DE69637510T2

DE69637510T2 - Verfahren zur herstellung temperatur-toleranter pflanzen

Info

Publication number: DE69637510T2
Application number: DE69637510T
Authority: DE
Inventors: Norio Murata
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Holdings Ltd
Priority date: 1995-12-28
Filing date: 1996-12-27
Publication date: 2009-06-10
Anticipated expiration: 2016-12-28
Also published as: US6756525B1; AU719618B2; WO1997024026A1; DE69637510D1; ATE393231T1; EP0891702B1; CN1185349C; JP3961026B2; AU1210197A; KR19990076833A; EP0891702A1; EP0891702A4; HK1016027A1; NZ324836A; ES2304789T3; CN1207645A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit neuen Eigenschaften, genauer ein Verfahren zur Herstellung von temperaturtoleranten Pflanzen, die gegenüber Umgebungsstress hoch resistent sind.
Stand der Wissenschaft
Viele Organismen adaptieren sich an starkem Umgebungsstress, in dem sie eine spezifische Verbindung, die „kompatibler gelöster Stoff" genannt wird, in ihrem Cytoplasma synthetisieren und akkumulieren, um sich gegen solchen Stress zu schützen. Umgebungsstress, von dem gezeigt wurde, dass sich Organismen durch einen solchen Mechanismus adaptieren, beinhalten Salze (Imhoff et al., FEMS Microbiol. Rev. 39: 57–66; Mackay et al., J. Gen. Microbiol. 130: 2177–2191, 1984; Rhodes und Hanson, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 44: 357–384, 1993), Dehydrierung (Yancy et al., Science 217: 1214–1222, 1982) und niedrige Temperaturen (Ko et al., J. Bacteriol. 176: 426–431, 1994).
Unter diesen kompatiblen gelösten Stoffen ist Glycinbetain (hier im Folgenden als Betain bezeichnet) in höheren Pflanzen (Robinson und Jones, Aust. J. Plant Physiol. 13: 659–668, 1986), Bakterien (Csonka, Microbiol. Rev. 53: 121–147, 1989) und Tieren (Garcia-Perez und Burg, Physiol. Rev. 71: 1081–1115; Lever et al., Biochim. Biophys. Acta. 1200: 259–264, 1994) weit verbreitet. Wie in 1 gezeigt wird, ist Betain eine bipolare Verbindung mit einer positiven Ladung und einer negativen Ladung in ihren Molekülen (Rhodes und Hanson, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 44: 357–384, 1993). Eine lange Diskussion bezüglich der physiologischen Funktionen von Betain hat nahe gelegt, dass Betain durch Erhaltung eines osmotischen Gleichgewichtes mit der Umgebung Zellen schützen könnte (Robinson und Jones, Aust. J. Plant Physiol. 13: 659–668, 1986) und dass Betain Strukturen von Proteinen höherer Ordnung stabilisieren könnte (Bernard et al., Acad. Sci. 111, 307: 99–104, 1988; Papageorgiou and Murata, Phtosynth. Res. 44: 243–252, 1995). Betain wird jedoch nicht ausschließlich in Zellen unter Salzstress oder Dehydrierungsstress synthetisiert. So konnte nicht geschlossen werden, dass Betain einen direkten Effekt auf den Schutz von Zellen gegen einen solchen Stress aufweist.
In Escherichia coli und Spinat (Spinacia oleracea) wird Betain aus Cholin über zwei Oxidationsschritte biosynthetisiert, wie in 1 gezeigt wird. Auf der anderen Seite kann Cholinoxidase, die aus dem Gram-positiven Erdbakterium Arthrobacter globiformis erhalten wird, Cholin in einer Ein-Schritt-Oxidationsreaktion zu Betain oxidieren (Ikuta, S. et al., J. Biochem. 82: 1741–1749, 1977).
Bei einem Versuch, einen direkten Effekt von Betain zu untersuchen, isolierten wir das codA-Gen, das eine neue Cholinoxidase kodiert, die die Oxidation von Cholin zu Betain katalysiert (Japanese Society of Plant Physiologist, Annual meeting of 1994, the 34th Symposium held March 28–30, 1994) und integrierten sie in Zellen des Cyanobakteriumstammes Synechococcus PCC7942 und kohlartige Pflanzen, wodurch sie erfolgreich bei dem Erhalt von salztoleranten und/oder osmotoleranten Pflanzen waren ( Japanische Patentanmeldung Nr. 106819/95 ). Dies bestätigte, dass Betain wirkt, um Organismen gegen Salzstress zu schützen.
Kein Bericht hat jedoch gezeigt, dass Betain Temperaturtoleranz für Pflanzen oder Bakterien verleiht.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Pflanzen herzustellen, die tolerant gegenüber Umgebungsänderungen, wie hohen Temperaturen oder niedrigen Temperaturen, durch Gen-Rekombinationstechniken sind.
Offenbarung der Erfindung
Als ein Ergebnis sorgfältiger Studien, um die obigen Probleme zu lösen, hatten wir Erfolg bei dem Erhalt von temperaturtoleranten Pflanzen durch Integration und Expression eines Gens, das Cholinoxidase in kohlartigen Pflanzen und Graspflanzen kodiert.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von temperaturtoleranten Pflanzen bereit, welches die Transformation einer höheren Pflanze mit einem rekombinanten Vektor, der ein Gen trägt, das Cholinoxidase kodiert, umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt auch temperaturtolerante Pflanzen bereit, die durch das Verfahren hergestellt wurden, oder Vorläufer davon mit denselben Eigenschaften.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1: Schematische Darstellung, die den Oxidationsprozess von Cholin zu Betain zeigt.
2A: (nur zur Referenz) Schematische Darstellung, die Konstrukte zeigt, die für die Transformation von Synechococcus PCC7942 verwendet werden. PAM bezieht sich auf Synechococcus PCC7942, transformiert mit pAM1044, und PAMCOD bezieht sich auf Synechococcus PCC7942, transformiert mit pAM1044, das das codA-Gen trägt. Gestrichelte Pfeile weisen auf Primer hin, die für die PCR verwendet werden. Dreiecke stellen den conII-Promotor dar. Pfeile weisen auf die Orientierung von Genen hin.
2B: (nur zur Referenz) SDS-PAGE (Fotografie von Elektrophorese), die den kompletten Ersatz von Chromosomen durch das Spectinomycin-resistente Gen und codA-Gen in DNA von Synechococcus PCC7942 zeigt. Bahn a: λ-HindIII/ϕx174-HaeIII-Fragment; Bahn b: der Wildtyp-Stamm von Synechococcus PCC7942; Bahn c: der Stamm PAM; Bahnen d und e: der Stamm PAMCOD (Bahnen b, c und d zeigen die Ergebnisse der PCR mit den Primern 1 und 2, und Bahn e zeigt die Ergebnisse der PCR mit den Primern 1 und 3).
3: (nur zur Referenz) Westernblot-Analyse (Fotografie der Elektrophorese), die die Expression von Cholinoxidase in den Synechococcus PCC7942-Stämmen PAM und PAMCOD zeigt. Bahn a: Proteinextrakte aus dem Stamm PAMCOD; Bahn b: Proteinextrakte aus dem Stamm PAM; Bahn c: gereinigte Cholinoxidase.
4: (nur zur Referenz) Ergebnisse des Wachstums von Synechococcus PCC7942-Stämmen, die bei verschiedenen Temperaturen für 10 Tage auf einer Agar-Platte in BG 11-Medium, ergänzt mit 1 mM Cholinchlorid gezüchtet wurden (Fotografien zeigen die Morphologie von Organismen). 1 und 4: PAM-Stamm; 2 und 3: PAMCOD-Stamm.
5: (nur zur Referenz) Wachstum der Synechococcus-Stämme PCC7942 PAM (O) und PAMCOD
in BG11-Medium, ergänzt mit 1 mM Cholinchlorid unter Beleuchtung. A: Wachstum bei 42°C; B: Wachstum bei 20°C.
6: (nur zur Referenz) Photosynthetische Sauerstoff-Freisetzungsspiegel aus den Synechococcus-Stämmen PCC7942 PAM (O) und PAMCOD
die bei niedrigen Temperaturen in der Gegenwart von 1 mM NaHCO₃ (A) oder in der Gegenwart von 1,4-Benzochinon und 1 mM K₃Fe(CN)₆ (B) gezüchtet wurden.
7: Schematische Darstellung, die die Restriktionsenzymkarte des codA-Gens zeigt.
8: Schematische Darstellung, die die Struktur des binären Vektorplasmids pGAH/codA zeigt, der für die Transformation von Arabidopsis verwendet wurde.
9: Westernblot-Analyse (Fotografie der Elektrophorese) von Cholinoxidase in löslichen Fraktionen der Wildtyp- und transformierten Pflanzen von Arabidopsis. Bahn 1: Cholinoxidase, stammend aus kommerziell erhältichen Arthrobacter globiformis (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA); Bahn 2: lösliche Fraktion der Wildtyppflanze; Bahn 3: lösliche Fraktion einer transformierten Pflanze.
10: Einfluss von niedriger Temperatur auf fotochemisches System II in Blättern der Wildtyp- und transformierten Pflanzen von Arabidopsis. (O): Wildtyp-Pflanze;
transformierte Pflanze.
11: Inhibition der Photosynthese bei niedriger Temperatur (A) und Erholung von der Inhibition der Photosynthese bei niedriger Temperatur (B) in Blättern der Wildtyp- und transformierten Pflanzen von Arabidopsis. (O): Wildtyp-Pflanze;
transformierte Pflanze.
12: Ergebnisse von Gefrier-Resistenz-Tests auf Blätter der Wildtyp- und transformierten Pflanzen von Arabidopsis. (O): Wildtyp-Pflanze;
transformierte Pflanze.
13: Einfluss von niedriger Temperatur im Wasser-Absorptionsstadium bei der Keimung von Saaten der Wildtyp- und transformierten Pflanzen von Arabidopsis (Fotografien zeigen die Morphologie der Organismen). A: Saaten, die ohne Niedrigtemperaturbehandlung im Wasser-Absorptionsstadium keimten; B: Saaten, die nach Niedrigtemperaturbehandlung im Wasserabsorptionsstadium keimten. Sowohl bei A wie auch bei B zeigte W auf der linken Seite die Ergebnisse von Saaten der Wildtyp-Pflanze und T auf der rechten Seite zeigt die Ergebnisse von Saaten der transformierten Pflanze.
