JP7033533B2 - 低コピー数のｒｉ遺伝子を含む植物 - Google Patents

Description

本願発明は、特に中間高さを有する、Ｒｉプラスミドを含むＡ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓでの感染によってアグロバクテリウムリゾゲネスのＲｉプラスミドに由来する１つ以上の遺伝子で形質転換された植物またはかかる植物の子孫およびその製造方法に関する。

コンパクトな植物構造が観賞植物の分野においてますます望まれている。鉢植え植物の産業は、環境、空間および輸送目的のためにさらにコンパクトな植物構造を好む。伸長成長挙動を示す鉢植え植物は、育種家、植物生産者および消費者の興味を失いつつある。

現在、該産業は、植物サイズを制限するために成長抑制剤で植物を処理する。さらに、形質転換された植物の長さが形質転換されていない野生型植物の高さの２０％未満である、コンパクトな植物構造を有するアグロバクテリウムリゾゲネスで形質転換された植物。かかる形質転換体は、矮性およびコンパクトな植物成長を含む多くの表現型を示す。該コンパクトな成長は、しわの寄った葉、花の形、花数の低下、開花の遅延のような望ましくない表現型と一致した。観賞植物について、アグロバクテリウムリゾゲネスのトランスフェクションの不利な点はコンパクトな成長の想定される利点よりも大きいようであった。コンパクトな成長は、しばしば、商業的価値を有するには小さすぎる植物をもたらす。植物の高さの影響を受けにくい形質転換体が時折観察されるが、かかる形質転換体は他の望ましくない表現型に苦しむ。

実際に、Christensen et al. (Plant Cell Rep (2008) 27, 1485-1495)は、Ｒｉプラスミドを含むＡ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓでの感染によってＡ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓのｒｏｌ遺伝子でのＫａｌａｎｃｈｏｅ ｂｌｏｓｓｆｅｌｄｉａｎａの形質転換を記載している。長さおよびコンパクトさにおいて様々な異なるＲｉ系統が得られた。しかしながら、全ての植物は、しわの寄った葉、より小さい花サイズ、乾燥重量の減少、少なくとも５０％の花数の深刻な低下および開花時間遅延に苦しんだ。サザンブロット分析によって、Ｒｉ－系統のいくつかはＲｉプラスミドの１（３０６および３１９系統）または２コピー（３３１系統）を有するように表されたが、他の系統（３１２および３２４）はサザンブロットにおいて複数のバンドを示した。しかしながら、これらのデータは信頼できず、間違っているようである。Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎの推定が間違っているという最初の兆候は、ＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎのＲｉ－系統が、カランコエ(Kalanchoe)ゲノムにおいて複数のＲｉコピーの取り込みをもたらす、Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓでのＫａｌａｎｃｈｏｅ ｂｌｏｓｓｆｅｌｄｉａｎａのストレートな(straight)形質転換の結果であったという事実にある。数は、７から１１またはそれ以上で変化するが、決して少なくない。さらに、ＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎのＲｉ－系統は、花序、花数および乾燥重量喪失において劇的な減少に苦しむ。本願明細書において使用されるｑＰＣＲである、コピー数を決定するための有意により信頼できる方法は、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎの系統３３１のコピー数は７であったことを実際に示した。さらに、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎによって観察された表現型は、疑われるコピー数と一致しないようである。例えば、葉のしわは系統３０６および３３１においてあまり顕著ではないようであるが、ｒｏｌ遺伝子のコピー数は系統３０６と比較して系統３３１において２倍であると言われているが、系統３０６と同じコピー数を有すると言われる系統３１９は系統３３１および３０６の両方よりもより顕著であるしわの寄った葉を有する。また、開花の遅延は、ｒｏｌ遺伝子の少ないコピーを含むと言われる対応物と比較して、系統３３１においてあまり顕著ではない。

天然土壌細菌Ａ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ アグロピン型系統のＲｉ－プラスミドは、植物細胞への移動のためにＲｉ－プラスミド上に２つのＴ－ＤＮＡ領域（Ｔ_Ｌ－ＤＮＡおよびＴ_Ｒ－ＤＮＡ、それぞれ配列番号１および２）を有する。植物細胞の感染の後に、細菌は全Ｔ－ＤＮＡ領域（Ｔ_Ｌ－ＤＮＡおよびＴ_Ｒ－ＤＮＡの両方）を移動させ、それにより植物ゲノムにｒｏｌ（根遺伝子）およびａｕｘ遺伝子を移動させ、感染部位で毛状根成長を引き起こす（Tepfer (1984) Cell, 37, pp. 959-967）。Ａ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓは植物に自然に感染するため、ｒｏｌ遺伝子は、植物に自然に導入され、植物癌遺伝子として機能し、植物組織において毛状根を発達させる。

Ｔ_Ｌ－ＤＮＡは、４つのｒｏｌ遺伝子ｒｏｌＡ、ｒｏｌＢ、ｒｏｌＣおよびｒｏｌＤ（それぞれ配列番号３－６）を含み、Ｔ_Ｒ－ＤＮＡは、２つのａｕｘｉｎ遺伝子ａｕｘ１およびａｕｘ２（それぞれ配列番号７および８）を含む数個の遺伝子を含む。Ｔ_Ｌ－ＤＮＡは、さらなる１８のオープンリーディングフレームを含む（Veena and Taylor (2007), In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant, 43, 383-403）。

用語
本願明細書において使用されるすべての技術用語は、生化学、分子生物学および農学において一般的に使用される用語であり、当業者によって理解することができる。技術用語は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook and Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001; Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing Associates and Wiley-lnterscience, New York, 1988 (定期的な更新を伴う); Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 5th ed., vol. 1-2, ed. Ausubel et al., John Wiley & Sons, Inc., 2002; Genome Analysis: A Laboratory Manual, vol. 1-2, ed. Green et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1997において見ることができる。植物生物学技術に関連する方法論が本願明細書に記載されており、Methods in Plant Molecular Biology: A Laboratory Course Manual, ed. Maliga et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1995のような学術論文において詳細に記載されている。ＰＣＲを使用する種々の技術が、Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, 1990 and in Dieffenbach and Dveksler, PCR Primer: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2003に記載されている。ＰＣＲ－プライマー対は、例えば目的のために意図されるコンピュータープログラム、Primer, Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MAを使用する、既知の技術によって既知の配列から得ることができる。核酸の化学合成のための方法は、例えば、Beaucage and Caruthers, 1981, Tetra. Letts. 22: 1859-1862およびMatteucci and Caruthers, 1981 J. Am. Chem. Soc. 103: 3185において議論されている。制限酵素消化、リン酸化、ライゲーションおよび形質転換は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されているように行われた。細菌細胞の成長および維持のために使用される全ての試薬および材料は、特記されない限り、Aldrich Chemicals (Milwaukee, Wl), DIFCO Laboratories (Detroit, Ml), Invitrogen (Gaithersburg, MD)またはSigma Chemical Company (St. Louis, MO)から得られた。

「形質転換」は、本願明細書において、アグロバクテリウムリゾゲネスのＲｉプラスミドに由来する１つ以上の遺伝子を宿主植物細胞に導入するためのあらゆる方法論を示す。特に、該１つ以上の遺伝子は１つ以上のｒｏｌ遺伝子を含む。重要なことには、Ａ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓが植物に自然に感染するため、形質転換は、植物細胞への野生型細菌由来のＲｉプラスミドからの野生型遺伝子、特にｒｏｌ遺伝子、の自然の移動を含む。したがって、本願明細書において使用されるように、形質転換は、宿主植物細胞への移動のためのベクターへの異種遺伝子のクローニングを意味せず必要もしない。さらに、アグロバクテリウムリゾゲネスのＲｉプラスミドに由来する１つ以上の遺伝子、例えば１つ以上のｒｏｌ遺伝子を発現する宿主植物細胞は、「形質転換された」として特徴付けられ得る。形質転換は、例えば自然感染、フローラルディップ法、浸潤法、またはパーティクルガン法を含む何らかの既知の方法によって起こり得る。細胞の形質転換は、限定はしないがノーザンブロット、サザンブロット、ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ（ｓｙｎ． ｑ－ＰＣＲ、ｑＲＴ－ＰＣＲ）および／またはゲノムシーケンシングを含む何らかの既知の方法によって検出され得る。Agrobacterium tumefaciensのＲｉプラスミド由来の１つ以上の遺伝子を該プラスミドから取ること、およびそれを想定される植物を形質転換するためにAgrobacterium tumefaciens系の文脈外で使用することもできる。当業者は、このような方法に気付くであろう。

「組織培養」なる用語は、しばしば植物のクローンを産生するために、滅菌条件下で増殖される植物組織を示す。植物組織培養は、多くの植物細胞が植物全体を再生する能力を有するという事実に依存する。単一細胞、細胞壁を有さない植物細胞（プロトプラスト）、葉片、または根は、しばしば、必要な栄養素および植物ホルモンを与えられた培養培地上で新規植物を生み出すために使用することができる。

本願明細書において使用される「種間ハイブリッド」は、同じ属およびその品種の植物の２つの異なる種の交配からの子孫、ならびに同種または和合性種から両親の１つまたは同胞種または品種への後の戻し交配から生じる子孫を含む。両親の１つへのこの戻し交配は、コンパクトさ形質と所望の特性とを安定に混合することを目的として１回以上行われ得る。「種間ハイブリッド」は、その背景において種間交配でのあらゆる植物を包含する。すなわち、種間ハイブリッドは、２つの植物種間の交配の第１のおよび後の世代、ならびに種間ハイブリッドの自家交配または同じまたは異なる種の植物との種間ハイブリッドの交配のいずれかから生産される子孫を含む。

Ａ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓは、アグロバクテリウムリゾゲネスおよびアグロピン株由来のそのＲｉ－プラスミドを示す。Ｔ－ＤＮＡはＴ_ＬおよびＴ_Ｒの２つのセグメントを含み、これらは１５Ｋｂ配列によって分離されており統合されていない。Ｔ_Ｌ－ＤＮＡは、４つの根座位遺伝子が存在する１８オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。Ｔ_Ｒ－ＤＮＡは、ａｕｘ１およびａｕｘ２を含むいくつかの遺伝子を含む。

「毛状根表現型」は、推定形質転換植物を示す植物表現型を示す。すなわち、Ａ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓが植物細胞に感染して１つ以上のｒｏｌ遺伝子を移動するとき、毛状根成長が感染部位で起こる。このようにして、毛状根表現型は、推定形質転換体を同定するためのマーカーフリー方法を提供する。

「中間高さ」は、同じ種の野生型またはコントロール植物の高さと比較して植物の高さの量的低下を示すが、アグロバクテリウムリゾゲネスのＲｉプラスミドの１つ以上の遺伝子で形質転換された該種の植物の高さと比較して植物の高さの増加を示す。形質転換された植物がしばしばコンパクトな成長または矮性を示すため、形質転換された植物の高さは、通常、野生型の形質転換されていないコントロール植物の高さの約２０％、１５％または１０％未満である。従って、同じ種の野生型の形質転換されていない植物、好ましくは形質転換された植物が生じる親植物の高さと比較されるとき、「中間高さ」の植物は、野生型の形質転換されていない植物の高さの２５％－７５％、好ましくは３０－７０％、さらに好ましくは４０－６０％の高さにより定義される。

「中間コンパクトさ」は、同じ種の野生型またはコントロール植物と比較して、植物コンパクトさの量的増加を示す。コンパクトさは節間距離と相関する。節間が短ければ短いほど、植物はよりコンパクトである。中間コンパクトさは、本願明細書において、２５－７５％、好ましくは３０－７０％、さらに好ましくは４０－６０％の節間距離の低下により定義される。「中間コンパクトさ」なるフレーズは「中間長さ」と相互関係にある。Ｒｉ形質転換体、特にｒｏｌ形質転換体において、長さが減少するとき、コンパクトさは増加する。

「コントロール植物」および「野生型植物」なる用語は、形質転換体植物と同じ植物、すなわち同じ親供給源に由来するまたは同じ種または品種に属する植物を意味することを意図する。当業者は、形質転換された植物とコントロールまたは野生型植物とを比較するための方法、および、コントロール植物として使用するための植物、すなわち形質転換事象が起こったか否かを確認するための植物を即座に理解する。

植物の「子孫」なる用語は、祖先として該植物を有するすべての子孫植物を含む。

Ａ．核酸配列
「遺伝子」なる用語は、ＲＮＡまたはポリペプチドの生産のために必要なコード配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列を示す。ポリペプチドは、完全長コード配列によって、またはいずれかのその部分によってコードされ得る。「その部分」なる用語は、遺伝子に関して使用されるとき、その遺伝子のフラグメント、特にタンパク質の少なくとも一部をコードするフラグメントを示す。フラグメントは、少数のヌクレオチドから全遺伝子配列マイナス１つのヌクレオチドまでのサイズの範囲であり得る。したがって、「遺伝子の少なくとも一部を含む核酸配列」は、遺伝子のフラグメントまたは遺伝子全体を含み得る。「遺伝子」はまた、構造遺伝子のコード領域を含み、遺伝子が完全長ｍＲＮＡの長さに対応するように、いずれかの末端の約１ｋｂの距離の５’および３’末端の両方のコード領域に隣接して位置する配列を含む。コード領域の５’に位置し、ｍＲＮＡに存在する配列は、５’翻訳されない（または非翻訳）配列（５’ＵＴＲ）と称される。コード領域の３’または下流に位置し、ｍＲＮＡに存在する配列は、３’翻訳されない（または非翻訳）配列（３’ＵＴＲ）と称される。

本願明細書において使用される「核酸」は、直鎖状または分枝鎖状、一本鎖または二本鎖、またはそれらのハイブリッドであるＲＮＡまたはＤＮＡを示す。該用語はまた、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを含む。

「コードする」および「コード」は、遺伝子が、転写および翻訳のメカニズムを介して、一連のアミノ酸が特定のアミノ酸配列に集合され、活性な酵素を生産することができる細胞に情報を提供するプロセスを示す。遺伝子コードの縮重のため、ＤＮＡ配列における特定の塩基変化は、タンパク質のアミノ酸配列を変化させない。したがって、タンパク質の機能特性に実質的に影響を及ぼさない転写因子をコードするＤＮＡ配列における修飾が考慮されることが理解される。

本願明細書において使用される「発現」なる用語は、機能的な最終産物、例えばｍＲＮＡまたはタンパク質の生産を示す。

「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」なる用語は、本願明細書において互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを示す。該用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工化学的アナログであるアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマーに適用される。プローブまたはプライマーは、より大きな配列のフラグメントとして、設計され、および合成され、または生み出されることができる短いオリゴヌクレオチド配列を示す。プローブまたはプライマーは、任意の長さ、例えば６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９または６０ヌクレオチド長であってよい。

例示的なｒｏｌ配列は、限定はしないが、配列番号１－１２のそれぞれに示されている配列、ならびに欠失された、置換された、挿入された、または付加された１つ以上の塩基を有する配列番号１－１２のフラグメントまたは変異体であって、変異体はｒｏｌ活性を有するポリペプチドをコードする、フラグメントまたは変異体で構成される核酸分子を含む。例えば、限定するものではないが、本願は、配列番号１、ならびに例えばｒｏｌＡ－Ｄおよびａｕｘ１－２を含むことができる配列番号１の種々のフラグメントを提供する。例えば、当業者に容易に明らかなように、ｒｏｌＡ遺伝子は、ｒｏｌＡ－Ｄおよびａｕｘ１－２を含むより大きな配列の７００ｂｐ部分またはフラグメントを表すことができる。

「変異体」は、標準または所定の特定の遺伝子またはタンパク質のヌクレオチドまたはアミノ酸配列から逸脱したヌクレオチドまたはアミノ酸配列である。「アイソフォーム」、「アイソタイプ」および「アナログ」なる用語はまた、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の「変異体」形態も示す。１つ以上のアミノ酸の付加、除去または置換、またはヌクレオチド配列における変化によって変更されるアミノ酸配列は、「変異体」配列と考えることができる。変異体は、置換されるアミノ酸が類似の構造的または化学的特性を有する「保存的」変化、例えばロイシンのイソロイシンでの置換を有し得る。変異体は、「非保存的」変化、例えばグリシンのトリプトファンでの置換を有し得る。類似の軽微な変異はまた、アミノ酸欠失または挿入または両方を含み得る。どのアミノ酸残基が置換、挿入または欠失され得るかを決定するための案内は、当分野でよく知られているコンピュータープログラム、例えばＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ｓｕｉｔｅ（ＩｎｆｏｒＭａｘ、Ｍｄ．）ソフトウェアを使用して見いだされ得る。「変異体」はまた、Ｍａｘｙｇｅｎ－ａｓｓｉｇｎｅｄ ｐａｔｅｎｔｓに記載されているもののような「シャッフルされた遺伝子」を示し得る。

