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TECHNISCHES
GEBIET
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist ein Gen der Phosphoenolpyruvatcarboxykinase
(hierin nachstehend auch als „PCK" bezeichnet) und
ein rekombinanter Vektor, enthaltend dasselbe.
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HINTERGRUND
DES STANDES DER TECHNIK
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PCK
stellt ein Enzym dar, das reversibel die Reaktion katalysiert, die
durch Carboxylierung von Phosphoenolpyruvat Oxalessigessigsäure bildet.
Bekannt sind die ATP-abhängige
PCK (EC 4.1.1.49) und die GTP-abhängige PCK (EC 4.1.1.32). Pflanzliche
PCKs sind ATP-abhängig
und spielen eine wichtige Rolle beim Photosynthese-Verfahren, durch
welches aus Kohlendioxid Stärke
gebildet wird.
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Andererseits
schließen
C4-Pflanzen hauptsächlich die Pflanzen ein, die
zur Familie der Gramineae gehören,
die in der tropischen Zone heimisch sind und für starke Sonnenlichteinwirkung,
hohe Temperaturen und Wassermangel gut angepasst sind. Die Rate
der Photosynthese von C4-Pflanzen ist insbesondere
das Zweifache der von C3-Pflanzen und die
Photosynthese wird nicht von Luftsauerstoff inhibiert. Die Photosynthese von
C4-Pflanzen erreicht keine Sättigung,
selbst wenn sie mit Licht mit einer Intensität bestrahlt werden, durch welche
die Photosynthese von C3-Pflanzen gesättigt wird.
Die optimale Temperatur für
die Photosynthese von C4-Pflanzen ist ferner
höher als
die von C3-Pflanzen.
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Wie
vorstehend erwähnt,
spielt die PCK von Pflanzen eine wichtige Rolle bei der Photosynthese. Wenn
folglich eine C3-Pflanze transformiert wird,
damit sie die PCK von C4-Pflanzen bildet,
wird erwartet, dass verschiedene Wirkungen erhalten werden können, wie
zum Beispiel die Steigerung der Photosyntheserate, eine effiziente
Verwertung des Sonnenlichts und Förderung der Photosynthese bei
hoher Temperatur. Bisher wurde jedoch das PCK-Gen von Pflanzen – und es
erübrigt
sich, dies von den C4-Pflanzen zu sagen – nicht vollständig sequenziert.
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BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft demgemäß die Bereitstellung eines
klonierten PCK-Gens einer C4-Pflanze, eines
rekombinanten Vektors enthaltend das Gen und einer mit dem rekombinanten
Vektor transformierten Pflanze.
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Diesen
Erfindern gelang das Klonieren des PCK-Gens von Urochloa panicoides,
bei der es sich um eine C4-Pflanze handelt,
und die Bestimmung der gesamten Sequenz des Gens ebenso wie die
durch das Gen codierte abgeleitete Aminosäuresequenz. Diesen Erfindern
gelang weiter die Konstruktion eines rekombinanten Vektors enthaltend
das PCK-Gen und die Transformation einer Pflanze mit dem rekombinanten
Vektor zum Erhalt einer transformierten Pflanze, die das PCK-Gen
exprimiert, wodurch die vorliegende Erfindung zum Abschluss gebracht
wird.
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Das
heißt,
es wird erfindungsgemäß eine klonierte
DNA bereitgestellt, welche die in SEQ ID NO 1, 2 oder 3 im Sequenzprotokoll
gezeigte Aminosäuresequenz
oder die in SEQ ID NO 1, 2 oder 3 gleiche Aminosäuresequenz codiert, außer dass
eine oder mehr Aminosäure(n)
addiert, deletiert oder insertiert wird/werden, unter der Voraussetzung,
dass das Polypeptid mit dieser Aminosäuresequenz eine Phosphoenolpyruvatcarboxykinase-Aktivität aufweist.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein rekombinanter
Vektor umfassend die erfindungsgemäße DNA, der diese DNA in einer
Wirtszelle exprimieren kann. Gegenstand der vorliegenden Erfindung
ist weiter eine mit dem erfindungsgemäßen rekombinanten Vektor transformierte
Pflanze, die Phosphoenolpyruvatcarboxykinase bildet.
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Das
PCK-Gen von Urochloa panicoides wurde erfindungsgemäß kloniert
und seine Nukleotidsequenz wurde bestimmt. Es wird erwartet, dass
durch Einführen
dieses Gens in eine C3-Pflanze, die Effizienz
der Photosynthese gefördert,
die Photoenergie effizienter verwertet und die Beständigkeit
der Pflanze gegenüber
hohen Temperaturen auch gefördert
werden kann.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 zeigt
die Positionen und Längen
der zum Erhalt von PCK1 eingesetzten cDNAs, bei der es sich um eine
cDNA-Sequenz von Urochloa panicoides der vollen Länge handelt;
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2 zeigt
die Positionen und Längen
der zum Erhalt von PCK2 eingesetzten cDNAs, bei der es sich um eine
cDNA-Sequenz von Urochloa panicoides der vollen Länge handelt;
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3 zeigt
die durch PCK1 codierte Aminosäuresequenz
im Vergleich zu der durch PCK2 codierten;
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4 ist
eine Gen-Map, welche die insertierte DNA-Region des für die Transformation
von Reispflanzen verwendeten rekombinanten Vektors zeigt; und
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5 stellt
eine schematische Ansicht dar, welche die Lokalisierung des PCK-Proteins
in einem Reis-Transformanten zeigt.
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BESTE AUSFÜHRUNGSFORM
DER ERFINDUNG
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Das
erfindungsgemäße Gen wurde
zur Herstellung einer cDNA-Bibliothek aus grünen Blättern von Urochloa panicoides
mittels eines herkömmlichen
Verfahrens und Identifizieren eines PCK-produzierenden Klons mittels eines Immunoblotting-Verfahrens
kloniert, das einen Anti-PCK-Antikörper einsetzt. Die Nukleotidsequenz
des Gens wurde durch Sequenzieren des cDNA-Inserts im Klon bestimmt
und die dadurch codierte Aminosäuresequenz
wurde abgeleitet. Das Molekulargewicht des Proteins mit der abgeleiteten
Aminosäuresequenz
ist identisch mit dem von gereinigter PCK, so dass angenommen wird,
dass das Gen die volle Länge der
PCK codiert. Das vorstehend erwähnte
Verfahren wird in den hierin nachstehend beschriebenen Beispielen
ausführlich
erläutert.
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Die
in der SEQ ID NO 1 und 2 im Sequenzprotokoll gezeigten Nukleotidsequenzen
wurden anhand des vorstehend erwähnten
Verfahrens bestimmt. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind
klonierte DNAs, codierend die in SEQ ID NO 1 bzw. 2 gezeigten Aminosäuresequenzen.
Der N-Terminus der aktiven PCK von Urochloa panicoides wurde auch
bestimmt, wie weiter konkret in den nachstehend beschriebenen Beispielen erläutert wird.
