MXPA00012786A - Plantas de cereales transgenicos tolerantes a la tension provocada por la escasez del agua o la tension provocada por las sales - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una planta de cereal transgénica y a un protoplasto o célula vegetal del cereal, transformada con unácido nucléico que codifica una enzima para la biosíntesis de la prolina que confiere tolerancia a la tensión provocada por la escasez del aguao a la tensión provocada por las sales a la planta. Otro aspecto de la presente invención es un método para conferir tolerancia a la tensión provocada por la escasez del agua o a la tensión provocada por las sales a una planta de cereal que incluye la transformación de un protoplasto o célula vegetal del cereal con unácido nucléico que codifica una enzima para la biosíntesis de la prolina. La presente invención también se refiere a un método para incrementar la tolerancia de una planta de cereal a las condiciones de la tensión provocadas por la escasez del agua o a las condiciones de tensión provocadas por las sales, el método incluye incrementar los niveles de una enzima para la biosíntesis de la prolina en la planta de cereal. Todavía otro aspecto de la presente invención es una planta de cereal transgénica transformada con un plásmido que confiere tolerancia a la tensión provocada por el escasez del agua o a la tensión provocada por las sales a la planta del cereal.

Description

PLANTAS DE CEREALES TRANSGENICOS TOLERANTES A LA TENSIÓN PROVOCADA POR LA ESCASEZ DEL.AGUA O A LA TENSIÓN PROVOCADA POR LAS SALES Campo de la Invención La presente invención se refiere a plantas de cereales transgénicos las cuales son transformadas con un ácido nucleico que codifica una enzima para la biosíntesis de prolina que confiere una tolerancia a la tensión provocada por la escasez del agua o a la tensión provocada por las sales, a la planta, y a un método para incrementar o conferir tolerancia a la tensión provocada por la escasez del agua o a la tensión provocada por las sales, a una planta de cereal.

Antecedentes de la Invención Las tensiones ambientales, tales como las sequías, la salinidad incrementada del suelo, y la temperatura extrema, son factores principales en la limitación del crecimiento y productividad de las plantas. Las pérdidas en todo el mundo en la producción de tres cosechas de cereales principales, el arroz, el maíz, y el R?f.125920 . ***. ".-^..^F ->* .?^figiá¡togifc&.>^^^^^jgft?,ss£iÍ.Aj^gtoM^^^^ trigo debido a las tensiones provocadas por el agua (sequías) se han estimado que van a estar por arriba de diez mil millones de dólares anualmente. Las tensiones provocadas por las sales y la^s tensiones provocadas por la sequía son dos de las más importantes tensiones abióticas.- De las 4,870 millones de hectáreas de tierra agrícola en el mundo, 930 millones (1% del total) son áreas afectadas por las sales (FAO Qarterly Bulletin of Statistics, Vol. 9 (1996)). Los niveles moderados del contenido de las sales en el suelo (tales como 50 mM) provocan una reducción substancial en la producción o rendimiento de las cosechas. Los niveles elevados de la sal en el suelo (más elevados que 100 o 150 mM) no son todos adecuados para plantar la mayoría de los cultivos de cereales. Aproximadamente 5.2% de las tierras agrícolas están bajo tensión de la sequía (FAO Quaterly Bulletin of Statistics, Vol. 9 h (1996)), y la pérdida de la producción del cultivo también es muy significativa. En términos prácticos, el arroz es el cultivo más importante a causa de que un porcentaje elevado de la población mundial depende del mismo para su alimentación básica. Junto con el trigo y el maíz, estos tres cultivos constituyen la fuente principal de los alimentos y calorías para alimentar a la gente. Con un incremento en la población y una reducción en la tierra que se puede arar, existe una posibilidad real de una escasez de alimentos por el año 2030. Por lo tanto, ea esencial utilizar totalmente la biotecnología de las plantas para mejorar las plantas y producir más alimentos. 5 La siembra de las variedades de cultivos de las cosechas tolerantes de la tensión representan una estrategia promisoria para resolver estos problemas (Epstein y colaboradores, "Saline Culture of Crops: A Genetic Approach", Science, 210:399-404 (1980)). Sin embargo, la siembra convencional es un proceso lento para generar variedades de cultivos con una tolerancia mejorada a las condiciones de la tensión. Los recursos del plasma del germen limitados para la tolerancia de la tensión e incompatibilidad en los cultivos entre las especies de plantas relacionadas lejanamente son problemas adicionales encontrados en la siembra convencional. El progreso reciente en la transformación genética de las plantas y la disponibilidad de los genes potencialmente útiles, caracterizados de diferentes fuentes, hace posible generar cultivos tolerantes de la tensión utilizando enfoques transgénicos (Tarczynski y colaboradores, "Stress Protection of Transgenic Tobacco by Production of the Osmolyte Mannitol", Science, 259:508-510 (1993). Pilon- Smits y colaboradores, "Improved Performance of Transgenic Fructan-Accumulating Tobacco Under Drouth Stress", Physiol. s-*»- -*.«"«? ^ -fa«>-gi-B-fes4g jmt « * -> - - .» üa<^«afi;.<t,y« Plant., 107:125-130 (1995)). La transformación de las plantas de cereales con los_ genes útiles agronómicamente que incrementan la tolerancia a la tensión abiótica es una forma importante de minimizar las pérdidas de la producción. Por ejemplo, podría ser altamente deseable producir plantas de arroz transgénico que puedan dar un rendimiento razonable cuando crezcan en tierras de desecho o marginales que contengan niveles relativamente elevados de una sal, tales como 100-150 mM, en el suelo. La caracterización y la clonación de los genes de las plantas que confieren tolerancia a la tensión, permanece como un desafío. Los estudios genéticos revelaron que la tolerancia a la sequía y la salinidad en algunas variedades de cultivos se debe principalmente a los efectos de los genes aditivos (Akbar y colaboradores, "Breeding For Soil Stress", en Progress in Rainfed Lowland Rice, International Rice Research Institute, Manila, Filipinas, pp. 263-272 (1986); Akbar y colaboradores, "Genetics of Salt Tolerance in Rice", en Rice Genetics, International Rice Research Institute, Manila, Filipilas, pp. 399-409 (1986)). Sin embargo, el mecanismo molecular subyacente para la tolerancia nunca ha sido revelado. Las respuestas fisiológica y bioquímica a los niveles elevados de los solutos iónicos o no iónicos y el potencial acuoso reducido han sido estudiados en una variedad de plantas. Con base en las observaciones experimentales acumuladas y una consideración teórica, un mecanismo sugerido que puede sostener la adaptación o tolerancia de las plantas a las tensiones osmóticas es la acumulación de osmolitos de peso molecular bajo, compatibles, tales como los alcoholes de azúcar, los aminoácidos especiales, y la glicina betaína (Greenway y colaboradores, "Mechanisms of Salt Tolerance in Nonhalophytes", Annu. Rev. Plant Physiol., 31: 149-190 (1980) : Yancey y colaboradores, "Living With Water Stress: Evolution of Osmolyte System", Science, 217:1214-1222 (1982)). En particular, el nivel de prolina se sabe que se incrementa en un número de plantas y bacterias bajo las tensiones provocadas por las sequías o las sales. Recientemente, un estudio transgénico ha demostrado que la acumulación del manitol del alcohol de azúcar en el tabaco transgénico confirió protección contra la tensión provocada por las sales (Tarezynsli y colaboradores, "Stress Protection of Transgenic Tobacco by Production of the Osmolyte Mannitol", Science, 259:508-510 (1993)). Dos estudios recientes que utilizan un enfoque transgénico han demostrado que el diseño metabólico de la ruta de biosíntesis de la glicina betaína no solamente es posible sino también puede conducir eventualmente a la producción de plantas tolerantes de la tensión (Holstrom y colaboradores, "Production of the Escherichia coli Betaine- Aldehyde Dehydrogenase, An Enzyme Required for the Synthesis of the Osmoprotgctant Glicine Betaine, in Transgenic Plants", Plant J., 6:749-758 (1994); Rathinasabapathi y colaboradores, "Metabolic Engineering of Glicine Betaine Synthesis: Plant Betaine Aldehyde Dehydrogenases Lacking Typical Transit Peptides are Targeted to Tobacco Chloroplast Where they Confer Betaine Aldehyde Resistance-", Planta, 193:155-162 (1994)). Además , los cambios metabólicos y la acumulación de compuestos de peso molecular bajo, un gran conjunto de genes son activados transcripcionalmente, lo cual conduce a la acumulación de nuevas proteínas en los tejidos vegetales de las plantas bajo condiciones de tensión osmótica, incluyendo la familia abundante en embriogénesis tardía (LEA) , deshidrinas, y C0R47 (Skriver y colaboradores, "Gene Expression in Responde to Abscisic Acid and Osmotic stress", Plant Cell., 2:503-512 (1990); Chandler y colaboradores, "Gene Expression Regulated by Abscisic Acid and its Relation to Stress Tolerance", Annu. Rev. Plant Physic . Plant Mol. Biol., 45:113-141 (1994)). Los niveles de . presión de un número de genes se ha reportado que se van a correlacionar con la tolerencia a la desecación, las sa^es, o el frío, de diferentes variedades de plantas de las Mismas especies. En general se supone que las proteínas inducidas por la tensión podrían desempeñar un papel en la tolerancia, pero las funciones de muchos genes de respuesta a la tensión son desconocidas. La explicación de la función de estos genes y enzimas de respuesta a la tensión involucradas en la 5 biosíntesis de los osmolitos inducidos por la tensión, no solamente hará avanzar el entendimiento de la adaptación de la planta y la tolerancia a las tensiones ambientales, sino también puede proporcionar una información importante para el diseño de nuevas estrategias para la mejora de los cultivos (Chandler y colaboradores, "Gene Expression Regulated by Abscisic Acid and its Relation to Stress Tolerance", Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 45:113-141 (1994)). Varios genes que codifican las enzimas clave involucradas en la biosíntesis de los osmolitos específicos (tales como el manitol, la prolina, o la glicina betaína) han sido introducidos en las células del tabaco. Las plantas de tabaco transgénicas regeneradas mostraron una tolerancia parcial a la tensión provocada por la sequía y la tensión provocada por las sales (Tarczynski y colaboradores, "Stress Protection of Transgenic Tobacco by Production of Osmotic Mannitol", Science, 259:508-510 (1993): Kishor y colaboradores, "Overexpression of ?1-pyrroline-5-carboxilate Synthetase Increases Proline Production and Confers Osmotolerance in Transgenic Plants", s Plant Physiol., 108:1387-1394 (1995); Liluis y colaboradores, "Enhanced i?aCl stress tolerance in transgenic tobáceo expressing bacterial choline dehydrogenase", Biotech, 14:177-180 (1996)). Sin embargo, solamente el tabaco transgénico fue utilizado para estos estudios, y un trabajo similar sobre la producción de plantas de cultivo de cereales tolerantes a la tensión no se ha llevado a cabo. No es claro si estos genes en las plantas de cereales transgénicas mejorará la tolerancia a las sales o a la sequía puesto que la fisiopatología en plantas dicotiledóneas, tales como el tabaco, es muy diferentes de las monocotiledóneas, tales como las plantas de cereales. Por consiguiente, solo la experimentación utilizando plantas de cultivo de cereales puede proporcionar la respuesta. La presente invención está dirigida a superar las deficiencias mencionadas anteriormente en la técnica previa.

