ES2339341T3 - Un metodo para modificar el numero celular, la arquitectura, y el rendimiento de plantas al sobreexpresar el factor de transcripcion e2f. - Google Patents
Un metodo para modificar el numero celular, la arquitectura, y el rendimiento de plantas al sobreexpresar el factor de transcripcion e2f. Download PDFInfo
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Abstract
Método para modificar una planta monocotiledónea al incrementar el tamaño y/o número de retoños, panículas, flores o semillas, que comprende sobreexpresar en una planta un ácido nucleico que codifica un factor de transcripción E2F de planta bajo el control de un promotor específico de semilla.
Description
Un método para modificar el número celular, la
arquitectura y el rendimiento de plantas al sobreexpresar el factor
de transcripción E2F.
La presente invención se relaciona con el campo
de la modificación del producto de plantas y/o arquitectura al
modular la regulación del ciclo celular, particularmente como se
especifica adelante.
\vskip1.000000\baselineskip
El crecimiento, desarrollo y diferenciación de
los organismos mayores está controlado por un conjunto altamente
ordenado de eventos denominados el ciclo celular (Morgan, 1997). La
división celular y el crecimiento celular están operados por el
ciclo celular que asegura el tiempo correcto y la alta fidelidad de
los diferentes eventos de transición involucrados. El control de
transición a través y entre las diferentes etapas el ciclo celular
mitótico depende de la actividad de las cinasas dependientes de
ciclina (CDKs) y su subconjunto específico de ciclinas y parece ser
conservada en todos los eucariotes mayores (como las enzimas
responsables de la replicación del ADN, los componentes
citoesqueléticos que median la organización espacial dentro y los
movimientos dirigidos de la célula o sus contenidos y la ruta
dependiente de ubiquitina para la degradación de las proteínas).
En eucariotes multicelulares, la asociación de
múltiples CDKs con diferentes clases de ciclinas denominadas
ciclinas G1 y mitóticas permite la formación de varios complejos de
proteína cinasa, cada una requerida para las etapas reguladoras
específicas durante el ciclo celular.
El entendimiento de la progresión del ciclo
celular sigue siendo mucho mejor en los sistemas de modelo de
mamífero y de levadura de lo que se aclara adicionalmente que la
actividad CDK se regula adicionalmente por factores que incluyen
cinasas CDK similares a las cinasas tipo Wee-1 de
levadura, fosfatasas CDK similares a levadura CDC25, inhibidores
CDK similares a levadura SIC1 y los productos génicos INK4 humanos,
y cinasas que activan CDK (CAK). La regulación del ciclo celular en
las transiciones de fase G1\rightarrow S y G2 \rightarrow M
depende de los complejos CDK-ciclina apropiados; se
considera que ambas transiciones son los puntos de control
principales en el ciclo
celular.
celular.
La decisión de la célula de proliferar y
sintetizar ADN y finalmente dividirse se hace en el punto de
restricción
G1 \rightarrow S hacia el final de G1. Superar este punto de no regreso necesita que la competencia de la célula inicie la síntesis de ADN así como también la expresión de los genes fase S. La transcripción de los genes específicos fase S requiere la unión al ADN de un factor de transcripción E2F. El factor de transcripción E2F heterodimérico/socio de dimerización (DP) regula la actividad promotora de múltiples genes, que son esenciales para la replicación de ADN y para el control del ciclo celular (Helin, 1998; Müller and Helin, 2000). La actividad E2F/DP se inhibe mediante el producto génico retinoblastoma (Rb) que se regula mediante la fosoforilación (Weinberg, 1995). Los factores de transcripción E2F son efectores críticos de la decisión de pasar el punto de restricción y permitir a la célula proceder en la fase
S.
G1 \rightarrow S hacia el final de G1. Superar este punto de no regreso necesita que la competencia de la célula inicie la síntesis de ADN así como también la expresión de los genes fase S. La transcripción de los genes específicos fase S requiere la unión al ADN de un factor de transcripción E2F. El factor de transcripción E2F heterodimérico/socio de dimerización (DP) regula la actividad promotora de múltiples genes, que son esenciales para la replicación de ADN y para el control del ciclo celular (Helin, 1998; Müller and Helin, 2000). La actividad E2F/DP se inhibe mediante el producto génico retinoblastoma (Rb) que se regula mediante la fosoforilación (Weinberg, 1995). Los factores de transcripción E2F son efectores críticos de la decisión de pasar el punto de restricción y permitir a la célula proceder en la fase
S.
En las plantas, el desarrollo
post-embriónico se basa en la división celular
iterativa en los meristemos. Las células en el meristemo permanecen
en un estado indeterminado en donde luego de la diferenciación ellas
salen del ciclo celular y se mueven desde el meristemo. En el
sistema celular no diferenciado o meristemático de la planta la
transición G1 \rightarrow S se caracteriza por la acción de
complejos de ciclina CDK que involucran las ciclinas tipo D. De
manera similar que el sistema de mamífero, se requiere fosforilación
de la proteína de retinoblastoma por el complejo
CycD-CDK para liberar el factor de transcripción E2F
asociado, forzando por lo tanto al internamiento de la célula a la
fase S y así la decisión de la célula pasa sobre el punto de salida
del ciclo celular. Así, se han identificado genes E2F y DP de
plantas lo que sugiere que están involucrados en el mecanismo
regulador G1 \rightarrow S (Ramirez-Parra et
al., 1999; Sekine et al., 1999;
Ramirez-Parra and Gutierez, 2000; Magyar et
al., 2000). Su función en la maquinaria molecular del ciclo
celular de la planta que controla la diferenciación y la salida del
ciclo celular ya es bastante desconocido. Por lo tanto, uno de los
objetos de la presente invención es identificar la capacidad
reguladora sobre el progreso del ciclo celular de los factores de
transcripción E2F al modular su expresión en una planta. La
modulación de la expresión de estos factores de transcripción
permite manipular los procesos biológicos que ellos controlan. Es
un objeto adicional de la presente invención modular estos procesos
biológicos hacia aplicaciones particulares útiles en la agricultura
y horticultura. La invención proporciona una solución a por lo menos
varios de los objetos anteriores al proporcionar las realizaciones
descritas.
\vskip1.000000\baselineskip
En la presente invención, se describe el efecto
de la sobreexpresión del E2Fa y E2Fa/DPa en plantas.
\newpage
En particular, la presente invención
proporciona:
- (i)
- Método para modificar una planta monocotiledónea al incrementar el tamaño y/o número de retoños, panículas, flores o semillas, que comprende sobreexpresar en una planta un ácido nucleico que codifica un factor de transcripción E2F de planta bajo el control de un promotor específico de semilla.
- (ii)
- Método como se establece en (i) anterior, en donde dicha planta ha incrementado el producto de semilla comparado con plantas de tipo silvestre.
- (iii)
- Método como se estable en una cualquiera de (i) o (ii) anterior, en donde dicha planta tiene una capacidad incrementada para acumulación de almacenamiento comparado con plantas del tipo silvestre.
- (iv)
- Método como se establece en una cualquiera de (i) a (iii) anterior, en donde dicha planta es una plántula con vigor intensificado comparado con las plantas de tipo silvestre.
- (v)
- Método como se establece en una cualquiera de (i) a (iv) anterior, en donde dicha planta comprende células diferenciadas estimuladas para reingresar al ciclo celular comparado con las plantas del tipo silves- tre.
- (vi)
- Método como se establece en una cualquiera de (i) a (v) anterior, en donde dicha planta comprende células en las que se anulan las señales de diferenciación celular comparadas con las de las plantas de tipo silvestre.
- (vii)
- Método como se establece en una cualquiera de (i) a (vi) anterior, en donde dicha planta comprende células que tienen una forma de célula alterada comparada con las plantas de tipo silvestre.
- (viii)
- Método como se establece en una cualquiera de (i) a (vii) anterior, en donde el número de retoños se incrementa comparado con las plantas del tipo silvestre.
- (ix)
- Método como se establece en una cualquiera de (i) a (viii) anterior, en donde el número de panículas se incrementa comparado con las plantas del tipo silvestre.
- (x)
- Método como se establece en una cualquiera de (i) a (ix) anterior, que comprende integrar en forma estable en el genoma de una planta o en una célula específica o tejido u órgano de una planta, un ácido nucleico expresable que codifica un factor de transcripción E2F de planta, o un homólogo, derivado o fragmento enzimáticamente activo del mismo.
- (xi)
- Método como se establece en una cualquiera de (i) a (x) anterior, en donde dicho factor de transcripción E2F se selecciona del grupo que consiste de: un factor de transcripción E2Fa, E2Fb, E2Fc o E2F. Como se representa por la SEQ ID NO 2 o 20 o un homólogo, derivado o fragmento enzimáticamente activo del mismo.
- (xii)
- Método como se establece en una cualquiera de (i) a (xi) anterior, que comprende adicionalmente la coexpresión de DP (socio de dimerización E2F).
- (xiii)
- Método como se establece en (xii) anterior, en donde dicho DP se selecciona del grupo que consiste en un DPa, un DPb o un DP como se presenta por SEQ ID NO 4 o un homólogo, derivado o fragmento enzimáticamente activo del mismo.
- (xiv)
- Método para la producción de una planta transgénica monocotiledónea que tiene tamaño incrementado y/o número de retoños, panículas, flores o semillas, que comprende las etapas de:
- (a)
- Suministrar una construcción de ADN que comprende un promotor específico de semilla ligado operablemente a un gen que codifica un factor de transcripción E2F;
- (b)
- Transformar dicha construcción de ADN de (a) en una célula de planta;
- (c)
- Cultivar la célula transgénica obtenida de la etapa (b) bajo condiciones que promuevan la regeneración y el crecimiento de plantas maduras; y
- (d)
- Seleccionar y evaluar dicha planta de (c) durante el curso del desarrollo para registrar sus características fenotípicas y morfológicas.
- (xv)
- Método como se establece en una cualquiera de (i) a (xiv) anterior, en donde dicha planta monocotiledónea o célula de planta se deriva de un cereal, tal como arroz o maíz.
\newpage
- (xvi)
- Uso de un factor de transcripción E2F o un homólogo, derivado o fragmento enzimáticamente activo del mismo bajo el control de un promotor específico de semilla para obtener plantas monocotiledóneas que tienen y/o número de retoños, panículas, flores o semillas tamaño incrementado.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente especificación también describe un
método para modificar el desarrollo de la planta y/o los procesos
de crecimiento, tal como modular el número de células en un tejido
particular tal como por ejemplo los cotiledones o los meristemos o
las semillas. La presente especificación también describe alterar la
arquitectura de la planta, tal como o alterar el tamaño y número de
órganos de la planta en particular, tal como por ejemplo
cotiledones, hojas, brotes, tallos, retoños, panículas, espigas,
flores, semillas, raíces, tubérculos. La presente especificación
también describe métodos para alterar el índice de crecimiento de
plantas, y/o respuesta inducida por tensión, y/o desempeño de la
planta, y/o producción, dicho método comprende modular la expresión
y/o actividad de un factor de transcripción E2F o un homólogo o un
derivado del mismo o un fragmento enzimáticamente activo del mismo,
solo o en combinación con su socio de dimerización (DP). La presente
especificación también describe que un gen que codifica un E2F se
coloca bajo el control de un promotor constitutivo o un promotor
regulable, preferiblemente un promotor específico de órgano o de
tejido o de célula, e introducirlo en la planta. La descripción de
la presente especificación también se extiende al uso de
construcciones genéticas para desarrollar los métodos descritos
aquí y con plantas transgénicas producidas de la misma manera que
tienen crecimiento alterado y/o desarrollo y/o arquitectura y/o
características fisiológicas comparadas con sus contrapartes
isogénicas.
\vskip1.000000\baselineskip
La especificación describe que las plantas
transformadas con un gen E2Fa muestra números celulares
incrementados en ciertos órganos y/o tamaño de órganos
incrementado, por ejemplo cotiledones alargados, y/o número
incrementado de órganos tal como más retoños y panículas, comparado
con las plantas no transformadas con un factor de transcripción
E2F.
La presente especificación describe un método
para incrementar el número celular de tipo de células específicos,
tejidos específicos, u órganos específicos, en una planta que
comprende modular la expresión y/o la actividad en dichos tipos de
células específicos, tejidos específicos u órganos específicos de un
factor de transcripción E2F de planta. En particular, la invención
proporciona tales métodos como se definen en las reivindicaciones 1
al 15.
En la descripción siempre que se utilice la
expresión "modular la expresión y/o la actividad de un factor de
transcripción E2F de planta", un "factor de transcripción
E2F" como se utilizan en esta expresión se relacionan con un gen
o ácido nucleico que codifica un factor de transcripción E2F de
planta o un homólogo o un derivado del mismo o un fragmento
enzimáticamente activo de un gen o ácido nucleico que codifica E2F,
así como también se relaciona con la proteína E2F, polipéptido o un
homólogo o un derivado o un fragmento enzimáticamente activo del
polipéptido o de proteína E2F.
La expresión "modular la expresión" de un
factor de transcripción E2F, se relaciona por ejemplo con métodos
para alterar la expresión de por lo menos un ácido nucleico en
tejidos o células específicas. De acuerdo con la invención, el
"ácido nucleico" puede ser el ácido nucleico endogénico del
tipo silvestre cuya expresión se modula o puede ser un ácido
nucleico derivado de la misma u otra especie, pero en caso de
originarse de la misma especie se puede modificar sustancialmente a
partir de su forma natural en composición y/o ambiente
genómico.
Una forma de modular la expresión de los
factores de transcripción E2F de acuerdo con la invención se
relaciona con un método que comprende la integración estable en el
genoma de una planta o en tejidos o células de planta específicos
de dicha planta de un ácido nucleico expresable que codifica un
factor E2F de planta, un homólogo o un derivado del mismo o un
fragmento enzimáticamente activo del mismo.
En el último caso, el término "expresión" o
"sobreexpresión" se debe entender como "expresión
ectópica". La "expresión ectópica" o "sobreexpresión
ectópica" de un gen o una proteína se refiere a los patrones de
expresión y/o niveles de expresión de dicho gen o proteína que no
ocurren normalmente bajo condiciones naturales. La expresión
ectópica se puede alcanzar en un número de formas que incluyen
conectar operablemente una secuencia de codificación que codifica
dicha proteína a un homólogo aislado o promotor heterólogo con el
fin de crear un gen quimérico y/o conectar operablemente dicha
secuencia de codificación a su propio promotor aislado (por ejemplo
un promotor no aislado naturalmente que controla la expresión de
dicha proteína) con el fin de crear una duplicación de gen
recombinante o efecto de multiplicación genético.
En el contexto de la presente especificación el
término "modulación" se relaciona con "intensificar o
reducir" la expresión de acuerdo con la invención se prevé la
expresión incrementada o intensificada de dicho ácido nucleico. Los
métodos para obtener la expresión incrementada o intensificada de
los genes o productos génicos están bien documentados en la técnica
y se pueden por ejemplo acoplar a un promotor constitutivo fuerte, o
el uso de intensificadores de transcripción y/o traducción. Los
métodos para reducir la expresión y/o actividad de un gen son por
ejemplo el uso de anticodificantes o co-supresión,
silenciadores, ribozimas, supresores etc.
\newpage
La "modulación de la expresión de gen"
también abarca el nivel de transcrito del gen que se altera y este
puede ser la base de los efectos observados. Por ejemplo, se sabe
que incrementar el nivel de transcrito de un transgen en las
plantas no solo puede conducir a niveles de proteína incrementados,
sino alternativamente, los transcritos pueden estar involucrados en
la cosupresión del gen natural correspondiente al transgen.
La expresión "expresable" se relaciona con
la presencia de secuencias de control que promueven la expresión
adecuada de los genes y/o la traducción apropiada de dichas
secuencias en una proteína específica. Dichas secuencias de control
incluyen secuencias promotoras que pueden ser promotoras
constitutivas o promotoras específicas de tejidos o células. Los
promotores también están previstos para uso en los métodos descritos
aquí que son específicos para dividir células.
En las tablas A y B, se da una lista no
exhaustiva de ejemplos de tales promotores específicos de células
de tejidos, promotores constitutivos y promotores específicos para
dividir células.
La modulación, por ejemplo aumentar o reducir la
actividad de un gen se puede lograr por ejemplo al inhibir
respectivamente o estimular los elementos de control que controlan
la expresión de un gen natural o del transgen. También modificar la
actividad del producto génico, del polipéptido, se puede lograr
adicionalmente al administrar o exponer las células, tejidos,
órganos u organismos a una proteína de interacción o un inhibidor o
activador de dicho producto génico. En el contexto de la presente
invención, tales inhibidores o activadores también pueden aceptar
su actividad contra la proteína E2F o el complejo E2F/DP.
