KR20020068256A - 플라보노이드 및 페놀 성분 함량이 증가된 식물 생산 방법 - Google Patents

플라보노이드 및 페놀 성분 함량이 증가된 식물 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식물에서 플라보노이드 함량을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 플라바논-3-히드록실라제 효소의 활성을 감소시키는 분자 유전학적 방법을 이용하여 식물을 생산하는 것을 특징으로 한다.

Description

플라보노이드 및 페놀 성분 함량이 증가된 식물 생산 방법{Method for Producing Plants with Increased Flavonoid and Phenolic Compound Content}
본 발명은 플라바논 3-히드록실라제 효소의 활성을 감소시키는 분자 유전학적 방법에 의해 식물을 재배함으로써 식물에서 플라보노이드 및 페놀 성분의 함량을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 방법에 따라, 분자 생물학적 방법(예를 들면, 안티센스 작제, 공억제, 특이적 항체의 발현 또는 특이적 억제제의 발현)에 의해 식물 전체에서 또는 식물의 일부분에서 플라바논 3-히드록실라제 효소의 활성을 완전히 또는 부분적으로, 영구적으로 또는 일시적으로 감소시킨다.
본 발명은 또한 플라바논 3-히드록실라제 효소의 효소 활성이 감소된, 플라보노이드 및 페놀 성분의 함량이 증가된 식물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 인간 및 동물에서 식품으로서, 보조 식품으로서, 또는 치료용 조성물, 건강-증진 조성물 또는 강장제(주스 제품, 주입 제품, 추출 제품, 발효 제품)의 제조에 있어서, 및 화장품의 제조에 있어서 본 발명의 방법에 의해 재배된 식물 또는 식물의 일부분의 용도에 관한 것이다.
식물에는 다양한 페놀 성분, 예를 들면, 카페산, 페룰산, 클로로겐산, 갈산, 에우게놀, 리그난, 코우마린, 리그닌, 스틸벤(폴리다틴, 레스베라트롤), 플라보노이드(플라본 카테친, 플라바논, 안토시아니딘, 이소플라본), 및 폴리메톡실화 플라본이 존재한다. 따라서, 일반적으로 페놀은 또한 수많은 식물-유래 식품 및 음료의 구성 성분이다.
특정 페놀 성분은 식품과 함께 섭취된 후 인간 또는 동물 대사과정에서 항산화제 효과를 나타낼 수 있기 때문에 특히 중요하다(Baum, B.O.; Perun, A.L. Antioxidant efficiency versus structure.Soc. Plast. Engrs Trans 2: 250-257, (1962); Gardner, P.T.; McPhail, D.B.; Duthie, G.G. Electron spin resonance spectroscopic assessment of the antioxidant potential of teas in aqueous and organic media.J. Sci. Food Agric. 76: 257-262, (1997); Rice-Evans, C.A.; Miller, N.J.; Pananga, G. Structure-antioxidant activity relationship of flavonoids and phenolic acids.Free Radic. Biol. Med. 20: 933-956, (1996); Salah, N.; Miller, N.J.; Paganga, G.; Tijburg, L.; Bolwell, G.P.; Rice-Evans, C. Polyphenolic flavonoids as scavenger of aqueous phase radicals and as chain-breaking antioxidants.Arch Biochem Biophys 322: 339-346, (1995); Stryer, L.BiochemistryS. Francisco: Freeman, (1975); Vieira, O.; Escargueil-Blanc, I.; Meilhac, O.; Basile, J.P.; Laranjinha, J.; Almeida, L.; Salvayre, R.; Negre-Salvayre, A. Effect of dietary phenolic compounds on apoptosis of human cultured endothelial cells induced by oxidized LDL.Br J Pharmacol 123: 565-573, (1998)).
또한, 폴리페놀은 세포 대사과정에서 다양성 효과를 나타낸다. 특히, 이들은 단백질 키나제 C, 티로신-단백질 키나제 및 포스파티딜이노시톨 3-키나제와 같은 시그널 트랜스덕션(signal transduction) 효소를조정하여(Agullo, G.; Gamet-payrastre, L.; Manenti, S.; Viala, C.; Remesy, C.; Chap, H.; Payrastre, B. Relationship between flavonoid structure and inhibition of phosphatidylinositol 3-kinase: a comparison with tyrosine kinase and protein kinase C inhibition.Biochem Pharmacol 53: 1649-1657, (1997); Ferriola, P.C.; Cody, V.; Middleton, E. Protein kinase C inhibition by plant flavonoids. Kinetic mechanisms and structure activity relationship.Biochem Pharmacol 38: 1617-1624, (1989); Cushman, M.; Nagarathman, D.; Burg, D.L.; Geahlen, R.L. Synthesis and protein-tyrosine kinase inhibitory activity of flavonoids analogues.J Meed Chem 34: 798-806, (1991); Hagiwara, M.; Inoue, S.; Tanaka, T.; Nunoki, K.; Ito, M.; Hidaka, H. Differential effects of flavonoids as inhibitors of tyrosine protein kinases and serine/threonin protein kinases.Biochem Pharmacol 37: 2987-2992, (1988)), 유도가능한 NO 신타제(synthase)를 조절하고(Kobuchi, H.; Droy-Lefaix, M.T.; Christen, Y.; Packer, L.Ginkgo bilobaextract (EGb761): inhibitory effect on nitric oxide production in the macrophage cell line RAW 264.7.Biochem Pharmacol 53: 897-903, (1997)), 예를 들어 인터루신 및 부착 분자(ICAM-1, VCAM-1)의 유전자 발현을 조절한다(Kobuchi, H.; Droy-Lefaix, M.T.; Christen, Y.; Packer, L.Ginkgo bilobaextract (EGb761): inhibitory effect on nitric oxide production in the macrophage cell line RAW 264.7.Biochem Pharmacol 53: 897-903, (1997); Wolle, J.; Hill, R. R.; Ferguson, E.; Devall, L.J.; Trivedi, B.K.; Newton, R.S.;
