JP2018529370A - ジャガイモ栽培品種y9 - Google Patents

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    • A23V2002/00Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Abstract

ジャガイモ栽培品種Y9が開示される。本発明は、Y9の塊茎、種子、植物体、その一部、Y9から作製された食品製品、およびY9をそれ自体とまたは別のジャガイモ品種と交配することによって生じる植物体を得るための方法に関する。本発明は、遺伝子材料内に1つまたは複数の導入遺伝子を含有するジャガイモ植物体を得る方法、ならびにそれらの方法によって得たトランスジェニック植物体および植物体の一部にも関する。本発明は、Y9に由来するジャガイモ栽培品種または栽培品種および植物体の一部の育種、Y9に由来する他のジャガイモ栽培品種、系統または植物体の一部を生じるための方法、ならびにそれら方法の使用に由来するジャガイモ植物体、品種、およびその一部にも関する。本発明はさらに、Y9を別のジャガイモ栽培品種と交配することによって生じるハイブリッドジャガイモの塊茎、種子、植物体およびその一部に関する。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、2015年10月8日に出願された米国仮出願番号第62/239,068号および2015年11月18日に出願された米国仮出願番号第62/256,940号に基づく優先権の利益を主張しており、これら仮出願の各々の全体の内容は、すべての目的のためにそれらの全体が参考として本明細書によって援用される。
分野
本開示は、Y9と名付けられた新規のジャガイモ栽培品種、ならびにそのジャガイモ変種により生じる塊茎、植物体、植物体の一部、組織培養物、および種子に関する。本開示は、さらに、フレンチフライ、ポテトチップ、乾燥ジャガイモ材料、ジャガイモフレーク、およびジャガイモ顆粒などの、ジャガイモ栽培品種Y9から作製された食品製品に関する。
背景
ジャガイモは、世界で4番目に最も重要な食用作物であり、群を抜いて最も重要な野菜である。ジャガイモは現在、米国のほぼ全ての州で商業的に育てられている。年間のジャガイモ生産は米国では1800万トン、世界的には3億トンを超える。ジャガイモの人気は、主にその多用性および栄養価に由来する。ジャガイモは、生で、凍結または乾燥させて使用することもでき、穀粉、デンプンまたはアルコールに加工することもできる。ジャガイモは、複合炭水化物を含有し、カルシウム、ナイアシンおよびビタミンCが豊富である。
食品産業におけるジャガイモの品質は、以下の2つの重大な因子の影響を受ける:(1)ジャガイモは、揚げたときまたは焼いたときに急速に酸化されて発がん性生成物であるアクリルアミドを形成する非必須遊離アミノ酸であるアスパラギンを大量に含有すること、および(2)ジャガイモは、打撲を受けたジャガイモの損傷した色素体からポリフェノールオキシダーゼが漏出したときに起こる望ましくない事象である、酵素による褐変および変色を高度に受けやすいこと。細胞質では、この酵素によりフェノールが酸化され、次いでこれが急速に重合して濃い色素が生じる。塊茎は、リン酸化されたデンプンを大量に含有し、その一部は貯蔵中に分解されてグルコースおよびフルクトースが生じる。120℃を超える温度で加熱すると、これらの還元糖がアミノ酸と反応してアクリルアミドを含めたメイラード生成物を形成する。2種の酵素、水ジキナーゼ(water dikinase)R1およびホスホリラーゼ−L(R1およびPhL)がデンプンリン酸化に関与する。褐変はまた、デンプンのグルコースおよびフルクトースへの部分分解の結果として、非酵素的にも誘発される。
多くのジャガイモ栽培品種は、真菌様卵菌病原体Phytophthora infestansによって引き起こされる壊滅的な病害である疫病にかかりやすい。ジャガイモの疫病は、急速に拡大し、壊死性になる可能性がある葉および茎の黒色/褐色病変によって同定される。P.infestansが宿主作物において急速に成長し、生殖すると、重症の疫病伝染病が発生する。
開示の要旨
したがって、毒性化合物のレベルが低下し、病害に対する抵抗性が増大しているが、未知または外来核酸は使用されていないジャガイモ品種を開発する必要がある。本開示は、この必要性を満たす。
前述の関連技術の例およびそれに関連する限定は、例示的なものであり、排他的なものではないものとする。関連技術の他の限定は、本明細書を読めば当業者には明らかになろう。
したがって、当技術分野において、アクリルアミド含有量が少なく、打撲黒斑耐性が増大しており、還元糖が減少しており、かつ、疫病に対する抵抗性が増大している塊茎を生じるジャガイモ植物体変種が必要とされている。
以下の実施形態およびその態様は、例示的なものであり、範囲を限定するものではないものとする、システム、ツールおよび方法と併せて記載されている。種々の実施形態では、上記の問題の1つまたは複数が低減または排除されており、一方、他の実施形態は、他の改善を対象とする。
この目的のために、本発明は、ジャガイモ植物体ゲノムに対してネイティブであり、外来DNA、Agrobacterium DNA、ウイルスマーカーまたはベクター骨格配列を含有しない核酸配列で形質転換された新規のジャガイモ変種Y9を提供する。もっと正確に言えば、ジャガイモ変種Y9のゲノムに挿入されるDNAは、打撲黒斑の発現、アスパラギンの蓄積および老化により甘くなることに関与する遺伝子をサイレンシングする、ジャガイモに対してネイティブであるまたはジャガイモ有性生殖適合性植物である野生ジャガイモに対してネイティブである非コードポリヌクレオチドである。
したがって、一実施形態では、本開示は、アスパラギンシンテターゼ−1遺伝子(fAsn1)の断片およびポリフェノールオキシダーゼ−5遺伝子の3’−非翻訳配列をアンチセンス方向に含むDNAセグメントを2コピー含有する第1のサイレンシングカセットと、ジャガイモホスホリラーゼ−L(pPhL)遺伝子の断片およびジャガイモR1遺伝子の断片をアンチセンス方向に含むDNAセグメントを2コピー含有する第2のサイレンシングカセットとを含む、pSIM1278と称される植物ベクターを提供する。pSIM1278ベクターは、植物の形質転換の前の植物DNAの維持を支持し、植物細胞の形質転換の際に植物細胞に移入されない、9,512bpの骨格領域と、形質転換の際に植物細胞のゲノムに安定に組み込まれるネイティブなDNAを含む、10,148bpのDNA挿入断片領域とを含む。
別の実施形態では、本発明は、Rpi−vnt1発現カセットと、植物液胞インベルターゼ遺伝子VInvに対するサイレンシングカセットとを含む、pSIM1678と称される第2の植物ベクターを提供する。Rpi−vnt1遺伝子カセットは、広範な疫病に対する抵抗性を付与する、そのネイティブなプロモーター配列およびターミネーター配列によって調節されるVNT1タンパク質コード領域からなり、一方、サイレンシングカセットは、対向する植物プロモーター、pGbssおよびpAgpで挟まれた、ジャガイモVInv遺伝子由来の配列の逆方向反復からなる。pSIM1678ベクターは、植物の形質転換の前の植物DNAの維持を支持し、植物細胞の形質転換の際に植物細胞に移入されない、9,512bpの骨格領域と、形質転換の際に植物細胞のゲノムに安定に組み込まれるネイティブなDNAを含む、9,090bpのDNA挿入断片領域とを含む。
異なる実施形態では、本発明は、本発明の植物ベクターの一方または両方で形質転換された植物細胞を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、本発明のベクターで形質転換された1つまたは複数の細胞を含むジャガイモ植物体変種を提供する。本発明の一態様では、ジャガイモ植物体変種は、ベクターpSIM1278の2つのサイレンシングカセットのうちの少なくとも一方を発現し、かつ、ベクターpSIM1678のサイレンシングカセットを発現し、これらのサイレンシングカセットの発現により、当該植物体の塊茎におけるアスパラギンシンテターゼ−1遺伝子、ポリフェノールオキシダーゼ−5遺伝子および液胞インベルターゼ遺伝子の下方制御がもたらされる。本発明の好ましい態様では、少なくとも1つのサイレンシングカセットを発現するジャガイモ植物体変種の塊茎は、同じ変種の形質転換されていない植物体の塊茎には存在しない2つまたはそれよりも多い望ましい形質を示す。本発明の最も好ましい態様では、2つまたはそれよりも多い望ましい形質は、アスパラギンの低蓄積、打撲黒斑の減少、熱により誘導されるアクリルアミド形成の減少および貯蔵中の還元糖の蓄積の減少からなる群から選択される。
本発明の異なる態様では、ジャガイモ植物体変種は、植物DNAベクターpSIM1278の両方のサイレンシングカセットを発現し、かつ、ベクターpSIM1678のサイレンシングカセットを発現し、サイレンシングカセットの発現により、ジャガイモ植物体変種の塊茎におけるアスパラギンシンテターゼ−1遺伝子、ポリフェノールオキシダーゼ−5遺伝子、ホスホリラーゼ−L遺伝子、ジキナーゼR1遺伝子および液胞インベルターゼ遺伝子の下方制御がもたらされる。本発明の好ましい態様では、植物DNAベクターpSIM1278の2つのサイレンシングカセットを発現し、かつ、ベクターpSIM1678のサイレンシングカセットを発現するジャガイモ植物体変種の塊茎は、同じ変種の形質転換されていない植物体の塊茎には存在しない2つまたはそれよりも多い望ましい形質を示す。好ましい実施形態では、2つまたはそれよりも多い望ましい形質は、アスパラギンの低蓄積、打撲黒斑の減少、貯蔵中の還元糖の蓄積の減少および熱により誘導されるアクリルアミド形成の減少からなる群から選択される。本発明の一態様では、植物DNAベクターpSIM1278の2つのサイレンシングカセットおよび植物DNAベクターpSIM1678のサイレンシングカセットを発現するジャガイモ植物体変種は、Atlantic Y9変種である。
本発明の別の態様では、本発明のジャガイモ植物体変種Y9は、植物DNAベクターpSIM1678の疫病抵抗性遺伝子(Rpi−vnt1)を発現する。本発明の別の態様では、本発明のジャガイモ植物体変種Y9は、疫病感染に対する抵抗性が増大している。
したがって、本発明によると、Y9と名付けられた、Solanum tuberosum L.の属および種の新しいジャガイモ栽培品種が提供される。したがって、この発明は、ジャガイモ栽培品種Y9、ジャガイモ栽培品種Y9の塊茎、ジャガイモ栽培品種Y9の植物体、ジャガイモ栽培品種Y9の種子、ジャガイモ栽培品種Y9から作製された食品製品、およびジャガイモ栽培品種Y9の自殖によってまたはジャガイモ栽培品種Y9と別のジャガイモ栽培品種との交配によって生じるジャガイモ植物体を生じさせるための方法、およびジャガイモ栽培品種Y9の変異誘発または形質転換によるバリアントの創出に関する。
したがって、栽培変種Y9を使用する、自殖、戻し交配、ハイブリッド作製、個体群への交配などの方法はいずれも本発明の実施形態である。ジャガイモ栽培変種Y9が少なくとも一方の親として使用されて生じた植物体は全てこの発明の範囲内に入る。有利に、当該ジャガイモ栽培変種を他の異なるジャガイモ植物体との交配に使用して、優れた特性を有する第1世代(F)ジャガイモハイブリッド塊茎、種子および植物体を生じさせることができる。
別の実施形態では、本発明は、単一のまたは多数の遺伝子変換されたジャガイモ栽培品種Y9の植物体を提供する。一実施形態では、移入される遺伝子(単数または複数)は、優性対立遺伝子(単数または複数)であっても劣性対立遺伝子(単数または複数)であってもよい。一部の実施形態では、移入される遺伝子(単数または複数)により、除草剤抵抗性、昆虫抵抗性、細菌、真菌、またはウイルスによる病害に対する抵抗性、雄性稔性、雄性不稔性、栄養品質の増強、デンプンおよび他の炭水化物の濃度の均一性および上昇、打撲を受ける傾向の減少、ならびにデンプンが糖に変換される速度の低下などの形質が付与される。遺伝子(単数または複数)は、天然に存在するジャガイモ遺伝子であってもよく、遺伝子工学の技法、戻し交配または変異によって導入された導入遺伝子であってもよい。
