CN116076620A - 一种多酚生菜在动物饲料中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种多酚生菜在动物饲料中的应用，属于功能饲料技术领域。本发明采用经过生物或非生物应激诱导剂处理后的多酚生菜作为原料，经干燥、粉碎得到多酚生菜粉，或经溶剂提取制备得到富含多酚的多酚生菜提取物，并将多酚生菜粉或多酚生菜提取物用于动物饲料。本发明的多酚生菜含有显著提高的有益于健康的多酚，例如槲皮素衍生物，菊苣酸，绿原酸和花青素等，将其用于动物饲料，可以显著提高动物的免疫力，并起到抗炎、防治ASFV(非洲猪瘟病毒)、防治禽流感等作用，是抗生素的有效替代品。并且，本发明可以同时高产率、经济地制备得到多种有利于动物健康的植物多酚。

Description

一种多酚生菜在动物饲料中的应用

技术领域

本发明属于功能饲料技术领域，具体涉及一种多酚生菜在动物饲料中的应用。

背景技术

随着我国饲料行业的不断发展，我国饲料添加剂产量自2016年以来呈现稳步上升趋势。据资料显示，2021年我国饲料添加剂产量为1477.5万吨，同比增长6.2％，其中单一饲料添加剂产量1367.9万吨，同比增长5.5％；混合型饲料添加剂产量109.6万吨，同比增长16.2％。

植物源中草药饲料添加剂是以药用植物为原料进行单一或混合配比而成，以畜禽饲料为载体，加入少量中草药，应用于畜禽生产中，可以改善饲料适口性、提高畜禽生产性能、改善畜产品品质和增强免疫功能，进而提高畜禽生长性能，在改善畜禽产品质量和提升畜禽机体能力等方面具有重要作用。在农业农村部194号文件的全面“禁抗”下，生产企业停止生产除中草药类外，含有促生长类药物饲料添加剂的商品饲料。中草药兼具药用价值和营养价值优势，且在一定程度上可以减少动物源性食品污染，是“抗生素”较为理想的替代品，运用中草药预防畜禽疾病成为饲料开发研究的新型途径。

多酚是次生植物代谢产物，在细胞培养、啮齿类动物和人类研究中已显示出抗氧化和抗炎作用。在大量的次生植物代谢产物中，多酚类物质可能是最有前途的，因为它具有良好的抗氧化和基因调节特性。已经很好地证实，多酚能够通过抑制核因子κB(NF-κB)的激活在体外和体内起抗炎作用，并通过诱导核因子红细胞2相关因子-2(Nrf2)诱导抗氧化和细胞保护作用。多酚类物质具有体外抗病毒活性，如表没食子儿茶素-3-没食子酸盐、飞燕草苷等，包括丙型肝炎、单纯疱疹、流感甚至埃博拉等多种病毒(D.K.Gessner等Journal ofAnimal Physiology and Animal Nutrition,101(2017),605-628)。

期刊文献(中草药饲料添加剂对奶牛乳房炎的影响研究进展，张晓东等，《中国饲料》，2021年第9期)公开了:存在于中草药中的多糖类、黄酮类等天然活性成分均可以抑制炎性因子分泌，增强免疫能力，降低乳房炎奶牛体细胞数量；中草药饲料添加剂对奶牛乳房炎有很好的防控效果，同时可以改善奶牛产奶量、细胞免疫和体液免疫能力等；中草药饲料添加剂针对奶牛乳房炎的主要发病机制，通过消炎抑菌改善乳腺细胞局部血液循环，参与调控炎性表达信号通路，提高奶牛机体细胞免疫、体液免疫和抗氧化能力，最终达到治愈目的。

专利US20220047650A1提供了使用枯草芽孢杆菌1579或其活性变体将至少一种多酚转化为原儿茶酸(PCA)的组合物和方法，将多酚如槲皮素转化为PCA可以减少炎症，降低皮质醇水平，并提高产奶农业动物的奶质量和产奶量。专利WO2019213703A1公开了包含源自甘蔗的多酚提取物的动物增补剂和饲料，具有抗氧化和抗炎能力。专利WO2018220340A1公开了一种动物饲料添加剂，包括至少一种有机硫化合物，以及至少一种酚类化合物，可以减少动物肠道中微生物产生的甲烷，从而减少这些微生物所使用的营养物，并增加营养物对动物的可用性。

越来越多的证据表明，植物多酚有助于减轻动物局部和全身炎症状况，基于氧化应激和炎症条件与农场动物高度相关的事实，多酚被认为是农场动物营养中有前途的饲料添加剂。然而，现有技术中的植物多酚并不容易经济地制备得到，尤其是不能高效、大量地同时制备得到多种有利于动物健康的植物多酚。

发明内容

本发明针对现有技术存在的问题，提供一种多酚生菜在动物饲料中的应用。本发明采用经过生物或非生物应激诱导剂处理后的多酚生菜作为原料，经干燥、粉碎得到多酚生菜粉，或经溶剂提取制备得到富含多酚的多酚生菜提取物，并将多酚生菜粉或多酚生菜提取物用于动物饲料。本发明的多酚生菜含有显著提高的有益于健康的多酚，例如槲皮素衍生物，菊苣酸，绿原酸和花青素等，将其用于动物饲料，可以显著提高动物的免疫力，并起到抗炎、防治ASFV(非洲猪瘟病毒)、防治禽流感等作用，是抗生素的有效替代品。并且，本发明可以同时高产率、经济地制备得到多种有利于动物健康的植物多酚。

为实现上述目的，本申请提供了一种多酚生菜在动物饲料中的应用，所述多酚生菜的多酚含量为1000-9000mg/kg。

所述多酚生菜合成方法包括：将普通生菜在极端环境中种植，从而增加生菜中多酚的产生；或给予生菜至少一种用于生菜中多酚的生物合成的系统，从而增加生菜中多酚的产生。所述多酚生菜含有显著增加量的有益于健康的多酚，例如槲皮素衍生物，菊苣酸，绿原酸和花青素，鲜多酚生菜菜的总多酚大于3000mg/kg。

所述多酚生菜经干燥、粉碎得到多酚生菜粉，或经溶剂提取制备得到多酚生菜提取物后再用于动物饲料。

本发明提供的系统和方法允许高产率生产多酚，用于多酚的高量，低成本，可缩放生产。特别地，所述系统和方法允许生产多酚，例如绿原酸，菊苣酸，槲皮素衍生物和花青素，以及有意义地探索它们的益处。另外，该系统和方法提供了商业上相关量的绿原酸，菊苣酸和槲皮素衍生物的成本有效的生产。本文提供的系统和方法利用容易获得的生菜底盘，利用生菜中具有代谢工程技术能力的多酚生物合成途径的天然丰富的中间体(内源性基因和酶)，显著提高生菜中的多酚含量。而所述多酚生菜的合成方法还可包括将将普通生菜在极端环境中种植，从而增加生菜中多酚的产生。此外，本发明还提供了多酚生菜粉及多酚生菜提取物、制备上述多酚生菜粉和多酚生菜提取物的方法，以及上述多酚生菜粉和多酚生菜提取物在动物饲料中的应用，使用上述动物饲料可以显著提高动物的免疫力，并起到抗炎、防治ASFV(非洲猪瘟病毒)、防治禽流感等作用。

术语和定义

除非另有明确定义，否则本发明所使用的所有技术术语和科学术语应具有与本领域(如化学、生物化学、配方科学、食品和营养科学、动物科学和畜牧业、细胞培养和分子生物学)普通技术人员通常理解的相同的含义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。

多酚

多酚是有益的具有抗氧化性能的植物化合物，其可以帮助保持健康和保护人免受各种疾病的侵害。已经鉴定了超过8000种类型的多酚(Tsao，R.Nutritions 2010，2(12)，1231-1246；和Zhou等，Nutritions 2006，8,515)。多酚可进一步分为至少四个主要基团，包括类黄酮，酚酸，多酚酰胺和其它多酚，黄酮类化合物占所有多酚的约60％。植物酚在许多方面类似于具有脂族结构的醇，但是芳环，酚羟基的氢原子的存在使它们成为弱酸。已知植物酚类化合物表现出多种功能，包括植物生长，发育和防御，并且对人类也具有有益作用。植物酚类化合物被认为是强天然抗氧化剂，在广泛的生物学和药理学性质如抗炎，抗癌，抗微生物，抗过敏，抗病毒，抗血栓形成，保肝，食品添加剂，信号分子等方面具有关键作用(Kumare等，Biotechnol.Rep.24(2019)1-10)。本发明所用多酚指包含一个以上酚结构单元的有机化学品，生菜中常见的多酚包括花青素，菊苣酸，绿原酸，二咖啡酰奎宁酸和槲皮素衍生物。

类黄酮

类黄酮(或生物类黄酮)是一类植物和真菌次生代谢产物(Formica等，Food andChemical Toxicology.1995，33(12):1061-80)。黄酮类化合物广泛分布于植物中，具有多种功能。类黄酮是花着色，在花瓣中产生黄色或红/蓝色色素沉着，吸引授粉昆虫的最重要的植物色素。类黄酮在高等植物中覆盖了广泛的功能，例如UV过滤，共生固氮和花色素沉着。另外，类黄酮可以起到化学信使，生理调节剂和细胞周期抑制剂的作用。此外，一些黄酮类化合物对引起植物疾病的生物体具有抑制活性。已经阐明了天然存在的槲皮素及其衍生物的生物合成途径(Winkel-Shirley，B.Plant Physiology.2001，126(2):485-93)。生物合成地，在植物中，使用苯丙氨酸氨裂解酶(PAL)，肉桂酸4-羟化酶(C4H)和4-香豆酰基CoA-连接酶(4CL)，在一系列称为通用苯基丙酸途径的步骤中将苯丙氨酸转化为4-香豆酰基CoA。使用7，2'-二羟基-4'-甲氧基异黄烷醇合成酶将一分子4-香豆酰基-CoA加入到三个丙二酰基-CoA分子中以形成四羟基查耳酮。然后使用查耳酮异构酶(CH)将四羟基查耳酮转化为柚皮苷元。柚皮素利用黄烷类3′-羟化酶转化为枇杷叶醇。然后用黄烷酮3-羟化酶(F3H)将枇杷叶醇转化为二氢槲皮素，然后用黄酮醇合酶(FLS)将其转化为槲皮素。以下酶糖基化和酯化过程将分别产生槲皮素-3-O-葡萄糖苷(Q3G)和槲皮素-3-O-丙二酰葡萄糖苷(Q3MG)。

槲皮素及其衍生物

槲皮素是最丰富的膳食类黄酮之一。槲皮素可在许多植物和食品中发现，例如红酒，洋葱，绿茶，苹果，浆果，银杏。槲皮素与改善的运动性能和降低的炎症，血压和血糖水平有关。该组合物还具有保护大脑，抗过敏，抗癌，抗菌和抗病毒的作用。然而，槲皮素通常没有足够的生物利用度，并且很大程度上转化为不同的代谢产物。尽管几乎不知道它们的生物活性，但是这些代谢产物与槲皮素饮食摄取相关的健康益处有关(Lesjak，M等，2018Journal of Functional Foods，40，68-75)。在植物提取物中发现的槲皮素及其衍生物的活性被认为是有效的抗氧化剂和抗炎剂，并且可以有助于富含槲皮素的饮食的总体生物活性(Carullo，G.El等，2017Future Medicinal Chemistry，9(1)，79-93)。槲皮素衍生物包括槲皮素-3-O-葡糖醛酸苷(Q3G)(也称作异槲皮素)，他玛利西汀，异鼠李素，异鼠李素-3-O-葡萄糖苷，槲皮素-3，4'-二-O-葡萄糖苷，槲皮素-3，5，7，3'，4'-五甲基醚。天然存在的槲皮素及其衍生物的一些例子包括槲皮素-3-O-丙二酰葡萄糖苷(Q3mg)和槲皮素-3-O-葡萄糖苷(Q3g)。