「変異体」配列のカテゴリーに含まれるものは、参照ｒｏｌ配列にハイブリダイズする配列である。例えば、２つの配列が６ｘ ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、５ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液および１００μｇの非特異的キャリアＤＮＡのハイブリダイゼーション溶液において二本鎖複合体を形成するとき、２つの配列はハイブリダイズする。Ausubel et al., 上記, at section 2.9, supplement 27 (1994)参照。配列は、６ｘ ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、５ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液および１００ｍｕ．ｇの非特異的キャリアＤＮＡのハイブリダイゼーション溶液において６０℃の温度として定義される「中ストリンジェンシー」でハイブリダイズし得る。「高ストリンジェンシー」ハイブリダイゼーションについて、温度は６８℃に増加される。中ストリンジェンシーハイブリダイゼーション反応後、ヌクレオチドは、２ｘ ＳＳＣ プラス ０．０５％ ＳＤＳの溶液において室温で５回洗浄し、次に０．１ｘ ＳＳＣ プラス ０．１％ ＳＤＳで６０℃で１時間洗浄した。高ストリンジェンシーについて、洗浄温度は６８℃に増加される。当業者は、ハイブリダイゼーション反応および洗浄プロセス中の温度、ハイブリダイゼーション反応および洗浄プロセス中の塩濃度などを変化させることによって、かかる条件を容易に選択することができる。本願目的のために、ハイブリダイズされたヌクレオチドは、１０，０００ｃｐｍ／ｎｇの特定の放射能を有する１ｎｇの放射性標識されたプローブを使用して検出することができ、ハイブリダイズされたヌクレオチドは－７０℃でせいぜい７２時間Ｘ線フィルムへの暴露後にはっきりと見える。

本願は、配列番号１－１８のいずれかに記載されている核酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるかかる核酸分子である。好ましいものは、配列番号１－１８のいずれかに示される核酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である核酸分子である。２つの核酸配列間の違いは、参照ヌクレオチドの５’または３’末端位置で起こり得る。

現実問題として、特定の核酸分子が参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるか否かを述べることは、当分野で知られているアルゴリズムを使用して２つの分子間で作られる比較に関与し、公に利用できるコンピュータープログラム、例えばＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを使用して慣用に決定することができる。Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-402 (1997)参照。

「配列同一性」および「配列類似性」なる用語は、グローバルまたはローカルアラインメントアルゴリズムを使用する２つのペプチドまたは２つのヌクレオチド配列のアラインメントによって決定することができる。次に、配列は、それらのそれぞれの全長にわたって少なくとも７０％の配列同一性を共有するとき、「実質的に同一」または「本質的に類似」と称され得る。パーセント配列同一性についての配列アラインメントおよびスコアは、コンピュータープログラム、例えばAccelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, Calif. 92121-3752 USAから利用できるGCG Wisconsin Package, Version 10.3、またはEmbossWin version 2.10.0（プログラム「ｎｅｅｄｌｅ」を使用する）を使用して決定され得る。あるいは、パーセント類似性または同一性は、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどのようなアルゴリズムを使用してデータベースに対して検索することによって決定され得る。

本願は機能性タンパク質をコードする核酸分子を考慮し得る。当分野で知られているとおり、かかるタンパク質がタンパク質のいずれかの機能を変更しないアミノ酸置換、付加および欠失を含むことが理解される。多くのタンパク質は遺伝子ファミリーによってコードされるため、他の遺伝子が本願のポリペプチドと類似の機能を有するタンパク質をコードすることができると予期される。これらの遺伝子は、配列比較によって同定することおよび機能的に注釈付けることができる。当業者は、慣用の方法、例えば適当なハイブリダイゼーションプローブでのｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーのスクリーニングを用いて機能的に関連するタンパク質配列を同定することができる。当業者は、パラロガス配列もまた、（縮重）オリゴヌクレオチドおよびＰＣＲに基づく方法を用いて単離することができることを知っている。

Ｂ．核酸構築物
上記で説明されているように、アグロバクテリウムリゾゲネスのＲｉプラスミドに由来する１つ以上の遺伝子配列は、宿主植物細胞に移動される。かかる移動は、自然な手段、例えば天然ｒｏｌ遺伝子を含むＲｉプラスミドを有するＡ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓでの植物細胞の自然感染を介して起こることができる。かかる自然または天然移動は、構築物および選択マーカーの必要性を回避する。

しかしながら、他の局面において、ｒｏｌ配列を含むアグロバクテリウムリゾゲネスのＲｉプラスミドに由来する１つ以上の遺伝子を、植物細胞への導入のために適当である核酸構築物に組み込むことができる。したがって、天然系が使用されない場合、核酸構築物を、植物細胞においてｒｏｌを発現するために使用することができる。

典型的な核酸構築物は、ｍＲＮＡおよび結果としてポリペプチドを生み出す最小の長さの塩基配列を含み得る。塩基配列の長さに理論的な上限は存在しない。かかる構築物の調製は、以下により詳細に記載されている。

転写のための核酸配列の供給源として、適当なｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡまたは合成ポリヌクレオチドが使用され得る。適当なｒｏｌ配列の単離のための方法は上記されている。したがって、配列の全体または実質的に全体をコードする配列を得ることができる。このＤＮＡ配列の適当な長さは、制限酵素の手段によって使用のために切ることができる。転写のために部分的な塩基配列の供給源としてゲノムＤＮＡを使用するとき、イントロンまたはエクソン領域のいずれか、または両方の組合せを使用することが可能である。

組み換え核酸構築物は、標準技術を使用して作製され得る。例えば、転写のための核酸配列は、該配列を含むベクターを、適当なセグメントを切るための制限酵素で処理することによって得ることができる。転写のための核酸配列はまた、それぞれの末端に適当な制限酵素認識部位を与えるように、合成オリゴヌクレオチドをアニーリングおよびライゲートすることによって、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において合成オリゴヌクレオチドを使用することによって、生み出され得る。次に、核酸配列は、適当な調節要素、例えば上流プロモーターおよび下流ターミネーター配列を含むベクターにクローニングされる。

別の局面は、アグロバクテリウムリゾゲネスのＲｉプラスミドに由来する１つ以上の遺伝子の遺伝子配列、例えばｒｏｌ配列が、正常な発達または植物生理学に過度に影響を及ぼすことなく、特定の細胞型、臓器または組織においてｒｏｌ配列の発現を駆動する１つ以上の調節配列に作動可能に連結されている核酸構築物に関する。

もちろん、自然形質転換または自然感染系の文脈において、天然または内因性調節配列が、異種配列よりもむしろ、使用される。

「プロモーター」は、転写を開始させるためのＲＮＡポリメラーゼおよび他のタンパク質の認識および結合に関与する、転写の開始から上流のＤＮＡ領域を意味する。「構成的プロモーター」は、植物の生存期間を通して、およびほとんどの環境条件下で活性であるものである。組織特異的、組織優先、細胞型特異的および誘導プロモーターは、「非構成的プロモーター」のクラスを構成する。「作動可能に連結」は、プロモーター配列が第２の配列に対応するＤＮＡ配列の転写を開始および仲介する、プロモーターおよび第２の配列間の機能的連結を示す。一般的に、「作動可能に連結」は、連結されている核酸配列が隣接していることを意味する。

細胞に導入される核酸配列の発現のために有用なプロモーターは、自然形質転換系のための天然または内因性プロモーター、または構成的プロモーター、例えばカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、または組織特異的、組織優先、細胞型特異的および誘導プロモーターを含み得る。例えば、脈管系特異的、木部特異的または木部優先プロモーターを使用することによって、それは、多くの組織、例えば脈管組織、とりわけ木部において特異的にｒｏｌ発現を修飾することができる。構成的プロモーターの使用は、一般的に、植物の全ての部分において酵素レベルおよび機能に影響を及ぼすが、組織優先プロモーターの使用は、特定の植物部への修飾された遺伝子発現の標的化を可能にし、より制御可能な表現型をもたらす。

ベクターはまた、ｍＲＮＡの転写が終結されるように、ｒｏｌ配列および付加されたｐｏｌｙＡ配列の下流に位置する終結配列を含み得る。かかる典型的なターミネーターは、天然または内因性ターミネーター配列、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓターミネーターまたはノパリン合成遺伝子（Ｔｎｏｓ）ターミネーターである。発現ベクターはまた、エンハンサー、開始コドン、スプライシングシグナル配列およびターゲティング配列を含み得る。

発現ベクターはまた、形質転換細胞を培養物において同定することができる選択マーカーを含み得る。マーカーは、異種核酸分子、すなわちプロモーターに作動可能に連結した遺伝子と関連していてもよい。本願明細書において使用される「マーカー」なる用語は、マーカーを含む植物または細胞の選択またはスクリーニングを可能にする形質または表現型をコードする遺伝子を示す。植物において、例えば、マーカー遺伝子は、抗生物質または殺草剤耐性をコードする。これは、形質転換またはトランスフェクトされていない細胞中から形質転換細胞の選択を可能にする。

適当な選択可能なマーカーの例は、アデノシンデアミナーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ハイグロマイシン－Ｂ－ホスホトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ、キサンチン－グアニンホスホ－リボシルトランスフェラーゼ、グリホサートおよびグルホシネート耐性、およびアミノグリコシド３’－Ｏ－ホスホトランスフェラーゼ(phosphotranserase)（カナマイシン、ネオマイシンおよびＧ４１８耐性）を含む。これらのマーカーは、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシンおよびゲンタマイシンに対する耐性を含み得る。構築物はまた、グルホシネートアンモニウムのような除草性ホスフィノトリシンアナログに対する耐性を与える選択可能なマーカー遺伝子Ｂａｒを含み得る。Thompson et al., EMBO J. 9: 2519-23 (1987)。他の適当な選択マーカーも同様に知られている。

可視マーカー、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が使用され得る。細胞分裂の制御に基づいて形質転換された植物を同定または選択するための方法もまた記載されている。ＷＯ ２０００／０５２１６８およびＷＯ ２００１／０５９０８６参照。同様に、腫瘍または毛状根成長のような特徴的な表現型の存在もまた、同定および選択のために使用され得る。

自然形質転換または自然感染系において、選択マーカーは使用されない。感染がそれ自身の独特な自然の表現型を提供するため、形質転換細胞は感染後の表現型、例えば毛状根表現型に基づいて選択することができる。

細菌またはファージ宿主中でベクターがクローン化されることができるように、細菌またはウイルス起源の複製配列もまた含まれ得る。好ましくは、広範な宿主範囲の原核生物複製起点が使用される。所望の構築物を有する細菌細胞の選択を可能にするために、細菌に対する選択可能なマーカーが含まれ得る。適当な原核生物選択可能なマーカーはまた、カナマイシンまたはテトラサイクリンのような抗生物質に対する耐性を含む。

当技術分野で知られているように、付加的な機能をコードする他の核酸配列もまたベクター中に存在し得る。例えば、アグロバクテリウムが宿主であるとき、植物染色体への後の移動および取り込みを容易にするために、Ｔ－ＤＮＡ配列を含み得る。

Ｃ．形質転換方法論：遺伝子の移動
上記説明のとおり、「形質転換」は、宿主植物または植物細胞にアグロバクテリウムリゾゲネスに由来する１つ以上の遺伝子を導入するためのあらゆる方法論を示す。重要なことには、Ａ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓは植物に自然に感染するため、形質転換は、植物細胞への野生型細菌由来のＲｉプラスミドからの野生型遺伝子、特にｒｏｌ遺伝子および／またはａｕｘ遺伝子の移動を含む。したがって、本願明細書において使用されるとき、形質転換は、異種遺伝子を宿主植物細胞への移動のためのベクターにクローニングすることを必要とせず、細菌を遺伝子操作する必要もない。

「形質転換された植物」は、別の生物体または種においてそれ自体で存在するか、または宿主コドン使用頻度と比較して別の生物体または種から最適化された核酸配列を含む植物を示す。単子葉および双子葉被子植物または裸子植物細胞が、当分野で公知の種々の方法において形質転換され得る。例えば、Klein et al., Biotechnology 4: 583-590 (1993); Bechtold et al. , C. R. Acad. Sci. Paris 316: 1 194-1 199 (1993); Bent et al., Mol. Gen. Genet. 204: 383-396 (1986); Paszowski et al., EMBO J. 3: 2717-2722 (1984); Sagi et al., Plant Cell Rep. 13: 262-266 (1994)参照。Ａ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓおよびＡ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓのようなアグロバクテリウム種を、例えばNagel et al., Microbiol Lett 67: 325 (1990)にしたがって使用することができる。さらに、植物は、リゾビウム、シノリゾビウムまたはメソリゾビウム形質転換によって形質転換され得る。Broothaerts et al., Nature 433: 629-633 (2005)。

例えば、アグロバクテリウムは、例えばエレクトロポレーションを介して植物発現ベクターで形質転換され得、その後、アグロバクテリウムが、例えば周知のリーフディスク法を介して植物細胞に導入される。これを達成するためのさらなる方法は、限定はしないが、エレクトロポレーション、パーティクル・ガン法、リン酸カルシウム沈降、およびポリエチレングリコール融合、発芽する花粉粒への移動（transfer into germinating pollen grains）、直接形質転換、Lorz et al., Mol. Genet. 199: 179-182 (1985)、および当分野で公知の他の方法を含む。カナマイシン耐性のような選択マーカーを使用するとき、どの細胞が成功裏に形質転換されているかを容易に決定させる。マーカー遺伝子は、選択後のマーカーの除去を容易にするために、ｃｒｅまたはｆｌｐのような特定のリコンビナーゼによって認識される組換え部位の対内に含まれ得る。米国特許出願公開第２００４／０１４３８７４号参照。

マーカー遺伝子を有さないトランスジェニック植物は、アグロバクテリウムリゾゲネスのＲｉプラスミドに由来する遺伝子配列、特にｒｏｌ配列を含む第１のプラスミドと異なる、マーカーをコードする核酸を含む第２のプラスミドを使用して生産され得る。選択可能なマーカー遺伝子が一過性に発現されるように、第１および第２のプラスミドまたはその一部が同じ植物細胞に導入され、形質転換された植物細胞が同定され、想定される遺伝子配列、例えばｒｏｌ配列がゲノムに安定に組み込まれ、選択可能なマーカー遺伝子が安定に組み込まれない形質転換された植物が得られる。米国特許出願公開第２００３／０２２１２１３号参照。

上記のアグロバクテリウム形質転換方法は、双子葉植物を形質転換するために知られている。さらに、de la Pena et al., Nature 325: 274-276 (1987)、Rhodes et al., Science 240: 204-207 (1988)、およびShimamato et al., Nature 328: 274-276 (1989)は、アグロバクテリウムを使用して穀類の単子葉植物を形質転換している。アグロバクテリウム介在形質転換のための減圧浸潤を説明するBechtold et al., C.R. Acad. Sci. Paris 316 (1994)も参照。

植物細胞は、選択可能または可視マーカーの使用なしで核酸または核酸構築物で形質転換され得、トランスジェニック生物は、導入された配列または構築物の存在を検出することによって同定され得る。特定の細胞におけるタンパク質、ポリペプチドまたは核酸分子の存在を測定して、例えば、細胞が成功裏に形質転換されているか、またはトランスフェクトされているか否かを決定することができる。例えば、当該分野の日常的なこととして、導入された構築物の存在は、ＰＣＲまたは特定の核酸またはポリペプチド配列を検出するための他の適当な方法によって検出することができる。さらに、形質転換細胞は、同様の条件下で培養される非形質転換細胞の増殖速度または形態学的特徴と比較して、形質転換細胞の増殖速度または形態学的特徴の差を認識することによって同定され得る。ＷＯ ２００４／０７６６２５参照。

