KR19990076833A

KR19990076833A - 내온도성 식물의 제조방법

Info

Publication number: KR19990076833A
Application number: KR1019980704960A
Authority: KR
Inventors: 노리오 무라따
Original assignee: 도리이 신이찌로; 산또리 가부시키가이샤
Priority date: 1995-12-28
Filing date: 1996-12-27
Publication date: 1999-10-25
Also published as: ATE393231T1; AU1210197A; AU719618B2; JP3961026B2; EP0891702B1; HK1016027A1; EP0891702A4; NZ324836A; DE69637510D1; WO1997024026A1; ES2304789T3; DE69637510T2; US6756525B1; CN1207645A; EP0891702A1; CN1185349C

Abstract

본 발명은 콜린 산화효소를 코딩하는 유전자를 수반하는 재조합 벡터로 식물을 형질전환시키는 것으로 구성된 내온도성 식물의 제조 방법, 및 상기 방법에 의해 제조된 내온도성 식물 또는 동일한 성질을 갖는 그의 자손에 관한 것이다.

Description

내온도성 식물의 제조방법

다수의 생물체는 심각한 환경 스트레스로부터 자신을 보호하기 위해 세포질내에 "적합 용질" ("compatible solute") 이라 불리는 특정 화합물을 합성하고 축적하여 상기 환경 스트레스에 적응한다. 상기 메카니즘에 의해 생물체가 적응하는 것으로 알려진 환경 스트레스에는 염류 (Imhoff et al., FEMS Microbiol. Rev. 39:57-66, 1986; Mackay et al., J. Gen. Microbiol. 130:2177-2191, 1984; Rhodes and Hanson, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 44:357-384, 1993), 탈수 (Yancy et al., Science 217:1214-1222, 1982) 및 저온 (Ko et al., J. Bacteriol. 176:426-431, 1994) 이 포함된다.

상기 적합 용질 중, 글리신 베타인 (이하 베타인이라 지칭) 은 고등 식물 (Robinson and Jones, Aust. J. Plant Physiol. 13:659-668, 1986), 박테리아 (Csonka, Microbiol. Rev. 53:121-147, 1989) 및 동물 (Garcia-Perez and Burg, Physiol. Rev. 71:1081-1115, 1991; Lever et al., Biochim. Biophys. Acta. 1200:259-264, 1994) 에 널리 분포되어 있다. 도 1 에서 볼 수 있듯이, 베타인은 분자내에 양전하 및 음전하를 갖는 양극성 화합물이다 (Rhodes and Hanson, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 44:357-384, 1993). 베타인의 생리적 기능에 대한 오랜 논란은 베타인이 환경과의 삼투 평형을 유지함으로써 세포를 보호한다는 것 (Robinson and Jones, Aust. J. Plant Physiol. 13:659-668, 1986) 및 베타인이 단백질의 고차 구조를 안정화시킬 수 있다는 것 (Bernard et al., Acad. Sci. 111, 307:99-104, 1988; Papageorgiou and Murata, Phtosynth. Res. 44:243-252, 1995) 을 시사한 바 있다. 그러나, 베타인은 염류성 스테레스 또는 탈수성 스트레스하의 세포에서는 독자적으로 합성되지 않는다. 따라서, 베타인이 상기 스트레스에 대한 세포의 보호에 직접적인 영향을 준다고 결론 내릴 수 없다.

에쉐리키아 콜라이 (Escherichia coli) 및 시금치 (Spinacia oleracea) 에서, 베타인은 도 1 에 나와 있듯이 두 단계의 산화 반응을 통해 콜린으로부터 생합성된다. 한편, 그람-양성 토양 박테리움인 아르트로박테르 글로비포르미스 (Arthrobacter globiformis) 로부터 수득된 콜린 산화효소는 1 단계 산화 반응을 통해 콜린을 베타인으로 산화시킬 수 있다 (Ikuta, S. et al., J. Biochem. 82:1741-1749, 1977).

베타인의 직접적인 영향을 연구한 시도에서, 콜린에서 베타인으로의 산화 반응을 촉매하는 신규 콜린 산화효소를 코딩하는 codA 유전자를 분리하고 [일본 식물 생리학회, 1994년 연례모임, 제 34 회 심포지움 (1994년 3월 28 - 30일)], 시아노박테리움 균주인 시네코코커스 (Synechococcus) PCC7942 및 브라시카세우스 (brassicaceous) 식물의 세포내로 삽입시켜 내염성 및/또는 내삼투성 식물을 수득하는데 성공했다 (일본 특허 출원 제 106819/95 호). 이는 베타인이 염류성 스트레스로부터 생물체를 보호하는 기능을 한다는 것을 확인해 주었다.

그러나, 베타인이 식물 또는 박테리아에 내온도성을 부여한다는 것이 증명된 바는 없다.

본 발명의 목적은 유전자 재조합 기법을 통해 고온 또는 저온과 같은 환경 변화에 대한 내성을 갖는 식물을 제조하는 것이다.

발명의 개시

상기 문제를 해결하려는 면밀한 연구의 결과로, 시아노박테리아, 브라시카세우스 식물 및 볏과 (gramineous) 식물에 콜린 산화효소를 코딩하는 유전자를 삽입하고 발현시켜 내온도성 식물을 수득하는데 성공하였다.

따라서, 본 발명은 콜린 산화효소를 코딩하는 유전자를 수반하는 재조합 벡터로 식물을 형질전환시키는 것으로 구성된 내온도성 식물의 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 내온도성 식물 또는 동일한 특성을 갖는 그의 자손도 제공한다.

본 발명은 새로운 특성을 갖는 식물의 제조방법, 보다 구체적으로, 환경 스트레스에 대한 내성이 강한 내온도성 식물의 제조방법에 관한 것이다.

도 1: 콜린에서 베타인으로의 산화 과정을 나타내는 개략도.

도 2A: 시네코코커스 PCC7942 의 형질전환에 사용되는 구성물을 나타내는 개략도. PAM 은 pAM1044 로 형질전환된 시네코코커스 PCC7942 를 나타내며, PAMCOD 는 codA 유전자를 수반하는 pAM1044 로 형질전환된 시네코코커스 PCC7942 를 나타낸다. 끊어진 화살표는 PCR 에 사용된 프라이머를 나타낸다. 삼각형은 conII 프로모터를 나타낸다. 화살표는 유전자의 방향을 나타낸다.

도 2B: 시네코코커스 PCC7942 DNA 에 있어서 스펙티노마이신-내성 유전자 및 codA 유전자에 의한 염색체의 전면 교체를 보여주는 SDS-PAGE (전기영동 사진). a 레인: λ-HindIII/Φx174-HaeIII 단편; b 레인: 시네코코커스 PCC7942 의 야생형 균주; c 레인: 균주 PAM; d 및 e 레인: 균주 PAMCOD (b, c 및 d 레인은 프라이머 1 및 2 를 사용한 PCR 의 결과를 보여주며, e 레인은 프라이머 1 및 3 을 사용한 PCR 의 결과를 보여준다).

도 3: 시네코코커스 PCC7942 균주 PAM 및 PAMCOD 내의 콜린 산화효소의 발현을 보여주는 웨스턴 블롯 분석 (전기영동 사진). a 레인: 균주 PAMCOD 로부터의 단백질 추출물; b 레인: 균주 PAM 으로부터의 단백질 추출물; c 레인: 정제된 콜린 산화효소.

도 4: 1 mM 콜린 클로라이드가 보충된 BG 11 배지의 아가 플레이트상에서 각기 다른 온도로 10 일 동안 증식된 시네코코커스 PCC7942 균주의 증식 결과 (생물체의 형태를 보여주는 사진). 1 및 4: PAM 균주; 2 및 3: PAMCOD 균주.

도 5: 조명하에 1 mM 콜린 클로라이드가 보충된 BG11 배지에서의 시네코코커스 균주 PCC7942 PAM (○) 및 PAMCOD (●) 의 증식. A: 42℃ 에서의 증식; B: 20℃ 에서의 증식.

도 6: 1 mM NaHCO₃의 존재하 (A) 또는 1,4-벤조퀴논 및 1 mM K₃Fe(CN)₆의 존재하 (B) 에 저온에서 증식된 시네코코커스 균주 PCC7942 PAM (○) 및 PAMCOD (●) 로부터의 광합성 산소 방출도.

도 7: codA 유전자의 제한효소 지도를 나타내는 개략도.

도 8: 아라비돕시스 (Arabidopsis) 의 형질전환에 사용된 2 성분-벡터 플라스미드 pGAH/codA 의 구조를 나타내는 도식도.

도 9: 야생형 및 형질전환된 아라비돕시스 식물의 수용성 분획내 콜린 산화효소의 웨스턴 블롯 분석 (전기영동 사진). 1 레인: 시판되는 아르트로박테르 글로비포르미스 (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo, USA) 에서 유도된 콜린 산화효소; 2 레인: 야생형 식물의 수용성 분획; 3 레인: 형질전환된 식물의 수용성 분획.

도 10: 야생형 및 형질전환된 아라비돕시스 식물의 잎내의 광화학 시스템 II 에 저온이 미치는 영향. (○): 야생형 식물; (●): 형질전환된 식물.

