DE112010003268T5

DE112010003268T5 - Stresstolerante Pflanzen

Info

Publication number: DE112010003268T5
Application number: DE112010003268T
Authority: DE
Inventors: Nestor Carillo; Mariana Giro; Annabella Fernanda Lodeyro; Matias Daniel Zurbriggen
Original assignee: Plant Bioscience Ltd
Current assignee: Plant Bioscience Ltd
Priority date: 2009-08-11
Filing date: 2010-08-11
Publication date: 2013-05-08
Also published as: GB0914012D0; CL2012000224A1; AU2010283592A1; WO2011018662A1; EP2464733A1; CN102482681B; CA2770550A1; AU2010283592B2; ZA201109457B; AR077852A1; EA201270263A1; MX2012001819A; BR112012003093A2; US20120204291A1; CN102482681A

Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Erhöhung der Stresstoleranz in Pflanzen durch die Expression einer für ein Fld-Polypeptid kodierenden Nukleinsäure und einer für ein FNR-Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz in einer Pflanze.

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit einer erhöhten Toleranz gegenüber Stress, insbesondere gegenüber oxidativem Stress. Die Erfindung betrifft des Weiteren Genexpressionskonstrukte zur Verwendung in derartigen Verfahren sowie transgene Pflanzen mit einer erhöhten Toleranz gegenüber Stress, z. B. Pflanzen, die durch die hierin beschriebenen Verfahren erhalten wurden bzw. erhalten werden können.
Einleitung
Äußere Bedingungen, die nachteilige Auswirkungen auf das Wachstum, die Entwicklung oder die Produktivität haben, rufen eine große Vielzahl an Reaktionen in einer Pflanze hervor, so wie eine veränderte Genexpression, einen veränderten zellulären Stoffwechsel sowie Veränderungen hinsichtlich der Wachstumsraten und der Ernteerträge. Man unterscheidet zwei Arten von Stress: der biotische Stress wird von anderen Organismen ausgeübt, so wie z. B. von einem Pathogen, wohingegen der abiotische Stress auf einen Überschuss oder ein Defizit in den physikalischen oder chemischen Gegebenheiten der Umgebung zurückzuführen ist, so wie z. B. auf Dürre, Versalzung, hohe oder niedrige Temperaturen oder ultraviolettes Licht.
Umgebungsbedingter Stress ist ein wesentlicher limitierender Faktor bei der Produktivität und der Ernteerträge von Pflanzen. Befinden sich Pflanzenzellen unter dem Einfluss von umgebungsbedingtem Stress, so werden durch die partielle Reduktion von molekularem Sauerstoff einige chemisch unterschiedliche reaktive Sauerstoffspezies (ROS = reactive oxygen species) erzeugt, die zu oxidativen Schädigungen führen oder als Signale agieren können. Die Autooxidation von Komponenten der photosynthetischen Elektronentransportkette führt zu einer Bildung von Superoxidradikalen sowie deren Derivaten, Wasserstoffperoxid und Hydroxylradikalen. Diese Verbindungen reagieren mit einer großen Vielzahl an Biomolekülen, einschließend DNA, und führen zur Zytostase oder zum Zelltod (Kim et al., 2008, Vranová et al., 2002).
Flavodoxin (Fld) ist ein Elektronentransfer-Flavoprotein, das in Bakterien und einigen Meeresalgen, jedoch nicht in Pflanzen vorkommt (Zurbriggen et al., 2007), und das dazu in der Lage ist, auf effektive Weise in einige von Ferredoxin (Fd) abhängige oxidoreduktive Signalwege einzugreifen, einschließend Photosynthese, Stickstoffassimilation sowie die durch Thioredoxin vermittelte Redox-Regulation (Tognetti et al., 2006, 2007b). In Mikroorganismen, die oxidativem und abiotischem Stress ausgesetzt sind, sind die Fld-Spiegel hochreguliert (Singh et al., 2004). Wird es in den Chloroplasten der Pflanzen exprimiert, so verhält sich das Flavoprotein wie ein allgemeines Antioxidans und verhindert die Bildung von unterschiedlichen Arten an reaktiven Sauerstoffspezies ROS in Chloroplasten (Tognetti et al., 2006). Die daraus resultierenden transgenen Pflanzen entwickelten multiple Toleranzen gegenüber einer großen Vielzahl an umweltbedingten Herausforderungen, in den Redoxzyklus eingreifenden Oxidantien und Xenobiotika (Tognetti et al., 2006; 2007a, PCT/GB2002/004612 , jeweils durch Bezugnahme hierin eingeschlossen). In Cyanobakterien unter Entzug von Eisen wird Fld durch das Photosystem I (PSI) reduziert, so wie dies auch in den mit Fld transformierten Pflanzen stattfindet (Tognetti et al., 2006). In heterotrophen Bakterien ist es möglich, Fld mittels einer Pyruvat-Fld-Reduktase sowie einer NADP(H)-Fld-Reduktase zu reduzieren (Blaschkowski et al., 1982). Fld reichert sich ebenfalls konstitutiv in Heterozysten von Cyanobakterien an und es wurde bereits argumentiert, es könne sich möglicherweise an dem Elektronentransfer zur Nitrogenase beteiligen (Sandmann et al., 1990), jedoch ist die Beschaffenheit des letzten Elektronendonors nicht bekannt und die Induktion eines effektiveren, für Heterozysten spezifischen Ferredoxins, das zur Vermittlung dieser Reaktion in der Lage wäre, warf Zweifel hinsichtlich der Rolle von Fld im Verlauf der Fixierung von Distickstoff auf (Razquin et al., 1995).
Bei der Ferredoxin-NADP(H)-Reduktase (FNR) (EC 1.18.1.2) handelt es sich um ein thylakoidgebundenes Enzym, das sowohl in Pflanzen als auch in Cyanobakterien vorkommt und das auf eine physikalische, konstitutive Weise am Elektron-Elektron-Transfer von Ferredoxin oder Fld zu NADP⁺ zur Bildung von NADP(H) beteiligt ist (Carrillo und Ceccarelli, 2003). Diese Aktivität steht in direktem Widerspruch zu der Möglichkeit einer Vermittlung der umgekehrten Reaktion in Licht, wenn ein starker Elektronendruck von dem PSI ausgeht. Es ist daher nicht wahrscheinlich, dass eine durch FNR vermittelte Reduktion von Ferredoxin (oder Fld) durch NADP(H) in vivo in einem maßgeblichen Ausmaß stattfindet und es liegen bisher keinerlei Berichte hinsichtlich der Beobachtung einer solchen Aktivität vor. Solubilisiertes FNR wird jedoch von dem Rest der Kette entkoppelt und katalysiert diese ohne Weiteres (Carrillo und Ceccarelli, 2003). In der Tat ist die lösliche FNR bei der Vermittlung der Photoreduktion von NADP⁺ durch isolierte FNR-abgereicherte Thylakoide nahezu inaktiv (Forti und Bracale, 1984). In Spezies von Cyanobakterien, die Phycobilisome zur Lichtsammlung enthalten, setzt sich die FNR aus drei Domänen zusammen: einer N-terminalen Domäne, die an der Bindung von Phycobilisomen beteiligt ist, gefolgt von einer FAD bindenden Domäne und einer NADP(H) bindenden Domäne, die zusammen den aktiven Teil des Enzyms bilden (Carrillo und Ceccarelli, 2003). Ein alternatives Initiationscodon befindet sich am Anfang der zweiten Domäne und ergibt so eine lösliche FNR mit zwei Domänen (Thomas et al., 2006). Dieses interne Met wird vorzugsweise dann verwendet, wenn bei den Zellen eine Verschiebung hin zu einer heterotrophen Lebensform stattfindet und die Fähigkeit zum Transfer von Elektronen von NADP(H) zu Fd oder Fld erforderlich ist (Thomas et al., 2006). In 1 ist ein Schema zur Beschreibung des theoretischen Modells dargestellt. Das Enzym kommt in allen Cyanobakterien und Photosynthese betreibenden eukaryotischen Zellen vor. Es wurde bereits beschrieben, dass weitere Enzyme mit einer ähnlichen Spezifität, jedoch mit unterschiedlichen physiologischen Funktionen, in einigen nicht photosynthetischen Pflanzengeweben, in Mitochondrien von Säugern sowie in einigen Bakterien vorkommen. FNR aus Cyanobakterien wurde bereits umfangreich charakterisiert (Sancho, 1987, Schluchter 1992). Darüber hinaus wurde das für die FNR kodierende Gen petH bereits aus einigen Stämmen von Cyanobakterien kloniert (Fillat et al., 1993). Das Vorliegen von aktiver FNR kann unter Anwendung eines Assays zur Aktivität der Diaphorase detektiert werden, wie im Folgenden beschrieben ist.
Es ist folglich bereits bekannt, dass das Einbringen einer bakteriellen Fld in Chloroplasten von Tabakpflanzen das Absinken der Fd-Spiegel kompensieren kann, was zu einer erhöhten Toleranz gegenüber Oxidantien sowie gegenüber einer großen Vielzahl an schädlichen Stressbedingungen führt. Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Verbesserung der Stresstoleranz in Pflanzen, indem sichergestellt wird, dass Fld in einem reduzierten Zustand gehalten wird.
Zusammenfassung der Erfindung
In einem Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit einer erhöhten Stresstoleranz, umfassend das Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Flavodoxin-Polypeptid kodiert, und einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ferredoxin-NADP(H)-Reduktase-Polypeptid in einer Pflanze kodiert. Die vorliegende Erfindung umfasst des Weiteren eine Pflanze, die durch ein solches Verfahren erhalten wurde bzw. erhalten werden kann. Die Erfindung betrifft des Weiteren ein Nukleinsäurekonstrukt, das eine Gensequenz umfasst, wobei diese eine Nukleinsäuresequenz, die für eine cyanobakterielle FNR kodiert, sowie eine Chloroplasten-Zielsequenz umfasst. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Nukleinsäurekonstrukt, das eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Flavodoxin-Polypeptid (Fld) kodiert, und eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Ferredoxin-NADP(I)-Reduktase-(FNR)-Polypeptid kodiert, umfasst. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine transgene Pflanze mit einer erhöhten Stresstoleranz, die eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Flavodoxin-Polypeptid kodiert, und eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Ferredoxin-NADP(H)-Reduktase-Polypeptid kodiert, exprimiert. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Reduktion der Menge an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in einer auf Stress reagierenden Pflanze, umfassend das Exprimieren eines Flavodoxin-Polypeptids und eines Ferredoxin-NADP(H)-Reduktase-Polypeptids in einer Pflanze.
Figuren
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden, nicht einschränkenden Figuren weiter veranschaulicht.
1: Vorgeschlagener Elektronenweg in doppelten Transformanten, die Fld und FNR aus Cyanobakterien exprimieren. Unter normalen Wachstumsbedingungen (Bild oben) waren sowohl Ferredoxin (Fd) als auch Flavodoxin (Fld) dazu in der Lage, den Elektronentransfer auf produktive Wege zu vermitteln, wobei Fd aus Gründen der Effizienz wahrscheinlich bevorzugt ist. Unter Stress (Bild unten) kommt es zu einem Absinken der Fd-Spiegel und Fld übernimmt den photosynthetischen Elektronentransfer zu NADP, während die lösliche FNR einen Teil des gebildeten NADP(H) dazu verwendet, Fld in einem reduzierten Zustand zu halten, wodurch die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) verhindert und der positive Zyklus geschlossen wird.
2: Anreicherung von FNR in Blättern von Tabakpflanzen des Wildtyps (PH) sowie von Transformanten. Es wurden Blattextrakte aus 6 Wochen alten, unabhängigen, transformierten Pflanzen (pnn), die insgesamt 17 μg Protein entsprachen, mittels SDS-PAGE fraktioniert und zur Immundetektion von FNR mit gegen die Reduktase aus Anabaena gerichteten Antiseren auf Nitrocellulosemembranen aufgeblottet.
3: Subzelluläre Lokalisation in In-Gel-Diaphorase-Aktivität der FNR aus transgenen Tabakpflanzen. A) Thylakoide und Stroma wurden nach einem osmotischen Schock von isolierten intakten Chloroplasten aus Wildtyp- und pFNR-Pflanzen getrennt. Proben, die 4 μg Chlorophyll entsprachen, wurden mittels SDS-PAGE gelöst und das Vorliegen von FNR wurde mittels einer Immunoblot-Analyse bestimmt. B) Stroma aus Wildtyp- und pFNR-Pflanzen, entsprechend 15 μg löslichem Protein insgesamt, wurden mittels nativer Elektrophorese gelöst und für Diaphorase-Aktivität gefärbt.
4: Expressionsniveaus von FNR und Fld in den Nachkommen von X4 Pflanzen. Blattextrakte aus 6 Wochen alten Tabakpflanzen, die insgesamt 8 μg löslichem Protein entsprachen, wurden mittels SDS-PAGE fraktioniert und zur Immundetektion mit gegen FNR und Fld aus Anabaena gerichteten Antiseren auf Nitrocellulosemembranen aufgeblottet.
5: Wirkung von Methylviologen (MV) auf Blattscheiben von FNR/Fld exprimierenden Pflanzen. Blattscheiben von 6 Wochen alten Tabakpflanzen wurden auf 20 μM MV gegeben und mit einer Lichtquelle mit 600 μmol Quanten m^–2s^–1 beleuchtet. A) Aufnahme im Anschluss an eine Inkubationszeit von 7 Stunden. B) Der Ionenaustritt wurde anhand einer Messung des Anstiegs der relativen Leitfähigkeit des Mediums im Anschluss an eine Behandlung der Blattscheiben mit MV ermittelt. C) Chlorophylle und Carotinoide wurden im Anschluss an eine 7-stündige Behandlung mit MV bestimmt.
6: Wirkung von MV auf vollständige Tabakpflanzen. Vier Wochen alte Pflanzen wurden in ein hydroponisches System überführt. Die Aufnahmen der Blätter wurden 24 Stunden nach dem Inkontaktbringen mit 100 μM MV unter Klimakammerbedingungen erstellt.
7: A) Detektion von Lipidperoxiden. Blattscheiben von 6 Wochen alten Pflanzen wurden auf 10 μM MV oder Wasser (rechter Balken) gegeben und für 3 Stunden mit einer Lichtquelle mit 700 μmol Quanten m^–2s^–1 beleuchtet. Jeder Wert steht für den Mittelwert aus vier wiederholten Probenmessungen ± der Standardabweichung. B) Die Aktivität von APX aus Blattextrakten aus Scheiben von FNR/Fld exprimierenden Pflanzen. Blattscheiben von 6 Wochen alten Tabakpflanzen wurden auf 20 μM MV gegeben und mit 600 μmol Quanten m^–2s^–1 beleuchtet. Proben wurden jeweils nach einer 1,5- und 3-stündigen Inkubationszeit entnommen.
8: Schematische Darstellung des binären Vektors pCAMBIA 2200, der ein Fragment der In-Frame-Fusion zwischen den für das Transitpeptid der FNR aus Erbsen kodierenden Sequenzen und dem Flavodoxin-Gen enthält. Die in an der EcoRI-Stelle von pCAMBIA 2200 eingefügte Kassette wurde zuvor in pDH51 konstruiert. Dieses EcoRI-Fragment enthielt den CaMV 35S Promotor, das chimäre Flavodoxin-Gen und das CaMV 35S Polyadenylierungssignal.
9: Schematische Darstellung des binären Vektors pCAMBIA 2200, der ein Fragment der In-Frame-Fusion zwischen den für das Transitpeptid der FNR aus Erbsen kodierenden Sequenzen und den beiden C-terminalen Domänen des FNR-Gens aus Anabaena enthält. Die in an der EcoRI-Stelle von pCAMBIA 2200 eingefügte Kassette wurde zuvor in pDH51 konstruiert. Dieses EcoRI-Fragment enthielt den CaMV 35S Promotor, das chimäre FNR-Gen und das CaMV 35S Polyadenylierungssignal.
10: Schematische Darstellung des vom Multisite Gateway abgeleiteten binären Vektors pBinary-BRACT B1,4-ubi-FNR/B2,3-actin-Fld, der die In-Frame-Fusionen zwischen den für ein Transitpeptid der FNR aus Erbsen kodierenden Sequenzen und den beiden C-terminalen Domänen des FNR(TP-FNR)- und des Fld(TP-Fld)-Gens aus Anabaena PCC7119 enthält. Die TP-FNR- und TP-Fld-Konstrukte sind in dem Koexpressionsvektor jeweils von dem nos Polyadenylierungssignal sowie den ubi und actin Promotoren flankiert. Diese Konstrukte werden zunächst mittels ortsspezifischer BP Rekombinationsreaktionen in geeignete Donorvektoren der pDONR221 Vektorserien kloniert. Die daraus resultierenden Eintrittsklone sind dann wiederum an einer simultanen doppelten LR ortsspezifischen Rekombination mit einem maßgeschneiderten binären T-DNA MultiSite Gateway Destinationsvektor, nämlich pDEST-BRACT R1,4-ubi/R2,3-actin, beteiligt, wodurch der Expressionsklon pBinary-BRACT B1,4-ubi-FNR/B2,3-actin-Fld erhalten wird, der die beiden relevanten Gene umfasst. Die Strategie für die Klonierung der Konstrukte in den binären Vektor basiert auf den BP und LR ortsspezifischen Rekombinationsreaktionen der Multisite Gateway Technologie (Invitrogen, http://www.invitrogen.com).
Hyg: Selektionsmarker (Resistenz gegen Hygromycin); LB: linke Begrenzung; nos: Nopalinsynthase; RB: rechte Begrenzung; TP: Transitpeptid; ubi: Ubiquitin.
11: Konstruktion der binären Vektoren für die Koexpression von Fld und FNR Polypeptiden in Pflanzen. Die schematische Darstellung zeigt die Konstruktion des binären Vektors pBinary-BRACT B1,4-ubi-FNR/B2,3-actin-Fld für die Koexpression von FNR und Fld in Pflanzen. Bei den PCR-Produkten der Sequenzen, die für die chimären Fusionen von FNR und Fld an ein Chloroplasten-Transitpeptid (TP), flankiert durch attB ortsspezifische Rekombinationssequenzen (attB1-FNR-attB4 bzw. attB2-Fld-attB3), kodieren, handelt es sich um Substrate in einer BP Rekombinationsreaktion mit den geeigneten Donorvektoren (pDONR21 P1-P4 bzw. pDONR p2-P3). Die daraus resultierenden Eintrittsklone pENTR221 L1-L4-FNR und pENTR221 L2-L3-Fld sind dann wiederum an einer simultanen doppelten LR ortsspezifischen Rekombination mit einem spezifisch konstruierten binären T-DNA MultiSite Gateway Destinationsvektor, nämlich pDEST-BRACT R1,4-ubi/R2,3-actin, beteiligt, wodurch ein Expressionsklon erhalten wird, der die beiden relevanten Gene unter der Kontrolle von konstitutiven Promotoren umfasst. Das Verfahren wird gemäß den vom Hersteller (Invitrogen, http://www.invitrogen.com) vorgeschlagenen Protokollen, Anweisungen sowie der Nomenklatur durchgeführt. ccdB: für die negative Selektion des Vektors verwendetes Gen; LB: linke Begrenzung; nos: Nopalinsynthase; RB: rechte Begrenzung; TP: Transitpeptid; ubi: Ubiquitin.
12: Stress in Gerstenpflanzen. Wirkung von Methylviologen (MV) auf Blattstreifen von FNR/Fld exprimierenden heterozygoten Gerstenpflanzen. Blattstreifen mit einer Länge von zwischen 10 und 15 mm wurden aus Blättern von 6 Wochen alten Gerstenpflanzen geschnitten, die in Erde kultiviert worden waren. Die Blattstreifen wurden dann in 50 μM MV und 0,05% Tween-20 für 30 Minuten bei 20°C in Dunkelheit inkubiert, um die Diffusion von MV in das Gewebe zu gestatten. Dann wurden die Blattstreifen mit der adaxialen Seite nach oben in Kunststoffschalen platziert unter einer Lichtquelle mit 450 μmol Quanten m^–2s^–1. Die Kontrollen wurden in destilliertem Wasser gehalten, das 0,05% Tween-20 enthielt. Der Gehalt von A) Chlorophyll und B) Carotenoid wurde jeweils nach einer Bestrahlung für 7,5 Stunden berechnet. FNR (1×): transgene Gerste, heterozygot für FNR. Fld (1×): transgene Gerste, heterozygot für Fld. FNR/Fld (1×): transgene Gerste, heterozygot für FNR und Fld. WT: Wildtyp Gerste.
Detaillierte Beschreibung
Die vorliegende Erfindung wird nun näher beschrieben. In den folgenden Abschnitten werden unterschiedliche Aspekte der Erfindung detaillierter definiert. Jeder auf diese Weise definierte Aspekt kann mit einem oder mehreren beliebigen weiteren Aspekten der Erfindung kombiniert werden, sofern nicht ausdrücklich etwas anderes angegeben ist. Insbesondere kann jedes Merkmal, das als bevorzugt oder vorteilhaft angegeben wird, mit einem oder mehreren beliebigen weiteren Merkmalen kombiniert werden, die als bevorzugt oder vorteilhaft angegeben werden.
Zur praktischen Ausführung der Erfindung werden, sofern nichts anderes angegeben ist, konventionelle Techniken aus Botanik, Mikrobiologie, Gewebekultur, Molekularbiologie, Chemie, Biochemie und rekombinanter DNA-Technologie eingesetzt, mit denen der Fachmann hinreichend vertraut ist. Derartige Techniken sind in der Literatur umfassend beschrieben.
Wie zuvor bereits erwähnt, ist bekannt, dass es durch das Einbringen eines bakteriellen Flavodoxins (Fld) in Chloroplasten von Tabakpflanzen möglich ist, das Absinken der Fd-Spiegel zu kompensieren, was zu einer erhöhten Toleranz gegenüber Oxidantien sowie gegenüber einer großen Vielzahl an schädlichen Stressbedingungen führt. Die Erfinder haben überraschenderweise gefunden, dass es durch das Einbringen eines zweiten Gens, das aus Bakterien abgeleitet ist und über eine Fld reduzierende Aktivität verfügt, in eine Pflanze, die bakterielles Fld exprimiert, möglich ist, die Stresstoleranz der Pflanze zu verbessern. Ohne an eine Theorie gebunden sein zu wollen, gehen die Erfinder davon aus, dass dies darauf zurückzuführen ist, dass Fld in einem reduzierten Zustand gehalten wird. Wie in den Beispielen gezeigt, haben die Erfinder ein Konstrukt verwendet, das eine von einem Cyanobakterium abgeleitete Nukleinsäuresequenz enthält und für ein gegen Chloroplasten gerichtetes Ferredoxin-NADP(H)-Reduktase-(FNR)-Polypeptid kodiert, und dieses bakterielle Gen wurde in einer Pflanze exprimiert, die gegen Chloroplasten gerichtetes Fld exprimiert.
Folglich betrifft die Erfindung in einem Aspekt ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit einer erhöhten Stresstoleranz, umfassend die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Fld-Polypeptid kodiert, und einer Nukleinsäuresequenz, die für ein FNR-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze. Die erfindungsgemäße Expression dieser Sequenzen in einer Pflanze kann auf unterschiedliche Arten erreicht werden, wie hierin erläutert ist.
In einer ersten Ausführungsform umfasst das Verfahren die Expression eines Nukleinsäurekonstrukts, die die Koexpression von Fld-Polypeptid und FNR, wie hierin beschrieben, in einer Pflanze reguliert. Folglich kann ein einzelnes Konstrukt gemäß den hierin detailliert beschriebenen unterschiedlichen Ausführungsformen, die Koexpression beider Gene in einer Pflanze regulieren, die gemäß den unterschiedlichen Aspekten der vorliegenden Erfindung mit einem solchen Konstrukt transformiert ist. Die daraus resultierende transgene Pflanze produziert Fld- und FNR-Polypeptide. Im vorliegenden Verfahren wird eine Pflanze mit dem Koexpressionskonstrukt transformiert und es werden stabile homozygote Pflanzen erzeugt und selektiert, die beide Transgene exprimieren.
Das Konstrukt, das in dem vorliegenden Verfahren verwendet werden kann, wird im Folgenden detaillierter beschrieben.
Das Nukleinsäurekonstrukt umfasst eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Fld-Polypeptid kodiert, und eine Nukleinsäuresequenz, die für ein FNR-Polypeptid kodiert. Vorzugsweise sind die Fld- und FNR-Sequenzen bakteriellen Ursprungs.
In einer Ausführungsform ist die Nukleinsäuresequenz, die für ein Fld-Polypeptid kodiert, von einem Cyanobakterium abgeleitet und das Flavodoxin-Polypeptid ist ein cyanobakterielles Flavodoxin. Alternativ ist die Nukleinsäuresequenz, die für ein Fld-Polypeptid kodiert, von einem heterotrophen Bakterium abgeleitet. Das Cyanobakterium kann aus Crocosphaera, Cyanobium, Cyanothece, Microcystis, Synechococcus, Synechocystis, Thermosynechococcus, Microchaetaceae, Nostocaceae, Lyngbya, Spirulina oder Trichodesmium ausgewählt sein. Bevorzugte Gattungen schließen Synechococcus, Fremyella, Tolypothrix Anabaena, Anabaenopsis, Aphanizomenon, Aulosira, Cylindrospermopsis, Cylindrospermum, Loefgrenia, Nodularia, Nostoc oder Wollea ein. Bevorzugt handelt es sich bei der Gattung um Anabaena und bei dem Cyanobakterium um Anabaena PCC7119 (Fillat et al., 1990).