Saxena, U. Selective inhibition of Tumor necrosis Factor-induced vascular cell adhesion molecule-1 gene expression by a novel flavonoid. Lack of effect on trascriptional factor NF-kB.Atherioscler Thromb Vasc Biol 16: 1501-1508, (1996)). 이들 효과가 불완전 골절, 심혈관 질환, 당뇨병, 다양한 특정 암, 종양 및 다른 만성 당뇨병을 예방하는데 유익하다는 것이 최근 인정되었다(Bertuglia, S.; Malandrino, S.; Colantuoni, A. Effects of the natural flavonoid delphinidin an diabetic microangiopathy.Arznei-Forsch/Drug Res 45: 481-485, (1995); Griffiths, K.; Adlercreutz, H.; Boyle, P.; Denis, L.; Nicholson, R.I.; Morton, M.S.Nutrition and CancerOxford: Isis Medical Media, (1996); Hertog, M.G.L.; Fesrens, E.J.M.; Hollman, P.C.K.; Katan, M.B.; Kromhout, D. Dietary antioxidant flavonoids and risk of coronary heart disease: the Zutphen elderly study.The Lancet 342: 1007-1011, (1993); Kapiotis, S.; Hermann, M.; Held, I.; Seelos, C.; Ehringer, H.; Gmeiner, B.M. Genistein, the dietary-derived angiogenesis inhibitor, prevents LDL oxidation and protects endothelial cells from damage by atherogenic LDL.Arterioscler Thromb Vasc Biol 17: 2868-74, (1997); Stampfer, M. J.; Hennekens, C.H.; Manson, J.E.; Colditz, G.A.; Rosner, B.; Willet, W.C. Vitamin E consumption and the risk of coronary disease in women.New Engl J Med 328: 1444-1449, (1993); Tijburg, L.B.M.; Mattern, T.; Folts, J.D.; Weisgerber, U.M.; Katan, M.B. Tea flavonoids and cardiovascular diseases: a review.Crit Rev Food Sci Nutr 37:771-785, (1997); Kirk, E.A.; Sutherland, P.; Wang, S.A.; Chait, A.; LeBoeuf, R.C. Dietary isoflavones reduce plasma cholesterol and atherosclerosis in C57BL/6 mice but not LDL receptor-deficient mice.J Nutr 128: 954-9, (1998) -참고문헌-).
따라서, 그의 효과를 페놀 성분 함량을 기준으로 하는 일련의 치료용 조성물, 건강-증진 조성물 또는 강장제는 이미 적합한 식물로부터 수득되고 있다(Gerritsen, M.E.; Carley, W.W.; Ranges, G.E.; Shen, C.P.; Phan, S.A.; Ligon, G.F.; Perry, C.A. Flavonoids inhibit cytokine-induced endothelial cell adhesion protein gene expression.Am J Pathol 147: 278-292, (1995); Lin, J.K.; Chen, Y.C.; Huang, Y.T.; Lin-Shiau, S.Y. Suppression of protein kinase C and nuclear oncogene expression as possible molecular mechanisms of cancer chemoprevention by apigenin and curcumin.J Cell Biochem Suppl 28-29: 39-48, 1997; Zi, X.; Mukhtar, H.; Agarval, R. Novel cancer chemopreventive effects of a flavonoid antioxidant silymarin: inhibition of mRNA expression of an endogenous tumor promoter TNF alpha.Biochem Biophys Res Comm 239: 334-339, 1997).
또한, 그들로부터 제조된 특정 식물-유래 식품 또는 음료가 다양한 질병에 대해 양성 효과를 가진다는 것은 공지되어 있다. 백포도주, 특히 적포도주에서 발견되는 레스베라트롤(Resveratrol) (또한, 다른 성분도) 예를 들어 불완전 골절, 심혈관 질환 및 암에 대해 작용한다(Gehm, B.D.; McAndrews, J.M.; Chien, P.-Y.; Jameson, J.L. Resveratrol, a polyphenolic compound found in grapes and wine, is an agonist for estrogen receptor.Proc Natl Acad Sci USA 94: 14138-14143,(1997); Jang, M.; Cai, L.; Udeani, G.O.; Slowing, K.V.; Thomas, C.F.; Beecher, C.W.W.; Fong, H.H.S. Farnsworth, N.R.; Kinghorn, A.D.; Mehtha, R.G.; Moon, R.C., Pezzuto, J.M. Cancer chemopreventive activity of resveratrol, a natural product derived from grapes.Science 275: 218-220, (1997)).