La expresión "modular la actividad de un
factor de transcripción E2F", por ejemplo incrementar la
actividad del gen, el producto génico, o el polipéptido codificado
por el gen, se puede lograr al administrar o exponer células,
tejidos, órganos u organismos a, una preparación de dicho gen,
producto génico o dicho polipéptido, de tal manera que este pueda
ejercer su función en dichos tejidos o células expuestas. En el
contexto de la presente descripción, por ejemplo las células se
exponen a las muestras de proteína de la proteína E2F o complejos
de proteína
E2F/DP.
E2F/DP.
Se demuestra aquí que los cotiledones agrandados
de las plantas Arabidopsis transformadas con E2F, contienen células
más pequeñas pero tres veces más células comparadas con WT. Las
células extra originadas de las divisiones de células adicionales
ocurren después de germinación de semillas. Luego de la
sobreexpresión ubicua y constitutiva del factor de transcripción
E2Fa, las células específicas en la epidermis del hipocotilo también
muestra extra división celular pero no hay diferencia en tamaño del
hipocotilo entre el E2Fa transgénico y el WT. Los niveles E2Fa
mejorados pueden por lo tanto prolongar el periodo de división
celular en ciertas células y tejidos tal como las cotiledóneas. Los
inventores han mostrado que el E2Fa o E2F/DPa pueden sostener la
división celular en células que son competentes para dividirse.
Excepto para el tamaño del cotiledón, las características
morfológicas de las E2Fa transgénicas son similares a las plantas
WT. También las plantas de arroz transformadas con el gen E2Fa y
que tienen más retoños y panículas, no muestran deformaciones en la
arquitectura general de la
planta.
planta.
De acuerdo con lo anterior se describe aquí
también un método como se describió anteriormente para aumentar el
número de células de tipos de células específicos, tejidos
específicos u órganos específicos en una planta sin alterar la
estructura y/o composición de dicha célula, tejido u órgano
específico o la planta completa.
Los métodos para monitorear la estructura
alterada o la composición de un tejido u órgano o la planta
completa, son por ejemplo la inspección visual de las
características morfológicas y fenotípicas externas tal como la
forma general del tejido u órgano o planta. Por ejemplo, se puede
ver fácilmente si una hoja se deforma o si el tallo tiene una
estructura aberrante, o si la raíz tiene estructuras deformadas.
También se pueden utilizar otras técnicas para determinar las
características morfológicas de un tejido tal como la identidad de
las células en el tejido o del órgano o la planta, aquellas
técnicas comprenden análisis microscópico, ensayos histológicos,
hibridación in situ o inmunoprecipitación in situ,
análisis FACS, ...
La sobreexpresión del E2Fa conduce a la
prolongación del periodo de división celular y/u otros mecanismos
de crecimiento junto con el incremento armonizado del crecimiento de
la planta. Esto significa que no se interrumpe el balance entre el
programa de ciclo celular básico y el crecimiento de la planta
general.
De acuerdo con lo anterior, una característica
técnica y particularmente importante de la presente invención es
que la estructura arquitectónica general de la planta no se daña. El
cambio radical en el comportamiento celular y curación celular
originada por la sobreexpresión del E2F, no afecta la estructura de
tejido general o la composición de la planta. Esta característica
de la presente invención es extremadamente importante, ya que
alterar un proceso biológico básico puede conducir a la deformación
de tejido. La delicadeza de este balance se ilustra por el hecho
que la sobreexpresión del E2F junto con su socio de dimerización DP
resulta en la intensificación de los efectos vistos cuando se
sobreexpresa el E2F solo y conduce a proliferación celular no
controlada en tejido diferenciado y posteriormente en la detención
del crecimiento temprano durante el desarrollo
post-embriónico de las
plantas.
plantas.
Los inventores muestran que al introducir el gen
E2Fa en una planta, ellos fueron capaces de intensificar la
proliferación celular y prolongar el periodo de división celular de
ciertas células en un cierto órgano de una planta. Los inventores
también han encontrado sorprendentemente que la sobreexpresión
general del E2F se puede utilizar para estimular las células que
están en proceso de diferenciación o células diferenciadas para
reingresar al programa de ciclo celular. Aunque se sabe que el E2F
tiene una función en el control del ciclo celular, se muestra ahora
por primer vez en las plantas, las células, que no se dividen más
espontáneamente, (por ejemplo, debido a que ellas se han
diferenciado), pueden ahora estar influenciadas o reingresar de
nuevo al ciclo celular, al transformarlas con
E2Fa.
E2Fa.
Por lo tanto otra realización de la presente
invención se relaciona con un método para estimular células, para
que reingresen al ciclo celular.
En una realización preferida los tipos de célula
que se estimulan para reingresar al ciclo celular son células en el
proceso de diferenciación o células diferenciadas.
Reingresar al ciclo celular significa que las
células normalmente no son capaces de ir al ciclo celular debido a
que ellas han pasado esa etapa de desarrollo y por lo tanto ellas
están destinadas a diferenciarse. Los métodos de la presente
invención se pueden utilizar para alterar ese destino celular y
dejar que tales células reingresen al ciclo celular. Este proceso
toma más que solo estimular la división celular o estimular la
progresión del ciclo celular, debido a que la necesidad de anular
las señales que determinan las células para diferenciar en cambio
forzarlas a cruzar el primer punto de control del ciclo celular. El
método de la presente invención tampoco es solamente alterar el
desarrollo ya que el desarrollo general del tipo del tejido o el
órgano permanece como estaba: la estructura y composición
permanecen sin alteración. También, el método de la presente
invención no es únicamente para alterar la diferenciación es decir
la diferenciación inversa, debido a los efectos del método descrito
aquí que también están en el nivel de órganos bien diferenciados:
por ejemplo muy específicamente los efectos están en los
cotiledones, o retoños o panículas que constituyen tejidos
diferenciados. Adicionalmente, los métodos de la presente invención
no están únicamente alterando el crecimiento, ya que el crecimiento
es un proceso que no necesariamente significa que se incrementa el
número de células. Por ejemplo el crecimiento se puede medir por
crecimiento más rápido o alcanzar más rápido la etapa adulta o el
tamaño incrementado de la célula.
También otros tipos de células específicas
preferidas para modificar la expresión o la actividad de un E2F,
son células meristemáticas, en por ejemplo el meristemo apical de
retoño o el meristemo apical de raíz.
Los presentes inventores ligan operacionalmente
el factor de transcripción E2Fa a varios promotores y transforman
estas construcciones en plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas.
De manera sorprendente, en todos los casos los inventores
observaron un incremento en el número de células en los tipos de
células particulares o un aumento en el tamaño y/o el número de
órganos particulares.
Los presentes inventores encontraron
sorprendentemente que la sobreexpresión constitutiva y ubicua del
factor de transcripción E2Fa en plantas de Arabidopsis
thaliana conduce a cotiledones agrandados comparados con las
plantas de tipo silvestre (WT). Adicionalmente, la expresión
preferida de semilla de este gen E2Fa en una planta de arroz
resulta en planta de arroz con número incrementado de retoños y
panículas.
La presente descripción también describe
cualquiera de los métodos descritos aquí para obtener una planta
con un número de órganos incrementado.
Alternativamente, la presente especificación
describe cualquiera de los métodos descritos aquí para obtener una
planta con tamaño incrementado de órganos.
Como se describe aquí, dicho órgano específico
es un brote, retoño, panícula, espiga, flor, hoja, cotiledón,
tallo, semilla, raíz o tubérculo. En particular, la invención
proporciona el incremento del tamaño y/o número de retoños,
panículas, flores o semillas.
Como se describe aquí, la sobreexpresión del E2F
bajo control de un promotor específico de semilla conduce a más
semillas, y también a un tamaño incrementado de las semillas. La
biomasa y el producto son directamente dependientes del número y
tamaño de órganos, la arquitectura de la planta (numero de ramas), y
la producción en masa de semillas (acumulación dependiente de
asimilados fotosintéticos). Por lo tanto el presente método se
puede utilizar para incrementar el rendimiento y por lo tanto la
importancia económica de una planta, particularmente
monocotiledóneas, gramíneas y cereales, se mejora al utilizar los
métodos. Los métodos de la invención mejoran particularmente las
monocotiledóneas.
Dependiendo del promotor utilizado (y por
supuesto de la planta utilizada, dicotiledónea versus
monocotiledónea), se puede incrementar el tamaño y el número de los
diferentes órganos. El principio básico de esta modificación de la
arquitectura de la planta es el incremento en el número de células
en órganos o tejidos particulares. De manera sorprendente, el uso
de un promotor constitutivo no resulta en el incremento del número
de células en la planta completa debido a que el E2F trabaja en una
forma dependiente de la célula. Adicionalmente, cuando la expresión
E2F se limita a la semilla, se incrementa muy sorprendentemente el
número de retoños así como también el número de panículas.
\newpage
De acuerdo con lo anterior, se describe aquí un
método para modificar el rendimiento de las plantas, tal como
cereales de gramíneas, cultivos u ornamentales. En una realización
particular los métodos descritos aquí se utilizan para modificar
maíz al incrementar el número de espigas. Otras realizaciones
particularmente descritas aquí comprenden los métodos como se
describió anteriormente para la aplicación en pastos para
incrementar el número de ramas y/o retoños, por ejemplo para
incrementar la producción de biomasa; para cultivos para
incrementar el número de retoños, panículas, flores y semillas, por
ejemplo para incrementar el producto total de semillas; para maíz
la expresión tardía del promotor se utiliza para incrementar el
número de ramas en los meristemos en inflorescencia que conduce a
un número incrementado de semilla; y para ornamentales para
incrementar el número de ramas. El producto de dichas plantas y la
importancia económica de dichas plantas se mejora
significativamente por los métodos descritos
aquí.
aquí.
Una realización adicional de la invención se
relaciona con un método como se mencionó anteriormente que comprende
integrar en forma estable en el genoma de dicha planta o en los
órganos o tejidos o células de plantas específicas de dicha planta
un ácido nucleico expresable que codifica un factor de transcripción
E2F de planta, un homólogo o un derivado del mismo o un fragmento
enzimáticamente activo del mismo.
La presente especificación describe
adicionalmente el complejo entre los factores de transcripción E2F2
y sus socios de dimerización. Por ejemplo el factor de
transcripción E2F heterodimérico/socio de dimerización (DP) regula
la actividad del promotor de múltiples genes que son esenciales para
la replicación de ADN y el control del ciclo celular. Un ejemplo de
tal una proteína similar a DP se aísla de la Arabidopsis
thaliana y su secuencia de aminoácido se representa en la SEQ
ID NO 4. La secuencia de ácido nucleico correspondiente se
representa en la SEQ ID NO 3. Las secuencias se recuperan del
Genbank bajo el número de acceso AJ294531 (Magyar et al.,
2000). Los inventores han encontrado sorprendentemente que los
efectos del E2F se pueden intensificar mediante la coexpresión del
E2F junto con DP.
Los inventores muestran por primera vez que la
expresión ectópica de E2Fa/DPa temprana durante el desarrollo en
células diferenciadas resulta en proliferación celular. En contraste
con la expresión de otros genes de tipo celular que no resultan en
proliferación en tejidos diferenciados, sorprendentemente la
sobreexpresión de los genes de los ciclos celulares E2F/DPa se
puede utilizar en plantas para anular las señales que regulan la
diferenciación celular. En el caso de la sobreexpresión general del
E2Fa y DPa bajo la influencia de un promotor constitutivo, este
método se puede utilizar como base para generar una detención del
crecimiento.
De acuerdo con lo anterior también se describe
aquí un método para intensificar la proliferación celular en
células que están en el proceso de diferenciación y para anular las
señales de diferenciación en una planta que comprende modular la
expresión y/o la actividad en células específicas o tejidos u
órganos de un factor de transcripción E2F de planta y un socio de
dimerización E2F de planta (DP) un homólogo o un derivado del mismo
o un fragmento enzimáticamente activo del mismo.
"Intensificar la proliferación celular en
células diferenciadas" significa que la división celular en las
células diferenciadas se estimula en tal una forma que la división
celular continua resulta en un exceso de número de células. La
proliferación no ocurre normalmente en tejidos diferenciados, debido
a que las células en esos tejidos están programadas para detener la
división.
La "anulación de las señales para
diferenciación en una planta" significa que se altera el destino
de la célula. Normalmente las células diferenciadas se programan
para detener la división y esta programación ocurre a través de
ciertas rutas de transducción de señal. La anulación de las señales
para diferenciación significa que el proceso de diferenciación se
obstaculiza.
Una realización adicional de la invención se
relaciona con un método o como se describió anteriormente que
comprende integrar en forma estable en el genoma de dicha planta o
en las células o tejidos u órganos de planta específicos de dicha
planta un ácido nucleico expresable que codifica un factor de
transcripción E2F de planta y por lo menos un ácido nucleico
expresable que codifica un socio de dimerización E2F de planta (DP),
un homólogo o un derivado del mismo o un fragmento enzimáticamente
activo del mismo.
Se han aislado y secuenciado los factores de
transcripción E2F de planta y se conocen en la técnica. Un ácido
nucleico de ejemplo que codifica un factor de transcripción E2F se
representa en la SEQ ID NO 1 y su correspondiente secuencia de
aminoácidos se representa de la SEQ ID NO 2. Estas secuencias se
depositan en la base de datos Genbank bajo el número de acceso
AJ294534 y se relaciona con mARN de Arabidopsis thaliana que
codifica una proteína relacionada con E2F (gen E2Fa) (Magyar et
al., 2000). Este gen, Arath; E2Fa también se puede encontrar en
las bases de datos públicas bajo el número de acceso MIPS At2g36010
F11 F19.8 y corresponde a la proteína CAC15486. Una variante de
empalme del factor de transcripción E2Fa de Arabidopsis
thaliana se representa en la SEQ ID NO 19, que codifica un
polipéptido como se representa en la SEQ ID NO 20. Esta secuencia se
aísla por primera vez por los inventores y muestra que tiene una
sustitución de aminoácidos comparada con el factor E2F de acuerdo
con la secuencia SEQ ID NO 2 o CAC15486.
Se debe hacer claridad en que la invención no se
limita a dicho ácido nucleico y/o dichas proteínas sino también a
otros factores de transcripción E2F conocidos que son útiles en los
métodos de la presente invención. Es claro que muchas variantes
alélicas o variantes de empalme del factor E2Fa existen y esas
variantes también se pueden utilizar en los métodos de la presente
invención. También se pueden identificar homólogos de E2Fa en otras
especies de plantas, por ejemplo mediante detección de las bases de
datos de secuencia con el Arath; también se puede utilizar la
secuencia E2Fa y el diseño de cebadores degenerativos para utilizar
en una reacción PCR sobre una colección de CADN de otro organismo y
estos homólogos en los métodos de la presente invención. También
Arath E2Fb (numero de acceso MIPS At5g22220 T6G21.10 y
correspondientes a la proteína CAC15485). Es un gen que también es
de particular interés para uso en los métodos de la presente
invención, ya que el E2Fa y E2Fb se relacionan bastante. También
Arath E2Fc (numero de acceso MIPS At1g47870 T2T6.2 y el
correspondiente a la proteína CAD10631) y factores E2F homólogos de
otras especies de planta se conocen en la técnica y se pueden
utilizar para los métodos de la presente
invención.
invención.
De acuerdo con una realización específica la
presente invención se relaciona con cualquier método de la presente
invención, en donde dicho factor de transcripción E2F es E2Fa, por
ejemplo pero no limitado a E2Fa de Arabidopsis thaliana.
De acuerdo con lo anterior, la presente
invención también incorpora cualquiera de los métodos como se
describen en la presente invención en donde se selecciona el factor
de transcripción E2F del grupo que consista de E2F, preferiblemente
E2Fa de Arabidopsis thaliana, o E2Fb o E2Fc y en donde el DP
se selecciona del grupo que consiste de DPA preferiblemente DPA de
Arabidopsis thaliana y DPB.
Adicionalmente los inventores han encontrado
sorprendentemente que en las plantas monocotiledóneas, tal como el
arroz, se incrementa el número de retoños y/o el número de
panículas, cuando el factor de transcripción E2F se sobreexpresa y
cuando dicha sobreexpresión de E2F está específicamente en la
semilla de dichas plantas.