In einer Ausführungsform weist die Fld-Sequenz eine Nukleinsäuresequenz auf, die aus den nachfolgend in Tabelle 1 gezeigten Sequenzen ausgewählt ist. In einer Ausführungsform weist die FNR-Sequenz eine Nukleinsäuresequenz auf, die aus den nachfolgend in Tabelle 2 gezeigten Sequenzen ausgewählt ist. Tabelle 1

Zugangs-Nr.		Name des Gens	Organismus
NP_358768.1	gi\|15903218	Flavodoxin	Streptococcus pneumoniae R6
NP_345761.1	gi\|15901157	Flavodoxin	Streptococcus pneumoniae TIGR4
NP_311794.1	gi\|15833021	Flavodoxin 2	Escherichia coli 0157:_H7]
NP_311593.1	gi\|15832820	vermutlich Flavodoxin	Escherichia coli 0157:H7
NP_308742.1	gi\|15829969	Flavodoxin 1	Escherichia coli O157:_H
CAC92877.1	gi\|15980620	Flavodoxin 1	Yersinia pestis
CAC89737.1	gi\|5978964	Flavodoxin 2	Yersinia pestis
NP_350007.1	gi\|15896658	Flavodoxin	Clostridium acetobutylicum
NP_349066.1	gi\|15895717	Flavodoxin	Clostridium acetobutylicum
NP_347225.1	gi\|15893876	Flavodoxin	Clostridium acetobutylicum
NP_346845.1	gi\|15893496	Flavodoxin	Clostridium acetobutylicum
NP_348645.1	gi\|15895296	vorhergesagtes Flavodoxin	Clostridium acetobutylicum
NP_347225.1	gi\|15893876	Flavodoxin	Clostridium acetobutylicum
NP_345845.1	gi\|15893496	Flavodoxin	Clostridium acetobutylicum
NP_282528.1	gi\|15792705	Flavodoxin	Campylobacter jejuni
AAK28628.1	gi\|13507531	Flavodoxin	Aeromonas hydrophila
NP_268951.1	gi\|15674777	vermutlich Flavodoxin	Streptococcus pyogenes
NP_266764.2	gi\|15672590	Flavodoxin	Lactococcus lactis Subsp. lactis
NP_207952.1	gi\|15645775	Flavodoxin (fldA)	Helicobacter pylori 26695
NP_232050.2	gi\|15542417	Flavodoxin 2	Vibrio cholerae
NP_231731.1	gi\|15642099	Flavodoxin 1	Vibrio cholerae
NP_219360.1	gi\|15639910	Flavodoxin	Treponema pallidum
NP_240122.1	gi\|15616909	Flavodoxin	1 Buchnera sp. APS
NP_214435.1	gi\|15607053	Flavodoxin	Aquifex aeolicus
FXAVEP	gi\|625194	Flavodoxin	Azotobacter vinelandii
S38632	gi\|481443	Flavodoxin	-Synechocystis sp. (Stamm PCC 6803)
FXDV	gi\|476442	Flavodoxin	Desulfovibrio vulgaris
A34640	gi\|97369	Flavodoxin	Desulfovibrio salexigens
S24311	gi\|97368	Flavodoxin	Desulfovibrio gigas (ATCC 19364)
A37319	gi\|95841	Flavodoxin	A Escherichia coli
S06648	gi\|81145	Flavodoxin	Rotalge (Chondrus crispus)
S04600	gi\|79771	Flavodoxin	Anabaena variabilis
A28670	gi\|79632	Flavodoxin	Synechococcus sp
S02511	gi\|78953	Flavodoxin	Klebsiella pneumoniae
FXDVD	gi\|65884	Flavodoxin	Desulfovibrio desulfuricans (ATCC 29577)
FXCLEX	gi\|65882	Flavodoxin	Clostridium sp
FXME	gi\|65881	Flavodoxin	Megasphaera elsdenii
NP_071157.1	gi\|11499913	Vermutlich Flavodoxin	Archaeoglobus fulgidus
BAA17947.1	gi\|1653030	Flavodoxin	Synechocystis sp. PCC 6803
BAB61723.1	gi\|14587807	Flavodoxin 2	Vibrio fischeri
BAB61721.1	gi\|14587804	Flavodoxin 1	Vibrio fischeri
AAK66769.1	gi\|14538018	Flavodoxin	Histophilus ovis
P57385.1	gi\|11132294	Flavodoxin
AAC75933.1	gi\|1789262	Flavodoxin 2	Escherichia coli K12
AAC73778.1	gi\|1786900	Flavodoxin 1	Escherichia coli K12
AAC75752.1	gi\|1789064	vermutlich Flavodoxin	Escherichia coli K12
F69821	gi\|7429905	Flavodoxin Homolog yhcB	Bacillus subtilis
QQKBFP	gi\|2144338	Pyruvat (Flavodoxin)dehydrogenase nifJ	Klebsiella pneumoniae
S16929	gi\|95027	Flavodoxin A	Azotobacter chroococcum
F71263	gi\|7430914	wahrscheinlich Flavodoxin	Syphilis spirochete
A64665	gi\|7430911	Flavodoxin	Helicobacter pylori_(Stamm 26695
JE0109	gi\|7430907	Flavodoxin	Desulfovibrio vulgaris
S42570	gi\|628879	Flavodoxin	Desulfovibrio desulfuricans (ATCC
BAB13365.1	gi\|10047146	Flavodoxin	Alteromonas sp. 0–7
AAF34250.1	gi\|6978032	Flavodoxin	Desulfovibrio gigas
CAB73809.1	gi\|6968816	Flavodoxin	Campylobacter jejuni
D69541	gi\|7483302	Flavodoxin	homolog Archaeoglobus fulgidus
F70479	gi\|7445354	Flavodoxin	Aquifex aeolicus
S55234	gi\|1084290	Flavodoxin Isoform I	Chlorella fusca
S18374	gi\|2117434	Flavodoxin	Anabaena sp. (PCC 7119)
555235	gi\|1084291	Flavodoxin Isoform II	Chlorella fusca
C64053	gi\|1074088	Flavodoxin A	Haemophilus influenzae (Stamm Rd KW20)
A61338	gi\|625362	Flavodoxin	Clostridium pasteurianum
A39414	gi\|95560	Flavodoxin	Enterobacter agglomerans plasmid
AAD08207.1	gi\|2314319	Flavodoxin (fldA)	Helicobacter pylori 26695
CAB37851.1	gi\|4467982	Flavodoxin	Rhodobacter capsulatus
AAC65882.1	gi\|3323245	Flavodoxin	Treponema pallidum
AAB88920.1	gi\|2648181	Vermutlich Flavodoxin	Archaeoglobus fulgidus
AAB65080.1	gi\|2289914	Flavodoxin	Klebsiella pneumoniae
AAB53659.1	gi\|710356	Flavoprotein	Methanothermobacter Thermautotrophicus
AAB51076.1	gi\|1914879	Flavodoxin	Klebsiella pneumoniae
AAB36613.1	gi\|398014	Flavodoxin	Azotobacter chroococcum
AAB20462.1	gi\|239748	Flavodoxin	Anabaena
AAA64735.1	gi\|142370	Flavodoxin_(nifF)	Azotobacter vinelandii
BAA35341.1	gi\|1651296	Flavodoxin	Escherichia coli
BAA35333.1	gi\|1651291	Flavodoxin	Escherichia coli
AAA27288.1	gi\|415254	Flavodoxin	Synechocystis sp.
AAA27318.1	gi\|154528	Flavodoxin	Synechococcus sp.
AAC45773.1	gi\|1916334	vermutlich Flavodoxin	Salmonella typhimurium
AAC07825.1	gi\|2984302	Flavodoxin	Aquifex aeolicus
AAC02683.1	gi\|2865512	Flavodoxin	Trichodesmium erythraeum