形質転換細胞または培養物から植物を再生する方法は、植物種によって異なるが、既知の方法論に基づく。例えば、カランコエ植物を再生するための方法は、当分野でよく知られており、Christensen, et al, (2008). Plant Cell Rep. 27, 1485-1495において見ることができる。

Ｄ．Ａ． ＲＨＩＺＯＧＥＮＥＳで形質転換された植物の選択および分析
同じ種のコントロールの形質転換されていない植物と比較してアグロバクテリウムリゾゲネスのＲｉプラスミドに由来する１つ以上の遺伝子を含み、発現する本願の形質転換された植物であって、該遺伝子は好ましくは１つ以上のｒｏｌ遺伝子を含む植物が選択される。さらに、本願の植物は、形質転換されていないコントロール植物と比較して変化した表現型を有し得る。かかる表現型は、中間高さまたは中間コンパクトさを含み得、形質転換された植物は、コントロール植物と比較して低下した高さおよび／またはコンパクトさを有する。

本願発明者は、今回、本願発明の第１の局面において、驚くべきことに、Ｒｉプラスミドを含むＡ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓでの感染によってアグロバクテリウムリゾゲネスのＲｉプラスミドに由来する１つ以上の遺伝子で形質転換された、上記の不利な点を有さないまたは有意な程度ではないが、想定される中間成長を示し、花数およびしわの寄った葉のような他の望ましくない表現型に影響を及ぼすことないまたは少なくとも有意に影響を及ぼすことない植物を見いだした。本願明細書において、「アグロバクテリウムリゾゲネスに由来する」なるフレーズは、特に、「アグロバクテリウムリゾゲネスのＲｉプラスミドに由来する」、特にそれぞれ配列番号１および２に示されるＲｉプラスミドのＴ_Ｌ－およびＴ_Ｒ－ＤＮＡに由来する、ことを意味することが意図される。この目的のため、本願発明は、Ｒｉプラスミドを含むＡ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓでの感染によってアグロバクテリウムリゾゲネスのＲｉプラスミドに由来する１つ以上の遺伝子で形質転換された植物、またはかかる植物の子孫であって、該植物または子孫は、そのゲノムにおいて、１～５コピーのＲｉプラスミドに由来する該１つ以上の遺伝子を含む、植物または子孫を提供する。本願発明の植物は、Ｒｉプラスミドに由来する遺伝子がＲｉプラスミドの導入によって植物の細胞に導入されるように、Ａ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓでの感染によって得られる。これは、該遺伝子が、Ｒｉプラスミドに由来しない、任意のＤＮＡがない、それらの天然環境中で植物細胞に導入されることを意味する。したがって、「Ｒｉプラスミドに由来する遺伝子」なる用語は、宿主がＲｉプラスミドで形質転換され、Ｒｉプラスミドの遺伝子が植物ゲノムに組み込まれるようになることを意味する。

Ｒｉプラスミドを含むＡ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓでの植物の感染によって、Ｒｉプラスミドが植物細胞に導入される。上記のように、この事象は、通常、植物ゲノムにおいて、Ｒｉプラスミドの多数のコピー、すなわちそこに存在する全ての遺伝子の取り込みをもたらす。しかしながら、特に感染の結果として発達させる毛状根の特徴に関して、または植物ゲノムにおいてＲｉプラスミドに由来する遺伝子の数を薄めるように形質転換された植物とトランスフェクトされていない植物との交配による、特定の選択技術が、Ｒｉプラスミドに由来する遺伝子の限定された数を有する植物を生じることが見いだされている。Ａ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ感染によってＲｉプラスミドで形質転換された植物の子孫であって、Ｒｉプラスミドに由来する１つ以上の遺伝子が削除され、Ｒｉプラスミドに存在する全てではないが１つ以上の遺伝子を含む子孫植物を引き起こす、子孫を得ることも可能である。

かかる遺伝子のより高いコピー数が、矮性、および、上述したような、しわの寄った葉および花数および花序数の減少のような他の望ましくない特性をもたらすことが見出された。Ｒｉプラスミドに由来する遺伝子の限定された数のコピーのみの存在により、かかる不利な点は少なくとも部分的に克服される。

好ましくは、植物またはその子孫は、そのゲノムにおいて、１～５コピーの少なくとも１つ以上のｒｏｌＡ、ｒｏｌＢ、ｒｏｌＣおよびｒｏｌＤ遺伝子を含む。しかしながら、ａｕｘ１、ａｕｘ２およびＲｉプラスミド上で同定されるオープンリーディングフレームもまた含むことができる。実験データに基づいて、特に、ｒｏｌ遺伝子が上記特性において重要な役割を果たすと考えられる。したがって、本願の植物またはその子孫は、好ましくは、そのゲノムにおいて、１～５コピーのｒｏｌＡ、ｒｏｌＢ、ｒｏｌＣおよびｒｏｌＤ遺伝子を含む。

特定の態様において、本願の植物またはその子孫は、そのゲノムにおいて、Ｒｉプラスミドに存在する１～５コピーの遺伝子（すなわち上記ｒｏｌおよびａｕｘ遺伝子を含む）を含む。好ましくは、植物またはその子孫は、１～５コピーのＲｉプラスミドを含む。しかしながら、上記のように、該植物の子孫においてＲｉプラスミドに由来する１つ以上の遺伝子を削除することが可能である。

コピー数は、好ましくは３以下、または２以下またはさらには１である。しわの寄った葉のような同時の悪影響なしで想定される中間高さが、このような少数の遺伝子コピーで得られることを見いだした。

好ましくは、植物は、Ｒｉプラスミドを含むアグロバクテリウムリゾゲネスでの感染によって得られる。しかしながら、公知の遺伝子操作技術によって植物にアグロバクテリウムリゾゲネスのＲｉプラスミドを導入し、植物のゲノムに組み込まれるＲｉプラスミド由来の１つ以上の遺伝子、またはそれらの２つ以上の組合せ、または全４つのｒｏｌ遺伝子、またはＲｉプラスミドの全遺伝子を引き起こすこともできる。しかしながら、植物または植物細胞のアグロバクテリウムリゾゲネスでの感染は、非常に効率的であり、便利であることが証明されている。当業者は、想定される植物をアグロバクテリウムリゾゲネスでトランスフェクトする方法について適切な技術を知っている。

アグロバクテリウムリゾゲネスは、好ましくは、野生型、例えば寄託番号ＡＴＣＣ４３０５７の下にＡＴＣＣで寄託されたＡ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ株Ａ４であり、野生型アグロバクテリウムリゾゲネスを使用するとき、ＧＭＯ（遺伝的に修飾された生物体）ではないと見なされる形質転換体をもたらす。

あらゆる方法論がＡ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓで、特に１つ以上のｒｏｌ遺伝子で形質転換された植物を生産するために使用することができるが、本願は上記属のいずれかに属する形質転換された植物を生み出すための「天然」および「非天然」方法論の両方を提供する。例えば、以下に議論されるように、出願人は、ｒｏｌ遺伝子を含む天然遺伝子を植物細胞に移動するために野生型Ａ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓを利用した。これはＡ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓが天然遺伝子を植物細胞に移動する「天然」系であるが、アグロバクテリウムリゾゲネスで形質転換されたコンパクトな植物がより緊密な構造を形成するコンパクトな葉による真菌感染の危険性の増加ならびに近隣の植物からの競争力のような障害に直面するため、実際は成功裏におこる可能性が低い。

好ましくは、記載されている植物またはその子孫は、形質転換されていないコントロール植物の２５－７５％、好ましくは３０－７０％、より好ましくは４０－６０％の中間高さを示す。

好ましい態様において、形質転換された植物またはその子孫は、形質転換されていないコントロール植物と比較して、８０％以上の花数を有する、および／または４日以上開花時間遅延を有さない。今回、アグロバクテリウムリゾゲネスで形質転換された植物、特にｒｏｌ形質転換された植物は、驚くべきことに、形質転換されていないコントロール植物と比較して、花数の有意な減少がない、すなわち花数の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％または１００％またはそれ以上（すなわち花数の増加）を有することを本願発明者によって見いだされた。開花遅延についても同様であり、形質転換されていない植物と比較して、好ましくは４日以内、さらに好ましくは２日以内である。いくつかの形質転換体において、開花は、形質転換されていないコントロール植物と比較して、さらに早くなった。

上記を考慮して、記載されている植物またはその子孫は、好ましくは以下の属または種のいずれかに属する：
カランコエ、特に、Ｋ． ｂｌｏｓｓｆｅｌｄｉａｎａ、Ｋ． ｌａｃｉｎｉａｔａ、Ｋ． ｐｉｎｎａｔａ、Ｋ． ｍａｒｍｏｒａｔａ、Ｋ． ｇａｓｔｏｎｉｓ－ ｂｏｎｎｉｅｒｉ、Ｋ． ｄｉｘｏｎｉａｎａ、Ｋ． ｈｕｍｉｌｉｓ、Ｋ． ａｍｂｏｌｅｎｓｉｓ、Ｋ． ａｒｏｍａｔｉｃａ、Ｋ． ｃａｍｐａｎｕｌａｔａ、Ｋ． ｃｉｔｒｉｎａ、Ｋ． ｃｏｃｃｉｎｅａ、Ｋ． ｃｒｕｎｄａｌｌｉｉ、Ｋ． ｄａｉｇｒｅｍｏｎｔｉａｎａ、Ｋ． ｄｅｃｕｍｂｅｎｓ、Ｋ． ｆａｕｓｔｉｉ、Ｋ． ｆｅｄｔｓｃｈｅｎｋｏｉ、Ｋ． ｆｉｇｕｅｒｅｄｏｉ、Ｋ． ｆｌａｍｍｅａ、Ｋ． ｇｌａｕｃｅｓｃｅｎｓ、Ｋ． ｇｒａｃｉｌｉｐｅｓ、Ｋ． ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａ、Ｋ． ｇｕｉｇｎａｒｄｉｉ、Ｋ． ｊｏｎｇｍａｎｓｉｉ、Ｋ． ｌａｃｉｎｉａｔａ、Ｋ．ｌａｔｉｓｅｐｅｌａ、Ｋ． ｌａｘｉｆｌｏｒａ、Ｋ． ｌｏｂａｔａ、Ｋ． ｌｏｎｇｉｆｌｏｒａ、Ｋ． ｍａｎｇｉｎｉｉ、Ｋ． ｎｙｉｋａｅ、Ｋ． ｏｂｔｕｓｅ、Ｋ． ｐａｎｉｃｕｌａｔａ、Ｋ． ｐｏｒｐｈｙｒｏｃａｌｙｘ、Ｋ． ｐｒｉｔｔｗｉｔｚｉｉ、Ｋ． ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ、Ｋ． ｐｕｍｉｌａ、Ｋ． ｒａｕｈｉｉ、Ｋ． ｒｏｔｕｎｄｉｆｏｌｉａ、Ｋ． ｓｃａｐｉｇｅｒａ、Ｋ． ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒｉｉ、Ｋ． ｓｐａｔｈｕｌａｔａ、Ｋ． ｓｔｒｅｐｔａｎｔｈａ、Ｋ． ｓｙｎｓｅｐａｌａ、Ｋ． ｔｏｍｅｎｔｏｓａ、Ｋ． ｔｈｙｒｓｉ ｆｌｏｒａ、Ｋ． ｔｕｂｉ ｆｌｏｒａ、Ｋ． ｕｎｉｆｌｏｒａ；
キク(Chrysantemum)、特に、Ｃｈｒｙｓａｎｔｅｍｕｍ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓａｎｔｅｍｕｍ ｘ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ （ｓｙｎ． Ｃ． ｘ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ、例えば、Ｄｅｎｄｒａｎｔｈｅｍａ ハイブリッド、またはＣｈｒｙｓａｎｔｅｍｕｍ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍおよび他のキク種、例えばＣｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ間のハイブリッド；
シオン(Aster)、特に、Ａｓｔｅｒ ｎｏｖｉ－ｂｅｌｇｉｉ、Ａｓｔｅｒ ｄｕｍｏｓｕｓ；
バラ(Rosa)、特に、Ｒｏｓａ ｈｙｂｒｉｄａ、Ｒｏｓａ ｃａｎｉｎａ、Ｒｏｓａ ｓｐｉｎｏｓｉｓｓｉｍａ、Ｒｏｓａ ｄａｍａｓｃｅｎａ 「ｔｒｉｇｉｎｔｉｐｅｔａｌａ」、Ｒｏｓａ ｃｅｎｔｉ ｆｏｌｉａ；
ナス(Solanum)、特に、Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ、Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ、Ｓｏｌａｎｕｍ ｎｉｃｏｔｉａｎａ；
トウダイグサ(Euphorbia)、特に、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｍｉｌｉｉ；
コチョウラン(Phaelanopsis)、特に、Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ ａｍａｂｉｌｉｓ、Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ ａｍｂｏｉｎｅｎｓｉｓ、Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ ａｐｈｒｏｄｉｔｅ、Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔａ；
メボウキ(Ocimum)、特に、Ｏｃｉｍｕｍ ｂａｓｉｌｉｃｕｍ；
トウガラシ(Capsicum)、特に、Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｂａｃｃａｔｕｍ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｃｈｉｎｅｎｓｅ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ；
ハッカ(Mentha)、特に、Ｍｅｎｔｈａ ａｒｖｅｎｓｉｓ、Ｍｅｎｔｈａ ｒｅｑｕｉｅｎｉｉ、Ｍｅｎｔｈａ ｓｐｉｃａｔａ、Ｍｅｎｔｈａ ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａ、Ｍｅｎｔｈａ ｐｕｌｅｇｉｕｍ、Ｍｅｎｔｈａ ｓｕａｖｅｏｌｅｎｓ、Ｍｅｎｔｈａ ａｑｕａｔｉｃ、Ｍｅｎｔｈａ ａｒｖｅｎｓｉｓ ｘ ｓｐｉｃａｔａ、Ｍｅｎｔｈａ ａｑｕａｔｉｃａ ｘ ａｒｖｅｎｓｉｓ、Ｍｅｎｔｈａ ｘ ｐｉｐｅｒｉｔａ；
ハイビスカス(Hibiscus)、特に、Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｒｏｓａ－ｓｉｎｅｎｓｉｓ、Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｓｃｈｉｚｏｐｅｔａｌｕｓ、Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｓａｂｄａｒｉｆｆａ、Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｓｙｒｉａｃｕｓ、Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｔｒｉｏｎｕｍ、Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｃａｎｎａｂｉｎｕｓ；
マンデビラ(Mandevilla)／マンデビラ(Dipladenia)、特に、Ｍａｎｄｅｖｉｌｌａ ｘ ａｍａｂｉｌｉｓ、Ｍａｎｄｅｖｉｌｌａ ｓａｎｄｅｒｉ、Ｍａｎｄｅｖｉｌｌａ ｓｐｌｅｎｄｅｎｓ；
ユーストマ(Eustoma)、特に、Ｅｕｓｔｏｍａ ｒｕｓｓｅｌｌｉａｎｕｍ、Ｅｕｓｔｏｍａ ｅｘａｌｔａｔｕｍ；
ラベンダー(Lavendula)、特に、Ｌａｖａｎｄｕｌａ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ、Ｌａｖａｎｄｕｌａ ｌａｔｉｆｏｌｉａ、Ｌａｖａｎｄｕｌａ ｌａｎａｔａ、Ｌａｖａｎｄｕｌａ ｄｅｎｔａｔｅ、Ｌａｖａｎｄｕｌａ ｓｔｏｅｃｈａｓ、Ｌａｖａｎｄｕｌａ ｐｅｄｕｎｃｕｌａｔａ、Ｌａｖａｎｄｕｌａ ｖｉｒｉｄｉｓ；
ユリ(Lillium)、特に、Ｌｉｌｉｕｍ ｂｏｌａｎｄｅｒｉ、Ｌｉｌｉｕｍ ｘ ｂｕｒｂａｎｋｉｉ、Ｌｉｌｉｕｍ ｃａｎａｄｅｎｓｅ、Ｌｉｌｉｕｍ ｃｏｌｕｍｂｉａｎｕｍ、Ｌｉｌｉｕｍ ｇｒａｙｉ、Ｌｉｌｉｕｍ ｈｕｍｂｏｌｄｔｉｉ、Ｌｉｌｉｕｍ ｋｅｌｌｅｙａｎｕｍ、Ｌｉｌｉｕｍ ｋｅｌｌｏｇｇｉｉ、Ｌｉｌｉｕｍ ｍａｒｉｔｉｍｕｍ、Ｌｉｌｉｕｍ ｍｉｃｈａｕｘｉｉ、Ｌｉｌｉｕｍ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｅ、Ｌｉｌｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ、Ｌｉｌｉｕｍ ｘ ｐａｒｄａｂｏｌｄｔｉｉ、Ｌｉｌｉｕｍ ｐａｒｄａｌｉｎｕｍ、Ｌｉｌｉｕｍ ｐａｒｒｙｉ、Ｌｉｌｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、Ｌｉｌｉｕｍ ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉｃｕｍ、Ｌｉｌｉｕｍ ｐｉｔｋｉｎｅｎｓｅ、Ｌｉｌｉｕｍ ｓｕｐｅｒｂｕｍ、Ｌｉｌｉｕｍ ｏｌｌｍｅｒｉ、Ｌｉｌｉｕｍ ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎｉａｎｕｍ、Ｌｉｌｉｕｍ ｗｉｇｇｉｎｓｉｉ；
クレマチス(Clematis)、特に、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ａｄｄｉｓｏｎｉｉ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ａｌｂｉｃｏｍａ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ａｌｐｉｎｅ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ａｒｉｓｔａｔａ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ａｒｍａｎｄｉｉ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｂａｌｄｗｉｎｉｉ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｂｉｇｅｌｏｖｉｉ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｂｒａｃｈｉａｔｅ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｃａｍｐａｎｉｆｌｏｒａ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｃａｔｅｓｂｙａｎａ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｃｈｒｙｓｏｃｏｍａ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｃｉｒｒｈｏｓａ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｃｏａｃｔｉｌｉｓ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ Ｃｏｌｕｍｂｉａｎａ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｃｒｉｓｐａ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｄｉｏｉｃａ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｄｒｕｍｍｏｎｄｉｉ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｄｕｒａｎｄｉｉ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｉｓｐａｈａｎｉｃａ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｆａｗｃｅｔｔｉｉ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｆｌａｍｍｕｌａ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｆｌｏｒｉｄａ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｆｒｅｍｏｎｔｉｉ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌａ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｇｌｙｃｉｎｏｉｄｅｓ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｈｅｎｒｙｉ Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｈｉｒｓｕｔｉｓｓｉｍａ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｘ ｊａｃｋｍａｎｉｉ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｅ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｌａｓｉａｎｔｈａ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｌｅｐｔｏｐｈｙｌｌａ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｌｉｇｕｓｔｉｃｉｆｏｌｉａ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｍａｃｒｏｐｅｔａｌａ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｍａｒｍｏｒａｒｉａ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｍｉｃｒｏｐｈｙｌｌａ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｍｏｎｔａｎａ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｍｏｒｅｆｉｅｌｄｉｉ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｎａｐａｕｌｅｎｓｉｓ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｏｃｈｒｏｌｅｕｃａ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｐａｌｍｅｒｉ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｐａｔｅｎｓ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｐａｕｃｉｆｌｏｒａ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｐｉｃｋｅｒｉｎｇｉｉ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｐｉｔｃｈｅｒ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｒｅｃｔａ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｅ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｒｈｏｄｏｃａｒｐａ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｓｍｉｌａｃｉｆｏｌｉａ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｓｏｃｉａｌｉｓ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｓｔａｎｓ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｔａｎｇｕｔｉｃａ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｔｅｒｎｉｆｌｏｒａ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｔｅｒｎｉｆｏｌｉａ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｔｅｘｅｎｓｉｓ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｖｉｏｒｎａ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｖｉｒｇｉｎｉａｎａ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｖｉｔａｌｂａ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｖｉｔｉｃａｕｌｉｓ、Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｖｉｔｉｃｅｌｌａ；
タバコ(Nicotiana)、特に、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｘ ｓａｎｄｅｒｒａｅ；
カンチョウジ(Bouvardia)、特に、Ｂｏｕｖａｒｄｉａ ｌｏｎｇｉｆｌｏｒａ；
バニラ(Vanilla)、特に、Ｖａｎｉｌｌａ ｐｌａｎｉｆｏｌｉａ；
サツマイモ(Ipomoea)、特に、Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔａｓ；
エキナセア(Echinacea)、特に、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ａｎｇｕｓｔｉ ｆｏｌｉａ、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐａｌｌｉｄａ；
チョウセンゴミシ(Schisandra)、特に、Ｓｃｈｉｓａｎｄｒａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ｓｃｈｉｓａｎｄｒａ ｇｌａｂｒａ、Ｓｃｈｉｓａｎｄｒａ ｒｕｂｒｉｆｌｏｒａ；
イワベンケイ(Rhodiola)、特に、Ｒｈｏｄｉｏｌａ ｒｏｓｅａ；
フランスギク(Leucanthemum)、特に、Ｌｅｕｃａｎｔｈｅｍｕｍ ｍａｘｉｍｕｍ、Ｌｅｕｃａｎｔｈｅｍｕｍ ｐａｌｕｄｏｓｕｍ、Ｌｅｕｃａｎｔｈｅｍｕｍ ｘ ｓｕｐｅｒｂｕｍ、Ｌｅｕｃａｎｔｈｅｍｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ、Ｌｅｕｃａｎｔｈｅｍｕｍ ａｄｕｓｔｕｍ、Ｌｅｕｃａｎｔｈｅｍｕｍ ｇｒａｍｉｎｉｆｏｌｉｕｍ、Ｌｅｕｃａｎｔｈｅｍｕｍ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉｕｍ、Ｌｅｕｃａｎｔｈｅｍｕｍ ｌａｃｕｓｔｒｅ、Ｌｅｕｃａｎｔｈｅｍｕｍ ｍｏｎｓｐｅｌｉｅｎｓｅ、Ｌｅｕｃａｎｔｈｅｍｕｍ ｐａｌｌｅｎｓ、Ｌｅｕｃａｎｔｈｅｍｕｍ ｐｒａｅｃｏｘ、Ｌｅｕｃａｎｔｈｅｍｕｍ ｓｕｂｇｌａｕｃｕｍ、Ｌｅｕｃａｎｔｈｅｍｕｍ ｓｙｌｖａｔｉｃｕｍ、Ｌｅｕｃａｎｔｈｅｍｕｍ ｗａｌｄｓｔｅｉｎｉｉ；
ゴクラクチョウカ(Strelitzia)、特に、Ｓｔｒｅｌｉｔｚｉａ ｒｅｇｉｎａｅ、
属内の種間ハイブリッド、および上記属および種のいずれかの属間接ぎ木も含む。