도 11: 야생형 및 형질전환된 아라비돕시스 식물의 잎내의 저온에서의 광합성 억제 (A) 및 저온에서의 광합성 억제로부터의 회복 (B). (○): 야생형 식물; (●): 형질전환된 식물.

도 12: 야생형 및 형질전환된 아라비돕시스 식물의 잎에 대한 내동결성 시험의 결과. (○): 야생형 식물; (●): 형질전환된 식물.

도 13: 야생형 및 형질전환된 아라비돕시스 식물의 종자 발아시 수분 흡수 단계에서 저온이 미치는 영향 (생물체의 형태를 보여주는 사진). A: 수분 흡수 단계에서 저온 처리되지 않은채 발아한 종자; B: 수분 흡수 단계에서 저온 처리된 후 발아한 종자. A 및 B 의 경우 모두, 좌측의 W 는 야생형 식물의 종자로부터 나온 결과를 보여주며, 우측의 T 는 형질전환된 식물의 종자로부터 나온 결과를 보여준다.

도 14: 벼의 형질전환에 사용된 두개의 키메라성 codA 유전자, 즉 35SINTPcodA 및 35SINcodA 의 구조.

도 15: 야생형 균주, codA 유전자를 발현하지 않는 형질전환체 (A), 및 codA 유전자를 발현하는 형질전환체 (B) 인 벼에서 베타인 축적을 나타내는 NMR 차트. 도면에서, GB 및 Ch 는, 각각, 베타인 및 콜린에 해당하는 피이크를 나타낸다.

도 16: 비교값 대 최고 활성도 (100% 라 가정) 로 나타낸, 시네코코커스 PCC7942 내로의 codA 유전자 도입이 광화학 시스템 II 에 의해 중재되는 전자 전달에 미치는 영향. (○): 조명하의 PAM 세포; (●): 조명하의 PAMCOD 세포; (□): 암조건하의 PAM 세포; (■): 암조건하의 PAMCOD 세포.

도 17: 시네코코커스 PCC7942 내에 codA 유전자가 도입된 경우, 저온에서의 광억제로부터의 광화학 시스템 II 에 의해 중재되는 전자 전달의 회복. (○): 조명하의 PAM 세포; (●): 조명하의 PAMCOD 세포.

도 18: codA 유전자가 시네코코커스 PCC7942 내에 도입된 경우, 암조건 하에서의 저온 처리가 광합성 산소 방출에 미치는 영향. (○): 조명하의 PAM 세포; (●): 조명하의 PAMCOD 세포.

도 19: codA 유전자가 시네코코커스 PCC7942 에 도입된 경우, 저온 처리가 지질 상 변이에 미치는 영향. (○): 조명하의 PAM 세포; (●): 조명하의 PAMCOD 세포.

도 20: codA 유전자가 시네코코커스 PCC7942 내에 도입된 경우, 수용성 분획 및 막 분획에서의 단백질 변화를 보여주는 일렉트로포레토그람 (electrophoretogram). 1 레인: 콜린 산화효소; 2: PAM 세포의 원형질 막; 3: PAMCOD 세포의 원형질 막; 4: PAM 세포의 틸라코이드 (thylakoid) 막; 5: PAMCOD 세포의 틸라코이드막; 6: PAM 세포의 수용성 분획; 7: PAMCOD 세포의 수용성 분획. 화살표는 콜린 산화효소를 나타낸다.

발명의 최상의 구현예

본 발명에서 사용된 바에 의하면, 내온도성이란 형질전환되지 않은 식물이 정상적으로 성장할 수 있는 온도보다 높거나 또는 낮은 온도에서 성장할 수 있는 형질전환된 식물의 능력을 뜻한다.

본 발명에서 사용된 콜린 산화효소를 코딩하는 유전자는 1 단계 반응으로 콜린을 베타인으로 전환시킬 수 있는 단백질을 코딩하고, 아르트로박테르 속의 그람-양성 토양 박테리아로부터 유래될 수 있는 유전자이다. 예컨데, 바람직하게는 아르트로박테르 글로비포르미스 및 아르트로박테르 파센스 (Arthrobacter pascens), 특히 아르트로박테르 글로비포르미스로부터 유래될 수 있다.

콜린 산화효소를 코딩하는 codA 유전자를 아르트로박테르 글로비포르미스로부터 클론하고 그의 뉴클레오티드 서열을 측정하였다. codA 유전자는 547 개의 아미노산을 코드하는 1641 bp 길이의 오픈 리딩 프레임을 함유한다. codA 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 서열 목록의 서열 번호: 1 에 나타내었다.

콜린 산화효소를 코딩하는 상기 유전자는 적합한 벡터내로 삽입되어 식물을 형질전환시킬 수 있다. 이어서, 특성의 발현에 관여하는 적합한 프로모터 또는 서열이 상기 벡터에 도입되어 식물체내에서 유전자를 발현시킬 수 있다.

콜린 산화효소를 코딩하는 유전자로는 서열 목록의 서열 번호: 1 의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 상기 아미노산 서열에 하나 이상의 아미노산이 첨가, 결실 또는 치환된 뉴클레오티드 서열 (단, 이들이 콜린 산화효소 활성을 갖는 단백질을 코드한다는 전제하에) 도 포함된다.

본 발명의 방법은 시아노박테리아에서 고등 식물에 이르기까지 다양한 종류의 식물에 내온도성을 부여할 수 있다. 시아노박테리아가 고등 식물의 모델 생물체로써 널리 이용되는데, 이는 이들이 고등 식물과 기본적으로 동일한 광합성 메카니즘을 가지며 쉽게 형질전환되어 짧은 시간내에 결과를 제공할 수 있기 때문이다. 형질전환시키기 쉬운 몇몇 시아노박테리아는 자신의 세포내로 세포외 DNA 를 쉽게 받아들여 효율적인 재조합이 일어나도록 한다. 상기 박테리아에는 시네코코커스 PCC7942, 시네코코커스 PCC6301 (ATCC 27144) 및 시네코시스티스 (Synechocystis) PCC6803 (ATCC 27184) 가 포함된다 (Protein, Nucleic Acid, Enzyme, Vol. 35, No. 14, pp. 2542-2551, 1991; Crit. Rev. Microbiol. Vol. 13, No. 1, pp. 111-132, 1985).

고등 식물에는 쌍자엽 식물 및 단자엽 식물이 포함된다. 하기 기재된 실시예에서, 내온도성이 강한 식물은 쌍자엽 식물인 브라시카세우스 식물로부터 수득될 수 있으나, 이에 국한되지 않으며 기타 과 및 속의 쌍자엽 식물을 사용할 수도 있다. 또한 본 발명의 방법은 단자엽 식물에도 적용될 수 있다. 원래 베타인-합성 능력이 결여된 단자엽 식물인 벼가 본 발명의 방법에 의해 형질전환된 후 이러한 능력을 획득하는 것으로 밝혀졌다.

콜린 산화효소-코딩 유전자가 삽입될 수 있는 벡터 및 형질전환된 식물의 형질전환 및 선별 방법은, 식물 세포를 비롯해, 형질전환될 식물의 성질에 따라 적절하게 선택될 수 있다.

예컨데, pUC303 과 같은 플라스미드가 시아노박테리아에 사용될 수 있다. 이어서, 목적하는 특성을 갖는 형질전환체가 플라스미드내에 삽입된 항생제-내성 유전자에 의해 선별될 수 있다. 본 발명에 따르면, 고온 및 저온 모두에 대한 내성을 갖는 식물이 아르트로박테르 글로비포르미스로부터 유래된 콜린 산화효소를 코딩하는 codA 유전자로 시아노박테리움 시네코코커스 PCC7942 를 형질전환시킴으로써 성공적으로 수득되었다.

codA 유전자로 형질전환된 시네코코커스 PCC7942 을 콜린 클로라이드가 보충된 BG11 배지에서 배양할 경우, 형질전환된 시네코코커스는 외부에서 공급된 콜린을 취하여 베타인으로 전환시키고, 약 80 mM 수준까지 베타인을 축적하는 것으로 밝혀졌다. 그러나, codA 유전자가 결여된 시네코코커스 균주의 대조군에서는 상기 축적이 관찰되지 않았다.

codA 로 형질전환된 시네코코커스 균주 및 형질전환되지 않은 균주 대조군을 42℃ 에서 콜린 클로라이드가 보충된 BG11 배지에서 배양시켜 고온에 대한 이들의 반응을 시험한 결과, 형질전환된 시네코코커스가 하룻동안 증식을 멈춘 후 다시 증식하기 시작했다. 형질전환되지 않은 대조군은 42℃ 에서 전혀 증식하지 않았다. 이들을 20℃ 에서 증식시켜 저온에 대한 반응을 시험한 결과, 형질전환된 균주는 4일 동안 느리게 증식하였으나 그 후 빠르게 증식하기 시작했다. 그러나, 형질전환되지 않은 대조군은 4일이 지난 후에도 여전히 매우 느리게 증식하였다. 또한 고형 배지를 사용한 증식 시험에서도, 형질전환된 균주가 형질전환되지 않은 균주와 비교해 고온 및 저온 모두에서 잘 증식한다는 것을 나타낸다. 상기 결과는 codA 유전자로 형질전환된 시네코코커스 균주가 형질전환되지 않은 균주보다 고온 및 저온 모두에서 월등하게 더 잘 증식함을 보여준다.