Tabelle 2

Zugangs-Nr.		Name des Gens	Organismus
P21890.2	gi/585127	petH	Anabaena sp. (Stamm PCC 7119)
P58558.1	gi/20138171	petH (all4121)	Anabaena sp. (Stamm PCC 7120)
Q44549.1	gi/2498066	petH (Ava_0782)	Anabaena variabilis (Stamm ATCC 29413/PCC 7937)
P00454.1	gi/119907	petH	Spirulina sp.
P31973.1	gi/399488	petH (SYNPCC7002_A0853)	Synechococcus sp. (Stamm ATCC 27264/PCC 7002/PR-6) (Agmenellum quadruplicatum)
Q55318.2	gi/2498067	petH (slr1643)	Synechocystis sp. (Stamm PCC 6803)
Q93RE3.1	gi/29839385	petH (tlr1211)	Thermosynechococcus elongatus (Stamm BP-1)
ZP_01619151.1	gi/119484669	L8106_14390	Lyngbya sp. PCC 8106
ZP_01629813.1	gi/119510685	N9414_21973	Nodularia spumigena CCY 9414
ZP_01730168.1	gi/126659027	CY0110_28804	Cyanothece sp. CCY 0110
ZP_01086181.1	gi/87303393	WH5701_10210	Synechococcus sp. WH 5701
ZP_01080624.1	gi/87124776	RS9917_01102	Synechococcus sp. RS9917
ZP_01124447.1	gi/8808938	WH7805_04581	Synechococcus sp. (Stamm WH7805)
YP_00122583.1	gi/148239896	petH (SynWH7803_1560)	Synechococcus sp. (Stamm WH7803)
YP_001227016.1	gi/148241859	petH (SynRCC307_0760)	Synechococcus sp. (Stamm RCC307)
CAO86244.1	gi/15902595	IPF_5476	Microcystis aeruginosa PCC 7806
YP_001656271.1	gi/166363998	petH (MAE_12570)	Microcystis aeruginosa (Stamm NIES-843)
YP_001802411.1	gi/172035910	petH (cce_0994)	Cyanothece sp. (Stamm ATCC 51142)
YP_001866231.1	gi/186683035	Npun_R2751	Nostoc punctiforme (Stamm ATCC 29133/PCC 73102)
BAG48514.1	gi/190350810	petH	Nostoc cf. verrucosum
BAG48518.1	gi/190350817	petH	Nostoc flagelliforme MAC
BAG48526.1	gi/190350832	petH	Nostoc cf. commune KG-102
ZP_03155450.1	gi/196256913	Cyan7822DRAFT_2608	Cyanothece sp. PCC 7822
ZP_03143292.1	gi/196244566	Cyan8802DRAFT_1689	Cyanothece sp. PCC 8802
YP_002714666.1	gi/225144671	S7335_1472	Synechococcus sp. PCC 7335
BAG69177.1	gi/197267616	petH	Nostoc commune IAM M-13
BAG69178.1	gi/197267618	petH	Nostoc sp. KU001
BAG69179.1	gi/197267620	petH	Nostoc cf. commune SO-42
BAG69180.1	gi/197267622	petH	Nostoc carneum IAM M-35
BAG69181.1	gi/197267624	petH	Nostoc linckia var. arvense IAM M-30
BAG69182.1	gi/197267626	petH	Nostoc sp. (Stamm PCC 7906)
BAG70314.1	gi/197724770	petH	Nostoc commune
BAG70315.1	gi/197724772	petH	Nostoc commune
BAG70316.1	gi/197724774	petH	Nostoc commune
BAG70322.1	gi/197724786	petH	Nostoc commune
BAG70319.1	gi/197724780	petH	Nostoc commune
BAG70320.1	gi/197724782	petH	Nostoc commune
BAG70321.1	gi/197724784	petH	Nostoc commune
BAG70323.1	gi/197724788	petH	Nostoc commune
YP_002597543.1	gi/223491251	CPCC7001_1059	Cyanobium sp. PCC 7001
ACJ05621.2	gi/227438935	petH	Fremyella diplosiphon B590
ACJ05622.1	gi/210061096	petH	Tolypothrix sp. PCC 7601
YP_002372707.1	gi/218247336	PCC8801_2543	Cyanothece sp. (Stamm PCC 8801) (Synechococcus/ sp. (Stamm PCC 8801 RF-1))
YP_002380418.1	gi/218442089	PCC7424_5201	Cyanothece sp. (Stamm PCC 7424) (Synechococcus sp. (Stamm ATCC 29155))
ACL47344.1	gi/21986005	Cyan7425_5047	Cyanothece sp. (Stamm PCC 7425/ATCC 29141)
ZP_01470332.1	gi/116073070	RS9916_31507	Synechococcus sp. RS9916
YP_723193.1	gi/113477132	Tery_3658	Trichodesmium erythraeum (Stamm IMS101)
BAE71336.1	gi/84468507	petH	Spirulina platensis
			Synechococcus elongatus
YP_399995.1	gi/81299787	Synpcc7942_0978	(Stamm PCC 7942) (Anacystis nidulans R2)
YP_376761.1	gi/78184326	Syncc9902_0749	Synechococcus sp. (Stamm CC9902)
ZP_00516246.1	gi/67922744	CwatDRAFT_3658	Crocosphaera watsonii
BAD97809.1	gi/63002589	petH	Nostoc commune
YP_171276.1	gi/56750575	petH (syc0566_c)	Synechococcus sp. (Stamm ATCC 27144/PCC 6301/SAUG 1402/1) (Anacystis nidulans)
NP-896844.1	gi/33865285	petH (SYNW0751)	Synechococcus sp. (Stamm WH8102)
YP_001015330.1	gi/124026214	petH (NATL1_15081)	Prochlorococcus marinus (Stamm NATL1A)
YP_91869.1	gi/72382514	PMN2A_0675	Prochlorococcus marinus (Stamm NATL2A)
YP_001009572.1	gi/123968714	petH (A9601_11811)	Prochlorococcus marinus (Stamm AS9601)
NP_894932.1	gi/33863372	petH (PMT_1101)	Prochlorococcus marinus (Stamm MIT 9313)
YP_001011479.1	gi/123966398	petH (P9515_11651)	Prochlorococcus marinus (Stamm MIT 9515)
YP_397581.1	gi/78779469	PMT9312_1086	Prochlorococcus marinus (Stamm MIT 9312)
YP_001016957.1	gi/124022650	petH (P9303_09411)	Prochlorococcus marinus (Stamm MIT 9303)
YP_001550998.1	gi/159903654	petH (P9211_11131)	Prochlorococcus marinus (Stamm MIT 9211)
YP_001091406.1	gi/126696520	petH (P9301_11821)	Prochlorococcus marinus (Stamm MIT 9301)
YP_002672070.1	gi/225078505	P9202_860	Prochlorococcus marinus MIT 9202
NP_893192.1	gi/33861631	petH (PMM1075)	Prochlorococcus marinus Subsp. pastoris (Stamm CCMP1986/MED4)
NP_875515.1	gi/33240573	petH (Pro_1123)	Prochlorococcus marinus
YP_001516374.1	gi/158335202	petH (AM1_2045)	Acaryochloris marina (Stamm MBIC 11017)
BAG48525.1	gi/190350830	petH	Nostoc cf. commune KG-54
ZP_01468296.1	gi/116071027	BL107_15315	Synechococcus sp. BL107
YP_730216.1	gi/113955010	sync_1003	Synechococcus sp. (Stamm CC9311)
ABD03802.1	gi/86558845	petH (CYB_2882)	Synechococcus sp. (Stamm JA-2-3B'a(2-13)) (Cyanobakterien Bakterium Yellowstone B-Prime)
YP_382213.1	gi/78213434	Syncc9605_1917	Synechococcus sp. (Stamm CC9605)
YP_474703.1	gi/86605940	petH (CYA_1257)	Synechococcus sp. (Stamm JA-3-3Ab) Cyanobakterien Bakterium Yellowstone A-Prime)
ZP_00516246.1	gi/67922744	CwatDRAFT_3658	Crocosphaera watsonii
NP_925241.1	gi/37521864	petH (gl12295)	Gloeobacter violaceus

In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Nukleinsäuresequenz, die für ein cyanobakterielles Fld kodiert, SEQ ID NR: 1. Die entsprechende Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NR: 6 dargestellt. Varianten von SEQ ID NR: 1 und SEQ ID NR: 6 liegen ebenfalls im Umfang der Erfindung. Varianten behalten die biologische Aktivität des Proteins bei.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit einer erhöhten Stresstoleranz sowie Verfahren zur Erhöhung der Stresstoleranz von Pflanzen, umfassend die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein FNR-Polypeptid in einer Pflanze kodiert. Die erfindungsgemäße Expression dieser Sequenzen in einer Pflanze kann auf unterschiedliche Arten erreicht werden, wie hierin erläutert ist. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem FNR-Polypeptid um ein durch SEQ ID NR: 8 oder 9 repräsentiertes oder um ein wie in Tabelle 2 gezeigtes Polypeptid oder um ein cyanobakterielles Homolog davon. Wie in den Beispielen gezeigt ist, haben die Erfinder ein Konstrukt verwendet, das eine aus einem Cyanobakterium abgeleitete Nukleinsäuresequenz umfasst und für ein gegen Chloroplasten gerichtetes Ferredoxin-NADP(H)-Reduktase-Polypeptid kodiert, und dieses bakterielle Gen wurde in einer Pflanze exprimiert.
In einer Ausführungsform ist die Nukleinsäuresequenz, die für ein FNR-Polypeptid kodiert, aus einem Cyanobakterium abgeleitet und das FNR-Polypeptid ist eine cyanobakterielle FNR. Bei dem Cyanobakterium kann es sich um ein Phycobilisomen enthaltendes Bakterium handeln, z. B. ausgewählt aus Crocosphaera, Cyanobium, Cyanothece, Microcystis, Synechococcus, Synechocystis, Thermosynechococcus, Microchaetaceae, Nostocaceae, Lyngbya, Spirulina oder Trichodesmium. Bevorzugte Gattungen schließen Synechococcus, Fremyella, Tolypothrix, Anabaena, Anabaenopsis, Aphanizomenon, Aulosira, Cylindrospermopsis, Cylindrospermum, Loefgrenia, Nodularia, Nostoc oder Wollea ein. In einer Ausführungsform handelt es sich bei der Gattung um Anabaena und bei dem Cyanobakterium um Anabaena PCC7119 (Fillat et al., 1990). Die Sequenz umfasst bevorzugt eine Sequenz, die für die C-terminale Zwei-Domänen-Region kodiert, jedoch nicht die Region, die für die Phycobilisomen-Bindungsdomäne kodiert. So umfasst z. B. die Nukleinsäuresequenz, die für eine cyanobakterielle FNR kodiert, SEQ ID NR: 3. Die entsprechende Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NR: 9 dargestellt. Varianten von SEQ ID NR: 3 oder SEQ ID NR: 9 liegen ebenfalls im Rahmen der Erfindung. Varianten behalten die biologische Aktivität des Proteins bei.
Bei dem Konstrukt kann es sich um ein heterologes Genkonstrukt handeln, wobei die für Fld und FNR kodierenden Nukleinsäuren von unterschiedlichen Organismen abgeleitet sind. In einer weiteren Ausführungsform sind sowohl die für Fld als auch die für FNR kodierenden Nukleinsäuren von dem gleichen Organismus abgeleitet, z. B. von einem Cyanobakterium. In einer Ausführungsform sind beide Nukleinsäuresequenzen von Anabaena abgeleitet. So kann das Konstrukt z. B. die wie in SEQ ID NR: 1 und 3 dargestellten Sequenzen oder eine funktionelle Variante davon umfassen.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das zuvor beschriebene Konstrukt des Weiteren mindestens zwei Chloroplasten-Zielsequenzen (die für ein Transitpeptid kodieren), um jedes der Polypeptide gegen die Chloroplasten zu richten. Jede Sequenz, die das Peptid zu dem Chloroplasten leitet, ist im Sinne der vorliegenden Erfindung geeignet. Beispiele hierfür sind in der Tabelle 2 von PCT/GB2002/004612 gezeigt, die hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist. So kann die Zielsequenz z. B. von FNR aus der Erbse abgeleitet sein.
Folglich kann das Konstrukt in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung eine, bevorzugt beide, der wie in SEQ ID NR: 2 und 4 dargestellten Sequenzen oder jeweils eine funktionelle Variante davon umfassen.
Das wie zuvor beschriebene Konstrukt lenkt die Koexpression von Nukleinsäuresequenzen, die für die Fld- und FNR-Polypeptide kodieren, aus einem einzelnen Konstrukt. Bevorzugt umfasst das Konstrukt mindestens zwei Chloroplasten-Zielsequenzen, um gegen Chloroplasten gerichtete Polypeptide zu kodieren. in beispielhafter Weise ist in 10 ein erfindungsgemäßes Fusionskonstrukt dargestellt und in 11 wird veranschaulicht, wie das Konstrukt hergestellt werden kann (siehe ebenfalls die Beispiele).
Die wie zuvor beschriebenen Konstrukte liegen ebenfalls im Umfang der Erfindung. Mit anderen Worten betrifft die Erfindung ein Nukleinsäurekonstrukt, das sowohl eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Fld-Polypeptid kodiert, als auch eine Nukleinsäuresequenz, die für ein FNR-Polypeptid kodiert, umfasst. Unterschiedliche Ausführungsformen des Konstrukts sowie bevorzugte Sequenzen wurden zuvor bereits dargelegt.
In beliebigen der hierin beschriebenen Konstrukten sind Wildtypsequenzen bevorzugt, die für Fld- oder FNR-Polypeptide kodieren, jedoch kann ebenfalls eine mutierte/variierte Sequenz oder Fragmente davon verwendet werden, unter der Voraussetzung, dass solche Sequenzen für ein Polypeptid kodieren, das über die gleiche biologische Aktivität verfügt wie die Wildtypsequenz. Sequenzvariationen in der Wildtypsequenz schließen stumme Basenveränderungen ein, die nicht zu einer Änderung in der kodierten Aminosäuresequenz und/oder zu Basenveränderungen (ihren, die zwar die Aminosäuresequenz, nicht jedoch die biologische Aktivität des Polypeptids beeinflussen. Bei den Veränderungen kann es sich um konservative Aminosäuresubstitutionen handeln, d. h. um eine Substitution eines Aminosäurerests, wobei die beiden Aminosäurereste ähnliche Eigenschaften aufweisen. Folglich behalten variierte/mutierte Polypeptide, die durch solche Sequenzen kodiert werden, die biologische Aktivität des Wildtyppolypeptids bei und verleihen eine Stresstoleranz. So scheinen z. B. Sequenzvariationen in der FNR-Nukleotidsequenz an den folgenden Positionen (wie in SEQ ID NR: 3 dargestellt) die Aktivität des Polypeptids nicht zu beeinflussen: 535: A/G; Asn (AAC)/Asp (GAC), 703: A/G; Met (ATG)/Val (GTG), 763: C/G; Gln (CAA)/Glu (GAA). Folglich liegen Varianten der FNR-Nukleinsäuresequenz/-Aminosäuresequenz, die diese alternativen Nukleotide/Aminosäuren umfassen, im Umfang der Ausführungsformen der Erfindung.
Bei den erfindungsgemäß verwendeten Nukleinsäuren kann es sich um doppel- oder einzelsträngige Nukleinsäuren, cDNA, genomische DNA oder RNA handeln. Jede der hierin beschriebenen Sequenzen, so wie die Sequenzen für die FNR- und Fld-Gene, können aus einer Pflanze oder einem Bakterium isolierte oder synthetisch hergestellte Sequenzen sein. Die Nukleinsäure kann in Abhängigkeit vom Design vollständig oder teilweise synthetisch sein. Der Fachmann wird verstehen, dass in den Fällen, in denen die erfindungsgemäße Nukleinsäure RNA einschließt, eine Bezugnahme auf die Sequenz so ausgelegt werden sollte, dass diese Bezugnahme auf das RNA-Äquivalent erfolgt, wobei T durch U substituiert ist.
Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung Homologe der FNR- oder -FLD-Polypeptide sowie deren Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren und in den erfindungsgemäßen Konstrukten und Vektoren. Das Homolog eines FNR- oder FLD-Polypeptids verfügt, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, über eine Gesamtsequenzidentität von 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, oder 99% zu der durch SEQ ID NR: 8 bis 10 bzw. SEQ ID NR: 6 oder 7 und/oder durch die in Tabelle 1 bzw. in Tabelle 2 gezeigten Orthologe und Paraloge repräsentierten Aminosäure. Die Gesamtsequenzidentität wird unter Verwendung eines globalen Algorithmus zur Sequenzausrichtung bestimmt, so wie des Needleman Wunsch Algorithmus in dem Programm GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), bevorzugt mit Standardparametern und bevorzugt mit Sequenzen von reifen Proteinen (d. h. ohne die Berücksichtigung von Sekretionssignalen oder Transitpeptiden).
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Verfahren bereitgestellt, in denen Konstrukte, Wirtszellen, Pflanzen und Vektoren zum Einsatz kommen, umfassend:

a) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus:
(i) einer Nukleinsäure, die durch SEQ ID NR: 1 oder 2 repräsentiert wird oder jenen, die für die in Tabelle 1 aufgeführten Homologe kodieren;
(ii) dem Komplement einer Nukleinsäure, die durch SEQ ID NR: 1 oder 2 repräsentiert wird oder von jenen, die für die in Tabelle 1 aufgeführten Homologe kodieren;
(iii) einer Nukleinsäure, die für das Polypeptid kodiert, das durch eine der SEQ ID NRs: 6 oder 7 repräsentiert wird oder jene, die der in Tabelle 1 aufgeführt sind, bevorzugt als ein Ergebnis der Degeneriertheit des genetischen Codes, wobei die isolierte Nukleinsäure aus einer Polypeptidsequenz abgeleitet sein kann, wie sie durch (eine beliebige der) SEQ ID NRs: 6 oder 7 repräsentiert wird oder jene, die in Tabelle 1 aufgeführt sind, und die des Weiteren bevorzugt eine im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhte Stresstoleranz verleiht;
(iv) einer Nukleinsäure, die in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz über eine Sequenzidentität von mindestens 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, oder 99% zu einer beliebigen der Nukleinsäuresequenzen aus SEQ ID NR: 1 oder 2 verfügt oder zu jenen, die für die in Tabelle 1 aufgeführten Homologe kodieren, bevorzugt zu denen aus SEQ ID NR: 1 oder 2, und die des Weiteren bevorzugt eine im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhte Stresstoleranz verleiht;
(v) einem Nukleinsäuremolekül, das unter stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül aus (i) bis (iv) hybridisiert und das des Weiteren bevorzugt eine im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhte Stresstoleranz verleiht;
(vi) einer Nukleinsäure, die für ein FLD-Polypeptid kodiert und die in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz über eine Sequenzidentität von mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, oder 99% zu der Aminosäuresequenz verfügt, die durch (eine beliebige der) SEQ ID NRs: 6 oder 7 oder durch eine der anderen in Tabelle 1 aufgeführten Aminosäuresequenzen repräsentiert wird, und die des Weiteren bevorzugt eine im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhte Stresstoleranz verleiht; und
b) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus:
(i) einer Nukleinsäure, die durch SEQ ID NR: 3 oder 4 repräsentiert wird oder jene, die für die in Tabelle 2 aufgeführten Homologe kodieren;
(ii) dem Komplement einer Nukleinsäure, die durch SEQ ID NR: 3 oder 4 repräsentiert wird oder von jenen, die für die in Tabelle 2 aufgeführten Homologe kodieren;
(iii) einer Nukleinsäure, die für das Polypeptid kodiert, das durch eine beliebige der SEQ ID NRs: 8 oder 9 repräsentiert wird oder jenen, die in Tabelle 2 aufgeführt sind, bevorzugt als ein Ergebnis der Degeneriertheit des genetischen Codes, wobei die isolierte Nukleinsäure aus einer Polypeptidsequenz abgeleitet sein kann, wie sie durch (eine beliebige der) SEQ ID NRs: 8 oder 9 repräsentiert wird oder jenen, die in Tabelle 2 aufgeführt sind, und die des Weiteren bevorzugt eine im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhte Stresstoleranz verleiht;
(iv) einer Nukleinsäure, die in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz über eine Sequenzidentität von mindestens 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, oder 99% zu einer beliebigen der Nukleinsäuresequenzen aus SEQ ID NR: 3 oder 4 verfügt oder zu jenen, die für die in Tabelle 2 aufgeführten Homologe kodieren, bevorzugt zu den Nukleinsäuresequenzen aus SEQ ID NR: 3 oder 4, und die des Weiteren bevorzugt eine im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhte Stresstoleranz verleiht;
(v) einem Nukleinsäuremolekül, das unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül aus (i) bis (iv) hybridisiert und des Weiteren bevorzugt eine im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhte Stresstoleranz verleiht;
(vi) einer Nukleinsäure, die für ein FLD-Polypeptid kodiert und die in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz über eine Sequenzidentität von mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, oder 99% zu der Aminosäuresequenz verfügt, die durch (eine beliebige der) SEQ ID NRs: 8 oder 9 oder durch eine der anderen in Tabelle 2 aufgeführten Aminosäuresequenzen repräsentiert wird, und die des Weiteren bevorzugt gemeinsam mit einem wie hierin beschriebenen FLD-Polypeptid, das in den Pflanzen vorliegt, eine im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhte Stresstoleranz verleiht.

In einer weiteren Ausführungsform werden Verfahren bereitgestellt, in denen Konstrukte, Wirtszellen, Pflanzen und Vektoren zum Einsatz kommen, umfassend ein isoliertes Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus:

(i) einem Nukleinsäuremolekül, das durch SEQ ID NR: 3 oder 4 repräsentiert wird oder jenen, die für die in Tabelle 2 aufgeführten Homologe kodieren;
(ii) dem Komplement einer Nukleinsäure, die durch SEQ ID NR: 3 oder 4 repräsentiert wird oder von jenen, die für die in Tabelle 2 aufgeführten Homologe kodieren;
(iii) einer Nukleinsäure, die für das Polypeptid kodiert, das durch eine beliebige der SEQ ID NRs: 8 oder 9 repräsentiert wird oder durch eines der in Tabelle 2 aufgeführten Polypeptide, bevorzugt als ein Ergebnis der Degeneriertheit des genetischen Codes, wobei die isolierte Nukleinsäure aus einer Polypeptidsequenz abgeleitet sein kann, wie sie durch (eine beliebige der) SEQ ID NRs: 8 oder 9 repräsentiert wird oder jenen die in Tabelle 2 aufgeführt sind, und die des Weiteren bevorzugt eine im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhte Stresstoleranz verleiht;
(iv) einer Nukleinsäure, die in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz über eine Sequenzidentität von mindestens 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43% 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, oder 99% zu einer beliebigen der Nukleinsäuresequenzen aus SEQ ID NR: 3 oder 4 verfügt oder zu jenen, die für die in Tabelle 2 aufgeführten Homologe kodieren, bevorzugt zu denjenigen aus SEQ ID NR: 3 oder 4, und die des Weiteren bevorzugt eine im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhte Stresstoleranz verleiht;
(v) einem Nukleinsäuremolekül, das unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül aus (i) bis (iv) hybridisiert und des Weiteren bevorzugt eine im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhte Stresstoleranz verleiht;
(vi) einer Nukleinsäure, die für ein FLD-Polypeptid kodiert, das in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz über eine Sequenzidentität von mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, oder 99% zu der Aminosäuresequenz verfügt, die durch (eine beliebige der) SEQ ID NRs: 8 oder 9 und durch eine der anderen in Tabelle 2 aufgeführten Aminosäuresequenzen repräsentiert wird, und die des Weiteren bevorzugt eine im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhte Stresstoleranz verleiht.

Bevorzugt erfolgt Vergleich zur Bestimmung der Sequenzidentität für Polypeptidsequenzen über die gesamte Polypeptidsequenz einer beliebigen Sequenz gemäß SEQ ID NR: 6 bis 9 bzw. für Nukleinsäuresequenzen über die gesamte kodierende Region der Nukleinsäuresequenzen einer beliebigen Sequenz gemäß SEQ ID NR: 1 bis 4. So werden z. B. für eine Bestimmung der Sequenzidentität einer Polypeptidsequenz zu der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NR: 8 die Sequenzen über die gesamte Länge von SEQ ID NR: 8 ausgerichtet.
Kontrollpflanzen sind Pflanzen, die das erfindungsgemäße rekombinante FLD und FNR zwar nicht umfassen, jedoch in allen anderen Hinsichten den erfindungsgemäßen Pflanzen so ähnlich wie möglich sind und auch auf die gleiche Weise behandelt werden.
In einer Ausführungsform ist eine funktionelle Variante des FLD- oder FNR-Polypeptids ein Polypeptid mit im Wesentlichen der gleichen biologischen Aktivität wie das durch die Sequenz gemäß SEQ ID NR: 6 oder 7 repräsentierte FLD bzw. wie die durch die Sequenz gemäß SEQ ID NR: 8 oder 9 repräsentierte FNR. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei funktionellen Varianten um Polypeptidhomologe, so wie sie hierin definiert sind oder so wie sie durch die hierin zuvor definierten Nukleinsäuresequenzhomologe kodiert werden.
Alle der wie hierin beschriebenen Nukleinsäurekonstrukte können des Weiteren eine regulatorische Sequenz umfassen. Folglich können sich die eine oder die mehreren wie hierin beschriebenen Nukleinsäuresequenzen unter der funktionellen Kontrolle einer regulatorischen Sequenz befinden, die zu einer Regulation der Genexpression in Pflanzen in der Lage ist. Bei einer regulatorischen Sequenz kann es sich um eine Promotorsequenz handeln, die die Expression des einen oder der mehreren Gene in dem Konstrukt steuert. So kann die Nukleinsäuresequenz z. B. unter Verwendung eines Promotors exprimiert werden, der eine Überexpression hervorruft. Erfindungsgemäß wird unter einer Überexpression verstanden, dass das Transgen auf einem Niveau exprimiert wird, das höher ist als das von den jeweiligen endogenen Promotoren regulierte Expressionsniveau der entsprechenden endogenen Gegenstücke (FNR oder Fd aus Pflanzen). So kann eine Überexpression z. B. unter Verwendung eines starken Promotors erfolgen, so wie des Promotors des Blumenkohl-Mosaikvirus (CaMV35S), des Actinpromotors aus Reis oder des Ubiquitinpromotors aus Mais oder eines beliebigen Promotors, der zu einer verstärkten Expression führt. Alternativ kann eine verstärkte oder gesteigerte Expression durch die Verwendung von Transkriptions- oder Translationsenhancern erreicht werden, wobei Enhancer in das Gen eingebracht werden können, um die Expression weiter zu verstärken. Des Weiteren kann ein induzierbares Expressionssystem verwendet werden, in denen die Expression durch einen Promotor angetrieben wird, der durch umgebungsbedingte Stressbedingungen induziert wird (z. B. durch das durch Pathogene aus Pfeffer induzierte Membranproteingen CaPIMPI oder durch Promotoren, die das dehydrationsresponsive Element (DRE) umfassen, durch den Promoter Hahb4 des Gens für das HD-Zip-Protein aus der Sonnenblume, der durch Wasserstress, hohe Salzkonzentrationen und ABA (Dezar et al., 2005) induziert werden kann, oder durch einen chemisch induzierbaren Promotor (so wie durch ein durch Steroide oder Ethanol induzierbares Promotorsystem). Solche Promotoren sind im Stand der Technik bereits beschrieben, z. B. in Pastori (2002). Weitere geeignete Promotoren und induzierbare Systeme sind dem Fachmann ebenfalls hinreichend bekannt.
Wie dem Fachmann bekannt ist, kann das Konstrukt ebenfalls einen selektierbaren Marker umfassen, der die Selektion von Transformanten ermöglicht, so wie einen Marker, der eine Resistenz gegen Antibiotika, wie z. B. Kanamycin, verleiht.
Wie zuvor detailliert ausgeführt, wird in einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren ein einzelnes Konstrukt verwendet, das die Koexpression von Nukleinsäuresequenzen reguliert, die für Fld und FNR kodieren.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit einer erhöhten Stresstoleranz:

a) die Expression eines Nukleinsäurekonstrukts in einer Pflanze, wobei das Konstrukt eine Sequenz umfasst, die für ein Fld-Polypeptid kodiert, b) die Expression eines Nukleinsäurekonstrukts, das eine Sequenz umfasst, die für ein wie hierin beschriebenes FNR-Polypeptid kodiert,
c) das Kreuzen der ersten und der zweiten Pflanze, und
d) das Erzeugen einer Pflanze, die sowohl für FNR als auch Fld homozygot ist und beides exprimiert.

