ES2375488T3

ES2375488T3 - Plantas que tienen rendimiento de semillas aumentado y método para preparar las mismas.

Info

Publication number: ES2375488T3
Application number: ES05823594T
Authority: ES
Inventors: Ana Isabel Sanz Molinero
Original assignee: CropDesign NV
Current assignee: CropDesign NV
Priority date: 2004-12-24
Filing date: 2005-12-23
Publication date: 2012-03-01
Anticipated expiration: 2025-12-23
Also published as: ZA200704606B; ATE528404T1; BRPI0519260A2; US7872173B2; AU2005318112A1; EP1833971A1; US20110179527A1; AU2005318112B2; WO2006067236A1; MX2007007389A; AR051866A1; CN101128590A; US20090126039A1; CA2594554A1; CN101128590B; EP1833971B1

Abstract

Método para aumentar el rendimiento de semillas en plantas hechas crecer en condiciones de crecimiento normales con respecto a plantas control, que comprende (i) transformar una planta, una parte de planta o una célula vegetal con un constructo que comprende un ácido nucleico de DnaJ de tipo I exógeno que codifica para un polipéptido DnaJ de tipo I que comprende un motivo CaaX en su extremo carboxilo terminal y comprende adicionalmente, desde el extremo amino terminal hasta el extremo carboxilo terminal: (i) un dominio J con referencia de InterPro IPR001623; (ii) una región de dominio G/F de aproximadamente 30 residuos de aminoácidos, rico en glicina (G) y fenilalanina (F); (iii) un dominio de dedo de zinc rico en Cys que contiene cuatro repeticiones de CXXCXGXG, en el que X representa un residuo cargado o polar (referencia de InterPro IPR001305); y (iv) un dominio carboxilo terminal (CTD; referencia de InterPro IPR002939), (ii) expresar dicho ácido nucleico; y (iii) en el que dicho polipéptido DnaJ de tipo I tiene una ubicación subcelular citosólica.

Description

Plantas que tienen rendimiento de semillas aumentado y método para preparar las mismas.

La presente invención se refiere en general al campo de la biología molecular y se refiere a un método para aumentar el rendimiento de semillas, en plantas hechas crecer en condiciones de crecimiento normales con respecto a plantas control. Más específicamente, la presente invención se refiere a un método para aumentar el rendimiento de semillas en plantas hechas crecer en condiciones de crecimiento normales, que comprende

(i): transformar una planta, una parte de planta o una célula vegetal con un constructo que comprende un ácido nucleico de DnaJ de tipo I exógeno que codifica para un polipéptido DnaJ de tipo I que comprende un motivo CaaX en su extremo carboxilo terminal y comprende adicionalmente, desde el extremo amino terminal hasta el extremo carboxilo terminal: (i) un dominio J con referencia de InterPro IPR001623; (ii) una región de dominio G/F de aproximadamente 30 residuos de aminoácidos, rico en glicina (G) y fenilalanina (F); (iii) un dominio de dedo de zinc rico en Cys que contiene cuatro repeticiones de CXXCXGXG, en el que X representa un residuo cargado o polar (referencia de InterPro IPR001305); y (iv) un dominio carboxilo terminal (CTD; referencia de InterPro IPR002939),

(ii): expresar dicho ácido nucleico; y

(iii) en el que dicho polipéptido DnaJ de tipo I tiene una ubicación subcelular citosólica.

La presente invención también se refiere a plantas transgénicas que tienen preferentemente actividad aumentada en el citosol de un polipéptido similar a DnaJ de tipo I o un homólogo del mismo, plantas que tienen rendimiento de semillas aumentado cuando se hacen crecer en condiciones de crecimiento normales con respecto a plantas control hechas crecer en condiciones comparables y que comprenden el constructo según la reivindicación 8. La invención también proporciona constructos según la reivindicación 8 que son útiles en los métodos de la invención.

La población mundial en aumento constante y el suministro cada vez más limitado de la tierra cultivable disponible para la agricultura incentiva la investigación agrícola hacia la mejora de la eficiencia de la agricultura. Los medios convencionales para las mejoras en la hortícultura y los cultivos utilizan técnicas de reproducción selectiva para identificar plantas que tengan características deseables. Sin embargo, tales técnicas de reproducción selectiva tienen varias desventajas, concretamente que estas técnicas normalmente requieren mucho trabajo y dan como resultado plantas que a menudo contienen componentes genéticos heterogéneos que no siempre pueden dar como resultado que se transmita el rasgo deseable desde las plantas progenitoras. Los avances en biología molecular han permitido a la humanidad modificar el germoplasma de animales y plantas. La ingeniería genética de plantas implica el aislamiento y la manipulación del material genético (normalmente en forma de ADN o ARN) y la posterior introducción de este material genético en una planta. Tal tecnología tiene la capacidad de suministrar cultivos o plantas que tienen diversos rasgos económicos, agronómicos u hortícolas mejorados. Un rasgo de interés económico particular es el rendimiento. El rendimiento se define normalmente como los productos medibles de valor económico de un cultivo. Esto puede definirse en cuanto a la cantidad y/o a la calidad. El rendimiento depende directamente de varios factores, por ejemplo, el número y el tamaño de los órganos, la arquitectura vegetal (por ejemplo, el número de ramas), la producción de semillas, etc. El desarrollo de la raíz, la captación de nutrientes y la tolerancia al estrés también pueden ser factores importantes en la determinación del rendimiento. La optimización de uno de los factores mencionados anteriormente puede por tanto aumentar el rendimiento del cultivo. Además, las semillas de plantas son una fuente importante de nutrición humana y animal. Cultivos tales como maíz, arroz, trigo, canola y soja representan más de la mitad de la ingestión calórica humana total, ya sea a través del consumo directo de las propias semillas o a través del consumo de productos cárnicos criados con semillas procesadas. También son fuente de azúcares, aceites y muchas clases de metabolitos usados en procesos industriales. Las semillas contienen un embrión, fuente de nuevos brotes y raíces tras la germinación, y un endospermo, fuente de nutrientes para el crecimiento del embrión, durante la germinación y crecimiento temprano de las plántulas. El desarrollo de una semilla implica muchos genes, y requiere la transferencia de metabolitos desde las raíces, las hojas y los tallos a la semilla en crecimiento. El endospermo, en particular, asimila los precursores metabólicos de polímeros de hidratos de carbono, aceite y proteínas y los sintetiza en macromoléculas de almacenamiento para rellenar el grano. La capacidad de aumentar el rendimiento de semillas de plantas, ya sea a través del índice de cosecha aumentado, peso de mil granos, número de semillas, biomasa de semillas, desarrollo de semillas, llenado de semillas aumentados o cualquier otro rasgo relacionado con las semillas tendría muchas aplicaciones en la agricultura, e incluso usos no agrícolas uses tales como en la producción biotecnológica de sustancias tales como productos farmacéuticos, anticuerpos o vacunas.

En la actualidad se ha encontrado que preferentemente el aumento de la actividad en el citosol de una célula vegetal de un polipéptido similar a DnaJ de tipo I proporciona plantas hechas crecer en condiciones de crecimiento normales con rendimiento de semillas aumentado con respecto a plantas control hechas crecer en condiciones comparables.

DnaJ es una co-chaperona molecular de la familia Hsp40 (proteína de choque térmico 40). Hsp40 actúa conjuntamente con la chaperona proteína de choque térmico 70 (Hsp70, también denominada DnaK) y la cochaperona factor de intercambio de nucleótidos GrpE para facilitar diferentes aspectos del metabolismo celular de proteínas que incluyen ensamblaje en el ribosoma, translocación de proteínas, plegamiento y desplegamiento de proteínas, supresión de la agregación de polipéptidos y señalización celular (Walid (2001) Curr Protein Peptide Sci 2: 227-244). DnaJ estimula que Hsp70 hidrolice el ATP, una etapa clave en la unión estable de un sustrato a Hsp70. Además, la propia DnaJ también tiene funciones moleculares de chaperona dado que se ha demostrado que se une a cadenas nacientes en sistemas de traducción in vitro y evita la agregación de polipéptido desnaturalizados (Laufen et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 96: 5452-5457). Los miembros de la familia DnaJ se han identificado en una variedad de organismos (tanto en procariotas como en eucariotas) y en una variedad de compartimentos celulares, tales como citosol, mitocondria, peroxisoma, glioxisoma, retículo endoplasmático y estroma de cloroplasto. Dentro de un organismo, múltiples Hsp40 pueden interaccionar con una única Hsp70 para generar pares de Hsp70:Hsp40 lo que facilita numerosas reacciones en el metabolismo celular de proteínas.

Todas las proteínas DnaJ se definen por la presencia de un dominio denominado “J”, dominio que consiste en aproximadamente 70 aminoácidos, ubicados habitualmente en el extremo amino terminal de la proteínas, y por la presencia del tripéptido HPD altamente conservado en el centro del dominio J (referencia de InterPro IPR001623; Zdobnov et al., (2002) 18(8): 1149-50); El dominio “J”, que consiste en cuatro hélices alfa, interacciona con las proteínas Hsp70. En el genoma de Arabidopsis thaliana, al menos se han identificado 89 proteínas que comprenden el dominio J (Miernyk (2001) Cell Stress & Chaperones). Hasta la fecha se han identificado 18 proteínas Hsp70.

Las proteínas DnaJ se han clasificado adicionalmente en tipo I, tipo II y tipo III.

Las proteínas de dominio DnaJ (o proteínas DnaJ) de tipo I (hasta la fecha son al menos 8 en Arabidopsis; Miernyk (2001) Cell Stress & Chaperone 6(3): 209-218), comprenden (desde el extremo amino terminal hasta el extremo carboxilo terminal) los dominios identificados dentro de la proteína DnaJ arquetipo tal como se caracterizó primero en Escherichia coli:

1) una región de dominio G/F de aproximadamente 30 residuos de aminoácidos, rico en glicina (G) y fenilalanina (F), que se ha propuesto que regula la especificidad por el polipéptido diana;

2) un dominio de dedo de zinc rico en Cys que contiene cuatro repeticiones de CXXCXGXG, en el que X representa un residuo cargado o polar; estas cuatro repeticiones funcionan en pares para formar el dominio I y II de unión a zinc (referencia de InterPro IPR001305; Linke et al. (2003) J Biol Chem 278(45): 44457-44466); se piensa que el dominio de dedo de zinc media interacciones proteina:proteína directas y más específicamente que se une a polipéptidos no nativos que van a suministrarse a Hsp70;

3) un dominio carboxilo terminal (CTD; referencia de InterPro IPR002939).

Las proteínas de dominio DnaJ de tipo II (hasta la fecha son al menos 35 en Arabidopsis) comprenden el dominio J ubicado en el extremo amino terminal de la proteína, o bien el dominio G/F o bien el dominio de dedo de zinc y un CTD. Las proteínas de dominio DnaJ de tipo III (hasta la fecha son al menos 45 en Arabidopsis) comprenden sólo el dominio J, que puede estar ubicado en cualquier parte dentro de la proteína.

En su forma nativa, las proteínas DnaJ pueden dirigirse a una variedad de compartimentos subcelulares, o bien en forma soluble o bien en forma unida a la membrana. Ejemplos de tales compartimentos subcelulares en plantas incluyen mitocondrias, cloroplastos, peroxisomas, núcleo, citoplasma y rutas secretoras. Las secuencias señal y los péptidos de tránsito, habitualmente ubicados en el extremo amino terminal de las proteínas DnaJ codificadas en el núcleo, son responsables del direccionamiento de estas proteínas a compartimentos subcelulares específicos.

Ejemplos de membranas celulares a las que pueden dirigirse proteínas DnaJ en circunstancias específicas incluyen la membrana externa de mitocondria, la membrana externa de cloroplasto, la membrana de peroxisoma, la membrana nuclear, el retículo endoplasmático (RE) y la propia membrana celular (Miernyk (2001) Cell Stress & Chaperone 6(3): 209-218). Un tipo de asociación a membrana de una proteína DnaJ se produce tras la modificación postraduccional de la proteína, es decir, tras la isoprenilación. Un grupo isoprenoide se une a la cisteína del motivo CaaX de farnesilación (en el que C es Cys, un residuo de aminoácido alifático y X cualquier aminoácido) ubicado en el extremo carboxilo terminal de la proteína. Se ha demostrado que esta farnesilación da como resultado una actividad biológica y asociación a la membrana mayores de la proteína DnaJ, especialmente a temperaturas elevadas (Zhu J-K et al., (1993) The Plant Cell 5:341-9).

Se ha sugerido que las proteínas DnaJ desempeñan un papel (junto con HSP70) en conferir tolerancia al estrés térmico en plantas. Aunque DnaJ puede tener un papel protector que desempeñar en plantas sometidas a estrés térmico, no queda claro si podría haber alguna ventaja adicional en el aumento de los niveles y/o la actividad de DnaJ en plantas no sometidas a estrés térmico.

Por tanto fue sorprendente encontrar que un polipéptido similar a DnaJ de tipo I podía usarse en condiciones de crecimiento normales para proporcionar plantas que tienen rendimiento de semillas aumentado en relación con el rendimiento de semillas en plantas control hechas crecer en condiciones comparables.

Por tanto, según una realización de la presente invención, se proporciona un método para aumentar el rendimiento de semillas en plantas hechas crecer en condiciones de crecimiento normales, que comprende

(ii): expresar dicho ácido nucleico; y

El término “citosol” se refiere a la ubicación subcelular de la proteína DnaJ útil en los métodos de la invención. Mediante el término citosol se abarca una asociación transitoria o prolongada de la proteína DnaJ con la superficie externa de mitocondrias, cloroplastos, peroxisoma, núcleo, RE o con la membrana celular.