En la presente invención dicha planta es una
planta monocotiledónea tal como arroz, en una realización preferida,
dicho factor de transcripción E2F es el factor de transcripción
AtE2Fa, como se establece en la SEQ ID NO 1 o se establece en la
SEQ ID NO 19, que es una variante de empalme de AtE2Fa.
Preferiblemente, dicho método comprende integrar en forma estable
en el genoma de dicha planta o en las células de plantas específicas
o tejidos de dichas plantas un ácido nucleico expresable que
codifica un factor de transcripción E2F de planta, un homólogo o
derivado del mismo o un fragmento enzimáticamente activo del mismo.
El factor E2F, tal como un factor E2Fa, está bajo el control de un
promotor específico de semillas, tal como promotor de oleosina de
arroz.
De acuerdo con lo anterior, otra realización es
cualquier método como se describe en la presente invención en donde
el ácido nucleico que codifica un factor de transcripción E2F de
planta se representa por la SEQ ID NO 2 o 20, o un homólogo o un
derivado del mismo o un fragmento enzimáticamente activo del
mismo.
También, la invención se relaciona con un método
que comprende mejorar la expresión o actividad en células
específicas o tejidos de un factor de transcripción E2F de planta,
un homólogo o un derivado del mismo o un fragmento enzimáticamente
activo del mismo al mejorar la expresión de un ácido nucleico que
codifica un factor de transcripción E2F de planta un homólogo o un
derivado del mismo o un fragmento enzimáticamente activo del mismo
en dichos tejidos o células específicas. Dicha intensificación de la
expresión del gen esta mediada por la sobreexpresión de ese gen,
bajo el control de un promotor específico de semilla.
De acuerdo con lo anterior la presente invención
incorpora cualquiera de los métodos como se describe aquí, que
comprende la sobreexpresión de un ácido nucleico que codifica dicho
factor de transcripción E2F de planta bajo el control de un
promotor específico de semilla.
La especificación describe adicionalmente
cualquiera de los métodos como se describe aquí para la producción
de una planta transgénica, que comprende las etapas de:
- (a)
- Proporcionar o elaborar una construcción de ADN que comprende una secuencia reguladora, que es capaz de modificar la expresión y/o la actividad de un factor de transcripción E2F, y conectar en forma operable esta secuencia reguladora a un gen que codifica un factor de transcripción E2F,
- (b)
- Transformar dicha construcción de ADN en una célula de plantas,
- (c)
- Cultivar la célula transgénica obtenida de la etapa (b) bajo condiciones que promuevan la regeneración y el crecimiento de la planta madura,
- (d)
- Seleccionar y evaluar dicha planta durante el curso del desarrollo para registrar sus características fenotípicas y morfológicas.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se describe preferiblemente, dicha
secuencia reguladora es un promotor. Alternativamente, dicha
secuencia reguladora no se liga operablemente al gen E2F en dicha
construcción de ADN, pero la secuencia reguladora se utiliza para
influenciar la expresión del gen E2F natural en la célula
anfitriona.
\newpage
Como se describe preferiblemente, dicha
secuencia reguladora se selecciona del grupo que consiste de un
promotor, un intensificador, un intensificador de transcripción,
una traducción y un intensificador adicionalmente.
La presente invención se relaciona con
cualquieras de los métodos descritos aquí en donde dicho E2F está
bajo el control de un promotor específico de semilla, y/o promotor
específico de embrión, tal como el promotor oleosi-
na.
na.
Como se describe en esta especificación, el
promotor LEAFY también se utiliza para expresar el gen E2F en arroz
y maíz durante la inducción de la formación de flor. Esta estrategia
permite obtener plantas con un número incrementado de producción
celular durante la formación de flor, es decir un número
incrementado de células en el meristemo en inflorescencia, y por lo
tanto un número incrementado y/o tamaño de semillas.
Como se describe en esta especificación, se
utiliza el promotor CDC2a para controlar la expresión E2Fa y llevar
a plantas que tiene un número incrementado de células en el
meristemo del ápice de los brotes (SAM) y meristemo de ápice de
raíz (RAM). Este meristemo vegetativo se transforma primero en un
meristemo en inflorescencia, que luego genera el meristemo floral
como una consecuencia se puede formar órganos más o menos grandes a
partir de estos meristemos. El promotor MCM3 (Stevens et
al., 2002), o el promotor RNR (Chabouté et al. 2002) que
se expresan en zonas de división activamente también se utilizan en
los métodos de la presente invención para incrementar el número de
células en los meristemos.
Las células de plantas o plantas utilizadas en
los métodos descritos aquí incluyen todas las plantas o células de
plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, que incluye
plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas. Dos de las plantas más
preferidas para uso en los métodos son Arabidopsis thaliana y
Oryza sativa (arroz).
De acuerdo con otra realización, la presente
invención se relaciona adicionalmente con cualquiera de los métodos
descritos aquí y en donde dicha planta o célula de planta se deriva
de arroz (Oryza sativa).
La especificación describe adicionalmente todas
las plantas transgénicas que se pueden obtener mediante cualquiera
de los métodos descritos aquí que muestran división celular
estimulada en células específicas o tejidos celulares.
Preferiblemente, se describe una planta transgénica que tiene
expresión alterada o actividad de un factor de transcripción E2F y
que tiene más células en un tejido de planta particular u órganos,
y/o órganos agrandados tal como cotiledones agrandados y/o retoños
agrandados y/o panículas agrandadas y/o brotes agrandados y/o
flores agrandadas y/o raíces agrandadas y/o semillas agrandadas y/o
tubérculos agrandados.
Adicionalmente, se describe una planta
transgénica que tiene expresión alterada y/o actividad de un factor
de transcripción E2F y que tiene más células en un tejido u órgano
de planta particular, y/o más órganos tal como retoños y/o más
panículas y/o más brotes y/o más flores y/o más raíces y/o más
semillas y/o más tubérculos.
De acuerdo con lo anterior se describe una
planta transgénica que se puede obtener mediante cualquiera de los
métodos como se describió anteriormente.
También se describe una parte, particularmente
una parte que se puede cosechar de una planta transgénica como se
describió anteriormente.
La modulación, por ejemplo reducir o aumentar,
el nivel de productos génicos activos o de la actividad de
productos génicos se puede alcanzar adicionalmente al administrar o
exponer las células, tejidos, órganos u organismos a,
respectivamente, un inhibidor o activador de dicho producto génico.
Tales inhibidores o activadores también pueden efectuar su
actividad contra la proteína E2F o el complejo E2F/DP. Tales
inhibidores o activadores incluyen proteínas y compuestos químicos
que se pueden obtener y/o identificar por ejemplo mediante una de
los siguientes,
métodos.
métodos.
De acuerdo con lo anterior, la especificación
también describe un método para identificar y obtener compuestos
que interfieren con la interacción entre el factor de transcripción
E2F y su socio de dimerización que comprende las etapas de:
- (a)
- Proporcionar un sistema de dos híbridos en donde un ácido nucleico que codifica un factor de transcripción E2F representado por la SEQ ID NO 2 o 20 o un homólogo o un derivado del mismo o un fragmento enzimáticamente activo del mismo y su socio de dimerización representado por la SEQ ID NO 4 o se expresa un homólogo o un derivado del mismo o un fragmento enzimáticamente activo del mismo,
- (b)
- Interactuar en por lo menos un compuesto con el complejo formado por los polipéptidos expresados como se define en (a), y,
- (c)
- Medir el efecto de dicho compuesto en la unión entre las proteínas de interacción como se define en (a) o medir la actividad de dicho complejo,
- (d)
- Identificar opcionalmente dicho compuesto.
También se describen los métodos anteriores en
donde dichos compuestos intensifican la actividad de dicho complejo
de proteína o promueve la formación de un complejo entre dichas
proteínas. La especificación también describe, los compuestos que
se pueden obtener mediante dichos métodos.
La especificación también describe un compuesto
identificado o que se puede identificar por medio de los métodos
anteriores como un regulador de crecimiento de las plantas. También
se describe un método para producir un regulador de crecimiento de
plantas que comprende las etapas de los métodos anteriores y
formular los compuestos obtenidos de dichas etapas en una forma
adecuada para la aplicación en agricultura o cultivos de células o
tejidos de
plantas.
plantas.
La especificación describe adicionalmente
diferentes usos nuevos de los factores de transcripción E2F. El
factor E2F utilizado en la presente invención puede ser cualquier
factor E2F seleccionado del grupo E2Fa, E2Fb y E2Fc. También se
utiliza el factor E2F en la presente invención solo o en combinación
con su socio de dimerización DP. Este DP es cualquier DP o un DP
seleccionado del grupo que consiste de DPa y DPb. En un ejemplo
particular de la presente invención se utiliza un factor de
transcripción E2Fa de Arabidopsis thaliana o un factor E2Fa
representado por la secuencia de las SEQ ID NOs 1, 2, 9 y 10. En un
ejemplo particular de la invención se utiliza el factor DPa de
Arabidopsis thaliana o el factor DPb como se representa en la
SEQ ID No 3 y 4.
Como se describe preferiblemente los usos del
factor E2F o DP comprenden modular la expresión y/o actividad en
células específicas o tejidos u órganos de un factor de
transcripción E2F de planta y un socio de dimerización E2F de
planta (DP), un homólogo o un derivado del mismo o un fragmento
enzimáticamente activo del mismo, por ejemplo al intensificar la
expresión de un ácido nucleico que codifica un factor de
transcripción E2F de planta solo o en combinación con un ácido
nucleico que codifica un DP de planta o un homólogo o un derivado de
dichos ácidos nucleicos o un fragmento enzimáticamente activo del
mismo, en dichas células o tejidos específi-
cos.
cos.
En una realización particular de la invención
los usos de E2F o DP involucran integrar en forma estable en el
genoma de dicha planta o en las células de plantas específicas o
tejidos de dicha planta un ácido nucleico expresable que codifica
un factor de transcripción E2F de planta o un ácido nucleico
expresable que codifica un socio de dimerización E2F de planta
(DP), un homólogo o un derivado del mismo o un fragmento
enzimáticamente activo del
mismo.
mismo.
El uso de un factor de transcripción E2F, un
homólogo o un derivado del mismo o un fragmento enzimáticamente
activo del mismo para prolongar el periodo de la división celular en
ciertas células y tejidos.
La expresión "prolongar el periodo de división
celular" significa alterar el destino de las células que se
dividen en tal una forma que ellos no detienen la división, pero en
cambio continúan dividiéndose. La expresión significa que las
células de la presente invención tienen un periodo de división
celular prolongado comparado con células en donde no se modula la
expresión y/o la actividad del E2F. El periodo de división celular
prolongado se puede observar por inspección visual del tejido para
ver si hay más células y/o si los órganos son más grandes, o
mediante análisis microscópico o mediante ensayos histológicos.
La presente especificación también describe el
uso de un factor de transcripción E2F, o un homólogo o un derivado
del mismo o un fragmento enzimáticamente activo para incrementar el
tamaño de los cotiledones.
Los cotiledones agrandados en dichas plantas
transgénicas resulta en vigor intensificado de las plántulas, que
puede traducirse en una tasa de crecimiento mayor (por ejemplo mayor
crecimiento en la etapa juvenil y resulta en un crecimiento general
mar rápido en la etapa adulta), mayor resistencia a la tensión, y
mayor supervivencia de las plántulas.
La presente especificación también describe el
uso de un factor de transcripción E2F, o un homólogo o un derivado
del mismo o un fragmento enzimáticamente activo del mismo para
intensificar la proliferación celular después de germinación de la
semilla.
La presente especificación también describe el
uso de un factor de transcripción E2F, o un homólogo o un derivado
del mismo o un fragmento enzimáticamente activo del mismo para
mejorar la resistencia a la tensión de las
plántulas.
plántulas.
La presente especificación también describe el
uso de un factor de transcripción E2F, o un homólogo o un derivado
del mismo o un fragmento enzimáticamente activo del mismo para
obtener plántulas con vigor intensificado.
La presente especificación también describe el
uso de un factor de transcripción E2F, o un homólogo o un derivado
del mismo o un fragmento enzimáticamente activo del mismo para
obtener plantas con crecimiento incremen-
tado.
tado.
La presente especificación también describe el
uso de un factor de transcripción E2F, o un homólogo o un derivado
del mismo o un fragmento enzimáticamente activo del mismo para
obtener plantas que tienen más células en un tejido particular de
la misma o un fragmento enzimáticamente activo del mismo para
obtener plantas que tienen más células en un tejido particular.
La expresión "mas células" se relaciona con
una planta que tiene más células en el mismo tejido u órgano cuando
se compara con el tejido u órgano de otra planta (de la misma
especie, con la misma edad, en los mismos ambientes) en donde no se
modula la expresión y/o actividad de un factor de transcripción
E2F.
Se pueden utilizar más células en dichas plantas
transgénicas para alterar las características arquitectónicas, por
ejemplo para alterar la estructura de la madera, por ejemplo para
hacerla más densa y pesada. Estas características alteradas pueden
tener un efecto benéfico por ejemplo en la resistencia a los
patógenos de la planta y la calidad del material de la planta. Por
lo tanto los métodos de la presente invención pueden contribuir
significativamente a la aplicabilidad industrial de dichas plantas
transgénicas. Más células en dichas plantas transgénicas también se
pueden utilizar para alterar las características bioquímicas de la
planta por ejemplo para producir más componentes de pared celular.
Ejemplos de aplicación industrial de estas plantas son el cultivo de
plantas para la producción de lignina, celulosa, pectina etc.
La presente especificación describe
adicionalmente el uso de un factor de transcripción E2F, o un
homólogo o un derivado del mismo o un fragmento enzimáticamente
activo del mismo para obtener plantas que tienen un número de
órganos incrementado.
La presente especificación también describe
adicionalmente el uso de un factor de transcripción E2F, o un
homólogo o un derivado del mismo o un fragmento enzimáticamente
activo del mismo para obtener plantas que tienen un tamaño de
órganos incrementados.
La presente especificación también describe
adicionalmente el uso de un factor de transcripción E2F, o un
homólogo o un derivado del mismo o un fragmento enzimáticamente
activo del mismo para obtener plantas que tienen un rendimiento
incrementado.
La presente especificación describe
adicionalmente el uso de un factor de transcripción E2F, o un
homólogo o un derivado del mismo o un fragmento enzimáticamente
activo del mismo para estimular células diferenciadas para que
reingresen al ciclo celular.
La presente especificación también describe el
uso de un factor de transcripción E2F, o un homólogo o un derivado
del mismo o un fragmento enzimáticamente activo del mismo para
anular las señales de diferenciación celu-
lar.
lar.
Los inventores también muestran que la
sobreexpresión del E2F y el DP resulta en forma celular alterada en
algunas células o en algunos tejidos de la planta.
La presente especificación también describe
adicionalmente el uso de un factor de transcripción E2F, o un
homólogo o un derivado del mismo o un fragmento enzimáticamente
activo del mismo para alterar la forma celular.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ácidos nucleicos se escriben de derecha a
izquierda en la orientación 5' a 3', a menos que se indique otra
cosa; las secuencias de aminoácido se escriben de izquierda a
derecha en la orientación amino a carboxi. Los aminoácidos se
denominan aquí por ser comúnmente conocidos con símbolos de tres
letras o por símbolos de una letra recomendados por la comisión de
nomenclatura bioquímica y IUPAC-IUB. Los nucleótidos
se pueden numerar o ser códigos de una letra comúnmente
aceptados.
Los términos "gen(es)",
"polinucleótido(s)", "ácido(s)
nucleico(s)", "secuencia(s) de
nucleótido(s)", "secuencia(s) de ácido(s)
nucleico(s)", o "molécula(s) de ácido(s)
nucleico(s)" como se utiliza aquí se refiere a una forma
polimérica de un polímero ribonucleótidos o desoxiribonucleótidos de
cualquier longitud ya sea monocatenarios o bicatenarios, o análogos
de los mismos, que tienen la característica esencial de un
ribonucleótido esencial en que ellos se pueden hibridar a ácidos
nucleicos en una forma similar a polinucleótidos de ocurrencia
natural.
Se ha hecho una gran variedad de modificaciones
al ADN y ARN que sirven a muchos propósitos útiles conocidos por
aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, metilación,
"caps" y sustitución de uno o más nucleótidos de ocurrencia
natural con un análogo. Dichos términos también incluyen ácidos
nucleicos de péptidos.
El término "polinucleótido" como se utiliza
aquí incluye tales formas químicamente, enzimáticamente o
metabólicamente modificadas de polinucleótidos.