Breve Descripción de la Invención La presente invención se refiere a una planta de cereal transgénica transformada con un ácido nucleico que codifica una enzima para la biosíntesis de la prolina que confiere tolerancia a la tensión provocada por la escasez s^ A-.^^^'-^^«^a£feS.^a¿A«.,^teg^g-^ ^St. .Y rí&^i, del agua o a la tensión provocada por las sales, a la planta. __. La presente invención también se refiere a una célula o protoplasto vegetal de un cereal transformado con un ácido nucleico que codifica una enzima para la biosíntesis de la prolina que confiere tolerancia a la tensión provocada por la escasez del agua o la tensión provocada por las sales sobre una planta de cereal regenerada a partir de dicho protoplasto o célula vegetal del cereal. Otro aspecto de la presente invención es un método para conferir tolerancia a la tensión provocada por la escasez del agua o a la tensión provocada por las sales, a una planta, que incluye la transformación de un protoplasto o célula vegetal del cereal con un ácido nucleico que codifica una enzima para la biosíntesis de la prolina. La presente invención también se refiere a un método para incrementar la tolerancia de una planta de cereal a las condiciones de la tensión provocada por la escasez del agua o a la tensión provocada por las sales, el método incluye incrementar los niveles de una enzima para la biosíntesis de la prolina en la planta de cereal. La presente invención permite la producción de plantas de cereal con tolerancia incrementada a la tensión provocada por la escasez del agua (sequía) o a la tensión provocada por las sales. _Así, una enzima para la biosíntesis de la prolina puede ser utilizada como una herramienta molecular para la mejora de los cultivos genéticos confiriendo una tolerancia a la tensión.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención se refiere a una planta de cereal transgénico transformada con un ácido nucleico que codifica una enzima para la biosíntesis de la prolina que confiere tolerancia a la tensión provocada por la escasez del agua o a la tensión provocada por las sales, a la planta. Los ácidos nucleicos adecuados que codifican una enzima para la biosíntesis de la prolina incluyen el gen P5CS de la mothbean (una planta de la india, Vigna aconitifolia, de la familia de las legumbres) y un mutante insensible a la inhibición de la retroalimentación, P5CS-129A, del gen P5CS. La secuencia del gen P5CS se puede encontrar en Kishor y colaboradores, "Overexpression of ?1-pyrroline-5-carboxilate Synthetase Increases Proline Production and Confers Osmotolerance in Transgenic Plants", Plant Physiol., 108:1387-1394 (1995), la cual es incorporada en el presente para referencia, y la secuencia del gen mutante de P5CS-129A se puede encontrar en Zhang y colaboradores, "Removal of Feedback Inhibition of P5CS in Plants", J. Biol. Chem., 270:20491:20496 (1995), la cual es incorporada en el presente para referencia. Los cereales los cuales pueden ser transformados de acuerdo con la invención objeto son miembros de la familia Gramineae (también conocida como Poaceae) , e incluyen el arroz (género Oriza) , el trigo, el maíz, la cebada, la avena, el sorgo, y el mijo. Preferentemente, el cereal es el arroz, el trigo, o el maíz, y aún más preferentemente el cereal es el arroz. Muchas especies de cereales pueden ser transformadas, y dentro de cada una de las especies, se pueden transformar las numerosas subespecies y variedades. Por ejemplo, dentro de las especies del arroz están las subespecies de Indica rice (Oriza sativa ssp. Indica), la cual incluye las variedades IR36, IR64, IR72, Pokkali, Nona Bokra, KDLM 105, Suponburi 60, Suponburi 90, Basmati 385, y Pusa Basmati 1. Otras subespecies del arroz son Japónica, la cual incluye Nipponbere, Kenfeng y Tainung 67. Los ejemplos de las variedades del maíz adecuadas incluyen A 188, B73, VA22, L6, L9, Kl, 509, 5922, 482, HNP e IGES. Los ejemplos de las variedades de trigo adecuadas incluyen Pavón, Anza, Chris, Coker 983, FLA301, FLA302, Fremont y Hunter.

