JP2001078603A - ｄｎａＫ遺伝子又はｈｓｐ７０遺伝子含有トランスジェニック植物 - Google Patents
ｄｎａＫ遺伝子又はｈｓｐ７０遺伝子含有トランスジェニック植物Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ストレス耐性が付与されたトランスジェニッ
ク植物又はその細胞を提供する。 【解決手段】 前記トランスジェニック植物又はその細
胞は、ＤｎａＫタンパク質又はＨＳＰ７０タンパク質
（特には、耐塩性ラン藻のＤｎａＫタンパク質）をコー
ドするＤＮＡを含む。
ク植物又はその細胞を提供する。 【解決手段】 前記トランスジェニック植物又はその細
胞は、ＤｎａＫタンパク質又はＨＳＰ７０タンパク質
（特には、耐塩性ラン藻のＤｎａＫタンパク質）をコー
ドするＤＮＡを含む。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ｄｎａＫ遺伝子又
はｈｓｐ７０遺伝子（特には、耐塩性ラン藻のｄｎａＫ
遺伝子）を含有するトランスジェニック植物（形質転換
植物）又はその細胞に関する。
はｈｓｐ７０遺伝子（特には、耐塩性ラン藻のｄｎａＫ
遺伝子）を含有するトランスジェニック植物（形質転換
植物）又はその細胞に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＤｎａＫタンパク質及びＨＳＰ７０タン
パク質は、分子シャペロンと呼ばれる一群のタンパク質
の１種である。分子シャペロンは、高温ストレスに伴っ
て、その発現が誘導されることから、別名、熱ショック
タンパク質（Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ；
ＨＳＰ）とも呼ばれている。分子シャペロンは、原核生
物から真核生物まで多くの生物種にわたって広くその存
在が認められており、例えば、（１）分子量約１５ｋＤ
ａ〜約３０ｋＤａの小ＨＳＰ（ｓｍａｌｌ ＨＳＰ）、
（２）分子量約６０ｋＤａのＨＳＰ６０タンパク質又は
ＧｒｏＥＬタンパク質（「ＨＳＰ６０」の名称は、真核
生物における名称であり、「ＧｒｏＥＬ」の名称は、原
核生物における名称である）、及び（３）分子量約７０
ｋＤａのＨＳＰ７０タンパク質又はＤｎａＫタンパク質
（「ＨＳＰ７０」の名称は、真核生物における名称であ
り、「ＤｎａＫ」の名称は、原核生物における名称であ
る）が知られている。
パク質は、分子シャペロンと呼ばれる一群のタンパク質
の１種である。分子シャペロンは、高温ストレスに伴っ
て、その発現が誘導されることから、別名、熱ショック
タンパク質（Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ；
ＨＳＰ）とも呼ばれている。分子シャペロンは、原核生
物から真核生物まで多くの生物種にわたって広くその存
在が認められており、例えば、（１）分子量約１５ｋＤ
ａ〜約３０ｋＤａの小ＨＳＰ（ｓｍａｌｌ ＨＳＰ）、
（２）分子量約６０ｋＤａのＨＳＰ６０タンパク質又は
ＧｒｏＥＬタンパク質（「ＨＳＰ６０」の名称は、真核
生物における名称であり、「ＧｒｏＥＬ」の名称は、原
核生物における名称である）、及び（３）分子量約７０
ｋＤａのＨＳＰ７０タンパク質又はＤｎａＫタンパク質
（「ＨＳＰ７０」の名称は、真核生物における名称であ
り、「ＤｎａＫ」の名称は、原核生物における名称であ
る）が知られている。
【０００３】分子シャペロンの機能に関しては、高温耐
性との関連性が指摘されているものの、現在も研究途上
にあり、未だ多くは解明されていない。例えば、タバコ
において、アンチセンス法によりＨＳＰ６０タンパク質
の発現を抑制すると、異常な表現型を示すことが知られ
ており［Ｐｌａｎｔ Ｊ．，６，４２５−４３２（１９
９４）］、また、シロイヌナズナにおいて、アンチセン
ス法によりＨＳＰ７０タンパク質の発現を抑制すると、
異常な表現型を示すことが知られている［Ｍｏｌ．Ｇｅ
ｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２５２，１１−１９（１９９
６）］。また、シロイヌナズナにおいて、熱ショック遺
伝子の転写を制御する遺伝子を抑制することにより、Ｈ
ＳＰ７０タンパク質の発現量が増加し、シロイヌナズナ
が高温耐性を獲得したことが知られている［Ｐｌａｎｔ
Ｊ．，８，６０３−６１２（１９９５）］。更には、
クリの木（ｃｈｅｓｔｎｕｔ）由来の分子量約１５ｋＤ
ａ〜約３０ｋＤａの小ＨＳＰをコードする遺伝子を大腸
菌に導入し、前記タンパク質を大腸菌中で発現させる
と、大腸菌が高温耐性を獲得したことが知られている
［Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１２０，５２１−５
２８（１９９９）］。
性との関連性が指摘されているものの、現在も研究途上
にあり、未だ多くは解明されていない。例えば、タバコ
において、アンチセンス法によりＨＳＰ６０タンパク質
の発現を抑制すると、異常な表現型を示すことが知られ
ており［Ｐｌａｎｔ Ｊ．，６，４２５−４３２（１９
９４）］、また、シロイヌナズナにおいて、アンチセン
ス法によりＨＳＰ７０タンパク質の発現を抑制すると、
異常な表現型を示すことが知られている［Ｍｏｌ．Ｇｅ
ｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２５２，１１−１９（１９９
６）］。また、シロイヌナズナにおいて、熱ショック遺
伝子の転写を制御する遺伝子を抑制することにより、Ｈ
ＳＰ７０タンパク質の発現量が増加し、シロイヌナズナ
が高温耐性を獲得したことが知られている［Ｐｌａｎｔ
Ｊ．，８，６０３−６１２（１９９５）］。更には、
クリの木（ｃｈｅｓｔｎｕｔ）由来の分子量約１５ｋＤ
ａ〜約３０ｋＤａの小ＨＳＰをコードする遺伝子を大腸
菌に導入し、前記タンパク質を大腸菌中で発現させる
と、大腸菌が高温耐性を獲得したことが知られている
［Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１２０，５２１−５
２８（１９９９）］。
【０００４】このように、植物における分子シャペロン
と高温耐性との関連性については、若干の報告があるも
のの、高温耐性以外の環境ストレス（例えば、高塩、乾
燥、又は強光）耐性と、分子シャペロンとの関連性につ
いては、これまで全く知られていなかった。
と高温耐性との関連性については、若干の報告があるも
のの、高温耐性以外の環境ストレス（例えば、高塩、乾
燥、又は強光）耐性と、分子シャペロンとの関連性につ
いては、これまで全く知られていなかった。
【０００５】一方、本発明者の一部及びその共同研究者
は、ｄｎａＫ遺伝子の１つを、高塩耐性ラン藻であるア
ファノテセ・ハロフィチカ（Ａｐｈａｎｏｔｈｅｃｅ
ｈａｌｏｐｈｙｔｉｃａ）から単離し、その塩基配列を
既に決定している［Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，
３５，７６３−７７５（１９９７）；ＤＤＢＪ，ＥＭＢ
Ｌ，ａｎｄ ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅｓ ｕｎｄｅｒ
ｔｈｅ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒＤ８４４２
１］。前記ラン藻は、ＮａＣｌ濃度が０．２５Ｍ〜３Ｍ
の高塩条件下で生育可能である。また、アファノテセ・
ハロフィチカのＤｎａＫタンパク質は、他の生物［大腸
菌及び淡水性ラン藻（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓ
ｐ．ＰＣＣ７９４２）］のＤｎａＫタンパク質と異な
り、高塩濃度においても、他のタンパク質が正しくアッ
センブリーするのを介在する活性を有することが知られ
ている［Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４０，４０
９−４１８（１９９９）］。
は、ｄｎａＫ遺伝子の１つを、高塩耐性ラン藻であるア
ファノテセ・ハロフィチカ（Ａｐｈａｎｏｔｈｅｃｅ
ｈａｌｏｐｈｙｔｉｃａ）から単離し、その塩基配列を
既に決定している［Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，
３５，７６３−７７５（１９９７）；ＤＤＢＪ，ＥＭＢ
Ｌ，ａｎｄ ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅｓ ｕｎｄｅｒ
ｔｈｅ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒＤ８４４２
１］。前記ラン藻は、ＮａＣｌ濃度が０．２５Ｍ〜３Ｍ
の高塩条件下で生育可能である。また、アファノテセ・
ハロフィチカのＤｎａＫタンパク質は、他の生物［大腸
菌及び淡水性ラン藻（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓ
ｐ．ＰＣＣ７９４２）］のＤｎａＫタンパク質と異な
り、高塩濃度においても、他のタンパク質が正しくアッ
センブリーするのを介在する活性を有することが知られ
ている［Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４０，４０
９−４１８（１９９９）］。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明者は、分子シャ