"Cadena codificante" se refiere a una
cadena de ADN que es homóloga a un transcrito de mARN de la misma,
"cadena anticodificante" que se refiere a la cadena
complementaria de la cadena codificante.
\newpage
"Que codifica" o "codifica" con
respecto a una secuencia de nucleótidos significa que comprende la
información para traducción a una proteína específica. Un ácido
nucleico que codifica una proteína puede contener secuencias no
traducidas tal como regiones no traducidas 5' y 3' (UTR 5' y 3') e
intrones o a esta le pueden faltar secuencias de intrones tales
como por ejemplo en el cADN.
Un "cuadro de lectura abierto" o
"(ORF)" se define como una secuencia de nucleótidos que
codifica un polipéptido. La información mediante la cual se
codifica una proteína se especifica por el uso de codones.
Típicamente, la secuencia de aminoácidos se codifica por el ácido
nucleico utilizando el código genético "universal" pero
existen variantes de este código universal (ver por ejemplo Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A 82: 2306-2309 (1985)). Los
límites de la secuencia de codificación se determinan mediante un
codón iniciador de traducción en el extremo 5' y un codón de
detención de traducción en el terminal 3'.
Como se utiliza aquí "secuencia de longitud
completa" con respecto a un ácido nucleico específico o su
proteína codificada significa que tiene la secuencia de aminoácido
completa de una proteína natural. En la presente invención, la
comparación con secuencias homólogas (hortólogas o parálogas) de
longitud completa se utiliza para identificar secuencias de
longitud completa. También, para un mARN o sea ADN, las secuencias
consensus presentes en las regiones no traducidas 5' y 3' ayudan en
la identificación de un polinucleótido de longitud completa. Para
una proteína la presencia de un codón iniciador y codón de detención
ayudan en la identificación del polipéptido de longitud completa.
Cuando se va a expresar el ácido nucleico, se puede tomar ventajas
de preferencia de codón conocidas o preferencias de contenido GC
del anfitrión de destino ya que estas preferencias se han mostrado
que difieren (ver por ejemplo http://www.kazusa.or.jp/codon/; Murray
et al. Nucl. Acids Res. 17: 477-498 (1989)).
Debido a la degeneración del código genético, un gran número de
ácidos nucleicos pueden codificar cualquier proteína dada. Como
tal, sustancialmente las secuencias de ácido nucleico divergentes
se pueden diseñar para efectuar la expresión de esencialmente la
misma proteína en diferentes anfitriones. Por el contrario, los
genes y las secuencias de codificación que codifican esencialmente
la misma proteína aislada de diferentes fuentes puede consistir de
sustancialmente de diferentes secuencias de ácido nucleico.
Un "ácido nucleico expresable" como se
utiliza aquí significa un ácido nucleico que lleva los elementos de
control necesarios para ser efectivos en la célula anfitriona.
El término "secuencia de control" o
"secuencia reguladora" o "elemento regulador" se refiere a
secuencias de ácido nucleico reguladoras que son necesarias para
efectuar la expresión de las secuencias a las que ellas se ligan.
Las secuencias de control difieren dependiendo del organismo
anfitrión de destino y luego la naturaleza de la secuencia a ser
expresada. Para la expresión de una proteína, en procariotes,
generalmente las secuencias de control incluyen un promotor, un
sitio de unión ribosómico, y un terminador. En eucariotes, la
secuencia de control incluye generalmente promotores, terminadores,
y en algunos casos intensificadores, y/o secuencias no traducidas
5' y 3'. El término "secuencia de control" está destinado a
incluir, en un mínimo, todos los componentes necesarios para la
expresión, y también pueden incluir componentes ventajosos
adicionales.
Como se utiliza aquí, un "promotor" incluye
referencia a una región de ADN en la dirección 5' del inicio de la
transcripción y está involucrado en la unión de polimerasa de ARN y
otras proteínas para iniciar la transcripción. La referencia aquí a
un "promotor" se toma en su contexto más amplio e incluye las
secuencias reguladoras transcripcionales derivadas de un gen
genómico eucariotico clásico, que incluye la caja TATA que se
requiere para la iniciación de la transcripción exacta, con o sin
una secuencia de caja CCAAT y elementos reguladores adicionales (es
decir secuencias de activación en la dirección 5', intensificadores
y silenciadores) que alteran la expresión génica en respuesta a
estímulos externos y/o del desarrollo, o en una forma específica del
desarrollo. El término "promotor" también incluye las
secuencias reguladoras transcripcionales de un gen procariótico
clásico, en cuyo caso este puede incluir una secuencia de la caja
-35 y/o unas secuencias reguladoras de la caja -10. El término
"promotor" también se utiliza para describir una molécula de
fusión o sintética, o derivada que confiere, activa o intensifica
la expresión de una molécula de ácido nucleico en una célula, tejido
u órgano.
Un "promotor de planta" es un promotor
capaz de iniciar la transcripción de células de planta.
Promotores "preferidos de tejido" como se
utiliza aquí se refiere a promotores que inician preferencialmente
la transcripción en ciertos tejidos tal como por ejemplo en hojas,
raíces, etc. Los promotores que inician la transcripción solo en
ciertos tejidos se denominan aquí "específicos de tejido".
Ejemplos de promotores preferidos de tejido o específicos de tejido
de plantas se dan en la Tabla A.
Aquellos expertos en la técnica advertirán que
los "promotores inducibles" tienen iniciación de transcripción
inducida o incrementada en respuesta a un estímulo del desarrollo
químico, ambiental, o físico.
Un "promotor constitutivo" es
transcripcionalmente activo durante la mayoría, pero no
necesariamente todas las fases de su crecimiento y desarrollo.
Ejemplos de promotores constitutivos se dan en la tabla B.
El término "terminador" como se utiliza
aquí es un ejemplo de una "secuencia de control" y se refiere a
una secuencia de ADN al final de una unidad transcripcional que
señala el procesamiento 3' y la poliadenilación de un transcrito
principal y la terminación de la transcripción. Los terminadores
comprenden secuencias no traducidas 3' con señales de
poliadenilación que facilitan el procesamiento 3' y la adición de
secuencias poliadeniladas al extremo 3' de un transcrito principal.
Se conocen y describen en la literatura los terminadores activos en
células derivadas de virus, levaduras, mohos, bacterias, insectos,
aves, mamíferos y plantas. Ellos se pueden aislar de bacterias,
hongos, virus, animales y/o plantas. Elementos reguladores
adicionales pueden incluir intensificadores transcripcionales así
como intensificadores traduccionales. Un intensificador traduccional
de planta utilizado frecuentemente es la secuencia omega CaMV. Se
ha mostrado que la inclusión de un intrón incrementa los niveles de
expresión hasta 100 veces en ciertas plantas (Mait, Transgenic
Research 6 (1997), 143-156; Ni, Plant Journal 7
(1995),
661-676).
661-676).
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El término "ligado operablemente" como se
utiliza aquí se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes
así descritos están en una relación que les permite funcionar en su
forma prevista. Una secuencia de control "ligada
operablemente" a una secuencia de codificación se liga en tal una
forma que la expresión de la secuencia de codificación se logra
bajo condiciones compatibles con las secuencias de control. En el
caso en el que la secuencia de control es un promotor, es obvio
para una persona experta que se utiliza ácido nucleico
bicatena-
rio.
rio.
En el término "que hibrida" incluye
referencia a la formación de una estructura de ácido nucleico dúplex
a través de la hibridación de dos secuencias de ácido nucleico
monocatenarias. El proceso de hibridación puede ocurrir
completamente en solución como por ejemplo en los procesos de
reacción de cadena de polimerasa, hibridación sustractiva, y
síntesis de su cADN. Alternativamente, uno de los ácidos nucleicos
complementarios se puede inmovilizar sobre un soporte sólido tal
como sobre una membrana de nylon en análisis de transferencia por
gel de ADN y ARN o sobre un soporte de vidrio de silicio para
hibridación de microensayo. Otros usos y técnicas que se basan en
la hibridación son bien conocidos por aquellos expertos en la
técnica. Los factores críticos para la hibridación son la
resistencia iónica y la temperatura de la solución y las
características de los ácidos nucleicos tal como la longitud y el
porcentaje de contenido de GC. El Tm es la temperatura en la que el
50% de una secuencia objetivo complementaria hibrida a una sonda
perfectamente emparejada bajo pH y resistencia iónica definida.
Para los híbridos ADN-ADN, se puede calcular el Tm a
partir de la ecuación de Meinkoth y Wahl (Anal. Biochem., 138:
267-284, 1984): Tm = 81.5ºC + 16.6 (logM) + 0.41
(%GC) - 0.61 (% en formamida) - 500/L en donde M es la molaridad de
cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de guanosina y
nucleótidos de citocina en el ADN, el porcentaje de formamida es el
porcentaje de formamida en la solución de hibridación, y L es la
longitud del híbrido en pares
base.
base.
Para los términos "condiciones rigurosas" o
"condiciones de hibridación rigurosas" incluyen referencia a
condiciones bajo las cuales una sonda hibridará a su secuencia
objetivo a un mayor grado detectable que otras secuencias (por
ejemplo, por lo menos 2 veces más de fondo). Las condiciones
rigurosas son dependientes de secuencia y serán diferentes en
diferentes circunstancias. Al controlar la rigurosidad de la
hibridación y/o condiciones de lavado se pueden identificar
secuencias objetivo que son 100% complementarias con la sonda.
Alternativamente, se pueden ajustar condiciones de rigurosidad para
permitir algún desajuste con menores grados de similitud. Las
condiciones rigurosas son aquellas en las que la concentración de
sal es menor aproximadamente 1.5 M de ión de Na típicamente 0.01 a
1.0 M de ión Na, (u otras sales) en pH 7.0 a 8.3 y la temperatura es
aproximadamente 30ºC para sondas cortas (10 a 50 nucleótidos) y por
lo menos 60ºC para sondas largas (por ejemplo más de 50
nucleótidos). También se pueden alcanzar condiciones rigurosas con
la adición de agentes desestabilizantes tal como formamida. Un
ejemplo de condiciones de baja rigurosidad incluyen hibridación con
una solución de amortiguador de 30 a 35% de formamida 1 M NaCl, 1%
SDS (dodecil sulfato de sodio) a 37ºC, y un lavado en 1x a 2x SSC
(20x SSC es 3.0 M NaCl/0.3M de citrato de trisodio) en 50 a 55ºC.
Condiciones de rigurosidad moderada de ejemplo incluye hibridación
en 40 a 45% de formamida, 1 M NaCl, 1% SDS a 37ºC, y un lavado en
0.5x SSC a 1.0x SSC en 55 a 60ºC. Condiciones de alta rigurosidad
incluyen hibridación en 50% de formamida, 1M NaCl, 1% SDS a 37ºC, y
un lavado en 0.1x SSC de 60 a 65ºC. La especificidad es típicamente
la función de los lavados posthibridación. Aquellos expertos en la
técnica entenderán que las condiciones para hibridación y lavado se
pueden ajustar para lograr hibridación a secuencias de la identidad
deseada. Una guía para la hibridación de ácidos nucleicos se
encuentra en Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2nd
Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
NY (1989); and in Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry
and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic
Acid Probes, Part I, Chapter 2 "Overview of principles of
hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays",
Elsevier, New York (1993).
Los términos "proteínas" y
"polipéptidos" se utilizan intercambiablemente en esta
solicitud y se refieren a un polímero de aminoácidos. Estos
términos no se refieren a una longitud específica de la molécula y
así los péptidos y oligopéptidos están incluidos dentro de la
definición de polipéptidos. Este término también se refiere a o
incluye las modificaciones postraduccionales del polipéptido, por
ejemplo, glucosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones,
sulfataciones y similares. Estas modificaciones son bien conocidas
por los expertos en la técnica y se describen ejemplos en Wold F.,
Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and
Prospects, pp. 1-12 in Posttranslational Covalent
Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New
York (1983) and Seifter et al., Meth. Enzymol. 182:
626-646 (1990). Se incluye dentro de la definición,
por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un
aminoácido (que incluyen, por ejemplo, aminoácidos no naturales,
etc.), polipéptidos con enlaces sustituidos así como también otras
modificaciones de ocurrencia natural y no natural conocidas en
la
técnica.
técnica.
El término "aminoácidos", "residuo de
aminoácidos" o "residuo" se utilizan intercambiablemente
aquí para referirse a un aminoácido que se incorpora en una
proteína, polipéptido o péptido. El aminoácido puede ser un
aminoácido de ocurrencia natural y puede ser un análogo conocido de
aminoácido naturales que pueden funcionar de una manera similar
como los aminoácidos de ocurrencia similar.
Como se utiliza aquí "homólogos" de una
proteína de la invención son aquellos péptidos, oligopéptidos,
polipéptidos, proteínas y enzimas que contienen sustituciones de
aminoácido, eliminaciones y/o adiciones con relación a dicha
proteína, proporcionando similar actividad biológica que la del
polipéptido no modificado del que ellos se derivan. Para producir
tales homólogos, los aminoácidos presentes en dicha proteína se
pueden reemplazar por otros aminoácidos que tienen similares
propiedades, por ejemplo hidrofobicidad, hidrofilicidad,
antigenicidad, propensión a formar o romper estructuras
helicoidales \alpha o estructuras de lámina \beta, y así
sucesivamente. Las tablas de sustitución conservadoras se conocen
bien en la técnica (ver por ejemplo Creighton (1984) Proteins. W.H.
Freeman and Company)). Un repaso de las propiedades físicas y
químicas de los aminoácidos se da en la
tabla C.
tabla C.
Dos formas especiales de homología, ortóloga y
paráloga, son conceptos evolutivos utilizados para describir
relaciones ancestrales de genes.
El término "parálogo" se relaciona con
duplicación de genes dentro del genoma de una especie que conduce a
genes parálogos.
El término "ortólogo" se relaciona con
genes homólogos en diferentes organismos debido a una relación
ancestral. La presente invención también se relaciona así con
homólogos, parálogos y ortólogos de las proteínas de acuerdo con la
invención.
"Variantes de sustitución" de una proteína
de la invención son aquellas en las que por lo menos un residuo en
dicha secuencia de aminoácido de proteína se ha removido y un
residuo diferente se inserta en su lugar. Se hacen sustituciones de
aminoácido típicamente de residuos sencillos, pero se pueden agrupar
dependiendo de las restricciones funcionales colocadas en el
polipéptido; las inserciones serán usualmente del orden de
aproximadamente 1-10 residuos de aminoácidos, y las
eliminaciones variarán de aproximadamente 1-20
residuos. Preferiblemente, las sustituciones de aminoácidos
comprenderán sustituciones de aminoácidos conservadoras, tal como
aquellas descritas anteriormente.
Las "variantes de inserción" de una
proteína de la invención son aquellas en las que uno o más residuos
de aminoácidos se introducen en un sitio predeterminado en dicha
proteína. Las inserciones pueden comprender inserciones
terminal-amino y/o terminal-carboxi
así como también inserciones intrasecuencia de aminoácidos
sencillos o múltiples. Generalmente las inserciones dentro de la
secuencia de aminoácidos eran más pequeñas que las funciones del
terminal amino o carboxi, del orden de aproximadamente 1 a 10
residuos. Ejemplos de péptidos o proteínas de fusión de terminal
amino o carboxi incluyen el dominio de unión o el dominio de
activación de un activador transcripcional como se utiliza en el
sistema de dos híbridos de levadura, proteínas de recubrimiento de
fago (histidina)_{6}-tag, glutationa,
S-transferasa-tag, proteína A,
proteína de unión maltosa, reductasa dihidrofolato, epítopo Tag
\cdot100, epítopo c-myc, epítopo FLAG ®, lacz, CMP
(péptido de unión calmobulina), epítopo HA, epítopo de proteína C y
epítopo VSV.
"Las variantes de eliminación" de una
proteína de la invención se caracterizan por la remoción de uno o
más aminoácidos de dicha proteína. Las variantes de aminoácidos de
una proteína de la invención se pueden hacer fácilmente utilizando
técnicas sintéticas de péptidos bien conocidas en el arte, tal como
síntesis de péptido de fase sólida y similares, o mediante
manipulaciones de ADN recombinante. La manipulación de secuencias de
ADN para producir variantes de sustitución, inserción o eliminación
de una proteína se conocen bien en el arte. Por ejemplo, las
técnicas para hacer mutaciones de sustitución en sitios
predeterminados en el ADN se conocen bien por aquellos expertos en
la técnica e incluyen mutagenia M13, mutagenia in vitro
T7-gen (USB, Cleveland, OH), mutagenia dirigida al
sitio QuickChange (Stratagene, San Diego, CA), mutagenia dirigida al
sitio mediada por PCR u otros protocolos de mutagenia dirigida al
sitio.
