CN114480484B - 番茄转录因子基因SlNAC2的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了番茄转录因子基因SlNAC2的应用。番茄转录因子基因SlNAC2在提高番茄耐盐性和/或降低番茄阿特拉津残留中的应用，所述的番茄NAC类转录因子基因SlNAC2核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明从番茄中克隆了NAC2转录因子SlNAC2，转基因实验进一步证明了SlNAC2在响应盐胁迫过程中的正调控功能；SlNAC2过表达显著降低阿特拉津残留，提高番茄植株对阿特拉津残留的代谢降解能力。本发明鉴定到的SlNAC2基因有利于分析研究番茄响应盐胁迫和代谢降解农药机制，可用于耐盐番茄和低农药残留番茄品种的培育。

Description

番茄转录因子基因SlNAC2的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及番茄转录因子基因SlNAC2的应用。

背景技术

番茄(Solanum lycopersicum L.)，又名西红柿，属于一年生草本植物，是重要的蔬菜作物之一，全世界消费量仅次于马铃薯，中国是世界上番茄产量最大的国家之一。番茄被广泛用于各种科学研究，如育种、果实发育成熟，非生物胁迫和生物胁迫等抗逆防御调节。

农业生产中，农药是防治病虫草害，调控作物生长，保障作物产量及品质的重要生产资料。随着人口的不断增长，消费者对农产品数量和质量要求不断提高。实施农药成为提高农业生产效率的必然选择，在农业生产的地位短时间难以替代。近年来，随着我国农药工业的快速发展，我国农药的生产量和使用量均位居世界前列，其中除草剂是使用量最大的农药，我国农田所需化学除草面积高达8亿亩。随着农药用量和使用面积的不断扩大，过量和不当使用造成的农药残留问题愈演愈烈。研究表明，我国单位面积农药用量高于世界用量的2.5-5.0倍，远高于主要发达国家农药使用水平。过量农药通过挥发、径流侵蚀和淋溶扩散到土壤、植物等环境的不同部分，甚至导致地表水和地下水的污染，给生态环境和人民健康造成极大负面影响。

阿特拉津(英文名Atrazine,简称ATZ)作为一种选择性内吸传导型三嗪类除草剂，由于成本低廉，使用方便且效果好，广泛用作玉米、甘蔗和高粱等农作物的除草剂。然而阿特拉津在水体和土壤中的残留期长，导致对后茬敏感作物如水稻、小麦、蔬菜等作物药害作用明显。此外，阿特拉津在作物体内的残留和降解代谢，直接关系到农产品质量安全和人类健康。随着我国园艺生产规模快速增加，果蔬中的农药残留超标问题非常普遍，农药残留过高造成消费者中毒的事件时有报道，农药残留超标问题已逐渐成为食品安全中人们关注的焦点之一。大量研究表明，植物体内农药降解代谢在降低农药残留过程中发挥重要作用，探究阿特拉津在蔬菜作物体内的解毒途径，为低农药残留蔬菜品种选育、提高农产品安全品质、实现农业可持续发展有着重要意义。

土壤盐渍化是影响植物生长发育的主要环境因素之一，对农业生产的威胁是一个全球性的热点问题。全世界超过10亿hm²的土地受到盐分胁迫的影响，我国盐渍土面积约2700万hm²，约占全国可耕地面积的25％。近年来，随着园艺产业的迅速发展，长年连作和不科学的超量施用化肥，导致菜田土壤次生盐渍化现象普遍存在，严重制约我国蔬菜产业的健康发展。因此，探究蔬菜作物耐盐调控机制，为蔬菜作物抗逆高效栽培技术研发和耐盐品种选育具有重要的现实意义。