베타인이 삼투보호제로써 뿐만 아니라 광독립영양 생물체내의 광합성 메카니즘의 보호에도 중요한 역할을 한다는 것이 지적된 바 있다 (Murata et al., FEBS Lett. 296:187-189, 1992). 따라서, 본 발명에 의해 형질전환된 시네코코커스 균주 및 형질전환되지 않은 균주를 각기 다른 저온에서 암조건하에 배양하여 광합성의 내온도성을 시험하였다. 그 결과, 저온에서의 광합성 산소 방출도 및 세포내 광화학 시스템 II 에 의해 중재되는 전자 전달의 비활성화에 있어 형질전환된 균주 및 형질전환되지 않은 균주간의 큰 차이점이 관찰되었다. 즉, 형질전환된 균주의 광합성 산소 방출도가 형질전환되지 않은 균주의 것보다 저온에 대한 내성이 보다 강했다. 형질전환된 균주의 세포내 광화학 시스템 II 에 의해 중재되는 전자 전달 활성 또한 형질전환되지 않은 균주의 것보다 저온에 대한 내성이 보다 강했다. 즉, 형질전환된 균주의 활성은 5℃ 에서 거의 원래대로 유지되고 5℃ 이하에서 감소하기 시작한 반면, 형질전환되지 않은 균주의 활성은 5℃ 에서 원래 활성도의 50% 로 감소하였다.

시네코코커스 PCC7942 의 증식에 최적인 온도가 30 내지 38℃ 임이 이미 공지된 바 있다. 따라서, 형질전환되지 않은 균주의 세포 증식이 42℃ 와 같은 고온에서 몇몇 단백질 구조의 변성에 의해 억제되었음이 추론된다. 그러나, codA 유전자를 수반하는 형질전환된 균주는 아마도 세포내에 축적된 약 80 mM 의 베타인이 단백질의 변성을 막았기 때문에 증식할 수 있었을 것이다. 20℃ 에서, 형질전환되지 않은 균주는 증식할 수 없으나, codA 유전자가 삽입된 형질전환된 균주는 증식할 수 있다. 이 또한 베타인의 축적에 의한 결과일 수 있다. 더욱이, 세포질내의 베타인 축적이 암조건하에서 시아노박테리아 세포의 저온에 대한 내성을 강화시키는 것으로 여겨진다. 그러나, 본 발명은 상기 작용 메카니즘에 국한되지는 않는다.

상기 결과는, 고온 및 저온 모두에 대한 탁월한 내성이, 본 발명의 방법에 의해 콜린 산화효소를 코딩하는 유전자로 형질전환된 시네코코커스에 부여되었음을 의미한다.

쌍자엽 식물은 원형질체 또는 조직 일부를 이용한 유전자 전이 기법을 통해 형질전환될 수 있다. 조직 단편을 이용한 유전자 전이의 경우, 아그로박테리움 (Agrobacterium) 에서 유래한 Ti 플라스미드를 사용할 수 있다. 유합조직이 형성된 식물의 조직 단편을 콜린 산화효소-코딩 유전자를 포함한 아그로박테리움으로 감염시키고, 카나마이신과 같은 항생제에 대한 내성을 이용해 선별한 후, 새순에서 분화시켜 형질전환된 식물을 얻는다.

본 발명에서, 내온도성이 강한 식물은 브라시카세우스 식물인 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) 를 하기와 같이 콜린 산화효소-코딩 유전자로 형질전환시켜 수득될 수 있다.

codA 유전자를 수반하는 2 성분 벡터 플라스미드 pGAH-codA 를 제조하여 Ti 플라스미드를 함유한 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) EHA101 에 삽입시킨다. 아라비돕시스의 자엽하축 유합조직을 생성된 codA 유전자를 포함하고 있는 아그로박테리움 EHA101 (pGAH/codA) 로 감염시킨 후, 새순을 형성시키고 카나마이신 및 히그로마이신 (hygromycin) 내성을 이용해 선별하여 뿌리를 유도하고 종자를 형성시킨다. 생성된 이형 T2 종자로부터 수득된 식물은 자가 수정되어 동형 T3 개체를 생성시키며, 이들 개체는 씨 뿌려져 형질전환된 식물을 형성한다.

상기 수득된 형질전환된 식물은 콜린 산화효소가 엽록체로 이동하였음을 보여준다. 잎의 콜린 및 베타인 농도를 측정하는 경우, 형질전환된 식물에서는 콜린 및 베타인 모두 관찰되는 반면, 야생형 식물에서는 단지 콜린만이 관찰되는데, 이는 베타인이 codA 유전자의 전이에 의해 식물내에 축적됨을 시사한다. 형질전환된 식물은 야생형과 비교해 탁월한 내온도성을 보인다.

단자엽 식물인 벼 (Oryza sativa L. cv. Nippon bare) 는, 예컨데, 플라스미드 pUC119 상에서 제조되고, 카울리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터의 전사 제어 하에서 해독된 후, 시토졸 (cytosol) 또는 색소체에 집중되어 있는 두개의 키메라 codA 유전자로 형질전환될 수 있다. 이 두 키메라 유전자 모두 5' 의 비해독 서열내에 벼-유래성 인트론을 포함하고 있어 발현량을 증진시킨다.

형질전환된 벼는 하기 방법에 의해 제조될 수 있다. 즉, 상기 키메라 codA 유전자를 선별 마커인 히그로마이신-내성 유전자와 함께 벼 종자의 배반 유합조직에서 유래한 현탁 배양 세포내로, 파티클 건 (particle gun) 장치를 통해 도입시킨 후, 항생제에 대한 내성을 기준으로 형질전환된 유합조직을 선별하고, 식물로 재분화시킴으로써 형질전환된 식물을 수득할 수 있다.

야생형 벼는 베타인-합성 능력을 갖고 있지 않지만, 본 발명의 방법에 의해 형질전환된 벼는 베타인-합성 능력을 갖는다. codA 유전자를 발현하는 형질전환된 벼는 농경 및 수경 조건하에서 모두 어떠한 뚜렷한 기형성도 보이지 않은채 형질전환되지 않은 식물과 동일하게 성장한다. 이로써 베타인 합성의 부산물로써 형성된 과산화수소가 세포내에서 효과적으로 해독되었다는 결론을 내릴 수 있다. 시아노박테리아 및 쌍자엽 식물에서의 베타인-합성 능력의 획득 및 내온도성간의 관계에 비추어, 본 발명의 방법에 의해 수득된 형질전환된 벼 또한 내온도성을 획득함을 예상할 수 있다. 이는 유전공학 기법을 통해 벼가 베타인-합성 능력을 획득한 최초의 케이스이다.

암조건하에 방치된 후의 형질전환된 식물 및 형질전환되지 않은 식물의 광화학 시스템 II 의 회복을 시네코코커스를 이용한 실험에서 비교한 경우, 형질전환된 식물이 보다 빠르게 회복하였는데, 이는 베타인의 존재가 광화학 시스템 II 의 회복을 가속화했음을 나타낸다. 또한 형질전환된 식물의 광합성도 형질전환되지 않은 식물의 것보다 저온에 대한 내성이 더 강한 것으로 나타났다. 형질전환된 식물 및 형질전환되지 않은 식물간의 막 지질 및 단백질에서 어떠한 큰 차이점도 발견되지 않은 것에 비추어 볼 때, 저온에서의 형질전환된 식물에서 관찰되는 광화학 시스템 II 의 보호가 베타인의 영향 때문인 것으로 보인다.

본 발명의 범위는 상기 기재된 바에 따라 제조된 내온도성 식물 또는 동일한 특성을 갖는 그의 자손에 대해 다룰 뿐만 아니라, 그로부터 수득된 식물 세포 (예컨데, 유합조직 배양 세포) 및 식물 일부 (예컨데, 꽃, 종자, 열매, 결절 등) 및 이들의 자손에 대해서도 다루고 있다.

본 발명에 따라, 환경 스트레스에 대해 강한 내성을 갖는 내온도성 형질전환 식물이 수득될 수 있다. 본 발명의 방법은 정상적으로는 식물이 성장할 수 없는 고온 및 저온 조건하에서도 성장할 수 있는 식물을 제조하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 내온도성이 부여될 수 있는 식물의 범위는, 광합성 박테리아로부터 고등 식물에 이르기까지, 매우 광범위하다. 특히, 본 발명은 대부분의 주요 농작물을 포함하는 단자엽 식물로부터 안정된 형질전환 식물이 수득되고, 이들의 베타인 합성 능력이 확인된 최초의 케이스이므로 산업상 매우 유용하다.

본 발명에 따른 내온도성 식물의 제조방법은 고온 및 저온 모두에 대한 내성을 갖는 식물을 제조하는데 사용될 수 있으므로 매우 유용하다. 하기 실시예는 본 발명을 보다 상세히 예시하나, 본 발명의 범위는 이에 국한되지 않는다.