유사한 작용이 카테친, 에피카테친-3-갈레이트, 에피갈로카테친 및 에피갈로카테친-3-갈레이트와 같은 성분(모두 차잎(Camellia sinensis)에서 발견되는 것임)에서도 발견된다. 특히 비발효 차잎(녹차)으로 제조된 주류가 건강-증진 효과를 나타낸다(Hu, G.; Han, C.; Chen, J. Inhibition of oncogene expression by green tea and (-)-epigallocatechin gallate in mice.Nutr Cancer 24: 203-209; (1995); Scholz, E; Bertram, B.Camellia sinensis(L.) O. Kuntze. Der Teestrauch[the tea shrub].Z. Phytotherapie 17: 235-250, (1995); Yu, R.; Jiao, J.J.; Duh, J.L.; Gudehithlu, K.; Tan, T.H.; Kong, A.N. Activation of mitogen-activated protein kinases by green tea polyphenols: potential signaling pathways in the regulation of antioxidant responsive elements-mediated phase II enzyme gene expression.Carcinigenesis 18: 451-456, (1997); Jankun, J.; Selman, S. H.; Swiercz, R. Why drinking green tea could prevent cancer.Nature 387: 561, (1997)). 게다가, 감귤류의 폴리메톡실화 플라본 또한 강력한 종양 억제 작용을 나타낸다(Chem, J.; Montanari, A.M.; Widmer, W.W. Two new polymethoxylierte flavone, a class of compounds with potential anticancer activity, isolated from cold pressed dancy tangerine peel oil solids.J Agric Food Chem 45: 364-368, (1997)).
본 발명의 목적은 재배 식물에서 간단하고 저렴한 플라보노이드 및 페놀 성분 함량의 증가 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 이러한 목적이 아실시클로헥산디온 군의 성장 조절제에 대한 생리학적 연구에서 출발하여 놀랍게도 현재 이용가능한 유전 공학적 방법을 통해, 치료용 성분, 건강-증진 성분 또는 강장 성분이 증가된 것을 특징으로 하여 재배될 수 있는 식물에 의해 달성된다는 것을 밝혔다.
프로헥사디온-칼슘 및 트리넥사팩-에틸(초기명: 시멕타카르브)와 같은 아실시클로헥산디온이 식물의 길이 성장을 억제하는 생물 조절제로 이용된다. 이의 생물 조절 작용 때문에, 이들은 길이 성장을 촉진하는 지베렐린의 생합성을 차단한다. 2-옥소글루타르산과의 구조적 관계 때문에, 이들은 보조 기질로서 2-옥소글루타르산을 필요로 하는 특정 디옥시제나제를 억제한다(Rademacher, W, Biochemical effects of plant growth retardants, in: Plant Biochemical Regulators, Gausman, HW (ed.), Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 169-200 (1991)). 이러한 화합물은 또한 페놀 대사과정과 연관되어 다양한 식물종에서 억제시키고자 하는 안토시아닌의 생성을 야기할 수 있다는 것은 공지되어 있다(Rademacher, W et al., The mode of action of acylcyclohexanediones - a new type of growth retardant, in: Progress in Plant Growth Regulation, Karssen, CM, von Loon, LC, Vreugdenhil, D (eds.), Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1992)). 페놀 성분 균형에 대한 이러한 효과는 부란병에 대한 프로헥사디온-칼슘의 부작용을 일으킨다고 여겨진다(Rademacher, W et al., Prohexadione-Calcium - a new plant growth regulator for apple with interesting biochemical features, Poster presented at the 25thAnnual Meeting of the Plant Growth Regulation Society of America, 7.-10. Juli 1998, Chicago). 룩스-엔드리치(A. Lux-Endrich)(바인스테판 소재의 문니히 공과 대학 박사 논문, 1998)는 부란병에 대한 프로헥사디온-칼슘의 대사작용에 대한 연구 과정에서 프로헥사디온-칼슘의 사과 세포 배양에서 페놀 성분 함량을 수배로 증가시키며, 이 과정 동안 보통은 존재하지 않는 페놀류가 발견된다는 것을 밝혔다. 또한, 이 연구 결과, 사과의 발아 조직에서 프로헥사디온-칼슘이 비교적 다량의 루테올리플라반 및 에리오딕티올을 생성시킨다는 것을 밝혔다. 보통 루테올리플라반은 사과 조직에 존재하지 않고, 에리오딕티올은 플라보노이드 대사과정의 중간체로서 소량 존재한다. 그러나, 예상했던 플라보노이드 카테친 및 시아니딘은 처치 조직에서 검출되지 않거나, 또는 그 양이 현저하게 감소되었다(S. Roemmelt et al. paper presented at the 8thInternational Workshop on Fire Blight, Kusadasi, Turkey, 12-15 October 1998).
프로헥사디온-칼슘, 트리넥사팩-에틸 및 다른 아실시클로헥산디온이 페놀 성분 대사과정에서 중요한 역할을 하는 2-옥소글루타르산-의존성 히드록실라제를 억제하는 것이 인정되었다. 이들은 주로 칼콘 신테타제(CHS) 및 플라바논 3-히드록실라제(F3H)이다(W. Heller and G. Forkmann, Biosynthesis, in: The Flavonoids, Harborne, JB (ed.), Chapman and Hall, New York, 1988). 그러나, 아실시클로헥산디온은 아직 알려지지 않은 다른 2-옥소글루타르산-의존성 히드록실라제도 억제한다는 것을 배제할 수 없다. 또한, 카테친, 시아니딘, 및 플라보노이드 합성의 다른 최종 생성물이 식물에서 생성될 수 있고, 주요 효소인 페닐알라닌 암모늄 리아제(PAL)의 활성을 피드백 메카니즘을 통해 증가시키는 것이 명백한 것으로 여겨진다. 그러나, CHS 및 F3H가 계속 억제되기 때문에, 이들 플라보노이드 최종 생성물은 생성될 수 없고, 그 결과 루테올리플라반, 에리오딕티올 및 다른 페놀의 형성이 증가된다(도 1).