ペロンの１つである前記アファノテセ・ハロフィチカＤ
ｎａＫタンパク質をコードする遺伝子を、タバコ、シ
バ、及びイネに導入したところ、驚くべきことに、スト
レス耐性を付与させることができることを見出した。本
発明の課題は、ストレス耐性が付与されたトランスジェ
ニック植物（例えば、ストレス耐性が新たに付与された
トランスジェニック植物、あるいは、ストレス耐性を向
上させたトランスジェニック植物）又はその細胞を提供
することにある。
ペロンの１つである前記アファノテセ・ハロフィチカＤ
ｎａＫタンパク質をコードする遺伝子を、タバコ、シ
バ、及びイネに導入したところ、驚くべきことに、スト
レス耐性を付与させることができることを見出した。本
発明の課題は、ストレス耐性が付与されたトランスジェ
ニック植物（例えば、ストレス耐性が新たに付与された
トランスジェニック植物、あるいは、ストレス耐性を向
上させたトランスジェニック植物）又はその細胞を提供
することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】前記課題は、本発明によ
る、ＤｎａＫタンパク質又はＨＳＰ７０タンパク質（特
には、耐塩性ラン藻のＤｎａＫタンパク質）をコードす
るＤＮＡを含む、ストレス耐性が付与されたトランスジ
ェニック植物により解決することができる。また、本発
明は、ＤｎａＫタンパク質又はＨＳＰ７０タンパク質
（特には、耐塩性ラン藻のＤｎａＫタンパク質）をコー
ドするＤＮＡを含む、トランスジェニック植物細胞に関
する。
る、ＤｎａＫタンパク質又はＨＳＰ７０タンパク質（特
には、耐塩性ラン藻のＤｎａＫタンパク質）をコードす
るＤＮＡを含む、ストレス耐性が付与されたトランスジ
ェニック植物により解決することができる。また、本発
明は、ＤｎａＫタンパク質又はＨＳＰ７０タンパク質
（特には、耐塩性ラン藻のＤｎａＫタンパク質）をコー
ドするＤＮＡを含む、トランスジェニック植物細胞に関
する。
【０００８】本明細書において、「植物」とは、生物を
微生物、植物、及び動物の３つに分類した場合の前記植
物を意味し、植物体（すなわち、植物全体）及びその一
部（例えば、花、葉、茎、根、若しくは種子、又は組
織）が含まれる。また、「植物細胞」には、例えば、分
化していない植物の細胞又は分化していない植物の組織
培養物、あるいは、プロトプラスト、カルス（細胞集
塊）、不定胚、又は不定芽が含まれる。
微生物、植物、及び動物の３つに分類した場合の前記植
物を意味し、植物体（すなわち、植物全体）及びその一
部（例えば、花、葉、茎、根、若しくは種子、又は組
織）が含まれる。また、「植物細胞」には、例えば、分
化していない植物の細胞又は分化していない植物の組織
培養物、あるいは、プロトプラスト、カルス（細胞集
塊）、不定胚、又は不定芽が含まれる。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明によるトランスジェニック
植物又はその植物細胞は、ＤｎａＫタンパク質又はＨＳ
Ｐ７０タンパク質（特には、耐塩性ラン藻のＤｎａＫタ
ンパク質）をコードするＤＮＡを含む。本発明によるト
ランスジェニック植物は、このようなＤＮＡを含むの
で、ストレス耐性が付与される。本明細書において、前
記「ストレス耐性」には、例えば、耐塩性（高塩耐性を
含む）、高温耐性、又は乾燥耐性が含まれる。
植物又はその植物細胞は、ＤｎａＫタンパク質又はＨＳ
Ｐ７０タンパク質（特には、耐塩性ラン藻のＤｎａＫタ
ンパク質）をコードするＤＮＡを含む。本発明によるト
ランスジェニック植物は、このようなＤＮＡを含むの
で、ストレス耐性が付与される。本明細書において、前
記「ストレス耐性」には、例えば、耐塩性（高塩耐性を
含む）、高温耐性、又は乾燥耐性が含まれる。
【００１０】本発明においては、「ＤｎａＫタンパク
質」として、原核生物のＤｎａＫタンパク質を用いるこ
とができ、例えば、ラン藻又はバクテリアのＤｎａＫタ
ンパク質を挙げることができる。また、「ＨＳＰ７０タ
ンパク質」として、真核生物のＨＳＰ７０タンパク質を
用いることができ、例えば、動物、植物、又は真菌（例
えば、カビ、酵母、又はキノコなど）のＨＳＰ７０タン
パク質を用いることができる。なお、本明細書におい
て、「ＤｎａＫタンパク質」又は「ＨＳＰ７０タンパク
質」には、天然体のＤｎａＫタンパク質又はＨＳＰ７０
タンパク質が含まれることは勿論のこと、変異体、遺伝
子工学的に得られるリコンビナントタンパク質、あるい
は、アミノ酸配列が、ＤｎａＫタンパク質又はＨＳＰ７
０タンパク質のアミノ酸配列において１又はそれ以上
（好ましくは１又は数個）のアミノ酸が欠失、置換、又
は付加されたアミノ酸配列であるタンパク質も含まれ
る。
質」として、原核生物のＤｎａＫタンパク質を用いるこ
とができ、例えば、ラン藻又はバクテリアのＤｎａＫタ
ンパク質を挙げることができる。また、「ＨＳＰ７０タ
ンパク質」として、真核生物のＨＳＰ７０タンパク質を
用いることができ、例えば、動物、植物、又は真菌（例
えば、カビ、酵母、又はキノコなど）のＨＳＰ７０タン
パク質を用いることができる。なお、本明細書におい
て、「ＤｎａＫタンパク質」又は「ＨＳＰ７０タンパク
質」には、天然体のＤｎａＫタンパク質又はＨＳＰ７０
タンパク質が含まれることは勿論のこと、変異体、遺伝
子工学的に得られるリコンビナントタンパク質、あるい
は、アミノ酸配列が、ＤｎａＫタンパク質又はＨＳＰ７
０タンパク質のアミノ酸配列において１又はそれ以上
（好ましくは１又は数個）のアミノ酸が欠失、置換、又
は付加されたアミノ酸配列であるタンパク質も含まれ
る。
【００１１】前記耐塩性ラン藻としては、耐塩性を有す
るラン藻である限り、特に限定されるものではないが、
例えば、ＮａＣｌ濃度が０．２５Ｍ〜３Ｍの条件下での
生育可能な高塩耐性ラン藻、例えば、アファノテセ・ハ
ロフィチカを挙げることができる。耐塩性ラン藻の１種
であるアファノテセ・ハロフィチカのＤｎａＫタンパク
質は、全体として７２１個のアミノ酸残基からなり、耐
塩性ラン藻以外の原核生物（例えば、大腸菌又は淡水性
ラン藻）のＤｎａＫタンパク質、あるいは、真核生物の
ＨＳＰ７０タンパク質と異なり、カルボキシル基末端
（Ｃ末端）に約１００個のアミノ酸残基からなる余分の
アミノ酸配列を有する。アファノテセ・ハロフィチカの
ＤｎａＫタンパク質は、高塩濃度においても、他のタン
パク質が正しくアッセンブリーするのを介在する活性を
有する。
るラン藻である限り、特に限定されるものではないが、
例えば、ＮａＣｌ濃度が０．２５Ｍ〜３Ｍの条件下での
生育可能な高塩耐性ラン藻、例えば、アファノテセ・ハ
ロフィチカを挙げることができる。耐塩性ラン藻の１種
であるアファノテセ・ハロフィチカのＤｎａＫタンパク
質は、全体として７２１個のアミノ酸残基からなり、耐
塩性ラン藻以外の原核生物（例えば、大腸菌又は淡水性
ラン藻）のＤｎａＫタンパク質、あるいは、真核生物の
ＨＳＰ７０タンパク質と異なり、カルボキシル基末端
（Ｃ末端）に約１００個のアミノ酸残基からなる余分の
アミノ酸配列を有する。アファノテセ・ハロフィチカの
ＤｎａＫタンパク質は、高塩濃度においても、他のタン
パク質が正しくアッセンブリーするのを介在する活性を
有する。
【００１２】本発明のトランスジェニック植物は、これ
に限定されるものではないが、例えば、ＤｎａＫタンパ
ク質又はＨＳＰ７０タンパク質（特には、耐塩性ラン藻
のＤｎａＫタンパク質）をコードするＤＮＡを、それ自
体公知の方法により、植物細胞のゲノムに導入し、得ら
れたトランスジェニック植物細胞を再生することによっ
て、得ることができる。
に限定されるものではないが、例えば、ＤｎａＫタンパ
ク質又はＨＳＰ７０タンパク質（特には、耐塩性ラン藻
のＤｎａＫタンパク質）をコードするＤＮＡを、それ自
体公知の方法により、植物細胞のゲノムに導入し、得ら
れたトランスジェニック植物細胞を再生することによっ
て、得ることができる。
【００１３】また、本発明のトランスジェニック植物細
胞は、これに限定されるものではないが、例えば、Ｄｎ
ａＫタンパク質又はＨＳＰ７０タンパク質（特には、耐
塩性ラン藻のＤｎａＫタンパク質）をコードするＤＮＡ
を、それ自体公知の方法により、植物細胞のゲノムに導
入することによって、得ることができる。
胞は、これに限定されるものではないが、例えば、Ｄｎ
ａＫタンパク質又はＨＳＰ７０タンパク質（特には、耐
塩性ラン藻のＤｎａＫタンパク質）をコードするＤＮＡ
を、それ自体公知の方法により、植物細胞のゲノムに導
入することによって、得ることができる。
【００１４】ＤｎａＫタンパク質又はＨＳＰ７０タンパ
ク質をコードするＤＮＡを植物細胞のゲノムに導入する
際には、ＤｎａＫタンパク質又はＨＳＰ７０タンパク質
をコードするＤＮＡを、適当なベクターに挿入すること
によって、前記ＤＮＡを含むベクターを構築し、このベ
クターを用いて植物細胞を形質転換することが好まし
い。
ク質をコードするＤＮＡを植物細胞のゲノムに導入する
際には、ＤｎａＫタンパク質又はＨＳＰ７０タンパク質
をコードするＤＮＡを、適当なベクターに挿入すること
によって、前記ＤＮＡを含むベクターを構築し、このベ
クターを用いて植物細胞を形質転換することが好まし
い。
【００１５】本発明に用いることのできる植物として
は、ＤｎａＫタンパク質又はＨＳＰ７０タンパク質（特
には、耐塩性ラン藻のＤｎａＫタンパク質）をコードす
るＤＮＡを挿入することによって、ストレス耐性（例え
ば、耐塩性）を導入することができる植物である限り、
特に限定されるものではなく、本来、ストレス耐性（例