Habiéndose identificado la planta de cereal de interés, las células vegetales adecuadas para la transformación incluyen embriones inmaduros, callos, células en suspensión, y protoplastos. Se prefiere 5 particularmente utilizar las células en suspensión y los embriones maduros. Estas células vegetales del cereal son transformadas con un ácido nucleico, el cual podría ser el ARN o el ADN y _ cual preferentemente es el ADNc, que codifica una enzima para la biosíntesis de la prolina. El ácido nucleico puede ser aislado biológicamente o sintético. En los siguientes Ejemplos, una enzima clave para la biosíntesis de la prolina, la ?1-pirrolin-5- carboxilato sintasa (P5CS), es codificada por el gen P5CS de mothbean (una planta de la India, Vigna aconitifolia, de la familia de las legumbres). Sin embargo, otros genes que codifican una enzima para la biosíntesis de la prolina, que incluyen un mutante insensible a la inhibición de la retroalimentación cel gen P5CS, el P5CS-129A, también pueden ser utilizau s. La transformación de las células vegetales puede ser efectuada utilizando un plásmido. El plásmido es utilizado para ínc-oducir el ácido nucleico que codifica una enzima para <.c< i osíntesis de la prolina en la célula vegetal. En consecuencia, un plásmido incluye preferentemente el ADN que codifica una enzima para la biosíntesis de la prolina _ insertada en un sitio de segmentación de la endonucleasa de restricción única. El ADN heterólogo, como se utiliza aquí, se refiere al ADN no 5 presente normalmente en la célula huésped particular transformada por el plásmido. El ADN es insertado en el vector utilizando procedimientos de clonación estándar conocidos fácilmente en la técnica. Esto involucra generalmente el uso de enzimas de restricción y ligasas del ADN, como se describió por Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2/a. edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989), la cual es incorporada aquí para referencia. El plásmido resultante el cual incluye el ácido nucleico que codifica una enzima para la biosíntesis de la prolina puede ser utilizado entonces para transformar una célula huésped, tal como un Agrobacterium y/o una célula vegetal. (Véase generalmente, Plant Molecular Biology Manual, 2/a. Edición, Gelvin y colaboradores, Eds., Kluwer Academic Press, Dordrecht, Netherlands (1994), la cual es incorporada aquí para referencia) . Para la transformación de la planta, el plásmido también incluye preferentemente un marcador seleccionable para la transformación de la planta. Los marcadores seleccionables por la planta utilizados comúnmente incluyen jÉ*B ^mL»1 <'sas> el gen de higromicin fosfotransfera (hpt), el gen de fosfinotricin acetil transferasa (bar) , el gen de 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), el gen de neomicin 3' -O-fosfotransferasa (npt II), o el gen de acetolactato sintasa (ALS) . La información sobre estos marcadores seleccionables también se puede encontrar en Bowen, "Markers for Plant Gene Transfer" en Transgenic Plants, Kung y colaboradores, Eds. Vol. 1, pp. 89-123, Academic Press, NY (1993), la cual es incorporada aquí para referencia. El plásmido también incluye preferentemente los promotores adecuados para la expresión del ácido nucleico que codifica una enzima para la biosíntesis de la prolina y para la expresión del gen marcador. El promotor del virus 35S de mosaico de coliflor es utilizado comúnmente para la transformación de las plantas, así como el promotor del gen de actina 1 del arroz. En el plásmido pJS102 utilizado en los siguientes Ejemplos, el ácido nucleico que codifica una enzima para la biosíntesis de la prolina está bajo el control del promotor del gen de actina 1 del arroz, constitutivo, y el gen marcador (bar) está bajo el control del promotor del virus 35S del mosaico de la coliflor. Otros promotores útiles para la transformación de las plantas con una enzima para la biosíntesis de prolina incluyen aquellos de los genes que codifican la ubiquitina y el inhibidor H de la proteinasa (PINH) así como los promotores inducidos por la tensión (tales como el promotor del gen de HVA1 de la cebada, un promotor inducido por el ácido abscísico (ABA) , tal como ABRC1 de la cebada enlazada a un promotor mínimo Act-100 del arroz, y un intrón de HVA22) . El plásmido designado pJS112 ha sido depositado de acuerdo con, y de manera satisfactoria con, los requerimientos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los propósitos de los procedimientos de patentes, con el American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110- 2209, bajo el No. de Acceso el 17 de junio de 1999. Para la transformación de la planta, el plásmido también incluye preferentemente una molécula de ácido nucleico que codifica un terminador de 3' tal como aquel de la región 3' no codificante de los genes que codifican un inhibidor de proteinasa, actina, o nopalin sintasa (nos) . Otros plásmidos adecuados para su uso en la presente invención pueden ser construidos. Por ejemplo, los genes que codifican una enzima para la biosíntesis de la prolina diferentes del gen de P5CS de mothbean (una planta de la India, Vigna aconitifolia, de la familia de las _^^^^_^^ ^^^^^ ^^^^^^ legumbres), podría ser ligado o unido en el plásmido JS109 después del uso de las enzimas de restricción para remover el gen de P5CS. Otros promotores podrían reemplazar el promotor del gen de actina 1 presente en el plásmido JS102. Alternativamente, otros plásmidos que contienen en general genes que codifican una enzima para la biosíntesis de la prolina bajo el control de un promotor adecuado, con marcadores seleccionables adecuados, pueden ser construidos fácilmente utilizando técnicas conocidas en el arte. Habiéndose identificado el plásmido, una técnica de transformación de las células vegetales del cereal con un gen el cual codifique una enzima para la biosíntesis de la prolina es poniendo en contacto la célula vegetal con un inoculo de una bacteria de Agrobacterium transformada con el plásmido que comprende el gen que codifica la enzima para la biosíntesis de la prolina. En general, este procedimiento involucra inocular las células vegetales con una suspensión de las bacterias transformadas y la incubación de las células durante 48 a 72 horas en el medio de regeneración sin antibióticos a 25-28 °C. Las bacterias del género agrobacterium pueden ser utilizadas para transformar las células vegetales. Las especies adecuadas incluyen Agrobacterium tumefaciens y Agrobacterium rhizogenes. El Agrobacterium tumefaciens (por ejemplo, las cepas LBA4404 o EHA105) es particularmente útil debido a su capacidad bien conocida de transformar las plantas. _ En la inoculación de las células de las plantas de cereal con Agrobacterium de acuerdo con la invención objeto, las bacterias deben ser transformadas con un vector el cual incluya un gen que codifique una enzima para la biosíntesis de prolina. Los plásmidos adecuados para la incorporación en Agrobacterium, los cuales incluyen un gen que codifica una enzima para la biosíntesis de la prolina, contienen un origen de replicación para la replicación en la bacteria de Escherichia coli, un origen de replicación para la replicación en la bacteria de Agrobacterium tumefaciens, las secuencias del límite derecho de T-ADN para la transferencia de los genes a las plantas, y los genes marcadores para la selección de las células vegetales transformadas. Se prefiere particularmente el vector pBI121 el cual contiene un origen de RK2 de copia inferior de la replicación, el gen marcador de neomicin fosfotransferasa (nptll) con un promotor de nopalin sintasa (NOS) y una señal de poliadenilación de NOS 3' . El vector pBI121 del plásmido del T-ADN está disponible de Clonetech Laboratories, Inc., 4030 Fabián Way, Palo Alto, California 94303. Un gen que codifica una enzima para la biosíntesis de la prolina es insertado en el vector para reemplazar el gen de beta-glucuronidasa (GUS.) • Típicamente, el Agrobacterium spp es transformado con un plásmido por la absorción directa del ADN del plásmido después del tratamiento químico y térmico, como se describió por Holsters y colaboradores, "Transfection and Transformation of Agrobacterium tumefaciens", Mol. Gen. Genet. 163:181-187 (1978), la cual es incorporada aquí para referencia; por le absorción directa del ADN del plásmido después de la electroporación, como se describió por Shen y colaboradores, "Eficient Transformation of Agrobacterium spp by High Voltage Electroporation", Nucleic Acids Research, 17:8385 (1989), la cual es incorporada aquí para referencia; por la transferencia conjugacional triparental de los plásmidos de Escherichia coli a Agrobacterium mediado por una ce~>a auxiliar Tra+ como se describió por Ditta y colaboraaorts, "Broad Host Range DNA Cloning System for Gram. negati ve Bacteria: Construction of a Gene Bank of Rhizobium melilotí", Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77:7347- 7351 (1981), la cu es incorporada aquí para referencia; o por la transferencia de conjugación directa de Escherichia coli a Agrobacterium como se describió por Simón y colaboradores, "A S^oad Host Range Mobilization System for in vivo Genetic ;n7ineepng: Transposon Mutagenesis in Gram-negative Bacteria", Biotechnology, 1:784-791 (1982), la cual es incorporada aquí pa.ra referencia. Otro método para la introducción de un plásmido que contiene el ácido nucleico que codifica una enzima para 5 la biosínteis de la prolina en una célula vegetal es por la transformación del núcleo de la célula vegetal, tal como el bombardeo de partículas. Cuando se utilice en toda esta solicitud, el bombardeo de partículas (también conocido como la transformación biolística) de la célula huésped, puede ser efectuada en una de varias formas. La primera involucra la propulsión de partículas activas biológicamente o inertes, én las células. Esta técnica se describe en las Patentes U.S. Nos. 4,945,050, 5,036,006 y 5,100,792, todas de Sanford y colaboradores, las cuales son incorporadas en el presente para referencia. En general, este procedimiento involucra la propulsión de partículas inertes o biológicamente activas en las células bajo condiciones efectivas para penetrar la superficie externa de la célula y para que sean incorporadas dentro del interior de la misma. Cuando las partículas inertes sean utilizadas, el plásmido puede ser introducido en la célula por el recubrimiento de las partículas con el plásmido que contiene el ADN heterólogo. Alternativamente, la célula de blanco u objetivo puede estar rodeada por el plásmido de modo que el plásmido sea llevado en la célula por la *. resucitación de la partícula. Las partículas biológicamente activas (por ejemplo, las células bacterianas secas que contienen el plásmido y el ADN heterólogo) también pueden ser propulsadas en las células vegetales. 5 Un método adicional para la introducción del plásmido en una célula vegetal es por la transformación de los protoplastos de la célula vegetal (estables o temporales) . Los protoplastos de la planta están encerrados solamente por la membrana del plasma y por lo tanto absorberán las macromoléculas semejantes al ADN heterólogo. Estos protoplastos diseñados pueden ser capaces de regenerar las plantas completas. Los métodos adecuados para introducir el ADN heterólogo en los protosplatos de la célula vegetal incluyen la electroporación y la transformación del polietilenglicol (PEG) . Cuando se utilice en toda esta solicitud, la electroporación es un método de transformación en el cual, generalmente, una concentración elevada del ADN del plásmido (que contiene el ADN heterólogo) es agregada a una suspensión de los protoplastos de la célula huésped y la mezcla es cortocircuitada con un campo eléctrico de 200 a 600 V/cm. A continuación de la electroporación, las células transformadas son identificadas por el crecimiento sobre un medio apropiado que contiene un agente selectivo.

