ES2315652T3

ES2315652T3 - Plantas que tienen caracteristicas mejoradas de crecimiento y un metodo para logarlo.

Info

Publication number: ES2315652T3
Application number: ES04724662T
Authority: ES
Inventors: Gabor Horvath; Sylvie Tarayre; Eva Kondorosi; Valerie Frankard
Original assignee: CropDesign NV; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: CropDesign NV; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 2003-03-31
Filing date: 2004-03-31
Publication date: 2009-04-01
Anticipated expiration: 2024-03-31
Also published as: EP1608760A2; WO2004087929A3; US20090288228A1; ATE413462T1; US8299319B2; DE602004017590D1; WO2004087929A2; US20070067875A1; EP1608760B1

Abstract

Método para incrementar el rendimiento/la biomasa con relación a las plantas de tipo silvestre correspondientes, que comprende la introducción en una planta de un ácido nucleico que codifica a una proteína CCS52 bajo el control de un promotor de fuerza media, en donde dicho promotor de fuerza media tiene un nivel de expresión en tejido vegetativo verde que es al menos 10 veces menor que aquel del promotor CaMV35S.

Description

Plantas que tienen características mejoradas de crecimiento y un método para lograrlo.

La presente invención se relaciona con un método para mejorar las características de crecimiento de una planta. Más específicamente, la presente invención se relaciona con un método para mejorar las características de crecimiento de una planta incrementando, en una planta, la expresión de un gen que activa el ciclo celular que codifica una proteína de 52 kDa (proteína CCS52) y/o por medio del incremento en actividad de la proteína CCS52 en si misma siendo dichas características mejoradas de crecimiento un incremento en rendimiento/biomasa.

Dada la siempre creciente población mundial, subsiste como un objetivo fundamental de la investigación agrícola el mejorar la eficiencia de la agricultura. Un medio convencional para mejoras en los cultivos y en horticultura utiliza técnicas selectivas de cultivo para identificar plantas que tienen características deseables. Sin embargo, tales técnicas selectivas de cultivo tienen varios inconvenientes, principalmente que aquellas técnicas son típicamente de intenso trabajo y resultan en plantas que a menudo contienen complementos genéticos heterólogos que pueden no siempre resultar en el paso deseable de la característica de las plantas progenitoras. En contraste, los avances en biología molecular le han permitido al hombre una manipulación más precisa del germoplasma de las plantas. La ingeniería genética de las plantas implica el aislamiento y la manipulación de material genético (típicamente en la forma de ADN o ARN) y la posterior introducción de ese material genético en una planta. Tal tecnología ha conducido al desarrollo de plantas que tienen diferentes características económicas, agronómicas u horticulturales mejoradas. Una característica de interés económico particular es el alto rendimiento.

La capacidad para mejorar una o más características de crecimiento de una planta, tendría muchas aplicaciones en áreas tales como la mejora en los cultivos, la reproducción de las plantas, la producción de plantas ornamentales, arboricultura, horticultura, silvicultura, producción de algas o plantas (para uso como biorreactores por ejemplo, para la producción de productos farmacéuticos, tal como anticuerpos o vacunas, o para la bioconversión de desechos orgánicos, o para uso como combustibles, en el caso de algas y plantas de alto rendimiento).

CCS52 pertenece a un pequeño grupo de proteínas que contienen varios motivos de repetición WD y es el homólogo de la planta de los activadores APC de los animales implicados en la degradación de la ciclina mitótica (WO 99/64451). En Cebolla y colaboradores (EMBO J., 1999, 18: 4476 - 84), se reportó el aislamiento de los clones de CCS52 a partir de los nódulos de la raíz de Medicago sativa y se describió a la CCS52 como parte de una familia más pequeña de genes que parece estar conservada en las plantas. Además, los dominios funcionales y los mecanismos de regulación de las proteínas CCS52 han sido descritos en forma detallada por Tarayre y colaboradores (The plant cell, 2004, vol. 16, 422 - 434).

En el documento WO 99/64451 se sugirió que la reducción de la expresión de CCS52 empuja a las células a la proliferación y que la sobreproducción de CCS52 empuja a las células a la diferenciación. También, en el documento a nombre de Kondorosi y colaboradores (1999, The EMBO J. 18 (16), páginas 4476 - 4484), se establece que la expresión de CCS52 puede activar a las células en proliferación a programas de diferenciación. Para algunas células, diferenciación significa endoreduplicación. Esta activación hacia la diferenciación (o endoreduplicación) claramente involucra una detención de la proliferación, y de este modo una detención de la división celular. Estos datos estaban en línea con los hallazgos anteriores en levadura que enseñan que cuando se utiliza CCS52 para incrementar la diferenciación (o endoreduplicación), se activa inevitablemente una detención del ciclo celular. Por lo tanto, el efecto sobre la endoreduplicación por un lado, especialmente el mayor tamaño celular, está inherentemente enlazado a una reducción del número de células debido a la detención de la división celular. Los resultados obtenidos en Medicago y Arabidopsis, para la sobreexpresión de CCS52 dirigida por el promotor CaMV35S corroboró este punto de vista.

Los ejemplos en el documento WO 99/64451 muestran que las plantas de Medicago expresan una versión antisentido de una forma del gen que codifica para CCS52 de Medicago de más pocas semillas y más pocas ramificaciones laterales. Además, los constructos para la sobreexpresión de un gen que codifica CCS52 de Medicago, bajo el control de un promotor constitutivo fuerte (CaMV35S), han sido divulgados y fueron utilizados para transformar plantas Medicago. Aunque se indicó que la sobreexpresión de un gen que codifica para CCS52 bajo el control de un promotor CaMV35S resultó en un efecto positivo sobre embriogénesis somática, no se regeneraron plantas y no se observaron efectos positivos adicionales. Por el contrario, se ha presentado evidencia de que la sobreexpresión de CCS52 bajo el control de un promotor CaMV35S es perjudicial. Este efecto perjudicial fue observado primero en plantas transgénicas Medicago. Después, se observó también este efecto perjudicial en Arabidopsis thaliana con el gen que codifica para CCS52 de Arabidopsis bajo el control de un promotor CaMV35S.

Por lo tanto, el estado del arte no enseña como el gen que codifica para CCS52 puede ser usado para mejorar las características de crecimiento de la planta, y hasta ahora solo se han obtenido resultados negativos con respecto al uso de CCS52 para mejora en el crecimiento.

Inesperadamente, se ha encontrado que, en contraste con observaciones previas, la sobreexpresión de un gen que codifica para CCS52 no provoca un efecto perjudicial. Además, se ha encontrado ahora que las características de crecimiento de una planta pueden incluso ser mejoradas por medio de los métodos de la presente invención. Estas características mejoradas de crecimiento se obtienen cuando se controla la sobreexpresión de un gen que codifica para CCS52 en una planta por medio de un promotor de fuerza media.

Sorprendentemente además, se ha encontrado también que las plantas elaboradas por medio de los métodos de la presente invención tienen características específicas tales como un mayor tamaño de la planta, un mayor tamaño de los órganos y/o un mayor número de órganos, comparado con las correspondientes plantas de tipo silvestre.

Por lo tanto, la presente invención enseña como mejorar las características de crecimiento de la planta, tales como el tamaño de la planta, el tamaño de los órganos y/o el número de órganos por medio de una mayor expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica a una proteína CCS52.

De acuerdo con una primera modalidad de la presente invención, se provee un método para incrementar el rendimiento/la biomasa con relación a las correspondientes plantas de tipo silvestre, que comprende la introducción dentro de una planta de un ácido nucleico que codifica a una proteína CCS52 bajo el control de un promotor de fuerza media en donde dicho promotor de fuerza media tiene un nivel de expresión en tejido vegetal verde que es al menos 10 veces menor que aquel del promotor CaMV35S.

La introducción dentro de una planta de un ácido nucleico que codifica a una proteína CCS52 bajo el control de tal promotor de fuerza media, puede resultar en una mayor expresión del ácido nucleico que codifica a una proteína CCS52. Adicionalmente, esta introducción puede resultar en un mayor nivel y/o actividad de la proteína CCS52.

Convenientemente, y de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, una mayor expresión de un ácido nucleico que codifica a una proteína CCS52 y/o un mayor nivel y/o actividad de la proteína misma CCS52 se pueden efectuar por medio de una aproximación recombinante directa, por ejemplo, por medio de la transformación de la planta con un ácido nucleico que codifica a una proteína CCS52 o a una variante de la misma.

Alternativamente, una mayor expresión de un ácido nucleico que codifica a una proteína CCS52 y/o un mayor nivel y/o actividad de la proteína misma CCS52 se pueden efectuar por medio de una aproximación recombinante indirecta, por ejemplo, por medio de la transformación de una planta para modificar la expresión de un gen que codifica para CCS52 ya en esa planta, cuyo gen que codifica para CCS52 puede ser endógeno o un transgén introducido (previamente) en la planta. Esto se puede efectuar por medio de la inhibición o estimulación de secuencias reguladoras que dirigen la expresión del gen endógeno o transgén. Tales secuencia reguladoras se pueden introducir en una planta. Por ejemplo, el promotor de fuerza media definido anteriormente se puede introducir en una planta para dirigir al gen endógeno que codifica para CCS52, donde el promotor de fuerza media puede ser heterólogo al gen endógeno que codifica para CCS52; Heterólogo no siendo de ocurrencia natural en las secuencias de ácido nucleico que flanquean a la región de codificación de CCS52 cuando está en su ambiente genómico biológico.

El término "proteína CCS52" como se lo utiliza aquí abarca a un gen activador del ciclo celular que codifica a una proteína de 52 kDa, y este término también abarca variantes de los mismos. Los ejemplos de proteínas CCS52 están representados aquí por la SEQ ID NO: 2, 4 ó 6. Otros ejemplos de proteínas CCS52 están descritas en Cebolla y colaboradores (EMBO 1999, vol. 18 (16) 4476 - 4484) y en Tarayre y colaboradores (The plant cell, 2004, vol. 16:
422 - 434). Los términos "ácido nucleico que codifica para CCS52" o "gen que codifica para CCS52" o "ácido nucleico que codifica a una proteína CCS52" se utilizan aquí en forma intercambiable y abarcan, por ejemplo, ácidos nucleicos como los representados por la SEQ ID NO: 1, 3 ó 5, o variantes de las mismas. Una variante e la proteína CCS52 o una variante del ácido nucleico que codifica a una proteína CCS52 incluyen:

(i): Porciones funcionales de un ácido nucleico que codifica para CCS52, por ejemplo de las SEQ ID NO: 1, 3 ó 5;

(ii): Ácidos nucleicos capaces de hibridación con un ácido nucleico que codifica para CCS52, por ejemplo con la SEQ ID NO: 1, 3 ó 5;

(iii): Variantes alternativas de empalme de un ácido nucleico que codifica para CCS52, por ejemplo de la SEQ ID NO: 1, 3 ó 5;

(iv): Variantes alélicas de un ácido nucleico que codifica para CCS52, por ejemplo de la SEQ ID NO: 1, 3 ó 5;

(v): Homólogos de una proteína CCS52, por ejemplo de la SEQ ID NO: 2, 4 ó 6;

(vi): Derivados de una proteína CCS52, por ejemplo de la SEQ ID NO: 2, 4 ó 6; y

(vii): Fragmentos activos de una proteína CCS52, por ejemplo de la SEQ ID NO: 2, 4 ó 6.

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De acuerdo con una modalidad preferida, tales variantes son (o codifican) proteínas que tienen al menos uno de los motivos conservados de CCS52 como se describió aquí anteriormente.

De acuerdo con una modalidad preferida, tales variantes son (o codifican) proteínas que tienen actividad de CCS52, o son (o codifican) proteínas que retienen una actividad biológica similar o al menos parte de la actividad biológica de una proteína CCS52. La actividad biológica de una proteína CCS52 puede ser analizada como se describe en Cebolla y colaboradores, 1999. Este análisis involucra la sobreexpresión de la CCS52 o una variante en Saccharomyces pombe. Los fenotipos de las células transformadas de levadura se comparan con los fenotipos de las células de levadura transformadas con el vector vacio pREP1 como control negativo, y con los fenotipos de las células de levadura transformadas con el pREP1-srw1^{+} como control positivo. La expresión ya sea de srw1^{+} o de CCS52 debe resultar en detención en el crecimiento de las células.

Convenientemente, los métodos de acuerdo con la invención pueden ser practicados utilizando variantes de la proteína CCS52 y variantes de los ácidos nucleicos que codifican para CCS52. Las variantes adecuadas incluyen variantes de la SEQ ID NO: 2, 4 ó 6 y/o variantes de la SEQ ID NO: 1, 3 ó 5.

El término "variante" incluye variantes en la forma de un complemento, ADN, ARN, ADNc o ADN genómico. La variante de ácido nucleico se puede sintetizar toda o en parte, puede ser un ácido nucleico bicatenario o un ácido nucleico monocatenario. También, el término "variante" abarca a una variante debida a la degeneración del código genético, un miembro de la familia del gen o de la proteína y variantes que son interrumpidas por una o más secuencias intervinientes, tales como intrones, secuencias espaciadoras o transposones.

Una variante de ácido nucleico que codifica a una proteína CCS52 es una porción funcional de un ácido nucleico que codifica a una proteína CCS52. Convenientemente, el método de la presente invención puede ser practicado también utilizando una porción de un ácido nucleico que codifica a una proteína CCS52. Una porción funcional se refiere a una pieza de ADN derivada de una molécula original (mayor) de ADN, cuya porción, retiene al menos parte de la funcionalidad del ADN original, cuya porción funcional, cuando se expresa en una planta, produce plantas que tienen características mejoradas de crecimiento. La porción se puede elaborar por medio de una o más supresiones y/o truncamientos del ácido nucleico. Las técnicas para hacer tales supresiones y/o truncamientos son bien conocidas en el arte. Las porciones adecuadas para uso en los métodos de acuerdo con la invención se pueden determinar fácilmente siguiendo los métodos descritos en la sección de los Ejemplos por medio de sustitución simple de las secuencias utilizadas en el Ejemplo actual con la porción.