特定の態様において、記載されている植物は、特に観賞使用のために適当な、カランコエ、シオン、キク(Chrysanthemum)、クレマチス、トウダイグサ、ハイビスカス、フランスギク、マンデビラ(Mandevilla)、タバコ、メボウキ、テンジクアオイ(Pelagonium)、コチョウラン、バラおよびナス(Solana)属のいずれかに属する。

他の局面において、本願発明は、観賞植物として、または食物の提供または製造のための、またはヒトまたは動物必要品、例えば医薬、刺激剤または化粧品の製造のための活性成分の供給源として、上記植物またはその子孫の使用に関する。「ヒトまたは動物必要品」なる用語は、本願明細書において、植物に由来する任意の植物部、化合物、化合物の混合物または抽出物を含む任意の産物であって、ヒトまたは動物による、特にかかる産物での該ヒトまたは動物の処置、特に医学的、美容的または刺激的処置のような身体の処置による、または動物またはヒトによる産物の消費による使用のための、任意の産物を意味することを意図する。したがって、食物もそれ自体、ヒトまたは動物必要品と見なされるべきである。

当分野において、刺激剤（シガレット）用の活性成分のための供給源として、農作物種Ｃｉｃｈｏｒｕｍ ｉｎｔｙｂｕｓ（Ｂｅｌｇｉａｎ ｅｎｄｉｖｅ）およびＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ（タバコ）を含むＡ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓで形質転換された植物の視覚的評価のみを行われる。しかしながら、本願発明者は、驚くべきことに、Ｒｉプラスミドの１から５のアグロバクテリウムリゾゲネス遺伝子、特にアグロバクテリウムリゾゲネスに由来するｒｏｌ遺伝子を含むかかる植物、例えば、アグロバクテリウムリゾゲネスまたはその１つ以上のｒｏｌ遺伝子で形質転換された植物、またはその子孫が、かかる植物が収穫が損なわれる非常に高く成長するときに特に望ましい中間高さを有するだけでなく、より小さい細胞容量の結果としてより濃縮された内容物を有することを見いだした。あらゆる理論に拘束されることなく、かかる形質転換体のより小さいサイズは、少なくとも部分的により小さい伸長する植物細胞によって、より小さい細胞であると考えられる。これは、例えば、ｒｏｌ形質転換された実、例えばトウガラシ種からのコショウ、またはＶａｎｉｌｌａ ｐｌａｎｉｆｏｌｉａからのバニラ、またはハーブ、例えばバジル（Ｏｃｉｍｕｍ ｂａｓｉｌｉｃｕｍ）が、形質転換されていない対応物と比較して、増強された味を有することを宣告する。トマト、ジャガイモおよび小麦、大麦などのような単子葉植物についても当てはまる。医薬または刺激剤の製造のための活性成分のための供給源として使用される植物についても当てはまる。薬用植物のようなかかる植物は、細胞中でより濃縮された様式において活性成分を有し、それをもってその単離および抽出を容易にする。刺激剤ニコチンを含むタバコの場合、より高いニコチン内容物を有し、より濃縮された産物を引き起こす。ヒト必要品としての使用のための植物、植物部、化合物、および化合物または抽出物の混合物のより詳細な使用は、実施例に示されている。

食物の提供または製造のための使用のための植物は、好ましくはバニラ、メボウキ、トウガラシ、サツマイモ、ナス属のいずれかに属するが、あらゆるかかる植物が本願発明によって包含される。植物それ自体は、食物、例えばニンジン、またはその実、例えばリンゴ、ナシ、ベリーなどとして使用することができる。また、抽出物、例えば茶を製造することができる。

医薬または刺激剤の製造のための活性成分のための供給源として使用される植物は、好ましくはカランコエ、ナス、タバコ、イワベンケイ、エキナセア、チョウセンゴミシ、バラ、ハイビスカス(Hibscus)およびキク属のいずれかに属する。ｒｏｌ形質転換されたカランコエは、強い抗腫瘍促進活性を有するブリオフィリン(bryophillin)、例えばブリオフィリンＡの上昇されたレベルを含み、興味深いことに、フラボノイド(flavonoids) ケンペロール(kaempferol)およびイソハムネイン(isohamnetin)のレベルが、本願明細書に記載されている植物、特にカランコエにおいて有意に増加され、癌処置に特に関心のあるかかる植物の抽出物を与える。ｒｏｌ形質転換されたチョウセンゴミシは、シザンドリン(schisandrin)、デソキシシザンドリン(desoxyschisandrin)、ゴミシン(gomisins)およびプレゴミシン(pregomisin)の上昇されたレベルを含む。ｒｏｌ形質転換されたエキナセアは、例えばプロパノイド(propanoid)およびエキナコシド(echinacoside)の上昇されたレベルを有する。

したがって、本願発明はまた、医薬として使用するための本願明細書に記載されている植物またはその子孫の抽出物、特に、癌、または、抗酸化剤、特にフラボノイドの作用によって緩和することができるあらゆる他の疾患または状態、例えば酸素ラジカル誘発性疾患の処置のために医薬として使用するためのカランコエ抽出物に関する。

また、ｒｏｌ形質転換されたＣｈｒｙｓｔａｎｔｅｎｕｍ ｍｏｒｆｏｌｉｕｍまたはＨｉｂｉｓｃｕｓ ｓａｂｄａｒｉｆｆａの葉の抽出物を茶の製造のために使用することができ、バラ種を香料などの製造のために使用することができる。

他の局面において、本願発明は、上記植物の製造方法であって、以下の工程：
（ａ）アグロバクテリウムリゾゲネスのＲｉプラスミドで野生型植物の組織を形質転換すること、
（ｂ）形質転換された組織が毛状表現型を有する根を発達させることを可能にすること、
（ｃ）工程（ｂ）の毛状表現型を有する根の中から、毛状表現型が工程（ｂ）において得られた根において観察される最大根毛長の最大半分の最大根毛長を示す根を選択すること；
（ｄ）再生培地上で選択された根を成長させ、形質転換された根付いた小植物が該選択された根から生み出すことを可能にすること；
（ｅ）該形質転換された根付いた小植物を対応する野生型植物のものの２５－７５％の高さを有する成熟な形質転換された母植物に成長させること
を含む、植物の製造方法に関する。

驚くべきことに、アグロバクテリウムリゾゲネスのＲｉプラスミドに由来する１から５の遺伝子で形質転換された植物が、上記の不利な点を有することなく、または有意に低い程度でこの方法で得ることができることが見出された。本願明細書において、「アグロバクテリウムリゾゲネスに由来する遺伝子」または「Ｒｉ遺伝子」なるフレーズは、上記定義のとおりであり、特に「アグロバクテリウムリゾゲネスのＲｉプラスミドに由来する遺伝子」、特にそれぞれ配列番号１および２に示されるＲｉプラスミドのＴ_Ｌ－およびＴ_Ｒ－ＤＮＡに由来する遺伝子を意味することが意図される。

工程（ａ）において、野生型植物の葉片のような組織が、アグロバクテリウムリゾゲネスのＲｉプラスミドで形質転換され、トランスフェクトされた植物細胞のゲノムにおいてＲｉプラスミドに由来する１つ以上の遺伝子の取り込みを引き起こす。上記のように、当業者は、Ｒｉプラスミドに由来する１つ以上の遺伝子の形質転換された植物細胞において発現をもたらすように植物においてＲｉプラスミドを導入する方法を知っている。植物は、例えばアグロバクテリウムリゾゲネスの培養物を植物またはその一部の新鮮な創傷と接触させることによって、例えばアグロバクテリウムリゾゲネスでの感染によって得ることができる。しかしながら、公知の遺伝子操作技術によって、Ｒｉプラスミドを植物細胞に導入し、植物細胞によって、Ｒｉプラスミドに由来する遺伝子またはその２つ以上の組合せ、例えば１つ以上のｒｏｌ遺伝子、その２つ以上の組合せ、または全４つのｒｏｌ遺伝子の発現を引き起こすこともできる。しかしながら、植物または植物細胞のアグロバクテリウムリゾゲネスでの感染は、非常に効率的であり、便利であることが証明されている。当業者は、想定される植物をアグロバクテリウムリゾゲネスでトランスフェクトする方法、および形質転換された植物を生産する方法について適切な技術を知っている。

後の工程において、かくして形質転換された組織は、根を発達させ、次にＡ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ形質転換された植物組織に対してよく知られた表現型選択マーカーである毛状根表現型で１つ以上の根を選択する特定の方法を行う。しかしながら、選択が根に最も多くおよび最も長い毛を有する最も多くの毛状形質転換体について作成される当該技術と対照的に、本願発明者は、驚くべきことに、工程（ｃ）に定義されるより少ない毛状根について選択することによって、中間高さを有する植物が矮性成長を示す植物の代わりに優先的に得られることを見いだした。驚くべきことに、本願発明のこの態様によって選択されるとき、より少ない毛状根が、Ｒｉプラスミドに由来する遺伝子のより少ないコピーを有する植物によって生産されることを見いだした。正常な形質転換事象において、形質転換体は、Ｒｉプラスミドに由来する遺伝子の１０個を超えるコピーを含む。毛の長さが最大の長さを有するものの最大半分である毛状根を有する組織部を選択することによって、想定される形質転換体が見られる。最大の毛の長さを有するものは、Ｒｉ遺伝子の１０個を超えるコピーを含む。

選択後、選択されたより少ない毛状根は、形質転換された根付いた小植物がそこから生み出すことを可能にするように再生培地上で成長させ、次に成熟まで成長させることができる。かかる成熟な形質転換された母植物は、１～５コピーのＲｉプラスミドに由来する遺伝子を含み、対応する野生型植物、例えば同じ種のコントロール植物の２５－７５％の想定される中間高さを有し、上記のとおり、記載されている方法の同じ工程を実施することにより、形質転換する工程に付されることなく同じ組織材料から生み出すことを可能にする。しかしながら、同じ種の別の野生型植物もまた、正常な野生型植物の高さとして、および該高さの指標として使用することができる。

