ES2304789T3 - Metodo para producir plantas tolerantes a las temperaturas. - Google Patents
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Abstract
UN METODO PARA LA PRODUCCION DE PLANTAS TOLERANTES A LA TEMPERATURA, QUE CONSISTE EN TRANSFORMAR UNA PLANTA CON UN VECTOR RECOMBINANTE QUE CONTIENE UNA OXIDASA DE COLINA CODIFICADORA DE GENES, ASI COMO PLANTAS TOLERANTES A LA TEMPERATURA PRODUCIDAS SEGUN DICHO METODO O PROGENIES DE LAS MISMAS CON LAS MISMAS PROPIEDADES.
Description
Método para producir plantas tolerantes a las
temperaturas.
La presente invención se refiere a un método
para producir plantas con nuevas propiedades, más específicamente, a
un método para producir plantas tolerantes a las temperaturas que
son muy resistentes al estrés ambiental.
Muchos organismos se adaptan por sí mismos a
condiciones extremas de estrés ambiental mediante la síntesis y
acumulación de un compuesto específico denominado "soluto
compatible" en su citoplasma para protegerse contra dicho
estrés. Las condiciones de estrés ambiental a las que han demostrado
adaptarse los organismos por sí mismos mediante dicho mecanismo
incluyen las sales (Imhoff et al., FEMS Microbiol. Rev. 39:
57-66, 1986; Mackay et al., J. Gen.
Microbiol. 130: 2177-2191, 1984; Rhodes y Hanson,
Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 44:
357-384, 1993), la deshidratación (Yancy et
al., Science 217: 1214-1222, 1982) y las bajas
temperaturas (Ko et al., J. Bacteriol. 176:
426-431, 1994).
Entre estos solutos compatibles, las glicina
betaína (en lo sucesivo denominada como betaína) está muy
distribuida en plantas superiores (Robinson y Jones, Aust. J. Plant
Physiol. 13: 659-668, 1986), bacterias (Csonka,
Microbiol. Rev. 53: 121-147, 1989) y animales
(García-Pérez y Burg, Physiol. Rev. 71:
1081-1115, 1991; Lever et al., Biochim.
Biophys. Acta. 1200: 259-264, 1994). Como se muestra
en la Figura 1, la betaína es un compuesto bipolar que tiene una
carga positiva y una carga negativa en sus moléculas (Rhodes y
Hanson, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 44:
357-384, 1993). Una larga discusión con respecto a
las funciones fisiológicas de la betaína ha sugerido que la betaína
puede proteger a las células mediante el mantenimiento de un
equilibrio osmótico con el entorno (Robinson y Jones, Aust. J.
Plant Physiol. 13: 659-668, 1986) y que la betaína
puede estabilizar estructuras de orden superior de proteínas
(Bernard et al., Acad. Sci. 111, 307: 99-104,
1988; Papageorgiou y Murata, Phtosynth. Res 44:
243-252, 1995). Sin embargo, la betaína no se
sintetiza exclusivamente en las células en condiciones de estrés
salino o de estrés hídrico. Por lo
tanto, no podía concluirse que la betaína tiene un efecto directo sobre la protección de las células contra dicho estrés.
tanto, no podía concluirse que la betaína tiene un efecto directo sobre la protección de las células contra dicho estrés.
En Escherichia coli y en la planta de
espinaca (Spinacia oleracea), la betaína se biosintetiza a
partir de colina mediante dos etapas de oxidación, como se muestran
en la Figura 1. Por otro lado, la colina oxidasa obtenida de la
bacteria del suelo gram positiva Arthrobacter globiformis
puede oxidar la colina hasta betaína en una reacción de oxidación
de una sola etapa (Ikuta, S. et al., J. Biochem. 82:
1741-1749, 1977).
En un intento de estudiar un efecto directo de
la betaína, se aisló el gen codA que codifica una nueva colina
oxidasa que cataliza la oxidación de colina a betaína (Japanese
Society of Plant Physiologist, Annual meeting of 1994, el 34th
Symposium, celebrado el 28-30 de marzo 1994) y se
integró en células de la cepa de cianobacterias
Synechococcus PCC7942 y plantas brasicáceas, teniendo éxito
de modo que se obtuvieron plantas tolerantes a las sales y/o
osmotolerantes (Solicitud de Patente Japonesa Nº 106819/95). Esto
confirmó que la betaína funciona para proteger a organismos contra
el estrés salino.
Sin embargo, ninguna publicación ha demostrado
que la betaína confiera una tolerancia a la temperatura en plantas o
bacterias.
Un objeto de la presente invención es producir
plantas que sean tolerantes a cambios ambientales, tales como altas
temperaturas o bajas temperaturas, mediante técnicas de
recombinación genética.
Como resultado de un estudio meticuloso para
resolver los problemas anteriores, se tuvo éxito en la obtención de
plantas tolerantes a las temperaturas mediante la integración y
expresión de un gen que codifica una colina oxidasa en plantas
brasicáceas y plantas gramíneas.
Por consiguiente, la presente invención
proporciona un método para producir plantas tolerantes a las
temperaturas, que comprende transformar una planta superior con un
vector recombinante que lleva un gen que codifica una colina
oxidasa.
La presente invención también proporciona
plantas tolerantes a las temperaturas producidas por dicho método o
progenies de las mismas que tienen las mismas propiedades.
Figura 1: Representación esquemática que muestra
el proceso de oxidación de la colina a betaína.
Figura 2A: Sólo como referencia, representación
esquemática que muestra construcciones usadas para la transformación
de Synechococcus PCC7942. PAM se refiere a
Synechococcus PCC7942 transformada con pAM1044 y PAMCOD se
refiere a Synechococcus PCC7942 transformada con pAM1044 que
lleva el gen codA. Las flechas rayadas indican los cebadores usados
para la PCR. Los triángulos representan el promotor conII. Las
flechas indican la orientación de los genes.
Figura 2B: Sólo como referencia,
SDS-PAGE (fotografía de una electroforesis) que
muestra el reemplazo completo de los cromosomas por el gen
resistente a espectinomicina y el gen codA en ADN de
Synechococcus PCC7942. Carril a: fragmento
\lambda-HindIII/\phix174-HaeIII;
carril b: la cepa de tipo silvestre de Synechococcus PCC7942;
carril c: la cepa PAM; carriles d y e: la cepa PAMCOD (los carriles
b, c y d muestran los resultados de la PCR con los cebadores 1 y 2 y
el carril e muestra los resultados de la PCR con los cebadores 1 y
3).
Figura 3: Sólo como referencia, análisis de
transferencia de Western (fotografía de una electroforesis) que
muestra la expresión de colina oxidasa en las cepas de
Synechococcus PCC7942 PAM y PAMCOD. Carril a: extractos de
proteína de la cepa PAMCOD; carril b: extractos de proteína de la
cepa PAM; carril c: colina oxidasa purificada.
Figura 4: Sólo como referencia, resultados del
cultivo de cepas de Synechococcus PCC7942 cultivadas a
diversas temperaturas durante 10 días en una placa de agar en medio
BG 11 suplementado con cloruro de colina 1 mM (fotografías que
muestran la morfología de los organismos). 1 y 4: cepa PAM; 2 y 3:
cepa PAMCOD.
Figura 5: Sólo como referencia, cultivo de las
cepas de Synechococcus PCC7942 PAM (\medcirc) y PAMCOD
(\medbullet) en medio BG11 suplementado con cloruro colina 1 mM
bajo iluminación. A: cultivo a 42ºC; B, cultivo a 20ºC.
Figura 6: Sólo como referencia, nivel de
liberación de oxígeno fotosintético a partir de cepas de
Synechococcus PCC7942 PAM (\medcirc) y PAMCOD
(\medbullet) cultivados a bajas temperaturas en presencia de
NaHCO_{3} 1 mM (A) o en presencia de
1,4-benzoquinona y K_{3}Fe(CN)_{6}
1 mM (B).
Figura 7: Representación esquemática que muestra
el mapa de enzimas de restricción del gen codA.
Figura 8: Representación esquemática que muestra
la estructura del vector plasmídico binario pGAH/codA usado para la
transformación de Arabidopsis.
Figura 9: Análisis de transferencia de Western
(fotografía de una electroforesis) de colina oxidasa en fracciones
solubles de las plantas de Arabidopsis de tipo silvestre y
transformada. Carril 1: colina oxidasa obtenida de Arthrobacter
globiformis disponible en el mercado (Sigma Chemical Co., St.
