CN1753989A - Tps植物基因构建体和转化体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用核酸转化的转基因单子叶植物、植物细胞或原生质体，所述核酸编码在诱导型启动子控制下的用于海藻糖生物合成的酶，这可增强对低温、盐和水分胁迫的耐受性。

Description

TPS植物基因构建体和转化体

本项申请要求2002年11月6日提交的美国临时专利申请系列No.60/424,410，和2002年12月4日提交的美国临时专利申请系列No.60/430,861的利益。

                      发明领域

本发明涉及用核酸转化的单子叶植物，所述核酸编码在海藻糖生物合成途径中的酶以增强对低温胁迫、水分胁迫和盐胁迫的耐受性。

                      发明背景

世界人口的爆炸性增长以及持续的耕地退化、淡水缺乏和增加的环境压力对全球的农业生产和食物安全产生严重的威胁。尽管通过传统育种方式集中努力提高主要农作物对非生物胁迫例如干旱、过量盐度和低温的抗性，取得的成功仍然有限(Boyer，J.S，“Plant Productivityand Environment，”Science，218：443-448(1982))。缺少令人满意的进展归因于对非生物胁迫的耐受性是个复杂性状的事实，所述性状受基因网络协同和差异表达的影响。幸运的是，现在应用转基因手段在具有比预期性状少得多的目标性状的农业上重要农作物中提高对非生物胁迫的耐受性成为可能(Zhang等人，“Engineering Salt-TolerantBrassica Plants：Characterization of Yield and Seed Oil Quality inTransgenic Plants with Increased Vacuolar Sodium Accumulation，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA，98：12832-12836(2001))。

非生物胁迫能通过改变生物的代谢、生长和发育直接或间接地影响它的生理状况。生物对干旱、盐度和低温胁迫的共同反应是积累糖和其他相容性溶质(Hare等人，“Dissecting the Roles of OsmolyteAccumulation During Stress，”Plant Cell Environ.，21：535-553(1998))。这些化合物充当渗透保护剂(osmoprotectant)，并且在某些情况下，在胁迫条件下稳定生物分子(Hare等人，“Dissecting the Rolesof Osmolyte Accumulation During Stress，”Plant Cell Environ.，21：535-553(1998))；Yancey等人，“Living with Water Stress：Evolution ofOsmolyte Systems，”Science，217：1214-1222(1982))。一种这样的化合物是海藻糖，即一种非还原性葡萄糖二糖，其在大量的生物包括细菌、酵母和无脊椎动物中作为非生物胁迫保护剂起着重要的生理功能(Crowe等人，”Anhydrobiosis，”Annu.Rev.Physiol.，54：579-599(1992))。已显示海藻糖可以在干旱期间有效地稳定脱水的酶、蛋白和脂膜以及保护生物结构免受破坏。在植物界中，除了熟知为例外的高度干旱耐受性“复苏植物(resurrection plant)”，绝大多数物种似乎不积累可检测量的海藻糖(Wingler，“The Function of TrehaloseBiosynthesis in Plants，”Phytochemistry，60：437-440(2002))。近来在鳞叶卷柏(Selaginella lepidophylla)，拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)和几种农作物中发现用于海藻糖生物合成的同源基因表明合成海藻糖的能力可能广泛分布在植物界中(Goddijn等人，“TrehaloseMetabolism in Plants，”Trends Plant Sci.，4：315-319(1999))。假定的海藻糖-6-磷酸合酶(TPS)植物基因可以与酵母的Δtps1突变体酵母株系互补，暗示着所述植物和酵母基因产物具有功能相似性(Zentella等人，“A Selaginella lepidophylla Trehalose-6-Phosphate SynthaseComplements Growth and Stress-Tolerance Defects in a Yeast tpslMutant，”Plant Physiol.，119：1473-1482(1999))。

在细菌和酵母中，海藻糖通过二步过程合成：首先UDP-葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸通过TPS催化的反应形成海藻糖-6-磷酸。然后海藻糖-6-磷酸通过海藻糖-6-磷酸磷酸酶(TPP)转化成海藻糖(Goddijn等人，“Trehalose Metabolism in Plants，”Trends Plant Sci.，4：315-319(1999))。近来在一些双子叶模式植物中，用于提高植物中海藻糖积累的代谢工程受到高度关注(Holmstrom等人，“Drought Tolerance inTobacco”，Nature，379：683-684(1996)；Goddijn等人，“Inhibition ofTrehalase Activity Enhances Trehalose Accumulation in TransgenicPlants，”Plant Physiol.，113：181-190(1997)；Romero等人，“Expressionof the Yeast Trehalose-6-Phosphate Synthase Gene in TransgenicTobacco Plants：Pleiotropic Phenotypes Include Drought Tolerance，”Planta，201：293-297(1997)；Pilon-Smits等人，“Trehalose-ProducingTransgenic Tobacco Plants Show Improved Growth PerformanceUnder Drought Stress，”J.Plant Physiol.，152：525-532(1998))。然而，在这些以前的研究中，在烟草或马铃薯植物中组成型地过量表达来自酵母或大肠肝菌(Escherichia coli)的TPS和/或TPP基因会造成不合需要的多效性影响，包括在正常生长条件下阻碍生长和改变代谢(Goddijn等人，“Inhibition of Trehalase Activity EnhancesTrehalose Accumulation in Transgenic Plants，”Plant Physiol.，113：181-190(1997)；Romero等人，“Expression of the YeastTrehalose-6-Phosphate Synthase Gene in Transgenic Tobacco Plants：Pleiotropic Phenotypes Include Drought Tolerance，”Planta，201：293-297(1997)；Pilon-Smits等人，“Trehalose-Producing TransgenicTobacco Plants Show Improved Growth Performance Under DroughtStress，”J.Plant Physiol.，152：525-532(1998))。本发明涉及产生具有提高了的对低温胁迫、水分胁迫和盐胁迫耐受性的转基因单子叶植物。

                      发明概述

本发明涉及用核酸转化的转基因单子叶植物，所述核酸编码在诱导型启动子控制之下的用于海藻糖生物合成的酶，这可赋予单子叶植物对低温、盐和水分胁迫的耐受性。

本发明进一步涉及用核酸转化的单子叶植物细胞或原生质体，所述核酸编码在诱导型启动子的控制之下的用于海藻糖生物合成的酶，这可赋予由单子叶植物细胞或原生质体再生而来的单子叶植物对低温、盐和水分胁迫的耐受性。

本发明也涉及通过在有效地赋予从所述单子叶植物细胞或原生质体再生而来的单子叶植物对低温、盐和水分胁迫的耐受性的条件下，用核酸转化单子叶植物细胞或原生质以赋予单子叶植物对低温、盐和水分胁迫耐受性的方法，所述核酸编码在诱导型启动子控制之下的用于海藻糖生物合成的酶。

本发明的另一方面进一步涉及通过在单子叶植物中增加用于海藻糖生物合成的酶的水平来增加单子叶植物对低温、盐或水分胁迫条件的耐受性的方法。

本发明也涉及用赋予所述单子叶植物对低温、盐和水分胁迫耐受性的质粒转化的转基因单子叶植物，其中所述质粒包含编码海藻糖-6-磷酸合酶的第一核酸，第一诱导型启动子，所述启动子位于所述第一核酸的5’并且控制所述第一核酸的表达，和位于所述第一核酸的3’的第一终止序列。

考虑到作为主要作物的水稻的重要性，开发新的具有增强的非生物胁迫耐受性的栽培种无疑对全球食物生产有巨大的影响。决定通过用海藻糖-6-磷酸合酶/磷酸酶(TPSP)融合基因转化水稻以提高对非生物胁迫的耐受性，所述融合基因包括大肠杆菌(E.coli)的otsA和otsB基因的编码区(分别编码TPS和TPP)(Seo等人，“Characterization of a Bifunctional Enzyme Fusion of Trehalose-6-Phosphate Synthetase and Trehalose-6-Phosphate Phosphatase ofEscherichia coli，”Appl.Environ.Microbiol.，66：2484-2490(2000))。这个方法具有只需单次转化事件和对海藻糖的形成产生更高的净催化效率的双重优点。(Seo等人，“Characterization of a BifunctionalEnzyme Fusion of Trehalose-6-Phosphate Synthetase and Trehalose-6-Phosphate Phosphatase of Escherichia coli，”Appl.Environ.Microbiol.，66：2484-2490(2000))。因为籼型(indica)水稻品种代表了全球生长的80％的水稻，所以尽管转化和再生要比在粳型(japonica)水稻品种中更困难，但还是选择具有经济价值的籼型水稻Pusa Basmati-1(PB-1)进行转化。因此，凡是用籼型水稻实现的东西同样可以用粳型水稻品种很好地完成。

已显示通过胁迫诱导型或组织特异性表达双功能TPSP融合酶可以实现在水稻中过量产生基因工程海藻糖而不会对植物的生长或谷物产量有任何有害的影响。在非生物胁迫期间，与未转化的植物相比，转基因植物积累了数量增加的海藻糖并且显示高水平的对盐、干旱和低温胁迫的耐受性。这些结果显示了转基因手段在开发具有增强的对非生物胁迫耐受性和提高的水稻生产力的新水稻栽培种上的潜在用途。

本发明使得能够产生具有增强的对低温胁迫、盐胁迫和水分胁迫(干旱)耐受性的单子叶植物。特别地，对低温、盐和水分胁迫的增强的耐受性可通过在诱导型启动子控制下激活海藻糖生物合成来获得。

                      附图简述

图1.A-E显示表达载体和DNA-印迹杂交分析的示意性说明。构建2个二元质粒并将其转化到籼型水稻中，所述二元质粒各含有包括大肠杆菌的otsA和otsB基因(分别编码TPS和TPP)编码区的海藻糖生物合成融合基因(TPSP)。图1A显示pSB109-TPSP质粒。图1B显示pSB-RTSP质粒。阴影盒表示启动子元件(ABA，ABA-诱导型；rbcS，水稻rbcS；35S，花椰菜花叶病毒35S启动子)；RB和LB分别代表T-DNA的右边界和左边界。图1C显示包含几个限制性内切核苷酸(endonucleotide)位点的pSB109-TPSP和pSB-RTSP的更详细的示意性说明。图1显示来自非转化对照(NTC)植物和分别用质粒pSB109-TPSP和pSB-RTSP转化的9个A系(图1D)和5个R系(图1E)的代表性转基因植物的DNA-印迹杂交分析。用HindIII(在质粒pSB109-TPSP上为单一位点，而在pSB-RTSP上存在2个位点)消化所述水稻的基因组DNA并且用2.2kb的TPSP融合基因作为探针进行DNA印迹杂交分析。显示分子大小(Kb)。

