3'-Bereich auf der rechten Seite dargestellt. Die Zählung der DNA-Sequenz erfolgt von links nach rechts, 5' nach 3' in allen Fällen.
  • 2b ist eine schematische Darstellung einer Restriktionskarte und des codierenden Bereichs des Klons L 10 eines mikrosporenspezifischen Klons, der aus einer genomischen Bibliothek von Brassica napus isoliert wurde. Der Klon enthält ein einziges Gen. Der Start der Transkription, die Exon-, Intron- und Promotor-Stellungen sind wie in 2a bezeichnet. Restriktionsschnittstellen sind derart angegeben, dass die Zahl des ersten Nucleotids der Restriktionsenzym-Erkennungsstelle gezeigt ist. Die Gene sind mit dem 5'-Bereich auf der linken Seite und dem 3'-Bereich auf der rechten Seite gezeigt. Die Zählung der DNA-Sequenz erfolgt von links nach rechts, von 5' nach 3' in allen Fällen.
  • 2c ist eine schematische Darstellung der Restriktionskarte und des codierenden Bereichs von Klon Nummer L 16, einem mikrosporenspezifischen Klon, der aus einer genomischen Bibliothek von Brassica napus isoliert wurde. Der Klon enthält ein einziges Gen, das Ähnlichkeit mit dem Klon L 10 zeigt. Die Intron- und die Exon-Stellungen sind wie in 1 bezeichnet. Restriktionsschnittstellen sind so angegeben, dass die Nummer des ersten Nucleotids der Restriktionsenzym-Erkennungsstelle gezeigt ist. Die Gene sind mit dem 5'-Bereich auf der linken Seite und dem 3'-Bereich auf der rechten Seite gezeigt. Die Zählung der DNA-Sequenz erfolgt von links nach rechts, von 5' nach 3' in allen Fällen.
  • 2d ist eine schematische Darstellung der Restriktionskarte und des codierenden Bereichs von Klon Nummer L 19, einem mikrosporenspezifischen Klon, der aus einer genomischen Bibliothek von Brassica napus isoliert wurde. Der Klon enthält ein einziges Gen. Der Start der Transkription, Exon-, Intron- und Promotor-Stellungen sind wie in 1 bezeichnet. Restriktionsschnittstellen sind so angegeben, dass die Nummer des ersten Nucleotids der Restriktionsenzym-Erkennungsstelle gezeigt ist. Die Gene sind mit dem 5'-Bereich auf der linken Seite und dem 3'-Bereich auf der rechten Seite gezeigt. Die Zählung der DNA-Sequenz erfolgt von links nach rechts, von 5' nach 3' in allen Fällen.
  • 3a ist die vollständige Nucleotid-Sequenz des in 2a dargestellten Klons L 4. Aus Klarheitsgründen ist nur der codierende Strang gezeigt.
  • 3b ist die Nucleotid-Sequenz desjenigen Teils des Klons L 10, der in der Figur als unterstrichen in der 2b gezeigt ist. Aus Klarheitsgründen ist nur der codierende Strang dargestellt.
  • 3c ist die Nucleotid-Sequenz desjenigen Teils des in der Figur gezeigten Klons L 16, der in der 2c unterstrichen ist. Aus Klarheitsgründen ist einzig der codierende Strang gezeigt.
  • 3d ist die Nucleotid-Sequenz desjenigen Teils des in der Figur gezeigten Klons L 19, der in der 2d unterstrichen ist. Aus Klarheitsgründen ist nur der codierende Strang gezeigt.
  • 4 ist die Nucleotid-Sequenz von drei cDNA-Klonen, die aus einer aus Mikrosporen stammenden cDNA-Bibliothek von Brassica napus isoliert wurden. Diese Klone sind mit cBp401, cBp405 und cBp408 bezeichnet. Diese drei cDNA-Klone sind zu Mitgliedern der mikrosporenspezifischen Gen-Familie von L 4 aus Brassica napus (Bp4A, Bp4B, Bp4C) extrem homolog. Die Nucleotid-Sequenz von zweien dieser drei Mitglieder der mikrosporenspezifischen Gen-Familie von L 4 aus Brassica napus sind in dieser Figur dargestellt (Bp4A, Bp4C). Das Gen Bp4C wurde zum Vergleich als Muster- oder Hauptsequenz ausgewählt. Die abgeleitete codierende Nucleotid-Sequenz für die Gene Bp4A und Bp4C ist als Sequenz gezeigt, aus der die beiden Exons der Gene an den Stellen heraus und -zusammengespleißt wurden, aus denen sie in vivo normalerweise gespleißt werden. Dies führte zu der codierenden Sequenz in der reifen mRNA. Die cDNA-Klone sind derart über die Sequenz von Bp4C gelegt, dass nur Nucleotid-Veränderungen gezeigt sind. Die Sequenzen werden deshalb als Varianten einer einzigen Hauptsequenz des Gens Bp4C dargestellt, das in Linie 1 gezeigt ist. Das ATG-Startcodon wie auch das TGA- oder das TAA-Stopcodon sind unterstrichen. Diese drei cDNA-Klone entsprechen verwandten Mitgliedern der mikrosporenspezifischen Gen-Familie von Brassica napus, von der ein Teil im Klon L 4 enthalten ist.
  • 5 ist eine Nucleotid-Teilsequenz eines cDNA-Klons, der zu dem in Klon L 10 enthaltenen Gen, dessen Restriktionskarte in 2b gezeigt ist, äußerst homolog ist.
  • 6 ist die Nucleotid-Sequenz des cDNA-Klons, der das Gen-Produkt von Klon L 19 ist, dessen Restriktionskarte in 2d gezeigt ist.
  • 7 (7A, 7B, 7C, 7D) sind schematische Darstellungen der zu beschreibenden Produktion von Vektoren, die den Promotor und Promotorbereiche aus Klon L 4 enthalten. Die spezifischen Beispiele werden in Einzelheiten weiter unten diskutiert.
  • 8 ist eine schematische Darstellung der Produktion von Vektoren, die die Promotor-Bereiche des Klons L 10 enthalten; die Details hierzu werden weiter unten diskutiert.
  • 9 ist eine schematische Darstellung der Produktion von Vektoren, die die Promotor-Bereiche des Klons L 19 enthalten, wobei die Details hierzu weiter unten diskutiert werden.
  • 10 ist eine schematische Darstellung einer Restriktionskarte eines genomischen Klons von Brassica napus der ein Gen enthält, das in hohen Mengen in allen Zellen konstitutiv exprimiert wird, darunter auch in sich entwickelnden Pollenzellen. Derjenige Teil des Klons, der eingesetzt wurde, um Promotor-Bereiche für die Erzeugung von Antisense-RNA bereitzustellen, ist gezeigt; dieses Konstrukt führt zu einer Antisense-RNA, die einen Bereich transkribierter RNA aus diesem Gen enthält.
  • 11 ist eine schematische Darstellung der Produktion eines Gens, das für ein Polylysin-Protein codiert.
  • 12 ist eine schematische Darstellung der Produktion eines Antisense-Gens, das spezifisch für den Intron-Bereich des Klons L 19 ist, und eines Wiederherstellers, dem der Intron-Bereich, der für die Antisense-RNA-Inhibition vorgesehen ist, fehlt.
  • 13 ist eine Darstellung des Verfahrens, das verwendet wird, um das T-DNA-Gen 2 (das IamH-Gen) des Agrobacterium tumefaciens Ti-Plasmids zu isolieren, und der Herstellung einer promotorlosen Version dieses Gens.
  • 14 ist eine schematische Darstellung der Herstellung von Klonen, die Versionen eines für die A-Kette von Ricin codierenden Bereichs enthalten.
  • 15 ist ein Histogramm, das die GUS-Aktivität in Pflanzen zeigt, die mit Sense- und Antisense-GUS-Genen transformiert sind.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • In 1 ist eine schematische Darstellung der Erzeugung des Antisense-Vektors PAL 1302 gezeigt. Ein Plasmid, das das GUS-Gen (beta-Glucuronidase, beschrieben in Jefferson, R. A., Plant Molecular Biology Reporter, 1987, 5: 387–405) in Antisense-Orientierung und flankiert durch den CaMV 35S-Promotor und das nos ter-Terminationssignal enthielt, wurde aus dem Vektor pBI 221.1 (zu beziehen von Clonetech Laboratories, Palo Alto, CA, USA) erhalten. Die zwischen dem CaMV 35S-Promotor und dem nos ter des Vektors pBI 221.1 gefundene, für GUS codierende Sequenz wurde ausgeschnitten und mit den Restriktions-Enzymen Sma I und Sst I verdaut. Die Sst I-Schnittstelle wurde mit Hilfe des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase I glattendig gemacht, und der glattendige Vektor und die für GUS codierende Sequenz wurden religiert. Ein Plasmid (pPAL 303), welches die für GUS codierende Sequenz bezüglich der Transkriptions-Richtung des CaMV 35S-Promotors invertiert enthielt, wurde identifiziert.
  • Der binäre Vektor PAL 1302, der das Antisense-GUS-Gen enthält, wurde unter Verwendung des Vektors pVU 1011 (bezogen vom Plant Breeding Institute, Cambridge, UK) konstruiert. pVU 1011 enthält die für Hygromycin-Phosphotransferase codierende Sequenz, flankiert durch den CaMV 35S-Promotor und das nos ter, insertiert in den Polylinker des binären Agrobacterium-Vektors Bin 19, wie von Bevan, M., Nucl. Acids Res. 1984, 12: 8711–8721 beschrieben. Der Vektor pVU 1011 kann transformierten Pflanzen sowohl Resistenz gegenüber Hygromycin als auch gegenüber Kanamycin verleihen. Die Insertion des Fragments aus dem CaMV 35S-Promotor, der Antisense-GUS und nos ter wurde derart bewirkt, dass das NPT II-Gen dieses Vektors inaktiviert wurde, und wurde wie folgt durchgeführt. Ein kleines Sph I-Pst I-Restriktionsfragment, das den rechten Rand ("right border", RB), den NOS-Promotor und den Anfang der für NPT II codierenden Sequenz von pVU 1011 enthielt, wurde zuerst in die dem CaMV 35S-Promotor von pPAL 303 vorangehenden Sph I- und Pst I-Schnittstellen subkloniert, wobei pPAL 306 gebildet wurde. Die Verdauung von pPAL 306 mit Sph I und Eco RI setzte ein Fragment frei, das aus dem RB, dem NOS-Promotor, dem Beginn der für NPT II codierenden Sequenz und dem CaMV 35S-Promotor-Antisense-GUS nos ter-Kontrukt bestand. Dieses Fragment wurde sodann in die Sph I-Schnittstellen von pVU 1011 ligiert, indem der Ligationsmischung mit Eco RI und Sph I geschnittenes pGEM-4Z (Promega Biotech, Madison, WI, USA) zugesetzt wurde, um ein kleines Fragment aus Polylinker als Brücke zwischen der Sph I-Schnittstelle von pVU 1011 und der Eco RI-Schnittstelle des aus pPAL 306 eingesetzten Stücks zu liefern. Die Orientierung des Insertionsstücks wurde bestätigt, und ein binärer Vektor (PAL 1302), der ein rekonstruiertes RB-Fragment und ein NPT II-Gen besaß, das durch die Insertion von CaMV 35S-Promotor-Antisense-GUS-Gen-nos ter inaktiviert war, wurde identifiziert. Dieser Vektor kann Pflanzen eine Resistenz nur gegenüber Hygromycin verleihen und trägt das Antisense-GUS-Gen.
  • In den 2a–d sind die in den vier mikrosporenspezifischen Klonen enthaltenen Gene aus Brassica napus in der Orientierung 5' nach 3' gezeigt. Wie dargestellt, entspricht der 5'-Bereich dem Promotor-Bereich; er ist mit einem kleinen Pfeilkopf bezeichnet. Der 3'-Bereich bezeichnet den Endpunkt der Transkription des Gens. Die Klone L 4, L 10 und L 19 wurden für die Isolation von mikrosporenspezifischen Promotor-Fragmenten und für die Isolierung von mikrosporen-spezifischen codierenden Bereichen verwendet. Die nicht transkribierten Bereiche sind als einzelne dünne Linie dargestellt, während die Bereiche der Klone, die transkribiert werden, durch einen in einem Kästchen angeordneten Bereich markiert sind. Innerhalb dieses mit einem Kästchen versehenen Bereichs ist derjenige Teil der transkribierten DNA, die die Exon-Bereiche darstellt, schwarz ausgefüllt, während die Intron-Sequenzen ungefüllt bleiben. Die ungefähren Bereiche der DNA, die für die Klone L 10, L 16 und L 19 sequenziert wurden, sind durch Unterstreichen gezeigt. Die angegebenen Restriktions-Schnittstellen sind diejenigen, die für die nachstehend im Einzelnen beschriebenen Konstrukte von Bedeutung sind. Der rechte und der linke Arm des Lambda-Klonierungs-Vektors sind nicht gezeigt.
  • In den 3a–d ist die vollständige DNA-Sequenz des Klons L 4 zusammen mit den DNA-Sequenzen derjenigen Teile der Klone L 10, L 16 und L 19 gezeigt, die in den 2a–d angegeben sind. In 3a, dem Klon L 4, befindet sich das Nucleotid 1 in der vollständigen Sequenz an der am weitesten links befindlichen Eco R1-Schnittstelle, während das Nucleotid 8579 das erste Nucleotid der am weitesten rechts gelegenen Eco R1-Schnittstelle ist. Der Start der Transkription des Gens 1 in Klon L 4 ist das Nucleotid 235. Die 5'- und 3'-Intron-Spleißstellen sind fett gedruckt. Das ATG-Startcodon ist genauso gezeigt wie das Stopcodon für die Termination. Die abgeleitete Aminosäuren-Sequenz der durch diese Gene codierten Proteine ist ebenfalls gezeigt. Das Ende der Transkription für Gen 1 liegt ungefähr bei Nucleotid 1427. Das zweite Gen in Klon L 4 ist sehr wahrscheinlich infolge einer Insertion und einer Deletion, die im Bereich des Promotors und des ersten Exons auftreten, nicht-funktionell. Dieses Gen wurde nicht für Konstrukte eingesetzt. Das dritte Gen in Klon L 4 besitzt einen Transkriptionsstart in der Position mit der Nummer 6298 in der DNA-Sequenz, und die Transkription endet ungefähr bei Nucleotid 7490. Das ATG-Startcodon, die Intron-Spleißstellen und das Stop-Codon für die Termination sind alle wie oben dargestellt. Vektoren wurden aus diesem Klon konstruiert, wobei sowohl Promotor-Fragmente aus den beiden Genen 1 und 2 als auch Promotor-Fragmente aus den Genen 1 und 2, die die ersten Exon- und Intron-Sequenzen und einen kurzen Teil des zweiten Exons für jedes der Gene enthielten, eingesetzt wurden. Die spezifischen Promotorfragment-Konstrukte werden nachstehend im Einzelnen erläutert.
  • In 3b ist die Nucleotid-Sequenz des in 2b markierten Bereichs des Klons L 10 gezeigt. Der Start der Transkription liegt bei Nucleotid 1. In dieser Sequenz befindet sich das ATG-Startcodon bei den Nucleotiden 45–47, das erste Exon endet bei Nucleotid 315, das zweite Exon beginnt bei Nucleotid 476 und erstreckt sich bis zum Nucleotid 1586. Das dritte Exon beginnt bei 1673 und erstreckt sich ungefähr bis zu dem Nucleotid 1989; das genaue Ende der Transkription wurde nicht bestimmt. Die abgeleitete Aminosäure-Sequenz ist ebenfalls gezeigt. Für einige Promotor-Konstrukte wurde der Bereich des Klons 5' des sequenzierten Teils eingesetzt. Die spezifischen Einzelheiten der Konstrukte sind weiter unten aufgelistet.
  • In 3c ist die Nucleotid-Sequenz des Klons L 16 gezeigt. Der Klon L 16 zeigt eine bemerkenswerte Homologie zu dem Klon L 10, insbesondere in den Teilen der beiden Klone, die für eine Protein-Sequenz codieren. Die Intron-Sequenzen zwischen den beiden Klonen unterscheiden sich dagegen deutlich. Der Klon L 16 enthält keine 5'-Promotor-Region und wurde als solcher nur als Quelle für codierende Sequenzen für Antisense-RNA-Konstrukte eingesetzt. Das Nucleotid 1 markiert eine Eco RI-Schnittstelle, die in einem codierenden Bereich der DNA auftritt, die homolog zu dem ersten Exon des Klons L 10 ist. Dieser codierende Bereich erstreckt sich homolog bis zum Nucleotid 124, wo sich das erste Intron befindet. Dieses Intron, das sich an derselben relativen Stellung wie das erste Intron des Klons 10 befindet, ist länger als das Intron in Klon L 10 und erstreckt sich bis zum Nucleotid 688. Das Nucleotid 689 ist der Beginn des zweiten Exons, und dieses Exon, das eine strenge Homologie mit dem zweiten Exon des Klons L 10 zeigt, erstreckt sich bis zum Nucleotid 1793. An diesem Punkt gibt es ein zweites Intron, und dieses Intron erstreckt sich bis zu dem Nucleotid 1909. Das dritte Exon beginnt bei 1910 und reicht ungefähr bis zu dem Nucleotid 2210. Die abgeleitete Aminosäure-Sequenz ist ebenfalls für spezifische Bereiche des Klons gezeigt, die eine deutliche Homologie zu dem Klon L 10 zeigen. Das genaue Nucleotid, an dem die Transkription aufhört, ist nicht ermittelt worden.
  • In 3d ist die Nucleotid-Sequenz des in 2d markierten Bereichs von Klon L 19 gezeigt. Der Beginn der Transkription befindet sich in Position 1 in der Sequenz. Das ATG-Startcodon liegt bei den Nucleotiden 136 bis 138, und das erste Intron beginnt bei Nucleotid 1201. Dieses Intron endet bei Nucleotid 1338, wo das zweite Exon anfängt. Das Ende der Transkription liegt ungefähr bei dem Nucleotid 2074. Die abgeleitete Aminosäure-Sequenz ist ebenfalls gezeigt.
  • In 4 sind die DNA-Sequenzen von drei cDNA-Klonen gezeigt, die homolog zu den in Klon L 4 enthaltenen Genen sind. Die DNA-Sequenz dieser drei cDNA-Klone wie auch die Sequenz der korrekt gespleißten, transkribierten Bereiche der Gene Bp4A und Bp4C im genomischen Klon L 4 sind passend untereinander dargestellt, wobei nur die Nucleotid-Unterschiede innerhalb dieser Klone gezeigt sind, während Nucleotide, die zwischen den Sequenzen konserviert sind, nur in der oberen Sequenz erscheinen. Die in 4 dargestellten Sternchen markieren das 5'-Ende der cDNA-Klone cBp401, cBp405 und cBp408.
  • In 5 ist der Teil der Nucleotid-Sequenz eines cDNA-Klons gezeigt, der homolog zu dem codierenden Bereich des Klons L 10 ist. Dieser cDNA-Klon ist ungefähr 1,3 kB lang und besitzt Eco R1-Schnittstellen an den 5'- und 3'-Enden der cDNA-Sequenz, die mit Hilfe von synthetischen Linkem während des cDNA-Klonierungsverfahrens angefügt worden waren.
  • In 6 ist die Nucleotid-Sequenz desjenigen cDNA-Klons gezeigt, der dem codierenden Bereich des Klons L 19 entspricht. Identifiziert in dieser Sequenz ist die Eco RV-Schnittstelle, die sich am 5'-Ende des transkribierten Bereichs von L 19 befindet. Ein Teil des poly-A-Schwanzes ist gezeigt. Nicht gezeigt sind die Eco RI-Schnittstellen, die als Linker während des cDNA-Klonierungsverfahrens angefügt wurden; diese Schnittstellen befinden sich benachbart zu den 5'- und 3'-Enden des cDNA-Klons.