花青素

花青素是属于酚类的有色水溶性色素(Khoo等，Food Nutr Res.61(1)，207)。所述色素为糖基化形式。负责颜色的花青素，红色，紫色和蓝色，存在于水果和蔬菜中。浆果，currant，葡萄和一些热带水果具有高的花青素含量。红色至紫色的叶状蔬菜，谷物，根和块茎是含有高含量花青素的可食用蔬菜。在花青素色素中，花青素-3-葡糖苷是大多数植物中发现的主要花青素。花青素具有抗糖尿病，抗癌，抗炎，抗微生物和抗肥胖作用，以及预防心血管疾病(He等，J Ethnopharmacol.137(3)(2011):1135-1142)。

酚酸

酚酸一般描述了具有一个羧酸基团的酚类化合物。酚或酚羧酸(称为多酚的一种植物化学物质)是植物酚化合物的主要种类之一。酚酸存在于各种基于植物的食品中，例如含有高浓度酚酸的种子，果皮和蔬菜叶。通常，酚酸以结合形式存在，例如酰胺，酯或糖苷，很少以游离形式存在(Pereira等，Molecules 14(6),(2009)2202-2211)。酚酸通常分成两个子组:羟基苯甲酸和羟基肉桂酸(Clifford等，J.Sci.Food Agric.79(1999)362-372)。酚酸具有比众所周知的高得多的体外抗氧化活性抗氧化维生素(Tsao等，Chromatogr.BAnalyt.Technol.Biomed.Life Sci.812(2004)85-99)。

羟基苯甲酸具有C6-C1的共同结构并衍生自苯甲酸。发现羟基苯甲酸为可溶性形式(与糖或有机酸缀合)，并与细胞壁级分结合，例如木质素(Strack等，PlantBiochemistry Academic，London，1997，pp.387)；和Khoddami等，Molecules 18(2003)2328-2375。与羟基肉桂酸相比，羟基苯甲酸通常以低浓度存在于红水果，洋葱，黑萝卜等中(Shashidi等，Technomic Publishing Co.，Inc.，Lancaster，PA，1995)。四种常用的羟基苯甲酸是-羟基苯甲酸，原儿茶酸，香草酸和丁香酸。

绿原酸

绿原酸(CGA)是咖啡酸和奎宁酸的酯，在木质素生物合成中起中间体的作用，包括羟基肉桂酸(咖啡酸，阿魏酸和/或香豆酸)与奎宁酸。绿原酸的例子包括5-O-咖啡酰奎宁酸(绿原酸或5-CQA)，4-O-咖啡酰奎宁酸(隐绿原酸或4-CQA)和3-O-咖啡酰奎宁酸(新绿原酸或3-CQA)。

5-O-咖啡酰奎宁酸

在生物合成方面，CQAs的生物合成的最初步骤是通过苯丙酸途径和酶催化转化。用肉桂酸和/或香豆酸的作用下，苯丙氨酸转化为对香豆酰基-CoA作为中间体，依次被苯丙氨酸氨裂解酶(PAL)，肉桂酸4-羟化酶(C4H)和4-肉桂酰基-CoA连接酶(4CL)连续催化。

菊苣酸

菊苣酸(也称作菊苣酸)是羟基肉桂酸，是苯基丙酸类的有机化合物，存在于各种植物物种中。它是咖啡酸和酒石酸的衍生物(Shi等，Functional Foods:Biochemical andProcessing Aspects’Press.2(27)(2002)pp.241)。菊苣酸在体外和体内研究中都显示出刺激吞噬作用，抑制透明质酸酶(一种分解人体内透明质酸的酶)的功能，保护胶原不受自由基损伤，抑制HIV-1整合酶的功能。

应激剂/诱导剂

本发明所用的应激剂/诱导剂可互换使用，是指引发导致植物产品更高生物活性化合物含量和质量属性的信号途径的各种生物、物理或化学诱导因素。应激剂/诱导剂可分为生物和非生物物质。植物激素/植物生长调节剂(例如水杨酸(SA)，茉莉酮酸酯等)也被认为是应激剂/诱导剂。生物、化学或物理来源的应激剂/诱导剂包括防御反应在内的反应的激活而增加植物的农艺/营养性状，导致例如水果和蔬菜的功能物质的增加。植物生长调节剂(PGR)可用作刺激植物次生代谢产物产生的应激剂/诱导剂。植物生长调节剂可包括天然存在的激素物质(植物激素)及其合成类似物。

植物

包括整个植物或任何部分，如植物器官(例如，收获的或未收获的叶子，等)，植物细胞，植物原生质体，可再生完整植物的植物细胞或组织培养物，植物愈伤组织，植物细胞团，植物移植，育苗，在植物中完整的植物细胞，植物克隆或微繁殖，或植物的一部分(例如，收获的组织或器官)，如植物插条，营养繁殖，胚，花粉，胚珠，花，叶，头，种子，无性繁殖的植物，根，茎，茎，根尖，移植物，它们的任何部分等，或它们的衍生物，优选具有与获得它的植物相同的遗传组成(或非常相似的遗传组成)。此外，还包括任何发育阶段，例如幼苗，生根前或生根后的插条，成熟和/或未成熟植物或成熟和/或未成熟叶片。

生菜植物

指未成熟或成熟的生菜植物，包括完整的生菜植物和去除了种子、根或叶的生菜植物。将产生植物的种子或胚也被认为是生菜植物。生菜植物可通过直接在地面(例如，土壤，例如，在田地上的土壤)播种或通过在受控环境条件下(例如，温室)发芽种子，然后将幼苗移植到田地中来生产。参见，例如，Gonai等，J.of Exp.Bot.，55(394)，111-118,2004；

LouiseJackson等，Acquaah，Principles of Plant Genetics and Breeding，2007，Blackwell Publishing，and Jackson，Louis等，University of California，Publishing 7216，所有这些文献在此引入作为参考。

“生菜植物细胞”:是指分离的，在组织培养中生长的和/或掺入生菜植物或生菜植物部分的生菜细胞。

“生菜植物部分”:本发明所用的生菜包括生菜头，生菜叶，生菜叶部分，花粉，胚珠，花等。在另一个实施方案中，本发明还涉及从生菜植物中分离的生菜头，生菜叶，生菜叶部分，花，花粉和胚珠。

“品种”或“栽培品种”:是指在已知最低级别的植物分类单元中的一种植物分组，不管是否完全满足授予育种者权利的条件，该分组都可以通过给定基因型或基因型的组合产生的特征来定义，并通过至少一种基因型的表达来区别于任何其它植物组，并且被认为是关于其适于不变地繁殖的单位。

本发明所用的多核苷酸或多肽是“重组的”，当它是人工的或工程化的，或衍生自人工的或工程化的蛋白质或核酸时。例如，在重组生物体的基因组中插入载体或任何其它载体中的多核苷酸异源位点，使得其不与通常位于多核苷酸侧翼的核苷酸序列相关，是重组多核苷酸。由重组多核苷酸在体外或体内表达的多肽是重组多肽。同样，在自然界中不存在的多核苷酸序列，例如天然存在的基因的变体是重组的。

本发明所用术语“异源的”，参照源自外来物种的序列，或者如果来自相同物种，则通过故意的人干预，在组成和/或基因组位点上基本上从其天然形式改变。例如，与异源多核苷酸可操作连接的启动子来自与衍生多核苷酸的物种不同的物种，或者，如果来自相同/类似物种，则一个或两个基本上由它们的原始形式和/或基因组位点修饰，或者启动子不是可操作连接的多核苷酸的天然启动子。

“转基因”:本发明所用的基因是指通过基因工程方法，例如通过转化将基因或基因转入生菜植物的基因组中。示例性转基因包括cDNA(互补DNA)片段，其是mRNA(信使RNA)的拷贝，并且该基因本身存在于其基因组DNA的原始区域中。在一个实施例中，描述了含有导入生菜植物或生菜植物细胞基因组的基因序列的DNA片段。该非天然DNA片段可以保留在转基因生菜植物中产生RNA或蛋白质的能力，或者它可以改变转基因植物遗传密码的正常功能。通常，转移的核酸被掺入植物的胚系中。转基因也可以描述任何DNA序列，而不管它是否含有基因编码序列或它是否已被人工构建，它已被导入生菜植物或载体构建体中，在该构建体中它先前未被发现。

“可操作地连接”:是指两个或多个元件之间的功能连接。例如，感兴趣的多核苷酸和调节序列(即启动子)之间的可操作连接是允许感兴趣的多核苷酸表达的功能性连接。可操作地连接的元件可以是邻接的或不邻接的。当用于指两个蛋白质编码区的连接时，通过可操作地连接是指编码区处于相同的读数框架。所述盒可另外包含至少一种另外的编码序列/基因以共转化到所述生物体中。或者，可以在多个表达盒上提供额外的编码序列/基因。这种表达盒具有多个限制性位点和/或重组位点，用于插入目的编码多核苷酸或其活性变体或片段，使其处于调控区(例如启动子)的转录调控之下。表达盒可另外包含可选择的标记基因。

“表达盒”:是指编码与至少一个编码表达控制序列的多核苷酸可操作地连接的目的多肽的多核苷酸。该表达盒可在5′-3′转录方向上包括转录和翻译起始区(即启动子)，编码目的多肽或其活性变体或片段的多核苷酸，以及在植物中起作用的转录和翻译终止区(即终止区)。调节区域(即启动子，转录调节区域和翻译终止区域)和/或多核苷酸或其活性变体或片段可以是天然的/类似于宿主细胞。或者，调节区和/或其活性变体或片段的多核苷酸可以是宿主细胞异源的或彼此异源的。

表达盒可另外包含5'前导序列。这样的前导序列可以起到增强翻译的作用。翻译前导是本领域已知的，包括：小RNA病毒前导，例如EMCV前导(脑心肌炎5'非编码区，Elroy-stein等(1989)Proc.Natl；ACAD.Sci.USA,86:6126-6130)；马铃薯Y病毒前导，例如TEV前导(烟草蚀刻病毒)(Galie等,(1995)Gene 165(2):233-238)，MDMV前导(玉米矮花叶病毒)(Virology 154:9-20)和人免疫球蛋白重链结合蛋白(BIP)(Macejak等人,(1991)Nature353:90-94)；苜蓿花叶病毒外壳蛋白mRNA的非翻译前导(AMV RNA 4)(Jobling等.(1987)Nature325:622-625)；烟草花叶病毒前导物(TMV)(Galie等.(1989)，in MolecularBiology of RNA,Cech(Liss，New York)，pp.237-256)；和玉米黄化斑驳病毒前导(MCMV)(Lommel等，

(1991)Virology 81:382-385；Della-Cioppa等.(1987)Plant Physiol.84:965-968)。

“表达控制序列”:是指能够增加或减少由表达盒编码的多肽表达的核酸分子片段。表达控制区的例子包括启动子，转录调节区和翻译终止区。终止区可以是转录起始区的天然产物，可以是天然的，具有可操作连接的多核苷酸或其活性变体或片段，可以是植物宿主的天然来源，或者可以来源于启动子，多核苷酸或其活性片段或变体，植物宿主或其任意组合的另一来源(即外源或异源)。方便的终止区可从根癌土壤杆菌的Ti质粒获得，例如章鱼碱合酶和诺帕林合酶终止区。也参见Guerineau等.(1991)Mol.Gen.Genet.262:141-144；Proudfoot(1991)Cell 64:671-674；Sanfacon等.(1991)Genes Dev.5:141-149；Mogen等.(1990)Plant Cell 2:1261-1272；Munroe等.(1990)Gene 91:151-158；Balias等.(1989)Nucleic Acids Res.17:7891-

7903；and Joshi等.(1987)Nucleic Acids Res.15:9627-9639。

“变体”:蛋白质是指通过缺失衍生自蛋白质的蛋白质(即在5'和/或3'末端截短)和/或在天然蛋白质的一个或多个内部位点缺失或添加一个或多个氨基酸和/或在天然蛋白质的一个或多个位点取代一个或多个氨基酸。所包括的变体蛋白具有生物活性，即它们继续具有天然蛋白所需的生物活性。

“植物生物刺激剂”:本发明所用的材料是指含有一种或多种物质和/或微生物的材料，所述物质和/或微生物在施用于植物或根际时，刺激天然过程以增强和/或改善营养吸收，营养效率，对非生物胁迫的耐受性和作物质量，而不依赖于其营养含量。在一些实施方案中，生物刺激剂是生物应激剂/激发剂。