Otra variante de un ácido nucleico que codifica a una proteína CCS52 es un ácido nucleico capaz de hibridación con un ácido nucleico que codifica a una proteína CCS52, por ejemplo con cualquiera de los ácidos nucleicos como los representados por la SEQ ID NO: 1, 3 ó 5. Las secuencias de hibridación adecuadas para uso en los métodos de acuerdo con la invención se pueden determinar fácilmente, por ejemplo, siguiendo los métodos descritos en la sección de los Ejemplos por simple sustitución de la secuencia utilizada en el Ejemplo actual con la secuencia de hibridación.

El término "hibridación" como se lo utiliza aquí significa apareamiento a secuencias complementarias de nucleótidos sustancialmente homólogas en un proceso de hibridación. El proceso de hibridación puede ocurrir completamente en solución, esto es, ambos ácidos nucleicos complementarios están en solución. Las herramientas en biología molecular que confían en un proceso así incluyen a la reacción en cadena de la polimerasa (PCR: y todos los métodos que se basan en ella), hibridación sustractiva, extensión aleatoria del iniciador, mapeo de la nucleasa S1, extensión del iniciador, transcripción inversa, síntesis de ADNc, despliegue diferencial de los ARN, y determinación de la secuencia de ADN. El proceso de hibridación puede ocurrir también con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizado a una matriz tal como cuentas magnéticas, glóbulos de Sefarosa o cualquier otra resina. Las herramientas en biología molecular que cuentan con tal proceso incluyen el aislamiento de poli (A^{+}) ARNm. El proceso de hibridación puede ocurrir además con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizado a un soporte sólido tal como una membrana de nitrocelulosa o de nylon o inmovilizado por ejemplo por medio de fotolitografía por ejemplo a un soporte de vidrio silíceo (esta última conocida como arreglos de ácido nucleico o microarreglos o como chips de ácido nucleico). Las herramientas en biología molecular que cuentan con un proceso así incluyen análisis de transferencia del gel de ARN y ADN, hibridación de colonias, hibridación de placas, hibridación in situ e hibridación de microarreglos. Con el propósito de permitir que ocurra la hibridación, generalmente se desnaturalizan térmica o químicamente las moléculas de ácido nucleico para fundir una hebra doble en dos hebras sencillas y/o para remover horquillas u otras estructuras secundarias de los ácidos nucleicos monocatenarios. El rigor de la hibridación está influenciado por condiciones tales como la temperatura, la concentración de sal/sodio y la composición del amortiguador de hibridación. Las condiciones de severidad para la hibridación incluyen alta temperatura y/o baja concentración de sal (las sales incluyen NaCl y citrato de Na_{3}) y/o la inclusión de formamida en el amortiguador de hibridación y/o disminución de la concentración de compuestos tales como SDS (detergente de dodecil sulfato de sodio) en el amortiguador de hibridación y/o exclusión de compuestos, tales como sulfato de dextrano o polietilén glicol (promoción de hacinamiento molecular) del amortiguador de hibridación. Las condiciones convencionales de hibridación están descritas, por ejemplo en Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3^{ra} Edición Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York, pero el especialista entrenado se dará cuenta que se pueden diseñar numerosas condiciones de hibridación diferentes en función de la identidad de secuencia conocida o la esperada y/o de la longitud de los ácidos nucleicos. Se prefieren particularmente las condiciones de hibridación de rigor suficientemente bajo (al menos en el primer caso) para aislar ácidos nucleicos heterólogos para las secuencias de ADN de la invención definidas más arriba. Un ejemplo de condiciones de baja rigurosidad es 4 - 6x SSC /0,1 - 0,5% p/v SDS a 37 - 45ºC durante 2-3 horas. Dependiendo de la fuente y la concentración del ácido nucleico involucrado en la hibridación, se pueden emplear condiciones alternativas de rigurosidad, tal como condiciones de rigurosidad media. Los ejemplos de condiciones de rigurosidad media incluyen 1 - 4x SSC/0,25% p/v SDS a \geq 45ºC durante 2 - 3 horas. Preferiblemente, las variantes capaces de hibridar con un gen que codifica para CCS52 son capaces de hibridar específicamente. Por "hibridar específicamente" se entiende hibridar bajo condiciones rigurosas. Un ejemplo de condiciones de alta rigurosidad incluyen 0,1 - 2XSSC, 0,1XSDS, y 1X SSC, 0,1X SDS a 60ºC durante 2 - 3 horas.

Los métodos de acuerdo con la presente invención se pueden practicar también utilizando una variante alternativa de empalme de un ácido nucleico que codifica a una proteína CCS52, por ejemplo, una variante alternativa de empalme de la SEQ ID NO: 1, 3 ó 5. El término "variante alternativa de empalme" como se la utiliza aquí abarca variantes de un ácido nucleico en las cuales se han removido intrones y/o exones seleccionados, reemplazado o añadido. Tales variantes de empalme se pueden encontrar en la naturaleza o se pueden sintetizar. Los métodos para elaborar tales variantes de empalme son bien conocidos en el arte. Las variantes de empalme adecuadas para uso en los métodos de acuerdo con la invención se pueden determinar fácilmente, por ejemplo, siguiendo los métodos descritos en la sección de los Ejemplos por medio de simple sustitución de la secuencia utilizada en el Ejemplo actual con la variante de empalme.

Otra variante de ácido nucleico que codifica para CCS52 útil en la práctica del método para mejorar las características de crecimiento de las plantas, es una variante alélica de la SEQ ID NO: 1, 3 ó 5. Las variantes alélicas existen en la naturaleza y abarcado dentro de los métodos de la presente invención está el uso de estos alelos naturales. Las variantes alélicas también abarcan Polimorfismos de un Solo Nucleótido (SNP) así como Polimorfismos Pequeños de Inserción/Supresión (INDEL). El tamaño de los INDEL es usualmente menor a 100 pb. Los SNP y los INDEL forman el conjunto más grande de variantes de secuencia en cepas polimórficas de ocurrencia natural de la mayoría de organismos. Las variantes alélicas adecuadas para uso en los métodos de acuerdo con la invención se pueden determinar fácilmente, por ejemplo, siguiendo los métodos descritos en la sección de los Ejemplos por simple sustitución de la secuencia utilizada en el Ejemplo actual con la variante alélica.

La presente invención provee un método para incrementar el rendimiento/la biomasa con relación a la correspondiente planta de tipo silvestre, que comprende incrementar la expresión en una planta de una variante alternativa de empalme o de una variante alélica de un ácido nucleico que codifica una proteína CCS52 y/o incrementando el nivel y/o la actividad en una planta de una proteína CCS52 codificada por una variante alternativa de empalme o variante alélica, en donde dicha expresión está dirigida por un promotor de fuerza media definido anteriormente.

Un ejemplo de una variante de la proteína CCS52 útil en la práctica de los métodos de la presente invención es un homólogo de una proteína CCS52. Los "homólogos" de una proteína CCS52 abarcan péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que tienen una sustitución, supresión y/o inserción de aminoácidos con relación a la proteína CCS52 en cuestión y que tienen actividad biológica y funcional similar a la CCS52. Los homólogos de una proteína CCS52 se pueden sintetizar a través de las técnicas de ingeniería genética y/o de ingeniería de proteínas. Para producir tales homólogos, se pueden reemplazar aminoácidos de la proteína por otros aminoácidos que tengan propiedades similares (tales como hidrofobicidad similar, hidrofilicidad, antigenicidad, propensión a formar o romper estructuras de hélice \alpha o estructuras de lámina \beta). Las tablas de sustitución conservadora son bien conocidas en el arte (ver, por ejemplo Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman and Company).

Los homólogos de una proteína CCS52 particular pueden existir en la naturaleza y se pueden encontrar en la misma o en diferentes especies u organismos a partir de los cuales se deriva la proteína particular CCS52. Dos formas especiales de homólogos, ortólogos y parálogos, son conceptos evolucionistas utilizados para describir relaciones ancestrales de genes. El término "ortólogos" se relaciona con genes en organismos diferentes que son homólogos debido a relación ancestral. El término "parálogos" se relaciona con duplicación de los genes dentro del genoma de una especie que conduce a genes parálogos. El término "homólogos" como se lo utiliza aquí abarca también parálogos y ortólogos de una proteína CCS52, que son también útiles en la práctica de los métodos de la presente invención.

Otra forma especial de un homólogo de CCS52 es un miembro de la misma familia de genes que codifican para las proteínas CCS52. Se sabe que AtCCS52A1 pertenece a una familia de múltiples genes, y por lo tanto una persona capacitada en el arte reconocerá que los métodos de acuerdo con la presente invención pueden ser practicados también utilizando la secuencia de codificación de un miembro de la familia de una proteína CCS52, tal como un miembro de la familia de la SEQ ID NO: 2, 4 ó 6.

Los homólogos útiles en el método de acuerdo con la invención tienen un orden creciente de preferencia, al menos del 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% de identidad de secuencia con una proteína CCS52, por ejemplo, con cualquiera de las SEQ ID NO: 2, 4 ó 6. Alternativamente, la secuencia de ácido nucleico que codifica a cualquiera de los homólogos anteriormente mencionados puede tener al menos 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% de identidad de secuencia con un ácido nucleico que codifica para CCS52, por ejemplo, con cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 3 ó 5.

El porcentaje de identidad de secuencia como se mencionó anteriormente, entre proteínas o ácidos nucleicos, se puede calcular utilizando un programa de alineación global que forma grupos de dos implementando el algoritmo de Needleman - Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443 - 453, 1970), que maximiza el número de correspondencias y mantiene el número de vacios en un mínimo. Para el cálculo de los porcentajes anteriormente mencionados, se puede utilizar el programa aguja (paquete EMBOSS) con una penalización por un intervalo abierto de 10 y una penalización de 0,1 por extensión del vacío. Para proteínas, se utiliza preferiblemente la matriz blosum62 con una longitud de palabra de 3. Para ácidos nucleicos, el programa aguja utiliza la matriz "ADN completo", con una longitud de palabra de 11, como lo suministra el paquete EMBOSS. El algoritmo de Needleman - Wunsch es más adecuado para análisis relacionados con secuencias de proteínas en toda su longitud.

Los homólogos útiles en los métodos de acuerdo con la invención (las proteínas o sus secuencias de codificación de ácido nucleico) se pueden derivar (ya sea directa o indirectamente (si se modifica posteriormente) a partir de cualquier fuente como se describe aquí más adelante, siempre que la secuencia, cuando se exprese en una planta, conduzca a características mejoradas en el crecimiento de la planta. El ácido nucleico (o la proteína) se pueden aislar de levadura, hongos, plantas, algas, insectos o animales (incluidos los humanos). Este ácido nucleico se puede modificar sustancialmente a partir de su forma nativa en composición y/o ambiente genómico a través de manipulación humana deliberada.

El ácido nucleico que codifica a un homólogo de CCS52 se aísla preferiblemente de una planta. Ejemplos de proteínas CCS52 son CCS52A1 de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 2 y la correspondiente secuencia de codificación SEQ ID NO: 1), CCS52A de Oryza sativa (SEQ ID NO: 4 y la correspondiente secuencia de codificación SEQ ID NO: 3), y CCS52B de Oryza sativa (SEQ ID NO: 6 y la correspondiente secuencia genómica SEQ ID NO: 5).

Las proteínas CCS52 de Arabidopsis thaliana y de Medicago sativa han sido subdivididas en diferentes clases (Cebolla y colaboradores, 1999, EMBO J. 18: páginas 4476 - 4484). La clase CCS52A (con las isoformas A1 y A2) y la clase CCS52B (con la isoforma B1). Estas clases y las isoformas son también abarcados por el término "homólogo" como se lo utiliza aquí. Convenientemente, estas diferentes clases e isoformas de las proteínas CCS52, o sus ácidos nucleicos de codificación, pueden ser utilizados en los métodos de la presente invención. Por lo tanto, la presente invención provee un método como se describió aquí anteriormente, en donde el ácido nucleico que codifica para CCS52 o la proteína CCS52 se obtienen a partir de una planta, preferiblemente de una planta dicotiledónea, preferiblemente además de la familia Brassicaceae, más preferiblemente de Arabidopsis thaliana. De acuerdo con una modalidad adicional, CCS52 es CCS52A o CCS52B. De acuerdo con una modalidad adicional de la invención, CCS52 es una proteína CCS52A1. Una persona capacitada en el arte reconocerá que una "CCS52A1" es una proteína más estrechamente relacionada con AtCCS52A1, que con AtCCS52A2 o AtCCS52B. Esta relación más cercana se puede determinar calculando el porcentaje de identidad de secuencia, o comparando la presencia de motivos conservados como se describe aquí más adelante.

Aún otros homólogos adecuados de CCS52 y sus secuencias de codificación pueden ser encontrados en bases de datos (públicas) de secuencia. Los métodos para la búsqueda e identificación de homólogos de la proteína CCS52 en bases de datos de secuencia estarían también dentro del dominio de una persona capacitada en el arte. Tales métodos, involucran las bases de datos para selección de secuencia con las secuencias suministradas por la presente invención, por ejemplo, la SEQ ID NO: 2, 4 ó 6 (o la SEQ ID NO: 1, 3 ó 5), preferiblemente en una forma entendible para un ordenador. Las bases de datos útiles de secuencia incluyen, pero no se limitan al Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.govlweb/Genbank), la European Molecular Biology Laboratory Nucleic Acid Database (EMBL) (http: /w.ebi.ac.uk/ebi-docs/embl-db.html) o versiones de las mismas o la base de datos MIPS (http://mips.gsf.de/). Se conocen en el estado del arte diferentes algoritmos de búsqueda y software para la alineación y comparación de secuencias. Tales software incluyen, por ejemplo, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA. Preferiblemente, se utiliza el software BLAST, que calcula el porcentaje de identidad de secuencia y realiza un análisis estadístico de la similitud entre las secuencias. El conjunto de programas denominado como programas BLAST tiene 5 implementaciones diferentes: tres diseñadas para rastreo de secuencias de nucleótidos (BLASTN, BLASTX, y TBLASTX) y dos diseñadas para rastrear secuencias de proteína (BLASTP y TBLASTN) (Coulson, Trends in Biotechnology: 76 - 80, 1994; Birren y colaboradores, GenomeAnalysis, 1: 543, 1997). El software para llevar a cabo un análisis BLAST está públicamente disponible a través del National Centre for Biotechnology Information.