실시예 1: codA 유전자에 의한 시아노박테리움 시네코코커스 PCC7942 의 형질전환

(1) codA 유전자의 클로닝

아르트로박테르 글로비포르미스로 부터 콜린 산화효소 유전자를, 1994년 일본 식물 생리학회 연례모임의 제 34 회 심포지움에서 공개된 구두 보고 요약서에 기재된 방법에 따라 분리한다. 요약하자면, 1) 콜린 산화효소를 시아노젠 브로마이드로 단편화시키고, 2) 적합한 단편의 N-말단 아미노산 서열을 분석하고, 3) 상기 아미노산 부분 서열로부터 적합한 부분을 선택하여 이에 해당하는 올리고뉴클레오티드를 합성하고, 4) 상기 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용해 콜린 산화효소 유전자의 부분 서열을 PCR [Polymerase Chain Reaction (중합효소 연쇄 반응)] 을 통해 증폭시키고, 5) 콜린 산화효소 유전자의 증폭된 부분 서열을 탐침으로 사용해 아르트로박테르 글로비포르미스의 게놈성 DNA 라이브러리를 스크린한다.

상기 수득된 양성 클론을 플라스미드 pBluescript (SK⁺) (Stratagene 사 제품) 내에 서브클론시켜 양성 클론을 분리한 후, 서던 블롯 분석을 실시한다. 상기 탐침에 혼성화된 3.6 kbp XbaI-XhoI 단편을 pBluescript 내에 서브클론시키고 제한효소로 매핑한다. 첫번째 SalI-부위에서 XhoI-부위에 이르는 영역 (약 2.5 kbp) 의 뉴클레오티드 서열을 분석한다.

그 결과, 콜린 산화효소 유전자가 547 아미노산 잔기의 폴리펩티드를 코드하는 1641 bp 의 오픈 리딩 프레임을 함유하는 것으로 나타났다. 콜린 산화효소-코딩 유전자의 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열을 서열 목록의 서열 번호: 1 에 나타내었다.

(2) codA 유전자에 의한 시네코코커스 PCC7942 의 형질전환

codA 유전자를 수반하는 플라스미드 pBluescript 를 제한 효소 BstEII (해독 원점으로부터 -40 인 지점) 및 SmaI (정지 코돈의 하류) 로 절단한다. BstE II-접착 말단을 클레노우 (Klenow) 단편 (Takara, Tokyo, Japan) 으로 채운다. codA 유전자의 코딩 영역 및 추정적 리보좀 접합 부위를 함유하는 평활 말단 단편을 플라스미드 pAM1044 의 SmaI 부위내에 삽입시킨다. pAM1044 의 conII 프로모터의 제어하에 발현되는 것으로 보이는 유전자의 정확한 방향을 제한 효소 분석을 통해 확인한다. conII 프로모터는 E. coli 프로모터의 공통 서열로써 뉴클레오티드 서열 TTGGACA (-35) 및 TATAAT (-10) 를 함유한다.

플라스미드 pAM1044 및 codA 유전자를 함유하는 플라스미드를 엘하이 등 (Elhai et al.) 의 방법을 통해 시네코코커스 PCC7942 를 형질전환시키는데 사용한다. 생성된 형질전환체를 균주 PAMCOD 라 지정한다. 대조용으로, 시네코코커스 PCC7942 를 pAM1044 만으로 형질전환시키고 균주 PAM 이라 명명한다.

형질전환체의 선별을 스펙티노마이신 30 μg/ml 을 함유한 BGl1 아가 플레이트 상에서 수행한다. 스펙티노마이신을 함유하는 신선한 BGl1 플레이트에서의 단일 콜로니의 수차례 계대배양 후, 모든 염색체 카피내에 스펙티노마이신-내성 유전자 및 codA 유전자가 완전히 삽입되었음을 도 2A 에 나와 있는 프라이머를 사용한 PCR 을 통해 확인하였다. 시네코코커스 염색체 내로 스펙티노마이신-내성 유전자 및 codA 유전자의 완전한 삽입을 프라이머 1 및 2 의 조합을 사용해 PCR 을 통해 확인한다.

균주 PAMCOD 및 PAM 의 배양을 1 mM 콜린 클로라이드 (Kitayama Chemical 제품) 가 보충된 BG 11 배지 (Stanier et al., Bacteriol. Rev. 35:171-205, 1971) 에서, 1% CO₂에 의한 통기하에, 30℃ 에서 70 μE m^-2s^-1의 백열등 조명하에 수행한다. 대수 증식기의 세포들을 하기 기재된 모든 실험에 사용한다. 광합성 활성은 5-10 μg/ml 의 엽록소 농도로 조절된 세포 밀도에서 측정된다.

실시예 2: 형질전환체에 삽입된 유전자의 확인

시네코코커스 PCC7942 의, 야생형 균주 PAM 및 PAMCOD 에서 각기 유래된 DNA 를 PCR 용 주형으로 사용하고, 증폭된 생성물을 SDS-PAGE 를 통해 분석한다. 그 결과를 도 2B 에 나타내었다.

야생형 균주에서 유래한 DNA 의 PCR 이 약 400 bp 의 증폭된 생성물을 생성시킨다 (도 2B, b 레인). 균주 PAM 에서 유래한 DNA 를 주형으로 사용한 PCR 은 약 2.4 kb 의 밴드를 생성시키는데, 이는 pAM1044 가 염색체내에 삽입되었음을 나타낸다. 야생형 균주에서 관찰되는 약 400 bp 의 밴드가 존재하지 않는데, 이는 균주 PAM 에서는 본래의 염색체가 변종 염색체에 의해 완전히 교체되었음을 나타낸다.

PAMCOD 에서 유래한 DNA 를 주형으로 사용할 경우, 야생형 염색체에 해당하는 밴드가 관찰되지 않는다 (도 2B, c 레인). 그러나, 예상했던 약 4.1 kb 의 밴드 또한 증폭되지 않았는데, 아마도 삽입체의 큰 크기 및 codA 서열내의 높은 GC 함량에 의한 것으로 보인다. 따라서, codA 유전자의 코딩 영역에 해당하는 프라이머 3 (도 2A) 을 프라이머 1 과 조합하여 사용한다. 예상했던 약 2.6 kb 의 밴드가 증폭되었는데 (도 2B, d 레인), 이는 codA 유전자가 균주 PAMCOD 의 염색체내에 존재함을 나타낸다.

실시예 3: 시네코코커스 균주 PAMCOD 내의 codA 유전자의 발현

실시예 1 에서 수득된 균주 PAMCOD 내의 codA 유전자의 발현을, 정제된 콜린 산화효소에 대한 폴리클로날 항혈청을 사용하는 웨스턴 블롯 분석을 통해 조사한다. 그 결과를 도 3 에 나타내었다. 균주 PAMCOD 로부터 추출된 단백질 추출물 (a 레인) 및 정제된 콜린 산화효소 (c 레인) 의 경우, 시그날이 60 kDa 에서 검출되었다. 상기 시그날은 균주 PAM 으로부터 추출된 단백질 추출물 (b 레인) 에서는 검출되지 않았다. 상기 결과는 codA 유전자가 conII 프로모터의 제어하에 시네코코커스 PCC7942 에서 발현되었음을 확인해 준다.

실시예 4: 세포내 베타인 농도의 분석

형질전환된 세포를 5mM 콜린 클로라이드가 보충된 BGll 배지 1 리터에서 증식시킨다. 각기 다른 농도의 NaCl 을 첨가하여 염류성 스트레스를 부여한다. 채취된 세포를 25℃ 에서 20 시간동안 1M H₂SO₄로 처리하고, 페리오데이트 (periodate) 침전 기법 (Wall, J.S. et al., Analyt. Chem. 32:870-874, 1960) 을 통해 혼합물로부터 베타인을 회수한다 . 내부 표준으로써 2 mM 2-메틸-2-프로판올 (Wako 사 제품) 을 함유하는 메탄올-d₄(Wako 사 제품) 1 ml 에 베타인 페리오데이트를 용해시킨다. 이 용액의¹H NMR 스펙트라를 NMR 튜브에서 Bruker AMX 360 Wb 를 사용해 측정한다. 통합된 피이크를 표준 곡선과 비교해 베타인의 정량한다.

균주 PAMCOD 의 세포내 베타인 농도를, 음성 염색된 세포의 전자 현미경 검사에 의해 추정된 세포 부피를 기준으로 측정한다. 단일 세포의 세포질은 길이 2.14 μm 및 직경 0.82 μm 의 원통 모양을 하고 있으며, 세포 부피는 약 1.13 μm³인 것으로 추정된다.

그 결과, 균주 PAMCOD 의 세포내 베타인 농도가 약 80 mM 인 것으로 계산되었다. 그러나, codA 유전자가 결여된 균주 PAM 에서는 베타인이 전혀 검출되지 않았다.

실시예 5: 고온 및 저온성 스트레스 하에서의 증식

(1) 고형 배지에서의 증식 시험

고온에서의 증식

시네코코커스 균주 PAM 및 PAMCOD 를 1 mM 콜린 클로라이드가 보충된 BGll 배지중의 아가 플레이트로 이동시키고, 40℃, 42℃ 및 44℃ 에서 증식을 관찰한다. 그 결과를 도 4A 에 나타내었다. 두 균주 모두 40℃ 에서는 거의 동일하게 증식한다. 두 균주 모두 44℃ 에서는 증식하지 않는다. 42℃ 에서, 균주 PAMCOD 는 매우 잘 증식하는 반면, 균주 PAM 은 매우 느리게 증식한다.