图2A-F显示水稻植株对盐的耐受性和盐胁迫引起的矿质营养的变化。图2A显示在连续4周100mM氯化钠的胁迫后植株的根部；在NTC中没有对植株施加胁迫。图2B显示生长在盐胁迫(NTS，R80，和A05)或无胁迫(NTC)条件下的植株茎部(黑条)和根部(白条)的干重。图2C显示在植物的盐胁迫后立即获取的叶片提取物(20微克的蛋白)的蛋白印迹。(图2D-F)在盐胁迫(NTS，R80和A05)或无胁迫(NTC)条件下植物茎部(黑条)和根部(白条)的矿质营养含量。图2D显示Na⁺。图2E显示K⁺。图2F显示Na⁺/K⁺的比例。所述离子浓度用毫克/克干重表示。值取平均值±SD(n＝5)。

图3A-D显示在干旱胁迫期间植株的外形和叶绿素荧光参数。将生长在土壤中的5周大小的非转化的和T4代转基因(R80和A05)的苗进行每个循环为100小时的2个循环的干旱胁迫处理，然后浇灌3周。图3A显示生长在良好浇灌条件下的植株(NTC，非转基因植株)。图3B显示两个循环的干旱胁迫处理后的同龄植株(NTS，干旱胁迫后的非转基因植株)。图3C和D显示在第一轮100小时的连续干旱胁迫期间幼小的、完全展开的叶片的叶绿素荧光测量值。图3C显示Φ_PSII，其是在环境生长条件下PSII光化学效率的衡量标准。图3D显示Fv/Fm的降低，所述Fv/Fm是对PSII的光氧化破坏的衡量标准。▲，非转化植株；■，R80；●，A05。虚线表示所有系的非胁迫对照植物的值范围。数据表示来自独立植株的平均值±SD(n＝5)。

图4显示在胁迫和非胁迫条件下的转基因(R80和A05)和非转基因植株茎部的海藻糖含量。在非胁迫(白条)、盐胁迫(100mM NaCl处理4周，带阴影线的条)或干旱胁迫(100小时，黑条)条件下的海藻糖积累。

图5显示生长在对照条件下的非转化植物和2个独立的、第5代转基因植物的光系统II的电子传递率。通过测量在360ppm的CO₂、25℃和50％的相对湿度下经过10周生长的NTC(▲)、R80(■)和A05(●)的最新完全展开叶子的叶绿素的荧光而计算在不断增强的照射下的电子传递率。数值为平均值±SD(n＝9)。数据根据非转基因对照植物的平均光饱和率进行标准化。

图6A和B显示对转基因水稻系中的海藻糖积累进行具有脉冲电流检测的高效阴离子交换层析分析(HPAEC-PAD)。图6A中，层析谱显示来自转基因系A05的叶组织提取物的PAD响应图。图6B中，层析谱显示用海藻糖酶消化后的相同样品的PAD响应图。箭标表示海藻糖的峰值。

图7A和B分别显示在低温胁迫中光系统II(Φ_PSII)的活性变化和可变荧光产量与最大荧光产量的比率(Fv/Fm)的变化。将5周大小的非转化系和T4代转基因系(R22、R38、R80、A05、A07和A27)的苗在10小时光照/14小时黑暗的光周期(光子通量密度为280μmol光子m^-2s^-1)和相对湿度为50-60％条件下于10℃暴露72小时，然后使其在25±3℃的正常生长条件下恢复24小时。监控低温胁迫期间和之后不同时间间隔的Φ_PSII的活性和Fv/Fm。数据表示来自独立植株的平均值±SD(n＝5)。图7A显示Fv/Fm。图7B显示Φ_PSII。

                      发明详述

本发明涉及用核酸转化的转基因单子叶植物，所述核酸编码在诱导型启动子控制之下的用于海藻糖生物合成的酶，这可赋予单子叶植物对低温、盐和水分胁迫的耐受性。

本发明提供了产生单子叶植物细胞或原生质体的方法，所述单子叶植物细胞或原生质体通过用编码在诱导型启动子控制下的用于海藻糖生物合成的酶的核酸转化单子叶植物细胞或原生质体而应用于对低温胁迫、盐胁迫或水分胁迫具有耐受性的单子叶植物的再生。一旦发生转化，所述单子叶植物细胞或原生质体可以再生形成转基因单子叶植物。

本发明也涉及通过在有效地赋予由单子叶植物细胞或原生质体产生的单子叶植物对低温、盐和水分胁迫耐受性的条件下，用核酸转化单子叶植物细胞或原生质体而赋予单子叶植物对低温、盐和水分胁迫耐受性的方法，所述核酸编码在诱导型启动子的控制下的用于海藻糖生物合成的酶。这个方法包括用包含诱导型启动子和编码用于海藻糖生物合成的酶的核酸的表达盒转化单子叶植物，这可赋予单子叶植物对低温、盐和水分胁迫的耐受性，其中所述诱导型启动子和所述核酸可操作地连接在一起以允许所述核酸表达。在优选的实施方案中，所述诱导型启动子由至少一个ABRC单位和最小启动子组成。在另一个优选的实施方案中，至少一个诱导型元件是光诱导型的具有叶绿体靶向转运肽的rbcS启动子片段。

本发明的另一方面进一步涉及通过在单子叶植物中增加用于海藻糖生物合成的酶的水平来增加单子叶植物对低温、盐或水分胁迫条件的耐受性的方法。

本发明也涉及用赋予单子植物对低温、盐或水分胁迫耐受性的质粒转化的转基因单子叶植物，其中所述质粒包含编码海藻糖-6-磷酸合酶的第一核酸，第一诱导型启动子，所述启动子位于第一核酸的5’并且控制所述第一核酸的表达，和位于所述第一核酸的3’的第一终止序列。

能根据本发明进行转化的单子叶植物是禾本科(Gramineae)(也称为Poaceae)的成员并且包括：水稻(稻属(Oryza))、小麦、玉米、大麦、燕麦、黑麦、粟和高梁。优选地，所述谷物是水稻、小麦或玉米，并且最优选地所述谷物是水稻。谷物的许多物种能被转化，并且在各个物种中有大量能被转化的亚种和变种。例如，在水稻物种内有籼型水稻亚种(Oryza sativa ssp.Indica)，所述籼型水稻包括变种IR36、IR64、IR72、Pokkali、Nona Bokra、KDML105、Suponburi 60、Suponburi 90、Basmati 385和Pusa Basmati 1。另一个水稻亚种是粳型水稻，其包括Nipponbare、Kenfeng和Tainung 67。合适的玉米变种的例子包括A188、B73、VA22、L6、L9、K1、509、5922、482、HN P和IGES。合适的小麦变种的例子包括Pavon、Bob White、Hi-Line、Anza、Chris、Coker 983、FLA301、FLA302、Fremont和Hunter。

确定所述目的植物后，适于转化的植物细胞包括成熟胚、未成熟胚、愈伤组织、悬浮细胞和原生质体。特别优选地使用成熟胚和未成熟胚。

在优选的实施方案中，至少一个ABRC单位来自大麦HVA22基因或大麦HVA1基因。至少一个来自大麦HVA22基因的ABRC单位的序列，即49-bp的ABA-效应复合物，列于Shen等人，“FunctionalDissection of an Abscisic Acid(ABA)-Inducible Gene Reveals TwoIndependent ABA-Responsive Complexes Each Containing a G-Boxand Novel Acting Element，”The Plant Cell，7：295-307(1995)之中，其全文在此引用作为参考。来自大麦HVA1基因的ABRC单位的序列列于Shen等人“Modular Nature of Abscisic Acid(ABA)ResponseComplexes：Composite Promoter Units that are Necessary andSufficient for Induction of Gene Expression in Barley，”The Plant Cell，8：1107-1119(1996)之中。在最优选的实施方案中，最多4个所述ABRC单位可操作地一起连接到所述表达盒中。

在单子叶植物中增加对低温胁迫、盐胁迫和水分胁迫耐受性的合适核酸是调节胁迫应答基因表达的基因和编码参与海藻糖生物合成的酶的基因。编码用于海藻糖生物合成的酶可以从大量生物中分离，所述生物包括细菌、酵母和无脊椎动物(通常参见，Crowe等人，“Anhydrobiosis，”Annu.Rev.Physiol.，54：579-599(1992)，其全文在此引用作为参考)。在一个优选的实施方案中，编码参与海藻糖生物合成的酶的核酸为编码海藻糖-6-磷酸合酶的DNA。优选地，来自酵母的TPS1基因编码海藻糖-6-磷酸合酶(关于不同的酵母TPS1基因的比较，参见Kwon等人，“Cloning and Characterization of GenesEncoding Trehalose-6-phosphate Synthase(TPS1)and Trehalose-6-phosphate Phosphatase(TPS2)from Zygosaccharomyces rouxii，”FEMS Yeast Res.，3：433-440(2003)，其全文在此引用作为参考)。更优选地，来自大肠杆菌的otsA基因编码码海藻糖-6-磷酸合酶。在另一个优选的实施方案中，编码参与海藻糖生物合成的酶的核酸是编码海藻糖-6-磷酸磷酸酶的DNA。优选地，来自酵母的TPS2基因编码海藻糖-6-磷酸磷酸酶(关于不同的酵母TPS2基因的比较，参见Kwon等人，“Cloning and Characterization of Genes Encoding Trehalose-6-phosphate Synthase(TPS1)and Trehalose-6-phosphate Phosphatase(TPS2)from Zygosaccharomyces rouxii，”FEMS Yeast Res.，3：433-440(2003)，其全文在此引用作为参考)。更优选地，来自大肠杆菌的otsB基团编码海藻糖-6-磷酸磷酸酶。在更优选的实施方案中，海藻糖-6-磷酸合酶(otsA)和海藻糖-6-磷酸磷酸酶(otsB)在单子叶植物中共表达。在最优选的实施方案中，海藻糖-6-磷酸合酶(otsA)和海藻糖-6-磷酸磷酸酶(otsB)在单子叶植物中作为融合蛋白表达。otsA和otsB基因的序列可在Kaasen等人的“Analysis of the otsBA Operon forOsmoregulatory Trehalose Synthesis in Escherichia coli and Homologyof the OtsA and OtsB Proteins to the Yeast Trehalose-6-phosphatesynthase/phosphatase complex，”Gene，145：9-15(1994)中找到，其全文在此引用作为参考。

合适的最小启动子包括水稻的Act1、水稻的rbcS、大麦或水稻的缩短的α-淀粉酶启动子、缩短的玉米泛素启动子或缩短的CaMV 35S启动子。

在优选的实施方案中，所述最小启动子是诱导型启动子。

在更优选的实施方案中，所述最小启动子是光诱导型的水稻rbcS启动子。

最优选地，所述最小启动子是胁迫诱导型的水稻最小Act1启动子，其序列可以在Su等人的“Dehydration Stress-regulate TransgeneExpression in Stably Transformed Rice Plants，”Plant Physiol.，117：913-922(1998)中找到，其全文在此引用作为参考。