转录因子(TFs)是一类调节基因表达的重要调控蛋白，TF与它相关的顺式调节序列结合，在基因表达方面起分子开关作用，调控植物信号传导途径。NAC转录因子广泛参与到植物对多种逆境胁迫的响应中而受到关注，NAC家族转录因子包括NAM，ATAF和CUC2三个亚族，是植物中最大的转录因子家族之一，NAC转录因子识别的核心序列为CGT(G/A)。研究表明，NAC转录因子可以调控植物对多种生物和非生物胁迫的响应，拟南芥中的NAC019，NAC055，NAC072正调控对盐胁迫的耐受性(Liu et al,2018；Sukiran et al,2019；Lu etal,2017)；AtJUB1可以直接控制DREB2A的表达，在调节干旱、盐和渗透胁迫耐受性方面具有重要作用(Shahnejat-Bushehri et al,2017)OsNAC2则表现出对盐耐性的负调控作用，OsNAC2的表达抑制水稻细胞色素氧化酶11(OsCOX11)的表达，从而降低了活性氧的清除能力导致植物对盐胁迫耐性的降低(Mao et al,2018)。虽然NAC2在调节植物非生物胁迫方面发挥重要作用，但NAC2在植物响应盐胁迫和农药毒害中的功能研究十分有限，尤其是番茄中尚未见关于SlNAC2调节耐盐性和降低农药残留的详细功能研究。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供番茄SlNAC2基因的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

番茄转录因子基因SlNAC2在提高番茄耐盐性和/或降低番茄阿特拉津残留中的应用，所述的番茄NAC类转录因子基因SlNAC2核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

有益效果：

本发明从番茄中克隆了NAC2转录因子SlNAC2，该基因编码的蛋白属于NAC家族转录因子，荧光定量PCR分析表明盐胁迫和阿特拉津均能够诱导SlNAC2的表达。转基因实验进一步证明了SlNAC2在响应盐胁迫过程中的正调控功能；SlNAC2过表达显著降低阿特拉津残留，提高番茄植株对阿特拉津残留的代谢降解能力。本发明鉴定到的SlNAC2基因有利于分析研究番茄响应盐胁迫和代谢降解农药机制，可用于耐盐番茄和低农药残留番茄品种的培育。

附图说明

图1、qRT-PCR检测番茄NAC2基因过表达的转基因植株中番茄NAC2基因相对表达量对比柱状图。其中WT为未转基因的野生型番茄Ailsa Craig，1#、2#、3#、4#表示番茄那次基因过表达的四个独立的株系。。

图2、盐胁迫诱导番茄SlNAC2基因的表达。

图3、番茄SlNAC2过表达植株和野生型WT叶片盐胁迫下基因表达。

图4、番茄过表达SlNAC2和野生型WT在NaCl胁迫下的表型图(A)和干重对比柱状图(B)

图5、番茄过表达SlNAC2和野生型WT钠、钾离子的含量

A:番茄过表达SlNAC2和野生型WT在NaCl胁迫下整株的钠离子总含量对比柱状图；B:番茄过表达SlNAC2和野生型WT在NaCl胁迫下叶片钠离子含量对比柱状图；C:番茄过表达SlNAC2和野生型WT在NaCl胁迫下叶片的钾离子含量对比柱状图；D:番茄过表达SlNAC2和野生型WT在NaCl胁迫下叶片的钠离子和钾离子含量比值的对比柱状图。

图6、盐胁迫对过表达SlNAC2番茄和野生型WT番茄过氧化氢、丙二醛、净光合速率含量的影响

A:番茄过表达SlNAC2和野生型WT在NaCl胁迫下叶片过氧化氢含量对比柱状图。B:盐胁迫下各组丙二醛含量对比柱状图。C:盐胁迫下各组净光合速率对比柱状图。

图7、阿特拉津胁迫诱导番茄SlNAC2基因的表达。

图8、番茄SlNAC2过表达植株和野生型WT叶片阿特拉津胁迫下SlNAC2基因表达。

图9在阿特拉津处理下番茄过表达SlNAC2和野生型WT的表型与鲜重

A:番茄过表达SlNAC2和野生型WT在阿特拉津处理下的表型图。B:番茄过表达SlNAC2和野生型WT在阿特拉津处理下的植株鲜重对比柱状图。

图10、在阿特拉津处理下番茄过表达SlNAC2和野生型WT的阿特拉津残留量、过氧化氢含量及相对电导率

A:番茄过表达SlNAC2和野生型WT在阿特拉津处理下整株的阿特拉津残留量对比柱状图。B:阿特拉津胁迫下各组植株叶片过氧化氢含量对比柱状图。C:阿特拉津胁迫下各组植株叶片相对电导率对比柱状图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明进一步进行描述。