Un experto en la técnica puede identificar fácilmente el “extremo carboxilo terminal” de una proteína.

La referencia en el presente documento a “plantas de tipo natural correspondientes” se considera que significa cualquier planta o plantas control, cuya elección estaría dentro de las capacidades de un experto en la técnica y pueden incluir, por ejemplo, plantas de tipo natural correspondientes o plantas correspondientes sin el gen de interés. Una “planta control” tal como se usa en el presente documento no sólo se refiere a plantas completas, sino también a partes de planta, (incluyendo semillas y partes de semilla).

La referencia en el presente documento a “condiciones (de crecimiento) sin estrés” se considera que significa crecimiento/cultivo de una planta a cualquier estadio en su ciclo de vida (desde semilla hasta planta madura y de vuelta a semilla de nuevo) en condiciones de crecimiento normales, que incluye el estrés leve diario con que se encuentra cada planta, pero que no incluye estrés grave. Un ejemplo de un estrés grave es el estrés térmico, cuya aparición se conocería bien en la técnica, y que dependería de diversos factores, tales como la región en la que se hace crecer la planta y que dependería de la propia planta.

La expresión “rendimiento de semillas aumentado” tal como se define en el presente documento se considera que significa un aumento en uno cualquiera o más de lo siguiente, cada uno con respecto a plantas control: (i) rendimiento de semillas aumentado, que incluye un aumento en la biomasa de las semillas (peso de las semillas) y que puede ser un aumento en el peso de las semillas por planta o basándose en una semilla individual; (ii) número aumentado de semillas (llenadas); (iii) tasa de llenado aumentada (que es el número de semillas llenadas dividido por el número total de semillas y multiplicado por 100); (iv) tamaño de semillas aumentado, que también puede influir en la composición de las semillas; (v) volumen de semillas aumentado, que también puede influir en la composición de las semillas; (vi) índice de cosecha aumentado, que se expresa como una razón del rendimiento de las partes que puede cosecharse, tales como semillas, con respecto a la biomasa total; y (vii) peso de mil granos aumentado (TKW), que se extrapola del número de semillas llenadas contadas y su peso total. Un TKW aumentado puede resultar de un tamaño de semillas y/o peso de semillas aumentado.

Tomando el maíz como ejemplo, un aumento del rendimiento de semillas puede manifestarse como uno o más de lo siguiente: un aumento en el número de espigas por planta, un aumento en el número de filas, número de granos por fila, peso del grano, peso de mil granos, longitud/diámetro de la espiga, entre otros. Tomando el arroz como ejemplo, un aumento del rendimiento de semillas puede manifestarse como un aumento en uno o más de lo siguiente: número de panojas por planta, número de espiguillas por panoja, número de flores por panoja, aumento en la tasa de llenado de las semillas, aumento en el peso de mil granos, entre otros. Según la presente invención, se proporciona un método para aumentar el rendimiento de semillas de planta en plantas hechas crecer en condiciones de crecimiento normales, comprendiendo el método

(ii): expresar dicho ácido nucleico; y

Preferiblemente además, el rendimiento de semillas aumentado se manifiesta como un aumento en el índice de cosecha con relación a las plantas de tipo natural correspondientes. Por tanto, según la presente invención, se proporciona un método para aumentar el índice de cosecha en plantas hechas crecer en condiciones de crecimiento normales, comprendiendo el método

(ii): expresar dicho ácido nucleico; y

Dado que las plantas transgénicas según la presente invención y tal como se definen por las reivindicaciones 9 y 10 tienen rendimiento aumentado, es probable que estas plantas presenten una tasa de crecimiento aumentada (durante al menos parte de su ciclo de vida), en relación con la tasa de crecimiento de plantas de tipo natural correspondientes en un estadio correspondiente en su ciclo de vida. La tasa de crecimiento aumentada puede ser específica para una o más partes de una planta (incluyendo semillas), o puede ser sustancialmente en toda la planta completa. Una planta que tiene una tasa de crecimiento aumentada puede incluso presentar floración temprana. El aumento en la tasa de crecimiento puede tener lugar en uno o más estadios en el ciclo de vida de una planta o sustancialmente durante todo el ciclo de vida de la planta. La tasa de crecimiento aumentada durante los estadios tempranos en el ciclo de vida de una planta puede reflejar vigor potenciado. El aumento en la tasa de crecimiento puede alterar el ciclo de cosecha de una planta permitiendo que se siembren plantas más tarde y/o se cosechen más pronto de lo que sería posible de otro modo. Si se aumenta de manera suficiente la tasa de crecimiento, puede permitir la siembra adicional de semillas de la misma especie de planta (por ejemplo siembra y cosecha de plantas de arroz seguido por siembra y cosecha de plantas de arroz adicionales todo dentro de un periodo de cultivo convencional). De manera similar, si se aumenta de manera suficiente la tasa de crecimiento, puede permitir la siembra adicional de semillas de diferentes especies de plantas (por ejemplo la siembra y cosecha de plantas de arroz seguido por, por ejemplo, la siembra y la cosecha opcional de soja, patata o cualquier cultivo de planta adecuado). En el caso de algunas plantas también pueden ser posibles momentos adicionales de cosecha del mismo rizoma. La alteración del ciclo de cosecha de una planta puede conducir a un aumento en la producción de biomasa anual por acre (debido al aumento en el número de veces (pongamos en un año) que cualquier planta particular puede hacerse crecer y cosecharse). Un aumento en la tasa de crecimiento también puede permitir el cultivo de plantas transgénicas en una zona geográfica más amplia que sus homólogas de tipo natural, dado que las limitaciones territoriales para el crecimiento de un cultivo a menudo vienen determinadas por condiciones medioambientales adversas o bien en el momento de la siembra (estación temprana) o bien en el momento de la cosecha (estación tardía). Tales condiciones adversas pueden evitarse si se acorta el ciclo de cosecha. La tasa de crecimiento puede determinarse derivando diversos parámetros a partir de curvas de crecimiento, tales parámetros pueden ser: T-Mid (el tiempo que tardan las plantas en alcanzar el 50% de su tamaño máximo) y T-90 (el tiempo que tardan las plantas en alcanzar el 90% de su tamaño máximo), entre otros.

Las características de crecimiento mencionadas anteriormente pueden modificarse de manera ventajosa en cualquier planta.

El término “planta” tal como se usa en el presente documento abarca plantas completas, ascendentes y progenie de las plantas y partes de planta, incluyendo semillas, brotes, tallos, hojas, raíces (incluyendo tubérculos), flores, y tejidos y órganos, comprendiendo cada uno de los mencionados anteriormente el gen/ácido nucleico de interés. El término “planta” también abarca células vegetales, cultivos en suspensión, tejido calloso, embriones, regiones meristemáticas, gametofitos, esporofitos, polen y microesporas, comprendiendo de nuevo cada uno de los mencionados anteriormente el gen/ácido nucleico de interés.

Las plantas que son particularmente útiles en los métodos de la invención incluyen todas las plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, en particular plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas incluyendo forraje o legumbres forrajeras, plantas ornamentales, cultivos alimenticios, árboles o arbustos seleccionados de la lisa que comprende Acacia spp., Acer spp., Actinidia spp., Aesculus spp., Agathis australis, Albizia amara, Alsophila tricolor, Andropogon spp., Arachis spp, Areca catechu, Astelia fragrans, Astragalus cicer, Baikiaea plurijuga, Betula spp., Brassica spp., Bruguiera gymnorrhiza, Burkea africana, Butea frondosa, Cadaba farinosa, Calliandra spp, Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Cassia spp., Centroema pubescens, Chaenomeles spp., Cinnamomum cassia, Coffea arabica, Colophospermum mopane, Coronillia varia, Cotoneaster serotina, Crataegus spp., Cucumis spp., Cupressus spp., Cyathea dealbata, Cydonia oblonga, Cryptomeria japonica, Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia oblonga, Dalbergia monetaria, Davallia divaricata, Desmodium spp., Dicksonia squarosa, Diheteropogon amplectens, Dioclea spp, Dolichos spp., Dorycnium rectum, Echinochloa pyramidalis, Ehrartia spp., Eleusine coracana, Eragrestis spp., Erythrina spp., Eucalyptus spp., Euclea schimperi, Eulalia villosa, Fagopyrurn spp., Feijoa sellowiana, Fragaria spp., Flemingia spp, Freycinetia banksii, Geranium thunbergii, Ginkgo biloba, Glycine javanica, Gliricidia spp, Gossypium hirsutum, Grevillea spp., Guibourtia coleosperma, Hedysarum spp., Hemarthia altissima, Heteropogon contortus, Hordeum vulgare, Hyparrhenia rufa, Hypericum erectum, Hyperthelia dissoluta, Indigo incamata, Iris spp., Leptarrhena pyrolifolia, Lespediza spp., Lettuca spp., Leucaena leucocephala, Loudetia simplex, Lotonus bainesii, Lotus spp., Macrotyloma axillare, Malus spp., Manihot esculenta, Medicago sativa, Metasequoia glyptostroboides, Musa sapientum, Nicotianum spp., Onobrychis spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Peltophorum africanum, Pennisetum spp., Persea gratissima, Petunia spp., Phaseolus spp., Phoenix canariensis, Phormium cookianum, Photinia spp., Picea glauca, Pinus spp., Pisum sativum, Podocarpus totara, Pogonarthria fleckii, Pogonarthria squarrosa, Populus spp., Prosopis cineraria, Pseudotsuga menziesii, Pterolobium stellatum, Pyrus communis, Quercus spp., Rhaphiolepsis umbellata, Rhopalostylis sapida, Rhus natalensis, Ribes grossularia, Ribes spp., Robinia pseudoacacia, Rosa spp., Rubus spp., Salix spp., Schyzachyrium sanguineum, Sciadopitys verticillata, Sequoia sempervirens, Sequoiadendron giganteum, Sorgo bicolor, Spinacia spp., Sporobolus fimbriatus, Stiburus alopecuroides, Stylosanthos humilis, Tadehagi spp, Taxodium distichum, Themeda triandra, Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga heterophylla, Vaccinium spp., Vicia spp., Vitis vinifera, Watsonia pyramidata, Zantedeschia aethiopica, Zea mays, amaranto, alcachofa, espárrago, brócoli, coles de Bruselas, repollo, canola, zanahoria, coliflor, apio, berza, lino, col rizada, lenteja, colza, quimbongó, cebolla, patata, arroz, soja, fresa, remolacha azucarera, caña de azúcar, girasol, tomate, calabaza, té y algas, entre otros.

Preferiblemente, la planta es una planta de cultivo tal como soja, girasol, canola, alfalfa, colza, algodón, tomate, patata o tabaco. Preferiblemente además, la planta es una planta monocotiledónea, tal como caña de azúcar. Más preferiblemente la planta es un cereal, tal como arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, sorgo o avena.

Común a todas las proteínas DnaJ es la presencia de un dominio J, que consiste en aproximadamente 70 aminoácidos (habitualmente ubicados en el extremo amino terminal de la proteína) y que comprende el tripéptido HPD altamente conservado en su centro (referencia de InterPro IPR001623; Zdobnov et al., (2002) 18(8): 1149-50); el dominio “J”, que consiste en cuatro hélices alfa, interacciona con proteínas Hsp70. En el genoma de Arabidopsis thaliana, se han identificado al menos 89 proteínas que comprenden el dominio J (Miernyk (2001) Cell Stress & Chaperones). Hasta la fecha, se han identificado 18 proteínas Hsp70.

Las proteínas con dominio DnaJ de tipo I (o proteínas DnaJ) comprenden un motivo CaaX en su extremo carboxilo terminal y se caracterizan además por la presencia de lo siguiente desde el extremo amino terminal hasta el extremo carboxilo terminal:

1.: una región de dominio G/F de aproximadamente 30 residuos de aminoácidos, rico en glicina (G) y fenilalanina (F), que se ha propuesto que regula la especificidad de polipéptido diana; y

2.: un dominio de dedo de zinc rico en Cys que contiene cuatro repeticiones de CXXCXGXG, en el que X representa un residuo cargado o polar; estas cuatro repeticiones funcionan en pares para formar el dominio I y II de unión a zinc (referencia de InterPro IPR001305; Linke et al. (2003) J Biol Chem 278(45): 44457-44466); se piensa que el dominio de dedo de zinc media interacciones proteína:proteína directas y más específicamente que se une a polipéptidos no nativos que va a suministrarse a Hsp70; y

3.: un dominio carboxilo terminal (CTD; referencia de InterPro IPR002939).

En su forma nativa, las proteínas DnaJ pueden dirigirse a una variedad de compartimentos subcelulares, o bien en forma soluble o bien en forma unida a membrana. Las proteínas DnaJ útiles en los métodos de la invención son aquellas sin una secuencia señal o un péptido de tránsito, y por tanto se ubican principalmente en el citosol de una célula vegetal.

Las proteínas DnaJ útiles en los métodos de la invención son las que comprenden un motivo CaaX en su extremo carboxilo terminal. Por tanto, este polipéptido está presente o bien en una forma soluble o bien en una forma unida a membrana, siendo reversible la existencia en cualquier forma.

Un “polipéptido similar a DnaJ de tipo I” puede identificarse fácilmente usando técnicas rutinarias bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, la estimulación de la actividad ATPasa de DnaK por DnaJ puede determinarse fácilmente in vitro tal como en Zhou et al., (2000), Protein Expression & Purification 19: 253-258. La capacidad de DnaJ para promover la formación de complejo entre DnaK y polipéptidos no nativos, tales como luciferasa desnaturalizada, puede determinarse mediante ELISA (Fan et al., (2004) Molec. Biol. Cell 15: 761-773).