在优选的实施方案中，包含诱导型启动子和编码用于海藻糖生物合成的酶的表达盒增强了单子叶植物对低温胁迫、盐胁迫和水分胁迫的耐受性。

这些单子叶植物细胞用核酸进行转化，所述核酸可以是RNA或DNA而优选地是cDNA，其编码增强单子叶植物对低温胁迫、盐胁迫和水分胁迫的耐受性的分子。所述核酸可以是生物学分离或合成的并且编码用于海藻糖生物合成的酶。在下面的实施例中，生物合成的关键酶，海藻糖-6-磷酸合酶(TPS)由大肠杆菌的otsA基因编码。在下面的实施例中，生物合成的第二个关键酶，海藻糖-6-磷酸磷酸酶(TPP)由大肠杆菌的otsB基因编码。

通过使用质粒来实现对植物细胞的转化。使用质粒将增强植物对盐胁迫和干旱胁迫的耐受性的核酸导入植物细胞。相应地，质粒优选地包括插入单一限制性内切核酸酶切割位点的、增强植物对盐胁迫和干旱胁迫的耐受性的DNA分子。如此处所使用的异源DNA是指不是通常存在于用质粒转化的特定宿主细胞中的DNA。通过使用本领域熟知的标准克隆方法将DNA插入载体。这个通常涉及使用限制性内切酶和DNA连接酶，如Sambrook等人在Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York中所描述的，其全文在此引用作为参考。然后可将包含增强植物对盐胁迫和干旱胁迫的耐受性的核酸的结果所得质粒用于转化宿主细胞，例如农杆菌(Agrobacterium)和/或植物细胞。(通常参见，Plant Molecular Biology Manual，第2版，Gelvin等人，Eds.，Kluwer Academic Press，Dordrecht，荷兰(1994)，其全文在此引用作为参考)。

关于植物转化，所述质粒还优选地包括用于植物转化的选择标记。通常使用的植物选择标记包括潮霉素磷酸转移酶(hpt)基因、膦丝菌素乙酰转移酶基因(bar)、5-烯醇丙酮酸基莽草酸酯-3-磷酸合酶基因(EPSPS)、新霉素3’-0-磷酸转移酶基因(nptII)或乙酰乳酸合酶基因(ALS)。在Kung等人(编者)的“Markers for Plant Gene Transfer”，Transgenic Plants，第一卷，89-123页，Academic Press，NY(1993)中可以找到关于这些选择标记的信息，其全文在此引用作为参考。在优选的实施方案中，所述质粒包括位于选择盒内为植物转化充当选择标记的膦丝菌素乙酰转移酶基因(bar)，所述基因在花椰菜花叶病毒35S启动子控制之下。

在优选的实施方案中，将所述质粒标记为pSB109-TPSP或pSB-RTSP，每个均含有otsA和otsB融合基因。

关于植物转化，所述质粒也优选地包括编码3’终止子的核酸分子，例如那些来自编码蛋白酶抑制剂、肌动蛋白1或胭脂碱合酶(nos)的基因3’非编码区的分子。在优选的实施方案中，所述质粒包括编码充当表达盒的3’终止子的蛋白酶抑制剂II基因(pinII)的3’非编码区域的核酸分子，所述表达盒包含诱导型启动子和编码用于海藻糖生物合成的酶的核酸。优选地，所述质粒包括编码作为植物转化选择盒3’终止子的胭脂碱合酶基因(nos)的3’非编码区域的核酸分子。

可以构建其他用于本发明的合适质粒。例如，除大肠杆菌的otsA基因或otsB基因之外，其他编码增加海藻糖生物合成和增强单子叶植物对低温胁迫、盐胁迫和水分胁迫耐受性的核酸可以在使用限制性内切酶去除otsA基因、otsB基因或otsA/otsB融合基因后连接到亲本质粒SB109-TPSP或SB-RTSP中。其他最小启动子可替代存在于质粒SB109-TPSP中的水稻肌动蛋白1基因启动子或存在于质粒SB-RTSP中的rbcS基因启动子。做为选择，通过使用本领域熟知的技术可以容易地构建其他具有合适的选择标记的、通常含有编码核酸的基因的质粒，所述核酸在合适的最小启动子控制下，能增加海藻糖生物合成和增强单子叶植物对低温胁迫、盐胁迫和水分胁迫的耐受性。

鉴定质粒后，一项用增强植物对低温胁迫、盐胁迫和水分胁迫耐受性的核酸转化单子叶植物细胞的技术是通过将所述植物细胞与农杆菌属细菌的接种物接触，所述细菌由包含增强单子叶植物对低温胁迫、盐胁迫和水分胁迫耐受性的核酸的质粒转化而来。一般地，这个方法涉及用转化的细菌的悬浮液接种所述植物细胞并于25-28℃下在无抗生素的再生培养基上温育所述细胞48到72小时。

来自农杆菌属的细菌可以用来转化植物细胞。合适的物种包括根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)。根癌农杆菌(例如LBA4404或EHA105株系)由于其众所周知的转化植物的能力而特别有用。

在根据本发明用农杆菌接种植物细胞中，所述细菌必需用包含编码用于海藻糖生物合成的酶的基因的载体转化。

包含增强植物对低温胁迫、盐胁迫和水分胁迫耐受性的核酸、适合于整合到农杆菌中的质粒含有用于在大肠杆菌中复制的复制起点、用于在根癌农杆菌中复制的复制起点、用于将基因转移到植物的T-DNA右边界序列和用于选择转化的植物细胞的标记基因。特别优选的是载体pBI121，其包含低拷贝RK2复制起点、具有胭脂碱合酶(nos)启动子的新霉素磷酸转移酶(nptII)标记基因和NOS 3’多腺苷酸化信号。T-DNA质粒载体pBI121可从Clontech Laboraties，4030Fabian Way，Palo Alto，California 94303商业购得。将增强单子叶植物对低温胁迫、盐胁迫和水分胁迫耐受性的核酸插入所述载体以取代β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因。

通常，通过如下方法用质粒来转化农杆菌属物种，即在化学和热处理后通过直接吸收质粒DNA，如Holsters等人在“Transfection andTransformation of Agrobacterium tumefaciens，”Mol.Gen.Genet.，163：181-187(1978)中所描述的，其全文在此引用作为参考；通过电穿孔后直接吸收DNA，如Shen等人在“Efficient Transformation ofAgrobacterium spp.by High Voltage Electroporation，”Nucleic AcidsResearch，17：8385(1989)中所描述的，其全文在此引用作为参考；通过Tra+辅助株系介导的从大肠杆菌到农杆菌的质粒三亲接合转移，如Ditta等人在“Broad Host Range DNA Cloning System for Gram-negative Bacteria：Construction of a Gene Bank of Rhizobiummeliloti，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：7347-7351(1981)中所描述的，其全文在此引用作为参考；或通过从大肠杆菌到农杆菌的直接接合转移，如Simon等人在“A Broad Host Range Mobilization System for invivo Genetic Engineering：Transposon Mutagenesis Gram-NegativeBacteria，”Biotechnology，1：784-791(1982)中所描述的，其全文在此引用作为参考。

另一种用于将含有编码用于海藻糖生物合成的酶的核酸导入植物细胞的方法是通过植物细胞核的转化，例如通过粒子轰击。如本申请通篇所使用的，通过几种方法中的一种可以实现对宿主细胞的粒子轰击(也称作生物弹射击(biolistic)转化)。第一个方法涉及向细胞推进惰性的或生物学活性的颗粒。这个技术公开于美国专利Nos.4,945,050、5,036,006和5,100,792，全属于Sanford等人，其全文在此引用作为参考。一般地，这个方法涉及在有效地穿透所述细胞的外表面并整合入其内部的条件下向细胞推进惰性的或生物学活性的颗粒。当使用惰性颗粒时，所述质粒可通过将含有异源DNA的质粒涂覆在所述颗粒上而导入细胞。作为另一种选择，可用所述质粒包围所述目的细胞，这样所述质粒就能通过所述颗粒的激发(wake)而运入所述细胞。生物学活性颗粒(例如，含有所述质粒和异源DNA的干燥细菌细胞)也可被推进植物细胞内。

另一种用于将质粒导入植物细胞的方法是通过植物细胞原生质体(稳定或瞬时的)的转化。植物原生质体仅由质膜包被，因此可吸入像异源DNA这类的大分子。这些工程改造的原生质体能够再生出完整的植株。用于将外源DNA导入植物细胞原生质体的合适方法包括电穿孔和聚乙二醇(PEG)转化。如本申请通篇所使用的，电穿孔是一种这样的转化方法，即其中一般地将高浓度的DNA(含有异源DNA)加入悬浮的宿主细胞原生质体中并且用200到600V/cm的电场电击所述混合物。电穿孔之后，通过让其生长在含有选择试剂的合适的培养基上来鉴定转化的细胞。

如本申请通篇所使用的，转化包括其中将所述质粒整合到植物染色体上的稳定转化。

在下面的实施例中，用农杆菌方法转化了水稻，所述方法如Hiei等人在“Efficient Transformation of Rice(Oryza sativa L.)Mediated byAgrobacterium and Sequence Analysis of the Boundaries of the T-DNA，”The plant Journal，6：271-282(1994)中所描述的，其全文在此引用作为参考。生物弹射击转化。其他转化方法已经成功地用于转化水稻植株，包括所述原生质体方法(关于综述，参见Cao等人，“Regeneration of Herbicide Resistant Transgenic Rice PlantsFollowing Microprojectile-Mediated Transformation of SuspensionCulture Cells，”Plant Cell Rep.，11：586-591(1992)，其全文在此引用作为参考)，和所述生物弹射击转化方法(公开于美国专利Nos.4,945,050、5,036,006和5,100,792，全部属于Sanford等人，其全文在此引用作为参考)。生物弹射击转化已经被成功用于转化小麦(关于综述，参见Weeks等人，“Rapid Production of Multiple Independent Lines ofFertile Transgenic Wheat(Triticum aestivum)，”Plant Physiol.，102：1077-1084(1993)，其全文在此引用作为参考)。生物弹射击转化也已经被成功用于转化玉米(关于综述，参见Mackey等人，“TransgenicMaize，”Transgenic Plants，Kung等人，Eds.，第二卷，21-33页(1993)，所述文献在此处全文引用作为参考)和小麦(参见Vasil等人的专利No.5,405,765，其全文在此引用作为参考)。

一旦根据本发明转化了单子叶植物细胞或原生质，就会再生形成转基因单子叶植物。一般地，再生是通过将转化的细胞或原生质体培养在含有允许茎分生组织引发的合适的生长调节剂和营养的培养基上而完成的。将合适的抗生素加入到所述再生培养基中以抑制农杆菌或其他污染物的生长，并且选择转化的细胞或原生质体的发育。接着在茎引发后，使得茎能够在组织培养中发育并对标记基因活性进行筛选。