Gemäß dem ersten Schritt des Verfahrens wird eine erste Pflanze mit einem Nukleinsäurekonstrukt transformiert, das eine Sequenz umfasst, die für ein Flavodoxin-Polypeptid kodiert. Solche Konstrukte wurden bereits in Tognetti et al. (2006) sowie in PCT/GB2002/004612 beschrieben, die beide hierin durch Bezugnahme eingeschlossen sind. Bevorzugte Konstrukte schließen Sequenzen ein, die von einem Cyanobakterium abgeleitet sind, bevorzugt von Anabaena, am meisten bevorzugt von Anabeana PCC7119. Das Konstrukt schließt bevorzugt ein Transitpeptid ein, um das Protein zum Chloroplasten zu dirigieren. Ein geeignetes Konstrukt ist ebenfalls in 8 dargestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Konstrukt ebenfalls eine Chloroplasten-Zielsequenz, z. B. eine aus der Erbse abgeleitete Sequenz. Das Transitpeptid dirigiert das Polypeptid zum Chloroplasten. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Konstrukt eine wie in SEQ ID NR: 1 oder 2 dargestellte Sequenz. Es werden stabile Transformanten erhalten, die das Fld-Transgen exprimieren.
In einem zweiten Schritt wird eine zweite Pflanze mit einem Nukleinsäurekonstrukt transformiert, das eine Sequenz umfasst, die für ein wie hierin beschriebenes FNR-Polypeptid kodiert. Es werden stabile Transformanten erzeugt, die homozygot für das Transgen sind und das FNR-Transgen exprimieren.
Das Nukleinsäurekonstrukt, das eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die für ein FNR-Polypeptid kodiert, und das in den verschiedenen Ausführungsformen der hierin beschriebenen Verfahren eingesetzt werden kann, ist im Nachfolgenden detailliert beschrieben. Die Nukleinsäuresequenz, die für ein FNR kodiert, ist bevorzugt bakteriellen Ursprungs und am meisten bevorzugt aus einem Cyanobakterium abgeleitet.
Bei dem Cyanobakterium kann es sich um ein Phycobilisomen enthaltendes Bakterium handeln, das z. B. ausgewählt ist aus Crocosphaera, Cyanobium, Cyanothece, Microcystis, Synechococcus, Synechocystis, Thermosynechococcus, Microchaetaceae, Nostocaceae, Lyngbya, Spirulina oder Trichodesmium. Bevorzugte Gattungen schließen Synechococcus, Fremyella, Tolypothrix, Anabaena, Anabaenopsis, Aphanizomenon, Aulosira, Cylindrospermopsis, Cylindrospermum, Loefgrenia, Nodularia, Nostoc oder Wollea ein.
Wie in den Beispielen gezeigt ist, kann das FNR-Gen aus Anabaena PCC7119 manipuliert werden. Die dritte Domäne wurde entfernt und das daraus resultierende chimäre Gen wurde in Tabakpflanzen eingebracht. Folglich handelt es sich in einer Ausführungsform bei der Gattung um Anabaena. Bevorzugt umfasst die Sequenz eine Sequenz, die für die C-terminale Zwei-Domänen-Region kodiert, jedoch nicht die Region, die für die Phycobilisomen-Bindungsdomäne kodiert. Die vollständige Sequenz von FNR ist in SEQ ID NR: 5 dargestellt. Das Konstrukt kann z. B. SEQ ID NR: 3 umfassen. Das Konstrukt kann bevorzugt eine Sequenz einschließen, die für ein Transitpeptid kodiert, um das Protein zum Chloroplasten zu dirigieren. Ein Transitpeptid ist ein Peptid, das den Chloroplasten ansteuert. Dies wird bevorzugt aus einer pflanzlichen FNR abgeleitet, z. B. aus der Erbse. Das Konstrukt kann z. B. SEQ ID NR: 4 umfassen. 9 zeigt in beispielhafter Weise ein erfindungsgemäßes Konstrukt.
In einem dritten Schritt werden die gemäß der ersten Art erhaltenen stabilen Transformanten mit gemäß der zweiten Art erhaltenen stabilen Transformanten gekreuzt, um so eine stabile homozygote Tochterpflanze zu erzeugen, die sowohl FNR als auch Fld exprimiert. Für einen Fachmann ist es offensichtlich, dass die Kreuzung einer Fld-Pflanze und einer FNR-Pflanze zum Erhalt einer ”Hybridpflanze” führt, die für jedes der Gene hemizygot ist. Die daraus resultierende Pflanze muss geselbstet werden, woraufhin eine Selektion der Nachkommen erfolgt, um doppelte Homozygoten aufzufinden – d. h. Pflanzen, die für beide Transgene homozygot sind. Einem Fachmann ist ebenfalls bekannt, dass für Polyploide mehr als ein Schritt der ”Selbstung” erforderlich ist. Folglich schließt der Schritt zum Erzeugen einer Pflanze, die sowohl für FNR als auch für Fld homozygot ist und beides exprimiert, das Erzeugen einer Nachkommenschaft der durch Schritt d) erhaltenen Pflanzen sowie die Selektion einer Pflanze ein, die homozygot für beide Transgene ist. Wie in den Beispielen gezeigt ist, wurden nach dem Kreuzen von FNR-Pflanzen mit Fld exprimierenden Schwesterpflanzen doppelt homozygote Pflanzen selektiert und es wurde gezeigt, dass diese im Vergleich zu einfach homozygoten Fld-Pflanzen über eine höhere Toleranz gegenüber Methylviologen (MV) verfügen, einer in den Redoxzyklus eingreifenden Verbindung, die oxidativen Stress verursacht.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhter Stresstoleranz

a) die Expression eines Nukleinsäurekonstrukts in einer Pflanze, wobei das Konstrukt eine Sequenz umfasst, die für ein Flavodoxin-Polypeptid oder ein FNR-Polypeptid in einer Pflanze kodiert,
b) das Transformieren der Pflanze mit einem Nukleinsäurekonstrukt, das eine Sequenz umfasst, die für ein Flavodoxin-Polypeptid bzw. für ein FNR-Polypeptid kodiert, zum Erhalt einer stabilen homozygoten Pflanze, die FNR und Fld exprimiert.

Gemäß dieser Ausführungsform wird ein einzelner Transformant erzeugt und dieser einzelne Transformant wird dann wiederum mit einem Nukleinsäurekonstrukt transformiert, das das zweite Gen umfasst, um eine stabile homozygote Pflanze zu erzeugen, die FNR und Fld exprimiert. Danach erfolgt die Selektion von stabilen homozygoten Pflanzen.
Der Fachmann wird wissen, dass die Verwendung von selektiven Markergenen für die verschiedenen Konstrukte hilfreich ist, um eine Selektion von doppelten Mutanten zu erleichtern.
Die Konstrukte, welche in dieser Ausführungsform eingesetzt werden können, wurden ebenfalls oben bereits beschrieben.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Nukleinsäurekonstrukt, das eine Nukleinsäuresequenz, die für eine cyanobakterielle FNR kodiert, sowie eine Chloroplasten-Zielsequenz umfasst. Solche Konstrukte sowie die entsprechenden unterschiedlichen Ausführungsformen sind vorstehend beschrieben.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung einen Vektor, der ein wie hierin beschriebenes Konstrukt umfasst. Der Vektor ist vorzugsweise geeignet zur Transformation von Pflanzen und dem Fachmann sind Vektoren bekannt, die hierzu verwendet werden können. Die Erfindung betrifft ebenfalls eine pflanzliche Wirtszelle, die ein wie hierin beschriebenes Konstrukt oder einen wie hierin beschriebenen Vektor umfasst.
Die Erfindung schließt ebenfalls Wirtszellen ein, die eine rekombinante Nukleinsäure, die für ein Flavodoxin-Polypeptid kodiert, und eine rekombinante Nukleinsäuresequenz, die für ein Ferredoxin-NADP(H)-Reduktase-Polypeptid kodiert, enthalten, beide jeweils wie hierin zuvor definiert. Erfindungsgemäßen Wirtszellen können beliebige Zellen sein, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus bakteriellen Zellen, so wie Zellen der Spezies E. coli oder Agrobakterium, Hefezellen, Pilzzellen, Zellen aus Algen oder Cyanobakterien oder pflanzliche Zellen. In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein erfindungsgemäßes Konstrukt, das in einer Zelle einer transgenen Pflanze enthalten ist.
In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Pflanzenzellen um nicht fortpflanzungsfähige Zellen, wie z. B. um Zellen, die nicht dazu verwendet werden können, unter Anwendung von standardmäßigen Zellkulturtechniken – d. h. von Zellkulturverfahren, jedoch ausschließend Verfahren zum Transfer von Zellkernen, Organellen oder Chromosomen in vitro – eine vollständige Pflanze aus der entsprechenden Zelle zu erzeugen.
Für die Zwecke der Erfindung bedeutet ”transgen”, ”Transgen” oder ”rekombinant”, z. B. im Hinblick auf eine Nukleinsäuresequenz, eine Expressionskassette, ein Genkonstrukt oder einen Vektor umfassend die Nukleinsäuresequenz oder einen mit den Nukleinsäuresequenzen transformierten Organismus, dass alle diese Konstruktionen durch rekombinanten Verfahren hervorgebracht wurden, in denen entweder

(a) die Nukleinsäuresequenzen, die für in den erfindungsgemäßen Verfahren zweckmäßige Proteine kodieren, oder
(b) eine oder mehrere genetische Kontrollsequenz(en), welche funktionell mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz verknüpft sind, wie z. B. ein Promotor, oder
(c) a) und b)