Louis, MO, Estados Unidos); carril 2: fracción soluble de la planta
de tipo silvestres; carril 3: fracción soluble de una planta
transformada.
Figura 10: Influencia de las bajas temperaturas
sobre el sistema fotoquímico II en hojas de las plantas de
Arabidopsis de tipo silvestre y transformada. (\medcirc):
planta de tipo silvestre; (\medbullet): planta transformada.
Figura 11: Inhibición de la fotosíntesis a bajas
temperaturas (A) y recuperación de la inhibición de la fotosíntesis
a bajas temperaturas (B) en hojas de las plantas de
Arabidopsis de tipo silvestre y transformada. (\medcirc):
planta de tipo silvestre; (\medbullet): planta transformada.
Figura 12: Resultados de ensayos de resistencia
a la congelación en hojas de las plantas de Arabidopsis de
tipo silvestre y transformada. (\medcirc): planta de tipo
silvestre; (\medbullet): planta transformada.
Figura 13: Influencia de las bajas temperaturas
en la fase de absorción de agua sobre la germinación de semillas de
las plantas de Arabidopsis de tipo silvestre y transformada
(fotografías que muestran la morfología de los organismos). A:
semillas germinadas sin tratamiento a bajas temperaturas en la fase
de absorción de agua; B: semillas germinadas después del tratamiento
a bajas temperaturas en la fase de absorción de agua. Tanto en A
como en B, la W a la izquierda muestra los resultados de semillas de
la planta de tipo silvestre y la T a la derecha muestra los
resultados de semillas de la planta transformada.
Figura 14: Estructuras de dos genes codA
quiméricos usados para la transformación de una planta de arroz, es
decir, 35SINTPcodA y 35SINcodA.
Figura 15: Gráficas de RMN que representan la
acumulación de betaína en plantas de arroz de la cepa de tipo
silvestre, un transformante (A) que no expresa el gen codA y un
transformante (B) que expresa el gen codA. En la figura, GB y Ch
representan los picos que se corresponden con la betaína y con la
colina, respectivamente.
Figura 16: Sólo como referencia, efecto de la
introducción del gen codA en Synechococcus PCC7942 sobre el
transporte de electrones mediado por el sistema fotoquímico II en
términos de valores relativos frente a una activación máxima
supuesta del 100%. (\medcirc): células de PAM bajo iluminación;
(\medbullet): células de PAMCOD bajo iluminación; (\Box):
células de PAM en la oscuridad; (\blacksquare) células de PAMCOD
en la oscuridad.
Figura 17: Recuperación del transporte de
electrones mediado por el sistema fotoquímico II de la
fotoinhibición a bajas temperaturas cuando se introdujo el gen codA
en Synechococcus PCC7942. (\medcirc): células de PAM bajo
iluminación; (\medbullet): células de PAMCOD bajo iluminación.
Figura 18. Sólo como referencia, efecto del
tratamiento a bajas temperaturas en condiciones de oscuridad sobre
la liberación de oxígeno fotosintético cuando se introdujo el gen
codA en Synechococcus PCC7942. (\medcirc): células de PAM
bajo iluminación; (\medbullet): células de PAMCOD bajo
iluminación.
Figura 19: Sólo como referencia, efecto del
tratamiento a bajas temperaturas sobre la transición de fase de
lípidos cuando se introdujo el gen codA en Synechococcus
PCC7942. (\medcirc): células de PAM bajo iluminación;
(\medbullet): células de PAMCOD bajo iluminación.
Figura 20: Sólo como referencia,
electroforetograma que muestra cambios de proteínas en las
fracciones solubles y en las fracciones de membrana cuando se
introdujo el gen codA en Synechococcus PCC7942. Carril 1:
colina oxidasa; 2: membrana protoplasmática de células de PAM; 3:
membrana protoplasmática de células de PAMCOD; 4: membrana tilacoide
de células de PAM; 5: membrana tilacoide de células de PAMCOD; 6:
fracción soluble de células de PAM; 7: fracción soluble de células
de PAMCOD. Una flecha señala la colina oxidasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se usa en este documento, la tolerancia a
la temperatura se refiere a una capacidad de una planta transformada
para crecer a temperaturas superiores o inferiores a las
temperaturas que normalmente permiten crecer a plantas no
transformadas.
El gen que codifica la colina oxidasa usada en
la presente invención es un gen que codifica una proteína capaz de
convertir la colina en betaína en una reacción de una sola etapa y
que procede de bacterias del suelo gram-positivas
del género Arthrobacter, en concreto, Arthrobacter
globiformis y Arthrobacter pascens, especialmente
Arthrobacter globiformis.
El gen codA que codifica la colina oxidasa de
Arthrobacter globiformis se clonó y se determinó su secuencia
de nucleótidos. El gen codA contiene una fase de lectura abierta de
1641 pb, que codifica 547 aminoácidos. La secuencia de nucleótidos
y la secuencia de aminoácidos del gen codA se muestran como la SEC
ID Nº: 1 en la Lista de secuencias.
Dicho gen que codifica la colina oxidasa puede
integrarse en vectores apropiados para transformar una planta.
Después, puede introducirse en esos vectores un promotor apropiado o
una secuencia implicada en la expresión de un carácter para expresar
el gen en la planta.
El gen que codifica la colina oxidasa puede
incluir, no sólo la secuencia de nucleótidos que codifica la
secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1 en la Lista de
secuencias, sino también las secuencias de nucleótidos en las que
se añaden, se delecionan o se sustituyen uno o más aminoácidos de
dicha secuencia de aminoácidos, con tal de que codifiquen una
proteína que tenga actividad colina oxidasa.
El método de la presente invención puede
conferir tolerancia a la temperatura en una gran diversidad de
plantas que varían desde cianobacterias hasta plantas superiores.
Las cianobacterias se usan mucho como organismos modelo de plantas
superiores porque tienen básicamente el mismo mecanismo
fotosintético que las plantas superiores y pueden transformarse
fácilmente para dar resultados en poco tiempo. Algunas
cianobacterias fáciles de transformar captan fácilmente ADN
extracelular hacia el interior de sus células para provocar una
recombinación eficaz. Dichas cianobacterias incluyen
Synechococcus PCC7942, Synechococcus PCC6301 (ATCC
27144) y Synechocystis PCC6803 (ATCC 27184) (Protein,
Nucleic Acid, Enzyme, Vol. 35, Nº 14, págs.
2542-2551, 1991; Crit. Rev. Microbiol. Vol. 13, Nº
1, págs. 111-132, 1985). Se usan en este documento
sólo como referencia.
Las plantas superiores incluyen dicotiledóneas y
monocotiledóneas. En los ejemplos que se describen a continuación,
podían obtenerse plantas muy tolerantes a las temperaturas a partir
de una planta brasicácea como dicotiledónea, pero esto no es
limitante y pueden usarse otras familias y géneros de
dicotiledóneas. El método de la presente invención también puede
ser aplicable a monocotiledóneas. Se descubrió que una planta de
arroz, monocotiledónea, que originalmente carece de capacidad de
síntesis betaína, adquirió esta capacidad después de la
transformación por el método de la presente invención.
El vector en el que puede integrarse el gen que
codifica la colina oxidasa y el método para la transformación y la
selección de plantas transformadas pueden seleccionarse de forma
apropiada dependiendo de la naturaleza de la planta que se va a
transformar, incluyendo células de plantas.
Por ejemplo, puede usarse un plásmido tal como
pUC303 para cianobacterias. Después, los transformantes que tengan
las propiedades deseadas pueden seleccionarse mediante un gen de
resistencia a antibióticos insertado en el plásmido. Se obtuvieron
con éxito plantas que mostraban una tolerancia tanto a altas como a
bajas temperaturas mediante la transformación de la cianobacteria
Synechococcus PCC7942 con el gen codA que codifica una colina
oxidasa procedente de Arthrobacter globiformis.
Cuando la Synechococcus PCC7942
transformada con el gen codA se cultivó en medio BG11 suplementado
con cloruro de colina, se descubrió que la Synechococcus
transformada captaba colina suministrada de forma exógena para
convertirla en betaína y que acumulaba betaína hasta un nivel de
aproximadamente 80 mM. Sin embargo, no se observó dicha acumulación
con un grupo de control de una cepa de Synechococcus que
carecía del gen codA.