플라바논 3-히드록실라제(F3H) 효소의 효소 활성이 감소되기 때문에, C 원자가 수소로 치화된 플라보노이드 에리오딕티올, 프로안토시아니딘, 예를 들면 루테오포롤, 루테올리플라반, 아피게니플라반 및 트리세티플라반, 및 전술한 구조적으로 관련된 성분의 균일 및 불균일 올리고머 및 폴리머가 대량 생성된다.
플라바논 3-히드록실라제(F3H) 효소의 효소 활성이 감소된 후, 식물에서 페놀 히드록시신남산(p-코우마르산, 페룰산, 시나프산), 살리실산 또는 움벨리페론, 또한 이들로부터 생성된 균일 또는 불균일 올리고머 및 폴리머의 함량이 증가된다. 마찬가지로 플로레틴과 같은 칼콘, 및 레스베라트롤과 같은 스틸벤의 함량도 증가된다.
플라바논 3-히드록실라제(F3H) 효소의 효소 활성이 감소되기 때문에, 플라보노이드, 페놀 성분, 칼콘 및 스틸벤의 글리코시드 함량도 증가된다.
이러한 발견 및 그로부터 유래된 가설에서 출발하여, 식물 전체에서 또는 식물의 개별 기관 또는 조직에서 안티센스 작제에 의해 F3H 활성이 완전히 또는 부분적으로, 영구적으로 또는 일시적으로 감소된 유전자 변형 재배 식물이 생산되어, 치료용 성분, 건강-증진 성분 또는 강장 성분의 함량이 양과 질적인 면에서 개선된다.
안티센스 배향으로 플라바논 3-히드록실라제를 발현시킴으로써 플라보노이드 및 페놀 성분 함량을 증가시키는 본 발명의 방법은 하기 재배 식물에서 성공적으로 이용될 수 있으나, 이 방법이 언급된 식물에만으로 한정되는 것은 아니다; 포도나무, 체리, 토마토, 서양자두, 자두류, 윌귤나무, 딸기, 감귤류(예, 오렌지, 그레이프프루트), 포포나무, 붉은 양배추, 브로콜리, 브뤼셀 스프라우트, 카카오, 케일, 당근, 파슬리, 셀러리, 양파, 마늘, 차, 커피, 홉, 콩, 종자유 평지, 귀리, 밀, 호밀, 아로니아 멜라노카르파(Aronia melanocarpa), 징코 빌로바(Ginkgo biloba).
또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 재배되어 플라바논 3-히드록실라제 효소의 효소 작용이 감소된, 플라보노이드 및 페놀 성분 함량이 증가된 식물에 관한 것이다.
안티센스 기술을 이용하여 플라바논 3-히드록실라제 활성을 감소시킨 식물을 재배하는 것에 대한 별법으로, 문헌에 공지된 다른 분자 유전학적 방법, 예컨대 공억제 또는 특이적 항체의 발현을 이용하여 상기 효과를 달성하는 것도 가능하다.
또한, 본 발명은 인간 및 동물에서 식품으로서, 보조 식품으로서, 또는 치료용 조성물, 건강-증진 조성물 또는 강장제(주스 제품, 주입 제품, 추출 제품, 발효 제품)의 제조에 있어서, 및 화장품의 제조에 있어서 본 발명의 방법에 의해 재배된 식물 또는 이들 식물의 일부분의 용도에 관한 것이다.
놀랍게도, 본 발명에 따라 재배된 식물, 또는 이들 식물의 일부분 또는 그로부터 제조된 제품(차, 추출물, 발효 제품, 주스 등)이 하기의 효과를 나타낸다는 것이 최근 밝혀졌다:
(1) 시험관 내에서 항산화 능력(전자 스핀 공명(ESR), LDL 산화, 총 항산화 능력, NO 제거)이 개선됨;
(2) 효소, 특히 시그널 트랜스덕션 효소(단백질 키나제 C, 티로신 단백질 키나제, 포스파티딜이노시톨 3-키나제)에 대한 조절 효과가 나타남;
(3) 산화환원-민감성 전사 인자(NF-kB, AP-1)의 조절이 엔도텔린 세포, 림프구 및 평활근 세포에서 유도됨;
(4) 염증 질환의 병인과 관련된 표적 유전자(시토키나제 IL-1 및 IL-8, 대식세포 화학주성 단백질 1(MCP-1), 부착 인자 ICAM-1 및 VCAM-1)의 유전자 발현이 조절됨;
(5) 항응집 효과가 유도됨;
(6) 간세포에서 콜레스테롤 합성이 억제됨;
(7) 증식억제/종양억제 효과가 나타남.