魅力的な態様において、選択工程（ｃ）はまた、工程（ｂ）の毛状表現型を有する根の中から、毛状表現型が工程（ｂ）において得られた根において観察される長さ当たりの最大枝数の最大半分である長さ当たりの枝数を示す根を選択することを含む。根毛長に加えて、分枝はまた、ほんの１～５コピーのＲｉ遺伝子を含む形質転換体に対する選択基準であり、この選択基準は毛の長さの上記基準またはそれの代わりとなるものと共に使用することができる。好ましくは、両方の基準が考慮される。毛状根の長さ当たりの枝数が非常に分岐した根を有する形質転換体の半分であるとき、かかる形質転換体は、Ｒｉ遺伝子の想定されるより低いコピー数を含む。

選択する間、形質転換されていない組織部から成長させるコントロール植物の根の発達を確認することが有利である。

上記方法によって得られた発明者の知見に基づいて、別の方法を、特定の選択工程なく、得られる形質転換された母植物の交配および戻し交配によって形質転換体のゲノムのうちＲｉ遺伝子を「薄める」ことによって発達させることができる。その場合、形質転換された母植物は、形質転換後に１０コピー以上のＲｉ遺伝子を有し、しばしば矮性成長および上述したような他の不利な点を示す。想定される中間高さが得られるまで形質転換された母植物の子孫を選択することによって、植物はゲノムにおいて１～５コピーのＲｉ遺伝子を有する。この目的のため、上記のような植物の第２の製造方法は、以下の工程：
（ａ）アグロバクテリウムリゾゲネスのＲｉプラスミドで野生型植物の組織を形質転換すること、
（ｂ）形質転換された組織が毛状表現型を有する根を発達させることを可能にすること、
（ｃ）毛状根表現型を有する推定的に形質転換された根を選択すること；
（ｄ）再生培地上で選択された根を成長させ、形質転換された根付いた小植物が該選択された根から生み出すことを可能にすること；
（ｅ）該形質転換された根付いた小植物を成熟な形質転換された母植物に成長させること；
（ｆ）工程（ｅ）の成熟な形質転換された母植物と比較して増加した高さおよび工程（ａ）の野生型植物のものと比較して低下した高さを有する子孫について選択しながら、交配、戻し交配および自家交配によって工程（ｅ）の成熟な形質転換された母植物の子孫を生み出すこと、
（ｇ）子孫が工程（ａ）の対応する野生型植物のものの２５－７５％の高さを有する成熟植物をもたらすまで、工程（ｆ）を繰り返すこと
を含む、方法を提供する。

この態様において、工程（ｃ）は、より詳細に毛の長さまたは枝数を調査する必要なしに、毛状根の存在について単に選択する。その代わりに、おそらく矮性成長習性（すなわち対応する野生型植物の２０％未満の長さを有する）を示す工程（ｅ）の成熟な形質転換された母植物が、１つ以上の交配または戻し交配または自家交配工程に付され、想定される中間高さの子孫をもたらすさらなる工程（ｆ）が加えられる。このようなさらなる交配によって、後の世代の植物において、さらなる機能を導入することができ、または現在の機能をさらに改善または除去することができる。子孫のハイブリッドをさらに交配および選択することができ、これは想定される結果に達するために複数回繰り返すことができる。

好ましくは、上記方法において、工程（ｅ）または、存在するとき、工程（ｆ）および／または（ｇ）は、対応する野生型植物のものの３０－７０％、好ましくは４０－６０％の植物の高さについて選択することを含む。第２の方法において、想定される高さの植物が工程（ｅ）中ですでに得られるとき、それらの植物の選択は、重要性の低いまたは余分な工程（ｆ）および（ｇ）を行ってもよい。工程（ｆ）において、想定される高さの植物が得られるとき同様である。その場合、工程（ｇ）は余分である。

好ましくは、工程（ｅ）または、存在するとき、工程（ｆ）および／または（ｇ）は、形質転換されていないコントロール植物と比較して、８０％以上、好ましくは９０％以上の花数を有する、および／または４日以上、好ましくは２日間以上開花時間遅延を有さない、植物または子孫について選択することをさらに含む。１～５コピーのＲｉプラスミドに由来する１つ以上の遺伝子を含むとき、かかる植物は生み出され、選択することができることを見いだした。

魅力的な態様において、工程（ａ）は、Ｒｉプラスミドを含むＡ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓを植物または植物部、例えば葉または葉部と共培養し、Ａ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓがＲｉプラスミドを該植物または植物部に送達することを可能にすることを含む。上記のように、Ｒｉプラスミドは任意の公知の形質転換技術によって植物細胞において導入することができ、例えば植物または植物部を創傷することを含む、Ａ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓを植物または植物部と共培養することが好ましい。

Ａ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓを植物または植物部と共培養することによる記載されている方法において、アグロバクテリウムリゾゲネスのＲｉプラスミドに由来する１つ以上の遺伝子は、植物細胞のゲノムに組み込まれ、好ましくは特に上記のとおりｒｏｌＡ、ｒｏｌＢ、ｒｏｌＣおよびｒｏｌＤから選択される１つ以上のｒｏｌ遺伝子を含む。特に、ａｕｘ１、ａｕｘ２およびＲｉプラスミド上で同定される任意のオープンリーディングフレームもまた、例えば植物ゲノムにおいてＲｉプラスミドの完全な組み込みの結果として、含まれる。

好ましい態様において、工程（ａ）は、遺伝子操作技術を適用する必要なく天然の形質転換方法であるアグロバクテリウムリゾゲネスでの感染を含む。あらゆる方法論が植物をＡ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓのＲｉプラスミドで形質転換するために使用することができるが、本願は、特に上記属のいずれかに属する形質転換された植物を生み出すための「天然」および「非天然」方法論の両方を提供する。例えば、以下に議論されるように、出願人は、ｒｏｌ遺伝子を含む天然遺伝子を植物細胞に移動するために野生型Ａ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓを利用した。これはＡ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓが外来ＤＮＡ（すなわちＡ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓまたは宿主細胞のＤＮＡに属さない）の存在なしで、天然遺伝子を植物細胞に移動する「天然」系であるが、アグロバクテリウムリゾゲネスで形質転換されたコンパクトな植物がより緊密な構造を形成するコンパクトな葉による真菌感染の危険性の増加ならびに近隣の植物からの競争力のような障害に直面するため、実際は成功裏におこる可能性が低い。これとは別に、形質転換された植物が実際はＲｉプラスミドの多くのコピーを含むため、これは、矮性成長だけでなく、開花の遅延ももたらし、野生型植物との他家受粉を不可能にする。

アグロバクテリウムリゾゲネスは、好ましくは野生型、例えば株Ａ４（ＡＴＣＣ４３０５７）であり、すなわち遺伝子操作の手段によって導入されている遺伝物質を含まない。有利には、野生型アグロバクテリウムリゾゲネスを使用することは、ＧＭＯ（遺伝的に修飾された生物体）ではないと見なされる形質転換体をもたらす。

好ましくは、上記方法は、Ｒｉプラスミドのコピーまたはその１つ以上の遺伝子の数の減少を有する植物について選択することを可能にする、アグロバクテリウムリゾゲネスのＲｉプラスミドに由来する１つ以上の遺伝子のコピー数をアッセイすることを含む。好ましくは、このようなアッセイ後、選択は、１～５コピーのＲｉプラスミドまたはその１つ以上の遺伝子を有する植物について行われる。可能なアッセイは、以下の実施例において説明されるが、分子生物学の当業者は、あらゆる適当なおよび適用できるアッセイを知っている。

非常に魅力的な局面において、本願発明は、本願明細書に記載されている植物またはその子孫に由来する植物部、抽出物、化合物またはそれらの２以上の混合物を含む産物に関する。該産物は、例えば、果実、塊茎、根、葉、食用抽出物、化粧品、医薬品、香料からなる群から選択することができる。しかしながら、かかる産物はこれらに限定されない。例えばコショウまたはトマトのような実またはジャガイモのような塊茎は、アグロバクテリウムリゾゲネスで形質転換されていない植物、例えばｒｏｌ以外で形質転換された植物からより増強された味を有する。該産物は、ｒｏｌ遺伝子またはその部分をコードする遺伝物質の存在により同定することができる。該存在は、例えば本願明細書に例示される、例えばＰＣＲ技術によって好都合に同定することができる。

以下の図および実施例は例示であり、本願を限定しない。もちろん、意図された精神および範囲内にとどまる限り多くの変形および修飾を行うことができることが理解される。

図１は、例示的なアグロピン株由来のＡ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ Ｒｉ－プラスミドを描写する。Ｔ－ＤＮＡはＴ_ＬおよびＴ_Ｒの２つのセグメントを含み、これらは１５Ｋｂ配列によって分離されており統合されていない。Ｔ_Ｌ－ＤＮＡは、４つの根座位遺伝子が存在する１８オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。Ｔ_Ｒ－ＤＮＡは、ａｕｘ１およびａｕｘ２を含むいくつかの遺伝子を含む。

図２、３および４は、アグロバクテリウムリゾゲネスに曝露された、それぞれＳｏｌａｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ、マンデビラ(Dipladenia)およびカランコエ種間ハイブリッド２００６－０１９９（Ｋ． ｌａｃｉｎｉａｔａ ｘ Ｋ． ｂｌｏｓｓｆｅｌｄｉａｎａ ハイブリッド）の葉片の根を示す。Ａ：形質転換されていないコントロール、Ｂ：形質転換された毛、Ｃ：形質転換された少ない毛。

図５Ａは、長日条件下で（０２：００から１７：００まで光）栄養繁殖の開始後１５週での、アグロバクテリウムリゾゲネスで形質転換された、図４Ｃのより少ない毛状根から再生された、カランコエ種間ハイブリッド２００６－０１９９野生型（左）およびカランコエ種間ハイブリッド４００６－０１９９Ｓ２を示す。植物の挿し木後３週間は、開花誘導のため短日条件（０７：００から１７：００まで光）に移した。図５Ｂは、長日条件下で（０２：００から１７：００まで光）栄養繁殖の開始後１５週での、図４Ｂの根から再生された、カランコエ種間ハイブリッド２００６－０１９９野生型（左）および毛状型のアグロバクテリウムリゾゲネスで形質転換されたカランコエ種間ハイブリッド４００６－０１９９Ｋ２０．１（右側３植物）を示す。植物の挿し木後３週間は、開花誘導のため短日条件（０７：００から１７：００まで光）に移した。

図６は、Ｋａｌａｎｃｈｏｅ ｐｉｎｎａｔａ ＡＡＥ、ｒｏｌ形質転換された植物（左）およびコントロール野生型植物（右）を示す。中間高さの植物（中央、Ｋ．ｐｉｎｎａｔａ ｒｏｌ－２ Ｐｅｍｂａ）は、左のｒｏｌ形質転換された植物の交配および戻し交配によって得られた。

図７は、バラ、ｒｏｌ形質転換された植物（左および中央）およびコントロール野生型植物（右）を示す。中間高さを有する植物（中央）は少ない毛状根についての選択から生じる。

図８は、シオン、ｒｏｌ形質転換された植物（左および中央）およびコントロール野生型植物（右）を示す。中間高さを有する植物（中央）は少ない毛状根についての選択から生じる。

植物原料
Ｋａｌａｎｃｈｏｅ ｐｉｎｎａｔａ、カランコエ種間ハイブリッド２００６－０１９９（Ｋｎｕｄ Ｊｅｐｓｅｎ Ａ／Ｓ、Ｈｉｎｎｅｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ ａｎｄ ＡｇｒｏＴｅｃｈ ａ／ｓ、Ｔａｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）インビボ植物を、日中および夜間２０℃の温度、１６時間日長および２６０μｍｏｌフォトンｍ^－２ｓ^－１の光強度で温室において培養した。インビトロ植物を、日中２５℃および夜間２２℃の温度、１３時間日長および７５μｍｏｌフォトンｍ^－２ｓ^－１の光強度で成長チャンバーにおいて培養した。他の種の植物は異なる供給者から購入した。

それぞれの種／ハイブリッドに対する葉外植片をコントロール実験のために使用した。インビボ材料由来の葉を、７０％ ＥｔＯＨで１分、次に２０分１％ ＮａＯＣｌ（ＶＷＲ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）および０，０３％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｍｅｒｃｋ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＵＳＡ）で滅菌し、滅菌水で３回洗浄し、切除まで保存した。

細菌株
アグロバクテリウムリゾゲネス株ＡＴＣＣ４３０５７（Ａ４）（Ｄｒ． Ｍａｒｇａｒｅｔａ Ｗｅｌａｎｄｅｒ、Ｓｗｅｄｉｓｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｗｅｄｅｎにより親切に提供された）を、毛状根の誘導のために使用した。該株を液体ＭＹＡ培地（Ｔｅｐｆｅｒ ａｎｄ Ｃａｓｓｅｄｅｌｂａｒｔ （１９８７） Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｓｃｉ． ４、ｐｐ． ２４－２８）で培養した。１ｍｌの細菌性グリセロールストック（－８０℃に保った）を５０ｍＬ Ｆａｌｃｏｎチューブ中で１０ｍＬ ＭＹＡに希釈し、２７℃で８時間インキュベートし、２６０ｒｐｍで振とうした。溶液を２５０ｍＬフラスコ中で１００ｍＬ ＭＹＡでさらに希釈し、２７℃で暗黒下で２４時間２６０ｒｐｍで振とうした。ＯＤ_６００＝０，４－０，６をＮａｎｏｄｒｏｐ １０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ、ＵＳＡ）で測定した。

形質転換
滅菌した葉またはインビトロ植物を最小１ｃｍｘ１ｃｍ断片に切除し、全ての外植片が準備できるまで滅菌水に保存した。水を外植片から捨て、Ａ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ－懸濁液を加え、３０分間全ての外植片を覆った。３０分後、Ａ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ－懸濁液を捨て、薄片を、表面上にＡ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ懸濁液の薄い層で、選択なしで暗黒下で２４時間共培養プレートに移した。外植片を暗黒下で２２℃の温度で実験室で培養した。共培養後、引き裂かれた滅菌ろ紙の断片で外植片を乾燥させることによって、外植片を０－培地（選択培地）に移した。切除された葉の両側で葉表面を可能な限り乾燥させた。根まで暗黒下に置かれた外植片を、再生培地に移すのに十分に発達させた。３セッション(session)にわたって材料を形質転換した。形質転換をＳｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（図２参照）、マンデビラ(Dipladenia)（図３参照）、カランコエ種間ハイブリッド２００６－０１９９（Ｋ． ｌａｃｉｎｉａｔａ ｘ Ｋ． ｂｌｏｓｓｆｅｌｄｉａｎａハイブリッド）（図４－５参照）、Ｋａｌａｎｃｈｏｅ ｐｉｎｎａｔａ（図６参照）、Ｒｏｓａ ｈｙｂｒｉｄａ（図７参照）およびＡｓｔｅｒ ｎｏｖｏ－ｂｅｌｇｉｉ（図８参照）で行った。それぞれの種において、コントロールおよび推定形質転換体を同じ日に行った。

基本培地
使用された全ての培地のバックグラウンドとして使用された基本培地は、２，２ｇ Ｌ^－１の濃度で１／２ ｘ ＭＳ（Ｓｉｇｍａ Ｍ０４０４）（ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇマクロ及びマイクロエレメントからなる）（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ、１９６２）、３０ｇ Ｌ^－１ スクロース（ｔａｂｌｅ ｓｕｇａｒ）、７ｇ Ｌ^－１ ｂａｃｔｏ ａｇａｒおよび０，５０ｇ Ｌ^－１ ２－（Ｎ－モルホリノ）－エタンスルホン酸（ＭＥＳ）（Ｄｕｃｈｅｆａ）であった。ｐＨは１Ｍ ＫＯＨによって６．３に調整され、培地は１２１℃および１０３，５ｋＰａでオートクレーブ処理された。

共培養培地
外植片およびＡ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの共培養のために使用された共培養培地は、３０μｇ ｍｌ^－１ アセトシリンゴン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を有する基本培地からなった。