“对照”或“对照生菜”或“对照生菜细胞”：提供了用于测量所述生菜植物或生菜植物细胞的表型变化的参考点，并且可以是任何合适的生菜植物或生菜细胞。对照生菜或生菜细胞可以包括，例如：(a)野生型或天然生菜或生菜细胞，即具有与遗传改变起始材料相同的基因型，产生受试生菜或生菜细胞；(b)生菜或生菜细胞，其具有与起始材料相同的基因型，但是已经用零构建体转化(即，用对感兴趣的性状没有已知影响的构建体，例如包含标记基因的构建体)；(c)生菜或生菜细胞，其是受试者生菜或生菜细胞的后代中的非转化分离物；(d)生菜或生菜细胞，其遗传上与生菜或生菜细胞相同，但不暴露于与受试者生菜或生菜细胞相同的处理(例如，胁迫剂/诱导剂处理，除草剂处理)；或(e)在目的基因不表达的条件下，受试者生菜或生菜细胞本身。

用于本发明的重组DNA，分子克隆和基因表达技术是本领域已知的，并在参考文献中描述，例如Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3^RDEd，Cold SpringHarbor Laboratory，New York，2001；Ausubel等.Current Protocols in MolecularBiology，J.Wiley and Sons，Baltimore，MD，1999。

多酚生菜

“多酚生菜”是指生菜中多酚含量相比普通生菜显著提高的生菜，具体来说，是多酚含量为1000-3000mg/kg的生菜。

在一些实施方案中，所述多酚生菜的合成所述多酚生菜合成方法包括：将普通生菜在极端环境中种植，从而增加生菜中多酚的产生。

在一些实施方案中，所述多酚生菜的合成方法包括：给予生菜至少一种用于生菜中多酚的生物合成的系统，从而增加生菜中多酚的产生。

用于在生菜中生物合成多酚的系统

“用于在生菜中生物合成多酚的系统”：指当引入生菜中时，当将该体系应用于生菜时，允许增加多酚的产量的体系。

在一些实施方案中，所述系统包括至少一种提高生菜中多酚产量的应激剂/诱导剂，或其同系物、异构体或衍生物。在一些实施方案中，所述系统包括表达盒，所述表达盒包含异源表达控制序列，所述异源表达控制序列可操作地连接到编码增加生菜中多酚产生的一种或多种蛋白质的至少一种多核苷酸。在一些实施方案中，所述系统包括至少一种应激剂/诱导剂，或其同系物、异构体或衍生物；以及本发明的表达盒。在一些实施方案中，一种或多种应激剂/诱导剂的组合，用于高产所需的有益于健康的多酚。

在一些实施方案中，所述应激剂/诱导剂是植物生长调节剂。在一些实施方案中，植物生长调节剂选自：生长素，细胞分裂素(CK)，赤霉素(GAS)，乙烯，油菜素甾类，茉莉酮酸酯(JAS)，甾内酯(SLS)，水杨酸(SA)，和任何同系物、异构体、衍生物或合成类似物，或它们的任何组合或混合物。在一些实施方案中，植物生长调节剂是植物激素。

在一些实施方案中，所述应激剂/诱导剂选自：花生四烯酸(AA)，吲哚-3-乙酸(IAA)，5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)，敏蛋白(HP)，或其任意组合或混合物。

在一些实施例中，所述应激剂/激发剂选自：吲哚-3-乙酸(IAA)，吲哚-3-丙酮腈(IAN)，吲哚-3-乙醛(IAC)，乙酸乙酯，吲哚-3-丙酮酸(IPYA)，吲哚-3-丁酸(IBA)，吲哚-3-丙酸(IPA)，吲唑-3-乙酸，CHI或苯氧基丙酸，萘乙酸(NAA)，苯氧基乙酸(PAA)，2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)，2，4，5-三氯苯氧乙酸(2，4，5-T)，萘乙酰胺(NAAM)，2-萘氧基乙酸(NOA)，2，3，5-三碘苯甲酸(TIBA)，噻吩-3-丙酸(IPA)，核糖玉米素，玉米素，异戊烯基腺嘌呤，二氢玉米素，6-苄基氨基嘌呤，6-苯基氨基嘌呤，激动素，N-苄基-9-(2-四氢吡喃基)腺嘌呤(BPA)，二苯基脲，噻苯脲，苯并咪唑，腺嘌呤，6-(2-噻吩基氨基)嘌呤，GA，GA4，GA7，GA3，

乙烯，乙烯利，扁桃内酯，28-高扁桃内酯，蓖麻子甾酮，扁桃甾酮，28-高扁桃甾酮，蒲黄甾醇茉莉酮酸，二氢茉莉酮酸甲酯，二氢茉莉酮酸，茉莉酮酸甲酯(MJ)，司曲高尔，奥洛班醇，GR24，花生四烯酸(AA)，水杨酸(SA)，敏蛋白(HP)，或它们的任意组合或混合物。

在一些实施例中，所述应激剂/激发剂选自：吲哚-3-乙酸(IAA)，萘乙酸(NAA)，草酸，苯并噻二唑(BTH)，2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)，花生四烯酸(AA)，水杨酸(SA)，茉莉酸甲酯(MJ)，敏蛋白(HP)或其任意组合或混合物。

在一些实施方案中，所述应激剂/诱导剂选自：脂多糖，果胶和纤维素(细胞壁)；壳聚糖，几丁质和葡聚糖(微生物)，藻酸盐，阿拉伯胶，瓜尔豆胶，LBG，酵母提取物，半乳糖醛酸，古罗糖醛酸，甘露聚糖，甘露聚糖醛酸，纤维素酶，隐球菌素，糖蛋白，低聚甘露聚糖，果胶酶，鱼蛋白水解物，乳铁蛋白，真菌孢子，菌丝体细胞壁，微生物细胞壁，冠状菌素，肌酸提取物，沙棘提取物；或其任意组合或混合物。

在一些实施方案中，所述应激剂/诱导剂选自：腐植酸和黄腐酸；蛋白质水解产物和其它含氮化合物；海藻提取物和植物制剂；壳聚糖和其它生物聚合物；无机化合物；有益真菌；有益菌；或其任意组合或混合物。

在一些实施方案中，该系统包括浓度为30mg/L至1000mg/L的应激剂/诱导剂。在一些实施方案中，所述系统包括浓度为30mg/L-500mg/L，30mg/L-400mg/L，30mg/L-300mg/L，30mg/L-200mg/L，30mg/L-150mg/L，30mg/L-100mg/L的应激剂/诱导剂。在一些实施方案中，所述系统包含浓度为30mg/L，60mg/L，120mg/L或200mg/L的所述应激剂/诱导剂。

在一些实施方案中，该系统包括浓度为1mM至1000mM的应激剂/诱导剂。在一些实施方案中，该系统包括浓度为1pm-900pm，1pm-800pm，1pm-700pm，1pm-600pm，1pm-500pm，1pm-400pm，1pm-300pm，1mm-200mm，1mm-100mm，5mm-100mm或5mm-90mm的应激剂/诱导剂。在一些实施方案中，所述系统包括浓度为5mM，10mM，15mM，45mM或90mM的应激剂/诱导剂。

在一些实施例中，该系统包括选自以下的应激剂/激发剂:吲哚-3-乙酸(IAA)，萘乙酸(NAA)，2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)，花生四烯酸(AA)，水杨酸(SA)和/或茉莉酮酸甲酯(MJ)，其中每种应激剂/激发剂独立地以1mM至100mM的浓度存在。在一些实施方案中，每个的应激剂/诱导剂独立地处于5mM，10mM，15mM，45mM或90mM的浓度。

在一些实施方案中，所述系统包含浓度为30-200mg/L的应激剂/诱导剂SHARPINPROTEIN(HP)，壳聚糖，藻酸盐，阿拉伯胶，瓜尔豆胶和/或酵母提取物。在一些实施方案中，该系统包括含有至少一种浓度在100-5000mg/L范围内的基于植物的提取物的应激剂/诱导剂。在一些实施方案中，所述系统包含浓度为30mg/L，60mg/L，120mg/L或200mg/L的应激剂/诱导剂SHARPIN PROTEIN(HP)，壳聚糖，藻酸盐，阿拉伯胶，瓜尔豆胶，酵母提取物。

在一些实施方案中，与对照系统相比，多酚的产量增加了3-9倍。在一些实施方案中，应激剂/诱导剂的组合导致添加剂或协同作用，导致多酚的产量增加。

在一些实施方案中，“用于在生菜中生物合成多酚的系统”包括表达盒，所述表达盒包含异源表达控制序列，所述异源表达控制序列可操作地连接到编码一种或多种增加生菜中多酚产量的蛋白质的至少一个多核苷酸。

在一些实施方案中，所述蛋白质包括丙二酸酯-CoA连接酶。在一些实施方案中，所述系统包括编码丙二酸酯-CoA连接酶的一个或多个多核苷酸。丙二酸酯-CoA连接酶直接催化丙二酸酯和CoA形成丙二酰-CoA，丙二酰-CoA是类黄酮生物合成的前体。在一些实施方案中，丙二酸酯-CoA连接酶是AAE13。用于丙二酰基-CoA的工程化生物合成和用于健康有益的多酚合成的增强构建体的转基因的一些例子是AAE13(丙二酸酯-CoA连接酶)和AtMYB12转录因子。

在一些实施方案中，该系统包括一个或多个编码苯基丙酸类途径的酶的多核苷酸。在特定的实施方案中，苯基丙酸途径的酶选自：苯丙氨酸氨裂解酶(PAL)，肉桂酸4-羟化酶(C4H)和4-香豆酸:CoA连接酶(4CL)，或其任意组合。

在一些实施方案中，该系统包括编码绿原酸途径的酶的一个或多个多核苷酸。在特定的实施方案中，绿原酸途径的酶选自：羟基肉桂酰基CoA:喹啉羟基肉桂酰基转移酶(HQT)，/I-Coum aroy 1-3-羟化酶(C3H)和咖啡酰基-CoA-3-(9-甲基转移酶(CCOAMT)，或其任意组合。

在一些实施方案中，该系统包括编码类黄酮途径的酶的一个或多个多核苷酸。在特定的实施方案中，酶类黄酮途径选自：查耳酮合酶(CHS)，查耳酮异构酶(CH)，黄烷酮3-羟化酶(F3H)和黄酮醇合酶(FLS)，类黄酮-3-羟化酶(F3’H)，香豆酸酯3-羟化酶(C3H)，肉桂酸酯4-羟化酶(C4H)，4-羟基肉桂酰基-CoA连接酶(4CL)，羟基肉桂酰基-CoA莽草酸酯/喹啉羟基肉桂酰基转移酶(HCT)，羟基肉桂酰基-CoA喹啉羟基肉桂酰基转移酶(HQT)，或其任意组合。

在某些实施方案中，该系统包括编码细胞色素P4503A4，CYP氧化还原酶和UDP-葡糖醛酸基转移酶或其任意组合的一个或多个多核苷酸。P4503A4，CYP氧化还原酶和UDP-葡糖醛酸基转移酶是可用于生产类黄酮葡糖脲的酶。葡糖醛酸苷，也称作葡糖醛酸苷，是通过通过糖苷键将葡糖醛酸连接到另一种物质上而产生的任何物质。葡糖酰脲修饰物可用于例如改善黄酮类化合物的水溶性。

在一些实施方案中，系统包括编码转录因子的一个或多个多核苷酸。所述转录因子可促进一种或多种黄酮前体或中间体的产生。在某些实施方案中，本发明产生一种转基因或转基因植物，其过量表达一种或多种转录因子，例如MYB转录因子，其通过类黄酮和绿原酸以及花青素生物合成途径增强代谢物通量。在一些实施方案中，多核苷酸编码MYB转录因子包括各种类似物。在某些实施方案中，一个或多个转基因可连接到与一个或多个由转录因子调控的启动子。