Los ortólogos de uno proteína CCS52 en otra especie de planta se pueden encontrar fácilmente llevando a cabo una búsqueda recíproca Blast. Este método incluye la búsqueda en una o más bases de datos de secuencia con un gen de búsqueda o proteína (por ejemplo, cualquiera de la SEQ ID NO: 1 ó 6), utilizando por ejemplo, el programa BLAST. Los genes objetivo de más alto rango que resultan de esta búsqueda son utilizados luego como una secuencia de búsqueda en una búsqueda BLAST similar. Solamente aquellos genes que tienen como correspondencia más alta nuevamente a la secuencia original de búsqueda son considerados como genes ortólogos. Por ejemplo, para encontrar un ortólogo del arroz de un gen de Arabidopsis thaliana, se puede llevara a cabo un análisis BLASTN o TBLASTX sobre una base de datos del arroz tal como la base de datos de la Oryza sativa Nipponbare disponible en el sitio web NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). En una siguiente etapa, se utilizan las secuencias del arroz de más alto rango en una búsqueda BLAST inversa sobre una base de datos de secuencia de Arabidopsis thaliana. Se puede utiliza el método para identificar ortólogos de muchas especies diferentes, por ejemplo, de maíz.

Los parálogos de una proteína CCS52 en la misma especie se pueden encontrar fácilmente llevando a cabo una búsqueda Blast sobre secuencias de la misma especie de las cuales se deriva la proteína CCS52. A partir de las secuencias que son seleccionadas por medio de la búsqueda Blast, se pueden identificar los parálogos verdaderos buscando la identidad de secuencia más alta o la conservación más alta de motivos de CCS52 típicos como se describe aquí más adelante.

Los homólogos de una proteína AtCCS52A1, como os representados por medio de la SEQ ID NO: 2, y sus secuencias de codificación, se pueden encontrar en muchas especies diferentes. Ejemplos de tales homólogos están presentes en el árbol filogenético en la Figura 12. Los homólogos se presentan por medio de su número de acceso en el Genbank. Los homólogos preferidos que se utilizan en la presente invención son los homólogos que se agrupan cerca de AtCCS52A1_At4g22910, por ejemplo, aquellos homólogos que se agrupan entre OsAP003298.3 y Hs19_NP_057347.1. Estos homólogos incluyen pero no se limitan a Hs19_NP_057347.1, Mm_NP_062731, XL-CAA74576.1, Ggcdh1c_AAL31949, Ggcdh1b_AAL31948.1, Ggcdh1d_AAL31950, Ggcdh1a_AAL31947, Dm_NP_
726941, Ag_agCP12792, Ce_NP_496075.1, Dm_NP_611854, y los homólogos que se agrupan más cercanamente a AtCCS52A1_At4g22910, incluyendo a Le_AW0030735, AtCCS52A2_At4g11920, MtCCS52A_AF134835, Gm_
BG044933, Os_AK070642, Zm_AY112458, AtCCS52B_At5g13840, MsCCSB, Gm_A1736659 y Zm_Al861254. Las secuencias del genoma de Arabidopsis thaliana y de Oryza sativa se encuentran ahora disponibles en bases públicas de datos tales como el Genbank y otros genomas están siendo secuenciados en este momento. Por lo tanto, se espera que sean fácilmente identificables otros homólogos por medio de la alineación de la secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 6 utilizando los programas BLASTX o BLASTP u otros programas.

Los análisis por medio del software mencionados anteriormente para comparación de secuencias, para el cálculo de identidad de secuencia, para la búsqueda de homólogos, ortólogos o parálogos o para la elaboración de un árbol filogenético, se hace preferencialmente con secuencias de longitud completa. Alternativamente, estos análisis por medio de software se pueden llevar a cabo con una región conservada de la proteína CCS52 o secuencia de ácido nucleico, como se describe aquí más adelante. Por lo tanto, estos análisis se pueden basar en la comparación y el cálculo de identidad de secuencia entre regiones conservadas, dominios funcionales, motivos o cajas.

La identificación de dominios de proteína, motivos y cajas, estaría también dentro del dominio de una persona capacitada en el arte utilizando información del dominio de una proteína tal como la disponible en las bases de datos PRODOM (http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/dbbrowser/jj/prodomsrchjj.html), PIR (http://pir.georgetown.edu/), PROSITE (http://au.expasy.org/PROSITE/) o pFAM (http://pFAM.wustl.edu/). Los programas de software diseñados para tal búsqueda del domino incluyen, pero no se limitan a, MotifScan, MEME, SIGNALSCAN, y GENESCAN. MotifScan es un programa preferido de software y está disponible en (http://hits. isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCAN), cuyo programa utiliza la información del dominio de la proteína de PROSITE y pFAM. Un algoritmo MEME (Versión 3.0) puede ser encontrado en el paquete GCG; o en http://www.sdsc.edu/MEME/meme. La información de SIGNALSCAN versión 4.0 está disponible en http://biosci.cbs.umn.edu/software/sigscan.html. GENESCAN puede ser encontrado en http://gnomic.stanford.edu/GENESCANW.html.

Se han identificado diez motivos conservados en proteínas CCS52 y las secuencias de consenso para estos motivos están representadas aquí por medio de las SEQ ID NO: 7 a 16 (ver Figura 13). Preferiblemente, se utilizan estos motivos para bases de datos de búsqueda y para identificar homólogos de secuencias de CCS52. La presencia de estos motivos (por ejemplo, como los representados por las SEQ ID NO: 7 a 16), se puede determinar por medio de selección de las secuencias de proteínas para identificación de secuencia con estos motivos de consenso. Otro aspecto de la presente invención es el uso de motivos conservados de CCS52 como los representados por medio de cualquiera de las SEQ ID NO: 7 a 15, para identificar, o para fabricar (a través de ingeniería de proteínas o el injerto de tales motivos dentro de una proteína objetivo), homólogos de un gen que codifica para CCS52 o proteína que son capaces de mejorar las características de crecimiento de una planta. El motivo N-terminal conservado, la caja C (SEQ ID NO: 16) está descrita además en Tarayre y colaboradores, 2004.

Los homólogos preferidos de CCS52 útiles en los métodos de la presente invención son proteínas CCS52 de la planta que incluyen al menos 4 de los motivos de consenso anteriormente mencionados. El motivo número 2, como el representado por medio de la SEQ ID NO: 8 ha sido descrito también como un motivo "CSM" N-terminal en Tarayre y colaboradores, 2004. El motivo número 9, como el representado por medio de la SEQ ID NO: 15, está presumiblemente involucrado en la interacción con otras proteínas; es un motivo IR C-terminal, que ha sido descrito como necesario para la funcionalidad de CCS52 en el complejo APC. Además, la presencia de múltiples motivos conservados (SEQ ID NO: 7 a 16) sugiere fuertemente que las proteínas CCS52 están involucradas en múltiples interacciones y que existen varios genes/proteínas objetivo que codifican para CCS52. Detalles adicionales sobre la relación entre el motivo IR y la funcionalidad de CCS52 están descritos en Tarayre y colaboradores (2004, Plant Cell., 16(2): 422 - 34), cuyo documento se incorpora aquí como referencia como si estuviera publicado en su totalidad.

La Figura 13 muestra los motivos individuales conservados de diferentes proteínas CCS52 así como las secuencias de consenso de las mismas, que se representan aquí por medio de las SEQ ID NO: 7 a 16. Una persona capacitada en el arte reconocerá que un motivo de CCS52 puede desviar, por ejemplo 1 ó 2 faltas de correspondencia, de los motivos de consenso de CCS52 mencionados anteriormente, sin perder su funcionalidad. Un ejemplo de tal desviación es el número de aminoácidos "X" en el motivo 3.

Como se puede deducir a partir de la Figura 13, las secuencias de consenso se pueden definir más cuando se toman en cuenta únicamente las proteínas CCS52A. Por ejemplo, para las proteína CCS52A, el Motivo número 1 tiene G sobre la posición 1, N en posición 3, F o L en posición 4, A en posición 5, L en posición 6 y L o I en posición 9. Este Motivo 1 de consenso para las proteínas CCS52A está representado aquí por medio de la SEQ ID NO: 17. Para las proteínas CCS52A, el Motivo número 7 tiene T en posición 5 y H en posición 8. También, para las proteínas CCS52A, el Motivo número 9 tiene "I" en posición 2 y "R" en posición 9.

Algunas de las variantes como las mencionadas aquí anteriormente pueden ocurrir en la naturaleza y pueden ser aisladas de la naturaleza. Una vez que la secuencia de una variante es conocida, y su correspondiente secuencia de codificación, la persona capacitada en el arte será capaz de aislar al gen correspondiente que codifica para la CCS52 o una variante de material biológico tal como bibliotecas genómicas, por ejemplo, por medio de la técnica de la PCR. Un ejemplo de tal experimento es descrito en el Ejemplo 1. Alternativamente, cuando no se conoce la secuencia exacta, se pueden aislar nuevas proteínas CCS52 de material biológico a través de técnicas de hibridación con base en sondas de proteínas CCS52 conocidas.

Alternativa y/o adicionalmente, se pueden sintetizar algunas variantes como las mencionadas anteriormente a través de técnicas que involucran, por ejemplo, mutación (sustitución, inserción o supresión) o derivación. Estas variantes son denominadas aquí como "derivadas", las cuales son también útiles en los métodos de la presente invención. Los derivados de una proteína se pueden elaborar fácilmente utilizando técnicas de síntesis de péptidos bien conocidas en el arte, tal como síntesis de péptidos en fase sólida y similares, o por medio de ingeniería de proteínas a través de manipulaciones del ADN recombinante. La manipulación de secuencias de ADN para producir variantes de sustitución, inserción o supresión de una proteína son bien conocidas en el arte. Por ejemplo, las técnicas para elaborar mutaciones por sustitución en sitios predeterminados en el ADN son bien conocidas por aquellos capacitados en el arte e incluyen mutagénesis M13, mutagénesis in vitro del Gen T7 (USB, Cleveland, OH), mutagénesis QuickChange Site Directed (Stratagene, San Diego, CA), mutagénesis dirigida al sitio mediada por la PCR u otros protocolos de mutagénesis dirigida al sitio.

Un ejemplo de un derivado es una variante de sustitución. El término "variantes de sustitución" de una proteína CCS52 se refiere a aquellas variantes en las cuales al menos un residuo en una secuencia de aminoácidos ha sido removido y se ha insertado un aminoácido diferente en su lugar. Las sustituciones de aminoácidos son típicamente de residuos individuales, pero puede ser de grupos de residuos dependiendo de la restricción funcional ubicada en el polipéptido; las inserciones son usualmente del orden de aproximadamente 1 - 10 aminoácidos, y las supresiones pueden estar en le rango de aproximadamente 1 - 20 aminoácidos. Preferiblemente, las sustituciones de aminoácidos incluyen sustituciones conservadoras de aminoácidos.

Otros derivados son "variantes de inserción" en las cuales se introducen uno o más aminoácidos dentro de un sitio predeterminado en la proteína CCS52. Las inserciones pueden incluir fusión amino - terminal y/o carboxi - terminal así como inserción dentro de la secuencia de aminoácidos individuales o múltiples. Generalmente, las inserciones dentro de la secuencia de aminoácidos son del orden de aproximadamente 1 a 10 aminoácidos. Los ejemplos de fusiones amino o carboxi - terminales incluyen la fusión del dominio de enlazamiento o del dominio de activación de una activador transcripcional como el utilizado en el sistema hibrido doble de levadura, proteínas de recubrimiento de fago, (histidina) rótulo 6, rótulo de la glutationa S-transferasa, proteína A, proteína de enlazamiento de maltosa, dihidrofolato reductasa, epítopo de Tag\cdot100, epítopo de cmyc, epítopo de FLAG\hat{a}, lacZ, CMP (péptido de enlazamiento de Calmodulina), epítopo de HA, epítopo de proteína C y epítopo de VSV.

Otros derivados de una proteína CCS52 son las "variantes de supresión", caracterizadas por la remoción de uno o más aminoácidos de la proteína.

Otro derivado de una proteína CCS52 se caracteriza por sustituciones, y/o supresiones y/o adiciones de aminoácidos de ocurrencia natural y que no son de ocurrencia natural comparados con los aminoácidos de una proteína CCS52 de ocurrencia natural. Un derivado puede incluir también uno o más sustituyentes no aminoácidos comparado con la secuencias de aminoácidos de la cual se deriva. Tales sustituyentes no aminoácidos incluyen por ejemplo, aminoácidos que no son de ocurrencia natural, una molécula reportera u otro ligando, enlazados en forma covalente o no covalente a la secuencia de aminoácidos. Tal molécula reportera puede estar enlazada para facilitar la detección de la proteína CCS52.

Otra variante de una proteína CCS52 útil en los métodos de la presente invención es un fragmento activo de una proteína CCS52. Los "fragmentos activos" de una proteína CCS52 abarcan al menos cinco residuos contiguos de aminoácidos de una proteína CCS52, los cuales retienen actividad funcional y/o biológica similar a la de una proteína de ocurrencia natural o de una parte de la misma. Los fragmentos adecuados incluyen fragmentos de una proteína CCS52 que comienza en el segundo o en el tercero o en un residuo posterior interno de metionina. Estos fragmentos que se originan a partir de la traducción de la proteína, iniciando en los codones internos ATG, mientras retienen su funcionalidad en los métodos de la presente invención. Los fragmentos funcionales adecuados de una proteína CCS52, o porciones adecuadas de ácido nucleicos que corresponden a tales fragmentos, útiles en los métodos de la presente invención, pueden tener uno o más de los motivos conservados de proteínas CCS52 como las representadas por medio de la SEQ ID NO: 7 a 16, mientras se retiene su funcionalidad en los métodos de la presente invención. Un ejemplo particular de un fragmento funcional es un fragmento de una proteína CCS52 del arroz, por ejemplo de la SEQ ID NO: 6, que termina con el motivo IR.

