ES2339341T3

ES2339341T3 - Un metodo para modificar el numero celular, la arquitectura, y el rendimiento de plantas al sobreexpresar el factor de transcripcion e2f.

Info

Publication number: ES2339341T3
Application number: ES02772293T
Authority: ES
Inventors: Tom Beeckman; Lieven De Veylder; Dirk Inze; Vladimir Mironov; Willem Broekaert; Willy Dillen; Valerie Frankard
Original assignee: CropDesign NV
Current assignee: CropDesign NV
Priority date: 2001-09-14
Filing date: 2002-09-12
Publication date: 2010-05-19
Anticipated expiration: 2022-09-12
Also published as: ZA200402813B; CA2459756A1; DE60235099D1; US20050059154A1; CA2459756C; EP1427834A1; US7592507B2; EP1427834B1; WO2003025185A1; ATE455175T1

Abstract

Método para modificar una planta monocotiledónea al incrementar el tamaño y/o número de retoños, panículas, flores o semillas, que comprende sobreexpresar en una planta un ácido nucleico que codifica un factor de transcripción E2F de planta bajo el control de un promotor específico de semilla.

Description

Un método para modificar el número celular, la arquitectura y el rendimiento de plantas al sobreexpresar el factor de transcripción E2F.

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con el campo de la modificación del producto de plantas y/o arquitectura al modular la regulación del ciclo celular, particularmente como se especifica adelante.

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Antecedente de la invención.

El crecimiento, desarrollo y diferenciación de los organismos mayores está controlado por un conjunto altamente ordenado de eventos denominados el ciclo celular (Morgan, 1997). La división celular y el crecimiento celular están operados por el ciclo celular que asegura el tiempo correcto y la alta fidelidad de los diferentes eventos de transición involucrados. El control de transición a través y entre las diferentes etapas el ciclo celular mitótico depende de la actividad de las cinasas dependientes de ciclina (CDKs) y su subconjunto específico de ciclinas y parece ser conservada en todos los eucariotes mayores (como las enzimas responsables de la replicación del ADN, los componentes citoesqueléticos que median la organización espacial dentro y los movimientos dirigidos de la célula o sus contenidos y la ruta dependiente de ubiquitina para la degradación de las proteínas).

En eucariotes multicelulares, la asociación de múltiples CDKs con diferentes clases de ciclinas denominadas ciclinas G1 y mitóticas permite la formación de varios complejos de proteína cinasa, cada una requerida para las etapas reguladoras específicas durante el ciclo celular.

El entendimiento de la progresión del ciclo celular sigue siendo mucho mejor en los sistemas de modelo de mamífero y de levadura de lo que se aclara adicionalmente que la actividad CDK se regula adicionalmente por factores que incluyen cinasas CDK similares a las cinasas tipo Wee-1 de levadura, fosfatasas CDK similares a levadura CDC25, inhibidores CDK similares a levadura SIC1 y los productos génicos INK4 humanos, y cinasas que activan CDK (CAK). La regulación del ciclo celular en las transiciones de fase G1\rightarrow S y G2 \rightarrow M depende de los complejos CDK-ciclina apropiados; se considera que ambas transiciones son los puntos de control principales en el ciclo
celular.

La decisión de la célula de proliferar y sintetizar ADN y finalmente dividirse se hace en el punto de restricción
G1 \rightarrow S hacia el final de G1. Superar este punto de no regreso necesita que la competencia de la célula inicie la síntesis de ADN así como también la expresión de los genes fase S. La transcripción de los genes específicos fase S requiere la unión al ADN de un factor de transcripción E2F. El factor de transcripción E2F heterodimérico/socio de dimerización (DP) regula la actividad promotora de múltiples genes, que son esenciales para la replicación de ADN y para el control del ciclo celular (Helin, 1998; Müller and Helin, 2000). La actividad E2F/DP se inhibe mediante el producto génico retinoblastoma (Rb) que se regula mediante la fosoforilación (Weinberg, 1995). Los factores de transcripción E2F son efectores críticos de la decisión de pasar el punto de restricción y permitir a la célula proceder en la fase
S.

En las plantas, el desarrollo post-embriónico se basa en la división celular iterativa en los meristemos. Las células en el meristemo permanecen en un estado indeterminado en donde luego de la diferenciación ellas salen del ciclo celular y se mueven desde el meristemo. En el sistema celular no diferenciado o meristemático de la planta la transición G1 \rightarrow S se caracteriza por la acción de complejos de ciclina CDK que involucran las ciclinas tipo D. De manera similar que el sistema de mamífero, se requiere fosforilación de la proteína de retinoblastoma por el complejo CycD-CDK para liberar el factor de transcripción E2F asociado, forzando por lo tanto al internamiento de la célula a la fase S y así la decisión de la célula pasa sobre el punto de salida del ciclo celular. Así, se han identificado genes E2F y DP de plantas lo que sugiere que están involucrados en el mecanismo regulador G1 \rightarrow S (Ramirez-Parra et al., 1999; Sekine et al., 1999; Ramirez-Parra and Gutierez, 2000; Magyar et al., 2000). Su función en la maquinaria molecular del ciclo celular de la planta que controla la diferenciación y la salida del ciclo celular ya es bastante desconocido. Por lo tanto, uno de los objetos de la presente invención es identificar la capacidad reguladora sobre el progreso del ciclo celular de los factores de transcripción E2F al modular su expresión en una planta. La modulación de la expresión de estos factores de transcripción permite manipular los procesos biológicos que ellos controlan. Es un objeto adicional de la presente invención modular estos procesos biológicos hacia aplicaciones particulares útiles en la agricultura y horticultura. La invención proporciona una solución a por lo menos varios de los objetos anteriores al proporcionar las realizaciones descritas.

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Resumen de la invención

En la presente invención, se describe el efecto de la sobreexpresión del E2Fa y E2Fa/DPa en plantas.

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En particular, la presente invención proporciona:

(i): Método para modificar una planta monocotiledónea al incrementar el tamaño y/o número de retoños, panículas, flores o semillas, que comprende sobreexpresar en una planta un ácido nucleico que codifica un factor de transcripción E2F de planta bajo el control de un promotor específico de semilla.

(ii): Método como se establece en (i) anterior, en donde dicha planta ha incrementado el producto de semilla comparado con plantas de tipo silvestre.

(iii): Método como se estable en una cualquiera de (i) o (ii) anterior, en donde dicha planta tiene una capacidad incrementada para acumulación de almacenamiento comparado con plantas del tipo silvestre.

(iv): Método como se establece en una cualquiera de (i) a (iii) anterior, en donde dicha planta es una plántula con vigor intensificado comparado con las plantas de tipo silvestre.

(v): Método como se establece en una cualquiera de (i) a (iv) anterior, en donde dicha planta comprende células diferenciadas estimuladas para reingresar al ciclo celular comparado con las plantas del tipo silves- tre.

(vi): Método como se establece en una cualquiera de (i) a (v) anterior, en donde dicha planta comprende células en las que se anulan las señales de diferenciación celular comparadas con las de las plantas de tipo silvestre.

(vii): Método como se establece en una cualquiera de (i) a (vi) anterior, en donde dicha planta comprende células que tienen una forma de célula alterada comparada con las plantas de tipo silvestre.

(viii): Método como se establece en una cualquiera de (i) a (vii) anterior, en donde el número de retoños se incrementa comparado con las plantas del tipo silvestre.

(ix): Método como se establece en una cualquiera de (i) a (viii) anterior, en donde el número de panículas se incrementa comparado con las plantas del tipo silvestre.

(x): Método como se establece en una cualquiera de (i) a (ix) anterior, que comprende integrar en forma estable en el genoma de una planta o en una célula específica o tejido u órgano de una planta, un ácido nucleico expresable que codifica un factor de transcripción E2F de planta, o un homólogo, derivado o fragmento enzimáticamente activo del mismo.

(xi): Método como se establece en una cualquiera de (i) a (x) anterior, en donde dicho factor de transcripción E2F se selecciona del grupo que consiste de: un factor de transcripción E2Fa, E2Fb, E2Fc o E2F. Como se representa por la SEQ ID NO 2 o 20 o un homólogo, derivado o fragmento enzimáticamente activo del mismo.

(xii): Método como se establece en una cualquiera de (i) a (xi) anterior, que comprende adicionalmente la coexpresión de DP (socio de dimerización E2F).

(xiii): Método como se establece en (xii) anterior, en donde dicho DP se selecciona del grupo que consiste en un DPa, un DPb o un DP como se presenta por SEQ ID NO 4 o un homólogo, derivado o fragmento enzimáticamente activo del mismo.

(xiv): Método para la producción de una planta transgénica monocotiledónea que tiene tamaño incrementado y/o número de retoños, panículas, flores o semillas, que comprende las etapas de:

(a): Suministrar una construcción de ADN que comprende un promotor específico de semilla ligado operablemente a un gen que codifica un factor de transcripción E2F;

(b): Transformar dicha construcción de ADN de (a) en una célula de planta;

(c): Cultivar la célula transgénica obtenida de la etapa (b) bajo condiciones que promuevan la regeneración y el crecimiento de plantas maduras; y

(d): Seleccionar y evaluar dicha planta de (c) durante el curso del desarrollo para registrar sus características fenotípicas y morfológicas.

(xv): Método como se establece en una cualquiera de (i) a (xiv) anterior, en donde dicha planta monocotiledónea o célula de planta se deriva de un cereal, tal como arroz o maíz.

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(xvi): Uso de un factor de transcripción E2F o un homólogo, derivado o fragmento enzimáticamente activo del mismo bajo el control de un promotor específico de semilla para obtener plantas monocotiledóneas que tienen y/o número de retoños, panículas, flores o semillas tamaño incrementado.

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La presente especificación también describe un método para modificar el desarrollo de la planta y/o los procesos de crecimiento, tal como modular el número de células en un tejido particular tal como por ejemplo los cotiledones o los meristemos o las semillas. La presente especificación también describe alterar la arquitectura de la planta, tal como o alterar el tamaño y número de órganos de la planta en particular, tal como por ejemplo cotiledones, hojas, brotes, tallos, retoños, panículas, espigas, flores, semillas, raíces, tubérculos. La presente especificación también describe métodos para alterar el índice de crecimiento de plantas, y/o respuesta inducida por tensión, y/o desempeño de la planta, y/o producción, dicho método comprende modular la expresión y/o actividad de un factor de transcripción E2F o un homólogo o un derivado del mismo o un fragmento enzimáticamente activo del mismo, solo o en combinación con su socio de dimerización (DP). La presente especificación también describe que un gen que codifica un E2F se coloca bajo el control de un promotor constitutivo o un promotor regulable, preferiblemente un promotor específico de órgano o de tejido o de célula, e introducirlo en la planta. La descripción de la presente especificación también se extiende al uso de construcciones genéticas para desarrollar los métodos descritos aquí y con plantas transgénicas producidas de la misma manera que tienen crecimiento alterado y/o desarrollo y/o arquitectura y/o características fisiológicas comparadas con sus contrapartes isogénicas.

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Descripción detallada de la invención

La especificación describe que las plantas transformadas con un gen E2Fa muestra números celulares incrementados en ciertos órganos y/o tamaño de órganos incrementado, por ejemplo cotiledones alargados, y/o número incrementado de órganos tal como más retoños y panículas, comparado con las plantas no transformadas con un factor de transcripción E2F.

La presente especificación describe un método para incrementar el número celular de tipo de células específicos, tejidos específicos, u órganos específicos, en una planta que comprende modular la expresión y/o la actividad en dichos tipos de células específicos, tejidos específicos u órganos específicos de un factor de transcripción E2F de planta. En particular, la invención proporciona tales métodos como se definen en las reivindicaciones 1 al 15.

En la descripción siempre que se utilice la expresión "modular la expresión y/o la actividad de un factor de transcripción E2F de planta", un "factor de transcripción E2F" como se utilizan en esta expresión se relacionan con un gen o ácido nucleico que codifica un factor de transcripción E2F de planta o un homólogo o un derivado del mismo o un fragmento enzimáticamente activo de un gen o ácido nucleico que codifica E2F, así como también se relaciona con la proteína E2F, polipéptido o un homólogo o un derivado o un fragmento enzimáticamente activo del polipéptido o de proteína E2F.

La expresión "modular la expresión" de un factor de transcripción E2F, se relaciona por ejemplo con métodos para alterar la expresión de por lo menos un ácido nucleico en tejidos o células específicas. De acuerdo con la invención, el "ácido nucleico" puede ser el ácido nucleico endogénico del tipo silvestre cuya expresión se modula o puede ser un ácido nucleico derivado de la misma u otra especie, pero en caso de originarse de la misma especie se puede modificar sustancialmente a partir de su forma natural en composición y/o ambiente genómico.

Una forma de modular la expresión de los factores de transcripción E2F de acuerdo con la invención se relaciona con un método que comprende la integración estable en el genoma de una planta o en tejidos o células de planta específicos de dicha planta de un ácido nucleico expresable que codifica un factor E2F de planta, un homólogo o un derivado del mismo o un fragmento enzimáticamente activo del mismo.

En el último caso, el término "expresión" o "sobreexpresión" se debe entender como "expresión ectópica". La "expresión ectópica" o "sobreexpresión ectópica" de un gen o una proteína se refiere a los patrones de expresión y/o niveles de expresión de dicho gen o proteína que no ocurren normalmente bajo condiciones naturales. La expresión ectópica se puede alcanzar en un número de formas que incluyen conectar operablemente una secuencia de codificación que codifica dicha proteína a un homólogo aislado o promotor heterólogo con el fin de crear un gen quimérico y/o conectar operablemente dicha secuencia de codificación a su propio promotor aislado (por ejemplo un promotor no aislado naturalmente que controla la expresión de dicha proteína) con el fin de crear una duplicación de gen recombinante o efecto de multiplicación genético.

En el contexto de la presente especificación el término "modulación" se relaciona con "intensificar o reducir" la expresión de acuerdo con la invención se prevé la expresión incrementada o intensificada de dicho ácido nucleico. Los métodos para obtener la expresión incrementada o intensificada de los genes o productos génicos están bien documentados en la técnica y se pueden por ejemplo acoplar a un promotor constitutivo fuerte, o el uso de intensificadores de transcripción y/o traducción. Los métodos para reducir la expresión y/o actividad de un gen son por ejemplo el uso de anticodificantes o co-supresión, silenciadores, ribozimas, supresores etc.

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La "modulación de la expresión de gen" también abarca el nivel de transcrito del gen que se altera y este puede ser la base de los efectos observados. Por ejemplo, se sabe que incrementar el nivel de transcrito de un transgen en las plantas no solo puede conducir a niveles de proteína incrementados, sino alternativamente, los transcritos pueden estar involucrados en la cosupresión del gen natural correspondiente al transgen.

La expresión "expresable" se relaciona con la presencia de secuencias de control que promueven la expresión adecuada de los genes y/o la traducción apropiada de dichas secuencias en una proteína específica. Dichas secuencias de control incluyen secuencias promotoras que pueden ser promotoras constitutivas o promotoras específicas de tejidos o células. Los promotores también están previstos para uso en los métodos descritos aquí que son específicos para dividir células.

En las tablas A y B, se da una lista no exhaustiva de ejemplos de tales promotores específicos de células de tejidos, promotores constitutivos y promotores específicos para dividir células.