別の実施形態では、本発明は、ジャガイモ栽培品種Y9の組織培養物に使用するための再生可能な細胞を提供する。一実施形態では、組織培養物は、前述のジャガイモ植物体の全ての生理的特性および形態学的特性を有する植物を再生することができ、かつ、前述のジャガイモ植物体と実質的に同じ遺伝子型を有する植物を再生することができるものである。一部の実施形態では、そのような組織培養物中の再生可能な細胞は、胚、プロトプラスト、分裂組織細胞、カルス、花粉、葉、葯、雌ずい、子葉(cotyledon)、胚軸、根、根端、花、種子、葉柄、塊茎、芽または茎である。さらに、本発明は、本発明の組織培養物から再生されたジャガイモ植物体を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、ジャガイモ植物体品種Atlantic Y9の塊茎から作られた食品製品を提供する。食品製品は、加熱加工された製品であることが好ましい。食品製品は、生ホールポテト、フレンチフライ、ポテトチップ、乾燥ジャガイモ材料、ジャガイモフレーク、またはジャガイモ顆粒であることがなおより好ましい。
上記の例示的な態様および実施形態に加えて、以下の説明を考察することにより、さらなる態様および実施形態が明らかになろう。
図1は、pSIM1278形質転換ベクターを示す。左側のベクター骨格領域は、10,149bpの位置で始まり、19,660bpの位置で終わる、9,512bpの長さである。骨格DNAは、主に、植物の形質転換の前のDNA挿入断片の維持の支持をもたらす細菌DNAからなる。隣接境界配列を含めたDNA挿入断片領域(右側)は、10,148bpの長さである(1bpから10,148bpまで)。DNA挿入断片は、形質転換の際にジャガイモゲノムに安定に組み込まれた。
図2は、pSIM1278形質転換ベクターに挿入したDNA挿入断片内のサイレンシングカセットの略図を提供する。各サイレンシングカセットは、スペーサーによって分離された、2コピーの2つの遺伝子断片を含有する。2コピーの、標的化された4つの遺伝子、すなわち、Asn−1、Ppo−5、PhlおよびR1の断片を含むDNAセグメントを、Proで示される、主に塊茎において活性である2つの収束プロモーターの間に逆方向反復として挿入した。結果として得られる、サイレンシングカセットを含有する植物体は、塊茎において、意図された標的遺伝子を動的にかつ勢いよくサイレンシングする、RNA分子の多様かつポリアデニル化されていないアレイを生じる。収束転写(convergent transcription)により、衝突転写(collisional transcription)がもたらされるので、RNA分子のサイズは、一般に、使用した2つのプロモーター間の距離よりも小さかった。
図3は、本発明のpSIM1678形質転換ベクターを示す。左側のベクター骨格領域は、9,091bpの位置で始まり、18,602bpの位置で終わる、9,512bpの長さである。骨格DNAは、主に植物の形質転換の前のDNA挿入断片の維持の支持をもたらす細菌DNAからなる。隣接境界配列を含めたDNA挿入断片領域(右側)は、9,090bpの長さである(1bpから9,090bpまで)。DNA挿入断片は、ネイティブなDNAのみからなり、形質転換の際にジャガイモゲノムに安定に組み込まれた。
図4は、pSIM1278形質転換ベクターに挿入したDNA挿入断片内のサイレンシングカセット(上の構築物)およびpSIM1678形質転換ベクターに挿入したDNA挿入断片内のサイレンシングカセット(下の構築物)の略図である。
図5は、表1および表2に記載のDNA配列を利用する、プラスミドpSIM1278を構築するためのプロセスを例示する。出発ベクター、pCAMBIA1301は、最終的なpSIM1278骨格における複製起点を含有する。
図6は、pSIM1278におけるT−DNA発現カセットの構築を例示する。融合PCRを使用して、エレメント1A(pAgp−第1のコピー)、1B(pAgp−第2のコピー)、2(Asn1、Ppo5)、3(Ppo5、Asn1)、4(pGbss−第1のコピー)および7(スペーサー1、Ppo5、Asn1)を増幅した。エレメント5(PhL、R1)および6(スペーサー2、R1、PhL、pGbss)は、Blue Heron Biotechnology,Inc.(Bothell、WA)により、ジャガイモゲノム由来の配列に基づいて合成された。エレメント8、9、および10は、図に示されている構成要素をライゲーションすることによって作出した。最後に、3つの断片、10、11および6を所望の発現カセットにまたがるように創出した。これらの3つの断片をライゲーションし、図5に示されているKpnI−SacI制限部位に挿入してpSIM1278を作出した。
図7は、表3および表4に記載のDNA配列を利用する、プラスミドpSIM1678を構築するためのプロセスを例示する。出発ベクター、pSIM1278は、最終的なpSIM1678骨格を含有する。
詳細な説明
定義
以下の説明および表では、いくつもの用語が使用されている。そのような用語に与えられる範囲を含め、本明細書および特許請求の範囲の明瞭かつ一貫した理解をもたらすために以下の定義を提供する。
用語「1つの(a)」または「1つの(an)」は、1つまたは複数のその実体を指す。例えば、「1つの(a)プライマー」とは、1つまたは複数のプライマーまたは少なくとも1つのプライマーを指す。そのように、用語「1つの(a)」(または「1つの(an)」)、「1つまたは複数の(one or more)」および「少なくとも1つの(at least one)」は、本明細書では互換的に使用される。さらに、不定冠詞「1つの(a)」または「1つの(an)」による「1つの要素(an element)」への言及は、文脈により、その要素がただ1つのみ存在することが明らかに必要とされている場合を除き、その要素が1つ超存在する可能性を除去するものではない。
対立遺伝子。「対立遺伝子」は、1つの形質または特性に関する遺伝子の1つまたは複数の代替形態のいずれかである。二倍体の細胞または生物では、所与の遺伝子の2つの対立遺伝子は、相同染色体の対上の対応する遺伝子座を占有する。
アミノ酸配列。本明細書で使用される場合、植物から単離された、植物に対してネイティブな、もしくは植物において天然に存在する、または、合成により作製されたものであるが内在性対応物の核酸配列を含む、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質およびその断片を包含する。
人工的に操作された(artificially manipulated)。本明細書で使用される場合、「人工的に操作された(artificially manipulated)」は、操作されていない天然に存在する対応物と比較して異なる生物学的、生化学的、形態学的、または生理的表現型および/または遺伝子型を有する植物体または植物細胞が生じるように、植物体または植物細胞を、手によって、または機械的手段もしくは組換え手段によって、例えば、遺伝子工学技法によって、移動させる、配置する、操作する(operate)または制御することを意味する。
無性繁殖。配偶子の融合を伴わない、葉挿し、茎挿し、根挿し、塊茎芽、匍匐枝、単一の植物細胞プロトプラスト、カルスなどから植物全体を作出することによって後代を生じさせること。
骨格。バイナリーベクターの、移入が意図されたDNA挿入断片配列以外の核酸配列。
戻し交配。「戻し交配」は、育種家が、雑種後代をまた親の一方と交配すること、例えば、第1世代雑種FとF雑種の親遺伝子型の一方との交配を繰り返すプロセスである。
細菌による輪腐病。細菌による輪腐病は、細菌Clavibacter michiganense ssp.によって引き起こされる病害である。細菌による輪腐病の名称は、塊茎内の維管束輪の特徴的な崩壊に由来する。この輪が多くの場合クリーム色がかった黄色〜薄茶色のチーズのような腐敗として現れる。ジャガイモの外表面に関しては、重度な病害にかかっている塊茎では、わずかにへこみ、乾燥し、ひびの入った面が示される可能性がある。感染した塊茎の維管束組織における細菌による輪腐病の症状は、上記のものよりは明白ではない可能性があり、裂けた散発的に現れる黒い線として、または連続した黄色がかった変色としてのみ現れる。
打撲黒斑。打撲を受けた塊茎組織に見出される黒斑は、細胞が傷害を受けた後に生成され、組織に褐色、灰色または黒色の外観を生じさせるメラニンと称される色素の結果である。メラニンは、細胞損傷の結果としてフェノール基質と適切な酵素が互いと接触すると形成される。損傷は、細胞の破壊である必要はない。しかし、通常、組織が強い衝撃を受けた場合、基質と酵素の混合は必ず起こるはずである。黒斑は、主に導管輪(vascular ring)の真下の髄周囲組織(perimedullary tissue)において起こるが、皮質組織の一部を含むほど大きい場合がある。
境界様配列。「境界様」配列は、改変しようとする選択された植物種から、または改変しようとする植物種に対して有性生殖適合性の植物から単離され、Agrobacteriumの境界配列と同様に機能する。すなわち、本発明の境界様配列は、それが連結したポリヌクレオチドの組み込みを促進し、容易にするものである。本発明のDNA挿入断片は、境界様配列を含有することが好ましい。DNA挿入断片の境界様配列は、5〜100bpの長さ、10〜80bpの長さ、15〜75bpの長さ、15〜60bpの長さ、15〜50bpの長さ、15〜40bpの長さ、15〜30bpの長さ、16〜30bpの長さ、20〜30bpの長さ、21〜30bpの長さ、22〜30bpの長さ、23〜30bpの長さ、24〜30bpの長さ、25〜30bpの長さ、または26〜30bpの長さの間である。DNA挿入断片の左境界配列および右境界配列は、改変しようとする植物のゲノムから単離されたものであるか、かつ/または、改変しようとする植物のゲノムに対してネイティブなものである。DNA挿入断片の境界様配列は、任意の公知のAgrobacterium由来のT−DNAの境界配列とは、ヌクレオチド配列が同一でない。したがって、DNA挿入断片の境界様配列は、Agrobacterium tumefaciensまたはAgrobacterium rhizogenesなどのAgrobacterium種由来のT−DNAの境界配列とは異なるヌクレオチドを1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、またはそれ超有し得る。すなわち、DNA挿入断片の境界、または本発明の境界様配列は、Agrobacterium tumefaciensまたはAgrobacterium rhizogenesなどのAgrobacterium種由来のT−DNAの境界配列に対して少なくとも95%、少なくとも90%、少なくとも80%、少なくとも75%、少なくとも70%、少なくとも60%または少なくとも50%の配列同一性を有するが、100%の配列同一性は有さない。本明細書で使用される場合、「DNA挿入断片の境界」および「DNA挿入断片の境界様」という説明的用語は、交換可能である。境界様配列は、植物のゲノムから単離することができ、ヌクレオチド配列を別のヌクレオチド配列に組み込むことが可能な効率が変化するように改変するかまたは変異させることができる。他のポリヌクレオチド配列を本発明の境界様配列に付加するまたは組み入れることができる。したがって、DNA挿入断片の左境界またはDNA挿入断片の右境界は、5’多重クローニング部位および3’多重クローニング部位、または追加的な制限部位を有するように改変することができる。DNA挿入断片の境界配列は、付随的なベクターに由来する骨格DNAが植物のゲノムに組み込まれない可能性が増大するように改変することができる。
から本質的になる(consisting essentially of)。ある特定の要素「から本質的になる(consisting essentially of)」組成物は、それらの要素、ならびに、本発明の組成物の基本的かつ新規の特性に実質的に影響を及ぼさない要素の包含に限定される。したがって、組成物が本発明の基本的かつ新規の特性に影響を及ぼさない、すなわち、選択された植物種にも選択された植物種に対して有性生殖適合性の植物にも由来するものではない外来DNAを含有しない限りは、その組成物は、「から本質的になる(consisting essentially of)」という言葉で特徴付けられる本発明の組成物の構成成分とみなすことができる。
子葉(cotyledon)。「子葉(cotyledon)」は、子葉(seed leaf)の一種である。子葉(cotyledon)は、種子の養分貯蔵組織を含有する。