Un “polipéptido similar a DnaJ de tipo I” puede identificarse fácilmente usando alineación de secuencias. Los métodos para la alineación de secuencias para comparación se conocen bien en la técnica, incluyendo tales métodos GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA. GAP usa el algoritmo de Needleman y Wunsch ((1970) J Mol Biol 48: 443-453) para encontrar la alineación de dos secuencias completas que maximiza el número de apareamientos y minimiza el número de huecos. El algoritmo BLAST (Altschul et al., (1990) J Mol Biol 215: 403-10) calcula el porcentaje de identidad de secuencia y realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias. El software para realizar el análisis BLAST está disponible al público a través del National Centre for Biotechnology Information. Los homólogos de polipéptidos similares a DnaJ de tipo I y su porcentaje de identidad con respecto a la secuencia de aminoácidos similar a DnaJ de tipo I útiles en los métodos de la invención, tal como se representan mediante SEQ ID NO: 2, pueden identificarse fácilmente usando, por ejemplo, el programa de alineación múltiple VNTI AlignX, basado en un algoritmo ClustalW modificado (InforMax, Bethesda, MD, http://www.informaxinc.com), con parámetros por defecto para la penalización de abertura de hueco y extensión de hueco. Preferiblemente, los polipéptidos similares a DnaJ de tipo I u homólogos de los mismos que comprenden un motivo CaaX en su extremo carboxilo terminal, y que son útiles en los métodos de la invención, son los que tienen en orden creciente de

5 preferencia una identidad de al menos el 35%, 40%, 45%, 50%, 55%. 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% con respecto a la SEQ ID NO: 2.

Ejemplos de polipéptidos cubiertos por la expresión “polipéptido similar a DnaJ de tipo I” se enumeran en la tabla 1 como SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, 10 SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SECT ID NO: 44, SEO ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEPA ID NO: 54 y SEQ ID NO:

56. La secuencia de polipéptido similar a DnaJ de tipo I usada para mostrar a modo de ejemplo la invención es tal como se representa en SEQ ID NO: 2.

Tabla 1: Ejemplos de ácidos nucleicos (ID de SEQ de ADN) de diferentes organismos que codifican para 15 polipéptidos similares a DnaJ de tipo I (ID de SEQ de proteína)

Nombre del gen: Número de registro de ADN ID de SEQ de ADN Número de registro de proteína ID de SEQ de proteína Fuente

CDS1877 DnaJ: AK066420.1 SEQ ID NO: 1 VT SEQ ID NO: 2 Oryza sativa

Orysa_DNAJ II CAAX: AK10195 SEQ ID NO: 3 VT SEQ ID NO: 4 Oryza sativa

Orysa_DNAJ III CAAX: AK105028 SEQ ID NO: 5 VT SEQ ID NO: 6 Oryza sativa

Orysa_DNAJ IV CAAX: AK104315 SEQ ID NO: 7 VT SEQ ID NO: 8 Oryza sativa

Zeama_ZMD J1: BT016805* SEQ ID NO: 9 T01643 SEQ ID NO: 10 Zea mays

Zeama_DNA JI CAAX: AY103727.1 SEQ ID NO: 11 VT SEQ ID NO: 12 Zea mays

Zeama_DNA J II CAAX: AY108160.1 SEQ ID NO: 13 VT SEQ ID NO: 14 Zea mays

Triae_DNAJ: BT008914.1 SEQ ID NO: 15 VT SEQ ID NO: 16 Triticum aestivum

(continuación)

At5g22060 AtJ2 CAAX: L36113 SEQ ID NO: 17 AAB8679 SEQ ID NO: 18 Arabidopsis thaliana

At3g44110 AtJ3 CAAX: NM_11427 9 SEQ ID NO: 19 S71199 SEQ ID NO: 20 Arabidopsis thaliana

Atrnu_DNAJ: L09124 SEQ ID NO: 21 VT SEQ ID NO: 22 Atriplex nummularia

Cucsa_DNAJ -1: X67695 SEQ ID NO: 23 VT SEQ ID NO: 24 Cucumis sativus

Dauca_J1P: AF308737 SEQ ID NO: 25 VT SEQ ID NO: 26 Daucus carota

Glyma_pm37 DNAJ: AF169022 SEQ ID NO: 27 VT SEQ ID NO: 28 Glycine max

Hevbr_DNAJ: AF085275 SEQ ID NO: 29 AAD1205 SEQ ID NO: 30 Hevea brasiliensis

Lyces_DNAJ: AF124139 SEQ ID NO: 31 AAF2838 SEQ ID NO: 32 Lycopersicum esculentum

Medsa_DNA J: AJ000995 SEQ ID NO: 33 CAA0444 SEQ ID NO: 34 Medicago sativa

Nicta_DNAJ: AJ299254 SEQ ID NO: 35 CAC1282 SEQ ID NO: 36 Nicotiana tabacum

sajg;_DNAJ2: AB003137 SEQ ID NO: 37 BAA7688 SEQ ID NO: 38 Salix gilgiana

Salgi_DNAJ: AB015601 SEQ ID NO: 39 BAA3512 SEQ ID NO: 40 Salix gilgiana

Solto_DNAJ: X94301 SEQ ID NO: 41 CAA6396 SEQ ID NO: 42 Solanum tuberosum

Orysa_DNAJ CASQ: AK110691 SEQ ID NO: 43 VT SEQ ID NO: 44 Oryza sativa

Triae_DNAJ 11 CASQ: BT009366 SEQ ID NO: 45 VT SEQ ID NO: 46 Triticum aestivum

Ceael_DNaJ: NM_07205 1 SEQ ID NO: 47 NP_5044 2 SEQ ID NO: 48 Caenorhabditis elegans

Homsa_HsJ2: D13388 SEQ ID NO: 49 P31689 SEQ ID NO: 50 Homo sapiens

Sacce_YDJ1: NC_001146 SEQ ID NO: 51 NP_0143 5 SEQ ID NO: 52 Saccharomyces cereviseae

Homsa_DNA JA2: NM_00588 0 SEQ ID NO: 53 NP_0058 SEQ ID NO: 54 Homo sapiens

Musmu_mDj 3: NM_019794 SEQ ID NO: 55 Q9QYJ0 SEQ ID NO: 56 Mus musculus

VT= traducción virtual; con correcciones minoritarias

Ha de entenderse que las secuencias que caen bajo la definición de “polipéptido similar a DnaJ de tipo I” no han de limitarse a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ 10 NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54 y SEQ ID NO: 56 enumeradas en la tabla 1, sino que cualquier polipéptido similar a DnaJ de tipo I que comprende un motivo CaaX en su extremo carboxilo terminal y comprende adicionalmente, desde el extremo amino terminal hasta el extremo carboxilo terminal: (i) un dominio J con referencia de InterPro IPR001623; (ii) una región de dominio G/F de aproximadamente 30 residuos de aminoácidos, rico en glicina (G) y fenilalanina (F); (iii) un dominio de dedo de zinc rico en Cys que contiene cuatro repeticiones de CXXCXGXG, en el que X representa un residuo cargado o polar (referencia de InterPro IPR001305); y (iv) un dominio carboxilo terminal (CTD; referencia de InterPro IPR002939), puede ser adecuado para su uso en los métodos de la invención.

El ácido nucleico que codifica para un polipéptido similar a DnaJ de tipo I puede ser cualquier ácido nucleico natural

: o sintético. Por tanto, la expresión “gen/ácido nucleico similar a DnaJ de tipo I” tal como se define en el presente documento es cualquier ácido nucleico/gen que codifica para un polipéptido similar a DnaJ de tipo I tal como se definió anteriormente en el presente documento. Ejemplos de ácidos nucleicos similares a DnaJ de tipo I incluyen los enumerados en la tabla 1 como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51 SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 55. Los ácidos nucleicos/genes similares a DnaJ de tipo I y las variantes de los mismos pueden ser adecuados en la puesta en práctica de los métodos de la invención. En la presente invención se describen ácidos nucleicos/genes similares a DnaJ de tipo I variantes que incluye partes de un ácido nucleico/gen y/o ácidos nucleicos similares a DnaJ de tipo I que pueden hibridar con un ácido nucleico/gen similar a DnaJ de tipo

I.

El término parte tal como se define en el presente documento se refiere a un pedazo de ADN que comprende al menos 600 nucleótidos, parte que codifica para un polipéptido de al menos 200 aminoácidos, que comprende desde el extremo amino terminal hasta el extremo carboxilo terminal, un dominio DnaJ, un dominio rico en G/F y un dominio de dedo de zinc rico en Cys, un dominio CTD y un motivo CaaX. Preferiblemente, la parte comprende al menos 1050 nucleótidos, parte que codifica para un polipéptido de al menos 350 aminoácidos que comprende desde el extremo amino terminal hasta el extremo carboxilo terminal, un dominio DnaJ, un dominio rico en G/F, un dominio de dedo de zinc rico en Cys, un dominio CTD y un motivo CaaX. Preferiblemente además, una parte tal como se definió anteriormente es una parte de un ácido nucleico tal como se representa mediante una cualquiera de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ 10 NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51 SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 55 de la tabla 1.

Puede prepararse una parte, por ejemplo, realizando una o más deleciones a un ácido nucleico similar a DnaJ de tipo I. Un ejemplo consiste en eliminar las secuencias de polinucleótido que codifican para secuencias de direccionamiento subcelular específicas, tales como secuencias de direccionamiento a mitocondrias o plastidios. Las partes pueden usarse en forma aislada o pueden fusionarse a otras secuencias codificantes (o no codificantes) con el fin de, por ejemplo, producir una proteína que combina varias actividades. Cuando se fusionan a otras secuencias codificantes, el polipéptido resultante producido tras la traducción podría ser más grande que el predicho para el fragmento similar a DnaJ de tipo I. Por ejemplo, un oligonucleótido que codifica para un motivo de farnesilación podría fusionarse a una secuencia de polinucleótido similar a DnaJ de tipo I que codifica para un polipéptido similar a DnaJ de tipo I que originariamente carece de este motivo. La parte puede fusionarse a otra parte de una secuencia codificante de otro miembro de la familia de DnaJ de tipo I sustituyendo de ese modo los dominios entre los dos polipéptidos similares a DnaJ de tipo I originales. Por ejemplo el dominio CTD de un polipéptido similar a DnaJ de tipo I puede intercambiarse por el dominio CTD de otro polipéptido similar a DnaJ de tipo I.

Otra variante de un ácido nucleico/gen similar a DnaJ de tipo I es un ácido nucleico que puede hibridar en condiciones de rigurosidad reducidas, preferiblemente en condiciones de rigurosidad, con un ácido nucleico/gen similar a DnaJ de tipo I tal como se definió anteriormente en el presente documento, secuencia de hibridación que codifica para al menos el dominio J y el dominio de dedo de zinc rico en Cys de un polipéptido similar a DnaJ de tipo

I. Una variante de este tipo comprende todos los dominios que caracterizan los polipéptidos similares a DnaJ de tipo I, desde el extremo amino terminal hasta el extremo carboxilo terminal, un dominio DnaJ, un dominio rico en G/F, un dominio de dedo de zinc rico en Cys y un dominio CTD, y adicionalmente un motivo CaaX.

Preferiblemente, la secuencia de hibridación es una que puede hibridar con un ácido nucleico tal como se representa por una cualquiera de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51 SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 55 de la tabla 1 o con una parte de cualquier de las secuencias mencionadas anteriormente tal como se definió anteriormente en el presente documento.

El término “hibridación” tal como se define el presente documento es un proceso en el que secuencias de nucleótidos sustancialmente homólogas se aparean entre sí. El proceso de hibridación puede producirse completamente en disolución, es decir ambos ácidos nucleicos complementarios están en disolución. El proceso de hibridación también puede producirse con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizados en una matriz tal como perlas magnéticas, perlas de Sepharose o cualquier otra resina. El proceso de hibridación puede producirse además con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizado en un soporte sólido tal como una membrana de nitrocelulosa o nailon o inmovilizado mediante por ejemplo fotolitografía en, por ejemplo, un soporte

5 de vidrio silíceo (conocido esto último como matrices o micromatrices de ácidos nucleicos o como chips de ácidos nucleicos). Con el fin de permitir que se produzca la hibridación, las moléculas de ácido nucleico se desnaturalizan generalmente de forma térmica o química para fundir una doble cadena en dos cadenas sencillas y/o eliminar horquillas u otras estructuras secundarias de los ácidos nucleicos monocatenarios. La rigurosidad de la hibridación se ve influida por condiciones tales como temperatura, concentración salina, fuerza iónica y composición del tampón de hibridación.

Las “condiciones de hibridación rigurosas” y “condiciones de lavado de hibridación rigurosas” en el contexto de los experimentos de hibridación de ácidos nucleicos tales como hibridaciones de tipo Southern y Northern dependen de la secuencia y son diferentes en diferentes parámetros ambientales. El experto es consciente de que pueden alterarse diversos parámetros durante la hibridación y el lavado y que o bien se mantendrán o bien cambiarán las

15 condiciones de rigurosidad.