La modulación, por ejemplo aumentar o reducir la actividad de un gen se puede lograr por ejemplo al inhibir respectivamente o estimular los elementos de control que controlan la expresión de un gen natural o del transgen. También modificar la actividad del producto génico, del polipéptido, se puede lograr adicionalmente al administrar o exponer las células, tejidos, órganos u organismos a una proteína de interacción o un inhibidor o activador de dicho producto génico. En el contexto de la presente invención, tales inhibidores o activadores también pueden aceptar su actividad contra la proteína E2F o el complejo E2F/DP.

La expresión "modular la actividad de un factor de transcripción E2F", por ejemplo incrementar la actividad del gen, el producto génico, o el polipéptido codificado por el gen, se puede lograr al administrar o exponer células, tejidos, órganos u organismos a, una preparación de dicho gen, producto génico o dicho polipéptido, de tal manera que este pueda ejercer su función en dichos tejidos o células expuestas. En el contexto de la presente descripción, por ejemplo las células se exponen a las muestras de proteína de la proteína E2F o complejos de proteína
E2F/DP.

Se demuestra aquí que los cotiledones agrandados de las plantas Arabidopsis transformadas con E2F, contienen células más pequeñas pero tres veces más células comparadas con WT. Las células extra originadas de las divisiones de células adicionales ocurren después de germinación de semillas. Luego de la sobreexpresión ubicua y constitutiva del factor de transcripción E2Fa, las células específicas en la epidermis del hipocotilo también muestra extra división celular pero no hay diferencia en tamaño del hipocotilo entre el E2Fa transgénico y el WT. Los niveles E2Fa mejorados pueden por lo tanto prolongar el periodo de división celular en ciertas células y tejidos tal como las cotiledóneas. Los inventores han mostrado que el E2Fa o E2F/DPa pueden sostener la división celular en células que son competentes para dividirse. Excepto para el tamaño del cotiledón, las características morfológicas de las E2Fa transgénicas son similares a las plantas WT. También las plantas de arroz transformadas con el gen E2Fa y que tienen más retoños y panículas, no muestran deformaciones en la arquitectura general de la
planta.

De acuerdo con lo anterior se describe aquí también un método como se describió anteriormente para aumentar el número de células de tipos de células específicos, tejidos específicos u órganos específicos en una planta sin alterar la estructura y/o composición de dicha célula, tejido u órgano específico o la planta completa.

Los métodos para monitorear la estructura alterada o la composición de un tejido u órgano o la planta completa, son por ejemplo la inspección visual de las características morfológicas y fenotípicas externas tal como la forma general del tejido u órgano o planta. Por ejemplo, se puede ver fácilmente si una hoja se deforma o si el tallo tiene una estructura aberrante, o si la raíz tiene estructuras deformadas. También se pueden utilizar otras técnicas para determinar las características morfológicas de un tejido tal como la identidad de las células en el tejido o del órgano o la planta, aquellas técnicas comprenden análisis microscópico, ensayos histológicos, hibridación in situ o inmunoprecipitación in situ, análisis FACS, ...

La sobreexpresión del E2Fa conduce a la prolongación del periodo de división celular y/u otros mecanismos de crecimiento junto con el incremento armonizado del crecimiento de la planta. Esto significa que no se interrumpe el balance entre el programa de ciclo celular básico y el crecimiento de la planta general.

De acuerdo con lo anterior, una característica técnica y particularmente importante de la presente invención es que la estructura arquitectónica general de la planta no se daña. El cambio radical en el comportamiento celular y curación celular originada por la sobreexpresión del E2F, no afecta la estructura de tejido general o la composición de la planta. Esta característica de la presente invención es extremadamente importante, ya que alterar un proceso biológico básico puede conducir a la deformación de tejido. La delicadeza de este balance se ilustra por el hecho que la sobreexpresión del E2F junto con su socio de dimerización DP resulta en la intensificación de los efectos vistos cuando se sobreexpresa el E2F solo y conduce a proliferación celular no controlada en tejido diferenciado y posteriormente en la detención del crecimiento temprano durante el desarrollo post-embriónico de las
plantas.

Los inventores muestran que al introducir el gen E2Fa en una planta, ellos fueron capaces de intensificar la proliferación celular y prolongar el periodo de división celular de ciertas células en un cierto órgano de una planta. Los inventores también han encontrado sorprendentemente que la sobreexpresión general del E2F se puede utilizar para estimular las células que están en proceso de diferenciación o células diferenciadas para reingresar al programa de ciclo celular. Aunque se sabe que el E2F tiene una función en el control del ciclo celular, se muestra ahora por primer vez en las plantas, las células, que no se dividen más espontáneamente, (por ejemplo, debido a que ellas se han diferenciado), pueden ahora estar influenciadas o reingresar de nuevo al ciclo celular, al transformarlas con
E2Fa.

Por lo tanto otra realización de la presente invención se relaciona con un método para estimular células, para que reingresen al ciclo celular.

En una realización preferida los tipos de célula que se estimulan para reingresar al ciclo celular son células en el proceso de diferenciación o células diferenciadas.

Reingresar al ciclo celular significa que las células normalmente no son capaces de ir al ciclo celular debido a que ellas han pasado esa etapa de desarrollo y por lo tanto ellas están destinadas a diferenciarse. Los métodos de la presente invención se pueden utilizar para alterar ese destino celular y dejar que tales células reingresen al ciclo celular. Este proceso toma más que solo estimular la división celular o estimular la progresión del ciclo celular, debido a que la necesidad de anular las señales que determinan las células para diferenciar en cambio forzarlas a cruzar el primer punto de control del ciclo celular. El método de la presente invención tampoco es solamente alterar el desarrollo ya que el desarrollo general del tipo del tejido o el órgano permanece como estaba: la estructura y composición permanecen sin alteración. También, el método de la presente invención no es únicamente para alterar la diferenciación es decir la diferenciación inversa, debido a los efectos del método descrito aquí que también están en el nivel de órganos bien diferenciados: por ejemplo muy específicamente los efectos están en los cotiledones, o retoños o panículas que constituyen tejidos diferenciados. Adicionalmente, los métodos de la presente invención no están únicamente alterando el crecimiento, ya que el crecimiento es un proceso que no necesariamente significa que se incrementa el número de células. Por ejemplo el crecimiento se puede medir por crecimiento más rápido o alcanzar más rápido la etapa adulta o el tamaño incrementado de la célula.

También otros tipos de células específicas preferidas para modificar la expresión o la actividad de un E2F, son células meristemáticas, en por ejemplo el meristemo apical de retoño o el meristemo apical de raíz.

Los presentes inventores ligan operacionalmente el factor de transcripción E2Fa a varios promotores y transforman estas construcciones en plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas. De manera sorprendente, en todos los casos los inventores observaron un incremento en el número de células en los tipos de células particulares o un aumento en el tamaño y/o el número de órganos particulares.

Los presentes inventores encontraron sorprendentemente que la sobreexpresión constitutiva y ubicua del factor de transcripción E2Fa en plantas de Arabidopsis thaliana conduce a cotiledones agrandados comparados con las plantas de tipo silvestre (WT). Adicionalmente, la expresión preferida de semilla de este gen E2Fa en una planta de arroz resulta en planta de arroz con número incrementado de retoños y panículas.

La presente descripción también describe cualquiera de los métodos descritos aquí para obtener una planta con un número de órganos incrementado.

Alternativamente, la presente especificación describe cualquiera de los métodos descritos aquí para obtener una planta con tamaño incrementado de órganos.

Como se describe aquí, dicho órgano específico es un brote, retoño, panícula, espiga, flor, hoja, cotiledón, tallo, semilla, raíz o tubérculo. En particular, la invención proporciona el incremento del tamaño y/o número de retoños, panículas, flores o semillas.

Como se describe aquí, la sobreexpresión del E2F bajo control de un promotor específico de semilla conduce a más semillas, y también a un tamaño incrementado de las semillas. La biomasa y el producto son directamente dependientes del número y tamaño de órganos, la arquitectura de la planta (numero de ramas), y la producción en masa de semillas (acumulación dependiente de asimilados fotosintéticos). Por lo tanto el presente método se puede utilizar para incrementar el rendimiento y por lo tanto la importancia económica de una planta, particularmente monocotiledóneas, gramíneas y cereales, se mejora al utilizar los métodos. Los métodos de la invención mejoran particularmente las monocotiledóneas.

Dependiendo del promotor utilizado (y por supuesto de la planta utilizada, dicotiledónea versus monocotiledónea), se puede incrementar el tamaño y el número de los diferentes órganos. El principio básico de esta modificación de la arquitectura de la planta es el incremento en el número de células en órganos o tejidos particulares. De manera sorprendente, el uso de un promotor constitutivo no resulta en el incremento del número de células en la planta completa debido a que el E2F trabaja en una forma dependiente de la célula. Adicionalmente, cuando la expresión E2F se limita a la semilla, se incrementa muy sorprendentemente el número de retoños así como también el número de panículas.

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De acuerdo con lo anterior, se describe aquí un método para modificar el rendimiento de las plantas, tal como cereales de gramíneas, cultivos u ornamentales. En una realización particular los métodos descritos aquí se utilizan para modificar maíz al incrementar el número de espigas. Otras realizaciones particularmente descritas aquí comprenden los métodos como se describió anteriormente para la aplicación en pastos para incrementar el número de ramas y/o retoños, por ejemplo para incrementar la producción de biomasa; para cultivos para incrementar el número de retoños, panículas, flores y semillas, por ejemplo para incrementar el producto total de semillas; para maíz la expresión tardía del promotor se utiliza para incrementar el número de ramas en los meristemos en inflorescencia que conduce a un número incrementado de semilla; y para ornamentales para incrementar el número de ramas. El producto de dichas plantas y la importancia económica de dichas plantas se mejora significativamente por los métodos descritos
aquí.

Una realización adicional de la invención se relaciona con un método como se mencionó anteriormente que comprende integrar en forma estable en el genoma de dicha planta o en los órganos o tejidos o células de plantas específicas de dicha planta un ácido nucleico expresable que codifica un factor de transcripción E2F de planta, un homólogo o un derivado del mismo o un fragmento enzimáticamente activo del mismo.

La presente especificación describe adicionalmente el complejo entre los factores de transcripción E2F2 y sus socios de dimerización. Por ejemplo el factor de transcripción E2F heterodimérico/socio de dimerización (DP) regula la actividad del promotor de múltiples genes que son esenciales para la replicación de ADN y el control del ciclo celular. Un ejemplo de tal una proteína similar a DP se aísla de la Arabidopsis thaliana y su secuencia de aminoácido se representa en la SEQ ID NO 4. La secuencia de ácido nucleico correspondiente se representa en la SEQ ID NO 3. Las secuencias se recuperan del Genbank bajo el número de acceso AJ294531 (Magyar et al., 2000). Los inventores han encontrado sorprendentemente que los efectos del E2F se pueden intensificar mediante la coexpresión del E2F junto con DP.

Los inventores muestran por primera vez que la expresión ectópica de E2Fa/DPa temprana durante el desarrollo en células diferenciadas resulta en proliferación celular. En contraste con la expresión de otros genes de tipo celular que no resultan en proliferación en tejidos diferenciados, sorprendentemente la sobreexpresión de los genes de los ciclos celulares E2F/DPa se puede utilizar en plantas para anular las señales que regulan la diferenciación celular. En el caso de la sobreexpresión general del E2Fa y DPa bajo la influencia de un promotor constitutivo, este método se puede utilizar como base para generar una detención del crecimiento.

De acuerdo con lo anterior también se describe aquí un método para intensificar la proliferación celular en células que están en el proceso de diferenciación y para anular las señales de diferenciación en una planta que comprende modular la expresión y/o la actividad en células específicas o tejidos u órganos de un factor de transcripción E2F de planta y un socio de dimerización E2F de planta (DP) un homólogo o un derivado del mismo o un fragmento enzimáticamente activo del mismo.

"Intensificar la proliferación celular en células diferenciadas" significa que la división celular en las células diferenciadas se estimula en tal una forma que la división celular continua resulta en un exceso de número de células. La proliferación no ocurre normalmente en tejidos diferenciados, debido a que las células en esos tejidos están programadas para detener la división.

La "anulación de las señales para diferenciación en una planta" significa que se altera el destino de la célula. Normalmente las células diferenciadas se programan para detener la división y esta programación ocurre a través de ciertas rutas de transducción de señal. La anulación de las señales para diferenciación significa que el proceso de diferenciación se obstaculiza.

Una realización adicional de la invención se relaciona con un método o como se describió anteriormente que comprende integrar en forma estable en el genoma de dicha planta o en las células o tejidos u órganos de planta específicos de dicha planta un ácido nucleico expresable que codifica un factor de transcripción E2F de planta y por lo menos un ácido nucleico expresable que codifica un socio de dimerización E2F de planta (DP), un homólogo o un derivado del mismo o un fragmento enzimáticamente activo del mismo.

Se han aislado y secuenciado los factores de transcripción E2F de planta y se conocen en la técnica. Un ácido nucleico de ejemplo que codifica un factor de transcripción E2F se representa en la SEQ ID NO 1 y su correspondiente secuencia de aminoácidos se representa de la SEQ ID NO 2. Estas secuencias se depositan en la base de datos Genbank bajo el número de acceso AJ294534 y se relaciona con mARN de Arabidopsis thaliana que codifica una proteína relacionada con E2F (gen E2Fa) (Magyar et al., 2000). Este gen, Arath; E2Fa también se puede encontrar en las bases de datos públicas bajo el número de acceso MIPS At2g36010 F11 F19.8 y corresponde a la proteína CAC15486. Una variante de empalme del factor de transcripción E2Fa de Arabidopsis thaliana se representa en la SEQ ID NO 19, que codifica un polipéptido como se representa en la SEQ ID NO 20. Esta secuencia se aísla por primera vez por los inventores y muestra que tiene una sustitución de aminoácidos comparada con el factor E2F de acuerdo con la secuencia SEQ ID NO 2 o CAC15486.

Se debe hacer claridad en que la invención no se limita a dicho ácido nucleico y/o dichas proteínas sino también a otros factores de transcripción E2F conocidos que son útiles en los métodos de la presente invención. Es claro que muchas variantes alélicas o variantes de empalme del factor E2Fa existen y esas variantes también se pueden utilizar en los métodos de la presente invención. También se pueden identificar homólogos de E2Fa en otras especies de plantas, por ejemplo mediante detección de las bases de datos de secuencia con el Arath; también se puede utilizar la secuencia E2Fa y el diseño de cebadores degenerativos para utilizar en una reacción PCR sobre una colección de CADN de otro organismo y estos homólogos en los métodos de la presente invención. También Arath E2Fb (numero de acceso MIPS At5g22220 T6G21.10 y correspondientes a la proteína CAC15485). Es un gen que también es de particular interés para uso en los métodos de la presente invención, ya que el E2Fa y E2Fb se relacionan bastante. También Arath E2Fc (numero de acceso MIPS At1g47870 T2T6.2 y el correspondiente a la proteína CAD10631) y factores E2F homólogos de otras especies de planta se conocen en la técnica y se pueden utilizar para los métodos de la presente
invención.

De acuerdo con una realización específica la presente invención se relaciona con cualquier método de la presente invención, en donde dicho factor de transcripción E2F es E2Fa, por ejemplo pero no limitado a E2Fa de Arabidopsis thaliana.