下述实施例中所用实验方法如无特殊说明，均为常规方法，包括PCR、纯化、酶切、连接、转化、测序等几个步骤。

下述实施例中所用实验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1番茄SlNAC2基因的克隆及番茄SlNAC2基因的过表达载体构建

1.番茄总RNA提取

采用Plant total RNA extraction kit(TIANGEN)提取番茄幼嫩叶片的总RNA，其步骤为：

(1)取0.1g番茄叶片在液氮中磨碎，加1mL裂解液，后用均浆仪处理；

(2)将均浆样品在15-30℃放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离；

(3)4℃，12,000rpm离心5min，去上清，转入一个新的无RNase的离心管中。

(4)加入200μL氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15s，室温放置3min；

(5)4℃，12,000rpm离心10min，样品会分为三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，水相的体积约为所用裂解液RZ试剂的50％。把水相转移到新管中，进行下一步操作；

(6)缓慢加入0.5倍体积的无水乙醇，混合均匀(此时可能会出现沉淀)。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3，4℃12,000rpm离心30s，弃掉收集管中的废液；

(7)向吸附柱CR3中加入500μL去蛋白液RD，4℃，12,000rpm离心30s，弃废液；

(8)向吸附柱CR3中加入600μL漂洗液RW，室温静止2min，4℃，12,000rpm离心30s，弃废液；

(9)重复操作步骤(8)；

(10)将吸附柱放入2mL收集管中，4℃，12,000rpm离心2min，去除残余废液；

(11)将吸附柱CR3转入一个新的离心管中，加入50μL RNase-Free ddH₂O，室温放置2min，4℃，12,000rpm离心2min；

(12)用紫外分光光度计测定OD₂₆₀/OD₂₈₀检验RNA样品含量与纯度，浓度为835ng/μL，OD₂₆₀/OD₂₈₀＝2.12。

2.基因克隆及番茄SlNAC2基因的过表达载体pFGC1008-35S-NAC2-HA构建

采用ReverTra Ace qPCR RT Kit(Toyobo)，将1μg番茄总RNA反转录成cDNA。

根据番茄SlNAC2基因的编码序列，设计扩增出完整框的引物(如表1中SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3所示的SlNAC2-F和SlNAC2-R)，并在引物上分别加上限制性酶切位点AscI和KpnI；采用SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示引物对番茄SlNAC2基因进行扩增，扩增产物采用AscI和KpnI酶切，将带有HA标签蛋白的pFGC1008-HA载体用限制性内切酶AscI和KpnI双酶切后，将酶切后的扩增产物连入线性化的pFGC1008-HA载体的35S启动子和HA标签蛋白之间，得到番茄SlNAC2基因的过表达载体pFGC1008-35S-NAC2-HA，由杭州擎科梓熙生物技术有限公司测序，测序结果如SEQ TD NO.1所示，结果表明所克隆的序列与solgenomics中公布的序列(Solyc05g007770.3)一致。

PCR反应体系如下：

PCR反应条件设置：

表1 SlNAC2扩增引物序列表

3.根癌农杆菌工程菌构建

将番茄SlNAC2基因的过表达载体pFGC1008-35S-NAC2-HA转入根癌农杆菌EHA105中，获得含番茄SlNAC2基因过表达载体的根癌农杆菌工程菌A。