14: Strukturen von zwei chimären codA-Genen, die für die Transformation von Reis verwendet wurden, sprich 35SINTPcodA und 35SINcodA.
15: NMR-Diagramme, die die Betain-Akkumulierung in Reispflanzen des Wildtyp-Stammes, einer Transformante (A), die das codA-Gen nicht exprimiert, und einer Transformante (B), die das codA-Gen exprimiert, darstellen. In den Figuren stellen GB und Ch Peaks dar, die zu Betain bzw. Cholin korrespondieren.
16: (nur zur Referenz) Effekt der Einführung des codA-Gens in Synechococcus PCC7942 auf den Electron-Transport, der durch das fotochemische System II vermittelt wird, in Begriffen der relativen Werte gegen die maximale Aktivierung, die bei 100% angenommen wird. (O): PAM-Zellen unter Beleuchtung;
PAMCOD-Zellen unter Beleuchtung; (☐): PAM-Zellen in der Dunkelheit;
PAMCOD-Zellen in der Dunkelheit.
17: Erholung des Electron-Transportes, der durch das fotochemische System II vermittelt wird, von der Fotoinhibition bei niedriger Temperatur, wenn das codA-Gen in Synechococcus PCC7942 eingeführt wurde. (O): PAM-Zellen unter Beleuchtung;
PAMCOD-Zellen unter Beleuchtung.
18: (nur zur Referenz) Effekt von Niedrigtemperatur-Behandlung unter dunklen Bedingungen auf die photosynthetische Sauerstoff-Freisetzung, wenn das codA-Gen in Synechococcus PCC7942 eingeführt wurde. (O): PAM-Zellen unter Beleuchtung;
PAMCOD-Zellen unter Beleuchtung.
19: (nur zur Referenz) Effekt von Niedrigtemperatur-Behandlung auf die Lipidphasen-Transition, wenn das codA-Gen in Synechococcus PCC7942 eingeführt wurde. (O): PAM-Zellen unter Beleuchtung;
PAMCOD-Zellen unter Beleuchtung.
20: (nur zur Referenz) Electrophoretogramm, das die Änderungen an Protein in den löslichen Fraktionen und Membranfraktionen zeigt, wenn das codA-Gen in Synechococcus PCC7942 eingeführt wurde. Bahn 1: Cholinoxidase; 2: protoplasmatische Membran von PAM-Zellen; 3: protoplasmatische Membran von PAMCOD-Zellen; 4: Thylakoidmembran von PAM-Zellen; 5: Thylakoidmembran von PAMCOD-Zellen; 6: lösliche Fraktion von PAM-Zellen; 7: lösliche Fraktion von PAMCOD-Zellen. Ein Pfeil weist auf Cholinoxidase hin.
Die besten Ausführungsarten der Erfindung
Wie hier verwendet, bedeutet Temperaturtoleranz eine Fähigkeit einer transformierten Pflanze, bei höheren oder niedrigeren Temperaturen zu wachsen, als den Temperaturen, die es normalerweise der nicht Transformierten erlauben zu wachsen.
Das Gen, das Cholinoxidase kodiert, das bei der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist ein Gen, das ein Protein kodiert, das in der Lage ist, Cholin zu Betain in einer Ein-Schritt-Reaktion zu konvertieren, und das aus Gram-positiven Erdbakterien der Gattung Arthrobacter, namentlich Arthrobacter globiformis und Arthrobacter pascens, insbesondere Arthrobacter globiformis, stammt.
Wir klonierten das codA-Gen, das Cholinoxidase kodiert, aus Arthrobacter globiformis und bestimmten seine Nucleotidsequenz. Das codA-Gen enthält einen offenen Leserahmen von 1.641 bp, der 547 Aminosäuren kodiert. Die Nucleotidsequenz und Aminosäuresequenz des codA-Gens werden als SEQ ID Nr. 1 im Sequenzprotokoll gezeigt.
Ein solches Gen, das Cholinoxidase kodiert, kann in geeignete Vektoren integriert werden, um eine Pflanze zu transformieren. Dann kann ein geeigneter Promotor oder eine Sequenz, die in die Expression eines Merkmales involviert ist, in diese Vektoren eingeführt werden, um das Gen in der Pflanze zu exprimieren.
Das Gen, das Cholinoxidase kodiert, kann nicht nur die Nucleotidsequenz enthalten, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1 im Sequenzprotokoll kodiert, sondern auch Nucleotidsequenzen, bei denen ein oder mehrere Aminosäuren zugefügt, deletiert oder substituiert in der Aminosäuresequenz wurden, vorausgesetzt, dass sie ein Protein kodieren, das Cholinoxidase-Aktivität aufweist.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann Temperaturtoleranz einer großen Bandbreite von Pflanzen verleihen, die von Cyanobakterien zu höheren Pflanzen reichen. Cyanobakterien werden breit als Modellorganismen für höhere Pflanzen verwendet, da sie grundsätzlich den gleichen photosynthetischen Mechanismus wie denjenigen von höheren Pflanzen aufweisen, und sie einfach transformiert werden können, um Ergebnisse in einer kurzen Zeit zu liefern. Einige einfach zu transformierende Cyanobakterien nehmen bereitwillig extrazelluläre DNA in ihre Zellen auf, um effiziente Rekombinationen hervorzurufen. Solche Cyanobakterien beinhalten Synechococcus PCC7942, Synechococcus PCC6301 (ATCC 27144) und Synechocystis PCC6803 (ATCC 27184) (Protein, Nucleic Acid, Enzyme, Vol. 35, Nr. 14, S. 2542–2551, 1991; Crit. Rev. Microbiol. Vol. 13, Nr. 1, S. 111–132, 1985). Sie werden hier nur zur Referenz verwendet.
Höhere Pflanzen beinhalten Dicotyledone und Monocotyledone. In den Beispielen, die unten beschrieben werden, konnten hochtemperaturtolerante Pflanzen aus kohlartigen Pflanzen, wie einem Dicotyledon, erhalten werden, aber dies ist nicht begrenzend und andere Familien und Gattungen von Dicotyledonen können verwendet werden. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann auch auf Monocotyledone anwendbar sein. Es wurde herausgefunden, dass ein monocotyledoner Pflanzenreis, dem es ursprünglich an Betain-synthetisierender Fähigkeit fehlte, diese Fähigkeit nach Transformation durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erwarb.
Der Vektor, in den das Cholinoxidase-kodierende Gen integriert werden kann, und das Verfahren zur Transformation und Selektion von transformierten Pflanzen kann passend ausgewählt werden, abhängig von der Natur der Pflanze, die transformiert werden soll, einschließlich Pflanzenzellen.
Zum Beispiel kann ein Plasmid, wie pCU303, für Cyanobaktieren verwendet werden. Dann können Transformanten, die die erwünschten Eigenschaften aufweisen, durch ein Antibiotika-Resistenzgen, das in das Plasmid inseriert wurde, ausgewählt werden. Pflanzen, die sowohl Toleranz gegenüber hohen und niedrigen Temperaturen zeigten, wurden erfolgreich durch Transformation des Cyanobakteriums Synechococcus PCC7942 mit dem codA-Gen, das Cholinoxidase kodiert, das von Arthrobacter globiformis stammte, erhalten.
Als das Synechococcus PCC7942, transformiert mit dem codA-Gen, in BG11-Medium, ergänzt mit Cholinchlorid, kultiviert wurde, wurde herausgefunden, dass transformierter Synechococcus exogen zugefügtes Cholin aufnahm, um es in Betain zu konvertieren und Beatin bis zu einem Spiegel von ungefähr 80 mM zu akkumulieren. Eine solche Akkumulierung wurde jedoch nicht bei einer Kontrollgruppe von Synechococcus-Stamm, dem es an dem codA-Gen fehlte, beobachtet.
Als der Synechococcus-Stamm, der mit dem codA-Gen transformiert wurde, und eine Kontrollgruppe des nicht transformierten Stammes in BG11-Medium, ergänzt mit Cholinchlorid, bei 42°C kultiviert wurden, um ihre Reaktion auf hohe Temperaturen zu untersuchen, hörte der transformierte Synechococcus für einen Tag auf zu wachsen und begann dann wieder zu wachsen. Die nicht transformierte Kontrollgruppe wuchs bei 42°C überhaupt nicht. Als sie bei 20°C kultiviert wurden, um ihre Reaktion auf niedrige Temperaturen zu untersuchen, wuchs der transformierte Stamm langsam für vier Tage, aber begann dann schnell zu wachsen. Die nicht transformierte Kontrollgruppe wuchs jedoch sogar nach vier Tagen weiterhin sehr langsam. Ein Wachstumstest, der ein festes Medium verwendete, zeigte auch, dass der transformierte Stamm sowohl bei hohen wie auch bei niedrigen Temperaturen im Vergleich mit dem nicht transformierten Stamm gut wuchs. Diese Ergebnisse enthüllten, dass der Synechococcus-Stamm, der mit dem codA-Gen transformiert wurde, signifikant besser wächst als der nicht transformierte Stamm, sowohl bei hohen wie auch bei niedrigen Temperaturen.
Es wurde darauf hingewiesen, dass Betain nicht nur als ein Osmoprotektant wirkt, sondern auch eine wesentliche Rolle bei dem Schutz eines photosynthetischen Mechanismus bei photoautotrophen Organismen spielt (Murata et al., FEBS Lett. 296: 187–189, 1992). So wurde der transformierte Synechococcus-Stamm und der nicht transformierte Stamm in der Dunkelheit bei verschiedenen niedrigen Temperaturen kultiviert, um die Temperaturtoleranz der Photosynthese zu untersuchen. Als ein Ergebnis wurde eine große Differenz zwischen dem transformierten und dem nicht transformierten Stamm bei dem photosynthetischen Sauerstoff-Freisetzungsspiegel und bei der Inaktivierung von Elektronentransport, der durch das fotochemische System II in Zellen bei niedrigen Temperaturen vermittelt wird, beobachtet. Namentlich der photosynthetische Sauerstoff-Freisetzungsspiegel des transformierten Stammes war gegenüber niedrigen Temperaturen toleranter als der des nicht transformierten Stammes. Die Elektron-Transport-Aktivität, die durch das fotochemische System II in Zellen des transformierten Stammes vermittelt wird, war auch gegenüber niedrigen Temperaturen toleranter als diejenige des nicht tranfsormierten Stammes, sprich die Aktivität des nicht transformierten Stammes wurde auf 50% des ursprünglichen Spiegels bei 5°C gesenkt, während die Aktivität des transformierten Stammes bei fast dem ursprünglichen Spiegel bei 5°C verblieb und unter 5°C abzunehmen begann.