Cuando la cepa de Synechococcus
transformada con el gen codA y un grupo de control de una cepa no
transformada se cultivaron en medio BG11 suplementado con cloruro
de colina a 42ºC para examinar su reacción a las altas
temperaturas, las Synechococcus transformadas detuvieron su
crecimiento durante un día y después comenzaron a crecer de nuevo.
El grupo de control no transformado no creció en absoluto a 42ºC.
Cuando se cultivaron a 20ºC para examinar su reacción a las bajas
temperaturas, la cepa transformada creció lentamente durante 4
días, pero después comenzó a crecer rápidamente. Sin embargo, el
grupo de control no transformado siguió creciendo muy lentamente
incluso después de 4 días. Un ensayo de crecimiento usando un medio
sólido también demostró que la cepa transformada crecía bien tanto
a altas como a bajas temperaturas, en comparación con la cepa no
transformada.
Estos resultados revelaron que la cepa de
Synechococcus transformada con el gen codA crece
significativamente mejor que la cepa no transformada tanto a altas
como a bajas temperaturas.
Se ha señalado que la betaína no sólo actúa como
un osmoprotector sino que también desempeña un papel esencial en la
protección de un mecanismo fotosintético en organismos
fotoautótrofos (Murata, et al., FEBS Lett. 296:
187-189, 1992). Por lo tanto, la cepa de
Synechococcus transformada y la cepa no transformada se
cultivaron en la oscuridad a diversas bajas temperaturas para
examinar la tolerancia a la temperatura de la fotosíntesis. Como
resultado, se observó una gran diferencia entre la cepa transformada
y la cepa no transformada en el nivel de liberación de oxígeno
fotosintético y en la inactivación del transporte de electrones
mediado por el sistema fotoquímico II en células a bajas
temperaturas. En concreto, el nivel de liberación de oxígeno
fotosintético de la cepa transformada era más tolerante a las bajas
temperaturas que el de la cepa no transformada. La actividad de
transporte de electrones mediada por el sistema fotoquímico II en
células de la cepa transformada también era más tolerante a las
bajas temperaturas que la de la cepa no transformada, es decir, la
actividad de la cepa no transformada se reducía hasta el 50% del
nivel original a 5ºC, mientras que la actividad de la cepa
transformada permanecía a casi el nivel original a 5ºC y comenzaba a
disminuir por debajo de 5ºC.
Se conocía de antemano que la temperatura óptima
para el crecimiento de Synechococcus PCC7942 varía de 30 a
38ºC. Por lo tanto, se deduce que se inhibía el crecimiento celular
de la cepa no transformada por desnaturalización de las estructuras
de algunas proteínas a una temperatura tan elevada como de 42ºC. Sin
embargo, la cepa transformada que lleva el gen codA podía crecer
probablemente porque aproximadamente 80 mM de betaína acumulados en
las células evitaban la desnaturalización de proteínas. A 20ºC, la
cepa no transformada no podía crecer, pero la cepa transformada en
la que se había integrado el gen codA podía crecer. Esto también
puede ser el resultado de la acumulación de betaína. Además, se
piensa que la acumulación de betaína en el citoplasma aumenta la
tolerancia de las células de cianobacterias a las bajas temperaturas
en la oscuridad. Sin embargo, la presente invención no se limita a
dicho mecanismo de acción.
Estos resultados significan que se ha conferido
una tolerancia excelente tanto a altas como a bajas temperaturas a
las Synechococcus transformadas con el gen que codifica la
colina oxidasa.
Las dicotiledóneas pueden transformarse mediante
técnicas de transferencia génica usando protoplastos o una parte de
tejido. En el caso de la transferencia génica usando fragmentos de
tejido, puede usarse el plásmido Ti de Agrobacterium.
Fragmentos de tejido de una planta con callos pueden infectarse con
una Agrobacterium en la que se haya integrado el gen que
codifica la colina oxidasa, seleccionarse por resistencia a un
antibiótico tal como kanamicina y, después, diferenciarse en brotes
para dar una planta transformada.
En la presente invención, podía obtenerse una
planta muy tolerante a las temperaturas mediante la transformación
de la planta brasicácea Arabidopsis thaliana con el gen que
codifica la colina oxidasa de la forma siguiente.
Se preparó un vector plasmídico binario
pGAH-codA que llevaba el gen codA y se integró en
una Agrobacterium tumefaciens EHA101 que llevaba el plásmido
Ti. Se infectaron callos de hipocótilo de Arabipdosis con la
Agrobacterium EHA101 resultante (pGAH/codA) que incorporaba
el gen codA, después se formaron brotes y se seleccionaron por
resistencia a kanamicina e higromicina para inducir raíces y formar
semillas. Las plantas obtenidas a partir de las semillas T2
heterocigotas resultantes se autofertilizaron para dar individuos T3
homocigotos que se sembraron para formar una planta
transformada.
La planta transformada obtenida de este modo
demostraba que la colina oxidasa se había transportado a los
cloroplastos. Cuando se midieron los niveles de colina y betaína en
la hoja, sólo se observó colina en la planta de tipo silvestre
mientras que se observó tanto colina como betaína en la planta
transformada, sugiriendo que la betaína se acumulaba en las plantas
por transferencia del gen codA. La planta transformada mostraba una
tolerancia a la temperatura extraordinaria en comparación con la de
tipo silvestre.
La planta de arroz, monocotiledónea, (Oryza
sativa L. var. Nipponbare) puede transformarse, por ejemplo,
con dos genes codA quiméricos preparados en el plásmido pUC119, que
se localizan en el citosol o en los plastos después de la
traducción bajo el control transcripcional del promotor 35S del
virus del mosaico de la coliflor. Ambos genes quiméricos incluyen
un intrón procedente del arroz en la secuencia 5' no traducida para
aumentar el nivel de expresión.
Puede producirse una planta de arroz
transformada mediante el procedimiento siguiente. En concreto, puede
obtenerse una planta transformada mediante la introducción de
dichos genes codA quiméricos en el interior de células de cultivos
en suspensión de callos del escutelo de semillas de una planta de
arroz, junto con un gen marcador de selección de resistencia a
higromicina, mediante un dispositivo de pistola de partículas, la
posterior selección de los callos transformados basada en la
resistencia a antibióticos y su diferenciación de nuevo en una
planta.
Aunque la planta de arroz de tipo silvestre
carece de capacidad de síntesis de betaína, la planta de arroz
transformada por el método de la presente invención adquirió la
capacidad de síntesis de betaína. La planta de arroz transformada
que expresaba el gen codA crecía tanto como la planta no
transformada sin mostrar ninguna anomalía aparente en condiciones
tanto geopónicas como hidropónicas. Esto permite concluir que el
peróxido de hidrógeno formado como subproducto de la síntesis de
betaína se detoxificaba eficazmente en las células. En vista de la
relación entre la adquisición de la capacidad de síntesis de betaína
y la tolerancia a la temperatura en cianobacterias y
dicotiledóneas, se puede esperar que la planta de arroz transformada
obtenida por el método de la presente invención también habrá
adquirido una tolerancia a la temperatura. Este es el primer caso en
el que una planta de arroz ha adquirido una capacidad de síntesis
de betaína a través de técnicas de ingeniería genética.
Cuando se comparó la recuperación del sistema
fotoquímico II de plantas transformadas y no transformadas después
de colocarlas en condiciones de oscuridad en experimentos que usaban
Synechococcus, la planta transformada se recuperó más
rápidamente, indicando que la presencia de betaína aceleraba la
recuperación del sistema fotoquímico II. También se demostró que la
fotosíntesis de la planta transformada es más tolerante a las bajas
temperaturas que la de la planta no transformada. En vista de que
no se encontraron grandes diferencias en los lípidos y proteínas de
membrana entre la planta transformada y la planta no transformada,
la protección del sistema fotoquímico II observada en la planta
transformada a bajas temperaturas parecía ser un efecto de la
betaína.
El alcance de la presente invención abarca no
sólo a plantas tolerantes a las temperaturas producidas como se ha
descrito anteriormente o a progenies de las mismas que tienen las
mismas propiedades, sino también a células de plantas (por ejemplo,
células de callos cultivados) y porciones de plantas (por ejemplo,
flores, semillas, frutos, tubérculos, etc.) obtenidas a partir de
las mismas, así como a las progenies de las mismas.