De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, un método para mejorar las características de crecimiento de la planta incluye una mayor expresión de un ácido nucleico que codifica a una proteína CCS52. Los métodos para obtener una mayor expresión de los genes o de los productos génicos (proteínas) están bien documentados en el arte e incluyen, por ejemplo, la sobreexpresión dirigida por un promotor operativamente enlazado, o el uso de reforzadores de transcripción o de reforzadores de traducción. El término sobreexpresión como se lo utiliza aquí significa cualquiera forma de expresión que sea adicional al nivel de expresión original tipo silvestre. Preferiblemente, el ácido nucleico que es introducido en la planta y/o el ácido nucleico que se sobreexpresa en la planta está en la dirección sentido con respecto al promotor al cual está operativamente enlazado. Preferiblemente, en los métodos de la presente invención un ácido nucleico que codifica a una proteína CCS52 se sobreexpresa en una planta, tal como un ácido nucleico que codifica para CCS52 de la SEQ ID NO: 1.

Alternativa y/o adicionalmente, la mayor expresión de un gen que codifica para CCS52 o un mayor nivel, y/o actividad de una proteína CCS52 en una célula de una planta, pueden ser logrados por medio de mutagénesis. Por ejemplo, las mutaciones pueden ser responsables por el control alterado de un gen endógeno que codifica para CCS52, resultando en una mayor expresión del gen, con relación al gen de tipo silvestre. Las mutaciones pueden provocar también cambios conformacionales en una proteína, resultando en niveles más altos y/o en más actividad de la proteína CCS52. Tales mutaciones o tale genes mutantes se pueden seleccionar, o aislar y/o ser introducidos en la misma especie de planta o en una diferente con el propósito de obtener plantas que tiene características de crecimiento mejoradas. Los ejemplos de tales mutantes incluyen mutantes dominantes positivos de un gen que codifica para CCS52. También se describen constructos genéticos y vectores que pueden ser utilizados en el método de acuerdo con la invención y que facilitan la introducción y/o facilitan la expresión y/o facilitan el mantenimiento en una célula huésped de los ácidos nucleicos útiles en los métodos de acuerdo con la invención. Por lo tanto, se describe un constructo genético que incluye:

(a): un ácido nucleico que codifica a una proteína CCS52 o a una variante de la misma, operativamente enlazado a

(b): un promotor de fuerza media como se definió anteriormente; y opcionalmente

(c): una secuencia de terminación de la transcripción.

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Los constructos útiles en los métodos de acuerdo con la presente invención pueden ser construidos utilizando tecnología de ADN recombinante bien conocida por las personas capacitadas en el arte. Los constructos génicos se pueden insertar en vectores, que pueden estar comercialmente disponibles, adecuados para transformarse en plantas y adecuados para mantenimiento y expresión del gen de interés en las células transformadas. Preferiblemente, el constructo genético es un vector de expresión de una planta, adecuado para la introducción y/o el mantenimiento y/o la expresión de un ácido nucleico en una célula de una planta, tejido, órgano o plata completa.

El ácido nucleico de acuerdo con (a) es convenientemente cualquiera de los ácido nucleicos descritos aquí anteriormente. Un ácido nucleico preferido es un ácido nucleico representado por medio de la SEQ ID NO: 1, 3 ó 5, o una variante de las mimas como se definió aquí anteriormente, o es un ácido nucleico que codifica a un proteína como la representada por medio de la SEQ ID NO: 2, 4 ó 6, o una variante de las mismas como se definió aquí anteriormente.

Con el término "promotor" se entiende una secuencia de control de transcripción. El promotor de (b) es operable en una planta, lo más preferible el promotor se deriva de una secuencia de una planta.

Los términos "secuencia de control de transcripción" o "promotor" se utilizan aquí en forma intercambiable y se toman en un contexto amplio para referirse a ácidos nucleicos reguladores capaces de efectuar la expresión de las secuencias a las cuales están operativamente enlazadas. Abarcados por los términos anteriormente mencionados están las secuencias reguladoras de la transcripción derivadas de un gen genómico clásico de eucariota (incluida la caja TATA que es requerida para la iniciación precisa de la transcripción, con o sin una secuencia de la caja CCAAT) y elementos reguladores adicionales (esto es, secuencias de activación secuencia arriba, reforzadores y silenciadores) que alteran la expresión génica en respuesta a estímulos evolucionistas y/o externos, o en una forma específica del tejido. También está incluido dentro del término una secuencia reguladora transcripcional de una gen procariota clásico, en cuyo caso puede incluir una secuencia de caja -35 y/o secuencias reguladoras transcripcionales de caja -10. El término "elemento regulador" también abarca una molécula sintética de fusión o derivada, que confiere, activa o refuerza la expresión de una molécula de ácido nucleico en una célula, tejido u órgano.

El término "operativamente enlazado" como se lo utiliza aquí se refiere a un enlace funcional entre la secuencia promotora y el gen de interés, de tal manera que la secuencia promotora sea capaza de iniciar la transcripción del gen de interés. Preferiblemente, el gen de interés está operativamente enlazado en la orientación sentido hacia el promotor.

El término "promotor de fuerza media" significa un promotor diferente a un promotor fuerte y se refiere al nivel de expresión en tejidos vegetales verdes, particularmente el término "promotor de fuerza media" se refiere a un promotor que tiene un nivel de expresión en tejidos vegetales verdes que es al menos 10 veces menor que aquella del promotor CaMV35S.

Preferiblemente, el promotor de fuerza media es de fuerza media total durante el crecimiento vegetativo de la planta. Un ejemplo de tal promotor es el promotor de ubiquitina del girasol.

El término "promotor de fuerza media" claramente no incluye a un promotor CaMV35S, que se sabe que es un promotor muy fuerte.

Un método para medir la fuerza del promotor es a través del uso de fusiones promotor - beta - glucuronidasa. Si se fusiona por este medio el promotor al gen uidA de Escherichia coli que codifica a la beta - glucuronidasa y el constructo quimérico se transforma en una planta. Las proteínas se extraen del material de la planta y se mide la actividad GUS (Jefferson y colaboradores, 1987, EMBO J. 20; 6(13): 3901 - 7). Se calcula luego la actividad de promotor como la densidad óptica en unidades por mg de proteína extraída.

Los ejemplo de mediciones de los niveles de expresión de CaMV35S han sido descritos previamente, por ejemplo, para arroz (Battraw y Hall, 1990, Plant Mol Biol. 15(4): 527 - 38), para tabaco (Jefferson y colaboradores, 1987, EMBO J., 20 - 6 (13): 3901 - 7) y para Arabidopsis (S. Planchais, PhD. thesis University of Ghent, 2000).

En el contexto de esta invención, se mide la actividad GUS de tejidos vegetales después de germinación. Preferiblemente, estas mediciones se llevan a cabo durante el crecimiento vegetativo de la planta, por ejemplo, después de 2, preferiblemente después de 4 semanas después de la germinación.

De acuerdo con una modalidad de la presente invención, el promotor de fuerza media es un promotor constitutivo. El término "constitutivo" como se define aquí se refiere a un promotor que está sustancialmente expresado en forma continua y sustancialmente en todos los tejidos de una planta. Los ejemplos de promotores constitutivos útiles son los promotores de ubiquitina (en caso de promotores de ubiquitina de monocotiledoneas sin intrón), tal como los promotores de ubiquitina de arroz o de maíz.

De acuerdo con una modalidad particular de la invención, el promotor de fuerza media es el promotor de ubiquitina de girasol (sin intrón). El término "promotor de fuerza media" como se lo utiliza aquí significa por lo tano también un promotor que tiene la misma actividad o similar, que el promotor de ubiquitina de girasol en Arabidopsis thaliana. Actividad similar significa en este contexto, una actividad que es al menos 20 veces superior o inferior que la del promotor de ubiquitina de girasol, preferiblemente al menos 10 veces superior o inferior o 5 veces superior o inferior o 3 veces superior o inferior.

Alternativamente y de acuerdo con otra modalidad de la invención, el promotor de fuerza media es un promotor preferido del tejido, caracterizado por el hecho de que muestra expresión de fuerza media en un tejido vegetativo verde. El término promotor "específico del tejido" se lo utiliza aquí en forma intercambiable con un promotor "preferido del tejido". Un promotor útil en los métodos de la presente invención puede tener un nivel de expresión fuerte, en otras partes de la planta diferentes al tejido vegetativo verde. Por ejemplo, el promotor 2S2 de Arabidopsis thaliana, que confiere expresión fuerte en semillas, puede ser utilizado para los métodos de la presente invención. Además del promotor 2S2, otros promotores adecuados preferidos del tejido incluyen pPROLAMIN o pOLEOSIN, o promotores que muestran expresión fuerte en la aleurona, el embrión, el escutelo o el endospermo. Un ejemplo de un promotor preferido útil de tejido joven es el promotor beta - expansina.

En el documento WO 99/64451, se sugirió clonar un gen que codifica para CCS52 bajo el control del promotor endod12Ams o el promotor Srglb3 con el propósito de tener un efecto positivo sobre la diferenciación y la embriogénesis somática. Estos efectos positivos nunca han sido mostrados. Estos promotores son distintos de los constructos de la presente invención.

Opcionalmente, en el constructo genético divulgado, se pueden incorporar también una o más secuencias de terminación. El término "secuencia de terminación de la transcripción" abarca una secuencia de control en el extremo de una unidad transcripcional, que señala el procesamiento y la poliadenilación 3' de un transcripto primario y la terminación de la transcripción. Se pueden incorporar elementos reguladores adicionales, tales como reforzadores transcripcionales o de traducción, en el constructo genético. Aquellos capacitados en el arte serán consientes de las secuencias terminadora y reforzadora, que pueden ser adecuadas para ser utilizadas en la realización de la invención. Tales secuencias serían conocidas o pueden ser obtenidas fácilmente por una persona capacitada en el arte.

Los constructos genéticos divulgados pueden incluir además un origen de replicación, que es requerido para el mantenimiento y/o la replicación en un tipo específico de célula. Un ejemplo es cuando se requiere mantener un constructo genético en una célula bacteriana como un elemento genético episomal (por ejemplo, un plásmido o un cósmido). Los orígenes preferidos de replicación incluyen, pero no están limitados a, el f1 - ori y al colE1.

El constructo genético divulgado puede incluir opcionalmente un gen marcador seleccionable. Como se lo utiliza aquí, el término "gen marcador seleccionable" incluye a cualquier gen, que confiera un fenotipo sobre una célula en la cual se exprese para facilitar la identificación y/o selección de las células, que son transfectadas o transformadas con un constructo genético de la invención. Los marcadores adecuados se pueden seleccionar de los marcadores que confieren resistencia a los herbicidas o a los antibióticos. Las células que contiene el ADN recombinante serán capaces por lo tanto de sobrevivir en presencia de concentraciones de antibiótico o de herbicida que maten a las células no transformadas. Los ejemplos de genes marcadores seleccionables incluyen a los genes que confieren resistencia a los antibióticos (tal como el nptll que codifica a la neomicina fosfotransferasa capaz de fosforilar neomicina y kanamicina, o el hpt que codifica a la higromicina fosfotransferasa capaz de de fosforilar a la higromicina), a los herbicidas (por ejemplo, el bar que provee resistencia a la Basta; aroA o gox que proveen resistencia contra el glifosato), o genes que proporcionan una característica metabólica (tal como mana que permite que las plantas utilicen manosa como una fuente de carbono). Los genes marcadores visuales resultan en la formación de color (por ejemplo, beta - glucuronidasa, GUS), luminiscencia (tal como la luciferasa) o fluorescencia (Proteína de Fluorescencia Verde, GFP, y derivados de la misma). Los ejemplos adicionales de genes marcadores seleccionables incluyen al gen e resistencia a la ampicilina (Ampr), al gen de resistencia a la tetraciclina (Tcr) al gen de resistencia a la kanamicina bacteriana (Kanr), al gen de resistencia a la fosfinotricina, y al gen de la cloramfenicol acetil transferasa (CAT), entre otros.

Por lo tanto, la presente invención describe un método para la producción de plantas transgénicas que tienen un mayor rendimiento/biomasa con relación a las plantas correspondientes de tipo silvestre; que comprende:

(a): la introducción dentro de la célula de una planta de un ácido nucleico que codifica para CCS52 o una variante del mismo bajo el control de un promotor de fuerza media anteriormente definido, preferiblemente introduciendo un constructo genético como se describió aquí anteriormente;

(b): el cultivo de dicha célula de la planta bajo condiciones que promuevan el crecimiento de la planta.

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La "introducción" del ácido nucleico que codifica para CCS52 para el constructo genético dentro de la célula de la planta se logra preferiblemente por medio de transformación. El término "transformación" como se lo utiliza aquí abarca la transferencia de un polinucleótido exógeno en una célula huésped, sin tener en cuenta el método utilizado para la transferencia. El tejido de la planta capaz de propagación posterior por clonación, ya sea por organogénesis o por embriogénesis, puede ser transformado con un constructo genético de la presente invención. La escogencia del tejido depende de la especie particular de la planta que esta siendo transformada. Los ejemplos de tejidos objetivo incluyen discos de hojas, polen, embriones, cotiledones, hipocotiledones, mega gametofitos, tejido calloso, tejido meristemático existente (por ejemplo, meristemo apical, brotes auxiliares, y meristemos de la raíz), y tejido inducido del meristemo (por ejemplo, meristemo del cotiledón y meristemo del hipocotiledón). El polinucleótido puede ser introducido en forma transitoria o estable dentro de una célula huésped y puede ser mantenido en forma no integrada, por ejemplo, como un plásmido. Alternativamente, puede estar integrado dentro del genoma del huésped. Preferiblemente, el ácido nucleótido que codifica para CCS52 está integrado en forma estable en el genoma de la célula de la planta, lo cual se puede lograr, por ejemplo, utilizando un vector de transformación de la planta o un vector de expresión de la planta que tienen bordes de ADN - T, los cuales flanquean al ácido nucleico que será introducido en el genoma.