在合适的转化方法中，所述要转化的单子叶植物细胞可以是在体外的或在体内的，即所述单子叶植物细胞可以位于单子叶植物中。

本发明也涉及用可操作地连接到诱导型启动子上的并增强对低温胁迫、盐胁迫和水分胁迫耐受性的核酸转化的转基因单子叶植物。

本发明也提供了由所述转基因单子叶植物产生的种子。本发明还涉及经萌发而产生所述转基因单子叶植株的种子。

本发明也包括用本发明的增强对低温胁迫、盐胁迫和水分胁迫耐受性的所述核酸片段转化而得的转基因单子叶植物。通过使用合适的限制位点可以构建合适的能赋予单子叶植物对低温胁迫、盐胁迫或水分胁迫耐受性的片段。片段是指小于完整分子的核酸连续部分，所述核酸部分能增强对盐胁迫和干旱胁迫的耐受性。

非必需核苷酸可以置于所述片段(或所述增强对盐胁迫和干旱胁迫耐受性的全长核酸)的5’和/或3’末端而不影响所述片段或分子的功能特性(即在增强对水分胁迫或盐胁迫耐受性方面)。例如，增强对低温胁迫、盐胁迫和水分胁迫耐受性的所述核酸可以在所述增强对低温胁迫、盐胁迫和水分胁迫耐受性的核酸的N-端末端(例如)与信号(或前导)序列缀合，所述信号(或前导)序列可共翻译地或翻译后地引导所述能增强对低温胁迫、盐胁迫和水分胁迫耐受性的核酸的转移。所述核苷酸序列也可改变以使所述增强对低温胁迫、盐胁迫和水分胁迫耐受性的核酸缀合到便于合成、纯化或鉴定的连接体或其他序列上。

所述转基因谷类植物细胞或原生质体或植株也可以用编码选择性标记的核酸例如bar基因转化，以使得能够检测转化体，和用编码花椰菜花叶病毒35S启动子的核酸转化以控制bar基因的表达。其他选择标记包括编码EPSPS、nptII或ALS的基因。其他启动子包括那些来自编码肌动蛋白1、rbcS、泛素和PINII的基因的启动子。这些附加的核酸序列也可以由编码赋予对低温胁迫、盐胁迫和水分胁迫耐受性的基因和其启动子的质粒提供。在适当之时，各种核酸也可以通过用多个质粒转化提供。

当此处涉及的增强对低温胁迫、盐胁迫和水分胁迫耐受性的核酸编码例如赋予对低温胁迫、盐胁迫和水分胁迫耐受性的基因时，与以前测过序的低温胁迫、盐胁迫和水分胁迫的基因的核苷酸同一性不是必需的。属于沉默突变的各种核苷酸替代是可能的(即由特定密码子编码的氨基酸不改变)，这对本领域技术人员而言应当是显而易见的。改变由特定密码子编码的所述氨基酸的核苷酸替代也是可能的，此处替代的氨基酸是保守替代(即氨基酸“同源性”是保守的)。在所述低温胁迫、盐胁迫和水分胁迫基因的核苷酸和/或氨基酸序列上添加、删除和/或替代少量核苷酸和/或氨基酸也是可能的，所述少量核酸和/或氨基酸的改变对编码的低温胁迫、盐胁迫和水分胁迫的基因的特性、二级结构和亲水/疏水性质具有最小的影响。本发明包括了这些变体。

                       实施例

实施例1-用于水稻转化的质粒构建

通过使用标准克隆和质粒操作方法在所述pSB11载体(Komari等人，“Vectors Carrying Two Separate T-DNAs for Co-Transformation of Higher Plants Mediated by Agrobacteriumtumefaciens and Segregation of Transformants Free from SelectionMarkers，”Plant J.，10：165-174(1996)，此处全文引用作为参考)上构建两个二元质粒pSB109-TPSP和pSB-RTSP，每个均含有TPSP融合基因(Seo等人，“Characterization of Bifunctional Enzyme Fusion ofTrehalose-6-Phosphate Synthetase and Trehalose-6-PhosphatePhosphatase of Escherichia Coli，”Appl.Environ.Mircobiol.，66：2484-2490(2000)，其全文在此引用作为参考)。图1A、B和C显示所述质粒在T-DNA区域内的组件和选择的限制性内切酶位点。在pSB109-TPSP上的表达盒由脱落酸(ABA)诱导型启动子组成(Su等人，“Dehydration-Stress-Regulated Transgene Expression in StablyTransformed Rice Plants，”Plant Physiol.，117：913-922(1998)，其全文在此引用作为参考)，所述启动子包含四个串联拷贝的ABA诱导型元件ABRC1(0.18kb)，所述ABRC1与最小水稻肌动蛋白1启动子(0.18kb)和HVA22内含子(0.24kb)偶联。其与TPSP编码区(2.2kb)连接，所述编码区通过在使用PCR除去otsA基因的终止密码子后融合otsA和otsB基因(Seo等人，“Characterization of a Bifunctional EnzymeFusion of Trehalose-6-Phosphate Synthetase and Trehalose-6-Phosphate Phosphatase of Escherichia coli，”Appi.Environ.Microbiol.，66：2484-2490(2000)，其全文在此引用作为参考)，接着连接到马铃薯蛋白酶抑制剂II基因(pinII)的3’非编码序列(1.0kb)来构建。所述选择盒包括花椰菜花叶病毒35S启动子(0.74kb)、膦丝菌素乙酰转移酶基因(bar，0.59kb)和胭脂碱合酶基因的3’非编码序列(Nos3’，0.28kb)。在pSB-RTSP中，具有叶绿体靶向转运肽(0.16kb)的水稻rbcS启动子1.3-kb片段(Kyozuka等人，“Light-Regulated and Cell-Specific Expression of Tomato rbcS-gusA and Rice rbcS-gusA FusionGenes in Transgenic Rice，”Plant Physiol.，102：991-1000(1993)，其全文在此引用作为参考)与TPSP编码区连接；剩下的组件与那些在pSB109-TPSP中的相似。在克隆和连接包含整合入质粒pSB-RTSP的rbcS启动子/转运肽和TPSP融合基因的约3.7kb DNA片段期间，在TPSP和3’pinII之间加入三个额外的限制位点(SacI、SalI和HindIII)。通过使用辅助质粒pRK2013进行三亲本交配将两个质粒(pSB109-TPSP和pSB-RTSP)分开地转入到含有pSB1载体(Komari等，“Vectors Carrying Two Separate T-DNAs for Co-Transformationof Higher Plants Mediated by Agrobacterium tumefaciens andSegregation of Transformants Free from Selection Markers，”PlantJ.，10：165-174(1996)，其全文在此引用作为参考)的根癌农杆菌株系LBA4404中。关于共培养，对于水稻转化，将来自单菌落的细菌在含有50mg/升壮观霉素的液体AB培养基中于30℃下培养3天，并且在AAM培养基中以每毫升3×10⁹个细胞的密度进行悬浮(Hiei等人，“Efficient Transformation of Rice(Oryza sativa L.)Mediated byAgrobacterium and Sequence Analysis of the Boundaries of the T-DNA，”Plant J.，6：271-282(1994)，其全文在此引用作为参考)。

实施例2-转基因水稻植株的产生

将籼型水稻变种PB-1的成熟种子脱壳，并在70％(体积/体积)乙醇中灭菌2-3分钟，然后转到50％(体积/体积)的Clorox溶液中并轻微震荡40分钟。用无菌水将种子冲洗数次。然后将所述灭菌的PB-1种子铺在Murashige和Skoog(MS)培养基(Sigma)上以诱导愈伤组织并在黑暗中于25℃下生长21天，所述培养基补充有3.0mg/升的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)/0.2mg/升6-苄氨基嘌呤(BAP)/300mg/升酪蛋白水解产物(CH)/30g/升麦芽糖/3.0g/升phytagel，且pH为5.8(MSCl)。在来自水稻胚的小盾片区域的愈伤组织诱导三周后，将150个胚发生的愈伤组织浸入根癌农杆菌悬浮液中10分钟。将感染的愈伤组织共培养在补充有10g/升葡萄糖/100μM乙酰丁香酮(acetosyringone)并且pH为5.2的MSCI培养基(MSCC)中。共培养3天后，用含有250mg/升氨噻肟头孢霉素的无菌水漂洗愈伤组织并将其印迹在滤纸上。立刻将所述愈伤组织放在选择培养基上，即补充有6mg/升双丙氨酰膦和250mg/升氨噻肟头孢霉素且pH为5.8的MSCl培养基(MSS)，并在黑暗中于25℃温育2-3周。在最初选择后已经增殖的微小愈伤组织(microcalli)进一步每2周在新鲜的MSS培养基上传代培养以进行2轮筛选。将活跃分裂的抗双丙氨酰膦的愈伤组织放于含有2.5mg/升BAP/1.0mg/升激动素/0.5mg/升萘乙酸(NAA)/300mg/升CH/30g/升麦芽糖/4mg/升双丙氨酰膦/250mg/升氨噻肟头孢霉素/2.0g/升phytagel并且pH为5.8的MS植物再生培养基(MSPR)上，并在10小时光照/14小时黑暗光周期下于25℃生长3-4周。使再生苗适应于在Yoshida营养液中水培生长(Yoshida等人，Laboratory Manual for Physiological Studies of Rice，International RiceResearch Institute，Manila，菲律宾，62-66页(1976)，其全文在此引用作为参考)10天。之后，将假定的最初转化体(T₀代)转移入盆中并且测试其对草铵膦-除草剂的抗性(Roy和Wu，“ArginineDecarboxylase Transgene Expression and Analysis of EnvironmentalStress Tolerance in Transgenic Rice，”Plant Sci.160：869-875(2001)，其全文在此引用作为参考)；所述转基因植物在温室中生长直至成熟用于进一步分析。

实施例3-转基因水稻植株的DNA印迹杂交分析

通过使用研钵和研杵将来自非转化对照(NTC)植株和分别用质粒pSB109-TPSP和pSB-RTSP转化的9个A系(ABA诱导型启动子)的和5个R系(rbcS启动子)的代表(T₀)转化体的叶子在液氮中研磨。按照厂商说明，通过使用DNAzolES(Molecular Research Center，Cincinnati)的胍-去污剂裂解方法分离水稻基因组DNA。用HindIII限制性酶消化5微克的基因组DNA过夜，通过0.8％的琼脂糖凝胶分级分离，碱性转移到Hybond N+尼龙膜(Amersham Pharmacia)上，并与作为探针的α-³²P-标记的2.2kb TPSP融合基因杂交(Seo等人，“Characterization of a Bifunctional Enzyme Fusion of Trehalose-6-Phosphate Synthetase and Trehalose-6-Phosphate Phosphatase ofEscherichia coli，”Appl.Environ.Microbiol.，66：2484-2490(2000)，其全文在此引用作为参考)。DNA探针的制备、杂交和膜的洗涤都按照Roy和Wu(“Arginine Decarboxylase Transgene Expression and Analysis ofEnvironmental Stress Tolerance in Transgenic Rice，”Plant Sci.160：869-875(2001)，其全文在此引用作为参考)的描述进行。所述α-³²P-标记的膜暴光形成放射自显影图。