<실시예 1: 리코페르시콘 에스쿨렌텀 밀.씨브이. 머니메이커(Lycopersicon esculentum Mill.cv. Moneymaker)로부터 플라바논 3-히드록실라제 유전자의 클로닝>
리코페르시콘 에스쿨렌텀 밀.씨브이. 머니메이커의 성숙 토마토를 세척하고 건조시키고, 무균 칼을 이용하여 과피를 씨, 중심 기둥부 및 목질부로부터 제거하였다. 과피(대략 50 g)를 액체 질소 중에서 냉동시켰다. 다음, 재료를 블렌더 내에서 분쇄하였다. 예비 냉동된 막자사발에서, 분쇄된 재료를 균질 배지 100 ml로 처리하고 혼합하였다. 다음, 현탁액을 무균 거즈를 통해 짜내어 원심분리 플라스크로 옮겼다. 다음, 10% SDS 1/10 부피를 첨가하고, 재료를 철저히 혼합하였다. 얼음 위에서 10분이 지난 후, 페놀/클로로포름 1 부피를 첨가하고, 원심분리 플라스크를 밀봉하고, 성분들을 철저히 혼합하였다. 4000 rpm에서 15분 동안 원심분리한 후, 상청액을 새 반응조로 옮겼다. 이를 페놀/클로로포름으로 3회 이상 및 클로로포름으로 1회 추출하였다. 다음, 3M NaAc 1 부피 및 에탄올 2.5 부피를 첨가하였다. -20℃에서 밤새 핵산을 침전시켰다. 다음날 아침, 핵산을 10,000 rpm에서 냉장된 원심분리(4℃)에서 15분 동안 펠릿화하였다. 상청액을 버리고, 펠릿을 저온의 3M NaAc 5 내지 10 ml로 재현탁시켰다. 이 세척 단계를 2회 반복하였다. 펠릿을 80% 에탄올로 세척하였다. 완전히 건조시킨 후, 펠릿을 무균 DEPC 물 0.5 ml에 녹이고, RNA 농도를 광도계로 측정하였다.
총 RNA 20 ㎍을 먼저 3M 아세트산나트륨 용액 3.3 ㎕, 1M 황산마그네슘 용액 2 ㎕로 처리하고, 이 혼합물을 DEPC 물을 이용하여 최종 부피 100 ㎕로 만들었다. 여기에 RNase-무함유 DNase(Boehringer Mannheim) 1 ㎕를 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 페놀/클로로포름/이소아밀 알콜과 함께 진탕함으로써 추출하여 효소를 제거한 후, RNA를 에탄올을 이용하여 침전시키고, 펠릿을 DEPC 물 100 ㎕에 녹였다. 이 용액으로부터 RNA 2.5 ㎍을 cDNA 키트(Gibco BRL)를 이용하여 cDNA로 전사시켰다.
플라바논 3-히드록실라제를 코딩하는 cDNA 클론으로부터 유래된 아미노산 서열을 이용하여 1차 서열의 보존 영역을 확인하였고(Britsch et al., Eur. J. Biochem. 217, 745-754 (1993)), 이들은 변성 PCR 올리고뉴클레오티드를 설계하기 위한 기반이 되었다. 펩티드 서열 SRWPDK(페투니아 하이브리다(Petunia hybrida) 서열 FL3H PETHY의 아미노산 147-152)를 이용하여 5' 올리고뉴클레오티드를 결정하고 하기 서열을 확인하였다:
5'-TCI (A/C) G (A/G) TGG CC(A/C/G) GA (C/T) AA (A/G) CC-3.
펩티드 서열 DHQAVV(페투니아 하이브리다 서열 FL3H PETHY의 아미노산 276-281)를 이용하여 추론된 올리고뉴클레오티드 서열은 5'-CTT CAC ACA (C/G/T) GC (C/T) TG (A/G) TG (A/G)TC-3이었다.
퍼킨-엘머(Perkin-Elmer)사의 tTth-폴리머라제를 이용하여 PCR 반응을 제조자 지시에 따라 수행하였다. 사용된 주형은 cDNA의 1/8(DNA 0.3 ㎍에 해당함)이었다. PCR 프로그램은 하기와 같다.
30 싸이클
94도에서 4초
40도에서 30초
72도에서 2분
72도에서 10분
단편을 제조자 지시에 따라 프로메가(Promega)사의 벡터 pGEM-T에로 클로닝하였다.
단편의 정확성을 시퀀싱을 통해 확인하였다. 벡터 pGEM-T의 다결합서열에 존재하는 제한 개열 부위 NcoI 및 PstI를 이용하여, PCR 단편을 단리하고, 오버행(overhang)을 T4-폴리머라제를 이용하여 평활-말단(blunt-end)으로 만들었다. 이 단편을 SmaI-(blunt-)cut 벡터 pBinAR에로 클로닝하였다(Hoefgen and Willmitzer, Plant Sci. 66: 221-230 (1990)) (도 2 참고). 이 벡터는 CaMV(콜리플라워 모자이크 바이러스) 35S 프로모터(Franck et al., Cell 21: 285-294 (1980)) 및 옥토파인(octopine) 신타제 유전자로부터의 종결 시그널(Gielen et al., EMBO J. 3: 835-846(1984))을 함유하였다. 이 벡터는 식물에서 항생제인 카나마이신을 제한하는 것을 매개하였다. 생성된 DNA 작제물은 센스 및 안티센스 배향의 PCR 단편을 함유하였다. 안티센스 작제물을 유전자 도입 식물을 재배하는데 이용하였다.
도 2: 단편 A(529 bp)는 CaMV 35S 프로모터(콜리플라워 모자이크 바이러스의 뉴클레오티드 6909 내지 7437)를 함유하였다. 단편 B는 안티센스 배향으로 F3H 유전자를 함유하였다. 단편 C(192 bp)는 옥토파인 신타제 유전자의 종결 시그널을 함유하였다.
리코페르시콘 에스쿨렌텀 밀.씨브이. 머니메이커로부터의 플라바논 3-히드록실라제의 더 큰 cDNA 단편을 5'RACE 시스템을 이용하여 클로닝하였다.