La transformación de una especie de planta es ahora una técnica de rutina. Convenientemente, de los diferentes métodos de transformación pueden ser utilizados para introducir el gen de interés dentro de una célula progenitora adecuada. Los métodos de transformación incluyen el uso de liposomas, electroporación, químicos que incrementan la absorción de ADN libre, inyección del ADN directamente dentro de la planta, bombardeo con pistola de partículas, transformación utilizando virus o polen y microproyección. Los métodos se pueden seleccionar del método de calcio/polietilén glicol para protoplastos (Krens, F.A. y colaboradores, 1882, Nature 296, 72 - 74; Negrutiu I. y colaboradores, June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363 - 373); electroporación de protoplastos (Shillito R.D. y colaboradores, 1985 Bio/Technol 3, 1099 - 1102); microinyección dentro del material de la planta (Crossway A. y colaboradores, 1986, Mol. Gen Genet 202, 179 - 185); bombardeo de partículas recubiertas de ADN o ARN (Klein T.M. y colaboradores, 1987, Nature 327, 70) infección con (no integradora) virus y similares. Un método preferido para la producción de plantas transgénicas de acuerdo con la invención, es un método de transformación mediado por Agrobacterium.

Las plantas transgénicas de arroz se producen Preferiblemente a través de una transformación mediada por Agrobacterium utilizando cualquiera de los métodos conocidos para transformación de arroz, tales como aquellos descritos en cualquiera de los siguientes escritos: solicitud europea de patente publicada EP1198985, Aldemita y Hodges (Planta, 1996, 199: 612 - 617,); Chan y colaboradores (Plant Mol. Biol., 1993, 22 (3): 491 - 506,); Hiei y colaboradores (Plant J., 1994, 6 (2): 271 - 282,). En el caso de la transformación del maíz, el método preferido es como se describe ya sea en Ishida y colaboradores (Nat. Biotechnol., 1996, 14(6): 745 - 50) o en Frame y colaboradores (Plant Physiol., 2002, 129 (1): 13 - 22).

Generalmente después de la transformación, las células de la planta o las agrupaciones de las células se seleccionan por la presencia de uno o más marcadores, las cuales son luego co-transformadas con el gen que codifica para CCS52.

La célula transformada resultante de la planta, la agrupación de células, o el tejido de la planta, pueden ser utilizados luego para regenerar una planta completa transformada a través de técnicas de regeneración bien conocidas por las personas capacitadas en el arte. Por lo tanto, el cultivo de células de la planta bajo condiciones que promuevan el desarrollo de la planta, puede abarcar las etapas de seleccionar y/o regenerar y/o de desarrollo hasta alcanzar la madurez.

Después de la transformación y regeneración del ADN, se pueden evaluar las plantas putativamente transformadas, utilizando por ejemplo análisis Southern, por la presencia del gen de interés, número de copia y/o organización genómica. Alternativa o adicionalmente, los niveles de expresión del ADN recientemente introducido se pueden monitorear utilizando análisis Western y/o Northern, siendo ambas técnicas conocidas por las personas ordinariamente capacitadas en el arte.

Las plantas transformadas generadas se pueden propagar por medio de una variedad de medios, tales como por medio de propagación clonal o técnicas de reproducción clásicas. Por ejemplo, se puede seleccionar una primera generación (o T1) de una planta transformada para producir transformantes homocigotos de segunda generación (o T2), y las plantas T2 preparadas adicionalmente a través de técnicas clásicas de reproducción.

Los organismos transformados generados pueden tomar una variedad de formas. Por ejemplo, pueden ser quimeras de células transformadas y de células no transformadas; transformantes clonales (por ejemplo, todas las células transformadas para contener el casete de expresión); injertos de tejidos transformados y no transformados (por ejemplo, en plantas un rizoma transformado injertado a un vástago no transformado).

La invención también describe células huésped que contiene una molécula aislada de ácido nucleico que codifica a una CCS52 o un constructo genético como se mencionó aquí anteriormente. Las células huésped preferidas de acuerdo con la invención son células de plantas. Por lo tanto, se describen células de plantas, tejidos, órganos y plantas completas que han sido transformados con un constructo genético como se describe aquí más arriba.

El método de acuerdo con la presente invención permite proveer plantas que tienen un rendimiento/biomasa mayores con relación a las plantas correspondientes de tipo silvestre. Estas plantas tienen mayores niveles de expresión de un ácido nucleico que codifica a una proteína CCS52 y/o un nivel y/o actividad mayores de una proteína CCS52. La presente invención también describe plantas que contienen un constructo genético como se describió aquí anteriormente, las cuales tienen un mayor rendimiento/biomasa.

La invención también divulga partes de la planta que pueden ser producidas de acuerdo con los métodos de la invención, preferiblemente una parte que puede ser cosechada de una planta, tal como, pero no limitado a, una semilla, una hoja, un fruto, una flor, un cultivo de tallo, un tallo, un rizoma, una raíz, un tubérculo, un bulbo y fibra de algodón.

El término "planta" como se lo utiliza aquí abarca a todas las plantas, progenitores y progenie de las plantas, y de las partes de la planta, incluyendo semillas, brotes; tallos, raíces (incluidos los tubérculos), y células de plantas, tejidos y órganos. El término "planta" también abarca por lo tanto a cultivos en suspensión, embriones, regiones meristemáticas, tejidos callosos, hojas, semillas, raíces, brotes, gametofitos, esporofitos, polen y microesporas. Las plantas que son particularmente útiles en los métodos de la invención incluyen a todas las plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, en particular plantas monocotiledoneas y dicotiledóneas incluyendo pasto o legumbre forrajera, plantas ornamentales, cultivos alimenticios, árboles, o arbustos seleccionados del listado que incluye Acacia spp., Acer spp., Actinidia spp.,A esculus spp., Agathis australis, Albizia amara, Alsophila tricolor, Andropogon spp., Arachis spp, Areca catechu, Astelia fragrans, Astragalus cicer, Baikiaea plurijuga, Betula spp., Brassica spp., Bruguiera gymnorrhiza, Burkea africana, Butea frondosa, Cadaba farinosa, Calliandra spp, Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Cassia spp., Centroema pubescens, Chaenomeles spp.,C innamomum cassia, Coffea arabica,Colophospermum mopane, Coronillia varia, Cotoneaster serotina, Crataegus spp., Cucumis spp., Cupressus spp., Cyathea dealbata, Cydonia oblonga, Cryptomeria japonica, Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia oblonga, Dalbergia monetaria, Davallia divaricata, Desmodium spp., Dicksonia squarosa, Diheteropogon amplectens, Dioclea spp, Dolichos spp., Dorycnium rectum, Echinochloa pyramidalis, Ehrartia spp., Eleusine coracana, Eragrestis spp., Erythrina spp., Eucalyptus spp., Euclea schimperi, Eulalia villosa, Fagopyrum spp., Feijoa sellowiana, Fragaria spp., Flemingia spp, Freycinetia banksii, Geranium thunbergii, Ginkgo biloba, Glycine javanica, Gliricidia spp, Gossypium hirsutum, Grevillea spp., Guibourtia coleosperma, Hedysarum spp., Hemarthia altissima, Heteropogon contortus, Hordeum vulgare, Hyparrhenia rufa, Hypericum erectum, Hyperthelia dissoluta, Indigo incarnata, Iris spp., Leptarrhena pyrolifolia, Lespediza spp., Lettuca spp., Leucaena leucocephala, Loudetia simplex, Lotonus bainesii, Lotus spp., Macrotyloma axillare, Malus spp., Manihot esculenta, Medicago sativa, Metasequoia glyptostroboides, Musa sapientum, Nicotianum spp., Onobrychis spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Peltophorum africanum, Pennisetum spp., Persea gratissima, Petunia spp., Phaseolus spp., Phoenix canariensis, Phormium cookianum, Photinia spp., Picea glauca, Pinus spp., Pisum sativum, Podocarpus totara, Pogonarthria fleckii, Pogonarthria squarrosa, Populus spp., Prosopis cineraria, Pseudotsuga menziesii, Pterolobium stellatum, Pyrus communis, Quercus spp., Rhaphiolepsis umbellata, Rhopalostylis sapida, Rhus natalensis, Ribes grossularia, Ribes spp., Robinia pseudoacacia, Rosa spp., Rubus spp., Salix spp., Schyzachyrium sanguineum, Sciadopitys verticillata, Sequoia sempervirens, Sequoiadendron giganteum, Sorghum bicolor, Spinacia spp., Sporobolus fimbriatus, Stiburus alopecuroides, Stylosanthos humilis, Tadehagi spp, Taxodium distichum, Themeda triandra, Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga heterophylla, Vaccinium spp., Vicia spp. Vitis vinifera, Watsonia pyramidata, Zantedeschia aethiopica, Zea mays, amaranto, alcachofa, espárrago, brócoli, col de Bruselas, col, canola, zanahoria, coliflor, apio, variedad de col rizada, lino, col rizada, lenteja, colza, kra, cebolla, patata, arroz, soja, paja, remolacha, caña de azúcar, girasol, tomate, té calabaza, árboles, pastos (incluido pasto forrajero) y algas, entre otros.

De acuerdo con una característica preferida del método de la presente invención, la planta es una planta de cultivo, tal como soja, girasol; canola, colza, algodón, alfalfa, tomate, patata, tabaco, papaya, calabaza, tulipanero, eucalipto, pino, leguminosa, lino, lupino y sorgo. De acuerdo con una modalidad preferida adicional del método de la presente invención, la planta es una planta monocotiledonea, tal como caña de azúcar, preferiblemente además la planta es un cereal, tal como arroz, maíz (incluido el maíz forrajero), trigo, cebada, mijo, avenas y centeno.

Por lo tanto, la presente invención provee cualquiera de los métodos como los descritos aquí anteriormente, y divulga una planta transgénica como la descrita aquí anteriormente, en donde la planta es una planta monocotiledonea de cultivo, preferiblemente un cereal, más preferiblemente en donde la planta es arroz o maíz.

De acuerdo con una modalidad particular del método de la invención, la planta es una planta dicotiledónea de cultivo, o una dicotiledónea ornamental, tal como azalea.

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Convenientemente, el desempeño del método de acuerdo con la presente invención conduce a plantas que tienen una variedad de características mejoradas de crecimiento con relación a las plantas correspondientes de tipo silvestre. El término "característica de crecimiento" como se lo utiliza aquí se refiere a un mayor rendimiento/biomasa pero puede referirse también adicionalmente a cualquier otra característica de crecimiento como se describe aquí más adelante.

El término "rendimiento" se refiere a la cantidad de material biológico producido y se utiliza en forma intercambiable con "biomasa". Para las plantas de cultivo, "rendimiento" también significa la cantidad de material cosechado por acre o unidad de producción. El rendimiento se puede definir en términos de cantidad o de calidad. El material cosechado puede variar de un cultivo a otro, por ejemplo, pueden ser semillas (por ejemplo para arroz, sorgo o maíz cuando se los cultiva para semilla); la biomasa por encima de la tierra (por ejemplo para maíz, cuando se lo utiliza como ensilaje), raíces (por ejemplo para remolacha, nabo, patata), frutos (por ejemplo, para tomate, papaya), fibras de algodón, o cualquier otra parte de la planta que sea de valor económico. "Rendimiento" también abarca a la estabilidad en el rendimiento de las plantas. Una estabilidad de alto rendimiento significa que el rendimiento no se ve fuertemente afectado por los cambios en las condiciones ambientales, tales como las condiciones por debajo del óptimo provocadas por sequía, enfriamiento, congelamiento, calor, salinidad o deficiencia de nutrientes. "Rendimiento" también abarca al rendimiento potencial, que es el rendimiento máximo obtenible bajo condiciones óptimas de crecimiento. El rendimiento puede depender de una cantidad de componentes del rendimiento, que pueden ser monitoreados por medio de ciertos parámetros. Estos parámetros son conocidos por las personas capacitadas en el arte y varían de un cultivo a otro. Por ejemplo, los criadores están bien enterados de los componentes específicos del rendimiento y de los correspondientes parámetros para el cultivo que ellos están intentando mejorar. Por ejemplo, los parámetros claves del rendimiento para el maíz incluyen al número de plantas por hectárea o por acre, al número de mazorcas por planta, al número de filas (de semillas) por mazorca, al número de granos por fila, y al peso por cada mil granos. Para el ensilaje del maíz, los parámetros típicos son el contenido de energía y de biomasa por encima de la tierra. Los parámetros claves del rendimiento para el arroz incluyen al número de plantas por hectárea o por acre, al número de panículas por planta, al número de flores (espiguillas) por panícula, a la tasa de llenado de semilla (número de semillas que llenan las espiguillas), y al peso por cada mil granos.

Generalmente, el término "mayor rendimiento" significa un incremento en biomasa en una o más partes de una planta con relación a la biomasa de las plantas de referencia correspondientes, por ejemplo con relación a las plantas correspondiente de tipo silvestre. Las plantas producidas por medio del método de la presente invención exhiben un mayor tamaño, que se manifiesta en plantas más altas y en un mayor diámetro de florón. Por lo tanto, el término "rendimiento/biomasa" como se lo utiliza aquí abarca plantas de mayor tamaño.

Las plantas producidas por medio del método de la presente invención también exhiben mayor tamaño de órganos, y por lo tanto, el término "mayor rendimiento/biomasa" como se lo utiliza aquí abarca un mayor tamaño de órganos. Por ejemplo, las plantas producidas por medio del método de acuerdo con la presente invención se caracterizan por un mayor tamaño de las hojas, que es particularmente importante para el forraje y para los cultivos alimenticios (y ornamentales). Además, las plantas exhiben un mayor tamaño del tallo. Además de la contribución al mayor rendimiento, por ejemplo, en árboles, un incremento en el espesor del tallo contribuye a mejorar la resistencia al viento/a la lluvia, por ejemplo, en cereales. Además, las plantas producidas por medio del método de acuerdo con la invención exhiben mayor tamaño de semilla.