  • In 7 (a, b, c, d, e) wird die Konstruktion von sechs Vektoren beschrieben, die den Promotor und Promotor-Fragmente aus dem Klon L 4 enthalten. Der erste Schritt in der Konstruktion dieser Vektoren erfolgte, indem zuerst das Eco R1-Sst 1 (Nucl. 1-2132) Fragment, das das erste Gen des Klons L 4 (235 Basenpaare von Promotor/Exon/Intron/zweitem Exon) enthielt, in den kommerziell erhältlichen Vektor pGEM-4Z (Promega Biotech, Madison, WI, USA) unter Verwendung der Eco R1-Sst 1-Schnittstellen des Polylinkers dieses Vektors subkloniert wurde. Dieses Plasmid wurde mit pPAL 0402 bezeichnet. Das 2,7 kB lange Eco RI-Fragment des Klons L4, das das dritte Gen (Bp4C) enthält, wurde dann in die Eco RI-Schnittstelle von pGEM 4Z einkloniert, was zu einem Plasmid führte, das pPAL 0411 genannt wurde. Das Plasmid pPAL 0402 wurde dann mit Eco R1 verdaut, und das 2,7 kB Eco R1-Fragment aus pPAL 0411 (Nucl. 5859–8579), das das Gen Nummer drei (Bp4C) aus Klon L4 enthält, wurde hinzugefügt. Es wurden Klone gewonnen, die dieses insertierte 2,7 kB lange Eco R1-Fragment in beiden Orientierungen relativ zur Promotorregion des ersten Gens enthalten. Ein Klon, der dieses dritte Genfragment in einer solchen Orientierung enthielt, dass der Promotor des dritten Gens in gegensätzlicher Richtung zum Promotor im ersten Gen lag, wurde ausgewählt und mit pPAL 0403 bezeichnet. Das Plasmid pPAL 0403 enthält das gesamte dritte Gen aus Klon L4 in einer solchen Art und Weise orientiert, dass sich die Promotorregion in unmittelbarer Nachbarschaft zur 235 Basenpaare langen Promotorregion des ersten Gens in pPAL 0403 befindet. Dieses Plasmid, pPAL 0403, wurde mit Dde I verdaut, wodurch ein Fragment mit einer Länge von ungefähr 1,9 kB entstand. Die Dde I-Schnittstellen befinden sich auf den Nukleotiden 303 und 7366. Wegen der Orientierung dieser Fragmente führt die Verdauung mit Dde I zu einem 1,9 kB-Fragment. Dieses 1,9 kB lange Fragment enthält eine Kopie des dritten Gens (Bp4C) in einer solchen Orientierung, dass die Transkriptionsrichtung dieses dritten Gens von rechts nach links verläuft, fusioniert mit dem 235 Basenpaare langen Promotorfragment des ersten Gens von Klon L4 (Bp4A), das von links nach rechts transkribiert wird, endend in einer Dde I-Schnittstelle, die sich 67 Basenpaare strangabwärts zur hauptsächlichen Startstelle der Transkription befindet und zwei Nucleotide vor diesem ATG Translationsstart-Codon steht. Dieses 1,9 kB lange Dde I-Fragment wurde mit Klenow-Fragment glattendig gemacht und in die Xba 1-Schnittstelle der Polylinker-Region von pGEM 4Z kloniert, die zuvor mit Klenow-Fragment glattendig gemacht worden war. Das gebildete Plasmid pPAL 0408 wurde isoliert und anschließend mit Sal 1 und Sst 1 verdaut, wodurch das klonierte Dde I-Fragment freigesetzt wurde, auf der linken Seite (Nucl. 7366) von Sal 1 begrenzt und auf der rechten Seite (Nucl. 303) dieses Konstrukts, und das einen Teil des Polylinkers von pGEM 4Z mit den folgenden jeweils nur einmal vorkommenden Schnittstellen enthält: Die Restriktionsenzym-Schnittstellen Bam HI, Sma I, Kpn I und Sst I. Dieses Sal I-Sst I-Fragment wurde in die Sal I-Sst I-Schnittstellen von PAL 1001 kloniert. PAL 1001 ist der binäre Vektor Bin 19 (beschrieben von Bevan, M., Nucleic Acids Res., 1984, 12: 8711–8721), dem das nos ter Polyadenylierungssignal als aus dem Plasmid pRAJ 221 (zu beziehen von Clonetech Laboratories, Palo Alto, CA USA) isoliertes 260 Bp langes Sst 1-Eco R1-Fragment in die Sst 1-Eco R1-Schnittstellen der Polylinker-Region von Bin 19 hinzugefügt worden war. Dieses nos ter wird als gepunkteter Kasten dargestellt. Der binäre Transformationsvektor, der aus der Insertion des Sal I-Sst I-Fragments von pPAL 0408 in PAL 1001 resultierte, wurde mit PAL 1107 bezeichnet. Die Einzelheiten der Konstruktion sind in 7a dargestellt. Dieser Vektor besitzt eine Kopie des dritten Gens in einer solchen Orientierung, dass die Transkription dieses dritten Gens von rechts nach links gerichtet ist, fusioniert mit dem 235 Basenpaare langen Promotor-Fragment des ersten Gens von Klon L4, das von links nach rechts transkribiert wird, und gefolgt von einem Polylinker mit singulären Schnittstellen für die Insertion von DNA, bestehend aus: Bam HI, Sma I, Kpn I und Sst I, woran sich das nos ter-Signal anschließt. Dieser Vektor hat die Eigenschaft, dass zusätzlich in 5'-Richtung nicht codierende Sequenzen strangaufwärts zum 235 Basenpaare langen Core-Promotor auf Bp4A angeordnet sind, diese zusätzlichen 5'-Sequenzen sich aber in einer entgegengesetzten Orientierung befinden. Das Vorliegen dieser Sequenzen in dieser Orientierung beeinträchtigt die Pollenspezifität des 235 Basenpaare langen Core-Promotors nicht.
  • Zusätzlich zu diesem Vektor wurden ähnlich strukturierte Vektoren hergestellt, die im Wesentlichen die gleiche Art der Genpromotor-Anordnung enthielten, aber das Intron des ersten Gens (Bp4A) von Klon L4 enthielten. Es ist gezeigt worden, dass Intron-Sequenzen in Pflanzengenen in manchen Fällen eine Rolle bei der Genexpression spielen. Dieser intronhaltige Vektor wurde erzeugt, indem eine Deletionsreihe des Klons pPAL 0402 gemacht wurde. pPAL 0402 wurde zuerst mit Pst I und Sma I verdaut. Exonuclease III wurde eingesetzt, um die DNA wie dargestellt in einer Richtung zu verdauen (7b). Nach Behandlung mit S1-Nuclease und Reparatur mit Klenow wurde das Plasmid religiert, und es wurden Klone gewonnen, bei denen verschiedene Teile der codierenden Regionen des Gens Bp4A herausverdaut worden waren. Die Deletions-Subklone wurden sequenziert. Einer wurde für Vektorkonstrukte ausgewählt. Dieser wird als Deletion 23B bezeichnet. Dieser Subklon war Vertreter für eine Deletion, aus der das meiste des zweiten Exons von Gen Bp4A entfernt war, der aber die Intron-Spleißstelle und das erste Exon des Gens Bp4A enthält. Dieser Subklon enthält einen Teil des Klons L4, der sich von Nucleotid 1 bis Nucleotid 1166 erstreckt. Zu diesem Subklon wurde das 2,7 kB lange Eco R1-Fragment von pPAL 0411 gegeben, das das dritte Gen von L4 (Bp4C) in einer solchen Orientierung enthält, dass die Transkriptionsrichtung des dritten Gens von rechts nach links ist (wie in PAL 1107, pPAL 0408), fusioniert mit der 235 Basenpaare langen Promotorregion des ersten Gens von Klon L4, das so orientiert ist, dass die Transkription von links nach rechts verläuft, gefolgt vom ersten Exon des Gens 1, dem gesamten Intron von Gen 1 und 33 Nucleotiden des zweiten Exons von Gen Bp4A aus Klon L4. Dieses Plasmid, das die Deletion 23B und das 2,7 kB lange Eco R1-Fragment mit dem dritten Genfragment enthielt, wurde pPAL 0406 genannt. Dieses Plasmid wurde mit Hind III verdaut, was zu einem Fragment führt, das einen kleinen Teil des Promotors des dritten Gens sowie den gesamten Promotor des ersten Gens, das erste Exon, Intron und einen Teil des zweiten Exons enthält. Dieses Hind III-Fragment wurde in die Hind III-Schnittstelle von PAL 1001 insertiert, woraus der Vektor PAL 1106 (abstammend von der Deletion 23B) resultiert. Dieser Vektor besitzt, in der nachstehenden Reihenfolge, einen Teil des Promotors aus dem dritten Gen in Klon L4, den gesamten 235 Basenpaare langen Promotor des ersten Gens in Klon L4, gefolgt vom ersten Exon, dem Intron und einem Teil des zweiten Exons von Gen 1 von Klon L4, gefolgt von einem Polylinker mit den folgenden singulären Klonierungsschnittstellen: Sal I, Xba I, Bam HI, Sma I, Kpn I und Sst I, und dem nos ter-Polyadenylierungssignal. Das Konstrukt ist in 7b dargestellt.
  • Weitere Konstrukte mit den Promotor-Regionen der in Klon L4 enthaltenen Gene wurden gemacht, um eine Anzahl geeigneter Vektoren bereitzustellen, die für die pollenspezifische Expression von Gensequenzen eingesetzt werden können. Die drei Gene in Klon L4 (Bp4A, Bp4B, Bp4C) zeigen eine sehr beinahe-exakte DNA-Homologie, und dies ist zwischen dem ersten (Bp4A) und dem dritten (Bp4C) Gen besonders offensichtlich. Das zweite Gen (Bp4B) ist eine homologe Kopie, die Sequenzveränderungen unterworfen wurde, die anscheinend zu einer Inaktivierung geführt haben. Die ausgedehnte Ähnlichkeit zwischen dem ersten, dem zweiten und dem dritten Gen in Klon L4 ist auch in der Promotor-Region vorhanden, so dass es unter den ersten 235 Nucleotiden der ersten und der dritten Genpromotor-Region nur 5 Nucleotide gibt, die voneinander abweichen. Strangabwärts zur TATA-Box in diesen beiden Promotoren ist der einzige Unterschied zwischen beiden das Vorhandensein eines zusätzlichen Nucleotids am Start der Transkription. Beispielsweise zeigt der Vergleich von Promotor 1, Bp4A in einer teilweisen Darstellung als:
    .......TATGTTTtAAAA... mit dem Promotor 3, Bp4C, in einer teilweisen Darstellung als:
    .......TATGTTTAAAA...., dass die unterstrichene transkribierte Region im einzelnen Nucleotid in Kleinbuchstaben differiert. Innerhalb der Sequenz des ersten Gens tritt jedoch eine Nucleotidveränderung auf, die eine Dde I-Schnittstelle (Nucl. 303) in die nicht-translatierte 5'-Leader-Sequenz strangaufwärts des ATG-Startcodons einführt, die in der nicht-transkribierten Leader-Sequenz des dritten Gens in Klon L4 nicht vorhanden ist. Es wurden chimäre Promotor-Konstrukte hergestellt, die diese Dde I-Schnittstelle im ersten Gen zur Kombination mit Sequenzen aus dem dritten Genpromotor nutzten. Die Region des für diese Konstrukte eingesetzten ersten Promotors bestand aus den Sequenzen, die zwischen der Sna BI-Schnittstelle (Nucl. 210) nahe der TATA-Box bis zur unmittelbar strangaufwärts vor dem ATG-Startcodon gelegenen Dde I-Schnittstelle im ersten Gen enthalten waren (das Nucleotid 303 ist das erste Nucleotid in der Erkennungssequenz für Dde I). Die andere Region dieses chimären Promotors (5' zur TATA-Box gelegen) war ein Fragment, das sich von der Eco R1-Schnittstelle des dritten Promotors (Nucleotid 5858) bis zu der Sna B1-Schnittstelle nahe der TATA-Box (Nukleotid 6272) erstreckte. Um die Konstruktion dieser pollenspezifischen Vektoren zu erleichtern, wurden deshalb die folgenden Rekonstruktionen durchgeführt.
  • Das von Eco R1 bis Dde 1 reichende Fragment, das die Promotor-Region des ersten Gens in Klon L4 umfaßt, wurde isoliert, indem zuerst pPAL 0402 mit Dde 1 geschnitten, mit Klenow glattendig gemacht und schließlich mit Eco R1 geschnitten wurde. Das dieser Region entsprechende 235 Basenpaare lange Fragment wurde in die Eco R1-Sma 1-Schnittstellen von pGEM 4Z kloniert. Dieses Plasmid (pPAL 0422) wurde dann mit Eco R1 und Sna B1 geschnitten. Ein DNA-Fragment, das den von Eco RI bis Sna BI reichenden Teil des Promotors für das Gen 3 in Klon L4 enthielt, wurde isoliert, indem pPAL 0411 mit Eco R1 und Sna B1 verdaut wurde. Dies setzte ein ungefähr 415 Basenpaare langes, von Eco RI (Nucl. 5858) bis Sna BI (Nucl. 6273) reichendes Fragment frei, das den größten Teil der 5'-Region des Gen 3-Promotors aus Klon L4 enthält (die Sna B1-Erkennungsstelle befindet sich 2 Basenpaare strangabwärts der TATA-Box). Dieses Eco R1-Sna B1-Fragment wurde verwendet, um das kürzere Eco R1-Sna B1-Fragment, das aus dem ersten Promotor-Subklon (pPAL 0422) entfernt worden war, zu ersetzen, wodurch ein Promotor-Fragment mit einer Länge von ungefähr 550 Basenpaaren rekonstruiert wird. Dieses Plasmid wird mit pPAL 0421 bezeichnet. Dieses chimäre Promotor-Fragment enthält 415 Basenpaare des Promotors von Gen Drei in Klon L4, gefolgt von ungefähr 99 Nukleotiden der ersten Genpromotor-/untranslatierten Leader-Sequenz.
  • Für die Konstruktion eines pollenspezifischen Kassetten-Vektors wurden zuerst die folgenden Plasmide konstruiert. Das erste konstruierte Plasmid enthielt das nos ter-Polyadenylierungssignal mit einem Polylinker vor dem nos ter-Signal. Dies wurde bewirkt, indem zuerst aus pRAJ 221 das nos ter als Sst 1-Eco R1-Fragment isoliert wurde und dieses Fragment unter Verwendung der Sst 1- und Eco R1-Schnittstellen im Polylinker in pGEM 4Z kloniert wurde. Dieser Subklon wird als pPAL 001 bezeichnet. An pPAL 001 wurde ein Fragment in Antisense-Orientierung angefügt, das für Neomycin-Phosphotransferase (NPT II) codiert und aus dem Plasmid pRAJ 162 stammt, und zwar wie folgt: Das Plasmid pRAJ 162 enthält das NPT II-Gen aus dem Transposon TN 5 insertiert als Sal I-Fragment und begrenzt von einem Polylinker im Plasmid pUC-9 (das vom Plant Breeding Institute, Cambridge, UK erhalten wurde). pRAJ 162 wurde mit Hind III und Sma I verdaut. Das das NPT II-Gen enthaltende DNA-Fragment wurde durch Elution aus einem Agarosegel isoliert. pPAL 001 wurde mit Hind III und Sma I verdaut, und das NPT II-Gen-Fragment wurde insertiert. Das resultierende Plasmid wurde pPAL 002 genannt und hatte die folgende Orientierung der Restriktions-Schnittstellen und des NPT II-Gens und von nos ter: HIND III, Pst I, Sal I, 3'-Ende NPT II-codierende Sequenz 5'-Ende, Sal I, Bam HI, Sma I, Kpn I, Sst I, nos ter, Eco RI. pPAL 002 wurde mit Hind III geschnitten, und die Schnittstellen wurden durch den Einsatz von Klenow-Fragment glattendig gemacht. pPAL 0421 wurde mit Hinc II und Pvu II verdaut, die beide glatte Ende hinterlassen, und das Promotor-Fragment wurde in mit Hind III geschnittenes, glattendiges pPAL 002 ligiert. Man erhielt Plasmide, die den Promotor in beiden Orientierungen relativ zum nos ter-Signal enthielten. Ein Plasmid mit der richtigen Orientierung (5' Promotor/Antisense NPT II/nos ter) wurde ausgewählt und pPAL 0419 genannt. pPAL 0419 besitzt die folgenden DNA-Fragmente: Einen kleinen Teil (ungefähr 130 Bp) pGEM 4Z, das den SP6-Promotor enthält, den 550 Basenpaare langen chimären Promotor, das NPT II-Gen in Antisense-Orientierung relativ zum Promotor, gefolgt vom nos ter Polyadenylierungssignal. Dieses gesamte Promotor/NPT II/nos ter-Konstrukt kann mit Hilfe von Eco RI ausgeschnitten werden. pPAL 0419 wurde mit Eco RI verdaut, und die Promotor-NPT II-nos ter-Struktur wurde unter Verwendung der einzelnen Eco RI-Schnittstelle im Polylinker von BIN 19 in letzteres hineinkloniert. Der resultierende Transformations-Vektor wurde mit PAL 1419 bezeichnet. Zusätzlich zum NPT II-Antisense-Gen enthält der Vektor ein konstitutives NPT II-Gen unter der Kontrolle des nos-Promotors. Dieser Vektor verleiht daher Resistenz gegenüber Kanamycin in allen Zelltypen mit der Ausnahme von Pollenzellen, in denen die Genexpression vom konstitutiven Promotor durch die Antisense-RNA, die vom in PAL 1419 enthaltenen Promotor/NPT II/nos ter-Konstrukt gebildet wird, inhibiert ist.
  • Um Promotor-Sequenzen bereitzustellen, die mit zusätzlichen Genkonstrukten eingesetzt werden könnten, wurde das Plasmid pPAL 0419 mit Sal I verdaut. Diese Verdauung entfernt die für NPT II codierende Region, und dieses mit Sal I verdaute pPAL 0149 wurde religiert, was zu pPAL 0420 führte. pPAL 0420 umfasst den pollenspezifischen Promotor, gefolgt von einem Polylinker für die Insertion von Genen, der die folgenden singulären Schnittstellen besitzt: Hinc II, Pst I, Sal I, Bam HI, Sma I, Kpn I, Sst I, gefolgt vom nos ter-Polyadenylierungs-Signal. Das gesamte Promotor/Polylinker/nos ter-Konstrukt kann bequem als einzelnes Eco R1-Fragment ausgeschnitten werden. Die Einzelheiten dieses Konstrukts sind in 7c dargestellt.
  • Zur Erzeugung zusätzlicher Konstrukte mit pollenspezifischen Promotoren wurde der folgende Weg eingeschlagen. Der intakte L4-Klon im Lambda-Klonierungsvektor wurde mit den Restriktionsenzymen Sst I und Hha I vollständig verdaut. Die resultierenden Fragmente wurden mittels Gelelektrophorese getrennt, und ein 2,65 kB langes Fragment wurde isoliert, das den Promotor/erstes Exon/Intron/Teilbereich des zweiten Exons von Gen drei in Klon L4 enthält und den Nucleotiden 4565 bis 7216 in der Sequenz von Klon L4 entspricht. Dieses Fragment wurde mit Klenow glattendig gemacht und in den zuvor beschriebenen binären Transformationsvektor PAL 1001 kloniert. PAL 1001 wurde zuerst mit Hind III geschnitten und mit Klenow glattendig gemacht. Klone mit diesem Fragment (Promotor/erstes Exon/Intron/Teil des zweiten Exons) wurden gewonnen. Man wählte einen Klon, der dieses Fragment in der korrekten Orientierung enthielt, so dass die Transkriptions-Richtung in Richtung des nos ter in PAL 1001 erfolgte. Dieser Vektor wurde PAL 1421 genannt. Dieser Vektor enthält ungefähr 1,9 kB der strangaufwärts gelegenen Promotor-Region aus dem Gen 3 in Klon L4, gefolgt vom ersten Exon, dem vollständigen Intron und 15 Basen des zweiten Exons von Gen Drei, gefolgt von einem Polylinker, der die folgenden singulären Schnittstellen aufweist: Sal I, Xba I, Bam HI, Sma I, Kpn I, Sst I, und schließlich das nos ter-Polyadenylierungs-Signal. Eine Variante dieses Vektors wurde konstruiert, indem PAL 1421 mit Eco RI verdaut und das Fragment dieses Klons isoliert wurde, das die Promotor-Polylinker-nos ter-Sequenzen enthält, aber weniger der strangaufwärts gelegenen Region des Promotors enthielt. Dieses Fragment wurde in PAL 1009 re-kloniert. PAL 1009 ist ein von BIN 19 stammender Vektor, aus dem der größte Teil des Polylinkers entfernt worden ist. Dieser Vektor wurde konstruiert, indem BIN 19 mit Hind III und Sst I verdaut wurde, diese Schnittstellen mit Klenow glattendig gemacht und so religiert wurden, dass ein Vektor entstand, der eine einzige Eco RI-Schnittstelle für die Insertion von Fragmenten enthielt. PAL 1009 wurde mit Eco RI verdaut, und das Eco RI-Fragment aus PAL 1421, das eine kürzere Struktur aus Promotor/Exon/Intron/zweitem Exon/Polylinker/nos ter enthält, wurde hieran angefügt. Dies führte zum Vektor PAL 1422, einem Vektor, der im wesentlichen mit PAL 1421 identisch ist, mit der Ausnahme, dass weniger 5'-Promotor-Region vorhanden ist. Es sollte angemerkt werden, dass sowohl PAL 1421 als auch PAL 1422 das Intron aus dem dritten Gen enthalten. Für Konstrukte, in denen das Vorhandensein des Introns möglicherweise nicht wünschenswert ist, wurden Intron-Sequenzen aus PAL 1421 entfernt, indem PAL 1421 zuerst mit Eco RI verdaut und dann die Struktur aus Promotor/Exon/Intron/zweitem Exon/Polylinker/nos ter mit Hilfe von Eco R1 gegen die Promotor/Polylinker/nos ter-Struktur von pPAL 0420 ausgetauscht wurde, so dass im binären Transformations-Vektor eine längere 5'-Promotor-Region rekonstruiert wird. Der gebildete Vektor wurde PAL 1423 genannt. Die Erläuterung zu dieser Konstruktion ist in 7d dargestellt.
  • In 7e wird ein schematisches Diagramm der Verwandtschaft der oben beschriebenen Vektoren gezeigt. Es sollte angemerkt werden, dass die in dieser Figur dargestellten Vektoren in drei Kategorien fallen: 1. Vektoren, die 5'-strangaufwärts gelegene Promotor-Regionen enthalten, die im wesentlichen aus der strangaufwärts gelegenen Region des Gens Bp4C stammen (pPAL 0420, PAL 1420, PAL 1423), 2. Promotorkonstrukte, die 5'-strangaufwärts gelegene Promotor-Regionen und Intron-Sequenzen aus dem Gen Bp4C enthalten (PAL 1422, PAL 1421), und 3. Promotoren, die eine chimäre 5'-strangaufwärts gelegene Region enthalten, in der ein Teil der 5'-DNA-Sequenz im Verhältnis zu der Anordnung, die im genomischen Klon erscheint, invertiert ist, und die das Promotor-Fragment von Bp4A als Core-Promotor-Struktur nutzen (PAL 1107, PAL 1106). Es sollte angemerkt werden, dass das Funktionieren eines jeden dieser Konstrukte von Pflanzenart bzw. -sorte zu Pflanzenart bzw. -sorte schwanken kann, und es kann wünschenswert sein, eine Anzahl dieser Promotor-Konstrukte zu testen, wenn man bestimmte Ausführungsformen dieser Erfindung durchführen möchte.