La Tm es la temperatura a la fuerza iónica y el pH definidos, en la que el 50% de la secuencia diana hibrida con una sonda perfectamente apareada. La Tm depende las condiciones de disolución y la composición de base y la longitud de la sonda. Por ejemplo, las secuencias más largas hibridan específicamente a temperaturas superiores. La tasa de hibridación máxima se obtiene desde aproximadamente 16ºC hasta 32ºC por debajo de la Tm. La presencia de cationes monovalentes en la disolución de hibridación reduce la repulsión electroestática entre las dos cadenas de ácido nucleico promoviendo de ese modo la formación del híbrido; este efecto es visible para concentraciones de sodio de hasta 0,4 M. La formamida reduce la temperatura de fusión de dúplex ADN-ADN y ADN-ARN con de 0,6 a 0,7ºC por cada porcentaje de formamida, y la adición de un 50% de formamida permite que se realice la hibridación a de 30 a 45ºC, aunque se reducirá la tasa de hibridación. Los apareamientos erróneos de pares de base reducen la

25 tasa de hibridación y la estabilidad térmica de los dúplex. En promedio y para sondas grandes, la Tm disminuye en aproximadamente 1ºC por % de apareamiento erróneo de base. La Tm puede calcularse usando las siguientes ecuaciones, dependiendo de los tipos de híbridos:

1.: Híbridos de ADN-ADN (Meinkoth y Wahl, Anal. Biochem., 138: 267-284, 1984):

Tm= 81,5ºC + 16,6xlog[Na+]a + 0,41x%[G/Cb] - 500x[Lc]-1 – 0,61x% formamida

2.: Híbridos de ADN-ARN o ARN-ARN:

Tm= 79,8 + 18,5 (log10[Na+]a) + 0,58 (%G/Cb) + 11,8 (%G/Cb)2 - 820/Lc

3.: Híbridos de oligo-ADN u oligo-RNAd:

Para <20 nucleótidos: Tm= 2 (In)

Para 20-35 nucleótidos: Tm= 22 + 1,46 (In)

35 a o para otro catión monovalente, pero sólo preciso en el intervalo de 0,01-0,4 M.

b sólo preciso para el % de GC en el intervalo del 30% al 75%.

c L = longitud de dúplex en pares de base.

d Oligo, oligonucleótido; In, longitud eficaz de cebador = 2X(n.º de G/C)+(n.º de A/T).

Nota: para cada 1% de formamida, la Tm se reduce en aproximadamente de 0,6 a 0,7ºC, mientras que la presencia de urea 6 M reduce la Tm en aproximadamente 30ºC.

La especificidad de hibridación es normalmente la función de lavados tras la hibridación. Para eliminar el fondo que resulta de la hibridación no específica, se lavan las muestras con soluciones salinas diluidas. Los factores críticos de tales lavados incluyen la fuerza iónica y la temperatura de la disolución de lavado final: cuanto más baja sea la concentración salina y más alta sea la temperatura de lavado, más alta será la rigurosidad del lavado. Las 45 condiciones de lavado se llevan a cabo normalmente a o por debajo de la rigurosidad de hibridación. Generalmente, las condiciones de rigurosidad adecuadas para ensayos de hibridación de ácidos nucleicos o procedimientos de detección de amplificación génica son tal como se expusieron anteriormente. También pueden seleccionarse condiciones de rigurosidad superiores o inferiores. Generalmente, se seleccionan condiciones de rigurosidad bajas que son de aproximadamente 50ºC menos que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. Las condiciones de rigurosidad medias son cuando la temperatura es de 20ºC por debajo de la Tm, y las condiciones de rigurosidad altas son cuando la temperatura es de 10ºC por debajo de la Tm. Por ejemplo, condiciones rigurosas son aquellas que son al menos tan rigurosas como, por ejemplo, las condiciones A-L; y condiciones de rigurosidad reducidas son al menos tan rigurosas como, por ejemplo, condiciones M-R. Puede controlarse la unión no específica usando una cualquiera de varias técnicas conocidas tales como, por ejemplo,

bloqueo de la membrana con disoluciones que contienen proteína, adiciones de ARN, ADN heterólogo, y SDS al tampón de hibridación, y el tratamiento con RNasa. A continuación se enumeran ejemplos de condiciones de lavado e hibridación en la tabla 2.

Tabla 2: Ejemplos de condiciones de hibridación y lavado (continuación)

Condición de rigurosidad: Híbrido de polinucleótido r Longitud de híbrido (pb) ‡ Temperatura de hibridación y tampón † Temperatura de lavado y tampón †

A: ADN:ADN > o igual a 50 65ºC 1 X SSC; o 42ºC, 1 X SSC y 50% de formamida 65ºC; 0,3 X SSC

B: ADN:ADN <50 Tb*; 1 X SSC Tb*; 1 X SSC

C: ADN:ARN > o igual a 50 67ºC 1 X SSC; o 45ºC, 1 X SSC y 50% de formamida 67ºC; 0,3 X SSC

D: ADN:ARN <50 Td*; 1 X SSC Td*; 1 X SSC

E: ARN:ARN > o igual a 50 70ºC 1 X SSC; o 50ºC, 1 X SSC y 50% de formamida 70ºC: 0,3 X SSC

F: ARN:ARN <50 Tf*; 1 X SSC Tf*; 1 X SSC

G: ADN:ADN > o igual a 50 65ºC o 45ºC, 4 X SSC; o 4 X SSC y 50% de formamida 65ºC; 1 X SSC

H: ADN:ADN <50 Th*; 4 X SSC Th*; 4 X SSC

I: ADN:ARN > o igual a 50 67ºC 4 X SSC; o 45ºC, 4 X SSC y 50% de formamida 67ºC; 1 X SSC

J: ADN:ARN <50 Tj*; 4 X SSC Tj*; 4 X SSC

K: ARN:ARN > o igual a 50 70ºC 4 X SSC; 40ºC, 6 X SSC y 50% de formamida 67ºC 1 X SSC

L: ARN:ARN <50 T1*; 2 X SSC T1*; 2 X SSC

M: ADN:ADN > o igual a 50 50ºC 4 X SSC; o 40ºC, 6 X SSC y 50% de formamida 50ºC; 2 X SSC

N: ADN:ADN <50 Tn*; 6 X SSC Tn*; 6 X SSC

0: ADN:ARN > o igual a 50 55ºC 4 X SSC; o 42ºC, 6 X SSC y 50% de formamida 55ºC; 2 X SSC

P: ADN:ARN <50 Tp*; 6 X SSC Tp*; 6 X SSC

Q: ARN:ARN > o igual a 50 60ºC 4 X SSC; o 45ºC, 6 X SSC y 50% de formamida 60ºC.; 2 X SSC

R: ARN:ARN <50 Tr*; 6 X SSC Tr*; 4 X SSC

r La “longitud del híbrido” es la longitud prevista para el ácido nucleico de hibridación. Cuando se hibridan ácidos nucleicos de secuencia conocida, la longitud del híbrido puede determinarse alineando las secuencias e identificando las regiones conservadas descritas en el presente documento. † SSPE (1 X SSPE es NaCl 0,15 M, NaH2PO4 10 mM, y EDTA 1,25 mM, pH 7,4) puede sustituir a SSC (1 X SSC es NaCl 0,15 M y citrato de sodio 15 mM) en los tampones de hibridación y lavado; los lavados se realizan durante 15 minutos tras completarse la hibridación. Las hibridaciones y lavados pueden incluir adicionalmente 5 X reactivo de Denhardt, 0,5-1,0% de SDS, 100 Pg/ml DE ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado, 0,5% de pirofosfato de sodio y hasta el 50% de formamida. * Tb-Tr: la temperatura de hibridación para los híbridos que se prevé que van a ser inferiores a 50 pares de base de longitud debe ser de 5-10ºC menos que la temperatura de fusión Tm de los híbridos; la Tm se determina según las ecuaciones mencionadas anteriormente. La presente invención también abarca la sustitución de una cualquiera, o más parejas de híbridos de ADN o ARN con o bien un PNA, o bien un ácido nucleico modificado.

Para los fines de definición del nivel de rigurosidad, puede hacerse referencia a Sambrook et al., (2001) Molecular 5 Cloning: a laboratory manual, 3ª edición Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, Nueva York o a Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989).

Un ácido nucleico similar a DnaJ de tipo I puede derivarse de cualquier fuente natural o artificial. Este ácido nucleico puede modificarse con respecto a su forma nativa en composición y/o entorno genómico mediante manipulación humana deliberada. El ácido nucleico es o bien de origen procariota o bien eucariota, procede de una fuente 10 microbiana, tal como levaduras u hongos, o procede de una fuente vegetal, de algas o animal (incluyendo el ser humano). Preferiblemente, el ácido nucleico es de origen eucariota. El ácido nucleico es preferiblemente además de origen vegetal, ya sea de la misma especie de planta (por ejemplo la misma que en la que se va introducir) o de una especie de planta diferente. El ácido nucleico puede aislarse de una especie monocotiledónea, preferiblemente de la familia Poaceae, preferiblemente además de Oryza sativa. Más preferiblemente, el ácido nucleico similar a DnaJ de

15 tipo I aislado de Oryza sativa está representado por SEQ ID NO: 1 y la secuencia de aminoácidos similar a DnaJ de tipo I es tal como se representa por SEQ ID NO: 2.

Puede además aumentarse la actividad de un polipéptido similar a DnaJ de tipo I o un homólogo del mismo introduciendo una modificación genética (preferiblemente en el locus de un gen similar a DnaJ de tipo I). El locus de un gen tal como se define en el presente documento quiere decir una región genómica, que incluye el gen de interés

20 y 10KB en el sentido de 5’ ó 3’ de la región codificante.

La modificación genética puede introducirse, por ejemplo, mediante uno cualquiera (o más) de los siguientes métodos: activación por T-ADN, TILLING, mutagénesis dirigida al sitio, evolución dirigida y recombinación homóloga. Tras la introducción de la modificación genética, sigue una etapa opcional de selección de actividad aumentada en el citosol de una célula vegetal de un polipéptido similar a DnaJ de tipo I, aumento en actividad que proporciona

25 plantas que tienen un rendimiento vegetal aumentado en condiciones sin estrés.

El marcado de la activación por T-ADN (Hayashi et al., Science (1992) 1350-1353) implica la inserción de T-ADN que contiene habitualmente un promotor (también puede ser un potenciador de la traducción o un intrón), en la región genómica del gen de interés o 10 KB en el sentido de 5’ ó 3’ de la región codificante de un gen en una configuración tal que el promotor dirija la expresión del gen seleccionado como diana. Normalmente, la regulación de 30 la expresión del gen seleccionado como diana mediante su promotor natural se ve alterada y el gen cae bajo el control del promotor recién introducido. El promotor normalmente está incluido en un T-ADN. Este T-ADN se inserta al azar en el genoma vegetal, por ejemplo, mediante infección por Agrobacterium y conduce a la sobreexpresión de genes cercanos al T-ADN insertado. Las plantas transgénicas resultantes muestran fenotipos dominantes debido a la sobreexpresión de genes próximos al promotor introducido. El promotor que va introducirse puede ser cualquier 35 promotor que puede dirigir la expresión de un gen en el organismo deseado, en este caso una planta. Por ejemplo, los promotores constitutivos, específicos de tejido, específicos de tipo celular e inducibles son todos adecuados para

su uso en la activación por T-ADN. Preferiblemente, el promotor es uno que puede dirigir la expresión del gen en tejido de semilla vegetal.

También puede introducirse una modificación genética en el locus de un gen similar a DnaJ de tipo I usando la técnica de TILLING (de sus siglas en inglés “Targeted Induced Local Lesions in Genomes”, detección de lesiones locales inducidas en genomas). Se trata de una tecnología de mutagénesis útil para generar y/o identificar, y para aislar finalmente variantes sometidas a mutagénesis aisladas de un ácido nucleico similar a DnaJ de tipo I que puede presentar actividad similar a DnaJ. TILLING también permite la selección de plantas que llevan tales variantes mutantes. Estas variantes mutantes pueden presentar incluso actividad similar a DnaJ superior que la presentada por el gen en su forma natural. TILLING combina la mutagénesis de alta densidad con métodos de selección de alto rendimiento. Las etapas seguidas normalmente en TILLING son: (a) mutagénesis con EMS (Redei GP y Koncz C (1992) en Methods in Arabidopsis Research, Koncz C, Chua NH, Schell J, eds. Singapur, World Scientific Publishing Co, págs. 16-82; Feldmann et al., (1994) en Meyerowitz EM, Somerville CR, eds, Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, págs. 137-172; Lightner J y Caspar T (1998) en J Martinez-Zapater, J Salinas, eds, Methods in Molecular Biology, vol. 82. Human Press, Totowa, NJ, págs. 91-104); (b) preparación del ADN y reunión de moléculas individuales; (c) amplificación por PCR de una región de interés; (d) desnaturalización y apareamiento para permitir la formación de heterodúplex; (e) DHPLC, en el que se detecta la presencia de un heterodúplex en un conjunto como un pico extra en el cromatograma; (f) identificación de la molécula individual mutante; y (g) secuenciación del producto de PCR mutante. En la técnica se conocen bien los métodos para TILLING (McCallum et al., (2000) Nat Biotechnol 18: 455-457; revisado por Stemple (2004) Nat Rev Genet 5(2): 14550).

Puede usarse mutagénesis dirigida al sitio para generar variantes de ácidos nucleicos similares a DnaJ de tipo I o partes de los mismos. Varios métodos están disponibles para lograr la mutagénesis dirigida al sitio, siendo los más comunes los métodos basados en PCR (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Eds. http://www.4ulr.com/products/currentprotocols/index.html).

Puede usarse evolución dirigida que consiste en repeticiones de transposiciones de ADN seguido por detección y/o selección apropiadas para generar variantes de ácidos nucleicos similares a DnaJ de tipo I o partes de los mismos que codifican para polipéptidos similares a DnaJ de tipo I tal como se describió anteriormente que tienen una actividad biológica aumentada (Castle et al., (2004) Science 304(5674): 1151-4; patentes estadounidenses

5.811.238 y 6.395.547).