Es war zuvor bekannt, dass die optimale Temperatur für das Wachstum von Synechococcus PCC7942 in dem Bereich von 30 bis 38°C liegt. So wurde geschlossen, dass der nicht transformierte Stamm durch die Denaturierung der Strukturen von einigen Proteinen bei solch einer hohen Temperatur wie 42°C am Zellwachstum gehindert wird. Der transformierte Stamm, der das codA-Gen trug, konnte jedoch vermutlich wachsen, da ungefähr 80 mM Betain, das in Zellen akkumulierte, die Denaturierung von Proteinen verhinderte. Bei 20°C konnte der nicht transformierte Stamm nicht wachsen, aber der transformierte Stamm, in den das codA-Gen integriert worden war, konnte wachsen. Dies könnte auch aus der Akkumulierung von Betain resultieren. Weiter glaubt man, dass Betain-Akkumulierung in Zytoplasma die Toleranz von cyanobakteriellen Zellen gegenüber niedrigen Temperaturen in der Dunkelheit steigert. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf einen solchen Wirkmechanismus begrenzt.
Diese Ergebnisse bedeuten, dass dem Synechococcus, der mit dem Gen transformiert wurde, das Cholinoxidase kodiert, eine ausgezeichnete Toleranz sowohl gegenüber hohen wie auch niedrigen Temperaturen verliehen wurde.
Dicotyledone können durch Gentransfer-Techniken, die Protoplasten oder einen Teil des Gewebes verwenden, transformiert werden. Im Falle des Gentransfers unter Verwendung von Gewebefragmenten kann das Ti-Plasmid von Agrobacterium verwendet werden. Gewebefragmente einer callösen Pflanze können mit Agrobacterium, in das das Cholinoxidase-kodierende Gen integriert wurde, infiziert werden, durch Resistenz gegenüber einen Antibioticum, wie Canamycin, ausgewählt werden, und dann in Schösslingen differenziert werden, um eine transformierte Pflanze zu ergeben. Bei der vorliegenden Erfindung konnte eine hochtemperaturtolerante Pflanze durch Transformation der kohlartigen Pflanze Arabidopsis thaliana mit dem Cholinoxidase-kodierenden Gen, wie folgt, erhalten werden.
Es wurde ein binäres Vektorplasmid pGAH-codA, das das codA-Gen trug, hergestellt und in Agrobacterium tumefaciens EHA101, das das Ti-Plasmid trug, integriert. Hypocotylcalli von Arabidopsis wurden mit dem resultierenden Agrobacterium EHA101 (pGAH/codA), das das codA-Gen in sich trug, infiziert, dann wurden Schösslinge gebildet und durch Kanamycin und Hygromycin-Resistenz ausgewählt, um Wurzeln zu induzieren und Samen zu bilden. Die Pflanzen, die aus dem resultierenden heterocygoten T2-Samen erhalten wurden, wurden selbstbefruchtet, um homocygote T3-Individuen zu ergeben, die ausgesät wurden, um eine transformierte Pflanze zu ergeben.
Die so erhaltene transformierte Pflanze zeigte, dass Cholinoxidase zu den Chloroplasten transportiert wurde. Als die Cholin- und Betain-Spiegel in dem Blatt gemessen wurden, wurde nur Cholin in der Wildtyppflanze beobachtet, während sowohl Cholin wie auch Betain in der transformierten Pflanze beobachtet wurden, was nahelegt, dass Betain in Pflanzen durch Transfer des codA-Gens akkumuliert wird. Die transformierte Pflanze zeigte eine bemerktenswerte Temperaturtoleranz, wenn sie mit Wildtyp verglichen wurde.
Die monocotyledone Pflanze Reis (Oryza sativa L. cv. Nippon bare) kann mit z. B. zwei chimären codA-Genen, die auf dem Plasmid pUC119 hergestellt werden, welches im Cytosol oder Plastid nach der Translation unter transkriptioneller Kontrolle des Blumenkohl-Mosaik-Virus 35S-Promotors lokalisiert ist, transformiert werden. Beide chimäre Gene beinhalten ein vom Reis stammendes Intron in der 5' nicht translatierten Sequenz, um den Expressionsspiegel zu steigern.
Ein transformierter Reis kann durch das folgende Vorgehen hergestellt werden. Namentlich kann eine transformierte Pflanze durch Einführung der chimären codA-Gene in Suspensionskulturzellen von Scutellum-Calli von Reissaaten zusammen mit einem Selektionsmarker-Hygromycin-Resistenzgen durch ein Teilchenkanonen-Gerät, dann Auswahl der transformierten Calli, basierend auf der antibiotischen Resistenz, und Redifferenzierung von ihnen zu einer Pflanze erhalten werden.
Obwohl es dem Wildtyp-Reis an Betain-synthetisierender Fähigkeit mangelt, erwarb der Reis, der durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung transformiert wurde, Betain-synthetisierende Fähigkeit. Der transformierte Reis, der das codA-Gen exprimierte, wuchs ähnlich wie die nicht transformierte Pflanze ohne irgendwelche offensichtlichen Abnormitäten unter sowohl geoponischen wie auch hydroponischen Bedingungen zu zeigen. Dies könnte darauf schließen lassen, dass Wasserstoff-Peroxid, das als Nebenprodukt der Betainsynthese gebildet wurde, effizient in den Zellen entgiftet wurde. Im Hinblick auf die Beziehung zwischen Erwerb von Betain-synthetisierender Fähigkeit und Temperaturtoleranz bei Cyanobakterien und Dicotyledonen, kann von dem transformierten Reis, der durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wurde, erwartet werden, dass er auch Temperaturtoleranz erworben hat. Dies ist der erste Fall, in dem Reis eine Betain-synthetisierende Fähigkeit durch gentechnische Techniken erworben hat.
Als die Erholung des fotochemischen Systems II von transformierten und nicht transformierten Pflanzen, nachdem sie unter dunkle Bedingungen platziert wurden, in Experimenten unter Verwendung von Synechococcus verglichen wurde, erholte sich die transformierte Pflanze schneller, was darauf hinweist, dass die Gegenwart von Betain die Erholung des fotochemischen Systems II beschleunigte. Es wurde auch gezeigt, dass die Photosynthese der transformierten Pflanze toleranter gegenüber niedrigen Temperaturen ist, als diejenige der nicht transformierten Pflanze. Im Hinblick darauf, dass kein großer Unterschied im Membranlipid und Protein zwischen der transformierten Pflanze und der nicht transformierten Pflanze gefunden wurde, schien der Schutz des fotochemischen Systems II, der in der transformierten Pflanze bei niedrigen Temperaturen beobachtet wurde, ein Effekt von Betain zu sein.
Der Umfang der vorliegenden Erfindung deckt nicht nur temperaturtolerante Pflanzen, die wie oben beschrieben hergestellt wurden, oder Abkömmlinge davon mit denselben Eigenschaften ab, sondern auch Pflanzenzellen (z. B. Callus-kultivierte Zellen) und Pflanzenteile (z. B. Blumen, Saaten, Früchte, Knollen etc.), die davon erhalten werden, wie auch Nachkommen davon.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können temperaturtolerante transformierte Pflanzen, die hochresistent gegenüber Umgebungsstress sind, erhalten werden. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um Pflanzen herzustellen, die unter Hochtemperatur- oder Niedrigtemperatur-Bedingungen, unter denen Pflanzen normalerweise nicht wachsen können, wachsen können. Die Bandbreite an Pflanzen, auf die Temperaturtoleranz durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung übertragen werden kann, ist sehr weit, sprich erstreckt sich auf höhere Pflanzen. Insbesondere ist die vorliegende Erfindung gewerblich sehr nützlich, da sie der erste Fall ist, in dem stabil transformierte Pflanzen von Monocotyledonen, einschließlich den meisten Hauptanbaupflanzen erhalten und auf ihre Betainsynthese bestätigt wurden.
Das Verfahren zur Herstellung von temperaturtoleranten Pflanzen gemäß der vorliegenden Erfindung ist sehr nützlich, da es verwendet werden kann, um Pflanzen herzustellen, die sowohl hohe wie auch niedrige Temperaturen tolerieren können. Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung ausführlicher, aber sie sollten nicht so aufgefasst werden, dass sie den Umfang davon begrenzen.
Beispiele
Beispiel 1: Transformation des Cyanobakteriums
Synechococcus PCC7942 mit dem codA-Gen (nur zur Referenz)
(1) Klonierung des codA-Gens
Das Cholinoxidasegen wurde aus Arthrobacter globiformis durch das Verfahren, das in den Abstracts of Oral Reports, veröffentlicht in dem 34th symposium of the annual meeting of the Japanese Society of Plant Physiologists, 1994, beschrieben wurde, isoliert. In Kürze wird 1) Cholinoxidase mit Cyanogenbromid fragmentiert, 2) die N-terminale Aminosäuresequenz eines geeigneten Fragments bestimmt, 3) geeignete Anteile von der Aminosäure-Teilsequenz ausgewählt, um Oligonucleotide, die dazu korrespondieren, zu synthetisieren, 4) eine partielle Sequenz des Cholinoxidasegens durch PCR (Polymerase-Kettenreaktion) unter Verwendung dieser Oligonucleotide als Primer amplifiziert, 5) die amplifzierte Teilsequenz des Cholinoxidasegens als eine Sonde verwendet, um die genomische DNA-Bibliothek von Arthrobacter globiformis zu screenen.