  • Die Konstruktion von pollenspezifischen Vektoren, in denen die Promotor-Regionen der Klone L10 und L19 verwendet werden, wurde wie folgt ausgeführt. Die Konstruktion der in 8 dargestellten pollenspezifischen Vektoren nutzt Promotor-Regionen aus Klon L10. Der Start der Transkription des Klons L10 befindet sich bei Nucleotid 1. Das ATG-Startcodon befindet sich bei den Nucleotiden 45 bis 47. Die Promotor-Region dieses Klons wurde ausgeschnitten, indem zuerst das Eco RI-Xba I-Fragment des Klons, das die gesamte Promotor-Region und einen Teil des ersten Exons (die Xba I-Schnittstelle ist in der DNA-Sequenz Nukleotid 359) umfasst, subkloniert wurde. Dieser Subklon (pPAL 10EX) wurde dann mit Hinc II und Nde I verdaut. Die Nde I-Schnittstelle befindet sich unmittelbar strangaufwärts vom ATG-Startcodon bei Nucleotid 60, und die Hinc II-Schnittstelle befindet sich bei Nucleotid Nummer –399. Die Verdauung mit diesen beiden Enzymen setzt ein DNA-Fragment mit 459 Nucleotiden frei, das 62 Nucleotide der untranslatierten, transkribierten Leader-Sequenz und 397 Nucleotide der 5'-Promotor-Region enthält. Die Nde I-Schnittstelle in diesem Fragment wurde durch Verwendung von Klenow-Fragment glattendig gemacht, und dieses Fragment wurde in die Hinc II-Schnittstelle des Polylinkers von pGEM 4Z subkloniert. Man fand Klone in beiden Orientierungen, und der Klon, der das Fragment in der folgenden Orientierung enthielt: Hind III, Sph I, Pst I. Hinc II, Promotor-62 Basenpaare langes Leader-Fragment (glattendig gemachtes Nde I/Hinc II wird weder mit Hinc II noch mit Nde I geschnitten) Xba I, Bam HI, Sma I, Kpn I, Sst I, Eco RI wurde ausgewählt und mit pPAL 1020 bezeichnet. Um zusätzliche Regionen strangaufwärts anzufügen, wurde das Hinc II-Hinc II-Fragment, das ungefähr 1 kB lang ist und in der DNA-Sequenz unmittelbar strangaufwärts zur Hinc II-Schnittstelle in Position –391 liegt, aus pPAL 10EX durch Verdauen mit Hinc II und Gel-Elution dieses Fragments isoliert. Dieses Hinc II-Fragment wurde in die Sma I-Schnittstelle von pGEM 4Z kloniert. Man erhielt Klone, die das Fragment in beiden Orientierungen enthielten, und es wurde ein Klon ausgewählt, der das Fragment in der folgenden Orientierung enthielt: Hind III, Sph I, Pst I, Hinc II, Sal I, Xba I, Bam HI, das Hinc II-Fragment in derselben Orientierung wie im genomischen Klon, jenes, das von rechts nach links orientiert ist, 5'-3' (als Hinc II/Sma I-Insertion, die von keinem der Enzyme geschnitten wird), Kpn I, Sst I, Eco RI. Dieser Subklon (pPAL10Hc) wurde mit Knp I verdaut, durch den Einsatz von Klenow-Fragment glattendig gemacht, dann mit Eco RI verdaut. Zu diesem geschnittenen Subklon wurde die Promotor-/untranslatierte Leader-Sequenz von pPAL 1020 hinzugefügt, indem pPAL 1020 mit Hinc II und Eco RI verdaut wurde und dieses Promotor-Fragment zu dem geschnittenen pPAL 10Hc hinzugefügt wurde. Der gebildete Subklon enthielt eine rekonstruierte Promotor-Region des Klons L10, die sich von der intakten Region nur durch die aufgefüllte Kpn I-Schnittstelle unterschied, die für die Verknüpfung der beiden Promotor-Fragmente eingesetzt wurde. Dieses Konstrukt wurde pPAL 1021 genannt. Dieser Vektor enthält in der folgenden Reihenfolge: Hind III, Pst I, Sph I, Hinc II, Sal I, Xba I, Bam HI, das ungefähr 1 kB lange Hinc II-Fragment, gebunden an das Hinc II-Nde I-Promotor-Fragment, gefolgt von Xba I, Bam HI, Sma I, Kpn I, Sst I und Eco RI. Dieser Subklon ermöglicht die bequeme Entfernung der Promotor-Region des Klons L10 derart, dass der Promotor leicht in Kassetten-Transformations-Vektoren eingesetzt werden kann. Die Erläuterung dieser Konstruktion ist in 8 zu sehen. Die Promotor-Region von pPAL 1021 wurde für die Konstruktion eines pollenspezifischen Kassetten-Transformations-Vektors eingesetzt, indem die folgenden Konstrukte gemacht wurden: Das Plasmid pPAL 1021 wurde mit Nco I und Pst I verdaut. Das Plasmid wurde mit Klenow behandelt und religiert. Dieses Verfahren entfernte wirksam denjenigen Teil des Polylinkers, der in pPAL 1021 5' zum Promotor angeordnet war. Dieses Plasmid wurde dann mit Hind III und Sst I verdaut und in die Hind III- und Sst I-Schnittstellen von PAL 1001 kloniert, wodurch PAL 1121 entstand. PAL 1121 besitzt in der folgenden Reihenfolge: den pollenspezifischen Promotor von Klon L10 (ungefähr 1,1 bis 1,2 kB), gefolgt von einem Polylinker mit den folgenden, jeweils nur einmal auftretenden Schnittstellen: Xba I, Bam HI, Sma I, Kpn I, Sst I, gefolgt von nos ter. Die Konstruktion hiervon ist in 8 erläutert.
  • Die Promotor-Region des Klons L19 wurde ebenfalls für die Konstruktion von pollenspezifischen Vektoren benutzt. Die Konstruktion dieser Vektoren ist wie in 19 dargestellt. In Klon L19 ist ein einziges pollenspezifisches Gen enthalten. Der Anfang der Transkription in diesem Gen befindet sich an Position 1 in der DNA-Sequenz. Das ATG-Startcodon befindet sich in der Nukleotid-Position 136–138. Das einzige Intron befindet sich auf den Nukleotiden 1202–1387, das Translations-Stopcodon befindet sich auf den Nukleotiden 2024–2026. Das Ende der Transkription befindet sich ungefähr bei Nukleotid 2074. Das gesamte Eco RI-Fragment dieses Klons wurde unter Ausnutzung der Eco RI-Schnittstelle, die sich im Polylinker befindet, in pGEM 4Z subkloniert. Der resultierende Klon wurde pPAL 1901 genannt. Die Promotor-Region dieses Klons wurde durch Verdauung von pPAL 1901 mit Bam HI und Eco RV als einzelnes Fragment ausgeschnitten, und es wurde ein 2177 Basenpaare langes Fragment isoliert, das der Promotor-Region entspricht. Dieses Fragment reicht von Nukleotid –2200 (Bam HI) bis Nukleotid 156 (Eco RV). Dieses Promotor-Fragment enthält mehr als 2 kB der 5'-strangaufwärts gelegenen Region des Promotors in Klon L19, 134 Basenpaare 5'-untranslatierte Leader-Sequenz und 23 Basenpaare translatierte Sequenz. Die Bam HI-Schnittstelle in diesem Fragment wurde durch Verwendung von Klenow glattendig gemacht und in PAL 1001 kloniert. Dieser Schritt wurde bewerkstelligt, indem PAL 1001 mit Hind III geschnitten wurde, diese Schnittstelle unter Verwendung von Klenow glattendig gemacht wurde und das glattendige Bam HI-Eco RV-Fragment in einer solchen Richtung insertiert wurde, dass der Promotor bezüglich Polylinker/nos ter Polyadenylierungs-Signal eine Orientierung von 5' nach 3' aufwies. Dieser Vektor wurde PAL 1920 genannt und enthielt in sich in der folgenden Reihenfolge: Den Promotor von Klon L19 mit 134 Basenpaaren der 5'-untranslatierten Leader-Sequenz, 23 Basenpaare der translatierten Sequenz, fusioniert mit einem Polylinker, der eine frühere Hind III-Schnittstelle enthielt, die durch glatte Enden inaktiviert worden war, Sph I, Pst I, Sal I, Hinc II, Xba I, Bam HI, Sma I, Kpn I, Sst I (die jeweils nur einmal vorhandenen Klonierungs-Schnittstellen sind unterstrichen), das nos ter Polyadenylierungs-Signal. Dieser Vektor eignet sich für die Insertion von DNA- Sequenzen, die in Pollenzellen transkribiert werden sollen. Die Erläuterung dieses Konstrukts ist in 9 gezeigt.
  • In 10 ist die Restriktionskarte eines Klons (HP 101) aus dem Genom von Brassica napus, der ein konstitutiv exprimiertes Gen enthält, gezeigt, und das Fragment dieses Klons, das eine 5'-Promotorregion zusammen mit einem Teil an transkribierter Sequenz enthält, ist bezeichnet. Dieses Fragment wurde isoliert, in dem zuerst das kleine 2,5 kB lange Eco RI-Fragment in pGEM 4Z kloniert und ein Subklon erhalten wurde, der dieses Fragment in der angezeigten Richtung relativ zum Polylinker von pGEM 4Z insertiert enthielt. Dieser Klon wurde als pPAL 0101 bezeichnet. Er wurde am 26. Januar 1990 bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, USA als pPAL0101/E. coli Stamm DH5 Alpha unter der Hinterlegungsnummer ATCC 68210 hinterlegt. Dieser E. coli-Stamm wächst auf standardmäßigem E. coli-Medium (LB) mit 100 μg pro ml Ampicillin. Dieser Subklon, pPAL 0101, wurde dann mit Eco RI verdaut, mit dem Klenow-Fragment behandelt, dann mit Bam HI verdaut, wodurch die angegebene Promotor-/transkribierte Region freigesetzt wird. Dieses Fragment wurde in Hinc II-Bam HI geschnittenes pGEM 4Z kloniert, wodurch der Subklon pPAL HP101 entstand. Der Subklon kann für die Isolierung von Promotor-Sequenzen in Vektorkonstrukten verwendet werden, die einen konstitutiven Promotor zur Synthese von pollenspezifischer Antisense-RNA nutzen.
  • In 11 ist eine schematische Darstellung der Erzeugung eines für Polylysin codierenden Gens gezeigt. In diesem Konstrukt wurde der Klonierungsvektor pGEM 4Z als Empfänger eines synthetischen Oligonucleotids genutzt, das ein ATG-Startcodon enthielt, und hierzu wurde ein Polynucleotid gegeben, das aus einem einzigen Nucleotid bestand. Deshalb ist dieses Gen in Abhängigkeit vom eingesetzten Nucleotid ein Gen, das vorwiegend ein Codon aufweist und für ein Protein codiert, das aus einer Polyaminosäure gebildet ist. Die Konstruktion erfolgte auf die folgende Weise: Um ein ATG-Startcodon in einem Umfeld bereitzustellen, das für die Initiation wünschenswert ist, wurde ein synthetisches Oligonucleotid konstruiert und zwischen die Hind III- und die Sph I-Schnittstelle in pGEM 4Z insertiert. Dieses Nucleotid besaß die Sequenz: 5'-ACGTGGATCCAAGATGACATG-3'. Der gebildete Subklon hatte deshalb die DNA-Sequenz (die Restriktions-Schnittstelle für eine eingeführte Bam HI- Schnittstelle ist unterstrichen, das ATG-Startcodon wird hervorgehoben) AACGT GGATCC AAG ATG ACA TGC GCA ACA TGG im 5'-Bereich, so dass es ein ATG-Startcodon in einer für die Initiation günstigen Umgebung und eine Bam HI-Schnittstelle strangaufwärts dieser Stelle zum Ausschneiden der codierenden Sequenz gab. Dieser Subklon wurde mit Pst I verdaut, in zwei gleiche Teilmengen unterteilt, von denen eine unter Verwendung terminaler Transferase und TTP mit T-Schwänzen und eine unter Verwendung von terminaler Transferase und dATP mit A-Resten als Schwanz versehen wurde. Die beiden mit einem Schwanz versehenen Plasmide wurden vermischt, mit Phenol-Chloroform extrahiert, mit Ethanol ausgefällt und resuspendiert. Die Plasmid-Mischung wurde mit Sst I geschnitten und reloziert. Klone, die gewonnen wurden, waren entweder Klone, die polyA oder polyT am codierenden Strang enthielten. Die Klone wurden mit Bam HI geschnitten, die Größe des Insertionsstücks wurde durch Gel-Elektrophorese bestimmt und sequenziert, um festzustellen, ob der Klon für Polylysin (polyA) oder Polyphenylalanin (polyT, polyU in der mRNA) codierte. Ein Klon, der für Polylysin codierte und annäherend 300 Nucleotide aufwies, wurde ausgewählt und pPAL pLys genannt. Dieser Klon kann mit Xba I oder Sal I geschnitten und mit dem Klenow-Fragment glattendig gemacht werden, bevor ein universeller Terminator (zu beziehen von Pharmacia PL Biochemicals, Montreal, Canada) hinzugesetzt wird, um die Konstruktion des Gens zu vervollständigen. Diese Konstruktion ist in 11 dargestellt.
  • In 12a ist ein Schema für die Erzeugung eines Antisense-Gens, das spezifisch für die Intron-Region des Klons L 19 ist, und für die Produktion einer intronfreien Version des Gens mit der Nummer L 19 gezeigt. Für den ersten Schritt hierbei wurde ein Restriktions-Fragment des Klons L 19 isoliert, der im Wesentlichen nur aus Intron besteht. Dieses Fragment wurde unter Verwendung des Restriktions-Enzyms Dde I isoliert, das eine Anzahl von Stellen im genomischen Klon schneidet, aber die Schnittstellen an den Nucleotiden 1186 und 1348 führen zu einem Restriktions-Fragment, das im Wesentlichen aus Intron-Sequenzen besteht, die nur ungefähr 16 Nucleotide an der 5'-Seite des Introns aufweisen, die im letztendlich erhaltenen Transkript enthalten sind, und 10 Nucleotide an der 3'-Seite des Introns, die im letztendlich erhaltenen Transkript enthalten sind. Dieses Dde I Fragment wurde durch Gel-Elektrophorese isoliert, glattendig gemacht und in mit Sma I geschnittenes pGEM 4Z kloniert. Man erhielt Klone in beiden Ausrichtungen, und derjenige Klon wurde ausgewählt, der den Intron-Bereich in folgender Orientierung enthielt: Hind III, Sph I, Pst I, Sal I, Xba I, Bam HI (zuvor Sma I), 3'-Ende des Introns, Intron-Sequenzen, 5'-Ende des Introns (zuvor Sma I), Kpn I, Sst I, Eco RI. Dieser Klon wurde pPAL 1914 genannt und mit Bam HI und Sst I verdaut und in PAL 1920 insertiert, das zuvor mit Bam HI und Sst I geschnitten worden war, wobei der Vektor PAL 1954 entstand.
  • Um einen spezifischen Promotor für die Wiederherstellung zu erzeugen, wurde der cDNA-Klon 19 cDNA (5) wie folgt mit der Promotor-Region fusioniert: Der cDNA-Klon wurde mit Eco RV und Sma I wie in 11 gezeigt verdaut. Zu diesem verdauten Vektor wurde das Eco RV-Sma I-Fragment aus Klon L 19 hinzugegeben. Es wurden Klone gewonnen, die den rekonstruierten 5'-Bereich des Promotors und codierende Sequenz enthielten, aber codierende Sequenzen trugen, denen das Intron fehlte, wobei der größte Teil der codierenden Bereiche aus dem cDNA-Klon stammte. Dieser Klon wurde mit Eco RI verdaut, mit Klenow glattendig gemacht und dann mit Sma I verdaut. Ein DNA-Fragment, das den gesamten codierenden Bereich und einen Teil des Promotor-Bereichs aufweist, wurde isoliert und in mit Sma I geschnittenes PAL 1920 kloniert, was zu einer Rekonstruktion der Promotor-Region und einem codierenden Bereich, dem ein Intron fehlt, führte. Dieser Vektor wurde mit PAL 1955 bezeichnet.
  • Gemäß 13 wurde das IamH-Gen des Plamids pTiC58 von Agrobacterium tumefaciens erhalten, in dem der Gen 2-Bereich des Plasmids pPCV311 (Koncz, C. und Schell, J., Molecular and General Genetics, (1986), 204: 383–396) isoliert wurde. Dieser Bereich wurde durch Verdauung mit Hind III und Apa I isoliert, wodurch ein Gen-Fragment entsteht, das DNA-Sequenz in einer Länge von annähernd 47 Nucleotiden strangaufwärts des ATG-Startcodons enthält und ungefähr 500 Nucleotide von DNA-Sequenz über das TAA-Stopcodon hinaus enthält. Dieses Fragment wurde durch die Verwendung von T4 DNA Polymerase I mit glatten Enden versehen und in mit Sma I geschnittenes pGEM 4Z insertiert. Klone wurden ausgewählt, die das Gen in der dargestellten Orientierung aufweisen, und einer von diesen wurde mit pPAL IamH bezeichnet. Dieser Klon wurde mit Bam HI und Sst I verdaut und in mit Bam HI-Sst I geschnittenes PAL 1402 insertiert, wobei man PAL 1424 erhielt.
  • In 14 ist die Erzeugung von Klonen im Einzelnen dargestellt, die die codierenden Sequenzen eines Proteins enthalten, das funktionell dem aus Ricinus communis isolierten Ricin-A-Kettenprotein verwandt ist. Dies erfolgte, indem zuerst ein zu Ricin homologer genomischer Klon aus einer genomischen DNA-Bibliothek von Ricinus zanzabarenis isoliert wurde, die unter Verwendung von Standardverfahren in den Vektor Lambda gt10 konstruiert worden war. Die Bibliothek wurde mit einer DNA-Sonde durchsucht, die der N-terminalen Leader Sequenz des Ricin-Gens entspricht. Die Sondensequenz wurde aus der veröffentlichten Sequenz eines Ricin-Gens aus Ricinus communis (Halting et. al., Nucl. Acids Res 13: 8019–8033, 1985) gewonnen. Ein genomischer Klon wurde isoliert, der die Leader-Sequenz und einen Teil der A-Kette enthielt, und mit RIC 1B bezeichnet. Dieser Klon enthielt die Promotor-Region, den 5'-untranslatierten Bereich, die N-terminale Leader-Sequenz und codierenden Bereich, der sich bis zur Aminosäure 191(Ile) in der veröffentlichten Sequenz (Hailing et. al., Nucl. Acids Res 13: 8019–8033, 1985) erstreckt. Der Unterschied zwischen der veröffentlichten Sequenz und RIC 1B liegt darin, dass die veröffentlichte Nucleotid-Sequenz im Bereich von Ile 191 wie folgt war: (Ile 191 unterstrichen) ACG AGA ATT CGG, was für die Aminosäuren The Arg Ile Arg codiert, während in RIC 1B die Nucleotid-Sequenz ACG AGA ATT CGG ist, die für dieselben Aminosäuren (The Arg Ile Arg) codiert, wobei der einzige Unterschied darin liegt, dass das letzte Arg in RIC 1B durch CGG codiert wird, während es in der veröffentlichten Sequenz durch AGG codiert wird. Diese einzelne Nucleotid-Substitution hat die Wirkung, das an Ile 191 eine Eco RI-Schnittstelle eingeführt wird. Dem Klon RIC 1B fehlten deshalb diejenigen Aminosäuren, die sich hinter Ile 191 befinden, da der Klon als einzelnes Eco RI-Fragment isoliert wurde. Diese verkürzte Version von Ricin wurde eingesetzt, um N-terminale Deletionen der Ricin-A-Kette wie folgt zu konstruieren: Der Klon RIC 1B wurde mit Hinc II und Eco RI verdaut. Das Fragment wurde in mit Eco RI-Sma I geschnittenes pGEM 4Z kloniert. Der gebildete Klon, pPAL R1B, wurde mit Pst I und Bam HI verdaut. Dieser geschnittene Klon wurde mit Exo III Nuclease verdaut, mit S1 Nuclease und Klenow-Fragment versetzt und dann religiert. Subklone wurden erhalten, die Deletionen verschiedener Teile des 5'-Bereichs aufwiesen, und einige dieser Deletionen wurden sequenziert. Einer Deletion mit Namen pPAL-Ridefin fehlte der größere Teil der N-terminalen Leader-DNA-Sequenz, und sie besaß Hind III und Sph I-Schnittstellen in 5'-Stellung zu diesem Bereich, so dass die DNA-Sequenz die Folgende war: AAGCTT GCATGC GCA ACA TGG...., worin die ersten sechs Nucleotide für eine in pGEM 4Z gefundene Hind III-Schnittstelle codieren, die nächsten sechs Nucleotide für die Sph I-Schnittstelle in pGEM 4Z codieren, und die folgenden drei Triplets für die Aminosäuren –20, –19, –18 .... (Ala The Trp ...) in der veröffentlichten Sequenz (Halling et. al., Nucl. Acids Res 13: 8019–8033, 1985) codieren. Dieser Subklon hatte dementsprechend eine Deletion, durch die die ersten 15 Aminosäuren der A-Ketten-Leader-Sequenzen von Ricin entfernt worden waren. Um ein ATG-Startcodon in einer günstigen Umgebung für die Initiation bereit zu stellen, wurde ein synthetisches Oligonucleotid konstruiert und zwischen den Hind III- und Sph I-Schnittstellen in den Subklon insertiert. Dieses Nucleotid hatte die Sequenz: 5'-ACGTGGATCCAAGATGACATG-3'. Der rekonstruierte Klon (pPAL Rictr) besaß demzufolge die DNA-Sequenz (die Restriktions-Schnittstelle für eine eingeführte Bam HI-Schnittstelle ist unterstrichen, das ATG-Startcodon ist hervorgehoben) AACGT GGATCC AAG ATG ACA TGC GCA ACA TGG im 5'-Bereich, so dass sich ein ATG-Startcodon in einer günstigen Umgebung für die Initiation befand und es eine Bam HI-Schnittstelle für das Ausschneiden der codierenden Sequenz gab. Der Klon pPAL Rictr wurde mit Eco RI verdaut, am Ende mit Klenow aufgefüllt und mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliert. Zu diesem Vektor wurde ein universaler Translations-Terminator zugegeben, der von Phamacia-PL biochemicals (Montreal, Canada) bezogen worden war, um ein Terminations-Codon bereit zu stellen. Der codierende Bereich aus diesem Klon wurde durch Verdauen mit Bam HI und Pvu II isoliert, was den codierenden Bereich und einem kleinen Teil von pGEM 4Z freisetzte, und dieses Fragment kann in die Bam HI- und Sma I-Schnittstellen von Transformationsvektoren kloniert werden. Dieses DNA-Fragment codiert für eine Version einer A-Kette von Ricin, in der ein C-terminaler Teil deletiert ist. Es ist anzumerken, dass eine Anzahl von C-terminalen und N-terminalen Deletionen der Ricin A-Kette in vitro auf ihre Toxizität untersucht wurden, und diese Berichte haben zu dem Schluss geführt, das die N-terminale Hälfte der Ricin A-Kette in vitro für eine Cytotoxizität ausreichend ist (siehe beispielsweise: Sudan et. al., Nucl. Acids Res., 17: 1717–1732, 1989). Um einen vollständigen codierenden Bereich für die Ricin A-Kette zu erhalten, wurde unter Verwendung der veröffentlichten Sequenz eine synthetische Version der restlichen A- Kette synthetisiert. Dieser synthetische Teil des Gens verlängerte die DNA-Sequenz bis zu Nucleotid 1182 in der veröffentlichten Sequenz und besaß an beiden Enden jeweils eine Eco RI-Schnittstelle, was es ermöglichte, dass dieses Fragment mit der Eco RI-Schnittstelle in der Gegend der Aminosäure-Nummern 190–192 verknüpft wurde. Diese rekonstruierte Version des Gens besaß auch eine Bam HI-Schnittstelle hinter dem Stopcodon, so dass die DNA-Sequenz des Gens am 3'-Ende wie folgt war: (Nucleotid 1181 ist mit * markiert) CCT CCA* TAA GGATCC GAATTC, was für die Aminosäuren: Pro Pro Stop und dann eine Bam HI- und eine Eco RI-Schnittstelle codiert, wobei die Eco RI-Schnittstelle für die Insertion des synthetischen Teils des Gens verwendet wird, während die Bam HI-Schnittstelle verwendet wird, um die vollständige Sequenz der A-Kette von Ricin herauszuschneiden, da sich eine synthetische Bam HI-Schnittstelle auch am 5'-Ende des codierenden Bereichs befindet. Der Klon wurde mit pPAL Riccom bezeichnet.