De acuerdo con la presente invención, pueden
obtenerse plantas transformadas tolerantes a las temperaturas que
sean muy resistentes a condiciones de estrés ambiental. El método de
la presente invención puede usarse para producir plantas que puedan
crecer en condiciones de altas temperaturas o bajas temperaturas en
las que las plantas normalmente no pueden crecer. El intervalo de
plantas a las que puede conferirse tolerancia a la temperatura por
el método de la presente invención es muy amplio, es decir,
concierne a plantas superiores. Especialmente, la presente
invención es muy útil industrialmente porque es el primer caso en el
que se obtuvieron plantas transformadas estables a partir de
monocotiledóneas, incluyendo la mayoría de los cultivos principales,
y se confirmó su síntesis de betaína.
El método para producir plantas tolerantes a las
temperaturas de acuerdo con la presente invención es muy útil
porque puede usarse para producir plantas que puedan tolerar tanto
altas como bajas temperaturas. Los siguientes ejemplos ilustran la
presente invención más en detalle, pero no se interpretan como
limitantes del alcance de la misma.
Se aisló el gen de la colina oxidasa a partir de
Arthrobacter globiformis mediante el método descrito en los
resúmenes de las comunicaciones orales publicados en el 34th
symposium of the annual meeting of the Japanese Society of Plant
Physiologists, 1994. En resumen. 1) la colina oxidasa se fragmenta
con bromuro de cianógeno, 2) se determina la secuencia de
aminoácidos N-terminal de un fragmento apropiado, 3)
se seleccionan porciones apropiadas a partir de dicha secuencia de
aminoácidos parcial para sintetizar oligonucleótidos que se
correspondan con la misma, 4) se amplifica por PCR (reacción en
cadena de la polimerasa) una secuencia parcial del gen de la colina
oxidasa, usando estos oligonucleótidos como cebadores, 5) la
secuencia parcial amplificada del gen de la colina oxidasa se usa
como sonda para explorar la genoteca de ADN genómico de
Arthrobacter globiformis.
Los clones positivos obtenidos de este modo se
subclonaron en el plásmido pBluescript (SK^{+}) (Stratagene) para
aislar los clones positivos, que se sometieron a un análisis de
transferencia de Southern. Se subclonó un fragmento
XbaI-XhoI de 3,6 kb que hibridaba con dicha sonda en
el pBluescript y se mapeó con enzimas de restricción. Se determinó
la secuencia de nucleótidos de la región que abarcaba desde el
primer sitio SalI hasta el sitio XhoI (de aproximadamente 2,5
kb).
Los resultados mostraron que el gen de la colina
oxidasa contiene una fase de lectura abierta de 1641 pb que
codifica un polipéptido de 547 restos aminoacídicos. La secuencia de
aminoácidos y la secuencia de nucleótidos del gen que codifica la
colina oxidasa se muestran como la SEC ID Nº: 1 en la Lista de
secuencias.
El plásmido pBluescript que llevaba el gen codA
se digirió con las enzimas de restricción BstEII (en la posición
-40 desde el origen de traducción) y SmaI (cadena abajo del codón de
terminación). Los extremos cohesivos BstEII se rellenaron con un
fragmento de Klenow (Takara, Tokio, Japón). El fragmento de extremos
romos que contenía la región codificante del gen codA y un supuesto
sitio de unión a ribosomas se insertó en el sitio SmaI del plásmido
pAM1044. Se confirmó la orientación correcta del gen, que parece
expresarse bajo el control del promotor conII de pAM1044, mediante
análisis con enzimas de restricción. El promotor conII es una
secuencia consenso de promotores de E. coli que contiene las
secuencias de nucleótidos TTGGACA (-35) y TATAAT (-10).
El plásmido pAM1044 y el plásmido que contenía
el gen codA se usaron para transformar Synechococcus PCC7942
por el método de Elhai et al. Los transformantes resultantes
se denominaron como la cepa PAMCOD. Como control, se transformó
Synechococcus PCC7942 sólo con pAM1044 y se denominó como la
cepa PAM.
La selección de los transformantes se realizó
sobre placas de agar BG11 que contenían 30 \mug/ml de
espectinomicina. Después de varios pases de una colonia individual
en placas de BG11 recién preparadas que contenían espectinomicina,
la inserción completa del gen de resistencia de espectinomicina y
del gen codA en todas las copias de los cromosomas se confirmó por
PCR (reacción en cadena de la polimerasa) usando los cebadores que
se muestra en la Figura 2A. La inserción completa del gen de
resistencia a espectinomicina y del gen codA en los cromosomas de
Synechococcus se confirmó por PCR usando una combinación de
los cebadores 1 y 2.
El cultivo de las cepas PAMCOD y PAM se realizó
en medio BG 11 (Stanier et al., Bacteriol. Rev. 35:
171-205, 1971) suplementado con cloruro de colina 1
mM (Kitayama Chemical) en aerobiosis con CO_{2} al 1% a 30ºC bajo
iluminación con una lámpara incandescente de 70 \muE m^{-2}
s^{-1}. Se usaron células en fase de crecimiento logarítmico en
todos los experimentos que se describen a continuación. Se midió la
actividad fotosintética a una densidad celular ajustada para una
concentración de clorofila de 5-10 \mug/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron los ADN de las cepas de
Synechococcus PCC7942 de tipo silvestre, PAM y PAMCOD como
moldes para PCR y los productos amplificados se analizaron mediante
SDS-PAGE. Los resultados se muestran en la Figura
2B.
La PCR del ADN de la cepa de tipo silvestre
produjo un producto amplificado de aproximadamente 400 pb (Fig. 2B,
carril b). La PCR usando el ADN de la cepa PAM como molde produjo
una banda de aproximadamente 2,4 kb, que indicaba que el pAM1044 se
había insertado en los cromosomas. La banda de aproximadamente 400
pb que se observaba en la cepa de tipo silvestre no estaba
presente, indicando que los cromosomas nativos se habían reemplazado
completamente por cromosomas mutantes en la cepa PAM.
Cuando se usó el ADN de PAMCOD como molde, no se
observó la banda que se correspondía con los cromosomas de tipo
silvestre (Fig. 2B, carril c). Sin embargo, tampoco se amplificó la
banda predicha de aproximadamente 4,1 kb, probablemente debido al
gran tamaño del inserto y al elevado contenido de GC en la secuencia
de codA. Por lo tanto, se usó el cebador 3 que se corresponde con
la región codificante del gen codA (Fig. 2A) junto con el cebador
1. Se amplificó la banda predicha de aproximadamente 2,6 kb (Fig.
2B, carril d), indicando que el gen codA está presente en los
cromosomas de la cepa PAMCOD.
\vskip1.000000\baselineskip
Se examinó la expresión del gen codA en la cepa
PAMCOD obtenida en el Ejemplo 1 mediante el análisis de
transferencia de Western usando un antisuero policlonal contra
colina oxidasa purificada. Los resultados se muestran en la Figura
3. Se detectaron señales a 60 kDa en extractos de proteína de la
cepa PAMCOD (carril a) y de colina oxidasa purificada (carril c).
No se detectó esta señal en extractos de proteína de la cepa PAM
(carril b). Este resultado confirmaba que el gen codA se había
expresado en Synechococcus PCC7942 bajo el control del
promotor conII.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron células transformadas en un litro
de medio BG11 suplementado con cloruro de colina 5 mM. Se
proporcionaron condiciones de estrés salino por adición de NaCl a
diversas concentraciones. Las células recogidas se trataron con
H_{2}SO_{4} 1 M a 25ºC durante 20 horas y se recuperó la betaína
de la mezcla mediante la técnica de precipitación con periodato
(Wall, J. S. et al., Analyt. Chem. 32:
870-874, 1960). Se disolvió periodato de betaína en
1 ml de metanol-d_{4} (Wako) que contenía
2-metil-2-propanol 2
mM (Wako) como patrón interno. Esta solución se midió para
determinar su espectro de RMN ^{1}H en un tubo de RMN usando un
Bruker AMX 360 Wb. Se cuantificó la betaína por comparación de los
picos integrados con una curva patrón.
Se determinó la concentración de betaína en las
células de la cepa PAMCOD en base a los volúmenes de células
estimados a partir de la micrografía de electrones de células
teñidas negativamente. El citoplasma de una célula individual tenía
una forma cilíndrica de 2,14 \mum de longitud y 0, 82 \mum de
diámetro y se estimó que el volumen de células era de
aproximadamente 1,13 \mum^{3}.