De acuerdo con lo anterior, la presente invención también incorpora cualquiera de los métodos como se describen en la presente invención en donde se selecciona el factor de transcripción E2F del grupo que consista de E2F, preferiblemente E2Fa de Arabidopsis thaliana, o E2Fb o E2Fc y en donde el DP se selecciona del grupo que consiste de DPA preferiblemente DPA de Arabidopsis thaliana y DPB.

Adicionalmente los inventores han encontrado sorprendentemente que en las plantas monocotiledóneas, tal como el arroz, se incrementa el número de retoños y/o el número de panículas, cuando el factor de transcripción E2F se sobreexpresa y cuando dicha sobreexpresión de E2F está específicamente en la semilla de dichas plantas.

En la presente invención dicha planta es una planta monocotiledónea tal como arroz, en una realización preferida, dicho factor de transcripción E2F es el factor de transcripción AtE2Fa, como se establece en la SEQ ID NO 1 o se establece en la SEQ ID NO 19, que es una variante de empalme de AtE2Fa. Preferiblemente, dicho método comprende integrar en forma estable en el genoma de dicha planta o en las células de plantas específicas o tejidos de dichas plantas un ácido nucleico expresable que codifica un factor de transcripción E2F de planta, un homólogo o derivado del mismo o un fragmento enzimáticamente activo del mismo. El factor E2F, tal como un factor E2Fa, está bajo el control de un promotor específico de semillas, tal como promotor de oleosina de arroz.

De acuerdo con lo anterior, otra realización es cualquier método como se describe en la presente invención en donde el ácido nucleico que codifica un factor de transcripción E2F de planta se representa por la SEQ ID NO 2 o 20, o un homólogo o un derivado del mismo o un fragmento enzimáticamente activo del mismo.

También, la invención se relaciona con un método que comprende mejorar la expresión o actividad en células específicas o tejidos de un factor de transcripción E2F de planta, un homólogo o un derivado del mismo o un fragmento enzimáticamente activo del mismo al mejorar la expresión de un ácido nucleico que codifica un factor de transcripción E2F de planta un homólogo o un derivado del mismo o un fragmento enzimáticamente activo del mismo en dichos tejidos o células específicas. Dicha intensificación de la expresión del gen esta mediada por la sobreexpresión de ese gen, bajo el control de un promotor específico de semilla.

De acuerdo con lo anterior la presente invención incorpora cualquiera de los métodos como se describe aquí, que comprende la sobreexpresión de un ácido nucleico que codifica dicho factor de transcripción E2F de planta bajo el control de un promotor específico de semilla.

La especificación describe adicionalmente cualquiera de los métodos como se describe aquí para la producción de una planta transgénica, que comprende las etapas de:

(a): Proporcionar o elaborar una construcción de ADN que comprende una secuencia reguladora, que es capaz de modificar la expresión y/o la actividad de un factor de transcripción E2F, y conectar en forma operable esta secuencia reguladora a un gen que codifica un factor de transcripción E2F,

(b): Transformar dicha construcción de ADN en una célula de plantas,

(c): Cultivar la célula transgénica obtenida de la etapa (b) bajo condiciones que promuevan la regeneración y el crecimiento de la planta madura,

(d): Seleccionar y evaluar dicha planta durante el curso del desarrollo para registrar sus características fenotípicas y morfológicas.

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Como se describe preferiblemente, dicha secuencia reguladora es un promotor. Alternativamente, dicha secuencia reguladora no se liga operablemente al gen E2F en dicha construcción de ADN, pero la secuencia reguladora se utiliza para influenciar la expresión del gen E2F natural en la célula anfitriona.

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Como se describe preferiblemente, dicha secuencia reguladora se selecciona del grupo que consiste de un promotor, un intensificador, un intensificador de transcripción, una traducción y un intensificador adicionalmente.

La presente invención se relaciona con cualquieras de los métodos descritos aquí en donde dicho E2F está bajo el control de un promotor específico de semilla, y/o promotor específico de embrión, tal como el promotor oleosi-
na.

Como se describe en esta especificación, el promotor LEAFY también se utiliza para expresar el gen E2F en arroz y maíz durante la inducción de la formación de flor. Esta estrategia permite obtener plantas con un número incrementado de producción celular durante la formación de flor, es decir un número incrementado de células en el meristemo en inflorescencia, y por lo tanto un número incrementado y/o tamaño de semillas.

Como se describe en esta especificación, se utiliza el promotor CDC2a para controlar la expresión E2Fa y llevar a plantas que tiene un número incrementado de células en el meristemo del ápice de los brotes (SAM) y meristemo de ápice de raíz (RAM). Este meristemo vegetativo se transforma primero en un meristemo en inflorescencia, que luego genera el meristemo floral como una consecuencia se puede formar órganos más o menos grandes a partir de estos meristemos. El promotor MCM3 (Stevens et al., 2002), o el promotor RNR (Chabouté et al. 2002) que se expresan en zonas de división activamente también se utilizan en los métodos de la presente invención para incrementar el número de células en los meristemos.

Las células de plantas o plantas utilizadas en los métodos descritos aquí incluyen todas las plantas o células de plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, que incluye plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas. Dos de las plantas más preferidas para uso en los métodos son Arabidopsis thaliana y Oryza sativa (arroz).

De acuerdo con otra realización, la presente invención se relaciona adicionalmente con cualquiera de los métodos descritos aquí y en donde dicha planta o célula de planta se deriva de arroz (Oryza sativa).

La especificación describe adicionalmente todas las plantas transgénicas que se pueden obtener mediante cualquiera de los métodos descritos aquí que muestran división celular estimulada en células específicas o tejidos celulares. Preferiblemente, se describe una planta transgénica que tiene expresión alterada o actividad de un factor de transcripción E2F y que tiene más células en un tejido de planta particular u órganos, y/o órganos agrandados tal como cotiledones agrandados y/o retoños agrandados y/o panículas agrandadas y/o brotes agrandados y/o flores agrandadas y/o raíces agrandadas y/o semillas agrandadas y/o tubérculos agrandados.

Adicionalmente, se describe una planta transgénica que tiene expresión alterada y/o actividad de un factor de transcripción E2F y que tiene más células en un tejido u órgano de planta particular, y/o más órganos tal como retoños y/o más panículas y/o más brotes y/o más flores y/o más raíces y/o más semillas y/o más tubérculos.

De acuerdo con lo anterior se describe una planta transgénica que se puede obtener mediante cualquiera de los métodos como se describió anteriormente.

También se describe una parte, particularmente una parte que se puede cosechar de una planta transgénica como se describió anteriormente.

La modulación, por ejemplo reducir o aumentar, el nivel de productos génicos activos o de la actividad de productos génicos se puede alcanzar adicionalmente al administrar o exponer las células, tejidos, órganos u organismos a, respectivamente, un inhibidor o activador de dicho producto génico. Tales inhibidores o activadores también pueden efectuar su actividad contra la proteína E2F o el complejo E2F/DP. Tales inhibidores o activadores incluyen proteínas y compuestos químicos que se pueden obtener y/o identificar por ejemplo mediante una de los siguientes,
métodos.

De acuerdo con lo anterior, la especificación también describe un método para identificar y obtener compuestos que interfieren con la interacción entre el factor de transcripción E2F y su socio de dimerización que comprende las etapas de:

(a): Proporcionar un sistema de dos híbridos en donde un ácido nucleico que codifica un factor de transcripción E2F representado por la SEQ ID NO 2 o 20 o un homólogo o un derivado del mismo o un fragmento enzimáticamente activo del mismo y su socio de dimerización representado por la SEQ ID NO 4 o se expresa un homólogo o un derivado del mismo o un fragmento enzimáticamente activo del mismo,

(b): Interactuar en por lo menos un compuesto con el complejo formado por los polipéptidos expresados como se define en (a), y,

(c): Medir el efecto de dicho compuesto en la unión entre las proteínas de interacción como se define en (a) o medir la actividad de dicho complejo,

(d): Identificar opcionalmente dicho compuesto.

También se describen los métodos anteriores en donde dichos compuestos intensifican la actividad de dicho complejo de proteína o promueve la formación de un complejo entre dichas proteínas. La especificación también describe, los compuestos que se pueden obtener mediante dichos métodos.

La especificación también describe un compuesto identificado o que se puede identificar por medio de los métodos anteriores como un regulador de crecimiento de las plantas. También se describe un método para producir un regulador de crecimiento de plantas que comprende las etapas de los métodos anteriores y formular los compuestos obtenidos de dichas etapas en una forma adecuada para la aplicación en agricultura o cultivos de células o tejidos de
plantas.

La especificación describe adicionalmente diferentes usos nuevos de los factores de transcripción E2F. El factor E2F utilizado en la presente invención puede ser cualquier factor E2F seleccionado del grupo E2Fa, E2Fb y E2Fc. También se utiliza el factor E2F en la presente invención solo o en combinación con su socio de dimerización DP. Este DP es cualquier DP o un DP seleccionado del grupo que consiste de DPa y DPb. En un ejemplo particular de la presente invención se utiliza un factor de transcripción E2Fa de Arabidopsis thaliana o un factor E2Fa representado por la secuencia de las SEQ ID NOs 1, 2, 9 y 10. En un ejemplo particular de la invención se utiliza el factor DPa de Arabidopsis thaliana o el factor DPb como se representa en la SEQ ID No 3 y 4.

Como se describe preferiblemente los usos del factor E2F o DP comprenden modular la expresión y/o actividad en células específicas o tejidos u órganos de un factor de transcripción E2F de planta y un socio de dimerización E2F de planta (DP), un homólogo o un derivado del mismo o un fragmento enzimáticamente activo del mismo, por ejemplo al intensificar la expresión de un ácido nucleico que codifica un factor de transcripción E2F de planta solo o en combinación con un ácido nucleico que codifica un DP de planta o un homólogo o un derivado de dichos ácidos nucleicos o un fragmento enzimáticamente activo del mismo, en dichas células o tejidos específi-
cos.

En una realización particular de la invención los usos de E2F o DP involucran integrar en forma estable en el genoma de dicha planta o en las células de plantas específicas o tejidos de dicha planta un ácido nucleico expresable que codifica un factor de transcripción E2F de planta o un ácido nucleico expresable que codifica un socio de dimerización E2F de planta (DP), un homólogo o un derivado del mismo o un fragmento enzimáticamente activo del
mismo.

El uso de un factor de transcripción E2F, un homólogo o un derivado del mismo o un fragmento enzimáticamente activo del mismo para prolongar el periodo de la división celular en ciertas células y tejidos.

La expresión "prolongar el periodo de división celular" significa alterar el destino de las células que se dividen en tal una forma que ellos no detienen la división, pero en cambio continúan dividiéndose. La expresión significa que las células de la presente invención tienen un periodo de división celular prolongado comparado con células en donde no se modula la expresión y/o la actividad del E2F. El periodo de división celular prolongado se puede observar por inspección visual del tejido para ver si hay más células y/o si los órganos son más grandes, o mediante análisis microscópico o mediante ensayos histológicos.

La presente especificación también describe el uso de un factor de transcripción E2F, o un homólogo o un derivado del mismo o un fragmento enzimáticamente activo para incrementar el tamaño de los cotiledones.

Los cotiledones agrandados en dichas plantas transgénicas resulta en vigor intensificado de las plántulas, que puede traducirse en una tasa de crecimiento mayor (por ejemplo mayor crecimiento en la etapa juvenil y resulta en un crecimiento general mar rápido en la etapa adulta), mayor resistencia a la tensión, y mayor supervivencia de las plántulas.

La presente especificación también describe el uso de un factor de transcripción E2F, o un homólogo o un derivado del mismo o un fragmento enzimáticamente activo del mismo para intensificar la proliferación celular después de germinación de la semilla.

La presente especificación también describe el uso de un factor de transcripción E2F, o un homólogo o un derivado del mismo o un fragmento enzimáticamente activo del mismo para mejorar la resistencia a la tensión de las
plántulas.

La presente especificación también describe el uso de un factor de transcripción E2F, o un homólogo o un derivado del mismo o un fragmento enzimáticamente activo del mismo para obtener plántulas con vigor intensificado.

La presente especificación también describe el uso de un factor de transcripción E2F, o un homólogo o un derivado del mismo o un fragmento enzimáticamente activo del mismo para obtener plantas con crecimiento incremen-
tado.

La presente especificación también describe el uso de un factor de transcripción E2F, o un homólogo o un derivado del mismo o un fragmento enzimáticamente activo del mismo para obtener plantas que tienen más células en un tejido particular de la misma o un fragmento enzimáticamente activo del mismo para obtener plantas que tienen más células en un tejido particular.

La expresión "mas células" se relaciona con una planta que tiene más células en el mismo tejido u órgano cuando se compara con el tejido u órgano de otra planta (de la misma especie, con la misma edad, en los mismos ambientes) en donde no se modula la expresión y/o actividad de un factor de transcripción E2F.

Se pueden utilizar más células en dichas plantas transgénicas para alterar las características arquitectónicas, por ejemplo para alterar la estructura de la madera, por ejemplo para hacerla más densa y pesada. Estas características alteradas pueden tener un efecto benéfico por ejemplo en la resistencia a los patógenos de la planta y la calidad del material de la planta. Por lo tanto los métodos de la presente invención pueden contribuir significativamente a la aplicabilidad industrial de dichas plantas transgénicas. Más células en dichas plantas transgénicas también se pueden utilizar para alterar las características bioquímicas de la planta por ejemplo para producir más componentes de pared celular. Ejemplos de aplicación industrial de estas plantas son el cultivo de plantas para la producción de lignina, celulosa, pectina etc.

La presente especificación describe adicionalmente el uso de un factor de transcripción E2F, o un homólogo o un derivado del mismo o un fragmento enzimáticamente activo del mismo para obtener plantas que tienen un número de órganos incrementado.

La presente especificación también describe adicionalmente el uso de un factor de transcripción E2F, o un homólogo o un derivado del mismo o un fragmento enzimáticamente activo del mismo para obtener plantas que tienen un tamaño de órganos incrementados.

La presente especificación también describe adicionalmente el uso de un factor de transcripción E2F, o un homólogo o un derivado del mismo o un fragmento enzimáticamente activo del mismo para obtener plantas que tienen un rendimiento incrementado.

La presente especificación describe adicionalmente el uso de un factor de transcripción E2F, o un homólogo o un derivado del mismo o un fragmento enzimáticamente activo del mismo para estimular células diferenciadas para que reingresen al ciclo celular.

La presente especificación también describe el uso de un factor de transcripción E2F, o un homólogo o un derivado del mismo o un fragmento enzimáticamente activo del mismo para anular las señales de diferenciación celu-
lar.

Los inventores también muestran que la sobreexpresión del E2F y el DP resulta en forma celular alterada en algunas células o en algunos tejidos de la planta.

La presente especificación también describe adicionalmente el uso de un factor de transcripción E2F, o un homólogo o un derivado del mismo o un fragmento enzimáticamente activo del mismo para alterar la forma celular.

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Definiciones y elaboraciones para las realizaciones

Los ácidos nucleicos se escriben de derecha a izquierda en la orientación 5' a 3', a menos que se indique otra cosa; las secuencias de aminoácido se escriben de izquierda a derecha en la orientación amino a carboxi. Los aminoácidos se denominan aquí por ser comúnmente conocidos con símbolos de tres letras o por símbolos de una letra recomendados por la comisión de nomenclatura bioquímica y IUPAC-IUB. Los nucleótidos se pueden numerar o ser códigos de una letra comúnmente aceptados.