So erhaltene positive Klone wurden in das Plasmid pBluescript (SK⁺) (Stratagene) subkloniert, um positive Klone zu isolieren, die Southernblot-Analyse unterworfen wurden. Ein 3,6 kbp XbaI-XhoI-Fragment, das mit der Sonde hybridisierte, wurde in pBluescript subkloniert und mit Restriktionsenzymen kartiert. Die Nucleotidsequenz der Region, die sich von dem ersten SalI-Ort bis zum XhoI-Ort (ungefähr 2,5 kbp) erstreckte, wurde bestimmt.
Die Ergebnisse zeigten, dass das Cholinoxidasegen einen offenen Leserahmen von 1.641 bp enthält, der ein Polypeptid von 547 Aminosäureresten kodiert. Die Aminosäuresequenz und die Nucleotidsequenz des Cholinoxidase-kodierenden Gens werden in SEQ ID Nr. 1 im Sequenzprotokoll gezeigt.
(2) Transformation von Synechococcus PCC7942 mit dem codA-Gen
Das Plasmid pBluescript, das das codA-Gen trug, wurde mit den Restriktionsenzymen BstEII (an Position -40 von dem Translationsursprung) und SmaI (stromabwärts des Stop-Codons) verdaut. Das BstEII-kohäsive Ende wurde mit einem Klenow-Fragment (Takara, Tokyo, Japan) aufgefüllt. Das abgestumpft endende Fragment, das die Kodierungsregion des codA-Gens und einen möglichen Ribosom-Bindungsort enthielt, wurde in den SmaI-Ort des Plasmids pAM1044 inseriert. Die korrekte Orientierung des Gens, welches unter Kontrolle des conII-Promotors von pAM1044 exprimiert zu werden schien, wurde durch Restriktionsenzymanalyse bestätigt. Der conII-Promotor ist eine Konsensus-Sequenz von E. coli-Promotoren, enthaltend die Nucleotidsequenzen TTGGACA (-35) und TATAAT (-10).
Das Plasmid pAM1044 und das Plasmid, das das codA-Gen enthielt, wurden verwendet, um Synechococcus PCC7942 durch das Verfahren von Elhai et al. zu transformieren. Die resultierende Transformante wurde als der Stamm PAMCOD bezeichnet. Als eine Kontrolle wurde Synechococcus PCC7942 mit pAM1044 allein transformiert und als der Stamm PAM bezeichnet.
Die Selektion der Transformanten wurde auf BG11-Agarplatten, die 30 μg/ml Spectinomycin enthielten, durchgeführt. Nach mehreren Passagen einer einzelnen Kolonie auf frische BG11-Platten, die Spectinomycin enthielten, wurde die komplette Insertion des Spectinomycin-Resistenzgens und des codA-Gens in alle Kopien von Chromosomen durch PCR (Polymerase-Kettenreaktion) unter Verwendung der Primer, die in 2A gezeigt werden, bestätigt. Die vollständie Insertion des Spectinomycin-Resistenzgens und des codA-Gens in Synechococcus-Chromosomen wurde durch PCR unter Verwendung einer Kombination aus den Primern 1 und 2 bestätigt.
Die Kultivierung der Stämme PAMCOD und PAM wurde in BG11-Medium (Stanier et al., Bacteriol. Rev. 35: 171–205, 1971), ergänzt mit 1 mM Cholinchlorid (Kitayama Chemical) unter Belüftung bei 1% CO₂ bei 30°C unter Beleuchtung mit einer Leuchtstoffröhre von 70 μE m^–2s^–1 durchgeführt. Logarithmisch wachsende Zellen wurden in allen Experimenten, die unten beschrieben werden, verwendet. Die photosynthetische Aktivität wurde bei einer Zelldichte gemessen, die auf eine Chlorophyllkonzentration von 5–10 μg/ml eingestellt war.
Beispiel 2: Bestätigung, dass das Gen in die Transformanten inseriert war (nur Referenz)
Es wurden DNAs von den Stämmen des Wildtyps, PAM und PAMCOD von Synechococcus PCC7942 als Matrizen für die PCR verwendet und die amplifizierten Produkte wurden durch SDS-PAGE analysiert. Die Ergebnisse werden in 2B gezeigt.
Die PCR von DNA von dem Wildtyp-Stamm produzierte ein amplifiziertes Produkt von ungefähr 400 bp (2, Bahn b). PCR unter Verwendung von DNA von dem Stamm PAM als einer Matrize produzierte eine Bande von ungefähr 2,4 kb, was darauf hinweist, dass pAM1044 in die Chromosomen inseriert wurde. Die Bande von ungefähr 400 bp, wie sie in dem Wildtyp-Stamm beobachtet wurde, existiert nicht, was darauf hinweist, dass native Chromosomen durch mutierte Chromosomen im Stamm PAM vollständig ersetzt wurden.
Wenn DNA von PAMCOD als eine Matrize verwendet wurde, wurde die Bande, die zu den Wildtyp-Chromosomen korrespondiert, nicht beobachtet (2B, Bahn c). Die vorhergesagte Bande von ungefähr 4,1 kb wurde jedoch auch nicht amplifziert, vermutlich aufgrund der großen Größe des Inserts und des hohen GC-Gehaltes in der codA-Sequenz. Daher wurde Primer 3, korrespondierend zu der Kodierungsregion des codA-Gens (2A) in Kombination mit Primer 1 verwendet. Die vorhergesagte Bande von ungefähr 2,6 kb wurde amplifiziert (2B, Bahn d), was darauf hinweist, dass das codA-Gen in Chromosomen des Stammes PAMCOD existiert.
Beispiel 3: Expression des codA-Gens in dem Synechococcus-Stamm PAMCOD (nur Referenz)
Die Expression des codA-Gens in dem Stamm PAMCOD, erhalten in Beispiel 1, wurde durch Westernblot-Analyse unter Verwendung eines polyklonalen Antiserums gegen gereinigte Cholinoxidase untersucht. Die Ergebnisse werden in 3 gezeigt. Signale wurden bei 60 kDa in Proteinextrakten von dem Stamm PAMCOD (Bahn a) und gereinigter Cholinoxidase (Bahn c) nachgewiesen. Dieses Signal wurde nicht in Proteinextrakten von dem Stamm PAM nachgewiesen (Bahn b). Dieses Ergebnis bestätigte, dass das codA-Gen in Synechococcus PCC7942 unter Kontrolle des conII-Promotors exprimiert wurde.
Beispiel 4: Analyse von Betainkonzentration in Zellen (nur Referenz)
Transformierte Zellen wurde in einen Liter von BG11-Medium, ergänzt mit 5 mM Cholinchlorid, gezüchtet. Es wurde Salz- Stress durch Zugabe von NaCl in verschiedenen Konzentrationen ausgeübt. Die geernteten Zellen wurden mit 1 M H₂SO₄ bei 25°C für 20 Stunden behandelt und Betain wurde aus der Mischung durch die Periodat-Präzipitationstechnik (Wall, J. S. et al., Analyt. Chem. 32: 870–874, 1960) gewonnen. Betainperiodat wurde in 1 ml Methanol-d₄ (Wako), enthaltend 2 mM 2-Methyl-2-propanol (Wako) als einen inneren Standard, aufgelöst. Diese Lösung wurde auf ¹H NMR-Spektren in einem NMR-Röhrchen unter Verwendung eines Bruker AMX 360 Wb gemessen. Betain wurde durch Vergleich der integrierten Peaks mit einer Standardkurve quantifiziert.
Die Betainkonzentration in Zellen des Stammes PAMCOD wurde auf der Basis von Zellvolumen, die aus dem Elektron-Mikrograph von negativ gefärbten Zellen geschätzt wurden, bestimmt. Das Cytoplasma einer einzelnen Zelle hatte eine zylindrische Form von 2,14 μm in Länge und 0,82 μm im Durchmesser und das Zellvolumen wurde auf ungefähr 1,13 μm³ geschätzt.
Als ein Ergebnis wurde die Betainkonzentration in Zellen des Stammes PAMCOD auf ungefähr 80 mM berechnet. Es konnte jedoch keine Spur von Betain in dem Stamm PAM, dem es an dem codA-Gen fehlte, nachgewiesen werden.
Beispiel 5: Wachstum unter Hoch- und Niedrigtemperatur-Stress (nur Referenz)
(1) Wachstumstests in einem festen Medium
Wachstum bei hohen Temperaturen
Die Synechococcus-Stämme PAM und PAMCOD wurden auf eine Agar-Platte in BG11-Medium, ergänzt mit 1 mM Cholinchlorid, transferiert und auf Wachstum bei 40°C, 42°C und 44°C beobachtet. Die Ergebnisse werden in 4A gezeigt. Beide Stämme wuchsen fast gleich bei 40°C. Kein Stamm wuchs bei 44°C. Bei 42°C wuchs der Stamm PAM sehr langsam, während der Stamm PAMCOD sehr gut wuchs.
Wachstum bei niedrigen Temperaturen
Die Synechococcus-Stämme PAM und PAMCOD wurden auf einer Agar-Platte in BG11-Medium, ergänzt mit 1 mM Cholinchlorid, transferiert und auf Wachstum bei 22°C, 20°C und 18°C beobachtet. Die Ergebnisse werden in 4B gezeigt. Beide Stämme wuchsen fast gleich bei 22°C. Bei 20°C wuchs der Stamm PAMCOD schneller als der Stamm. Kein Stamm wuchs bei 18°C gut.
(2) Wachstumstests in einem flüssigen Medium
Wachstum bei hohen Temperaturen
Zellen der Synechococcus-Stämme PAM und PAMCOD, die vorläufig in BG11-Medium, ergänzt mit 1 mM Cholinchlorid, bei 30°C gezüchtet wurden, wurden auf 42°C transferiert und auf Wachstum durch Beobachtung der Trübung bei einer Wellenlänge von 730 nm beurteilt. Die Ergebnisse werden in 5A gezeigt. Die Zellen des Stamms PAMCOD hörten an dem ersten Tag auf zu wachsen, aber sie begannen dann wieder zu wachsen. Die Zellen des Stamms PAM wuchsen jedoch überhaupt nicht.
Wachstum bei niedrigen Temperaturen
Zellen der Synechococcus-Stämme PAM und PAMCOD, die vorläufig in BG11-Medium, ergänzt mit 1 mM Cholinchlorid, bei 30°C gezüchtet wurden, wurden auf 20°C transferiert und auf Wachstum durch Beobachtung der Trübung bei einer Wellenlänge von 730 nm beurteilt. Die Ergebnisse werden in 5B gezeigt. Die Zellen des Stammes PAMCOD wuchsen langsam für 4 Tage, aber begannen dann, schnell zu wachsen. Die Zellen des Stamms PAM wuchsen jedoch noch nach 4 Tagen langsam.
Beispiel 6: Photosynthetische Aktivität unter Niedrigtemperatur-Stress (nur Referenz)