Cuando se utilice en esta solicitud, la transformación abarca la transformación estable en la cual el plásmido es integrado en los cromosomas de la planta. En los ejemplos que siguen, el arroz ha sido transformado utilizado la transformación biolística. Otros métodos de transformación han sido utilizados para transformar exitosamente las plantas del arroz, incluyendo el método de los protoplastos (para una revisión, véase Cao y colaboradores, "Regeneration of herbicide Resistant Transgenic Rice Plants Following Microprojectile-Mediated Transformation of Suspensión Culture Cells", Plant Cell Rep. , 11:586-591 (1992), la cual es incorporada aquí para referencia), y el método de Agrobacterium (Hiei y colaboradores, "Eficcient Transformation of Rice (Oriza sativa L.) Mediated oy Agrobacterium and Sequence Analysis to the Boundaries of the T-DNA", The Plant Journal, 6:271- 282 (1994), la cual es incorporada aquí para referencia). La transformación biolística también ha sido utilizada para transformar exitosamente el maíz (para una revisión, véase Mackey y colaboradores, "Transgenic Maize", en Transgenic Plants, Kung y colaboradores, Eds., vol. 2, pp. 21-33 (1993), la cual es incorporada para referencia aquí) y el trigo (véase la Patente U.S. No. 5,405,765 de Vasil y colaboradores, la cual es incorporada aquí para referencia) .

Una vez que un protoplasto o célula vegetal del cereal es transformada de_ acuerdo con la presente invención, la misma es regenerada para formar una planta de cereal transgénica. En general, la regeneración es efectuada cultivando las células o protoplastos transformados sobre un medio que contiene los reguladores del crecimiento y los nutrientes adecuados para permitir el inicio de los meristemas de los brotes. Los antibióticos apropiados son agregados al medio de regeneración para inhibir el crecimiento del Agrobacterium u otros contaminantes y para la selección del desarrollo o revelado de los protoplastos o las células transformadas. A continuación del inicio de los brotes, los brotes se permite que se desarrollen en el cultivo de los tejidos y son seleccionados para verificar la actividad del gen marcador. En los métodos de transformación adecuados, la célula vegetal del cereal que va a ser transformada puede ser in vivo o in vitro, es decir la célula vegetal del cereal puede estar localizada en una planta del cereal. La invención también proporciona una semilla producida por la planta del cereal transgénica. La invención también está dirigida a la semilla, la cual durante la germinación, produce la planta del cereal transgénica.