实施例4-检测海藻糖和可溶性糖类

按Goddijn等人(“Inhibition of Trehalase Activity EnhancesTrehalose Accumulation in Transgenic Plant，”Plant Physiol.，113：181-190(1997)，其全文在此引用作为参考)的描述提取可溶性糖类。将来自0.5克新鲜叶组织匀浆物的提取物进行离心(10分钟，3,220xg)；上清液通过离子交换柱以除去带电化合物，所述离子交换柱由层积在1毫升Dowex 50W(氢形式)上的1毫升Amberlite IR-68(醋酸盐形式)组成。冻干后，将样品溶解在HPLC-级水中并且通过使用装配有Carbopac PA-1分析柱和Carbopac PA-1保护柱的Dionex DX-500系列层析仪(Dionex)对样品进行高效阴离子交换层析处理，所述高效阴离子交换层析具有脉冲电流检测。用100mM氢氧化钠在1,400磅/英寸²(psi)下以每分钟1.0毫升的流速将糖类洗脱34分钟。通过使用可靠的标准糖(Sigma)对绝大部分存在的可溶性糖进行定量。通过用猪肾来源的海藻糖酶(Sigma)温育样品来确定植物提取物中海藻糖的特性。

实施例5-盐胁迫耐受性和植物矿质营养的确定

在生长室中，将来自每个T₄代转基因系(R22、R38、R80、A05、A07和A27)和NTC的10颗苗于25±3℃下以10小时光照/14小时黑暗的光周期(光子通量密度为每m/s 280μmol光子)在Yoshida营养液(Yoshida等人，Laboratory Manual for Physiological Studies of Rice，International Rice Research Institute，Manila，菲律宾，61-66页(1976)，其全文在此引用作为参考)中水培生长(适度通风)，并且相对湿度为50-60％。5周后，50％的幼苗接受100mM氯化钠胁迫(导电率为10-12dS/m)处理。每周更换营养液。连续盐胁迫4周后，分别收获茎部和根部样品以确定其鲜重和干重。对于矿质营养的分析，用浓硝酸在120℃消化150mg研磨的干物质过夜。然后将样品在220℃下溶解在HNO₃∶HClO₄(1∶1，体积/体积)中，重新悬浮于5％(体积/体积)硝酸中，并且通过同步电感耦合氩等离子体发射光谱法(ICP痕量分析仪；Plant，Soil，and Nutrition Laboratory，U.S.Department ofAgriculture-Agriculture Research Service，Cornell University，lthaca，NY)对钠(Na⁺)、钾(K⁺)、钙(Ca²⁺)和铁(Fe)元素组成进行分析。

实施例6-干旱和低温胁迫耐受性的确定

在进行干旱或低温胁迫实验前将来自6个独立的T₄转基因系和非转化系的苗按单株种在10cm×10cm的盆中，并用Yoshida营养液浇灌来生长5周。首先，通过停止灌溉3天以使盆中土壤变干以进行干旱胁迫(缺水)。然后，开始第一轮100小时的干旱处理，接着重新又浇水2天。重复另一轮100小时的干旱胁迫，并且通过3周的每天浇灌以使所述植物得以恢复。通过将5周大小的幼苗置于10℃下以10小时光照/14小时黑暗的光周期(光子通量密度为280μmol光子每m每s)对它们进行72小时低温胁迫，并且相对湿度为50-60％；接着将所述幼苗置于25±3℃正常生长条件下以使其恢复。

实施例7-蛋白提取和免疫印迹

用蛋白提取缓冲液(20mM Tris.HCl，pH8.0/10mM EDTA/30mM氯化钠/2mM甲苯磺酰氟，于4℃进行1小时)从0.2g来自新鲜叶片组织的匀浆中提取蛋白。通过在4℃下以12,000xg离心15分钟澄清所述匀浆。免疫印迹方法基本上与Xu等人(“Expression of a LateEmbryogenesis Abundant Protein Gene，HVA1，from Barley ConfersTolerance to Water Deficit and Salt Stress in Transgenic Rice，”PlantPhysiol.110：249(1996)，其全文在此引用作为参考)所描述的一样。按照厂商说明书(BioRad)，将所述抗TPSP蛋白多克隆抗体以1∶1500的稀度用于蛋白印迹分析，用碱性磷酸酶颜色反应检测所述蛋白。

实施例8-叶绿素荧光参数

如Saijo等人(“Over-Expression of a Single Ca2+-DependentProtein Kinase Confers Both Cold and Salt/Drought Tolerance on RicePlants，”Plant J.23：319-327(2000)，其全文在此引用作为参考)所描述的，利用脉冲振幅调制荧光计(FMS2，Hansatech Instruments，PentneyKing’s Lynn，英国)测量Fv/Fm和Φ_PSII以分别估计在环境光照条件下对光系统II(PSII)反应中心和PSII光化学的量子效率的光氧化破坏。对最新的完全展开的叶片进行测量。首先在环境光照下确定Φ_PSII的测量值；接着在测量Fv/Fm前对同样的叶子进行10分种暗适应。

实施例9-具有提高的海藻糖水平的转基因水稻植株在表型上是正常的并且是可育的

通过农杆菌介导的基因转移(Hiei等人，“EfficientTransformation of Rice(Oryza sativa L.)Mediated by Agrobacteriumand Sequence Analysis of the Boundaries of the T-DNA，”Plant J.，6：271-282(1994)，其全文在此引用作为参考)将两个质粒构建体pSB109-TPSP(图1A、C)和pSB-RTSP(图1B、C)(每个均含有TPSP融合基因)导入PB-1籼型水稻细胞中。在质粒构建体pSB109-TPSP中，ABA和胁迫诱导型启动子(Su等人，“Dehydration-Stress-Regulated Transgene Expression in Stably Transformed RicePlants，”Plant Physiol.，117：913-922(1998)，其全文在此引用作为参考)驱动所述融合基因在细胞质中表达。在另一个质粒pSB-RTSP中，来自稻(Oryza sativa)并具有转运肽的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基基因(rbcS)的光调控启动子(Kyozuka等人，“Light-Regulatedand Cell-Specific Expression of Tomato rbcS-gusA and Rice rbcS-gusAFusion Genes in Transgenic Rice，”Plant Physiol.，102：991-1000(1993)，其全文在此引用作为参考)驱动靶向叶绿体的融合基因在叶片叶肉细胞中表达。大量假定的转基因PB-1植物(T₀代)再生(表1)；这些植物包括28个A系(ABA诱导型启动子)和76个R系(rbcS启动子)。

表1.用在质粒pSB109-TPSP和pSB-RTSP中含有TPSP融合基因的根癌农杆菌株系LBA4404(pSB1)转化水稻的效率

质粒	pSB109-TPSP	pSB-RTSP
			启动子	ABA和胁迫诱导型	具有转运肽的水稻rbsS
表达靶向	细胞质	叶绿体
			共培养的愈伤组织数目	150	150
抗双丙氨酰膦(bialophos)的愈伤组织数目	41/150	118/150
			再生植株数目	29/41	89/118
抗草铵膦的植株数	28/29	76/89
			可育T0株系数目	22(79％)	68(90％)

圆括号内的数目表示完全可育植株的百分数。

通过DNA-印迹杂交分析(图1D和E)确定所述TPSP转基因的整合。基于所述T-DNA连接片段分析，大约40％的用任意一个所述质粒转化的转基因植株含有单拷贝的转基因，而35-45％的植株含有2个或3个拷贝的转基因。

90个独立的含有低拷贝数转基因的最初转化体(T₀)中大部分都表现有正常的表型和完全可育。与以前报导的使用驱动单个TPS和/或TPP基因的组成型启动子相反，在本工作中使用胁迫诱导型或组织特异性启动子看来可使转基因对植物生长的负面影响最小化。所述T₀植物通过自花受粉获得分离的T₁后代以用来进行遗传学和HPLC分析。对于草铵膦-除草剂抗性标记基因，45个转基因系显示3∶1的分离模式。对叶片提取物的HPLC分析显示转基因系海藻糖的含量是非转基因植物海藻糖含量(每克鲜重含17±5μg海藻糖)的3倍到8倍。通过将样品用猪海藻糖酶温育后接着对单糖产物进行层析分析以确定所述植物组织提取物中海藻糖的特性(图6)。因为曾经报导基因沉默发生在T₃代，尽管T₂和T₁代植株没有沉默(Iyer等人，“TransgeneSilencing in Monocots，”Plant Mol.Biol.，43：323-346(2000)，其全文在此引用作为参考)，所以通过T₄代对纯合体植株的非生物胁迫耐受性进行生理学实验。除了少数具有多拷贝转基因的转基因系外，从许多独立的转基因系获得的结果在每一代对盐和干旱胁迫耐受性上是一致的。

实施例10-转基因水稻植株是耐盐的并且保持平衡的矿质营养

在水培生长条件下，具有1个或2个拷贝转基因的T₄代转基因植株在4周的100mM氯化钠处理期间和随后显示出显著增强的盐耐受性。对6个独立的转基因植物系(3个A系和3个R系)进行详细的分析。为了清楚地说明，显示来自2个代表性转基因系(R80和A05)的结果(图2)；来自其他4个系的结果与展示的2个系非常相似。在延长暴露于盐胁迫后，几乎所有的转基因植物都存活并且展现旺盛的根部和茎部生长。相反地，所有非转化的经胁迫的(NTS)植物要么死亡要么接近死亡，因为叶子遭受严重的盐损害和伴随的叶绿素丧失。盐胁迫后转基因植株发育出比NTS植株更长和更粗的根(图2A)。与NTC植株比较时，正如它们较低的干重所表明的，盐胁迫严重地抑制了NTS植株茎和根的生长。两种转基因系的茎和根的干重(图2B)都接近NTC植株的干重并且在解除盐胁迫后，所述转基因植物能够生长、开花和结出正常能活的种子。为了确定TPSP基因产物是否存在于盐胁迫植物中，从叶子样品中分离出总蛋白进行蛋白印迹分析。使用抗所述融合蛋白的多克隆抗体的免疫印迹分析显示只在转基因植株中存在预期的表观分子量为88KDa的蛋白(图2C)。

为了评估在转基因水稻中的海藻糖积累在盐胁迫期间怎样影响植株矿质营养，通过使用电感耦合等离子发射光谱法确定6个独立的转基因系和2个非转基因系茎部和根部的矿质含量(表2)。

表2.转基因系(R22、R38、R80、A05、A07和A27)和非转化对照系进行或不进行盐胁迫时在茎和根中的植物矿质营养含量(钠、钾、钙和铁离子)