Las plantas producidas por medio del método de la presente invención exhiben un mayor número de órganos, y por lo tanto, el término "mayor rendimiento/biomasa" como se lo utiliza aquí abarca un mayor número de órganos. Por ejemplo, las plantas producidas por medio del método de acuerdo con la presente invención exhiben un mayor número de hojas, lo cual es particularmente importante para cultivos de forraje y ornamentales. Además, las plantas exhiben un mayor número de ramificaciones (ramificaciones laterales, ramificaciones de florón), lo cual contribuye a incrementar la frondosidad de la planta. También, las plantas tienen un mayor número de ramas con vellosidad. Un incremento en biomasa de estructuras de excrecencia epidérmica especializada es conveniente en la producción de fibras de algodón o de vellosidades glandulares. Las vellosidades especializadas se pueden utilizar también para la producción de metabolitos útiles, compuestos farmacéuticos, alimentos con propiedades medicinales y aditivos para alimentos. Además, las plantas exhiben un mayor número de flores, lo cual es importante para cultivos ornamentales y para semilla.

También están abarcados dentro del término "mayor rendimiento/biomasa" un mayor rendimiento en semilla. El rendimiento en semilla se puede manifestar por medio de un mayor peso total en semilla, un mayor número en el total de las semillas, un mayor número de semillas rellenas, y/o un mayor tamaño de las semillas. Un mayor tamaño y/o volumen de las semillas puede influir también en la composición de las semillas.

El término "característica de crecimiento" como se lo utiliza aquí, también abarca la arquitectura de la planta. Por ejemplo, las plantas producidas por medio del método de la invención exhiben una forma alterada de la hoja, lo cual puede ser ventajoso para plantas ornamentales, y una vascularización alterada, lo cual es importante para árboles productores de madera y/o de papel y de pulpa. El término "arquitectura" como se lo utiliza aquí abarca la apariencia o morfología de una planta, incluyendo cualquiera o muchas características estructurales o combinación de características estructurales de los mismos. Tales características estructurales incluyen la forma, el tamaño, el número, la posición, la textura, la disposición, y el patrón de cualquier célula, tejido u órgano o grupos de células, tejidos u órganos de una planta, incluyendo la raíz, la hoja, el brote, el tallo, el pecíolo, las vellosidades, la flor, la florescencia (para monocotiledoneas y dicotiledóneas), panículas, pétalo, estigma, estilo, estambre, polen, óvulo, semilla, embrión, recubrimiento de semilla, aleurona, fibra, cambium, madera, duramen, parénquima, aerénquima, elemento cernidor, tejido vegetal o vascular, entre otros. El término "arquitectura" abarca por lo tanto el área de la hoja, el espesor de la hoja, la disposición de los tallos laterales, la forma del tallo y la disposición de las flores (y de los frutos).

La presente invención también se relaciona con el uso de un ácido nucleico que codifica a una proteína CCS52 bajo el control de un promotor de fuerza media, en donde dicho promotor de fuerza media tiene un nivel de expresión en tejido vegetativo verde que es al menos 10 veces menor que aquel del promotor CaMV35S, para incrementar el rendimiento/biomasa, preferiblemente el rendimiento de semilla.

Alternativamente, incrementar la expresión de un ácido nucleico que codifica para CCS52, o introducir un ácido nucleico que codifica para CCS52 o el constructo genético dentro de la célula de la planta, se puede lograr por medio de cruzamiento o por medio de reproducción.

Además, las técnicas clásicas de reproducción, tienen por objeto mejorar las características de crecimiento de la planta, se pueden basar en la selección de un mejor desempeño de las variantes alélicas de un gen que codifica para CCS52, cuyos alelos de mejor desempeño pueden tener un nivel de expresión que es superior que el nivel del tipo silvestre. La variación alélica puede ocurrir en la naturaleza, o se puede crear por medio de tratamiento mutagénico de material biológico, por ejemplo, por medio de mutagénesis EMS. Por lo tanto, el uso de variantes alélicas de CCS52 en los programas de reproducción, que tienen por objeto mejorar cualquiera de las características de crecimiento como se mencionó anteriormente, es también abarcado por la presente invención; esto puede ser adicional a su uso en los métodos de acuerdo con la presente invención. Un ejemplo de un programa de reproducción es un programa convencional d reproducción asistida por marcadores.

Información adicional relacionada con la función de un gen que codifica para CCS52 y genes relacionados se puede descubrir por medio del uso de genéticas inversas, tales como TILLING (Targeted Induced Local Lesions IN Genomes) en combinación con el descubrimiento sitios y motivos cruciales para la función del gen y de la proteína (McCAllum y colaboradores, 2000, Plant Physiol 123 (2): 439 - 42; Perry y colaboradores, 2003 Plant Physiol 131 (3): 866 - 71). Las plantas que tienen fenotipos mutantes o dominantes negativos, o fenotipos dominantes positivos se pueden analizar y comparar para identificar las mutaciones más efectivas. Los fenotipos se pueden comparar con fenotipos identificados, por ejemplo, en el análisis QTL (Quaintitative Trait Loci) y la información de la secuencia se puede comparar con el mapeo del gen incluido en un QTL. Ambos métodos pueden ser útiles cuando se los combina en la identificación de nuevos fenotipos de interés para la reproducción de cultivos.

Se describirá ahora la presente invención con referencia a las siguientes figuras en las cuales:

La Fig. 1 es un mapa del clon de entrada, p1627, que contiene al gen de interés, que codifica para CCS52A1, (CDS0198) dentro de los sitios AttL1 y AttL2 para la clonación de Gateway® en la columna vertebral de pDONR201. Este vector también contiene 7un casete bacteriano de resistencia a la kanamicina y un origen bacteriano de replicación.

La Fig. 2 es un mapa del vector binario para expresión en Arabidopsis thaliana del gen que codifica para CCS52A1 de Arabidopsis thaliana (CDS0198) bajo el control de un promotor de ubiquitina de girasol (pUBIdeltaT). El casete de expresión de CCS52A1 incluye además a la secuencia terminadora doble T-zein y T-rbcS-deltaGA. Este casete de expresión está localizado dentro del borde izquierdo (repetición LB, LB Ti C58) y el borde derecho (repetición RB, RB Ti C58) del plásmido Ti de nopalina. Clonado dentro de estos bordes está también un marcador seleccionable y un marcador cribable, ambos bajo el control de un promotor constitutivo y seguido por una secuencia de terminación de transcripción de nopalina (tNOS) o de octopina (tOCS). Además, este vector también contiene un origen de replicación (pBR322 ori + bom) para replicación bacteriana y un marcador bacteriano seleccionable (Spe/SmeR) para selección bacteriana.

La Fig. 3 muestra una vista aérea de una planta de Arabidopsis thaliana de tipo silvestre (izquierda) y de una planta de Arabidopsis thaliana transgénica que expresa a un transgén que codifica para CCS52A1 bajo el control de un promotor de ubiquitina (derecha). Ambas plantas tienen 4 semanas de edad.

La Fig. 4 muestra una primera hoja de caulífero de una planta de Arabidopsis thaliana de tipo silvestre (izquierda) y de una planta de Arabidopsis thaliana transgénica que expresan a un gen que codifica para CCS52A bajo el control de un promotor de ubiquitina (derecha).

La Fig. 5 muestra una primera hoja de florón de una planta de Arabidopsis thaliana de tipo silvestre (izquierda) y de una planta de Arabidopsis thaliana transgénica que expresan a un gen que codifica para CCS52A1 bajo el control de un promotor de ubiquitina (derecha).

La Fig. 6 muestra tejido de hoja de una planta de Arabidopsis thaliana de tipo silvestre (izquierda) y de una planta de Arabidopsis thaliana transgénica que expresan a un gen que codifica para CCS52A bajo el control de un promotor de ubiquitina.

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La Fig. 7 muestra epidermis y vellosidades de una planta de Arabidopsis thaliana de tipo silvestre (A) y de una planta de Arabidopsis thaliana transgénica que expresan a un gen que codifica para CCS52A1 bajo el control de un promotor de ubiquitina (B).

La Fig. 8 muestra una planta de Arabidopsis thaliana de tipo silvestre (izquierda) y una planta de Arabidopsis thaliana transgénica que expresan a un gen que codifica para CCS52A bajo el control de un promotor 2S2 (derecha), que son más frondosas.

La Fig. 9 muestra una planta de Arabidopsis thaliana de tipo silvestre (izquierda) y una planta de Arabidopsis thaliana transgénica que expresan a un gen que codifica para CCS52A1 bajo el control de un promotor de ubiquitina (derecha).

La Fig. 10 muestra secciones transversales del tallo principal de una planta de Arabidopsis thaliana de tipo silvestre (izquierda) y de una planta de Arabidopsis thaliana transgénica que expresan a un gen que codifica para CCS52A1 bajo el control de un promotor de ubiquitina (derecha).

La Fig. 11 muestra semillas producidas por una planta de Arabidopsis thaliana de tipo silvestre (izquierda) y por una planta de Arabidopsis thaliana transgénica que expresan a un gen que codifica para CCS52A1 bajo el control de un promotor de ubiquitina (derecha).

La Fig. 12 muestra un árbol filogenético de proteínas relacionadas con CCS52 en plantas y animales. Las secuencias se presentan por medio de su número de acceso en el Genbank. Se hicieron múltiples alineaciones de secuencia a través de las secuencias enteras utilizando CLUSTAL W (Higgins y colaboradores, (1994) Nucleic Acids Res. 22: 4673 - 4680), con la matriz BLOSSUM 62 y con los parámetros GAPOPEN 10, GAPEXT 0,05 y GAPDIST 8. La vista del filograma provee un estimado de la filogenia, esto es, la longitud de las ramas es proporcional al cambio evolucionario.

La Fig. 13 muestra los motivos conservados de consenso en proteínas de plantas relacionadas con CCS52.

La Fig. 14 muestra las secuencias de la presente invención con sus respectivos números de SEQ ID.

La Fig. 15 es un mapa del vector binario p35S::AtCCS52A1 para expresión en Arabidopsis thaliana del gen que codifica para CCS52A1 de Arabidopsis thaliana (referencia interna CDS0198) bajo el control del promotor CaMV35S. El casete de expresión de CCS52A1 comprende además una secuencia doble de terminación de la transcripción T-zein y T-rbcS-deltaGA. Este casete de expresión está localizado dentro del borde izquierdo (repetición LB, LB Ti C58) y el borde derecho (repetición RB, RB Ti C58) del plásmido Ti de nopalina. Dentro del ADN-T se provee además un marcador seleccionable y un marcador cribable, ambos bajo el control de un promotor constitutivo y seguido por una secuencia de terminación de transcripción tNOS o una tOCS. Este vector contiene además un origen de replicación (pBR322 ori + bom) para replicación bacteriana y un marcador bacteriano seleccionable (Spe/SmeR) para selección bacteriana.

La Fig. 16 muestra plantas de Arabidopsis thaliana de tipo silvestre y plantas de Arabidopsis thaliana transgénicas transformadas con el vector que porta al casete de expresión p35S::AtCCS52A1.

La Fig. 17 es un mapa del vector binario pEXP::AtCCS52A1 para expresión en Oryza sativa del gen que codifica para CCS52A1 de Arabidopsis thaliana (referencia interna CDS0198) bajo el control del promotor de beta-expansina. El casete de expresión de CCS52A1 comprende además una secuencia doble de terminación de la transcripción T-zein y T-rbcS-deltaGA. Este casete de expresión está localizado dentro del borde izquierdo (repetición LB, LB Ti C58) y sobre el borde derecho (repetición RB, RB Ti C58) del plásmido Ti de nopalina. Dentro del ADN-T se provee además un marcador seleccionable y un marcador cribable, ambos bajo el control de un promotor constitutivo y seguido por una secuencia de terminación de transcripción poliA o una T-NOS. Este vector contiene además un origen de replicación (pBR322 ori + bom) para replicación bacteriana y un marcador bacteriano seleccionable (Spe/SmeR) para selección bacteriana.

Ejemplos

La presente invención será descrita ahora con referencia a los siguientes ejemplos, los cuales se presentan a manera de ejemplo únicamente.

Manipulación de ADN

A menos que se estipule otra cosa, las técnicas de ADN recombinante se lleva a cabo de acuerdo a protocolos estándar descritos en Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3^{ra} Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York o en los Volúmenes 1 y 2 de Ausubel y colaboradores (1998), Current Protocols in Molecular Biology. Los materiales y métodos estándar para trabajo molecular en plantas se describen en Plant Molecular Biology Labfase (1993) por R.D.D. Croy, publicado por BIOS Scientific Publications Ltd (Reino Unido) y Blackwell Scientific Publications (Reino Unido).

Ejemplo 1 Clonación de Arabidopsis thaliana CCS52A1

Se amplificó el gen que codifica para CCS52A de Arabidopsis (referencia interna CDS0198) por medio de PCR utilizando como molde una biblioteca de ADNc de semillero de Arabidopsis thaliana (Invitrogen, Paisley, Reino Unido). Después de transcripción inversa del ARN extraido de semilleros, se clonaron los fragmentos de ADNc en pCMV Sport 6.0. El tamaño inerte promedio de la biblioteca de ADNc fue de 1,5 kb, y el número original de clones fue aproximadamente de 1,59 x 10^{7} cfu. El título original de 9,6 x 10^{5} cfu/ml fue llevado hasta 6 x 10^{11} cfu/ml después de amplificación de la biblioteca. Después de la extracción del plásmido de los clones, se utilizaron 200 ng de molde de plásmido en una mezcla de 50 \mul de PCR. Los iniciadores utilizados para amplificación por PCR, pm01391 con la secuencia 5' GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACAATGGAAG AAGAAGATCCTACAGC 3' (SEQ ID NO 18) y prm01392 con la secuencia 5'GGGGACCAC TTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTCTCACC
GAATTGTTGTTCTA C 3' (SEQ ID NO 19) un sitio AttB para clonación por recombinación Gateway (itálicas). La PCR se llevó a cabo utilizando Hifi Taq ADN polimerasa en condiciones estándar. Se amplificó un fragmento PCR de la longitud esperada y se la purificó utilizando también métodos estándar. Se llevó a cabo la primera etapa del procedimiento Gateway, la reacción BP, durante la cual el fragmento de PCR se recombina in vivo con el plásmido pDONR201 para producir el "clon de entrada", p1627 (Fig. 1). Se adquirió el plásmido pDONR201 a Invitrogen, como parte de la tecnología Gateway®.