También están abarcadas por la presente invención las plantas del cereal transgénicas transformadas con fragmentos de los ácidos nucleicos que codifican una enzima para la biosíntesis de la prolina de la presente invención. 5 Los fragmentos adecuados capaces de conferir la tolerancia a la tensión provocada por la escasez del agua o a la tensión provocada por las sales, pueden ser construidos utilizando los sitios de restricción apropiados. Un fragmento se refiere a una porción continua de la molécula que codifica una enzima para la biosíntesis de la prolina que es menor que la molécula completa. Los nucleótidos no esenciales podrían ser colocados en los extremos 5' o 3' de los fragmentos (o las moléculas de longitud total que codifican una enzima para la biosíntesis de la prolina) sin afectar las propiedades funcionales del fragmento o molécula (es decir en el incremento de la tolerancia a la tensión provocada por la escasez del agua o a la tensión provocada por las sales) . Por ejemplo, los nucleótidos que codifican una enzima para la biosíntesis de la prolina pueden ser conjugados con una secuencia de la señal (o señal directora) en el extremo N-terminal (por ejemplo) de la enzima para la biosíntesis de la prolina la cual dirige cotranslacionalmente o postranslacionalmente la transferencia de la enzima para la biosíntesis de la prolina. La secuencia de nucleótidos ^>^.^^^^_^^¡¡^^ :^ ^¡í_^1^i! _!¿M£^sf^ .** ' ?-Y ~ . ~w . . -^s^^^a-^fe^^fe?^^aK^fe*^,;. también puede ser alterada de modo que la enzima codificada sea conjugada con un enlazador y otra secuencia para facilidad de síntesis, purificación, o identificación de la enzima. 5 La presente invención también se refiere a una célula o protoplasto vegetal del cereal transformado con un ácido nucleico que codifica una enzima para la biosíntesis de la prolina que confiere una tolerancia a la tensión provocada por la es, sez del agua o a la tensión provocada por las sales sobre una planta de cereal regenerada a partir de la célula o protoplasto vegetal del cereal. Una vez que la transformación ha ocurrido, la célula o protoplasto vegetal del cereal puede ser regenerada para formar una planta de cereal transgénica. 15 Preferentemente, el ácido nucleico que codifica una enzima para la biosíntesis de la prolina es controlado por un promotor fuerte para efectuar la expresión máxima de una enzima para la biosíntesis de la prolina, o por un promotor inducido por la tensión para efectuar la inducción del promotor en retí uesta a las condiciones de la tensión. En una modalidad, el protoplasto o célula vegetal del cereal transgénico es transformada con el ácido nucleico que codifica el promotor, tal como el promotor del gen de la actina 1 del a - xz, proporcionando un plásmido el cual incluye el ADN que codifica una enzima para la biosíntesis de la prolina y el promotor. _ El protoplasto o la célula vegetal del cereal transgénico o la planta, también pueden ser tansformado con un ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable, tal como el gen bar, para permitir la detección de los agentes de transformación, y con un ácido nucleico que codifica el promotor del virus 35S del mosaico de la coliflor para controlar la expresión del gen bar. Otros marcadores seleccionables incluyen los genes que codifican el EPSPS, nptll, o ALS. Otros promotores incluyen aquellos de los genes que codifican la actina 1, la ubiquitina, y PINII. Estas secuencias de ácido nucleico adicionales también pueden ser provistas por el plásmido que codifica la enzima para la biosíntesis de la prolina y su promotor. En donde sea apropiado, los diversos ácidos nucleicos también podrían ser provistos por la transformación con los plásmidos múltiples. Aunque la secuencia de nucleótidos referida aquí codifica una enzima para la biosíntesis de la prolina, la identidad de los nucleótidos con respecto a las enzimas secuenciadas previamente para la biosíntesis de la prolina no son requeridas. Como debe ser evidente fácilmente para aquellas personas expertas en la técnica, son posibles varias substituciones de nucleótidos las cuales son * **tmt£krOßto?i&il? i- i " -*. -¡¡feutf-> ¿ '=Sr. mutaciones silenciosas (es decir el aminoácido codificado por el codon particular no .cambia) . También es posible substituir un nucleótido el cual altera el aminoácido codificado por un codon particular, en donde el aminoácido 5 substituido es una substitución conservadora (es decir la "homología" del aminoácido es conservada) . También es posible tener adiciones, deleciones, y/o substituciones de nucleótidos y/o aminoácidos menores en la enzima para las secuencias de los nucleótidos y/o los aminoácidos de la biosíntesis de la prolina las cuales tienen una influencia mínima sobre las propiedades, la estructura secundaria, y la naturaleza hidrofílica/hidrofóbica de las enzimas codificadas por la biosíntesis de la prolina. Estas variantes son abarcadas por el ácido nucleico que codifica una enzima para la biosíntesis de la prolina de acuerdo con la invención objeto. La presente invención también está dirigida a una planta de cereal transgénica regenerada a partir de las células o protoplastos vegetales del cereal transgénico, así como a las semillas producidas por las plantas de cereal transgénicas. Otro aspecto de la presente invención es un método para conferir tolerancia a la tensión provocada por la escasez del agua o a la tensión provocada por las sales a una planta de cereal que incluye la transformación de una célula o protoplasto vegetal del cereal con un ácido nucleico que codifica una enzima para la biosíntesis de la prolina. En una modalidad preferida, el método incluye además la regeneración de la célula o protoplasto de la planta de cereal transformada para formar una planta de cereal transgénica. La presente invención también incluye las semillas producidas por la planta de cereal transgénica. La presente invención también se refiere a un método para incrementar la tolerancia de una planta de cereal a las condiciones de la tensión provocada por la escasez del agua o a la tensión provocada por las sales, el método incluye incrementar los niveles de una enzima para la biosíntesis de la prolina en la planta de cereal. En una modalidad preferida, el plásmido es designado pJS102, pJS107, ?JS112 (Véanse los Ejemplos 1 y 2) .