El término "homólogos" de un factor de
transcripción E2F son aquellos péptidos, oligopéptidos,
polipéptidos, proteínas y enzimas que contienen sustituciones de
aminoácidos, eliminaciones y/o adiciones relacionadas con dicho
factor de transcripción E2F, que suministra similar actividad
biológica que el polipéptido no modificado del que ellos se
derivan. Preferiblemente dichos homólogos tienen por lo menos
aproximadamente el 90% de identidad de secuencia. La invención
también se relaciona así con el uso de tales homólogos de factores
de transcripción E2F en los métodos descritos y más preferiblemente
con el uso de homólogos de la proteína representada en la SEQ ID NO
2.
"Los derivados" de una proteína de la
invención son aquellos péptidos, oligopéptidos, polipéptidos,
proteínas y enzimas que pueden comprender residuos de aminoácido de
ocurrencia natural, glucosilados alterados, acilados o de
ocurrencia no natural comparados con la secuencia de aminoácido de
una forma de ocurrencia natural de dicho polipéptido. Un derivado
también puede comprender uno o más sustituyentes no aminoácidos
comparados con la secuencia de aminoácido del que esta se deriva,
por ejemplo una molécula indicadora u otro ligando, unida
covalentemente o no covalentemente a la secuencia de aminoácido tal
como, por ejemplo, una molécula indicadora que se une para
facilitar su detección.
Un "fragmento enzimáticamente activo" de un
factor de transcripción E2F comprende por lo menos 5 residuos de
aminoácidos contiguos de dicha proteína pero debe retener la
actividad biológica del factor de transcripción E2F de ocurrencia
natural. Este término también significa cualquier fragmento de
proteína que es aún capaz de ejercer la función.
El término "sitio celular" significa los
eventos estructurales y bioquímicos cíclicos asociados con el
crecimiento y con la división de las células, y en particular con
la regulación de la replicación del ADN y la mitosis. El ciclo
celular incluye fases denominadas: G0, Gap1(G1), síntesis de
ADN (S), Gap2 (G2), y mitosis (M). Normalmente estas cuatro fases
ocurren secuencialmente, sin embargo, el ciclo celular también
incluye ciclos modificados en donde una o más fases están ausentes
resultando el ciclo celular modificado tal como endomitosis,
acitoquinesis, poliploidía, politenia, y endoreduplicación.
"Moléculas de ADN recombinantes" o "gen
quimérico" significa un ADN híbrido producido al unir piezas de
ADN de diferentes fuentes a través de manipulación humana
deliberada.
El término "expresión" significa la
producción de una secuencia de nucleótido o proteína en la célula.
Sin embargo, dicho término incluye la protección de la proteína en
un sistema libre de células. Esto incluye la transcripción en un
producto de ARN, modificación postranscripcional y/o traducción a un
producto de proteína o polipéptido de un ADN que codifica ese
producto, así como también modificaciones postraduccionales
posibles. Dependiendo de las construcciones específicas y
condiciones utilizadas, la proteína se puede recuperar de las
células, del medio de cultivo o de ambos. Para el experto es bien
conocido que no solo es posible expresar una proteína natural sino
también expresar la proteína como polipéptidos de fusión o agregar
secuencias de señal que dirigen la proteína a compartimentos
específicos de la célula anfitriona, por ejemplo, asegurando la
secreción del péptido en el medio del cultivo, etc. Adicionalmente,
una proteína y fragmentos de los mismos se pueden sintetizar
químicamente y/o modificar de acuerdo con los métodos estándar
descritos.
"Un vector" como se utiliza aquí incluye
referencias a un ácido nucleico utilizado para transfección o
transformación de una célula anfitriona y en el que se puede
insertar un ácido nucleico. Los vectores de inspección de la
transcripción y/o traducción de un ácido nucleico insertado allí.
Los vectores de expresión pueden por ejemplo ser vectores de
clonación, vectores binarios o vectores de integración y típicamente
contienen secuencias de control como se describió anteriormente
para asegurar la expresión en células procarióticas y eucarióticas.
Los elementos reguladores que permiten la expresión en las células
anfitrionas procarióticas comprenden, por ejemplo, el promotor
P_{L}, lac, trp o tac en E. coli. Ejemplos de elementos
reguladores que permiten la expresión en células anfitrionas
eucarióticas aox1o Gal1 en levadura o el promotor Sv40 cmd, Sv 40,
RSB o el intensificador o un intrón de globina en mamíferos y otras
células de animales. En este contexto los vectores de expresión
adecuados se conocen en la técnica tal como el vector de expresión
cADN Okayama-Berg pcDV1 (Pharmacia), pCDM8,
pRc/CMV, pcADN1, pcADN3 (Invitrogen), pSPORT1 (GIBCO BRL).
Ventajosamente, los vectores de la invención comprenden un marcador
seleccionable y/o clasificable. Los genes de marcador seleccionables
útiles para la selección de células de plantas transformadas,
callo, tejido de plantas y plantas se conocen bien por aquellos
expertos en la técnica. Por ejemplo, la resistencia antimetabolito
proporciona la base de la selección para: el gen dhfr que confiere
resistencia al metotrexato (Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.)
13 (1994), 143-149); el gen npt que confiere
Resistencia a la neomicina aminoglicosida, kanamicina y paromomicina
(Herrera-Estrella, EMBO J. 2 (1983),
987-995); y hpt, que confiere resistencia a la
higromicina (Marsh, Gene 32 (1984), 481-485). Se
han descrito genes de marcadores seleccionables adicionales, a saber
trpB, que permite a las células utilizar indol en lugar de
triptofan; hisD, que permite a las células usar histinol en lugar de
histidina (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047);
manosa-6 -fosfato isomerasa que permite a las
células utilizar manosa (WO 94/20627) y ornitina descarboxilasa que
confiere resistencia al inhibidor ornitina descarboxilasa,
2-(difluorometil)-DL-ornitina o DFMO
(McConlogue, 1987, In: Current Communications in Molecular Biology,
Cold Spring Harbor Laboratory ed.) o desaminasa de Aspergillus
terreus que confiere resistencia a Blasticidina S (Tamura,
Biosci. Biotechnol. Biochem. 59 (1995), 2336-2338).
Los marcadores clasificables útiles también se conocen por aquellos
expertos en la técnica y están disponibles comercialmente.
Ventajosamente, dicho marcador es un gen que codifica luciferasa
(Giacomin, PI. Sci. 116 (1996), 59-72; Scikantha, J.
Bact. 178 (1996), 121), proteína fluorescente verde (Gerdes, FEBS
Lett. 389 (1996), 44-47) o
\beta-glucuronidasa (Jefferson, EMBO J. 6
(1987),
3901-3907).
3901-3907).
El vector o molécula de ácido nucleico de
acuerdo con la invención se puede integrar en el genoma de la célula
anfitriona o se puede mantener en alguna forma
extracromosómicamente. A este respecto también se entiende que la
molécula de ácido nucleico de la invención se puede utilizar para
restaurar o crear un gen mutante a través de la recombinación
homóloga o través de otros mecanismos moleculares tal como por
ejemplo interferencia de ARN (Paszkowski (ed.), homólogous
Recombinationand Gene Silencing in Plants. Kluwer Academic
Publishers (1994)).
Como se utiliza aquí, una "célula
anfitriona" es una célula que contiene un vector y soporta la
expresión y/o replicación de este vector. Las células anfitrionas
pueden ser células procarióticas tal como E. Coli y A.
tumefaciens, o estas pueden ser células eucarióticas tales como
células de levadura, de insectos, de anfibios, de plantas o de
mamíferos. Preferiblemente, las células anfitrionas son células de
plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas.
El término "fragmento de una secuencia" o
"parte de una secuencia" significa una secuencia truncada de la
secuencia original referida. La secuencia truncada (secuencia de
proteína o ácido nucleico) puede variar ampliamente de longitud; el
tamaño mínimo es una secuencia de tamaño para proporcionar una
secuencia con por lo menos una función comparable y/o actividad
enzimática de la secuencia original referida, aunque el tamaño
máximo no es crítico. En algunas aplicaciones, el tamaño máximo
usualmente no es mayor que aquel requerido para proporcionar la
actividad deseada y/o función de la secuencia original. Típicamente,
la secuencia de aminoácido truncada variará de aproximadamente 5 a
aproximadamente 60 aminoácidos de longitud. Mas típicamente, sin
embargo, la secuencia tendrá un máximo de aproximadamente 50
aminoácidos de longitud, preferiblemente un máximo de
aproximadamente 30 aminoácidos. Es usualmente deseable seleccionar
secuencias de aproximadamente 10, 12 o 15 aminoácidos hasta
aproximadamente 20 o 25 aminoácidos.
Como se utiliza, el término "planta"
incluye referencia a plantas completas, órganos de plantas (tal como
hojas, raíces, tallos, etc.), semillas y células de plantas y
progenie de la misma.
La "célula de planta" como se utiliza aquí,
incluye cultivos en suspensión, embriones, regiones meristemáticas,
tejidos de callo, hojas, semillas, raíces, brotes, gametofitos,
esporofitos, polen, y microesporas. Las plantas que se pueden
utilizar en los métodos de la invención incluyen todas las plantas
que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, en particular
plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas que incluyen un forraje o
leguminosas forrajeras, plantas ornamentales, cultivos
alimenticios, árboles, o arbustos seleccionados de la lista que
comprende Acacia spp., Acer spp., Actinidia
spp., A esculus spp., Agathis australis, Albizia
amara, Alsophila tricolor, Andropogon spp., Arachis spp,
Areca catechu, Astelia fragrans, Astragalus cicer, Baikiaea
plurijuga, Betula spp., Brassica spp., Bruguiera
gymnorrhiza, Burkea africana, Butea frondosa, Cadaba farinosa,
Calliandra spp, Camellia sinensis, Canna indica,
Capsicum spp., Cassia spp., Centroema pubescens,
Chaenomeles spp., Cinnamomum cassia, Coffea arabica,
Colophospermum mopane, Coronillia varia, Cotoneaster serotina,
Crataegus spp., Cucumis spp., Cupressus spp.,
Cyathea dealbata, Cydonia oblonga, Cryptomeria japonica,
Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia oblonga,
Dalbergia monetaria, Davallia divaricata, Desmodium spp.,
Dicksonia squarosa, Diheteropogon amplectens, Dioclea spp,
Dolichos spp., Dorycnium rectum, Echinochloa pyramidalis,
Ehrartia spp., Eleusine coracana, Eragrestis spp.,
Erythrina spp., Eucalyptus spp., Euclea schimperi,
Eulalia villosa, Fagopyrum spp., Feijoa sellowiana,
Fragaria spp., Flemingia spp, Freycinetia banksii,
Geranium thunbergii, Ginkgo biloba, Glycine javanica,
Gliricidia spp, Gossypium hirsutum, Grevillea spp.,
Guibourtia coleosperma, Hedysarum spp., Hemarthia
altissima, Heteropogon contortus, Hordeum vulgare, Hyparrhenia rufa,
Hypericum erectum, Hyperthelia dissoluta, Indigo incamata, Iris
spp., Leptarrhena pyrolifolia, Lespediza spp.,
Lettuca spp., Leucaena leucocephala, Loudetia simplex,
Lotonus bainesii, Lotus spp., Macrotyloma axillare,
Malus spp., Manihot esculenta, Medicago sativa, Metasequoia
glyptostroboides, Musa sapientum, Nicotianum spp.,
Onobrychis spp., Ornithopus spp., Oryza spp.,
Peltophorum africanum, Pennisetum spp., Persea
gratissima, Petunia spp., Phaseolus spp., Phoenix
canariensis, Phormium cookianum, Photinia spp., Picea
glauca, Pinus spp., Pisum sativum, Podocarpus totara,
Pogonarthria fleckii, Pogonarthria squarrosa, Populus spp.,
Prosopis cineraria, Pseudotsuga menziesii, Pterolobium stellatum,
Pyrus communis, Quercus spp., Rhaphiolepsis umbellata,
Rhopalostylis sapida, Rhus natalensis, Ribes grossularia, Ribes
spp., Robinia pseudoacacia, Rosa spp., Rubus spp.,
Salix spp., Schyzachyrium sanguineum, Sciadopitys
verticillata, Sequoia sempervirens, Sequoiadendron giganteum,
Sorghum bicolor, Spinacia spp., Sporobolus fimbriatus,
Stiburus alopecuroides, Stylosanthos humilis, Tadehagi spp,
Taxodium distichum, Themeda triandra, Trifolium spp.,
Triticum spp., Tsuga heterophylla, Vaccinium spp.,
Vicia spp. Vitis vinifera, Watsonia pyramidata,
Zantedeschia aethiopica, Zea mays, amaranto, alcachofa,
espárragos, brócoli, coles de brúcela, col, canola, zanahoria,
coliflor, apio, col rizada, lino, lenteja, oleaginosas, cebolla,
papa, arroz, soya, paja, remolacha azucarera, caña de azúcar,
girasol, tomate, calabaza, y té, entre otros. Una planta
particularmente preferida es Oriza sativa.
Una "planta" como se utiliza aquí también
significa una célula de planta, un tejido de planta o un órgano de
planta. Un órgano o tejido de planta es cualquier tejido de planta o
cualquier órgano de planta que pueda ser denominado por ser una
parte de una planta o parte de un explante derivado de planta.
El término "cotiledón" significa la hoja de
la semilla que absorbe nutrientes. Para las poáceas y los cereales
el escutelo es el único cotiledón que absorbe endoesperma.
El término "panícula" como se utiliza aquí
significa un grupo de flores junto con el tallo de un planta.
Posiblemente, este grupo de flores consiste de un número de tallos
individuales (racimos) cada uno de los cuales tiene una serie de
flores sencillas a lo largo de su longitud. Para el maíz, las
panículas también se denominan espigas.
El término "retoño" como se utiliza aquí es
un brote de planta: un brote que crece desde la base del tallo,
especialmente el tallo de un césped.
El término "transformación" como se utiliza
aquí, se refiere a la transferencia de un polinucleótido exógeno
dentro de una célula anfitriona, independiente del método utilizado
para la transferencia. El polinucleótido se puede introducir
transitoriamente o establemente en la célula anfitriona y se puede
mantener no integrado, por ejemplo, como un plásmido o
alternativamente se puede integrar en el genoma anfitrión. La célula
de la planta transformada resultante se puede utilizar luego para
regenerar una planta transformada en una forma conocida por un
experto. La transformación mediada por Agrobacterium o agrolística
de las plantas, levaduras, mohos u hongos filamentosos se basa en
la transferencia de parte de las secuencias de vector de
transformación, denominadas T-ADN, al núcleo y en
la integración de dicho T-ADN y en el genoma de
dicho eucariote.
Con "Agrobacterium" significa un miembro de
la Agrobacteriaceae, más preferiblemente Agrobacterium o
Rizobacterium y más preferiblemente Agrobacterium
tumefaciens.
"T-ADN" o ADN transferido,
significa que parte del vector de transformación flanqueado por los
límites el TDA de ADN que es, después de la activación de los genes
Agrobacterium ByR, mellado en los límites del T-ADNy
se transfiere como un ADN monocatenario al núcleo de una célula
eucariótica.
Como se utiliza aquí, "límites de
T-ADN" "región de límite de
T-ADN" o "región de límite" significa el
límite del T-ADN derecho (RB) o el límite izquierdo
(LB). Tal un límite comprende una secuencia de núcleo flanqueada
por una región interna de límite como parte del flanqueo
T-ADN que flanquea el límite y/o un límite de región
externo como parte de la estructura de vector que flanquea el
límite. Un elemento de transferencia del T-ADN
intensificador se ha caracterizado y reside en el límite derecho de
la región externa y se llama "overdrive" (Peralta, Hellmiss
et al., 1986; van Haaren, Sedee et al., 1987).
"Vector de transformación de
T-ADN" o "vector de T-ADN"
significa cualquier vector que abarca una secuencia de
T-ADN flanqueada por un borde de
T-ADN derecho e izquierdo que consiste de por lo
menos las secuencias de un núcleo de borde izquierdo y derecho,
respectivamente, y se utilizan para la transformación de cualquier
célula eucariótica.
Como se utiliza aquí, "planta transgénica"
incluye referencia a una planta que comprende dentro de su genoma
un polinucleótido heterólogo. Generalmente el polinucleótido
heterólogo se integra establemente dentro del genoma de tal manera
que el polinucleótido se pasa a generaciones sucesivas. El
polinucleótido heterólogo se puede integrar en el genoma solo o
como una parte de un vector.