在一些实施例中，MYB转录因子选自：HY5，ATCPC，AtMYBL2，AtMyBLL，ATMYB12，ATMYB60，ATMYB75/PAP1，ATMYB90/PAP2，ATMYBLL，ATMYBLL3，ATMYB114，ATMYB123/TT2，HVMYBLO，BOMYB2，PURPLE，MRMYBLSMMYB39，GMYB10，VLMYBAL-1，V1MYBA1-2，V1MYBA1-3，V1MYBA2，VVMYBAL，WMYBA2，VVMYBC2-LL，VVMYBFL，VMYBPAL，VMYBPA2，VVMYB5A，VVMYB5B，ESMYBP3，MTPAR，LHMYB6，LHMYB12，LHMYB12-LAT，LJMYB14，LJTT2A，LJTT2B，LJTT2C，ZMCL，ZMPL，PL-BH，ZMPL，ZMMYB-IF35，GMMYBLO，PPMYBLO，PPMYBPAL，CSRUBY，OGMYBL，PCMYBLO，PYMYBLO，PETUNIA AN2，PETUNIA DPL，PETUNIA PHZ，PHMYBX，PHMYB27，PTMYB134，PTOMYB216，STANL，STAN2，STMTFL，TAMYB14，AMROSEAL，AMROSEA2，VENOSA，SORGHUM YL，GMMYB176，GMMYB-G20-L，GMMYB12B2，FAMYBL，FAMYB9，FAMYBLO，FAMYBLL，PVMYB4A，NTAN2，LEANTL，S1MYB12，S1MYB72 AMDEL，FAMYBLO，FAVBHLH和MYB12-like及其类似物。在一些实施方案中，MYB转录因子是AtMYB12。

在一些实施方案中，与对照系统相比，多酚的产量增加了2-5倍。

在一些实施方案中，本发明的系统产生多酚，所述多酚是绿原酸或水溶性槲皮素衍生物。在某些实施方案中，绿原酸是3-O-咖啡酰奎宁酸(3-CQA)，4-咖啡酰奎宁酸(4-CQA)和/或5-咖啡酰奎宁酸(5-CQA)。在某些实施方案中，水溶性槲皮素衍生物是槲皮素-3-葡糖苷(Q3G)和/或槲皮素-3-丙二酰葡糖苷(Q3MG)。在一些实施方案中，通过LC-MS对多酚产量的增加进行定量。在一些实施方案中，通过LC-MS对多酚产量的增加进行定量。同等剂量下，多酚生菜粉或多酚生菜提取物，针对不同适应症的效果好于绿原酸(3-CQA)、菊苣酸(CRA)、槲皮素-3-O-葡萄糖苷(Q3G)、槲皮素-3-O-丙二酰葡萄糖苷(Q3mg)或3，4-二咖啡酰奎宁酸(3，4-DICQA)单独使用的效果(具体内容参见WO2022183014A1实施例9)。

在一些实施方案中，异源表达控制序列包含在植物细胞中具有功能的启动子。在一些实施方案中，启动子是组成型活性植物启动子。在一些实施方案中，启动子是组织特异性启动子。在特定的实施方案中，组织特异性启动子是叶特异性启动子。在一些实施方案中，启动子是诱导型启动子。在一些实施方案中，所述多核苷酸还包含调节序列，所述调节序列选自：5'UTR，其位于起翻译前导序列作用的启动子序列和编码序列之间，3'非翻译序列，3'转录终止区和多腺苷酸化区。许多启动子具有对任何目的基因的植物基因表达的效用，所述目的基因包括但不限于可选择的标记，害虫耐受性，抗病性，营养增强的基因，和其它农艺目的基因。

用于生菜植物基因表达的组成型启动子的一些例子包括但不限于WO99/43838和美国专利No.6,072,050中公开的rsyn7启动子和其它组成型启动子；核心CaMV 35S启动子(Odell等(1985)Nature 313:810-812)；水稻肌动蛋白(McElroy等.(1990)Plant Cell 2:163-171)；泛素(Chripensen等.(1989)Plant Mol.Biol.12:619-632和Chistensen等.(1992)Plant Mol.Biol.18:675-689)；PEMU(Last等.(1991)Theor.Appl.Genet.81:581-588)；MAS(Velten等.(1984)EMBO J.3:2723-2730)；ALS启动子(US其它组成型促进剂包括，例如，美国专利5,608,149；

5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142；和6,177,611)。

组织特异性启动子可用于靶向特定植物组织中增强的表达。组织优选的启动子包括Yamamoto等.(1997)Plant J.12(2):255-265；Kawamata等.(1997)Plant CellPhysiol.38(7):792-803；Hansen等.(1997)Mol.Gen Genet.254(3):337-343；Russell等.(1997)Transgenic Res.6(2):157-168；Rinehart等.(1996)Plant Physiol.112(3):1331-1341；Van Camp

等.(1996)Plant Physiol.112(2):525-535；Canevascini等.(1996)PlantPhysiol.112(2):513-524；

Yamamoto等.(1994)Plant Cell Physiol.35(5):773-778；Lam(1994)ResultsProbl.20:181-196；

OROZCO等.(1993)Plant Mol Biol.23(6):1129-1138；Matsuoka等.(1993)ProcNatl.ACAD.Sci.

USA 90(20):9586-9590；和Geevara-Garcia等.(1993)Plant J.4(3):495-505。如果需要，这些启动子可以被修饰以用于弱表达。

叶特异性启动子是本领域已知的。参见，例如Yamamoto等.(1997)Plant J.12(2):255-265；Kwon等.(1994)Plant Physiol.105:357-67；Yamamoto等.(1994)Plant CellPhysiol.35(5):773-778；Gotor等.(1993)Plant J.3:509-18；Orozco等.(1993)PlantMol.Biol.23(6):1129-1138；和Matsuoka等.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(20):9586-9590。

合成促进剂也是本领域已知的。合成的组成型促进剂公开在例如美国专利6,072,050和6,555,673。

对于该系统的任何多核苷酸，该多核苷酸可以包括在植物转化载体中。“变换”是指将新的遗传物质(例如，外源转基因或表达盒形式)导入生菜植物细胞。将DNA转移到生菜植物细胞中的示例性机制包括(但不限于)电穿孔，微射弹轰击，农杆菌介导的转化和原生质体对DNA的直接摄取。植物原生质体的转化也可以使用基于磷酸钙沉淀，聚乙二醇处理，电穿孔以及这些处理的组合的方法来实现(参见:Potrykus等，1985；Omirulleh等，1993；Fromm等，1986；Uchimiya等，1986；Marcotte等，1986)。植物的转化和外源遗传元件的表达参见Choi等(1994)和Ellul等,(2003)。

“植物转化载体”:本发明所用的DNA分子是指用作将外源遗传物质递送到植物细胞中的载体的DNA分子。表达盒可以是载体(例如，植物转化载体)的组成部分，并且多个表达盒可以一起存在于单个载体中。例如，载体可以编码多个感兴趣的蛋白质(例如，两种不同的类黄酮生物合成酶，或单个类黄酮生物合成酶和可选择的标记或可筛选的标记)。

用于转化生菜细胞的载体不受限制，只要该载体能在细胞中表达插入的DNA即可。例如，可以使用包含用于在生菜细胞中组成型基因表达的启动子(例如花椰菜花叶病毒35S启动子)和可被外源刺激物诱导的启动子的载体。合适载体的一些例子包括用于植物转化的具有GUS报告基因的二元农杆菌载体。将载体导入的生菜细胞包括各种形式的生菜细胞，例如培养的细胞悬液，原生质体，叶部分和愈伤组织。载体可以通过已知的方法引入生菜细胞中，例如聚乙二醇法，聚阳离子法，电穿孔，农杆菌介导的转移，粒子轰击和原生质体直接吸收DNA。

在一些实施方案中，植物转化载体包括可选择标记。在特定实施方案中，可选择标记选自杀生物剂抗性标记，抗生素抗性标记或除草剂抗性标记。

在一些实施例中，本发明的系统还包括可筛选标记器。在特定实施方案中，可筛选标记选自B-葡糖醛酸酶或UIDA基因(GUS)，R-位点基因，B-内酰胺酶基因，荧光素酶基因，XYLE基因，淀粉酶基因，酪氨酸酶基因和A-半乳糖苷酶基因。

在一些实施方案中，植物转化载体衍生自根癌农杆菌的质粒。在某些实施方案中，所述载体衍生自根癌农杆菌的Ti质粒。在某些实施方案中，所述载体衍生自发根农杆菌的RI质粒。农杆菌介导的转移是一种广泛适用的将基因座导入植物细胞的系统。现代农杆菌转化载体能够在大肠杆菌以及农杆菌中复制，从而便于操作(Klee等，1985)。此外，用于农杆菌介导的基因转移的载体的最新技术进步已经改进了载体中基因和限制性位点的排列，以便于构建能够表达各种多肽编码基因的载体。

所述载体具有方便的多接头区域，所述多接头区域侧翼是启动子和用于直接表达插入的多肽编码基因的多腺苷酸化位点。另外，可以使用同时含有已布防和已布防的Ti基因的农杆菌进行转化。

通过农杆菌介导的植物整合载体转化以将DNA导入生菜植物细胞的方案和方法已经建立了(Fraley等，1985；美国专利5,563,055)。例如，美国专利5,349,124描述了一种使用农杆菌介导的转化转化生菜植物细胞的方法。通过插入具有编码表达蛋白质毒性的全长苏云金芽孢杆菌(Bt)毒素蛋白质的DNA编码序列的嵌合基因对于鳞翅目幼虫，例如毛虫，该方法导致生菜对这些昆虫具有抗性。

微射弹轰击技术可广泛应用，并可用于转化几乎任何植物种类。例如，涉及用生菜进行微射弹轰击转化的例子可参见Elliott等,2004；PHYS.Rev.Lett.92，095501。

转基因生菜细胞和转基因生菜植物

在一些实施方案中，本发明公开了用一个或多个本发明所述的多核苷酸和/或表达盒转化的转基因生菜。如本发明所述，转基因生菜细胞可以是生菜植物的一部分。在一些实施方案中，本发明公开了用本发明所述的一个或多个多核苷酸和/或表达盒转化的转基因生菜细胞。在一些实施方案中，转基因生菜包括转基因生菜细胞。在一些实施方案中，转基因生菜或生菜细胞是生菜种子。在某些实施方案中，本发明提供了一种生菜种子，其包括如本发明所述的系统。

在一些实施方案中，本发明的转基因生菜细胞，转基因生菜或转基因生菜种子显示出一种或多种多酚或其衍生物的提高的产量。在一些实施方案中，相对于对照生菜细胞或对照生菜，提高的产量包括增加一种或多种多酚或其衍生物的产量。在一些实施方案中，相对于对照生菜细胞或对照生菜，一种或多种多酚或其衍生物的增强的生产修饰。在一些实施例中，所述一种或多种多酚或其衍生物选自绿原酸或其衍生物，例如3-O-咖啡酰奎宁酸(3-CQA)，4-O-咖啡酰奎宁酸(4-CQA)，5-O-咖啡酰奎宁酸(5-CQA)，3，4-二咖啡酰奎宁酸(3，4-DICQA)，菊苣酸；槲皮素和水溶性槲皮素衍生物，如槲皮素-3-O-葡萄糖苷(Q3G)和槲皮素-3-O-丙二酰葡萄糖苷(Q3MG)；其它类黄酮如芹菜素及其衍生物，木犀草素及其衍生物，黄酮及其衍生物，杨梅素及其衍生物；和花青素如氰化3-丙二酰基葡糖苷，氰基二氢-3-O-葡糖苷和类似物。在一些实施例中，所述一个或多个实施例包括更多的多酚或其衍生物包含槲皮素-3-O-丙二酰葡萄糖苷(Q3mg)。在一些实施方案中，所述一种或多种多酚或其衍生物包含5-O-咖啡酰奎尼酸(5-CQA)。