Como resultado, la concentración de betaína en
las células de la cepa PAMCOD se calculó a aproximadamente 80 mM.
Sin embargo, no pudieron detectarse trazas de betaína en la cepa PAM
que carecía del gen codA.
\vskip1.000000\baselineskip
Las cepas de Synechococcus PAM y PAMCOD
se transfirieron a una placa de agar en medio BG11 suplementado con
cloruro de colina 1 mM y se observaron para determinar su
crecimiento a 40ºC, 42ºC y 44ºC. Los resultados se muestran en la
Figura 4A. Ambas cepas crecieron casi por igual a 40ºC. Ninguna cepa
creció a 44ºC. A 42ºC, la cepa PAM creció muy lentamente mientras
que la cepa PAMCOD creció muy bien.
\vskip1.000000\baselineskip
Las cepas de Synechococcus PAM y PAMCOD
se transfirieron a una placa de agar en medio BG11 suplementado con
cloruro de colina 1 mM y se observaron para determinar su
crecimiento a 22ºC, 20ºC y 18ºC. Los resultados se muestran en la
Figura 4B. Ambas cepas crecieron casi por igual a 22ºC. A 20ºC, la
cepa PAMCOD creció más rápidamente que la cepa PAM. Ninguna cepa
creció bien a 18ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se transfirieron a 42ºC células de las cepas de
Synechococcus PAM y PAMCOD, que se habían cultivado de forma
preliminar en medio BG11 suplementado con cloruro de colina 1 mM a
30ºC, y se evaluaron para determinar su crecimiento mediante el
control de la turbidez a una longitud de onda de 730 nm. Los
resultados se muestran en la Figura 5A. Las células de la cepa
PAMCOD dejaron de crecer el primer día, pero después reanudaron su
crecimiento. Sin embargo, las células de las cepas PAM no crecieron
en absoluto.
\vskip1.000000\baselineskip
Se transfirieron a 20ºC células de las cepas de
Synechococcus PAM y PAMCOD, que se habían cultivado de forma
preliminar en medio BG11 suplementado con cloruro de colina 1 mM a
30ºC, y se evaluaron para determinar su crecimiento mediante el
control de la turbidez a una longitud de onda de 730 nm. Los
resultados se muestran en la Figura 5B. Las células de la cepa
PAMCOD crecieron lentamente durante 4 días, pero después comenzaron
a crecer rápidamente. Sin embargo, las células de la cepa PAM
continuaron creciendo lentamente después de 4 días.
\vskip1.000000\baselineskip
Se examinó la inactivación de la liberación de
oxígeno fotosintético inducida por estrés a bajas temperaturas. Se
cultivaron en la oscuridad a diversas temperaturas células de las
cepas PAM y PAMCOD que se habían cultivado de forma preliminar a
30ºC. Después de esto, se midió la actividad de liberación de
oxígeno fotosintético a 30ºC en presencia de NaHCO_{3} 1 mM o en
presencia de 1,4-benzoquinona y
K_{3}Fe(CN)_{6} usando un electrodo de oxígeno de
tipo Clark.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron células en la oscuridad a diversas
temperaturas de 0 a 20ºC durante 1 hora, y después a 30ºC durante 5
minutos. Después del cultivo, se midió la actividad de liberación de
oxígeno fotosintético de la forma que se ha descrito anteriormente.
Las células de las cepas PAM y PAMCOD mostraron actividades
absolutas de liberación de oxígeno fotosintético de 387 \pm 23 y
379 \pm 19 \mumoles de O_{2}/mg de clorofila/hora,
respectivamente, en presencia de CO_{2} y las actividades
absolutas de liberación de oxígeno fotosintético de 802 \pm 36 y
740 \pm 82 \mumoles de O_{2}/mg de clorofila/hora,
respectivamente, en presencia de 1,4-benzoquinona y
K_{3}Fe(CN)_{6}.
Los resultados se muestran en la Figura 6 (A: en
presencia de NaHCO_{3}; B: en presencia de
1,4-benzoquinona y
K_{3}Fe(CN)_{6}). Como se muestra en la Figura 6A,
la actividad de liberación de oxígeno fotosintético de la cepa
PAMCOD era más tolerante a las bajas temperaturas que la de la cepa
PAM. Como se muestra en la Figura 6B, la actividad de transporte de
electrones mediado por el sistema fotoquímico II de la cepa PAMCOD
también era más tolerante a las bajas temperaturas que la de la cepa
PAM, es decir, la actividad de la cepa PAM disminuía hasta el 50%
del nivel inicial a 5ºC mientras que la actividad de la cepa PAMCOD
permanecía casi al nivel inicial a 5ºC y comenzaba a disminuir por
debajo de 5ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se amplificó por PCR un fragmento
XbaI-NdeI (de aproximadamente 200 pb) de la señal de
tránsito de la rbcS (subunidad pequeña de la ribulosa
1,5-bisfosfato carboxilasa) de la planta de tabaco
(Nicotiana sylvestris), usando
5'CTGTCTAGATGTAATTAACAATGGCT3' y 5'CCACATATGCATGCATTGCACTCT3' como
cebadores, y se introdujeron sitios XbaI y NdeI.
Después, se amplificó por PCR un fragmento de
BamHI N-terminal (de aproximadamente 100 pb) del gen
codA, usando 5'AACCATATGCACATCGACAACATC3' y
5'GCTCCATCCAGCGGTCCAGC3' como cebadores, y después se introdujo un
sitio NdeI. Se preparó un fragmento BamHI-SmaI (de
aproximadamente 1,6 kb) del gen codA mediante enzimas de
restricción. Por último, se amplificó por PCR un fragmento de SmaI
C-terminal (de aproximadamente 80 pb) del gen codA,
usando 5'GAAACAGTCCTGCTTCCACAC3' y
5'GCGAGCTCTGCCTACACCGC
CAT3' como cebadores, y se introdujo un sitio SacI.
CAT3' como cebadores, y se introdujo un sitio SacI.
El gen GUS (de la
\beta-glucuronidasa) en el vector plasmídico
binario pBI221 se reemplazó por estos fragmentos.
El mapa de enzimas de restricción del gen codA
se muestra en la Figura 7.
Se introdujo un fragmento
HindIII-EcoRI que contenía el promotor 35S del virus
del mosaico de la coliflor y el terminador NOS (de la nopalina
sintasa) en el vector plasmídico binario pGAH para preparar un
plásmido pGAH/codA (Fig. 8). Este plásmido contenía los genes de
resistencia a kanamicina e higromicina.
\vskip1.000000\baselineskip
Las Agrobacterium tumefaciens EHA 101 que
llevaban el plásmido Ti se mezclaron con el vector plasmídico
binario pGAH/codA obtenido en el Ejemplo 7, después se congelaron y
se descongelaron y se seleccionaron en placas de LB que contenían
tetraciclina y kanamicina. La agrobacteria resultante en la que se
había integrado el gen codA se denominó EHA101 (pGAH/codA).
\vskip1.000000\baselineskip
Se indujo la germinación de la cepa WS de
Arabidopsis thaliana para preparar un segmento de hipocótilo.
Se indujo la formación de callos en este hipocótilo en medio B5
(ICN Biochemicals) (pH 5,7) que contenía 0,05 mg/l de cinetina
(Wako) y 0,05 mg/l de 2,4-D (Wako) para formar
callos de hipocótilo.
Después, los callos se infectaron con la
Agrobacterium EHA101 (pGAH/codA) que contenía el codA,
preparada en el Ejemplo 8, y se cocultivaron. Después de retirar la
Agrobacterium mediante medio B5 que contenía 250 mg/l de
vancomicina, 500 mg/l de carbenicilina y 200 mg/l de Claforan, los
cultivos se transfirieron a un medio de diferenciación que contenía
kanamicina e higromicina (medio B5 que contenía 25 mg/l de
kanamicina y 15 mg/l de higromicina) para formar brotes. Por lo
tanto, se seleccionaron brotes resistentes a kanamicina e
higromicina para inducir raíces y formar semillas. Las semillas T2
resultantes son individuos heterocigotos en los que sólo se ha
transformado uno de los cromosomas.
Después, las plantas obtenidas a partir de las
semillas T2 se autofertilizaron y se seleccionaron mediante
kanamicina e higromicina para dar semillas T3 homocigotas.