实施例2构建番茄SlNAC2基因过表达的转基因植株

番茄Ailsa Craig种子用自来水浸泡(或用摇床28℃200r/min)6-8h，然后用75％酒精消毒30sec，之后在10％NaClO中消毒15min(用摇床28℃200r/min)，灭菌蒸馏水冲洗3次并转移到灭菌器皿，接种于1/2MS培养基。25℃黑暗条件下培养至发芽，转入光照培养室，幼苗生长条件为25℃、16h光照/8h黑暗，光照强度1800lx。

2准备外植体、培养农杆菌

种子发芽后6d，将无菌苗的子叶用刀切下，子叶带有一小段叶柄，置入看护培养基KCMS中预培养1d(避光，过夜即可，看护培养时间过长容易导致侵染过度)。在含有抗生素的LB平板上挑取农杆菌单菌落，接种于20mL含有抗生素的LB中，28℃、200r/min过夜培养至对数中期(OD600≈1.0，约16-24h)。先摇菌，再切子叶(12-20h之间接种)。

3转化再生

3.1侵染

培养好的含番茄SlNAC2基因过表达载体的根癌农杆菌工程菌A菌液转到10mL离心管(封口膜封口)，4℃4000r/min离心10min；倒出培养基，加入悬浮培养基MS0.2，摇匀。将3～4皿的子叶外植体转移到倒有MS0.2的灭菌培养皿中，倒入悬浮好的菌液至OD600≈0.2～0.3(7-8mL MS0.2，其中2-3mL倒入培养皿)暗下接种感染4-5min，并轻轻晃动培养皿。将外植体转移到灭菌滤纸上，吸干残留的菌液，回接到KCMS上，22℃共培养2d(避光)。反面朝上。

3.2选择培养、再生

共培养后，将外植体小心的转入MRS1(2Z+)上，2～3周后转入MRS2(0.2Z+)中培养，选择培养的过程中要及时清理污染的材料，直至长出再生芽。

4.再生芽生根、移栽

待再生芽长至1cm左右时，将芽切下(可以不切，以免伤害生根部位)，放入生根培养基中生根。2周后对生根良好、长至5cm左右的转化苗进行炼苗，移栽至一次性塑料杯中，成活后移栽至花盆中，得番茄SlNAC2基因过表达植株,转基因植株的qRT-PCR验证结果如图1。

结果显示，与野生型对照(WT)相比，番茄SlNAC2基因过表达植株的四个独立的株系1#、2#、3#、4#的SlNAC2基因相对表达量均明显提高。

实施例3对实施例2制备得到的番茄SlNAC2基因过表达的转基因植株盐胁迫处理

盐胁迫处理的具体方法如下：

本研究分为野生型番茄Ailsa Craig空白对照组和番茄SlNAC2基因过表达的转基因植株组。

当番茄SlNAC2基因过表达植株OE-1#、OE-2#和野生型番茄Ailsa Craig幼苗长至三叶一心时，挑选长势整齐一致的幼苗分为两组，一组为未经胁迫处理的对照组，一组为盐胁迫实验组。分析野生型植株NAC2基因在盐胁迫下48小时的表达情况，盐胁迫处理三小时后显著诱导NAC2基因的表达，最高表达水平在24小时左右，随后在处理48小时后，NAC2表达水平仍然显著高于对照，表明盐胁迫能够诱导NAC2的表达(图2)。

当番茄长至五叶一心时盐胁迫实验组和对照组定植于含有1L 1/2剂量Hoagland营养液的方形塑料盒(长17.2cm，宽10.2cm，高7.2cm)中进行，每个容器定植3株幼苗，气泵间歇通气(20min/h)以维持营养液溶氧量。待移栽后缓苗5天，盐胁迫实验组营养液中加入使培养液终浓度含150mM NaCl的营养液中，对照组为正常营养液处理，直至处理结束。盐胁迫处理时间8天。

实验结束即出现表型后拍照并测定植株钠离子含量、植株干重、叶片钠离子、钾离子含量、叶片过氧化氢、丙二醛含量，以及叶片净光合速率和SlNAC2基因相对表达量。结果如图3～6所示，图中WT为未转基因的野生型番茄Ailsa Craig，OE-1#、OE-2#为番茄SlNAC2基因过表达的转基因植株。