系	钠		钾		钙		铁
										茎	根	茎	根	茎	根	茎	根
	非胁迫条件下
NTC-1											1.4±0.3	1.2±0.1	33±8	18±6	2.5±0.6	0.6±0.1	0.13±0.08		2.8±1.5
	NTC-2	1.1±0.3	1.3±0.3	33±3	15±2	2.3±0.1	0.7±0.1	0.13±0.04		3.5±0.7
R22											1.2±0.3	1.1±0.4	30±2	21±1	2.5±0.5	1.6±0.2	0.20±0.09		6.1±3.0
	R38	0.9±0.2	1.8±0.2	35±5	23±4	2.3±0.5	1.0±0.3	0.16±0.03		3.7±0.4
R80											1.2±0.2	1.5±0.2	44±1	23±1	2.8±0.7	0.5±0.1	0.28±0.01		4.3±1.1
	A05	1.0±0.3	1.5±0.8	45±1	22±4	2.7±0.5	0.6±0.1	0.21±0.04		4.3±0.4
A07											2.2±0.7	1.1±0.2	45±1	24±1	3.7±1.2	0.9±0.2	0.25±0.07		4.3±0.2
	A27	1.9±0.4	1.0±0.3	47±4	20±1	2.4±0.8	1.5±0.2	0.19±0.01		5.1±2.9

盐胁迫条件下(100mM NaCl)
									NTS-1	77±13	7±3	31±4	6±2	4.4±0.8	1.8±0.3	0.25±0.08	9.3±2.7
NTS-2	87±17	4±1	30±2	3±1	5.6±0.5	1.7±0.3	0.24±0.05	8.3±3.4
									R22	34±10	6±2	26±2	16±2	4.6±0.7	1.0±0.3	0.47±0.11	5.8±2.3
R38	24±10	7±1	30±2	17±4	4.1±0.8	0.5±0.1	0.42±0.07	4.7±1.5
									R80	28±7	6±2	29±2	17±2	4.2±0.6	0.7±0.1	0.47±0.08	6.8±2.6
A05	30±10	6±1	34±5	17±1	4.2±0.8	0.5±0.2	0.46±0.03	7.8±1.4
									A07	24±8	7±1	29±2	18±3	2.7±0.5	0.5±0.1	0.48±0.04	5.3±0.8
A27	18±7	7±3	29±4	20±1	3.0±0.5	0.5±0.3	0.45±0.05	5.5±1.4

所述离子浓度表示为mg/g茎或根干重。值为平均值±SD(n＝5)。

在连续用盐胁迫(100mM氯化钠)处理4周后，与NTC相比NTS植物在茎和根部都显示出有非常大量增加的钠离子含量，而在所有转基因植物的茎部增加的量要少得多(图2D)。盐胁迫后，转基因植物茎部的钠离子含量只有NTS植物的30-35％。在转基因植物和NTS植物间观察到的茎部钠离子含量的差异部分是由于转基因植物在盐胁迫下更加快速的生长速度引起的生长稀释造成的。还有一种可能，海藻糖可能在维持离子选择性方面起着直接或间接作用，因此促进将细胞内钠离子排出。这个可能性与在盐胁迫下的水稻幼苗中外源脯氨酸不能阻止钠离子在叶组织中积累的报导相符合。相反，用外源海藻糖处理可显著降低盐诱导的钠离子在叶中的积累(Garcia等人，“Effectsof Osmoprotectants Upon NaCl Stress in Rice，”Plant Physiol.，115：159-169(1997)，其全文在此引用作为参考)。

转基因系R80和A05在非胁迫和盐胁迫条件下保持从茎到根的钾离子体内稳态(表2)。盐胁迫后，转基因植物中茎和根钾离子的水平与非胁迫对照的相似，而在NTS植物中可看到根部钾离子降低4倍(图2E)。于是，与所述NTS植物相比，转基因植物在根部能够维持对钾离子吸收比对钠离子吸收有更高水平的选择性并且从茎部排出钠离子。维持转基因植物的茎和根的钠离子/钾离子比例(图2F)与几乎正常的植物生长相关，并且可能是在盐胁迫下最小化钠毒性的基础。维持钠离子/钾离子体内稳态是盐耐受性的重要方面这一观点是被普便接受的(Rus等人，“AtHKT1 is a Salt Tolerance Determinant thatControls Na⁺ Entry into Plant Roots，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA，98：14150-14155(2001)；和Epstein，“Plant Biology：How CalciumEnhances Plant Salt Tolerance，”Science，280：1906-1907(1998)，所述文献在此全文引用作为参考)。

与NTC相比，在转基因系中看到可能对胁迫耐受性产生间接作用的几种其他植物矿质状况的变化。已发现盐胁迫导致NTS系根和茎的钙离子含量有显著增加，而在转基因系中，只在茎而不是根中观察到这种钠介导的钙离子含量增加(表2)。这种钙离子的升高可能是在高钠离子浓度下改变了转运蛋白对离子的选择性造成的(Epstein，“Plant Biology：How Calcium Enhances Plant Salt Tolerance，”Science，280：1906-1907(1998)，其全文在此引用作为参考)。与NTC相比，在转基因系中还发现茎部具有显著更高水平的铁离子含量(表2)。已充分地证明了铁、铜和锌离子是重要的抗氧化酶，例如在许多非生物胁迫期间在清除反应性氧种类中起作用的超氧化物歧化酶发挥功能所必需的(Epstein，“Plant Biology：How Calcium Enhances PlantSalt Tolerance，”Science，280：1906-1907(1998)，Alscher等人，“Roleof Superoxide Dismutases(SODs)in Controlling Oxidative Stress inPlants，”J.Exp.Bot.，53：1331-1341(2002)，其全文在此引用作为参考)。总的说来，盐胁迫和植物矿质含量的相互关系是复杂的，并且在盐胁迫期间提高了的海藻糖含量和改善了的矿质状况之间的联系还不清楚。

实施例11-转基因水稻植物具有水分胁迫耐受性

为了研究干旱耐受性，将生长在土壤中的5周大小的非转化和转基因幼苗进行每轮100小时的2轮干旱胁迫处理。干旱处理后，每个系所有15株植株显示枯萎和干旱诱导的幼叶卷曲。非转基因植物在48小时胁迫内展现出叶子卷曲，相比之下在相同时间期间在转基因植物中有明显更少的可见症状。在每轮100小时的两轮干旱胁迫和随后3周的浇灌后，两个转基因系R80和A05(图3B)的生长几乎与非胁迫处理的对照植物(图3A)一致。相反，干旱胁迫后的NTS的生长受到严重的抑制(图3B)。

实施例12-转基因水稻植物产生数量增加的海藻糖和其他可溶性糖类

为了估计植物中海藻糖的积累是否可能在胁迫耐受性上充当正的调节剂，测量海藻糖和其他可溶性糖类的水平(表3)。

表3.生长在无胁迫、盐胁迫(100mM氯化钠处理4周)或干旱胁迫(在首轮100小时干旱胁迫后)条件下的非转化(NT)和6个转基因水稻系(R22、R38、R80、A05、A07和A27)茎部的海藻糖、葡萄糖、果糖、蔗糖和总的可溶性糖类的含量水平。

系	海藻糖	葡萄糖	果糖	蔗糖	总计
						非胁迫条件
NTC-1	17±5	3.9±0.17	3.4±0.61	46±3.7	53±4.4
						NTC-2	16±6	3.8±0.36	3.1±0.70	45±5.1	52±5.6
R22	96±14	5.0±0.39	4.5±0.74	51±1.3	61±2.2
						R38	71±11	4.9±0.27	4.3±0.65	49±3.6	58±4.1
R80	55±8	5.5±0.30	4.9±0.79	54±4.5	64±6.0
						A05	48±7	5.6±0.33	5.2±0.85	53±9.6	64±10
A07	62±8	5.6±0.44	5.1±0.89	60±8.3	71±9.9
						A27	54±9	5.2±0.41	4.6±0.69	52±6.7	62±7.8
干旱胁迫条件
						NTS-1	53±11	4.7±0.75	4.0±0.86	45±2.6	54±3.8
NTS-2	47±8	4.6±0.47	3.5±0.95	48±3.6	57±4.7
						R22	156±19	4.9±0.49	3.7±0.78	57±2.3	65±3.5
R38	257±26	5.6±0.66	4.8±0.47	57±6.6	68±7.2
						R80	163±23	4.3±1.24	3.1±0.81	51±4.2	59±4.9
A05	508±48	3.7±0.51	2.3±0.41	60±5.6	67±6.4
						A07	474±103	4.0±0.83	2.6±0.71	56±8.1	63±10
A27	401±69	3.8±0.42	2.8±0.39	27±2.4	34±3.1
						盐胁迫条件
NTS-1	29±6	3.5±0.08	3.0±0.04	35±2.7	42±3.9
						NTS-2	34±6	3.1±0.11	2.6±0.03	37±2.7	42±4.0
R22	69±8	4.2±0.12	4.0±0.08	36±2.1	44±2.7
						R38	130±19	5.1±0.47	5.2±0.12	28±2.4	48±3.1
R80	76±12	4.2±0.15	3.9±0.10	42±3.0	50±3.8
						A05	91±13	4.0±0.14	3.3±0.10	44±4.7	51±5.7
A07	75±8	3.0±0.12	2.3±0.09	34±2.5	40±3.1
						A27	143±18	2.8±0.14	1.9±0.10	35±4.9	40±5.8

显示平均值±SD(n＝3)。可溶性糖类含量数据表示为mg/g茎鲜重，

除了在海藻糖情况下其含量表示为μg/g鲜重。

在NTC植物的茎中检测到较低但明显含量的海藻糖(17μg/g鲜重)；在盐或干旱胁迫下这些水平会显著升高。生长在对照条件下的转基因植物展现出与NTS植物相当的海藻糖水平(图4)。盐胁迫后，与NTS植物相比，转基因系(R80和A05)显示出高2.5-3倍的茎海藻糖水平，而在干旱胁迫后，转基因系中海藻糖水平增加了3-到9-倍(图4)。尽管经基因工程改造以增加细胞质或叶绿体中海藻糖合成的转基因植物展现相似抗性水平，但是R-系在干旱胁迫期间表现出在低得多的海藻糖水平下具有相当的保护性(表3)。总之，在被评估的转基因系中海藻糖的积累和胁迫耐受性之间没有明显的相关关系。另一方面，转基因和非转基因系之间海藻糖水平的差异明显地与增强的对非生物胁迫耐受性相关。

实施例13-转基因水稻植物显示改善的光系统II功能

在许多不同的非生物胁迫期间，光合作用的降低和随后反应性氧种类的产生被认为是造成植物生产性能降低和光氧化损害的主要原因。通过使用体内叶绿素荧光技术(Saijo等人，“Over-Expression of aSingle Ca²⁺-Dependent Protein Kinase Confers Both Cold andSalt/Drought Tolerance on Rice Plants，”Plant J.，23：319-327(2000)，其全文在此引用作为参考)确定PSII光化学(Φ_PSII)量子产率来估计在干旱胁迫期间增加的海藻糖积累对光合作用的影响。Φ_PSII是对植物在环境光照条件下光合作用性能的衡量标准。在首轮100小时的干旱胁迫后，NTS植物中PSII光化学量子产率降低大约68％，而与非胁迫对照相比，所述两个表现最好的转基因系(R80和A05)的活性只降低29-37％(图3C)。类似地，在转基因系中，干旱诱导的荧光参数Fv/Fm的降低远比NTS植物的小(图3D)，所述荧光参数Fv/Fm是对PSII的累积光氧化损害的衡量标准。在其他独立的实验中，在低温胁迫(图7)和盐胁迫中都获得类似的结果，这表明保持光合作用能力对这些胁迫耐受性起着共同的作用。