在某些实施方案中，多酚或其衍生物选自绿原酸和槲皮素。在一些特定实施例中，一种或多种多酚或其衍生物包括5-O-咖啡酰奎尼酸(5-CQA)，4-O-咖啡酰奎宁酸(4-CQA)，3-O-咖啡酰奎宁酸(3-CQA)，3，4-二咖啡酰奎宁酸(3，4-DICQA)，菊苣酸，槲皮素，槲皮素-3-O-丙二酰葡萄糖苷(Q3mg)和槲皮素-3-O-葡萄糖苷(Q3g)。

在一些实施方案中，本发明所述的生菜是具有来自一般生菜类型的红叶的生菜栽培种。在一些实施方案中，本发明的生菜，其中一般生菜类型选自活页，橡树叶，罗曼，巴特海德，冰山和夏脆生菜。在一些实施方案中，生菜是红叶生菜品种。在一些实施方案中，红叶生菜品种选自Lollo Rossa，新的红火生菜，红帆生菜，红藻生菜，半乳生菜，巴氏生菜和贝尼托生菜。在一些实施例中，生菜为安纳波利斯生菜，红吉力生菜，红火生菜，金福生菜，刺眼生菜，首乌生菜，公转生菜，金鸡生菜，生菜，OOC 1441生菜，脉冲生菜，红雾生菜，红色拉碗生菜，赤潮生菜，Bellevue生菜，Oredgeous生菜，石榴脆生菜，Vulcan生菜，Cantarix生菜，Breen生菜，Rouge d'Hiver生菜，Oscarde生菜，Blade生菜，Spock生菜，Edox生菜，Fortress生菜，Stanford生菜，Scaramanga生菜、Rutgers Scarlet生菜、缤纷一号生菜。

在一些实施方案中，转基因生菜细胞包括悬浮培养植物细胞。在特定的实施方案中，悬浮培养植物细胞是红叶生菜的细胞。

生产转基因植物细胞或转基因植物的方法

在一些方面，本发明提供了生产能够合成一种或多种多酚的转基因生菜的方法。在一些实施方案中，该方法包括：将本发明的系统，转基因或表达盒导入生菜细胞中，以产生转化的生菜细胞；在足以使包含多个转化生菜细胞的生菜细胞培养物发育的条件下培养转化生菜细胞；筛选转化的生菜细胞以表达由该系统，转基因或表达盒编码的多肽；以及从生菜细胞培养物中选择表达该多肽的转化生菜细胞。在一些实施方案中，用原生质体，电穿孔，用碳化硅纤维搅拌，农杆菌介导的转化，或通过DNA包被颗粒的加速进行转化。在一些实施方案中，使用农杆菌介导的转化来转化生菜细胞，并且植物转化载体包含农杆菌载体。在一些实施方案中，转化细胞的选择基于可筛选标记表达的检测。在一些实施例中，变换可以是稳定变换或瞬态变换。

可以使用各种方法将感兴趣的序列引入植物或植物部分中。“介绍”或“引入”是指将多核苷酸或多肽以这样的方式呈递给植物，植物细胞或植物部分，使得该序列能够进入植物的细胞内部。本发明的方法不依赖于将序列导入植物或植物部分的特定方法，只是多核苷酸或多肽可进入植物的至少一个细胞的内部。将多核苷酸或多肽导入植物的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化方法，瞬时转化方法和病毒介导的方法。

“稳定转化”:是指多核苷酸整合到植物基因组中或多核苷酸整合到质体基因组中{即，叶绿体，淀粉体，染色体，statoliths，叶绿体，elaioplasts和蛋白体)，该多核苷酸可由植物后代遗传。“瞬态变换”:是指多核苷酸被引入植物中而不整合到植物的基因组中。转化方案以及将多肽或多核苷酸序列导入植物的方案可以根据植物或植物细胞的类型而变化，所述植物或植物细胞靶向于转化。将多肽和多核苷酸引入植物细胞的合适方法包括显微注射(Crossway等.(1986)Biotechniques 4:320-334)，电穿孔(Riggs等.(1986)Proc.Nalt.Acad.Sci.USA 83:5602-5606，农杆菌-间接转化(美国专利5,563,055和5,981,840)，直接基因转移(Paszkowski等.(1984)EMBO J.3:2717-2722)和弹道粒子加速度(参见美国专利4,945,050；5,879,918；5,886,244和5,932,782；Tomes等.(1995)in Plant Cell,Tissue,and Organ Culture:Fundamental Methods,Ed.Gamborg和Phillips(Springer-Verlag，Berlin)；McCabe

等.(1988)Biotechnology6:923-926)；和LED变换(WO00/28058)。也参见Weissinger

等.(1988)Ann.Rev.Genet.22:421-477；Sanford等.(1987)Paramate Scienceand Technology 5 27-37(洋葱)；Christou等.(1988)植物生理学.87:671-674(大豆)；McCabe等.(1988)

Bio/Technology 6:923-926(大豆)；Finer and McMullen(1991)In Vitro CellDev.Biol 27P:175-182(大豆)；Singh等.(1998)Theor.Appl.Genet.96:319-324(大豆)；DATTA等.(1990)

Biotechenology 8:736-740(大米)；Klein等(1986)Proc.Nalt.Acad.Sci.USA85:4305-4309(玉米)；Klein等.(1988)Biotechnology 6:559-563(玉米)；美国专利5,240,855；5,322,783和5,324,646；Klein等(1988)Plant Physiol.91:440-444(玉米)；Fromm等.(1990)Biotechnology8:833-839(玉米)；Hooykaas-van Slogteren等(1984)Nature(London)311:763-764；美国专利5736369(Gereals)；Bytebier等(1987)Proc.Nalt.Acad.Sci.USA 84:5345-5349(百合科)；De Wet等.(1985)in TheExperimental Manipulation of Ovule Tissues,Ed.Chapman等.(Longman

New York)，pp.197-209(花粉)；Kaeppler等.(1990)Plant Cell Reports 9:415-418和Kaeppler等.(1992)Theor.Appl.Genet.84:560-566(晶须介导的转化)；D’HALLUIN等.(1992)Plant cell4:1495-1505(电穿孔)；Li等.(1993)Plant Cell Report 12:250-255和Christouand Ford(1995)Annals of Botany 75:407-413(水稻)；Osjoda等.(1996)Nature Biotechnology 14:745-750(玉米通过根癌农杆菌)；所有这些文献在此引入作为参考。

在某些实施方案中，转化是通过农杆菌介导的转化，植物转化载体包括农杆菌载体。在特定的实施方案中，农杆菌载体包括Ti质粒或Ri质粒。农杆菌介导的转移是本领域中用于将基因座导入植物细胞中的一种确定的方法。DNA可以被引入到整个植物组织中，从而绕过从原生质体再生完整植物的需要。农杆菌转化载体能够在大肠杆菌中复制以及农杆菌，允许方便的操作(Klee等，1985.Bio.Tech.3(7):637-342)。此外，用于农杆菌介导的基因转移的载体改善了基因和限制性位点在载体中的排列，以便于构建能够表达各种多肽编码基因的载体。这样的载体具有方便的多接头区域，其侧翼是启动子和用于直接表达插入的多肽编码基因的多腺苷酸化位点。另外，可以使用同时含有已布防和已布防基因的农杆菌进行转化。

在某些实施方案中，使用根癌农杆菌Ti质粒介导的植物表达载体pSCP-Me(SignalChem)转化生菜细胞或生菜植物。PSCP-ME是用于在携带组成型SCP启动子和嵌合终止子的双子叶植物中高水平表达外源基因的二元载体。所有转基因可以克隆到pSCP-ME中进行瞬时或稳定的转化。

多酚生菜粉和多酚生菜提取物

在一些实施方案中，本发明公开的多酚生菜粉通过取多酚生菜、干燥、粉碎得到。在某些实施方案中，干燥选自晾干、烘干、冻干、吸附、风干中的至少一种。在某些实施方案中，通过球磨将多酚生菜粉碎至目数20-2000目。在某些实施方案中，通过球磨将多酚生菜粉碎至目数600-2000目。

在一些实施方案中，本发明公开多酚生菜提取物包含水和乙醇以及可溶于其中的生菜组分。在一些实施方案中，提取物包含约2％绿原酸，2％菊苣酸和2％花青素和约3.5％槲皮素(w/w)。

在一些实施方案中，本发明提供了一种制备多酚生菜提取物的方法，包括将生菜样品与溶剂混合并将液相与固相分离。在一些实施方案中，溶剂是食品级溶剂。在某些实施方案中，溶剂是乙醇。生菜样品可以是新鲜的，冷冻的或脱水的。在一些实施方案中，生菜与溶剂的比例(g/ml)为1:10，1:5，2:5，3:5，4:5或1:1。在某些实施方案中，生菜与溶剂的比例(g/ml)为2:5。在一些实施方案中，制备生菜提取物的方法包括冷冻生菜样品，研磨冷冻的生菜样品，将生菜样品与乙醇以2:5的比例(g/ml)混合，以及将液相与固相分离。

在一些实施方案中，本发明提供了一种制备多酚生菜提取物的方法，包括步骤:将生菜榨汁处理，榨汁后直接用汁对渣进行浸泡，固液分离得到生菜汁和生菜渣，将得到的生菜渣与溶剂混合提取，并固相分离，将液相与生菜汁合并，干燥后得多酚生菜提取物。在一些实施方案中，溶剂为乙醇。在一些实施方案中，生菜渣与溶剂的配比为(1-4):(1-10)g/mL。在一些实施方案中，生菜渣与溶剂为2:5g/mL。

动物饲料

本发明所使用的术语“动物饲料”是指适合或旨在由动物摄入的任何化合物、制剂或

混合物。“动物饲料”可以是固体(例如粉末，颗粒，粒料)、半固体(例如凝胶，软膏，乳膏，糊剂)或液体(例如溶液，悬浮液，乳液)。在一些实施方案中，所述动物饲料口服给予动物。在一些实施方案中，所述动物饲料的喂养方式为混合喂养或液体饮水喂养。

在某些实施方案中，所述动物是反刍动物。反刍动物包括例如奶牛，山羊，绵羊，牦牛，鹿或羚羊。在某些实施方案中，所述动物是单胃动物。单胃动物包括袋鼠，大鼠，狗，猪，猫，马，鸟(例如鸽和企鹅)和兔。在某些实施方案中，所述动物是禽类动物，如鸡，鸭、鹅。在某些实施方案中，所述动物是水产动物，如鱼，虾等。

在一些实施方案中，所述动物饲料为宠物饲料。在一些实施方案中，动物饲料包括粗饲料、精料和混合饲料。

在一些实施方案中，所述动物饲料包含上述多酚生菜粉和/或多酚生菜提取物。在一些实施方案中，所述动物饲料还包含佐剂、载体或稀释剂。在一些实施方案中，所述动物饲料还包括粘合剂、崩解剂、赋形剂、调味料、着色剂、稳定剂、缓冲剂、乳化剂、分散剂、增稠剂、增溶剂、微量营养素、抗氧化剂、饲料材料、液体载体。

在一些实施方案中，所述粘合剂包含树胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶，所述崩解剂包含磷酸氢钙等赋形剂，玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸，所述润滑剂包括硬脂酸镁，所述甜味剂包括蔗糖、乳糖或糖精。

在一些实施方案中，所述动物饲料还包括功能性成分，所述功能性成分选自益生元、益生菌、后生元或植物多糖。在一些实施方案中，所述多酚生菜粉或多酚生菜提取物，与益生菌复合使用，所述多酚生菜粉或多酚生菜提取物，与益生菌的质量比为(1-2):(1-2)。在一些实施方案中，多酚生菜粉或多酚生菜提取物，与益生菌的质量比为1：1。同等剂量下，多酚生菜粉或多酚生菜提取物，与上述功能性成分复配得到的复合粉，针对不同适应症的效果好于多酚生菜粉或多酚生菜提取物、或功能性成分单独使用的效果。

在一些实施方案中，所述动物饲料具有抗炎作用。在一些实施方案中，所述动物饲料具有改善动物的肠胃炎的作用。所述动物饲料可增强肠道上皮屏障功能，缓解抗生素、重金属与其他药物导致的肠道损伤，从而改善动物的肠胃炎。