選択培地
選択培地は、推定的に形質転換された外植片およびコントロールの根形成のために使用されたホルモン非含有培地であった。フィルター滅菌された抗生物質をオートクレーブ後に選択培地に基本培地に加えた。選択培地は、１００ｍｇ Ｌ^－１の濃度においてチメンチン（ＴＩＭ）を有する基本培地１／２ ｘ ＭＳ培地からなった。好ましくは、選択培地は、アルギニン、好ましくは０．５ｍＭのアルギニンを含んだ。

再生培地
ホルモンＮ－（２－クロロ－４－ピリジル）－Ｎ－フェニルウレア（ＣＰＰＵ）を含む再生培地を、推定的に形質転換された根クラスター上の根粒の再生のために使用した。フィルター滅菌されたホルモンおよび抗生物質をオートクレーブ後に再生培地に加えた。ＣＰＰＵ－培地は、１．５μｇ Ｌ^－１ ＣＰＰＵを１００ｍｇ Ｌ^－１の濃度においてＴＩＭと共に有する基本１／２ ｘ ＭＳ培地を含んだ。

共培養
全ての処理において、外植片を２４時間共培養した。共培養後、外植片を滅菌濾紙上に吸い取り、引き裂かれた滅菌ろ紙の断片で完全に乾燥させた。コントロールおよび推定的に形質転換された外植片を選択培地に移した。

植物選択
共培養の２４時間後に、それぞれのペトリ皿上に８つの外植片にて外植片を０－培地（選択培地）に移した。数週間後、根の数の増加および外植片の数の減少（ガラス化によって葉切片がガラス様になる、または感染のため）が処理中の特定のペトリ皿についてモニタリングされた。

植物再生
推定的に形質転換された外植片の根が１．５－２ｃｍの長さに発達したとき、それらをＣＰＰＵ－培地に外植片の一部でクラスターにおいて移した。移された根クラスターを、環境チャンバー（Ｃｅｌｌｔｈｅｒｍ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）において１１時間日光および２０／１８℃の日中／夜間温度および４５－７０μｍｏｌ フォトンｍ^－２ｓ^－１の強度（Ｐｈｉｌｉｐｓ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）での棚状に置いた。Ａ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ処理された外植片を有する根クラスターのみを移した。ここで、根クラスターの数ならびに根から発達する根粒の数をモニタリングした。４つの種のいずれかについて３０日後に陽性発達が観察されなかったとき、根粒発達の計測を停止した。

コントロール植物
コントロール植物を形質転換体のように処理したが、細菌を含まない品種当たり２５より少ない数の外植片を含むＭＹＡ培地において植え付けた(inoculate)。コントロール実験植物は形質転換体と並行して行った。

植物成長条件
本願明細書に記載されている植物を、以下の表１および２に記載されている日長および温度にしたがって温室において成長させた。植物は、１０．５ｃｍまたは１３ｃｍの直径を有するポットにおいて生産された。挿し木を栄養（ｖｅｇ．）植物から採取し、品種、種、属およびポットサイズに依存して植栽後最初の３－８週間、成長させ、栄養維持させた。表１に記載されている植物を、植栽後４－９週間開花誘導条件に移した。植栽後１３－１９週の間に、品種、種 属、ポットサイズおよび時期、植物に依存して、生殖（ｇｅｎ．）段階に入り、開花したまたは開花しようとしている花を有する成熟であった。

自然光が１００μｍｏｌ／ｍ^２／ｓ未満であったとき、植物を７０μｍｏｌ フォトン ｍ^－２ｓ^－１ＳＯＮ－Ｔ光を補った自然光条件下で成長させた。コチョウランおよびバニラを除く全ての植物を、泥炭ベースの土壌混合物において成長させ、１００万当たり２００成分（ｐｐｍ）窒素、２００ｐｐｍカリウム、４０ｐｐｍリン、２００ｐｐｍカルシウム、４０ｐｐｍマグネシウム、６０ｐｐｍ硫黄(sulphate)、１ｐｐｍ鉄、０．６ｐｐｍマンガン、０．１ｐｐｍ銅、０．１ｐｐｍ亜鉛、０．３ｐｐｍホウ素、０．０３ｐｐｍモリブデンを含む溶液を入れた(water)。コチョウランおよびバニラを除く全ての植物において、光強度が４５０μｍｏｌ フォトン ｍ^－２ｓ^－１より高く、湿度が６０－８０％相対湿度間の範囲で維持されたとき、カーテンを用いた陰影が有効であった。

コチョウランおよびバニラを、樹皮ベースの土壌混合物において成長させ、１００万当たり５０成分（ｐｐｍ）窒素、５０ｐｐｍカリウム、１０ｐｐｍリン、５０ｐｐｍカルシウム、１０ｐｐｍマグネシウム、１５ｐｐｍ硫黄(sulphate)、０．２ｐｐｍ鉄、０．１ｐｐｍマンガン、０．０１ｐｐｍ銅、０．０１ｐｐｍ亜鉛、０．０５ｐｐｍホウ素、０．００５ｐｐｍモリブデンを含む溶液を入れた(water)。

バニラおよびコチョウラン植物を自然光条件下で成長させた。光強度が２５０μｍｏｌ フォトン ｍ^－２ｓ^－１より高く、湿度が８０－９０％相対湿度間の範囲で維持されたとき、カーテンを用いた陰影が有効であった。

表１：成長条件

表２：バニラおよびコチョウラン植物に対する成長条件

分子分析
サンプル毎に６つの独立したＤＮＡ単離を、Ｎｕｃｌｅｏｍａｇ ９６ 植物 キットの溶解バッファー ＭＣ１が１％ ＰＶＰで補われている修飾で、供給者の推奨にしたがって、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘ（ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）においてＮｕｃｌｅｏｍａｇ ９６ 植物、（http://www.mn-net.com/）で行った。

ｑＰＣＲ増幅を以下のプログラムにしたがってＤＮＡサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）において行った：２分間９２℃、次に２０秒９２℃、２０秒５９℃および２０秒７２℃の４５サイクル。ｒｏｌＣおよびＲｅｆ１に対する反応について、供給者の指示にしたがってＳＡＬＳＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用することによってＬＣｇｒｅｅｎ＋で個々にどこか標識化された、表１（ＢｉｏＦｉｒｅ Ｄｅｆｅｎｓｅ、http://biofiredefense.com/； ＭＲＣ－Ｈｏｌｌａｎｄ、www.mlpa.com）。

表３：使用されたプライマー

ΔＣ_ｔの使用は、２つの反応が同様の効率を有し、それらは別々のウェルで行われたため、それらは独立した方法において進むと仮定する。相対的定量化は、

によって行われ、比は

によって計算され、コピー数は、４倍体植物の一次形質転換体の分析された植物に基づいて計算され、そのために比を４倍してコピー数を得る。

一次４倍体形質転換体のコピー数を決定するために、内部カランコエ参照としてＲｅｆ１を有するＡ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓのｒｏｌＣのｑＰＣＲを、形質転換されていないコントロール植物２００６－０１９９（親系統としてＫ．ｌａｃｉｎｉａｔａおよびＫ．ｂｌｏｓｓｆｅｌｄｉａｎａを有する種間ハイブリッド）、該コントロール植物の３つの独立した一次形質転換体（すなわち本願明細書に記載されているとおり根形態に基づくさらなる交配なしで形質転換体の選択によって得られる）４００６－０１９９Ｋ２０．１、４００６－０１１９Ｓ１１および４００６－０１９９Ｓ２、ならびに上記Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ、２００８によって記載されているＲｉ系統 ３３１において行った。該形質転換体は、これらの成長習性、表１と異なる。予想されるように２００６－０１９９について、ｒｏｌＣを検出することができず、したがって比またはコピー数を決定することができず、３つのＡ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ形質転換体の場合、参照遺伝子Ｒｅｆ１と比較してコピー数において明らかな違いがある。中間高さを有する準コンパクトな形質転換体４００６－０１９９Ｓ１１および４００６－０１９９Ｓ２は、Ｒｅｆ１と比較してｒｏｌＣの１つのコピーを有し、矮性成長を示すコンパクトな形質転換体４００６－０１９９Ｋ２０．１は、１１コピーのｒｏｌＣを有し、Ｒｉ系統 ３３１は中間高さを示した、表４参照。形質転換体４００６－０１９９Ｓ１１および４００６－０１９９Ｓ２はコントロールと同様の花数を示し、葉にしわがなかったが、４００６－０１９９Ｋ２０．１およびＲｉ系統 ３３１の両方はコントロールと比較してしわの寄った葉および約５０％減少した花数を示したことも観察された。Ｋ．ｐｉｎｎａｔａ ＡＡＥは、形質転換されていない野生型コントロールであり、Ｋ．ｐｉｎｎａｔａ ＡＡＥ ｒｏｌは、野生型と比較して矮性、しわの寄った葉、開花の遅延および約５０％の開花数を示し、１０コピーのｒｏｌＣを有するｒｏｌ形質転換されたＫ．ｐｉｎｎａｔａ ＡＡＥであった。Ｋ．ｐｉｎｎａｔａ ＡＡＥ－ｒｏｌを野生型ＡＡＥと戻し交配し、中間高さを有するが、葉にしわがないＫ．ｐｉｎｎａｔａ Ｒｏｌ－２ Ｐｅｍｂａのようないくつかの系統を引き起こし、花数および花序は、形質転換されていないＫ．ｐｉｎｎａｔａ ＡＡＥとほぼ同じであった。Ｋ．ｐｉｎｎａｔａ Ｒｏｌ－２ ＰｅｍｂａにおけるｒｏｌＣコピー数は２であると決定された。別の実験において、Ｋ．ｐｉｎｎａｔａ ＡＡＥをｒｏｌで形質転換し、一次形質転換体において、選択は、本願明細書に記載されている根形態、すなわち形質転換体中で観察される最大根毛長の最大半分である選択された形質転換体の根毛長について行われた。Ｋ．ｐｉｎｎａｔａ Ｋ２ ＡＡＥおよびＫ．ｐｉｎｎａｔａ Ｐｉｎ５ Ａ１５ ＡＡＥは、このようにして得られ、Ｋ．ｐｉｎｎａｔａ Ｒｏｌ－２ Ｐｅｍｂａと類似の表現型を有し、それぞれ２および３のｒｏｌＣコピーを有した。

同様の結果が処理された他の植物属について得られ、選択も上記のように根形態に基づいて行われた、表４参照。

表４：コントロールと比較しての成長習性およびｒｏｌＣのコピー数

^ｃコントロール野生型
^＊ｒｏｌ形質転換された
^＊＊ｒｏｌ形質転換され、根形態について選択された
^＊＊＊ｒｏｌ形質転換され、ｗｔと戻し交配された

統計分析
Ｋ． ｐｉｎｎａｔａは形質転換の参照として機能した。同様に、コントロール外植片は５つの複製を有し、種／ハイブリッド当たり合計２５で種／ハイブリッド当たり５つの外植片であった。外植片は感染のために実験から取り除かれ得るため、外植片の数は時間とともに変化した。したがって、外植片の総数をモニタリングし、外植片の数と根形成とのより良い比を得た。数が増加するため、根の数をモニタリングした。ペトリ皿当たりの生存外植片の平均およびペトリ皿当たりの根の平均を計算した。２つの平均を使用して、各ペトリ皿に対する比を計算し、外植片当たりの根の数を記載した。

傾きを使用しておよび線形回帰でＶ_ｍａｘ（根の発達／日）をモデル化した。標準偏差（ＳＤ）およびｓｔｕｄｅｎｔ ｔ－検定（ｔ－検定）を各観察についてＥｘｃｅｌにおいて計算し、個々の種／ハイブリッド内での変数を検証した。ＡＮＯＶＡ検定をＲで行った（Ｒは統計的計算のためのフリーソフトウェア環境である）。

結果
実験は、異なる種およびハイブリッドおよびインビボおよびインビトロからの単純な材料について形質転換効率を試験するためにアグロバクテリウムリゾゲネスでの自然形質転換を含んだ。種Ｓｔｒｅｌｉｔｚｉａ ｒｅｇｉｎａｅ、Ａｓｔｅｒ ｎｏｖｉ－ｂｅｌｇｉｉ、Ａｓｔｅｒ ｄｕｍｏｓｕｓ、Ｃｈｒｙｓａｎｔｅｍｕｍ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓａｎｔｅｍｕｍ ｘ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ （ｓｙｎ． Ｃ． ｘ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ、例えばＤｅｎｄｒａｎｔｈｅｍａハイブリッド、またはＣｈｒｙｓａｎｔｅｍｕｍ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍおよび他のキク種、例えばＣｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ間のハイブリッド、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｍｉｌｉｉ、Ｂｏｕｖａｒｄｉａ ｌｏｎｇｉｆｌｏｒａ、Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｒｏｓａ－ｓｉｎｅｎｓｉｓ、Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｓｃｈｉｚｏｐｅｔａｌｕｓ、Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｓａｂｄａｒｉｆｆａ、Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｓｙｒｉａｃｕｓ、Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｔｒｉｏｎｕｍ、Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｃａｎｎａｂｉｎｕｓ、Ｍａｎｄｅｖｉｌｌａ ｘ ａｍａｂｉｌｉｓ、Ｍａｎｄｅｖｉｌｌａ ｓａｎｄｅｒｉ、Ｍａｎｄｅｖｉｌｌａ ｓｐｌｅｎｄｅｎｓ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｘ ｓａｎｄｅｒｒａｅ Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ ａｍａｂｉｌｉｓ、Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ ａｍｂｏｉｎｅｎｓｉｓ、Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ ａｐｈｒｏｄｉｔｅ、Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔａ、Ｖａｎｉｌｌａ ｐｌａｎｉｆｏｌｉａ、Ｏｃｉｍｕｍ ｂａｓｉｌｉｃｕｍ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｂａｃｃａｔｕｍ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｃｈｉｎｅｎｓｅ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ、Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔａｓ、Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ、Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ、Ｓｏｌａｎｕｍ ｎｉｃｏｔｉａｎａ、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐａｌｌｉｄａ、Ｒｏｓａ ｈｙｂｒｉｄａ、Ｒｏｓａ ｃａｎｉｎａ、Ｒｏｓａ ｓｐｉｎｏｓｉｓｓｉｍａ、Ｒｏｓａ ｄａｍａｓｃｅｎａ 「ｔｒｉｇｉｎｔｉｐｅｔａｌａ」、Ｒｏｓａ ｃｅｎｔｉｆｏｌｉａ、Ｓｃｈｉｓａｎｄｒａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ｓｃｈｉｓａｎｄｒａ ｇｌａｂｒａ、Ｓｃｈｉｓａｎｄｒａ ｒｕｂｒｉｆｌｏｒａ、Ｒｈｏｄｉｏｌａ ｒｏｓｅａ、Ｋａｌａｎｃｈｏｅ ｐｉｎｎａｔａ、Ｋａｌａｎｃｈｏｅ ｍａｒｍｏｒａｔａ、Ｋａｌａｎｃｈｏｅ ｇａｓｔｏｎｉｓ－ｂｏｎｎｉｅｒｉ、Ｋａｌａｎｃｈｏｅ ｄｉｘｏｎｉａｎａ、Ｋａｌａｎｃｈｏｅ ｈｕｍｉｌｉｓ、Ｋａｌａｎｃｈｏｅ ｌａｃｉｎｉａｔａに属する植物は、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、（２００８、上記）によってＫ． ｂｌｏｓｓｆｅｌｄｉａｎａ 「Ｍｏｌｌｙ」に最適であるか、または各種の最適化のためにわずかに変更された条件で形質転換された。Ｋ． ｂｌｏｓｓｆｅｌｄｉａｎａ 「Ｍｏｌｌｙ」は、品種が形質転換系のバックグラウンドを形成したため、形質転換体内でコントロールとして使用された。

根の誘導および成長は、各処理においてペトリ皿当たりの根の総数としてモニタリングした。いくつかの外植片が感染によって除去されたため、時間とともに、外植片の総数もモニタリングした。これは、各植物系において外植片当たりの根の数を計算するとき、より不偏の評価を得るために行われた。