实施例14-转基因水稻植物在非胁迫条件下具有增强的能力

已知在非生物胁迫下改善的光合作用可限制光氧化损害和使得能够持续生长(Owens，“Processing of Excitation Energy by AntennaPigments，”Photosynthesis and the Environment，Baker，ed.，Kluwer，Dordrecht，荷兰，1-23页(1996)，其全文在此引用作为参考)，并且通过图3的数据清楚表明。在同样的条件下，转基因植物表现出比那些相应的NTC植物高大约20％的可溶性糖类的水平，包括葡萄糖、果糖和蔗糖水平的微小改变(表3)。这两个结果都与海藻糖可能参与对糖的感应和调节碳代谢的提示(Goddijn等人，“Trehalose Metabolismin Plants，”Trends Plant Sci.，4：315-319(1999)，Thevelein和Hohmann，“Trehalose Synthase：Guard to the Gate of Glycolysis inYeast？”Trends Biochem.Sci.，20：3-10(1995)，其全文在此引用作为参考)相一致。最近在表达大肠肝菌海藻糖生物合成基因的转基因烟草植物中已证明了海藻糖调节光合作用能力的能力(Paul等人，“Enhancing Photosynthesis with Sugar Signals，”Trends Plant Sci.，6：197-200(2001)，其全文在此引用作为参考)。具有增强的TPS表达的植物在每单位叶面积上展现出比非转基因对照更高的光合作用，然而那些过量表达TPP的植物显示出减小的光合作用速率。这些数据导致他们得出如下结论：即，是海藻糖-6-磷酸而不是海藻糖调节光合作用能力((Paul等人，“Enhancing Photosynthesis with Sugar Signals，”Trends Plant Sci.，6：197-200(2001)，其全文在此引用作为参考)。

图5显示PSII电子传递速率的光强度依赖性，其由在对照(非胁迫)条件下对非转基因水稻和转基因系R80和A05测量的Φ_PSII测量值所确定(Saijo等人，“Over-Expression of a Single Ca²⁺-DependentProtein Kinase Confers Both Cold and Salt/Drought Tolerance on RicePlants，”Plant J.23：319-327(2000)，其全文在此引用作为参考)。尽管在限制的光强度下光合作用差异较小，但在光饱和时，转基因植物中光合作用的速率比NTC高5-15％。在光饱和时，光合作用速率被暗反应的能力所限制，特别是卡尔文循环和丙糖磷酸在细胞质中的利用(Owens，“Processing of Excitation Energy by Antenna Pigments，”Photosynthesis and the Environment，Baker，ed.，Kluwer，Dordrecht，荷兰，1-23页(1996)，其全文在此引用作为参考)。结合在胁迫和非胁迫两个条件下都观察到的更高水平的可溶性糖类水平(表3)，转基因植物中提高了的光饱和光合作用水平支持这样的提示，即在植物中海藻糖充当糖感应的调节剂因此调节与碳代谢相关基因的表达(Paul等人，“Enhancing Photosynthesis with Sugar Signals，”Trends Plant Sci.，6：197-200(2001)，其全文在此引用作为参考)。在胁迫前更高的光合作用能力的存在为在胁迫期间光合作用的产物提供了更大的储备，于是限制了过度光强诱导的光氧化损害的程度，并且部分地解释了转基因植物在胁迫期间更旺盛的生长。有趣地是通过TPSP融合基因产物获得的更高海藻糖合成效率(Seo等人，“Characterization of aBifunctional Enzyme Fusion of Trehalose-6-Phosphate Synthetase andTrehalose-6-Phosphate Phosphatase of Escherichia coli，”Appl.Environ.Microbiol.，66：2484-2490(2000)，其全文在此引用作为参考)表明是海藻糖而非海藻糖-6-磷酸导致增强的对光合作用能力。

实施例15-转基因小麦植物的产生

如Weeks等人报导的(“Rapid Production of Multiple IndependentLines of Fertile Transgenic Wheat(Triticum aestivum)，Plant Physiol.102：1077-1084(1993)，其全文在此引用作为参考)，从温室中生长的普通小麦(Triticum aestivum L.)cv.Bob White春小麦变种中分离出未成熟胚并且在轰击前在改造的MS培养基中于黑暗中预培养1-4天。根据厂商说明书(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)制备金颗粒和用质粒DNA对其进行涂覆。在轰击之前和之后对靶组织进行渗透处理。将轰击过的组织放在补充有5mg l^-1双丙氨酰膦(来自H.Anzai博士，Meiji Seika Kaisha，日本的赠品)的相同的培养基上，并于25℃下在黑暗中培养4周。将双丙氨酰膦抗性愈伤组织转移至再生培养基(含有2％蔗糖、0.15mg l^-1赛二唑素和1mg l^-1双丙氨酰膦的MS培养基)中，并在16小时光周期(66μmol·m^-2s^-1)下于25℃培养2-3周。大约2周后，将再生的茎转移到含有生根培养基(半强度的MS培养基和2mg l^-1双丙氨酰膦(balaphos))的Magenta^盒(Sigma，St.Louis，MO，美国)中，并在上述光照条件下于25℃培养2-4周。

将苗从生根培养基中转移到温室盆栽混合物(Sunshine mixnumber 1；Fison’s，加拿大)中，并且在移植后头几天内用烧杯盖上以防干燥。在补充光照以提供150μmol·m^-2s^-1光强度的16小时光照周期条件下，温室白天/夜晚温度为25±2/19℃。通过含有20％草铵膦的商用除草剂Glufosinate 200^TM(AgrEvo，NJ，美国)的1000倍稀释液进行叶片涂染测定(painting assay)和/或用喷雾来检测最初转化体和后代的除草剂抗性。

实施例16-检测转化的小麦植物中SB109-TPSP和Bar基因的存在

成功地再生了总共35个假定的含有质粒pSB109-TPSP(含有驱动TPSP融合基因的ABA胁迫诱导型启动子)的转基因小麦系。通过用0.5％的Basta^TM(Hoechst-Roussel，Agri-Vet Company，Somerville，NJ)涂染叶片以检测转移到温室中盆栽的一个月大小的植物对基于膦丝菌素的除草剂的抗性。在57％的转基因植物中叶片保持绿色并且显示草铵膦-除草剂抗性，但在敏感的和非转基因对照植物中叶片变黄。通过PCR分析证实TPSP基因的整合。根据TPSP基因设计两套引物(TPS1/TPS2，TPP1/TPP2)用以基因组DNA的PCR分析。在20个使用任一对引物分析的植物DNA样品中，9株植株显示预期的PCR产物，证实了所述转基因的存在。有趣地是，大多数最初的转化体看上去具有正常的表型，不像其他在双子叶植物中的报导，其中当海藻糖基因在双子叶植物中组成型表达时观察到多个表型变化/多效性效应。这也许是由于小麦中海藻糖生物合成基因的调控表达的原因。

实施例17-转基因小麦植物是盐胁迫耐受性的

对含有TPSP基因的转基因植物的盐耐受性进行分析。从转基因和非转基因植物中切取0.5cm长的叶段，并将其漂浮在不同浓度的氯化钠(200、400和800mM)溶液中，所述漂浮是将叶片的上表面与溶液接触并保持连续白光照射72小时。然后用蒸馏水漂洗所述叶段，并且通过使用研杵和研钵将其用1ml DMF进行研磨而用DMF(N，N’-二甲基甲酰胺)提取。将匀浆物和带有所述溶剂的洗涤液(1ml)以2,500rpm离心10分钟。然后将沉淀用0.5ml溶剂涡旋，并将汇集的上清液调整到3ml的终体积。用分光光度计测量叶片提取物在664nm和647nm的吸收值(A)。通过下列等式计算Chl-a、Chl-b和Chl-a+Chl-b浓度(μg/ml)：Chl-a＝12.00 A-664减去3.11 A-647，Chl-b＝20.78A-664减去4.88 A-647，和Chl-a+Chl-b＝17.67 A-647加7.12 A-664。

所述结果显示来自表达TPSP基因的植物的叶段显示出对氯化钠的耐受性，只有少的或不明显的漂白，而来自野生型的叶段显示出强烈的漂白。接下来，从没有盐处理的对照样品和氯化钠处理72小时后的样品中分离叶绿素。测定在缺少盐处理时植物中叶绿素的含量并设置为100。结果显示在非转基因对照植物中，叶绿素含量在400mM盐时减少大约15％和在800mM NaCl时减少大约25％。相反，在转基因系的情况中，盐胁迫后叶绿素含量与没有盐胁迫时几乎一样高。

实施例18-转基因小麦植物是水分胁迫耐受性的

在浸润叶样品后通过测量溶液的电解质导电率而对水分胁迫的耐受性进行检测。从植株上切下叶段。从两个非转基因植株中的每一个和4个转基因植株中的每一个上取双份样品(每份5mg)。将所述叶片样品放在置于9cm直径培养皿中的干滤纸上，并在层流罩超净台内干燥。6个小时后，将样品转移到含有2ml蒸馏水的不同试管中。将试管于60磅/英寸²以5分钟的间隔真空处理三次以除去粘附在叶表面的气泡。然后将所述试管置于倾斜位置于300rpm摇动2小时。摇动后，使用电导计(VWR International，West Chester，PA)测量溶液的电导率。

这些结果显示用于浸润来自非转基因植物的叶片的溶液的电导率是5,400μmho/mg叶片，而来自不同转基因系的则在3,100到3,700μmho/mg叶片。这些结果表明来自转基因植物的叶片较少受干燥的损害。换句话说，来自转基因植物的叶片更加能忍受水分胁迫。

尽管为了说明目的对本发明进行了详细描述，但是应理解这些细节只是说明性的，而本领域专业人员可以在其中作出改变而不背离由下面权利要求限定的本发明的精神和范围。

Claims (83)