Ejemplo 2 Construcción del vector (pUBI::A tCCS52A1)

Se utilizó posteriormente el clon de entrada p1627 en una reacción LR con p0712, un vector de destinación utilizado para la transformación de Arabidopsis thaliana. Este vector contiene como elementos funcionales dentro de los bordes de ADN-T, un marcador seleccionable de la planta, un marcador cribable y un casete Gateway destinado a recombinación in vivo en LR con la secuencia de interés ya clonada en el clon de entrada. Secuencia arriba de este casete Gateway se encuentra el promotor de ubiquitina de girasol (referencia interna PRO155) para expresión constitutiva del gen de interés. Después de la etapa de recombinación de LR, se transformó el vector de expresión resultante pUBI::AtCCS52A1 (Fig. 2) en la cepa LBA4044 de Agrobacterium y posteriormente en las plantas de Arabidopsis thaliana como se describe en el Ejemplo 3.

Ejemplo 3 Transformación de Arabidopsis Siembra y crecimiento de plantas progenitoras

Para las plantas progenitoras, se suspendieron aproximadamente 12 mg de semillas tipo silvestre de Arabidopsis thaliana (ecotipo Columbia) en 27,5 ml de solución de agar al 0,2%. Se incubaron las semillas por 2 a 3 días a una temperatura de 4ºC y luego fueron sembradas. Se les permitió luego a las semillas germinar bajo las siguientes condiciones estándar: 22ºC durante el día, 18ºC durante la noche, humedad relativa del 65 - 70%, 12 horas de período de luz, subirrigación con agua durante 15 min cada 2 a 3 días. Se sembraron las plántulas desarrolladas en macetas de 5,5 cm de diámetro, que contenían una mezcla de arena y turba (relación 1:3). Se les permitió a las plantas crecer bajo las mismas condiciones estándar que se mencionaron anteriormente.

Condiciones de crecimiento de Agrobacterium y preparación

La cepa C58C1RIF de Agrobacterium con el plásmido auxiliar pMP90 que contenía al vector pUBI::AtCCS52A1 fue inoculada en un tubo plástico de 50 ml que contenía 1 ml de Caldo Luria (LB) sin antibióticos. Se agitó el cultivo a 28ºC durante 8 - 9 horas. Después de la adición de 10 ml de LB sin antibiótico, se agitó el tubo plástico durante la noche a 28ºC. Se monitoreó la DO a 600 nm. Con una densidad óptica de aproximadamente 2,0, se añadieron al cultivo 40 ml de sacarosa al 10% y Silwet L-77 al 0,05% (una mezcla química de heptametiltrisiloxano modificado con polialquilenoxido (84%) y aliloxipolietileneglicol metil éter (16%), OSI Specialties Inc.). Se marcó el cultivo obtenido de Agrobacterium con CD2175 y se lo utilizó para transformar las plantas progenitoras de Arabidopsis.

Inmersión de la flor

Cuando cada planta progenitora tenía florescencia de 7 - 10 cm de alto, se invirtieron las florescencias en el cultivo de Agrobacterium y se agitó suavemente durante 2 - 3 segundos. Se utilizaron 2 plantas por transformación. Posteriormente, se regresaron las plantas a las condiciones normales de crecimiento como se describió anterior-
mente.

Recolección de semilla

Cinco semanas después de que las flores fueron sumergidas en el cultivo de Agrobacterium, se detuvo el riego de las plantas. Se incubaron las plantas a 25ºC con un período de luz de 20 horas. Una semana después, se cosecharon las semillas y se las colocó en un secador de semillas durante una semana. Se limpiaron luego las semillas y se las recolectó en tubos plásticos de 15 ml. Se almacenaron las semillas a 4ºC hasta un proceso posterior.

Ejemplo 4 Evaluación de las plantas transformadas de Arabidopsis Selección de la primera generación de plantas transgénicas

Se colocaron 100 mg de semillas en un tubo plástico de 50 ml y se las suspendió en 27 ml de una solución de agar al 0,2%. Se almacenaron los tubos a 4ºC durante 3 días para liberar las semillas del estado de letargo. Después de este período, se examinó la suspensión de semilla bajo luz azul para determinar la presencia de semillas transformadas. Se aspiraron 20 semillas con fluorescencia brillante (que expresan al marcador seleccionable) con una pipeta Pasteur, se las transfirió a un tubo plástico de 15 ml, y se ajustó el volumen de la suspensión a 15 ml con una solución de agar al 0,2%. Se transfirió la misma cantidad de semilla no fluorescente a un tubo plástico separado de 15 ml y se ajustó el volumen de la suspensión hasta 15 ml con una solución de agar al 0,2%. Se dispensó la suspensión de semillas de expresión como gotas de 50 \mul sobre una mitad de una bandeja de 50 x 30 cm que contenía una mezcla de arena y tierra en una proporción de 1 a 2. Se dispensaron de la misma manera las semillas sin expresión sobre la otra mitad de la bandeja. Se colocó la bandeja en un invernadero bajo las siguientes condiciones: 22ºC durante el día, 18ºC durante la noche, humedad relativa del 60%, 20 horas d período de luz, subirrigación una vez al día con agua durante 15 min. El día 14 después de la siembra, se trasplantaron 5 plántulas con expresión y 5 sin expresión en macetas individuales de 10 cm de diámetro llenas con una mezcla de arena y turba (relación 1:3).

Cultivo y toma de imágenes de la primera generación de planta transgénicas

Se colocaron luego las macetas en un invernadero bajo las mismas condiciones descritas para las bandejas. Se subirrigaron las macetas durante 15 minutos, una vez por semana, o más si fuera necesario. El día 21, 28, 35, 42 y 49 después de la siembra, se fotografiaron los fibrones de cada planta utilizando una cámara digital. El día 35, 42, 49 y 56 después de la siembra, se fotografió la floración de cada planta, usando una cámara digital. Se registró el número de pixeles correspondiente a los tejidos de la planta sobre cada fotografía, se las convirtió en cm^{2} y se las utilizó como una medida del tamaño de la planta. El día 57 después de la siembra, cuando maduraron las primeras silicuas, se colocó una bolsa plástica que permite la respiración sobre cada planta y se la adhirió firmemente a la base de las plantas para recoger las semillas que caen. El día 90 después de la siembra, cuando todas las silicuas maduraron, se recolectaron las semillas y se las colocó en un secador de semillas durante 1 semana antes de almacenarlas en un contenedor sellado a 4ºC.

Rendimiento de semillas de la primera generación de plantas transgénicas

Se tomaron las florescencias cosechadas de las plantas T1 y se las frotó suavemente para liberar las semillas de las silicuas. La mezcla de las semillas y el tamo fue pasada luego sobre una malla para remover los fragmentos grandes de tallos, hojas, silicuas, etc. Se vertieron luego las semillas sobre un canal vibrador equipado con una aspiradora que permite que los fragmentos más livianos, tal como los pétalos y las fibras pequeñas, sean aspirados mientras se retienen las semillas más pesadas. Los datos sobre los parámetros de las semillas fueron medidos utilizando un sistema automatizado.

Se siguió un procedimiento similar para evaluar las características fenotípicas de las líneas T2 de Arabidopsis. Se trasplantaron al menos 15 plántulas con expresión y al menos 15 sin expresión dentro de macetas individuales con un diámetro de 10 cm (que contenían una mezcla de arena y turba en una proporción de 1 a 3) y se las procesó como se describió anteriormente. Las características fenotípicas, como se describió anteriormente, fueron heredadas a las generaciones futuras.

Ejemplo 5 Características fenotípicas de las plantas transgénicas pUBI::AtCCS52A1 Incremento de biomasa

Las plantas transgénicas que producen CCS52 mostraron un incremento de biomasa con relación a las plantas de control. Esto se manifestó por medio de un mayor tamaño de las hojas (ver Fig .4, 5 y 6).

El incremento de biomasa de la hoja se manifestó también por medio de un número mayor de hojas del florón (ver Fig. 3) y un número mayor de hojas del caulífero (Fig. 8).

El incremento de biomasa se manifestó además por medio de un incremento en el espesor del tallo y más follaje, lo cual condujo a un fenotipo tupido. Como se ilustra en la Fig. 9 y en la Fig. 10, las plantas transgénicas pUBI::CCS52 tienen un mayor diámetro de florón así como un mayor diámetro de tallo (principal) y un mayor diámetro del follaje lateral. En consecuencia, se estima que, toda la biomasa de la planta se multiplica por tres o por cuatro en las plantas transgénicas de Arabidopsis que producen CCS52.

Vellosidades modificadas

Como se muestra en la Fig. 7, las plantas transgénicas tienen vellosidades con un mayor número de ramificaciones con relación a las vellosidades de tipo silvestre.

Planta modificada y forma de los órganos

Como se muestra en la Fig. 4 la hoja del caulífero de la planta transgénica era de unas forma diferente y de un mayor tamaño que la correspondiente planta de tipo silvestre. Como se muestra en la Fig. 5, la hoja del florón de la planta transgénica tenia un ancho mayor y un área mayor que la correspondiente hoja de tipo silvestre. Además, esta figura ilustra que era visible un incremento sustancial del sistema de vascularización en la hoja transgénica.

Mayor rendimiento - rendimiento de semilla

Como se muestra en la Fig. 11, se aumentó el tamaño de la semilla en la planta transgénica pUBI::CCS52.

Ejemplo 6 La sobreexpresión de AtCCS52A1 bajo el control del promotor 2S2 resultó en plantas con más follaje

Partiendo del clon de entrada p1627, se elaboró un vector de expresión en una forma similar a como se describe en los Ejemplos 1 y 2, excepto porque el promotor secuencia arriba del gen AtCCS52A1 era el promotor preferido 2S2 de la semilla de Arabidopsis. Este vector de expresión fue transformado en Arabidopsis como se describe en el Ejemplo 3 y se llevó a cabo la evaluación de la planta como se describe en el Ejemplo 4.

Las características fenotípicas de las plantas transformadas p2S2::CCS52 eran similares a las de las plantas transformadas pUBI::CCS52 descritas en el Ejemplo 5. Se observó que las plantas transformadas p2S2::CCS52 habían incrementado la biomasa de las hojas, el número de ramificaciones y/o la biomasa de los tallos. Como se ilustra adicionalmente en la Fig. 8, la planta transgénica p2S2::CCS52 tenía un mayor número de hojas, al menos 2 veces más ramificaciones de florón, tallos más gruesos y más ramificaciones laterales, lo cual dio lugar a un fenotipo mas tupido. Además, estas plantas mostraron más flores.

Ejemplo 7 La sobreexpresión de CCS52 bajo el control del promotor CaMV35S en Arabidopsis resultó en plantas anormalmente pequeñas

Partiendo del clon de entrada p1627, se elaboró un vector de expresión en una forma similar a como se describe en los Ejemplos 1 y 2, excepto porque el promotor secuencia arriba del gen AtCCS52A1 era el promotor CaMV35S. El vector de expresión resultante p35S::AtCCS52A1 (Fig. 15) fue transformado en Arabidopsis como se describe en el Ejemplo 3 y se llevó a cabo la evaluación de la planta como se describe en el Ejemplo 4.

Se regeneraron las plantas de Arabidopsis y crecieron bajo condiciones óptimas de desarrollo como se mencionó en el Ejemplo 4. Se alternaron la planta nulizigota sin el transgen con la planta transgénica que incluye al transgen en una bandeja de crecimiento (Fig. 16). Durante el crecimiento en condiciones óptimas, se observó una significativa diferencia entre la planta transgénica y la planta tipo silvestre. Después de 5 a 6 semanas, se fotografiaron las plantas (Fig. 16). En esta etapa, las plantas transgénicas mostraron fenotipo pequeño y anormal comparado con la planta tipo silvestre madura y saludable. La planta transgénica tenía claramente hojas más pequeñas, tallos más pequeños o inexistentes, diámetro más pequeño de florón, menos hojas y menos flores comparada con la planta de tipo silvestre. Claramente, las plantas transgénicas p35S::CCS52 sufrieron una detención temprana en el crecimiento. Estas plantas transgénicas son pequeñas y tienen una formación anormal de órganos. En las plantas transgénicas las hojas eran rojizas, indicando que esas plantas sufrieron de estrés y las plantas anormales produjeron cantidades significativamente menores de silicuas y de semillas, comparadas con las plantas de tipo silvestre.

Ejemplo 8 Sobreexpresión de AtCCS52 bajo el control de diferentes promotores de fuerza media en arroz

Partiendo del clon de entrada p1627, se elaboran diferentes vectores de expresión en una forma similar a como se describe en los Ejemplos 1 y 2, excepto porque la destinación del vector para la reacción de recombinación en LR es un vector de destinación útil para la transformación de Oryza sativa. Este vector de destinación transporta como elementos funcionales dentro de los bordes de ADN-T, un marcador seleccionable de la planta, un marcador cribable y un casete Gateway destinado a recombinación in vivo en LR con la secuencia de CCS52 ya clonada en el clon de entrada. Diferentes versiones de este vector de destinación tienen diferentes promotores de fuerza media secuencia arriba de este casete Gateway. Los diferentes vectores de expresión resultantes tienen por lo tanto diferentes promotores secuencia arriba del gen que codifica para CCS52.

\newpage

Un ejemplo de tal vector de expresión, pEXP::AtCCS52A1 que transporta al promotor de beta-expansina de arroz (PR00061) secuencia arriba del gen AtCCS52A1, está representado en la Fig. 17. Otros ejemplos de vectores de expresión son CD02376, que transportan al promotor de protamina del arroz (PRO090); o CD05509, que transporta al promotor de Oleosina del arroz de 18 kDa (PRO0218); o CD13390, que transporta al promotor putativo de la protoclorofilide reductasa del arroz (PRO0123) o un vector que transporta al promotor de metalotioneina secuencia arriba del gen AtCCS52A1.