La activación por T-ADN, TILLING, la mutagénesis dirigida al sitio y la evolución dirigida son ejemplos de tecnologías que permiten la generación de alelos y variantes similares a DnaJ de tipo I novedosos.

La recombinación homóloga permite la introducción en un genoma de un ácido nucleico seleccionado en una posición seleccionada definida. La recombinación homóloga es una tecnología convencional usada de manera rutinaria en ciencias biológicas para organismos inferiores tales como levadura y el musgo Physcomitrella. Se han descrito métodos para realizar recombinación homóloga en plantas no sólo para plantas modelo (Offringa et al., (1990) EMBO J 9(10): 3077-84) sino también para plantas de cultivo, por ejemplo arroz (Terada et al., (2002) Nat Biotech 20(10): 1030-4; lida y Terada (2004) Curr Opin Biotech 15(2):132-8). El ácido nucleico que va a dirigirse (que puede ser un ácido nucleico similar a DnaJ de tipo I o variante del mismo tal como se definió anteriormente en el presente documento) se dirige al locus de un gen similar a DnaJ de tipo I. El ácido nucleico que va a dirigirse puede ser un alelo mejorado usado para sustituir el gen endógeno o puede introducirse además del gen endógeno.

Según la presente invención, se aumenta el rendimiento de semillas de plantas transformando una planta con un constructo que comprende un ácido nucleico exógeno que codifica para un polipéptido similar a DnaJ de tipo I tal como se define en la reivindicación 1 y que expresa dicho ácido nucleico. El ácido nucleico que va a introducirse en una planta puede se un ácido nucleico de longitud completa o puede ser una parte o una secuencia de hibridación tal como se definió anteriormente en el presente documento.

El término “exógeno” tal como se define en el presente documento se refiere a un gen/ácido nucleico aislado, que puede provenir de especies de plantas iguales o diferentes, por ejemplo un gen/ácido nucleico de arroz aislado introducido y/o expresado en una planta de arroz es “exógeno” según la definición anterior.

Los “homólogos” de una proteína abarcan péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que tienen sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos con respecto a la proteína no modificada en cuestión y tienen actividad biológica y funcional similar como la proteína no modificada de la cual derivan. Para producir tales homólogos, pueden sustituirse los aminoácidos de la proteína por otros aminoácidos que tienen propiedades similares (tal como hidrofobicidad, hidrofilicidad, antigenicidad, propensión a formar o romper estructuras de D-hélice

o estructuras de láminas E similares). En la técnica se conocen bien las tablas de sustitución conservativa (véase por ejemplo Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman and Company). La tabla 3 a continuación proporciona ejemplos de sustituciones de aminoácidos conservados.

Tabla 3: Ejemplos de sustituciones de aminoácidos conservadas

Residuo: Sustituciones conservativas Residuo Sustituciones conservativas

Ala: Ser Leu Ile; Val

Arg: Lys Lys Arg; Gln

Asn: Gln; His Met Leu; Ile

Asp: Glu Phe Met; Leu; Tyr

Gln: Asn Ser Thr; Gly

Cys: Ser Thr Ser; Val

Glu: Asp Trp Tyr

Gly: Pro Tyr Trp; Phe

His: Asn; Gln Val Ile; Leu

Ile: Leu, Val

Los homólogos incluyen ortólogos y parálogos, que abarcan conceptos evolutivos usados para describir relaciones

5 ancestrales de genes. Los parálogos son genes dentro de la misma especie que se han originado mediante la duplicación de un gen ancestral y los ortólogos son genes procedentes de diferentes organismos que se han originado mediante especiación.

Los ortólogos en, por ejemplo, especies de plantas monocotiledóneas puede encontrarse fácilmente realizando una denominada búsqueda en blast recíproca. Esto puede realizarse mediante un primer blast que implica una 10 secuencia de consulta (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2) frente a cualquier base de datos de secuencias, tal como la base de datos de NCBI disponible al público que puede encontrarse en: http: //www.ncbi.nlm.nih.gov. Puede usarse BLASTN o TBLASTX (usando valores por defecto convencionales) cuando se empiece a partir de una secuencia de nucleótidos y puede usarse BLASTP o TBLASTN (usando valores por defecto convencionales) cuando se empiece a partir de una secuencia proteica. Opcionalmente pueden filtrarse los resultados de BLAST. Entonces 15 se someten a BLAST nuevamente (segundo BLAST) las secuencias de longitud completa de o bien los resultados filtrados o bien los no filtrados frente a las secuencias del organismo de la cual se deriva la secuencia de consulta (siendo la secuencia de consulta SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, por tanto el segundo blast estaría frente a las secuencias de arroz). Entonces se comparan los resultados del BLAST primero y segundo. Se identifica un parálogo si una coincidencia de alto impacto del segundo blast proviene de la misma especie de la que se deriva la secuencia 20 de consulta; se identifica un ortólogo si una coincidencia de alto impacto no proviene de la misma especie de la que se deriva la secuencia de consulta. Coincidencias de alto impacto son las que tienen un valor de E bajo. Cuanto más bajo sea el valor de E, más significativa es la puntuación (o en otras palabras, menor es la posibilidad de que se encuentre la coincidencia por casualidad). Se conoce bien en la técnica el cálculo del valor de E. En el caso de familias grandes, puede usarse ClustalW, seguido por un árbol de unión por proximidad, para ayudar a visualizar el

25 agrupamiento de genes relacionados y para identificar ortólogos y parálogos.

Un homólogo puede estar en la forma de una “variante de sustitución” de una proteína, es decir en el que se ha eliminado al menos un residuo en una secuencia de aminoácidos y se ha insertado un residuo diferente en su lugar. Normalmente las sustituciones de aminoácidos son de residuos individuales, pero pueden agruparse dependiendo de las limitaciones funcionales del polipéptido; las inserciones habitualmente serán del orden de aproximadamente 1

30 a 10 residuos de aminoácidos. Preferiblemente, las sustituciones de aminoácidos comprenden sustituciones de aminoácidos conservativas (véase la tabla 3 anterior).

Un homólogo también puede estar en la forma de una “variante de inserción” de una proteína, es decir en el que se introducen uno o más residuos de aminoácidos en un sitio predeterminado en una proteína. Las inserciones pueden comprender fusiones de extremo amino terminal y/o extremo carboxilo terminal así como inserciones dentro de una 35 secuencia de un único o múltiples aminoácidos. Generalmente, las inserciones dentro de las secuencia de aminoácidos serán más pequeñas que las fusiones de extremo amino o extremo carboxilo terminal, del orden de aproximadamente 1 a 10 residuos. Ejemplos de proteínas o péptidos de fusión de extremo amino o extremo carboxilo terminal incluyen el dominio de unión o el dominio de activación de un activador de la transcripción tal como se usa en el sistema de dos híbridos de levadura, proteínas de la envuelta de fagos, cola de 6 (histidinas), cola 40 de glutatión S-transferasa, proteína A, proteína de unión a maltosa, dihidrofolato reductasa, epítopo de Tag-100,

epítopo de c-myc, epítopo de FLAG®, lacZ, CMP (péptido de unión a calmodulina), epítopo de HA, epítopo de proteína C y epítopo de VSV.

Los homólogos en la forma de “variantes de deleción” de una proteína se caracterizan por la eliminación de uno o más aminoácidos de una proteína. Un ejemplo de una variante de deleción de este tipo es eliminar las secuencias de direccionamiento a mitocondrias o plastidios de las proteínas similares a DnaJ de tipo I dirigidas de otro modo a estos orgánulos.

Las variantes de aminoácidos de una proteína pueden prepararse fácilmente usando técnicas de síntesis de péptidos bien conocidas en la técnica, tales como síntesis de péptidos en fase sólida y similares, o mediante manipulación de ADN recombinante. En la técnica se conocen bien los métodos para la manipulación de secuencias de ADN para producir variantes de sustitución, inserción o deleción de una proteína. Por ejemplo, los expertos en la técnica conocen bien las técnicas para realizar mutaciones por sustitución en sitios predeterminados en el ADN e incluyen mutagénesis de M13, mutagénesis in vitro del gen de T7 (USB, Cleveland, OH), mutagénesis dirigida al sitio QuickChange (Stratagene, San Diego, CA), mutagénesis dirigida al sitio mediada por PCR u otros protocolos de mutagénesis dirigida al sitio.

El polipéptido similar a DnaJ de tipo I puede ser un derivado. Los “derivados” incluyen péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que pueden comprender sustituciones, deleciones o adiciones de residuos de aminoácidos que se producen de forma natural o no natural en comparación con la secuencia de aminoácidos de una forma de la proteína que se produce de forma natural, por ejemplo, tal como se presenta en SEQ ID NO: 2. Los “derivados” de una proteína abarcan péptidos, oligopéptidos, polipéptidos y enzimas que pueden comprender residuos de aminoácidos alterados, glicosilados, acilados, prenilados que se producen de forman natural o que no se producen de forma natural en comparación con la secuencia de aminoácidos de una forma del polipéptido que se produce de forma natural. Un derivado también puede comprender uno o más sustituyentes de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de la que se deriva, por ejemplo una molécula indicadora u otro ligando, unido covalente o no covalentemente a la secuencia de aminoácidos, tal como una molécula indicadora que se une para facilitar su detección, y residuos de aminoácidos que no se producen de forma natural con respecto a la secuencia de aminoácidos de una proteína que no se produce de forma natural.

El polipéptido similar a DnaJ de tipo I puede estar codificado por una variante de corte y empalme alternativa de un ácido nucleico/gen similar a DnaJ de tipo I. La expresión “variante de corte y empalme alternativa” tal como se usa en el presente documento abarca variantes de una secuencia de ácido nucleico en la que se han escindido, sustituido o añadido intrones y/o exones seleccionados, o en la que se han acortado o alargado intrones. Tales variantes serán unas en las que se conserva la actividad biológica de la proteína, lo que puede lograrse conservando selectivamente segmentos funcionales de la proteína. Tales variantes de corte y empalme pueden encontrarse en la naturaleza o pueden prepararse por el hombre. Los métodos para preparar tales variantes de corte y empalme se conocen bien en la técnica. Debe entenderse que las variantes de corte y empalme que codifican para un polipéptido que es un polipéptido similar a DnaJ de tipo I comprenden un motivo CaaX en su extremo carboxilo terminal y comprenden adicionalmente, desde el extremo amino terminal hasta el extremo carboxilo terminal, (i) un dominio J con referencia de InterPro IPR001623; (ii) una región de dominio G/F de aproximadamente 30 residuos de aminoácidos, rico en glicina (G) y fenilalanina (F); (iii) un dominio de dedo de zinc rico en Cys que contiene cuatro repeticiones de CXXCXGXG, en el que X representa un residuo cargado o polar (referencia de InterPro IPR001305); y (iv) un dominio carboxilo terminal (CTD; referencia de InterPro IPR002939).

El homólogo también puede estar codificado por una variante alélica de un ácido nucleico que codifica para un polipéptido similar a DnaJ de tipo I o un homólogo del mismo, preferiblemente una variante alélica del ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 1. Preferiblemente además, el polipéptido codificado por la variante alélica es un polipéptido similar a DnaJ de tipo I, comprendiendo el polipéptido similar a DnaJ de tipo I un motivo CaaX en su extremo carboxilo terminal y comprendiendo adicionalmente, desde el extremo amino terminal hasta el extremo carboxilo terminal, (i) un dominio J con referencia de InterPro IPR001623; (ii) una región de dominio G/F de aproximadamente 30 residuos de aminoácidos, rico en glicina (G) y fenilalanina (F); (iii) un dominio de dedo de zinc rico en Cys que contiene cuatro repeticiones de CXXCXGXG, en el que X representa un residuo cargado o polar (referencia de InterPro IPR001305); y (iv) un dominio carboxilo terminal (CTD; referencia de InterPro IPR002939).

Las variantes alélicas existen en la naturaleza, y dentro de los métodos de la presente invención se abarca el uso de estos alelos naturales. Las variantes alélicas abarcan polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), así como polimorfismos pequeños de inserción/deleción (INDEL). El tamaño de los INDEL es habitualmente inferior a 100 pb. Los SNP y los INDEL forman el conjunto más grande de variantes de secuencia en cepas polimórficas que se producen de forma natural en la mayoría de organismos.

Según un aspecto preferido de la presente invención, se prevé la expresión potenciada o aumentada del ácido nucleico similar a DnaJ de tipo I o variante del mismo. Los métodos para obtener la expresión potenciada o aumentada de genes o productos génicos están bien documentados en la técnica e incluyen, por ejemplo, la sobreexpresión dirigida por promotores apropiados, el uso de potenciadores de la transcripción o potenciadores de la traducción. Los ácidos nucleicos aislados que sirven como elementos promotores o potenciadores pueden introducirse en una posición apropiada (normalmente en el sentido de 5’) de una forma no heteróloga de un polinucelótido de modo que se regule por aumento la expresión de un ácido nucleico similar a DnaJ de tipo I o variante del mismo. Por ejemplo, pueden alterarse in vivo promotores endógenos por mutación, deleción y/o sustitución (véase, Kmiec, patente estadounidense n.º 5.565.350; Zarling et al., documento PCT/US93/03868), o pueden introducirse promotores aislados en una célula vegetal en la orientación y distancia apropiadas de un gen de la presente invención de modo que se controle la expresión del gen.