えば、耐塩性）を有しない植物であることもできるし、
あるいは、本来、ストレス耐性（例えば、耐塩性）を有
する植物であることもできる。
は、ＤｎａＫタンパク質又はＨＳＰ７０タンパク質（特
には、耐塩性ラン藻のＤｎａＫタンパク質）をコードす
るＤＮＡを挿入することによって、ストレス耐性（例え
ば、耐塩性）を導入することができる植物である限り、
特に限定されるものではなく、本来、ストレス耐性（例
えば、耐塩性）を有しない植物であることもできるし、
あるいは、本来、ストレス耐性（例えば、耐塩性）を有
する植物であることもできる。
【００１６】例えば、本来、ストレス耐性を有しない植
物に本発明方法を適用した場合には、その植物にストレ
ス耐性を新たに導入することができる。また、本来、ス
トレス耐性を有する植物（特には、そのストレス耐性が
それほど高くない植物）の場合には、本発明方法によ
り、そのストレス耐性を向上させることができる。例え
ば、タバコは、本来、ＨＳＰ７０タンパク質を有してい
るので、本来、多少の耐塩性を有する植物である。タバ
コに、例えば、耐塩性ラン藻のＤｎａＫタンパク質を導
入すると、タバコ由来のＨＳＰ７０タンパク質の効果に
加えて、耐塩性ラン藻由来のＤｎａＫタンパク質の効果
が働くことによって、耐塩性がより向上する。また、耐
塩性ラン藻由来のｄｎａＫ遺伝子のプロモーターとして
構成的プロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウ
イルスの３５Ｓプロモーター）を用いた場合には、耐塩
性ラン藻由来のＤｎａＫタンパク質が常時、細胞内で発
現されているので、ストレスがかかったときに、タバコ
由来のＨＳＰ７０タンパク質が発現されるまでの間も、
耐塩性ラン藻由来のＤｎａＫタンパク質が細胞を守るこ
とが可能である。
物に本発明方法を適用した場合には、その植物にストレ
ス耐性を新たに導入することができる。また、本来、ス
トレス耐性を有する植物（特には、そのストレス耐性が
それほど高くない植物）の場合には、本発明方法によ
り、そのストレス耐性を向上させることができる。例え
ば、タバコは、本来、ＨＳＰ７０タンパク質を有してい
るので、本来、多少の耐塩性を有する植物である。タバ
コに、例えば、耐塩性ラン藻のＤｎａＫタンパク質を導
入すると、タバコ由来のＨＳＰ７０タンパク質の効果に
加えて、耐塩性ラン藻由来のＤｎａＫタンパク質の効果
が働くことによって、耐塩性がより向上する。また、耐
塩性ラン藻由来のｄｎａＫ遺伝子のプロモーターとして
構成的プロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウ
イルスの３５Ｓプロモーター）を用いた場合には、耐塩
性ラン藻由来のＤｎａＫタンパク質が常時、細胞内で発
現されているので、ストレスがかかったときに、タバコ
由来のＨＳＰ７０タンパク質が発現されるまでの間も、
耐塩性ラン藻由来のＤｎａＫタンパク質が細胞を守るこ
とが可能である。
【００１７】本発明トランスジェニック植物における前
記植物としては、双子葉植物又は単子葉植物のいずれで
あることもでき、例えば、草本性植物としては、例え
ば、穀類植物、芝草類、又は野菜類を挙げることがで
き、木本性植物としては、例えば、常緑広葉樹、落葉広
葉樹、又は果樹類を挙げることができる。
記植物としては、双子葉植物又は単子葉植物のいずれで
あることもでき、例えば、草本性植物としては、例え
ば、穀類植物、芝草類、又は野菜類を挙げることがで
き、木本性植物としては、例えば、常緑広葉樹、落葉広
葉樹、又は果樹類を挙げることができる。
【００１８】前記芝草類としては、例えば、イネ科芝草
［例えば、スズメガヤ亜科（例えば、シバ類又はバーミ
ューダーグラス類）、ウシノケグサ亜科（例えば、ベン
トグラス類、ブルーグラス類、フェスク類、又はライグ
ラス類）、又はキビ亜科］、カヤツリグサ科芝草、キク
科芝草、又はマメ科芝草を挙げることができる。前記穀
類植物としては、例えば、イネ科植物、例えば、イネ、
ライムギ、オオムギ、コムギ、キビ、モロコシ、サトウ
キビ、トウモロコシ・ポップコーン、又はハトムギを挙
げることができる。前記野菜類としては、例えば、ナス
科植物（例えば、タバコ、ナス、ジャガイモ、トマト、
若しくはトウガラシ）又はゴマ科植物（例えば、ゴマ）
を挙げることができる。
［例えば、スズメガヤ亜科（例えば、シバ類又はバーミ
ューダーグラス類）、ウシノケグサ亜科（例えば、ベン
トグラス類、ブルーグラス類、フェスク類、又はライグ
ラス類）、又はキビ亜科］、カヤツリグサ科芝草、キク
科芝草、又はマメ科芝草を挙げることができる。前記穀
類植物としては、例えば、イネ科植物、例えば、イネ、
ライムギ、オオムギ、コムギ、キビ、モロコシ、サトウ
キビ、トウモロコシ・ポップコーン、又はハトムギを挙
げることができる。前記野菜類としては、例えば、ナス
科植物（例えば、タバコ、ナス、ジャガイモ、トマト、
若しくはトウガラシ）又はゴマ科植物（例えば、ゴマ）
を挙げることができる。
【００１９】前記常緑広葉樹としては、例えば、ユーカ
リ、アカシア、又はコーヒーを挙げることができる。前
記落葉広葉樹としては、例えば、ポプラ、クヌギ、ヤナ
ギ、シラカバ、又はコナラを挙げることができる。前記
果樹類としては、例えば、ミカン、オレンジ、モモ、ス
モモ、ブドウ、カキ、又はパパイヤを挙げることができ
る。
リ、アカシア、又はコーヒーを挙げることができる。前
記落葉広葉樹としては、例えば、ポプラ、クヌギ、ヤナ
ギ、シラカバ、又はコナラを挙げることができる。前記
果樹類としては、例えば、ミカン、オレンジ、モモ、ス
モモ、ブドウ、カキ、又はパパイヤを挙げることができ
る。
【００２０】本発明においては、ＤｎａＫタンパク質又
はＨＳＰ７０タンパク質をコードするＤＮＡを挿入する
前記ベクターとして、植物の形質転換に用いることので
きる公知の種々のベクターを用いることができ、例え
ば、バイナリーベクターｐＢＩ１２１を挙げることがで
きる。
はＨＳＰ７０タンパク質をコードするＤＮＡを挿入する
前記ベクターとして、植物の形質転換に用いることので
きる公知の種々のベクターを用いることができ、例え
ば、バイナリーベクターｐＢＩ１２１を挙げることがで
きる。
【００２１】本発明において、前記ベクターに、Ｄｎａ
Ｋタンパク質又はＨＳＰ７０タンパク質をコードするＤ
ＮＡを挿入する場合には、ＤｎａＫタンパク質又はＨＳ
Ｐ７０タンパク質がそれ単独で発現するように、前記Ｄ
ＮＡを単独で挿入することもできるし、あるいは、Ｄｎ
ａＫタンパク質又はＨＳＰ７０タンパク質と融合用パー
トナーとの融合タンパク質として発現するように、前記
ＤＮＡ（すなわち、ＤｎａＫタンパク質又はＨＳＰ７０
タンパク質をコードするＤＮＡ）と融合用パートナーを
コードするＤＮＡとを連結した形で挿入することもでき
る。
Ｋタンパク質又はＨＳＰ７０タンパク質をコードするＤ
ＮＡを挿入する場合には、ＤｎａＫタンパク質又はＨＳ
Ｐ７０タンパク質がそれ単独で発現するように、前記Ｄ
ＮＡを単独で挿入することもできるし、あるいは、Ｄｎ
ａＫタンパク質又はＨＳＰ７０タンパク質と融合用パー
トナーとの融合タンパク質として発現するように、前記
ＤＮＡ（すなわち、ＤｎａＫタンパク質又はＨＳＰ７０
タンパク質をコードするＤＮＡ）と融合用パートナーを
コードするＤＮＡとを連結した形で挿入することもでき
る。
【００２２】前記融合用パートナーとしては、例えば、
精製用タンパク質［例えば、グルタチオンＳ−トランス
フェラーゼ（ＧＳＴ）の全部又は一部］、検出用タンパ
ク質［例えば、β−ガラクトシダーゼαペプチド（Ｌａ
ｃＺ α）の全部又は一部］、又は発現用タンパク質
（例えば、シグナル配列）を用いることができる。
精製用タンパク質［例えば、グルタチオンＳ−トランス
フェラーゼ（ＧＳＴ）の全部又は一部］、検出用タンパ
ク質［例えば、β−ガラクトシダーゼαペプチド（Ｌａ
ｃＺ α）の全部又は一部］、又は発現用タンパク質
（例えば、シグナル配列）を用いることができる。
【００２３】本発明においては、前記ベクターに、Ｄｎ
ａＫタンパク質又はＨＳＰ７０タンパク質をコードする
ＤＮＡに加えて、前記ＤＮＡの上流及び下流に、それぞ
れ、対象とする植物細胞内で機能するプロモーター及び
ターミネーターを挿入することが好ましく、また、形質
転換体を得る際に有効な選択マーカーとして適当なＤＮ
Ａを挿入することができる。
ａＫタンパク質又はＨＳＰ７０タンパク質をコードする
ＤＮＡに加えて、前記ＤＮＡの上流及び下流に、それぞ
れ、対象とする植物細胞内で機能するプロモーター及び
ターミネーターを挿入することが好ましく、また、形質
転換体を得る際に有効な選択マーカーとして適当なＤＮ
Ａを挿入することができる。
【００２４】前記プロモーターとしては、例えば、カリ
フラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターを挙げ
ることができる。前記ターミネーターとしては、例え
ば、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）由来のターミネーター
を挙げることができる。前記選択マーカーとしては、例
えば、カナマイシン耐性遺伝子（ＮＰＴII）を挙げるこ
とができる。
フラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターを挙げ
ることができる。前記ターミネーターとしては、例え