Se elaboran vectores similares, para la expresión de otros genes que codifican para CCS52A o genes que codifican para CCS52B bajo el control de promotores como los mencionados aquí anteriormente.

Todos estos vectores de expresión son adecuados para la transformación del arroz siguiendo protocolos como los mencionados aquí anteriormente.

Plantas transgénicas de arroz con AtCCS52A1, que sobreexpresan a AtCCS52A1 bajo el control de un promotor de fuerza media, tienen características mejoradas de crecimiento. Especialmente, las plantas transgénicas de arroz tienen mayor rendimiento/biomasa, que se manifiesta por medio de un mayor tamaño de la planta (mayor área de la planta y/o mayor altura de la planta) o mayor índice de cosecha, que es la proporción de la biomasa total sobre la biomasa cosechada. Una mayor biomasa se manifiesta también por medio de un mayor tamaño de órganos tales como el mayor tamaño de la hoja, mayor tamaño de la semilla (mayor peso por cada mil granos (TKW)), mayor rendimiento de semilla/biomasa de semilla o mayor diámetro de tallo. Una mayor biomasa se manifiesta también por medio de un mayor número de órganos tal como un mayor número de hojas, mayor número de ramificaciones, mayor número de cañas, mayor número de panículas, mayor número de flores, mayor número de semillas o mayor número semillas llenas o mayor tasa de llenado. Además, estas plantas transgénicas de arroz muestran floración temprana (ciclo de vida más corto), comparadas con las correspondientes nulizigotas.

Ejemplo 9 Sobreexpresión de CCS52 bajo el control de un promotor de fuerza media en maíz

Se elaboran constructos similares como los descritos en el Ejemplo 7 para la transformación de maíz y se utilizan los métodos de la invención descritos aquí en maíz (Zea mays). Con este propósito, se clona un gen que codifica para CCS52, por ejemplo, un ortólogo de maíz, bajo el control de un promotor operable en maíz, en un vector de transformación de la planta adecuado para transformación de maíz mediada por Agrobacterium. El promotor operable en maíz puede ser, por ejemplo, un promotor de fuerza media, que sea constitutivo, por ejemplo, un promotor de ubiquitina o cualquiera de los promotores útiles como se mencionó aquí anteriormente. Los métodos para usar para la transformación del maíz han sido descritos en la literatura (Ishida y colaboradores, Nat Biotechnol. 1996 Jun; 14 (6): 745 - 50; Frame y colaboradores, Plant Physiol. 2002 May; 129 (1): 13 - 22).

Las líneas transgénicas (endogámicas) elaboradas por medio de estos métodos se pueden cruzar con otra línea no transgénica o transgénica (endogámica) o ser autopolinizada/polinizada por familia. En forma digna de consideración, se pueden utilizar líneas transgénicas (endogámicas) como un progenitor macho o hembra. La heredabilidad y el número de copias del transgén se revisan por medio del análisis de transferencia de Southern y por PCR cuantitativo en tiempo real y se determinan los niveles de expresión del transgén por medio de PCR inversa y de análisis de Northern. Se seleccionan los eventos transgénicos con inserciones una sola copia del transgén y con diferentes niveles de expresión del transgén para evaluaciones adicionales en generaciones posteriores.

Las semillas de la progenie obtenidas como se describió aquí más arriba se germinan y se cultivan en el invernadero en condiciones bien adaptadas para el maíz (período de luz de 16:8, temperatura durante el día 26 - 28ºC y 20 - 24ºC de temperatura durante la noche) así como bajo condiciones de deficiencia de agua, deficiencia de nitrógeno, y condiciones de exceso de NaCl. Los segregantes nulos de la misma línea progenitora (línea endogámica o híbridos), así como plantas de tipo silvestre de la misma línea endogámica o híbridos se utilizan como controles. Las plantas de la progenie se evalúan sobre diferentes parámetros de biomasa y de desarrollo, incluyendo, pero sin limitarse a la altura de la planta, al ancho del tallo, a los nodos por debajo de la mazorca, a las raíces de refuerzo, al número de hojas, al color verde de la hoja, al ángulo de la hoja, al área total por encima de la tierra, al tiempo para el penacho, al tiempo para la seda, el tiempo de maduración, la altura de la mazorca, el número de mazorcas, el largo de la mazorca, el peso de la mazorca, el número de filas, el número de granos, la humedad del grano. También se monitorean los rasgos del grano incluyen pero no se limitan al tamaño del grano, el peso del grano, el contenido de almidón, el contenido de proteína, y el contenido de aceite. El rendimiento del maíz se calcula de acuerdo a métodos conocidos. Las plantas de maíz transformadas con una proteína CCS52 muestran características mejoradas de crecimiento. Más particularmente, muestran una mejoría en uno cualquiera o más de los parámetros de biomasa y de desarrollo anteriormente mencionados.

Los eventos transgénicos que son mejorados en forma más significativa comparados con las correspondientes líneas de control se seleccionan para análisis adicionales de campo y reproducción asistida por marcadores, con el objetivo de transferir los rasgos transgénicos validados en campo dentro de otro germoplasma. El proceso de desarrollar el fenotipo del maíz para los parámetros relacionados con rendimiento y crecimiento se realiza utilizando protocolos bien establecidos. Las plantas de maíz se evalúan particularmente sobre componentes de rendimiento con diferentes densidades de plantas y bajo diferentes condiciones ambientales. Las mejoras posteriores para combinación de genes de diferentes sistemas por medio de hibridación específica para los loci (tal como un transgén que contiene loci) de un germoplasma dentro de otro son también realizadas utilizando protocolos bien establecidos, incluyendo, pero sin limitarse a, MAS.

Ejemplo 10 Sobreexpresión de AtCCS52A2, AtCCS52B u ortólogos de otras plantas, tales como OsCCS52A

Se repiten experimentos como los descritos en los Ejemplos 7 a 9 con otros genes que codifican para CCS52.

Se clona al AtCCS52A2 (referencia interna CDS0199) bajo el control del promotor de Oleosina del arroz de 18 kDa (PRO0128) en el vector CD04769, del promotor de Prolamina del arroz (PRO0090) en el vector CD04778, del promotor de beta- expansina del arroz (PRO0061) en el vector CD13386 o del promotor putativo de la protoclorofilide reductasa (PRO0123) en el vector CD13522.

Se clonó al AtCCS52B (CDS0390) bajo el control del promotor de prolamina del arroz (PRO0090) en el vector CD02164, del promotor de la beta-expansina del arroz (PRO0061) en el vector CD13388 o del promotor de metalotioneina del arroz (PRO0126) en el vector CD13530.

Las plantas transformadas con un gen que codifica para CCS52 bajo el control de un promotor de fuerza media, por ejemplo, transformadas con uno de los constructos como se mencionó anteriormente, muestran características mejoradas de crecimiento, tales como mayor tamaño de la planta, mayor tamaño de órganos y/o mayor número de órganos.

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Referencias citadas en la descripción

Este listado de referencias citado por el solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.

Documentos de patente citados en la descripción

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<110> CropDesign N.V.

\hskip1cm

Centre National de la Recherche Scientifique

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<120> Plantas que tienen características mejoradas de crecimiento y un método para lograrlo

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<130> BET 04P0246

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<150> EP 03290812.1

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<151> 2003-03-31

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<160> 19

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 1905

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<212> ADN

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<213> Arabidopsis thaliana

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<220>

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<221> característica nueva o poco común

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<223> ADNc para CCS52A1

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<400> 1

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1

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2

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<210> 2

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<211> 518

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<212> PRT

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<213> Arabidopsis thaliana

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<220>

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<221> CARACTERÍSTICA NUEVA O POCO COMÚN

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<223> proteína CCS52A1

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<400> 2

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3

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4

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5

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<210> 3

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<211> 2028

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<212> ADN

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<213> Oryza sativa

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<220>

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<221> característica nueva o poco común

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<223> ADNc para CCS52A

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<400> 3

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6

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7

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<210> 4

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<211> 507

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<212> PRT

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<213> Oryza sativa

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<220>

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<221> CARACTERÍSTICA NUEVA O POCO COMÚN

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<223> proteína CCS52A

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<400> 4

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8

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9

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10

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<210> 5

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<211> 1587

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<212> ADN

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<213> Oryza sativa

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<220>

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<221> característica nueva o poco común

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<223> ADN que codifica a una proteína CCS52B

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<400> 5

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11

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12

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<210> 6

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<211> 528

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<212> PRT

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<213> Oryza sativa

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<220>

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<221> CARACTERÍSTICA NUEVA O POCO COMÚN

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<223> proteína CCS52B

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<400> 6

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13

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14

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15

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<210> 7

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> motivo de consenso 1 de la proteína CCS52

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<220>

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<221> CARACTERÍSTICA NUEVA O POCO COMÚN

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<222> (1)..(6)

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<223> Xaa = desconocida

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<400> 7

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16

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<210> 8

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<211> 17

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> motivo de consenso 2 de la proteína CCS52

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<220>

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<221> CARACTERÍSTICA NUEVA O POCO COMÚN

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<222> (1)..(15)

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<223> Xaa = desconocida

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<400> 8

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17

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<210> 9

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<211> 18

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> motivo de consenso 3 de la proteína CCS52

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<220>

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<221> CARACTERÍSTICA NUEVA O POCO COMÚN

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<222> (13)..(14)

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<223> Xaa = desconocida o ausente

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<220>

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<221> CARACTERÍSTICA NUEVA O POCO COMÚN

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<222> (1)..(12)

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<223> Xaa = desconocida

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<220>

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<221> CARACTERÍSTICA NUEVA O POCO COMÚN

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<222> (17)..(18)

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<223> Xaa = desconocida

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<400> 9

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18

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<210> 10

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<211> 6

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> motivo de consenso 4 de la proteína CCS52

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<400> 10

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19

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<210> 11

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<211> 11

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> motivo de consenso 5 de la proteína CCS52

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<220>

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<221> CARACTERÍSTICA NUEVA O POCO COMÚN

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<222> (2)..(7)

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<223> Xaa = desconocida

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<400> 11

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20

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<210> 12

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<211> 12

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> motivo de consenso 6 de la proteína CCS52

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<220>

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<221> CARACTERÍSTICA NUEVA O POCO COMÚN

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<222> (3)..(10)

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<223> Xaa = desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\hskip1cm

21

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> motivo de consenso 7 de la proteína CCS52

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA O POCO COMÚN

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\hskip1cm

22

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> motivo de consenso 8 de la proteína CCS52

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA O POCO COMÚN

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\hskip1cm

23

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> motivo de consenso 9 de la proteína CCS52

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA O POCO COMÚN

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\hskip1cm

24

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> caja C de consenso

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTCA NUEVA O POCO COMÚN

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)..(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\hskip1cm

25

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> motivo de consenso 1 de las proteínas CCS52A

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA O POCO COMÚN

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)..(4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = F o L

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA O POCO COMÚN

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)..(9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = L o I

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\hskip1cm

26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> iniciador

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\hskip1cm

27

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\hskip1cm

28

Claims

1. Método para incrementar el rendimiento/la biomasa con relación a las plantas de tipo silvestre correspondientes, que comprende la introducción en una planta de un ácido nucleico que codifica a una proteína CCS52 bajo el control de un promotor de fuerza media, en donde dicho promotor de fuerza media tiene un nivel de expresión en tejido vegetativo verde que es al menos 10 veces menor que aquel del promotor CaMV35S.

2. Método de acuerdo a la reivindicación 1, en donde dicho rendimiento/biomasa incrementados incluyen un mayor tamaño de planta, un mayor tamaño de órganos o un mayor número de órganos.

3. Método de acuerdo a la reivindicación 2, en donde dicho mayor tamaño de órganos se selecciona entre mayor tamaño de hoja, mayor tamaño de semilla o mayor diámetro de tallo.

4. Método de acuerdo a la reivindicación 2, en donde dicho mayor número de órganos se selecciona entre mayor número de hojas, mayor número de ramificaciones, mayor número de flores o mayor número de semillas.

5. Método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha proteína CCS52 es una proteína CCS52A.

6. Método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho ácido nucleico que codifica a una proteína CCS52 es como el representado por medio de la SEQ ID NO: 1, 3 ó 5, o una variante de cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 3 ó 5 y/o en donde dicha proteína CCS52 es una proteína como la representada por la SEQ ID NO: 2, 4 ó 6, o una variante de cualquiera de las SEQ ID NO: 2, 4 ó 6.

7. Método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicho promotor de fuerza media es un promotor constitutivo de fuerza media.

8. Método de acuerdo a la reivindicación 7, en donde dicho promotor es un promotor de ubiquitina o un promotor con un patrón de expresión similar.

9. Método de acuerdo a la reivindicación 7, en donde dicho promotor de fuerza media es un promotor específico del tejido.

10. Método de acuerdo a la reivindicación 9, en donde dicho promotor específico del tejido es un promotor específico del tejido vegetativo verde.

11. Método de acuerdo a la reivindicación 9, en donde dicho promotor específico del tejido es un promotor específico de tejido joven.

12. Método de acuerdo a la reivindicación 11, en donde dicho promotor específico del tejido joven es un promotor de beta-expansina.

13. El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde dicha planta es una planta monocotiledonea, preferiblemente un cereal tal como arroz o maíz.

14. El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde dicha planta es una planta dicotiledónea, preferiblemente una planta dicotiledónea de cultivo u ornamental, tal como la azalea.

15. El uso de un ácido nucleico que codifica a una proteína CCS52 bajo el control de un promotor de fuerza media para incrementar el rendimiento/la biomasa en una planta con relación a las plantas de tipo silvestre correspondientes, en donde dicho promotor de fuerza media tiene un nivel de expresión en tejido vegetativo verde que es al menos 10 veces menor que aquel del promotor CaMV35S.