０－培地での根の発達
根形成は以下の種に起こることが見いだされた；Ｓｔｒｅｌｉｔｚｉａ ｒｅｇｉｎａｅ、Ａｓｔｅｒ ｎｏｖｉ－ｂｅｌｇｉｉ、Ａｓｔｅｒ ｄｕｍｏｓｕｓ、Ｃｈｒｙｓａｎｔｅｍｕｍ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓａｎｔｅｍｕｍ ｘ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ （ｓｙｎ． Ｃ． ｘ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ、例えばＤｅｎｄｒａｎｔｈｅｍａハイブリッド、またはＣｈｒｙｓａｎｔｅｍｕｍ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍおよび他のキク種、例えばＣｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ間のハイブリッド、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｍｉｌｉｉ、Ｂｏｕｖａｒｄｉａ ｌｏｎｇｉｆｌｏｒａ、Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｒｏｓａ－ｓｉｎｅｎｓｉｓ、Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｓｃｈｉｚｏｐｅｔａｌｕｓ、Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｓａｂｄａｒｉｆｆａ、Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｓｙｒｉａｃｕｓ、Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｔｒｉｏｎｕｍ、Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｃａｎｎａｂｉｎｕｓ、Ｍａｎｄｅｖｉｌｌａ ｘａｍａｂｉｌｉｓ、Ｍａｎｄｅｖｉｌｌａ ｓａｎｄｅｒｉ、Ｍａｎｄｅｖｉｌｌａ ｓｐｌｅｎｄｅｎｓ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｘ ｓａｎｄｅｒｒａｅ、Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ ａｍａｂｉｌｉｓ、Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ ａｍｂｏｉｎｅｎｓｉｓ、Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ ａｐｈｒｏｄｉｔｅ、Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔａ、Ｖａｎｉｌｌａ ｐｌａｎｉｆｏｌｉａ、Ｏｃｉｍｕｍ ｂａｓｉｌｉｃｕｍ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｂａｃｃａｔｕｍ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｃｈｉｎｅｎｓｅ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ、Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔａｓ、Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ、Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ、Ｓｏｌａｎｕｍ ｎｉｃｏｔｉａｎａ、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐａｌｌｉｄａ、Ｒｏｓａ ｈｙｂｒｉｄａ、Ｒｏｓａ ｃａｎｉｎａ、Ｒｏｓａ ｓｐｉｎｏｓｉｓｓｉｍａ、Ｒｏｓａ ｄａｍａｓｃｅｎａ 「ｔｒｉｇｉｎｔｉｐｅｔａｌａ」、Ｒｏｓａ ｃｅｎｔｉｆｏｌｉａ、Ｓｃｈｉｓａｎｄｒａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ｓｃｈｉｓａｎｄｒａ ｇｌａｂｒａ、Ｓｃｈｉｓａｎｄｒａ ｒｕｂｒｉｆｌｏｒａ、Ｒｈｏｄｉｏｌａ ｒｏｓｅａ、Ｋａｌａｎｃｈｏｅ ｐｉｎｎａｔａ、Ｋａｌａｎｃｈｏｅ ｍａｒｍｏｒａｔａ、Ｋａｌａｎｃｈｏｅ ｇａｓｔｏｎｉｓ－ｂｏｎｎｉｅｒｉ、Ｋａｌａｎｃｈｏｅ ｄｉｘｏｎｉａｎａ、Ｋａｌａｎｃｈｏｅ ｈｕｍｉｌｉｓ、Ｋａｌａｎｃｈｏｅ ｌａｃｉｎｉａｔａ。根形成は、０－培地に移した後１００日以内に再生培地に移した。再生培地への移動の最初のときに、Ｓｔｒｅｌｉｔｚｉａ ｒｅｇｉｎａｅ、Ａｓｔｅｒ ｎｏｖｉ－ ｂｅｌｇｉｉ、Ａｓｔｅｒ ｄｕｍｏｓｕｓ、Ｃｈｒｙｓａｎｔｅｍｕｍ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓａｎｔｅｍｕｍ ｘ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ（ｓｙｎ． Ｃ． ｘ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ、例えばＤｅｎｄｒａｎｔｈｅｍａハイブリッド、またはＣｈｒｙｓａｎｔｅｍｕｍ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍおよび他のキク種、例えばＣｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ間のハイブリッド、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｍｉｌｉｉ、Ｂｏｕｖａｒｄｉａ ｌｏｎｇｉｆｌｏｒａ、Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｒｏｓａ－ｓｉｎｅｎｓｉｓ、Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｓｃｈｉｚｏｐｅｔａｌｕｓ、Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｓａｂｄａｒｉｆｆａ、Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｓｙｒｉａｃｕｓ、Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｔｒｉｏｎｕｍ、Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｃａｎｎａｂｉｎｕｓ、Ｍａｎｄｅｖｉｌｌａ ｘａｍａｂｉｌｉｓ、Ｍａｎｄｅｖｉｌｌａ ｓａｎｄｅｒｉ、Ｍａｎｄｅｖｉｌｌａ ｓｐｌｅｎｄｅｎｓ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｘ ｓａｎｄｅｒｒａｅ Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ ａｍａｂｉｌｉｓ、Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ ａｍｂｏｉｎｅｎｓｉｓ、Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ ａｐｈｒｏｄｉｔｅ、Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔａ、Ｖａｎｉｌｌａ ｐｌａｎｉｆｏｌｉａ、Ｏｃｉｍｕｍ ｂａｓｉｌｉｃｕｍ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｂａｃｃａｔｕｍ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｃｈｉｎｅｎｓｅ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ、Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔａｓ、Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ、Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ、Ｓｏｌａｎｕｍ ｎｉｃｏｔｉａｎａ、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐａｌｌｉｄａ、Ｒｏｓａ ｈｙｂｒｉｄａ、Ｒｏｓａ ｃａｎｉｎａ、Ｒｏｓａ ｓｐｉｎｏｓｉｓｓｉｍａ、Ｒｏｓａ ｄａｍａｓｃｅｎａ 「ｔｒｉｇｉｎｔｉｐｅｔａｌａ」、Ｒｏｓａ ｃｅｎｔｉｆｏｌｉａ、Ｓｃｈｉｓａｎｄｒａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ｓｃｈｉｓａｎｄｒａ ｇｌａｂｒａ、Ｓｃｈｉｓａｎｄｒａ ｒｕｂｒｉｆｌｏｒａ、Ｒｈｏｄｉｏｌａ ｒｏｓｅａ、Ｋａｌａｎｃｈｏｅ ｐｉｎｎａｔａ、Ｋａｌａｎｃｈｏｅ ｍａｒｍｏｒａｔａ、Ｋａｌａｎｃｈｏｅ ｇａｓｔｏｎｉｓ－ｂｏｎｎｉｅｒｉ、Ｋａｌａｎｃｈｏｅ ｄｉｘｏｎｉａｎａ、Ｋａｌａｎｃｈｏｅ ｈｕｍｉｌｉｓ、Ｋａｌａｎｃｈｏｅ ｌａｃｉｎｉａｔａからの推定形質転換体は、コントロールと有意に異なった。

本願発明によって形質転換された植物の可能な使用
カランコエ
例：
・Ｋａｌａｎｃｈｏｅ ｐｉｎｎａｔａ
・Ｋａｌａｎｃｈｏｅ ｍａｒｍｏｒａｔａ
・Ｋａｌａｎｃｈｏｅ ｇａｓｔｏｎｉｓ－ｂｏｎｎｉｅｒｉ種間ハイブリッド「Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｐａｒｆａｉｔ」
・Ｋａｌａｎｃｈｏｅ ｄｉｘｏｎｉａｎａ
・Ｋａｌａｎｃｈｏｅ ｈｕｍｉｌｉｓ
・Ｋａｌａｎｃｈｏｅ ｌａｃｉｎｉａｔａ種間ハイブリッド「Ａｍａｚｉｎｇ Ｐｉｎｋ」

現在の使用は、主に観賞植物としてである。植物の高さの低下および分枝の増加が、形質転換されていない植物と比較して観察された。強い抗腫瘍促進活性を示す二次代謝産物、例えばブリオフィリン(bryophillin)Ａの含有量も、この属／種を薬用植物として興味深いものにさせる。カランコエ、特にＫ ｐｉｎｎａｔａもまた、クマル酸、フェルラ酸、シリング酸、カフェ酸、クエン酸、イソクエン酸、リンゴ酸、Ｐ－ヒドロキシ安息香酸、ケルセチンとしてのフラボノイド、ケンペロール、ケルセチン－３－ジアラビノシド、ケンペロール(kaempferol)－３－グルコシド、ケルセチン－３－Ｌ－ラムノシド（rhamnosido）－Ｌ－アラビノフラノシド、η－ヘントリアコンタン(hentricontane)、η－トリトリアコンタン、シトステロールを含む。試験は、これらの化合物のいくつかがｒｏｌ形質転換された植物においてより高い濃度を示したことを示した。

これらの化合物のいずれかは、カランコエから単離され、ヒトまたは動物必要品としてまたはヒトまたは動物必要品において、例えば医薬として使用することができる。ｒｏｌ遺伝子を含むＡ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓのＲｉプラスミドで形質転換された植物は、コントロールと比較してより高い濃度を示した。

バラ
例：
・Ｒｏｓａ ｈｙｂｒｉｄａ
・Ｒｏｓａ ｃａｎｉｎａ
・Ｒｏｓａ ｓｐｉｎｏｓｉｓｓｉｍａ
・Ｒｏｓａ ｄａｍａｓｃｅｎａ 「Ｔｒｉｇｉｎｔｉｐｅｔａｌａ」
・Ｒｏｓａ ｃｅｎｔｉｆｏｌｉａ

現在の使用は、主に観賞植物としてである。植物の高さの低下および分枝の増加が、形質転換されていないコントロールと比較して観察され、ポット当たりのより少ない挿し木から十分な分枝を有することができる。バラは、香料産業においても重要な使用を有する。ヨーロッパにおいてＲｏｓａ ｄａｍａｓｃｅｎａ 「Ｔｒｉｇｉｎｔｉｐｅｔａｌａ」、世界の他の地域においてＲｏｓａ ｃｅｎｔｉｆｏｌｉａが特に使用される。主成分は、芳香性アルコールゲラニオールおよびｌ－シトロネロールおよびローズカンファーである。β－ダマスケノンも香りの重要な一因である。ｒｏｌ遺伝子を含むＡ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓのＲｉプラスミドで形質転換された植物は、コントロールと比較してより高い濃度を示した。

ゴクラクチョウカ
例：
・Ｓｔｒｅｌｉｔｚｉａ ｒｅｇｉｎａｅ

そのサイズのために切り花として主に使用される。植物の高さの有意な低下および生産時間（開花までの時間）においても有意な低下が、Ｒｉプラスミドを含むアグロバクテリウムリゾゲネスで形質転換された植物において観察される。

シオン
例：
・Ａｓｔｅｒ ｎｏｖｉ－ｂｅｌｇｉｉ
・Ａｓｔｅｒ ｄｕｍｏｓｕｓ

鉢植え植物および切り花として主に使用される。植物の高さの有意な低下および分枝の増加が、形質転換されていないコントロールと比較して観察され、ポット当たりのより少ない挿し木から十分な分枝を有することができる。

キク
例：
・Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ
・Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ
・Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｘ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ（Ｄｅｎｄｒａｎｔｈｅｍａハイブリッド）

鉢植え植物および切り花として主に使用されるが、キク茶（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ）における成分としても使用される。植物の高さの低下および分枝の増加が、形質転換体において観察され、鉢植え植物として該植物をしようするときポット当たりのより少ない挿し木から十分な分枝を有することができる。Ｒｉ形質転換されたＣｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍおよびＣｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍから作製された茶抽出物の風味は、形質転換されていない対応物よりもより増強されたようであった。

トウダイグサ
例：
・Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｍｉｌｉｉ
・Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ（Ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａ）

観賞植物として主に使用される。植物の高さの低下および分枝の増加が、形質転換されていない植物と比較して観察され、ポット当たりのより少ない挿し木から摘心なく十分な分枝を有することができる。

ハイビスカス
例
・Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｒｏｓａ－ｓｉｎｅｎｓｉｓ
・Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｓｃｈｉｚｏｐｅｔａｌｕｓ
・Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｓａｂｄａｒｉｆｆａ
・Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｓｙｒｉａｃｕｓ
・Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｔｒｉｏｎｕｍ
・Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｃａｎｎａｂｉｎｕｓ

温帯地域（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｓｙｒｉａｃｕｓ）および熱帯／亜熱帯（全ての種）において鉢植え植物または観賞用園芸植物として主に使用される。植物の高さの低下および分枝の増加が、形質転換体において観察され、ポット当たりのより少ない挿し木から摘心なく十分な分枝を有することができる。ハイビスカス花はアントシアニンを含み、ｒｏｌ遺伝子を含むＡ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓのＲｉプラスミドで形質転換された植物は、コントロールと比較してより高い濃度を示した。

マンデビラ(Dipladenia)／マンデビラ(Mandevilla)
例：
・Ｍａｎｄｅｖｉｌｌａ ｘａｍａｂｉｌｉｓ
・Ｍａｎｄｅｖｉｌｌａ ｓａｎｄｅｒｉ
・Ｍａｎｄｅｖｉｌｌａ ｓｐｌｅｎｄｅｎｓ

熱帯／亜熱帯において鉢植え植物または観賞用園芸植物として主に使用される。形質転換体において、植物の高さの低下および分枝の増加が観察され、ポット当たりのより少ない挿し木から摘心なく十分な分枝を有することができる。物理的な固定物に植物を付着させる高価な作業を、ｒｏｌ形質転換体において必要としない。

タバコ
例：
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ

タバコの生産のための作物として主に使用される。タバコの葉は、通常、２～８％のニコチンを含み、ｒｏｌ遺伝子を含むＡ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓのＲｉプラスミドで形質転換された植物は、コントロールと比較してより高い濃度を示した。

・Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ
・Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｘ ｓａｎｄｅｒｒａｅ

観賞／寝具植物として主に使用される。植物の高さの低下および分枝の増加が観察され、ポット当たりのより少ない挿し木から摘心なく十分な分枝を有することができる。

カンチョウジ
例：
・Ｂｏｕｖａｒｄｉａ ｌｏｎｇｉｆｌｏｒａ

鉢植え植物および切り花として主に使用される。形質転換された植物において、植物の高さの低下および分枝の増加が観察され、必要とされる化学的成長制御が少なく、ポット当たりのより少ない挿し木から十分な分枝を有することができる。

コチョウラン
例：
・Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ ａｍａｂｉｌｉｓ
・Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ ａｍｂｏｉｎｅｎｓｉｓ
・Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ Ａｐｈｒｏｄｉｔｅ
・Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔａ

鉢植え植物および切り花として使用され、ヨーロッパにおいて最も大きな鉢植え植物産物（生産数と売上高）である。形質転換された植物において、植物の高さの低下および分枝の増加が観察され、市場で予想されるより高い価格で、必要とされる化学的成長制御が少なく、植物当たりのより多くの穂を有することができる。

Ｖａｎｉｌｌａ ｐｌａｎｉｆｏｌｉａ
バニラは、その高いバニリン含有量（４－ヒドロキシ－３－メトキシベンズアルデヒド）によってバニラ香味料のための一次供給源の１つであり、ｒｏｌ遺伝子を含むアグロバクテリウムリゾゲネスのＲｉプラスミドで形質転換された植物は、コントロールと比較してより高い濃度を示した。

バジル(Basil)
例：
・Ｏｃｉｍｕｍ ｂａｓｉｌｉｃｕｍ

食用植物として使用される。葉は、メチルカビコール(metylchavicol)、キネオールおよびリナロールの含有量によって、強い辛味、しばしば甘い香りで、若干アニスのような味がし得る。ｒｏｌ遺伝子を含むアグロバクテリウムリゾゲネスのＲｉプラスミドで形質転換された植物は、コントロールと比較してより高い濃度を示した。

トウガラシ
例：
・Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ、
・Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｂａｃｃａｔｕｍ、
・Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｃｈｉｎｅｎｓｅ、
・Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ、
・Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ。

スパイスおよび野菜として主に使用されるが、カプサイシン（メチルバニリルノネンアミド）を含むトウガラシはまた、血液循環を刺激するか、または疼痛を軽減するための医薬における使用が見いだされている。ｒｏｌ遺伝子を含むアグロバクテリウムリゾゲネスのＲｉプラスミドで形質転換された植物は、コントロールと比較してより高い濃度を示した。