저온에서의 증식

시네코코커스 균주 PAM 및 PAMCOD 를 1 mM 콜린 클로라이드가 보충된 BGll 배지중의 아가 플레이트로 이동시키고, 22℃, 20℃ 및 18℃ 에서 증식을 관찰한다. 그 결과를 도 4B 에 나타내었다. 두 균주 모두 22℃ 에서는 거의 동일하게 증식한다. 20℃ 에서는, 균주 PAMCOD 가 다른 균주보다 빠르게 증식한다. 두 균주 모두 18℃ 에서는 증식하지 않는다.

(2) 액체 배지에서의 증식 시험

고온에서의 증식

30℃ 에서 1 mM 콜린 클로라이드가 보충된 BGll 배지에서 예비 증식된 시네코코커스 균주 PAM 및 PAMCOD 의 세포를 42℃ 로 이동시키고, 파장 730 nm 에서 혼탁도를 모니터하여 증식 정도를 측정한다. 그 결과를 도 5A 에 나타내었다. 균주 PAMCOD 의 세포는 첫째 날에 증식을 멈추었으나, 다시 증식을 회복하였다. 그러나, 균주 PAM 의 세포는 전혀 증식하지 않는다.

저온에서의 증식

30℃ 에서 1 mM 콜린 클로라이드가 보충된 BGll 배지에서 예비 증식된 시네코코커스 균주 PAM 및 PAMCOD 의 세포를 20℃ 로 이동시키고, 파장 730 nm 에서 혼탁도를 모니터하여 증식 정도를 측정한다. 그 결과를 도 5B 에 나타내었다. 균주 PAMCOD 의 세포는 4 일간 느리게 증식한 후, 빠르게 증식하기 시작한다. 그러나, 균주 PAM 의 세포는 4 일 후에도 여전히 느리게 증식한다.

실시예 6: 저온성 스트레스 하에서의 광합성 활성

저온성 스트레스에 의해 유발되는 광합성 산소 방출의 비활성화를 시험한다. 30℃ 에서 예비 증식된 균주 PAM 및 PAMCOD 의 세포를 각기 다른 온도에서 암조건하에 증식시킨다. 이어서, 1 mM NaHCO₃의 존재 또는 1,4-벤조퀴논 및 1 mM K₃Fe(CN)₆의 존재하에, 30℃ 에서, 클라크형 (Clark-type) 산소 전극을 사용해 광합성 산소 방출 활성을 측정한다.

저온에서의 광합성 활성

암조건 하에 0 내지 20℃ 의 각기 다른 온도에서 1 시간동안 세포를 증식시킨 후, 30℃ 에서 5 분간 증식시킨다. 증식 후, 광합성 산소 방출 활성을 상기 기재된 방식으로 측정한다. 균주 PAM 및 PAMCOD 의 세포는 CO₂의 존재하에, 각기, 387 ± 23 및 379 ± 19 μmole O₂/ mg 엽록소 / 시간 의 절대 광합성 산소 방출 활성을 보이고, 1,4-벤조퀴논 및 K₃Fe(CN)₆의 존재하에서는, 각기, 802 ± 36 및 740 ± 82 μmole O₂/ mg 엽록소 / 시간 의 절대 광합성 산소 방출 활성을 보인다.

결과를 도 6 (A: NaHCO₃의 존재하; B: 1,4-벤조퀴논 및 K₃Fe(CN)₆의 존재하) 에 나타내었다. 도 6A 에서 볼 수 있듯이, 균주 PAMCOD 의 광합성 산소 방출 활성이 균주 PAM 의 것보다 저온에 대한 내성이 강했다. 도 6B 에서 볼 수 있듯이, 균주 PAMCOD 의 광화학 시스템 II 에 의해 중재되는 전자 전달 활성 또한 균주 PAM 의 것보다 저온에 대한 내성이 강했는데, 즉, 균주 PAMCOD 의 활성은 5℃ 에서 초기 활성도를 거의 유지하고 5℃ 이하가 되면 감소하기 시작한 반면, 균주 PAM 의 활성은 5℃ 에서 초기 활성도의 50% 로 감소한다.

실시예 7: codA 유전자를 수반하는 2 성분 벡터 플라스미드의 제조

담배 [니코티아나 실베스트리스 (Nicotiana sylvestris)] 에서 유래한 rbcS (ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase small subunit) 트랜싯 시그날 XbaI-NdeI 단편 (약 200 bp) 을 5'CTGTCTAGATGTAATTAACAATGGCT3' 및 5'CCACATATGCATGCATTGCACTCT3' 을 프라이머로 사용해 PCR 로 증폭시키고, XbaI 및 NdeI 부위를 도입시킨다.

이어서, codA 유전자의 N-말단-BamHI 단편 (약 100 bp) 을 5'AACCATATGCACATCGACAACATC3' 및 5'GCTCCATCCAGCGGTCCAGC3' 을 프라이머로 사용해 PCR 로 증폭시킨 후, NdeI 부위를 도입시킨다. codA 유전자의 BamHI-SmaI 단편 (약 1.6 kbp) 을 제한 효소를 이용해 제조한다. 마지막으로, codA 유전자의 SmaI-C-말단 단편 (약 80 bp) 을 5'GAAACAGTCCTGCTTCCACAC3' 및 5'GCGAGCTCTGCCTACACCGCCAT3' 을 프라이머로 사용해 PCR 로 증폭시키고, SacI 부위를 도입시킨다.

2-성분 벡터 플라스미드 pBI221 내의 GUS (β-glucuronidase) 유전자가 상기 단편들에 의해 교체된다.

codA 유전자의 제한 효소 지도를 도 7 에 나타내었다.

카울리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터 및 NOS (Nopalin synthase) 터미네이터를 함유하는 HindIII-EcoRI 단편을 2-성분 벡터 플라스미드 pGAH 에 도입시켜 플라스미드 pGAH/codA 를 제조한다 (도 8). 상기 플라스미드는 카나마이신- 및 히그로마이신-내성 유전자를 함유한다.

실시예 8: 아그로박테리움 내로 2 성분 벡터 플라스미드의 도입

Ti 플라스미드를 함유하는 아그로박테리움 투메파시엔스 EHA 101 을 실시예 7 에서 수득된 2-성분 벡터 플라스미드 pGAH/codA 와 혼합한 후, 동결시키고 융해시켜, 테트라싸이클린 및 카나마이신을 함유하는 LB 플레이트 상에서 스크린한다. codA 유전자가 삽입된 생성된 아그로박테리움을 EHA101 (pGAH/codA) 라 명명한다.

실시예 9: 아라비돕시스의 형질전환

아라비돕시스 탈리아나 균주 WS 를 발아시켜 자엽하축 조각을 제조한다. 상기 자엽하축을 0.05 mg/l 의 키네틴 (Wako 사 제품) 및 0.5 mg/l 의 2,4-D (Wako 사 제품) 을 함유하는 B5 배지 (ICN Biochemicals 사 제품) (pH 5.7) 에서 유합조직화하여 자엽하축 유합조직을 형성시킨다.

이어서, 상기 유합조직을 실시예 8 에서 제조된 codA-함유 아그로박테리움 EHA101 (pGAH/codA) 로 감염시키고 공동 배양시킨다. 250 mg/l 의 반코마이신 (vancomycin), 500 mg/l 의 카르베니실린 (carbenicillin) 및 200 mg/l 의 클라포란 (Claforan) 을 함유하는 B5 배지를 통해 아그로박테리움을 제거한 후, 배양액을 카나마이신 및 히그로마이신을 함유하는 분화 배지 (25 mg/1 의 카나마이신 및 15 mg/l 의 히그로마이신을 함유하는 B5 배지) 로 이동시켜 새순을 형성시킨다. 그런 다음, 카나마이신- 및 히그로마이신-내성을 갖는 새순을 선별하여 뿌리를 유발하고 종자를 형성시킨다. 생성된 T2 종자는 염색체 중 단 하나만이 형질전환된 이형체이다.

이어서, T2 종자로부터 수득된 식물을 자가-수정시키고, 카나마이신 및 히그로마이신을 이용해 선별하여 동형 T3 종자를 수득한다.

야생형 및 형질전환체 균주의 식물을, 0.1% HYPONEX (Hyponex Corporation, Marysville, OH, USA) 를 함유하는 배지 (pH 5.2) 에서 22℃ 에서 30 일 동안 물 또는 질석 및 펠라이트 (perlite) 로 구성된 토양 상에서, 하루중 16 시간은 75 μmol m^-2s^-1의 조명하에 그리고, 별도의 지시가 없는 한, 나머지 8 시간은 암조건 하에서 성장시킨 후, 실험에 사용한다.

실시예 10: 발현된 콜린 산화효소의 면역학적 연구

본 발명의 발명자들이 발표한 문헌 (Deshniumu, P. et al., Plant Mol. Biol. 29:897-907, 1995) 에 기재된 방법에 따라 콜린 산화효소에 대한 항체를 제조한다.