ば、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）由来のターミネーター
を挙げることができる。前記選択マーカーとしては、例
えば、カナマイシン耐性遺伝子（ＮＰＴII）を挙げるこ
とができる。
【００２５】本発明においては、植物の形質転換法とし
て、それ自体公知の方法、例えば、目的の遺伝子を含む
ベクターを有するアグロバクテリウムを、植物組織に感
染させる方法、ポリエチレングリコール処理法、プロト
プラストに電気パルス処理して前記ベクターを導入する
エレクトロポレーション法、あるいは、金粒子に前記ベ
クターを乗せて植物組織に導入するパーティクルガン法
を用いることができる。前記方法により形質転換された
植物細胞を、適当な培地［例えば、ムラシゲ・スクーグ
（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ）培地；Ｐ
ｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１５，４７３−４９７
（１９６２）］で培養し、再生することにより、形質転
換植物を得ることができる。この際、選択マーカーに対
応する適当な抗生物質（例えば、カナマイシン）を培地
に加えておくと、形質転換体を選択することができる。
て、それ自体公知の方法、例えば、目的の遺伝子を含む
ベクターを有するアグロバクテリウムを、植物組織に感
染させる方法、ポリエチレングリコール処理法、プロト
プラストに電気パルス処理して前記ベクターを導入する
エレクトロポレーション法、あるいは、金粒子に前記ベ
クターを乗せて植物組織に導入するパーティクルガン法
を用いることができる。前記方法により形質転換された
植物細胞を、適当な培地［例えば、ムラシゲ・スクーグ
（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ）培地；Ｐ
ｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１５，４７３−４９７
（１９６２）］で培養し、再生することにより、形質転
換植物を得ることができる。この際、選択マーカーに対
応する適当な抗生物質（例えば、カナマイシン）を培地
に加えておくと、形質転換体を選択することができる。
【００２６】例えば、イネ科芝草（例えば、ノシバ又は
ベントグラス）に、ＤｎａＫタンパク質又はＨＳＰ７０
タンパク質をコードするＤＮＡを導入する場合には、例
えば、以下に示す手順により実施することができる。
ベントグラス）に、ＤｎａＫタンパク質又はＨＳＰ７０
タンパク質をコードするＤＮＡを導入する場合には、例
えば、以下に示す手順により実施することができる。
【００２７】前記ポリエチレングリコール処理による導
入は、例えば、以下のようにして行うことができる。１
〜１００μｇ／ｍｌのベクターと、１０5〜１０6個／ｍ
ｌのプロトプラストとを、浸透圧調節剤として０．４〜
０．６Ｍのマンニトール等を含むバッファー等の液体媒
体中に懸濁する。これにポリエチレングリコール溶液を
最終濃度１０〜３０％になるように加え、室温で５〜３
０分間放置した後、ポリエチレングリコールを希釈する
ことにより、遺伝子をプロトプラスト中に導入する。
入は、例えば、以下のようにして行うことができる。１
〜１００μｇ／ｍｌのベクターと、１０5〜１０6個／ｍ
ｌのプロトプラストとを、浸透圧調節剤として０．４〜
０．６Ｍのマンニトール等を含むバッファー等の液体媒
体中に懸濁する。これにポリエチレングリコール溶液を
最終濃度１０〜３０％になるように加え、室温で５〜３
０分間放置した後、ポリエチレングリコールを希釈する
ことにより、遺伝子をプロトプラスト中に導入する。
【００２８】前記エレクトロポレーション法による導入
は、例えば、以下のようにして行うことができる。１〜
１００μｇ／ｍｌのベクターと、１０5〜１０6個／ｍｌ
のプロトプラストとを、浸透圧調節剤として０．４〜
０．６Ｍのマンニトール等を含むバッファー等の液体媒
体中に懸濁する。これに電界強度３００〜６００Ｖ／ｃ
ｍ時定数１０〜５０ｍｓからなる電気パルスを印加して
電気的刺激を加え、遺伝子をプロトプラスト中に導入す
る。
は、例えば、以下のようにして行うことができる。１〜
１００μｇ／ｍｌのベクターと、１０5〜１０6個／ｍｌ
のプロトプラストとを、浸透圧調節剤として０．４〜
０．６Ｍのマンニトール等を含むバッファー等の液体媒
体中に懸濁する。これに電界強度３００〜６００Ｖ／ｃ
ｍ時定数１０〜５０ｍｓからなる電気パルスを印加して
電気的刺激を加え、遺伝子をプロトプラスト中に導入す
る。
【００２９】前記パーティクルガン法による導入は、例
えば、以下のようにして行うことができる。細胞集塊
（０．３〜０．５ｍｌ程度）を、ろ紙(ワットマンＮ
ｏ．４；直径＝７ｃｍ）上に均一に展開・吸着させ、ベ
クターを塩化カルシウムとスペルミジンとを用いて吸着
させた直径０．１〜５μｍの金属粒子を、パーティクル
ガンを用いて８００〜１５００ＰＳＩの空気圧あるいは
火薬の爆発時の圧力により打ち込み導入する。金属粒子
には、タングステン又は金などを用いることができる。
えば、以下のようにして行うことができる。細胞集塊
（０．３〜０．５ｍｌ程度）を、ろ紙(ワットマンＮ
ｏ．４；直径＝７ｃｍ）上に均一に展開・吸着させ、ベ
クターを塩化カルシウムとスペルミジンとを用いて吸着
させた直径０．１〜５μｍの金属粒子を、パーティクル
ガンを用いて８００〜１５００ＰＳＩの空気圧あるいは
火薬の爆発時の圧力により打ち込み導入する。金属粒子
には、タングステン又は金などを用いることができる。
【００３０】遺伝子導入処理後のプロトプラストは、植
物の組織培養培地、例えば、Ｎ６培地、Ｒ２培地、Ｋ８
ｐ培地、又はＡＡ培地等に植物生育調節物質、例えば、
２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、ナフタレン酢酸等の
オーキシン類及びカイネチン等のサイトカイニン類を添
加した液体又は固形培地により培養する。培養は暗所で
行い、温度としては２０〜３０℃が好ましい。前記培養
により、遺伝子が導入されたプロトプラストから細胞集
塊が形成される。
物の組織培養培地、例えば、Ｎ６培地、Ｒ２培地、Ｋ８
ｐ培地、又はＡＡ培地等に植物生育調節物質、例えば、
２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、ナフタレン酢酸等の
オーキシン類及びカイネチン等のサイトカイニン類を添
加した液体又は固形培地により培養する。培養は暗所で
行い、温度としては２０〜３０℃が好ましい。前記培養
により、遺伝子が導入されたプロトプラストから細胞集
塊が形成される。
【００３１】遺伝子導入処理後の脱分化状態の細胞集塊
を、植物の組織培養培地、例えば、Ｎ６培地、Ｒ２培
地、Ｋ８ｐ培地、又はＡＡ培地等に植物生育調節物質、
例えば、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、ナフタレン
酢酸等のオーキシン類及びカイネチン等のサイトカイニ
ン類を添加した液体又は固形培地により培養する。培養
は暗所で行い、温度としては２０〜３０℃が好ましい。
更に、１４〜４０日間隔で新鮮培地に継代し、培養を継
続する。培養は明所で行うのが好適である。培養開始２
４〜４８日で不定胚又は不定芽が得られる。
を、植物の組織培養培地、例えば、Ｎ６培地、Ｒ２培
地、Ｋ８ｐ培地、又はＡＡ培地等に植物生育調節物質、
例えば、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、ナフタレン
酢酸等のオーキシン類及びカイネチン等のサイトカイニ
ン類を添加した液体又は固形培地により培養する。培養
は暗所で行い、温度としては２０〜３０℃が好ましい。
更に、１４〜４０日間隔で新鮮培地に継代し、培養を継
続する。培養は明所で行うのが好適である。培養開始２
４〜４８日で不定胚又は不定芽が得られる。
【００３２】前記不定胚又は不定芽を、植物体再生培
地、例えば、Ｎ６培地、Ｒ２培地、ＭＳ培地、又はＬＳ
培地等に植物生育調節物質、例えば、２，４−ジクロロ
フェノキシ酢酸、ナフタレン酢酸等のオーキシン類及び
カイネチン等のサイトカイニン類を添加した培地により
培養する。１４〜４０日間隔で新鮮培地に継代し、培養
を継続する。培養は明所で行うのが好適である。培養開
始２４〜４８日で形質転換植物体が得られる。
地、例えば、Ｎ６培地、Ｒ２培地、ＭＳ培地、又はＬＳ
培地等に植物生育調節物質、例えば、２，４−ジクロロ
フェノキシ酢酸、ナフタレン酢酸等のオーキシン類及び
カイネチン等のサイトカイニン類を添加した培地により
培養する。１４〜４０日間隔で新鮮培地に継代し、培養
を継続する。培養は明所で行うのが好適である。培養開
始２４〜４８日で形質転換植物体が得られる。
【００３３】
【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。
【実施例１】《形質転換タバコの作成》 （ａ）ベクターの構築 アファノテセ・ハロフィチカのｄｎａＫ遺伝子を有する
プラスミドｐＥＡＤＫ１［Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，３５，７６３−７７５（１９９７）］から、ｄｎ
ａＫ遺伝子を含むＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ断片（すなわ
ち、制限酵素ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩの消化により得ら