Aufgrund dessen wurden aktive PCKs nachgewiesen, deren N-Termini
Serin, welches die 57. Aminosäure
darstellt, Glutaminsäure,
welche die 61. Aminosäure
darstellt, Leucin, welches die 66. Aminosäure darstellt, Glycin, welches
die 69. Aminosäure
darstellt bzw. Glycin, welches die 75. Aminosäure der in SEQ ID NO. 1 gezeigten
Aminosäuresequenz
darstellt, sind. Folglich geht aus dieser Tatsache hervor, dass
die Aminosäuresequenz
von der 75. Aminosäure
Glycin bis zum C-Terminus zum Ausüben der PCK-Aktivität ausreichend
ist. Anhand der Tatsache, dass eine aktive PCK, die einen N-Terminus
oberstromig von der 57. Aminosäure
Serin von SEQ ID NO 1 aufweist, nicht gefunden wurde, wird angenommen,
dass die Aminosäuresequenz
von der 1. Aminosäure
Methionin bis zur 56. Aminosäure
Alanin während
des Reinigungsverfahrens des PCK-Proteins abgeschnitten wird. Dies
wurde in den nachstehend beschriebenen Beispielen durch Expression einer
DNA, umfassend eine Sequenz in der kleinen Rubisco-Untereinheit
von Reis bestätigt,
die aus Reis-Genom-DNA und der DNA, codierend die Polypeptid-Region
von der 57. Aminosäure
Serin bis zum C-Terminus hergestellt wird.
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In
den nachstehenden Beispielen wurden die in SEQ ID NO 1 und 2 gezeigten
Aminosäuresequenzen weiter
an die KpnI-Stelle (ein Teil der in SEQ ID NO 2a gezeigten Aminosäuresequenz
befindet sich in der oberstromigen Seite) ligiert, und eine DNA,
codierend eine Aminosäuresequenz
des Transit-Peptids, das aus der kleinen Rubisco-Untereinheit von
Reis stammte, wurde an die oberstromige der vorstehend erwähnten ligierten
DNA (SEQ ID NO 3) ligiert. Die Aminosäuresequenz vom 52. Serin bis
zum C-Terminus codiert das reifen PCK-Protein. Es wurde bestätigt, dass
die mit dieser DNA transformierte Reispflanze mit dieser DNA codierte PCK
produzierte, welche PCK eine PCK-Aktivität aufwies. Folglich gehören durch
Ligieren von Teilen einer Vielzahl natürlich vorkommender PCK-Gene
hergestellte DNAs auch zum erfindungsgemäßen Umfang.
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Es
ist im Stand der Technik überall
bekannt, dass es Fälle
gibt, worin die physiologische Aktivität von einem physiologisch aktiven
Peptid beibehalten wird, selbst wenn die Aminosäuresequenz des Peptids in einem
geringen Ausmaß modifiziert
ist, das heißt,
selbst wenn eine oder mehr Aminosäuren in der Aminosäuresequenz
substituiert oder deletiert sind, oder selbst, wenn eine oder mehr
Aminosäure(n)
an die Aminosäuresequenz
addiert oder in sie insertiert wird/werden. Die DNA-Fragmente, welche
die Polypeptide codieren, die solche Modifikationen aufweisen, die
PCK-Aktivität
aufweisen, sind im erfindungsgemäßen Umfang
enthalten. Deshalb gehören
DNAs, die das Polypetid mit der gleichen Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO
1, 2 oder 3 gezeigt codieren, außer dass eine oder mehr Aminosäure(n) addiert,
insertiert oder deletiert wird/werden, die PCK-Aktivität aufweist,
auch zum erfindungsgemäßen Umfang.
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Die
DNA-Modifikation, welche die Addition, Insertion oder Deletion der
dadurch codierten Aminosäuresequenz
veranlasst, kann durch eine im Stand der Technik überall bekannte
ortsspezifische Mutagenese erreicht werden (z. B. Nucleic Acid Research,
Vol. 10, Nr. 20, S. 6487–6500,
1982). In der vorliegenden Beschreibung versteht man unter „einer
oder mehr Aminosäure(n)" die Anzahl von Aminosäuren, die
mittels der ortsspezifischen Mutagenese addiert, insertiert oder
deletiert werden können.
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Die
ortsspezifische Mutagenese kann zum Beispiel unter Verwendung eines
synthetischen Oligonukleotid-Primers durchgeführt werden, der komplementär zu einer
einsträngigen
Phagen-DNA ist, außer
dass sich die gewünschte
Mutation wie folgt verhält.
Das heißt,
dass unter Verwendung des vorstehend erwähnten synthetischen Oligonukleotids
als ein Primer, von einem Phagen eine komplementäre Kette produziert wird und
Wirtsbakterienzellen mit der erhaltenen doppelsträngigen DNA
transformiert werden. Die Kultur der transformierten Bakterienzellen
wird auf Agar ausplattiert, und es werden aus einer den Phagen enthaltenden
Einzelzelle Plaques gebildet. Theoretisch enthalten 50% der neuen
Kolonien den Phagen mit einer einsträngigen Kette, welche die Mutation
trägt,
und die verbleibenden 50% der Kolonien enthalten den Phagen mit
der Originalsequenz. Die erhaltenen Plaques werden dann der Hybridisierung
mit einer mit einer Kinase behandelten synthetischen Sonde bei einer
Temperatur unterworfen, bei der die Sonde mit der DNA hybridisiert
wird, die genau die gleiche Sequenz wie die DNA mit der gewünschten
Mutation, aber nicht mit der Original-DNA-Sequenz, die nicht vollständig komplementär zur Sonde
ist, aufweist. Dann wurden die Plaques, in denen die Hybridisierung
beobachtet wurde, gewonnen, kultiviert und die DNA wird gesammelt.
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Außer der
vorstehend erwähnten
ortsspezifischen Mutagenese, schließen die Verfahren zur Deletion, Insertion
oder Addition von einer oder mehr Aminosäure(n) ohne Verlust der Enzymaktivität ein Verfahren
ein, worin das Gen mit einem Mutagen behandelt wird und ein Verfahren,
worin das Gen selektiv gespalten, ein ausgewähltes Nukleotid entfernt, addiert
oder substituiert und dann das Gen ligiert wird.
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Die
erfindungsgemäße DNA kann
anhand des in den nachstehenden Beispielen ausführlich beschriebenen Verfahrens
erhalten werden. Da die Nukleotidsequenz des PCK-Gens von Urochloa
panicoides wie in SEQ ID NO 1–3
gezeigt erfindungsgemäß bestimmt
wurde, kann das erfindungsgemäße Gen als
Alternative ohne weiteres anhand des PCR-Verfahrens unter Nutzung
der Genom-DNA von Urochloa panicoides als eine Matrize oder anhand
des RT-PCR-Verfahrens unter Nutzung von cDNAs von Urochloa panicoides
als eine Matrize erhalten werden.
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Die
erfindungsgemäße DNA kann
in einen Expressionsvektor für
Pflanzen insertiert werden, um einen rekombinanten Vektor zu erhalten.
Eine transformierte Pflanze, welche die PCK von Urochloa panicoides
exprimieren kann, kann mittels Transformation einer Pflanze mit
dem erhaltenen rekombinanten Vektor erhalten werden. Das Verfahren
zum Transformieren von Pflanzen wurde bereits etabliert, und das
Verfahren, das Agrobacterium tumefaciens einsetzt, wird bevorzugt
verwendet. Das Transformationsverfahren, das Agrobacterium tumefaciens
einsetzt, ist im Stand der Technik überall bekannt und Dikotyledonen
(z. B. Japanische Offenlegungsschrift (Kokai) Nr. 4-330234) ebenso
wie Monokotyledonen (WO 94/00977) können transformiert werden.