縮重プライマー。用語「縮重プライマー」は、類似しているが厳密な相同ではない配列とハイブリダイズした際の塩基ミスマッチに適応させることができる十分なヌクレオチド変動を含有するオリゴヌクレオチドである。
双子葉植物(双子葉類)。胚に子葉(seed leaf)または子葉(cotyledon)を2つ有する顕花植物。双子葉類の例としては、これだけに限定されないが、タバコ、トマト、ジャガイモ、サツマイモ、キャッサバ、アルファルファおよびダイズを含めたマメ科植物、ニンジン、イチゴ、レタス、オーク、カエデ、クルミ、バラ、ミント、カボチャ、ヒナギク、およびサボテンが挙げられる。
DNA挿入断片。本発明によれば、植物のゲノムに挿入されるDNA挿入断片は、その植物に対してネイティブなポリヌクレオチド配列を含むか、またはその植物に対してネイティブな遺伝子エレメントを有する。一実施例では、例えば、本発明のジャガイモ品種Y9のpSIM1278由来のDNA挿入断片は、ジャガイモもしくは野生ジャガイモ、ジャガイモ有性生殖適合性の植物体に対してネイティブであり、形質転換の際に植物細胞のゲノムに安定に組み込まれ、打撲黒斑の発現、アスパラギンの蓄積、および老化により甘くなることに関与する遺伝子をサイレンシングする、非コードポリヌクレオチドである。DNA挿入断片は、2つの発現カセットを含み、pSIM1278形質転換ベクターと称される形質転換ベクターに挿入されることが好ましい。第1のカセットは、ADPグルコースピロホスホリラーゼ(Agp)遺伝子のAgpプロモーターと顆粒結合合成酵素(Gbss)遺伝子のGbssプロモーターの間に逆方向反復として配置された、アスパラギンシンテターゼ−1(Asn1)遺伝子とポリフェノールオキシダーゼ−5(Ppo5)遺伝子の両方の断片を含む。これらのプロモーターは、主に塊茎において活性である。第2のカセットの機能は、デンプン関連遺伝子ジキナーゼ−R1(R1)およびホスホリラーゼ−L(PhL)遺伝子のプロモーターをサイレンシングすることである。このカセットは、第1のカセットと同じAgpプロモーターおよびGbssプロモーターに作動可能に連結した、デンプン関連遺伝子ジキナーゼ−R1(R1)およびホスホリラーゼ−L(PhL)遺伝子のプロモーターの断片で構成される。第2のDNA挿入断片は、Rpi−vnt1発現カセットと、植物液胞インベルターゼ遺伝子VInvに対するサイレンシングカセットとを含む、pSIM1678と称される形質転換ベクターによってもたらされる。Rpi−vnt1遺伝子カセットは、広範な疫病に対する抵抗性を付与する、そのネイティブなプロモーター配列およびターミネーター配列によって調節されるVNT1タンパク質コード領域からなり、一方、サイレンシングカセットは、対向する植物プロモーター、pGbssおよびpAgpで挟まれた、ジャガイモVInv遺伝子由来の配列の逆方向反復からなる。これらの発現カセットは、外来DNAを含有せず、選択された植物種または選択された植物種に対して有性生殖適合性の植物のいずれかのみに由来するDNAからなる。
胚。胚は、成熟した種子中に含有される未成熟の植物体である。
外来。核酸に関して、「外来」は、その核酸が、非植物生物に由来する、または形質転換しようとする植物体と同じ種ではない植物体に由来する、または、形質転換しようとする植物体と交配できない植物体に由来しない、または標的植物体の種に属さないことを意味する。本発明によると、外来DNAまたはRNAは、真菌、細菌、ウイルス、哺乳動物、魚類または鳥類の遺伝子構造には天然に存在するが、形質転換しようとする植物体には天然に存在しない核酸を表す。したがって、外来核酸は、例えば、形質転換された植物によって自然に産生されないポリペプチドをコードする核酸である。外来核酸は、タンパク質産物をコードする必要はない。本発明によると、所望の遺伝子内植物(intragenic plant)は、そのゲノム内にいかなる外来核酸も組み込まれていない植物である。
遺伝子。本明細書で使用される場合、「遺伝子」は、コード領域を指し、その領域の5’側または3’側のヌクレオチド配列を含まない。機能的な遺伝子は、プロモーターまたはターミネーターに作動可能に連結したコード領域である。遺伝子は、異なる種に由来するか同じ種に由来するかにかかわらず、種のゲノムに、形質転換または種々の育種方法を使用して導入することができる。
遺伝子変換された(変換)。遺伝子変換された(変換)植物は、戻し交配技法によって、遺伝子工学によって、または変異によって、ある品種の所望の形態学的特性および生理的特性の基本的に全てを、当該品種に移入される1つまたは複数の遺伝子に加えて回復させる、戻し交配と称される植物育種技法によって開発された植物を指す。1つまたは複数の遺伝子座も移入することができる。
遺伝子再構成。遺伝物質の新しい組織化が導入される、in vivoおよびin vitroにおいて自然に起こり得る遺伝子エレメントの再会合を指す。例えば、異なる染色体の遺伝子座にあるポリヌクレオチドの一緒になったスプライシングが、in vivoにおいて植物発生および有性組換えのどちらの間にも自然に起こり得る。したがって、in vitroにおける非天然遺伝子改変技法による遺伝子エレメントの組換えは、同じくin vivoにおける有性組換えを通じて起こり得る組換え事象と類似している。
ジャガイモシストセンチュウ。一般にジャガイモシストセンチュウとして公知のGlobodera rostochiensisは、ジャガイモ植物体の根および塊茎に影響を及ぼす、植物に寄生する線形動物である。症状としては、不十分な植物生長、しおれ、水ストレスおよび養分欠乏が挙げられる。
胚軸。胚軸は、子葉(cotyledon)と根の間の胚または実生の部分である。したがって、胚軸は、苗条と根の間の移行部とみなすことができる。
インフレーム。ヌクレオチドトリプレット(コドン)が植物細胞において所望の組換えタンパク質の新生アミノ酸配列に翻訳される。具体的には、本発明は、第1の核酸が読み枠内で第2の核酸と連結しており、第1のヌクレオチド配列は遺伝子であり、第2のヌクレオチドはプロモーターまたは同様の調節エレメントであることを意図している。
組み込む。選択された植物種に由来する、または選択された植物と同じ種由来の植物に由来する、または選択された植物種に対して有性生殖適合性の植物に由来する核酸配列を、選択された植物種の細胞のゲノムに挿入することを指す。「組み込み」とは、ネイティブな遺伝子エレメントのみを植物細胞ゲノムに組み入れることを指す。例えば相同組換えによってネイティブな遺伝子エレメントを組み込むために、本発明では、ネイティブでないDNAを、そのようなプロセスにおけるステップとして「使用」することができる。したがって、本発明では、特定のDNA分子の「使用」と特定のDNA分子の植物細胞ゲノムへの「組み込み」は区別される。
導入。本明細書で使用される場合、感染、トランスフェクション、形質転換または形質導入を含めた方法によって核酸配列を細胞に挿入することを指す。
単離された。「単離された」は、その通常のネイティブな環境から物理的に分離された任意の核酸または化合物を指す。単離された材料は、例えば溶媒、緩衝液、イオン、または他の構成成分を含有する適切な溶液中で維持することができ、精製された形態であっても精製されていない形態であってもよい。
疫病。ジャガイモ植物体の葉、茎、果実、および塊茎に感染し、それらを破壊し得る、卵菌Phytophthora infestansによって引き起こされる、「ジャガイモの疫病」としても公知のジャガイモの病害。
リーダー。遺伝子の前にある(または遺伝子に対して5’側にある)、転写されるが翻訳はされない配列。
遺伝子座。遺伝子座は、例えば、雄性不稔性、除草剤耐性、昆虫抵抗性、病害抵抗性、蝋様デンプン、脂肪酸代謝の改変、フィチン酸代謝の改変、炭水化物代謝の改変、およびタンパク質代謝の改変などの、1つまたは複数の形質を付与するものである。形質は、例えば、戻し交配、自然変異もしくは誘導された変異によって品種のゲノムに導入された天然に存在する遺伝子、または遺伝子形質転換技法によって導入された導入遺伝子により、付与され得る。遺伝子座は、単一の染色体上の位置に組み込まれた1つまたは複数の対立遺伝子を含み得る。
市場性のある収量。市場性のある収量は、直径2インチから4インチの間である、収穫される全ての塊茎の重量である。市場性のある収量は、cwt(ハンドレッドウェイト)単位で測定され、cwt=100ポンドである。
単子葉植物(単子葉類(monocot))。胚に子葉(cotyledon)または子葉(seed leaf)を1つ有する顕花植物である。単子葉類の例としては、これだけに限定されないが、芝草、トウモロコシ、イネ、エンバク、コムギ、オオムギ、モロコシ、ラン、アヤメ、ユリ、タマネギ、およびヤシが挙げられる。
ネイティブ。「ネイティブ」な遺伝子エレメントとは、形質転換しようとする植物のゲノムに天然に存在する、それを起源とする、またはそれに属する核酸を指す。したがって、形質転換しようとする植物体もしくは植物種のゲノムから単離されたか、または、形質転換しようとする植物種に対して有性生殖適合性または交配可能である植物体もしくは種から単離された核酸、遺伝子、ポリヌクレオチド、DNA、RNA、mRNA、またはcDNA分子はいずれも、その植物種に対して「ネイティブ」である、すなわち、その植物種に固有である。言い換えれば、ネイティブな遺伝子エレメントとは、古典的な植物育種を通じて植物を改善するために植物育種家が利用可能な全ての遺伝物質を表す。本発明によると、ネイティブな核酸の任意のバリアントも「ネイティブ」とみなされる。この点において、「ネイティブ」な核酸は、植物またはその有性生殖適合性の種から単離し、得られるバリアントが、植物から単離された改変されていないネイティブな核酸と、ヌクレオチド配列が、99%またはそれ超、98%またはそれ超、97%またはそれ超、96%またはそれ超、95%またはそれ超、94%またはそれ超、93%またはそれ超、92%またはそれ超、91%またはそれ超、90%またはそれ超、89%またはそれ超、88%またはそれ超、87%またはそれ超、86%またはそれ超、85%またはそれ超、84%またはそれ超、83%またはそれ超、82%またはそれ超、81%またはそれ超、80%またはそれ超、79%またはそれ超、78%またはそれ超、77%またはそれ超、76%またはそれ超、75%またはそれ超、74%またはそれ超、73%またはそれ超、72%またはそれ超、71%またはそれ超、70%またはそれ超、69%またはそれ超、68%またはそれ超、67%またはそれ超、66%またはそれ超、65%またはそれ超、64%またはそれ超、63%またはそれ超、62%またはそれ超、61%またはそれ超、または60%またはそれ超、同様になるように、改変するかまたは変異させることもできる。ネイティブな核酸バリアントは、ヌクレオチド配列が、約60%未満、約55%未満、または約50%未満、同様であってもよい。植物から単離された「ネイティブ」な核酸は、その核酸から転写および翻訳される天然に存在するタンパク質産物のバリアントをコードしてもよい。したがって、ネイティブな核酸は、核酸を単離した植物において発現される改変されていないネイティブなタンパク質と、アミノ酸配列が、99%またはそれ超、98%またはそれ超、97%またはそれ超、96%またはそれ超、95%またはそれ超、94%またはそれ超、93%またはそれ超、92%またはそれ超、91%またはそれ超、90%またはそれ超、89%またはそれ超、88%またはそれ超、87%またはそれ超、86%またはそれ超、85%またはそれ超、84%またはそれ超、83%またはそれ超、82%またはそれ超、81%またはそれ超、80%またはそれ超、79%またはそれ超、78%またはそれ超、77%またはそれ超、76%またはそれ超、75%またはそれ超、74%またはそれ超、73%またはそれ超、72%またはそれ超、71%またはそれ超、70%またはそれ超、69%またはそれ超、68%またはそれ超、67%またはそれ超、66%またはそれ超、65%またはそれ超、64%またはそれ超、63%またはそれ超、62%またはそれ超、61%またはそれ超、または60%またはそれ超、同様であるタンパク質をコードしてもよい。
ネイティブな遺伝子エレメント。「ネイティブな遺伝子エレメント」は、本発明に従って選択された植物種のゲノムに組み入れ、組み込むことができる。ネイティブな遺伝子エレメントは、選択された植物種に属する植物体または選択された植物種に対して有性生殖適合性の植物体から単離される。例えば、栽培されたジャガイモ(Solanum tuberosum)に組み入れられるネイティブなDNAは、任意の遺伝子型のS.tuberosumまたはS.tuberosumに対して有性生殖適合性の任意の遺伝子型の野生ジャガイモ種(例えば、S.demissum)に由来するものであってよい。