Las plantas de las cepas de tipo silvestre y
transformantes se usaron para los experimentos después del cultivo
en un medio (pH 5,2) que contenía HYPONEX al 0,1% (Hyponex
Corporation, Marysville, OH, Estados Unidos) a 22ºC durante 30
días, en agua o tierra constituida por vermiculita y perlita, con
iluminación de 75 \mumol m^{-2} s^{-1} durante 16 horas en un
día y en la oscuridad durante las 8 horas restantes a menos que se
indique otra cosa.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó un anticuerpo contra colina oxidasa
de acuerdo con el método descrito en la bibliografía por los
inventores de la presente invención (Deshniumu, P. et al.,
Plant Mol. Biol. 29: 897-907, (1995).
Se molieron hojas de plantas de 20 días de edad
de las cepas de Arabidopsis thaliana de tipo silvestre y
transformantes en una microcentrífuga a 0ºC y los homogeneizados se
centrifugaron a 10.000 x g durante 10 minutos para preparar
fracciones solubles. Las proteínas solubles del sobrenadante se
separaron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a
una membrana de nylon (Immobilon PVDF; Millipore, Bedford, MA,
Estados Unidos). La membrana se incubó con el anticuerpo anterior
contra la colina oxidasa y se detectó con un sistema que consistía
en un anticuerpo secundario biotinilado, avidina y peroxidasa de
rábano rusticano biotinilada (ABC Kit; Vectastain, Burlingane, CA,
Estados Unidos).
Los resultados del análisis de transferencia de
Western se muestran en la Figura 9. Se identificó la presencia de
una proteína inmunosensible de 64 kDa que se correspondía con la
colina oxidasa. También se observó una pequeña cantidad de una
proteína de 70 kDa que se correspondía con un precursor de la colina
oxidasa y el péptido de tránsito de la rbcS. Estos resultados
demuestran que el gen codA se integró correctamente y se expresó en
los cromosomas y que el precursor expresado se procesó en una
proteína madura.
Después, se detectó la localización de la colina
oxidasa expresada en plantas con el anticuerpo contra la colina
oxidasa anterior mediante un método descrito en la bibliografía
(Mustardy, L. et al., Plant Physiol. 94:
334-340, 1990). Un trozo pequeño de una hoja joven
de una planta se fijó con glutaraldehído al 1% en tampón fosfato
sódico 0,1 M (pH 7,2) durante una hora. Después de aclararse con el
mismo tampón, la muestra se deshidrató con etanol y se puso en
resina Lowicryl K4M (TAAB Laboratories Equipment Ltd., Berkshire,
Reino Unido). Se realizó un inmunomarcaje con oro mediante un
método descrito en la bibliografía (Mustardy et al.,
anteriormente).
Como resultado, se observó que la colina oxidasa
expresada se localizaba en el estroma de los cloroplastos, indicando
que la colina oxidasa se había transportado a los cloroplastos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se calculó el contenido de betaína en hojas de
plantas por medición del espectro de RMN de un compuesto de amonio
cuaternario (Wall, J. et al., Analyt. Chem. 32:
870-874, 1960). Se pulverizaron 5 g de hoja de las
plantas de tipo silvestre y transformada en nitrógeno líquido
mediante un motor de cerámica. Este polvo se suspendió en 25 ml de
H_{2}SO_{4} 1,0 M y se incubó a 25ºC durante 2 horas. Después de
que se eliminaran las sustancias insolubles, se recuperó el
sobrenadante por centrifugación a 1000 x g durante 10 minutos. El
sobrenadante se incubó con 10 ml de una solución de
KI-I_{2} a 0º durante 2 horas. Se recuperaron la
betaína y la colina modificadas con periodita mediante
centrifugación a 1000 x g durante 30 minutos y se disolvieron en
0,5 ml de CD_{4}OH (Wako) que contenía
2-metil-2-propanol
0,5 mM (Wako) como patrón interno para medir el espectro de RMN
^{1}H. Se observaron dos picos principales que se correspondían
con la betaína y con la colina y los picos integrados de betaína se
usaron para la determinación de la concentración.
El contenido de clorofila en las hojas se midió
mediante el siguiente procedimiento. Se pulverizaron hojas (1 g) en
nitrógeno líquido mediante un motor de cerámica. El polvo se
suspendió en 10 ml de acetona:agua (4:1, v/v). Después de una
incubación durante 30 minutos, se eliminaron las sustancias
insolubles y el sobrenadante se sometió a espectrofotometría (Arnon,
D. I. Plant Physiol. 24: 1-15, 1949).
Como resultado, tanto la betaína como la colina
se observaron en la planta transformada, mientras que sólo se
observó colina en la planta de tipo silvestre. El contenido de
betaína era de 1,0 \mumol/g de hoja fresca. El contenido de
clorofila era de 0,3 \mumol/g de hoja fresca.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó un ensayo para determinar si la
introducción del gen codA y la acumulación de betaína confieren o no
tolerancia al estrés por bajas temperaturas.
Las plantas de tipo silvestre y transformada se
incubaron a 5ºC durante 7 días bajo iluminación continua de 250
\mumol m^{-2} s^{-1}. No se observaron diferencias
significativas a simple vista entre las plantas de tipo silvestre y
las transformadas. Cuando estas plantas se incubaron a 22ºC durante
2 días más, las hojas de la planta de tipo silvestre comenzaron a
marchitarse y emblanquecerse. Sin embargo, aparentemente la planta
transformada no se vio afectada en absoluto por este
tratamiento.
\vskip1.000000\baselineskip
Se evaluaron las influencias del estrés por
bajas temperaturas sobre la actividad del sistema fotoquímico II de
una hoja de la planta transformada mediante el control de la
fluorescencia de la clorofila. La actividad del sistema fotoquímico
II se midió como una proporción de la fluorescencia de la clorofila
variable con respecto a la fluorescencia de la clorofila máxima
(Fv/Fm) usando un fluorómetro de pulsos de intensidad modulada (PAM-
2000; Walts, Effeltrich, Alemania) (Annu. Rev. Plant Physiol. Plant
Mol. Biol. 42: 313-349, 1991).
Los resultados se muestran en la Figura 10.
Después de la incubación a 5ºC durante 7 días bajo iluminación
continua de 250 \mumol m^{-2} s^{-1}, la actividad del sistema
fotosintético II disminuyó tanto en las plantas de tipo silvestre
como en las transformadas. La disminución fue marcada en el primer
día y después se enlenteció tanto en las plantas de tipo silvestre
como en las transformadas. Sin embargo, la planta transformada
mostró una inactivación mucho más lenta que la planta de tipo
silvestre en cada momento. Después de la incubación durante 5 días,
la planta de tipo silvestre perdió casi completamente la actividad,
pero la planta transformada conservó aproximadamente el 30% del
nivel de actividad original. Sin embargo, no se observaron
diferencias significativas en la actividad del sistema fotosintético
II entre ellas de 10 a 15ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
El grado de inhibición de la fotosíntesis se
midió a una temperatura tan baja como 1ºC. Los resultados se
muestran en la Figura 11A. Las hojas de la planta transformada eran
más tolerantes a la inhibición de la fotosíntesis por bajas
temperaturas que las hojas de la planta de tipo silvestre. En
concreto, las hojas de la planta de tipo silvestre perdieron
aproximadamente el 75% de la actividad del sistema fotosintético II
después de 2,5 horas, mientras que pasaron 3,5 horas o más hasta
que las hojas de la planta transformada se inactivaron en el mismo
grado.
La Figura 11B muestra los resultados del ensayo
de recuperación de la inhibición de la fotosíntesis por bajas
temperaturas. Después del ensayo anterior a bajas temperaturas, las
hojas se incubaron a 17ºC con 70 \mumol m^{-2} s^{-1}. Las
hojas de las plantas tanto de tipo silvestre como transformadas
mostraron una recuperación de la inhibición de la fotosíntesis por
bajas temperaturas. Sin embargo, la planta transformada mostró un
mayor grado de recuperación que la planta de tipo silvestre. Después
de la incubación durante 4 horas, las hojas de la planta de tipo
silvestre recuperaron del 25 al 50% de la actividad original. Sin
embargo, las hojas de la planta transformada mostraron una
recuperación del 25 al 75%.
\vskip1.000000\baselineskip
Se arrancaron hojas de las plantas de
Arabidopsis de tipo silvestre y transformada y se sumergieron
en agua a una temperatura que disminuía a una velocidad de 3ºC/min.