Geeignete Pflanzen zum Einführen
des erfindungsgemäßen PCK-Gens
schließen
Reis, Mais, Tomaten, Tabak und dergleichen ein, obwohl die Pflanzen
nicht darauf beschränkt
sind. Ein Beispiel des Verfahrens zur Transformation wird ausführlich in
den nachstehend beschriebenen Beispielen beschrieben.
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BEISPIELE
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Die
vorliegende Erfindung wird nun konkreter unter Bezugnahme auf die
Beispiele beschrieben. Es sollte jedoch zur Kenntnis genommen werden,
dass die vorliegende Erfindung nicht auf die folgenden Beispiele
beschränkt
ist.
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BEISPIEL 1 CLONIEREN UND
IDENTIFIZIEREN VON PCK1
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(I) MATERIALIEN UND VERFAHREN
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(1) PFLANZENMATERIAL
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Das
gesamte für
RNA-Isolationen verwendete Pflanzenmaterial stammte von U. panicoides,
Zugang CQ2798, erhältlich
von CSIRO, Division of Tropical Crops and Pastures, Brisbane, Queensland,
Australien. Im Licht gezüchtete
Pflanzen wurden während
der Sommermonate 5 Wochen in vollem Sonnenlicht gezogen. Im Dunkeln
gezüchtete
Pflanzen wurden bei 28°C
aus Samen, der auf nasses Gewebe in mit Aluminiumfolie eingewickelte
Polystyren-Kasten gesät
wurde, gezogen.
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(2) REINIGUNG VON PCK
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PCK
wurde aus von im Licht gezüchteten
Blättern
von U. panicoides, im Wesentlichen wie in Burnell JN, Purification
and properties of phosphoenolpyruvate carboxykinase from C4 plants, Aust. J. Plant Physiol. 13: 577–587 (1986),
beschrieben gereinigt, außer
dass eine zweite DEAE-Sepharose-CL-6B-Säule
(gewerblich erhältlich
von Pharmacia) ausgelassen wurde. Zwischen 100 μg und 200 μg Protein in 1 ml aus Fraktionen von
der Sephacryl S-300-Säule
(gewerblich erhältlich
von Pharmacia), die eine Peak-PCK-Aktivität enthielten, wurde
mit einem gleichen Volumen von 125 mM Tris-HCl, pH 6,8, 20% Glycerol,
4% SDS, 10% 2-Mercaptoethanol, 0,0025% Bromphenolblau kombiniert
und 2 Minuten bei 85°C
erhitzt. Die Proben wurden bei 12000 × g 5 Minuten vor der Trennung
auf 16 cm × 18
cm × 0,2
cm 10%igen SDS-Polyacrylamid-Trenngelen gemäß einem bekannten Verfahren
geklärt
(Laemmli UK: Cleavage of structural proteins during the assembly
of the head of bacteriophage T4, Nature 227: 680–685 (1970)). Die Gele wurden
1 Stunde in 0,5% Coomassie-Blau R-250, 40% Ethanol, 10% Essigsäure gefärbt und
mit 10% Methanol und 10% Essigsäure
entfärbt.
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Bei
der Präparation
zur Elektroelution wurden gefärbte
Proteinbanden ausgeschnitten, mit 0,15 M NaCl, 1% SDS, 50 mM Tris-HCl,
pH 7,5 und dann mit 10 mM Tris-Acetat, pH 8,6, 1 mM EDTA, 1% SDS äquilibriert.
Die Gelscheiben wurden mittels Passieren durch einen 5 ml fassenden
Spritzenzylinder zerkleinert und in die Anodenvertiefung der Falle
eines Little Blue TankTM-Elektroelutionsapparates (ISCO, USA)
gegeben. Die Falle wurde mit 10 mM Tris-Acetat, pH 8,6, 1 mM EDTA,
1% SDS gefüllt,
während
die Anoden- und Kathodenkammern mit 40 mM Tris-Acetat, pH 8,6, 1
mM EDTA, 1% SDS gefüllt
wurden. Die Elektroelution wurde 3 Stunden bei einer konstanten
Leistung von 3 W durchgeführt.
Die Rückgewinnung
des Proteins aus der Kathodenvertiefung der Falle betrug > 90%. Die elektroeluierte
PCK wurde mittels Zentrifugation in Centricon-30TM-Ultrafiltrationskapseln
(Amicon, Australien) konzentriert, um das 100fache mit PBS (15 mM
Natriumphosphat, pH 7,2, 140 mM NaCl, 3 mM KCl) verdünnt und
erneut konzentriert.
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(3) HERSTELLUNG VON ANTI-PCK-ANTISERUM
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Es
wurden ca. 500 μg
von mit Gel gereinigter PCK in 500 μl PBS mit einem gleichen Volumen
von Freund's kompletten
Adjuvans gemischt. Aliquote (500 μl)
des Gemischs wurden intramuskulär
in jeden Oberschenkel eines Kaninchens (eine langohrige Neuseeland-Varietät) injiziert.
30 Tage und 48 Tage nach der initialen Injektion erhielt das Kaninchen
wie vorstehend einen Boost, außer
dass Freunds inkomplettes Adjuvans verwendet wurde. Das Blut wurde
zum Zeitpunkt des zweiten Boosts und danach in 10- bis 14-tägigen Intervallen
aus einer Ohrvene entnommen. Die Blutproben wurden vor dem Klären mittels
Zentrifugation 10 Minuten bei 1000 × g koagulieren lassen. Das
geklärte
Serum wurde mit 0,02% Natriumazid hergestellt und bei 4°C aufbewahrt.
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(4) ELEKTROBLOTTING UND
IMMUNODETEKTION VON PCK
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Die
Proteine wurden mittels SDS-PAGE auf 10% Acrylamid-Trenngelen (Laemmli,
vorstehend) aufgetrennt und entweder mit Coomassie-Blau R-250 gefärbt oder
zum Elektroblotting verwendet. Für
die Immunoblotting-Experimente wurden die Gele in 25 mM Tris, 192
mM Glycin, 20% Methanol vor dem Elektroblotting auf der Nitrocellulose-Membran
(Schleicher und Schüll,
Deutschland) mit diesem Puffer in einer Trans-BlotTM-Kammer
(Bio-Rad, Australien) 1 Stunde auf Eis bei 250 mA äquilibriert.
Die Blots wurden mit 0,5% Magermilchpulver in TBST (12,5 mM Tris-HCl,
pH 8,0, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 0,1% Tween 20) 16 Stunden vor dem
Zufügen
des geklärten
Kaninchen-anti-PCK-Antiserums und 1-stündiger Inkubation blockiert.
Die Blots wurden 3 × 10
Minuten mit TBST gewaschen und die gebundenen Antikörper unter
Verwendung des ProtBlotTM-Detektionssystems
nach Angaben des Herstellers (Promega, Australien) nachgewiesen.
Für die N-terminale
Aminosäuresequenz-Bestimmung
wurden die Proteine an die Polyvinylidendifluorid-Membran (PVDF-Membran;
Bio-Rad, Australien) mittels Elektroblotting wie oben transferiert,
außer
dass es sich bei dem verwendeten Tank-Puffer um 10 mM CAPS, pH 11,
und 10% Methanol handelte. Die Blots wurden mit 0,1% Coomassie-Blau
R-250 in 50% Methanol gefärbt,
mit 50% Methanol entfärbt
und luftgetrocknet. Die bei der Sequenzbestimmung zu verwendenden
Proteinbanden wurden ausgeschnitten.