EJEMPLOS Ejemplo 1 - construcción del Plásmido pJS107 para la Transformación de la Planta 1» .- -*-W' Construcción del Plásmido El pJS107 fue construido aislando un fragmento de Salí de 2.4 kb que contiene el ADNc del P5CS de la mothbean (una planta de la India, de la familia de las legumbres) (Vigna aconitifolia L.) del plásmido pUbiP5CS (Hu y colaboradores, "A Bifunctional Enzyme (?1-pyrroline-5-carboxylate synthetase) Catalizes the First Two Steps en Pro Biosynthesis in Plants", Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 89:9354-9358 (1992), la cual es incorporada aquí para referencia) . Este fragmento de ADN fue despuntado con la polimerasa del ADN de Klenow y se subclonó en el sitio Smal del vector de expresión pJS104 (Su y colaboradores, "Dehidration-Stress-Regulated Transgene Expression in Stably Transformed Rice Plants", Plant Physiol., 117:913-922 (1998), la cual es incorporada aquí para referencia) para crear pJS107. En pJS107, la secuencia que codifica P5CS estuvo corriente abajo de un complejo promotor mducible por la tensión (designado como el complejo del promotor inducible por AIPC-ABA) . El AIPC incluye un elemento de respuesta al ABA de 49 pb del gen Hva22 de la cebada (Shen y colaboradores, "Functional Dissection Of An Abscisic Acid (ABA) -Inducible Gene Reveáis Two Independent ABA-Responsive Complexes Each Containing A G-Box And A Novel Cis.Acting Element", Plant Cell, 7:295-307 (1995), la - ** " •*--*- t ^•?¿agaM_&fc,¿ -- i&fc^aii cual es incorporada aquí para referencia) , un promotor del gen de actina del arroz _ mínimo de 180 pb (Su y colaboradores, "Dehidration-Stress-Regulated Transgene Expression in Stably Transformed Rice Plants", Plant Physiol. , 117:913-922 (1998), la cual es incorporada aquí para referencia) , y un intrón de Hva22 (Shen y colaboradores, "Functional Dissection Of An Abscisic Acid (ABA) -Inducible Gene Reveáis Two Independent ABA-Responsive Complexes Each Containing A G-Box And A Novel Cis.Acting Element", Plant Cell, 7:295-307 (1995), la cual es incorporada aquí para referencia) . PJS107 también contiene el cásete bar, el cual se utilizó para la selección de los callos transgénicos y las plantas en la presencia del herbicida, Bialaphos.

Transformación de las Células de Arroz con un ADNc del P5CS de la Mothbean (una planta de la India, Vigna aconitifolia, de la familia de las legumbres) (Zhu et al., "Overexpression Of A P5CS Gene And Analysis Of Tolerance To Water And Salt Stress In Transgenic Rice", Plant Science 139:41-48 (1998), la cual es incorporada aquí para referencia) El procedimiento y el medio utilizado para el establecimiento de las células en suspensión fue de acuerdo con un método descrito previamente (Cao y colaboradores, "Assessment Of Rice Genetic .Transformation Techniques, En Rice Biotechnology, Toenniessen y colaboradores, Eds., CAB International, Oxon, UK, pp. 175-198 (1991); Cao y colaboradores, "Regeneration of Herbicide Resistant Transgenic Rice P^ants Following Michoprojectile-Mediated Transformation Of Suspensión Culture Cells", Plant Cell Rep. , 11:586-191 (2992), las cuales son incorporadas aquí para referencia) . as semillas de arroz descortezadas (Oriza sativa L. var. Nipponbare) fueron utilizadas para la inducción del callo. A continuación del crecimiento en los cultivos en suspensión, el pSJ107 se introdujo en las células del cultivo en suspensión por el método biolístico. Las células fueron cultivadas y seleccionadas en el medio KPR (Cao y colaboradores, "Assessment Of Rice Genetic Transformation T^chniques, en Rice Biotechnology, Toenniessen y colaboradores, Eds., CAB International, Oxon, UK, pp. 175-198 (1991); la cual es incorporada aquí para referencia) que cor ti ene 8 mg por litro de Bialaphos. Los callos resistentes fueron transferidos al medio de regeneración de MS ara la regeneración en las plantas. Las plantas regenereaas del mismo callo resistente fueron consideradas como r Iones de la misma línea. Las plantas regeneradas fueror "ransferidas al suelo y se hicieron crecer en el invernadero (32 °C día/22 °C noche, con un fotoperíodo suplementario de 10 horas) . El plásmido pJS107 (ABRC1/promotor Act-100/intrón Hca22/ADNc de p5CS/Pin2 3' //promotor 35S/bar/Nos 3') se introdujo en las células en suspensión del arroz utilizando el método de transformación mediado biolísticamente.

Regeneración y Análisis de las Plantas Transgénicas Un número de plantas transgénicas (Oriza sativa L.) fueron regeneradas, y se analizaron cuatro líneas con un número de copias transgénicas relativamente bajas. Los resultados son mostrados en la Tabla 1, posterior.

Tabla 1. Análisis de las Plantas de Arroz Transgénicas Transformadas Con un ADNc de P5CS de Mothbean a La actividad de P5CS se evaluó con base en la conversión del [14C] glutamato a [14C] prolina: separación por CCD. b Plantas de ocho semanas de edad (4-10 por línea) fueron sometidas a tensión sin agua durante 6 días, luego agua 1 día. Cuatro ciclos (28 días). 10 Por consiguiente, los datos indicaron que las plantas de arroz transgénicas produjeron un nivel incrementado de la actividad enzimática de P5CS así como el contenido de prolina (medida utilizando un método colorimétrico) en las hojas. " .ifegufe •fe. si.2 » Ejemplo 2 - Transformación de los Callos de Arroz con un ADNc de P5CS de Mothbean y Comparación de una Sintesis de Prolina Inducible contra Constitutiva en el Arroz Transgénico Construcción del Plásmido Se construyeron tres plásmidos. Los componentes de estos plásmido son: pJS102 (con un promotor constitutivo) : promotor de actina 1 del arroz/ADNc de p5CS/Pin2 3' //promotor 35S/bar/Nos 3' ; pJS112 (con un promotor inducible de la tensión) : ABRC4 /promotor Act-100/intrón Hva22/ADNc de p5CS/Pin2 3' //promotor 35S/bar/Nos 3'); y pJSHO (con un promotor constitutivo y todos los componentes como en pJS12, excepto que un gen reportero uidA se utilizó en lugar del ADNc de P5CS en pJS112) .

Transformación de los Callos de Arroz con un ADNc del P5CS de Mothbean La preparación de los callos de arroz, el procedimiento de transformación, y la regeneración de las plantas fueron similares a aquellas descritas en el Ejemplo 1.

Análisis de las Plantas Transgénicas: Tratamientos para el Crecimiento y Contra la Tensión de las Plantas en el Suelo Se utilizó la tierra del campo refinada y esterilizada para hacer crecer las plantas de arroz en el invernadero. Las semillas de R2 se germinaron en el medio ^ MS durante 7 días, y las plantas nacidas de las semillas se trasplantaron al suelo en macetas pequeñas (20.32X20.32 cm (8X8 pulgadas) ) con orificios en el fondo (4 a 6 plantas por maceta) . Las macetas se mantuvieron en bandejas de fondo plano que contiene agua. Las plantas nacidas de las semillas se hicieron crecer durante unas 2 semanas adicionales, y dentro del intervalo de la tercera semana, se probaron para verificar la resistencia a Basta. Dos plantas resistentes a Basta con la misma altura de la planta por maceta se seleccionaron para los tratamientos contra la tensión. Los tratamientos contra la tensión se llevaron a cabo como sigue. En la primera ronda del tratamiento contra la tensión, el agua fue abstenida o retirada de las bandejas durante 7 días, y luego, las plantas sometidas a tensión fueron reabastecidas con agua durante 2 días. Se impusieron una a tres rondas adicionales de tratamientos contra la tensión a las plantas. Para el ensayo de tensión provocada por las sales, las plantas de tres semanas de edad fueron transferidas a bandejas que contienen 300 mM de solución de NaCl durante 20 días. La solución de NaCl se cambió cada 3 días para mantener una concentración constante de NaCl en el suelo. Las macetas que contienen las plantas sometidas a la tensión fueron transfectadas nuevamente a las bandejas que contienen agua del grifo para permitir que las plantas sometidas a tensión se recuperaran y crecieran sin tensión durante 10 días. Después de 10 días de recuperación, se impuso una segunda ronda de tensión provocada por la sal utilizando la misma concentración de solución de NaCl durante 10 días. El fertilizante líquido (Peters Excel, N:P:K = 15:5:15, Scotts Professional Co.) mezclado con agua del grifo o la solución de NaCl, se aplicó a las plantas por semana.