Los términos "gen(es)", "polinucleótido(s)", "ácido(s) nucleico(s)", "secuencia(s) de nucleótido(s)", "secuencia(s) de ácido(s) nucleico(s)", o "molécula(s) de ácido(s) nucleico(s)" como se utiliza aquí se refiere a una forma polimérica de un polímero ribonucleótidos o desoxiribonucleótidos de cualquier longitud ya sea monocatenarios o bicatenarios, o análogos de los mismos, que tienen la característica esencial de un ribonucleótido esencial en que ellos se pueden hibridar a ácidos nucleicos en una forma similar a polinucleótidos de ocurrencia natural.

Se ha hecho una gran variedad de modificaciones al ADN y ARN que sirven a muchos propósitos útiles conocidos por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, metilación, "caps" y sustitución de uno o más nucleótidos de ocurrencia natural con un análogo. Dichos términos también incluyen ácidos nucleicos de péptidos.

El término "polinucleótido" como se utiliza aquí incluye tales formas químicamente, enzimáticamente o metabólicamente modificadas de polinucleótidos.

"Cadena codificante" se refiere a una cadena de ADN que es homóloga a un transcrito de mARN de la misma, "cadena anticodificante" que se refiere a la cadena complementaria de la cadena codificante.

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"Que codifica" o "codifica" con respecto a una secuencia de nucleótidos significa que comprende la información para traducción a una proteína específica. Un ácido nucleico que codifica una proteína puede contener secuencias no traducidas tal como regiones no traducidas 5' y 3' (UTR 5' y 3') e intrones o a esta le pueden faltar secuencias de intrones tales como por ejemplo en el cADN.

Un "cuadro de lectura abierto" o "(ORF)" se define como una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido. La información mediante la cual se codifica una proteína se especifica por el uso de codones. Típicamente, la secuencia de aminoácidos se codifica por el ácido nucleico utilizando el código genético "universal" pero existen variantes de este código universal (ver por ejemplo Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 82: 2306-2309 (1985)). Los límites de la secuencia de codificación se determinan mediante un codón iniciador de traducción en el extremo 5' y un codón de detención de traducción en el terminal 3'.

Como se utiliza aquí "secuencia de longitud completa" con respecto a un ácido nucleico específico o su proteína codificada significa que tiene la secuencia de aminoácido completa de una proteína natural. En la presente invención, la comparación con secuencias homólogas (hortólogas o parálogas) de longitud completa se utiliza para identificar secuencias de longitud completa. También, para un mARN o sea ADN, las secuencias consensus presentes en las regiones no traducidas 5' y 3' ayudan en la identificación de un polinucleótido de longitud completa. Para una proteína la presencia de un codón iniciador y codón de detención ayudan en la identificación del polipéptido de longitud completa. Cuando se va a expresar el ácido nucleico, se puede tomar ventajas de preferencia de codón conocidas o preferencias de contenido GC del anfitrión de destino ya que estas preferencias se han mostrado que difieren (ver por ejemplo http://www.kazusa.or.jp/codon/; Murray et al. Nucl. Acids Res. 17: 477-498 (1989)). Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos pueden codificar cualquier proteína dada. Como tal, sustancialmente las secuencias de ácido nucleico divergentes se pueden diseñar para efectuar la expresión de esencialmente la misma proteína en diferentes anfitriones. Por el contrario, los genes y las secuencias de codificación que codifican esencialmente la misma proteína aislada de diferentes fuentes puede consistir de sustancialmente de diferentes secuencias de ácido nucleico.

Un "ácido nucleico expresable" como se utiliza aquí significa un ácido nucleico que lleva los elementos de control necesarios para ser efectivos en la célula anfitriona.

El término "secuencia de control" o "secuencia reguladora" o "elemento regulador" se refiere a secuencias de ácido nucleico reguladoras que son necesarias para efectuar la expresión de las secuencias a las que ellas se ligan. Las secuencias de control difieren dependiendo del organismo anfitrión de destino y luego la naturaleza de la secuencia a ser expresada. Para la expresión de una proteína, en procariotes, generalmente las secuencias de control incluyen un promotor, un sitio de unión ribosómico, y un terminador. En eucariotes, la secuencia de control incluye generalmente promotores, terminadores, y en algunos casos intensificadores, y/o secuencias no traducidas 5' y 3'. El término "secuencia de control" está destinado a incluir, en un mínimo, todos los componentes necesarios para la expresión, y también pueden incluir componentes ventajosos adicionales.

Como se utiliza aquí, un "promotor" incluye referencia a una región de ADN en la dirección 5' del inicio de la transcripción y está involucrado en la unión de polimerasa de ARN y otras proteínas para iniciar la transcripción. La referencia aquí a un "promotor" se toma en su contexto más amplio e incluye las secuencias reguladoras transcripcionales derivadas de un gen genómico eucariotico clásico, que incluye la caja TATA que se requiere para la iniciación de la transcripción exacta, con o sin una secuencia de caja CCAAT y elementos reguladores adicionales (es decir secuencias de activación en la dirección 5', intensificadores y silenciadores) que alteran la expresión génica en respuesta a estímulos externos y/o del desarrollo, o en una forma específica del desarrollo. El término "promotor" también incluye las secuencias reguladoras transcripcionales de un gen procariótico clásico, en cuyo caso este puede incluir una secuencia de la caja -35 y/o unas secuencias reguladoras de la caja -10. El término "promotor" también se utiliza para describir una molécula de fusión o sintética, o derivada que confiere, activa o intensifica la expresión de una molécula de ácido nucleico en una célula, tejido u órgano.

Un "promotor de planta" es un promotor capaz de iniciar la transcripción de células de planta.

Promotores "preferidos de tejido" como se utiliza aquí se refiere a promotores que inician preferencialmente la transcripción en ciertos tejidos tal como por ejemplo en hojas, raíces, etc. Los promotores que inician la transcripción solo en ciertos tejidos se denominan aquí "específicos de tejido". Ejemplos de promotores preferidos de tejido o específicos de tejido de plantas se dan en la Tabla A.

Aquellos expertos en la técnica advertirán que los "promotores inducibles" tienen iniciación de transcripción inducida o incrementada en respuesta a un estímulo del desarrollo químico, ambiental, o físico.

Un "promotor constitutivo" es transcripcionalmente activo durante la mayoría, pero no necesariamente todas las fases de su crecimiento y desarrollo. Ejemplos de promotores constitutivos se dan en la tabla B.

El término "terminador" como se utiliza aquí es un ejemplo de una "secuencia de control" y se refiere a una secuencia de ADN al final de una unidad transcripcional que señala el procesamiento 3' y la poliadenilación de un transcrito principal y la terminación de la transcripción. Los terminadores comprenden secuencias no traducidas 3' con señales de poliadenilación que facilitan el procesamiento 3' y la adición de secuencias poliadeniladas al extremo 3' de un transcrito principal. Se conocen y describen en la literatura los terminadores activos en células derivadas de virus, levaduras, mohos, bacterias, insectos, aves, mamíferos y plantas. Ellos se pueden aislar de bacterias, hongos, virus, animales y/o plantas. Elementos reguladores adicionales pueden incluir intensificadores transcripcionales así como intensificadores traduccionales. Un intensificador traduccional de planta utilizado frecuentemente es la secuencia omega CaMV. Se ha mostrado que la inclusión de un intrón incrementa los niveles de expresión hasta 100 veces en ciertas plantas (Mait, Transgenic Research 6 (1997), 143-156; Ni, Plant Journal 7 (1995),
661-676).

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TABLA A Promotores preferidos de tejido o específicos de tejido de plantas de ejemplo

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4

5

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TABLA B Promotores de planta constitutivos de ejemplo para uso en el desempeño de la materia objeto descrita en la presente especificación

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El término "ligado operablemente" como se utiliza aquí se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes así descritos están en una relación que les permite funcionar en su forma prevista. Una secuencia de control "ligada operablemente" a una secuencia de codificación se liga en tal una forma que la expresión de la secuencia de codificación se logra bajo condiciones compatibles con las secuencias de control. En el caso en el que la secuencia de control es un promotor, es obvio para una persona experta que se utiliza ácido nucleico bicatena-
rio.

En el término "que hibrida" incluye referencia a la formación de una estructura de ácido nucleico dúplex a través de la hibridación de dos secuencias de ácido nucleico monocatenarias. El proceso de hibridación puede ocurrir completamente en solución como por ejemplo en los procesos de reacción de cadena de polimerasa, hibridación sustractiva, y síntesis de su cADN. Alternativamente, uno de los ácidos nucleicos complementarios se puede inmovilizar sobre un soporte sólido tal como sobre una membrana de nylon en análisis de transferencia por gel de ADN y ARN o sobre un soporte de vidrio de silicio para hibridación de microensayo. Otros usos y técnicas que se basan en la hibridación son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Los factores críticos para la hibridación son la resistencia iónica y la temperatura de la solución y las características de los ácidos nucleicos tal como la longitud y el porcentaje de contenido de GC. El Tm es la temperatura en la que el 50% de una secuencia objetivo complementaria hibrida a una sonda perfectamente emparejada bajo pH y resistencia iónica definida. Para los híbridos ADN-ADN, se puede calcular el Tm a partir de la ecuación de Meinkoth y Wahl (Anal. Biochem., 138: 267-284, 1984): Tm = 81.5ºC + 16.6 (logM) + 0.41 (%GC) - 0.61 (% en formamida) - 500/L en donde M es la molaridad de cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de guanosina y nucleótidos de citocina en el ADN, el porcentaje de formamida es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación, y L es la longitud del híbrido en pares
base.

Para los términos "condiciones rigurosas" o "condiciones de hibridación rigurosas" incluyen referencia a condiciones bajo las cuales una sonda hibridará a su secuencia objetivo a un mayor grado detectable que otras secuencias (por ejemplo, por lo menos 2 veces más de fondo). Las condiciones rigurosas son dependientes de secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Al controlar la rigurosidad de la hibridación y/o condiciones de lavado se pueden identificar secuencias objetivo que son 100% complementarias con la sonda. Alternativamente, se pueden ajustar condiciones de rigurosidad para permitir algún desajuste con menores grados de similitud. Las condiciones rigurosas son aquellas en las que la concentración de sal es menor aproximadamente 1.5 M de ión de Na típicamente 0.01 a 1.0 M de ión Na, (u otras sales) en pH 7.0 a 8.3 y la temperatura es aproximadamente 30ºC para sondas cortas (10 a 50 nucleótidos) y por lo menos 60ºC para sondas largas (por ejemplo más de 50 nucleótidos). También se pueden alcanzar condiciones rigurosas con la adición de agentes desestabilizantes tal como formamida. Un ejemplo de condiciones de baja rigurosidad incluyen hibridación con una solución de amortiguador de 30 a 35% de formamida 1 M NaCl, 1% SDS (dodecil sulfato de sodio) a 37ºC, y un lavado en 1x a 2x SSC (20x SSC es 3.0 M NaCl/0.3M de citrato de trisodio) en 50 a 55ºC. Condiciones de rigurosidad moderada de ejemplo incluye hibridación en 40 a 45% de formamida, 1 M NaCl, 1% SDS a 37ºC, y un lavado en 0.5x SSC a 1.0x SSC en 55 a 60ºC. Condiciones de alta rigurosidad incluyen hibridación en 50% de formamida, 1M NaCl, 1% SDS a 37ºC, y un lavado en 0.1x SSC de 60 a 65ºC. La especificidad es típicamente la función de los lavados posthibridación. Aquellos expertos en la técnica entenderán que las condiciones para hibridación y lavado se pueden ajustar para lograr hibridación a secuencias de la identidad deseada. Una guía para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989); and in Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New York (1993).

Los términos "proteínas" y "polipéptidos" se utilizan intercambiablemente en esta solicitud y se refieren a un polímero de aminoácidos. Estos términos no se refieren a una longitud específica de la molécula y así los péptidos y oligopéptidos están incluidos dentro de la definición de polipéptidos. Este término también se refiere a o incluye las modificaciones postraduccionales del polipéptido, por ejemplo, glucosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones, sulfataciones y similares. Estas modificaciones son bien conocidas por los expertos en la técnica y se describen ejemplos en Wold F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, pp. 1-12 in Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York (1983) and Seifter et al., Meth. Enzymol. 182: 626-646 (1990). Se incluye dentro de la definición, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (que incluyen, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), polipéptidos con enlaces sustituidos así como también otras modificaciones de ocurrencia natural y no natural conocidas en la
técnica.

El término "aminoácidos", "residuo de aminoácidos" o "residuo" se utilizan intercambiablemente aquí para referirse a un aminoácido que se incorpora en una proteína, polipéptido o péptido. El aminoácido puede ser un aminoácido de ocurrencia natural y puede ser un análogo conocido de aminoácido naturales que pueden funcionar de una manera similar como los aminoácidos de ocurrencia similar.

Como se utiliza aquí "homólogos" de una proteína de la invención son aquellos péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que contienen sustituciones de aminoácido, eliminaciones y/o adiciones con relación a dicha proteína, proporcionando similar actividad biológica que la del polipéptido no modificado del que ellos se derivan. Para producir tales homólogos, los aminoácidos presentes en dicha proteína se pueden reemplazar por otros aminoácidos que tienen similares propiedades, por ejemplo hidrofobicidad, hidrofilicidad, antigenicidad, propensión a formar o romper estructuras helicoidales \alpha o estructuras de lámina \beta, y así sucesivamente. Las tablas de sustitución conservadoras se conocen bien en la técnica (ver por ejemplo Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman and Company)). Un repaso de las propiedades físicas y químicas de los aminoácidos se da en la
tabla C.

TABLA C Propiedades de aminoácidos de ocurrencia natural

7

Dos formas especiales de homología, ortóloga y paráloga, son conceptos evolutivos utilizados para describir relaciones ancestrales de genes.

El término "parálogo" se relaciona con duplicación de genes dentro del genoma de una especie que conduce a genes parálogos.

El término "ortólogo" se relaciona con genes homólogos en diferentes organismos debido a una relación ancestral. La presente invención también se relaciona así con homólogos, parálogos y ortólogos de las proteínas de acuerdo con la invención.

"Variantes de sustitución" de una proteína de la invención son aquellas en las que por lo menos un residuo en dicha secuencia de aminoácido de proteína se ha removido y un residuo diferente se inserta en su lugar. Se hacen sustituciones de aminoácido típicamente de residuos sencillos, pero se pueden agrupar dependiendo de las restricciones funcionales colocadas en el polipéptido; las inserciones serán usualmente del orden de aproximadamente 1-10 residuos de aminoácidos, y las eliminaciones variarán de aproximadamente 1-20 residuos. Preferiblemente, las sustituciones de aminoácidos comprenderán sustituciones de aminoácidos conservadoras, tal como aquellas descritas anteriormente.