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(5) ISOLATION VON RNA
AUS U. PANICOIDES
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Die
Gesamt-RNA wurde nach dem Verfahren von Chomczynski und Sacchi (Chomczynski
P, Sacchi N: Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium
thiocyanate phenol chloroform extraction. Anal. Biochem. 162: 156–159 (1987))
aus verschiedenen Geweben von U. panicoides gereinigt. Poly(A)+-RNA wurde aus der Gesamt-RNA mittels Batch-Behandlung
mit Oligo-(dT)25-konjugierten paramagnetischen
Partikeln (Dynal, Norwegen) nach dem Verfahren des Herstellers isoliert.
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(6) KONSTRUKTION UND SCREENING
DER cDNA-BIBLIOTHEK VON U. PANICOIDES
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Eine
direktionale cDNA-Bibliothek wurde in λgt11D aus 3 μg Poly(A)+-RNA
von U. panicoides unter Verwendung eines TimeSaverTM-cDNA-Synthese-Kits
(Amrad-Pharmacia, Australien) nach den Anleitungen des Anbieters
konstruiert. Die Verpackung der Bibliothek erfolgte unter Verwendung
von „Gigapack-IITM Packing Extracts" (Stratagene, USA), und wurde titriert
und auf ausplattierten Y1088-Bakterien
amplifiziert (Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T: Molecular Cloning.
A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, NY (1989)). Die Transfers wurden wie vorstehend
für Immunoblots
1 Stunde vor der 16-stündigen
Inkubation in 50 ml TBST enthaltend 10 μl Kaninchen-anti-PCK-Antiserum
blockiert. Die Transfers wurden gewaschen und die gebundenen Antikörper wie
in den Immunoblotting-Experimenten nachgewiesen.
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Zum
Screening durch Hybridisierung wurden Plaques an Hybond-N+TM (Amersham, Australien) transferiert,
denaturiert und Phagen-DNA mit 0,4 M NaOH nach Angabe des Herstellers
fixiert. Die Membranen wurden 1 Stunde bei 42°C in 5 × SSC (1x = 0,15 M NaCl, 15
mM Trinatriumcitrat), 50 Formamid, 0,1% SDS, 50 mM Natriumphosphat
(pH 7,0), 0,1% FicollTM (Amrad-Pharmacia,
Australien), 0,1% Polyvinylpyrrolidon, 0,1% Rinderserumalbumin,
250 μg/ml
hitzedenaturierter Heringsspermien-DNA vor dem Zufügen einer hitzedenaturierten
radioaktiv markierten Sonde vorhybridisiert. Die DNA-Restriktionsfragment-Sonden
wurden aus den Agarosegelen gereinigt (Sambrook J., et al., vorstehend)
und mit [α-32P]-dCTP (NEN-DuPont, Australien) durch „Random
Priming" unter Verwendung
eines GIGAprime-DNA-Markierungskits (Bresatec, Austalien) radioaktiv
markiert. Die Hybridisierung wurde 16 Stunden bei 42°C durchgeführt, bevor
die Membranen zweimal in 2 × SSC,
0,1% SDS 15 Minuten bei 42°C
und zweimal in 0,1 × SSC,
0,1% SDS 15 Minuten bei 65°C
gewaschen wurden.
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(7) SUBKLONIEREN UND SEQUENZIEREN
VON cDNA-INSERTS
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Phagen-DNA
wurde aus Plattenlysaten hergestellt und die Inserts wurden in pBluescript
II-KSTM (Stratagene, USA) unter Verwendung
von Standardverfahren (Sambrook J. et al., vorstehend) subkloniert.
Zum Sequenzieren wurden Sets von ineinandergeschachtelten Deletionen
unter Verwendung von Exonuklease III (Henikoff S: Unidirectional
digestion with exonuclease III creates targeted breakpoints for
DNA sequencing. Gene 28: 351–359
(1984)), gefolgt vom Aufschluss der Mungbohnen-Nuklease vor der
erneuten Ligation, konstruiert. Die Minipräparationen durch alkalische
Lyse (Sambrook J. et al., vorstehend) aus geeigneten Deletionsplasmiden
wurden durch Kochen in Alkali denaturiert (Yie Y. Wei Z, Tien P:
A simplified and reliable protocol for plasmid DNA sequencing: fast
miniprep and denaturation. Nucleic Acids Res 21: 361 (1993)) und
unter Verwendung des Didesoxy-Kettenterminationsverfahrens (Sanger
F, Nicklen S, Coulson AR: DNA sequencing with chain terminating
inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463–5467 (1977)) mit einem T7-Sequencing KitTM (Amrad-Pharmacia, Australien) sequenziert.
Die Restriktionsenzyme und andere Nukleinsäure modifizierenden Enzyme
wurden von Amrad-Pharmacia, Australien, bezogen.
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(8) NORTHERN-ANALYSE
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Poly(A)+-RNA wurde auf einem 1,2%igen Agarosegel
enthaltend 8 mM Formaldehyd getrennt (Sambrook J. et al., vorstehend).
Die RNA wurde 2 Stunden unter einem Druck von 75 mmHg unter Verwendung von
0,4 M NaOH als der Puffer an Hybond-N+TM transferiert.
Die Membranen wurden 3–4
Stunden bei 42°C
in 0,9 M NaCl, 6 mM EDTA, 60 mM NaH2PO4, pH 7,4, 50% Formamid, 0,1% SDS, 10% Dextransulfat,
0,04% FicollTM, 0,04% Polyvinylpyrrolidon,
0,04% Rinderserumalbumin, 0,5 mg/ml DNA von denaturierten Heringsspermien
vorhybridisiert. Die hitzedenaturierten, radioaktiv markierten Restriktionsfragmente
wurden zugefügt und
die Hybridisierung wurde 16 Stunden bei 42°C durchgeführt. Die Membranen wurden wie
vorstehend für Plaque-Lifts
beschrieben gewaschen.
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ERGEBNISSE
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(1) HERSTELLUNG VON KANINCHEN-ANTI-PCK
ANTISERUM VON U. PANICOIDES
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Der
erste Schritt bei der molekularen Charakterisierung von PCK von
U. panicoides bestand darin, ein Antiserum gegen gereinigte PCK
zu erhalten. Die Ammoniumsulfat-Fraktionierung gefolgt von der Ionenaustausch-
und Molekularsieb-Säulenchromatographie
wurden zur Reinigung von PCK von im Feld gewachsenen U. panicoides
nach Burnell JN (vorstehend) verwendet. Protein aus der Peakfraktion,
die mittels Säulenchromatographie
auf Sephacryl-S-300 (Pharmacia) erhalten wurde, wurde mit hilfe
von SDS-PAGE getrennt.
Das Färben
mit Coomassie-Blau ließ fünf Protein-Spezies
von ca. 69, 63, 62, 61 und 60 kDa erkennen. Es wurde angenommen,
dass es sich bei der am reichlichsten vorkommenden Spezies, die
bei 62 kDa wanderte, um PCK handelt und das Gel wurde gereinigt.
Das gereinigte Endprodukt schien nach SDS-PAGE homogen zu sein und
wurde folglich als das Antigen zur Herstellung eines Kaninchen-Antiserums
verwendet.