US 5,565,350

WO 00/15815

Unter einer für die Zwecke der Erfindung geeigneten transgenen Pflanze ist daher, wie oben ausgeführt, zu verstehen, dass sich die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren nicht an ihrem natürlichen Locus in dem Genom der betreffenden Pflanze befinden, wobei es möglich sein kann, dass die Nukleinsäuren homolog oder heterolog exprimiert werden. Wie bereits erwähnt bedeutet ”transgen” aber auch, dass – während sich die Nukleinsäuren gemäß den verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung jeweils an ihrer natürlichen Position in dem Genom einer Pflanze befinden – die Sequenz hinsichtlich der natürlichen Sequenz modifiziert wurde und/oder dass die regulatorischen Sequenzen der natürlichen Sequenzen modifiziert wurden. Bevorzugt wird ”transgen” so verstanden, dass es sich auf die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren an einem nicht natürlichen Locus innerhalb des Genoms bezieht, d. h. es findet eine homologe, oder bevorzugt eine heterologe, Expression der Nukleinsäuren statt. Bevorzugte transgene Pflanzen sind hierin genannt.
Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls Verfahren zur Verstärkung der Stressantwort oder Toleranz einer Pflanze, umfassend die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Flavodoxin-Polypeptid kodiert, und einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ferredoxin-NADP(H)-Reduktase-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze. Das Verfahren verwendet die verschiedenen hierin beschriebenen Konstrukte und Verfahrensschritte, um eine stresstolerante Pflanze zu erzeugen. Die Stressantwort ist erhöht im Vergleich zu einer Wildtyp-/Kontrollpflanze sowie im Vergleich zu einer Pflanze, die ausschließlich eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Flavodoxin-Polypeptid kodiert, jedoch keine Nukleinsäuresequenz exprimiert, die für ein Ferredoxin-NADP(H)-Reduktase-Polypeptid kodiert. Die Stressantwort kann um mindestens das 2- bis 10-fache oder mehr verstärkt werden.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine transgene Pflanze, die durch ein wie hierin beschriebenes Verfahren erhalten wurde bzw. erhalten werden kann. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine transgene Pflanze, die ein wie hierin beschriebenes Konstrukt exprimiert. Die Erfindung betrifft ebenfalls eine transgene Pflanze mit einer erhöhten Stresstoleranz, wobei die transgene Pflanze eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Flavodoxin-Polypeptid kodiert, und eine Nukleinsäure, die für ein Ferredoxin-NADP(H)-Reduktase-Polypeptid kodiert, exprimiert.
Die erfindungsgemäße Pflanze exprimiert eine Nukleinsäuresequenz, die für ein FNR-Polypeptid kodiert, z. B. umfassend eine wie in SEQ ID NR: 8 oder 9 dargestellte Sequenz oder eine funktionelle Variante davon, und sie exprimiert ebenfalls eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Fld-Polypeptid kodiert, z. B. umfassend eine wie in SEQ ID NR: 5, 6 oder 7 dargestellte Sequenz oder eine funktionelle Variante davon.
Die Erfindung erstreckt sich ebenfalls auf erntbare Teile einer Pflanze, so wie, jedoch nicht auf diese beschränkt, Samen, Blätter, Früchte, Blüten, Stängel, Wurzeln, Rhizome, Knollen und Zwiebeln, wobei die erntbaren Teile eine rekombinante Nukleinsäure umfassen, die für ein FNR-Polypeptid kodiert, bevorzugt ebenfalls umfassend eine rekombinante Nukleinsäure, die für ein Flavodoxin-Polypeptid kodiert. Die Erfindung betrifft des Weiteren Produkte, die – bevorzugt auf direktem Weg – von einem erntbaren Teil einer solchen Pflanze abgeleitet sind, so wie getrocknete Pellets oder Pulver, Öle, Fette und Fettsäuren, Stärken oder Proteine.
Die erfindungsgemäßen Samen umfassen in einer Ausführungsform die erfindungsgemäßen Konstrukte oder den erfindungsgemäßen Vektor. In einer weiteren Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Samen sortenecht im Hinblick auf das erfindungsgemäße Konstrukt oder den erfindungsgemäßen Vektor. In einer weiteren Ausführungsform umfassen die Samen eine rekombinante Nukleinsäure, die für ein FNR-Polypeptid kodiert, sowie ebenfalls eine rekombinanten Nukleinsäure, die für ein Flavodoxin-Polypeptid kodiert, beide wie jeweils hierin offenbart, und zeigen eine erhöhte Stresstoleranz.
Die Erfindung schließt ebenfalls Verfahren zur Herstellung eines Produkts ein, umfassend: a) das Kultivieren der erfindungsgemäßen Pflanzen und b) die Herstellung des Produkts aus oder durch die erfindungsgemäßen Pflanzen oder Teile dieser Pflanzen, einschließend Samen. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Verfahren Schritte: a) das Kultivieren der erfindungsgemäßen Pflanzen, b) das Entfernen der erntbaren Teile von den Pflanzen, wie zuvor definiert, und c) die Herstellung des Produkts aus den oder durch die erntbaren Teile der Erfindung.
Das Produkt kann an dem gleichen Ort hergestellt werden, an dem die Pflanze kultiviert wurde, oder die Pflanze oder Teile der Pflanze können zur Herstellung des Produkts von dem Ort entfernt werden, an dem die Pflanzen kultiviert wurden. Typischerweise wird die Pflanze kultiviert, die gewünschten erntbaren Teile werden von der Pflanze entfernt, sofern dies möglich ist in wiederholten Zyklen, und das Produkt wird aus den erntbaren Teilen der Pflanze hergestellt. Der Schritt des Kultivierens der Pflanze kann nur einmal pro Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren erfolgen, während die Schritte zur Herstellung des Produkts mehrmals erfolgen dürfen, z. B. durch wiederholtes Entfernen der erntbaren Teile der erfindungsgemäßen Pflanzen sowie, falls erforderlich, die weitere Verarbeitung dieser Pflanzenteile zum Erhalt des Produkts. Es ist ebenfalls möglich, dass der Schritt zum Kultivieren der erfindungsgemäßen Pflanzen wiederholt wird und dass Pflanzen oder deren erntbare Teile so lange gelagert werden, bis dann schließlich ein einmaliger Schritt zur Herstellung des Produkts aus den angesammelten Pflanzen oder Teilen der Pflanzen erfolgt. Die Schritte zur Kultivierung der Pflanzen und zur Herstellung des Produkts können ebenfalls mit einer zeitlichen Überschneidung durchgeführt werden, und zwar zu einem großen Teil gleichzeitig oder auch nacheinander. Im Allgemeinen werden die Pflanzen für einige Zeit kultiviert, bevor das Produkt hergestellt wird.
In einer Ausführungsform handelt es sich bei den durch die erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Produkten um pflanzliche Produkte, so wie z. B., ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein, um Nahrungsmittel, Futtermittel, Nahrungsergänzungsmittel, Futterergänzungsmittel, Fasern, kosmetische oder pharmazeutische Produkte. Unter Nahrungsmitteln werden Zusammensetzungen verstanden, die zur Ernährung oder zur Ergänzung der Ernährung verwendet werden. Als Nahrungsmittel werden insbesondere Futtermittel und Futterergänzungsmittel für Tiere angesehen. In einer weiteren Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren zur Herstellung von landwirtschaftlichen Produkten eingesetzt, so wie z. B., ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein, Pflanzenextrakte, Proteine, Aminosäuren, Kohlenhydrate, Fette, Öle, Polymere, Vitamine und dergleichen. Es ist möglich, dass ein pflanzliches Produkt zu einem großen Teil aus einem oder mehreren landwirtschaftlichen Produkten besteht.
Bei der Pflanze gemäß den unterschiedlichen Aspekten der Erfindung kann es sich um eine monokotyledone oder eine dikotyledone Pflanze handeln. Eine dikotyledone Pflanze kann aus den Familien ausgewählt sein, die Asteraceae, Brassicaceae (z. B. Brassica napus), Chenopodiaceae, Cucurbitaceae, Leguminosae (Caesalpiniaceae, Aesalpiniaceae Mimosaceae, Papilionaceae oder Fabaceae), Malvaceae, Rosaceae oder Solanaceae einschließen, jedoch nicht auf diese beschränkt sind. So kann die Pflanze z. B. ausgewählt sein aus Salat, Sonnenblume, Arabidopsis, Brokkoli, Spinat, Wassermelone, Kürbis, Kohl, Tomate, Kartoffel, Paprika, Tabak, Baumwolle, Raps, Okra, Apfel, Rose, Erdbeere, Alfalfa, Bohne, Sojabohne, Ackerbohne (fava), Erbse, Linse, Erdnuss, Kichererbse, Aprikose, Birne, Pfirsich, Reben und Zitrusfrüchten. In einer Ausführungsform handelt es sich bei der Pflanze um Tabak. In einer Ausführungsform handelt es sich bei der Pflanze um eine Gerste. In einer Ausführungsform handelt es sich bei der Pflanze um Sojabohne. In einer Ausführungsform handelt es sich bei der Pflanze um Baumwolle. In einer Ausführungsform handelt es sieh bei der Pflanze um Mais. In einer Ausführungsform handelt es sich bei der Pflanze um Reis. In einer Ausführungsform handelt es sich bei der Pflanze um Raps, einschließend Canola. In einer Ausführungsform handelt es sich bei der Pflanze um Weizen. In einer Ausführungsform handelt es sich bei der Pflanze um Zuckerrohr. In einer Ausführungsform handelt es sich bei der Pflanze um Zuckerrüben.
Ebenfalls eingeschlossen sind Nutzpflanzen für die Gewinnung von Biokraftstoff und Bioenergie, so wie Raps bzw. Canola, Leinsamen, Lupine und Weide, Pappel, Pappelhybriden, Rutenhirse, Miscanthus oder Nacktsamer, so wie die Nordamerikanische Weihrauchkiefer. Ebenfalls eingeschlossen sind Nutzpflanzen für die Silage (Mais), Weide- oder Futterpflanzen (Gräser, Klee, Esparsette, Alfalfa), Faserpflanzen (z. B. Baumwolle, Flachs), Baustoffe (z. B. Kiefer, Eiche), Pflanzen zur Zellstoffgewinnung (z. B. Pappel), Rohstofflieferanten für die chemische Industrie (z. B. Raps mit hohem Gehalt an Erucasäure, Leinsamen) sowie für Zwecke der Freizeitgestaltung (z. B. Rasengräser für Golfanlagen), Zierpflanzen für öffentliche und private Gärten (z. B. Löwenmäulchen, Petunie, Rose, Geranie, Nicotiana sp.) sowie Zimmerpflanzen und Schnittblumen für zuhause (Usambaraveilchen, Begonie, Chrysantheme, Geranie, Buntnessel, Grünlilie, Dracaena, Gummibaum). In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Bäume, wie Pappel- oder Eukalyptusbäume.
Eine monokotyledone Pflanze kann z. B. aus den Familien Arecaceae, Amaryllidaceae oder Poaceae ausgewählt sein. So kann es sich bei der Pflanze z. B. um eine Getreidepflanze handeln, so wie um Spezies von Weizen, Reis, Gerste, Mais, Hafer, Sorghum, Roggen, Zwiebel, Lauch, Hirse, Buchweizen, Rasengras, italienisches Weidelgras, Rutenhirse, Miscanthus, Zuckerrohr oder Festuca.
Bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um eine Nutzpflanze. Mit dem Begriff ”Nutzpflanze” ist eine beliebige Pflanze gemeint, die für den Verzehr durch Menschen oder Tiere oder für einen anderen Zweck, der nicht mit Nahrung oder Futter in Verbindung steht, in kommerziellem Maßstab kultiviert wird. Nicht einschränkende Beispiele für Nutzpflanzen schließen Sojabohne, Rübe, Zuckerrübe, Sonnenblume, Raps einschließend Canola, Zichorie, Karotte, Maniok, Alfalfa, Klee, Raps, Leinsamen, Baumwolle, Tomate, Kartoffel, Tabak, Pappel, Eukalyptus, Kiefer, Zuckerrohr und Getreide so wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff, Mohrenhirse und Hafer ein.
Bevorzugte Pflanzen sind Tabak, Mais, Weizen, Reis, Raps, Sorghum, Sojabohne, Kartoffel, Tomate, Gerste, Erbse, Bohne, Baumwolle, Ackerbohne, Salat, Brokkoli oder weitere Kohlpflanzen oder Pappel. In einer weiteren Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Pflanzen und die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Pflanzen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Mais, Reis, Weizen, Sojabohne, Baumwolle, Raps einschließend Canola, Zuckerrohr, Zuckerrübe und Alfalfa.
Verfahren zur Transformation von Pflanzen, z. B. mittels einer durch Agrobacterium vermittelten Transformation oder Partikelbeschuss, und darauffolgende Techniken zur Regeneration und Selektion von transformierten Pflanzen sind auf dem Gebiet bekannt. Der Umfang der Erfindung umfasst ebenfalls die Transformation von Chloroplasten mittels Bioballistik.
Gemäß den unterschiedlichen Aspekten der Erfindung werden die Antworten von Pflanzen auf Stress gesteigert, verstärkt oder verbessert. Dies soll bedeuten, dass im Vergleich zu dem Niveau, wie es in einer Pflanze des Wildtyps zu beobachten ist, eine Steigerung festzustellen ist. Darüber hinaus, wie in den Beispielen gezeigt ist, wird das Niveau ebenfalls im Hinblick auf die Stressantwort einer transgenen Pflanze erhöht, die eine Nukleinsäuresequenz exprimiert, die nur für Fld kodiert. Für den Fachmann ist es offensichtlich, dass solche Stressantworten gemessen werden können und dass eine Steigerung um das 2- bis 10-fache erzielt werden kann. Es gibt zwei Arten von Stress: der biotische Stress wird von anderen Organismen ausgeübt, so wie z. B. von einem Pathogen, wohingegen der abiotische Stress auf einen Überschuss oder ein Defizit in den physikalischen oder chemischen Gegebenheiten der Umgebung zurückzuführen ist, so wie z. B. auf Dürre, Versalzung, zu hohe oder zu niedrige Temperaturen oder hoher Sonneneinstrahlung.
Die Herstellung und das Abfangen von chemisch reaktiven Spezies, so wie ROS/RNS, spielen eine zentrale Rolle in einem großen Bereich von biotischem und abiotischem Stress sowie bei physiologischen Antworten in Pflanzen. Oxidativer Stress kann durch unterschiedliche umweltbedingte und biologische Faktoren induziert werden, so wie durch Hyperoxie, Licht, Dürre, Versalzung, Kälte, Metallionen, Schadstoffe, Xenobiotika, Toxine, Reoxygenierung nach Anoxie, experimentelle Manipulationen, Infektionen durch Pathogene und die Alterung von Organen der Pflanze.
Folglich betrifft die Erfindung insbesondere Verfahren zur Steigerung oder Verstärkung der Antwort einer Pflanze auf oxidativen Stress, der z. B. durch extreme Temperaturen, Dürre, ultraviolettes Licht, Bestrahlung, Versalzung, Kälte, Metallionen, Schadstoffe, Toxine oder Infektionen durch bakterielle, virale oder fungale Pathogene oder eine Kombination aus diesen.
In einer weiteren Ausführungsform betreffen die erfindungsgemäßen Verfahren und die erfindungsgemäßen Pflanzen eine erhöhte Toleranz gegenüber Stressfaktoren, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Dürre, niedrigen Temperaturen von weniger als 15°C bis über dem Gefrierpunkt, Temperaturen um den Gefrierpunkt, durch Salz bedingtem Stress, Mangel an Nährstoffen, durch Schwermetalle bedingtem Stress, Infektionen durch Pathogene sowie Kombinationen aus diesen.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Reduktion der Menge an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in einer Pflanze als Reaktion auf Stress, umfassend die Expression eines Flavodoxin-Polypeptids und eines Ferredoxin-NADP(H)-Reduktase-Polypeptids in einer Pflanze. Gemäß diesem Verfahren kann ein Konstrukt verwendet werden, das die Expression von sowohl Fld als auch FNR auf die hierin beschriebenen Weise reguliert. Alternativ können Fld exprimierende Pflanzen mit FNR exprimierenden Pflanzen gekreuzt werden, um eine Koexpression der beiden Gene zu erzielen.
In noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zum Erhöhen des Gehalts an Chlorophyll und/oder Carotenoid in Pflanzen oder Teilen von Pflanzen, z. B. in erntbaren Teilen, Blüten oder Samen, unter Stressbedingungen im Vergleich zu Kontrollpflanzen beansprucht.
Die relativen Expressionsniveaus von Fld und FNR gemäß den Ausführungsformen der Erfindung können variieren, wobei der Effekt in direkter Abhängigkeit von der Dosis an Fld ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Expressionsniveau von Fld mindestens ebenso hoch wie das von Ferredoxin.
Beispiele
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden, nicht einschränkenden Beispiele näher erläutert.
Verfahren
Vektorkonstruktion
Konstruktion von Ti-Vektoren zur Expression von FNR sowie zur Koexpression von Fld und FNR in Tabak
In Cyanobakterien ist die FNR ein intrinsisches Membranprotein, das aus drei Domänen besteht, einer FAD-Bindungsdomäne, einer NADP(H)-Bindungsdomäne und einer integralen Domäne, die mit Phycobilisomen in Wechselwirkung tritt (Fillat et al., 1993), wobei jedoch die ersten beiden Domänen entweder durch Proteolyse oder Mutagenese von der intrinsischen Domäne getrennt werden können, wodurch eine lösliches Zwei-Domänen-Protein erhalten wird, das die vollständige Aktivität von NADP(H)-Ferredoxin beibehält (Martinez-Júlvez et al., 1996). Diese Technik sollte garantieren, dass die cyanobakterielle FNR im Chloroplastenstroma der transgenen Pflanzen löslich bleibt und nur die gewünschte Aktivität aufweist. Folglich manipulieren wir im Rahmen der vorliegenden Erfindung das FNR-Gen aus Anabaena PCC7119. Die dritte Domäne wurde entfernt und das resultierende chimäre Gen wurde in eine Tabakpflanze eingebracht. Nach dem Kreuzen der FNR-Pflanzen mit Fld exprimierenden Schwesterpflanzen wurden doppelt homozygote Pflanzen selektiert und es wurde gezeigt, dass diese über eine höhere Toleranz gegenüber der Toxizität von Methylviologen (MV) verfügen als die einfach homozygoten Fld-Pflanzen.
Ein DNA-Fragment, das für eine Region der FNR aus Anabaena PCC7119 (ohne die Phycobilisom-Bindungsdomäne) kodiert, wurde mittels PCR-Amplifikation des vollständigen Gens, das in das Plasmid pTrc99a kloniert worden war (Fillat et al., 1990), erhalten, und zwar unter Verwendung der Primer (Primer 1) 5'-CCGAGCTCACACCATGACTCAAGCGAA-3', (SEQ ID NR: 11) und (Primer 2) 5'-ACGTCGACCAACTTAGTATGTTTCTAC-3' (SEQ ID NR: 12), die jeweils komplementär zu den Positionen 1 bis 19 und 906 bis 925 sind. Um weitere Manipulationen zu ermöglichen, wurden jeweils am 5'-Ende des Primers 1 eine SacI-Erkennungsstelle (GAGCTC) und am 3'-Ende des Primers 2 eine SalI-Stelle (GTCGAC) eingebracht. Die PCR-Bedingungen waren wie folgt: 30 Zyklen zu je 60 sec bei 94°C, 60 sec bei 54°C und 90 sec bei 72°C, unter Verwendung von 1 ng Template-DNA und 50 pmol eines jeden Primers in einem Medium enthaltend 10 mM Tris-HCl pH 8,4, 5 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,2 mM eines jeden dNTP und 2,5 Einheiten Taq DNA Polymerase.
Nach Abschluss der 30 Zyklen wurden die Reaktionen für 10 min bei 72°C inkubiert. Ein aufgereinigtes PCR-Fragment mit der prädizierten Länge (940 bp) wurde mit SacI und SalI verdaut. Das Fragment wurde zwischen den BamHI- und SalI-Restriktionsstellen in kompatible Stellen eines von pUC9 abgeleiteten rekombinanten Plasmids kloniert, das für den vollständigen Vorläufer der FNR aus der Erbse kodiert (Ceccarelli et al., 1991) und aus dem mittels des Verdaus mit SacI und SalI das DNA-Fragment entfernt worden war, das für die reife Region der FNR aus der Erbse kodiert. Dadurch wurde eine In-Frame-Fusion des aus der Erbsen-FNR abgeleiteten Chloroplasten-Transitpeptids mit der reifen Region der FNR aus Anabaena erzeugt.
Die Sequenz des chimären Gens wurde an beiden Strängen bestimmt und mittels des Verdaus mit BamHI and SalI aus dem entsprechenden Plasmid ausgeschnitten. Das Fragment mit 1120 bp wurde dann zwischen den CaMV 35S Promotor und die Polyadenylierungsregionen von pDH51 kloniert (Pietrzcak et al., 1986). Die vollständige Kassette wurde weiter als ein EcoRI-Fragment isoliert und an der EcoRI-Stelle des binären Vektors pCAMBIA 2200 (Hajdukiewiez et al., 1994) eingebracht. Das Konstrukt wurde schließlich mittels Elektroporation in den Stamm GV3101 pMP 90 des Agrobacterium tumefaciens mobilisiert (Ausubel et al., 1987).
Konstruktion von Ti-Vektoren zur Expression von FNR und Fld sowie zur Koexpression von Fld und FNR in Gerstenpflanzen
Es wurden zwei unabhängige Vektoren zur Verwendung in einem Kotransformationsprotokoll für Gerstenpflanzen mit FNR und Fld gemäß Harwood et al. (2009) entwickelt. Alle der hierin verwendeten Technologien der Molekularbiologie und rekombinanten DNA sind dem Fachmann hinreichend bekannt und in der Literatur ausführlich beschrieben. Die Sequenz des chimären Gens, die die zuvor bereits beschriebene Im-Leseraster-Fusion des aus der Erbsen-FNR abgeleiteten Chloroplasten-Transitpeptids mit der zuvor bereits beschriebenen C-terminalen kodierenden Zwei-Domänen-Region aus Anabaena PCC7119 FNR (SEQ ID NR: 4) umfasst, wurde mittels PCR amplifiziert, um Produkte zu erzeugen, die zur Klonierung in einen binären Vektor der pBRACT-Reihe geeignet sind (Harwood et al., 2009), der das hpt Gen enthält, das eine Resistenz gegen Hygromycin verleiht und unter der Kontrolle eines 35S Promotors an der linken Begrenzung (LB) steht. Das chimäre klonierte Gen befindet sich unter der Kontrolle des Ubiquitinpromotors aus Mais an der rechten Begrenzung (RB). Das chimäre Konstrukt, das die In-Frame-Fusion des aus der Erbsen-FNR abgeleiteten Chloroplasten-Transitpeptids mit der für Fld kodierenden Region aus Anabaena PCC7119 FNR (SEQ ID NR: 2, Tognetti et al., 2006; PCT/GB20021004612 ) enthält, wird einem ähnlichen Protokoll wie zuvor beschrieben unterworfen.
Die daraus resultierenden binären Vektoren, die die betreffende Gene unter der Kontrolle der gewünschten regulatorischen Sequenzen enthalten, können direkt für Protokolle zur Transformation von Pflanzen eingesetzt werden, z. B. für eine durch Agrobacterium vermittelte Transformation von Pflanzengewebe oder für Techniken des Partikelbeschusses.
Konstruktion von binären Vektoren zur Koexpression von Fld- und FNR-Polypeptiden in Pflanzen