如图所示，所有的对照植株没有显著差异，但盐胁迫处理8d后，WT叶片开始萎黄，相反番茄SlNAC2基因过表达的转基因植株OE-1#和OE-2#的叶片依旧保持绿色，明显优于WT植株(图4A)。为了确认观察到的表型，我们测定了WT和OE-1#、OE-2#植株的净光合速率(图6C)和干重(图4B)。结果表明，所有对照植株的净光合速率和干重没有显著性差异。盐胁迫处理后，尽管盐胁迫处理后WT和OE-1#、OE-2#植株中的净光合速率都有所减少，但OE-1#、OE-2#植株叶片净光合速率显著高于WT植株(图6C)，另外，盐胁迫处理后，番茄SlNAC2基因过表达的转基因植株OE-1#和OE-2#的干重显著高于野生型WT(图4B)；不加盐对照条件下OE-1#、OE-2#植株叶片SlNAC2基因相对表达量显著高于WT，分别为WT的22.1倍和18.4倍，而加盐条件下，OE-1#、OE-2#植株叶片NAC2基因相对表达量进一步升高，分别为加盐条件下WT水平的7.5倍和10.7倍(图3)。此外，加盐条件下番茄植株钠离子含量(图5A)和叶片钠离子含量显著积累(图5B)，叶片钾离子大量流失(图5C)。盐胁迫下，转基因植株OE-1#和OE-2#叶片钠离子含量显著低于WT，分别较WT降低了7.1％和6.5％(图5B)；而胁迫条件下过表达株系中的钾离子含量显著高于WT，分别高于WT14.5％和20.5％(图5C)；胁迫条件下WT叶片中Na+:K+比例显著高于转基因植株。这些结果表明，SlNAC2能够降低Na+在植物体内的积累，减少K+外排，缓解盐害造成的离子毒害。进一步分析叶片胁迫指标如过氧化氢含量(图6A)和丙二醛含量(图6B)发现，对照条件下，WT和过表达植株叶片过氧化氢和丙二醛含量没有显著性差异，但盐胁迫下转基因植株OE-1#和OE-2#过氧化氢含量比WT植株分别降低了17.3％，19.3％；丙二醛含量分别较WT植株降低33.7％和40.0％。总之，通过分析结合SlNAC2在盐胁迫下的表达模式，WT和SlNAC2过表达植株表型分析表明，SlNAC2与植株耐盐性呈正相关关系。

阿特拉津胁迫处理的具体方法如下：

本研究分为野生型番茄Ailsa Craig空白对照组和番茄SlNAC2基因过表达的转基因植株组。

当番茄SlNAC2基因过表达植株OE-1#、OE-2#和野生型番茄Ailsa Craig幼苗长至三叶一心时，挑选长势整齐一致的幼苗分为两组，一组为未经胁迫处理的对照组，一组为阿特拉津农药胁迫实验组。分析野生型植株NAC2基因在阿拉津处理下48小时的表达情况，阿拉津处理处理6小时后显著诱导NAC2基因的表达，最高表达水平在24小时左右，随后在处理6-48小时之间，NAC2表达水平仍然显著高于对照，表明阿拉津能够诱导NAC2的表达。当番茄长至五叶一心时盐胁迫实验组和对照组定植于含有1L 1/2剂量Hoagland营养液的方形塑料盒(长17.2cm，宽10.2cm，高7.2cm)中进行，每个容器定植3株幼苗，营养液每2天更换一次，以保证营养元素和氧气的正常供应。待长出六片真叶时，阿特拉津胁迫实验组营养液中加入终浓度含0.03mg/L阿特拉津的营养液中，对照组为正常营养液处理，直至处理结束，阿特拉津迫处理时间8天。