Como se utiliza aquí, el término
"heterólogo" en referencia a un ácido nucleico es un ácido
nucleico que se deriva de una célula u organismo con un fondo
genómico diferente o, si es del mismo fondo genómico se modifica
sustancialmente de su forma natural en composición y/o ambiente
genómico a través de modificación humana deliberada. De acuerdo con
lo anterior, una proteína heteróloga aunque se origina de la misma
especie puede estar sustancialmente modificada por manipulación
humana.
"Transgénico" se utiliza aquí para incluir
cualquier célula, estirpe celular, callo, tejido, parte de planta o
planta, cuyo genotipo se ha alterado mediante la presencia de ácido
nucleico heterólogo que incluye aquellos transgénicos inicialmente
alterados así como aquellos creados por cruces sexuales o
propagación asexual del mismo transgénico inicial.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1. Ubicación in situ de mARN E2Fa
y DPa. Se ven señales de hibridación como puntos negros.
- (a)
- Alta expresión de E2Fa en una sección longitudinal del meristemo apical del brote (SAM) y tejidos de diferenciación circundantes de rábano. La flecha señala el SAM.
- (b)
- Expresión homogénea de DPa en la sección longitudinal del SAM y hojas jóvenes de rábano. La flecha señala el SAM.
- (c)
- Expresión E2Fa en la sección longitudinal a través de un meristemo de raíz (RM) de rábano.
- (d)
- Expresión DPa homogénea en la sección longitudinal a través del RM de rábano.
- (e)
- Sección longitudinal a través de un hipocotilo de una plántula de Arabidopsis. Se detectan los transcritos E2Fa en las células corticales y epidérmicas. La flecha señala a los tejidos de corteza y epidermis.
- (f)
- Sección longitudinal a través de un hipocotilo de una plántula de Arabidopsis etiolada. La expresión es más fuerte en el gancho del hipocotilo de las plántulas que crecen en la oscuridad que en las que crecen a la luz. La flecha señala a los tejidos de corteza y epidermis.
Barras de escala: 50 \mum (a, b), 20 \mum (c
a f).
\newpage
Figura 2. Análisis molecular de plantas de
Arabidopsis que sobreexpresan E2Fa y DPa.
- (a)
- transferencia de gel de ARN de plantas transgénicas E2Fa 35S CaMV independientes.
- (b)
- transferencia de gel de ARN de plantas transgénicas DPa 35S CaMV independientes.
- (c)
- Relación de la detención del crecimiento observada con la presencia de ambos transgenes E2Fa 35S CaMV y DPa 35S CaMV. 1, Planta tipo silvestre; 2, cruce entre una planta E2Fa 35S CaMV y una planta de control; 3, cruce entre una planta DPa 35S CaMV y una planta de control; 4 a 13, individuos hermanos de un cruce entre una planta E2Fa 35S CaMV homocigota y un DPa 35S CaMV heterocigoto. Las líneas marcadas con * muestran hojas rizadas y cotiledones y se detienen en la etapa de plántula. Se prueba la presencia de los trangenes mediante PCR.
- (d)
- Niveles de transcritos de genes de fase S en plantas E2Fa/DPa CaMV 35S y de control.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 3. Fenotipo de plantas que sobreexpresan
E2Fa y DPa.
- (a)
- Control no transformado.
- (b)
- Planta que sobreexpresa E2Fa.
- (c)
- Planta que sobreexpresa E2Fa/DPa.
Se fotografían todas las plantas en la misma
magnificación 12 días después de siembra.
Barra de escala: 0.25 cm.
Los dos cotiledones en (a) y (b) se muestran en
la esquina inferior izquierda y superior derecha.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 4. Análisis microscópico de plantas que
sobreexpresan E2Fa/Dpa y E2Fa.
- (a), (e)
- Epidermis abaxial de plantas de control de 5 semanas de edad y 3 semanas de edad, respectivamente.
- (b), (f)
- Epidermis abaxial de una planta E2Fa de 5 semanas de edad y 3 semanas de edad, respectivamente.
- (c), (d)
- Empalizada de una planta E2Fa y una planta de control de 5 días de edad, respectivamente.
- (g)
- Hipocotilo de planta de control de 12 días de edad.
- (h)
- Hipocotilo de planta E2Fa de 12 días de edad.
- (i)
- Hipocotilo de planta E2Fa/DPa de 12-días de edad;
- (j)
- Hipocotilo de una planta E2Fa/DPa de 3 semanas de edad;
- (k), (i)
- Micrografías de exploración de (g) e (i).
La flecha en (d) y (f) señala a las paredes de
la célula sintetizadas novedosas; los asteriscos en (g) y (h)
indican líneas celulares en los que se forman estomas.
Barras de escala: 100 \mum (a a d, k, l) y 50
\mum (e a j).
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 5. Nivel ploide de ADN en plantas
transgénicas E2Fa/DPa 35S CaMV y de control.
- (a)
- Tricomo de una planta de control.
- (b)
- Tricomo de una planta transgénica E2Fa/DPa. Las flechas señalan al núcleo.
- (c)
- Distribución ploide de control (izquierda) y plántulas transgénicas E2Fa/DPa (derecha) cosechadas 12 días después de germinación.
- (d)
- Cuantificación de los resultados mostrados en (c).
Barra de escala: 50 \mum; (a) y (b) tienen la
misma magnificación.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 6. La secuencia de nucleótido del gen
E2Fa de Arabidopsis (SEQ ID NO 1) y la secuencia de aminoácido (SEQ
ID NO 2) del marco de lectura abierto que codifica la proteína E2Fa
de Arabidopsis.
Figura 7. La secuencia de nucleótido del gen DPa
de Arabidopsis (SEQ ID NO 3) y la secuencia de aminoácido (SEQ ID
NO 4) del marco de lectura abierto que codifica la proteína DPa de
Arabidopsis.
Figura 8. La secuencia de nucleótido de una
variante de empalme del gen E2Fa de Arabidopsis (SEQ ID NO 19) y la
secuencia de aminoácido (SEQ ID NO 20) del marco de lectura abierto
que codifica la proteína variante E2Fa de Arabidopsis.
Figura 9. Alineación de secuencia de las dos
proteínas E2Fa de la presente invención, la SEQ ID NO 2, comparada
con la SEQ ID NO 20 (CDS009 E2Fa) y comparada con la secuencia
forman la base de datos pública bajo el número de acceso Genbank
CAC15486. Se hace la alineación de secuencia con el programa Align X
como un componente del software Vector NTI Suite 5.5, utilizando el
algoritmo Clustal W (NucleicAcid Research, 22 (22):
4673-4680,
1994).
1994).
Figura 10. Alineación de secuencia de los dos
ácidos nucleicos E2Fa de la presente invención, la SEQ ID NO 1,
comparada con la SEQ ID NO 19 (CDS009 E2Fa) y con la secuencia
forman la base de datos pública bajo el número de acceso Genbank
AJ294534. Se hace la alineación de secuencia con el programa Align X
como un componente del Vector NTI Suite 5.5, utilizando el
algoritmo Clustal W (NucleicAcid Research, 22 (22):
4673-4680, 1994).
Figura 11. Presentación de los datos de
evaluación de producción de semilla de dos líneas de arroz
transgénicas, transformadas con el gen E2Fa según se codifica por
la SEQ ID NO 19. Se denominan las dos líneas de planta como 1 y 2
en el eje X. Para cada una de las dos líneas de arroz, se cosechan y
se pesan las semillas de varias plantas positivas (círculos
sólidos) y varias plantas negativas (círculos vacíos). Se mide el
rendimiento de semilla en gramos y se representan los valores
correspondientes en el eje Y. Se muestra la diferencia menos
significativa como una barra vertical y se muestran los valores
promedio de las plantas positivas y las plantas negativas como una
flecha sólida o vacía respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se amplifican las regiones que codifican E2Fa y
DPa mediante PCR con los cebadores 5'- GGCCATGGCCGGTGT
CGTACGATCTTCTCCCGA-3' (SEQ ID NO 5) y 5'-GGGGATCCTCATCTCGGGGTTGAGT-3' (SEQ ID NO 6) o 5'-GGCCATGGAGTTGTTTGTCACTCC-3' (SEQ ID NO 7) y 5'-GGAGATCTTCAGCGAGTATCAATGG-3' (SEQ ID NO 8), respectivamente. Se corta el fragmento PCR E2Fa obtenido con NcoI y BamHI y se digiere el fragmento DPa con NcoI y BgIII. Posteriormente, se clonan los fragmentos de restricción entre el promotor 35S CaMV y la región no traducida 3' sintasa nopalina (NOS) en los sitios NcoI y BamHI de PH35S (Hemerly et al., 1995), lo que resulta en los vectores PH35SE2Fa y PH35SDPa. Se libera el casete 35S-E2Fa-Nos CaMV mediante EcoRI y XbaI y se clona en los sitios EcoRI y XbaI de pBinPLUS (van Engelen et al., 1995), lo que resulta en el vector pBINE2Fa, mientras que se libera el casete 35S-DPa-Nos CaMV mediante EcoRI y XbaI y se hacen extremos romos en el sitio SmaI de PgSC1704, lo que resulta en el vector PgSCDPa. Se movilizan ambos pBinE2Fa y PgSCDPa por el pRK2013 de plásmido auxiliar en el C58C1Rif^{R} Agrobacterium tumefaciens que alberga el pMP90 de plásmido (Koncz and Schell, 1986). Se transforma la Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. ecotipo Columbia mediante el método de inmersión floral (Clough and Bent, 1998).Se obtienen las plantas CaMV 35S DPa y CaMV 35S E2Fa transgénicas en medio que contiene canamicina o higromicina, respectivamente. Para todos los análisis, se hacen crecer las plantas bajo un fotoperiodo de 16 hr a la luz/8 hr en la oscuridad a 22ºC en medio de germinación (Valvekens et al., 1988). Se desarrolla el análisis de transferencia Northern como se describe (De Veylder et al., 2001). Se prueba la relación del fenotipo con la presencia de transgenes al moler plantas individuales en 400 \mul de amortiguador de extracción de ADN (200 mM de Tris-HCl, pH 7.5, 205 mM de NaCl, 25 de mM ácido etilenodiaminatetraacético, 0.5% de dodecil sulfato de sodio). Se centrifugan los extractos a 18,000xg durante 2 minutos. Se precipita el ADN al agregar 300 \mul de isopropanol a 300 \mul de extracto y centrifugación durante 10 minutos a 18,000xg. Se enjuaga el sedimento con 70% de etanol, se seca al aire, y se resuspende en 100 \mul de agua. Para análisis PCR, se utiliza 5 \mul con los cebadores anteriormente mencionados. Debido a que los transgenes no contienen intrones, ellos se podrían distinguir del gen E2Fa y DPa endógeno con base en su tamaño.
CGTACGATCTTCTCCCGA-3' (SEQ ID NO 5) y 5'-GGGGATCCTCATCTCGGGGTTGAGT-3' (SEQ ID NO 6) o 5'-GGCCATGGAGTTGTTTGTCACTCC-3' (SEQ ID NO 7) y 5'-GGAGATCTTCAGCGAGTATCAATGG-3' (SEQ ID NO 8), respectivamente. Se corta el fragmento PCR E2Fa obtenido con NcoI y BamHI y se digiere el fragmento DPa con NcoI y BgIII. Posteriormente, se clonan los fragmentos de restricción entre el promotor 35S CaMV y la región no traducida 3' sintasa nopalina (NOS) en los sitios NcoI y BamHI de PH35S (Hemerly et al., 1995), lo que resulta en los vectores PH35SE2Fa y PH35SDPa. Se libera el casete 35S-E2Fa-Nos CaMV mediante EcoRI y XbaI y se clona en los sitios EcoRI y XbaI de pBinPLUS (van Engelen et al., 1995), lo que resulta en el vector pBINE2Fa, mientras que se libera el casete 35S-DPa-Nos CaMV mediante EcoRI y XbaI y se hacen extremos romos en el sitio SmaI de PgSC1704, lo que resulta en el vector PgSCDPa. Se movilizan ambos pBinE2Fa y PgSCDPa por el pRK2013 de plásmido auxiliar en el C58C1Rif^{R} Agrobacterium tumefaciens que alberga el pMP90 de plásmido (Koncz and Schell, 1986). Se transforma la Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. ecotipo Columbia mediante el método de inmersión floral (Clough and Bent, 1998).Se obtienen las plantas CaMV 35S DPa y CaMV 35S E2Fa transgénicas en medio que contiene canamicina o higromicina, respectivamente. Para todos los análisis, se hacen crecer las plantas bajo un fotoperiodo de 16 hr a la luz/8 hr en la oscuridad a 22ºC en medio de germinación (Valvekens et al., 1988). Se desarrolla el análisis de transferencia Northern como se describe (De Veylder et al., 2001). Se prueba la relación del fenotipo con la presencia de transgenes al moler plantas individuales en 400 \mul de amortiguador de extracción de ADN (200 mM de Tris-HCl, pH 7.5, 205 mM de NaCl, 25 de mM ácido etilenodiaminatetraacético, 0.5% de dodecil sulfato de sodio). Se centrifugan los extractos a 18,000xg durante 2 minutos. Se precipita el ADN al agregar 300 \mul de isopropanol a 300 \mul de extracto y centrifugación durante 10 minutos a 18,000xg. Se enjuaga el sedimento con 70% de etanol, se seca al aire, y se resuspende en 100 \mul de agua. Para análisis PCR, se utiliza 5 \mul con los cebadores anteriormente mencionados. Debido a que los transgenes no contienen intrones, ellos se podrían distinguir del gen E2Fa y DPa endógeno con base en su tamaño.
\vskip1.000000\baselineskip
Para evaluar la importancia de la expresión E2Fa
y DPa en las células que se dividen y endoreduplican, se generan
plantas de Arabidopsis thaliana transgénicas que contienen ya
sea el gen DPa o el E2Fa bajo el control del promotor 35S del virus
mosaico de la coliflor (CaMV) constitutivo. Fuera de las líneas
transgénicas múltiples, se seleccionan dos líneas CaMV 35S E2Fa
independientes (Figura 2a) y dos CaMV 35S DPa (Figura 2b), que
contienen solo un locus T-ADN. Mientras que las
plantas transgénicas DPa son morfológicamente idénticas a las
plantas de de control no transformadas, las plantas E2Fa de 3
semanas de edad tienen cotiledones alargados (Figuras 3a y 3b
y
Tabla D).
Tabla D).
Los valores indican la media \pm DE. ^{a}Se
hacen crecer plantas transgénicas y no transformadas (n = 12) en el
mismo plato de Petri para excluir las diferencias en las condiciones
de crecimiento. Se confirma el incremento observado en el tamaño
del cotiledón en por lo menos tres experimentos independientes. Se
determina el número de células epidérmicas adaxiales por la
proporción del tamaño del cotiledón con el tamaño de la célula
epidérmica adaxial, que se mide para por lo menos 50 células en cada
cotiledón. ^{b}Se mide el número de células adaxiales antes de
germinación al contar todas las células de por lo menos cinco
cotiledones diferentes por fila.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Para la microscopía electrónica de exploración,
se fijan plántulas durante la noche en 4% de paraformaldehído y 1%
de glutaraldehído en amortiguador de fosfato 0.1 M (pH 7.2), seguido
por una etapa de postfijación en 2% de tetraóxido de osmio y por
una serie de etanol graduado. Se lleva a cabo secado de punto
crítico en dióxido de carbono líquido. Se montan estas plántulas en
tocones, cubriéndolas por rociado con oro, y se examinan con un
microscopio de exploración (JEOL Ltd., Tokio, Japón) con un voltaje
acelerado de 10 kV. Se desarrolla teñido fluorescente de núcleos al
fijar las plántulas en una mezcla de 9:1 (v/v) etanol y ácido
acético. Después que se han enjuagado las muestras, se tiñen
durante 24 horas con 0.1 \mug/ml de
4',6-diamidino-2-fenilindol
y se analizan con un microscopio confocal invertido LSM510 (Zeiss,
Jena, Alemania) con un objetivo X20
plan-apochromat.