在一些实施方案中，所述动物饲料具有改善乳房炎的作用。在一些实施方案中，所述动物饲料具有防治非洲猪瘟病毒ASFV作用。在一些实施方案中，所述动物饲料具有防治禽流感作用。在一些实施方案中，所述动物饲料具有改善动物肉质的作用。在一些实施方案中，所述动物饲料具有提高动物健康程度的作用。在一些实施方案中，所述动物饲料具有提高动物活跃度的作用。所述动物饲料能改善肉品感官指标和营养价值，其机制与多酚类化合物等植物提取物具有调节肝脏代谢、改善动物机体的抗氧化水平紧密相关。

在一些实施方案中，给予受试动物有效量的本发明的动物饲料，以实现前述作用。在一些实施方案中，所述多酚生菜粉或多酚生菜提取物的用量为每天0.1-200g/1000kg。在一些实施方案中，所述多酚生菜粉或多酚生菜提取物的用量为每天0.5-100g/1000kg。

本发明所使用的术语“有效量”：指提供所需生理变化的治疗剂(例如，多酚生菜粉、多酚生菜提取物、动物饲料)的量，例如抗病毒，抗炎等。期望的生理变化可以是，例如，疾病症状的减少，或者疾病的严重程度的降低，或者可以是疾病进展的减少。关于病毒感染，所需的生理变化可以包括，例如，受试者中可检测到的病毒减少，症状减少，病毒复制减少，和/或病毒与宿主细胞的结合减少。对于炎症，所需的生理变化可以包括，例如，炎症消退，炎症进展速率降低，炎症生物标志物水平降低，与炎症相关的症状降低，或临床缓解。

本发明具有以下有益效果:

1、本发明的多酚生菜相比普通生菜具有显著提高的多酚含量，多酚含量为1000-9000mg/kg，为普通生菜在极端环境中种植，或生菜经过生物或非生物应激诱导剂处理后得到，其含有显著提高的有益于健康的多酚，例如槲皮素衍生物，菊苣酸，绿原酸和花青素等，将其用于动物饲料，可以显著提高动物的免疫力，是抗生素的有效替代品，且效果优于普通生菜粉或生菜提取物。

2、本发明的多酚生菜粉或多酚生菜提取物具有抗炎作用，具体来说可以有效治疗奶牛的显性乳房炎，患有显性乳房炎的奶牛食用多酚生菜粉或多酚生菜提取物后体细胞显著下降，5-7天内即可恢复健康；可以调节肝脏代谢、改善动物机体的抗氧化水平，从而具有改善动物的肠胃炎的作用。

3、本发明的多酚生菜粉或多酚生菜提取物具有抗病毒作用，具体来说可有效防治ASFV(非洲猪瘟病毒)，可以有效防止疫情蔓延、降低死亡率；可以有效防治禽流感，提高存活率，芦花鸡二次感染2.5倍禽流感病毒，存活并产蛋。

4、本发明的多酚生菜粉或多酚生菜提取物可以改善动物肉质、提高动物健康程度和动物活跃度。例如，可以改善肉质、提高种猪产仔存活率、种猪受孕率、提高猪仔健康程度、提高育肥猪活跃度，可以提高肉鸡的肉质，也提高蛋鸡的蛋色。

5、本发明的多酚生菜粉或多酚生菜提取物可代替抗生素，应用于禽畜牧、宠物、水产等。

6、本发明的多酚生菜粉或多酚生菜提取物可代替抗生素，应用于宠物饲料、动物保健品和兽药。

7、本发明的多酚生菜可大批量生产，同时经济地制备得到多种有利于动物健康的植物多酚。

附图说明

图1实施例A中未经处理(1)和经处理(2)的多酚生菜的生物活性成分的LC-MS色谱图，A:绿原酸(3-CQA)；B:菊苣酸(CRA)；C:槲皮素-3-O-葡萄糖苷(Q3G)；D:槲皮素-3-O-丙二酰葡萄糖苷(Q3mg)；E:3，4-二咖啡酰奎宁酸(3，4-DICQA)。

图2显示了实施例A用植物生长调节剂处理的红叶生菜中绿原酸和菊苣酸的产量(2A)和水溶性槲皮素衍生物(2B)增加了3至9倍；2A描述了绿原酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸(3,4-二CQA)和菊苣酸(3-CQA、CRA和3,4-二CQA)的生产，2B描述了槲皮素衍生物(Q3G和Q3MG)的生产。

图3实施例B中未经处理(1)和经处理(2)的多酚生菜的生物活性成分的LC-MS色谱图，A:绿原酸(3-CQA)；B:菊苣酸(CRA)；C:槲皮素-3-O-葡萄糖苷(Q3G)；D:槲皮素-3-O-丙二酰葡萄糖苷(Q3mg)；E:3，4-二咖啡酰奎宁酸(3，4-DICQA)。

图4显示了实施例B中绿原酸和菊苣酸的产生(4A)和水溶性槲皮素衍生物(4B)在红莴苣中显著增加，在处理后，通过调节主要苯丙醇途径的基因而增加；4A描述了绿原酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸(3,4-二CQA)和菊苣酸(3-CQA、CRA和3,4-二CQA)的生产，4B描述了槲皮素衍生物(Q3G和Q3MG)的生产。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案，实施例是为了举例说明而不是为了限制。

多酚生菜制备实施例

实施例A

多酚生菜的制备，本实施例证明，当用生物/非生物应激剂/诱导剂处理时，红叶生菜中多酚的产量增加。

在25-28℃，40-60％相对湿度，平均光周期为12小时/天的实验室温室中培养红色品种的生菜植物(Lactucasativa)。所用的非生物应激剂/诱导剂是吲哚-3-乙酸(IAA)，萘乙酸(NAA)，草酸，苯并噻二唑(BTH)；2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)，花生四烯酸(AA)，水杨酸(SA)和茉莉酮酸甲酯(MJ)，用量为5，10，15，45和90mM。所用的生物应激剂/诱导剂是超敏蛋白(HP)，壳聚糖，牛蒡低聚果糖(BFO)，大虎杖提取物和海藻提取物，其浓度为30mg/L，60mg/L，120mg/L和1000mg/L。所有的应激剂溶解在去离子水中(非水溶性应激剂预先溶解在1ml乙醇中)。加入一组样品和仅含1ml乙醇的水。对照样品未进行处理。在第14天对红生菜施用应激剂/诱导剂处理。每个实验单元由随机选择的五个生菜组成，并分配给一个处理。通过生根吸收或叶扩散处理每个样品，每种诱导剂喷3次(约70ml)。在50天收获生菜样品。

提取和定量

在用50％乙溶剂提取取样品后，在对处理过的和未处理过的(对照)红生菜中主要有益健康的多酚进行了表征和定量。将2克样品[吲哚-3-乙酸(IAA)处理组，45mM]用液氮冷冻，研磨，并与5ml乙醇混合。在室温下摇动样品/乙醇混合物4小时在5000×g下离心10分钟(4℃)。收集上清液，过滤，并进行LC-MS分析，结果见图1-2。如图1-2所示[吲哚-3-乙酸(IAA)处理组]，可以看出用生物或非生物刺激剂处理的红生菜与未处理的生菜比，多酚类绿原酸(3-CQA)、菊苣酸、3，4-二咖啡酰奎宁酸(3，4-DICQA)、槲皮素-3-O-葡糖苷(Q3G)、槲皮素-3-O-丙二酰葡糖苷(Q3MG)含量均显著提高了。

实施例B

通过调节主要苯基丙酸途径的基因增强红生菜中多酚的产生，该实施例显示了通过调节初级苯基丙酸途径的基因来增强多酚。更具体地说，本实施例通过过量表达AAE13和AtMYB12来增加红生菜中的多酚含量，作为食用植物体内生产生物活性分子的代表性例子，其通过使用本发明涉及基于专有基因组学的技术(例如，系统)以增强下游代谢物的产生。

使用由Signalchem开发的用于植物悬浮细胞技术的瞬时表达和稳定转化的高效平台。具体地，用植物表达载体pSCP-ME(SignalChem)，用于在携带组成型SCP启动子和嵌合终止子的双子叶植物中高水平表达外源基因的二元载体转化根癌农杆菌Ti质粒介导的农杆菌。为了工程化丙二酰辅酶A的生物合成并增加健康有益的多酚合成的构建体，将转基因AAE13(丙二酸酯辅酶A连接酶)和AtMYB12转录因子克隆到PSCP-ME中以进行瞬时和稳定的转化。

将携带转基因的农杆菌菌株AGL1的过夜培养物转移到1000ml烧瓶中，在250mlYEP培养基中补充100mg/L卡那霉素，50mg/L的卡宾西林和50mg/L的利福平，生长4-8小时，直到600nm(OD600)的光密度达到约0.5-1。细胞在室温下在离心机中制粒，并再悬浮在45ml包含5g/L D-葡萄糖，10mM MES，10mM MGCB和200mM乙酰丁香酮的渗透培养基中。采用真空渗滤的农业渗滤方法在红生菜叶片中瞬时表达和稳定转化。

在农业渗透后5-7天，使用LC/MS对处理过的和未处理过的生菜样品中的主要有益健康的多酚进行了表征和定量。结果见图3-4。结果显示，经处理后，多酚3-CQA，菊苣酸，3，4-二咖啡酰奎尼酸(3，4-DICQA)，槲皮素-3-O-葡萄糖苷(Q3G)，槲皮素-3-O-丙二酰葡萄糖苷(Q3MG)含量显著提高了。

多酚生菜粉或多酚生菜提取物制备实施例

实施例1

取实施例A的多酚生菜作为样品，将2克样品用液氮冷冻，研磨，并与5ml 50％的乙醇混合。在室温下摇动样品/乙醇混合物4小时在5000×g下离心10分钟(4℃)。收集上清液，冷冻干燥，得多酚生菜提取物1。

实施例2

取实施例B的多酚生菜作为样品，将2克样品用液氮冷冻，研磨，并与5ml 50％的乙醇混合。在室温下摇动样品/乙醇混合物4小时在5000×g下离心10分钟(4℃)。收集上清液，冷冻干燥，得多酚生菜提取物2。

实施例3

1)取100kg实施例A的多酚生菜作为样品，生菜榨汁:将生菜采用工业型榨汁机(GXYZ-400)进行榨汁处理，得到汁和渣的混合物，室温下搅拌浸泡30min后，过滤，得到生菜汁和生菜渣；

2)将生菜渣与浓度为38％的乙醇-水溶液按照2kg/5L的比例混合，进行多酚物质的提取，提取时间为35min，提取温度为室温，提取过程中不断进行搅拌，提取结束后，固液分离，得到富含多酚物质的提取液和提取渣；

3)提取液经减压蒸馏去除有机溶剂后，与生菜汁混合，冷冻干燥得多酚生菜提取物3。

实施例4

1)取100kg新鲜的实施例A的多酚生菜，去掉受损叶片，沥干表面水分，真空冻干，温度为-40℃，时间为24h，水分含量小于15％。

2)将步骤1)冻干后的干菜，在温度为0℃，湿度为60的车间环境下，通过紫外线灯和臭氧机灭菌，机器通过75％酒精消毒，球磨磨制目数为800目，得多酚生菜粉。

对比例1

取实施例A的未经处理的红叶生菜作为样品，将2克样品用液氮冷冻，研磨，并与5ml50％的乙醇混合。在室温下摇动样品/乙醇混合物4小时在5000×g下离心10分钟(4℃)。收集上清液，冷冻干燥，得生菜提取物1。