实验结束即出现表型后拍照并测定植株阿特拉津积累量、植株鲜重、叶片SlNAC2基因相对表达量、叶片过氧化氢含量和相对电导率。结果如图7～10所示，图中WT为未转基因的野生型番茄Ailsa Craig，OE-1#、OE-2#为番茄NAC2基因过表达的转基因植株。

如图9A所示，所有的对照植株没有显著差异，但阿特拉津胁迫处理8d后，番茄幼苗生长受到严重抑制，但番茄SlNAC2基因过表达的转基因植株OE-1#和OE-2#的生长明显优于野生型WT。阿特拉津胁迫下OE-1#和OE-2#鲜重分别较对照增加了62.5％和83.7％。为进一步确定阿特拉津胁迫下SlNAC2基因表达情况，分析了阿特拉津诱导番茄SlNAC2基因的表达(图7)和不同处理组番茄叶片SlNAC2表达情况(图8)。结果表明，对照条件下OE-1#、OE-2#植株叶片SlNAC2基因相对表达量显著高于WT，而阿特拉津胁迫条件下，OE-1#、OE-2#植株叶片SlNAC2基因相对表达量进一步升高，分别为相同条件下WT植株的5.5倍和13.5倍(图8)。此外，阿特拉津胁迫条件下WT植株阿特拉津显著积累，与野生型WT相比，转基因植株OE-1#和OE-2#阿特拉津含量显著降低，分别较WT降低了67.8％和45.4％(图10A)。

进一步分析叶片胁迫指标如过氧化氢含量(图10B)和相对电导率(图10C)发现，所有对照植株叶片过氧化氢含量和相对电导率没有显著性差异，但阿特拉津胁迫下转基因植株OE-1#和OE-2#过氧化氢含量比WT植株分别降低了27.7％，28.9％；相对电导率含量分别较对照降低35.7％和48.6％。

综上，过表达NAC2基因的转基因植株的农药耐性明显高于WT植株，番茄NAC2基因过表达能够增加植株的阿特拉津抗性，NAC2基因可能对阿特拉津的解毒反应起到重要作用。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 番茄转录因子基因SlNAC2的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 849

<212> DNA

<213> 番茄(Solanum lycopersicum )

<400> 1

atggttggaa aaattagctc tgatcttcct cctggattta ggtttcatcc aacagatgag 60

gaattaatca tgtactatct tcgatatcaa gctacttcaa ggccatgccc tgtctcaatt 120

atccccgaaa tcgatgtcta caagttcgat ccctgggtat tacctgaaaa ggcagaattt 180

ggagaaaatg agtggtattt ttttacccct agagatagaa aatatccaaa tggtgttagg 240

ccaaatagag cagctgtgtc tggttattgg aaggctactg gcactgataa agcaatttat 300

agtgcaaata aatatgttgg aatcaaaaaa gcacttgttt tttacaaagg caaaccacca 360

aaaggtgtca agactgattg gatcatgcat gaatatcgtt tgagtgattc aaagtctcaa 420

acatctaagc aaagtggatc tatgaggtta gatgattggg tactatgtag aatttataag 480

aagaaaaatt tggggaaaac tatagagatg atgaaagttg aggaagaaga attagaggca 540

caaaatgtga gtactacaaa taatgaaatt gaagttgttg gtggaccaca aacaatgaaa 600

ttaccaagaa tttgttcatt gtcacatcta ttggaattgg attattttgg atcaattcca 660

caattactaa gtgacaattt attatatgat gaccaaagtt acacaatgaa taatgtgaat 720

aacacaagta atgtggatca agtatcatca caacaacaaa atacaaataa tattacaagc 780

aataattgta atattttctt caattatcag caaccgctct ttgtgaatcc aacatttcaa 840

taccagtag 849

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttggcgcgcc atggttggaa aaattag 27

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cggggtacca ctgagattga aatgttg 27

Claims (1)

1.番茄转录因子基因SlNAC2在降低番茄阿特拉津残留中的应用，所述的番茄转录因子基因SlNAC2核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

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