  • In 15 sind die Ergebnisse der Inhibition der Aktivität des β-Glucuronidase-Gens durch Antisense-RNA in einem Treppenpolygon der GUS-Genaktivität gezeigt, die man in transgenen Pflanzen findet, die ein GUS-Sense-Gen enthielten und mit einem Vektor transformiert worden waren, der ein GUS-Antisense-Gen enthielt. Das Niveau der GUS-Aktivität wurde als Prozentsatz der GUS-Aktivität, die man in der ursprünglichen GUS+ Pflanze TTR-48 findet, ausgedrückt. Gewebe wurde von jungen (Y), mittleren (M) und alten (O) Blättern gewonnen, und die GUS-Aktivität wurde spektrophotometrisch bestimmt. Die Reihen 1 bis 5 bezeichnen Proben aus den re-transformierten Pflanzen TTR-1 bis TTR-5 (TTR-48/PAL 1302); Reihe 6 bezeichnet Proben aus der Pflanze TTR-48; Reihe 7 bezeichnet Proben aus TTR-88 (TTR-48/pVU 1011), und Reihe 8 bezeichnet Proben aus untransformiertem Tabak.
  • BESTE AUSZUFÜHRUNGSART DER ERFINDUNG
  • Es ist bekannt, das die Anzahl von Pflanzensorten oder -arten, die bisher erfolgreich genetisch transformiert wurden, nur einen bescheidenen Prozentsatz der Gesamtzahl von Pflanzensorten oder -arten darstellen, die von potentiellem kommerziellem Interesse sind. Es ist jedoch wahr, dass die Anzahl transformierter Arten ständig angestiegen ist, und es gibt jeden Grund, anzunehmen, dass im Verlauf der Zeit Transformationssysteme für jede interessierende Feldfrucht entwickelt werden können. Eine routinemäßige Transformation wurde anfänglich mit Arten oder Sorten aus zwei Pflanzenfamilien erzielt: Solanaceae und Brassicaceae. Beispiel für kommerziell interessierende Arten aus diesen Familien, die transformiert worden sind, umfassen: Tabak, Nicotiana tabacum L., Tomate, Lycopersicon esculentum Mill, Kartoffel, Solanum tuberosum L., und Petunie, Petunia hybrida (Solanaceae); Canola/Rapssaat, Brassica napus L., Kohl, Brokkoli, Grünkohl etc., Brassica oleracea L., Senfarten, Brassica juncea L., Brassica nigra L. und Sinapis alba L. (Brassicaceae).
  • In jüngster Zeit wurde über die Transformation kommerziell wichtiger Arten aus anderen Familien berichtet, beispielsweise Zuckerrübe, Beta vulgaris, (Chenoprodiaceae), Gurke, Curcurbita sp., (Curcurbitaceae), Baumwolle, Gossypium sp., (Malvaceae), Sonnenblume, Helianthus annuus und Salat (Lactuca sativa, (Asteraceae=Compositae), und Erbsen, Pisum sativum, Sojabohne, Glycine max und Alfalfa, Medicago sp Fabaceae=Leguminoseae). Transformation wurde auch mit drei Arten wie Pappel, Populus sp. (Salicaceae) und Walnuß, Juglans migra (Juglandaceae) erreicht.
  • Transformationserfolge mit Spezies der Monocotyledonen hat sich nicht derart schnell eingestellt, da diese Spezies im allgemeinen nicht sehr empfänglich für eine durch Agrobacterium vermittelte Transformation sind. Bemerkenswerten Erfolg hat man jedoch unter anderem bei Spargel, Asparagus officinalis; Gladiolen, Gladiolus sp., (Liliaceae); Mais, Zea mays und Reis, Oryza sativa Poaceae) erzielt. Die jüngste Entdeckung, dass eine Transformation mit Agrobacterium durch Infektion von keimenden Samen erreicht werden kann, ohne das Erfordernis einer Regeneration aus Zellkultur (Chee, P. P. et. al., 1989, Plant Physiol. 91: 1212–1218), eröffnet neue Horizonte für Sorten oder Arten, die möglicherweise schwierig zu regenerieren sind. Außerdem sind weit gestreute Studien über den Gebrauch von Teilchenkanonen zum Übertragen von in DNA gehüllten Mikroprojektilen in Pflanzenzellen von Sorten oder Arten, die anderen Verfahren nicht leicht zugänglich sind, sehr vielversprechend. Es ist zu erwarten, dass die vorliegende Erfindung mit jeder beliebigen der oben genannten Sorten oder Arten und mit jeder anderen Spezies durchgeführt werden kann, die genetisch transformierbar ist.
  • Die pollenspezifischen Promotoren, auf die voranstehend Bezug genommen wurde, wurden aus einer Pflanze der Spezies (Sorte oder Art) Brassica napus isoliert.
  • Im Hinblick auf jede der oben aufgeführten Pflanzenarten oder -sorten ist anzunehmen, dass es möglich ist, die genannten Promotoren einzusetzen, um die Expression einer gegebenen DNA-Sequenz auf Mikrosporen und auf einen spezifischen Zeitraum während der Pollenbildung zu beschränken. Die veröffentlichte wissenschaftliche Literatur hat deutlich gezeigt, dass Pflanzengene universell sind und dass die für Pflanzengewebe spezifischen Promotorfragmente ihre Funktion in anderen Arten oder Sorten beibehalten. Beispielsweise sind Promotor-Fragmente von Weizen-Endosperm derart funktionsfähig, dass sie eine geeignete samenspezifische Expression in Tabak ergeben (Simpson, J. et. al., EMBO Jour. 4: 2723–2729, 1985), und der Alkohol-Dehydrogenase-Promotor (Adh-1) aus Mais (Zea mays) kann in Verbindung mit anderen Promotor-Fragmenten eingesetzt werden, um eine angemessene Expression in Tabak zu liefern (Ellis, J. G. et. al., 1987, EMBO J. 6: 11–16). Außerdem ist das transponierbare Mais-Element Ac in Tabak und anderen Pflanzenarten oder -sorten aktiv (Taylor et. al., 1989, Plant Mol. Biol. 13: 109–118), was einen weiteren Beweis für die Universalität der Struktur und Funktion von Pflanzengenen liefert. Diese Beispiele zeigen die äquivalente gewebespezifische Funktion derselben Promotoren in sehr stark voneinander abweichenden Arten (Monocotyledonen bis Dicotyledonen). Unsere eigene Forschung und die Studien anderer haben eine äquivalente Promotor-Funktion bei enger verwandten Arten innerhalb derselben Familie oder zwischen Familien wie den Solanaceae und den Brassicaceae gezeigt.
  • Es sollte jedoch klar sein, dass Verbesserungen oder Verfeinerungen der Promotor-Funktion für individuelle Pflanzen oder Pflanzenarten erforderlich sein könnten, um den passenden Zeitraum oder das geeignete Ausmaß der Expression zu maximieren oder zu modulieren, damit die eine oder andere Ausgestaltung der Erfindung ausgeführt werden kann. Dementsprechend werden hier Verfahren für die Modifikation von Promotoren zur Veränderung oder Verbesserung ihrer Funktion in verschiedenen Pflanzen unterschiedlichen Ursprungs bereitgestellt.
  • Mit der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Vorteile im Vergleich gegenüber anderen Hybridisierungssystemen erzielt:
    • (a) Die Erzeugung von hybridem Saatgut ist arbeitsunaufwendig und kann bei für den Handel annehmbaren Kosten in großem Maßstab erfolgen;
    • (b) Männliche Sterilität wird in einfacher Weise vererbt und ist in Reaktion auf Belastungen durch die Umgebung, die die Wirksamkeit von auf Selbst-Inkompatibilität und CMS basierenden Systemen beschränken, stabil.
    • (c) Erzeugtes Saatgut ist relativ wenig mit selbstbestäubten Samen kontaminiert.
    • (d) Das System vermeidet den Einsatz von defekten cytoplasmatischen Organellen, die als solche die Leistung des hybriden Saatguts beeinträchtigen können; und
    • (e) Das System beschleunigt in hohem Maße die Entwicklung und erhöht die Anzahl der Linien, die als Eltern in einer Hybridkreuzung getestet werden können, da es auf jede Pflanze oder Zuchtlinie angewendet werden kann, die transformierbar ist und in Pflanzen regeneriert werden kann, ohne Einschluß zusätzlicher genomischer DNA. Außerdem können Pflanzenlinien auf Kombinationsfähigkeit untersucht werden, bevor sie in das Hybridisierungssystem eingebunden werden, was die Züchtungsstrategie modifizieren kann.
  • Die folgenden Bezeichnungen und Ausdrücke sollen, soweit sie im Verlauf der vorliegenden Offenbarung und Ansprüche verwendet werden, in Übereinstimmung mit den nachstehenden Definitionen verstanden werden, es sei denn, der Zusammenhang gibt vor, dass diese Bezeichnungen und Ausdrücke nicht als derart beschränkt verstanden werden sollen.
  • Die voranstehende Beschreibung der Erfindung definiert in allgemeinen Ausdrücken die Schritte, die verwendet werden können, um erfindungsgemäß männlich sterile Pflanzen, Pflanzen für die Wiederherstellung und hybrides Saatgut mit einer Mischung von männlich fertilen und männlich sterilen Pflanzen oder mit wiederhergestellter männlicher Fertilität zu erzeugen. Es sollte klar sein, dass diese verschiedenen Schritte mit Hilfe einer Vielzahl unterschiedlicher Verfahren ausgeführt werden können. In der nachstehenden Beschreibung bevorzugter Verfahren werden verschiedene alternative Methoden offenbart, mit denen diese Schritte durchgeführt werden können. Es sollte jedoch im Auge behalten werden, dass dem Fachmann auch andere Abwandlungen bewusst sind. Dementsprechend soll der Rahmen der vorliegenden Erfindung nur durch den Rahmen oder Umfang der beigefügten Ansprüche beschränkt sein.
  • Die Isolierung von Genen, die für die Pollenbildung wesentlich bzw. entscheidend sind, kann mit Hilfe verschiedener Verfahren bewerkstelligt werden. Gemäß einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens können Gene identifiziert werden, die nur in spezifischen Zeitabschnitten während der Pollenentwicklung exprimiert werden, deren Regulation streng kontrolliert ist. Die Gene können gemäß den unten in Einzelheiten beschriebenen Verfahren durch Klonierungstechniken isoliert werden. Der Identifizierungsschritt kann auch dadurch bewirkt werden, dass man in Übereinstimmung mit weiter unten beschriebenen Standard-Klonierungstechniken feststellt, ob ein bestimmtes "grünes" Gen, von dem man weiß, dass es für die Pollenbildung wesentlich oder entscheidend ist und dass es ausschließlich in Mikrosporengewebe in einer (bestimmten) Pflanze exprimiert wird, dieselbe Verwendbarkeit auch in einer anderen Pflanze besitzt. Es ist auch bekannt, dass bestimmte Gene für die zelluläre Funktion wesentlich oder entscheidend sind und in allen Typen lebender Zellen exprimiert werden. Diese Gene können unter Verwendung der veröffentlichten DNA-Sequenzen für diese essentiellen Gene isoliert werden, von denen manche in der Pflanzen- und Tierwelt konserviert vorliegen, und in Verbindung mit einem Promotor, der die Gen-Expression auf ausschließlich Pollengewebe beschränkt, für die Konstruktion einer rekombinanten DNA, die männliche Sterilität verleiht, verwendet werden.
  • Das Gen gemäß Anspruch 1, das Cryptocytotoxizität verleiht, kann gemäß einer beliebigen unter einer Vielzahl bekannter Methoden in die Pflanzenzelle eingeführt werden; vorzugsweise dadurch, dass zuerst dieses Gen in einen geeigneten Vektor eingesetzt und dann dieser Vektor verwendet wird, um das Gen in eine Pflanzenzelle einzuführen. Die Selektionierung auf die transformierte Zelle erfolgt mit Hilfe der Aktivität eines Marker-Gens, das in der Lage ist, transformierten Zellen Resistenz gegenüber einem toxischen Mittel zu verleihen. Auf diese Weise selektionierte transformierte Pflanzenzellen können dazu veranlasst werden, in Pflanzenstrukturen zu differenzieren, die schließlich ganze Pflanzen ergeben. Außerdem sollte klar sein, dass in Fällen, in denen in bestimmten Ausgestaltungen dieser Erfindung die Transformation einer Pflanzenzelle mit zwei unterschiedlichen Genen erforderlich ist, diese Gene physisch miteinander verknüpft sein können, indem sie beide auf demselben Vektor liegen, oder physisch voneinander getrennt auf verschiedenen Vektoren vorhanden sind. Die Transformation der Zelle kann mit zwei Vektoren gleichzeitig erfolgen, vorausgesetzt, dass jeder Vektor einen einzeln selektierbaren Marker besitzt. Alternativ kann die Transformation mit zwei Vektoren nacheinander erfolgen, wobei man nach der Transformation mit dem ersten Vektor einen zwischengeschalteten Regenerationsschritt ermöglicht. Es sollte darüber hinaus klar sein, dass es möglich ist, eine geschlechtliche Kreuzung individueller Pflanzen, die unterschiedliche rekombinante DNA-Moleküle enthalten, durchzuführen und deren Nachkommen auf die gekreuzten Pflanzen zu selektionieren, die beide rekombinanten DNA-Moleküle enthalten.
  • Wenn es die Kosten rechtfertigen und die Aufrechterhaltung wie oben diskutiert nicht leicht bewirkt werden kann, können transformierte Pflanzenzellen nach Standardmethoden in Kultur gezüchtet werden, um eine Zell-Linie mit einer großen Anzahl transformierter Zellen zu erzeugen. Eine große Anzahl transformierter Zellen kann routinemäßig aus dieser transformierten Zell-Linie regeneriert werden, um die männlich sterile Linie zu vermehren und zu erhalten. Routineverfahren zum Kultivieren solcher Zellen und zum Regenerieren transformierter Pflanzen aus solchen Zellen sind in Pflanzengewebekultur-Standardhandbüchern beschrieben. Plant Tissue and Cell Culture, Green, C. E., Somers, D. A., Hackett, W. P., and Biesboer, D. D., Hrsg. 1987, Alan R. Liss, Inc., New York, Experiments in Plant Tissue Culture, Dodds, J. H. und Roberts, L. W. Hrsg., 1985, Cambridge University Press, oder Cell Structure and Somatic Cell Genetics of Plants, Vasil, I. K., Scowcroft, W. R. und Frey K. J., Hrsg., 1984, Academic Press, New York, Handbook of Plant Cell Culture, Band 1–4, Evans, D. A., Sharp, W. R., Ammirato, P. V. und Yamada, Y., Hrsg., 1984–1986, Macmillan, New York, Bio-technology in Agriculture and Forestry, Band 1 und 2, Bajaj, Y. P. S. Hrsg., 1986, Springer-Verlag, Berlin oder Plant Propagation by Tissue Culture-Handbook and Directory of Commercial Laboratories, George, E. F. und Sherrington, P. D., 1984, Eastern Press, Reading).
  • Es kann auch möglich sein, männlich sterile Pflanzen durch Fusion von Zellen der transformierten Pflanzenzell-Linie mit Zellen von Pflanzenarten zu erzeugen, die sich nach Standardverfahren nicht transformieren lassen. Man erhält eine fusionierte Pflanzenzell-Linie, die eine genetische Komponente aus jeder der beiden Pflanzenzellen trägt. Fusionierte Zellen können auf Zellen selektioniert werden, die das rekombinante Gen enthalten, und in vielen Fällen in Pflanzen regeneriert werden, die das männlich sterile Merkmal tragen.
  • Es sollte klar sein, dass ein beliebiger unter einer Vielzahl unterschiedlicher Promotoren verwendet werden kann, um die Expression des rekombinanten Gens zu regulieren, vorausgesetzt, dass der Promotor die Transkription dieses Gens zum geeigneten Zeitpunkt und in ausreichenden RNA-Mengen bewirkt, um die gesunde Mikrosporenentwicklung zu hemmen oder zu blockieren.
  • Wenn ein pollenspezifischer Promotor zur Inaktivierung eines Sense-Gens, das für die Pollenbildung oder -funktionsfähigkeit wie hier voranstehend diskutiert wesentlich oder entscheidend ist, eingesetzt wird, kann es schwierig sein, a priori zu bestimmen, welcher pollenspezifische Promotor oder welches modifizierte Promotor-Konstrukt wirksam die Funktion dieses Gens hemmen wird. Es ist bevorzugt, einen pollenspezifischen Promotor einzusetzen, der ein ähnliches Entwicklungsmuster zeigt wie dieses Gen. Ein bequemes Verfahren zum Bestimmen, wann das Sense-Gen, dessen Inaktivierung man wünscht, exprimiert wird, ist es, RNA aus sich entwickelnden Mikrosporen in unterschiedlichen Stadien zu isolieren und diese RNA mit Hilfe der so genannten Northern-Blot-Analyse auf die Expression des gesuchten Ziel-Gens zu analysieren. Dieses Verfahren ermöglicht die Bestimmung des genauen Entwicklungszeitraums, in dem das Sense-Gen exprimiert wird. Um den Zeitabschnitt in der Pollenentwicklung zu bestimmen, in welchem der pollenspezifische Promotor, dessen Verwendung zur Inaktivierung des genannten Sense-Gens man wünscht, exprimiert wird, kann eine vergleichbare Analysenreihe vorgenommen werden, wobei man als Sonde für die Expression dieses pollenspezifischen Promotors ein Reporter-Gen verwendet, das mit dem genannten Promotor oder dem natürlich vorkommenden Sense-Gen unter der Kontrolle desjenigen pollenspezifischen Promotors, der in der ursprünglich für die Isolierung des Sense-Gens verwendeten Pflanze gefunden wird, verknüpft ist. Wenn der pollenspezifische Promotor aus einer Pflanze isoliert und in einer anderen Pflanzenart oder -sorte verwendet wird, ist es das bevorzugte Verfahren, ein mit diesem Promotor verknüpftes Reporter-Gen zu verwenden, um den exakten Entwicklungszeitablauf zu bestimmen, den dieses Promotor-Fragment in dieser besonderen Pflanzenart besitzt.
  • Darüber hinaus sollte klar sein, dass die Aktivität des pollenspezifischen Promotors unabhängig davon, ob er für dieselbe oder für eine andere Art vorgesehen ist, strukturell verändert werden kann, um die Aktivität in diesen Pflanzen zu verändern oder abzuwandeln. Veränderungen, die ins Auge gefasst sind, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein: Hinzufügung oder Deletion von Sequenzen, Orientierung von strangaufwärts oder strangabwärts gelegenen Sequenzen und den Einschluß von Introns oder von Teilen der codierenden Sequenz des pollenspezifischen Gens. Die oben erwähnte Abwandlung kann dazu dienen, die Expression zu steigern oder die Regulation der Expression hinsichtlich ins Auge gefasster Stadien der Entwicklung zu verbessern.