아라비돕시스 탈리아나의 야생형 및 형질전환주의 20 일된 식물의 잎을 0℃ 에서 초원심분리기로 분쇄시키고, 호모게네이트 (homegenate) 를 10,000 x g 에서 10 분동안 원심분리시켜 수용성 분획을 제조한다. 상청액의 수용성 단백질을 SDS-PAGE 를 이용해 분리하고, 나일론 막 (Immobilon PVDF; Millipore, Bedford, MA, USA) 으로 이동시킨다. 상기 막을 콜린 산화효소에 대한 상기 항체와 함께 항온배양시키고, 비오틴된 2차 항체, 아비딘 (avidin) 및 비오틴된 양고추냉이 과산화수소 효소로 이루어진 시스템 (ABC Kit; Vectastain, Burlingame, CA, USA) 으로 검출한다.

웨스턴 블롯 분석 결과를 도 9 에 나타내었다. 콜린 산화효소에 해당하는 64 kDa 의 면역반응성 단백질의 존재가 확인되었다. 콜린 산화효소의 전구체에 해당하는 70 kDa 의 소량의 단백질 및 rbcS 트랜싯 펩티드가 또한 관찰되었다. 상기 결과는 codA 유전자가 염색체내에 정확히 삽입되고 발현되었으며, 발현된 전구체가 성숙 단백질로 프로세싱되었음을 보여준다.

이어서, 식물내에 발현된 콜린 산화효소의 집중화를 콜린 산화효소에 대한 상기 항체를 이용해 문헌 (Mustardy, L. et al., Plant Physiol. 94:334-340, 1990) 에 기재된 방법을 통해 검출한다. 식물의 어린 잎 조각을 0.1 M 인산 나트륨 완충액 (pH 7.2) 중의 1% 글루타르알데히드로 1 시간동안 고정시킨다. 동일한 완충액으로 씻어낸 후, 시료를 에탄올로 탈수시키고, 로위크릴 (Lowicryl) K4M 수지 (TAAB Laboratories Equipment Ltd., Berkshire, U.K.) 중에 위치시킨다. 문헌 (Mustardy et al., supra) 에 기재된 방법을 이용해 면역-금 라벨링 (Immuno-gold labelling) 을 수행한다.

그 결과, 발현된 콜린 산화효소가 엽록체의 스트로마에 집중되어 있는 것이 관찰되었는데, 이는 콜린 산화효소가 엽록체로 운반되었음을 나타낸다.

실시예 11: 형질전환된 식물내 베타인 및 엽록소 농도의 측정

식물 잎의 베타인 함량을 4 차 암모늄 화합물의 NMR 스펙트라 측정을 통해 산정한다 (Wall, J. et al., Analyt. Chem. 32:870-874, 1960). 야생형 및 형질전환된 식물의 잎 5 g 을 세라믹 모터로 액체 질소중에서 제분한다. 상기 분말을 25 ml 의 1.0 M H₂SO₄중에 현탁시키고 25℃ 에서 2 시간동안 항온배양한다. 비수용성 물질들을 제거한 후, 1000 x g 에서의 10 분 동안의 원심분리를 통해 상청액을 회수한다. 상청액을 0℃ 에서 2 시간동안 10 ml 의 KI-I₂용액중에서 항온배양한다. 과요오드화물에 의해 변형된 베타인 및 콜린을 1000 x g 에서의 30 분간의 원심분리를 통해 회수하고, 내부 표준으로써 0.5 mM 2-메틸-2-프로판올 (Wako) 을 함유하는 0.5 ml 의 CD₄OH (Wako) 에 용해시켜¹H NMR 스펙트라를 측정한다. 베타인 및 콜린에 해당하는 두 개의 주된 피이크가 관찰되며, 통합된 베타인 피이크는 농도 측정에 사용된다.

잎의 엽록소 함량을 하기 방법을 통해 측정한다. 잎 (1 g) 을 세라믹 모터로 액체 질소중에서 제분한다. 상기 분말을 10 ml 의 아세톤 : 물 (4:1, v/v) 에 현탁시킨다. 30 분간의 항온배양 후, 비수용성 물질들을 제거하고 상청액을 분광광도계 (Arnon, D.I. Plant Physiol. 24:1-15, 1949) 로 측정한다.

그 결과, 야생형 식물에서는 콜린만 관찰된 반면, 형질전환된 식물에서는 베타인 및 콜린 모두 관찰되었다. 베타인 함량은 어린 잎 1 g 당 1.0 μmol 이다. 엽록소 함량은 어린 잎 1 g 당 0.3 μmol 이다.

실시예 12: 저온성 스트레스에 대한 형질전환된 아라비돕시스의 내성

codA 유전자의 도입 및 베타인의 축적이 저온성 스트레스에 대한 내성을 부여하는지의 여부를 측정하기 위한 시험을 실시한다.

야생형 및 형질전환된 식물을 5℃ 에서 7 일간 지속적인 250 μmol m^-2s^-1의 조명하에 항온배양한다. 야생형 및 형질전환된 식물간에 어떠한 뚜렷한 차이점도 육안으로는 관찰되지 않았다. 상기 식물을 22℃ 에서 2 일간 추가로 항온배양하면, 야생형 식물의 잎이 시들고 백화되기 시작한다. 그러나, 형질전환된 식물은 상기 처리에 의해 전혀 영향을 받지 않았다.

실시예 13: 저온에서 광화학 시스템 II 활성의 비활성화

저온성 스트레스가 형질전환된 식물 잎의 광화학 시스템 II 활성에 미치는 영향을 엽록소의 형광성을 모니터하여 측정한다. 광화학 시스템 II 의 활성을, 펄스 강도-변화 형광계 (PAM-2000; Walts, Effeltrich, Germany) 를 사용해, 최고 엽록소 형광도에 대한 변동 엽록소 형광도의 비율 (Fv/Fm) 로써 측정한다 (Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42:313-349, 1991).

그 결과를 도 10 에 나타내었다. 250 μmol m^-2s^-1의 지속적인 조명하에 5℃ 에서 7 일간 항온배양 후, 광합성 시스템 II 활성이 야생형 및 형질전환된 식물 모두에서 감소하였다. 야생형 및 형질전환된 식물의 경우 모두, 첫째 날에는 빠르게 감소하다가 점차 늦춰지기 시작했다. 그러나, 형질전환된 식물이 야생형 식물 보다 매순간 훨씬 느린 비활성화를 보였다. 5 일간의 항온배양 후, 야생형 식물은 거의 완전히 활성을 잃었으나, 형질전환된 식물은 원래 활성도의 약 30% 수준을 유지하였다. 그러나, 10 내지 15℃ 에서는 그들간의 광합성 시스템 II 활성에 어떠한 뚜렷한 차이점도 관찰되지 않았다.

실시예 14: 저온에 의한 광합성의 억제 및 회복, 및 내동결성

(1) 저온에 의한 광합성의 억제 및 광합성 억제로부터의 회복에 관한 시험

광합성 억제의 정도를 1℃ 와 같이 낮은 온도에서 측정한다. 그 결과를 도 11A 에 나타내었다. 형질전환된 식물의 잎이 야생형 식물의 잎보다 저온에 의한 광합성 억제에 대한 내성이 보다 강했다. 즉, 야생형 식물의 잎은 2.5 시간 후 광합성 시스템 II 활성의 약 75% 를 잃는 반면, 형질전환된 식물의 잎이 동일한 정도로 비활성화 되는데는 3.5 시간 이상이 소요된다.

도 11B 는 저온에 의한 광합성 억제로부터의 회복성 시험의 결과를 보여준다. 상기 저온 시험 후, 잎을 17℃ 에서 70 μmol m^-2s^-1의 조명하에 항온배양한다. 야생형 및 형질전환된 식물의 잎 모두 저온에 의한 광합성 억제로부터의 회복성을 보인다. 그러나, 형질전환된 식물이 야생형 식물보다 높은 정도의 회복성을 보인다. 4 시간 동안의 항온배양 후, 야생형 식물의 잎은 원래 활성도의 25 내지 50% 를 회복한다. 그러나, 형질전환된 식물의 잎은 25 내지 75% 의 회복성을 보인다.

(2) 잎에 대한 내동결성 시험

아라비돕시스의 야생형 및 형질전환된 식물의 잎을 찢고, 3℃/분의 속도로 감소하는 온도에서 물에 침수시킨다. 온도가 -3℃ 까지 떨어졌을 때, 액체 질소에 의해 냉각된 바늘을 잎에 접촉시켜 잎을 동결시킨다. 이어서, 1℃/시간의 속도로 -2℃ 내지 -12℃ 에 이르는 다양한 측정 온도까지 잎을 냉각시킨다. 잎을 제거하고, 4℃ 에서 하룻밤 동안 방치하여 이들을 해동시킨다. 다음날, 온도를 상온으로 복귀시키고, 광화학 시스템 II 활성을 측정한다. 그 결과를 도 12 에 나타내었다. 어떠한 온도에서든, 형질전환된 식물이 야생형 식물보다 높은 활성을 나타내었다.