天然に存在する核酸。天然に存在する核酸は、選択された植物種のゲノム内に見出され、DNA分子であってもRNA分子であってもよい。植物種のゲノム内に通常存在する制限部位の配列は、ベクターまたはオリゴヌクレオチドなどの外因性DNA分子に、その制限部位がそのゲノムから物理的に単離されていないにもかかわらず、工学的に操作して入れることができる。したがって、本発明では、制限酵素認識配列などのヌクレオチド配列を、その配列が選択された植物種のゲノムまたは形質転換しようとする選択された植物種に対して有性生殖適合性の植物体において天然に存在する限りは、合成により創出することが可能になる。
作動可能に連結した。2つまたはそれ超の分子を、植物細胞においてそれらが組み合わさって適正に機能するように組み合わせること。例えば、プロモーターにより構造遺伝子の転写が制御される場合、そのプロモーターは、構造遺伝子に作動可能に連結している。
植物。本明細書で使用される場合、用語「植物」は、これだけに限定されないが、被子植物および裸子植物、例えば、ジャガイモ、トマト、タバコ、アルファルファ、レタス、ニンジン、イチゴ、サトウダイコン、キャッサバ、サツマイモ、ダイズ、トウモロコシ、芝草、コムギ、イネ、オオムギ、モロコシ、エンバク、オーク、ユーカリ、クルミ、およびヤシなどを含む。したがって、植物は、単子葉類であっても双子葉類であってもよい。単語「植物」は、本明細書で使用される場合、有性生殖によって生じたか無性生殖によって生じたかにかかわらず、植物細胞、種子、植物後代、むかご、および、これらのいずれかの後裔、例えば、挿し木または種子なども包含する。植物細胞は、懸濁培養物、カルス、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、根、苗条、配偶体、胞子体、花粉、種子および小胞子を含む。植物は、成熟度が種々の段階であってよく、液体または固体培養物中で生育させることもでき、鉢、温室または圃場において土壌または適切な培地で生育させることもできる。植物における導入されたリーダー、トレーラーまたは遺伝子配列の発現は一過性であっても恒久的であってもよい。「選択された植物種」は、これだけに限定されないが、これらの「植物」の任意の1つの種であってよい。
植物体の一部。本明細書で使用される場合、用語「植物体の一部」(またはジャガイモ植物体、またはその一部)は、これだけに限定されないが、プロトプラスト、葉、茎、根、根端、葯、雌ずい、種子、胚、花粉、胚珠、子葉(cotyledon)、胚軸、花、塊茎、芽、組織、葉柄、細胞、分裂組織細胞などを含む。
植物種。少なくともいくらかの有性生殖適合性を示す、種々の公式に名付けられた植物種に属する植物の群。
植物の形質転換および細胞培養。植物細胞を遺伝子改変し、維持、さらなる生育、および/またはさらなる発達のために適切な植物培養培地に移すプロセスを広範に指す。
的確な育種。選択された植物種から、または選択された植物と同じ種の別の植物から、または選択された植物種に対して有性生殖適合性の種から単離されたネイティブな遺伝子および調節エレメントなどの核酸を、個々の植物細胞に安定に導入し、その後、これらの遺伝子改変された植物細胞を植物全体に再生させることによって植物を改善することを指す。未知または外来の核酸は植物のゲノムに恒久的には組み入れられないので、本発明の技術では、従来の植物育種によっても利用可能である同じ遺伝物質を使用する。
後代。本明細書で使用される場合、2つのジャガイモ植物体であって、少なくとも1つの植物体はジャガイモ栽培品種Y9を含む、植物体の交配から生じたFジャガイモ植物体を含み、後代は、これだけに限定されないが、その後の、反復親系統とのF、F、F、F、F、F、F、F、およびY9世代の交配をさらに含む。
定量的形質遺伝子座(QTL)。定量的形質遺伝子座(QTL)とは、通常は継続的に分布する、数値で表すことが可能な形質をいくらかの程度まで制御する遺伝子座を指す。
組換え。本明細書で使用される場合、遺伝子をクローニングすることができ、DNAについて配列決定することができ、タンパク質産物を産生させることができる種々の技術を広範に説明する。本明細書で使用される場合、この用語はまた、植物宿主系の細胞に遺伝子を移入した後に産生されたタンパク質も説明する。
再生。再生は、組織培養物からの植物の発達を指す。
調節配列。植物系における目的の遺伝子の転写または結果として得られるRNAの翻訳を増大させ、かつ/または最大にするために発現ベクターに含めることができる、当業者には標準であり公知の配列を指す。それらとしては、これだけに限定されないが、プロモーター、ペプチド移出シグナル配列、イントロン、ポリアデニル化、および転写終結部位が挙げられる。植物における発現レベルが上昇するように核酸構築物を改変する方法も当技術分野で公知である(例えば、Rogersら、J. Biol. Chem. 260巻、3731〜38頁、1985年;Cornejoら、Plant Mol. Biol. 23巻:567:81、1993年を参照されたい)。タンパク質の転写の速度に影響を及ぼすための植物系の工学的操作では、正または負に作用する配列、エンハンサーおよびサイレンサーなどの調節配列、ならびにクロマチン構造を含めた、当技術分野で公知の様々な因子が影響を及ぼし得る。本発明は、目的のタンパク質を発現させるために植物を工学的操作するのに利用することができる、これらの因子の少なくとも1つを提供する。本発明の調節配列は、ネイティブな遺伝子エレメントである、すなわち、選択された改変しようとする植物種から単離されたものである。
選択マーカー。「選択マーカー」は、一般には、抗生物質、除草剤または毒性化合物に対するある種の抵抗性を付与するタンパク質をコードする遺伝子であり、形質転換事象を同定するために使用される。選択マーカーの例としては、ストレプトマイシン抵抗性をコードするストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼ(spt)遺伝子、マンノース−6−リン酸をフルクトース−6リン酸に変換するホスホマンノースイソメラーゼ(pmi)遺伝子;カナマイシンおよびジェネテシン抵抗性をコードするネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(nptII)遺伝子、ハイグロマイシンに対する抵抗性をコードするハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(hptまたはaphiv)遺伝子、スルホニル尿素型除草剤に対する抵抗性をコードするアセト乳酸合成酵素(als)遺伝子、ホスフィノトリシンまたはバスタ(basta)などの、グルタミン合成酵素の作用が阻害されるように作用する除草剤に対する抵抗性をコードする遺伝子(例えば、bar遺伝子)、または当技術分野で公知の他の同様の遺伝子が挙げられる。
センス抑制。トランスジェニック植物において、内在性遺伝子の発現を、その遺伝子の全部または一部の1つまたは複数の追加的なコピーを発現させることによって低減させること。
比重。本明細書で使用される場合、「比重」は、密度の表現であり、ジャガイモ品質の尺度である。塊茎の比重およびデンプン含有量および乾物または総固形物の百分率の間には高い相関がある。比重が高いほど、加工製品の回収率が高くなり、かつ、品質がより良好になる。
T−DNA様。「T−DNA様」配列は、選択された植物種から、または選択された植物種に対して有性生殖適合性の植物から単離された核酸であり、Agrobacterium種T−DNAと少なくとも75%、80%、85%、90%、または95%であるが100%ではない配列同一性を共有する。T−DNA様配列は、それぞれが、ヌクレオチド配列を別のポリヌクレオチドに組み込むことが可能な1つまたは複数の境界または境界様配列を含有してよい。
総収量。総収量は、収穫された塊茎全ての総重量を指す。
トレーラー。遺伝子の後に続く(または遺伝子の3’側にある)、転写されるが翻訳はされない配列。
転写されるDNA。前述のプロモーターの作用により、単一のmRNAとして転写される、遺伝子と、その遺伝子に付随する非翻訳リーダー配列およびトレーラー配列の両方を含むDNA。
植物細胞の形質転換。DNAが植物細胞のゲノムに安定に組み込まれるプロセス。「安定に」とは、細胞ゲノムにおける、および細胞ゲノムによるポリヌクレオチドの恒久的な、または一過性ではない保持および/または発現を指す。したがって、安定に組み込まれたポリヌクレオチドは、形質転換された細胞ゲノム内の定着物(fixture)であり、細胞または得られた形質転換された植物の連続的な後代を通じて複製および繁殖させることができるポリヌクレオチドである。形質転換は、当技術分野で周知の種々の方法を使用して、天然の条件下で行うこともでき、人工的な条件下で行うこともできる。形質転換は、Agrobacterium媒介形質転換プロトコール、ウイルス感染、ウィスカー、電気穿孔、熱ショック、リポフェクション、ポリエチレングリコール処理、微量注入、および微粒子銃(particle bombardment)を含めた、原核生物または真核生物宿主細胞に核酸配列を挿入するための任意の公知の方法に依拠するものであってよい。
導入遺伝子。タンパク質コード領域を含む、宿主ゲノムに挿入される遺伝子。本発明に関しては、導入遺伝子を含むエレメントが宿主ゲノムから単離される。
トランスジェニック植物。少なくとも1つの導入遺伝子を含有する、遺伝子改変された植物。
バリアント。本明細書で使用される場合、「バリアント」は、特定の遺伝子またはタンパク質の標準または所与のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列から逸脱したヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を意味するものと理解される。用語「アイソフォーム」、「アイソタイプ」および「類似体」も、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の「バリアント」形態を指す。1つまたは複数のアミノ酸の付加、除去もしくは置換、またはヌクレオチド配列の変化により変更されたアミノ酸配列は、「バリアント」配列とみなすことができる。バリアントは、置換アミノ酸が同様の構造的または化学的性質を有する「保存的」変化、例えば、ロイシンのイソロイシンでの置き換えを有してよい。バリアントは、「非保存的」変化、例えば、グリシンのトリプトファンでの置き換えを有してよい。類似の軽微な変動は、アミノ酸の欠失または挿入、またはその両方を含んでもよい。どのアミノ酸残基を置換する、挿入する、または欠失させることができるかの決定の手引きは、Vector NTI Suite(InforMax、MD)ソフトウェアなどの、当技術分野で周知のコンピュータプログラムを使用して見出すことができる。
つるの成熟度。つるの成熟度は、植物の、炭水化物の利用および光合成を続ける能力を指す。つるの成熟度は、1〜5のスケールにスコア化され、ここで、1=枯れたつるであり、5=まだ開花する緑色のつるである。
ジャガイモは、四倍体であり、高度にヘテロ接合性であり、かつ近交弱勢に対して感受性であるので、ジャガイモ植物体のゲノムへの望ましい形質の挿入には特定の難しさがある。したがって、従来の育種を使用すると、加工中のアクリルアミドの生成が少なく、N−ニトロソ−N−(3−ケト−1,2−ブタンジオール)−3’−ニトロチラミン(Wangら、Arch Toxicol、70巻:10〜5頁、1995年)、5−ヒドロキシメチル−2−フルフラール(Janzowskiら、Food Chem Toxicol、38巻:801〜9頁、2000年)、および変異原性を有する他のメイラード反応生成物(Shibamoto、Prog Clin Biol Res、304巻:359〜76頁、1989年)を含めた有害なメイラード反応生成物が少ないトランスジェニックジャガイモ植物体を効率的に開発することが非常に難しい。