  • Um Gene zu isolieren, die spezifisch in sich entwickelnden Mikrosporen exprimiert werden, kann eine Genom-Bibliothek von Pflanzen-DNA aus DNA konstruiert werden, die nach Standardverfahren Molecular Cloning, a Laboratory Manual Maniatis, T., Fritsch, E. F., und Sambrooks, J., Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Habour, New York, 1982) aus frischem, jungem Blattmaterial isoliert und mit aus verschiedenen Geweben stammenden Sonden gescreent wird, von denen eine aus Mikrosporen-RNA hergestellt ist. Die anderen Sonden sollten aus von unterschiedlichen Geweben stammender RNA hergestellt sein, um in Geweben der Pflanze exprimierte Gene zu repräsentieren, von denen man nicht erwartet, dass sie in Mikrosporen exprimierte Gene umfassen. Beispiele hierfür umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Gewebe wie Blätter, Wurzeln, Samen, Narben, Stengel und andere Organe. Einige Gene werden in allen Geweben exprimiert, und andere nur in einer beschränkten Anzahl von Geweben, und durch den Vergleich vieler Pflanzengewebe ist es möglich, Gene zu isolieren, die ausschließlich in Mikrosporen exprimiert werden.
  • Die Mikrosporen-RNA kann aus Mikrosporen isoliert werden, die sich im frühen bis späten einkernigen Stadium befinden. Auch wenn man andere Mikrosporen-Stadien nutzen kann, kann die Isolierung der Mikrosporen während früher liegender Entwicklungsstadien mit technischen Schwierigkeiten verbunden sein, und ältere Zellen können eine beschränkte Aktivität der im Kern befindlichen Gene besitzen, und Promotoren können für den Einsatz wie in der vorliegenden Anmeldung beschrieben ungeeignet sein.
  • Mikrosporen können in bequemer Weise isoliert werden, indem man manuell die Knospen abtrennt, um die Antheren zu entfernen, die sodann durch vorsichtiges Verreiben in einem Mörser mit Pistill in Gegenwart einer 10%-igen Saccharose-Lösung aufgebrochen werden. Der Extrakt wird dann durch ein 44 μm Nylonsieb bzw. -tuch filtriert, und die Mikrosporen werden durch einminütiges Zentrifugieren bei 3000 × g gesammelt. Die pelletierten Mikrosporen werden in 10%-iger Saccharose resuspendiert, filtriert und wie zuvor pelletiert. Auch andere Isolierungsverfahren können verwendet werden.
  • Andere Gewebe als Mikrosporen können durch verschiedene Methoden aufgebrochen oder zerkleinert werden, und das zerkleinerte Gewebe kann für eine RNA-Isolierung eingesetzt werden. In bequemer Weise kann das Gewebe unter Verwendung eines motorgetriebenen Homogenisators mit 10 ml einer Lösung aus 6 M Guanidinium-HCl, 0,1 M Na-acetat, pH 6,0, 0,1 M beta-Mercaptoethanol pro Gramm Gewebe zerkleinert werden. Das Homogenat wird mit 5000 × g zentrifugiert, und der Überstand wird über eine Lösung von 6 M CsCl in Tris-EDTA-Puffer (TE-Puffer) geschichtet. Man zentrifugiert 12 bis 20 Stunden lang bei 15°C bei 100.000 × g, um die RNA zu pelletieren, die anschließend in Wasser resuspendiert und in Gegenwart von 0,3 M Na-acetat und 2 Volumina Ethanol wiederum präzipitiert wird. Die RNA wird abzentrifugiert und in Wasser resuspendiert. Die durch ein solches Verfahren gewonnene RNA kann mit Hilfe von Oligo-d-T-Cellulose-Chromatographie fraktioniert werden, um die polyadenylierte mRNA von der Hauptmenge der nicht polyadenylierten RNA zu trennen. Die Mikrosporen-RNA wird isoliert, indem man einen dicht sitzenden, motorgetriebenen Glas-Homogenisator verwendet, um die Mikrosporen zu zerkleinern. Die Homogenisierung von 300 μl gepackten Mikrosporen wird in 1 ml einer Lösung aus 6 M Guanidinium-HCl, 0,1 M Na-acetat, pH 6,0, 0,1 M beta-Mercaptoethanol durchgeführt. Das Homogenat wird mit 5000 × g zentrifugiert, und der trübungsfreie Überstand wird über eine Lösung von 6 M CsCl in TE-Puffer geschichtet. Man zentrifugiert über Nacht bei 100.000 × g, um die RNA zu pelletieren, die anschließend in Wasser resuspendiert und in Gegenwart von 0.3 M Na-acetat und 2 Volumina Ethanol wieder ausgefällt wird. Auch andere RNA-Extraktionsverfahren können eingesetzt werden, um die RNA aus den beschriebenen Geweben zu gewinnen. Man setzt Standardmethoden unter Verwendung von Oligo-dT-Cellulose ein, um polyadenylierte mRNA aus diesen RNA-Gesamtpräparationen zu erhalten.
  • Die mRNA wird für Detektionszwecke markiert. Bequemerweise wird radioaktive cDNA hergestellt, indem man die genannte mRNA sowie AMV reverse Transcriptase in Gegenwart von randomisierten Hexanucleotid-Primern und alpha-[32P]-dCTP einsetzt. Man benutzt Sonden für die Hybridisierung an Erhebungen auf Nitrocellulose-Plaque-Platten mit den Klonen der genomischen Bibliothek. Ausgewählt werden Klone, die sich als nur mit Mikrosporen-cDNA und nicht mit cDNA aus einem anderen untersuchten Gewebe fest hybridisierend erweisen. Diese Klone werden plaqueweise gereinigt und für eine DNA-Isolierung gezüchtet. Alternative Techniken für das Handhaben von DNA und RNA sowie rekombinanter DNA, das Züchten und das Isolieren von Klonen kann in Handbüchern für die standardmäßige Laboratoriumstechnik gefunden werden, beispielsweise in Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Maniatis, T., Fritsch, E. F., und Sambrook, J., Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Habour, New York, 1982).
  • Für Anwendungen, bei denen die genomische DNA-Sequenz von L4, L10, L16 oder L19 aus Brassica napus verwendet wird, um bestimmte Ausgestaltungen dieser Erfindungen auszuführen, besteht das bevorzugte Verfahren zur Gewinnung (Isolierung) eines Sense-Gens, das für die Pollenbildung oder -funktion entscheidend oder wesentlich ist, darin, mit Hilfe von Standardverfahren (siehe Gait, M. J., Hrsg. (1984), Oligonucleotide synthesis, a practical approach, S. 1–22, IRL Press, Oxford, U. K.) synthetisch eine homologe DNA-Sequenz zu erzeugen, diese Sequenz für Detektionszwecke zu markieren und die genannte markierte Sequenz zu verwenden, um eine nach den beschriebenen Verfahren erzeugte Genom-Bibliothek von Brassica napus zu screenen.
  • Die Identität des Promotors und der codierenden Region eines gegebenen genomischen Klons wird durch Restriktionskartierung und Hybridisierungs-Analyse bestimmt. Dies läßt sich durch Hybridisierung von aus Mikrosporen-RNA erzeugten cDNA-Sonden mit Restriktionsfragmenten der genannten DNA-Klone erreichen, die auf Nitrocellulose immobilisiert sind. Restriktionsendonuclease-Fragmente, die sowohl die codierende Region als auch DNA-Bereiche an beiden Seiten der codierenden Region enthalten, werden durch Subklonieren in geeignete Vektoren isoliert. Wenn sie einmal isoliert sind, ist es bequem, Techniken wie beispielsweise S1-Kartierung und DNA-Sequenzierung einzusetzen, um exakte Informationen über die codierenden Regionen und Restriktionsschnitte innerhalb der subklonierten DNA zu gewinnen. Diese Analyse läßt sich leicht durchführen, sobald die Polarität bezüglich der Gen-Transkription bekannt ist.
  • Um die Polarität der Transkription des Sense-Gens zu bestimmen, können einzelne Restriktionsfragmente in käufliche Vektoren wie pGEM3, pGEM4 oder pGEM3Z, pGEM4Z (zu beziehen von Promega Biotech, Madison, WI, USA) subkloniert werden. Wenn man diese Vektoren verwendet, ist man in der Lage, einzelsträngige RNS-Sonden zu erzeugen, die zu dem einen oder dem anderen Strang der DNA-Doppelhelix in einem gegebenen Subklon komplementär sind. Diese strangspezifischen Sonden werden mit mRNA hybridisiert, um die Polarität der Transkription festzustellen. Unter diesen Sonden kann man diejenigen Sonden isolieren, die mit der mRNA hybridisieren und daher zu ihr komplementär sind. Mit Hilfe dieser Information ist es möglich, unzweideutig festzustellen, von welchem DNA-Strang des doppelsträngigen genomischen DNA-Moleküls die Sense-mRNA transkribiert wurde.
  • Um Promotor-DNA-Sequenzen einzugrenzen und zu isolieren, kann die pGEM-Vektorenreihe für die unidirektionale Deletion von Sequenzen aus den einzelnen Subklonen in Hybridisierungs-Protektions-Experimenten verwendet werden. Detaillierte Beschreibungen dieser experimentellen Verfahren lassen sich in einer Anzahl von Laborhandbüchern und in den technischen Anweisungen des Herstellers finden, die mit der pGEM-Vektorreihe ausgeliefert werden. Mit diesen Experimenten lassen sich der Promotor- und der codierende Bereich der pollenspezifischen genomischen Klone sicher feststellen.
  • Die Sequenz individueller Deletionen in den pGEM-Vektoren kann durch Didesoxy-Sequenzierung von Plasmid-Minipreps nach der Beschreibung in den technischen Erläuterungen des Herstellers bestimmt werden. Deletierte Subklone, die bis ganz nahe an den Start der Transkription deletiert sind, oder spezifische Restriktions-Fragmente, die die Promotor-Region oder die Promotor-Region und den Transkriptionsstart umfassen, werden für die Konstruktion von Genen ausgewählt, die nur in sich entwickelnden Mikrosporen von pollentragenden Pflanzen exprimiert werden. Gewöhnlich wird das Promotor-Fragment strangaufwärts zu einem Terminator, beispielsweise dem in pRAJ-221 (zu beziehen von Clonetech Laboratories, Palo Alto, CA) zu findenden nos Terminator insertiert, und spezifische Restriktions-Fragmente, die in Antisense-RNA transkribiert werden sollen, werden zwischen die Promotor- und die Terminator-Sequenzen insertiert. Das gesamte Konstrukt wird durch eine Kombination von Sequenzierung und Restriktionsverdauungen verifiziert. Das so konstruierte und verifizierte Antisense-Gen kann für die Transformation von Pflanzenzellen in T-DNA basierte Vektoren eingebaut werden. T-DNA-Vektoren mit einem selektionierbaren Marker sind bevorzugt. Es sollte klar sein, dass das Antisense-Gen in Abhängigkeit von der Wahl der eingesetzten Vektoren, Restriktionsenzyme und einzelnen Gene auf verschiedenen Wegen konstruiert werden kann. So kann es beispielsweise günstig sein, Restriktions-Fragmente, die in Antisense-RNA transkribiert werden sollen, in einen T-DNA basierten Vektor zu insertieren, dem zuvor eine Promotor- und eine Terminator-Struktur zugefügt worden waren. Alternativ ist es möglich, ein Promotor-Fragment strangaufwärts zu einer codierenden Region und einem Terminator zu insertieren, die zuvor einem T-DNA basierten Vektor zugefügt worden waren. Außerdem kann es für manche anbaubare Pflanzen wünschenswert sein, das Antisense-Gen nicht in einen T-DNA basierten Vektor einzubauen, sondern statt dessen in einen Vektor, der sich für einen direkte DNA-Aufnahme eignet. Promotoren, die keine mikrosporenspezifische Promotoren sind, können genutzt und mit spezifischen Restriktions-Fragmenten von Genen und Terminatoren verknüpft werden, vorausgesetzt, dass diese Promotoren in Mikrosporen funktionsfähig sind.
  • Die Einführung fremder DNA in Pflanzen hat man auf verschiedenen Wegen erreicht. Die am weitesten verbreiteten und allgemein erfolgreichen Verfahren sind abhängig vom Einsatz eines infektiösen Agens', beispielsweise dem Ti-Plasmid vom Agrobacterium tumefaciens als Vektor für die Einschleusung der fremden DNA. Andere Verfahren, die eingesetzt wurden, bedienen sich mechanischer Mittel, beispielsweise der direkten DNA-Aufnahme, Liposomen, Elektroporation (Guerche, P. et. al., 1987, Plant Science 52: 111–116) und Mikroinjektion (Neuhaus, G. et. al., 1987, Theor. Appl. Genet. 75: 30–36). In jüngster Zeit ist die Möglichkeit des Einsatzes von Mikroprojektilen und einer Kanone oder anderen Vorrichtung zum Erzwingen des Eindringens kleiner, mit DNA beschichteter Metallpartikel in Zellen auf bemerkenswerte Aufmerksamkeit gestoßen (Klein, T. M. et. al., 1987, Nature 327: 70–73). Bis heute wurde über einen Erfolg mit dieser und anderen mechanischen Methoden nicht in größerem Umfang berichtet.
  • Die Verwendung des Blumenkohl-Mosaikvirus' (Cauliflower Mosaic Virus, CaMV) (Howell, S. H. et. al., 1980, Science 208: 1265) und von Gemini-Viren (Goodman, R. M., 1981, J. Gen. Virol. 54: 9) als Vektoren ist vorgeschlagen worden, aber die bei weitem größten Erfolge hat man gemäß den entsprechenden Berichten mit Aprobacteria sp. (Horsch, R. B. et. al., 1985, Science 227: 1229–1231) erzielt. Verfahren für den Einsatz von auf Agrobacterium basierenden Transformationssystemen sind nun für viele verschiedene Arten und Sorten beschrieben worden. Im Allgemeinen werden Bakterienstämme eingesetzt, die modifizierte Versionen des natürlich auftretenden Ti-Plasmids beherbergen, derart, dass DNA ohne die nachfolgende Ausbildung von Tumoren auf die Wirtspflanze übertragen wird. Diese Verfahren beinhalten die Insertion der in das Pflanzengenom zu insertierenden und an einen selektierbaren Marker, der zur Identifizierung und Selektionierung transformierter Zellen eingesetzt wird, verknüpften DNA innerhalb der Grenzen des Ti-Plasmids. Die Bakterien und Pflanzengewebe werden zusammen kultiviert, um die Übertragung fremder DNA in Pflanzenzellen zu ermöglichen, und dann werden die transformierten Pflanzen auf Selektionsmedien regeneriert. Eine beliebige Anzahl von verschiedenen Organen und Geweben kann als Ziel für eine durch Agrobacterium mediierte Transformation dienen, wie es spezifisch für Mitglieder der Brassicaceae beschrieben wurde. Diese umfassend dünne Zellschichten (Charest, P. J. et. al., 1988, Theor. Appl. Genet. 75: 438–444) Hypocotyle (DeBlock, M. et. al., 1989, Plant Physiol. 91: 694–701), Blattscheiben (Feldman, K. A. und Marks, M. D., 1986, Plant Sci. 47: 63–69), Stengel (Fry J. et. al., 1987, Plant Cell Repts, 6: 321–325), Keinblätter (Moloney M. M., et. al., 1989, Plant Cell Repts 8: 238–242) und Embryoide (Neuhaus, G. et. al., 1987, Theor. Appl. Genet. 75: 30–36). Es sollte jedoch klar sein, dass es bei manchen Feldfrüchten wünschenswert sein kann, ein anderes Gewebe oder eine andere Transformationsmethode auszuwählen.
  • Aus transformierten Pflanzenzellen regenerierte Pflanzen werden auf die Expression des Marker-Gens getestet, bei dem es sich gewöhnlich um das Gen handelt, das Resistenz gegenüber dem selektionierenden Agens verleiht. Im Fall des häufig eingesetzten Gens Neomycin-Phosphotransferase (NPT II), das Resistenz gegenüber Kanamycin und dem Antibiotikum G-418 verleiht, wird auf Gen-Expression getestet, indem Kanamycin unter Verwendung von in der verfügbaren Literatur beschriebenen Techniken in vitro phosphoryliert wird, oder indem man durch Northern-Blot-Analyse von RNA aus dem Gewebe der transformierten Pflanze auf das Vorhandensein der mRNA testet, die für das NPT II-Gen codiert.
  • Das Vorhandensein eines stabil integrierten Sense- oder Antisense-Gens in der genetischen Komponente der Pflanzenzelle kann auch durch Einsatz der sogenannten Southern-Blot-Techniken sichergestellt werden. In diesem Verfahren wird die gesamte zelluläre oder nukleäre DNA aus der transformierten Pflanze oder Pflanzenzelle isoliert und vorzugsweise mit einem Restriktionsenzym geschnitten, das üblicherweise den für die Transformation eingesetzten Vektor an spezifischen oder singulären Stellen schneidet, wodurch diskrete Fragmente entstehen. Diese diskreten Vektor-Fragmente können in der nukleären oder der gesamten DNA der transformierten Pflanze oder Pflanzenzellen mit Hilfe standardmäßiger Gelelektrophorese oder Hybridisierungstechniken detektiert werden.
  • Die Bildung von Mikrosporen in Pflanzen, die die Antisense-Gene enthalten, wird zuerst durch Untersuchung der Antheren-Strukturen mit dem Auge und dem Mikroskop beobachtet. Wenn die Blütenstrukturen reifen, sollte die Staubbeutelbildung verzögert oder vollständig gehemmt sein, so dass keine reifen Pollenkörner gebildet oder freigesetzt werden.
  • Da die Aktivität und damit die Wirksamkeit eines jeden eingeführten rekombinanten DNA-Moleküls nach dem Zufallsprinzip durch die Position der Insertion des rekombinanten DNA-Moleküls in die Pflanze beeinflusst wird, kann der Grad, bis zu dem das insertierte rekombinante DNA-Molekül die Pflanze empfindlich gegenüber Agentien macht, die eine verringerte männliche Fertilität bewirken, oder dies verursacht, von Pflanze zu Pflanze schwanken. Daher ist es notwendig, eine Pflanze auszuwählen, die keine funktionsfähigen Pollenkörner erzeugt.
  • Die Erzeugung von hybridem Saatgut erfolgt durch Bestäubung transformierter männlich steriler Pflanzen mit Pollen, die von ausgewählten männlich fertilen Pflanzen stammen. Die Bestäubung kann in beliebiger Weise erfolgen, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, von Hand, durch Wind oder durch Insektenbestäubung oder durch mechanischen Kontakt zwischen der männlich fertilen und der männlich sterilen Pflanze. Für die Erzeugung von hybridem Saatgut in kommerziellem Maßstab sind die Bestäubung durch Wind oder durch Insekten bei den meisten Pflanzenarten zu bevorzugen. Die Selektion von Pflanzen auf Pollendonation wird durch standardmäßiges Kreuzen unterschiedlicher Pflanzen mit anschließender Analyse der Nachkommen und Selektion der Linien mit den besten kombinatorischen Fähigkeiten und überlegenen agronomischen Merkmalen bewirkt. Die Wiederherstellung der Fertilität in den Hybriden wird durch Einsatz der in den spezifischen Beispielen dargelegten Methoden bewirkt.
  • Die Erfindung und andere, vorliegend beschriebene Verfahren werden durch die nachstehenden Beispiele erläutert:
  • Beispiel 1 (erläutert keine beanspruchte Ausführungsform der Erfindung)
  • In diesem Beispiel wurde Antisense-RNA spezifisch für die Inhibition von Gen-Aktivität in Pflanzen eingesetzt. Eine Tabakpflanze, die das β-Glucuronidase-Gen unter der Kontrolle des CaMV 35S-Promotors exprimiert, wurde durch Transformation einer nicht transformierten Tabak-Kulturvarietät als Kontrolle, N. tabaccum, cv. Delgold, erzeugt. Um dies zu bewirken, wurden Tabakblätter mit einer Länge von weniger als 8 inches (20,32 cm) oberflächensterilisiert, indem sie 5–6 Sekunden lang mit Ethanol behandelt und daran anschließend einige Minuten lang, gewöhnlich 5–10 Minuten oder bis sich die Schnittkante des Blattstiels weiß verfärbte, 1%-igem Natriumhypochlorit ausgesetzt wurden, und dann wurden sie mehrmals mit sterilem destilliertem Wasser gespült. Blattsegmente von ungefähr 0,5–1,0 Quadratzentimetern wurden auf sprossinduzierenden Medien zwei Tage lang mit Agrobacterium tumefaciens GV 3101 cokultiviert, welches das Ti-Plasmid pMP 90 zur Bereitstellung von vir-Funktionen in trans trägt (beschrieben von Koncz, C. und Schell, J., 1986, Mol. Gen. Genet. 204: 383–396), das den binären Vektor pBI 121.1 trägt. Dieser Vektor stammt von Bin 19 ab, der das GUS-Gen unter der Kontrolle des CaMV 35S-Promotors und terminiert durch das nos ter enthält und von Clonetech Laboratories, Palo Alto, CA., USA bezogen werden kann. Transformierte Tabak-Zellen wurden auf einem sprossinduzierenden Medium mit 0,8% Agar, MS Salzen, B5-Vitaminen, 3% Saccharose, 1 mg/l Benzyladenin, 0,1 mg/l alpha-Naphtalinessigsäure (NAA) 300 μg/ml Kanamycin und 500 μg/ml Carbenicillin selektioniert (im Wesentlichen wie von Horsch et. al., 1985, Science, 227: 1229–1231 beschrieben). Regenerierte Schösslinge wurden dann in ein wurzelinduzierendes Medium übertragen, das aus B5-Medium mit 2% Saccharose, 500 μg/ml Carbanicillin und jeweils 0,5 mg/l NAA und Indolessigsäure (IAA) bestand. Nach der Selektion auf Kanamycin wurde eine Tabak-Transformante, die ein relativ hohes konstitutives Niveau an GUS-Aktivität zeigte und eine einzelne, nicht wieder neu- oder umgeordnete Insertion des 35S CaMV-Promotor-GUS-nos-ter-Konstrukts enthielt, ausgewählt. Diese Pflanze (TTR-48, GUS+) wurde dann retransformiert, und zwar mit einem binären Vektor PAL 1302, der ein Antisense-GUS-Gen enthält und dessen Konstruktion in 1 beschrieben ist. In Experimenten, die die Retransformation der Tabakpflanze TTR-48 mit PAL 1302 einschlossen, enthielt das sprossinduzierende Medium 20 μg/ml Hygromycin und 300 μg/ml Kanamycin, um die Selektion auf Pflanzen sicherzustellen, die sowohl das Sense- als auch das Antisense-GUS-Konstrukt enthalten. Transformanten wurden im Gewächshaus bis zur Geschlechtsreife gezogen und selbst bestäubt.