Funcionamiento durante el Crecimiento de las Plantas Transgénicas Bajo Condiciones de Tensión Provocadas por la Escasez del Agua Puesto que no existió diferencia significativa en el funcionamiento del crecimiento entre las plantas de NT y las plantas uidA en las plantas que nacen de las semillas, probadas, las plantas uidA (L3) fueron elegidas como las plantas de control más adecuado para el siguiente experimento a causa de que las mismas también contuvieron bar y el mismo cásete promotor que las plantas transgénicas de p5cs. 5 Antes de la prueba de tensión provocada por la escasez del agua, inicial, la totalidad de las plantas de 3 semanas incluyendo las plantas de control L3, fueron probadas para ia resistencia a Basta. Las plantas resistentes a Bast.. sanas, con una altura de la planta similar fueron seleccionadas para analizar el funcionamiento del crecimiento. Bajo condiciones sin tensión en el suelo, no se observó ninguna diferencia significativa ent^e las plantas transgénicas que contienen p5cs y las plantas de control de SIPC-uidA en su funcionamiento del crecimiento durante el período completo del experimento. Durante la abstención o retiro del agua de las bandejas, el ccr.tenido absoluto del agua en el suelo se redujo desde 35% hasta 12% después de 7 días de la tensión provocada por la falta de agua. A continuación de 2 ciclos de la prueba de ten-ión por escasez del agua, las hojas de las plantas de control de SIPC-uidA empezaron a ponerse amarillas, y las plantas de Actl-p5cs mostraron una velocidad de creciii ento baja, mientras que las plantas de SIPC-p5cs con ?r ?romotor inducible por la tensión mostraron un ere ;?miento sano. Después de 4 ciclos de »-, .- « >. . a» . - . .- a J.^- & 4_M?**<m?u*f. .. ,- _.. „„ -, ^^ : .£A&ferfz&te£."s Jtf?B®B£B&x KjßeBí¡ßgBBJ?iSSi*mM~¡?»&?*^Jt&nJ tensión provocada por la escasez de agua, se encontraron más síntomas severos, tales ;omo la clorosis de las agua (tanto en las plantas de control como de Actl-p5cs) o la muerte de las puntas de las hojas (solamente en las plantas 5 de control) . Las plantas de SIPC-p5cs todavía mostraron una velocidad elevada de crecimiento y una clorosis de las hojas menos severa. Los datos en la Tabla 2 (mitad de arriba) muestran el peso de los brotes frescos promedio y el peso de las raíces frescas de las plantas después de 4 ciclos de 7 días de la prueba de tensión por escasez de agua. Los resultados indicaron que bajo condiciones de tensión por escasez de agua, las plantas de SIPC-p5cs (L5 y L7), las cuales contuvieron un promotor inducible por la tensión, para activar o impulsar la expresión de p5cs, crecieron mucho más rápido cuando se compararon con las plantas de Actl-p5cs (Ll), las cuales contuvieron un promotor constitutivo para activar o impulsar la expresión de p5cs. La diferencia entre la utilización de un promotor inducible por la tensión y un promotor constitutivo fue altamente significativa (P<0.01:t = 5.88 a 7.64). j A at i- » .fe Funcionamiento del Crecimiento de las Plantas de Arroz Transgénicas Bajo Condiciones, de Tensión Provocadas por la Sal Para crear una salinidad del suelo elevada, se- agregó una solución 300 mM de NaCl a las bandejas en las cuales se colocaron las macetas. En una etapa inicial (10 d después de la tensión inicial), las plantas de control (L3) empezaron a marchitarse y las hojas empezaron a ponerse 0 amarillas, mientras que las plantas transgénicas de p5cs todavía mostraron un crecimiento sano. Después de 20 días de tensión por NaCl, las plantas de Actl-p5cs (Ll) también empezaron a marchitarse. A continuación de 10 días de provisión de agua para permitir la recuperación y una 5 tensión adicional de 10 días de 300 mM NaCl, ocurrió un daño más severo tanto en las plantas de control (L3) como en las plantas de Actl-p5cs. Por el contrario, las hojas de las plantas de SIPC-p5cs todavía permanecieron verdes con una velocidad de crecimiento elevada. El peso de los brotes frescos promedio y el peso de la raíz fresca son mostrados en la Tabla II (mitad inferior) . Estos valores indicaron que las plantas de SIPC-p5cs (L5 y L7) crecieron significativamente más (P<0.01:t = 6.3 hasta 7.79) bajo condiciones de tensión provocadas por la sal que las plantas de actl-p5cs (Ll) y las plantas de control (L3), a pesar del descubrimiento de que el nivel de prolina fue inferior en las plantas de SIJPC-p5cs. De las dos líneas de SIPC-p5cs, L5 fue la mejor. En conclusión, la expresión del transgen inducible por la tensión en las plantas de p5cs mostró ventajas significativas sobre la expresión constitutiva del transgen p5cs en el crecimiento de las plantas de arroz bajo condiciones de tensión provocadas por las sales y la escasez de agua.

Tabla 2. Funcionamiento del crecimiento de las plantas transgénicas en el suelo bajo condiciones de tensión provocadas por las sales y por la escasez del agua.

Peso Brote Fresco Peso Raíz Fresca Valor t" en Exp Tensión Agua Linea del Arroz Promotor (mg / planta) (mg/planta) Comparación Peso Brotes Peso Raiz JS110(13) Inducible 30O±20 (10O) 90+20 (100) Ll L3 954 3 21 JS102(L1) Constitutivo 550+60 (183) 130+20 (144) L5 3 14 22 805 JSU2(L5) Inducible 940+100 (310) 220+30 (224) L7 L3 4 97 622 JS1 12(L7) Inducible 730+60 (243) 170+20 (189) L1 5 7 64 5 88 Peso Brote Fresco Peso Raíz Fresca Valor t " en Exp Tensión NaCl Linea Transgenica Promotor (mg / planta) (mg/planta) Comparación Peso Brotes Peso Raíz JS1 10(13) Inducible 320+40 (100) 70+10 (100) Ll L3 5 68 4 18 JS102(L1) Constitutivo 580±100 (181) 1 10±2O (157) Ll L5 603 7 79 JS1 12(L5) Inducible 1030+140 (322) 240±30 (343) L5 L3 11 72 11 92 JS112(L7) Inducible 870+150 (272) 180+30 (257) L7 L3 7 83 7 67 * Cuando se compara con los valores de t de la tabla de distribución de Student, y to.o?<n=6) = 3.17. Todos los valores más elevados que 3.17 son significativos .