Las "variantes de inserción" de una proteína de la invención son aquellas en las que uno o más residuos de aminoácidos se introducen en un sitio predeterminado en dicha proteína. Las inserciones pueden comprender inserciones terminal-amino y/o terminal-carboxi así como también inserciones intrasecuencia de aminoácidos sencillos o múltiples. Generalmente las inserciones dentro de la secuencia de aminoácidos eran más pequeñas que las funciones del terminal amino o carboxi, del orden de aproximadamente 1 a 10 residuos. Ejemplos de péptidos o proteínas de fusión de terminal amino o carboxi incluyen el dominio de unión o el dominio de activación de un activador transcripcional como se utiliza en el sistema de dos híbridos de levadura, proteínas de recubrimiento de fago (histidina)_{6}-tag, glutationa, S-transferasa-tag, proteína A, proteína de unión maltosa, reductasa dihidrofolato, epítopo Tag \cdot100, epítopo c-myc, epítopo FLAG ®, lacz, CMP (péptido de unión calmobulina), epítopo HA, epítopo de proteína C y epítopo VSV.

"Las variantes de eliminación" de una proteína de la invención se caracterizan por la remoción de uno o más aminoácidos de dicha proteína. Las variantes de aminoácidos de una proteína de la invención se pueden hacer fácilmente utilizando técnicas sintéticas de péptidos bien conocidas en el arte, tal como síntesis de péptido de fase sólida y similares, o mediante manipulaciones de ADN recombinante. La manipulación de secuencias de ADN para producir variantes de sustitución, inserción o eliminación de una proteína se conocen bien en el arte. Por ejemplo, las técnicas para hacer mutaciones de sustitución en sitios predeterminados en el ADN se conocen bien por aquellos expertos en la técnica e incluyen mutagenia M13, mutagenia in vitro T7-gen (USB, Cleveland, OH), mutagenia dirigida al sitio QuickChange (Stratagene, San Diego, CA), mutagenia dirigida al sitio mediada por PCR u otros protocolos de mutagenia dirigida al sitio.

El término "homólogos" de un factor de transcripción E2F son aquellos péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que contienen sustituciones de aminoácidos, eliminaciones y/o adiciones relacionadas con dicho factor de transcripción E2F, que suministra similar actividad biológica que el polipéptido no modificado del que ellos se derivan. Preferiblemente dichos homólogos tienen por lo menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia. La invención también se relaciona así con el uso de tales homólogos de factores de transcripción E2F en los métodos descritos y más preferiblemente con el uso de homólogos de la proteína representada en la SEQ ID NO 2.

"Los derivados" de una proteína de la invención son aquellos péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que pueden comprender residuos de aminoácido de ocurrencia natural, glucosilados alterados, acilados o de ocurrencia no natural comparados con la secuencia de aminoácido de una forma de ocurrencia natural de dicho polipéptido. Un derivado también puede comprender uno o más sustituyentes no aminoácidos comparados con la secuencia de aminoácido del que esta se deriva, por ejemplo una molécula indicadora u otro ligando, unida covalentemente o no covalentemente a la secuencia de aminoácido tal como, por ejemplo, una molécula indicadora que se une para facilitar su detección.

Un "fragmento enzimáticamente activo" de un factor de transcripción E2F comprende por lo menos 5 residuos de aminoácidos contiguos de dicha proteína pero debe retener la actividad biológica del factor de transcripción E2F de ocurrencia natural. Este término también significa cualquier fragmento de proteína que es aún capaz de ejercer la función.

El término "sitio celular" significa los eventos estructurales y bioquímicos cíclicos asociados con el crecimiento y con la división de las células, y en particular con la regulación de la replicación del ADN y la mitosis. El ciclo celular incluye fases denominadas: G0, Gap1(G1), síntesis de ADN (S), Gap2 (G2), y mitosis (M). Normalmente estas cuatro fases ocurren secuencialmente, sin embargo, el ciclo celular también incluye ciclos modificados en donde una o más fases están ausentes resultando el ciclo celular modificado tal como endomitosis, acitoquinesis, poliploidía, politenia, y endoreduplicación.

"Moléculas de ADN recombinantes" o "gen quimérico" significa un ADN híbrido producido al unir piezas de ADN de diferentes fuentes a través de manipulación humana deliberada.

El término "expresión" significa la producción de una secuencia de nucleótido o proteína en la célula. Sin embargo, dicho término incluye la protección de la proteína en un sistema libre de células. Esto incluye la transcripción en un producto de ARN, modificación postranscripcional y/o traducción a un producto de proteína o polipéptido de un ADN que codifica ese producto, así como también modificaciones postraduccionales posibles. Dependiendo de las construcciones específicas y condiciones utilizadas, la proteína se puede recuperar de las células, del medio de cultivo o de ambos. Para el experto es bien conocido que no solo es posible expresar una proteína natural sino también expresar la proteína como polipéptidos de fusión o agregar secuencias de señal que dirigen la proteína a compartimentos específicos de la célula anfitriona, por ejemplo, asegurando la secreción del péptido en el medio del cultivo, etc. Adicionalmente, una proteína y fragmentos de los mismos se pueden sintetizar químicamente y/o modificar de acuerdo con los métodos estándar descritos.

"Un vector" como se utiliza aquí incluye referencias a un ácido nucleico utilizado para transfección o transformación de una célula anfitriona y en el que se puede insertar un ácido nucleico. Los vectores de inspección de la transcripción y/o traducción de un ácido nucleico insertado allí. Los vectores de expresión pueden por ejemplo ser vectores de clonación, vectores binarios o vectores de integración y típicamente contienen secuencias de control como se describió anteriormente para asegurar la expresión en células procarióticas y eucarióticas. Los elementos reguladores que permiten la expresión en las células anfitrionas procarióticas comprenden, por ejemplo, el promotor P_{L}, lac, trp o tac en E. coli. Ejemplos de elementos reguladores que permiten la expresión en células anfitrionas eucarióticas aox1o Gal1 en levadura o el promotor Sv40 cmd, Sv 40, RSB o el intensificador o un intrón de globina en mamíferos y otras células de animales. En este contexto los vectores de expresión adecuados se conocen en la técnica tal como el vector de expresión cADN Okayama-Berg pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcADN1, pcADN3 (Invitrogen), pSPORT1 (GIBCO BRL). Ventajosamente, los vectores de la invención comprenden un marcador seleccionable y/o clasificable. Los genes de marcador seleccionables útiles para la selección de células de plantas transformadas, callo, tejido de plantas y plantas se conocen bien por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, la resistencia antimetabolito proporciona la base de la selección para: el gen dhfr que confiere resistencia al metotrexato (Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13 (1994), 143-149); el gen npt que confiere Resistencia a la neomicina aminoglicosida, kanamicina y paromomicina (Herrera-Estrella, EMBO J. 2 (1983), 987-995); y hpt, que confiere resistencia a la higromicina (Marsh, Gene 32 (1984), 481-485). Se han descrito genes de marcadores seleccionables adicionales, a saber trpB, que permite a las células utilizar indol en lugar de triptofan; hisD, que permite a las células usar histinol en lugar de histidina (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047); manosa-6 -fosfato isomerasa que permite a las células utilizar manosa (WO 94/20627) y ornitina descarboxilasa que confiere resistencia al inhibidor ornitina descarboxilasa, 2-(difluorometil)-DL-ornitina o DFMO (McConlogue, 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.) o desaminasa de Aspergillus terreus que confiere resistencia a Blasticidina S (Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59 (1995), 2336-2338). Los marcadores clasificables útiles también se conocen por aquellos expertos en la técnica y están disponibles comercialmente. Ventajosamente, dicho marcador es un gen que codifica luciferasa (Giacomin, PI. Sci. 116 (1996), 59-72; Scikantha, J. Bact. 178 (1996), 121), proteína fluorescente verde (Gerdes, FEBS Lett. 389 (1996), 44-47) o \beta-glucuronidasa (Jefferson, EMBO J. 6 (1987),
3901-3907).

El vector o molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención se puede integrar en el genoma de la célula anfitriona o se puede mantener en alguna forma extracromosómicamente. A este respecto también se entiende que la molécula de ácido nucleico de la invención se puede utilizar para restaurar o crear un gen mutante a través de la recombinación homóloga o través de otros mecanismos moleculares tal como por ejemplo interferencia de ARN (Paszkowski (ed.), homólogous Recombinationand Gene Silencing in Plants. Kluwer Academic Publishers (1994)).

Como se utiliza aquí, una "célula anfitriona" es una célula que contiene un vector y soporta la expresión y/o replicación de este vector. Las células anfitrionas pueden ser células procarióticas tal como E. Coli y A. tumefaciens, o estas pueden ser células eucarióticas tales como células de levadura, de insectos, de anfibios, de plantas o de mamíferos. Preferiblemente, las células anfitrionas son células de plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas.

El término "fragmento de una secuencia" o "parte de una secuencia" significa una secuencia truncada de la secuencia original referida. La secuencia truncada (secuencia de proteína o ácido nucleico) puede variar ampliamente de longitud; el tamaño mínimo es una secuencia de tamaño para proporcionar una secuencia con por lo menos una función comparable y/o actividad enzimática de la secuencia original referida, aunque el tamaño máximo no es crítico. En algunas aplicaciones, el tamaño máximo usualmente no es mayor que aquel requerido para proporcionar la actividad deseada y/o función de la secuencia original. Típicamente, la secuencia de aminoácido truncada variará de aproximadamente 5 a aproximadamente 60 aminoácidos de longitud. Mas típicamente, sin embargo, la secuencia tendrá un máximo de aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, preferiblemente un máximo de aproximadamente 30 aminoácidos. Es usualmente deseable seleccionar secuencias de aproximadamente 10, 12 o 15 aminoácidos hasta aproximadamente 20 o 25 aminoácidos.

Como se utiliza, el término "planta" incluye referencia a plantas completas, órganos de plantas (tal como hojas, raíces, tallos, etc.), semillas y células de plantas y progenie de la misma.

La "célula de planta" como se utiliza aquí, incluye cultivos en suspensión, embriones, regiones meristemáticas, tejidos de callo, hojas, semillas, raíces, brotes, gametofitos, esporofitos, polen, y microesporas. Las plantas que se pueden utilizar en los métodos de la invención incluyen todas las plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, en particular plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas que incluyen un forraje o leguminosas forrajeras, plantas ornamentales, cultivos alimenticios, árboles, o arbustos seleccionados de la lista que comprende Acacia spp., Acer spp., Actinidia spp., A esculus spp., Agathis australis, Albizia amara, Alsophila tricolor, Andropogon spp., Arachis spp, Areca catechu, Astelia fragrans, Astragalus cicer, Baikiaea plurijuga, Betula spp., Brassica spp., Bruguiera gymnorrhiza, Burkea africana, Butea frondosa, Cadaba farinosa, Calliandra spp, Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Cassia spp., Centroema pubescens, Chaenomeles spp., Cinnamomum cassia, Coffea arabica, Colophospermum mopane, Coronillia varia, Cotoneaster serotina, Crataegus spp., Cucumis spp., Cupressus spp., Cyathea dealbata, Cydonia oblonga, Cryptomeria japonica, Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia oblonga, Dalbergia monetaria, Davallia divaricata, Desmodium spp., Dicksonia squarosa, Diheteropogon amplectens, Dioclea spp, Dolichos spp., Dorycnium rectum, Echinochloa pyramidalis, Ehrartia spp., Eleusine coracana, Eragrestis spp., Erythrina spp., Eucalyptus spp., Euclea schimperi, Eulalia villosa, Fagopyrum spp., Feijoa sellowiana, Fragaria spp., Flemingia spp, Freycinetia banksii, Geranium thunbergii, Ginkgo biloba, Glycine javanica, Gliricidia spp, Gossypium hirsutum, Grevillea spp., Guibourtia coleosperma, Hedysarum spp., Hemarthia altissima, Heteropogon contortus, Hordeum vulgare, Hyparrhenia rufa, Hypericum erectum, Hyperthelia dissoluta, Indigo incamata, Iris spp., Leptarrhena pyrolifolia, Lespediza spp., Lettuca spp., Leucaena leucocephala, Loudetia simplex, Lotonus bainesii, Lotus spp., Macrotyloma axillare, Malus spp., Manihot esculenta, Medicago sativa, Metasequoia glyptostroboides, Musa sapientum, Nicotianum spp., Onobrychis spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Peltophorum africanum, Pennisetum spp., Persea gratissima, Petunia spp., Phaseolus spp., Phoenix canariensis, Phormium cookianum, Photinia spp., Picea glauca, Pinus spp., Pisum sativum, Podocarpus totara, Pogonarthria fleckii, Pogonarthria squarrosa, Populus spp., Prosopis cineraria, Pseudotsuga menziesii, Pterolobium stellatum, Pyrus communis, Quercus spp., Rhaphiolepsis umbellata, Rhopalostylis sapida, Rhus natalensis, Ribes grossularia, Ribes spp., Robinia pseudoacacia, Rosa spp., Rubus spp., Salix spp., Schyzachyrium sanguineum, Sciadopitys verticillata, Sequoia sempervirens, Sequoiadendron giganteum, Sorghum bicolor, Spinacia spp., Sporobolus fimbriatus, Stiburus alopecuroides, Stylosanthos humilis, Tadehagi spp, Taxodium distichum, Themeda triandra, Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga heterophylla, Vaccinium spp., Vicia spp. Vitis vinifera, Watsonia pyramidata, Zantedeschia aethiopica, Zea mays, amaranto, alcachofa, espárragos, brócoli, coles de brúcela, col, canola, zanahoria, coliflor, apio, col rizada, lino, lenteja, oleaginosas, cebolla, papa, arroz, soya, paja, remolacha azucarera, caña de azúcar, girasol, tomate, calabaza, y té, entre otros. Una planta particularmente preferida es Oriza sativa.

Una "planta" como se utiliza aquí también significa una célula de planta, un tejido de planta o un órgano de planta. Un órgano o tejido de planta es cualquier tejido de planta o cualquier órgano de planta que pueda ser denominado por ser una parte de una planta o parte de un explante derivado de planta.

El término "cotiledón" significa la hoja de la semilla que absorbe nutrientes. Para las poáceas y los cereales el escutelo es el único cotiledón que absorbe endoesperma.

El término "panícula" como se utiliza aquí significa un grupo de flores junto con el tallo de un planta. Posiblemente, este grupo de flores consiste de un número de tallos individuales (racimos) cada uno de los cuales tiene una serie de flores sencillas a lo largo de su longitud. Para el maíz, las panículas también se denominan espigas.

El término "retoño" como se utiliza aquí es un brote de planta: un brote que crece desde la base del tallo, especialmente el tallo de un césped.

El término "transformación" como se utiliza aquí, se refiere a la transferencia de un polinucleótido exógeno dentro de una célula anfitriona, independiente del método utilizado para la transferencia. El polinucleótido se puede introducir transitoriamente o establemente en la célula anfitriona y se puede mantener no integrado, por ejemplo, como un plásmido o alternativamente se puede integrar en el genoma anfitrión. La célula de la planta transformada resultante se puede utilizar luego para regenerar una planta transformada en una forma conocida por un experto. La transformación mediada por Agrobacterium o agrolística de las plantas, levaduras, mohos u hongos filamentosos se basa en la transferencia de parte de las secuencias de vector de transformación, denominadas T-ADN, al núcleo y en la integración de dicho T-ADN y en el genoma de dicho eucariote.

Con "Agrobacterium" significa un miembro de la Agrobacteriaceae, más preferiblemente Agrobacterium o Rizobacterium y más preferiblemente Agrobacterium tumefaciens.