对比例2

1)取100kg新鲜的实施例A的未经处理的红叶生菜，去掉受损叶片，沥干表面水分，真空冻干，温度为-40℃，时间为24h，水分含量小于15％。

2)将步骤1)冻干后的干菜，在温度为0℃，湿度为60的车间环境下，通过紫外线灯和臭氧机灭菌，机器通过75％酒精消毒，球磨磨制目数为800目，得生菜粉1。

对比例3

1)取100kg新鲜的实施例A的多酚生菜，去掉受损叶片，沥干表面水分，真空冻干，温度为-40℃，时间为24h，水分含量小于15％。

2)将步骤1)冻干后的干菜，在温度为0℃，湿度为60的车间环境下，通过紫外线灯和臭氧机灭菌，机器通过75％酒精消毒，球磨磨制目数为400目，得多酚生菜粉2。

应用例

1、多酚生菜对于奶牛乳头炎的测试

测试方法:在内蒙古奶牛场，选定40头体重980kg左右、患有显性乳房炎的奶牛，随机分成8组，其中，实施例1-4每天喂养普通饲料(饲料)55斤，以及按照实施例1-4制备得到的多酚生菜粉60g/天或多酚生菜提取物50g/天，对比例1-2与实施例1和3不同仅在于除普通饲料外，喂养的是对比例1-2的生菜粉60g/天或生菜提取物50g/天，对照组仅喂养普通饲料(饲料)55斤，连续喂养7天，抗生素组除普通饲料外，采用地塞米松磷酸钠30万国际单位、青霉素320万国际单位、链霉素200万国际单位、生理盐水200ml混合注射进入乳房，抗生素注射3天，每天一次。每24h取奶牛的奶样测试奶牛的体细胞，结果如表1。

表1体细胞测试结果

备注:测试当季所有奶牛平均奶样平均体细胞为83.9万，30万到25万体细胞单位以内为正常。

通过以上数据分析可知，本发明实施例1-4的多酚生菜粉或多酚生菜提取物可以有效治疗奶牛的显性乳房炎，患有显性乳房炎的奶牛食用多酚生菜粉或多酚生菜提取物后体细胞显著下降，5-7天内即可恢复健康。而对比例1-2的生菜粉或生菜提取物虽然具有一定的治疗效果，但恢复程度较实施例1-4劣化较多。而比较实施例4和对比例3可知，当球磨磨程度较小时，不利于多酚生菜中活性成分发挥抗炎作用。而实施例1-4与抗生素组效果相当，当抗生素组由于使用了抗生素，奶牛产出的奶不可以销售，损失严重。

2、防治ASFV有效性试验及提高动物健康实验

测试方法:测试猪场为种猪养殖场，自2014年开始运行，常年有母猪500头，每年出售小猪12000头。2022年7月底至8月中猪场的1号猪舍100头每周出现非瘟转阳性7头，持续半个多月左右死亡二十多头。后来用拔牙式全清处理，全隔离措施，猪场临近2号栏舍也有过阳性发生。选取使用正常防疫针的母猪250头，随机分成五组。

A组用实施例1的多酚生菜提取物产品千分之一，复合益生菌千分之一；

B组用实施例4的多酚生菜粉产品千分之一，复合益生菌千分之一；

C组用对比例1的多酚生菜提取物产品千分之一，复合益生菌千分之一；

D组用对比例3的多酚生菜粉产品千分之一，复合益生菌千分之一；

E组只用复合益生菌千分之二。

F组只用实施例1的多酚生菜提取物产品千分之二。

G组只用实施例4的多酚生菜粉产品千分之二；

其中，复合益生菌为TILAND铁兰32，山东合正生物科技有限公司提供。

试验期两个月。

试验结果:A-D组每周两次阳性测试，全部为阴性，未发现疫情蔓延，无母猪死亡，小猪仔也健康；整体猪的毛色光亮，运动量增加，活跃度提高，食量增大；E组发现8头阳性，另行隔离，继续用原饲料饲养2周前后死亡；F-G组发现各2头，另行隔离，继续用原饲料饲养未死亡。

长势明显改变，A-B料肉比相比减少4％左右，C-D组料肉比减少2％左右；E组料肉比减少2％；F-G组料肉比减少3％。

母猪健康状况良好，A-D组头胎母猪产仔数量分别为12.5、12.2、11.2、11.1头，产房产仔成活率提高至98.1％、97.8％、94.2％、94.0％，仔猪健康，均无阳性；A-D组细小病毒肠道感染仅死亡2头、3头、31头、39头；产后母猪发情明显提早了，A-B组断奶7天左右可以正常配种，受孕率100％，C-D组9天左右可以正常配种，受孕率92％；A-B组小猪保育至35天均重达12公斤全部出栏出售，C-D组小猪保育至37天均重达12公斤全部出栏出售。

E组头胎母猪平均产仔数量为10.9头，产房产仔成活率为91.2％；因细小病毒引起的肠道感染死亡49头；仔猪出栏90％。

F组头胎母猪平均产仔数量为11.4头，产房产仔成活率为95.5％；因细小病毒引起的肠道感染死亡15头；仔猪出栏96％。

G组头胎母猪平均产仔数量为11.8头，产房产仔成活率为95.3％；因细小病毒引起的肠道感染死亡12头；仔猪出栏96％。

对比例A-G组，可以看出，采用本发明的多酚生菜粉或多酚生菜提取物，与益生菌复配使用，在防治非洲猪瘟、改善动物肉质、提高动物健康程度和动物活跃度等方面，均比单独使用多酚生菜粉或多酚生菜提取物，或益生菌具有更好的技术效果。并且，采用实施例1的的多酚生菜提取物或实施例4的多酚生菜粉，与益生菌复配使用，相比采用对比例1的的多酚生菜提取物或对比例3的多酚生菜粉，与益生菌复配使用，在防治非洲猪瘟、改善动物肉质、提高动物健康程度和动物活跃度等方面具有更好的技术效果。

3、防治禽流感试验

取250只体重为1200-1300g的芦花鸡，雄性雌性各50％，接种自然感染浓度1.5倍的H1N1病毒，具体接种方法为：种痘。随机分成5组(A-E组)，其中A组喂食普通饲料和实施例4的多酚生菜粉(添加量为0.5g/kg饲料)，B组喂食普通饲料和实施例3的多酚生菜提取物(添加量为0.3g/kg，饮水)，C组喂食普通饲料和黄芪、银翘粉(二者添加量均为1g/kg，饲料，黄芪、银翘粉制备工艺同实施例4)，D组喂食普通饲料和恩诺沙星、土霉素(用50-100PPm的恩诺沙星饮水4-5天；在饲料中每百公斤加入5克土霉素)，E组喂食普通饲料和金钢烷胺(用按每公斤体重10-25毫克饮水4-5天)；其中，A-E组普通饲料用量为110g/每天。

另取100只体重为800-1100的雌性芦花鸡(开产日龄150-180天，在农村一般饲养管理条件下，年产蛋130-150个；较好饲养条件下产蛋180-200个；蛋重45克，蛋壳多为浅褐色)，接种间隔25天二次感染2.5倍的H1N1病毒，具体接种方法为：种痘。随机分成5组(A1-E1组)，其中A1组喂食普通饲料和实施例4的多酚生菜粉(添加量为0.5g/kg饲料)，B1组喂食普通饲料和实施例3的多酚生菜提取物(添加量为0.3g/kg，饮水)，C1组喂食普通饲料和黄芪、银翘粉(二者添加量均为1g/kg，饲料，黄芪、银翘粉制备工艺同实施例4)，D1组喂食普通饲料和恩诺沙星、土霉素(用50-100PPm的恩诺沙星饮水4-5天；在饲料中每百公斤加入5克土霉素)，E1组喂食普通饲料和金钢烷胺(按每公斤体重10-25毫克饮水4-5天)；其中，A1-E1组普通饲料用量为110g/每天。

A组50只和A1组20只全部存活。其他4组，无一存活。而且A1组的芦花鸡成年后正常产蛋，产蛋单枚重量为60+/-4g，比正常产蛋大30-40％。

本发明的多酚生菜粉抗禽流感病毒效果很好，比自然感染浓度高1.5-2.0倍造模，依然有很好的治疗效果，极限情况下二次接种病毒为2.5倍。

本发明方案不仅限于上述技术手段所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。以上所述是本发明的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

Claims (41)

1.一种多酚生菜在动物饲料中的应用，其特征在于，所述多酚生菜的多酚含量为1000-9000mg/kg。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多酚生菜合成方法包括：将普通生菜在极端环境中种植，从而增加生菜中多酚的产生。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多酚生菜的合成方法包括：给予生菜至少一种用于生菜中多酚的生物合成的系统，从而增加生菜中多酚的产生；所述系统包括至少一种提高生菜中多酚产量的应激剂/诱导剂，或其同系物、异构体或衍生物；所述系统包括浓度为1mM至1000mM的所述应激剂/诱导剂；通过LC-MS定量增加的多酚的产量；与对照生菜样品相比，多酚的产量增加了3-9倍。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应激剂/诱导剂至少包括一种非生物应激剂/诱导剂。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述非生物应激剂/诱导剂选自：生长素，细胞分裂素，赤霉素，乙烯，油菜素甾类，茉莉酮酸酯，甾内酯，水杨酸，花生四烯酸，5-氨基乙酰丙酸，草酸及其同系物、异构体、衍生物、合成类似物中的至少一种；优选为花生四烯酸，5-氨基乙酰丙酸，乙烯中的至少一种。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述非生物应激剂/激发剂选自：吲哚-3-乙酸，吲哚-3-丙酮腈，吲哚-3-乙醛，乙酸乙酯，吲哚-3-丙酮酸，吲哚-3-丁酸，吲哚-3-丙酸，吲唑-3-乙酸，CHI，苯氧基丙酸，萘乙酸，苯氧基乙酸，2，4-二氯苯氧基乙酸，2，4，5-三氯苯氧基乙酸，萘乙酰胺，2-萘氧基乙酸，2，3，5-三碘苯甲酸，噻吩-3-丙酸，核糖基玉米素，玉米素，异戊炔基腺嘌呤，二氢玉米素，6-苄氨基嘌呤，6-苯基氨基嘌呤，激动素，N-苄基-9-(2-四氢吡喃基)腺嘌呤，二苯基脲，噻苯隆，苯并咪唑，腺嘌呤，6-(2-噻吩基氨基)嘌呤，GA，GA4，GA7，GA3，乙烯，乙烯利，扁豆内酯，28-高扁豆内酯，蓖麻甾酮，扁豆甾酮，28-高扁豆甾酮，蒲黄甾醇，茉莉酮酸，二氢茉莉酮酸甲酯，二氢茉莉酮酸，茉莉酮酸甲酯，司群醇，奥洛班醇，GR24，花生四烯酸，水杨酸中的至少一种；优选为吲哚-3-乙酸，萘乙酸，草酸，苯并噻二唑，2，4-二氯苯氧基乙酸，花生四烯酸，水杨酸，茉莉酸甲酯的至少一种。

7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述系统包括选自以下的应激剂/激发剂:吲哚-3-乙酸，萘乙酸，草酸，苯并噻二唑，2，4-二氯苯氧基乙酸，花生四烯酸，水杨酸和茉莉酮酸甲酯，其中每个应激剂/激发剂独立地以5mM，10mM，15mM，45mM或90mM的浓度存在。

8.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应激剂/诱导剂至少包括一种生物应激剂/诱导剂；所述系统包括浓度为10mg/L-5000mg/L的生物应激剂/诱导剂。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述生物应激剂/诱导剂选自：脂多糖，果胶，纤维素，壳聚糖，几丁质，葡聚糖，藻酸盐，阿拉伯胶，酵母提取物，海藻提取物，腐植酸，黄腐酸，大虎杖提取物，虎杖提取物，辣木叶提取物，穿心莲提取物，甜菜提取物，亚麻子提取物，贯叶连翘提取物，蒲公英提取物，红车轴草提取物，荨麻提取物，缬草提取物，大蒜提取物，韭菜提取物，甘草提取物，红葡萄皮提取物，蓝莓果提取物，山楂叶提取物，艾蒿提取物，橄榄叶提取物，石榴叶提取物，番石榴叶提取物，琉璃苣叶提取物，琉璃苣花提取物，栽培烟叶提取物，百叶提取物，无花果树叶提取物，扁柏叶提取物，大青叶提取物，野芹菜叶提取物，法式橡木提取物，玉米提取物，迷迭香提取物，棕榈花粉提取物，苜蓿植物提取物，半乳糖醛酸酯，谷氨酸酯，甘露聚糖，甘露聚糖醛酸酯，纤维素酶，隐球菌素，糖蛋白，敏蛋白，糖蛋白，低聚果胶，果胶酶，鱼蛋白，水解物，乳铁蛋白，真菌孢子，菌丝体细胞壁，微生物壁，冠菌素，牛至提取物的至少一种。