Es wurde die Inaktivierung von photosynthetischer Sauerstoff-Freisetzung, induziert durch Niedrigtemperatur-Stress, untersucht. Die Zellen der Stämme PAM und PAMCOD, die vorläufig bei 30°C gezüchtet wurden, wurden in der Dunkelheit bei verschiedenen Temperaturen gezüchtet. Danach wurde die photosynthetische Sauerstoff-Freisetzungs-Aktivität bei 30°C in der Gegenwart von 1 mM NaHCO₃ oder in der Gegenwart von 1,4-Benzochinon und 1 mM K₃Fe(CN)₆ unter Verwendung einer Clark-Typ-Sauerstoffelektrode gemessen.
Photosynthetische Aktivität bei niedrigen Temperaturen
Zellen wurden in der Dunkelheit bei verschiedenen Temperaturen von 0 bis 20°C für 1 Stunde, dann bei 30°C für 5 Minuten gezüchtet. Nach dem Wachstum wurde die photosynthetische Sauerstoff-Freisetzungs-Aktivität auf die Weise, die oben beschrieben wurde, gemessen. Die Zellen der Stämme PAM und PAMCOD zeigten absolute Aktivitäten der photosynthetischen Sauerstoff-Freisetzung von 387 ± 23 bzw. 379 ± 19 μmol O₂/mg Chlorophyll/Stunde in der Gegenwart von CO₂ und die absoluten Aktivitäten von photosynthetischer Sauerstoff-Freisetzung von 802 ± 36 bzw. 740 ± 82 μmol O₂/mg Chlorophyll/Stunde in der Gegenwart von 1,4-Benzochinon und K₃Fe(CN)₆.
Die Ergebnisse werden in 6 gezeigt (A: in der Gegenwart von NaHCO₃; B: in der Gegenwart von 1,4-Benzochinon und K₃Fe(CN₆). Wie in 6A gezeigt wird, war die photosynthetische Sauerstoff-Freisetzungs-Aktivität des Stammes PAMCOD gegenüber niedrigen Temperaturen toleranter als die des Stammes PAM. Wie in 6B gezeigt wird, war die Elektron-Transport-Aktivität, die durch das fotochemische System II des Stammes PAMCOD vermittelt wird, auch toleranter gegenüber niedrigen Temperaturen als die des Stammes PAM, sprich die Aktivität des Stammes PAM verringerte sich auf 50% des Anfangsspiegels bei 5°C, während die Aktivität des Stammes PAMCOD fast an dem Anfangsspiegel bei 5°C verblieb und unter 5°C abzunehmen begann.
Beispiel 7: Herstellung eines binären Vektorplasmids, das das codA-Gen trägt
Ein rbcS (Ribulose-1,5-Biphosphatcarboxylase-kleine Untereinheit)-Transitsignal-XbaI-NdeI-Fragment (ungefähr 200 bp) von Tabak (Nicotiana silvestris) wurde durch PCR unter Verwendung von 5'CTGTCTAGATGTAATTAACAATGGCT3' und 5'CCACATATGCATGCATTGCACTCT3' als Primern amplifziert und XbaI- und NdeI-Orte wurden eingeführt.
Dann wurde ein N-terminales BamHI-Fragment (ungefähr 100 bp) von dem codA-Gen durch PCR unter Verwendung von 5'AACCATATGCACATCGACAACATC3' und 5'GCTCCATCCAGCGGTCCAGC3' als Primern amplifiziert, dann wurde ein NdeI-Ort eingeführt. Ein BamHI-SmaI-Fragment (ungefähr 1,6 kbp) des codA-Gens wurde durch Restriktionsenzyme hergestellt. Schließich wurde ein SmaI-C-Terminalfragment (ungefähr 80 bp) des codA-Gens durch PCR unter Verwendung von 5'GAAACAGTCCTGCTTCCACAC3' und 5'GCGAGCTCTGCCTACACCGCCAT3' als Primern amplifiziert und ein SacI-Ort wurde eingeführt.
Das GUS (β-Glucuronidase)-Gen in dem binären Vektorplasmid pBI221 wurde durch diese Fragmente ersetzt.
Die Restriktionsenzym-Karte des codA-Gens wird in 7 gezeigt.
Ein HindIII-EcoRI-Fragment, das den Blumenkohl-Mosaikvirus 35S Promotor und den NOS (Nopalinsynthase)-Terminator enthielt, wurde in das binäre Vektorplasmid pGAH eingeführt, um ein Plasmid pGAH/codA herzustellen (8). Dieses Plasmid enthält Kanamycin- und Hygromycin-resistente Gene.
Beispiel 8: Einführung des binären Vektorplasmids in Agrobacterium
Das Agrobacterium tumefaciens EHA 101, das das Ti-Plasmid trägt, wurde mit dem binären Vektorplasmid pGAH/codA, das in Beispiel 7 erhalten wurde, gemischt, dann gefroren und geschmolzen und auf LB-Platten, die Tetracyclin und Kanamycin enthielten, gescreent. Das resultierende Agrobacterium, in das das codA-Gen integriert wurde, wurde als EHA 101 (pGAH/codA) bezeichnet.
Beispiel 9: Transformation von Arabidopsis
Man ließ den Arabidopsis thaliana-Stamm WS keimen, um ein Hypocotylsegment herzustellen. Man ließ dieses Hypocotyl in B5-Medium (ICN Biochemicals) (pH 5,7), enthaltend 0,05 mg/l Kinetin (Wako) und 0,5 mg/l 2,4-D (Wako), callös werden, um Hypocotylcallil zu bilden.
Dann wurden die Calli mit dem codA enthaltenden Agrobacterium EHA 101 (pGAH/codA), hergestellt in Beispiel 8, infiziert und co-kultiviert. Nach der Entfernung von Agrobacterium durch B5-Medium, das 250 mg/l Vancomycin, 500 mg/l Carbenicillin und 200 mg/l Claforan enthielt, wurden die Kulturen auf ein Differenzierungsmedium transferiert, das Kanamycin und Hygromycin enthielt (B5-Medium, das 25 mg/l Kanamycin und 15 mg/l Hygromycin enthielt), um Schösslinge zu bilden. So wurden Kanamycin- und Hygromycin-resistente Schösslinge selektiert, um Wurzeln zu induzieren und Saaten zu bilden. Die resultierenden T2-Saaten waren heterocygote Individuen, in denen nur eines der Chromosomen transformiert worden war.
Dann wurden die Pflanzen, die aus den T2-Saaten erhalten wurden, selbst befruchtet und durch Kanamycin und Hygromycin selektiert, um homocygote T3-Saaten zu geben.
Die Pflanzen der Wildtyp- und transformierten Stämme wurden für die Experimente, nachdem sie in einem Medium (pH 5,2), das 0,1% HYPONEX (Hyponex Corporation, Marysville, OH, USA) enthielt, bei 22°C für 30 Tage auf Wasser oder Erde, die aus Vermiculite und Perlite bestand, unter Beleuchtung von 75 μmol m^–2s^–1 für 16 Stunden eines Tages und in der Dunkelheit für die verbleibenden 8 Stunden gezüchtet wurden, verwendet, außer es wird anders angegeben.
Beispiel 10: Immunologische Studie der exprimierten Cholinoxidase
Es wurde ein Antikörper gegen Cholinoxidase gemäß dem Verfahren, das in der Literatur durch die Erfinder der vorliegenden Erfindung beschrieben wird (Deshniumu, P. et al., Plant Mol. Biol. 29: 897–907, 1995) hergestellt.
Blätter von 20 Tage alten Pflanzen der Wildtyp- und transformierten Stämme von Arabidopsis thaliana wurden in einer Mikrozentrifuge bei 0°C zermahlen und die Homogenate wurden bei 10.000 × g für 10 Minuten zentrifugiert, um lösliche Fraktionen herzustellen. Lösliche Proteine des Überstandes wurden durch SDS-PAGE getrennt und auf eine Nylonmembran transferiert (Immobilon PVDF; Millipore, Redford, MA, USA). Die Membran wurde mit dem obigen Antikörper gegen Cholinoxidase inkubiert und mit einem System untersucht, das aus einem biotinylierten sekundären Antikörper, Avidin und biotinylierter Meerrettich-Peroxidase (ABC Kit; Vectastain, Burlingane, CA, USA) bestand.
Die Ergebnisse der Westernblot-Analyse werden in 9 gezeigt. Die Gegenwart eines Immun-reaktiven Proteins von 64 kDa, korrespondierend zu Cholinoxidase, wurde identifiziert. Eine kleine Menge eines Proteins von 70 kDa, korrespondierend zu einem Precursor von Cholinoxidase und dem rbcS-Transitpeptid, wurde auch beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen, dass das codA-Gen korrekt integriert und in Chromosomen exprimiert wurde und dass der exprimierte Precursor in ein reifes Protein weiter verarbeitet wurde.
Dann wurde die Lokalisierung der exprimierten Cholinoxidase in Pflanzen mit dem obigen Antikörper gegen Cholinoxidase durch ein Verfahren, das in der Literatur (Mustardy, L. et al., Plant Physiol. 94: 334–340, 1990) beschrieben wird, nachgewiesen. Ein kleiner Teil eines jungen Blattes von einer Pflanze wurde mit 1% Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,2) für 1 Stunde fixiert. Nachdem sie mit demselben Puffer gespült wurde, wurde die Probe mit Ethanol dehydriert und in Lowicryl K4M-Harz (TAAB Laboratories Equipment Ltd., Berkshire, U.K.) platziert. Immun-Gold-Markierung wurde durch ein Verfahren, das in der Literatur beschrieben wird (Mustardy et al., supra) durchgeführt.
Als ein Ergebnis wurde beobachtet, dass die exprimierte Cholinoxidase im Stroms von Chloroplasten lokalisiert war, was darauf hinweist, dass Cholinoxidase zu den Chloroplasten transportiert wurde.
Beispiel 11: Bestimmung von Betain und Chlorophyllspiegeln in transformierten Pflanzen
Der Betaingehalt in Blättern von Pflanzen wurde durch Messung von NMR-Spektren einer quaternären Ammoniumverbindung berechnet (Wall, J. et al., Analyt. Chem. 32: 870–874, 1960). 5 g Blätter der Wildtyp- und transformierten Pflanzen wurden in flüssigem Stickstoff durch einen keramischen Motor pulverisiert. Dieses Pulver wurde in 25 ml 1,0 M H₂SO₄ suspendiert und bei 25°C für 2 Stunden inkubiert. Nachdem unlösliche Teilchen entfernt wurden, wurde der Überstand durch Zentrifugation bei 1.000 × g für 10 Minuten gewonnen. Der Überstand wurde mit 10 ml einer KI-I₂-Lösung bei 0°C für 2 Stunden inkubiert. Betain und Cholin, modifiziert mit Periodid, wurden durch Zentrifugation bei 1.000 × g für 30 Minuten gewonnen und in 0,5 ml CD₄OH (Wako), enthaltend 0,5 mM 2-Methyl-2-propanol (Wako) als einem inneren Standard, aufgelöst, um ¹H NMR-Spektren zu messen. Es wurden zwei Hauptpeaks, die zu Betain und Cholin korrespondierten, beobachtet und die integrierten Betainpeaks wurden zur Bestimmung der Konzentration verwendet.