  • Die Blätter von Tabakpflanzen, die aus der Retransformation von TTR-48 (GUS+) mit dem Antisense-GUS-Vektor PAL 1302 stammten, wurden auf GUS-Aktivität getestet. Die GUS-Aktivität in Blattextrakten wurde spektrophotometrisch bestimmt. Ungefähr 0,5 g Blattgewebe wurden mit einem Polytron in 2 ml GUS-Extraktionspuffer (50 mM NaPO4 pH 7,0, 1 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 10 mM β-Mercaptoethanol, 1 mM p-Nitrophenylglucuronid, 100 μg/ml Rinderserumalbumin, 0,2% Natriumazid) zerkleinert, 6 Stunden lang bei 30°C inkubiert, und die Reaktion wurde durch den Zusatz von 0,4 ml 2,5 M 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol abgebrochen. Die gebildete Menge an p-Nitrophenol wurde berechnet, indem die Absorption bei 415 nm gemessen wurde. Eine ebenfalls zum Abbruch gebrachte Reaktionsmischung, die eine identische Menge an Blattextrakt enthielt, wurde als Leerprobe eingesetzt. Die relativen Enzymaktivitäten in den Extrakten wurden berechnet und als Nanomol p-Nitrophenol, gebildet pro mg Protein pro Minute, ausgedrückt. Zehn Pflanzen wurden durchgetestet, und sie alle zeigten eine starke Verringerung des GUS-Aktivitäts-Niveaus im Vergleich zu denjenigen, die in TTR-48 beobachtet werden. Fünf Pflanzen (TTR-1 bis TTR-5) wurden für eine genaue Analyse des Effekts einer Antisense-RNA-Inhibition der GUS-Genaktivität ausgewählt. Die retransformierten Tabakpflanzen TTR-1 bis TTR-5 (15, Reihen 1 bis 5) zeigten alle eine deutliche bis vollständige (Reihe 4) Absenkung der GUS-Aktivität, ungeachtet des Entwicklungsstadiums der untersuchten Blätter. Ein Vergleich des höchsten Niveaus an GUS-Aktivität, das in der ursprünglichen GUS+-Pflanze TTR-48 beobachtet wurde (15, Reihe 6) mit dem höchsten Wert, der in einer der mit PAL 1302 retransformierten Pflanzen gefunden wurde (Reihen 1 bis 5), zeigt, dass die Absenkung der GUS-Aktivität mindestens 90% betrug. Das Niveau der GUS-Aktivität, das man in der Kontrollpflanze TTR-88 (15, Zeile 7) fand, war ähnlich demjenigen der ursprünglichen GUS+-Pflanze (Reihe 6), was zeigt, das der Retransformations- und Regenerationsprozess, dem TTR-48 unterzogen worden war, nicht für den Abfall der in TTR-1 bis TTR-5 beobachteten GUS-Aktivität verantwortlich war. Eine Western-Blot-Analyse der gesamten Protein-Extrakte, die man aus jungen Blättern erhielt, wurde durchgeführt. Für die Extraktion von Blattprotein wurden ungefähr 100 mg Gewebe in einem 1,5 ml großen Eppendorf-Röhrchen, das 0,7 ml des oben beschriebenen GUS-Extraktionspuffers enthielt, zerkleinert. Ein gleiches Volumen an SDS PAGE 2X-Probenaufgabepuffer (1,3 M Tris-Cl pH 6,8, 2% β-Mercaptoethanol, 50% Glycerin, 5 mM EDTA, 0,1% Bromphenolblau) wurde zugesetzt, und die Proben wurden 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Der Extrakt wurde bei 12.000 Upm 2 Minuten zentrifugiert, und der Überstand wurde auf –80°C eingefroren, bis er benutzt wurde. Die Proteine in 10% SDS PAGE Gelen wieder aufgelöst und sofort elektrophoretisch auf einen Nitrocellulose-Filter übertragen. Das GUS-Protein wurde dann in den Gelen detektiert, wobei man den Kaninchen-Anti-β-Glucuronidase-Antikörper, erhalten von Clontech Laboratories, und einen Kit (Promega Biotech, Madison, WI, USA) mit einem Anti-Kaninchen 1 gG alkalische-Phosphatase-Konjugat gemäß den Angaben des Herstellers einsetzte. Gleiche Mengen an Protein wurden durch Natrium-Dodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS PAGE) getrennt, auf Nitrocellulose übertragen und mit für das GUS-Protein spezifischen Antikörpern zur Kreuzreaktion gebracht. Die auf dem Westernblot detektierte Menge an GUS-Protein korrelierte gut mit der GUS- Aktivität, die man in den Blättern aller untersuchten Tabakpflanzen gefunden hatte, unabhängig davon, ob diese ein hohes Aktivitätsniveau wie TTR-48 oder keine unterscheidbare Aktivität besaßen wie TTR-3 (15, Reihe 3). Die Verringerung der GUS-Aktivität in TTR-1 bis TTR-5 kann deshalb direkt geringeren Mengen an GUS-Enzym innerhalb dieser Pflanzen zugeordnet werden. Southern-Blot-Analysen wurden durchgeführt, um sicherzustellen, dass das GUS-Sense-Gen in TTR-1 bis TTR-5 immer noch vorhanden und intakt war und um zu verifizieren, dass das GUS-Antisense-Konstrukt korrekt in die DNA dieser Pflanzen integriert war. Es wurde gefunden, dass die Anordnung des originalen GUS-Sense-Gens TTR-48 von der Transformation mit dem das Antisense-Gen enthaltenden Vektor unbeeinflusst geblieben war, und es wurde weiterhin auch sichergestellt, dass unter den für diese Analyse ausgewählten Pflanzen zwischen 1–3 Kopien des Antisense-Gens in das Genom der Pflanze insertiert waren, die das Sense-Gen enthielt. Es wurde auch festgestellt, dass ein einziges insertiertes Antisense-Gen zu einer nahezu vollständigen Reduktion der Aktivität des Sense-Gens führen konnte. Eine Northern-Blot-Analyse wurde an der gesamten Blatt-RNA durchgeführt, um festzustellen, ob die Reduktion der Mengen an GUS-Enzym, die in TTR-1 bis TTR-5 beobachtet worden war, mit ihren Mengen an GUS mRNA korrelierte. Der Gesamtgehalt an RNA wurde aus Tabakblättern präpariert, indem 0,5 g Gewebe unter Verwendung eines Polytron 10 bis 30 Sekunden lang in 2 ml Extraktionspuffer (6 M Guanidin-HCl, 0,1 M NaAc pH 6,0, 1,0% β-Mercaptoethanol) zerkleinert wurden. Die Mischung wurde dann 3 Minuten lang bei 5.000 Upm zentrifugiert, mit dem Überstand wurde ein gleiches Volumen von 5,7 M CsCl in 0,1 M NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7,5, 1 mM EDTA überschichtet, und man zentrifugierte nochmals 16 Stunden lang bei 15°C mit 35.000 Upm. Das gebildete RNA-Pellet wurde in 0,1 M NaAc pH 6,0, 0,1% SDS resuspendiert und mit einem gleichen Volumen Phenol-Chloroform (50 : 50, v/v) extrahiert. Die wässrige Phase wurde auf 0,3 M NaAc eingestellt, und die RNA wurde mit 2 Volumina Ethanol ausgefällt. Nach der Zentrifugation wurde das Pellet in 70%-igem Ethanol gewaschen und in sterilem destilliertem Wasser resuspendiert. RNA-Proben wurden in Gegenwart von Methylquecksilberhydroxid auf 1,3%-igen Agarose-Gelen getrennt und auf eine Nylon-Membran überführt. Die Membranen wurden mit Sonden versehen, bei denen es sich um (32P) UTP-markierte Transkripte von GUS-Sense- oder Antisense-RNA handelte. Diese Transkripte wurden aus pGEM-GUS hergestellt, einem Plasmid, das man durch Insertieren des Bam HI-Sst I-Fragments von pBI 221.1 (das die gesamte, für GUS codierende Sequenz enthält) in die Bam HI-Sst I-Schnittstellen von pGEM-4Z erhalten hatte. Sonden wurden erzeugt, indem pGEM-GUS mit Eco RI geschnitten und sodann T7 RNA-Polymerase verwendet wurde, um ein Transkript bereitzustellen, das mit GUS-Antisense-RNA hybridisieren kann, oder indem man eine Verdauung mit Hind III und eine Transkription mit SP6 RNA-Polymerase durchführte, wobei ein Antisense-Transkript gebildet wurde, das nur mit mRNA des GUS-Sense-Gens hybridisieren kann. Eine radiomarkierte, Sense-spezifische GUS-RNA-Sonde zeigte, dass die Mengen an GUS mRNA, die man in TTR-1 bis TTR-5 fand, deutlich geringer waren als diejenigen, die in TTR-48, der ursprünglichen GUS+-Pflanze, beobachtet wurden. Wie vorhergesagt, besaß untransformierter Tabak das GUS-Transkript nicht. Die Mengen an Sense-mRNA korrelieren gut mit der Menge an GUS-Protein und -Aktivität, die in diesen Pflanzen beobachtet werden. Eine Norfhern-Blot-Analyse unter Verwendung einer Antisense-spezifischen GUS RNA-Sonde zeigte das Vorhandensein des Antisense-GUS-Transkripts in den retransformierten Pflanzen. Die verringerten Mengen an GUS-Protein und GUS-Aktivität, die in TTR-1 bis TTR-5 beobachtet wurden, können dementsprechend den in diesen Pflanzen gefundenen geringen Mengen an GUS mRNA zugeordnet beziehungsweise mit diesen korreliert werden. Geringe Mengen an GUS-mRNA sind immer mit dem Vorhandensein der Antisense-GUS-RNA verknüpft. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, das ein ins Auge gefasstes Sense-Gen erfolgreich unter Einsatz von Antisense-RNA inhibiert werden kann.
  • Beispiel 2 (erläutert keine beanspruchte Ausführungsform der Erfindung)
  • Wir richten unsere Aufmerksamkeit nun auf die Verwendung von konstitutiven Promotoren, die pollenspezifische Antisense-RNA produzieren. Der CaMV 35S-Promotor aus pB1 221 wurde als Hind III-Xba I-Fragment isoliert und in PAL 1001 kloniert, das zuvor mit Hind III und Xba I geschnitten worden war. Dies erzeugte einen Vektor, der den CaMV 35S-Promotor verknüpft mit den nos ter enthielt, und zwischen dem Promotor und dem Terminator befanden sich singuläre Schnittstellen für: Xba I, Bam HI, Sma I, Kpn I und Sst I. Dieser Vektor wurde mit PAL 1007 bezeichnet. PAL 1007 wurde mit Bam HI verdaut, und zu diesem verdauten Vektor gab man ein 2,4 kB langes Bam HI-Fragment, das den codierenden Bereich des Klons L16 in Antisense-Orientierung enthielt. Dieser Vektor wurde mit PAL 1305 bezeichnet und zur Transformation von Brassica napus eingesetzt. Die Transformation wurde entweder mit Hilfe des Verfahrens durchgeführt, das bei Moloney, M. M. et. al. (Plant Cell Reports (1989) 8: 238–242) beschrieben ist, oder die Transformation kann mit oberflächensterilisierten Schichten von Stengel-Epidermis durchgeführt werden. Für dieses Verfahren wurden Samen von B. napus L. ssp. Oleifera cv. Westar in ca. 20 cm großen Töpfen ausgesät, die "Promix" vermischt mit 2 g/l des Langzeitdüngers "Nutricoate" enthielten. Im Gewächshaus wurden Pflanzen unter einer 16 (stündigen) Photoperiode (unter Verwendung von natürlichem und künstlichem Licht) gezogen. Für die Cokultivations- und Regenerationsexperimente wurden Stengelabschnitte von den drei obersten Stengel-Blattknoten von ungefähr 1,5 Monate alten Pflanzen eingesetzt (das heißt solchen mit länglichen floralen Blütenähren und mehreren offenen Blüten). Intakte Stengelabschnitte wurden 30 Sekunden lang in 70%-igem Ethanol und 10 Minuten lang in 1%-igem Natriumhypochorit oberflächensterilisiert, woran sich drei Waschgänge in sterilem destilliertem Wasser anschlossen. Für die Transformation wurden Agrobacterium tumefaciens GV 3101, das das Ti-Plasmid pMP 90 zur Bereitstellung der vir-Funktionen in trans trägt, und der binäre Vektor PAL 1110 auf YEP-Medium (das aus 10 g/l Hefeextrakt, 10 g/l Bacto-pepton und 5 g/l NaCl, pH 7,0, enthaltend 100 μg/ml Kanamycin für die Selektion auf bakterielle Zellen, die die binären Vektoren enthielten) vermehrt. Die Zellen wurden ein bis zwei Tage bei 28°C gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und mit einer annähernden Dichte von 106–107 Zellen pro ml in flüssigem EL resuspendiert, das aus MS Mikro- und Makronährstoffen und B5-Vitaminen mit 40 mg/l FeNa-EDTA (erhalten von BDH chemicals) und 3% Saccharose, 10 mg/l Benzyladenin und 0,5 mg/l alpha-Naphtalinessigsäure (NAA) und 18,8 mM KNO3 plus 20,6 mM NH4NO3 besteht. Das Medium wurde mit 0,8%-igem Agar (Sigma) verfestigt, wenn die EL-Medien für feste Mediumplatten eingesetzt wurden.
  • Die Zellsuspension wurde auf den Boden einer sterilen Petrischale gegossen, und sterilisierte Stengel wurden direkt in die Bakteriensuspensionen hineingeschnitten. Die Segmente wurden der Länge nach in Halbsegmente unterteilt und in ungefähr 5 mm lange Abschnitte geschnitten. Die zerteilten Segmente wurden für eine dreitägige gemeinschaftliche Kultur unter kontinuierlichem fluoreszierendem Licht (60 Microeinstein/m2/sec2) bei 25°C auf Filterpapierscheiben auf festem EL- Medium gegeben. Nach einer zwei- bis dreitägigen gemeinschaftlichen Kultur wurden die Gewebeschnitte auf festes EL-Medium transferiert, das 500 μg/ml Carbenicillin und 100 μg/ml Bekanamycin (Sigma) enthielt. Innerhalb von vier bis acht Wochen bildeten sich Schösslinge, und Abschnitte wurden alle drei bis vier Wochen auf frisches festes EL-Medium mit Carbinicillin und Bekanamycin transferiert. Schösslinge, die sich gebildet hatten und die nicht ausbleichten, wurden ausgeschnitten und zur Wurzelbildung auf PDR-Medium (85 – mit 2% Saccharose und 0,5 mg/l sowohl von NAA als auch von IAA) gegeben. In manchen Fällen wurde grüner, sich nicht regenerierender Callus, der auf selektivem Medium wuchs, von den Pflanzenausschnitten abgetrennt und auf frisches Medium gegeben, um eine Regeneration zu stimulieren. Transformierte Pflanzen wurden in eine Mistkammer gesetzt und nach zwei bis vier Wochen in das Gewächshaus überführt. Pflanzen wurden unter einer 16-stündigen Photoperiode gezüchtet und zum Blühen gebracht. Klonale Vermehrung wurde genauso wie Kreuzen von Hand und Selektion von Keimlingen aus gekreuzten Pflanzen auf kanamycinhaltigem Medium verwendet, um die Pflanzenlinien zu vermehren. Das genannte Medium bestand aus 0,8% Agar, einem Zehntel MS Salzen und 100 μg/ml Bekanamycin ohne Saccharose im Medium. Es wurden oberflächensterilisierte Samen eingesetzt. Die Samen wurden oberflächensterilisiert, indem sie einige Sekunden lang in 70%-igem Ethanol gespült, 15 Minuten lang in 1%-igem Natriumhypochlorit eingeweicht und schließlich dreimal mit sterilem destilliertem Wasser gespült wurden. Man legte die Samen in sterile Schalen auf die Oberfläche des Agars und ließ sie sprossen. Pflanzen, die das Kanamycin-Gen verknüpft mit dem Antisense-Gen nicht trugen, blichen aus und starben, während diejenigen, die das Antisense-Gen trugen, grün blieben und anschließend in Erde überführt und zum Blühen gebracht wurden.
  • Beispiel 3 (erläutert keine beanspruchte Ausführungsform der Erfindung)
  • In diesem Beispiel nutzen wir einen anderen pollenspezifischen codierenden Bereich in dem Vektor PAL 1007. In diesem Fall wurde ein 1,3 kB langes Hind III-Fragment aus dem Klon L 19 isoliert, glattendig gemacht und die Sma I-Schnittstelle von pGEM 4Z kloniert. Dieser Subklon wurde pPAL 1914 genannt und wurde dann mit Xba I und Sst I verdaut. Dieses Fragment wurde zu mit Xba I-Sst I geschnittenem PAL 1007 gegeben, wodurch ein Vektor mit der Bezeichnung PAL 1307 entstand.
  • Dieser Vektor enthält den CaMV 35S-Promotor fusioniert mit einem codierenden Bereich des Klons L 19 in Antisense-Orientierung. Dieser Vektor wurde benutzt, um Brassica napus wie in Beispiel 2 erläutert zu transformieren.
  • Beispiel 4 (erläutert keine beanspruchte Ausführungsform der Erfindung)
  • Wir richten nun unsere Aufmerksamkeit auf die Verwendung von induzierbaren Promotoren für die Erzeugung von pollenspezifischer Antisense-RNA. In diesem Beispiel wurde das 1,2 kB lange Hind III-Pst I-Fragment des 70 kD großen Hitzeschockprotein-Promotors aus D. melanogaster aus dem Subklon pPW 229 (Holmgren, R. et. al., 1979, Cell 18: 1359–1370) isoliert und in mit Hind III-Pst I geschnittenes pGEM 42 kloniert. Der Hitzeschock-Promotor wurde als Hind III-Sma I-Fragment ausgeschnitten und in mit Hind III-Sma I geschnittenes PAL 1001 kloniert. Dies erzeugte einen Vektor (PAL 1009), der einen Hitzeschock-Promotor und danach einen Teil des Polylinkers und nos ter enthält. Die Sma I-Schnittstelle wurde verwendet, um das 1,3 kB lange Hind III-Fragment aus dem Klon L 19 zu klonieren, worauf dieses Fragment glattendig gemacht wurde. Der Klon, der dieses Fragment in der Antisense-Orientierung relativ zum Hitzeschock-Promotor enthält, wurde PAL 1403 genannt. Dieser Vektor wurde eingesetzt, um Brassica napus wie in Beispiel 2 zu transformieren. Zusätzlich wurde, weil eine einzelne Eco RI-Schnittstelle am Ende des nos ter in diesem Konstrukt existiert, diesem Konstrukt ein Marker-Gen hinzugefügt, nämlich das Enzym beta-Glucuronidase, gesteuert durch den CaMV 35S-Promotor, wobei man diese einzelne Eco RI-Schnittstelle für die Insertion dieses Gens verwendete. Dieser Vektor, der der gleiche wie PAL 1403 ist, mit der Ausnahme, dass er nun ein geeignetes Gen für die Beobachtung der Transformation enthielt, wurde mit PAL 1408 bezeichnet und für die Transformation von Brassica napus wie in Beispiel 2 beschrieben eingesetzt.
  • Beispiel 5 (erläutert keine beanspruchte Ausführungsform der Erfindung)
  • Dieses Beispiel betrifft die Verwendung eines pollenspezifischen Promotors, um pollenspezifische Antisense-RNA in Pollenzellen spezifisch zu exprimieren. Hierfür wurde der Vektor PAL 1107 für die Erzeugung von Antisense-RNA aus dem in 4 beschriebenen cDNA-Klon 4F eingesetzt. Um diesen Antisense-Vektor zu konstruieren, wurde das Eco RI-Fragment aus dem cDNA-Klon 4F isoliert, mit Klenow glattendig gemacht und in die Sma I-Schnittstelle von PAL 1107 kloniert. Ein Vektor, der den cDNA-Klon in Antisense-Orientierung enthielt (wie mit Hilfe von Restriktionsenzym-Analyse festgestellt), wurde ausgewählt. Dieser Vektor wurde mit PAL 11074F bezeichnet und eingesetzt, um Brassica napus wie in Beispiel 2 zu transformieren.
  • Beispiel 6 (erläutert keine beanspruchte Ausführungsform der Erfindung)
  • Für dieses Beispiel wurde der Vektor PAL 1107 für die Erzeugung von Antisense-RNA aus dem 2,4 kB langen Bam HI-Fragment des Klons L 16, der in Beispiel 4 beschrieben ist, verwendet. Um diesen Antisense-Vektor zu konstruieren, wurde das 2,4 kB lange Bam HI-Fragment aus dem Klon L 16 isoliert und in die Bam HI-Schnittstelle von PAL 1107 kloniert. Ein Vektor, der dieses Fragment in Antisense-Orientierung (wie bestätigt durch Restriktionsenzym-Analyse) enthielt, wurde ausgewählt. Dieser Vektor wurde mit PAL 1107-16CRAS bezeichnet und eingesetzt, um Brassica napus wie in Beispiel 2 beschrieben zu transformieren.