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Das
sich ergebende Antiserum wurde zum Sondieren eines Immunoblots der
gleichen Säulenfraktion zur
Antigenreinigung verwendet. Das erhaltene Muster war identisch mit
dem mit Coomassie gefärbten
Profil sowohl hinsichtlich der nachgewiesenen Proteine als auch
der relativen Färbungsintensitäten der
fünf Spezies. Wenn
der Rohgewebsextrakt von U. panicoides mit diesem Antiserum sondiert
wurde, wurden jedoch feine Unterschiede bei der Färbungsintensität gesehen.
Im Rohextrakt färbte
sich die Spezies von 63, 62 und 61 kDa mit gleicher Intensität, während sich
die Spezies von 60 kDa viel weniger intensiv anfärbte, wohingegen sich in der
gereinigten PCK, die Spezies von 63 kDa weniger intensiv als die
anderen Spezies anfärbte.
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(2) KLONIERUNGS- UND SEQUENZANALYSE
VON PCK-cDNA
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Aus
grünen
Blättern
der im Feld gewachsenen U. panicoides isolierte Poly(A)+-RNA
wurde zur Konstruktion einer cDNA-Expressionsbibliothek in einem
Vektor des λgt11-Derivats
verwendet. Wenn 2 × 105 Plaques dieser Bibliothek mit dem Anti-PCK-Antiserum
durchsucht wurden, wurden 40 immunreaktive Klone erhalten. Zwölf von diesen
wurden erneut auf Homogenität
durchsucht. Die cDNA-Inserts wurden subkloniert und die Enden sequenziert.
Alle 12 Inserts wiesen Homologie zur PCK-Sequenz von Saccharomyces
cerevisiae auf (Stucka R et al., Nucleotide sequence of the phosphoenolpyruvate
carboxykinase gene from Saccaromyces cerevisiae. Nucleic Acids Res
16: 10926 (1988)). Das längste
Insert, das von λPCK100101,
betrug 1,4 kb und reichte folglich nicht aus, um das PCK-Protein
von ca. 62 kDa zu codieren. Zum Erhalt von cDNAs, die den gesamten
offenen Leserahmen von PCK abdecken, wurde die Bibliothek erneut
mit radioaktiv markierten Restriktionsfragmenten von den 5'-Enden der cDNAs,
die sich progressiv mehr in der 3'-Richtung erstrecken, durchsucht. Die
sich ergebenden überlappenden
Klone, die in beiden Richtungen vollständig sequenziert wurden, sind
in 1 ersichtlich. Das λPCK110402-Insert überlappt
die λPCK100101-
und λPCK190203-Inserts
um 675 bzw. 132 bp. Die überlappenden
Regionen dieser Klone weisen identische Sequenzen auf.
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Aufgrund
dessen, wurden insgesamt 2220 bp der cDNA-Sequenz bestimmt, die
einen offenen Leserahmen (ORF) von 1872 bp, wie in SEQ ID NO 1 im
Sequenzprotokoll gezeigt ist, einschließen. Dieser ORF codiert für ein Protein
mit 624 Resten. Das diesen ORF codierende Gen wird als PCK1 bezeichnet.
Der PCK1-ORF ist von einer 3'-untranslatierten
Region mit 288 bp, die sich von einem Poly(A)-Schwanz erstreckt und
einer 5'-untranslatierten
Region mit 57 bp flankiert.
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(3) EIGENSCHAFTEN VON
PCK1-PROTEIN
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Die
molekulare Masse des abgeleiteten PCK1-Proteins mit 624 Resten beträgt 68 474
Da. Der Algorithmus von Kyte und Doolittle (Kyte J, Doolittle RF:
A simple method for displaying the hydropathic character of a protein,
J. Mol. Biol. 157: 105–132
(1982)) deutet darauf hin, dass PCK1 eine hydrophile Beschaffenheit insgesamt
mit keinen Transmembran-Domänen
gemäß den Kriterien
von Popot und de Vitry, besitzt (Popot J-L, de Vitry C: On the microassembly
of integral membrane proteins. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem.
19: 369–403
(1990)). Dies ist mit seiner cytosolischen Lokalisierung konsistent.
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(4) AMINO-TERMINALE SEQUENZANALYSE
VON PCK
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Die
N-terminale Aminosäuresequenz
der PCK von U. panicoides wurde mittels direkter Sequenzierung bestimmt.
Die Proteine in der von der Sephacryl-S-300-Säule (Pharmacia) gewonnenen
Fraktion, enthaltend die Peak-PCK-Aktivität, wurden mittels SDS-PAGE
dergestalt getrennt, dass Proteine von 60–63 kDa als eine einzelne breite
Bande liefen. Dieses Material wurde auf die PVDF-Membran geblotted
und die gesamte Bande zwölf
Zyklen des automatisierten Edman-Abbaus unterworfen. Jeder Zyklus
führte
zur Freisetzung nachweisbarer Mengen von entweder vier oder fünf Aminosäuren. Aus
diesen Daten wurden insgesamt fünf überlappende
Sequenzen, die der von der PCK-cDNA von U. panicoides abgeleiteten
Aminosäuresequenz entsprechen,
identifiziert. Diese Sequenzen sind in der nachstehenden Tabelle
1 ersichtlich.
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-
Wie
in Tabelle 1 ersichtlich ist, beginnen alle fünf Sequenzen innerhalb von
19 Resten voneinander, wobei die am meisten N-terminalen 56 Reste
vom initiierenden Methionin beginnen. Von den identifizierten N-Termini
waren die Sequenzen I und III am reichlichsten vorhanden. In einem
zweiten Experiment wurde die PCK wie vorstehend erwähnt elektrophoretisch
aufgetrennt und jede Bande getrennt sequenziert. Ergebnisse wurden
jedoch nur für
die Spezies mit 62 und 61 kDa erhalten. Die Bande von 62 kDa ergab
nur N-terminale Sequenzen III und IV, die Proteinen mit abgeleiteten
molekularen Massen von 61,8 bzw. 61,4 kDa entsprachen. Die Bande
von 61 kDa ergab nur Sequenz V, die zu einem Protein mit einer abgeleiteten
Masse von 60,8 kDa führte.
Zusammengenommen deuten die N-terminalen Sequenzierungsexperimente
darauf hin, dass das PCK-Translationsprodukt von U. panicoides von
69 kDa durch die Entfernung einer Leader-Sequenz mit 56–75 Resten
zu einem reifen Protein von zwischen 60,8 und 62,7 kDa verarbeitet
wird. Folglich werden erfindungsgemäß auch DNAs, codierend diese
fünf Protein-Spezies
bereitgestellt.
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(5) LICHTEINWIRKUNGSEFFEKT
AUF DIE PCK1-EXPRESSION
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Samen
von U. panicoides wurden gekeimt und die Sämlinge vor der Exposition einer
96-stündigen kontinuierlichen
Lichteinwirkung 7 Tage im Dunkeln gezogen. Die etiolierten Triebe
waren im Allgemeinen 5 bis 6 cm lang und wogen 15 bis 20 mg. Die
elongierten Coleoptilen waren weiß mit gelben unreifen Blättern, die
durch die intakten Spitzen sichtbar waren. Nach 6-stündiger Lichtexposition
waren die Spitzen der Coleoptilen rupturiert und die Blatthalme
begannen sichtbar zu grünen
und zu expandieren. Die Blätter
grünten
weiterhin und expandierten während
der gesamten 96-stündigen
Lichtbehandlung. Im Gegensatz dazu veränderte sich der Rest der Coleoptilen
sehr wenig, wobei die Länge
und das Gewicht der Triebe während
der Lichtexposition nur sehr wenig zunahmen.