Basierend auf das MultiSite Gateway Klonierungssystem (Invitrogen, http://www.invitrogen.com) (Karimi et al., 2007; Dafny-Yelin und Tzfira, 2007) wird ein einzelnes Konstrukt entwickelt, das die Koexpression von FNR- und Fld-Polypeptiden in einer mit einem solchen Konstrukt transformierten Pflanze dirigieren kann. In 11 ist der mehrstufige Prozess des Designs und der Konstruktion des zuvor genannten binären Vektors beschrieben. Der Prozess wird gemäß den vom Hersteller zur Verfügung gestellten Anweisungen, Protokollen und Richtlinien durchgeführt. Alle der hierin verwendeten Technologien der Molekularbiologie und rekombinanten DNA sind dem Fachmann bekannt und in der Literatur vollständig beschrieben.
Die Sequenz des chimären Gens, die die zuvor bereits beschriebene In-Frame-Fusion des aus der Erbsen-FNR abgeleiteten Chloroplasten-Transitpeptids mit der C-terminalen kodierenden Zwei-Domänen-Region aus Anabaena PCC7119 FNR (SEQ ID NR: 4) umfasst, werden mittels PCR amplifiziert, um Produkte zu erhalten, die für eine Verwendung als Substrat in einer Gateway BP Rekombinationsreaktion mit einem geeigneten Donorvektor geeignet sind. Die beiden genspezifischen Primer, Vorwärts und ein Rückwärts, sind so entworfen worden, dass in ihre jeweiligen 5'-Enden die attB1- bzw. die attB4-Sequenz eingebracht werden, die für eine spezifische BP Rekombinationsreaktion mit den attP1- bzw. den attP4-Stellen in dem Donorvektor pDONR221 P1-P4 erforderlich sind. Durch die ortsspezifische BP Rekombinationsreaktion zwischen dem attB1-FNR-attB4 PCR-Produkt und dem Vektor pDONR221 P1-P4 wird der Eintrittsklon pENTR221 L1-L4-FNR erhalten, in dem das FNR-Konstrukt von attL1 und attL4 ortsspezifischen Sequenzen für die LR Rekombination flankiert ist. Das chimäre Konstrukt, das die In-Frame-Fusion des aus der Erbsen-FNR abgeleiteten Chloroplasten-Transitpeptids mit der für Fld kodierenden Region aus Anabaena PCC7119 FNR (SEQ ID NR: 2, Tognetti et al., 2006; PCT/GB2002/004612 ) enthält, wird einem ähnlichen Protokoll wie zuvor beschrieben unterworfen, mit der Ausnahme, dass die Primer anstelle der attB1- und attB4-Stellen des vorherigen Konstrukts die attB2 und attB3 rekombinationsspezifischen Sequenzen umfassen. Durch die BP Rekombinationsreaktion zwischen dem daraus resultierenden attB2-Fld-attB3 PCR-Produkt und dem Donorvektor pDONR221 P2-P3 wird der Eintrittsklon pENTR221 L2-L3-Fld erhalten, in dem das Fld-Konstrukt von attL2 und attL3 LR rekombinationsspezifischen Stellen flankiert ist.
Die Eintrittsklone pENTR221 L1-L4-FNR und pENTR221 L2-L3-Fld werden als Substrate für eine MultiSite Gateway LR Rekombinationsreaktion mit einem beliebigen der ad hoc entworfenen pDEST-BRACT Destinationsvektoren (pBRACT) verwendet. Bei den pDEST-BRACT Vektoren handelt es sich um MultiSite Gateway Destinationsvektoren, die mittels einer einzelnen LR ortsspezifischen Rekombinationsreaktion gentechnisch dahingehend verändert wurden, dass sie zwei Gateway-Kassetten enthalten, deren Ziel die unabhängige Klonierung in einer vorbestimmten Orientierung von zwei unterschiedlichen Konstrukten ist, die durch kompatible attL-Sequenzen flankiert werden. Es handelt sich hierbei um binäre T-DNA-Vektoren, die zusätzlich zu den linken und rechten T-DNA-Begrenzungssequenzen (LB bzw. RB) eine vollständige Expressionskassette für Marker zur Selektion von Pflanzen sowie Pflanzen regulatorische Regionen (Promotoren, Terminatoren, Enhancer), die eine jede Gateway-Kassette flankieren, um so die Expression der zu klonierenden Sequenzen zur steuern. Die verschiedenen entwickelten pDEST-BRACT Destinationsvektoren unterscheiden sich hinsichtlich der Identität ihrer Promotoren und Terminatoren und/oder hinsichtlich der attL-Sequenzen, die sie enthalten. Sie könnten für eine optimale Expression der Transgene in monokotyledonen oder dikotyledonen Pflanzen unter der Kontrolle von konstitutiven oder induzierbaren Promotoren maßgeschneidert werden.
Bei dem daraus resultierenden Expressionsklon handelt es sich um einen binären Vektor, der die betreffenden Gene unter der Kontrolle der gewünschten regulatorischen Sequenzen enthält, und der direkt für Protokolle zur Transformation von Pflanzen eingesetzt werden kann, z. B. für eine durch Agrobacterium vermittelte Transformation von Pflanzengewebe oder für Techniken des Partikelbeschusses.
Expression von Fld und FNR in Tabakpflanzen
Transformation der Pflanzen
Die Transformation von Blattscheiben aus Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum cv Petit Havana) erfolgte unter Anwendung von herkömmlichen Techniken (Gallois und Marinho, 1995) und die Nachkommen von Kanamycin resistenten Transformanten wurden weiter analysiert. Primäre Transformanten mit einem hohen Expressionsniveau von cyanobakterieller FNR, wie mittels SDS-PAGE und Immunoblotting evaluiert wurde, wurden selbstbestaubt und alle nachfolgenden Experimente wurden mit der homozygoten Nachkommenschaft durchgeführt.
Erzeugung von transgenen Pflanzen, die gleichzeitig sowohl Fld als auch FNR exprimieren, aus Anabaena
Die Herstellung von doppelt exprimierenden Pflanzen erfolgte mittels Kreuzbestäubung. Als Eltern wurden transgene Pflanzen, die FNR aus Anabaena (pFNR) exprimieren und in diesem Projekt generiert wurden, sowie eine stabile homozygote Linie mit einem hohen Expressionsniveau von Fld aus Anabaena in Chloroplasten (pFld, Tognetti et al., 2006) verwendet. Primäre doppelt heterozygote Transformanten, die sowohl pFNR als auch pFld exprimieren, wurden selbstbestaubt und die Selektion von doppelt homozygoten Pflanzen erfolgte mittels SDS-PAGE und Immunoblotting.
Stressbehandlungen
Samen von Kontrollpflanzen und transgenen Pflanzen wurden auf Murashige-Skoog (MS) Agar gekeimt, das mit 3% (w/v) Saccharose sowie bei den Transformanten mit 100 μg ml^–1 Kanamycin ergänzt war. Nach 4 Wochen bei 25°C und 100 μmol Quanten m^–2s^–1 (16 h Beleuchtung/8 h Dunkelheit) wurden die Pflänzchen in Erde gesetzt. Es wurden Blattscheiben mit einem Durchmesser von 13 mm aus jungen, voll entwickelten Blättern von zwei Monate alten Tabakpflanzen, die auf Erde kultiviert worden waren, ausgestanzt. Die Blattscheiben wurden beschwert, einzeln mit der Oberseite nach oben in 24-Well-Platten in 1 ml sterilem destilliertem Wasser schwimmen gelassen, das die angegebenen Mengen an MV enthielt, und für 12 h in der Dunkelheit bei 25°C inkubiert, um eine Diffusion von MV in das Blatt zu gestatten. Im Anschluss wurden die Wells mit einer Weißlichtquelle bei 700 μmol Quanten m^–2s^–1 beleuchtet. Die Kontrollen wurden unter den gleichen Bedingungen in Wasser gehalten. Der Elektrolytaustritt aus den Blattscheiben während MV Stress wurde als die Leitfähigkeit des Mediums unter Verwendung eines Geräts zur Messung der Leitfähigkeit Horiba, Modell B-173 gemessen.
Plänzchen, die für 3 oder 4 Wochen in Erde kultiviert worden waren, wurden in ein hydroponisches System überführt, das Hoagland Lösung (Hoagland und Arnon, 1950) enthielt. Nach 3 Tagen wurde die Hoagland Lösung mit 100 μM MV ergänzt.
Analytische Verfahren
Bestimmung des Pigmentgehalts
Der Gehalt an Chlorophyll und Carotenoiden in den Blättern und Plastiden wurde jeweils unter Verwendung von Standardverfahren bestimmt (Lichtenthaler, 1987).
Detektion von Lipidperoxiden
Zur Quantifizierung des Vorliegens von Lipidperoxiden (LOOHs) in Gewebeextrakten aus den Pflanzen wurde der FOX-Assay verwendet (DeLong, et al., 2002). Es erfolgte eine Extraktion von Blattgewebe (4 cm²) mit 300 μL von 80:20 (v/v) Ethanol:Wasser, enthaltend 0,01% butyliertes Hydroxytoluen. Die Lipide wurden in die organische Phase aufgeteilt, gevortext und bei 3.000 g zentrifugiert. Es wurden 50 μl des Pflanzenextrakts mit 50 μl von 10 mM Tris-phenylphosphin (TPP, einem Mittel zur Reduktion von LOOH) in Methanol und 500 U boviner Leberkatalase (Sigma) kombiniert. Das Gemisch wurde gerührt und für 30 min inkubiert, um eine vollständige Reduktion jeglicher vorhandenen -OOHs durch TPP (+TPP) zu ermöglichen. Die Proben, bei denen keine Zugabe von TPP (-TPP) erfolgte, wurden auf die gleiche Weise behandelt, mit der Ausnahme, dass das TPP-Aliquot mit Methanol substituiert war. Nachfolgend an die 30-minütige Inkubation mit TPP wurden 900 μl eines FOX-Reagens, das aus 90% Methanol (v/v), 25 mM H₂SO₄, 4 mM butyliertem Hydroxytoluen (BHT), 25 μM Eisenammoniumsulfat-Hexahydrat und 100 μM Xylenol Orange bestand, zu jeder Probe gegeben, wobei die optische Dichte bei 560 nm 10 min nach der Zugabe in einem Ultrospec 1100 Spektrophotometer (Amersham, Biosciences) aufgezeichnet wurde. Die Unterschiede bezüglich der optischen Dichte zwischen den Proben mit und ohne die Zugabe von TPP war indikativ für das Vorliegen von LOOHs; die -OOH-Werte wurden dann als mikromolare H₂O₂-Äquivalente ausgedrückt, und zwar unter Verwendung einer Standardkurve umfassend einen zwischen 0–20 μM H₂O₂ Bereich.
Assays zur Enzymaktivität
Zur Identifikation von Enzymen, die eine von NADPH abhängige Diaphoraseaktivität zeigen, wurden Blattextrakte, die 15 μg an löslichem Protein entsprachen, mittels nicht denaturierender PAGE auf 12% Polyacrylamidgels aufgelöst. Im Anschluss an die Elektrophorese wurde das Gel mittels der Inkubation in 50 mM Tris-HCl, pH 8,5, 0,3 mM NADP⁺, 3 mM Glc-6-P, 1 Einheit ml^–1 Glc-6-P Dehydrogenase und 1 mg ml^–1 Nitroblau-Tetrazolium gefärbt, bis zum Auftreten der purpurfarbenen Formazanbanden.
Die enzymatischen Aktivitäten der Ascorbat-Peroxidasen (APX) wurden unter Anwendung des Verfahrens gemäß Mittler und Zilinskas (1993) in nativem Gel bestimmt.
Ergebnisse
Expression von löslicher FNR aus Anabaena in transgenen Tabak Chloroplasten
Zur Expression einer löslichen cyanobakteriellen FNR in Plastiden von Tabakpflanzen wurde ein chimäres Gen hergestellt, in dem die C-terminale für FNR aus Anabaena kodierende Zwei-Domänen-Region (Fillat et al., 1990) am Aminoterminus in-frame an eine DNA-Sequenz fusioniert war, die für das Chloroplasten-Transitpeptid der FNR aus der Erbse kodiert (bezüglich der Details siehe den Abschnitt ”Verfahren”). Das Konstrukt wurde unter der Kontrolle des konstitutiven CaMV 35S Genpromotors in einen binären Vektor aus Agrobacterium kloniert und mittels einer durch Agrobacterium vermittelten Transformation von Blattscheiben in die Zellen der Tabakpflanze eingebracht. Gegen Kanamycin resistente Pflanzen wurden aus einer Gewebekultur gewonnen und mittels Immunoblotting hinsichtlich der Akkumulation von FNR bewertet. Proteine, die aus primären Transformanten, von denen Proben erhalten worden waren (pFNR), oder aus einem Exemplar einer Tabakpflanze des Wildtyps (PH) extrahiert worden waren, wurden mittels SDS-PAGE sowie entweder eine Färbung derselben mit Coomassie Brillant Blau oder ein Blotting auf Nitrocellulosemembranen aufgelöst, und nachfolgend unter Anwendung von Standardtechniken mit gegen Anabaena FNR erzeugten Antiseren sondiert (2).
In Blattextrakten, die aus einer Reihe an Transformanten erhalten worden waren, war eine reaktive Bande in voll entwickeltem Ausmaß zu beobachten, was auf einen Plastidimport sowie auf eine Verarbeitung des exprimierten Flavoproteins schließen lässt. Während die FNR im Stroma der Chloroplasten aus transgenen Pflanzen detektiert wurde, kam es in der Fraktion der Thylakoidmembranen zu keiner Immunreaktivität (3A). Die Diaphoraseaktivität der stromalen Fraktion der Chloroplasten zeigte, dass das Enzym in den transgenen Tabakpflanzen aktiv ist (3B).
Pflanzen, die die cyanobakteriellen FNR in den Chloroplasten exprimieren, sahen bezüglich ihres Phänotyps im Vergleich zu ihren Schwesterpflanzen des Wildtyps normal aus und zeigten das gleiche Toleranzniveaus gegenüber der Toxizität von MV wie die Pflanzen des Wildtyps (Daten nicht gezeigt).
Expression von FNR und Fld aus Anabaena in Chloroplasten von transgenen Tabakpflanzen
Um doppelt exprimierende Pflanzen zu erhalten, erfolgte eine Kreuzbestäubung zwischen homozygoten Pflanzen, die entweder FNR oder Fld exprimieren. Die daraus resultierende Nachkommenschaft enthielt, wie erwartet, nur doppelt heterozygote Exemplare. Sie wurden selbstbestäubt und doppelt homozygote (2×) Pflanzen wurden mittels eines Western Blots selektiert (4).
Toleranz gegenüber Methylviologen
Es wurden Experimente durchgeführt, um die Toleranz von FNR bzw. Fld exprimierenden Blattscheiben gegenüber MV zu bewerten, wie im Abschnitt ”Verfahren” beschrieben. In den Kontrollblattscheiben wurde eine Entfärbung des Blattgewebes visuell erfasst, was einen erhöhten Abbau von Chlorophyll wiederspiegelt (5A). Eine Schädigung der Membranen durch die Einwirkung von MV wurde anhand einer Messung des Elektrolytaustritts festgestellt. Die für die Leitfähigkeit erhaltenen Werte wurden bezüglich des Ionenaustritts korrigiert, der in Wasser unter den gleichen Bedingungen auftritt, und in Form des prozentualen Anteils des gesamten Ionengehalts (des maximalen Werts, der nach dem Autoklavieren der Blattscheiben zum Abschluss der Behandlung mit MV erhalten wurde) ausgedrückt. Der Gehalt an Chlorophyll wurde jeweils als der Anteil des gesamten Chlorophylls der Blattscheiben ausgedrückt, die unter den gleichen Bedingungen in der Abwesenheit von MV inkubiert worden waren. Sowohl im Hinblick auf eine Schädigung der Membranen als auch auf die Pigmentintegrität waren die doppelt homozygoten FNR/Fld-Pflanzen in einem deutlich besser erhaltenen Zustand als die einfach homozygoten Fld exprimierenden Schwesterpflanzen (5B, 5C).
Um die Toleranz von vollständigen Pflanzen gegenüber MV zu bewerten, wurden diese in ein hydroponisches System getestet, so wie im Abschnitt ”Verfahren” beschrieben. Die gleichzeitige Expression von FNR und Fld bot einen besseren Schutz gegen die durch MV induzierte Schädigung als die Expression von Fld alleine (6).
Um die Propagation von ROS zu bewerten, erfolgte eine Messung der Lipidperoxidation unter Anwendung eines FOX-Assays (Delong et al., 2002). Es wurden Blattscheiben von transgenen Tabakpflanzen und solchen des Wildtyps mit 10 μM MV behandelt, wie im Abschnitt ”Verfahren” beschrieben. Die Spiegel von Lipidhydroperoxiden (LOOHs) wurden in μM H₂O₂ cm^–2 ausgedrückt und waren in der doppelt homozygoten Kreuzung X416 deutlich niedriger als das homozygote parentale pFld. Beide verfügten über eine erhöhte Toleranz im Vergleich zu den Pflanzen des Wildtyps (7A). Einige Proteine sind ebenfalls bevorzugte Ziele von ROS. Unter diesen ist die Ascorbatperoxidase (APX) in den Chloroplasten eines der meist sensitivsten. Das Inkontaktbringen von Pflanzen des Wildtyps mit 20 μM MV führt bereits nach einer Inkubation von nur 90 min zu einer 70 bis 80%-igen Abnahme der Aktivität dieses Enzyms. Die Expression von Fld bietet einen partiellen Schutz (40 bis 50% verbleibende Aktivität). Die gleichzeitige Anwesenheit von FNR in Fld exprimierenden Pflanzen führt zu einer beinahe quantitativen Konservierung der Aktivität der APX (7B).
Expression und Koexpression von Fld und FNR in Gerste
Pflanzentransformation. Erzeugung von transgenen Gerstenpflanzen, die gleichzeitig sowohl Fld als auch FNR aus Anabaena exprimieren.
Unter Verwendung von pBract214 Vektoren, die Fld- bzw. FNR-Gene umfassen, erfolgte eine Transformation von Gerstenpflanzen, wie zuvor bereits beschrieben. Die Vektoren wurden unabhängig voneinander in Agrobacterium tumefaciens transformiert und die Variante der Sommergerste namens Golden Promise wurde mit einem Gemisch aus den beiden Linien von Agrobacterium transformiert. Die Transformation der Gerstenpflanzen wurde basierend auf der Infektion von unreifen Embryonen mit A. tumefaciens durchgeführt, gefolgt von der Selektion des transgenen Gewebes auf Medien, die das Antibiotikum Hygromycin enthielten. Dieses Verfahren führte zu der Produktion von fruchtbaren unabhängigen transgenen Linien (Harwood et al., 2009) und es erfolgte eine weitere Analyse der Nachkommen von gegen Hygromycin resistenten Transformanten. Primäre heterozygote Transformanten, die cyanobakterielle FNR und cyanobakterielles Fld exprimierten, wie mittels SDS-PAGE und Immunoblotting evaluiert wurde, wurden für weiterführende Experimente verwendet. In einer abgewandelten Form des hierin beschriebenen Protokolls wurde die Infektion der Embryonen jeweils mit nur einer der Linien von A. tumefaciens durchgeführt, die eines der cyanobakteriellen Genkonstrukte trug, um unabhängige heterozygote transgene Linien zu erhalten, die das FNR- bzw. das Fld-Konstrukt exprimieren.
Stressbehandlung in Gerstenpflanzen
Transgene Gerstenpflanzen sowie Kontrollpflanzen wurden unter kontrollierten Umgebungsbedingungen kultiviert, und zwar mit Temperaturen von 15°C bei Tag und 12°C bei Nacht, 80% relativer Luftfeuchte mit einer 16-stündigen Photoperiode, bereitgestellt Mittels Metallhalidlampen (HQI) mit Wolframbirnen bei einer Intensität von 500 μmol Quanten m^–2s^–1 auf der Höhe der Ähren von ausgewachsenen Pflanze. Das Gemisch der Pflanzerde setzte sich aus Levington M3 Kompost/Perlit/Kies in einem Mischungsverhältnis von 2:2:1 zusammen. Es wurden Blattstreifen mit einer Länge von zwischen 10 und 15 mm aus den Blättern von 6 Wochen alten Gerstenpflanzen geschnitten, die in Erde kultiviert worden waren. Die Blattstreifen wurden dann in destilliertem Wasser mit der angegebenen Menge an MV und 0,05% Tween-20 für 30 Minuten bei 20°C in Dunkelheit inkubiert, um die Diffusion von MV in das Gewebe zu gestatten. Dann wurden die Blattstreifen mit der adaxialen Seite nach oben in Kunststoffschalen platziert und im Anschluss unter einer Lichtquelle mit 450 μmol Quanten m^–2s^–1 über den angegebenen Zeitraum inkubiert. Die Kontrollen wurden in destilliertem Wasser gehalten, das 0,05% Tween-20 enthielt. Der Gehalt von Chlorophyll und Carotenoid wurde dann wie in Abschnitt 5.1 beschrieben ermittelt.
Ergebnisse
Die unabhängigen heterozygoten Gerstenpflanzen, die sowohl Fld als auch FNR exprimierten und gemäß den hierin beschriebenen Verfahren erhalten worden waren, wurden Bedingungen oxidativen Stresses ausgesetzt, um ihre relative Toleranz im Vergleich zu ihren jeweiligen Gegenstücken des Wildtyps zu bewerten. In 12 sind typische Ergebnisse gezeigt, die dann erhalten wurden, wenn Blattstreifen von transgenen Pflanzen, die jeweils heterozygot für die FNR- und Fld-Gene waren, sowie Exemplare des Wildtyps mit dem in den Redoxzyklus eingreifenden Herbizid Methylviologen in Kontakt gebracht wurden, und der Gehalt der photosynthetischen Pigmente, Chlorophylle und Carotenoide wurde dann wie im Abschnitt ”Verfahren” beschrieben ermittelt. Der Abbau von Pigmenten ist ein Anzeichen für eine Verschlechterung des Photosyntheseapparats. Die Ergebnisse zeigen, dass die doppelt heterozygoten transgenen FNR/Fld-Pflanzen dazu in der Lage waren, der Provokation durch oxidativen Stress standzuhalten und dabei im Vergleich zu den Pflanzen des Wildtyps (sowie mit FNR alleine) um das 2- bis 4-fache erhöhte Gesamtspiegel von Chlorophyll bzw. Carotenoiden beizubehalten. In Fld exprimierenden transgenen Gerstenpflanzen ist ein intermediäres Toleranzniveau zu beobachten. Die Tatsache, dass Pflanzen, die für beide Transgene, FNR und Fld, heterozygot sind, ein hohes Toleranzniveau aufweisen, ist bemerkenswert angesichts des Umstands der Dosisabhängigkeit der schützenden Wirkung, die durch die Transgene verliehen wird.
Abschließende Anmerkungen
Durch die gleichzeitige Expression von sowohl Fld als auch FNR aus der gleichen cyanobakteriellen Spezies in Pflanzen wird eine im Vergleich zu Pflanzen, die lediglich Fld alleine exprimieren, erhöhte Toleranz gegenüber der Toxizität von MV verliehen. Der Einfachheit halber stehen pn-Pflanzen für primäre FNR-Transformanten von Tabakpflanzen, Xn-Pflanzen für die Kreuzungen von pn-Pflanzen mit pfld5-8 aus Tognetti et al. (2006). Xnn oder Xnnn repräsentieren die Segreganten der Selbstbestäubung von X4 doppelt heterozygoten Pflanzen.
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Sequenzprotokoll
Im Folgenden werden die wie hierin beschriebenen Nukleinsäuresequenzen sowie die entsprechenden Peptide aufgeführt.
SEQ ID NR: 1 Fld-Nukleinsäuresequenz zur Verwendung in einem einzelnen Fusionskonstrukt ohne die Zielsequenz
SEQ ID NR: 2: Fld-Nukleinsäuresequenz zur Verwendung in einem einzelnen Fusionskonstrukt mit der Zielsequenz
SEQ ID NR: 3: Nukleinsäuresequenz der FNR aus Anabaena PCC7119 zur Verwendung in einem einzelnen Fusionskonstrukt (für zwei Domänen kodierende Sequenz) ohne die Zielsequenz
SEQ ID NR: 4: Nukleinsäuresequenz der FNR zur Verwendung in einem einzelnen Fusionskonstrukt (FNR-Konstrukt mit einer für zwei Domänen kodierenden Sequenz) mit der Zielsequenz
SEQ ID NR: 5: Vollständige Nukleinsäuresequenz der FNR (mit 3 Domänen)
SEQ ID NR: 6: Aminosäuresequenz von Fld
SEQ ID NR: 7: Aminosäuresequenz von Fld mit Zielsequenz
SEQ ID NR: 8: Aminosäuresequenz der FNR aus Anabaena PCC7119 (2 Domänen) ohne die Zielsequenz
SEQ ID NR: 9: Aminosäuresequenz der FNR aus Anabaena PCC7119 (2 Domänen) mit der Zielsequenz
SEQ ID NR: 10: Vollständige Aminosäuresequenz der FNR (3 Domänen) ohne die Zielsequenz
SEQUENCE LISTING