"T-ADN" o ADN transferido, significa que parte del vector de transformación flanqueado por los límites el TDA de ADN que es, después de la activación de los genes Agrobacterium ByR, mellado en los límites del T-ADNy se transfiere como un ADN monocatenario al núcleo de una célula eucariótica.

Como se utiliza aquí, "límites de T-ADN" "región de límite de T-ADN" o "región de límite" significa el límite del T-ADN derecho (RB) o el límite izquierdo (LB). Tal un límite comprende una secuencia de núcleo flanqueada por una región interna de límite como parte del flanqueo T-ADN que flanquea el límite y/o un límite de región externo como parte de la estructura de vector que flanquea el límite. Un elemento de transferencia del T-ADN intensificador se ha caracterizado y reside en el límite derecho de la región externa y se llama "overdrive" (Peralta, Hellmiss et al., 1986; van Haaren, Sedee et al., 1987).

"Vector de transformación de T-ADN" o "vector de T-ADN" significa cualquier vector que abarca una secuencia de T-ADN flanqueada por un borde de T-ADN derecho e izquierdo que consiste de por lo menos las secuencias de un núcleo de borde izquierdo y derecho, respectivamente, y se utilizan para la transformación de cualquier célula eucariótica.

Como se utiliza aquí, "planta transgénica" incluye referencia a una planta que comprende dentro de su genoma un polinucleótido heterólogo. Generalmente el polinucleótido heterólogo se integra establemente dentro del genoma de tal manera que el polinucleótido se pasa a generaciones sucesivas. El polinucleótido heterólogo se puede integrar en el genoma solo o como una parte de un vector.

Como se utiliza aquí, el término "heterólogo" en referencia a un ácido nucleico es un ácido nucleico que se deriva de una célula u organismo con un fondo genómico diferente o, si es del mismo fondo genómico se modifica sustancialmente de su forma natural en composición y/o ambiente genómico a través de modificación humana deliberada. De acuerdo con lo anterior, una proteína heteróloga aunque se origina de la misma especie puede estar sustancialmente modificada por manipulación humana.

"Transgénico" se utiliza aquí para incluir cualquier célula, estirpe celular, callo, tejido, parte de planta o planta, cuyo genotipo se ha alterado mediante la presencia de ácido nucleico heterólogo que incluye aquellos transgénicos inicialmente alterados así como aquellos creados por cruces sexuales o propagación asexual del mismo transgénico inicial.

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Breve descripción de las figuras

Figura 1. Ubicación in situ de mARN E2Fa y DPa. Se ven señales de hibridación como puntos negros.

(a): Alta expresión de E2Fa en una sección longitudinal del meristemo apical del brote (SAM) y tejidos de diferenciación circundantes de rábano. La flecha señala el SAM.

(b): Expresión homogénea de DPa en la sección longitudinal del SAM y hojas jóvenes de rábano. La flecha señala el SAM.

(c): Expresión E2Fa en la sección longitudinal a través de un meristemo de raíz (RM) de rábano.

(d): Expresión DPa homogénea en la sección longitudinal a través del RM de rábano.

(e): Sección longitudinal a través de un hipocotilo de una plántula de Arabidopsis. Se detectan los transcritos E2Fa en las células corticales y epidérmicas. La flecha señala a los tejidos de corteza y epidermis.

(f): Sección longitudinal a través de un hipocotilo de una plántula de Arabidopsis etiolada. La expresión es más fuerte en el gancho del hipocotilo de las plántulas que crecen en la oscuridad que en las que crecen a la luz. La flecha señala a los tejidos de corteza y epidermis.

Barras de escala: 50 \mum (a, b), 20 \mum (c a f).

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Figura 2. Análisis molecular de plantas de Arabidopsis que sobreexpresan E2Fa y DPa.

(a): transferencia de gel de ARN de plantas transgénicas E2Fa 35S CaMV independientes.

(b): transferencia de gel de ARN de plantas transgénicas DPa 35S CaMV independientes.

(c): Relación de la detención del crecimiento observada con la presencia de ambos transgenes E2Fa 35S CaMV y DPa 35S CaMV. 1, Planta tipo silvestre; 2, cruce entre una planta E2Fa 35S CaMV y una planta de control; 3, cruce entre una planta DPa 35S CaMV y una planta de control; 4 a 13, individuos hermanos de un cruce entre una planta E2Fa 35S CaMV homocigota y un DPa 35S CaMV heterocigoto. Las líneas marcadas con * muestran hojas rizadas y cotiledones y se detienen en la etapa de plántula. Se prueba la presencia de los trangenes mediante PCR.

(d): Niveles de transcritos de genes de fase S en plantas E2Fa/DPa CaMV 35S y de control.

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Figura 3. Fenotipo de plantas que sobreexpresan E2Fa y DPa.

(a): Control no transformado.

(b): Planta que sobreexpresa E2Fa.

(c): Planta que sobreexpresa E2Fa/DPa.

Se fotografían todas las plantas en la misma magnificación 12 días después de siembra.

Barra de escala: 0.25 cm.

Los dos cotiledones en (a) y (b) se muestran en la esquina inferior izquierda y superior derecha.

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Figura 4. Análisis microscópico de plantas que sobreexpresan E2Fa/Dpa y E2Fa.

(a), (e): Epidermis abaxial de plantas de control de 5 semanas de edad y 3 semanas de edad, respectivamente.

(b), (f): Epidermis abaxial de una planta E2Fa de 5 semanas de edad y 3 semanas de edad, respectivamente.

(c), (d): Empalizada de una planta E2Fa y una planta de control de 5 días de edad, respectivamente.

(g): Hipocotilo de planta de control de 12 días de edad.

(h): Hipocotilo de planta E2Fa de 12 días de edad.

(i): Hipocotilo de planta E2Fa/DPa de 12-días de edad;

(j): Hipocotilo de una planta E2Fa/DPa de 3 semanas de edad;

(k), (i): Micrografías de exploración de (g) e (i).

La flecha en (d) y (f) señala a las paredes de la célula sintetizadas novedosas; los asteriscos en (g) y (h) indican líneas celulares en los que se forman estomas.

Barras de escala: 100 \mum (a a d, k, l) y 50 \mum (e a j).

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Figura 5. Nivel ploide de ADN en plantas transgénicas E2Fa/DPa 35S CaMV y de control.

(a): Tricomo de una planta de control.

(b): Tricomo de una planta transgénica E2Fa/DPa. Las flechas señalan al núcleo.

(c): Distribución ploide de control (izquierda) y plántulas transgénicas E2Fa/DPa (derecha) cosechadas 12 días después de germinación.

(d): Cuantificación de los resultados mostrados en (c).

Barra de escala: 50 \mum; (a) y (b) tienen la misma magnificación.

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Figura 6. La secuencia de nucleótido del gen E2Fa de Arabidopsis (SEQ ID NO 1) y la secuencia de aminoácido (SEQ ID NO 2) del marco de lectura abierto que codifica la proteína E2Fa de Arabidopsis.

Figura 7. La secuencia de nucleótido del gen DPa de Arabidopsis (SEQ ID NO 3) y la secuencia de aminoácido (SEQ ID NO 4) del marco de lectura abierto que codifica la proteína DPa de Arabidopsis.

Figura 8. La secuencia de nucleótido de una variante de empalme del gen E2Fa de Arabidopsis (SEQ ID NO 19) y la secuencia de aminoácido (SEQ ID NO 20) del marco de lectura abierto que codifica la proteína variante E2Fa de Arabidopsis.

Figura 9. Alineación de secuencia de las dos proteínas E2Fa de la presente invención, la SEQ ID NO 2, comparada con la SEQ ID NO 20 (CDS009 E2Fa) y comparada con la secuencia forman la base de datos pública bajo el número de acceso Genbank CAC15486. Se hace la alineación de secuencia con el programa Align X como un componente del software Vector NTI Suite 5.5, utilizando el algoritmo Clustal W (NucleicAcid Research, 22 (22): 4673-4680,
1994).

Figura 10. Alineación de secuencia de los dos ácidos nucleicos E2Fa de la presente invención, la SEQ ID NO 1, comparada con la SEQ ID NO 19 (CDS009 E2Fa) y con la secuencia forman la base de datos pública bajo el número de acceso Genbank AJ294534. Se hace la alineación de secuencia con el programa Align X como un componente del Vector NTI Suite 5.5, utilizando el algoritmo Clustal W (NucleicAcid Research, 22 (22): 4673-4680, 1994).

Figura 11. Presentación de los datos de evaluación de producción de semilla de dos líneas de arroz transgénicas, transformadas con el gen E2Fa según se codifica por la SEQ ID NO 19. Se denominan las dos líneas de planta como 1 y 2 en el eje X. Para cada una de las dos líneas de arroz, se cosechan y se pesan las semillas de varias plantas positivas (círculos sólidos) y varias plantas negativas (círculos vacíos). Se mide el rendimiento de semilla en gramos y se representan los valores correspondientes en el eje Y. Se muestra la diferencia menos significativa como una barra vertical y se muestran los valores promedio de las plantas positivas y las plantas negativas como una flecha sólida o vacía respectivamente.

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Ejemplos

Ejemplo 1

Sobreexpresión de E2Fa y DPa en Arabidopsis Regeneración de plantas transgénicas y análisis molecular

Se amplifican las regiones que codifican E2Fa y DPa mediante PCR con los cebadores 5'- GGCCATGGCCGGTGT
CGTACGATCTTCTCCCGA-3' (SEQ ID NO 5) y 5'-GGGGATCCTCATCTCGGGGTTGAGT-3' (SEQ ID NO 6) o 5'-GGCCATGGAGTTGTTTGTCACTCC-3' (SEQ ID NO 7) y 5'-GGAGATCTTCAGCGAGTATCAATGG-3' (SEQ ID NO 8), respectivamente. Se corta el fragmento PCR E2Fa obtenido con NcoI y BamHI y se digiere el fragmento DPa con NcoI y BgIII. Posteriormente, se clonan los fragmentos de restricción entre el promotor 35S CaMV y la región no traducida 3' sintasa nopalina (NOS) en los sitios NcoI y BamHI de PH35S (Hemerly et al., 1995), lo que resulta en los vectores PH35SE2Fa y PH35SDPa. Se libera el casete 35S-E2Fa-Nos CaMV mediante EcoRI y XbaI y se clona en los sitios EcoRI y XbaI de pBinPLUS (van Engelen et al., 1995), lo que resulta en el vector pBINE2Fa, mientras que se libera el casete 35S-DPa-Nos CaMV mediante EcoRI y XbaI y se hacen extremos romos en el sitio SmaI de PgSC1704, lo que resulta en el vector PgSCDPa. Se movilizan ambos pBinE2Fa y PgSCDPa por el pRK2013 de plásmido auxiliar en el C58C1Rif^{R} Agrobacterium tumefaciens que alberga el pMP90 de plásmido (Koncz and Schell, 1986). Se transforma la Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. ecotipo Columbia mediante el método de inmersión floral (Clough and Bent, 1998).Se obtienen las plantas CaMV 35S DPa y CaMV 35S E2Fa transgénicas en medio que contiene canamicina o higromicina, respectivamente. Para todos los análisis, se hacen crecer las plantas bajo un fotoperiodo de 16 hr a la luz/8 hr en la oscuridad a 22ºC en medio de germinación (Valvekens et al., 1988). Se desarrolla el análisis de transferencia Northern como se describe (De Veylder et al., 2001). Se prueba la relación del fenotipo con la presencia de transgenes al moler plantas individuales en 400 \mul de amortiguador de extracción de ADN (200 mM de Tris-HCl, pH 7.5, 205 mM de NaCl, 25 de mM ácido etilenodiaminatetraacético, 0.5% de dodecil sulfato de sodio). Se centrifugan los extractos a 18,000xg durante 2 minutos. Se precipita el ADN al agregar 300 \mul de isopropanol a 300 \mul de extracto y centrifugación durante 10 minutos a 18,000xg. Se enjuaga el sedimento con 70% de etanol, se seca al aire, y se resuspende en 100 \mul de agua. Para análisis PCR, se utiliza 5 \mul con los cebadores anteriormente mencionados. Debido a que los transgenes no contienen intrones, ellos se podrían distinguir del gen E2Fa y DPa endógeno con base en su tamaño.

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Selección de líneas transgénicas

Para evaluar la importancia de la expresión E2Fa y DPa en las células que se dividen y endoreduplican, se generan plantas de Arabidopsis thaliana transgénicas que contienen ya sea el gen DPa o el E2Fa bajo el control del promotor 35S del virus mosaico de la coliflor (CaMV) constitutivo. Fuera de las líneas transgénicas múltiples, se seleccionan dos líneas CaMV 35S E2Fa independientes (Figura 2a) y dos CaMV 35S DPa (Figura 2b), que contienen solo un locus T-ADN. Mientras que las plantas transgénicas DPa son morfológicamente idénticas a las plantas de de control no transformadas, las plantas E2Fa de 3 semanas de edad tienen cotiledones alargados (Figuras 3a y 3b y
Tabla D).

TABLA D Número y tamaño de células epidérmicas adaxiales en cotiledones de plantas que sobreexpresan E2Fa. Estos datos muestran que las plantas transgénicas tienen más división celular ectópica en comparación con las plantas tipo silvestre

8

Los valores indican la media \pm DE. ^{a}Se hacen crecer plantas transgénicas y no transformadas (n = 12) en el mismo plato de Petri para excluir las diferencias en las condiciones de crecimiento. Se confirma el incremento observado en el tamaño del cotiledón en por lo menos tres experimentos independientes. Se determina el número de células epidérmicas adaxiales por la proporción del tamaño del cotiledón con el tamaño de la célula epidérmica adaxial, que se mide para por lo menos 50 células en cada cotiledón. ^{b}Se mide el número de células adaxiales antes de germinación al contar todas las células de por lo menos cinco cotiledones diferentes por fila.

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Ejemplo 2

Microscopía electrónica de exploración Método

Para la microscopía electrónica de exploración, se fijan plántulas durante la noche en 4% de paraformaldehído y 1% de glutaraldehído en amortiguador de fosfato 0.1 M (pH 7.2), seguido por una etapa de postfijación en 2% de tetraóxido de osmio y por una serie de etanol graduado. Se lleva a cabo secado de punto crítico en dióxido de carbono líquido. Se montan estas plántulas en tocones, cubriéndolas por rociado con oro, y se examinan con un microscopio de exploración (JEOL Ltd., Tokio, Japón) con un voltaje acelerado de 10 kV. Se desarrolla teñido fluorescente de núcleos al fijar las plántulas en una mezcla de 9:1 (v/v) etanol y ácido acético. Después que se han enjuagado las muestras, se tiñen durante 24 horas con 0.1 \mug/ml de 4',6-diamidino-2-fenilindol y se analizan con un microscopio confocal invertido LSM510 (Zeiss, Jena, Alemania) con un objetivo X20 plan-apochromat.