F3H의 mRNA 유동 평형량이 감소된 식물이 재배되는 것을 배제하는 것은 안티센스 작제물에 사용된 F3H PCR 단편의 크기가 작았기 때문에 성공적이지 못했고, 더 큰 F3H 단편을 사용한 제2 안티센스 작제물이 제조되어야 했다.
5'RACE 방법(cDNA 말단의 급속 증폭을 위한 시스템)을 더 큰 F3H 단편을 클로닝하는데 이용하였다.
cDNA 말단의 급속 증폭을 위한 5'RACE 시스템(라이프 테크놀로지(Life TechnologiesTM)사의 버젼 2~0)을 이용하여 F3H PCR 단편을 신장시켰다.
전체 RNA를 리코페르시콘 에스쿨렌텀 밀.씨브이. 머니메이커(상기 참조)의 성숙 토마토로부터 단리하였다.
cDNA 제1 가닥 합성을 GSP-1(유전자 특이적 프라이머) 5'-TTCACCACTGCCTGGTGGTCC-3'를 이용하여 제조자 지시에 따라 수행하였다. RNase를 분해시킨 후, cDNA를 라이프 테크놀로지 사의 GlassMAX 스핀 시스템을 이용하여 제조자 지시에 따라 정제하였다.
시토신 호모폴리머를 제조자 지시에 따라 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제를 이용하여 정제된 단일 F3H cDNA의 3' 말단에 부가하였다.
5'-신장된 F3H cDNA를 제2 유전자-특이적 프라이머(GSP-2)를 사용하여 증폭시키고, 이를 GSP-1 인식 서열의 3' 영역 상부에 결합시켜, "네스티드(nested)" PCR을 수행하였다. 사용된 5' 프라이머는 시판되는 "5'RACE 단축 앵커 프라이머"이었고, cDNA의 호모폴리머 dC 테일에 상보적인 것이다.
F3H신장으로 명명된, 증폭된 cDNA를 제조자의 지시에 따라 프로메가사의 벡터 pGEM-T에로 클로닝하였다.
cDNA를 시퀀싱을 통해 확인하였다.
F3H신장cDNA 단편을 벡터 pGEM-T의 다결합서열에 존재하는 제한 개열 부위 NcoI 및 PstI을 이용하여 단리하였고, 오버행을 T4-말단을 이용하여 평활-말단으로 만들었다. 이 단편을 SmaI-(blunt-)cut 벡터 pBinAR에로 클로닝하였다(Hoefgen and Willmitzer, 1990) (도 3 참고). 이 벡터는 CaMV(콜리플라워 모자이크 바이러스) 35S 프로모터(Franck et al., 1980) 및 옥토파인 신타제 유전자로부터의 종결 시그널(Gielen et al., 1984)을 함유하였다. 이 벡터는 식물에서 항생제인 카나마이신을 제한하는 것을 매개하였다. 생성된 DNA 작제물은 센스 및 안티센스 배향의 PCR 단편을 함유하였다. 안티센스 작제물을 유전자 도입 식물을 재배하는데 이용하였다.
도 3: 단편 A(529 bp)는 CaMV 35S 프로모터(콜리플라워 모자이크 바이러스의 뉴클레오티드 6909 내지 7437)를 함유하였다. 단편 B는 안티센스 배향으로 F3H 유전자를 함유하였다. 단편 C(192 bp)는 옥토파인 신타제 유전자의 종결 시그널을 함유하였다.
<실시예 2: 안티센스 배향으로 플라바논 3-히드록실라제의 서브단편(subfragment)을 발현하는 유전자 도입 리코페르시콘 에스쿨렌텀 밀.씨브이. 머니메이커의 재배>
사용된 방법은 문헌[Ling et al., Plant Cell Report 17, 843-847 (1998)]에 기재된 것이다. 대략 22℃에서 16/8시간의 명암 조건 하에 배양시켰다.
토마토 종자(리코페르시콘 에스쿨렌텀 밀.씨브이. 머니메이커)를 4% 차아염소산 나트륨 용액 중에서 10분 동안 인큐베이션하여 멸균시키고, 이어서 무균 증류수로 3 내지 4회 세척하고, 발아를 위해 3% 수크로즈(pH 6.1)가 보충된 MS 배지에 놓았다. 7 내지 10일의 발아 시간 후, 자엽을 형질전환을 위해 즉시 사용하였다.
1 일: "MSBN" 배지를 함유한 페트리 접시에 대략 10일된 담배 현탁액 배양물 1.5 ml를 적재하였다. 이 플레이트를 막으로 덮고, 실온에서 다음날까지 인큐베이션하였다.
2 일: 담배 현탁액 배양물이 적재된 플레이트 위에 무균 여과지를 공기 기포가 생기지 않도록 놓았다. 횡단으로 절단된 자엽을 여과지 상에 거꾸로 놓았다. 페트리 접시를 배양물 챔버에서 3일 동안 인큐베이션하였다.
5 일: 아그로박테리아 배양물 (LBA4404)를 대략 3000 g에서 10분 동안 원심분리하여 침강시키고, OD가 0.3이 되도록 MS 배지에 재현탁시켰다. 자엽 섹션을 이 현탁액에 놓고, 부드럽게 진탕하면서 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 다음, 자엽 섹션을 무균 여과지 상에서 약간 건조시키고, 출발 플레이트로 다시 옮겨 배양물 챔버에서 3일 동안 동시 배양하였다.
8 일: 동시 배양한 자엽 섹션을 MSZ2K50 + β 상에 놓고, 배양물 챔버에서 4주 더 인큐베이션하였다. 다음, 이를 계대배양하였다.