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Die
Triebe wurden an verschiedenen Zeitpunkten während der 96-stündigen Lichtbehandlung
geerntet. Die Gesamt-RNA wurde aus diesen Trieben präpariert,
auf einem Agarosegel getrennt, geblottet und mit dem radioaktiv
markierten 1,4 kb-Insert von λPCK100101
sondiert. Die Gesamt-RNA aus der Wurzel und dem Gewebe grüner Blätter von
im Licht gezogener Pflanzen wurde auch einbezogen. In der Gesamt-RNA
aus dem grünen
Blatt, weist die wichtigste, durch die teilweise PCK-cDNA-Sonde
nachgewiesene Spezies, eine Länge von
2,7 kb auf. Die Sonde hybridisiert auch an einen heterogenen „Smear" von kleineren RNAs
als 2,7 kb. In Experimenten, in denen Poly(A)+-RNA
mit radioaktiv markierten Restriktionsfragmenten von jedem Ende
und der Mitte der PCK1-cDNA aus grünen Blättern sondiert wird, wird nur
die 2,7-kb-RNA nachgewiesen. Folglich handelt es sich bei dieser
Spezies am wahrscheinlichsten um die PCK1-mRNA, während der
heterogene „Smear" in der Gesamt-RNA
auf die PCK1-Transkripte zurückzuführen ist,
denen die Poly(A)-Schwänze
fehlen. Die nicht polyadenylierten RNAs könnten entweder aus dem Abbau
der PCK1-mRNA oder der prämaturem
Termination der PCK1-Transkription entstehen.
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Die
1,4-kb-cDNA-Sonde weist nicht die PCK1-mRNA in der Gesamt-RNA aus
Wurzeln oder etiolierten Trieben nach. Nach 6-stündigem Grünen wird die PCK1-mRNA jedoch
in den Trieben nachgewiesen. Die Fülle dieser RNA nimmt während der
nächsten
84 Stunden stetig zu, aber zu keiner Zeit während des Lichtregimes ist
die PCK-mRNA so reichhaltig wie im grünen Blatt. Obwohl das 2,7-kb-Transkript
nach nur 6-stündiger
Lichtexposition vorliegt, wird der heterogene „Smear" nicht bis nach der 48-stündigen Lichtexposition
nachgewiesen.
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BEISPIEL 2 CLONIEREN UND
IDENTIFIKATION VON PCK2
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Das
gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 wurde wiederholt. Aufgrund der
durch Analyse bei Isolation der PCK1 cDNA erhaltenen positiven Klone,
wurde ein Klon mit einer hohen Homologie mit PCK1-cDNA, aber mit einer
Nukleotidsequenz erhalten, die sich von der von PCK1-cDNA unterscheidet.
Die überlappenden
Klone sind in 2 gezeigt. Das λPCK170204-Insert überlappt
die λPCK190202-
und λPCK110101-Inserts
um 227 bzw. 107 bp. Die überlappenden
Regionen dieser Klone weisen identische Sequenzen auf. Aufgrund
dessen wurden insgesamt 2245 bp der cDNA-Sequenz bestimmt, die einen
offenen Leserahmen (ORF) von 1878 bp, wie in SEQ ID NO 2 des Sequenzprotokolls
gezeigt, umfassen. Dieser ORF codiert für ein Protein mit 626 Resten.
Das Gen, das diesen ORF codiert, wird als PCK2 bezeichnet. Der PCK2-ORF
ist von einer 3'-untranslatierten
Region mit 304 bp flankiert, die sich bis zu einem Poly(A)-Schwanz
erstreckt und eine 5'-untranslatierte Region
mit 44 bp. Die durch PCK2 codierte Aminosäuresequenz weist eine Homologie
von 96% mit der durch PCK1 codierten Aminosäuresequenz auf, und unter den
26 Aminosäureresten,
die nicht identisch sind, sind 22 Aminosäurereste ähnlich den Aminosäureresten
in diesen Aminosäuresequenzen.
Der Vergleich zwischen den Aminosäuresequenzen von PCK1 und PCK2
ist in 3 ersichtlich.
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BEISPIEL 3 EINFÜHRUNG DES
PCK-GENS IN REIS UND EXPRESSION
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1. KONSTRUKTION
DES GENS ZUR EXPRESSION VON PCK-CDNA IN PFLANZEN
-
MATERIALIEN
UND VERFAHREN
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PFLANZENMATERIAL
UND ISOLATION VON GENOM-DNA
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Genom-DNA
wurde aus grünen
Blättern
einer Reispflanze (Oryza sativa cv. Nipponbare) extrahiert, die
in einem Gewächshaus
gezogen, oder grünen
Blättern
einer Maispflanze (Zea mays L. Subsp. Mays Linie B73), die anhand
des Verfahrens von Komari et al. gezogen wurde (Komari T, Saito
Y, Nakakido F, Kumashiro T: Efficient selection of somatic hybrids
in Nicotiana tabacum L. using a combination of drug-resistance markers introduced
by transformation. Theor. Appl. Genet. 77: 547–552 (1989)).
-
DNA-MANIPULATION
-
DNA-Manipulation
wurde gemäß dem Standardverfahren
durchgeführt
(Sambrook J. et al., vorstehend). Oligo-DNAs wurden unter Verwendung
eines DNA-Synthesizers 392 (Applied Biosystems, USA) hergestellt.
Die PCR wurde gemäß dem Standardverfahren
durchgeführt
(Mcpherson MJ, Quirke P, Taylor GR: PCR. A practical approach. Oxford
express press, Oxford NY (1991)). Zum Subclonieren von PCR-Produkten, wurde
das TA Cloning KitTM (Invitrogen, USA) verwendet.
Die Sequenzierung wurde unter Verwendung des DNA Cycle Sequencing
KitsTM (Applied Biosystems, USA) und dem
Sequencer 373A (Applied Biosystems, USA) durchgeführt.
-
PRÄPARATION
ANDERER DNA-REGIONEN
-
Ein
Promotor wurde aus der Genom-DNA von Mais durch das PCR-Verfahren
unter Verwendung von Primern isoliert, die bezogen auf die Sequenz
der Promotor-Region der Mais-Phosphoenolpyruvatcarboxylase synthetisiert
wurde (Hudspeth RL, Grula JW: Structure and expression of the maize
gene encoding the phosphoenolpyruvate carboxylase isozyme involved
in C4 photosynthesis. Plant Mol. Biol. 12: 579–589 (1989)). Die Nukleotidsequenzen
der verwendeten Primer waren wie folgt:
Forward-Primer: 5'-AGACGACTCTTAGCCACAGCC-3'
Reverse-Primer:
5'-TCGATGGAGTGGTGCTTCTC-3'
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Als
Terminator wurde das Blumenkohl-Mosaik-Virus-35S-Terminator (SphI-EcoRI-Fragment)
auf einer Plasmid-DNA pGL2 eingesetzt (Biland B, Iida S, Peterhans
A, Potrykus I, Panszkowski J: The 3'-terminal
region of the hygromycin-B-resistance gene is important for its
activity in Escherichia coli and Nicotiana tabacum. Gene 100: 247–250 (1991)).