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Morfología celular en cotiledones de plantas 35S-E2Fa

Los cotiledones de mayor tamaño pueden resultar de células más grandes o de un número mayor de células. Para discriminar entre estas posibilidades, se mide el tamaño de la célula epidérmica adaxial. Notablemente, en las células de cotiledón de línea que sobreexpresa E2Fa más fuerte es menos de la mitad del tamaño de las células de control. Como una consecuencia de un incremento en el tamaño del cotiledón y una reducción en el tamaño de la célula, los cotiledones transgénicos contienen casi tres veces mayor cantidad de células que las plantas de control (Tabla D). Debido a que el número de células epidérmicas en los cotiledones es aproximadamente el mismo que en las semillas de control y las plantas transgénicas (Tabla D), las células extra deberían originarse a partir de divisiones celulares adicionales que ocurren después de la germinación de la semilla. Cinco días después de la siembra, las células de cotiledón epidérmicas adaxiales de plantas tipo silvestre se diferencian en células pavimentosas con forma de ficha de puzle y estomas (Figura 4a). En las líneas que sobreexpresan E2Fa de 5 días de edad solo se pueden observar células poligonales y pocos estomas (Figura 4b). De forma similar, en lugar del tejido empalizado típico que consiste de células redondas con espacios intracelulares, las células oclusivas E2Fa 35S CaMV son todavía poligonales sin espacios ni divisiones intracelulares (Figuras 4c y 4d). Estos resultados indican que los niveles de E2Fa intensificados prolongan el periodo de la división celular, una situación reminiscente a aquella en los mamíferos cuando la sobreexpression del E2F1 inhibe la diferenciación de las células en los mioblastos y megacariocitos (Wang et al., 1995; Guy et al.,
1996).

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Morfología celular en el hipocotilo de plantas 35S-E2Fa

En el hipocotilo de plantas transgénicas 35S-E2Fa, las líneas celulares que consisten de células epidérmicas normales alternas con líneas que muestran claramente divisiones extracelulares, sugiere que el E2Fa trabaja en una forma específica del tipo de célula (Figuras 4g y 4h). Las líneas celulares que dividen ectópicamente son aquellas en las que se forman estomas normalmente (Berger et al., 1998), lo que indica que el E2F y/o E2Fa/DPa puede solo sostener la división celular en las células que son competentes para división.

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Análisis del efecto de la sobreexpression de E2Fa en células diferenciadas

En las plantas de control de 3 semanas, todas las células de cotiledón epidérmicas se diferencian completamente y tienen forma de ficha de puzle (Figura 4e). En contraste, en los cotiledones que sobreexpresan E2Fa de la misma edad se observan numerosas paredes celulares nuevamente formadas con una apariencia recta (Figura 4f). Así, el E2Fa puede estimular las células diferenciadas para reingresar al programa de ciclo celular.

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Comparación de la morfología celular en líneas que sobreexpresan E2Fa y E2Fa/DPa

El análisis microscópico muestra que el fenotipo visto en las líneas que sobreexpresan E2Fa se intensifica fuertemente en las plantas E2Fa/DPa 35S CaMV. Los cotiledones y hojas de plantas de 2 semanas de edad consisten completamente de células pequeñas formadas irregularmente, que nunca se habían visto en los tejidos de tipo silvestre de la misma edad (datos no mostrados). También en el hipocotilo, se observan muchas más divisiones celulares, lo que resulta en islas de pequeñas células irregulares (Figura 4i). Este fenotipo llega a ser más pronunciado en hipocotilos más viejos (Figura 4j). La microscopía electrónica de exploración muestra que se interrumpe totalmente el patrón de diferenciación epidérmico típico encontrado en los hipocotilos tipo silvestre, exhibiendo una mezcla de células isodiamétricas pequeñas y células abultadas alargadas (Figuras 4k y 4l). Por lo tanto se puede utilizar la sobreexpresión E2F y DP para alterar la forma de la célula.

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Ejemplo 3

Hibridación in situ Método

Se desarrollan hibridaciones in situ como se describe (de Almeida Engler et al., 1991). No solo se utiliza plántulas de Arabidopsis thaliana sino también Raphanus sativus (rábano) para obtener más tejido para ubicación de transcrito más precisa. Se utilizan secuencias que codifican E2Fa y DPa de longitud completa para generar sondas de ARN etiquetadas [^{35}S]. No se observan señales en las hibridaciones de control. Se obtienen micrografías al superponer las imágenes digitales de campo oscuro y brillante.

Se colocan tejidos para examen histológico durante la noche en etanol para remover la clorofila, posteriormente se aclara, se monta en un portaobjetos para microscopio, y se almacena en ácido láctico para microscopía. Se observan células ópticas de contraste de interferencia diferencial en un microscopio DMLB (Leica, Wetzlar, Alemania).

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Ubicación de transcritos E2Fa y DPa

De esta manera, se revela la presencia de ambos transcritos E2Fa y DPa en el meristemo apical de los brotes y los tejidos de diferenciación circundantes (Figuras 1a y 1b). En la raíz, las señales de hibridación son las más fuertes en la región apical de la raíz en donde las células se dividen activamente y llegan a ser más débiles que las células que salen de la región meristemática (Figuras 1c, y 1d). La coexpresión de E2Fa y DPa en los tejidos de división sugiere que se requiere el complejo E2Fa/DPa para la progresión del ciclo celular. Se detectan los transcritos E2Fa también en la epidermis y corteza del hipocotilo de plantas que crecen a la luz de 5 días de edad (Figura 1e). En esta etapa, se despoja la corteza de la división celular, pero experimenta endoreduplicación extensa, que se intensifica en las plantas que crecen en la oscuridad (Gendreau et al., 1997; Raz andKoorneef, 2001). En forma similar, la señal de hibridación E2Fa es más fuerte en las células del hipocotilo cortical de las plantas que crecen en la oscuridad (Figura 1f), lo que indica que el E2Fa puede tener una función en la regulación de endoreduplicación.

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Ejemplo 4

Análisis citométrico de flujo Método

Se pican las plantas con una hoja de afeitar en 500 \mul de 45 mM de MgCl_{2}, 30 mM de citrato de sodio, 20 mM de ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (pH 7), y 1% de Triton X-100 (Galbraith et al., 1991). Se filtra el sobrenadante sobre una malla de 30 \mum y se agrega 1 \mul de 4',6-diamidino-2-fenilindol a partir de una solución madre de 1 mg/ml. Se analizan los núcleos con el citómetro de flujo BRYTE HS y el software WinBryte (Bio-Rad, Hercules, CA,
USA).

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Análisis de núcleos

Las células pavimentosas de Arabidopsis exhiben una amplia variación en el tamaño nuclear debido a la ocurrencia de la endoreduplicación (Melargno et al., 1993). En las plantas transgénicas E2Pa/DPa, se observan la mayoría de núcleos pequeños en las células pavimentosas en el cotiledón, lo que sugiere que se suprime en este tejido la endoreduplicación (datos no mostrados). En contraste, las células corticales y oclusivas del hipocotilo y cotiledón, respectivamente, se enriquecen con núcleos más grandes. El tamaño nuclear de los tricomas maduros también se ha incrementado dramáticamente (Figuras 5a y 5b). Estos datos indican que a pesar de la activación de la división celular, el E2Fa/DPa induce la endoreduplicación en una forma específica del tipo celular.

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Análisis citométrico de flujo

Se confirma la endoreduplicación extensa en las plantas E2Pa/DPa 35S CaMV mediante análisis citométrico de flujo. Las plántulas transgénicas de dos semanas de edad muestran dos endociclos adicionales cuando se comparan con las plantas de control (Figuras 5c y 5d). También en la expresión ectópica de la Drosophila de E2F/DP es suficiente para activar la replicación de ADN precoz en los tejidos de endoreduplicación (Britton and Edgar, 1998). Se puede mediar esta replicación por vía de la inducción transcriptional de Ciclina E, que lleva a la formación del complejo de E/CDK2 de ciclina específica de fase S que es un regulador central para la endoreduplicación (Edgar and Orr-Weaver, 2001) Aunque no ha sido identificado ningún homólogo claro de la ciclina E en el genoma de Arabidopsis, la activación de un complejo CDK específico de fase S en el Endosperma del maíz luego del inicio de la endoreduplicación (Grafi and Larkins, 1995) sugiere que las plantas regulan su endociclo en una forma similar a aquella de la Drosophila. También, la inactivación del homólogo Rb del maíz mediante fosforilación soporta que la expresión E2Fa/DPa tenga una función en el endociclo de la planta (Grafi et al., 1996).

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Niveles de ploidía

Aunque los efectos de la sobreexpresión E2Fa/DPa en células de tejidos fundamentales y epidérmicos parecen ser diferentes, los fenotipos observados surgen probablemente a través de un mecanismo común. El incremento en el nivel de ploidía en el tejido fundamental indica que el E2Fa/DPa ectópico estimula la proliferación del ciclo celular al activar la entrada de la fase S. Considerando que, después de la duplicación del ADN las células epidérmicas pueden proceder en mitosis, las células del tejido fundamental pueden carecer de un factor importante para la progresión a través de la fase M y se pueden estimular para reingresar a la fase S, que lleva a incrementos en los niveles de ploidía. Alternativamente, las células que se dividen mitóticamente pueden contener un inhibidor de endoreduplicación. La entrada de fase S mediada por E2Fa/DPa se puede deber a la inactivación de Rb mediante titulación externa, aliviando por lo tanto la represión transcripcional mediada por Rb de genes específicos de fase S.

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Ejemplo 5

Análisis PCR mediado por transcriptasa-inversa Método

Se aíslan ARN de plantas 8 días después de siembra utilizando el reactivo Trizol (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK). Se prepara primero una hebra de cADN a partir de 3 \mug de ARN total con el equipo RT Superscript II (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) y oligo(dT) (Chabouté et al., 2000) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utiliza una alícuota de 0.25 \mul del volumen de reacción de transcripción inversa total (20 \mul) como una plantilla en una amplificación PCR mediada por RT semicuantitativo, lo que asegura que la cantidad de producto amplificado permanece en proporción lineal a la plantilla inicial presente en la reacción. Se separan diez microlitros de la reacción PCR en 0.8% de un gel de agarosa y se transfieren en membranas Hybond N+ (Amersham Pharmacia Biotech). Se hibridan las membranas a 65ºC con sondas etiquetadas con fluoresceína (primer módulo aleatorio de Imágenes de Genes; Amersham Pharmacia Biotech). Se detectan las bandas hibridadas con el módulo de detección CDP Star (Amersham Pharmacia Biotech). Los cebadores utilizados son 5'-TATGGCTGTCTGGGGTTTC-3' (SEQ ID NO 9) y 5'-CAACTTGAACGTGTGGTTGG-3' (SEQ ID NO 10) para pol\alpha ADN (No. de acceso GenBank AB020742), 5' -TCGAGTCGGTTGGAAGAAAG-3' (SEQ ID NO 11) y 5'-CTCAT GAACCATAGCCGTCA-3' (SEQ ID NO 12) para ORC (AL049730), 5'-GCACCGTCAACTGTTGTTTG-3' (SEQ ID NO 13) y 5'-CAAGCCTCTCCTGCA
GAATC-3' (SEQ ID NO 14) para CDC6 (AC005496), 5' -AGGCTAATGAGGGAGGGGTA-3' (SEQ ID NO 15) y 5'-GGAACTGGCCTCATTTGTGT-3' (SEQ ID NO 16) para MCM5 (AC004483), y GTGCCAATCTACGAGGGTTTC (SEQ ID NO 17) y CAATGGGACTAAAACGAAAA (SEQ ID NO 18) para ACT2 (U41998).

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Comparación de nivel de transcrito en plantas E2Fa/DPa y de control

Previamente, se ha mostrado la secuencia de unión de consenso E2F por ser conservada en plantas y mamíferos (Chabouté et al., 2000). Se pueden encontrar estas secuencias en los promotores de los genes de Arabidopsis de los cuales se regulan las contrapartes de mamíferos mediante E2F/DP (Leone et al., 1998) e incluyen ADN pol\alpha, ORC, MCM, y CDC6. Se compara el nivel de transcrito de estos genes en plantas transgénicas E2Fa/DPa y de control mediante análisis de PCR de trascripción inversa (RT) semicuantitativo. Mientras que el nivel de expresión del gen de control (actina 2) no es influenciado por sobreexpresión E2Fa/DPa, se regulan ascendentemente de forma dramática todos los genes de fase S (Figura 2d). Estos datos demuestran que el E2Fa/DPa regula la expresión de los genes de fase S en Arabidopsis y sugiere que los fenotipos observados resultan de la expresión incorrecta de estos
genes.

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Ejemplo 6

Experimentos de cruce de sobreexpresión de líneas E2Fa y DPa

Para analizar si en las plantas cooperan las proteínas DP y E2F, se cruzan plantas homocigotas para el gen E2Fa 35S CaMV con líneas DPa 35S CaMV heterocigotas. La mitad de la descendencia se desarrolla normalmente, mientras que el 50% de las plantas exhiben cotiledones y hojas rizadas a lo largo de su eje próximo distal (Figura 3c). El análisis de reacción de cadena de polimerasa (PCR) en plantas individuales confirma que las plantas con el fenotipo de hoja rizada contienen ambas construcciones 35S-E2Fa CaMV y 35S-DPa CaMV, mientras que los hermanos fenotípicamente normales contienen solo el gen E2Fa 35S CaMV (Figura 2c).

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Ejemplo 7

Expresión ectópica de E2Fa/DPa y efecto en el crecimiento de la planta

La expresión ectópica del E2Fa/DPa resulta en la proliferación celular no controlada en tejidos diferenciados. Por consiguiente, las plantas se detienen en el crecimiento temprano durante el desarrollo post-embriónico. Por lo tanto, el factor de transcripción E2Fa/DPa es un componente crucial que regula la división celular en las plantas. Su actividad tiene que ser controlada en una forma rigurosa. El efecto inhibidor de crecimiento anteriormente mencionado está en agudo contraste con el fenotipo encontrado luego de la sobreexpresión de las ciclinas Arath; CYCB1;1 y Arath;CYCD; 2, ambas promueven el crecimiento de la planta (Doerner et al., 1996; Cockcroft et al., 2000). Una principal diferencia entre las líneas de sobreproducción de ciclina y las plantas transgénicas E2Fa/DPa es que las anteriores en los tejidos diferenciados de otra forma. Así, en contraste a CYCD2;1 y CYCB1;1, el E2Fa/DPa anula las señales que regulan la diferenciación celular. El efecto negativo observado en el crecimiento muestra que el balance correcto entre la división y la diferenciación es vital para el desarrollo de la planta. Las plantas se pueden detener en el crecimiento como una consecuencia de su diferenciación retrasada o debido a que se interrumpe la señalización celular esencial requerida entre diferentes capas de tejido. Postulamos que las plantas regulan su diferenciación a través de la modulación de la actividad E2Fa/DPa. La decisión entre la proliferación y la diferenciación se basa en la expresión concertada de genes que determinan el destino celular. La expresión incorrecta de los genes de ciclo celular inducida por E2Fa/DPa puede reprimir la inducción de genes necesaria para la diferenciación, lo que implica que la diferenciación celular requiere la inactivación de la actividad transcripcional E2Fa/DPa. La acumulación de proteínas Rb activas en los tejidos de hoja diferenciados sugiere que, como en los mamíferos, esta inactivación se controle por Rb (Huntley et al., 1998). No obstante, nuestros datos indican que se pueden utilizar las rutas E2Fa/DPa para dirigir la división celular en las plantas en una forma específica, lo que permite que se ajuste el rendimiento y la
arquitectura.