Cuando la temperatura se disminuyó hasta -3ºC, se aplicó una aguja
enfriada en nitrógeno líquido a las hojas para congelarlas. Después,
las hojas se enfriaron a una velocidad de 1ºC/hora hasta diversas
temperaturas de medición que variaban desde -2ºC a -12ºC. Las hojas
se retiraron y se dejaron durante una noche a 4ºC de tal modo que se
descongelaran. Al día siguiente, la temperatura se volvió a la
temperatura ambiente y se midió la actividad del sistema fotoquímico
II. Los resultados se muestran en la Figura 12. A cualquier
temperatura, la planta transformada mostró una actividad mayor que
la planta de tipo silvestre.
\vskip1.000000\baselineskip
Se mantuvieron semillas de la planta de tipo
silvestre y semillas T3 de la planta transformada en agua helada (a
aproximadamente 0ºC) durante 2 horas y se esterilizaron, después se
indujo su germinación en medio MS (Murashige-Skoog)
que contenía sacarosa al 2% y goma gelano al 0,5%. Se indujo la
germinación de las semillas a 22ºC durante 20 días con luz durante
16 horas y en la oscuridad durante 8 horas cada día.
Los resultados se muestran en la Figura 13. Como
es evidente a partir de la figura, tanto las plantas de tipo
silvestre como las transformadas germinaron cuando sus semillas no
se sometieron a tratamiento de enfriamiento en la fase de absorción
de agua (Fig. 13A). Cuando las semillas se sometieron a tratamiento
de enfriamiento en la fase de absorción de agua, la planta de tipo
silvestre no germinó pero la planta transformada germinó y creció
tanto como las semillas no tratadas (Fig. 13B).
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon dos genes codA quiméricos
(denominados como 35SINcodA y 35SINTPcodA, respectivamente), que se
localizan en el citosol o en los plastos después de la traducción
del gen de la colina oxidasa (codA) procedente de Arthrobacter
globiformis bajo el control transcripcional del promotor 35S del
virus del mosaico de la coliflor en el plásmido pUC119, mediante el
procedimiento que se describe en el Ejemplo 6 (véase la Fig. 14).
Considerando que es necesaria la presencia de un intrón para la
expresión elevada de un gen en la planta de arroz (por ejemplo,
véase Tanaka, A. et al., Nucleic Acids Res. 18:
6767-6770, 1990), se introdujo un intrón en la
secuencia 5' no traducida del gen de la superóxido dismutasa de la
planta de arroz (SodCc2: Sakamoto, A. et al., FEBS Lett.
358: 62-66, 1995) en ambos genes quiméricos. Además,
se añadió una secuencia de ADN procedente del péptido de tránsito
de la rbcS (Coruzz, G. et al., EMBO J. 3:
1671-1679, 1984) de la planta de guisante al
35SINTPcodA, para transferir la proteína codA a los
cloroplastos.
\vskip1.000000\baselineskip
Cada uno de los dos genes codA quiméricos
preparados en el Ejemplo 16 se introdujo en células de cultivos en
suspensión de callos del escutelo de semillas de una planta de
arroz, junto con el marcador de selección del gen de resistencia a
higromicina, mediante un dispositivo de pistola de partículas. Los
callos transformados se seleccionaron en base a la resistencia a
antibióticos y se volvieron a diferenciar en plantas. Se realizó
una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) sobre los callos
transformadas o individuos transformados y vueltos a diferenciar
que mostraban resistencia a higromicina, para evaluar la integración
y la transcripción del gen codA dentro del genoma nuclear mediante
la técnica de transferencia de Northern, y se seleccionaron de 80 a
100 o más transformantes para cada gen codA.
\vskip1.000000\baselineskip
Los transformantes obtenidos en el Ejemplo 17 se
exploraron mediante la técnica de transferencia de Western para
obtener una planta de arroz transformada (la presente generación)
que expresase el gen codA a nivel de proteínas, incluyendo
finalmente 6 individuos que llevaban el gen localizado en plastos y
10 individuos que llevaban el gen localizado en el citosol.
La planta de arroz carece de actividad colina
oxidasa endógena pero fracciones solubles preparadas a partir de
hojas o raíces de los transformantes mostraron actividad colina
oxidasa. Al contrario de lo que se esperaba, se descubrió que todos
los individuos de los transformantes del tipo plastos expresaban una
cantidad inferior de proteína colina oxidasa que los del tipo
citosol, a pesar de que se usó el mismo promotor de expresión.
Cuando la expresión del gen codA se examinó
adicionalmente mediante la técnica de transferencia de Northern, no
se encontraron diferencias significativas en la cantidad de ambos
genes expresados a nivel de transcripción. Cuando se examinó el
procesamiento del intrón mediante PCR con transcripción inversa,
múltiples variantes de corte y empalme que contenían diferentes
sitios aceptores 3', que podían no provocar una traducción normal
en proteínas se detectaron a partir del ARNm transcrito a partir del
gen del tipo plastos. Esto sugería que el bajo nivel de expresión
de proteínas por la planta transformada con el gen del tipo plastos
podía deberse a un procesamiento anormal del precursor de ARNm.
Este fenómeno parece estar relacionado con el hecho de que la
secuencia que codifica el péptido de tránsito usado para la
dirección a plastos de la colina oxidasa procedía de una
dicotiledónea (gen de la rbcS del guisante). Por lo tanto,
fácilmente puede esperarse que la expresión del codA en
cloroplastos de la planta de arroz sería más eficaz y la planta de
arroz transformada resultante sería más tolerante al estrés por las
temperaturas si la secuencia que codifica el péptido de tránsito
procediera de una monocotiledónea tal como de la rbcS de la planta
de arroz.
\vskip1.000000\baselineskip
Se detectó la betaína que se acumulaba en los
tejidos de transformantes que expresaban colina oxidasa mediante
RMN de protones. La Figura 15 muestra los resultados de la RMN de la
cepa de tipo silvestre, de un transformante que no expresa el gen
codA (Fig. 15A) y de un transformante que expresa el gen codA (Fig.
15B).
El transformante que expresa betaína
biosintetizada por colina oxidasa y la cantidad de betaína que se
acumulaba mostraba una correlación positiva con la cantidad de
colina oxidasa detectada mediante la técnica de transferencia de
Western. La cantidad de betaína que se acumulaba era mayor en hojas
que en raíces y alcanzó 4 \mumol/g de hoja fresca en individuos
con una expresión elevada del gen codA. Este el primer caso en el
que una planta de arroz adquirió una capacidad de síntesis de
betaína a través de una técnica de ingeniería genética.
\vskip1.000000\baselineskip
Para examinar si las plantas transformadas
adquirieron tolerancia a la temperatura por la presencia de betaína
o por otras causas, se realizaron los siguientes ensayos usando el
transformante preparado mediante la transformación de la
Synechococcus PCC7942 con un plásmido que contenía el gen
codA y la PAM preparada mediante su transformación sólo con pAM1044
en el Ejemplo 1.
Se cultivaron a 20ºC células de PAM y de PAMCOD,
cultivadas de forma preliminar a 30ºC en presencia de cloruro de
colina 1 mM, en condiciones de iluminación o de oscuridad. En
condiciones de oscuridad, se mantuvo la actividad del sistema
fotoquímico II. Sin embargo, la actividad del sistema fotoquímico II
de células de PAM disminuyó hasta el 35% del nivel original después
del cultivo con 50 \muE m^{-2} s^{-1} durante 120 minutos
(Fig. 16A). La actividad del sistema fotoquímico II de células de
PAMCOD también disminuyó pero en un grado menor que la de las
células de PAM (Fig. 16A). Esto reveló que el sistema fotoquímico II
de las células de PAMCOD es más tolerante a la fotoinhibición que el
de las células de PAM.