1.用核酸转化的转基因单子叶植物，所述核酸编码在诱导型启动子控制下的用于海藻糖生物合成的酶，这可赋予所述植物对低温胁迫、盐胁迫或水分胁迫的耐受性。

2.权利要求1所述的转基因单子叶植物，其中所述单子叶植物选自水稻、小麦、玉米、大麦、燕麦、黑麦、粟和高粱。

3.权利要求2所述的转基因单子叶植物，其中所述单子叶植物是水稻植物。

4.权利要求2所述的转基因单子叶植物，其中所述单子叶植物是小麦植物。

5.权利要求1所述的转基因单子叶植物，其中所述用于海藻糖生物合成的酶是海藻糖-6-磷酸合酶。

6.权利要求5所述的转基因单子叶植物，其中所述海藻糖-6-磷酸合酶由大肠杆菌otsA基因编码。

7.权利要求1所述的转基因单子叶植物，其中所述用于海藻糖生物合成的酶是海藻糖-6-磷酸磷酸酶。

8.权利要求7所述的转基因单子叶植物，其中所述海藻糖-6-磷酸磷酸酶由大肠杆菌otsB基因编码。

9.权利要求1所述的转基因单子叶植物，其中所述转基因单子叶植物是另外用编码用于海藻糖生物合成的酶的第二核酸转化的。

10.权利要求1所述的转基因单子叶植物，其中所述转基因单子叶植物是用海藻糖-6-磷酸合酶/海藻糖-6-磷酸磷酸酶的融合基因转化的。

11.权利要求1所述的转基因单子叶植物，其中所述诱导型启动子是胁迫诱导型启动子或光诱导型启动子。

12.权利要求11所述的转基因单子叶植物，其中所述诱导型启动子是胁迫诱导型启动子和脱落酸诱导型启动子。

13.权利要求11所述的转基因单子叶植物，其中所述诱导型启动子是光诱导型RbcS启动子。

14.权利要求1所述的转基因单子叶植物，其中所述转基因单子叶植物包含编码选择标记的核酸。

15.由权利要求1所述的转基因单子叶植物产生的种子。

16.经萌发就能产生权利要求1所述的转基因单子叶植物的种子。

17.用核酸转化的单子叶植物细胞或原生质体，所述核酸编码在诱导型启动子控制下的用于海藻糖生物合成的酶，这可赋予从所述单子叶植物细胞或原生质体再生的单子叶植物对低温胁迫、盐胁迫或水分胁迫的耐受性。

18.权利要求17所述的单子叶植物细胞或原生质体，其中所述单子叶植物细胞或原生质体来源于选自水稻、小麦、玉米、大麦、燕麦、黑麦、粟和高粱的植物。

19.权利要求18所述的单子叶植物细胞或原生质体，其中所述单子叶植物细胞或原生质体来源于水稻植物。

20.权利要求18所述的单子叶植物细胞或原生质体，其中所述单子叶植物细胞或原生质体来源于小麦植物。

21.权利要求17所述的单子叶植物细胞或原生质体，其中所述用于海藻糖生物合成的酶是海藻糖-6-磷酸合酶。

22.权利要求21所述的单子叶植物细胞或原生质体，其中所述海藻糖-6-磷酸合酶由大肠杆菌otsA基因编码。

23.权利要求17所述的单子叶植物细胞或原生质体，其中所述用于海藻糖生物合成的酶是海藻糖-6-磷酸磷酸酶。

24.权利要求23所述的单子叶植物细胞或原生质体，其中所述海藻糖-6-磷酸磷酸酶由大肠杆菌otsB基因编码。

25.权利要求17所述的单子叶植物细胞或原生质体，其中所述单子叶植物细胞或原生质体是另外用编码用于海藻糖生物合成的酶的第二核酸转化的。

26.权利要求17所述的单子叶植物细胞或原生质体，其中所述单子叶植物细胞或原生质体是用海藻糖-6-磷酸合酶/海藻糖-6-磷酸磷酸酶融合基因转化的。

27.权利要求17所述的单子叶植物细胞或原生质体，其中所述诱导型启动子是胁迫诱导型启动子或光诱导型启动子。

28.权利要求27所述的单子叶植物细胞或原生质体，其中所述启动子是胁迫诱导型启动子和脱落酸诱导型启动子。

29.权利要求27所述的单子叶植物细胞或原生质体，其中所述启动子是光诱导型RbcS启动子。

30.权利要求17所述的单子叶植物细胞或原生质体，其中所述单子叶植物细胞或原生质体包含编码选择标记的核酸。

31.由权利要求17所述的单子叶植物细胞或原生质体再生的转基因单子叶植物。

32.权利要求31所述的转基因单子叶植物，其中所述转基因单子叶植物是水稻植物。

33.权利要求31所述的转基因单子叶植物，其中所述转基因单子叶植物是小麦植物。

34.由权利要求31所述的转基因单子叶植物产生的种子。

35.权利要求34所述的转基因单子叶植物产生的种子，其中所述转基因单子叶植物是水稻植物。

36.权利要求34所述的转基因单子叶植物产生的种子，其中所述转基因单子叶植物是小麦植物。

37.从权利要求25所述的单子叶植物细胞或原生质体再生的转基因单子叶植物。

38.权利要求37所述的转基因单子叶植物，其中所述转基因单子叶植物是水稻植物。

39.权利要求37所述的转基因单子叶植物，其中所述转基因单子叶植物是小麦植物。

40.由权利要求37所述的转基因单子叶植物产生的种子。

41.权利要求40所述的转基因单子叶植物产生的种子，其中所述转基因单子叶植物是水稻植物。

42.权利要求40所述的转基因单子叶植物产生的种子，其中所述转基因单子叶植物是小麦植物。

43.从权利要求26所述的单子叶植物细胞或原生质体再生的转基因单子叶植物。

44.权利要求43所述的转基因单子叶植物，其中所述转基因单子叶植物是水稻植物。

45.权利要求43所述的转基因单子叶植物，其中所述转基因单子叶植物是小麦植物。

46.由权利要求43所述的转基因单子叶植物产生的种子。

47.权利要求46所述的转基因单子叶植物产生的种子，其中所述转基因单子叶植物是水稻植物。

48.权利要求46所述的转基因单子叶植物产生的种子，其中所述转基因单子叶植物是小麦植物。

49.赋予单子叶植物对低温胁迫、水分胁迫或盐胁迫耐受性的方法，包括：

在有效地赋予从所述单子叶植物细胞或原生质体产生的单子叶植物对低温胁迫、盐胁迫或水分胁迫耐受性的条件下，用核酸转化单子叶植物细胞或原生质体，所述核酸编码用于海藻糖生物合成的酶。

50.权利要求49的方法，其中所述单子叶植物细胞或原生质体来源于选自水稻、小麦、玉米、大麦、燕麦、黑麦、粟和高粱的植物。

51.权利要求50的方法，其中所述单子叶植物细胞或原生质体来自水稻植物。

52.权利要求50的方法，其中所述单子叶植物细胞或原生质体来自小麦植物。

53.权利要求49的方法，其中所述用于海藻糖生物合成的酶是海藻糖-6-磷酸合酶。

54.权利要求53的方法，其中所述海藻糖-6-磷酸合酶由大肠杆菌otsA基因编码。

55.权利要求49的方法，其中所述用于海藻糖生物合成的酶是海藻糖-6-磷酸磷酸酶。

56.权利要求55的方法，其中所述海藻糖-6-磷酸磷酸酶由大肠杆菌otsB基因编码

57.权利要求49的方法，进一步包括：

用编码用于海藻糖生物合成的酶的第二核酸转化所述单子叶植物细胞或原生质体。

58.权利要求49的方法，其中用海藻糖-6-磷酸合酶/海藻糖-6-磷酸磷酸酶融合基因转化单子叶植物细胞或原生质体。

59.权利要求49的方法，其中所述转化包括：

在所述颗粒有效地穿入细胞内部的条件下将颗粒推入所述单子叶植物细胞中；和

将含有编码用于海藻糖生物合成的酶的核酸的质粒导入所述细胞内部。

60.权利要求59的方法，其中所述质粒与所述颗粒相连，由此所述质粒连同所述颗粒一起被运入所述细胞或原生质体内部。

61.权利要求49的方法，其中所述转化包括：

将所述单子叶植物的组织与农杆菌属的细菌接种物接触，其中用含有编码用于海藻糖生物合成的酶的核酸的质粒转化所述细菌。

62.权利要求49的方法，进一步包括：

再生所述转化的单子叶植物细胞或原生质体以产生转基因单子叶植物。

63.通过权利要求62的方法产生的转基因单子叶植物。

64.由权利要求63所述的转基因单子叶植物产生的种子。

65.增强单子叶植物对低温胁迫、盐胁迫或水分胁迫条件耐受性的方法，所述方法包括：

提高所述单子叶植物中用于海藻糖生物合成的酶的水平。

66.权利要求65的方法，其中所述单子叶植物选自水稻、小麦、玉米、大麦、燕麦、黑麦、粟和高粱。

67.权利要求66的方法，其中所述单子叶植物是水稻植物。

68.权利要求66的方法，其中所述单子叶植物是小麦植物。

69.权利要求65的方法，其中所述用于海藻糖生物合成的酶是海藻糖-6-磷酸合酶。

70.权利要求69的方法，其中所述海藻糖-6-磷酸合酶由大肠杆菌otsA基因编码。

71.权利要求65的方法，其中所述用于海藻糖生物合成的酶是海藻糖-6-磷酸磷酸酶。

72.权利要求71的方法，其中所述海藻糖-6-磷酸磷酸酶由大肠杆菌otsB基因编码。

73.用质粒转化的转基因单子叶植物，所述质粒赋予所述单子叶植物对低温胁迫、盐胁迫或水分胁迫的耐受性，所述质粒包含：

编码海藻糖-6-磷酸合酶的第一核酸；

第一诱导型启动子，所述启动子位于所述第一核酸的5’并且控制所述第一核酸的表达；和

位于所述第一核酸3’的第一终止序列。

74.权利要求73所述的转基因单子叶植物，其中所述质粒进一步包含：

编码海藻糖-6-磷酸磷酸酶的第二核酸，所述第二核酸位于控制所述第二核酸的表达的所述第一诱导型启动子的3’、所述第一核酸的3’和所述第一终止序列的5’。

75.权利要求74所述的转基因单子叶植物，其中所述第二核酸与所述第一核酸融合并且在所述第一诱导型启动子控制下共表达。

76.权利要求73所述的转基因单子叶植物，其中所述质粒进一步包含：

编码选择标记的第三核酸，所述第三核酸位于所述第一终止序列的3’；

第二启动子，其位于所述第三核酸的5’和所述第一终止序列的3’，所述第二启动子控制所述第三核酸的表达；和

第二终止序列，其位于所述第三核酸的3’。

77.权利要求73所述的转基因单子叶植物，其中所述诱导型启动子是胁迫诱导型启动子或光诱导型启动子。

78.权利要求77所述的转基因单子叶植物，其中所述启动子是胁迫诱导型或脱落酸诱导型启动子。

79.权利要求77所述的转基因单子叶植物，其中所述启动子是光诱导型RbcS启动子。

80.权利要求76所述的转基因单子叶植物，其中所述质粒称为pSB109-TPSP。

81.权利要求76所述的转基因单子叶植物，其中所述质粒称为pSB-RTSP。

82.权利要求80所述的转基因单子叶植物，其中所述诱导型启动子是胁迫诱导型和脱落酸诱导型启动子。

83.权利要求81所述的转基因单子叶植物，其中所述启动子是光诱导型RbcS启动子。

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