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Ejemplo 8

Expresión ectópica de E2Fa en plantas de arroz

En las plantas dicotiledóneas, la sobreexpresión del gen E2Fa lleva a cotiledones agrandados. Por el contrario a las plantas dicotiledóneas, donde el meristemo se agranda entre 2 cotiledones, en monocotiledóneas el meristemo agrandado aparece lateralmente orientado al escutelo. Cuando el escutelo se diferencia, se forma el coleóptilo y circunda el meristemo apical del brote (SAM), tomando una forma tubular. El SAM inicia las hojas, cada una opuesta a la anterior. Este meristemo vegetativo primero se transforma en un meristemo de inflorescencia, que genera el meristemo floral. Para analizar el efecto de la sobreexpresión de E2Fa en plantas monocotiledóneas, se clona el gen y se liga operablemente al promotor de oleosina, con el fin de obtener una construcción expresable en semillas de monocotiledóneas.

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Clonación de E2Fa en el vector de expresión de arroz

Los inventores aíslan una variante de empalme del E2F como se representa en la SEQ ID NO 1. Esta variante de empalme se representa aquí como SEQ ID NO 9 y solo difiere en dos codones de la SEQ ID NO 1, lo que resulta en la alternativa, la proteína E2Fa más pequeña representada aquí como la SEQ ID NO 10. A la variante de empalme E2Fa aislada (SEQ ID NO 9) se le da el número de designación interno CDS009 y se clona en el vector p0426 que lleva un marcador seleccionable y el promotor de oleosina para expresión específica de semilla del transgen E2Fa. Al vector de expresión de planta resultante se le da el número de referencia interno p1134.

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Manipulación de ADN

Se desarrollan todos los procesos de ADN de acuerdo con los protocolos estándar (Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J (1982) Molecular Cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York).

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Clonación de E2F/CDS009

Se amplifica la secuencia E2F de Arabidopsis (Número de Acceso: AJ294534) de cultivos en suspensión celular de colección de cADN de Arabidopsis Thaliana mediante PCR utilizando polimerasa de ADN Platinum Pfx (Invitrogen) y los siguientes cebadores: Codificante, que incluye attB1 5' GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTT
CACAATGTATTGCTCTTCTTCGATGC 3' (SEQ ID NO 21) y Anti-codificante, que incluye attB2 5'GGGGAC
CACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGCTTGGTGTCATCTTGAGAATAG3' (SEQ ID NO 22).

Las condiciones para PCR son como sigue: 1 ciclo de 2 minutos de desnaturalización a 94ºC, 35 ciclos de 1 minuto de desnaturalización a 94ºC, 1 minuto de hibridación a 58ºC y 2 minutos de amplificación a 68ºC, y 1 ciclo de 5 minutos a 68ºC. Se aísla un fragmento prominente de aproximadamente el tamaño esperado a partir de un gel y se purifica utilizando el equipo de Recuperación de ADN de Gel Zymoclean (Zymo Research, Orange, California).

Se utiliza el fragmento PCR purificado en una reacción GatewayTM BP estándar (Invitrogen) utilizando
pDONR201 como un vector receptor. Se confirma la identidad y composición de par base del inserto mediante secuenciación. El plásmido resultante se prueba con calidad utilizando digestos de restricción y se da la designación p0426 (clon de entrada), se obtiene pDONR201, un vector que hace parte de la tecnología de clonación GatewayTM, de Invitrogen. P0426, de acuerdo con la terminología Gateway TM, es un "clon de entrada", y se utiliza como tal en una reacción GatewayTM LR estándar, con un vector de destino que lleva la poleosina. El vector resultante de la reacción GatewayTM LR es p1134. Se controla este vector por análisis de digesto de restricción y se utiliza en la transformación de Arabidopsis thaliana. Este vector contiene como elementos funcionales dentro de la región T-ADN un gen marcador seleccionable y un "casete Gateway" destinado para la clonación LR de las secuencias de interés. La expresión de estas secuencias de interés, luego se recombinada en p1134, y se controlan mediante el promotor de oleosina.

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Transformación del arroz

Se descascarillan semillas secas maduras del cultivo japónico de arroz Taipei. Se lleva a cabo esterilización al incubar por un minuto en 70% de etanol, seguido por 30 minutos en 0.2% de HgCl2, seguido por un lavado de 15 minutos 6 veces con agua destilada estéril. Las semillas estériles luego se hacen germinar en un medio que contiene 2,4-D (medio de inducción de callo). Después de la incubación en la oscuridad durante cuatro semanas, se práctica escisión al callo derivado del escutelo, embriogénico, y se propaga en el mismo medio. Después de dos semanas se multiplican o propagan los callos mediante subcultivo en el mismo medio durante otras 2 semanas. Se subcultivan las piezas de callo embriogénicas en medio fresco 3 días antes de cocultivo (para reforzar la actividad de la división celular). Se utiliza la cepa de Agrobacterium LBA4404 que alberga vectores T-ADN binarios para cocultivo. Se inocula el Agrobacterium en medio AB con los antibióticos apropiados y se cultiva durante 3 días a 28ºC. Luego se recolectan las bacterias y se suspenden en medio de cocultivo líquido a una densidad de aproximadamente 1 (OD600). Luego se transfiere la suspensión a un plato de petri y se sumergen los callos en la suspensión durante 15 minutos. Luego se manchan en seco los tejidos de callo sobre un papel de filtro se transfieren a medio de cocultivo solidificado y se incuban durante 3 días en la oscuridad a 25ºC. Se hacen crecer los callos cocultivados en medio que contiene 2,4-D durante 4 semanas en la oscuridad a 28ºC en la presencia de una concentración adecuada del agente selectivo. Durante este periodo, se hacen crecer rápidamente islas de callos resistentes desarrolladas. Después de la transferencia de este material a un medio de regeneración e incubación a la luz, se libera el potencial embriogénico y se desarrollan los brotes en las siguientes cuatro a cinco semanas. Se realiza escisión a los brotes de los callos y se incuban durante 2 a 3 semanas en un medio que contiene auxina de la cual ellos se transfieren al suelo. Se hacen crecer los brotes endurecidos bajo alta humedad y días cortos en un invernadero. Luego se cultivan las semillas tres a cinco meses después de trasplante. El método produce transformantes de locus sencillo a un índice de más del 50% (Aldemita and Hodges 1996, Chan et (Aldemita and Hodges (1996) Planta 199, 612-617; Chan et al. (1993) Plant Mol. Biol 22, 491-506; Hiei et al. (1994) Plant J. 6, 271-282).

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Evaluación de las plantas de arroz transformadas

Se generan aproximadamente 15 a 20 transformantes T0 independientes. Se transfieren los transformantes principales de las cámaras de cultivo de tejido a un invernadero para crecimiento y cosecha de la semilla T1. Se retienen cinco eventos de los cuales la progenie T1 segrega 3:1 para la presencia/ausencia del transgen. Para cada uno de estos eventos, se seleccionan 10 plántulas T1 que contienen el transgen (hetero- y homo-cigotas), y 5 plántulas T1 que carecen de transgen (nulizigotas), mediante PCR.

Se transfieren las plantas T1 seleccionadas a un invernadero. Cada planta recibe una etiqueta de código de barras única para vincular de forma inequívoca los datos de fenotipo a la planta correspondiente. Se hacen crecer las plantas T1 seleccionadas en el suelo en macetas de 10 de diámetro bajo las siguientes configuraciones ambientales: fotoperiodo= 11.5 h, intensidad de la luz del día= 30,000 luz o más, temperatura durante el día= 28ºC o más, temperatura durante la noche= 22ºC, humedad relativa= 60-70%. Se hacen crecer las plantas transgénicas y los nulicigotos correspondientes de lado a lado en posiciones aleatorias. De la etapa de siembra hasta la etapa de madurez se pasan las plantas 10 veces a través de una cabina de imagen digital. En cada de punto de tiempo (2048x1536 píxeles, 16 millones de colores) se toman imágenes digitales de cada planta desde por lo menos 6 ángulos diferentes. Se obtienen los parámetros descritos adelante en una forma automática a partir de las imágenes digitales utilizando software de análisis de imagen.

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Área de la planta por encima del suelo

Se determina el área de la planta por encima del suelo al contar el número de píxeles totales de las partes de la planta sobre el suelo discriminadas desde el fondo. Se promedia este valor para las fotos tomadas en el mismo punto de tiempo desde diferentes ángulos y se convierten a un valor de superficie física expresado en metros cuadrados mediante calibración. Los experimentos muestran que el área de la planta por encima del suelo medida de esta forma se correlaciona con la biomasa de las partes de la planta por encima del suelo.

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Altura de la planta

Se determina la altura de la planta mediante la distancia entre las líneas horizontales pasando por el borde superior de la maceta y el píxel superior correspondiente a una parte de la planta por encima de la tierra. Se promedia este valor para las fotos tomadas al mismo tiempo desde diferentes ángulos y se convierte, mediante calibración, a una distancia física expresada en mm. Los experimentos muestran que la altura de la planta medida de esta forma se correlaciona con la altura de la planta medida de forma manual con una regla. Se cosechan las panículas principales maduras, se colocan en bolsas, se etiquetan con código de barras y luego se secan durante tres días en un horno a 37ºC. Luego se trillan las panículas y se recolectan todas las semillas. Se separan las cáscaras llenas de las vacías utilizado un dispositivo de soplado de aire. Después de la separación, se cuentan luego ambos lotes de semillas utilizando una máquina para conteo disponible comercialmente. Se desechan las cáscaras vacías. Se pesan las cáscaras llenas en una balanza analítica y se mide el área de la sección cruzada de las semillas utilizando imagen digital. Este procedimiento resulta en el conjunto de los parámetros relacionados con la semilla descritos adelante.

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Número de retoños

Se mide el número de retoños en la cosecha al cortar la parte vegetativa y contar visualmente el número de retoños para cada planta.

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Número de semillas total por planta

Se mide el número de semillas total al contar el número de cáscaras llenas cosechadas de una planta.

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Producción de semilla por planta

Se mide el rendimiento de semilla total al pesar todas las cáscaras llenas de una planta.

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TABLA E Resultados de la evaluación de plantas de arroz transformadas con E2Fa

9

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Los inventores encontraron sorprendentemente que las plantas transformadas E2F muestran más retoños, así más ramificación, en comparación con las plantas de control no transformadas con E2F. Esto significa que tienen un número incrementado de órganos y por lo tanto muestran tener más biomasa, incrementando así en rendimiento. Se puede explicar el efecto de la alteración del número de órganos mediante la expresión y/o actividad alterada del E2F en los tejidos de meristemo, tales como el meristemo del brote. Los efectos de la transformación con pOleosina::E2Fa puede ocurrir muy tempranamente durante el crecimiento, probablemente afectando la formación de semilla y el crecimiento del embrión, por ejemplo influenciar la funcionalidad del meristemo dentro del embrión que lleva a un número incrementado de primordios y órganos.

Una conexión con el fenotipo del cotiledón de la planta transformada 35S::E2Fa, puede ser aquel que tiene actividad 35S en los cotiledones que se constituyen de los tejidos hechos antes de la formación del meristemo apical del brote (SAM) durante el desarrollo, pero por el contrario, no existe actividad 35S en el meristemo. Esto significa que el promotor 35S, aunque se conoce por ser un promotor constitutivo, no está activo en el SAM y que este es activo en los cotiledones en donde en combinación con E2Fa lleva a modificación de la división celular en los cotiledones. En contraste, el promotor de Oleosina, que tiene un patrón de expresión diferente en la semilla y/o embrión puede ser altamente expresado en el escutelo pero también en los tejidos circundantes tales como el SAM, RAM. Por lo tanto, en contraste con el promotor 35S, la pOleosina se activa al final o dentro del SAM y afecta más la formación de SAM, primordio y órgano. De tal manera que el fenotipo observado en el arroz se correlaciona probablemente con el rendimiento de más células dentro del SAM, lo que lleva a incrementar la formación de primordios y posteriormente el número incrementado de órganos. También, la actividad del E2F en el meristemo de inflorescencia puede llevar a flores incrementadas y por lo tanto también número de semillas
incrementado.

Las plantas positivas también muestran un número incrementado de panículas en comparación con plantas de control. Esto ilustra que las plantas de la presente invención tienen biomasa incrementada y por lo tanto rendimiento incrementado. Adicionalmente se analizan las semillas de las panículas y los inventores demuestran que las plantas transformadas con E2F tienen producción de semilla incrementada (ver Figura 11). Este efecto se puede explicar mediante la presencia de más semillas o mediante el tamaño de semilla incrementado.

Referencias

Aldemita, R. R., and Hodges, T. K. (1996). Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of japonica and indica rice varieties. Planta 199, 612-617.

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Claims

1. Método para modificar una planta monocotiledónea al incrementar el tamaño y/o número de retoños, panículas, flores o semillas, que comprende sobreexpresar en una planta un ácido nucleico que codifica un factor de transcripción E2F de planta bajo el control de un promotor específico de semilla.

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha planta tiene rendimiento de semilla incrementado en comparación con las plantas tipo silvestre.

3. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde dicha planta tiene capacidad incrementada para acumulación de almacenamiento en comparación con las plantas tipo silvestre.

4. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha planta es una plántula con vigor intensificado en comparación con plantas tipo silvestre.

5. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha planta comprende células diferenciadas estimuladas para reingresar al ciclo celular en comparación con las plantas tipo silvestre.

6. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicha planta comprende células en las que las señales de diferenciación celular se anulan en comparación con las plantas tipo silvestre.

7. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicha planta comprende células que tienen una forma celular alterada en comparación con las plantas tipo silvestre.

8. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde se incrementa el número de retoños en comparación con las plantas tipo silvestre.

9. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde se incrementa el número de panículas en comparación con plantas tipo silvestre.

10. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende integrar establemente en el genoma de una planta o en una célula, tejido u órgano específico de una planta, un ácido nucleico que se puede expresar que codifica un factor de transcripción E2F de planta, o un homólogo, derivado o fragmento enzimáticamente activo del mismo.

11. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde dicho factor de transcripción E2F se selecciona del grupo que consiste de: un factor de transcripción E2Fa, E2Fb, E2Fc o E2F según se representa por la SEQ ID NO 2 o 20 o un homólogo, derivado o fragmento enzimáticamente activo del mismo.

12. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende adicionalmente la coexpresión de DP (socio de dimerización E2F).

13. Método de acuerdo con la reivindicación 12, en donde dicho DP se selecciona del grupo que consiste de un DPa, un DPb o un DP como se presenta por la SEQ ID NO 4 o un homólogo, derivado o fragmento enzimáticamente activo del mismo.

14. Método para la producción de una planta transgénica monocotiledónea que tiene tamaño y/o número de retoños, panículas, flores o semillas incrementado, que comprende las etapas de:

(a): proporcionar una construcción de ADN que comprende un promotor específico de semilla ligado operablemente a un gen que codifica un factor de transcripción E2F;

(c): cultivar la célula transgénica obtenida de la etapa (b) bajo condiciones que promueven la regeneración y el crecimiento de la planta madura; y

15. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde dicha planta monocotiledónea o célula de planta se deriva de un cereal, tal como arroz o maíz.

16. Uso de un factor de transcripción o un homólogo, derivado o fragmento enzimáticamente activo del mismo bajo el control de un promotor específico de semilla para obtener plantas monocotiledóneas que tienen tamaño y/o número de de retoños, panículas, flores o semillas incrementado.