La fotoinhibición del sistema fotoquímico II
está causada por la competición entre la inactivación inducida por
la luz de la proteína D1 y la recuperación del sistema fotoquímico
II por captación de proteína D1 recién sintetizada (Aro, E. -M.
et al., Biochim. Biophys. Acta 1019: 269-275,
1990; Aro, E. -M. et al., Biochim. Biophys. Acta 1143:
113-134, 1993). Para examinar si la tolerancia de
células de PAMCOD al estrés lumínico a bajas temperaturas es el
resultado de la supresión de la inactivación de la proteína D1 o de
la estimulación de la síntesis de la proteína D1, se indujo la
fotoinhibición en presencia de un inhibidor de la síntesis de
proteína, linomicina (400 mg/ml). En condiciones de oscuridad, la
linomicina no tenía influencia sobre la actividad del sistema
fotoquímico II de células de PAM y de PAMCOD. Bajo iluminación, se
inactivaron los complejos del sistema fotoquímico II a la misma
velocidad en células de ambos transformantes (Fig. 16B). Este
resultado muestra que la mejora de la tolerancia de las células de
PAMCOD al estrés lumínico a bajas temperaturas no es el resultado
de la supresión de la inactivación de la proteína D1. La presencia
de betaína parecía estimular la recuperación del sistema fotoquímico
II.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ensayaron células de PAM y de PAMCOD para
determinar la recuperación del sistema fotoquímico II de la
fotoinhibición por medición de la actividad de liberación de
oxígeno. Se expusieron las células a una luz de 3500 \muE
m^{-2} s^{-1} para inhibir los complejos del sistema fotoquímico
II hasta el 15% del nivel original. Después, las células se
cultivaron a 20ºC o a 30ºC bajo iluminación de 70 \muE m^{-2}
s^{-1}. Los resultados se muestran en la Figura 17.
A 20ºC, las células de PAM mostraban sólo una
ligera recuperación de los complejos del sistema fotoquímico II de
la fotoinhibición. Sin embargo, las células de PAMCOD se recuperaron
hasta el 60% del nivel original después de 2 horas (Fig. 17A). A
30ºC, las células de ambas cepas recuperaron completamente la
actividad del sistema fotoquímico II después de 2 horas. Sin
embargo, las células de PAMCOD se recuperaron mucho más rápido que
las células de PAM (Fig. 17B).
\vskip1.000000\baselineskip
Se compararon las tolerancias de células de PAM
y de PAMCOD a estrés por bajas temperaturas en condiciones de
oscuridad a bajas temperaturas. Se muestran en la Figura 18 los
efectos de diversos tratamientos a bajas temperaturas sobre la
inactivación de la fotosíntesis neta y del transporte del electrones
mediado por el sistema fotoquímico II en ambas células. La
actividad de liberación de oxígeno mediante la fotosíntesis de
células de PAMCOD era más tolerante a las bajas temperaturas que la
de células de PAM (Fig. 18A). Se obtuvieron resultados similares
para el transporte de electrones mediado por el sistema fotoquímico
II. La actividad de las células de PAM disminuyó hasta el 50% del
nivel original a 5ºC, mientras que la actividad de las células de
PAMCOD permaneció casi al mismo nivel que la de las de control a 5ºC
y disminuyó por debajo de 5ºC (Fig. 18B). Estos resultados
demuestran que la fotosíntesis de las células de PAMCOD es más
tolerante a las bajas temperaturas que la de las células de PAM.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha descrito que las células de cianobacterias
expuestas a bajas temperaturas disminuyen su crecimiento o su
actividad fotosintética debido al cambio de fase de lípidos de las
membranas protoplasmáticas desde el estado de cristal líquido hasta
el estado de separación de fases (Murata, N., J. Bioenerg. Biomembr.
21: 61-75, 1989). Se realizó un ensayo para
examinar si la mejora de la tolerancia a las bajas temperaturas de
células de PAMCOD está o no relacionada con el cambio de fase de
lípidos de las membranas.
La transición de fase de lípidos de membranas
protoplasmáticas puede ensayarse por aglutinación de zeaxantina
mediante el control del cambio de absorbancia en células de
Synechococcus PC7942 y PCC6301 (denominada anteriormente
como Anacystis nidulans) a 388 nm (Brand, J. J., Plant
Physiol. 59: 970-973, 1977; Gombos, Z. et
al., Plant Physiol. 80: 415-419, 1986; Murata
N., J. Bioenerg. Biomembr. 21: 61-75, 1989; Ono, T.
et al., Plant Physiol. 67: 176-181, 1981; Wada, H.
et al., Nature 347: 200-203, 1990; Yamamoto,
H. Y. et al., Biochim. Biophys. Acata 507:
119-127, 1978). La Figura 19 muestra los resultados
de células de PAM y células de PAMCOD ensayadas por un método
similar. La Figura 19 muestra que la transición de fase de lípidos
de membrana de células de PAM aparece a los 10ºC y finaliza a los
2ºC, siendo la temperatura intermedia de 6ºC. Por otro lado, la
transición de lípidos de membrana de células de PAMCOD comienza a
los 5ºC. Esto significa que la transición de lípidos de membranas
protoplasmáticas de células de PAMCOD se produce a una temperatura
5ºC inferior que la de células de PAM.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha sabido que la temperatura de transición de
lípidos de membrana de cianobacterias depende del grado de
insaturación de los ácidos grasos y de la naturaleza de los lípidos
(Murata, N., J. Bioenerg. Biomembr. 21: 61-75,
1989). Por lo tanto, se ensayaron lípidos de membrana de células de
PAMCOD. Las Tablas 1 y 2 muestras componentes de los ácidos grasos
y glicerolípidos en membranas protoplasmáticas y membranas
tilacoides de células de PAM y de PAMCOD. La Tabla 1 muestra la
composición de lípidos en células cultivadas a 30ºC en presencia de
cloruro de colina 1 mM. La Tabla 2 muestra la composición de
glicerolípidos en células cultivadas a 30ºC en presencia del cloruro
de colina 1 mM.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
- 14:0:
- ácido mirístico
- 14:1:
- ácido \Delta9-mirístico
- 16:0:
- ácido palmítico
- 16:1:
- ácido \Delta9-palmítico
- 18:0:
- ácido esteárico
- 18:1(9):
- ácido \Delta9-esteárico
- 18:1(11):
- ácido \Delta11-esteárico
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los dobles enlaces están en forma cis.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- MGDG:
- monogalactosil diacilglicerol
- DGDG:
- digalactosil diacilglicerol
- SQDG:
- sulfoquinovosil diacilglicerol
- PG:
- fosfatidilglicerol
\vskip1.000000\baselineskip
Como es evidente a partir de las Tablas 1 y 2,
no se observaron diferencias significativas entre ambas.
La Figura 20 muestra los patrones
electroforéticos de proteínas de membrana y fracciones solubles de
células de PAM y de PAMCOD. Se observó una ligera diferencia en las
fracciones de membrana. En concreto, las células de PAMCOD mostraron
un aumento en la cantidad de la proteína de 14 kda y una disminución
en la cantidad de la proteína de 16 kda. No se encontraron otras
diferencias en la fracción soluble excepto por que las células de
PAMCOD mostraban una banda que se correspondía con la colina
oxidasa.
Por lo tanto, no se encontraron diferencias
significativas en los lípidos o proteínas de membrana entre células
de PAM y de PAMCOD, indicando que la protección del sistema
fotoquímico II, como se había observado en células de PAMCOD a bajas
temperaturas, es un efecto de la betaína.
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2400 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: mat peptide
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 361..2002
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (5)
1. Un método para producir una planta superior
tolerante a las temperaturas que comprende transformar una planta
superior con un vector recombinante que lleva un gen que codifica
una colina oxidasa procedente de Arthrobacter globiformis o
de Arthrobacter pascens, en el que la tolerancia a la
temperatura significa una capacidad de la planta transformada para
crecer a temperaturas superiores o inferiores a las temperaturas que
normalmente permiten crecer a plantas no transformadas; en el que la
planta superior es una dicotiledónea o una monocotiledónea.
2. El método de la reivindicación 1, en el que
el gen que codifica la colina oxidasa es una secuencia de
nucleótidos de acuerdo con los siguientes a) o b)
a) la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº:
1 o
b) la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº:
1, en la que se añaden, se delecionan y/o se sustituyen uno o más
nucleótidos de dicha secuencia de nucleótidos, con tal de que
codifique una proteína que tenga actividad colina oxidasa.
3. El método de la reivindicación 1, en el que
la dicotiledónea es una planta brasicácea.
4. El método de la reivindicación 1, en el que
la monocotiledónea es una planta gramínea.
5. Uso de un gen que codifica una colina oxidasa
procedente de la bacteria del suelo Arthrobacter globiformis
o Arthrobacter pascens para producir una planta superior
tolerante a las temperaturas en el que la tolerancia a la
temperatura significa una capacidad de la planta transformada para
crecer a temperaturas superiores o inferiores a las temperaturas que
normalmente permiten crecer a plantas no transformadas, mediante la
transformación de dicha planta con dicho gen, en el que la planta
superior es una dicotiledónea o una monocotiledónea.
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