형성된 싹을 뿌리 유도 배지에 옮겼다.
성공적으로 뿌리를 내린 후, 식물을 시험하고 온실로 옮겼다.
<실시예 3: 1차 래트 간세포 배양물에서 콜레스테롤 생합성의 억제>
원액의 제조
A) 천연 플라바논 3-히드록실라제 유전자만을 함유하는 성숙 토마토 씨브이."머니메이커"의 동결건조물 10 내지 20 mg(대조군) 및 B) 추가로 실시예 2에 기재된 안티센스 배향의 플라바논 3-히드록실라제의 서브단편을 함유하는 성숙 토마토 씨브이. "머니메이커"의 동결건조물 10 내지 20 mg을 정확히 칭량하고, 총 플라보노이드 10 mM을 함유한 원액이 생성되도록 하는 DMSO 양으로 처리하였다. 시험을 시작하기 직전에 배양물 배지 중에서 이 원액의 희석액을 제조하였다. 10배 희석하여 10-4내지 10-8M이 되게 하였다.
간세포 배양물의 제조
1차 간세포를 수컷 스프라구-돌리(Spraque-Dawley) 래트(240-290 g)의 간으로부터 콜라게나제 관류를 이용하여 수득하였다(Gebhardt et al., Arzneimittel-Forschung/Drug Res. 41: 800-804 (1991) 1990). 간세포를 콜라겐-피복된 페트리 접시(6-웰 플레이트, Greiner, Nuetingen)에서, 10% 송아지 혈청이 보충된 윌리엄(Williams) 배지 E 중의 세포 밀도 125,000 세포/㎠로 배양하였다. 특히 배양물 배지에 대한 상세한 설명은 문헌[Gebhardt et al., Cell Biol. Toxicol. 6: 369-372 (1990) and Mewes et al., Cancer Res. 53: 5135-5142 (1993)]에 기재되어 있다. 2시간 후, 배양물을 인슐린 0.1 μM이 보충된 혈청-무함유 배지로 옮겼다. 20시간이 더 지난 후, 이들을 시험에 이용하였다. 시험 성분은 각 경우 2 내지 3 마리의 래트로부터 독립적으로 수득한 3개의 배양물에서 시험하였다.
시험 성분 A 및 B를 함유한 간세포 배양물의 인큐베이션
시험 성분 A 및 B가 콜레스테롤 생합성에 영향을 미치는지 입증하기 위해,간세포 배양물을 총 22시간 동안 유지시켰다. 다음, 이를14C 아세테이트(단지 미량으로)가 보충된 혈청-무함유 윌리엄 배지 E에서 지시된 농도의 시험 성분과 함께 2시간 동안 인큐베이션하였다. 각 시험에는 대조군이 포함되었다. 시험 방법은 문헌[Gebhardt (1991) and Gebhardt, Lipids 28: 613-619 (1993)]에 상세하게 기재되어 있다. 미량의14C 아세테이트를 세포내 아세틸-CoA 풀로 급속히 교체함으로써,14C 아세테이트를 콜레스테롤 함량이 90%보다 큰 스테롤 분획에 혼입시켜, 문제없이 측정하였다(Gebhardt, 1993).
콜레스테롤 생합성에 대한 영향을 분석하는 방법
14C 아세테이트를 스테롤 분획(가수분해 불가능한 지질)에로 혼입되는 것을 Gebhardt(1991)의 방법을 이용하여 측정하였다. 추출[엑스트렐루트(Extrelut:등록상표) 컬럼(Merck, Darmstadt) 사용]을 통해 95%보다 많은14C 아세테이트(그리고 형성된 소량의 다른 저분자량 대사물)이 제거되었다. 이 시험을 시험 성분의 영향하에 콜레스테롤 및 전구체 스테롤의 상대적인 합성 속도를 비교하였다(Gebhardt, 1993).
간세포 배양물 중 바이러스 및 세균 양의 확인
시험 인큐베이션 전과 후에, 사용된 모든 배양물을 미생물에 의한 오염 및 세포 단일층의 일체성에 대해 현미경을 이용하여 시각적으로 확인하였다. 세포 형태에서 (특히 고농도에서) 인식가능한 변화는 어떠한 샘플에서도 관찰되지 않았다.이는 시험 결과가 시험 성분의 세포 독소 효과에 영향을 받는다는 것을 크게 배제시키는 것이다.
모든 배양물에 대해 통상적인 무균 시험을 수행한 결과, 미생물에 의한 오염이 전혀 발견되지 않았다.
결과
유전자 변형되지 않은 토마토로부터의 샘플 A)(대조군)은 콜레스테롤 생합성에 대한 효과를 전혀 나타내지 않았다. 반대로, 안티센스 배향의 플라바논 3-히드록실라제의 서브단편을 함유한 토마토로부터의 샘플 B)에 의해 콜레스테롤 생합성은 상당히 억제되었다.