れるＤＮＡ断片）を切り出し、バイナリーベクターｐＢ
Ｉ１２１［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１１
８，６２７−６４０（１９８６）］のＸｂａＩ／Ｂａｍ
ＨＩ認識部位に導入した。この操作により、バイナリー
ベクターｐＢＩ１２１におけるカリフラワーモザイクウ
イルスの３５Ｓプロモーターとノパリン合成酵素（ＮＯ
Ｓ）由来のターミネーターとの間に、アファノテセ・ハ
ロフィチカのｄｎａＫ遺伝子が導入されたプラスミドｐ
ＢＩ１２１−ＡＤＫが得られた。なお、このプラスミド
ｐＢＩ１２１−ＡＤＫは、前記バイナリーベクターｐＢ
Ｉ１２１に由来するカナマイシン耐性遺伝子（ＮＰＴI
I）を選択マーカーとして有している。
プラスミドｐＥＡＤＫ１［Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，３５，７６３−７７５（１９９７）］から、ｄｎ
ａＫ遺伝子を含むＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ断片（すなわ
ち、制限酵素ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩの消化により得ら
れるＤＮＡ断片）を切り出し、バイナリーベクターｐＢ
Ｉ１２１［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１１
８，６２７−６４０（１９８６）］のＸｂａＩ／Ｂａｍ
ＨＩ認識部位に導入した。この操作により、バイナリー
ベクターｐＢＩ１２１におけるカリフラワーモザイクウ
イルスの３５Ｓプロモーターとノパリン合成酵素（ＮＯ
Ｓ）由来のターミネーターとの間に、アファノテセ・ハ
ロフィチカのｄｎａＫ遺伝子が導入されたプラスミドｐ
ＢＩ１２１−ＡＤＫが得られた。なお、このプラスミド
ｐＢＩ１２１−ＡＤＫは、前記バイナリーベクターｐＢ
Ｉ１２１に由来するカナマイシン耐性遺伝子（ＮＰＴI
I）を選択マーカーとして有している。
【００３４】（ｂ）タバコの形質転換 前記実施例１（ａ）で得られたプラスミドｐＢＩ１２１
−ＡＤＫを、トリペアレンタルメイティング（ｔｒｉｐ
ａｒｅｎｔａｌ ｍａｔｉｎｇ）により、アグロバクテ
リウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４株に導入
した。この際、ヘルパープラスミドとしては、ｐＲＫ２
０１３［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１２，
８７１１−８７２１（１９８４）］を使用した。
−ＡＤＫを、トリペアレンタルメイティング（ｔｒｉｐ
ａｒｅｎｔａｌ ｍａｔｉｎｇ）により、アグロバクテ
リウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４株に導入
した。この際、ヘルパープラスミドとしては、ｐＲＫ２
０１３［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１２，
８７１１−８７２１（１９８４）］を使用した。
【００３５】続いて、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔ
ａｂａｃｕｍ ｃｖ ＰｅｔｉｔＨａｖａｎａ ＳＲ
１）の葉から切り出した円形葉片（ｌｅａｆ ｄｉｓ
ｃ）を、先に得られたプラスミドｐＢＩ１２１−ＡＤＫ
含有アグロバクテリウム・ツメファシエンスを用いて、
形質転換した。３％スクロース及び５０μｇ／ｍｌカナ
マイシンを含有するムラシゲ・スクーグ寒天培地［Ｐｌ
ａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１５，４７３−４９７（１
９６２）］上で無菌的に生長させ、合計２５０個の植物
個体が得られた。この中から１５種類の独立した形質転
換体（Ｆ0）を選び、種子を採取した。１５種類のＦ1の
中から、ｄｎａＫ−ｍＲＮＡの発現量が多い４種類を選
択し、種子を採取した。得られた４種類の形質転換体
（Ｆ2）は、いずれも、基本的に同じ表現型を示した。
以下、この内の１種類を、形質転換タバコの解析に使用
した。
ａｂａｃｕｍ ｃｖ ＰｅｔｉｔＨａｖａｎａ ＳＲ
１）の葉から切り出した円形葉片（ｌｅａｆ ｄｉｓ
ｃ）を、先に得られたプラスミドｐＢＩ１２１−ＡＤＫ
含有アグロバクテリウム・ツメファシエンスを用いて、
形質転換した。３％スクロース及び５０μｇ／ｍｌカナ
マイシンを含有するムラシゲ・スクーグ寒天培地［Ｐｌ
ａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１５，４７３−４９７（１
９６２）］上で無菌的に生長させ、合計２５０個の植物
個体が得られた。この中から１５種類の独立した形質転
換体（Ｆ0）を選び、種子を採取した。１５種類のＦ1の
中から、ｄｎａＫ−ｍＲＮＡの発現量が多い４種類を選
択し、種子を採取した。得られた４種類の形質転換体
（Ｆ2）は、いずれも、基本的に同じ表現型を示した。
以下、この内の１種類を、形質転換タバコの解析に使用
した。
【００３６】《形質転換タバコの耐塩性評価》以下、ム
ラシゲ・スクーグ培地（ムラシゲ・スクーグ培地それ自
体には、ＮａＣｌは含まれていない）を用いて、明暗サ
イクル［１６時間光照射（光強度＝２００μＥｍ
-2ｓ-1，温度＝２７℃，湿度＝６０％）及び８時間暗所
（温度＝２５℃，湿度＝６０％）］で種子から６週間生
育させた後、０．３Ｍ−ＮａＣｌ又は０．６Ｍ−ＮａＣ
ｌを含むムラシゲ・スクーグ培地、あるいは、ムラシゲ
・スクーグ培地（すなわち、ＮａＣｌ濃度＝０Ｍ）に移
して更に生育させた形質転換タバコを用いて、耐塩性に
関する種々の解析を行なった。また、コントロールとし
て、前記実施例１（ｂ）で宿主として使用した、形質転
換前のタバコ（以下、野生型タバコと称する）を用い
た。
ラシゲ・スクーグ培地（ムラシゲ・スクーグ培地それ自
体には、ＮａＣｌは含まれていない）を用いて、明暗サ
イクル［１６時間光照射（光強度＝２００μＥｍ
-2ｓ-1，温度＝２７℃，湿度＝６０％）及び８時間暗所
（温度＝２５℃，湿度＝６０％）］で種子から６週間生
育させた後、０．３Ｍ−ＮａＣｌ又は０．６Ｍ−ＮａＣ
ｌを含むムラシゲ・スクーグ培地、あるいは、ムラシゲ
・スクーグ培地（すなわち、ＮａＣｌ濃度＝０Ｍ）に移
して更に生育させた形質転換タバコを用いて、耐塩性に
関する種々の解析を行なった。また、コントロールとし
て、前記実施例１（ｂ）で宿主として使用した、形質転
換前のタバコ（以下、野生型タバコと称する）を用い
た。
【００３７】（ａ）ＤｎａＫタンパク質の発現 ０．３Ｍ−ＮａＣｌ若しくは０．６Ｍ−ＮａＣｌ含有ム
ラシゲ・スクーグ培地又はムラシゲ・スクーグ培地に移
してから３日間生育させた形質転換タバコ及び野生型タ
バコから、それぞれ、葉を採取し、葉１ｇに対して水１
ｍｌを加えてホモジナイズした後、Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ
を用いて濾過することにより、葉抽出物を得た。得られ
た葉抽出物を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
法（ゲル濃度＝１２．５％）により分離した後、アファ
ノテセ・ハロフィチカＤｎａＫタンパク質に対する抗血
清［Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３５，７６３−
７７５（１９９７）］を用いるウエスタンブロット法に
より、目的タンパク質を検出した。
ラシゲ・スクーグ培地又はムラシゲ・スクーグ培地に移
してから３日間生育させた形質転換タバコ及び野生型タ
バコから、それぞれ、葉を採取し、葉１ｇに対して水１
ｍｌを加えてホモジナイズした後、Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ
を用いて濾過することにより、葉抽出物を得た。得られ
た葉抽出物を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
法（ゲル濃度＝１２．５％）により分離した後、アファ
ノテセ・ハロフィチカＤｎａＫタンパク質に対する抗血
清［Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３５，７６３−
７７５（１９９７）］を用いるウエスタンブロット法に
より、目的タンパク質を検出した。
【００３８】野生型タバコでは、いずれの条件下（すな
わち、ＮａＣｌ濃度＝０Ｍ，０．３Ｍ，及び０．６Ｍ）
においても、バンドが一本も検出されなかったのに対し
て、形質転換タバコでは、全ての条件下（すなわち、Ｎ
ａＣｌ濃度＝０Ｍ，０．３Ｍ，及び０．６Ｍ）におい
て、アミノ酸配列から予想される分子量の位置にバンド
が一本検出された。また、形質転換タバコにおけるバン
ドの濃度は、ＮａＣｌ濃度により変動しなかった。これ
らの結果から、形質転換タバコでは、ＮａＣｌの存在の
有無に関わらず、ＤｎａＫタンパク質が発現されている
ことが確認された。しかも、ＤｎａＫタンパク質の発現
量は、ＮａＣｌ濃度（すなわち、塩ストレス）により変
動しないことも確認された。なお、本評価に使用した抗
血清は、タバコのＨＳＰ７０タンパク質には反応しなか
った。
わち、ＮａＣｌ濃度＝０Ｍ，０．３Ｍ，及び０．６Ｍ）
においても、バンドが一本も検出されなかったのに対し