Der Chlorophyllgehalt im Blatt wurde durch das folgende Verfahren gemessen. Blatt (1 g) wurde in flüssigem Stickstoff durch einen keramischen Motor pulverisiert. Das Pulver wurde in 10 ml Aceton:Wasser (4:1, v/v) suspendiert. Nach der Inkubation für 30 Minuten wurden unlösliche Teilchen entfernt und der Überstand wurde Spectrophotometrie unterworfen (Arnon, D. I. Plant Physiol. 24: 1–15, 1949).
Als ein Ergebnis wurde sowohl Betain wie auch Cholin in der transformierten Pflanze beobachtet, während in der Wildtyp-Pflanze nur Cholin beobachtet wurde. Der Betaingehalt betrug 1,0 μmol/g frisches Blatt. Der Chlorophyllgehalt betrug 0,3 μmol/g frisches Blatt.
Beispiel 12: Toleranz von transformierten Arabidopsis gegenüber Niedrigtemperatur-Stress
Es wurde ein Test durchgeführt, um zu bestimmen, ob oder ob nicht die Einführung des codA-Gens und die Akkumulierung von Betain Toleranz gegen Niedrigtemperatur-Stress verleiht.
Die Wildtyp- und transformierten Pflanzen wurden bei 5°C für 7 Tage unter fortgesetzter Beleuchtung von 250 μmol m^–2s^–1 inkubiert. Es wurde kein signifikanter Unterschied mit dem nackten Auge zwischen den Wildtyp- und transformierten Pflanzen beobachtet. Als diese Pflanzen bei 22°C für weitere 2 Tage inkubiert wurden, begannen die Blätter der Wildtyp-Pflanze herabzuhängen und weißer zu werden. Die transformierte Pflanze wurde jedoch offensichtlich überhaupt nicht durch diese Behandlung beeinträchtigt.
Beispiel 13: Inaktivierung der fotochemischen System II-Aktivität durch niedrige Temperaturen
Die Einflüsse von Niedrigtemperatur-Stress auf die fotochemische System II-Aktivität von Blättern der transformierten Pflanze wurden durch Beobachtung der Fluoreszenz von Chlorophyll beurteilt. Die Aktivität des fotochemischen Systems II wurde als ein Verhältnis von variabler Chlorophyll-Fluoreszenz zu maximaler Chlorophyll-Fluoreszenz (Fv/Fm) unter Verwendung eines Puls-Intensitäts-modulierten Fluorometers (PAM-2000; Walts, Effeltrich, Deutschland) gemessen (Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: 313–349, 1991).
Die Ergebnisse werden in 10 gezeigt. Nach der Inkubation bei 5°C für 7 Tage unter kontinuierlicher Beleuchtung von 250 μmol m^–2s^–1 nahm die photosynthetische System II-Aktivität sowohl in den Wildtyp- wie auch transformierten Pflanzen ab. Die Abnahme war deutlich an dem ersten Tag und verlangsamte sich dann sowohl in den Wildtyp- wie auch transformierten Pflanzen. Die transformierte Pflanze zeigte jedoch eine viel langsamere Inaktivierung als die Wildtyp-Pflanze zu jedem Zeitpunkt. Nach der Inkubation für 5 Tage verlor die Wildtyp-Pflanze fast vollständig die Aktivität, aber die transformierte Pflanze erhielt ungefähr 30% des ursprünglichen Spiegels an Aktivität. Es wurde jedoch kein signifikanter Unterschied zwischen ihnen in der photosynthetischen System II-Aktivität bei 10 bis 15°C beobachtet.
Beispiel 14: Inhibition der Photosynthese durch niedrige Temperaturen und ihre Erholung, wie auch Gefrier-Resistenz
(1) Tests zur Inhibition der Photosynthese durch niedrige Temperaturen und Erholung von der Inhibition von Photosynthese
Das Ausmaß der Inhibition der Photosynthese wurde bei einer so niedrigen Temperatur wie 1°C gemessen. Die Ergebnisse werden in 11A gezeigt. Die Blätter der transformierten Pflanze waren gegenüber Inhibition von Photosynthese durch niedrige Temperaturen toleranter als Blätter der Wildtyp-Pflanze. Namentlich die Blätter der Wildtyp-Pflanze verloren ungefähr 75% der photosynthetischen System II-Aktivität nach 2,5 Stunden, während es ungefähr 3,5 Stunden oder mehr dauerte, bis die Blätter der transformierten Pflanze in dem gleichen Ausmaß inaktiviert wurden.
11B zeigt die Ergebnisse des Erholungstests von der Photosynthese-Inhibition durch niedrige Temperaturen. Nach dem obigen Niedrigtemperatur-Test wurden die Blätter bei 17°C mit 70 μmol m^–2s^–1 inkubiert. Die Blätter sowohl der Wildtyp- wie auch transfomierten Pflanzen zeigten Erholung von der Photosynthese-Inhibition durch niedrige Temperaturen. Die transformierte Pflanze zeigte jedoch ein größeres Ausmaß an Erholung als die Wildtyp-Pflanze. Nach Inkubation für 4 Stunden gewannen die Blätter der Wildtyp-Pflanze 25 bis 50% der ursprünglichen Aktivität zurück. Die Blätter der transformierten Pflanze zeigten jedoch eine Erholung von 25 bis 75%.
(2) Gefrier-Resistenz-Tests an Blättern
Die Blätter der Wildtyp- und transformierten Pflanzen von Arabidopsis wurden zerrissen und in Wasser bei einer Temperatur, die mit einer Geschwindigkeit von 3°C/Minute abnahm, getaucht. Als die Temperatur auf –3°C abgesenkt war, wurde eine Nadel, die durch Flüssigstickstoff gekühlt wurde, an die Blätter gebracht, um sie zu gefrieren. Dann wurden die Blätter mit einer Geschwindigkeit von 1°C/Stunde auf verschiedene Messtemperaturen, die von –2°C bis –12°C reichten, abgekühlt. Die Blätter wurden entfernt und man ließ sie über Nacht bei 4°C so stehen, dass sie schmolzen. An dem folgenden Tag wurde die Temperatur auf Raumtemperatur zurückgebracht und die fotochemische System II-Aktivität wurde gemessen. Die Ergebnisse werden in 12 gezeigt. Bei jeder Temperatur zeigte die transformierte Pflanze eine höhere Aktivität als die Wildtyp-Pflanze.
Beispiel 15: Einflüsse von Niedrigtemperatur-Behandlung im Wasser-Absorptions-Stadium auf die Keimung von Saaten
Saaten der Wildtyp-Pflanze und T3-Saaten der transformierten Pflanze wurden in Eiswasser (ungefähr 0°C) für 2 Stunden erhalten und sterilisiert, dann ließ man sie auf MS (Murashige-Skoog)-Medium, das 2% Saccharose und 0,5% Gellangummi enthielt, keimen. Man ließ die Saaten bei 22°C für 20 Tage mit Licht für 16 Stunden und in der Dunkelheit für 8 Stunden jeden Tages keimen.
Die Ergebnisse werden in 13 gezeigt. Wie aus der Figur offensichtlich wird, keimten sowohl die Wildtyp- wie auch die transformierten Pflanzen, wenn ihre Saaten nicht einer Abkühlungsbehandlung im Wasser-Absorptions-Stadium unterworfen wurden (13A). Wenn die Saaten eine Abkühlungsbehandlung in dem Wasser-Absorptions-Stadium unterworfen wurden, keimte die Wildtyp-Pflanze nicht, aber die transformierte Pflanze keimte und wuchs ähnlich zu unbehandelten Saaten (13B).
Beispiel 16: Herstellung eines chimären codA-Gens, das für die Transformation von Reis verwendet wird
Es wurden zwei chimäre codA-Gene (bezeichnet als 35SINcodA bzw. 35SINTPcodA), die im Cytosol oder Plastid nach der Translation des Cholinoxidasegens (codA) lokalisiert sind, stammend von Arthrobacter globiformis, unter transkriptioneller Kontrolle des Blumenkohl-Mosaikvirus 35S-Promtors auf dem Plasmid pUC119 durch das Verfahren, das in Beispiel 6 beschrieben wird, hergestellt (siehe 14).
Unter Berücksichtigung, dass die Gegenwart eines Introns für die hohe Expression eines Gens in Reis erforderlich ist (siehe z. B. Tanaka, A. et al., Nucleic Acids Res. 18: 6767–6770, 1990), wurde ein Intron in die 5' nicht-translatierte Sequenz des Superoxid-Dismutasegens von Reis (SodCc2: Sakamoto, A. et al., FEBS Lett. 358: 62–66, 1995) in beide chimäre Gene eingeführt. Weiter wurde eine DNA-Sequenz, die von dem rbcS-Transitpeptid (Coruzz, G. et al., EMBO J. 3: 1671–1679, 1984) von Erbsen stammte, zu 35SINTPcodA zugefügt, um das codA-Protein zu Chloroplasten zu transferieren.
Beispiel 17: Transformation von Reis
Jedes der zwei chimären codA-Gene, die in Beispiel 16 hergestellt wurden, wurde in Suspension-Kulturzellen von Scutellum-Calli von Reissaaten zusammen mit dem Selektionsmarker Hygromycin-Resistenzgen durch ein Teilchenkanonengerät eingeführt. Die transformierten Calli wurden basierend auf der antibiotischen Resistenz selektiert und zu Pflanzen redifferenziert. Man führte Polymerase-Kettenreaktion (PCR) auf den transformierten Calli oder transformierten/redifferenzierten Individuen, die Hygromycin-Resistenz zeigten, durch, um Integration und Transkription des codA-Gens in das nukleäre Genom durch Northernblot-Technik zu beurteilen und 80 bis 100 oder mehr Transformanten für jedes codA-Gen auszuwählen.
Beispiel 18: Analyse der Expression des codA-Gens in transformiertem Reis
Die Transformanten, die in Beispiel 17 erhalten wurden, wurden durch Westernblot-Technik gescreent, um den transformierten Reis (die vorliegende Generation), der das codA-Gen auf dem Proteinniveau exprimiert, zu erhalten, wobei letztendlich 6 Individuen, die das Gen lokalisiert in Plastid und 10 Individuen, die das Gen lokalisiert in Cytosol trugen, mit eingeschlossen wurden.
Reis fehlt es an endogener Cholinoxidase-Aktivität, aber lösliche Fraktionen, die aus Blättern oder Wurzeln der Transformanten hergestellt wurden, zeigten Cholinoxidase-Aktivität. Entgegen der Erwartung wurde von allen Individuen der Plastid-Typ-Transformanten gefunden, dass sie eine niedrigere Menge des Cholinoxidase-Proteins exprimieren als der Cytosol-Typ, trotzdem derselbe Expressionspromotor verwendet wurde.