  • Beispiel 7 (erläutert keine beanspruchte Ausführungsform der Erfindung)
  • Für dieses Beispiel wurde der Vektor PAL 1107 für die Erzeugung von Antisense-RNA aus dem 1,3 kB langen Hind III-Fragment des Klons L 19, das in Beispiel 5 beschrieben ist, verwendet. Um diesen Antisense-Vektor zu konstruieren, wurde das 1,3 kB lange Hind III-Fragment aus dem Klon L 19 isoliert, glattendig gemacht und in die Sma I-Schnittstelle von PAL 1107 kloniert. Ein Vektor, der dieses Fragment in Antisense-Orientierung (wie bestätigt durch Restriktionsenzym-Analyse) enthielt, wurde ausgewählt. Dieser Vektor wurde mit PAL 1107-19CRAS bezeichnet und eingesetzt, um Brassica napus wie in Beispiel 2 beschrieben zu transformieren.
  • Beispiel 8 (erläutert keine beanspruchte Ausführungsform der Erfindung)
  • Hierfür wurde der Vektor PAL 1107 für die Erzeugung von Antisense-RNA aus dem in 5 beschriebenen, dem Klon L 10 verwandten cDNA-Klon eingesetzt. Um diesen Antisense-Vektor zu konstruieren, wurde das Eco RI-Fragment aus dem cDNA-Klon isoliert, mit Klenow glattendig gemacht und in die Sma I-Schnittstelle von PAL 1107 kloniert. Ein Vektor, der den cDNA-Klon in Antisense-Orientierung enthielt (was durch Restriktionsenzym-Analyse festgestellt wurde), wurde ausgewählt. Dieser Vektor wurde mit PAL 110710G bezeichnet und dazu verwendet, Brassica napus wie in Beispiel 2 zu transformieren.
  • Beispiel 9 (erläutert keine beanspruchte Ausführungsform der Erfindung)
  • Hierfür wurde der Vektor PAL 1107 für die Erzeugung von Antisense-RNA aus dem in 6 beschriebenen, dem Klon L 19 verwandten cDNA-Klon eingesetzt. Um diesen Antisense-Vektor zu konstruieren, wurde das Eco RI-Fragment aus dem cDNA-Klon isoliert, mit Klenow glattendig gemacht und in die Sma I-Schnittstelle von PAL 1107 kloniert. Ein Vektor, der den cDNA-Klon in Antisense-Orientierung enthielt (was durch Restriktionsenzym-Analyse festgestellt wurde), wurde ausgewählt. Dieser Vektor wurde mit PAL 110719 bezeichnet und dazu verwendet, Brassica napus wie in Beispiel 2 zu transformieren.
  • Beispiel 10 (erläutert keine beanspruchte Ausführungsform der Erfindung)
  • In diesem Beispiel wurde der pollenspezifische Promotor im Vektor PAL 1421 für die Erzeugung von Antisense-RNA unter Verwendung des cDNA-Klons eingesetzt, der zu dem in L 10 enthaltenen Gen homolog ist. Dies wurde bewerkstelligt, indem der cDNA-Klon mit Eco RI aus dem Klonierungsvektor ausgeschnitten und dieses Fragment mit Klenow glattendig gemacht wurde. Dieses glattendige cDNA-Fragment wurde in die Sma I-Schnittstelle von PAL 1421 kloniert. Es wurden Klone erhalten, die das cDNA-Insertionsstück in beiden Orientierungen enthielten, und unter diesen wurde einer ausgewählt, der das insertierte Stück in der Antisense-Orientierung relativ zu dem Promotor von PAL 1421 enthielt, was zur Bildung eines binären Transformations-Vektors PAL 1492 führte. PAL 1492 wurde verwendet, um Brassica napus wie in Beispiel 2 beschrieben zu transformieren.
  • Beispiel 11 (erläutert keine beanspruchte Ausführungsform der Erfindung)
  • In diesem Beispiel wurde der pollenspezifische Promotor im Vektor PAL 1121 für die Erzeugung von Antisense-RNA unter Verwendung des cDNA-Klons eingesetzt, der zu dem in L 10 enthaltenen Gen homolog ist. Dies wurde bewerkstelligt, indem der cDNA-Klon mit Eco RI aus dem Klonierungsvektor ausgeschnitten und dieses Fragment mit Klenow glattendig gemacht wurde. Das glattendige cDNA-Fragment wurde in die Sma I-Schnittstelle von PAL 1121 kloniert. Es wurden Klone erhalten, die das cDNA-Insertionsstück in beiden Orientierungen enthielten, und unter diesen wurde einer ausgewählt, der das insertierte Stück in der Antisense-Orientierung relativ zu dem Promotor von PAL 1121 enthielt, was zur Bildung eines binären Transformations-Vektors PAL 1110 führte. PAL 1110 wurde verwendet, um Brassica napus wie in Beispiel 2 beschrieben zu transformieren.
  • Beispiel 12 (erläutert keine beanspruchte Ausführungsform der Erfindung)
  • In diesem Beispiel wurde der pollenspezifische Promotor aus Klon 19 für die Expression von pollenspezifischer Antisense-RNA eingesetzt. Der Transformations-Vektor PAL 1920 wurde mit Sma I verdaut. In die Sma I-Schnittstelle wurde das DNA-Fragment eingefügt, das dem cDNA-Klon entspricht, der zu Klon L 10 homolog ist, und zwar durch das Verdauen des diesen Klon enthaltenden Vektors mit Eco RI und Auffüllen des Fragments. Dieses glattendige cDNA-Fragment wurde in die Sma I-Schnittstelle von PAL 1920 kloniert. Es wurden Klone erhalten, die das cDNA-Insertionsstück in beiden Orientierungen enthielten, und darunter wurde einer ausgewählt, der das Insertionsstück in der Antisense-Orientierung relativ zum Promotor von pPAL 1920 enthielt, was zur Bildung eines binären Transformations-Vektors PAL 1921 führte. PAL 1921 wurde verwendet, um Brassica napus wie in Beispiel 2 beschrieben zu transformieren.
  • Beispiel 13 (erläutert keine beanspruchte Ausführungsform der Erfindung)
  • In diesem Beispiel wird Antisense-RNA spezifisch für den Intron-Bereich von Klon L 19 erzeugt, und es wird ein spezifisches Wiederherstellungs-Gen erzeugt, dem das Intron aus Klon L 19 fehlt. Die Konstruktion dieser beiden Vektoren ist in 12 gezeigt. PAL 1954 wurde eingesetzt, um Brassica napus wie in Beispiel 2 zu transformieren, so dass man eine männlich sterile Linie erhielt. Um eine spezifische Wiederherstellungs-Pflanzenlinie zu erzeugen, wurde der Vektor PAL 1955 verwendet, um Brassica napus wie in Beispiel 2 zu transformieren.
  • Beispiel 14 (erläutert keine beanspruchte Ausführungsform der Erfindung)
  • In diesem Beispiel benutzen wir das hochaktive Promotor-Fragment des Klons HP 101, um eine Antisense-RNA zu dem Intron-Bereich des Klons 19 zu synthetisieren. Für dieses Beispiel wurde der den Intron-Bereich von Klon 19 tragende Subklon, der in 12 erläutert ist, pPAL 1914, mit Hind III und Bam HI verdaut. Das Promotor-Fragment aus dem Klon pPAL 101 wurde diesem Konstrukt als Hind III-Bam HI-Fragment zugegeben, was zu Klonen führte, die das Promotor-Fragment in Antisense-Orientierung relativ zu dem Intron enthalten. Dieser Klon enthielt den Promotor in einer derartigen Orientierung, dass die Transkription des Promotors die Produktion einer RNA bewirken würde, von der ein Teil Antisense-RNA enthalten würde, die homolog zu dem Intron-Bereich des Klons 19 ist. Dieser Klon wurde mit pPAL 19 HP bezeichnet. Der Klon pPAL 19 HP wurde mit Hind III und Sst I verdaut und unter Verwendung der Hind III- und Sst I-Schnittstellen von PAL 1001 in den Vektor PAL 1001 kloniert, wobei PAL HP 19 erzeugt wurde. PAL HP 19 wurde verwendet, um Brassica napus wie in Beispiel 2 zu transformieren. Es ist anzumerken, das der Vektor PAL 1955 zur Wiederherstellung der Fertilität von Pflanzen eingesetzt werden kann, die PAL HP 19 tragen.
  • Beispiel 15 (erläutert keine beanspruchte Ausführungsform der Erfindung)
  • Der in dem Subklon pPAL 0420 enthaltene pollenspezifische Promotor wurde für die Konstruktion eines Antisense-RNA-Gens unter der Kontrolle eines pollenspezifischen Promotors wie folgt eingesetzt: Ein DNA-Fragment, das für ein Polyubiquitin von Arabadopsis codierte, wurde aus einem Plasmid isoliert, das ein Polyubiquitin-Gen mit 5 Kopien des monomeren Ubiquitin-Proteins enthält. Dieses wurde von der Universität von Wisconsin, Madison, WI, USA erhalten und ist in Burke et. al., Molecular and General Genetics, im Druck, beschrieben. Ein Bam HI-Bgl II-Fragment wurde isoliert, das 3 der 5 Kopien des Polyubiquitin-Gens enthielt, und dieses Fragment wurde unter Ausnutzung der singulären Bam HI-Schnittstelle des Polylinkers von PAL 0420 in pPAL 0420 insertiert. Dabei entstand ein Plasmid, das den pollenspezifischen Promotor aus Klon L 4 und dahinter ein DNA-Fragment mit für Ubiquitin codierenden Sequenzen in Antisense-Orientierung, gefolgt von dem nos ter Polyadenylierungs-Signal enthielt. Dieses Promotor-/Antisense-Genkonstrukt wurde durch Verdauung mit Eco RI aus pPAL 0420 ausgeschnitten. Das Eco RI-Fragment, das den Promotor und das Antisense-Gen enthält, wurde in die Eco RI-Schnittstelle des Polylinkers von BIN 19 insertiert, was zur Bildung eines binären Transformations-Vektors führte, der mit PAL 1479 bezeichnet wurde. PAL 1479 wurde verwendet, um Brassica napus wie in Beispiel 2 beschrieben zu transformieren.
  • Beispiel 16 (erläutert keine beanspruchte Ausführungsform der Erfindung)
  • Der Vektor PAL 1479 wurde eingesetzt, um Tabak wie in Beispiel 1 beschrieben zu transformieren.
  • Beispiel 17 (erläutert keine beanspruchte Ausführungsform der Erfindung)
  • Der pollenspezifische Promotor, der in dem Subklon pPAL 0420 enthalten ist, wurde für die Konstruktion eines pollenspezifischen Antisense-RNA-Gens wie folgt eingesetzt: Ein DNA-Fragment, das für Kiefern-Actin (pine actin) codiert, wurde von J. Kenny-Byrne, Petawawa, Kanada, erhalten. Es wurden zwei Klone erhalten, Pac 1-A und Pac 2, wobei der Klon Pac 1-A in: Canadian Journal of Forestry Research (1988) 18: 1592–1602 beschrieben ist, und der zweite Klon Pac 2 (dessen Sequenz eine enge Homologie zu derjenigen von Pac 1-A besitzt und dessen Nucleotid-Sequenz zur Veröffentlichung eingereicht ist). Ein Sph I-Fragment wurde aus Pac 2 isoliert, das die gesamte codierende Sequenz von Kiefern-Actin enthält. Dieses Fragment enthält außerdem eine kleine Menge des 5'- und 3'-nichtcodierenden Bereichs. Dieses Sph I-Fragment wurde in die einzige Sph I-Schnittstelle von pGEM 4Z kloniert. Aus diesem Subklon wurde ein Xba I-Fragment isoliert, das nur codierenden Bereich enthält, und dieses Xba I-Fragment wurde in die einzige Eco RI-Schnittstelle von pGEM 4Z kloniert. Ein Klon wurde ausgewählt, der eine solche Orientierung besaß, dass das 5'-Ende des Gens sich in der Nähe zur Bam HI-Schnittstelle im Polylinker und das 3'-Ende des Gens sich ganz nahe bei der Sal I-Schnittstelle im Polylinker befand. Dieses Plasmid wurde mit pPAL PAC bezeichnet. Die für Actin codierende Region wurde durch Verdauung mit Bam HI und Sal I aus pPAL PAC isoliert. Dieses Bam HI-Sal I-Fragment wurde unter Verwendung der Bam HI- und Sal I-Schnittstellen, die im Polylinker von pPAL 0420 enthalten sind, in pPAL 0420 kloniert. Dies führte zu einem Plasmid, das den pollenspezifischen Promotor aus Klon L 4 und im Anschluss daran ein die für Actin codierende Sequenz in Antisense-Orientierung enthaltendes DNA-Fragment, gefolgt vom nos ter Polyadenylierungs-Signal, enthielt. Dieses Promotor-/Antisense-Gen-Konstrukt wurde durch Verdauung mit Eco RI aus pPAL 0420 ausgeschnitten. Das Eco RI-Fragment, das das Promotor-Antisense-Gen enthält, wurde in die Eco RI-Schnittstelle des Polylinkers von BIN 19 insertiert, was zur Bildung eines binären Transfotmations-Vektors PAL 1498 führte. PAL 1498 wurde eingesetzt, um Brasssica napus wie in Beispiel 2 beschrieben zu transformieren.
  • Beispiel 18 (erläutert keine beanspruchte Ausführungsform der Erfindung)
  • Der Vektor PAL 1498 wurde verwendet, um Tabakpflanzen wie in Beispiel 1 ausgeführt zu transformieren.
  • Beispiel 19 (erläutert keine beanspruchte Ausführungsform der Erfindung)
  • In diesem Beispiel transformieren wir Tabak, der zuvor auf Hygromycin-Resistenz transformiert worden war, mit einem Antisense-Gen, das die Hygromycin-Resistenz spezifisch in den Pollenzellen blockiert, und zwar aufgrund der Tatsache, dass sich das Antisense-Gen unter der Kontrolle eines pollenspezifischen Promotors im Vektor PAL 1106 befindet. Transformierter Tabak, der gegenüber Hygromycin resistent war, wurde unter Verwendung des Vektors PAL 1302 erhalten, der in Beispiel 1 beschrieben ist. Die Selektion von gegenüber Hygromycin resistenten Tabakpflanzenzellen erfolgte über eine Co-Kultur mit PAL 1302 und Selektion durch 50 μg Hygromycin pro ml. Eine Southern-Blot-Analyse zeigte das Vorhandensein von 5 bis 6 Kopien des Hygromycin-Phosphortransferase-Sense-Gens in einer Pflanze an. Diese Pflanze, mit TTR-122 bezeichnet, wurde mit einem Vektor mit dem Namen PAL 1107A retransformiert. PAL 1107A ist der Vektor PAL 1106, an den das 0,8 kB lange Bam HI-Hygromycin-Phosphotransferase-Fragment angefügt ist, das aus PAL 1302 isoliert und in Antisense-Orientierung relativ zu dem pollenspezifischen Promotor in PAL 1106 in diesen Vektor insertiert ist. Der resultierende Vektor wurde mit PAL 1107A bezeichnet. Durch diese Transformation erhaltene Pflanzen waren im Blattgewebe resistent sowohl gegenüber Hygromycin als auch gegenüber Kanamycin, und man konnte anhand von Southern-Blot-Analyse zeigen, dass sie das Antisense-Gen enthielten. Man ließ diese Pflanzen im Gewächshaus heranwachsen und sich selbst befruchten. Klonale Vermehrung dieser Pflanzen wurde als anfängliche Vermehrung einzelner Pflanzen eingesetzt, und diese klonal vermehrten Pflanzen wurden für die Erzeugung einer männlich sterilen Pflanzenlinie verwendet. Beispielsweise wurde eine Pflanze, die eine einzelne Kopie des Antisense-Gens enthielt und aus der Transformation von TTR-122 stammte, in eine Sand-Erde-Mischung gepflanzt und im Gewächshaus herangezogen. Diese Pflanze wird als TTR-203 bezeichnet. Die Messung der Hygromycin-Phosphotransferase-Aktivität in dieser Pflanze zeigte eine hohe Aktivität in den Blättern, den Blütenblättern, der Narbe und den Pistill- (Stempel-) und Staubgefäß-Wänden, aber nur sehr geringe Mengen in Pollen. TTR-122 zeigte ein hohes Niveau an Hygromycin-Phosphotransferase-Aktivität in den Blättern, den Blütenblättern, der Narbe und den Pistill- (Stempel-) und Staubgefäß-Wänden und in Pollen. Dies zeigte, dass das Antisense-Gen bezüglich der Blockierung der Expression des Sense-Gens nur in den Pollen wirksam war. Die Northern-Blot-Analyse bestätigte das Vorhandensein des Antisense-Transkripts spezifisch in den Pollen von TTR-203 und zeigte darüber hinaus (nur) geringe Mengen des Sense-Gen-mRNA. Wenn zum ersten Mal Blütenknospen erschienen, wurde TTR-203 dreimal wöchentlich mit einer Hygromycin-Lösung (250 μg pro ml) gegossen, wobei die Sand-Erde-Mischung vollständig gesättigt wurde. Diese Bewässerung wurde etwa vier Wochen lang oder für den Zeitraum fortgesetzt, in dem der größte Teil der Blüten erschien. Blüten, die während dieser Zeit auf Pflanzen mit dem Antisense-Gen hervorgebracht wurden, waren männlich steril. Die Staubgefäß- und Pollenbildung war gestört, und es entwickelten sich keine reifen Pollen. Die weibliche Befruchtungsfähigkeit wurde durch diese Behandlung nicht beeinträchtigt, denn eine von Hand erfolgende Bestäubung konnte für die Bestäubung des weiblichen Teils der männlich sterilen Blüten benutzt werden. Pollen, der von einer hygromycinresistenten Pflanzen stammte, wurde für die Erzeugung von hybridem Saatgut eingesetzt. Das Bewässern der Pflanzen mit Hygromycin wurde beendet, und eine normale Bewässerung wurde aufgenommen. Blüten, die sich auf den Pflanzen bildeten, nachdem die Bewässerung mit Hygromycin beendet worden war, waren männlich fertil und führten zu selbstbestäubtem Saatgut.
  • Beispiel 20 (erläutert keine beanspruchte Ausführungsform der Erfindung)
  • Der pollenspezifische Vektor PAL 1107 wurde für die Erzeugung männlich-steriler Pflanzen eingesetzt. Die oben beschriebene Pflanze TTR-122 wurde mit einem Vektor retransformiert, der PAL 1107HYGAS genannt wird. Die Transformation erfolgte wie in Beispiel 2 beschrieben. PAL 1107HYGAS ist der Vektor PAL 1107, an den das 0,8 kB lange Bam HI-Hygromycin-Phosphotransferase-Fragment angefügt ist, das aus PAL 1302 isoliert und in Antisense-Orientierung relativ zu dem pollenspezifischen Promotor in PAL 1107 in PAL 1107 insertiert wurde. Durch diese Transformation erhaltene Pflanzen waren im Blattgewebe resistent sowohl gegenüber Hygromycin als auch gegenüber Kanamycin, und es wurde anhand von Southern-Blot-Analyse gezeigt, dass sie das Antisense-Gen enthielten. Diese Pflanzen wurden im Gewächshaus herangezogen und bestäubten sich selbst. Klonale Vermehrung dieser Pflanzen wurde für eine anfängliche Vermehrung einzelner Pflanzen eingesetzt, und diese klonal vermehrten Pflanzen wurden für die Erzeugung männlich steriler Pflanzenlinien wie in Beispiel 19 benutzt.
  • Beispiel 21 (erläutert keine beanspruchte Ausführungsform der Erfindung)
  • Für die Erzeugung männlich steriler Pflanzen wurde der Vektor 1419 benutzt, um Tabak wie in Beispiel 1 erläutert zu transformieren. Der Vektor PAL 1419 enthält den pollenspezifischen Promotor aus Klon L 4, der die Expression des NPT II-Gens steuert, das sich in Antisense-Orientierung relativ zum pollenspezifischen Promotor befindet. Dieser Vektor enthält auch eine konstitutive Version des NPT II-Gens in Sense-Orientierung, dessen Expression sich unter der Kontrolle des nos-Promotors befindet. Der Vektor kann deshalb allen Pflanzenzellen mit Ausnahme der Pollenzellen Resistenz gegenüber Kanamycin verleihen, wobei die Expression des Sense-Gens in diesen Zellen durch die Expression des Antisense-Gens, das spezifisch in den Pollen exprimiert wird, inhibiert wird. Nach der Transformation des Vektors PAL 1419 wurden Tabakpflanzen gewonnen. Diese Pflanzen wurden eingewurzelt und zum Blühen gebracht. Während der Blühperiode wurden die Pflanzen mit Kanamycin gegossen.
  • Beispiel 22 (erläutert keine beanspruchte Ausführungsform der Erfindung)
  • Der Vektor PAL 1419 wurde eingesetzt, um Brassica napus wie in Beispiel 2 erläutert zu transformieren.
  • Beispiel 23 (erläutert keine beanspruchte Ausführungsform der Erfindung)
  • Der Vektor PAL 1419 wurde für die Transformation von Petunienblattscheiben verwendet.
  • Beispiel 24 (erläutert keine beanspruchte Ausführungsform der Erfindung)
  • In diesem Beispiel wurde die vollständige Ricin A-Kette (pPAL Riccom), die in 14 beschrieben ist, als Bam HI-Fragment in den Vektor PAL 1420 insertiert. Es wurden Vektoren gewonnen, die das Ricin-Gen sowohl in Sense- als auch in Antisense-Orientierung enthielten. Ein Vektor, der die Ricin A-Kette in Sense-Orientierung enthielt, wurde gewonnen und PAL 1420RIC genannt. Ein Vektor, der das Gen in Antisense-Orientierung enthielt, wurde PAL 1420RICAS genannt. PAL 1420RIC und PAL 1420RICAS wurden eingesetzt, um Brassica napus wie in Beispiel 2 beschrieben zu transformieren, was zu Pflanzen führte, die entweder die Sense- oder die Antisense- Kopie des Ricin A-Ketten-Gens unter der Kontrolle des pollenspezifischen Promotors in PAL 1420 trugen.