て、形質転換タバコでは、全ての条件下（すなわち、Ｎ
ａＣｌ濃度＝０Ｍ，０．３Ｍ，及び０．６Ｍ）におい
て、アミノ酸配列から予想される分子量の位置にバンド
が一本検出された。また、形質転換タバコにおけるバン
ドの濃度は、ＮａＣｌ濃度により変動しなかった。これ
らの結果から、形質転換タバコでは、ＮａＣｌの存在の
有無に関わらず、ＤｎａＫタンパク質が発現されている
ことが確認された。しかも、ＤｎａＫタンパク質の発現
量は、ＮａＣｌ濃度（すなわち、塩ストレス）により変
動しないことも確認された。なお、本評価に使用した抗
血清は、タバコのＨＳＰ７０タンパク質には反応しなか
った。
【００３９】（ｂ）ＣＯ2取り込み速度における塩スト
レスの影響 ０．３Ｍ−ＮａＣｌ若しくは０．６Ｍ−ＮａＣｌ含有ム
ラシゲ・スクーグ培地又はムラシゲ・スクーグ培地に移
してから、１日間経過後、２日間経過後、及び３日間経
過後の形質転換タバコ及び野生型タバコにおけるＣＯ2
取り込み速度を、光合成系測定機（ｐｏｒｔａｂｌｅ
ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ ＨＣＭ
−１０００；Ｗａｌｚ社）を用いて測定した。
レスの影響 ０．３Ｍ−ＮａＣｌ若しくは０．６Ｍ−ＮａＣｌ含有ム
ラシゲ・スクーグ培地又はムラシゲ・スクーグ培地に移
してから、１日間経過後、２日間経過後、及び３日間経
過後の形質転換タバコ及び野生型タバコにおけるＣＯ2
取り込み速度を、光合成系測定機（ｐｏｒｔａｂｌｅ
ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ ＨＣＭ
−１０００；Ｗａｌｚ社）を用いて測定した。
【００４０】結果を図１及び図２に示す。図１は、形質
転換タバコ及び野生型タバコにおけるＣＯ2取り込み速
度の経時変化を示すグラフである。図１において、記号
「Ｔ」は「形質転換タバコ」を意味し、記号「Ｃ」は
「野生型タバコ」を意味する。また、記号「Ｔ」及び
「Ｃ」の直後の各記号（「０Ｍ」，「０．３Ｍ」，及び
「０．６Ｍ」）は、ＮａＣｌ濃度を示す。図２は、塩ス
トレス環境下に移行してから３日間経過後の、形質転換
タバコ及び野生型タバコにおけるＣＯ2取り込み速度の
低下の割合を示すグラフである。
転換タバコ及び野生型タバコにおけるＣＯ2取り込み速
度の経時変化を示すグラフである。図１において、記号
「Ｔ」は「形質転換タバコ」を意味し、記号「Ｃ」は
「野生型タバコ」を意味する。また、記号「Ｔ」及び
「Ｃ」の直後の各記号（「０Ｍ」，「０．３Ｍ」，及び
「０．６Ｍ」）は、ＮａＣｌ濃度を示す。図２は、塩ス
トレス環境下に移行してから３日間経過後の、形質転換
タバコ及び野生型タバコにおけるＣＯ2取り込み速度の
低下の割合を示すグラフである。
【００４１】図１及び図２から明らかなように、ＮａＣ
ｌ濃度が０．３Ｍである場合には、野生型タバコにおけ
るＣＯ2取り込み速度が低下したのに対して、形質転換
タバコでは、３日間経過後でもほとんど影響がなかっ
た。ＮａＣｌ濃度が０．６Ｍである場合には、野生型タ
バコのＣＯ2取り込み速度が３日間経過後に約４０％に
低下したのに対して、形質転換タバコでは、３日間経過
後でも約８５％の低下に抑えられた。
ｌ濃度が０．３Ｍである場合には、野生型タバコにおけ
るＣＯ2取り込み速度が低下したのに対して、形質転換
タバコでは、３日間経過後でもほとんど影響がなかっ
た。ＮａＣｌ濃度が０．６Ｍである場合には、野生型タ
バコのＣＯ2取り込み速度が３日間経過後に約４０％に
低下したのに対して、形質転換タバコでは、３日間経過
後でも約８５％の低下に抑えられた。
【００４２】また、塩ストレス環境下に移行してから３
日間経過後の形質転換タバコ及び野生型タバコの状態に
も明らかな差異が認められ、野生型タバコでは、塩スト
レスにより、葉が曲がり、しおれてくることが確認され
た。
日間経過後の形質転換タバコ及び野生型タバコの状態に
も明らかな差異が認められ、野生型タバコでは、塩スト
レスにより、葉が曲がり、しおれてくることが確認され
た。
【００４３】（ｃ）植物細胞中のＮａ+イオン含量にお
ける塩ストレスの影響 ０．３Ｍ−ＮａＣｌ若しくは０．６Ｍ−ＮａＣｌ含有ム
ラシゲ・スクーグ培地又はムラシゲ・スクーグ培地に移
してから３日間経過後の形質転換タバコ及び野生型タバ
コから、それぞれ、葉を採取し、前項（ａ）と同様にし
て、葉抽出物を得た。得られた葉抽出物中のＮａ+イオ
ン含量を、イオン分析器（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｐｅｒｓ
ｏｎａｌ Ｉｏｎ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＰＩＡ−１００
０；島津製作所）により測定した。
ける塩ストレスの影響 ０．３Ｍ−ＮａＣｌ若しくは０．６Ｍ−ＮａＣｌ含有ム
ラシゲ・スクーグ培地又はムラシゲ・スクーグ培地に移
してから３日間経過後の形質転換タバコ及び野生型タバ
コから、それぞれ、葉を採取し、前項（ａ）と同様にし
て、葉抽出物を得た。得られた葉抽出物中のＮａ+イオ
ン含量を、イオン分析器（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｐｅｒｓ
ｏｎａｌ Ｉｏｎ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＰＩＡ−１００
０；島津製作所）により測定した。
【００４４】結果を図３に示す。図３は、形質転換タバ
コ及び野生型タバコにおけるＮａ+イオン含量を示すグ
ラフである。図３においては、Ｎａ+イオン含量を、葉
１ｇ［採取直後の重量（ｆｒｅｓｈ ｗｅｉｇｈｔ；Ｆ
Ｗ）］当たりの重量（ｍｇ）で示す。野生型タバコの葉
の細胞内のＮａ+イオン含量は約４倍に増加したのに対
して、形質転換タバコでは、約２倍以下の増加に抑えら
れた。
コ及び野生型タバコにおけるＮａ+イオン含量を示すグ
ラフである。図３においては、Ｎａ+イオン含量を、葉
１ｇ［採取直後の重量（ｆｒｅｓｈ ｗｅｉｇｈｔ；Ｆ
Ｗ）］当たりの重量（ｍｇ）で示す。野生型タバコの葉
の細胞内のＮａ+イオン含量は約４倍に増加したのに対
して、形質転換タバコでは、約２倍以下の増加に抑えら
れた。
【００４５】（ｄ）光合成電子伝達系における塩ストレ
スの影響 ０．３Ｍ−ＮａＣｌ若しくは０．６Ｍ−ＮａＣｌ含有ム
ラシゲ・スクーグ培地又はムラシゲ・スクーグ培地に移
してから３日間経過後の形質転換タバコ及び野生型タバ
コから、それぞれ、葉を採取し、前項（ａ）と同様にし
て、葉抽出物を得た。得られた葉抽出物中のクロロフィ
ルａ及びクロロフィルｂ含量を、マッキニー（Ｍａｃｋ
ｉｎｎｅｙ）の方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１４
０，３１５−３２２（１９４１）］に従って測定した。
結果を図４に示す。図４においては、クロロフィル［ク
ロロフィルａ（Ｃｈｌ．ａ）及びクロロフィルｂ（Ｃｈ
ｌ．ｂ）］含量を、葉１ｇ［採取直後の重量（ｆｒｅｓ
ｈ ｗｅｉｇｈｔ；ＦＷ）］当たりの重量（ｍｇ）で示
す。また、前記葉抽出物中の総タンパク質含量、並びに
リブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキ
シゲナーゼ（ＲｕＢｉｓＣＯ）大サブユニット含量及び
ＲｕＢｉｓＣＯ小サブユニット含量を、ＮａＣｌ濃度が
０Ｍである場合の含量を１００としたときの相対量とし
て、表１に示す。
スの影響 ０．３Ｍ−ＮａＣｌ若しくは０．６Ｍ−ＮａＣｌ含有ム
ラシゲ・スクーグ培地又はムラシゲ・スクーグ培地に移
してから３日間経過後の形質転換タバコ及び野生型タバ
コから、それぞれ、葉を採取し、前項（ａ）と同様にし
て、葉抽出物を得た。得られた葉抽出物中のクロロフィ
ルａ及びクロロフィルｂ含量を、マッキニー（Ｍａｃｋ
ｉｎｎｅｙ）の方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１４
０，３１５−３２２（１９４１）］に従って測定した。
結果を図４に示す。図４においては、クロロフィル［ク
ロロフィルａ（Ｃｈｌ．ａ）及びクロロフィルｂ（Ｃｈ
ｌ．ｂ）］含量を、葉１ｇ［採取直後の重量（ｆｒｅｓ
ｈ ｗｅｉｇｈｔ；ＦＷ）］当たりの重量（ｍｇ）で示
す。また、前記葉抽出物中の総タンパク質含量、並びに
リブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキ
シゲナーゼ（ＲｕＢｉｓＣＯ）大サブユニット含量及び
ＲｕＢｉｓＣＯ小サブユニット含量を、ＮａＣｌ濃度が
０Ｍである場合の含量を１００としたときの相対量とし
て、表１に示す。
【００４６】塩ストレスによるクロロフィルの減少は、
野生型タバコと形質転換タバコとでそれほど大きな差異
は認められなかった。一方、二酸化炭素を固定する酵素
であるＲｕＢｉｓＣＯの塩ストレスによる減少は、形質
転換タバコにおいて抑えられた。
野生型タバコと形質転換タバコとでそれほど大きな差異
は認められなかった。一方、二酸化炭素を固定する酵素
であるＲｕＢｉｓＣＯの塩ストレスによる減少は、形質
転換タバコにおいて抑えられた。
【００４７】 《表１》 野生型タバコ 形質転換タバコ ＮａＣｌ（Ｍ） ０ ０．３ ０．６ ０ ０．３ ０．６ 総タンパク質 １００ ７８ ５４ １００ １０５ ６８ ＲｕＢｉｓＣＯ 大ユニット １００ ７７ ４４ １００ １１３ ７６ 小ユニット １００ ８０ ６１ １００ ８８ ８１