サツマイモ
例：
・Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔａｓ

サツマイモとして知られている。その大きな澱粉質の甘い味の塊根は根菜である。デンプンに加えて、サツマイモは複合炭水化物、食物繊維およびベータ－カロテン（プロビタミンＡカロテノイド）が豊富であるが、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、マンガンおよびカリウムを含む他の微量栄養素の適度な含有量を有する。ｒｏｌ遺伝子を含むアグロバクテリウムリゾゲネスのＲｉプラスミドで形質転換された植物は、コントロールと比較してより高い濃度を示した。

トマト
例：
・Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ

トマトは、食用の、しばしば赤色／橙色／黄色／緑色の実／小果実である。強力な抗酸化物質であるリコピンを含む実は、大腸、胃、肺、前立腺および膵臓癌のリスクの低下と関連している。本願発明者は、植物の高さの低下および分枝の増加を観察し、食用実を有する室内用鉢植え植物としても、または限定された利用できる空間を有する庭においても植物を使用することができる。さらに、本願発明者は、リコピン含有がｒｏｌ遺伝子を含むアグロバクテリウムリゾゲネスのＲｉプラスミドで形質転換された植物の実において増加したことに気付いた。

ジャガイモ(Potato)
例
・Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ

ジャガイモは、ビタミンおよびミネラルならびに様々な植物化学物質、例えばカロテノイドおよび天然フェノールを含む食用植物である。

植物の高さの低下および分枝の増加が観察され、限定された利用できる空間を有する庭において食用塊茎を有する庭園植物としても植物を使用することができる。さらに、ビタミンおよびミネラルの含有がｒｏｌ形質転換されたジャガイモ植物の塊茎において増加したことに気付いた。また、より増強された味が観察された。

Ｓｏｌａｎｕｍ ｎｉｃｏｔｉａｎｕｍ
Ｓｏｌａｎｕｍ ｎｉｃｏｔｉａｎｕｍは、Ｓｏｌａｎｕｍ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ．およびＳｏｌａｎｕｍ ｌａｃｉｎｉａｔｕｍの属間移植キメラであり（Ｋａｄｄｏｕｒａ、Ｒ．Ｌ． ａｎｄ Ｍａｎｔｅｌｌ、Ｓ．Ｈ．、（１９９１） Ａｎｎ Ｂｏｔ ６８ （６）： ５４７－５５６、観賞植物として使用される。形質転換されていないコントロールと比較して植物の高さの低下および分枝の増加が観察され、ポット当たりのより少ない挿し木から十分な分枝を有することができる。

エキナセア
例：
・Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐｕｒｐｕｒｅａ
・Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ、
・Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ｐａｌｌｉｄａ

エキナセアは、フェニルプロパノイド、エキナコシド(echinacoside)を含む植物薬のために主に使用される。エキナセアの主な成分は、様々な(variable)効果および効力の多種多様の化学物質からなる複合体である。活性な物質の範囲は、免疫系の種々の部分に対する効果を刺激または調節する抗菌剤を有する。全ての種はフェノールを含み、フェニルプロパノイド成分、例えばシコリン酸およびカフタル酸はＥ． ｐｕｒｐｕｒｅａに存在し、他のフェノールはエキナコシドを含む。エキナセア健康効果において重要であり得る他の化学成分は、アルキルアミドおよび多糖類を含む。エキナセア調製物の免疫調節効果は、脂溶性アルキルアミド（アルカミド）によって引き起こされる可能性が高く、アルキルアミドは、ＣＢ２受容体でのＴＨＣと同様の効力を有し、ＴＨＣは約１．５倍強い（～４０ｎｍ 対 ～６０ｎｍ アフィニティー）。しかしながら、効力は、精神活性ＣＢ１受容体でのＴＨＣより劇的に低い（～４０ｎｍ 対 ～＞１５００ｎｍ アフィニティー）。ｒｏｌ遺伝子を含むＡ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓのＲｉプラスミドで形質転換された植物の一部において、化学物質含有の濃度範囲が増加したことが今回観察された。さらに、植物の高さの低下および分枝の増加が観察され、観賞価値を有する観葉／庭園植物としても植物を使用することができる。

チョウセンゴミシ
例：
・Ｓｃｈｉｓａｎｄｒａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ
・Ｓｃｈｉｓａｎｄｒａ ｇｌａｂｒａ
・Ｓｃｈｉｓａｎｄｒａ ｒｕｂｒｉｆｌｏｒａ（観賞使用）

チョウセンゴミシの小果実は、従来の漢方薬において使用される。化学成分は、実の種において見いだされるリグナン シザンドリン、デオキシシザンドリン、ゴミシンおよびプレゴミシンを含む。化学物質含有の濃度範囲がｒｏｌ遺伝子を含むＡ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓのＲｉプラスミドで形質転換された植物の植物部において増加したことが観察された。さらに、植物の高さの低下および分枝の増加が観察され、観賞価値を有する観葉／庭園植物としても植物を使用することができる。

イワベンケイ
例：
・Ｒｈｏｄｉｏｌａ ｒｏｓｅａ

イワベンケイは、寒いシベリアの天気により良く対処するために、中国、ロシアおよびスカンジナビアにおいて植物薬において使用されている。空気中の一部は、世界のいくつかの地域において食物として消費され、ときどきサラダに加えられる。根および他の植物部は、ロサビン(rosavin)、ロサリン(rosarin)、ロジン(rosin)およびサリドロシド(salidroside)（および、ときどきｐ－チロソール(tyrosol)、ロジオニシド(rhodioniside)、ロジオリン(rhodiolin)およびロシリジン(rosiridin)を含む。化学物質含有の濃度範囲がｒｏｌ形質転換された植物の植物部において増加したことが観察された。植物は非常に遅い成長であり、植物の観賞価値は限定される。

カランコエにおけるフラボノイドレベルの上昇
野生型Ｋａｌａｎｃｈｏｅ ｐｉｎｎａｔａおよび表４に記載されている５つのＲｉ遺伝子コピーを有する形質転換された対応物（すなわち、一次Ｒｉ形質転換されたＫ．ｐｉｎｎａｔａと野生型形質転換されていないＫ．ｐｉｎｎａｔａを戻し交配によって得られた）を取り、水分喪失８５ｗ／ｗ％まで５０ｇの葉を凍結乾燥することによって抽出物を調製し、次に５℃の暗所で一晩メタノール（乾燥葉部分重量当たり５重量部メタノール）中でインキュベートした。上清を回収し、加圧下で蒸発させて完全に乾燥させた。抽出物サンプルを１００ｍｇ／ｍｌメタノールの濃度で調製し、濾過した（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、０．２０μｍ）。ＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析（高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）と質量分析（ＭＳ）との組合せ、ＭＳ／ＭＳは１つの質量分析装置における２つの質量分析器の組合せである）を使用して、脱プロトン化された分子イオンのそれらの特徴的な質量にしたがってフラボノイドの種々の誘導体を同定した。［Ｍ－Ｈ］^－を質量対電荷比に基づいて同定のために使用した（ｍ／ｚ；ケルセチン＝３０１；イソラムネチン＝３１５；ケンペロール＝２８５）。ＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳを、Tsimogiannis et al. (Molecules (2007) 12, 593-606にしたがって行った。

野生型Ｋ．ｐｉｎｎａｔａにおいて、ケンペロールおよびイソラムネチンのレベルは、植物原料１ｇ当たりそれぞれ２，１２および４，７４μｇであったが、Ｋ．ｐｉｎｎａｔａにおいて、５コピーのＲｉ遺伝子を有すると決定され、該レベルは植物原料１ｇ当たりそれぞれ２，４１および６，０３μｇであったことを見いだした。

Claims (29)

1. Ｒｉプラスミドを有するＡ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓでの感染によってアグロバクテリウムリゾゲネスのＲｉプラスミドで形質転換された植物またはかかる植物の子孫であって、該植物または子孫は、そのゲノムにおいて、ｒｏｌＣ遺伝子を含む、１～５コピーのＲｉプラスミドに由来する複数の遺伝子を含み、形質転換されていない植物の２５－７５％の中間高さを示し、８０％以上の花数を有し、
   該植物は、
   （ａ）アグロバクテリウムリゾゲネスのＲｉプラスミドで野生型植物の組織を形質転換すること、
   （ｂ）形質転換された組織が毛状表現型を有する根を発達させることを可能にすること、
   （ｃ）工程（ｂ）の毛状表現型を有する根の中から、毛状表現型が工程（ｂ）において得られた根において観察される最大根毛長の最大半分の最大根毛長を示す根を選択すること；
   （ｄ）再生培地上で選択された根を成長させ、形質転換された根付いた小植物が該選択された根から生み出すことを可能にすること；
   （ｅ）該形質転換された根付いた小植物を対応する野生型植物のものの２５－７５％の高さを有する成熟な形質転換された母植物に成長させること
   によって得られる、
   植物または子孫。
2. そのゲノムにおいて、１～５コピーの少なくとも１つ以上のｒｏｌＡ、ｒｏｌＢ、ｒｏｌＣおよびｒｏｌＤ遺伝子を含む、請求項１に記載の植物またはその子孫。
3. そのゲノムにおいて、１～５コピーのｒｏｌＡ、ｒｏｌＢ、ｒｏｌＣおよびｒｏｌＤ遺伝子を含む、請求項２に記載の植物またはその子孫。
4. そのゲノムにおいて、１～５コピーのＲｉプラスミドに存在する遺伝子を含む、請求項３に記載の植物またはその子孫。
5. そのゲノムにおいて、１～５コピーのＲｉプラスミド上のＴ－ＤＮＡ領域を含む、請求項４に記載の植物またはその子孫。
6. コピー数が３以下である、請求項１から５のいずれかに記載の植物またはその子孫。
7. コピー数が２以下である、請求項５に記載の植物またはその子孫。
8. コピー数が１である、請求項６に記載の植物またはその子孫。
9. 植物が野生型アグロバクテリウムリゾゲネスでの感染によって得られる、請求項１から８のいずれかに記載の植物またはその子孫。
10. 植物または子孫が形質転換されていないコントロール植物の３０－７０％の中間高さを示す、請求項１に記載の植物またはその子孫。
11. 該植物または子孫が、形質転換されていないコントロール植物と比較して、４日以上開花時間遅延を有さない、請求項１から１０のいずれかに記載の植物またはその子孫。
12. 該植物または子孫が、形質転換されていないコントロール植物と比較して、９０％以上の花数を有する、および／または２日以上開花時間遅延を有さない、請求項１１に記載の植物またはその子孫。
13. 請求項１から１２のいずれかに記載の植物またはその子孫であって、アグロバクテリウムリゾゲネスで形質転換された植物は以下の属のいずれかに属する：
    －カランコエ；
    －キク；
    －シオン；
    －バラ；
    －ナス；
    －トウダイグサ；
    －コチョウラン；
    －メボウキ；
    －トウガラシ；
    －ハッカ；
    －ハイビスカス；
    －マンデビラ(Mandevilla)／マンデビラ(Dipladenia)；
    －ユーストマ；
    －ラベンダー；
    －ユリ；
    －クレマチス；
    －タバコ；
    －カンチョウジ；
    －バニラ；
    －サツマイモ；
    －エキナセア；
    －チョウセンゴミシ；
    －イワベンケイ；
    －フランスギク；
    －ゴクラクチョウカ
    属内の種間ハイブリッドも含む。
14. 植物が、カランコエ、シオン、キク、クレマチス、トウダイグサ、ハイビスカス、フランスギク、マンデビラ(Mandevilla)、タバコ、メボウキ、コチョウラン、バラおよびナス属のいずれかに属する、請求項１３に記載の植物またはその子孫。
15. 観賞植物として、食物の提供または製造のための、またはヒトまたは動物必要品、例えば医薬、刺激剤または化粧品の製造のための活性成分の供給源として、請求項１から１４のいずれかに記載の植物またはその子孫の使用。
16. 食物の提供または製造のための使用のための植物が農作物種である、請求項１５に記載の使用。
17. 食物の提供または製造のための使用のための植物がバニラ、メボウキ、トウガラシ、サツマイモ、ナス属のいずれかに属する、請求項１５または１６に記載の使用。
18. 医薬または刺激剤の製造のための活性成分の供給源として使用される植物がカランコエ、ナス、タバコ、イワベンケイ、エキナセア、チョウセンゴミシ、バラ、ハイビスカスおよびキク属のいずれかに属する、請求項１５に記載の使用。
19. 請求項１から１４のいずれかに記載の植物の製造方法であって、
    （ａ）アグロバクテリウムリゾゲネスのＲｉプラスミドで野生型植物の組織を形質転換すること、
    （ｂ）形質転換された組織が毛状表現型を有する根を発達させることを可能にすること、
    （ｃ）工程（ｂ）の毛状表現型を有する根の中から、毛状表現型が工程（ｂ）において得られた根において観察される最大根毛長の最大半分の最大根毛長を示す根を選択すること；
    （ｄ）再生培地上で選択された根を成長させ、形質転換された根付いた小植物が該選択された根から生み出すことを可能にすること；
    （ｅ）該形質転換された根付いた小植物を対応する野生型植物のものの２５－７５％の高さを有する成熟な形質転換された母植物に成長させること
    を含む、植物の製造方法。
20. 工程（ｃ）が、工程（ｂ）の毛状表現型を有する根の中から、毛状表現型が工程（ｂ）において得られた根において観察される長さ当たりの最大枝数の最大半分である長さ当たりの枝数を示す根を選択することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
21. 請求項１から１４のいずれかに記載の植物の製造方法であって、
    （ａ）アグロバクテリウムリゾゲネスのＲｉプラスミドで野生型植物の組織を形質転換すること、
    （ｂ）形質転換された組織が毛状表現型を有する根を発達させることを可能にすること、
    （ｃ）毛状根表現型を有する推定的に形質転換された根を選択すること；
    （ｄ）再生培地上で選択された根を成長させ、形質転換された根付いた小植物が該選択された根から生み出すことを可能にすること；
    （ｅ）該形質転換された根付いた小植物を成熟な形質転換された母植物に成長させること；
    （ｆ）工程（ｅ）の成熟な形質転換された母植物と比較して増加した高さおよび工程（ａ）の野生型植物のものと比較して低下した高さを有する子孫について選択しながら、交配、戻し交配および自家交配によって工程（ｅ）の成熟な形質転換された母植物の子孫を生み出すこと、
    （ｇ）子孫が工程（ａ）の対応する野生型植物のものの２５－７５％の高さを有し、８０％以上の花数を有する成熟植物をもたらすまで、工程（ｆ）を繰り返すこと
    を含む、植物の製造方法。
22. 工程（ｅ）または、存在するとき、工程（ｆ）および／または（ｇ）が、対応する野生型植物の３０－７０％の植物の高さについて選択することを含む、請求項１９から２１のいずれかに記載の方法。
23. 工程（ｅ）または、存在するとき、工程（ｆ）および／または（ｇ）が、形質転換されていないコントロール植物と比較して、４日以上開花時間遅延を有さない、植物または子孫について選択することをさらに含む、請求項１９から２２のいずれかに記載の方法。
24. 工程（ｅ）または、存在するとき、工程（ｆ）および／または（ｇ）が、形質転換されていないコントロール植物と比較して、９０％以上の花数を有する、および／または２日以上開花時間遅延を有さない、植物または子孫について選択することをさらに含む、請求項１９から２３のいずれかに記載の方法。
25. 工程（ａ）が、Ｒｉプラスミドを有するＡ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓを植物または植物部と共培養し、Ａ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓがＲｉプラスミドを該植物または植物部に送達することを可能にすることを含む、請求項１９から２４のいずれかに記載の方法。
26. 工程（ａ）が、アグロバクテリウムリゾゲネスでの感染を含む、請求項１９から２５のいずれかに記載の方法。
27. アグロバクテリウムリゾゲネスが野生型アグロバクテリウムリゾゲネスである、請求項２６に記載の方法。
28. アグロバクテリウムリゾゲネスで形質転換された植物が、請求項１４に定義のとおりである、請求項１９から２７のいずれかに記載の方法。
29. 選択が、アグロバクテリウムリゾゲネスのＲｉプラスミドに由来する１つ以上の遺伝子のコピー数をアッセイすることをさらに含む、請求項１９から２８のいずれかに記載の方法。

Images