실시예 15: 종자의 발아에 있어 수분-흡수 단계에서의 저온 처리의 영향

야생형 식물의 종자 및 형질전환된 식물의 T3 종자를 빙수 (약 0℃) 에 2 시간동안 방치하고 살균시킨 후, 2% 수크로스 및 0.5% 겔란 고무를 함유하는 MS (Murashige-Skoog) 배지에서 발아시킨다. 종자를 22℃ 에서 20 일간 발아시키는데, 하루중 16 시간은 광조건하에서 그리고 8 시간은 암조건하에서 발아시킨다.

그 결과를 도 13 에 나타내었다. 도면을 통해 알 수 있듯이, 야생형 및 형질전환된 식물 모두 수분-흡수 단계에서 이들의 종자가 냉각 처리되지 않은 경우에 발아하였다 (도 13A). 수분-흡수 단계에서 종자가 냉각 처리된 경우, 야생형 식물은 발아하지 않으나, 형질전환된 식물은 발아하며 처리되지 않은 종자와 동일하게 성장한다 (도 13B).

실시예 16: 벼의 형질전환에 사용되는 키메라 codA 유전자의 제조

카울리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터의 전사 제어하에서 아르트로박테르 글로비포르미스로부터 유래된 콜린 산화효소 유전자 (codA) 의 해독 후, 시토졸 또는 색소체에 위치하는 두개의 키메라 codA 유전자 (각각, 35SINcodA 및 35SINTPcodA 라 지칭) 를 실시예 6 에 기재된 방법을 통해 플라스미드 pUC119 상에서 제조한다 (도 14 참고). 인트론의 존재가 벼에서의 높은 유전자 발현도에 필수적이라는 것을 고려해 (예컨데, Tanaka, A. et al., Nucleic Acids Res. 18:6767-6770, 1990 참고), 벼의 수퍼옥시드 디스뮤타아제 유전자의 5' 비해독 서열내의 인트론 (SodCc2: Sakamoto, A. et al., FEBS Lett. 358:62-66, 1995) 을 두개의 키메라 유전자 모두에 도입시킨다. 더 나아가, 완두콩의 rbcS 트랜싯 펩티드로부터 유래된 DNA 서열 (Coruzz, G. et al., EMBO J 3:1671-1679, 1984) 을 35SINTPcodA 에 첨가하여, codA 단백질을 엽록체로 이동시킨다.

실시예 17: 벼의 형질전환

실시예 16 에서 제조된 두개의 키메라 codA 유전자를 각각, 선별 마커인 히그로마이신-내성 유전자와 함께, 파티클 건 장치를 이용해 벼 종자의 배반 유합조직으로부터 생성된 현탁 배양 세포내에 도입시킨다. 형질전환된 유합조직을 항생제 내성을 기준으로 선별하여 식물로 재분화시킨다. 히그로마이신 내성을 보이는 형질전환된 유합조직 또는 형질전환/재분화된 개체에 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 을 실시하여, 노던 블롯 기법을 통해 핵 게놈내의 codA 유전자의 도입 및 전사를 측정하고 각 codA 유전자에 대해 80 내지 100 개 이상의 형질전환체를 선별한다.

실시예 18: 형질전환된 벼에서의 codA 유전자 발현 분석

실시예 17 에서 수득된 형질전환체를 웨스턴 블롯 기법으로 스크린하여, 최종적으로 색소체에 위치하는 유전자를 수반하는 6 개의 개체 및 시토졸에 위치하는 유전자를 수반하는 10 개의 개체를 포함하는, codA 유전자를 단백질 수준으로 발현하는 형질전환된 벼 (당대) 를 수득한다.

벼에는 내인성 콜린 산화효소 활성이 결여되어 있지만, 형질전환체의 잎 또는 뿌리로부터 제조된 수용성 분획은 콜린 산화효소 활성을 나타낸다. 예상과는 반대로, 색소체-형 형질전환체의 모든 개체가, 동일한 발현 프로모터의 사용에도 불구하고, 시토졸-형 보다 적은 양의 콜린 산화효소 단백질을 발현하는 것으로 밝혀졌다.

codA 유전자의 발현을 노던 블롯 기법을 통해 더 조사한 경우, 전사 수준에서 발현된 두개의 유전자의 양에는 어떠한 뚜렷한 차이점도 발견되지 않았다. 인트론의 프로세싱을 역전사 PCR 을 통해 시험한 경우, 단백질의 정상정인 해독을 가져오지 않을 수 있는 상이한 3'-수용체 부위를 함유하는 복수의 스플리싱 (splicing) 변이체가 색소체-형 유전자로부터 전사된 mRNA 로부터 검출되었다. 이는 색소체-형 유전자로 형질전환된 식물에 의한 낮은 단백질 발현도가 mRNA 전구체의 비정상적인 프로세싱에 기인될 수 있음을 시사한다. 상기 현상은 콜린 산화효소의 색소체-표적화에 사용되는 트랜싯 펩티드를 코딩하는 서열이 쌍자엽 식물 (완두콩 rbcS 유전자) 로부터 유래된다는 사실과 관련이 있는 것으로 보인다. 따라서, 트랜싯 펩티드를 코딩하는 서열이 벼 rbcS 와 같은 단자엽 식물로부터 유래되면, 벼 엽록체내의 codA 발현이 보다 효율적이고, 생성된 형질전환 벼 또한 온도성 스트레스에 대한 내성이 보다 강할 것임을 쉽게 예상할 수 있다.

실시예 19: 형질전환된 벼내의 베타인 생합성

콜린 산화효소를 발현하는 형질전환체의 조직에 축적되는 베타인을 양성자 NMR 을 이용해 검출한다. 도 15 는 야생형 균주, codA 유전자를 발현하지 않는 형질전환체 (도 15A) 및 codA 유전자를 발현하는 형질전환체 (도 15B) 의 NMR 결과를 나타낸다.

콜린 산화효소를 발현하는 형질전환체가 베타인을 생합성하고, 축적된 베타인의 양은 웨스턴 블롯 기법을 통해 검출된 콜린 산화효소 양과 명확한 상관관계를 나타낸다. 축적된 베타인의 양은 뿌리보다 잎에서 더 많으며, 높은 codA 유전자 발현도를 보이는 개체에서는 4 μmol/ g 어린 잎 에 이른다. 이는 유전공학 기법을 통해 벼가 베타인-합성 능력을 획득한 최초의 케이스이다.

실시예 20: 저온에서 조명하에서의 광합성의 비활성화

형질전환된 식물이 베타인의 존재 또는 기타 요인에 의해 내온도성을 획득하는지의 여부를 시험하기 위해, codA 유전자를 함유하는 플라스미드로 시네코코커스 PCC7942 를 형질전환시켜 제조한 형질전환체, 및 실시예 1 에서 pAM1044 만으로 형질전환시켜 제조한 PAM 을 사용해 하기 시험을 수행한다.

1 mM 콜린 클로라이드의 존재하에 30℃ 에서 예비 증식된 PAM 및 PAMCOD 세포를 20℃ 에서 조명하에 또는 암조건하에 증식시킨다. 암조건하에서는, 광화학 시스템 II 의 활성이 유지된다. 그러나, PAM 세포의 광화학 시스템 II 활성은, 500 μEm^-2s^-1하에서 120 분 동안의 배양 후, 원래 활성도의 35% 로 감소하였다 (도 16A). PAMCOD 세포의 광화학 시스템 II 의 활성 또한 감소하였으나 PAM 세포보다는 적게 감소하였다 (도 16A). 이는 PAMCOD 세포의 광화학 시스템 II 가 PAM 세포의 것보다 광억제에 대한 내성이 보다 강함을 나타낸다.

광화학 시스템 II 의 광억제는 D1 단백질의 광유발성 비활성화 및 신규 합성된 D1 단백질을 획득하므로써 광화학 시스템 II 의 회복 간의 경쟁에 의해 유발된다. (Aro, E.-M. et al., Biochim. Biophys. Acta 1019:269-275, 1990; Aro, E.-M. et al., Biochim. Biophys. Acta 1143:113-134, 1993). 저온에서 광스트레스에 대한 PAMCOD 세포의 내성이 D1 단백질의 비활성화 억제 또는 D1 단백질 합성의 촉진에 의한 것인지를 시험하기 위해, 단백질 합성 억제제인 리노마이신 (400 mg/ml) 의 존재하에 광억제를 유발하였다. 암조건하에서, 리노마이신은 PAM 및 PAMCOD 세포의 광화학 시스템 II 활성에 아무런 영향을 미치지 않았다. 조명 하에서는, 광화학 시스템 II 복합체가, 두 형질전환체의 세포에서 모두, 동일한 속도로 비활성화 되었다 (도 16B). 상기 결과는 저온에서 광스트레스에 대한 PAMCOD 세포의 내성의 향상이 D1 단백질의 비활성화 억제의 결과가 아님을 보여준다. 베타인의 존재가 광화학 시스템 II 의 회복을 촉진하는 것으로 보인다.