Si se desea la expresión del polipéptido, generalmente es deseable que incluya una región de poliadenilación en el extremo 3’ de una región codificante del polinucleótido. La región de poliadenilación puede derivarse del gen natural, de una variedad de otros genes vegetales o de T-ADN. La secuencia de extremo 3’ que va a añadirse puede derivarse de, por ejemplo, los genes de nopalina sintasa u octopina sintasa, o alternativamente de otro gen vegetal,

o menos preferiblemente de cualquier otro gen eucariota.

También puede añadirse una secuencia intrónica a la región no traducida en 5’ o a la secuencia codificante de la secuencia codificante parcial para aumentar la cantidad del mensaje maduro que se acumula en el citosol. Se ha demostrado que la inclusión de un intrón que puede experimentar corte y empalme en la unidad de transcripción tanto en constructos de expresión de plantas como de animales aumenta la expresión génica tanto en los niveles de ARNm como de proteína hasta 1000 veces, Buchman y Berg, Mol. Cell biol. 8:4395-4405 (1988); Callis et al., Genes Dev. 1:1183-1200 (1987). Tal potenciación intrónica de la expresión génica normalmente es superior cuando se coloca cerca del extremo 5’ de la unidad de transcripción. En la técnica se conoce el uso de los intrones del maíz intrón Adh1-S 1, 2 y 6, el intrón Bronze-1. Véase generalmente, The maize Handbook, capítulo 116, Freeling y Walbot, Eds., Springer, N.Y. (1994).

La invención también proporciona un constructo génico que comprende:

(i): un ácido nucleico o variante del mismo que codifica para un polipéptido similar a DnaJ de tipo I, comprendiendo el polipéptido similar a DnaJ de tipo I u homólogo del mismo un motivo CaaX en su extremo carboxilo terminal y comprendiendo adicionalmente, desde el extremo amino terminal hasta el extremo carboxilo terminal, (i) un dominio J con referencia de InterPro IPR001623; (ii) una región de dominio G/F de aproximadamente 30 residuos de aminoácidos, rico en glicina (G) y fenilalanina (F); (iii) un dominio de dedo de zinc rico en Cys que contiene cuatro repeticiones de CXXCXGXG, en el que X representa un residuo cargado o polar (referencia de InterPro IPR001305); y (iv) un dominio carboxilo terminal (CTD; referencia de InterPro IPR002939); y

(ii): una o más secuencias de control que pueden dirigir la expresión de la secuencia de ácido nucleico de (i) en una semilla de planta y que comprenden un promotor RP6 de prolamina de arroz; y opcionalmente

(iii) una secuencia de terminación de la transcripción.

Los constructos útiles en los métodos según la presente invención pueden construirse usando tecnología de ADN recombinante bien conocida por los expertos en la técnica. Los constructos génicos pueden insertarse en vectores, que pueden estar disponibles comercialmente, ser adecuados para transformar en plantas y adecuados para la expresión del gen de interés en las células transformadas.

Las plantas se transforman con un vector que comprende la secuencia de interés (es decir, ácido nucleico o variante del mismo que codifica para un polipéptido similar a DnaJ de tipo I u homólogo del mismo que comprende un motivo CaaX en su extremo carboxilo terminal). La secuencia de interés está operativamente unida a una o más secuencias de control (al menos a un promotor). Las expresiones “elemento regulador”, “secuencia de control” y “promotor” se usan todas de forma intercambiable en el presente documento y han de considerarse en un contexto amplio para hacer referencia a secuencias de ácido nucleico reguladoras que pueden llevar a cabo la expresión de las secuencias a las que se unen. Las expresiones mencionadas anteriormente abarcan secuencias reguladoras de la transcripción derivadas de un gen genómico eucariota (que incluyen la caja TATA que se requiere para el inicio preciso de la transcripción, con o sin una secuencia de caja CCAAT) y elementos reguladores adicionales (es decir silenciadores, potenciadotes y secuencias de activación en el sentido de 5’) que alteran la expresión génica en respuesta a estímulos de desarrollo y/o externos, o de una manera específica de tejido. También se incluye dentro de la expresión una secuencia reguladora de la transcripción de un gen procariota clásico, en cuyo caso puede incluir una secuencia de caja -35 y/o secuencias reguladoras de la transcripción de caja -10. La expresión “elemento regulador” también abarca una molécula de fusión sintética o derivado que confiere, activa o potencia la expresión de una molécula de ácido nucleico en una célula, tejido u órgano. La expresión “operativamente unido” tal como se usa en el presente documento se refiere a un ligamiento funcional entre la secuencia promotora y el gen de interés, de modo que la secuencia promotora puede iniciar la transcripción del gen de interés.

De manera ventajosa, puede usarse cualquier tipo de promotor, ya sea natural o sintético, para dirigir la expresión de la secuencia del ácido nucleico. Preferiblemente, el promotor es un promotor específico de tejido, es decir uno que puede iniciar preferentemente la transcripción en determinados tejidos, tales como las hojas, las raíces, tejido de semilla, etc. Particularmente se prefieren los promotores derivados de plantas, especialmente promotores específicos de tejido derivados de planta. La expresión “específico de tejido” tal como se define en el presente documento se refiere a un promotor que se expresa predominantemente en al menos un tejido u órgano vegetal, pero que puede tener expresión residual en cualquier parte de la planta debido a la expresión con pérdidas del

promotor. Preferiblemente además, el promotor específico de tejido es un promotor específico de semilla, más particularmente un promotor aislado de un gen que codifica para una proteína de almacenamiento en semillas, especialmente un promotor específico de endospermo. Lo más preferiblemente se aísla el promotor específico de endospermo de un gen de prolamina, tal como un promotor de prolamina de arroz RP6 (Wen et al., (1993) Plant 5 Physiol 101(3): 1115-6) tal como se representa por SEQ ID NO: 57, o un promotor de potencia similar y/o un promotor con un patrón de expresión similar que el promotor de prolamina de arroz. Puede analizarse la potencia similar y/o el patrón de expresión similar, por ejemplo, acoplando los promotores a un gen indicador y comprobando la función el gen indicador en los tejidos de la planta. Un gen indicador bien conocido es beta-glucuronidasa y la tinción colorimétrica GUS usada para visualizar la actividad beta-glucuronidasa en tejido vegetal. Debe quedar claro

10 que no se restringe la aplicabilidad de la presente invención al ácido nucleico similar a DnaJ de tipo I representado por SEQ ID NO: 1, ni se restringe la aplicabilidad de la invención a la expresión de un ácido nucleico similar a DnaJ de tipo I cuando se activa mediante un promotor de prolamina.

Ejemplos de promotores específicos de semillas se presentan en la tabla 4, cuyos promotores y derivados de los mismos son útiles en la realización de los métodos tal como se dan a conocer en el presente documento. Debe

15 entenderse que la lista a continuación no es exhaustiva.

Tabla 4: Ejemplos de promotores específicos de semillas para su uso en la presente invención

FUENTE DEL GEN: PATRÓN DE EXPRESIÓN REFERENCIA

genes específicos de semillas: semilla Simon, et al., Plant Mol. Biol. 5: 191, 1985; Scofield, et al., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987; Baszczynski, et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990.

albúmina de nuez de Brasil: semilla Pearson, et al., Plant Mol. Biol. 18: 235-245, 1992.

legúmina: semilla Ellis, et al., Plant Mol. Biol. 10: 203-214, 1988.

glutelina (arroz): semilla Takaiwa, et al., Mol. Gen. Genet. 208: 15-22, 1986; Takaiwa, et al., FEBS Letts. 221: 43-47, 1987.

zeína: semilla Matzke et al., Plant Mol Biol, 14(3): 323-32, 1990.

napA: semilla Stalberg, et al., Planta 199: 515- 519 , 1996.

glutenina-1 de AMP y BMP de trigo: endospermo Mol Gen Genet 216:81-90, 1989; NAR 17: 461-2, 1989.

SPA de trigo: semilla Albani et al., Plant Cell, 9: 171-184, 1997.

D,E,J-gliadinas de trigo: endospermo EMBO 3:1409-15, 1984.

promotor de Itr1 de cebada: endospermo

(continuación)

FUENTE DEL GEN: PATRÓN DE EXPRESIÓN REFERENCIA

hordeína B1, C, D, de cebada: endospermo Theor Appl Gen 98:1253-62, 1999; Plant J 4: 343-55, 1993; Mol Gen Genet 250:750-60, 1996.

DOF de cebada: endospermo Mena et al., The Plant Journal, 116(1): 53-62, 1998.

blz2: endospermo Documento EP99106056.7

promotor sintético: endospermo Vicente-Carbajosa et al., Plant J. 13: 629-640, 1998.

prolamina NRP33 de arroz: endospermo Wu et al., Plant Cell Physiology 39(8) 885-889, 1998.

D-globulina de arroz Glb-1: endospermo Wu et al., Plant Cell Physiology 39(8) 885-889, 1998.

OSH1 de arroz: embrión Sato et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117-8122, 1996.

D-globulina de arroz REB/OHP-1: endospermo Nakase et al., Plant Mol. Biol. 33: 513-522, 1997.

ADP-glucosa de arroz PP: endospermo Trans Res 6:157-68, 1997.

familia génica ESR de maíz: endospermo Plant J 12:235-46, 1997.

Ȗ-kafirina de sorgo: endospermo PMB 32:1029-35, 1996.

KNOX: embrión Postma-Haarsma et al., Plant Mol. Biol. 39: 257-71, 1999.

oleosina de arroz: embrión y aleurona Wu et al., J. Biochem., 123:386, 1998.

oleosina de girasol: semilla (embrión y semilla seca) Cummins et al., Plant Mol. Biol. 19: 873-876, 1992.

Opcionalmente, también pueden usarse una o más secuencias terminadoras en el constructo introducido en una

5 planta. El término “terminador” abarca una secuencia de control que es una secuencia de ADN en el extremo de una unidad de transcripción que señala procesamiento en 3’ y poliadenilación de un transcrito primario y terminación de la transcripción. Elementos reguladores adicionales pueden incluir también potenciadores de la transcripción y de la traducción. Los expertos en la técnica conocen las secuencias terminadoras y potenciadoras que pueden ser adecuadas en la realización de la invención. Un experto en la técnica conocería tales secuencias o podría obtenerlas

10 fácilmente.

Los constructos genéticos tal como se dan a conocer en el presente documento pueden incluir adicionalmente una secuencia de origen de replicación que se requiere para el mantenimiento y/o la replicación en un tipo de célula específico. Un ejemplo es cuando se requiere un constructo genético que va a mantenerse en una célula bacteriana como un elemento genético episómico (por ejemplo molécula de plásmido o cósmido). Los orígenes de replicación

15 preferidos incluyen, pero no se limitan a, el f1-ori y colE1.

El constructo genético puede comprender opcionalmente un gen marcador seleccionable. Tal como se usa en el presente documento, la expresión “gen marcador seleccionable” incluye cualquier gen que confiere un fenotipo en una célula en la que éste se expresa para facilitar la identificación y/o selección de células que se transfectan o transforman con un constructo de ácido nucleico de la invención. Pueden seleccionarse marcadores adecuados a 20 partir de marcadores que confieren resistencia a antibióticos o a herbicidas, que introducen un nuevo rasgo metabólico o que permiten la selección visual. Ejemplos de genes marcadores seleccionables incluyen genes que confieren resistencia a antibióticos (tal como nptll que fosforila la neomicina y la kanamicina, o hptll, que fosforila la higromicina), a herbicidas (por ejemplo bar que proporciona resistencia a Basta; aroA o gox que proporciona resistencia a glifosato), o los genes que proporcionan un rasgo metabólico (tal como manA que permite que las 25 plantas usen manosa como única fuente de carbono). Los genes marcadores visuales dan como resultado la formación de color (por ejemplo E-glucuronidasa, GUS), luminiscencia (tal como luciferasa) o fluorescencia (proteína

fluorescente verde, GFP, y derivados de la misma).

La presente invención también abarca plantas tal como se define en las reivindicaciones 9 y 10.

La invención también proporciona un método para la producción de plantas transgénicas que tienen rendimiento de semillas aumentado cuando se hacen crecer en condiciones de crecimiento normales, que comprende transformar una planta definida en la reivindicación 1.

El constructo puede introducirse directamente en una célula vegetal o en la propia planta (incluyendo la introducción en un tejido, órgano o cualquier otra parte de una planta). El ácido nucleico se introduce en una planta mediante transformación.

El término “transformación” tal como se hace referencia en el presente documento abarca la transferencia de un polinucleótido exógeno en una célula huésped, independientemente del método usado para la transferencia. El tejido vegetal que puede someterse a propagación clonal posterior, ya sea mediante organogénesis o embriogénesis, puede transformarse con un constructo genético de la presente invención y regenerarse una planta completa a partir del mismo. El tejido particular elegido variará dependiendo de los sistemas de propagación clonal disponibles para, y que mejor se adapten a, la especie particular que está transformándose. Dianas tisulares a modo de ejemplo incluyen discos de hojas, polen, embriones, cotiledones, hipocótilos, megagametofitos, tejido calloso, tejido meristemático existente (por ejemplo, meristemo apical, yemas axilares y meristemos radiculares), y tejido meristemático inducido (por ejemplo, meristemo de cotiledón y meristemo de hipocótilo). El polinucleótido puede introducirse de manera transitoria o estable en una célula huésped y mantenerse no integrado, por ejemplo, como un plásmido. Alternativamente, puede integrarse en el genoma del huésped. La célula vegetal transformada resultante puede usarse entonces para regenerar una planta transformada de una manera conocida por los expertos en la técnica.