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Die
Region, codierend das Transit-Peptid, wurde anhand des PCR-Verfahrens
unter Verwendung von Primern, die bezogen auf die Sequenz der kleinen
Rubisco-Untereinheit von Reis synthetisiert wurden, aus der Reis-Genom-DNA
isoliert (Matsuoka M, Kano-Murakami Y, Tanaka Y, Ozeki Y, Yamamoto
N: Classification and nucleotide sequence of cDNA encoding the small
subunit of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase from rice. Plant
Cell Physiol. 29: 1015–1022
(1988)). Die Nukleotidsequenzen der verwendeten Primer waren wie
folgt:
Forward-Primer: 5'-GGAATTCCATGGTGCATCTCAAGAAGTAC-3'
Reverse-Primer:
5'-GCTCTAGACTGCATGCACCTGATCC-3'
-
Die
Gene, codierend die an Chloroplasten zu transportierende PCK, wurden
am KpnI-Ort in den Inserts von λPCK170204
und λPCK100101
ligiert, und das vorstehend erwähnte
Gen, codierend das Transit-Peptid, wurde an den oberstromigen Ort
der durch PCK2 codierten 57. Aminosäure Serin ligiert.
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Im
Multiklonierungsort einer Plasmid-DNA pUC18 (Yanish-Perron C, Vieira
J, Messing J: Improved M13 phage cloning vectors and host strains:
nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors. Gene 33:
103–119
(1985)), wurden der Promotor, das Gen, codierend das Transit-Peptid
und PCK, und der Terminator in der erwähnten Reihenfolge insertiert.
Das konstruierte Plasmid wurde als pPCK bezeichnet.
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Die
Gen-Map des konstruierten Plasmids ist in 4 ersichtlich.
Die Nukleotidsequenz der konstruierten cDNA-Region wird in SEQ ID
NO 3 im Sequenzprotokoll gezeigt. In der in SEQ ID NO 3 gezeigten
Nukleotidsequenz, stellt nt1–nt153
die Region dar, die das Transit-Peptid codiert, das aus der kleinen
Rubisco-Untereinheit von Reis herrührte, nt154–nt966 die Region darstellt,
die den N-terminalen Ort von PCK2 codiert und nt967–nt1863
die Region darstellt, die den C-terminalen Ort von PCK1 codiert.
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2. TRANSFORMATION
VON REISPFLANZEN
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MATERIALIEN
UND VERFAHREN
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Die
Oberflächen
von Samen der Japonica-Reisvarietät „Tsukinohikari" wurde 30 Sekunden
mit 70%igem Ethanol und dann 40 Minuten mit 1%igem Natriumhypochlorit
sterilisiert und dreimal mit sterilisiertem Wasser gewaschen. Die
Samen wurden dann auf festes 2N6-Medium gegeben und bei 30°C im Dunkeln kultiviert.
Die aus der Scutella unreifen Samen dedifferenzierten Kalli wurden
in flüssigem
N6-Medium bei 25°C im
Dunkeln bei einer Umdrehung von 125 U/min subkultiviert. Die kultivierten
Zellen wurden jede Woche in frischem Medium subkultiviert.
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Nach
3 Tagen ab dem Beginn einer Subkultur wurden die Zellen in einer
Enzymlösung,
enthaltend 1,0% Cellulase Onozuka (Yakult Honsha, Japan), 1,0% Macerozym
(Yakult Honsha, Japan), 0,1% Pectoriaze Y-23 (Seishin Seiyaku, Japan),
0,5% Dricellase (Kyowa Hakko, Japan) und 0,4 M Mannitol suspendiert
und die Suspension wurde 3 Stunden bei 30°C im Dunkeln stehen lassen.
Die Zellsuspension wurde dann durch ein Nylonnetz einer Maschengröße von 20
um filtriert und das erhaltene Filtrat wurde 5 Minuten bei 50 × g zentrifugiert.
Das erhaltene Präzipitat
aus Protoplasten wurde in 0,4 M Mannitol suspendiert und die Protoplasten wurden
zweimal mit dieser Lösung
gewaschen.
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Die
erhaltenen Protoplasten wurden in EPAA-Puffer suspendiert (Tada
Y, Sakamoto M, Fujimura T: Efficient gene introduction into rice
by electroporation and analysis of transgenic plants: use of electroporation buffer
lacking chloride ions. Theor. Appl. Genet. 80: 475–480 (1990))
und die Suspension wurde 5 Minuten in Eis stehen lassen. Zur Protoplasten-Suspension
wurden 10 μg
pGL2-Plasmid und 30 μg
pPCK-Plasmid zugefügt
und es wurde unter Verwendung eines Elektroporationsapparates ein
elektrischer Puls von 250 μF,
600 V/cm, auf die Suspension aufgebracht (Bio-Rad, USA). Die Puls-behandelten
Protoplasten wurden 15 Minuten in Eis und dann 30 Minuten bei Raumtemperatur
stehen lassen.
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Die
Protoplasten wurden mittels Zentrifugation gesammelt und in R2-1-Medium,
enthaltend 1,25% SeeplaqueTM-Agarose (FMC,
USA) auf eine Zellpopulation von 3 × 105 Zellen/ml
suspendiert. Die Suspension wurde dann auf einer Petrischale (9
cm) in der Form kleiner Tröpfchen
verfestigt. Dazu wurden R2-1-Medium und Reis-Oc-Zellen (Baba A,
Hasezawa S, Shono K: Cultivation of rice protoplasts and their transformation mediated
by Agrobacterium spheroplast. Plant Cell Physiol. 27: 463–471 (1986))
zugefügt
und die Resultante wurde bei 25°C
im Dunkeln kultiviert.
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Zwei
Wochen danach wurden das flüssige
Medium und die Oc-Zellen entfernt und R2-t-Medium wurde zugefügt, gefolgt
von der Kultur bei 25°C
unter kontinuierlicher Beleuchtung. Eine Woche danach wurde das Medium
durch R2-t-Medium enthaltend 40 mg/l Hygromycin ersetzt und die
Kultur fortgesetzt. Eine Woche danach, wurden die Agarose-Tröpfchen enthaltend
Kalli mit Durchmessern von ca. 0,2–0,5 mm zusammen mit kleinen
Mengen sterilisierten Wassers aufgespalten und die Resultante wurde
auf N6-12-Medium gegeben, gefolgt von Kultivieren der Resultanten
bei 25°C
unter kontinuierlicher Beleuchtung. Als die Kalli wuchsen und einen
Durchmesser von nicht weniger als 2 mm aufwiesen, wurden die Kalli
an N6S3-Medium, enthaltend 40 mg/l Hygromycin, transplantiert, und
die Kultur wurde weiter fortgesetzt. Differenzierte Pflanzen, die
bis zu einer Höhe
von nicht weniger als ca. 10 cm wuchsen, wurden in Töpfe transplantiert
und in einem Gewächshaus kultiviert.
-
-
-
LITERATUR
-
- Chu, C.-C. (1978) The N6 medium and its application
to anther culture of cereal crops. In Proc. Symp. Plant Tissue Culture.
Peking: Science Press, S. 43–50;
Murashige, T. Und Skoog, F. (1962) A revised medium for rapid growth
and bio assay with tobacco tissue culture. Physiol. Plant. 15: 473–497;
- Ohira, K., Ojima, K. and Fujiwara, A. (1973) Studies on the
nutrition of rice cell culture I. A simple, defined medium for rapid
growth in suspension culture. Plant Cell Physiol. 14: 1113–1121;
- Toriyama, K., Hinata, K. and Sasaki, T. (1986) Haploid and diploid
plant regeneration from protoplasts of anther callus in rice. Theor.