加工の変化、デキストロースの低減、ならびにアスパラギナーゼ、クエン酸塩、および競合アミノ酸などの添加物を通じてアクリルアミドを低減するためのいくつかの方法が試験されており、研究が進行中である。ジャガイモ産業全体を通して加工の変化を実行するために必要な資本支出は、数百万ドルかかる。支出に加えて、これらの加工の変化には、アスパラギナーゼまたはクエン酸塩などの添加物に付随する潜在的に負のフレーバーを含めた重大な欠点がある。一般には、フライ製造者は、フレンチフライの加工中、所望の黄金色を発生させるためにデキストロースを添加するが、デキストロースはまた、メイラード反応によるアクリルアミドの形成も増加させる。ただ単に加工からデキストロースを取り除くことによってアクリルアミドの有意な減少が起こるが、そうすると、特徴的な黄金色をいくつかの他のやり方(例えば、アナトーのような着色料を添加することによってなど)で発生させなければならない。代替の着色料を使用することにより、これらの褐色化反応によって発生する典型的なフレーバーが存在しなくなる。アスパラギンのような反応物を減少させるために添加物を使用することに伴う別の難題は、凍結貯蔵中に水分移行が起こり、その結果、アスパラギンが表面に戻ってアクリルアミドが増加することである。最後に、ジャガイモが打撲を受けた後に起こる黒変が、フレンチフライおよびチップの加工における品質および回収率に影響を及ぼす。損傷し、打撲を受けたジャガイモは、不要な部分を切り取らなければならないか、または加工前に拒絶され、その結果、品質の問題または経済的損失が生じる。
本発明の「ネイティブな技術」戦略は、ジャガイモの農業特性および栄養価を改善するというジャガイモ産業の必要性に、打撲黒斑に関与するポリフェノールオキシダーゼ−5(PPO−5)の発現、アクリルアミド形成における前駆物質であるアスパラギンの蓄積に関与するアスパラギンシンテターゼ−1(Asn−1)の発現を低減させること、スクロースをグルコースおよびフルクトースに変換する酵素液胞インベルターゼの発現、ならびに/または通常はアスパラギンなどのアミノ酸と反応し、アクリルアミドを含めた毒性メイラード生成物を形成する還元糖の蓄積に関連する酵素であるホスホリラーゼ−Lおよびキナーゼ−R1の発現を低減させることによって対処するものである。塊茎におけるこれらの遺伝子の部分的なまたは完全なサイレンシングにより、アクリルアミドが生成する潜在性が低下する。本発明のネイティブな技術の使用により、ジャガイモを、ジャガイモ植物体またはジャガイモ植物体に対して有性生殖適合性である植物体から得られた、非コード調節領域を含む遺伝子材料である「ネイティブな」遺伝子材料のみを用いて形質転換することにより、いかなる外来遺伝子材料も植物のゲノムに組み込むことなく望ましい形質を組み入れることが可能になる。望ましい形質としては、衝撃に誘導される打撲黒斑に対する高い耐性、アクリルアミドを含めた毒性メイラード生成物の蓄積の減少を結果として伴う、アクリルアミド前駆物質アスパラギンの形成の減少および還元糖の蓄積の減少、品質の改善、ならびに食品の色の制御が挙げられる。これらの望ましい形質を既存のジャガイモ品種に組み入れることは従来育種によっては実現不可能であり、これは、ジャガイモが四倍体であり、高度にヘテロ接合性であり、かつ近交弱勢に対して感受性であることが理由である。
本発明において使用する非コードジャガイモ植物体DNA挿入断片配列は、ジャガイモ植物体ゲノムに対してネイティブであり、いかなるAgrobacterium DNAも含有しない。DNA挿入断片のうちの1つは、2つの発現カセットを含み、pSIM1278形質転換ベクターと称される形質転換ベクターに挿入されることが好ましい。第1のカセットは、ADPグルコースピロホスホリラーゼ(Agp)遺伝子のAgpプロモーターと顆粒結合合成酵素(Gbss)遺伝子のGbssプロモーターの間に逆方向反復として配置された、アスパラギンシンテターゼ−1(Asn1)遺伝子とポリフェノールオキシダーゼ−5(Ppo5)遺伝子の両方の断片を含む。これらのプロモーターは、主に塊茎において活性である。第2のカセットの機能は、デンプン関連遺伝子ジキナーゼ−R1(R1)およびホスホリラーゼ−L(PhL)遺伝子のプロモーターをサイレンシングすることである。このカセットは、第1のカセットと同じAgpプロモーターおよびGbssプロモーターに作動可能に連結した、デンプン関連遺伝子ジキナーゼ−R1(R1)およびホスホリラーゼ−L(PhL)遺伝子のプロモーターの断片で構成される。これらの発現カセットは外来DNAを含有せず、選択された植物種または選択された植物種に対して有性生殖適合性の植物に由来するDNAのみからなる。第2のDNA挿入断片は、Rpi−vnt1発現カセットおよび植物液胞インベルターゼ遺伝子、VInvに対するサイレンシングカセットを含む、pSIM1678と称される形質転換ベクターによってもたらされる。Rpi−vnt1遺伝子カセットは、疫病に対する広範な抵抗性を付与する、そのネイティブなプロモーター配列およびターミネーター配列によって調節されるVNT1タンパク質コード領域からなり、一方、サイレンシングカセットは、対向する植物プロモーター、pGbssおよびpAgpで挟まれた、ジャガイモVInv遺伝子由来の配列の逆方向反復からなる。第1のカセットの機能は、疫病に対する抵抗性を付与することであり、一方、第2のカセットの機能は、液胞インベルターゼ遺伝子をサイレンシングし、それにより、グルコースおよびフルクトースを減少させることである。
本発明において使用する商業的に有益なジャガイモ植物体変種は、Atlanticである。Atlanticは、Y9の親変種である。植物体は中程度に大きく、太く直立した茎、および、わずかに膨らみ、まばらに軟毛を有する節を有する。葉は明るく、中間の緑色で、滑らかであり、中程度に軟毛を有し、突き出た羽、大きな非対称の一次小葉および多数の二次および三次小葉を有する。花は豊富であり、緑色の千枚通し形の、軟毛を有する萼裂片、薄いラベンダー色の花冠、オレンジ色の葯および大量の生育可能な花粉を有する。当該品種は、そうか病及びVerticilliumによる立ち枯れ病に抵抗性があり、ピンクアイ(pinkeye)への耐性を示し、レースAのジャガイモシストセンチュウ、Xウイルス、塊茎網状壊疸への高い耐性を示し、そして、打撲黒斑へのいくらかの耐性を示す。塊茎は、特に温暖な乾燥時期の砂質土壌において、内部熱壊死に罹患しやすい。直径の大きい塊茎(直径>4インチ)における空洞病は、一部の生長地域において重篤になり得る。塊茎は、楕円から丸形であり、軽〜重度に鱗状で覆われた網状の皮、中程度に浅い芽、および白色の果肉を有する。塊茎休眠は、中程度の長さである。高収量潜在性、高い比重、ならびに均一な塊茎の大きさ及び形状のため、Atlanticは、田畑からの、または非常に短期間の貯蔵からの、チップス製造に標準的な変種である(Webb et al.,1978)。この変種は、繁殖力が高く、特にチップスの製造のために、主に北東部及び南東部で育てられる。
本発明は、形質転換ベクターpSIM1278で形質転換し、その後、第2の形質転換ベクターpSIM1678で形質転換し、マーカーではなくポリメラーゼ連鎖反応を使用して同定し、繁殖に成功した、有意な市場価値のあるジャガイモ変種、すなわち、Atlanticを提供する。本発明のジャガイモ植物体変種Y9の塊茎から作られた食品製品も提供される。ジャガイモ栽培品種Y9は、以下のOrganization for Economic Cooperation and Development(OECD)の独特の植物変種識別子を有する。
ネイティブなDNAを用いた標的化遺伝子サイレンシングにより、ジャガイモ植物体変種Y9の塊茎における標的化遺伝子のRNA転写物のレベルが低下する。ジャガイモ栽培品種Y9は、塊茎における還元糖のレベルを多数の機構によって低下させる発現カセットを含有する。pSIM1278を用いた形質転換を通じて、デンプン関連遺伝子(R1)およびホスホリラーゼ−L遺伝子(PhL)のプロモーターに対するサイレンシングカセットが導入され、一方、pSIM1678を用いた形質転換により、インベルターゼ遺伝子に対するサイレンシングカセットが導入された(VInv;Yeら、2010年)。まとめると、これらの形質は、デンプンおよびスクロースの還元糖(グルコースおよびフルクトース)への変換を遅くすることによって機能する。
したがって、本発明のジャガイモ植物体変種Y9の塊茎には、揚げたときまたは焼いたときのアクリルアミド形成の低減に関連する、遊離のアミドアミノ酸アスパラギンおよびグルタミンの比率の低下を含めた、高度に望ましい形質が組み入れられる。具体的には、本発明のジャガイモ変種Y9は、遊離のアスパラギン含有量が2分の1〜4分の1よりも大きく減少すること、打撲黒斑に伴う変色が低減すること、および、疫病に対する抵抗性が増大することを特徴とする。さらに、本発明のジャガイモ変種Y9は、貯蔵中の、デンプンの還元糖グルコースおよびフルクトースへの分解の遅延を示す。デンプンから糖への変換を損なうことにより、さらに、老化により甘くなることおよびアクリルアミド形成が低減され、熱により誘導される褐変が限定される。
したがって、本発明のジャガイモ変種Y9は、加熱加工の際にその塊茎で生成されるアクリルアミドが有意に少なく、いかなる潜在的に有害な外来遺伝子も保有しないので、ジャガイモ産業および食品市場において非常に価値がある。
本発明では、新しい遺伝子内ジャガイモ植物体変種を開発するために、ネイティブな技術を使用して、選択されたジャガイモ植物体変種のゲノムにネイティブな非コードDNAを組み込む。方法は、形質同定、ベクターの設計、Agrobacteriumへのベクターの組み入れ、レシピエントジャガイモ変種の選択、植物の形質転換、オープンリーディングフレームが存在しないことの証明、および新しいジャガイモ植物体変種がネイティブなDNAのみを含有することの確認を含む。本発明のジャガイモ栽培品種Y9は、アクリルアミドを形成する能力が低く、スクロースの量が少なく、かつ、打撲黒斑に対する抵抗性が形質転換されていない対応物よりも高い。さらに、本発明のジャガイモ栽培品種Y9は、疫病に対する抵抗性が増大している。
(実施例1)
pSIM1278形質転換ベクター骨格
プラスミドpSIM1278は、ジャガイモを形質転換するために使用される、19.7kbのバイナリー形質転換ベクターである。この実施例では、遺伝子エレメントの供給源、骨格およびT−DNA配列のクローニングステップ、ならびにプラスミド内のエレメントの順序を示す。
プラスミド骨格(図1および表1)は、2つのよく特徴付けられた細菌の複製起点を含有する。pVS1(pVS1 StaおよびRep)はAgrobacteriumにおけるプラスミドの維持を可能にし、pBR322(pBR322 bomおよびori)は、Escherichia coliにおけるプラスミドの維持を可能にするものである。Agrobacterium DNAオーバードライブ配列により、RBにおける切断が増強され、そしてE.coli nptII遺伝子は、細菌性カナマイシン選択マーカーである。骨格は、Ranger Russetジャガイモポリユビキチン(Ubi7)プロモーターとRanger Russetジャガイモポリユビキチン(Ubi3)ターミネーターで挟まれたAgrobacteriumイソペンテニルトランスフェラーゼ(ipt)遺伝子を含む発現カセットを含有する。iptカセットは、宿主植物へのプラスミド骨格DNAの組み込みに対する選択に使用するためのスクリーニング可能な表現型である。形質転換された植物組織において存在する場合、iptの過剰発現により植物ホルモンであるサイトカイニンが過剰産生され、その結果、生育が妨げられる表現型を有し、葉が異常であり、根付くことができない植物が生じる。
骨格部分は植物細胞に移入されない。骨格の種々のエレメントを表1に記載する。
(実施例2)
pSIM1278形質転換ベクターT−DNA
pSIM1278に使用する、隣接境界配列を含めたpSIM1278 DNA挿入断片領域は、長さが1bpから10,148bpまでの10,148bpである。pSIM1278 DNA挿入断片は、ネイティブなDNAのみからなり、ジャガイモゲノム内に安定に組み込まれる。pSIM1278 DNA挿入断片またはその機能性部分は、ベクターpSIM1278の、本発明のジャガイモ植物体品種に組み込まれる唯一の遺伝物質である。
pSIM1278 DNA挿入断片は、図1(ベクター骨格領域と共に)、図2、および以下の表2に記載されている。LB配列およびRB配列(各25bp)を、Agrobacterium tumefaciens由来のT−DNAの境界と類似し、同様に機能するように、合成により設計した。GenBank Accession AY566555を、境界領域についてのDNAの供給源が明白になるように修正した。遺伝子エレメント5および10と記載されているASN1は、Chawlaら、2012年ではStAst1と称されている。