La transformación de especies de plantas es en la actualidad una técnica bastante rutinaria. De manera ventajosa, puede usarse cualquiera de varios métodos de transformación para introducir el gen de interés en una célula antecesora adecuada. Los métodos de transformación incluyen el uso de liposomas, electroporación, productos químicos que aumentan la captación de ADN libre, inyección del ADN directamente en la planta, bombardeo con pistola de partículas, transformación usando virus o polen y microproyección. Los métodos pueden seleccionarse del método de calcio/polietilenglicol para protoplastos (Krens FA et al., (1982) Nature 296, 72-74; NegrutiuI et al., (1987) Plant Mol Biol 8: 363-373); electroporación de protoplastos (Shillito RD et al., 1985 Bio/Technol 3, 1099-1102); microinyección en material vegetal (Crossway A et al., (1986) Mol. Gen Genet 202: 179-185); bombardeo de partículas recubiertas con ADN o ARN (Klein TM et al., (1987) Nature 327: 70) infección con virus (no integrativos) y similares. Se producen preferiblemente plantas de arroz transgénicas que expresan un gen/ácido nucleico similar a DnaJ de tipo I mediante transformación mediada por Agrobacterium usando cualquiera de los métodos bien conocidos para la transformación del arroz, tal como se describe en cualquiera de los siguientes: solicitud de patente europea publicada EP 1198985 A1, Aldemita y Hodges (Planta 199: 612-617, 1996); Chan et al., (Plant Mol Biol 22 (3): 491-506, 1993), Hiei et al., (Plant J 6 (2): 271-282, 1994), cuyas descripciones se incorporan como referencia en el presente documento como si se expusieran completamente. En el caso de la transformación del maíz, el método preferido es tal como se describe en o bien Ishida et al., (Nat. Biotechnol 14(6): 745-50, 1996) o bien Frame et al., (Plant Physiol 129(1): 13-22, 2002), cuyas descripciones se incorporan como referencia en el presente documento como si se expusieran completamente.

Generalmente tras la transformación, se seleccionan células vegetales o agrupaciones celulares para detectar la presencia de uno o más marcadores que están codificados por genes que pueden expresarse en plantas cotransfectadas con el gen de interés, tras lo cual el material transformado se regenera para dar una planta completa.

Tras la transferencia de ADN y la regeneración, pueden evaluarse las supuestas plantas transformadas, por ejemplo usando análisis de tipo Southern, para detectar la presencia del gen de interés, el número de copias y/o la organización genómica. Alternativa o adicionalmente, pueden monitorizarse los niveles de expresión del ADN recién introducido usando análisis de tipo Northern y/o Western, siendo ambas técnicas bien conocidas para los expertos habituales en la técnica.

Las plantas transformadas generadas pueden propagarse mediante una variedad de medios, tales como mediante propagación clonal o técnicas de reproducción clásicas. Por ejemplo, puede autofecundarse una planta transformada de primera generación (o T1) para dar transformantes de segunda generación (o T2) homocigotos, y propagarse adicionalmente las plantas T2 mediante técnicas de reproducción clásicas.

Los organismos transformados generados pueden tener una variedad de formas. Por ejemplo, pueden ser quimeras de células transformadas y de células no transformadas; transformantes clonales (por ejemplo, todas las células transformadas para contener el casete de expresión); injertos de tejido transformado y no transformado (por ejemplo, en plantas, un rizoma transformado injertado en un esqueje no transformado).

También se da a conocer una célula vegetal o planta producida por cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, y todas las partes de plantas y propágulos de las mismas. También se da a conocer una progenie de una célula, un tejido, un órgano o una planta completa transformada o transfectada primaria que se ha producido mediante cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, siendo el único requisito que la progenie presente la(s) misma(s) característica(s) genotípica(s) y/o fenotípica(s) que las producidas en el progenitor mediante los métodos según la invención. También se dan a conocer células huésped que contienen un ácido nucleico aislado similar a DnaJ de tipo I o variante del mismo. Células huésped preferidas son células vegetales. También se dan a conocer partes que pueden cosecharse de una planta tal como pero sin limitarse a semillas, hojas, frutos, flores, cultivos de tallos, rizomas, túberos y bulbos. También se dan a conocer productos derivados, preferiblemente derivados directamente de una parte que puede cosecharse de una planta de este tipo, tales productos puede ser polvos o gránulos secos, aceites, grasas y ácidos grasos, almidón o proteínas.

Los ácidos nucleicos similares a DnaJ de tipo I o los polipéptidos similares a DnaJ de tipo I pueden encontrar uso en programas de reproducción en el que se identifica un marcador de ADN que puede ligarse genéticamente a un gen similar a DnaJ de tipo I o variante del mismo. Los ácidos nucleicos/genes similares a DnaJ de tipo I o los polipéptidos similares a DnaJ de tipo I pueden usarse para definir un marcador molecular. Este ADN o proteína marcadora puede usarse entonces en programas de reproducción para seleccionar plantas que tienen un rendimiento vegetal aumentado. El gen similar a DnaJ de tipo I o variante del mismo puede, por ejemplo, ser un ácido nucleico que se representa por una cualquiera de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51 SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 55 de la tabla 1.

Las variantes alélicas de un gen/ácido nucleico similar a DnaJ de tipo I también pueden encontrar uso en programas de reproducción asistida por marcador. Tales programas de reproducción requieren algunas veces la introducción de variación alélica mediante tratamiento mutagénico de las plantas, usando por ejemplo mutagénesis con EMS; alternativamente, el programa puede iniciarse con una colección de variantes alélicas de denominado origen “natural” provocadas involuntariamente. La identificación de las variantes alélicas tiene lugar entonces, por ejemplo, mediante PCR. A esto le sigue una etapa para la selección de variantes alélicas superiores de la secuencia en cuestión y que proporcionan un aumento del rendimiento mejorado en una planta. La selección normalmente se lleva a cabo mediante la monitorización de las prestaciones de rendimiento de plantas que contienen plantas que contienen diferentes variantes alélicas de la secuencia en cuestión, por ejemplo, diferentes variantes alélicas de una cualquiera de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51 SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 55 de la tabla 1. Pueden monitorizarse las prestaciones de rendimiento en un invernadero o en el campo. Etapas opcionales adicionales incluyen el cruzamiento de plantas, en las que se identificó la variante alélica superior, con otra planta. Esto podría usarse, por ejemplo, para preparar una combinación de características fenotípicas interesantes.

También puede usarse un ácido nucleico similar a DnaJ de tipo I como sondas para mapear genética y físicamente los genes de los que forman parte, y como marcadores para rasgos ligados a esos genes. Tal información puede ser útil en la reproducción de plantas con el fin de desarrollar líneas con fenotipos deseados. Tal uso de ácidos nucleicos similares a DnaJ de tipo I requiere sólo una secuencia de ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos de longitud. Los ácidos nucleicos similares a DnaJ de tipo I pueden usarse como marcadores de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP). Las transferencias de tipo Southern (Sambrook J, Fritsch EF y Maniatis T (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual) de ADN genómico vegetal digerido por restricción pueden estudiarse con sondas con los ácidos nucleicos similares a DnaJ de tipo I. Los patrones de bandas resultantes pueden someterse entonces a análisis genéticos usando programas informáticos tales como MapMaker (Lander et al., (1987) Genomics 1: 174-181) con el fin de construir un mapa genético. Además, pueden usarse los ácidos nucleicos para estudiar con sondas las transferencias de tipo Southern que contienen ADN genómicos tratados con endonucleasas de restricción de un conjunto de individuos que representan los progenitores y la progenie de una cruce genético definido. Se observa y se usa la segregación de los polimorfismos de ADN para calcular la posición del ácido nucleico similar a DnaJ de tipo I o variante del mismo en el mapa genético obtenido previamente usando esta población (Botstein et al., (1980) Am. J. Hum. Genet. 32:314-331).

La producción y el uso de sondas derivadas de genes vegetales para su uso en el mapeo genético se describe en Bematzky y Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37-41. Numerosas publicaciones describen el mapeo genético específico de clones de ADNc específicos usando la metodología explicada de manera resumida anteriormente o variaciones de la misma. Por ejemplo, pueden usarse poblaciones de intercruces F2, poblaciones de retrocruces, poblaciones apareadas al azar, líneas isogénicas cercanas y otros conjuntos de individuos para el mapeo. Tales metodologías las conocen bien los expertos en la técnica.

Las sondas de ácido nucleico también pueden usarse para el mapeo físico (es decir, colocación de secuencias en mapas físicos; véase Hoheisel et al., en: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press 1996, págs. 319-346, y referencias citadas en el mismo).

Las sondas de ácido nucleico pueden usarse en mapeo por hibridación in situ por fluorescencia directa (FISH) (Trask (1991) Trends Genet. 7:149-154). Aunque los métodos actuales del mapeo por FISH favorecen el uso de clones grandes (de varios kb a varios cientos de kb; véase Laan et al., (1995) Genome Res. 5:13-20), mejoras en la sensibilidad pueden permitir la realización del mapeo por FISH usando sondas más cortas.

5 Puede llevarse a cabo una variedad de métodos basados en la amplificación de ácidos nucleicos para el mapeo genético y físico usando los ácidos nucleicos. Los ejemplos incluyen amplificación específica de alelos (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11:95-96), polimorfismo de fragmentos amplificados por PCR (CAPS; Sheffield et al., (1993) Genomics 16:325-332), ligamiento específico de alelo (Landegren et al., (1988) Science 241:1077-1080), reacciones de extensión de nucleótidos (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18:3671), mapeo de hibridos de radiación (Walter et

10 al., (1997) Nat. Genet. 7:22-28) y mapeo Happy (Dear y Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17:6795-6807). Para estos métodos, se usa la secuencia de un ácido nucleico para diseñar y producir pares de cebadores para su uso en la reacción de amplificación o en reacciones de extensión de cebador. El diseño de tales cebadores lo conocen bien los expertos en la técnica. En métodos que emplean mapeo genético basado en PCR, puede ser necesario identificar diferencias en la secuencia de ADN entre los progenitores del cruce de mapeo en la región

15 correspondiente a la secuencia de ácido nucleico presente. Esto, sin embargo, generalmente no es necesario para los métodos de mapeo.

La realización de los métodos según la presente invención da como resultado plantas que tiene un rendimiento de semillas aumentado en plantas hechas crecer en condiciones de crecimiento normales, tal como se describió anteriormente en el presente documento. Este rendimiento de semillas aumentado también puede combinarse con

20 otros rasgos económicamente ventajosos, tales como además rasgos de potenciación del rendimiento, tolerancia a diversos tipos de estrés, rasgos que modifican diversas características arquitéctonicas y/o características bioquímicas y/o fisiológicas.

Descripción de las figuras

La presente invención se describirá a continuación con referencia a las siguientes figuras en las que:

25 La figura 1 muestra la estructura de dominios típica del polipéptido similar a DnaJ de tipo I. El dominio J está ubicado en el extremo amino terminal de la proteína y codifica para un dominio de unión a HSP70 que comprende el tripéptido HPD altamente conservado. El dominio G/F rico en glicina y fenilalanina está especificando proteínas diana para la actividad de la chaperona Hsp70. Los cuatro dominios ricos en cisteína están implicados en la coordinación del zinc, con dos iones zinc por monómero de DnaJ de tipo I. El dominio CTD es el menos conservado

30 de los cuatro dominios definidos, y puede comprender un motivo de farnesilación CaaX.

La figura 2 muestra una alineación múltiple de varias proteínas similares a DnaJ de tipo I de la tabla 1, usando el programa de alineación múltiple VNTI AlignX, basado en un algoritmo ClustalW modificado (InforMax, Bethesda, MD, http://www.informaxinc.com), con parámetros por defecto de penalización por abertura de hueco de 10 y una extensión de hueco de 0,05). El dominio J tiene subrayado doble, sus cuatro hélices representadas como recuadros

35 grises y su tripéptido HPD conservado en recuadro. El dominio G/F está subrayado con puntos. Los dos dominios I y II de unión a zinc y sus CxxCxGxG conservados están en recuadros. En el dominio CTD, el motivo de farnesilación está en recuadro.

La figura 3 muestra una alineación de polipéptidos similares a DnaJ de tipo I de Arabidopsis thaliana tal como se da a conocer en la tabla a continuación. El dominio J tiene subrayado doble, el dominio G/F está subrayado en negrita,

40 los dos dominios I y II de unión a zinc y sus CxxCxGxG conservados están en recuadros, y el CTD tiene subrayado sencillo. El motivo de farnesilación CaaX en el extremo carboxilo terminal de las proteínas está representado en negrita cuando está presente. Las secuencias de aminoácidos que preceden al dominio J (separadas por un paréntesis; ubicación aproximada) representan secuencias de direccionamiento subcelular.

Número de registro de MIPS: Número de registro de proteínas del NCBI

At3g44110: S71199

At5g22060: AAB86799.1

At1g28210: NP849719

At1g80030: AAK60328

At2g22360: AAD22362

At3g 17830: NM112664

At4g39960: AAL36077

At5g48030: BAB11067

La figura 4 muestra un vector binario para la expresión en Oryza sativa de un similar a DnaJ de tipo I de Oryza sativa (referencia interna CDS1877) bajo el control de un promotor de prolamina (referencia interna PR00090).

La figura 5 detalla ejemplos de secuencias de polinucleótidos (desde la iniciación hasta la terminación) y polipéptidos en la realización de los métodos según la presente invención.

Ejemplos

La presente invención se describirá a continuación con referencia a los siguientes ejemplos, que son solo a modo de ilustración.