Los pesos de los brotes frescos y de las raíces frescas son en mg/planta. Promedio + SE representa los promedios de 6 plantas (Peso) . Los valores entre paréntesis son los porcentajes de las plantas transgénicas de p5cs comparado con las plantas de control (L3), representado por 100. La dispersión de los datos dentro de cada conjunto de 6 plantas fue más bien pequeño. Por ejemplo, los valores reales para el peso de los brotes frescos de seis plantas JS110(L3) en el experimento de tensión por escasez de agua (parte superior de la tabla) fueron: 280, 282, 288, 315, 320 y 325; los valores reales para el peso de los brotes frescos de seis plantas JS112(L5) fueron: 840, 845, 860, 1025, 1045 y 1050. Aunque la invención ha sido descrita con detalle para propósitos de ilustración, se entiende que tal detalle es solamente para este propósito, y se pueden hacer variaciones en la misma por aquellos expertos en la técnica sin apartarse del espíritu y alcance de la invención la cual está definida por las siguientes reivindicaciones.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la_ solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes

Claims (32)

REIVINDICACIONES

1. Una planta de cereal transgénico, caracterizada porque es transformada con un ácido nucleico que codifica una enzima para la biosíntesis de la prolina, que confiere tolerancia a la tensión provocada por la escasez del agua o a la tensión provocada por las sales, a la planta.

2. Una planta de cereal transgénico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la planta de cereal es una planta de arroz.

3. Una planta de cereal transgénico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el ácido nucleico que codifica una enzima para la biosíntesis de la prolina es el gen de P5CS de mothbean (una planta de la India, Vigna aconitifolia) , de la familia de las legumbres) c in gen de P5CS de mothbean mutante, el cual es insensible i la inhibición por retroalimentación de la prolina.

4. Un - planta de cereal transgénico de conformidad con . • reivindicación 3, caracterizada porque el gen de P5CS de mothbean mutante es P5CS-129A.

5. Una planta de cereal transgénico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la planta de cereal transgénico incluye un ácido nucleico que codifica un promotor, en donde la expresión del ácido nucleico que codifica la enzima para la biosíntesis de la prolina es controlada por el promotor.

6. Una planta de cereal transgénico de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el promotor es el promotor del gen de actina 1 del arroz.

7. Una planta de cereal transgénico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la planta de cereal transgénico incluye un ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable.

8. Una semilla, caracterizada porque es producida por la planta de cereal transgénico de conformidad con la reivindicación 1.

9. Una semilla, caracterizada porque durante la germinación, produce una planta de cereal transgénico de conformidad con la reivindicación 1.

10. Una célula o protoplasto vegetal del cereal, caracterizada porque es transformada con un ácido nucleico que codifica una enzima para la biosíntesis de la prolina que confiere tolerancia a la tensión provocada por la escasez del agua o a la tensión provocada por las sales-sobre una planta de cereal regenerada a partir del protoplasto o célula vegetal del cereal.

11. Una célula o protoplasto vegetal del cereal de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque la célula o protoplasto vegetal del cereal es derivado de una planta de arroz.

12. Una célula o protoplasto vegetal del cereal de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque el ácido nucleico que codifica una enzima para la biosíntesis de la prolina es el gen P5CS de mothbean o un gen de P5CS de mothbean mutante el cual es insensible a la inhibición de la retroalimentación por la prolina.

13. Una célula o protoplasto vegetal del cereal de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque el gen de P5CS de mothbean mutante es P5CS-129A.

14. Una célula o protoplasto vegetal del cereal de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque el protoplasto o célula vegetal del cereal incluye un ácido nucleico que codifica un promotor, en donde la expresión de dicho ácido nucleico que codifica la enzima para la biosíntesis de la prolina está controlada por el promotor.

15. Una célula o protoplasto vegetal del cereal de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el promotor es el promotor del gen de la actina 1 del arroz.

16. Un protoplasto o célula vegetal del cereal de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el protoplasto o la célula vegetal del cereal incluye un ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable.

17. Una planta de cereal transgénico, caracterizada porque es regenerada a partir de la célula o protoplasto vegetal del cereal de conformidad con la reivindicación 10.

18. Una semilla, caracterizada porque se produce por la planta de cereal transgénico de conformidad con la reivindicación 17. 5

19. Un método para conferir tolerancia a la tensión provocada por la escasez del agua o a la tensión provocada por las sales, a una planta de cereal, caracterizado porque comprende: transformar un protoplasto o célula vegetal del 10 cereal con un ácido nucleico que codifica una enzima para la biosíntesis de la prolina bajo condiciones efectivas para impartir tolerancia a la tensión provocada por la escasez del agua o a la tensión provocada por las sales, a las plantas del cereal. 15

20. Un método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el protoplasto o la célula vegetal del cereal, es derivado de una planta de arroz . 20

21. Un método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el ácido nucleico que codifica una enzima para la biosíntesis de la prolina es el gen de P5CS de mothbean o un gen de P5CS de mothbean mutante el cual es insensible a la inhibición de la retroalimentación por la prolina.

22. Un método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el gen de P5CS de mothbean mutante es el P5CS-129A.

23. Un método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la transformación comprende : impulsar las partículas en la célula vegetal del cereal bajo condiciones efectivas para que las partículas penetren al interior de la célula; e introducir un plásmido que comprende el ácido nucleico que codifica una enzima para la biosíntesis de la prolina en el interior de la célula.

24. Un método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el plásmido está asociado con las partículas, por lo cual el plásmido es llevado hacia el interior de la célula o el protoplasto.

25. Un método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la transformación comprende : poner en contacto el tejido de la planta monocotiledónea con un inoculo de una bacteria del género Agrobacterium, en donde la bacteria es transformada con un plásmido que comprende el gen que incrementa la tolerancia a la tensión provocada por la escasez del agua o a la tensión provocada por las sales.

26. Un método de conformidad con la reivindicación 19, . racterizado porque además comprende: regenerar la célula o protoplasto vegetal del cereal transformado para formar una planta de cereal transgénica.

27. Una planta de cereal transgénica, caracterizada porque es producida por el método de conformidad con la reivindicación 26.

28. Una semilla, caracterizada porque es producida por le planta de cereal transgénica de conformidad con la -eivmdicación 27.

29. Ur método para incrementar la tolerancia a las condiciones de tensión provocadas por el escasez del agua o a la tensi provocada por las sales, el método está caracterizado porgue comprende: incrementar los niveles de una enzima para la biosíntesis de la prolina en la planta de cereal.

30. Un método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la planta de cereal es una planta de arroz.

31. Un método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el ácido nucleico que codifica una enzima para la biosíntesis de la prolina es el gen P5CS de mothbean o un gen de P5CS de mothbean mutante el cual es insensible a la inhibición de la retroalimentación por la prolina.

32. Un método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el gen de P5CS de mothbean mutante es el P5CS-129A. ¿T-, •.'-^^^ágS^^^tei^^-