  • Beispiel 25 (erläutert keine beanspruchte Ausführungsform der Erfindung)
  • In diesem Beispiel wird die verkürzte Version der in 14 beschriebenen Ricin A-Kette (pPAL Rictr) als Bam HI-Fragment in den Vektor PAL 1420 insertiert. Es wurden Vektoren gewonnen, die das verkürzte Gen sowohl in Sense- als auch in Antisense-Richtung enthielten. Ein Vektor, der die Ricin A-Kette in Sense-Orientierung enthielt, wurde gewonnen und mit PAL 1420tRIC bezeichnet. Ein Vektor, der das Gen in Antisense-Orientierung enthielt, wurde als PAL 1420tRICAS bezeichnet. PAL 1420tRIC und PAL 1420tRICAS wurden gemäß Beispiel 2 für die Transformation von Brassica napus eingesetzt, was zu Pflanzen führte, die entweder die Sense- oder die Antisense-Kopie des Gens für die verkürzte Ricin A-Kette unter der Kontrolle des pollenspezifischen Promotors in PAL 1420 enthielten.
  • Beispiel 26 (erläutert keine beanspruchte Ausführungsform der Erfindung)
  • PAL 1420RIC und PAL 1420RICAS wurden wie in Beispiel 1 für die Transformation von Tabakpflanzen eingesetzt, was zu Pflanzen führte, die entweder die Sense- oder die Antisense-Kopie des Gens für die Ricin A-Kette unter der Kontrolle des pollenspezifischen Promotors in PAL 1420 trugen.
  • Beispiel 27 (erläutert keine beanspruchte Ausführungsform der Erfindung)
  • Die Vektoren PAL 1420tRIC und PAL 1420tRICAS wurden wie in Beispiel 1 für die Transformation von Tabakpflanzen eingesetzt, was zu Pflanzen führte, die entweder die Sense- oder die Antisense-Kopie des verkürzten Gens für die Ricin A-Kette unter der Kontrolle des pollenspezifischen Promotors in PAL 1420 trugen.
  • Beispiel 28 (erläutert keine beanspruchte Ausführungsform der Erfindung)
  • Für dieses Beispiel wurde der Vektor PAL 1423 benutzt, um das im Subklon pPAL pLys enthaltene Polylysin-Gen zu exprimieren. Der codierende Bereich von pPAL pLys wurde durch Verdauung mit Bam HI isoliert und in Sense-Orientierung in mit Bam HI geschnittenes PAL 1423 kloniert, was zu PAL 1487 führte. PAL 1487 wurde eingesetzt, um Tabak wie in Beispiel 1 zu transformieren.
  • Beispiel 29 (erläutert keine beanspruchte Ausführungsform der Erfindung)
  • Für dieses Beispiel wurde der Vektor 1920 benutzt, um das im Subklon pPAL pLys enthaltene Polylysin-Gen zu exprimieren. Der codierende Bereich von pPAL pLys wurde durch Verdauung mit Bam HI isoliert und in Sense-Orientierung in mit Bam HI geschnittenes PAL 1920 kloniert, was zu PAL 1987 führte. PAL 1987 wurde eingesetzt, um Tabak wie in Beispiel 1 zu transformieren.
  • Beispiel 30 (erläutert keine beanspruchte Ausführungsform der Erfindung)
  • In diesem Beispiel nutzen wir einen pollenspezifischen Promotor, um ein Proteinmolekül zu synthetisieren, das gegenüber der Zellfunktion und -entwicklung zerstörerisch wirkt, nämlich die Protease Trypsin. Die cDNA-Sequenz, die für Trypsin codiert, wurde von Stevenson et. al., Nucl. Acids Res., 1986, 14: 8307–8330 beschrieben. Der cDNA-Klon pMPt9 wurde erhalten und für die Erzeugung eines modifizierten Trypsin-Moleküls benutzt, in dem die N-terminalen Aminosäurereste entfernt waren, so dass ein Protein entstand, das ausschließlich aus der aktiven Protease-Form von Trypsin bestand und sich von der reifen Form dadurch unterschied, dass sich ein Methionin-Rest an der N-terminalen Position des reifen Proteins befand, der das Isoleucin ersetzt, das an dieser Position im aktiven reifen Protein gefunden wird. Dies erfolgte dadurch, dass das Plasmid pMPt9 mit Fok I und Pst I verdaut und ein Fragment gewonnen wurde, das die Nucleotide 81 bis 835 umspannt, wobei die Nucleotide nach 835 den G:C-Schwanz bilden, der für das Klonieren der cDNA genutzt wird, und dass dieses Fragment mit Klenow behandelt und in glattendiges, mit Sma I geschnittenes M13mp19RF kloniert und ein einzelsträngiger Phagenklon isoliert wurde, der für eine punktspezifische Mutagenese genutzt wurde, um das Isoleucin-Codon der Nucleotide 84 bis 86 gemäß der veröffentlichten Sequenz von ATT in ATG umzuwandeln, das an diejenige Stelle ein Initiations-Codon einführt, wo sich zuvor das Isoleucin-Codon befand. Das gewonnene, mutierte Gen wurde mit Sal I und Sst I ausgeschnitten und in PAL 1421 insertiert, und das Produkt wurde mit PAL 1456 bezeichnet. Der Vektor PAL 1456 wurde genutzt, um Tabak wie in Beispiel 1 zu transformieren. Es ist anzumerken, dass ein Wiederherstellungs-Gen hergestellt werden kann, wenn ein Trypsin-Inhibitor in analoger Weise unter Verwendung eines aus Klon L 4 stammenden Promotors insertiert wird und die Transformation in eine männliche Elternlinie erfolgt. Die Expression des Trypsin- Inhibitors in der Hybride wird dann spezifisch die Aktivität des Trypsin-Enzyms blockieren. Man kann eine Anzahl von cDNA- und genomischen DNA-Sequenzen für Sojabohnen- und andere Trypsin-Inhibitoren auffinden, siehe beispielsweise: Jofuku, K. D. und Goldberg, R. B., The Plant Cell, 1989, 1: 1079–1093.
  • Beispiel 31 (erläutert eine beanspruchte Ausführungsform der Erfindung)
  • In diesem Beispiel nutzen wir einen pollenspezifischen Promotor, um das Enzym IamH spezifisch in Pollenzellen zu synthetisieren. Das Enzym besitzt eine Aktivität, die die Erzeugung von NAA aus NAM bewirken kann, wobei die Substanz NAA als Pflanzenhormon fungiert, das gegenüber sich entwickelnden Pollenkörnern im Wesentlichen toxisch ist, während der Vorläufer NAM relativ nicht-toxisch ist. Für dieses Beispiel wurde das IamH-Gen in den Vektor PAL 1423 insertiert. Das IamH-Gen wurde aus pPCV311 wie in 12 beschrieben isoliert und als Bam HI-Sst I-Fragment in die Bam HI-Sst I-Schnittstellen von PAL 1423 kloniert, was PAL 1424 ergab. Dieser Vektor besitzt das IamH-Gen (T-DNA-Gen 2) unter der Kontrolle eines pollenspezifischen Promotors aus dem Klon L 4. PAL 1424 wurde eingesetzt, um Tabak wie in Beispiel 1 erläutert zu transformieren.
  • Beispiel 32 (erläutert eine beanspruchte Ausführungsform der Erfindung)
  • Der Vektor PAL 1424 wurde eingesetzt, um Brassica napus wie in Beispiel 2 erläutert zu transformieren.
  • Beispiel 33 (erläutert eine beanspruchte Ausführungsform der Erfindung)
  • In diesem Beispiel wurde der Vektor PAL 1107 für die Erzeugung des gewebespezifischen GUS (β-Glucuronidase) Enzyms benutzt. Das Gen für dieses Enzym kann von Clonetech Laboratories, Palo Alto, CA, USA bezogen werden. Das Gen wurde als Bam HI-Sst I-Fragment in PAL 1107 insertiert und genutzt, um Tabak wie in Beispiel 1 zu transformieren. Hergestellte Pflanzen besaßen eine detektierbare GUS-Aktivität nur in sich entwickelnden Pollenzellen, aber in keinem anderen untersuchten Gewebe. Es ist anzumerken, dass man ein nicht-toxisches Analogon von Glucuronsäure, das mit einem toxischen Molekül wie Glyphosat konjugiert ist, auf die Pflanzen aufbringen könnte, und eine Abspaltung der toxischen Einheit von der Glucuronsäure würde nur in Pollenzellen auftreten. Dies liefert ein Beispiel für ein Enzym, das für die Erzeugung, und zwar in gewebespezifischer Weise, einer toxischen Substanz aus einem nicht-toxischen Analogon eingesetzt werden könnte.

Claims (29)

  1. Rekombinantes DNA-Molekül zur Verwendung bei der Herstellung einer Pflanze, die ein Merkmal für männliche Sterilität trägt, und von reproduktivem Material dieser Pflanze, umfassend eine DNA-Sequenz unter der Steuerung eines auf einen Pollen ausgerichteten Promotors, die für ein Genprodukt codiert, das dann, wenn es in einer Zelle/einem Gewebe einer Pollen produzierenden Pflanze erzeugt wird, in der Lage ist, eine nicht-toxische Substanz cytotoxisch gegenüber dieser Zelle/diesem Gewebe zu machen, wobei die genannte cytotoxische Substanz selektiv die Funktion und/oder die Entwicklung einer Zelle/eines Gewebes, die/das für die Pollenbildung und/oder -funktion wesentlich ist, in einer Pflanze, die aus einer Pflanzenzelle regeneriert wurde, in deren Genom das genannte rekombinante DNA-Molekül integriert ist, stört, wenn die genannte Pflanze der nicht-toxischen Substanz ausgesetzt wird, derart, dass die Pflanze männlich steril gemacht wird, unter der Voraussetzung, dass die genannte DNA-Sequenz kein Gen ist, das für Glucuronidase codiert.
  2. Rekombinantes DNA-Molekül wie in Anspruch 1 beansprucht, worin die genannte Pflanze eine Pflanze der Familie Solanaceae oder Cruciferae, vorzugsweise eine Pflanze der Gattung Brassica, stärker bevorzugt eine Pflanze der Art Brassica napus oder Brassica campestris ist.
  3. Rekombinantes DNA-Molekül wie in Anspruch 1 beansprucht, worin die DNA-Sequenz für Methoxinin-Dehydrogenase codiert und die nicht-toxische Substanz 2 Amino-4-methoxy-buttersäure ist.
  4. Rekombinantes DNA-Molekül wie in Anspruch 1 beansprucht, worin die DNA-Sequenz für Rhizobitoxin-Synthase codiert und die nicht-toxische Substanz 2 Amino-4-methoxy-buttersäure ist.
  5. Rekombinantes DNA-Molekül wie in Anspruch 1 beansprucht, worin die DNA-Sequenz für Indolacetamid-Hydrolase codiert und die nicht-toxische Substanz durch Indolacetamid-Hydrolase in IAA überführt wird.
  6. Rekombinantes DNA-Molekül wie in Anspruch 1 beansprucht, worin der Promotor ein pollenspezifischer Promotor ist, der in der Lage ist, die Expression einer oder mehrerer der DNA-Sequenzen selektiv in sich entwickelnden Mikrosporen-Zellen zu steuern.
  7. Rekombinantes DNA-Molekül wie in Anspruch 1 beansprucht, worin die Zellen/Gewebe einer Pflanze, die für die Pollenbildung und/oder -funktion wesentlich sind, Mikrosporen, Tapetum- und Staubbeutelwandzellen sind.
  8. Rekombinantes DNA-Molekül wie in Anspruch 1 beansprucht, worin der Promotor ist oder umfasst: eine Promotorsequenz eines oder mehrerer pollenspezifischer Gene aus Brassica napus, eines oder mehrerer der Promotorregionen der auf Pollen ausgerichteten Gene in den Klonen L4, L10, L16 oder L19, ausgewählt aus der Gruppe, die aus der Promotor-Region des Gens Bp4A des Klons L4 mit den in 3a gezeigten Nucleotiden 1–307, der Promotorregion des Gens Bp4C des Klons L4 mit den in 3a gezeigten Nucleotiden 4565–6268, der Promotorregion des Klons L10 mit den in 3b gezeigten Nucleotiden –789–64, der Promotorregion des Klons L19 mit dem in 3d gezeigten Nucleotiden 1–1201 und von Teilen davon, die als pollenspezifische Promotoren wirken, besteht, sowie ein DNA-Molekül, das mit dem genannten rekombinanten DNA-Molekül hybridisiert und als auf einen Pollen ausgerichteter Promotor wirkt.
  9. Rekombinantes DNA-Molekül wie in Anspruch 1 beansprucht, weiter umfassend ein oder mehrere Selektionsmarker-Gene, welche die Selektion einer mit dem rekombinanten DNA-Molekül transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze ermöglichen.
  10. Pflanzenzelle, die mit einem rekombinanten DNA-Molekül wie in Anspruch 1 beansprucht transformiert wurde.
  11. Plasmidvektor, der in der Lage ist, eine Pflanzenzelle zu transformieren, und der ein rekombinantes DNA-Molekül wie in Anspruch 1 beansprucht umfasst.
  12. Pflanzenzellkultur, enthaltend eine Pflanzenzelle, die mit einem rekombinanten DNA-Molekül wie in Anspruch 1 beansprucht transformiert wurde.
  13. Pflanze, die ein Merkmal für männliche Sterilität trägt, wobei in das Genom dieser Pflanze ein rekombinantes DNA-Molekül wie in Anspruch 1 beansprucht integriert ist.
  14. Pflanze, die ein Merkmal für männliche Sterilität trägt, regeneriert aus einer Zelle einer Pflanze, die mit einem rekombinanten DNA-Molekül wie in Anspruch 1 beansprucht transformiert wurde.
  15. Samen oder Saatgut einer Pflanze, der/das in der Lage ist, zu einer Pflanze heranzuwachsen, die ein Merkmal für männliche Sterilität trägt, wobei in das Genom dieses Samens/Saatguts ein rekombinantes DNA-Molekül wie in Anspruch 1 beansprucht integriert ist.
  16. Verfahren zum Erzeugen einer Pflanze, die ein Merkmal für männliche Sterilität trägt, umfassend die Schritte: (i) Einführen eines oder mehrerer rekombinanter DNA-Moleküle wie in Anspruch 1 beansprucht in das Genom einer oder mehrerer Pflanzenzellen einer Pollen produzierenden Pflanze; (ii) Selektieren einer Pflanzenzelle, in die das rekombinante DNA-Molekül stabil integriert ist; und (iii) Regenerieren einer Pflanze, die das Merkmal für männliche Sterilität trägt, aus der ausgewählten Pflanzenzelle.
  17. Verfahren zum Erzeugen von Hybrid-Samen oder -Saatgut, umfassend die Schritte: (i) Einführen eines oder mehrerer rekombinanter DNA-Moleküle wie in Anspruch 1 beansprucht in das Genom einer oder mehrerer Pflanzenzellen einer Pollen produzierenden Pflanze; (ii) Selektieren einer Pflanzenzelle, in die das rekombinante DNA-Molekül stabil integriert ist; (iii) Regenerieren einer Pflanze, die das Merkmal für männliche Sterilität trägt, aus der ausgewählten Pflanzenzelle; (iv) Erhöhen der Anzahl von Pflanzen, die das Merkmal für männliche Sterilität tragen; (v) Exponieren der genannten Pflanzen, die das Merkmal männlicher Sterilität tragen, gegenüber der nicht-toxischen Substanz, die diese Pflanzen männlich steril macht; (vi) Kreuzen einer so erhaltenen männlich sterilen Pflanze mit einer männlich fertilen Pflanze und Gewinnen von Hybrid-Samen bzw. -Saatgut.
  18. Verfahren zum Erzeugen von Hybridsamen bzw. -Saatgut mit wiederhergestellter männlicher Fertilität, wobei das Verfahren umfasst: (a) (i) Einsetzen eines Gens, das dieser Pflanze Widerstandsfähigkeit gegenüber einem chemischen Mittel oder einer natürlich auftretenden oder künstlich induzierten physiologischen Belastung verleiht, und eines mit diesem Gen verknüpften rekombinanten DNA-Moleküls gemäß Anspruch 1 in das Genom einer Pflanzenzelle einer Pollen produzierenden Pflanze, die in der Lage ist, zu einer differenzierten ganzen Pflanze zu regenerieren; (ii) Gewinnen einer transformierten Pflanzenzelle dieser Pflanze; und (iii) Regenerieren einer Pflanze, die mit den in (a) (i) oben beschriebenen DNA-Sequenzen genetisch transformiert ist und das Merkmal der männlichen Sterilität trägt, aus dieser Pflanzenzelle; und (b) Erzeugen einer Linie männlich steriler Pflanzen aus der in Schritt (a) regenerierten Pflanze; (c) Bewirken einer Hybrid-Kreuzung zwischen diesen männlich sterilen Pflanzen und männlich fertilen Pflanzen.
  19. Hybridsamen oder- Saatgut einer Pollen produzierenden Pflanze mit einem nuklearen Genom, in das ein rekombinantes DNA-Molekül wie in Anspruch 1 beansprucht und mindestens ein Wiederherstellungs-DNA-Molekül inkorporiert ist, das für ein Wiederherstellungs-Genprodukt codiert, wobei das Wiederherstellungs-Genprodukt in der Lage ist, die Expression oder Aktivität des Genprodukts, das durch das genannte rekombinante DNA-Molekül codiert wird, zu verhindern oder zu unterbrechen, derart, dass der Hybridsamen bzw. das Hybrid-Saatgut in der Lage ist, zu einer Pflanze heranzuwachsen, die männlich fertil ist.
  20. Verwendung eines rekombinanten DNA-Moleküls, umfassend eine DNA-Sequenz unter der Steuerung eines auf einen Pollen ausgerichteten Promotors, die für ein Genprodukt codiert, das dann, wenn es in einer Zelle/einem Gewebe einer Pollen produzierenden Pflanze erzeugt wird, in der Lage ist, eine nicht-toxische Substanz cytotoxisch gegenüber dieser Zelle/diesem Gewebe zu machen, wobei die genannte cytotoxische Substanz selektiv die Funktion und/oder die Entwicklung einer Zelle/eines Gewebes, die/das für die Pollenbildung und/oder -funktion wesentlich ist, in einer Pflanze, die aus einer Pflanzenzelle regeneriert wurde, in deren Genom das genannte rekombinante DNA-Molekül integriert ist, stört, wenn die genannte Pflanze der nicht-toxischen Substanz ausgesetzt wird, derart, dass die Pflanze männlich steril gemacht wird, für die Implementierung eines Merkmals für männliche Sterilität in eine Pflanze.
  21. Verwendung eines rekombinanten DNA-Moleküls wie in Anspruch 20 beansprucht, worin die genannte Pflanze eine Pflanze der Familie Solanaceae oder Cruciferae, vorzugsweise eine Pflanze der Gattung Brassica, stärker bevorzugt eine Pflanze der Art Brassica napus oder Brassica campestris ist.
  22. Verwendung eines rekombinanten DNA-Moleküls wie in Anspruch 20 beansprucht, worin die DNA-Sequenz für Methoxinin-Dehydrogenase codiert und die nicht-toxische Substanz 2-Amino-4-methoxy-buttersäure ist.
  23. Verwendung eines rekombinanten DNA-Moleküls wie in Anspruch 20 beansprucht, worin die DNA-Sequenz für Rhizobitoxin-Synthase codiert und die nicht-toxische Substanz 2-Amino-4-methoxy-buttersäure ist.
  24. Verwendung eines rekombinanten DNA-Moleküls wie in Anspruch 20 beansprucht, worin die DNA-Sequenz für β-Glucuronidase codiert und die nicht-toxische Substanz ein nicht-toxisches Analogon von Glucuronsäure ist.
  25. Verwendung eines rekombinanten DNA-Moleküls wie in Anspruch 20 beansprucht, worin die DNA-Sequenz für Indolacetamid-Hydrolase codiert und die nicht-toxische Substanz durch Indolacetamid-Hydrolase in IAA überführt wird.
  26. Verwendung eines rekombinanten DNA-Moleküls wie in Anspruch 20 beansprucht, worin der Promotor ein pollenspezifischer Promotor ist, der in der Lage ist, die Expression einer oder mehrerer der DNA-Sequenzen selektiv in sich entwickelnden Mikrosporen-Zellen zu steuern.
  27. Verwendung eines rekombinanten DNA-Moleküls wie in Anspruch 20 beansprucht, worin die Zellen/das Gewebe einer Pflanze, die für die Pollenbildung und/oder -funktion entscheidend sind, Mikrosporen, Tapetum- und Staubbeutelwandzellen sind.
  28. Verwendung eines rekombinanten DNA-Moleküls wie in Anspruch 20 beansprucht, worin der Promotor ist oder umfasst: eine Promotorsequenz eines oder mehrerer pollenspezifischer Gene aus Brassica napus, eines oder mehrerer der Promotorregionen der auf Pollen ausgerichteten Gene in den Klonen L4, L10, L16 oder L19, ausgewählt aus der Gruppe, die aus der Promotor-Region des Gens Bp4A des Klons L4 mit den Nucleotiden 1–307, der Promotorregion des Gens Bp4C. des Klons L4 mit den Nucleotiden 4565–6268, der Promotorregion des Klons L10 mit den Nucleotiden –789–64, der Promotorregion des Klons L19 mit den Nucleotiden 1–1201 und von Teilen davon, die als pollenspezifische Promotoren wirken, besteht, oder allele, homologe oder andere Varianten davon, die damit einen Homoduplex bilden und als auf einen Pollen ausgerichteter Promotor wirken.
  29. Verwendung eines rekombinanten DNA-Moleküls wie in Anspruch 20 beansprucht, weiter umfassend ein oder mehrere Selektionsmarker-Gene, welche die Selektion einer mit dem rekombinanten DNA-Molekül transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze ermöglichen.
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