Appl. Genet. 73: 16–19.
-
3. LOKALISIERUNG
VON PCK-PROTEIN IN EINER TRANSFORMIERTEN REISPFLANZE
-
MATERIALIEN
UND VERFAHREN
-
Aus
den grünen
Blättern
einer transformierten Reispflanze, die in einer künstlichen
Wetterkammer gezogen wurde (28°C
Tag/22°C
Nacht, Regime: 16 Stunden (langer Tag)), wurden die Hauptvenen entfernt
(5–10 g)
und die Blätter
wurden in 0,5–1
mm breite Stücke
geschnitten. Die erhaltenen Blattstücke wurden in einer Enzym-Lösung, enthaltend
0,8% Cellulase Onozuka RS, 0,8% Fancellase (Yakult Honsha, Japan),
0,25% Pectolyase Y-23, 150 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 5,6), 0,3%
Rinderserumalbumin und 0,4 M Mannitol 1 Stunde bei 30°C aufgeschlossen.
Das behandelte Gewebe wurde mit Puffer gewaschen (50 mM Hepes-KOH, pH
7,0, 0,33 M Sorbitol, 2 mM EDTA, 1 mM MgCl2,
1 mM MnCl2, 0,1% Rinderserumalbumin) und
im ca. 10fachen Volumen von eiskaltem Puffer, enthaltend 1 mg/ml
Natriumisoascorbat, gefolgt von Homogenisierung des Gewebes mit
einem PolytronTM-Homogenisator (Kinematica,
Schweiz) suspendiert. Die Homogenisierung mit dem Polytron-Homogenisator
wurde zweimal 3 Sekunden lang bei der höchsten Leistungsstufe durchgeführt. Das
erhaltene Homogenat wurde durch 4-lagiges MiraclothTM (Calbiochem,
USA) filtriert und das Filtrat wurde schnell zentrifugiert (die
Umdrehung wurde vermindert, wenn sie 6000 × g erreichte). Das erhaltene
Präzipitat
wurde in einem Puffer suspendiert und die Resultante wurde als Chloroplast-Probe
verwendet. Zu dieser Probe wurde Trypsin bis zu einer Konzentration
von 50 μg/ml
zugefügt
und das Gemisch wurde 30 Minuten in Eis stehen lassen. Nach dieser
Trypsin-Behandlung wurden die Chloroplasten durch Zentrifugation 3
Minuten bei 10000 × g
gesammelt und in 50 mM Hepes-KOH-Puffer (pH 8,0) suspendiert. Die
Suspension wurde bei –80°C gefroren
und dann bei Raumtemperatur aufgetaut, um die Chloroplasten aufzuspalten.
Die aufgespaltenen Chloroplasten wurden 5 Minuten bei 10000 × g zentrifugiert
und der erhaltene Überstand
(lösliche
Chloroplasten-Fraktion) wurde der SDS-PAGE unterworfen. Nach der
Elektrophorese wurden die Proteine im Gel elektrophoretisch an eine
Nitrocellulose-Membran transferiert und das PCK-Protein wurde unter Verwendung
von gegen PCK-Protein von U. panicoides gerichtetes Kaninchen-Antiserum,
Peroxidase-markierter Anti-Kaninchen-IgG-Ziegen-Antikörper (MBL)
und dem HRPTM-Färbungskit (Bio-Rad, USA) nachgewiesen.
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ERGEBNISSE
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In
der löslichen
Fraktion der isolierten Chloroplasten wurde ein PCK-Protein einer
Größe, die
der Größe des verarbeiteten
Transit-Peptids entspricht, nachgewiesen. Da das PCK-Protein durch
die Trypsin-Behandlung
der isolierten Chloroplaste nicht zersetzt wurde, wird angenommen,
dass PCK-Protein in die Chloroplasten (Stroma-Fraktion) transportiert
wurde.
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4. MESSUNG
DER PCK-AKTIVITÄT
DES TRANSFORMIERTEN REIS
-
MATERIALIEN
UND VERFAHREN
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Alle
die folgenden Vorgänge
wurden bei 4°C
durchgeführt.
Jeweils ca. 0,2 g grüne
Blätter
von Reis-Transformanten (PKS12 und PKS18) wurden mit einem Mörser zusammen
mit 1 ml Extraktionspuffer (50 mM HEPES-KOH, pH 7,0, 2 mM MnCl2, 2 mM MgCl2, 1
mM EDTA, 0,1% (v/v) 2-Mercaptoethanol, 1 mM PMSF, 1 mM Benzamidin,
1 mM 6-Amino-n-capronsäure,
10% (w/v) Glycerol, 0,2% (w/v) Natriumisoascorbat, 2% (w/v) Polycral
AT) pulverisiert. Die erhaltene pulverisierte Lösung wurde 20 Minuten bei 15000 × g zentrifugiert und
der erhaltene Überstand
wurde auf die NAP5TM-Säule (Pharmacia, Schweden),
die vorläufig
mit einem Säulenpuffer
(25 mM HEPES-KOH, pH 7,0, 2 mM MnCl2, 2
mM MgCl2, 0,1% (v/v) 2-Mercaptoethanol,
10% (w/v) Glycerol) zum Durchführen
der Entsalzung äquilibriert
wurde, aufgebracht, wodurch ein Rohextrakt erhalten wurde. Die Quantifizierung
von Chlorophyll in der pulverisierten Lösung wurde gemäß dem Verfahren von
Wintermans und De Mots durchgeführt
(Wintermans JFGM, De Mots A: Spectrophotometric characteristics
of chlorophylls a and b and their pheophytins in ethanol. Biochem.
Biophys. Acta 109: 448–453
(1965)). Die Quantifizierung von Proteinen im Rohextrakt wurde unter
Verwendung eines Protein-Assay-KitsTM (Bio-Rad,
USA) gemäß dem Verfahren
nach Bradford durchgeführt
(Bradford MM: A rapid and sensitive method for quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.
Anal. Biochem. 72: 248–254
(1976)). Die Messung der Phosphoenolpyruvatcarboxykinase wurde durch
Messung der Rate der Abnahme der Absorption von Oxalessigsäure bei
280 nm von 1 ml des Reaktionsgemischs, enthaltend 25 mM HEPES-KOH,
pH 7,5, 4 mM DTT, 0,2 mM Oxalessigsäure, 1 Einheit Pyruvatkinase,
0,2 mM ATP und 50 μl
Rohextrakt, durchgeführt.
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ERGEBNISSE
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Die
PCK-Aktivität
wurde im Rohextrakt von grünen
Blättern
von transformiertem und nicht transformiertem Reis nachgewiesen.
Im nicht transformierten Reis wurde jedoch im Wesentlichen keine
PCK-Aktivität nachgewiesen.
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Diese
Ergebnisse zeigen, dass aktives PCK-Protein in Chloroplasten transformierter
Reispflanzen lokalisiert ist, in die ein chimäres Gen, das durch Addition
einer Sequenz hergestellt wurde, codierend das Transit-Peptid der
kleinen Rubisco-Untereinheit von Reis an der cDNA, die das aus U.
panicoides isolierte PCK-Protein codiert, eingeführt wurde.
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