\vskip1.000000\baselineskip
Los cotiledones de mayor tamaño pueden resultar
de células más grandes o de un número mayor de células. Para
discriminar entre estas posibilidades, se mide el tamaño de la
célula epidérmica adaxial. Notablemente, en las células de
cotiledón de línea que sobreexpresa E2Fa más fuerte es menos de la
mitad del tamaño de las células de control. Como una consecuencia
de un incremento en el tamaño del cotiledón y una reducción en el
tamaño de la célula, los cotiledones transgénicos contienen casi
tres veces mayor cantidad de células que las plantas de control
(Tabla D). Debido a que el número de células epidérmicas en los
cotiledones es aproximadamente el mismo que en las semillas de
control y las plantas transgénicas (Tabla D), las células extra
deberían originarse a partir de divisiones celulares adicionales
que ocurren después de la germinación de la semilla. Cinco días
después de la siembra, las células de cotiledón epidérmicas
adaxiales de plantas tipo silvestre se diferencian en células
pavimentosas con forma de ficha de puzle y estomas (Figura 4a). En
las líneas que sobreexpresan E2Fa de 5 días de edad solo se pueden
observar células poligonales y pocos estomas (Figura 4b). De forma
similar, en lugar del tejido empalizado típico que consiste de
células redondas con espacios intracelulares, las células oclusivas
E2Fa 35S CaMV son todavía poligonales sin espacios ni divisiones
intracelulares (Figuras 4c y 4d). Estos resultados indican que los
niveles de E2Fa intensificados prolongan el periodo de la división
celular, una situación reminiscente a aquella en los mamíferos
cuando la sobreexpression del E2F1 inhibe la diferenciación de las
células en los mioblastos y megacariocitos (Wang et al.,
1995; Guy et al.,
1996).
1996).
\vskip1.000000\baselineskip
En el hipocotilo de plantas transgénicas
35S-E2Fa, las líneas celulares que consisten de
células epidérmicas normales alternas con líneas que muestran
claramente divisiones extracelulares, sugiere que el E2Fa trabaja
en una forma específica del tipo de célula (Figuras 4g y 4h). Las
líneas celulares que dividen ectópicamente son aquellas en las que
se forman estomas normalmente (Berger et al., 1998), lo que
indica que el E2F y/o E2Fa/DPa puede solo sostener la división
celular en las células que son competentes para división.
\vskip1.000000\baselineskip
En las plantas de control de 3 semanas, todas
las células de cotiledón epidérmicas se diferencian completamente y
tienen forma de ficha de puzle (Figura 4e). En contraste, en los
cotiledones que sobreexpresan E2Fa de la misma edad se observan
numerosas paredes celulares nuevamente formadas con una apariencia
recta (Figura 4f). Así, el E2Fa puede estimular las células
diferenciadas para reingresar al programa de ciclo celular.
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis microscópico muestra que el fenotipo
visto en las líneas que sobreexpresan E2Fa se intensifica
fuertemente en las plantas E2Fa/DPa 35S CaMV. Los cotiledones y
hojas de plantas de 2 semanas de edad consisten completamente de
células pequeñas formadas irregularmente, que nunca se habían visto
en los tejidos de tipo silvestre de la misma edad (datos no
mostrados). También en el hipocotilo, se observan muchas más
divisiones celulares, lo que resulta en islas de pequeñas células
irregulares (Figura 4i). Este fenotipo llega a ser más pronunciado
en hipocotilos más viejos (Figura 4j). La microscopía electrónica de
exploración muestra que se interrumpe totalmente el patrón de
diferenciación epidérmico típico encontrado en los hipocotilos tipo
silvestre, exhibiendo una mezcla de células isodiamétricas pequeñas
y células abultadas alargadas (Figuras 4k y 4l). Por lo tanto se
puede utilizar la sobreexpresión E2F y DP para alterar la forma de
la célula.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se desarrollan hibridaciones in situ como
se describe (de Almeida Engler et al., 1991). No solo se
utiliza plántulas de Arabidopsis thaliana sino también
Raphanus sativus (rábano) para obtener más tejido para
ubicación de transcrito más precisa. Se utilizan secuencias que
codifican E2Fa y DPa de longitud completa para generar sondas de
ARN etiquetadas [^{35}S]. No se observan señales en las
hibridaciones de control. Se obtienen micrografías al superponer
las imágenes digitales de campo oscuro y brillante.
Se colocan tejidos para examen histológico
durante la noche en etanol para remover la clorofila, posteriormente
se aclara, se monta en un portaobjetos para microscopio, y se
almacena en ácido láctico para microscopía. Se observan células
ópticas de contraste de interferencia diferencial en un microscopio
DMLB (Leica, Wetzlar, Alemania).
\vskip1.000000\baselineskip
De esta manera, se revela la presencia de ambos
transcritos E2Fa y DPa en el meristemo apical de los brotes y los
tejidos de diferenciación circundantes (Figuras 1a y 1b). En la
raíz, las señales de hibridación son las más fuertes en la región
apical de la raíz en donde las células se dividen activamente y
llegan a ser más débiles que las células que salen de la región
meristemática (Figuras 1c, y 1d). La coexpresión de E2Fa y DPa en
los tejidos de división sugiere que se requiere el complejo E2Fa/DPa
para la progresión del ciclo celular. Se detectan los transcritos
E2Fa también en la epidermis y corteza del hipocotilo de plantas que
crecen a la luz de 5 días de edad (Figura 1e). En esta etapa, se
despoja la corteza de la división celular, pero experimenta
endoreduplicación extensa, que se intensifica en las plantas que
crecen en la oscuridad (Gendreau et al., 1997; Raz
andKoorneef, 2001). En forma similar, la señal de hibridación E2Fa
es más fuerte en las células del hipocotilo cortical de las plantas
que crecen en la oscuridad (Figura 1f), lo que indica que el E2Fa
puede tener una función en la regulación de endoreduplicación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se pican las plantas con una hoja de afeitar en
500 \mul de 45 mM de MgCl_{2}, 30 mM de citrato de sodio, 20 mM
de ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (pH
7), y 1% de Triton X-100 (Galbraith et al.,
1991). Se filtra el sobrenadante sobre una malla de 30 \mum y se
agrega 1 \mul de
4',6-diamidino-2-fenilindol
a partir de una solución madre de 1 mg/ml. Se analizan los núcleos
con el citómetro de flujo BRYTE HS y el software WinBryte
(Bio-Rad, Hercules, CA,
USA).
USA).
\vskip1.000000\baselineskip
Las células pavimentosas de Arabidopsis exhiben
una amplia variación en el tamaño nuclear debido a la ocurrencia de
la endoreduplicación (Melargno et al., 1993). En las plantas
transgénicas E2Pa/DPa, se observan la mayoría de núcleos pequeños
en las células pavimentosas en el cotiledón, lo que sugiere que se
suprime en este tejido la endoreduplicación (datos no mostrados).
En contraste, las células corticales y oclusivas del hipocotilo y
cotiledón, respectivamente, se enriquecen con núcleos más grandes.
El tamaño nuclear de los tricomas maduros también se ha
incrementado dramáticamente (Figuras 5a y 5b). Estos datos indican
que a pesar de la activación de la división celular, el E2Fa/DPa
induce la endoreduplicación en una forma específica del tipo
celular.
\vskip1.000000\baselineskip
Se confirma la endoreduplicación extensa en las
plantas E2Pa/DPa 35S CaMV mediante análisis citométrico de flujo.
Las plántulas transgénicas de dos semanas de edad muestran dos
endociclos adicionales cuando se comparan con las plantas de
control (Figuras 5c y 5d). También en la expresión ectópica de la
Drosophila de E2F/DP es suficiente para activar la replicación de
ADN precoz en los tejidos de endoreduplicación (Britton and Edgar,
1998). Se puede mediar esta replicación por vía de la inducción
transcriptional de Ciclina E, que lleva a la formación del complejo
de E/CDK2 de ciclina específica de fase S que es un regulador
central para la endoreduplicación (Edgar and
Orr-Weaver, 2001) Aunque no ha sido identificado
ningún homólogo claro de la ciclina E en el genoma de Arabidopsis,
la activación de un complejo CDK específico de fase S en el
Endosperma del maíz luego del inicio de la endoreduplicación (Grafi
and Larkins, 1995) sugiere que las plantas regulan su endociclo en
una forma similar a aquella de la Drosophila. También, la
inactivación del homólogo Rb del maíz mediante fosforilación
soporta que la expresión E2Fa/DPa tenga una función en el endociclo
de la planta (Grafi et al., 1996).
\vskip1.000000\baselineskip
Aunque los efectos de la sobreexpresión E2Fa/DPa
en células de tejidos fundamentales y epidérmicos parecen ser
diferentes, los fenotipos observados surgen probablemente a través
de un mecanismo común. El incremento en el nivel de ploidía en el
tejido fundamental indica que el E2Fa/DPa ectópico estimula la
proliferación del ciclo celular al activar la entrada de la fase S.
Considerando que, después de la duplicación del ADN las células
epidérmicas pueden proceder en mitosis, las células del tejido
fundamental pueden carecer de un factor importante para la
progresión a través de la fase M y se pueden estimular para
reingresar a la fase S, que lleva a incrementos en los niveles de
ploidía. Alternativamente, las células que se dividen mitóticamente
pueden contener un inhibidor de endoreduplicación. La entrada de
fase S mediada por E2Fa/DPa se puede deber a la inactivación de Rb
mediante titulación externa, aliviando por lo tanto la represión
transcripcional mediada por Rb de genes específicos de fase S.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Se aíslan ARN de plantas 8 días después de
siembra utilizando el reactivo Trizol (Amersham Pharmacia Biotech,
Little Chalfont, UK). Se prepara primero una hebra de cADN a partir
de 3 \mug de ARN total con el equipo RT Superscript II (Gibco
BRL, Gaithersburg, MD, USA) y oligo(dT) (Chabouté et
al., 2000) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se
utiliza una alícuota de 0.25 \mul del volumen de reacción de
transcripción inversa total (20 \mul) como una plantilla en una
amplificación PCR mediada por RT semicuantitativo, lo que asegura
que la cantidad de producto amplificado permanece en proporción
lineal a la plantilla inicial presente en la reacción. Se separan
diez microlitros de la reacción PCR en 0.8% de un gel de agarosa y
se transfieren en membranas Hybond N+ (Amersham Pharmacia Biotech).
Se hibridan las membranas a 65ºC con sondas etiquetadas con
fluoresceína (primer módulo aleatorio de Imágenes de Genes;
Amersham Pharmacia Biotech). Se detectan las bandas hibridadas con
el módulo de detección CDP Star (Amersham Pharmacia Biotech). Los
cebadores utilizados son
5'-TATGGCTGTCTGGGGTTTC-3' (SEQ ID
NO 9) y 5'-CAACTTGAACGTGTGGTTGG-3'
(SEQ ID NO 10) para pol\alpha ADN (No. de acceso GenBank
AB020742), 5' -TCGAGTCGGTTGGAAGAAAG-3' (SEQ ID NO
11) y 5'-CTCAT GAACCATAGCCGTCA-3'
(SEQ ID NO 12) para ORC (AL049730),
5'-GCACCGTCAACTGTTGTTTG-3' (SEQ ID
NO 13) y 5'-CAAGCCTCTCCTGCA
GAATC-3' (SEQ ID NO 14) para CDC6 (AC005496), 5' -AGGCTAATGAGGGAGGGGTA-3' (SEQ ID NO 15) y 5'-GGAACTGGCCTCATTTGTGT-3' (SEQ ID NO 16) para MCM5 (AC004483), y GTGCCAATCTACGAGGGTTTC (SEQ ID NO 17) y CAATGGGACTAAAACGAAAA (SEQ ID NO 18) para ACT2 (U41998).
GAATC-3' (SEQ ID NO 14) para CDC6 (AC005496), 5' -AGGCTAATGAGGGAGGGGTA-3' (SEQ ID NO 15) y 5'-GGAACTGGCCTCATTTGTGT-3' (SEQ ID NO 16) para MCM5 (AC004483), y GTGCCAATCTACGAGGGTTTC (SEQ ID NO 17) y CAATGGGACTAAAACGAAAA (SEQ ID NO 18) para ACT2 (U41998).
\vskip1.000000\baselineskip
Previamente, se ha mostrado la secuencia de
unión de consenso E2F por ser conservada en plantas y mamíferos
(Chabouté et al., 2000). Se pueden encontrar estas secuencias
en los promotores de los genes de Arabidopsis de los cuales se
regulan las contrapartes de mamíferos mediante E2F/DP (Leone et
al., 1998) e incluyen ADN pol\alpha, ORC, MCM, y CDC6. Se
compara el nivel de transcrito de estos genes en plantas
transgénicas E2Fa/DPa y de control mediante análisis de PCR de
trascripción inversa (RT) semicuantitativo. Mientras que el nivel
de expresión del gen de control (actina 2) no es influenciado por
sobreexpresión E2Fa/DPa, se regulan ascendentemente de forma
dramática todos los genes de fase S (Figura 2d). Estos datos
demuestran que el E2Fa/DPa regula la expresión de los genes de fase
S en Arabidopsis y sugiere que los fenotipos observados resultan de
la expresión incorrecta de estos
genes.
genes.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Para analizar si en las plantas cooperan las
proteínas DP y E2F, se cruzan plantas homocigotas para el gen E2Fa
35S CaMV con líneas DPa 35S CaMV heterocigotas. La mitad de la
descendencia se desarrolla normalmente, mientras que el 50% de las
plantas exhiben cotiledones y hojas rizadas a lo largo de su eje
próximo distal (Figura 3c). El análisis de reacción de cadena de
polimerasa (PCR) en plantas individuales confirma que las plantas
con el fenotipo de hoja rizada contienen ambas construcciones
35S-E2Fa CaMV y 35S-DPa CaMV,
mientras que los hermanos fenotípicamente normales contienen solo
el gen E2Fa 35S CaMV (Figura 2c).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
La expresión ectópica del E2Fa/DPa resulta en la
proliferación celular no controlada en tejidos diferenciados. Por
consiguiente, las plantas se detienen en el crecimiento temprano
durante el desarrollo post-embriónico. Por lo
tanto, el factor de transcripción E2Fa/DPa es un componente crucial
que regula la división celular en las plantas. Su actividad tiene
que ser controlada en una forma rigurosa. El efecto inhibidor de
crecimiento anteriormente mencionado está en agudo contraste con el
fenotipo encontrado luego de la sobreexpresión de las ciclinas
Arath; CYCB1;1 y Arath;CYCD; 2, ambas promueven el crecimiento de la
planta (Doerner et al., 1996; Cockcroft et al.,
2000). Una principal diferencia entre las líneas de sobreproducción
de ciclina y las plantas transgénicas E2Fa/DPa es que las
anteriores en los tejidos diferenciados de otra forma. Así, en
contraste a CYCD2;1 y CYCB1;1, el E2Fa/DPa anula las señales que
regulan la diferenciación celular. El efecto negativo observado en
el crecimiento muestra que el balance correcto entre la división y
la diferenciación es vital para el desarrollo de la planta. Las
plantas se pueden detener en el crecimiento como una consecuencia de
su diferenciación retrasada o debido a que se interrumpe la
señalización celular esencial requerida entre diferentes capas de
tejido. Postulamos que las plantas regulan su diferenciación a
través de la modulación de la actividad E2Fa/DPa. La decisión entre
la proliferación y la diferenciación se basa en la expresión
concertada de genes que determinan el destino celular. La expresión
incorrecta de los genes de ciclo celular inducida por E2Fa/DPa
puede reprimir la inducción de genes necesaria para la
diferenciación, lo que implica que la diferenciación celular
requiere la inactivación de la actividad transcripcional E2Fa/DPa.
La acumulación de proteínas Rb activas en los tejidos de hoja
diferenciados sugiere que, como en los mamíferos, esta inactivación
se controle por Rb (Huntley et al., 1998). No obstante,
nuestros datos indican que se pueden utilizar las rutas E2Fa/DPa
para dirigir la división celular en las plantas en una forma
específica, lo que permite que se ajuste el rendimiento y la
arquitectura.
arquitectura.
\newpage
Ejemplo
8
En las plantas dicotiledóneas, la sobreexpresión
del gen E2Fa lleva a cotiledones agrandados. Por el contrario a las
plantas dicotiledóneas, donde el meristemo se agranda entre 2
cotiledones, en monocotiledóneas el meristemo agrandado aparece
lateralmente orientado al escutelo. Cuando el escutelo se
diferencia, se forma el coleóptilo y circunda el meristemo apical
del brote (SAM), tomando una forma tubular. El SAM inicia las hojas,
cada una opuesta a la anterior. Este meristemo vegetativo primero
se transforma en un meristemo de inflorescencia, que genera el
meristemo floral. Para analizar el efecto de la sobreexpresión de
E2Fa en plantas monocotiledóneas, se clona el gen y se liga
operablemente al promotor de oleosina, con el fin de obtener una
construcción expresable en semillas de monocotiledóneas.