プラスミドpSIM1278 T−DNAは、2つの発現カセットを含有する:
第1のカセット(エレメント4〜12、表2)は、形質転換されたジャガイモ変種におけるAsn1およびPpo5を下方制御するものである。第1のカセットは、2つの同一の405bpのAsn1の断片および2つの同一の144bpのPpo5の断片で構成される。Asn1の断片およびPpo5の断片は、非コード157bp Ranger Russetジャガイモヌクレオチドスペーサーエレメントによって分離された逆方向反復として配置する。Asn1断片およびPpo5断片は、主に塊茎において活性である2つのジャガイモ収束プロモーター;ADPグルコースピロホスホリラーゼ(Agp)遺伝子のAgpプロモーターと顆粒結合デンプン合成酵素(Gbss)遺伝子のGbssプロモーターとの間に配置する。これらのプロモーターにより、逆方向反復の発現が駆動されて二本鎖RNAが生成し、Asn1およびPpo5が下方制御される。
第2のカセット(エレメント14〜21、表2)は、形質転換されたジャガイモ品種におけるPhLおよびR1を下方制御するものである。第2のカセットは、2つの同一の509bpのPhLプロモーター領域(pPhL)の断片および2つの同一の532bpのR1プロモーター領域(pR1)の断片で構成される。pPhL断片およびpR1断片は、Ranger Russetジャガイモポリユビキチン遺伝子の非コード258bp断片によって分離された逆方向反復として配置する。第1のカセットと同様に、pPhL断片およびpR1断片は、ジャガイモAgpプロモーターとGbssプロモーターとの間に配置され、それらによって転写される。
したがって、表1および表2から見ることができるように、pSIM1278プラスミドは、ジャガイモ植物体を形質転換するために設計されたバイナリーベクターである。ベクター骨格は、E.coliおよびAgrobacteriumの両方における複製のための配列を、ベクター骨格DNAを有する植物を除去するためのスクリーニング用のiptマーカーと共に含有する。T−DNA領域は、LB配列とRB配列で挟まれた2つの発現カセットからなる。宿主植物組織にpSIM1278ベクターを含有するAgrobacteriumを接種すると、pSIM1278のT−DNA領域が宿主ゲノム内に移入される。
本開示のジャガイモ栽培品種Y9を創出するために使用した、表2に記載されているDNA挿入断片は、隣接する遺伝子を活性化せず、ジャガイモ植物体品種の表現型に悪影響を及ぼさない。
(実施例3)
pSIM1678形質転換ベクター骨格
プラスミドpSIM1678は、ジャガイモを形質転換するために使用される、18.6kbのバイナリー形質転換ベクターである。この実施例では、遺伝子エレメントの供給源、骨格およびT−DNA配列のクローニングステップ、ならびにプラスミド内のエレメントの順序を示す。
プラスミド骨格(図3;表3)は、2つのよく特徴付けられた細菌の複製起点を含有する。pVS1(pVS1 StaおよびRep)はAgrobacteriumにおけるプラスミドの維持を可能にし、pBR322(pBR322 bomおよびori)は、Escherichia coliにおけるプラスミドの維持を可能にするものである。Agrobacterium DNAオーバードライブ配列により、RBにおける切断が増強され、そしてE.coli nptII遺伝子は、細菌性カナマイシン選択マーカーである。骨格は、Ranger Russetジャガイモポリユビキチン(Ubi7)プロモーターとRanger Russetジャガイモポリユビキチン(Ubi3)ターミネーターとで挟まれたAgrobacteriumイソペンテニルトランスフェラーゼ(ipt)遺伝子を含む発現カセットを含有する(GarbarinoおよびBelknap、1994年)。iptカセットは、宿主植物へのプラスミド骨格DNAの組み込みに対する選択に使用するためのスクリーニング可能な表現型である。形質転換された植物組織において存在する場合、iptの過剰発現により植物ホルモンであるサイトカイニンが過剰産生され、その結果、生育が妨げられる表現型を有し、葉が異常であり、根付くことができない植物が生じる。
骨格部分は植物細胞に移入されない。骨格の種々のエレメントは、表3に記載されている。
(実施例4)
pSIM1678形質転換ベクターT−DNA
pSIM1678において使用する、隣接境界配列を含めたpSIM1678 DNA挿入断片領域は、9,090bpの長さである(1bpから9,090bpまで)。pSIM1678 DNA挿入断片は、ネイティブなDNAのみからなり、ジャガイモゲノム内に安定に組み込まれる。pSIM1678 DNA挿入断片またはその機能性部分は、本発明のジャガイモ植物体変種に組み込まれるベクターpSIM1678の唯一の遺伝物質である。
pSIM1678 DNA挿入断片は、図3(ベクター骨格領域と共に)、および以下の表4に記載されている。表4では、LB配列およびRB配列(各25−bp)を、Agrobacterium tumefaciens由来のT−DNAの境界と類似し、同様に機能するように、合成により設計した。GenBank Accession AY566555を、境界領域についてのDNAの供給源が明白になるように修正した。
プラスミドpSIM1678 T−DNAは、1−bpから9,090−bpまでであり、2つの発現カセットを含有する(図3):
第1のカセット(エレメント4〜6、表4)は、Solanum venturiiに由来する2,626bpのRpi−vnt1(Vnt1)遺伝子を含有する。遺伝子産物VNT1は、ジャガイモをPhytophthora infestansによる疫病感染から保護する植物免疫応答に関与するR−タンパク質である。この遺伝子は、ネイティブなVnt1プロモーターpVnt1、およびターミネーターtVnt1の下で発現する。
第2のカセット(エレメント8〜14、表4)は、形質転換されたジャガイモ変種における液胞インベルターゼ(VInv)の下方制御を結果としてもたらす。第2のカセットは、分離された逆方向反復として配置された2つのVInvの断片(エレメント10および12、表4)で構成される。VInv断片は、主に塊茎において活性である2つのジャガイモ収束プロモーター;ADPグルコースピロホスホリラーゼ(Agp)遺伝子のAgpプロモーターと顆粒結合デンプン合成酵素(Gbss)遺伝子のGbssプロモーターとの間に配置する。これらのプロモーターにより、逆方向反復の発現が駆動されて二本鎖RNAが生成し、VInvが下方制御される。
したがって、表3および表4から見ることができるように、pSIM1678プラスミドは、ジャガイモ植物体を形質転換するために設計されたバイナリーベクターである。ベクター骨格は、E.coliおよびAgrobacteriumの両方における複製のための配列を、ベクター骨格DNAを有する植物を除去するためのスクリーニング用のiptマーカーと共に含有する。T−DNA領域は、LB配列とRB配列とで挟まれた2つの発現カセットからなる。宿主植物組織にpSIM1678ベクターを有するAgrobacteriumを接種すると、pSIM1678のT−DNA領域が宿主ゲノム内に移入される。
(実施例5)
Agrobacterium株およびトランスフェクション
C58由来のAgrobacterium株AGL1は、強毒性プラスミドpTiBo542のトランスファーDNAを正確に欠失させることによって開発された(Lazoら、1991年)。一般的な組換え遺伝子(recA)にトランスポゾンを挿入することにより、pSIM1278などの組換えプラスミドベクターが安定化する(図1)。AGL1は、カルベニシリンおよびリファンピシンに対する抵抗性を示し、チメンチンを使用する形質転換されたジャガイモ組織から除去される。選択後、植物は、抗生物質およびAgrobacteriumのどちらも含まず、ジャガイモ由来の発現カセットが植物のゲノム内に挿入されている。
ストックの植物体を、3%スクロースおよび2g/lのゲルライトを含有する、半分の強度のM516(Phytotechnology)培地(繁殖培地)40mlを伴うマゼンタボックス(magenta box)中で維持した。4週齢の植物体から4〜6mmのジャガイモ節間セグメントを切り取り、pSIM1278を有するAgrobacterium AGL1株を感染させ、3%スクロースおよび6g/lの寒天を含有する組織培養培地(共栽培培地)に移した。2日後、感染外植片を、3%スクロース、6g/lの寒天および150mg/lのチメンチンを含有するM404(Phytotechnology)培地に移してAgrobacteriumを除去した(ホルモンを含まない培地)。この方法の詳細は、Richaelら(2008年)に記載されている。
1カ月後、感染外植片を、いかなる合成ホルモンも欠く新鮮な培地に移し、Percival生育チャンバー中、24℃、16時間の光周期の下でインキュベートし、そこで感染外植片の苗条形成を開始させた。多くの苗条がipt遺伝子を発現し、サイトカイニン過剰産生表現型を示した。これらの苗条は、さらなる分析については検討されなかった。PCR遺伝子型決定により、残りの苗条の約0.3〜1.5%が、P−DNAの少なくとも一部を含有するがipt遺伝子を欠くことが実証された。したがって、形質転換された植物を選択するためにマーカーは使用しなかった。iptに基づく、マーカーを用いない植物の形質転換に関する詳細は、Richaelら(2008年)により公開されている。
Agrobacteriumを除去するプロセスは外植片への感染後2日目に開始した。この目的のために、組織を、生きているAgrobacteriumを含まないことが証明されるまで、抗生物質チメンチン(150mg/L)に供した。証明は、形質転換された事象の茎断片を栄養ブロス−酵母抽出物(NBY培地)上、28℃で2週間インキュベートすることによって得た(2回繰り返した)。97 CFR Part 340に従って、生きているAgrobacteriumを含まない場合にのみ、形質転換された植物を圃場に移し、植えた。
Atlantic Y9事象は、異なるプラスミドを用いた2つの別々の形質転換に由来する挿入断片を含有する。第1の挿入断片、プラスミドpSIM1278は、塊茎における最大4つのジャガイモ遺伝子、Asn1、Ppo5、R1、およびPhLをサイレンシングするために設計された逆方向反復からなる2つのカセットを含有する。同様に、第2のプラスミド、pSIM1678は、塊茎におけるVInv遺伝子をサイレンシングするための逆方向反復からなるカセットを含有するが、同時に、ネイティブなジャガイモプロモーター下にあるRpi−vnt1遺伝子のコピーも含有する。
ジャガイモ植物体変種を、組み込まれたDNA挿入断片配列の構造およびコピー数を決定するため、およびベクター骨格配列が存在しないことを確認するために、DNAゲルブロット分析によって分析した。
(実施例6)
ベクター骨格DNAが存在しないことの証明
多くの商業的なトランスジェニック作物とは異なり、本開示のジャガイモ栽培品種は、ベクター骨格DNAなどの、形質転換のために使用されたAgrobacterium由来のDNA配列を含まないことが以下の2つの異なる方法によって確認された:1)第1に、Agrobacteriumから植物細胞へのイソペンテニルイソメラーゼ(ipt)遺伝子発現カセットを含む骨格DNAの偶発的移入により、ipt遺伝子発現、したがって、サイトカイニン型ホルモンであるイソペンテニルアデノシンの形成が誘発されるので、負の選択が可能なiptマーカー遺伝子がベクター骨格内に存在するかしないかを決定し、植物体が、プラスミド骨格内の負の選択が可能なイソペンテニルイソメラーゼ(ipt)マーカー遺伝子に関連する表現型を有した場合には、それらを廃棄した。2)次いで、第1のスクリーニング方法を通過した形質転換されたジャガイモ植物体に対して、サザンブロットハイブリダイゼーションを使用して骨格DNAが存在しないことを確認した。
したがって、上記の2つの分析から、Atlantic Y9事象が、形質転換に使用したいずれのプラスミドに由来する骨格も含有しないことが示された。
(実施例7)
挿入DNAの安定性
細菌T−DNAは、植物への挿入後に安定であるとは限らない。推定される不安定率(0.5〜5.9×10−4)は、減数分裂に関連付けられ(Mullerら、1987年;Connerら、1998年)、これは、ジャガイモは栄養生殖するので、ジャガイモには関係ない。したがって、DNA挿入は安定であることが予測される。商業的に植えられるのは塊茎であるので、その後の世代の定義には種子ではなく塊茎を使用した。