Als die Expression des codA-Gens durch Northernblot-Technik weiter untersucht wurde, wurde keine signifikante Differenz in der Menge beider Gene, exprimiert auf dem Transkriptionsniveau, gefunden. Als die Weiterverarbeitung des Introns durch reverse transkriptive PCR untersucht wurde, wurde eine Vielzahl von Splicing-Varianten, die verschiedene 3'-Acceptor-Orte enthielten, die keine normale Translation zu Protein herbeiführen könnten, aus der mRNA, die aus dem Plastidtypgen transkribiert wurde, nachgewiesen. Dies legte nahe, dass die Niedrigspiegel-Proteinexpression durch die Pflanze, die mit dem Plastid-Typ-Gen transformiert wurde, durch eine abnormale Verarbeitung des mRNA-Precursors hervorgerufen sein könnte. Dieses Phänomen scheint mit der Tatsache in Zusammenhang zu stehen, dass die Sequenz, die das Transitpeptid, das für die Plastidzielgebung der Cholinoxidase verwendet wurde, kodiert, von einem Dicodyledon (Erbsen-rbcS-Gen) stammte. Daher kann einfach angenommen werden, dass die Expression des codA in Reischloroplasten effizienter sein würde und der resultierende transformierte Reis toleranter gegenüber Temperaturstress sein würde, wenn die Sequenz, die das Transitpeptid kodiert, von einem Monocotyledon stammt, wie Reis-rbcS.
Beispiel 19: Betain-Biosynthese in transformiertem Reis
Betain, das in Geweben von Transformanten, die Cholinoxidase exprimieren, akkumulierte, wurde durch Proton-NMR nachgewiesen. 15 zeigt die Ergebnisse des NMR vom Wildtyp-Stamm, einer Transformante, die nicht codA-Gen exprimiert (15A) und einer Transformante, die das codA-Gen exprimiert (15B).
Die Transformante, die Cholinoxidase exprimiert, biosynthetisiert Betain und die akkumulierende Menge des Betains zeigte eine positive Korrelation mit der Menge an Cholinoxidase, die durch Westernblot-Technik nachgewiesen wurde. Die akkumulierende Menge an Betain war in Blättern größer als in Wurzeln und erreichte 4 μmol/g frische Blätter in Individuen, die das codA-Gen hoch exprimierten. Dies ist der erste Fall, in dem Reis eine Betain-synthetisierende Fähigkeit durch eine gentechnische Technik erlangte.
Beispiel 20: Inaktivierung der Photosynthese unter Beleuchtung bei niedrigen Temperaturen (nur Referenz)
Um zu untersuchen, ob transformierte Pflanzen Temperaturtoleranz durch die Gegenwart von Betain oder durch andere Ursachen erwarben, wurden die folgenden Tests durchgeführt, die die Transformante, die durch Transformation des Synechococcus PCC7942 mit einem Plasmid, das das codA-Gen enthielt, hergestellt wurde, und PAM, das durch Transformation von ihm mit pAM1044 allein in Beispiel 1 hergestellt wurde, verwendeten.
PAM- und PAMCOD-Zellen, die zuvor bei 30°C in der Gegenwart von 1 mM Cholinchlorid gezüchtet wurden, wurden bei 20°C unter Beleuchtung oder dunklen Bedingungen gezüchtet. Unter dunklen Bedingungen wurde die Aktivität des fotochemischen Systems II erhalten. Die Aktivität des fotochemischen Systems II von PAM-Zellen verringerte sich jedoch auf 35% des ursprünglichen Spiegels nach der Kultivierung mit 500 μEm^–2s^–1 für 120 Minuten (16A). Die Aktivität des fotochemischen Systems II in PAMCOD-Zellen verringerte sich auch, aber in einem geringeren Ausmaß als bei PAM-Zellen (16A). Dies enthüllte, dass das fotochemische System II von PAMCOD-Zellen gegenüber Fotoinhibition toleranter ist als das von PAM-Zellen.
Die Fotoinhibition des fotochemischen Systems II wird durch Wettbewerb zwischen lichtinduzierter Inaktivierung von D1-Protein und Erholung des fotochemischen Systems II durch Aufnahme von neu synthetisierten D1-Protein hervorgerufen (Aro, E.-M. et al., Biochim. Biophys. Acta 1019: 269–275, 1990; Aro, E.-M. et al., Biochim. Biophys. Acta 1143: 113–134, 1993). Um zu untersuchen, ob die Toleranz von PAMCOD-Zellen gegenüber Fotostress bei niedrigen Temperaturen von Suppression der Inaktivierung von D1-Protein oder Promotion von D1-Proteinsynthese stammt, wurde Fotoinhibition in der Gegenwart von einem Proteinsynthese-Inhibitor, Linomycin (400 mg/ml), induziert. Unter dunklen Bedingungen hatte Linomycin keinen Einfluss auf die fotochemische System II-Aktivitä von PAM- und PAMCOD-Zellen. Unter Beleuchtung wurden die fotochemischen System II-Komplexe mit der gleichen Geschwindigkeit in Zellen von beiden Transformanten inaktiviert (16B). Dieses Ergebnis zeigt, dass die Verbesserung der Toleranz von PAMCOD-Zellen gegenüber Fotostress bei niedrigen Temperaturen nicht aus der Suppression der Inaktivierung von D1-Protein stammt. Die Gegenwart von Betain schien die Erholung des fotochemischen Systems II zu fördern.
Beispiel 21: Erholung von Fotoinhibition (nur Referenz)
PAM- und PAMCOD-Zellen wurden auf die Erholung des fotochemischen Systems II von Fotoinhibition durch Messung der Sauerstoff-Freisetzungsaktivität getestet. Die Zellen wurden gegenüber Licht von 3.500 μEm^–2s^–1 exponiert, um fotochemisches System II-Komplexe auf 15% des ursprünglichens Spiegels zu inhibieren. Dann wurden Zellen bei 60°C oder 30°C unter Beleuchtung von 70 μEm^–2s^–1 gezüchtet. Die Ergebnisse werden in 17 gezeigt.
Bei 20°C zeigten PAM-Zellen nur eine geringe Erholung der fotochemischen System II-Komplexe von Fotoinhibition. PAMCOD-Zellen erlangten jedoch 60% des ursprünglichen Spiegels nach 2 Stunden zurück (17A). Bei 30°C erlangten Zellen von beiden Stämmen vollständig die Aktivität des fotochemischen Systems II nach 2 Stunden zurück. PAMCOD-Zellen erholten sich jedoch viel schneller als PAM-Zellen (17B).
Beispiel 22: Inaktivierung der Photosynthese unter dunklen Bedingungen bei niedrigen Temperaturen
Die Toleranzen von PAM- und PAMCOD-Zellen gegenüber Niedrigtemperatur-Stress wurden unter dunklen Bedingungen bei niedrigen Temperaturen verglichen. Die Effekte von verschiedenen Niedrigtemperatur-Behandlungen auf Inaktivierung von Gesamtphotosynthese und Elektrontransport, vermittelt durch fotochemisches System II in beiden Zellen, werden in 18 gezeigt. Die Sauerstoff-Freisetzungsaktivität durch Photosynthese von PAMCOD-Zellen war gegenüber niedrigen Temperaturen toleranter als die von PAM-Zellen (18A). Ähnliche Ergebnisse wurden für Elektrontransport, vermittelt durch fotochemisches System II, erhalten. Die Aktivität von PAM-Zellen nahm auf 50% des ursprünglichen Spiegels bei 5°C ab, während die Aktivität von PAMCOD-Zellen fast auf dem gleichen Spiegel wie demjenigen der Kontrolle bei 5°C verblieb und unter 5°C abnahme (18B). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Photosynthese von PAMCOD-Zellen gegenüber niedrigen Temperaturen toleranter ist als die von PAM-Zellen.
Beispiel 23: Phasenübergang von protoplasmatischen Membranen (nur Referenz)
Von cyanobakteriellen Zellen, die gegenüber niedrigen Temperaturen ausgesetzt waren, wurde berichtet, dass sie Wachstum oder die photosynthetische Aktivität aufgrund der Änderung der Lipidphase von protoplasmatischen Membranen vom Flüssigkristallzustand zu Phasentrennungszustand verringern (Murata, N., J. Bioenerg. Biomembr. 21: 61–75, 1989). Es wurde ein Test durchgeführt, um zu untersuchen, ob oder ob nicht die Verbesserung der Niedrigtemperatur-Toleranz von PAMCOD-Zellen mit der Änderung der Lipidphase von Membranen im Zusammenhang steht.
Der Übergang der Lipidphase von protoplasmatischen Membranen kann durch Agglutinierung von Zeaxanthin durch die Beobachtung von Änderung in der Absorption bei Zellen von Synechococcus PCC7942 und PCC6301 (zuvor als Anacystis nidulans bezeichnet) bei 388 nm getestet werden (Brand, J. J., Plant Physiol. 59: 970–973, 1977: Gombos, Z. et al., Plant Physiol. 80: 415–419, 1986; Murata N., J. Bioenerg. Biomembr. 21: 61–75, 1989; Ono, T. et al., Plant Physiol. 67: 176–181, 1981; Wada, H. et al., Nature 347: 200–203, 1990; Yamamoto, H. Y. et al., Biochim. Biophys. Acta 507: 119–127, 1978). 19 zeigt die Ergebnisse von PAM-Zellen und PAMCOD-Zellen, die durch ein ähnliches Verfahren getestet wurden. 19 zeigt, dass der Phasenübergang von Membranlipid von PAM-Zellen bei 10°C auftritt und bei 2°C aufhört, wobei die durchschnittliche Temperatur 6°C beträgt. Auf der anderen Seite beginnt der Übergang von Membranlipid von PAMCOD-Zellen bei 5°C. Dies bedeutet, dass der Lipidübergang von protoplasmatischen Membranen von PAMCOD-Zellen bei einer Temperatur 5° niedriger als bei PAM-Zellen auftritt.
Beispiel 24: Änderung von Membranlipid und Protein (nur Referenz)
Von der Übergangstemperatur von Membranlipid von Cyanobakterien war bekannt, dass sie von dem Ausmaß der Ungesättigtheit von Fettsäuren und der Natur des Lipids abhängt (Murata, N., J. Bioenerg. Biomembr. 21: 61–75, 1989). So wurde das Membranlipid von PAMCOD-Zellen getestet.