실시예 21: 광억제로부터의 회복

산소 발생 활성 측정을 통해, PAM 및 PAMCOD 세포의 광억제로부터의 광화학 시스템 II 회복성을 시험한다. 세포를 3500 μEm^-2s^-1의 조명에 노출시켜 광화학 시스템 II 복합체를 원래의 15% 수준으로 억제한다. 이어서, 세포를 20℃ 또는 30℃ 에서 70 μEm^-2s^-1의 조명하에 증식시킨다. 그 결과를 도 17 에 나타내었다.

20℃ 에서, PAM 세포는 광억제로부터의 광화학 시스템 II 복합체의 회복성을 약간만 나타낸다. 그러나, PAMCOD 세포는, 2 시간 후, 원래의 60% 수준으로 회복하였다 (도 17A). 30℃ 에서는, 두 균주의 세포 모두, 2 시간 후, 광화학 시스템 II 의 활성을 완전히 회복하였다. 그러나, PAMCOD 세포가 PAM 세포보다 훨씬 빠르게 회복하였다 (도 17B).

실시예 22: 저온에서 암조건하의 광합성의 비활성화

저온성 스트레스에 대한 PAM 및 PAMCOD 세포의 내성을 암조건하에 저온에서 비교한다. 다양한 저온 처리가 두 세포내의 실질적인 광합성 비활성화 및 광화학 시스템 II 에 의해 중재되는 전자 전달에 미치는 영향을 도 18 에 나타내었다. PAMCOD 세포의 광합성에 의한 산소 발생 활성이 PAM 세포의 것보다 저온에 대한내성이 보다 강했다 (도 18A). 광화학 시스템 II 에 의해 중재되는 전자 전달에서도 유사한 결과가 수득되었다. PAM 세포의 활성은 5℃ 에서 원래의 50% 수준으로 감소한 반면, PAMCOD 세포의 활성은 5℃ 에서 대조군의 것과 거의 동일한 수준을 유지하고 5℃ 이하에서 감소하기 시작한다 (도 18B). 상기 결과는 PAMCOD 세포의 광합성이 PAM 세포의 것보다 저온에 대한 내성이 보다 강함을 보여준다.

실시예 23: 원형질 막의 상 변이

저온에 노출된 시아노박테리아 세포가, 액체 결정 상태에서 상 분리 상태로의 원형질 막의 지질상 변이로 인해, 증식 또는 광합성 활성을 감소시키는 것으로 알려져 있다 (Murata, N., J. Bioenerg. Biomembr. 21:61-75, 1989). PAMCOD 세포의 저온에 대한 내성의 향상이 막의 지질 상의 변이와 연관되는지의 여부를 조사하기 위한 시험을 실시한다.

원형질 막의 지질 상 변이를, 388 nm 에서의 시네코코커스 PCC7942 및 PCC6301 [이전엔 아나시스티스 니듈란스 (Anacystis nidulans) 라 불림] 의 흡광도 변화를 모니터함으로써, 제아크산틴 (zeaxanthin) 의 응집을 통해 시험할 수 있다 (Brand, J.J., Plant Physiol. 59:970-973, 1977; Gombos, Z. et al., Plant Physiol. 80:415-419, 1986; Murata N., J. Bioenerg. Biomembr. 21:61-75, 1989; Ono, T. et al., Plant Physiol. 67:176-181, 1981; Wada, H. et al., Nature 347:200-203, 1990; Yamamoto, H.Y. et al., Biochim. Biophys. Acta 507:119-127, 1978). 도 19 는 유사한 방법으로 시험한 PAM 세포 및 PAMCOD 세포로부터의 결과를 보여준다. 도 19 는 PAM 세포의 막 지질의 상 변이가 10℃ 에서 일어나며, 2℃ 에서 종결되고, 중간 온도는 6℃ 임을 보여준다. 한편, PAMCOD 의 막 지질의 변이는 5℃ 에서 시작된다. 이는 PAMCOD 세포의 원형질 막의 지질 변이가 PAM 세포보다 5℃ 낮은 온도에서 일어남을 의미한다.

실시예 24: 막 지질 및 단백질의 변화

시아노박테리아의 막 지질의 변이 온도가 지방산의 불포화도 및 지질의 성질에 따라 달라진다는 것이 공지되어 있다 (Murata, N., J. Bioenerg. Biomembr. 21:61-75, 1989). 따라서, PAMCOD 세포의 막 지질을 시험하였다. 표 1 및 2 는 PAM 및 PAMCOD 세포의 원형질막 및 틸라코이드막내의 지방산 및 글리세롤지질의 성분을 보여준다. 표 1 은 1 mM 콜린 클로라이드의 존재하에 30℃ 에서 증식한 세포내의 지질 조성을 보여준다. 표 2 는 1 mM 콜린 클로라이드의 존재하에 30℃ 에서 증식한 세포내의 글리세롤지질 조성을 보여준다.

지방산 14:0 14:1 16:0 16:1 18:0 18:1(9) 18:1(11)

(몰 %) 원형질막 PAM 1 1 54 36 3 2 2 PAMCOD 2 2 53 38 2 2 2 틸라코이드막 PAM 1 2 52 40 2 2 2 PAMCOD 1 2 50 40 2 2 2

약어: 14:0: 미리스트산 14:1: Δ9-미리스트산 16:0: 팔미트산 16:1: Δ9-팔미트산 18:0: 스테아르산 18:1(9): Δ9-스테아르산 18:1(11): Δ11-스테아르산 모든 이중결합은 시스 (cis) 형태임.

틸라코이드막 원형질막 지질 종류 PAM PAMCOD PAM PAMCOD

(몰 %) (몰 %) MGDG 54 53 56 55 DGDG 22 23 19 19 SQDG 14 14 15 15 PG 10 10 10 11

약어: MGDG: 모노갈락토실 디아실글리세롤 DGDG: 디갈락토실 디아실글리세롤 SQDG: 술포퀴노보실 디아실글리세롤 PG: 포스파티딜글리세롤

표 1 및 2 에서 볼 수 있듯이, 둘 사이에는 뚜렷한 차이점이 관찰되지 않았다.

도 20 은 PAM 및 PAMCOD 세포의 막 및 수용성 분획의 단백질 전기영동 패턴을 보여준다. 막 분획에서 약간의 차이점이 관찰되었다. 즉, PAMCOD 세포에서 14kda 의 단백질 양 증가 및 16 kda 의 단백질 양 감소가 나타났다. 수용성 분획에서는, PAMCOD 세포가 콜린 산화효소에 해당하는 밴드를 보인 것 외에, 다른 차이점은 발견되지 않았다.

따라서, PAM 및 PAMCOD 세포간의 막 지질 또는 단백질에서 뚜렷한 차이점이 발견되지 않았는데, 이는 저온에서 볼 수 있는 PAMCOD 세포의 광화학 시스템 II 의 보호는 베타인의 영향에 의한 것임을 나타낸다.

(2) 서열 번호 : 1

(i) 서열의 특성

(A) 서열의 길이 : 2400

(B) 서열의 타입 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 2본쇄

(D) 토폴로지 : 선형

(ii) 분자의 타입 : DNA

(ix) 서열의 특징

(A) 특징을 나타내는 기호 : mat peptide

(B) 존재 위치 : 361..2002

(xi) 서열의 기재방법

Claims

콜린 산화효소를 코딩하는 유전자를 수반하는 재조합 벡터로 식물을 형질전환시키는 것으로 구성된 내온도성 식물의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 콜린 산화효소를 코딩하는 유전자가 토양 박테리아 아르트로박테르 (Arthrobacter) 로부터 유래되는 방법.
제 1 항 또는 2 항에 있어서, 콜린 산화효소를 코딩하는 유전자가 서열 목록에 나와 있는 서열 번호: 1 의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이거나, 또는 상기 아미노산 서열이 콜린 산화효소 활성을 갖는 단백질을 코드한다는전제하에, 상기 아미노산 서열에 하나 이상의 아미노산이 첨가, 결실 및/또는 치환된 뉴클레오티드 서열인 방법.
제 1 항 내지 3 항중 어느 한 항에 있어서, 내온도성 식물이 광합성 식물인 방법.
제 1 항 내지 4 항중 어느 한 항에 있어서, 내온도성 식물이 시아노박테리움인 방법.
제 1 항 내지 4항중 어느 한 항에 있어서, 내온도성 식물이 고등 식물인 방법.
제 6 항에 있어서, 고등 식물이 쌍자엽 식물인 방법.
제 7 항에 있어서, 쌍자엽 식물이 브라시카세우스 (brassicaceous) 식물인 방법.
제 6 항에 있어서, 고등 식물이 단자엽 식물인 방법.
제 9 항에 있어서, 단자엽 식물이 볏과 (gramineous) 식물인 방법.
제 1 항의 방법에 의해 제조된 내온도성 식물, 또는 동일한 성질을 갖는 그의 자손.
제 1 항의 방법에 의해 제조된 내온도성 식물로부터 수득된 식물 세포 또는 식물 일부 및 그의 자손, 또는 동일한 성질을 갖는 그의 자손.
콜린 산화효소를 코딩하는 유전자를 함유하는 내온도성 식물, 또는 동일한 성질을 갖는 그의 자손.
내온도성 식물의 제조에 있어서 콜린 산화효소를 코딩하는 유전자의 사용.