【００４８】《形質転換タバコの高温耐性評価》ムラシ
ゲ・スクーグ培地を用いて、明暗サイクル［１６時間光
照射（光強度＝２００μＥｍ-2ｓ-1，温度＝２７℃，湿
度＝６０％）及び８時間暗所（温度＝２５℃，湿度＝６
０％）］で種子から６週間生育させた後、高温ストレス
条件（４０℃且つ湿度８０％）下で１週間生育させ、再
び元の生育条件に戻したときの、（ａ）ＤｎａＫタンパ
ク質の発現、及び（ｂ）ＣＯ2取り込み速度における高
温ストレスの影響を、形質転換タバコ及び野生型タバコ
（コントロール）について解析した。
ゲ・スクーグ培地を用いて、明暗サイクル［１６時間光
照射（光強度＝２００μＥｍ-2ｓ-1，温度＝２７℃，湿
度＝６０％）及び８時間暗所（温度＝２５℃，湿度＝６
０％）］で種子から６週間生育させた後、高温ストレス
条件（４０℃且つ湿度８０％）下で１週間生育させ、再
び元の生育条件に戻したときの、（ａ）ＤｎａＫタンパ
ク質の発現、及び（ｂ）ＣＯ2取り込み速度における高
温ストレスの影響を、形質転換タバコ及び野生型タバコ
（コントロール）について解析した。
【００４９】（ａ）ＤｎａＫタンパク質の発現 「形質転換タバコの耐塩性評価」における前項（ａ）に
記載の方法により、形質転換タバコ及び野生型タバコに
おけるＤｎａＫタンパク質の発現を解析した。野生型タ
バコではバンドが一本も検出されなかったのに対して、
形質転換タバコでは、高温ストレスの有無に関わらず、
ＤｎａＫタンパク質が発現されていることが確認され
た。しかも、ＤｎａＫタンパク質の発現量は、高温スト
レスの有無により変動しないことも確認された。
記載の方法により、形質転換タバコ及び野生型タバコに
おけるＤｎａＫタンパク質の発現を解析した。野生型タ
バコではバンドが一本も検出されなかったのに対して、
形質転換タバコでは、高温ストレスの有無に関わらず、
ＤｎａＫタンパク質が発現されていることが確認され
た。しかも、ＤｎａＫタンパク質の発現量は、高温スト
レスの有無により変動しないことも確認された。
【００５０】（ｂ）ＣＯ2取り込み速度における高温ス
トレスの影響 「形質転換タバコの耐塩性評価」における前項（ｂ）に
記載の方法により、形質転換タバコ及び野生型タバコに
おけるＣＯ2取り込み速度を解析した。１週間の高温ス
トレスにより、形質転換タバコにおいても、野生型タバ
コにおいても、ＣＯ2取り込み速度は高温ストレス前の
約２５％に低下した。高温ストレス解除に伴い、形質転
換タバコでは、ＣＯ2取り込み速度の回復が３日目から
始まり、１０日後には高温ストレス前の約８０％まで回
復した。一方、野生型タバコでは、ＣＯ2取り込み速度
の回復が著しく遅く、１０日後でも高温ストレス前の約
５０％までにしか回復しなかった。これらの解析から、
形質転換タバコに高温耐性が付与されたことが判明し
た。
トレスの影響 「形質転換タバコの耐塩性評価」における前項（ｂ）に
記載の方法により、形質転換タバコ及び野生型タバコに
おけるＣＯ2取り込み速度を解析した。１週間の高温ス
トレスにより、形質転換タバコにおいても、野生型タバ
コにおいても、ＣＯ2取り込み速度は高温ストレス前の
約２５％に低下した。高温ストレス解除に伴い、形質転
換タバコでは、ＣＯ2取り込み速度の回復が３日目から
始まり、１０日後には高温ストレス前の約８０％まで回
復した。一方、野生型タバコでは、ＣＯ2取り込み速度
の回復が著しく遅く、１０日後でも高温ストレス前の約
５０％までにしか回復しなかった。これらの解析から、
形質転換タバコに高温耐性が付与されたことが判明し
た。
【００５１】《形質転換タバコの乾燥耐性評価》ムラシ
ゲ・スクーグ培地を用いて、明暗サイクル［１６時間光
照射（光強度＝２００μＥｍ-2ｓ-1，温度＝２７℃，湿
度＝６０％）及び８時間暗所（温度＝２５℃，湿度＝６
０％）］で種子から６週間生育させた後、培地から取り
出し、濾紙上に寝かせ、２７℃で１０時間光照射（光強
度＝１８０μＥｍ-2ｓ-1）を行ない、再び元の生育条件
に戻したときの、（ａ）ＤｎａＫタンパク質の発現、及
び（ｂ）ＣＯ2取り込み速度における乾燥ストレスの影
響を、形質転換タバコ及び野生型タバコ（コントロー
ル）について解析した。
ゲ・スクーグ培地を用いて、明暗サイクル［１６時間光
照射（光強度＝２００μＥｍ-2ｓ-1，温度＝２７℃，湿
度＝６０％）及び８時間暗所（温度＝２５℃，湿度＝６
０％）］で種子から６週間生育させた後、培地から取り
出し、濾紙上に寝かせ、２７℃で１０時間光照射（光強
度＝１８０μＥｍ-2ｓ-1）を行ない、再び元の生育条件
に戻したときの、（ａ）ＤｎａＫタンパク質の発現、及
び（ｂ）ＣＯ2取り込み速度における乾燥ストレスの影
響を、形質転換タバコ及び野生型タバコ（コントロー
ル）について解析した。
【００５２】（ａ）ＤｎａＫタンパク質の発現 「形質転換タバコの耐塩性評価」における前項（ａ）に
記載の方法により、形質転換タバコ及び野生型タバコに
おけるＤｎａＫタンパク質の発現を解析した。野生型タ
バコではバンドが一本も検出されなかったのに対して、
形質転換タバコでは、乾燥ストレスの有無に関わらず、
ＤｎａＫタンパク質が発現されていることが確認され
た。しかも、ＤｎａＫタンパク質の発現量は、乾燥スト
レスの有無により変動しないことも確認された。
記載の方法により、形質転換タバコ及び野生型タバコに
おけるＤｎａＫタンパク質の発現を解析した。野生型タ
バコではバンドが一本も検出されなかったのに対して、
形質転換タバコでは、乾燥ストレスの有無に関わらず、
ＤｎａＫタンパク質が発現されていることが確認され
た。しかも、ＤｎａＫタンパク質の発現量は、乾燥スト
レスの有無により変動しないことも確認された。
【００５３】（ｂ）ＣＯ2取り込み速度における乾燥ス
トレスの影響 「形質転換タバコの耐塩性評価」における前項（ｂ）に
記載の方法により、形質転換タバコ及び野生型タバコに
おけるＣＯ2取り込み速度を解析した。１０時間の乾燥
ストレスにより、形質転換タバコにおいても、野生型タ
バコにおいても、ＣＯ2取り込み速度は乾燥ストレス前
の約１０％に低下した。乾燥ストレス解除に伴い、形質
転換タバコでは、ＣＯ2取り込み速度の回復が２４時間
後から始まり、３日後には乾燥ストレス前の約８０％ま
で回復した。一方、野生型タバコでは、ＣＯ2取り込み
速度の回復が著しく遅く、２日後から回復が始まり、３
日後には乾燥ストレス前の約７０％までにしか回復しな
かった。
トレスの影響 「形質転換タバコの耐塩性評価」における前項（ｂ）に
記載の方法により、形質転換タバコ及び野生型タバコに
おけるＣＯ2取り込み速度を解析した。１０時間の乾燥
ストレスにより、形質転換タバコにおいても、野生型タ
バコにおいても、ＣＯ2取り込み速度は乾燥ストレス前
の約１０％に低下した。乾燥ストレス解除に伴い、形質
転換タバコでは、ＣＯ2取り込み速度の回復が２４時間
後から始まり、３日後には乾燥ストレス前の約８０％ま
で回復した。一方、野生型タバコでは、ＣＯ2取り込み
速度の回復が著しく遅く、２日後から回復が始まり、３
日後には乾燥ストレス前の約７０％までにしか回復しな
かった。
【００５４】
【実施例２】《形質転換イネの作成》 （ｉ）タバコの代わりに、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉ
ｖａ Ｌ．ｃｖ．Ｓａｓａｎｉｓｈｉｋｉ）を用いるこ
と、そして、（ii）アグロバクテリウム・ツメファシエ
ンスＬＢＡ４４０４株の代わりに、アグロバクテリウム
・ツメファシエンスＥＨＡ１０１株を用いること以外
は、前記実施例１（ｂ）に記載の手順を繰り返すことに
より、アファノテセ・ハロフィチカのｄｎａＫ遺伝子を
ゲノムに導入した形質転換イネを得た。
ｖａ Ｌ．ｃｖ．Ｓａｓａｎｉｓｈｉｋｉ）を用いるこ
と、そして、（ii）アグロバクテリウム・ツメファシエ
ンスＬＢＡ４４０４株の代わりに、アグロバクテリウム
・ツメファシエンスＥＨＡ１０１株を用いること以外
は、前記実施例１（ｂ）に記載の手順を繰り返すことに
より、アファノテセ・ハロフィチカのｄｎａＫ遺伝子を
ゲノムに導入した形質転換イネを得た。
【００５５】《形質転換イネの耐塩性評価》ムラシゲ・
スクーグ培地を用いて、明暗サイクル［１６時間光照射
（光強度＝２００μＥｍ-2ｓ-1，温度＝２７℃，湿度＝
７０％）及び８時間暗所（温度＝２５℃，湿度＝７０
％）］で種子から６週間生育させた後、０．１Ｍ−Ｎａ
Ｃｌを含むムラシゲ・スクーグ培地に移して更に１０日
間生育させた形質転換イネを用いて、以下の解析を行な
った。また、コントロールとして、前記実施例２で宿主
として使用した、形質転換前のイネ（以下、野生型イネ
と称する）を用いた。
スクーグ培地を用いて、明暗サイクル［１６時間光照射
（光強度＝２００μＥｍ-2ｓ-1，温度＝２７℃，湿度＝
７０％）及び８時間暗所（温度＝２５℃，湿度＝７０
％）］で種子から６週間生育させた後、０．１Ｍ−Ｎａ
Ｃｌを含むムラシゲ・スクーグ培地に移して更に１０日
間生育させた形質転換イネを用いて、以下の解析を行な
った。また、コントロールとして、前記実施例２で宿主
として使用した、形質転換前のイネ（以下、野生型イネ
と称する）を用いた。
【００５６】塩ストレス環境下に移してから１０日経過
後の形質転換イネ及び野生型イネの第６葉を用いて、葉
の先端からそれぞれ１０ｃｍ、１２．５ｃｍ、及び１５
ｃｍの部分の光合成反応中心II（Ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅ
ｍ II；ＰＳII）の最大量子収率を測定した。前記測定
には、ＰＡＭフルオロメーター（ＰＡＭ ｆｌｕｏｒｏ