Tabellen 1 und 2 zeigen Bestandteile der Fettsäure und Glycerolipid in protoplasmatischen Membranen und Thylakoidmembranen von PAM- und PAMCOD-Zellen. Tabelle 1 zeigt die Lipidzusammensetzung in Zellen, die bei 30°C in der Gegenwart von 1 mM Cholinchlorid gezüchtet wurden. Tabelle 2 zeigt Glycerolipidzusammensetzung in Zellen, die bei 30°C in der Gegenwart von 1 mM Cholinchlorid gezüchtet wurden. Tabelle 1

		Fettsäure
		14:0	14:1	16:0	16:1	18:0	18:1 (9)	18:1 (11)
		mol%
Protoplasmatische Membran	PAM	1	1	54	36	3	2	2
Protoplasmatische Membran	PAMCOD	2	2	53	38	2	2	2
Thylakoidmembran	PAM	1	2	52	40	2	2	2
Thylakoidmembran	PAMCOD	1	2	50	40	2	2	2

Abkürzungen:

14:0: Myristinsäure
14:1: Δ9-Myristinsäure
16:0: Palminsäure
16:1: Δ9-Palminsäure
18:0: Stearinsäure
18:1 (9): Δ9-Stearinsäure
18:1 (11): Δ11-Stearinsäure

Alle Doppelbindungen liegen in cis-Form vor. Tabelle 2

Tylakoidmembran Protoplasmatische Membran

Lipidklasse PAM PAMCOD PAM PAMCOD

(mol%) (mol%)

MGDG 54 53 56 55

DGDG 22 23 19 19

SQDG 14 14 15 15

PG 10 10 10 11
Abkürzungen:

MGDG: Monogalactosyldiacylglycerol
DGDG: Digalactosyldiacylglycerol
SQDG: Sulfochinovosyldiacylglycerol
PG: Phosphatidylglycerol

Wie es aus den Tabellen 1 und 2 offensichtlich wird, wurde kein signifikanter Unterschied zwischen beiden beobachtet.
20 zeigte elektrophoretische Muster von Proteinen aus Membran- und löslichen Fraktionen von PAM- und PAMCOD-Zellen. Ein geringer Unterschied wurde bei den Membranfraktionen beobachtet. Namentlich zeigten PAMCOD-Zellen eine Steigerung in der Menge des Proteins von 14 kDa und eine Abnahme in der Menge des Proteins von 16 kDa. Kein anderer Unterschied wurde in löslichen Fraktionen gefunden, außer dass PAMCOD-Zellen eine Bande zeigten, die zu Cholinoxidase korrespondierte.
So wurde kein signifikanter Unterschied im Membranlipid oder Protein zwischen PAM- und PAMCOD-Zellen gefunden, was darauf hinweist, dass der Schutz des fotochemischen Systems II, wie er in PAMCOD-Zellen bei niedrigen Temperaturen gesehen wird, ein Effekt von Betain ist. SEQUENPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Erzeugung einer temperaturtoleranten höheren Pflanze, das die Transformation einer höheren Pflanze mit einem rekombinanten Vektor umfasst, der ein Gen trägt, das eine Cholinoxidase codiert, abstammend von Arthrobacter globiformis oder Arthrobacter pascens, wobei Temperaturtoleranz die Fähigkeit der transformierten Pflanze zum Wachstum bei höheren oder niedrigeren Temperaturen als den Temperaturen bedeutet, die es normalerweise nicht-transformierten Pflanzen erlauben zu wachsen; wobei die höhere Pflanze eine Dicotyledone oder Monocotyledone ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Gen, das Cholinoxidase codiert, eine Nukleotidsequenz gemäß dem folgenden a) oder b) ist: a) die Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1 oder b) die Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1, worin ein oder mehr Nukleotide zu der Nukleotidsequenz zugefügt sind, von dieser deletiert sind und/oder darin substituiert sind, mit der Maßgabe, dass sie ein Protein mit einer Cholinoxidaseaktivität codiert.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Dicotyledone eine Brassicaceae-Pflanze ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Monocotyledone eine Gramineae-Pflanze ist.
Verwendung eines Gens, codierend eine Cholinoxidase, die von den Erdbakterien Arthrobacter globiformis oder Arthrobacter pascens abstammt, zur Erzeugung einer temperaturtoleranten höheren Pflanze, wobei die Temperaturtoleranz eine Fähigkeit der transformierten Pflanze zum Wachstum bei höheren oder niedrigeren Temperaturen als den Temperaturen bedeutet, die normalerweise nicht-transformierten Pflanzen das Wachstum erlauben, durch Transformation der Pflanze mit dem Gen, wobei die höhere Pflanze eine Dicotyledone oder eine Monocotyledone ist.