分子アッセイおよび表現型アッセイを使用して遺伝学的安定性を評価した。挿入断片の構造は、3世代のY9ジャガイモ(G0〜G3)にわたって単離されたゲノムDNAのサザンブロット分析を使用して安定であることが示され、一方、表現型安定性は、第2世代の圃場で生育させた塊茎におけるポリフェノールオキシダーゼ活性を測定することによって評価した。この方法では、ジャガイモの切断面にカテコールを塗布した後、PPOサイレンシングの視覚的証拠が示される。これらの試験は、Y9における所望の遺伝子変化が多数のクローンサイクルにわたって安定なままであり、同時に形質が維持されることを確実にするために行った。
DNA挿入断片の安定性を、サザンブロットを使用して3つの連続的なクローン世代(G1、G2、およびG3)を元の形質転換体(G0)と比較することによって評価した。安定なDNA挿入断片は、同じ構造を維持し、したがって、多世代の植物体にわたって同じ消化パターンを生じることが予測される。Y9事象における挿入断片の安定性を試験するために、pSIM1278およびpSIM1678の両方に由来する挿入断片の領域にハイブリダイズする2種のプローブ(GBS1およびAGP)、ならびにpSIM1678挿入断片に特異的な2種のプローブ(INVおよびVNT1)を使用して、その消化パターンを比較した。これらのプローブがハイブリダイズするDNA配列は、ジャガイモゲノム内およびDNA挿入断片(単数または複数)内に含有されるので、サザンブロットでは内在性バンドおよび挿入断片特異的バンドの両方が予測される。
全てのゲノムDNA試料を制限酵素EcoRVで消化し、AGPまたはGBS1のいずれかに特異的なプローブとハイブリダイズさせた。EcoRVは、両方の挿入断片の内部を消化して、pSIM1278挿入断片において予測サイズ(例えば、2.3kb)の内側のバンドを伴う独特のバンディングのパターンをもたらすので、これらの試験に選択した。Y9の全ての試料の間で、バンディングのパターンは、どちらのプローブについても互いに同一であった。Atlantic対照に存在する複数のバンドはY9でも見られるが、Y9は、pSIM1278挿入断片およびpSIM1678挿入断片に対応するバンドも含有する。これらのバンドは、同様に、分析したY9の全ての世代の間で一貫しており、これにより、両方の挿入断片の遺伝学的安定性が示される。
第2の分析は、pSIM1678挿入断片に特異的な2種のプローブを使用して実施した。この分析のために、ゲノムDNA試料を制限酵素XbaIで消化し、VNT1プローブおよびINVプローブとハイブリダイズした。XbaIは、pSIM1678を内部で消化し、既知サイズ(例えば、INVプローブについては4.6kb)のバンドを生じるので、これらの試験の制限酵素として選択した。再度、内在性バンドおよび挿入断片特異的バンドの両方が検出され、分析した3世代の間で一貫したバンディングのパターンが伴った。遺伝学的および表現型解析により、pSIM1278およびpSIM1678の両方の形質転換によって生じる挿入が3世代にわたって安定であることが示された。3世代にわたって実証された安定性を考慮すると、安定性は、その後の栄養繁殖のサイクルの間、維持される可能性がある。
(実施例8)
遺伝子サイレンシングの有効性および組織特異性
サイレンシングの標的とする遺伝子およびプロモーターに由来する配列を含有する逆方向反復配列を導入することによってサイレンシングを実現した。二本鎖RNA媒介性サイレンシングに関与するいくつもの並行経路が存在するが、これらの逆方向反復の転写は、ウイルス防御に関与する細胞機構によって処理されると考えられている(Fusaroら、2006年)。Y9ジャガイモは、合計5つの異なるジャガイモ遺伝子に由来する配列を含有する3つの独特のカセットを含有する。pSIM1278構築物は、2つの遺伝子サイレンシングカセットからなる(図4、上の構築物を参照されたい)。一方のカセットは、2種の遺伝子、アスパラギンシンテターゼ−1(Asn1)およびポリフェノールオキシダーゼ−5(Ppo5)に由来する配列の逆方向反復を含有する。第2のカセットは、デンプン関連遺伝子、R1(531−bp)およびホスホリラーゼ−L(PhL)(508−bp)のプロモーターに由来する配列を含む。最終的なカセットを、液胞インベルターゼ(VInv)遺伝子由来の配列を含有する逆方向反復を含むpSIM1678構築物によって導入した(図4、下の構築物を参照されたい)。
3つのサイレンシングカセットは全て、塊茎において、光合成的に活性な組織および根と比較して高度に活性である、ジャガイモのAgp遺伝子およびGbss遺伝子に由来する同じよく特徴付けられた組織特異的プロモーターによって調節される(Nakataら、1994年;Visserら、1991年)。したがって、発現および遺伝子サイレンシングは、塊茎において最も有効であり、かつ、大きく限定されると予測された。
5種の標的遺伝子の全ての発現を、ノーザンブロット分析によって特徴付けて、核カセットからの遺伝子サイレンシングの効果を決定した。そして、以下の表5により示される通り、5遺伝子の全てが塊茎において下方制御されることが示された。
Y9事象において、Asn1、Ppo5、PhL、R1、およびVInv遺伝子の塊茎特異的な下方制御が観察された。他の組織における発現レベルは、葉におけるAsn1ならびに花におけるAsn1およびVInvの部分的な下方制御以外は影響を受けなかった。
(実施例9)
ジャガイモ栽培品種Y9の特徴付けの概要
ジャガイモ変種Y9は、疫病に対する抵抗性を増大させること、打撲黒斑に関与する酵素の発現を低下させること、および、反応物、すなわちアスパラギンおよび還元糖の濃度を低下させることによりアクリルアミドを減少させることによって品質を改善するというジャガイモ産業の必要性に対処するものである。ジャガイモ品種Y9を、ジャガイモ植物体ゲノムに対してネイティブであり、外来DNA、Agrobacterium DNA、ウイルスマーカーまたはベクター骨格配列を含有しない核酸配列で形質転換した。さらに、農学的試験を行って、当該事象が、形質に関連する特性を例外として従来の対照と同様に生育することを確実にした。
2014年に米国の7カ所において圃場試験を行った。この試験の目的は、Y9ジャガイモの表現型性能、塊茎、および生態学的相互作用を、非形質転換対照である、親変種のAtlanticと比較して評価することであった。
表現型、塊茎、および生態学的相互作用の試験は、Y9とAtlantic対照の間でいかなる意味のある差異も示さなかった。
表現型特性のいずれについても統計的な差は検出されず、これにより、Y9が表現型に関してAtlanticと同等であることが示される。
塊茎評価について、Y9について、対照と比較して比重がより高かったが、従来のジャガイモにおいてみられる値の範囲内であった。この変化は、従来のジャガイモと同一であるY9の環境影響を変化させない。
昆虫、病害、および非生物的ストレッサー、ならびに節足動物発生量についての差異がないことにより、Y9の生態学的相互作用が従来のジャガイモと同じであるという結論が支持される。
表現型性能、塊茎評価、および生態学的相互作用の試験は、Y9とAtlantic対照の間に意味のある差異を示さなかった。表現型特性のいずれに関しても、統計的な差異が検出されなかった。塊茎評価については、比重は対照と比較してY9に関して高かったが、従来のジャガイモにおいて見いだされる値の範囲内であった。この変化は、従来のジャガイモと同じであるY9の環境影響を変化させない。昆虫、病害、および非生物学的ストレッサーならびに節足動物発生量に関して差異がないことにより、Y9の生態学的相互作用が従来のジャガイモと同じであるという結論が支持される。
(実施例10A)
ジャガイモ栽培品種Y9疫病有効性2013実験
この試験の目的は、ジャガイモ事象Y9の葉の疫病(Phytophthora infestans)に対する圃場での有効性を評価することであった。
2013年の間に3カ所で圃場試験を行った。プロットに、疫病のUS−8株、US−22株、および/またはUS−23株を接種した。葉の感染の程度を、季節を通して評価した。
Y9では、それらの形質転換されていない親対照と比較して、疫病への葉の感染の有意な低減が観察され、これにより、試験したP.infestansの株に対する疫病抵抗性形質の有効性が実証される。
(実施例10B)
ジャガイモ栽培品種Y9疫病有効性2014実験
この試験の目的は、ジャガイモ事象Y9の葉の疫病(Phytophthora infestans)に対する圃場での有効性を評価することであった。
2014年の間に2カ所で圃場試験を行った。プロットに疫病のUS−23株を接種した。葉の感染の程度を、季節を通して評価した。
Y9では、それらの形質転換されていない親対照と比較して、疫病への葉の感染の有意な低減が観察され、これにより、試験したP.infestansの株に対する疫病抵抗性形質の有効性が実証される。
参照による組み込み
本明細書において引用されている全ての参考文献、論文、刊行物、特許、特許公報、および特許出願は、あらゆる目的に関してそれらの全体が参照により組み込まれる。しかし、本明細書において引用されている参考文献、論文、刊行物、特許、特許公報、および特許出願のいずれに対する言及も、それらが有効な先行技術を構成するまたは世界の任意の国における共通の一般知識の一部を形成することの承認またはいかなる形態の示唆でもなく、そのように取られるべきではない。
上記の説明は、単に例示的な実施形態および実施例を表すものであることが理解されるべきである。読者の利便性のために、上記の説明は、本開示の原理を教示する全ての可能性のある実施形態、実施例のうちの限られた数の代表的な例に焦点を合わせている。説明は、全ての可能性のある変形またはさらには記載されるそれらの変形の組合せを徹底的に列挙しようとはしていない。本開示の特定の部分に関しては代替実施形態が示されていない場合があること、または別の記載されていない代替実施形態が一部に関して利用可能であり得ることは、それらの代替実施形態の権利放棄とみなされるべきではない。それらの記載されていない実施形態の多くは、本開示の原理の適用の差異ではなく、技術および材料の差異を伴うことが当業者には理解されよう。したがって、本開示は、以下の特許請求の範囲に記載されている範囲および等価物未満に限定されるものではない。
参考文献
Chawla, R., Shakya, R., and Rommens, C.M. (2012). Tuber-Specific Silencing of Asparagine synthetase-1 Reduces the Acrylamide-Forming Potential of Potatoes Grown in the Field without Affecting Tuber Shape and Yield. Plant Biotechnology Journal 10, 913-924.
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Simpson, J., Timko, M.P., Cashmore, A.R., Schell, J., Van Montagu, M., and Herrera-Estrella, L. (1985). Light-Inducible and Tissue-Specific Expression of a Chimaeric Gene under Control of the 5’-Flanking Sequence of a Pea Chlorophyll A/b-Binding Protein Gene. The EMBO Journal 4, 2723-2729.
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VanHaaren, M.J.J., Sedee, N.J.A., de Boer, H.A., Schilperoort, R.A., and Hooykaas, P.J.J. (1989). Mutational Analysis of the Conserved Domains of a T-Region Border Repeat of Agrobacterium tumefaciens. Plant Molecular Biology 13, 523-531.