\vskip1.000000\baselineskip
Los inventores aíslan una variante de empalme
del E2F como se representa en la SEQ ID NO 1. Esta variante de
empalme se representa aquí como SEQ ID NO 9 y solo difiere en dos
codones de la SEQ ID NO 1, lo que resulta en la alternativa, la
proteína E2Fa más pequeña representada aquí como la SEQ ID NO 10. A
la variante de empalme E2Fa aislada (SEQ ID NO 9) se le da el
número de designación interno CDS009 y se clona en el vector p0426
que lleva un marcador seleccionable y el promotor de oleosina para
expresión específica de semilla del transgen E2Fa. Al vector de
expresión de planta resultante se le da el número de referencia
interno p1134.
\vskip1.000000\baselineskip
Se desarrollan todos los procesos de ADN de
acuerdo con los protocolos estándar (Maniatis T, Fritsch EF and
Sambrook J (1982) Molecular Cloning: a laboratory manual, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York).
\vskip1.000000\baselineskip
Se amplifica la secuencia E2F de Arabidopsis
(Número de Acceso: AJ294534) de cultivos en suspensión celular de
colección de cADN de Arabidopsis Thaliana mediante PCR
utilizando polimerasa de ADN Platinum Pfx (Invitrogen) y los
siguientes cebadores: Codificante, que incluye attB1 5'
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTT
CACAATGTATTGCTCTTCTTCGATGC 3' (SEQ ID NO 21) y Anti-codificante, que incluye attB2 5'GGGGAC
CACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGCTTGGTGTCATCTTGAGAATAG3' (SEQ ID NO 22).
CACAATGTATTGCTCTTCTTCGATGC 3' (SEQ ID NO 21) y Anti-codificante, que incluye attB2 5'GGGGAC
CACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGCTTGGTGTCATCTTGAGAATAG3' (SEQ ID NO 22).
Las condiciones para PCR son como sigue: 1 ciclo
de 2 minutos de desnaturalización a 94ºC, 35 ciclos de 1 minuto de
desnaturalización a 94ºC, 1 minuto de hibridación a 58ºC y 2 minutos
de amplificación a 68ºC, y 1 ciclo de 5 minutos a 68ºC. Se aísla un
fragmento prominente de aproximadamente el tamaño esperado a partir
de un gel y se purifica utilizando el equipo de Recuperación de ADN
de Gel Zymoclean (Zymo Research, Orange, California).
Se utiliza el fragmento PCR purificado en una
reacción GatewayTM BP estándar (Invitrogen) utilizando
pDONR201 como un vector receptor. Se confirma la identidad y composición de par base del inserto mediante secuenciación. El plásmido resultante se prueba con calidad utilizando digestos de restricción y se da la designación p0426 (clon de entrada), se obtiene pDONR201, un vector que hace parte de la tecnología de clonación GatewayTM, de Invitrogen. P0426, de acuerdo con la terminología Gateway TM, es un "clon de entrada", y se utiliza como tal en una reacción GatewayTM LR estándar, con un vector de destino que lleva la poleosina. El vector resultante de la reacción GatewayTM LR es p1134. Se controla este vector por análisis de digesto de restricción y se utiliza en la transformación de Arabidopsis thaliana. Este vector contiene como elementos funcionales dentro de la región T-ADN un gen marcador seleccionable y un "casete Gateway" destinado para la clonación LR de las secuencias de interés. La expresión de estas secuencias de interés, luego se recombinada en p1134, y se controlan mediante el promotor de oleosina.
pDONR201 como un vector receptor. Se confirma la identidad y composición de par base del inserto mediante secuenciación. El plásmido resultante se prueba con calidad utilizando digestos de restricción y se da la designación p0426 (clon de entrada), se obtiene pDONR201, un vector que hace parte de la tecnología de clonación GatewayTM, de Invitrogen. P0426, de acuerdo con la terminología Gateway TM, es un "clon de entrada", y se utiliza como tal en una reacción GatewayTM LR estándar, con un vector de destino que lleva la poleosina. El vector resultante de la reacción GatewayTM LR es p1134. Se controla este vector por análisis de digesto de restricción y se utiliza en la transformación de Arabidopsis thaliana. Este vector contiene como elementos funcionales dentro de la región T-ADN un gen marcador seleccionable y un "casete Gateway" destinado para la clonación LR de las secuencias de interés. La expresión de estas secuencias de interés, luego se recombinada en p1134, y se controlan mediante el promotor de oleosina.
\vskip1.000000\baselineskip
Se descascarillan semillas secas maduras del
cultivo japónico de arroz Taipei. Se lleva a cabo esterilización al
incubar por un minuto en 70% de etanol, seguido por 30 minutos en
0.2% de HgCl2, seguido por un lavado de 15 minutos 6 veces con agua
destilada estéril. Las semillas estériles luego se hacen germinar en
un medio que contiene 2,4-D (medio de inducción de
callo). Después de la incubación en la oscuridad durante cuatro
semanas, se práctica escisión al callo derivado del escutelo,
embriogénico, y se propaga en el mismo medio. Después de dos
semanas se multiplican o propagan los callos mediante subcultivo en
el mismo medio durante otras 2 semanas. Se subcultivan las piezas
de callo embriogénicas en medio fresco 3 días antes de cocultivo
(para reforzar la actividad de la división celular). Se utiliza la
cepa de Agrobacterium LBA4404 que alberga vectores
T-ADN binarios para cocultivo. Se inocula el
Agrobacterium en medio AB con los antibióticos apropiados y se
cultiva durante 3 días a 28ºC. Luego se recolectan las bacterias y
se suspenden en medio de cocultivo líquido a una densidad de
aproximadamente 1 (OD600). Luego se transfiere la suspensión a un
plato de petri y se sumergen los callos en la suspensión durante 15
minutos. Luego se manchan en seco los tejidos de callo sobre un
papel de filtro se transfieren a medio de cocultivo solidificado y
se incuban durante 3 días en la oscuridad a 25ºC. Se hacen crecer
los callos cocultivados en medio que contiene 2,4-D
durante 4 semanas en la oscuridad a 28ºC en la presencia de una
concentración adecuada del agente selectivo. Durante este periodo,
se hacen crecer rápidamente islas de callos resistentes
desarrolladas. Después de la transferencia de este material a un
medio de regeneración e incubación a la luz, se libera el potencial
embriogénico y se desarrollan los brotes en las siguientes cuatro a
cinco semanas. Se realiza escisión a los brotes de los callos y se
incuban durante 2 a 3 semanas en un medio que contiene auxina de la
cual ellos se transfieren al suelo. Se hacen crecer los brotes
endurecidos bajo alta humedad y días cortos en un invernadero. Luego
se cultivan las semillas tres a cinco meses después de trasplante.
El método produce transformantes de locus sencillo a un índice de
más del 50% (Aldemita and Hodges 1996, Chan et (Aldemita and Hodges
(1996) Planta 199, 612-617; Chan et al.
(1993) Plant Mol. Biol 22, 491-506; Hiei et
al. (1994) Plant J. 6, 271-282).
\vskip1.000000\baselineskip
Se generan aproximadamente 15 a 20
transformantes T0 independientes. Se transfieren los transformantes
principales de las cámaras de cultivo de tejido a un invernadero
para crecimiento y cosecha de la semilla T1. Se retienen cinco
eventos de los cuales la progenie T1 segrega 3:1 para la
presencia/ausencia del transgen. Para cada uno de estos eventos, se
seleccionan 10 plántulas T1 que contienen el transgen (hetero- y
homo-cigotas), y 5 plántulas T1 que carecen de
transgen (nulizigotas), mediante PCR.
Se transfieren las plantas T1 seleccionadas a un
invernadero. Cada planta recibe una etiqueta de código de barras
única para vincular de forma inequívoca los datos de fenotipo a la
planta correspondiente. Se hacen crecer las plantas T1
seleccionadas en el suelo en macetas de 10 de diámetro bajo las
siguientes configuraciones ambientales: fotoperiodo= 11.5 h,
intensidad de la luz del día= 30,000 luz o más, temperatura durante
el día= 28ºC o más, temperatura durante la noche= 22ºC, humedad
relativa= 60-70%. Se hacen crecer las plantas
transgénicas y los nulicigotos correspondientes de lado a lado en
posiciones aleatorias. De la etapa de siembra hasta la etapa de
madurez se pasan las plantas 10 veces a través de una cabina de
imagen digital. En cada de punto de tiempo (2048x1536 píxeles, 16
millones de colores) se toman imágenes digitales de cada planta
desde por lo menos 6 ángulos diferentes. Se obtienen los parámetros
descritos adelante en una forma automática a partir de las imágenes
digitales utilizando software de análisis de imagen.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determina el área de la planta por encima del
suelo al contar el número de píxeles totales de las partes de la
planta sobre el suelo discriminadas desde el fondo. Se promedia este
valor para las fotos tomadas en el mismo punto de tiempo desde
diferentes ángulos y se convierten a un valor de superficie física
expresado en metros cuadrados mediante calibración. Los
experimentos muestran que el área de la planta por encima del suelo
medida de esta forma se correlaciona con la biomasa de las partes de
la planta por encima del suelo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determina la altura de la planta mediante la
distancia entre las líneas horizontales pasando por el borde
superior de la maceta y el píxel superior correspondiente a una
parte de la planta por encima de la tierra. Se promedia este valor
para las fotos tomadas al mismo tiempo desde diferentes ángulos y se
convierte, mediante calibración, a una distancia física expresada
en mm. Los experimentos muestran que la altura de la planta medida
de esta forma se correlaciona con la altura de la planta medida de
forma manual con una regla. Se cosechan las panículas principales
maduras, se colocan en bolsas, se etiquetan con código de barras y
luego se secan durante tres días en un horno a 37ºC. Luego se
trillan las panículas y se recolectan todas las semillas. Se
separan las cáscaras llenas de las vacías utilizado un dispositivo
de soplado de aire. Después de la separación, se cuentan luego
ambos lotes de semillas utilizando una máquina para conteo
disponible comercialmente. Se desechan las cáscaras vacías. Se
pesan las cáscaras llenas en una balanza analítica y se mide el área
de la sección cruzada de las semillas utilizando imagen digital.
Este procedimiento resulta en el conjunto de los parámetros
relacionados con la semilla descritos adelante.
\vskip1.000000\baselineskip
Se mide el número de retoños en la cosecha al
cortar la parte vegetativa y contar visualmente el número de
retoños para cada planta.
\vskip1.000000\baselineskip
Se mide el número de semillas total al contar el
número de cáscaras llenas cosechadas de una planta.
\vskip1.000000\baselineskip
Se mide el rendimiento de semilla total al pesar
todas las cáscaras llenas de una planta.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los inventores encontraron sorprendentemente que
las plantas transformadas E2F muestran más retoños, así más
ramificación, en comparación con las plantas de control no
transformadas con E2F. Esto significa que tienen un número
incrementado de órganos y por lo tanto muestran tener más biomasa,
incrementando así en rendimiento. Se puede explicar el efecto de la
alteración del número de órganos mediante la expresión y/o actividad
alterada del E2F en los tejidos de meristemo, tales como el
meristemo del brote. Los efectos de la transformación con
pOleosina::E2Fa puede ocurrir muy tempranamente durante el
crecimiento, probablemente afectando la formación de semilla y el
crecimiento del embrión, por ejemplo influenciar la funcionalidad
del meristemo dentro del embrión que lleva a un número incrementado
de primordios y órganos.
Una conexión con el fenotipo del cotiledón de la
planta transformada 35S::E2Fa, puede ser aquel que tiene actividad
35S en los cotiledones que se constituyen de los tejidos hechos
antes de la formación del meristemo apical del brote (SAM) durante
el desarrollo, pero por el contrario, no existe actividad 35S en el
meristemo. Esto significa que el promotor 35S, aunque se conoce por
ser un promotor constitutivo, no está activo en el SAM y que este
es activo en los cotiledones en donde en combinación con E2Fa lleva
a modificación de la división celular en los cotiledones. En
contraste, el promotor de Oleosina, que tiene un patrón de expresión
diferente en la semilla y/o embrión puede ser altamente expresado
en el escutelo pero también en los tejidos circundantes tales como
el SAM, RAM. Por lo tanto, en contraste con el promotor 35S, la
pOleosina se activa al final o dentro del SAM y afecta más la
formación de SAM, primordio y órgano. De tal manera que el fenotipo
observado en el arroz se correlaciona probablemente con el
rendimiento de más células dentro del SAM, lo que lleva a
incrementar la formación de primordios y posteriormente el número
incrementado de órganos. También, la actividad del E2F en el
meristemo de inflorescencia puede llevar a flores incrementadas y
por lo tanto también número de semillas
incrementado.
incrementado.
Las plantas positivas también muestran un número
incrementado de panículas en comparación con plantas de control.
Esto ilustra que las plantas de la presente invención tienen biomasa
incrementada y por lo tanto rendimiento incrementado.
Adicionalmente se analizan las semillas de las panículas y los
inventores demuestran que las plantas transformadas con E2F tienen
producción de semilla incrementada (ver Figura 11). Este efecto se
puede explicar mediante la presencia de más semillas o mediante el
tamaño de semilla incrementado.
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Claims (16)
1. Método para modificar una planta
monocotiledónea al incrementar el tamaño y/o número de retoños,
panículas, flores o semillas, que comprende sobreexpresar en una
planta un ácido nucleico que codifica un factor de transcripción
E2F de planta bajo el control de un promotor específico de
semilla.
2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en
donde dicha planta tiene rendimiento de semilla incrementado en
comparación con las plantas tipo silvestre.
3. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 o 2, en donde dicha planta tiene capacidad
incrementada para acumulación de almacenamiento en comparación con
las plantas tipo silvestre.
4. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha planta es una plántula con
vigor intensificado en comparación con plantas tipo silvestre.
5. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha planta comprende células
diferenciadas estimuladas para reingresar al ciclo celular en
comparación con las plantas tipo silvestre.
6. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en donde dicha planta comprende células en
las que las señales de diferenciación celular se anulan en
comparación con las plantas tipo silvestre.
7. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en donde dicha planta comprende células que
tienen una forma celular alterada en comparación con las plantas
tipo silvestre.
8. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en donde se incrementa el número de retoños
en comparación con las plantas tipo silvestre.
9. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en donde se incrementa el número de
panículas en comparación con plantas tipo silvestre.
10. Método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, que comprende integrar establemente en el
genoma de una planta o en una célula, tejido u órgano específico de
una planta, un ácido nucleico que se puede expresar que codifica un
factor de transcripción E2F de planta, o un homólogo, derivado o
fragmento enzimáticamente activo del mismo.
11. Método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en donde dicho factor de transcripción E2F
se selecciona del grupo que consiste de: un factor de transcripción
E2Fa, E2Fb, E2Fc o E2F según se representa por la SEQ ID NO 2 o 20
o un homólogo, derivado o fragmento enzimáticamente activo del
mismo.
12. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, que comprende adicionalmente la coexpresión
de DP (socio de dimerización E2F).
13. Método de acuerdo con la reivindicación 12,
en donde dicho DP se selecciona del grupo que consiste de un DPa,
un DPb o un DP como se presenta por la SEQ ID NO 4 o un homólogo,
derivado o fragmento enzimáticamente activo del mismo.
14. Método para la producción de una planta
transgénica monocotiledónea que tiene tamaño y/o número de retoños,
panículas, flores o semillas incrementado, que comprende las etapas
de:
- (a)
- proporcionar una construcción de ADN que comprende un promotor específico de semilla ligado operablemente a un gen que codifica un factor de transcripción E2F;
- (b)
- transformar dicha construcción de ADN de (a) en una célula de planta;
- (c)
- cultivar la célula transgénica obtenida de la etapa (b) bajo condiciones que promueven la regeneración y el crecimiento de la planta madura; y
- (d)
- seleccionar y evaluar dicha planta de (c) durante el curso del desarrollo para registrar sus características fenotípicas y morfológicas.
15. Método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, en donde dicha planta monocotiledónea o
célula de planta se deriva de un cereal, tal como arroz o maíz.
16. Uso de un factor de transcripción o un
homólogo, derivado o fragmento enzimáticamente activo del mismo
bajo el control de un promotor específico de semilla para obtener
plantas monocotiledóneas que tienen tamaño y/o número de de
retoños, panículas, flores o semillas incrementado.
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