Claims (5)

  1. 플라바논 3-히드록실라제 효소의 활성을 감소시키는 분자 유전학적 방법에 의해 식물을 재배함으로써, 식물에서 플라보노이드 및 페놀 성분 함량을 증가시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 분자 생물학적 방법(예를 들면, 안티센스 작제, 공억제, 특이적 항체의 발현 또는 특이적 억제제의 발현)에 의해 플라바논 3-히드록실라제 효소의 활성을 식물 전체에서 또는 식물의 일부분에서 완전히 또는 부분적으로, 영구적으로 또는 일시적으로 감소시킴으로써, 식물에서 플라보노이드 및 페놀 성분 함량을 증가시키는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 식물이 포도나무, 체리, 토마토, 서양자두, 자두류, 윌귤나무, 딸기, 감귤류(예, 오렌지, 그레이프프루트), 포포나무, 붉은 양배추, 브로콜리, 브뤼셀 스프라우트, 카카오, 케일, 당근, 파슬리, 셀러리, 양파, 마늘, 차, 커피, 홉, 콩, 종자유 평지, 귀리, 밀, 호밀, 아로니아 멜라노카르파(Aronia melanocarpa), 징코 빌로바(Ginkgo biloba)인 방법.
  4. 플라바논 3-히드록실라제 효소의 효소 활성을 감소시키는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 방법에 의해 재배된, 플라보노이드 및 페놀 성분이 증가된 식물.
  5. 인간 및 동물에서 식품으로서, 보조 식품으로서, 또는 치료용 조성물, 건강-증진 조성물 또는 강장제(주스 제품, 차 제품, 추출 제품, 발효 제품)의 제조에 있어서, 및 화장품의 제조에 있어서 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 방법에 의해 재배된 식물 또는 식물의 일부분의 용도.
KR1020017002018A 1999-06-17 2000-06-07 플라보노이드 및 페놀 성분 함량이 증가된 식물 생산 방법 KR20020068256A (ko)

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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100642939B1 (ko) * 2003-02-11 2006-11-10 학교법인 신천학원 자두추출물을 함유하는 화장비누 및 그 추출방법
KR100663669B1 (ko) * 2005-05-18 2007-01-02 금호석유화학 주식회사 배유 내에 높은 농도의 플라보노이드를 생산하는 형질전환쌀
KR101415687B1 (ko) * 2012-09-19 2014-07-10 농업회사법인 호트팜 주식회사 조직배양기술을 이용한 아로니아의 줄기마디배양으로부터 유식물체의 대량 증식방법

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005074710A1 (en) * 2004-02-06 2005-08-18 Konkuk University Industrial Coorperation Corp Sprouted bean containing high concentration of isoflavone and the preparing method thereof
KR100553522B1 (ko) * 2004-02-06 2006-02-20 학교법인 건국대학교 이소플라본 강화 발아 녹두 및 그 제조방법
BRPI1006254A2 (pt) * 2009-04-21 2016-08-09 Haas John I método para melhorar o desempenho desejado de um animal ruminante, método para aprimorar a saúde e funcionalidade do rúmen de um grupo de animais ruminantes, método para melhorar o desempenho desejado de um animal ruminante que recebeu um antibiótico ionóforo poliéter ou antibiótico macrolídeo que contém um alimento animal
EP2286669A1 (en) * 2009-07-29 2011-02-23 Nestec S.A. Flavanones-containing food compositions
US20140072692A1 (en) * 2012-06-07 2014-03-13 Ichiro Yamada Garlic egg yolk composition
WO2015140589A1 (en) * 2014-03-20 2015-09-24 Hongkong Chuanghui International Limited Method for preparation multifunctional liquid medicament from vegetable feedstock, and the product produced by the method
CN105985936A (zh) * 2015-02-02 2016-10-05 中国人民解放军第二军医大学 灯盏花黄烷酮-3-羟化酶及其编码基因与应用
CN111875689B (zh) * 2020-08-07 2022-02-01 山东玄康种业科技有限公司 一种利用番茄绿茎紧密连锁标记创制雄性不育系的方法
EP4206192A1 (en) 2020-08-25 2023-07-05 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Kaempferol aglycone-containing extract
CN112391362B (zh) * 2020-11-04 2022-07-05 江南大学 催化活性提高的黄酮3β-羟化酶突变体及其应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5432068A (en) * 1990-06-12 1995-07-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Control of male fertility using externally inducible promoter sequences
RO116095B1 (ro) * 1992-03-09 2000-10-30 Univ Washington Metoda de reglare a fertilitatii plantelor
GB9525459D0 (en) * 1995-12-13 1996-02-14 Zeneca Ltd Genetic control of fruit ripening
BR9909414A (pt) * 1998-02-25 2001-01-09 Du Pont Fragmento de ácido nucléico isolado codificador de toda ou uma parte substancial de uma flavanona-3-hidroxilase, gene quimérico, célula hospedeira transoformada, polipeptìdeo de flavanona-3-hidroxilase, método de alteração do nìvel de expressão de uma flavanona-3- hidroxilase em uma célula hospedeira, método de obtenção de um fragmento de ácido nucléico codificador de toda ou uma parte substancial da sequencia de aminoácidos codificadora de uma flavanona-3-hidroxilase, seu produto e método de avaliação da capacidade de pelo menos um composto em inibir a atividade de uma flavanona-3-hidroxilase
AU2687000A (en) * 1999-02-22 2000-09-14 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Transgenic plants and method for transforming carnations

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100642939B1 (ko) * 2003-02-11 2006-11-10 학교법인 신천학원 자두추출물을 함유하는 화장비누 및 그 추출방법
KR100663669B1 (ko) * 2005-05-18 2007-01-02 금호석유화학 주식회사 배유 내에 높은 농도의 플라보노이드를 생산하는 형질전환쌀
KR101415687B1 (ko) * 2012-09-19 2014-07-10 농업회사법인 호트팜 주식회사 조직배양기술을 이용한 아로니아의 줄기마디배양으로부터 유식물체의 대량 증식방법

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