10.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述系统包含浓度为30mg/L，60mg/L或120mg/L的生物应激剂/诱导剂，所述生物应激剂/诱导剂选自超敏蛋白Harpin Protein，牛蒡低聚果糖和壳聚糖的至少一种。

11.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多酚选自绿原酸及其衍生物，水溶性槲皮素衍生物和花青素；所述绿原酸选自咖啡酰奎宁酸，4-咖啡酰奎宁酸，5-O-咖啡酰奎宁酸，菊苣酸，和3，4-二咖啡酰奎宁酸；所述水溶性槲皮素衍生物是槲皮素-3-O-葡萄糖苷和/或槲皮素-3-O-丙二酰葡萄糖苷；所述花青素是氰化3-丙二酰基-葡糖苷和/或氰化二素-3-O-葡糖苷。

12.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述系统包括表达盒，所述表达盒包含异源表达控制序列，所述异源表达控制序列可操作地连接到编码增加生菜中多酚产量的一种或多种蛋白质的至少一个多核苷酸；与对照生菜样品相比，多酚的产量增加了2-5倍。

13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述合成方法包括施用表达盒，所述表达盒包含异源表达控制序列，所述异源表达控制序列可操作地连接到至少一个编码增加生菜中多酚产量的一种或多种蛋白质的多核苷酸。

14.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述蛋白质包括丙二酸酯-CoA连接酶、转录因子；所述丙二酸-CoA连接酶包括AAE13；所述MYB转录因子选自：HY5，ATCPC，AtMYBL2，AtMyBLL，ATMYB12，ATMYB60，ATMYB75/PAP1，ATMYB90/PAP2，ATMYBLL，ATMYBLL3，ATMYB114，ATMYB123/TT2，HVMYBLO，BOMYB2，PURPLE，MRMYBLSMMYB39，GMYB10，VLMYBAL-1，V1MYBA1-2，V1MYBA1-3，V1MYBA2，VVMYBAL，WMYBA2，VVMYBC2-LL，VVMYBFL，VMYBPAL，VMYBPA2，VVMYB5A，VVMYB5B，ESMYBP3，MTPAR，LHMYB6，LHMYB12，LHMYB12-LAT，LJMYB14，LJTT2A，LJTT2B，LJTT2C，ZMCL，ZMPL，PL-BH，ZMPL，ZMMYB-IF35，GMMYBLO，PPMYBLO，PPMYBPAL，CSRUBY，OGMYBL，PCMYBLO，PYMYBLO，PETUNIA AN2，PETUNIA DPL，PETUNIA PHZ，PHMYBX，PHMYB27，PTMYB134，PTOMYB216，STANL，STAN2，STMTFL，TAMYB14，AMROSEAL，AMROSEA2，VENOSA，SORGHUM YL，GMMYB176，GMMYB-G20-L，GMMYB12B2，FAMYBL，FAMYB9，FAMYBLO，FAMYBLL，PVMYB4A，NTAN2，LEANTL，S1MYB12，S1MYB72 AMDEL，FAMYBLO，FAVBHLH和MYB12-like及其类似物，优选为AtMYB12。

15.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述系统还包括编码苯基丙酸类途径的酶的一个或多个多核苷酸、编码绿原酸途径的酶的一个或多个多核苷酸或所述系统还包括编码类黄酮途径的酶的一个或多个多核苷酸；所述苯基丙酸途径的酶选自：苯丙氨酸氨裂解酶，肉桂酸4-羟化酶和4-香豆酸-CoA连接酶的至少一种；所述绿原酸途径的酶选自：羟基肉桂酰基CoA:喹啉羟基肉桂酰基转移酶，香豆酰基-3-羟化酶，和咖啡酰基-CoA-3-O-甲基转移酶的至少一种；所述类黄酮途径的酶选自：查耳酮合酶，查耳酮异构酶，黄烷酮3-羟化酶，黄酮醇合酶，类黄酮-3-羟化酶，香豆酸酯3-羟化酶，肉桂酸酯4-羟化酶，4-羟基肉桂酰基-CoA连接酶，羟基肉桂酰基-CoA莽草酸酯，喹啉羟基肉桂酰基转移酶，羟基肉桂酰基-CoA喹啉羟基肉桂酰基转移酶中的至少一种。

16.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述系统还包括编码细胞色素P4503A4，CYP氧化还原酶和UDP-葡糖醛酸基转移酶或其任意组合的一个或多个多核苷酸。

17.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述多核苷酸为在生菜细胞中表达而被密码子优化。

18.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述异源表达控制序列包括在植物细胞中具有功能的启动子；所述启动子选自组成型活性植物启动子、诱导型启动子和组织特异性启动子；所述组织特异性启动子是叶特异性启动子。

19.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述多核苷酸还包含选自下组的调节序列:5'UTR，其位于起翻译前导序列作用的启动子序列和编码序列之间，3'非翻译序列，3'转录终止区和多腺苷酸化区。

20.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述表达盒包含在植物转化载体中；所述植物转化载体包括可选择标记、可筛选标记。

21.如权利要求20所述的应用，其特征在于，所述可选择标记选自杀生物剂抗性标记，抗生素抗性标记或除草剂抗性标记；所述可筛选标记选自B-葡糖醛酸酶或UIDA基因，R-位点基因，B-内酰胺酶基因，荧光素酶基因，XYLE基因，淀粉酶基因，酪氨酸酶基因和A-半乳糖苷酶基因。

22.如权利要求20所述的应用，其特征在于，所述载体衍生自根癌农杆菌的Ti质粒或发根农杆菌的RI质粒。

23.如权利要求12-22所述的应用，其特征在于，所述多酚生菜的合成方法包括：向生菜细胞中引入用于生菜中多酚的生物合成的系统以产生转化的生菜细胞，在足以使包含多个转化生菜细胞的生菜细胞培养物发育的条件下培养转化生菜细胞，筛选转化的生菜细胞以表达该系统编码的多肽，并从生菜细胞培养物中选择表达该多肽的转化生菜细胞。

24.如权利要求23所述的应用，其特征在于，所述转化是通过使用原生质体，电穿孔，与碳化硅纤维的搅拌，农杆菌介导的转化，或通过DNA包被的颗粒的加速；所述转化优选通过农杆菌介导的转化进行，并且所述植物转化载体包含农杆菌载体；所述筛选基于可筛选标记的表达。

25.如权利要求23所述的应用，其特征在于，转基因生菜细胞或转基因生菜表现出一种或多种多酚或其衍生物的改变的产量，所述改变的产量包括相对于对照生菜细胞或对照生菜，一种或多种多酚或其衍生物的增加的产量；所述一种或多种多酚或其衍生物选自绿原酸、槲皮素、水溶性槲皮素衍生物和其他黄酮；所述绿原酸选自3-O-咖啡酰奎宁酸、菊苣酸、3，4-DICQA；所述水溶性槲皮素衍生物选自槲皮素-3-O-葡糖苷和槲皮素-3-O-丙二酰葡糖苷；所述其他黄酮选自芹菜素及其衍生物，木犀草素及其衍生物，黄酮及其衍生物，杨梅素及其衍生物，花青素及其类似物；所述花青素选自氰化3-丙二酰葡糖苷，氰化丁-3-G-葡糖苷。

26.如权利要求25所述的应用，其特征在于，所述一种或多种多酚或其衍生物包含槲皮素-3-O-丙二酰葡萄糖苷、3-O-咖啡酰奎尼酸。

27.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述生菜是红叶生菜栽培品种；所述红叶生菜品种选自Lollo Rossa，新的红火生菜，红帆生菜，红藻生菜，半乳生菜，巴氏生菜，贝尼托生菜，安纳波利斯生菜，红吉力生菜，红火生菜，金福生菜，刺眼生菜，首乌生菜，公转生菜，金鸡生菜，生菜，OOC 1441生菜，脉冲生菜，红雾生菜，红色拉碗生菜，赤潮生菜，Bellevue生菜，Oredgeous生菜，石榴脆生菜，Vulcan生菜，Cantarix生菜，Breen生菜，Rouge d'Hiver生菜，Oscarde生菜，Blade生菜，Spock生菜，Edox生菜，Fortress生菜，Stanford生菜，Scaramanga生菜，Rutgers Scarlet生菜，缤纷一号生菜；所述普通生菜类型选自活页，橡树叶，罗曼，巴特海德，冰山和夏脆生菜。

28.如权利要求1所述的应用，其特征在于，培养生菜细胞、生菜植物或生菜种子，在足以产生所述一种或多种多酚或其衍生物的条件下进行。

29.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多酚生菜经干燥、粉碎得到多酚生菜粉，或经溶剂提取制备得到多酚生菜提取物后再用于动物饲料；生菜样品是新鲜的、冷冻的或脱水的。

30.如权利要求29所述的应用，其特征在于，所述多酚生菜粉通过取多酚生菜、干燥、粉碎得到；所述干燥选自晾干、烘干、冻干、吸附、风干中的至少一种；所述粉碎为通过球磨将多酚生菜粉碎至目数20-2000目，优选通过球磨将多酚生菜粉碎至目数600-2000目。

31.如权利要求29所述的应用，其特征在于，所述多酚生菜提取物的提取方法包括：将生菜样品与溶剂混合并将液相与固相分离，所述溶剂是食品级溶剂，优选为乙醇；生菜与溶剂的比例为1:10、1:5、2:5、3:5、4:5或1:1g/ml，优选为2:5g/ml。

32.如权利要求29所述的应用，其特征在于，所述多酚生菜提取物的提取方法包括：冷冻生菜样品，研磨冷冻的生菜样品，将生菜样品与乙醇以2:5g/ml的比例混合，以及将液相与固相分离。

33.如权利要求29所述的应用，其特征在于，所述多酚生菜提取物的提取方法包括：将生菜榨汁处理，榨汁后直接用汁对渣进行浸泡，固液分离得到生菜汁和生菜渣，将得到的生菜渣与溶剂混合提取，并固相分离，将液相与生菜汁合并，干燥后得多酚生菜提取物；所述溶剂为乙醇；生菜渣与溶剂的配比为(1-4):(1-10)g/mL，优选为2:5g/mL。

34.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述动物饲料的形态选自固体、半固体或液体；所述固体选自粉末、颗粒、粒料，所述半固体选自凝胶、软膏、乳膏、糊剂，所述液体选自溶液、悬浮液、乳液；所述动物饲料用作动物保健品、兽药、宠物饲料。

35.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述动物饲料口服给予动物；所述动物饲料的喂养方式为混合喂养或液体饮水喂养。

36.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述动物是反刍动物、单胃动物、禽类动物或水产动物；所述反刍动物包括奶牛，山羊，绵羊，牦牛，鹿或羚羊；所述单胃动物包括袋鼠，大鼠，狗，猪，猫，马，鸟和兔；所述禽类动物包括鸡，鸭、鹅。

37.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述动物饲料包括粗饲料、精料和混合饲料；所述动物饲料还包含佐剂、载体、稀释剂，优选为粘合剂、崩解剂、赋形剂、调味料、着色剂、稳定剂、缓冲剂、乳化剂、分散剂、增稠剂、增溶剂、微量营养素、抗氧化剂、饲料材料、液体载体；所述粘合剂包含树胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶，所述崩解剂包含磷酸氢钙等赋形剂，玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸，所述润滑剂包括硬脂酸镁，所述甜味剂包括蔗糖、乳糖或糖精。

38.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述动物饲料还包括功能性成分，所述功能性成分选自益生元、益生菌、后生元或植物多糖。

39.如权利要求29-38所述的应用，其特征在于，所述动物饲料具有抗炎作用、防治非洲猪瘟病毒ASFV作用、防治禽流感作用、改善动物肉质的作用、提高动物健康程度的作用、提高动物活跃度的作用。

40.如权利要求39所述的应用，其特征在于，所述动物饲料具有改善动物的肠胃炎、改善乳房炎的作用。

41.如权利要求29-38所述的应用，其特征在于，所述多酚生菜粉或多酚生菜提取物的用量为每天0.1-200g/1000kg，优选为每天0.5-100g/1000kg。

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