ｍｅｔｅｒ；Ｗａｌｚ社）を用いた。結果を図５に示
す。図５において、黒の棒グラフは形質転換イネの結果
を示し、白抜きの棒グラフは野生型イネの結果を示す。
また、図５においては、ＰＳIIの最大量子収率として、
（Ｆ’m−Ｆ）／Ｆ’mを用いた［Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，９９０，８７−９２（１９８
９）］。図５から明らかなように、葉のいずれの部位に
おいても、形質転換イネの方が野生型イネよりも高い活
性を示した。また、葉の先端部分に近いほど、より顕著
な差異がみられた。
後の形質転換イネ及び野生型イネの第６葉を用いて、葉
の先端からそれぞれ１０ｃｍ、１２．５ｃｍ、及び１５
ｃｍの部分の光合成反応中心II（Ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅ
ｍ II；ＰＳII）の最大量子収率を測定した。前記測定
には、ＰＡＭフルオロメーター（ＰＡＭ ｆｌｕｏｒｏ
ｍｅｔｅｒ；Ｗａｌｚ社）を用いた。結果を図５に示
す。図５において、黒の棒グラフは形質転換イネの結果
を示し、白抜きの棒グラフは野生型イネの結果を示す。
また、図５においては、ＰＳIIの最大量子収率として、
（Ｆ’m−Ｆ）／Ｆ’mを用いた［Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，９９０，８７−９２（１９８
９）］。図５から明らかなように、葉のいずれの部位に
おいても、形質転換イネの方が野生型イネよりも高い活
性を示した。また、葉の先端部分に近いほど、より顕著
な差異がみられた。
【００５７】
【実施例３】《形質転換ノシバの作成及び耐ストレス性
評価》ノシバ（Ｚｏｙｓｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）のプ
ロトプラストと、前記実施例１（ａ）で調製したベクタ
ーとを用いて、常法により形質転換ノシバを得た。「形
質転換タバコの耐塩性評価」、「形質転換タバコの高温
耐性評価」、及び「形質転換タバコの乾燥耐性評価」に
それぞれ記載した方法に従って、形質転換ノシバの種々
の耐ストレス性を評価したところ、宿主として使用した
形質転換前のノシバ（野生型ノシバ）と比較して、耐塩
性、高温耐性、及び乾燥耐性が向上していた。
評価》ノシバ（Ｚｏｙｓｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）のプ
ロトプラストと、前記実施例１（ａ）で調製したベクタ
ーとを用いて、常法により形質転換ノシバを得た。「形
質転換タバコの耐塩性評価」、「形質転換タバコの高温
耐性評価」、及び「形質転換タバコの乾燥耐性評価」に
それぞれ記載した方法に従って、形質転換ノシバの種々
の耐ストレス性を評価したところ、宿主として使用した
形質転換前のノシバ（野生型ノシバ）と比較して、耐塩
性、高温耐性、及び乾燥耐性が向上していた。
【００５８】
【実施例４】《形質転換ベントグラスの作成及び耐スト
レス性評価》クリーピングベントグラス（Ａｇｒｏｓｔ
ｉｓ ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒａ）のプロトプラストと、
前記実施例１（ａ）で調製したベクターとを用いて、常
法により形質転換クリーピングベントグラスを得た。
「形質転換タバコの耐塩性評価」、「形質転換タバコの
高温耐性評価」、及び「形質転換タバコの乾燥耐性評
価」にそれぞれ記載した方法に従って、形質転換クリー
ピングベントグラスの種々の耐ストレス性を評価したと
ころ、宿主として使用した形質転換前のクリーピングベ
ントグラス（野生型クリーピングベントグラス）と比較
して、耐塩性、高温耐性、及び乾燥耐性が向上してい
た。
レス性評価》クリーピングベントグラス（Ａｇｒｏｓｔ
ｉｓ ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒａ）のプロトプラストと、
前記実施例１（ａ）で調製したベクターとを用いて、常
法により形質転換クリーピングベントグラスを得た。
「形質転換タバコの耐塩性評価」、「形質転換タバコの
高温耐性評価」、及び「形質転換タバコの乾燥耐性評
価」にそれぞれ記載した方法に従って、形質転換クリー
ピングベントグラスの種々の耐ストレス性を評価したと
ころ、宿主として使用した形質転換前のクリーピングベ
ントグラス（野生型クリーピングベントグラス）と比較
して、耐塩性、高温耐性、及び乾燥耐性が向上してい
た。
【００５９】
【発明の効果】本発明によれば、本来、ストレス耐性を
有しない植物に対しては、ストレス耐性を新たに付与す
ることができ、本来、ストレス耐性を有する植物に対し
ては、そのストレス耐性を向上させることができる。
有しない植物に対しては、ストレス耐性を新たに付与す
ることができ、本来、ストレス耐性を有する植物に対し
ては、そのストレス耐性を向上させることができる。
【図１】塩ストレス環境下に移行後の、形質転換タバコ
及び野生型タバコにおけるＣＯ 2取り込み速度の経時変
化を示すグラフである。
及び野生型タバコにおけるＣＯ 2取り込み速度の経時変
化を示すグラフである。
【図２】塩ストレス環境下に移行してから３日間経過後
の、形質転換タバコ及び野生型タバコにおけるＣＯ2取
り込み速度の低下の割合を示すグラフである。
の、形質転換タバコ及び野生型タバコにおけるＣＯ2取
り込み速度の低下の割合を示すグラフである。
【図３】塩ストレス環境下に移行してから３日間経過後
の、形質転換タバコ及び野生型タバコにおけるＮａ+イ
オン含量を示すグラフである。
の、形質転換タバコ及び野生型タバコにおけるＮａ+イ
オン含量を示すグラフである。
【図４】塩ストレス環境下に移行してから３日間経過後
の、形質転換タバコ及び野生型タバコにおけるクロロフ
ィルａ及びクロロフィルｂ含量を示すグラフである。
の、形質転換タバコ及び野生型タバコにおけるクロロフ
ィルａ及びクロロフィルｂ含量を示すグラフである。
【図５】塩ストレス環境下に移行してから１０日間経過
後の、形質転換イネ及び野生型イネにおける光合成反応
中心IIの最大量子収率を示すグラフである。
後の、形質転換イネ及び野生型イネにおける光合成反応
中心IIの最大量子収率を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 日比野 隆 愛知県名古屋市緑区相川１丁目181番１号 ネオハイツ相川501 (72)発明者 高倍 鉄子 愛知県名古屋市千種区園山町１丁目21番４ 号 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD04 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD10 4B024 AA08 BA80 CA02 DA01 EA04 FA02 FA07 FA10 GA11 GA17 GA21 4B065 AA88Y AA89X AB01 AC02 AC08 AC14 AC20 BA02 BA25 BB37 CA24 CA53
Claims (4)
- 【請求項１】 ＤｎａＫタンパク質又はＨＳＰ７０タン
パク質をコードするＤＮＡを含む、ストレス耐性が付与
されたトランスジェニック植物。 - 【請求項２】 前記ＤｎａＫタンパク質が、耐塩性ラン
藻のＤｎａＫタンパク質である、請求項１に記載のトラ
ンスジェニック植物。 - 【請求項３】 ＤｎａＫタンパク質又はＨＳＰ７０タン
パク質をコードするＤＮＡを含む、トランスジェニック
植物細胞。 - 【請求項４】 前記ＤｎａＫタンパク質が、耐塩性ラン
藻のＤｎａＫタンパク質である、請求項３に記載のトラ
ンスジェニック植物細胞。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25364199A JP2001078603A (ja) | 1999-09-07 | 1999-09-07 | ｄｎａＫ遺伝子又はｈｓｐ７０遺伝子含有トランスジェニック植物 |
| PCT/JP2000/001506 WO2001017332A1 (fr) | 1999-09-07 | 2000-03-13 | Plantes transgeniques contenant le gene dnak ou le gene hsp70 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25364199A JP2001078603A (ja) | 1999-09-07 | 1999-09-07 | ｄｎａＫ遺伝子又はｈｓｐ７０遺伝子含有トランスジェニック植物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001078603A true JP2001078603A (ja) | 2001-03-27 |
Family
ID=17254166
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25364199A Pending JP2001078603A (ja) | 1999-09-07 | 1999-09-07 | ｄｎａＫ遺伝子又はｈｓｐ７０遺伝子含有トランスジェニック植物 |
Country Status (2)
| Country | Link |
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