Manipulación del ADN: a menos que se establezca lo contrario, se realizan técnicas de ADN recombinante según protocolos convencionales descritos en (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3ª edición Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, Nueva York) o en los volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al., (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Los métodos y materiales convencionales para el trabajo molecular en plantas se describen en Plant Molecular Biology Labfase (1993) por R.D.D. Croy, publicado por BIOS Scientific Publicaciones Ltd (RU) y Blackwell Scientific Publications (RU).

Ejemplo 1: Clonación génica

Se amplificó el gen similar a DnaJ de tipo I de Oryza sativa (CDS1877) mediante PCR usando como molde una biblioteca de ADNc de plántulas de Oryza sativa (Invitrogen, Paisley, RU). Tras la transcripción inversa de ARN extraído de las plántulas, se clonaron los ADNc en pCMV Sport 6.0. El tamaño de inserto promedio del banco era de 1,6 kb y el número original de clones era del orden de 1,67x107 ufc. Se determinó que el título original era de 3,34 x 106 ufc/ml tras la primera amplificación de 6x1010 ufc/ml. Tras la extracción de plásmidos, se usaron 200 ng de molde en una mezcla de PCR de 50 Pl. Se usaron los cebadores prm04266 (SEQ ID NO: 58; sentido, codón de iniciación en negrita, sitio AttB1 en cursiva: 5’ GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACAATGTACGGACGCATGCC 3’) y prm04267 (SEQ ID NO: 59; inverso, complementario, terminación en negrita, sitio AttB2 en cursiva: 5’ GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGCATCGAATTGTTCTTACTGC 3’), que incluyen los sitios AttB para la recombinación Gateway, para la amplificación por PCR. Se realizó la PCR usando Taq ADN polimerasa Hifi en condiciones convencionales. Se amplificó un fragmento de PCR de 1340 pb (incluyendo los sitios attB) y se purificaron también usando métodos convencionales. Entonces se realizó la primera de etapa del procedimiento Gateway, la reacción de BP, durante la cual el fragmento de PCR se recombina in vivo con el plásmido pDONR201 para producir, según la terminología Gateway, un “clon de entrada”, p04452. Se adquirió el plásmido pDONR201 de Invitrogen, como parte de la tecnología Gateway®.

Ejemplo 2: Construcción del vector

Posteriormente se usó el clon de entrada p04452 en la reacción de LR con p00830, un vector de destino usado para la transformación de Oryza sativa. Este vector contiene como elementos funcionales dentro de los límites del T-ADN: un marcador seleccionable vegetal; un casete de expresión de marcador que puede detectarse; y un casete Gateway destinado a la recombinación in vivo LR con la secuencia de interés ya clonada en el clon de entrada. Se ubicó un promotor de prolamina RP6 de arroz (SEQ ID NO: 57; Wen et al., (1993) Plant Physiol 101(3): 1115-6) para la expresión específica en endospermo (PRO0090) en el sentido de 5’ de este casete Gateway.

Tras la etapa de recombinación LR, se transformó el vector de expresión resultante p072 (figura 4) en la cepa de Agrobacterium LBA4044 y posteriormente en plantas de Oryza sativa. Se dejó que las plantas de arroz transformadas crecieran y entonces se examinaron para determinar los parámetros descritos en el ejemplo 3.

Ejemplo 3: Evaluación y resultados un similar a DnaJ de tipo I bajo el control del promotor RP6 de arroz

Se generaron aproximadamente de 15 a 20 transformantes de arroz T0 independientes. Se transfirieron los transformantes primarios desde una cámara de cultivo tisular hasta un invernadero para el crecimiento y la cosecha de semillas T1. Se conservaron 5 acontecimientos, de los cuales la progenie T1 segregó 3:1 para la presencia/ausencia del transgén. Para cada uno de estos acontecimientos, se seleccionaron aproximadamente 10 plántulas T1 que contenían el transgén (hetero y homocigotas) y aproximadamente 10 plántulas T1 que carecían del transgén (nulicigotas) monitorizando la expresión del marcador visual. Se evaluaron adicionalmente 4 acontecimientos T1 en la generación T2 siguiendo el mismo procedimiento de evaluación que para la generación T1 pero con más individuos por acontecimiento.

Análisis estadístico: Prueba de la F

Se usó un ANOVA de dos factores (análisis de variantes) como modelo estadístico para la evaluación global de las características fenotípicas de la planta. Se llevó a cabo una prueba de la F en todos los parámetros medidos de todas las plantas de todos los acontecimientos transformados con el gen de la presente invención. Se llevó a cabo la prueba de la F para comprobar un efecto del gen sobre todos los acontecimientos de transformación y para verificar un efecto global del gen, también conocido como efecto génico global. El umbral para la significación para un efecto génico global auténtico se ajustó a un nivel de probabilidad del 5% para la prueba de la F. Un valor de la prueba de la F significativo apunta a un efecto génico, lo que significa que no sólo es la presencia o la posición del gen la que provoca las diferencias en el fenotipo.

Dado que se llevaron a cabo dos experimentos con acontecimientos solapantes, se realizó un análisis combinado

5 además del análisis descrito anteriormente. Esto es útil para controlar la constancia de los efectos a lo largo de los dos experimentos, y si éste es el caso, para acumular pruebas a partir de ambos experimentos con el fin de aumentar la confianza en la conclusión. El método usado era un enfoque de modelo mixto que tiene en consideración la estructura de múltiples niveles de los datos (es decir, experimento – acontecimiento - segregantes). Se obtuvieron valores de P comparando la prueba de razón de probabilidades con respecto a distribuciones de chi

10 cuadrado.

3.1 Medición de parámetros relacionados con las semillas

Se cosecharon las panojas primarias maduras, se pusieron en bolsas, se marcaron con código de barras y luego se secaron durante tres días en un horno a 37ºC. Entonces se trillaron las panojas y se recogieron y contaron todas las semillas. Se separaron las farfollas llenas de las vacías usando un dispositivo de soplado de aire. Se desecharon las 15 farfollas vacías y se contó de nuevo la fracción restante. Se pesaron las farfollas llenas en una balanza analítica. Se determinó el número de semillas llenas contando el número de farfollas llenas que permanecieron tras la etapa de separación. Se midió el rendimiento de semillas total pesando todas las farfollas llenas cosechadas de una planta. Se midió el número de semillas total por planta contando el número de farfollas cosechas de una planta. El índice de cosecha en la presente invención se define como la razón del rendimiento de semillas total y el área por encima del

20 suelo (mm2) multiplicado por un factor de 106.

3.2 �?rea por encima del suelo

Se determinó el área sobre el suelo de la planta contando el número total de píxeles de las fotografías de las partes por encima del suelo de las plantas diferenciadas del fondo. Se promedió este valor para las fotografías tomadas en el mismo punto de tiempo desde diferentes ángulos y se convirtió a un valor de superficie física expresado en mm

25 cuadrados mediante calibración. Los experimentos muestran que el área por encima del suelo de la planta medida de esta forma se correlaciona con la biomasa de la planta.

La tabla de resultados (tabla 5) muestra a continuación la diferencia en porcentaje entre los transgénicos y los nulicigotos correspondientes, para el índice de cosecha.

El análisis combinado realizado confirma la constancia de los efectos con respecto a los dos experimentos, y por 30 tanto aumenta la confianza en la conclusión.

Tabla 5: �?ndice de cosecha

�?ndice de cosecha

% de aumento de T1: % de aumento de T2 Valor de P combinado

Acontecimiento 1: 55 24 0,0024

Acontecimiento 2: 35 11 0,0585

Global: 9 (5 acontecimientos) 8 (4 acontecimientos) 0,0063

LISTA DE SECUENCIAS

<110> CropDesign N.V. 35 <120> Plantas que tienen rendimiento aumentado y método para preparar las mismas

<130> CD-128-PCT

<150>: Documento EP 04106985.7 <151>

<150>: Documento US 60/641.688 <151>

<160> 59 40 <170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 1263

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 1

<210> 2

<211> 420

<212> PRT

<213> Oryza sativa 10 <400> 2

<210> 22

<211> 417

<212> PRT

<213> Atriplex nummularia

<400> 22

<210> 25

<211> 1257

<212> ADN

<213> Daucus carota

<400> 25

<210> 28

<211> 417

<212> PRT

<213> Glycine max

<400> 28

<210> 29

<211> 1248

<212> ADN

<213> Hevea brasiliensis

<400> 29

<210> 30

<211> 415

<212> PRT

<213> Hevea brasiliensis

<400> 30

<210> 31

<211> 1260

<212> ADN

<213> Lycopersicum esculentum

<400> 31

<210> 32

<211> 419

<212> PRT

<213> Lycopersicum esculentum

<400> 32

<210> 33

<211> 1272

<212> ADN

<213> Medicago sativa

<400> 33

<210> 34 <211> 423

<212> PRT

<213> Medicago sativa

<400> 34

<210> 35

<211> 1257

<212> ADN

<213> Nicotiana tabacum

<400> 35

<210> 36

<211>: 418 10 <212> PRT

<213> Nicotiana tabacum

<400> 36

<210> 37

<211> 1272

<212> ADN

<213> Salix gilgiana

<400> 37

<210> 38

<211>: 423 10 <212> PRT

<213> Salix gilgiana

<400> 38

<210> 39

<211> 1263

<212> ADN

<213> Salix gilgiana

<400> 39

<210> 40

<211>: 420 10 <212> PRT

<213> Salix gilgiana

<400> 40

<210> 41

<211> 1260

<212> ADN

<213> Solanum tuberosum

<400> 41

<210> 42

<211>: 419 10 <212> PRT

<213> Solanum tuberosum

<400> 42

<210> 43

<211> 1293

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 43

<210> 44

<211>: 430 10 <212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 44

<210> 45

<211> 1263

<212> ADN

<213> Triticum aestivum

<400> 45

<210> 46

<211>: 420 10 <212> PRT

<213> Triticum aestivum

<400> 46

<210> 47

<211> 1320

<212> ADN

<213> Caenorhabditis elegans

<400> 47

<210> 48

<211>: 439 10 <212> PRT

<213> Caenorhabditis elegans

<400> 48

<210> 49

<211> 1194

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 49

<210> 50

<211>: 397 10 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 50

<210> 51

<211> 1230

<212> ADN

<213> Sacharomyces cereviseae

<400> 51

<210> 52

<211>: 409 10 <212> PRT

<213> Sacharomyces cereviseae

<400> 52

<213> Homo sapiens

<400> 53

<210> 54

<211> 412

<212> PRT 10 <213> Homo sapiens

<400> 54

<210> 55

<211> 1239

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 55

<210> 56

<211> 412

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 56

<210> 57

<211> 654

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 57

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método para aumentar el rendimiento de semillas en plantas hechas crecer en condiciones de crecimiento normales con respecto a plantas control, que comprende

(i)

transformar una planta, una parte de planta o una célula vegetal con un constructo que comprende un ácido nucleico de DnaJ de tipo I exógeno que codifica para un polipéptido DnaJ de tipo I que comprende un motivo CaaX en su extremo carboxilo terminal y comprende adicionalmente, desde el extremo amino terminal hasta el extremo carboxilo terminal: (i) un dominio J con referencia de InterPro IPR001623; (ii) una región de dominio G/F de aproximadamente 30 residuos de aminoácidos, rico en glicina (G) y fenilalanina (F); (iii) un dominio de dedo de zinc rico en Cys que contiene cuatro repeticiones de CXXCXGXG, en el que X representa un residuo cargado o polar (referencia de InterPro IPR001305); y (iv) un dominio carboxilo terminal (CTD; referencia de InterPro IPR002939),

(ii)

expresar dicho ácido nucleico; y

(iii) en el que dicho polipéptido DnaJ de tipo I tiene una ubicación subcelular citosólica.
2.

Método según la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido DnaJ de tipo I tiene, en orden creciente de preferencia, una identidad de al menos el 75%, 80%, 85%, 90% o 95% con SEQ ID NO: 2.
3.

Método según las reivindicaciones 1 a 2, en el que dicho ácido nucleico de DnaJ de tipo I es de origen procariota

o eucariota, preferiblemente de origen eucariota, más preferiblemente dicho ácido nucleico de DnaJ de tipo I es de origen vegetal tal como una planta monocotiledónea, preferiblemente de la familia Poaceae, más preferiblemente el ácido nucleico es de Oryza sativa.
4.

Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho ácido nucleico de DnaJ de tipo I está operativamente unido a un promotor específico de semilla.
5.

Método según la reivindicación 4, en el que dicho promotor específico de semilla es un promotor específico de endospermo.
6.

Método según la reivindicación 5, en el que dicho promotor específico de endospermo es un promotor RP6 de prolamina de arroz.
7.

Método según la reivindicación 1, en el que dicho rendimiento de semillas aumentado es un índice de cosecha aumentado.
8.

Constructo que comprende:

(i)

un ácido nucleico que codifica para un polipéptido DnaJ de tipo I según la reivindicación 1; y

(ii)

una o más secuencias de control que pueden dirigir la expresión de la secuencia de ácido nucleico de (i) en una semilla de planta y que comprenden un promotor RP6 de prolamina de arroz; y opcionalmente

(iii) una secuencia de terminación de la transcripción.
9.

Planta transgénica que tiene rendimiento de semillas aumentado en condiciones de crecimiento normales con respecto a plantas control, comprendiendo dicha planta transgénica un constructo según la reivindicación 8.
10.

Planta transgénica según la reivindicación 9, en la que dicha planta es una planta monocotiledónea, tal como caña de azúcar o en la que la planta es un cereal, tal como arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, avena o sorgo.