寄託情報
上に開示されており、添付の特許請求の範囲に列挙されているJ.R.Simplot Companyの独自のジャガイモ栽培品種Y9の塊茎は、American Type Culture Collection(ATCC)、10801 University Boulevard、Manassas、Va.20110への寄託がなされた。寄託日は、2015年6月17日であった。50バイアルの微小塊茎の寄託物を、本出願の出願日の前からJ.R.Simplot Companyにより維持されている同じ寄託物から取得した。特許が付与された際に全ての制限が決定的に取り除かれ、寄託は、37 C.F.R.§§1.801〜1.809の要件の全てを満たすものとする。ATCC受託番号はPTA−122247である。寄託物は、受託所において、30年または最後の要求から5年の期間、または特許の権利行使可能期間のいずれか長い方の期間維持され、必要に応じてその期間中に交換される。

Claims (29)

  1. 代表的な試料がATCC受託番号PTA−122247の下で寄託されている、ジャガイモ栽培品種Y9のジャガイモの塊茎または塊茎の一部。
  2. 請求項1に記載の塊茎または塊茎の一部を成長させることによって生じたジャガイモ植物体またはその一部。
  3. 請求項2に記載の植物体の生理的特性および形態学的特性の全てを有するジャガイモ植物体であって、内在性アスパラギンシンテターゼ−1遺伝子および内在性ポリフェノールオキシダーゼ−5遺伝子の発現を阻害するために有効なジャガイモDNAの逆方向反復と、それに加えて、ホスホリラーゼ−L遺伝子およびジキナーゼR1遺伝子の内在性ジャガイモプロモーターの逆方向反復とを含有する、栽培品種Y9に存在するpSIM1278の挿入断片領域を含み、ジャガイモ疫病抵抗性遺伝子Rpi−vnt1と、内在性液胞インベルターゼ遺伝子VInvの発現を阻害するために有効なジャガイモDNAの逆方向反復とを含有する、Y9に存在するpSIM1678の挿入断片領域をさらに含む、ジャガイモ植物体。
  4. 請求項2に記載の植物体から生じた細胞の組織培養物であって、前記組織培養物の前記細胞が、葉、花粉、胚、子葉(cotyledon)、胚軸、分裂組織細胞、根、根端、雌ずい、葯、花、茎および塊茎からなる群から選択される植物体の一部から生じ、前記組織培養された細胞が、内在性アスパラギンシンテターゼ−1遺伝子および内在性ポリフェノールオキシダーゼ−5遺伝子の発現を阻害するために有効なジャガイモDNAの逆方向反復と、それに加えて、ホスホリラーゼ−L遺伝子およびジキナーゼR1遺伝子の内在性ジャガイモプロモーターの逆方向反復とを含有する、栽培品種Y9に存在するpSIM1278の挿入断片領域を含み、ジャガイモ疫病抵抗性遺伝子Rpi−vnt1と、内在性液胞インベルターゼ遺伝子VInvの発現を阻害するために有効なジャガイモDNAの逆方向反復とを含有する、Y9に存在するpSIM1678の挿入断片領域をさらに含む、組織培養物。
  5. 請求項4に記載の組織培養物から再生されたジャガイモ植物体であって、ジャガイモ栽培品種Y9の生理的特性および形態学的特性の全てを有する、ジャガイモ植物体。
  6. 請求項1に記載のジャガイモの塊茎または塊茎の一部を成長させることによって生じたジャガイモの種子であって、内在性アスパラギンシンテターゼ−1遺伝子および内在性ポリフェノールオキシダーゼ−5遺伝子の発現を阻害するために有効なジャガイモDNAの逆方向反復と、それに加えて、ホスホリラーゼ−L遺伝子およびジキナーゼR1遺伝子の内在性ジャガイモプロモーターの逆方向反復とを含有する、栽培品種Y9に存在するpSIM1278の挿入断片領域を含み、ジャガイモ疫病抵抗性遺伝子Rpi−vnt1と、内在性液胞インベルターゼ遺伝子VInvの発現を阻害するために有効なジャガイモDNAの逆方向反復とを含有する、Y9に存在するpSIM1678の挿入断片領域をさらに含む、ジャガイモの種子。
  7. 請求項6に記載の種子を成長させることによって生じたジャガイモ植物体またはその一部。
  8. 請求項7に記載のジャガイモ植物体の組織培養物から再生されたジャガイモ植物体であって、内在性アスパラギンシンテターゼ−1遺伝子および内在性ポリフェノールオキシダーゼ−5遺伝子の発現を阻害するために有効なジャガイモDNAの逆方向反復と、それに加えて、ホスホリラーゼ−L遺伝子およびジキナーゼR1遺伝子の内在性ジャガイモプロモーターの逆方向反復とを含有する、栽培品種Y9に存在するpSIM1278の挿入断片領域を含み、ジャガイモ疫病抵抗性遺伝子Rpi−vnt1と、内在性液胞インベルターゼ遺伝子VInvの発現を阻害するために有効なジャガイモDNAの逆方向反復とを含有する、Y9に存在するpSIM1678の挿入断片領域をさらに含む、再生されたジャガイモ植物体。
  9. ジャガイモの種子を生じさせるための方法であって、2種のジャガイモ植物体を交配するステップと、得られたジャガイモの種子を収穫するステップとを含み、少なくとも一方のジャガイモ植物体が請求項2に記載のジャガイモ植物体である、方法。
  10. ジャガイモの種子を生じさせるための方法であって、2種のジャガイモ植物体を交配するステップと、得られたジャガイモの種子を収穫するステップとを含み、少なくとも一方のジャガイモ植物体が請求項7に記載のジャガイモ植物体である、方法。
  11. 請求項10に記載の方法によって生じたジャガイモの種子であって、内在性アスパラギンシンテターゼ−1遺伝子および内在性ポリフェノールオキシダーゼ−5遺伝子の発現を阻害するために有効なジャガイモDNAの逆方向反復と、それに加えて、ホスホリラーゼ−L遺伝子およびジキナーゼR1遺伝子の内在性ジャガイモプロモーターの逆方向反復とを含有する、栽培品種Y9に存在するpSIM1278の挿入断片領域を含み、ジャガイモ疫病抵抗性遺伝子Rpi−vnt1と、内在性液胞インベルターゼ遺伝子VInvの発現を阻害するために有効なジャガイモDNAの逆方向反復とを含有する、Y9に存在するpSIM1678の挿入断片領域をさらに含む、ジャガイモの種子。
  12. 請求項11に記載のジャガイモの種子を成長させることによって生じたジャガイモ植物体またはその一部。
  13. 請求項12に記載の植物から生じたジャガイモの種子であって、内在性アスパラギンシンテターゼ−1遺伝子および内在性ポリフェノールオキシダーゼ−5遺伝子の発現を阻害するために有効なジャガイモDNAの逆方向反復と、それに加えて、ホスホリラーゼ−L遺伝子およびジキナーゼR1遺伝子の内在性ジャガイモプロモーターの逆方向反復とを含有する、栽培品種Y9に存在するpSIM1278の挿入断片領域を含み、ジャガイモ疫病抵抗性遺伝子Rpi−vnt1と、内在性液胞インベルターゼ遺伝子VInvの発現を阻害するために有効なジャガイモDNAの逆方向反復とを含有する、Y9に存在するpSIM1678の挿入断片領域をさらに含む、ジャガイモの種子。
  14. 前記ジャガイモ植物体の一方がジャガイモ栽培品種Y9であり、第2のジャガイモ植物体がトランスジェニックである、請求項9に記載の方法。
  15. ジャガイモの種子を生じさせる方法であって、2種のジャガイモ植物体を交配するステップと、得られたジャガイモの種子を収穫するステップとを含み、前記ジャガイモ植物体の一方が請求項7に記載のジャガイモ植物体であり、第2のジャガイモ植物体がトランスジェニックである、方法。
  16. 請求項14に記載の方法によって生じた種子を成長させることによって生じたジャガイモ植物体またはその一部であって、内在性アスパラギンシンテターゼ−1遺伝子および内在性ポリフェノールオキシダーゼ−5遺伝子の発現を阻害するために有効なジャガイモDNAの逆方向反復と、それに加えて、ホスホリラーゼ−L遺伝子およびジキナーゼR1遺伝子の内在性ジャガイモプロモーターの逆方向反復とを含有する、栽培品種Y9に存在するpSIM1278の挿入断片領域を含み、ジャガイモ疫病抵抗性遺伝子Rpi−vnt1と、内在性液胞インベルターゼ遺伝子VInvの発現を阻害するために有効なジャガイモDNAの逆方向反復とを含有する、Y9に存在するpSIM1678の挿入断片領域をさらに含む、ジャガイモ植物体またはその一部。
  17. ジャガイモ栽培品種Y9に所望の形質を導入する方法であって、
    (a)塊茎の代表的な試料がATCC受託番号PTA−122247の下で寄託されているY9植物体を、所望の形質を含む別のジャガイモ栽培品種の植物と交配して後代植物体を生じさせるステップであり、前記所望の形質が、雄性不稔性、除草剤抵抗性、昆虫抵抗性、脂肪酸代謝の改変、炭水化物代謝の改変、および細菌による病害、真菌による病害、またはウイルスによる病害に対する抵抗性からなる群から選択されるステップと、
    (b)前記所望の形質を有する1つまたは複数の後代植物体を選択するステップと、
    (c)選択された後代植物体をY9植物体と戻し交配して戻し交配後代植物体を生じさせるステップと、
    (d)前記所望の形質を有する戻し交配後代植物体を選択するステップと、
    (e)ステップ(c)および(d)を2回またはそれよりも多く連続して繰り返して、前記所望の形質を含む選択された第3またはその後の戻し交配後代植物体を生じさせるステップと
    を含む方法。
  18. 請求項17に記載の方法によって生じたジャガイモ植物体であって、所望の形質を有し、内在性アスパラギンシンテターゼ−1遺伝子および内在性ポリフェノールオキシダーゼ−5遺伝子の発現を阻害するために有効なジャガイモDNAの逆方向反復と、それに加えて、ホスホリラーゼ−L遺伝子およびジキナーゼR1遺伝子の内在性ジャガイモプロモーターの逆方向反復とを含有する、栽培品種Y9に存在するpSIM1278の挿入断片領域を含み、ジャガイモ疫病抵抗性遺伝子Rpi−vnt1と、内在性液胞インベルターゼ遺伝子VInvの発現を阻害するために有効なジャガイモDNAの逆方向反復とを含有する、Y9に存在するpSIM1678の挿入断片領域をさらに含む、ジャガイモ植物体。
  19. 前記所望の形質が除草剤抵抗性であり、前記抵抗性が、イミダゾリノン、スルホニル尿素、グリホサート、グルホシネート、L−ホスフィノトリシン、トリアジンおよびベンゾニトリルからなる群から選択される除草剤に対して付与される、請求項18に記載のジャガイモ植物体。
  20. 前記所望の形質が昆虫抵抗性であり、前記昆虫抵抗性が、Bacillus thuringiensis内毒素をコードする導入遺伝子によって付与される、請求項18に記載のジャガイモ植物体。
  21. 前記所望の形質が脂肪酸代謝の改変または炭水化物代謝の改変であり、前記所望の形質が、フルクトシルトランスフェラーゼ、レバンスクラーゼ、α−アミラーゼ、インベルターゼおよびデンプン分枝酵素からなる群から選択されるタンパク質をコードする核酸またはステアリル−ACPデサチュラーゼのアンチセンスをコードするDNAによって付与される、請求項18に記載のジャガイモ植物体。
  22. 植物商品を作製する方法であって、請求項2に記載の植物またはその一部を得るステップと、前記植物体またはその植物体の一部から前記植物商品を作製するステップとを含み、前記植物商品が、生ホールポテト、フレンチフライ、ポテトチップ、乾燥ジャガイモ材料、ジャガイモフレークおよびジャガイモ顆粒からなる群から選択される、方法。
  23. 請求項22に記載の方法によって作製された植物商品であって、内在性アスパラギンシンテターゼ−1遺伝子および内在性ポリフェノールオキシダーゼ−5遺伝子の発現を阻害するために有効なジャガイモDNAの逆方向反復と、それに加えて、ホスホリラーゼ−L遺伝子およびジキナーゼR1遺伝子の内在性ジャガイモプロモーターの逆方向反復とを含有する、栽培品種Y9に存在するpSIM1278の挿入断片領域を含み、ジャガイモ疫病抵抗性遺伝子Rpi−vnt1と、内在性液胞インベルターゼ遺伝子VInvの発現を阻害するために有効なジャガイモDNAの逆方向反復とを含有する、Y9に存在するpSIM1678の挿入断片領域をさらに含む、植物商品。
  24. 請求項1に記載のジャガイモの塊茎から作られた食品製品。
  25. スライスされたジャガイモの塊茎食品製品である、請求項1に記載のジャガイモの塊茎から作られた食品製品。
  26. フレンチフライまたはチップである、請求項1に記載のジャガイモの塊茎から作られた食品製品。
  27. 請求項1に記載のジャガイモの塊茎から得られた、加熱加工された塊茎製品。
  28. 請求項1に記載のジャガイモの塊茎から得られた、加熱加工された塊茎製品であって、フレンチフライ、チップ、およびベークドポテトからなる群から選択される、加熱加工された塊茎製品。
  29. 請求項1に記載のジャガイモの塊茎から得られた、加熱加工された塊茎製品であって、フレンチフライ、チップ、およびベークドポテトからなる群から選択され、栽培品種Y9に存在するpSIM1278およびpSIM1678の挿入断片領域を含まない対照ジャガイモ植物体から得られる対照の加熱加工された塊茎製品のアクリルアミドの濃度よりも少なくとも50%低い、60%低い、70%低い、80%低い、85%低い、またはそれを超えて低いアクリルアミドの濃度を有する、加熱加工された塊茎製品。
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Class et al. Patent application title: EVENT-SPECIFIC DETECTION METHODS Inventors: Jingsong Ye (Boise, ID, US) Jingsong Ye (Boise, ID, US) Jeffrey W. Habig (Boise, ID, US) Janet Layne (Meridian, ID, US) Jeffery W. Hein (Boise, ID, US) Matthew G. Pence (Eagle, ID, US) Stephanie Hudon (Meridian, ID, US) Assignees: JR SIMPLOT COMPANY

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