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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

GB 2002/004612 [0004, 0034, 0050, 0095]
US 5565350 [0064]
WO 00/15815 [0064]
GB 20021004612 [0092]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Kim et al., 2008 [0003]
Vranová et al., 2002 [0003]
Zurbriggen et al., 2007 [0004]
Tognetti et al., 2006, 2007b [0004]
Singh et al., 2004 [0004]
Blaschkowski et al., 1982 [0004]
Sandmann et al., 1990 [0004]
Razquin et al., 1995 [0004]
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Forti und Bracale, 1984 [0005]
Carrillo und Ceccarelli, 2003 [0005]
Thomas et al., 2006 [0005]
Sancho, 1987 [0005]
Schluchter 1992 [0005]
Fillat et al., 1993 [0005]
Fillat et al., 1990 [0028]
Fillat et al., 1990 [0032]
Dezar et al., 2005 [0046]
Pastori (2002) [0046]
Tognetti et al. (2006) [0050]
Fillat et al., 1993 [0088]
Martinez-Júlvez et al., 1996 [0088]
Fillat et al., 1990 [0089]
Ceccarelli et al., 1991 [0090]
Pietrzcak et al., 1986 [0091]
Hajdukiewiez et al., 1994 [0091]
Ausubel et al., 1987 [0091]
Harwood et al. (2009) [0092]
Tognetti et al., 2006 [0092]
Karimi et al., 2007 [0094]
Dafny-Yelin und Tzfira, 2007 [0094]
Tognetti et al., 2006 [0095]
Gallois und Marinho, 1995 [0098]
Tognetti et al., 2006 [0099]
Hoagland und Arnon, 1950 [0101]
Lichtenthaler, 1987 [0102]
DeLong, et al., 2002 [0103]
Fillat et al., 1990 [0106]
Delong et al., 2002 [0112]
Harwood et al., 2009 [0113]
Tognetti et al. (2006) [0116]

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhter Stresstoleranz, umfassend Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz kodierend für ein Flavodoxin-Polypeptid und einer Nukleinsäuresequenz kodierend für ein Ferredoxin-NADP(H)-Reduktase-Polypeptid in einer Pflanze, wobei die Nukleinsäuresequenzen bakteriellen Ursprungs sind.
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend Exprimieren eines Nukleinsäurekonstrukts in der Pflanze, wobei das Nukleinsäurekonstrukt eine Nukleinsäuresequenz kodierend für ein Flavodoxin-Polypeptid und eine Nukleinsäuresequenz kodierend für ein Ferredoxin-NADP(H)-Reduktase-Polypeptid umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Konstrukt die Koexpression eines Flavodoxin- und eines Feredoxin-NADP(H)-Reduktase-Polypeptid regelt.
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend a) Exprimieren eines Nukleinsäurekonstrukts in einer Pflanze, das Konstrukt umfassend eine Sequenz kodierend für ein Flavodoxin-Polypeptid, b) Exprimieren eines Nukleinsäurekonstrukts in einer zweiten Pflanze, das Konstrukt umfassend eine Nukleinsäuresequenz kodierend für ein FNR-Polypeptid, c) Kreuzen der ersten und zweiten Pflanze, und d) Generieren einer stabilen homozygoten FNR und Fld-exprimierenden Pflanze.
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend a) Exprimieren eines Nukleinsäurekonstrukts in einer Pflanze, das Konstrukt umfassend die Sequenz kodierend für ein Flavodoxin-Polypeptid oder ein FNR-Polypeptid, b) Transformieren der Pflanze mit einem Nukleinsäurekonstrukt, umfassend eine Sequenz kodierend für ein Flavodoxin-Polypeptid beziehungsweise einer Sequenz kodierend für ein FNR-Polypeptid, um eine stabile homozygote FNR und Fld-exprimierende Pflanzen zu erzeugen.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Nukleinsäuresequenz kodierend für ein Flavodoxin-Polypeptid a) aus einem Cyanobakterium gewonnen wird und das Flavodoxin-Polypeptid ein cyanobakterielles Flavodoxin ist oder b) aus einem heterotrophen Bakterium gewonnen wird.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Nukleinsäuresequenz kodierend für ein Flavodoxin-Polypeptid ausgewählt ist aus einer Nukleinsäure, wie in Tabelle 1 dargestellt.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Nukleinsäuresequenz kodierend für ein Ferredoxin-NADP(H)-Reduktase-Polypeptid ausgewählt ist aus einer Nukleinsäuresequenz, wie in Tabelle 2 dargestellt.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Nukleinsäuresequenz kodierend für Ferredoxin-NADP(H)-Reduktase aus einem Cyanobakterium-Polypeptid gewonnen wird und die Ferredoxin-NADP(H)-Reduktase-Polypeptid ein cyanobakterielles FNR ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, wobei das Cyanobakterium ausgewählt ist aus Crocosphaera, Cyanobium, Cyanothece, Microcystis, Synechococcus, Synechocystis, Thermosynechococcus, Microchaetaceae, Nostocaceae, Lyngbya, Spirulina oder Trichodesmium.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, wobei das Cyanobakterium ausgewählt ist aus Fremyella, Tolypothrix, Anabaena, Anabaenopsis, Aphanizomenon, Aulosira, Cylindraspermopsis, Cylindrospermum, Loefgrenia, Nodularia, Nostoc oder Wollea.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Nukleinsäuresequenz kodierend für ein cyanobakterielles Flavodoxin, SEQ ID Nr. 1 oder eine funktionelle Variante davon umfasst.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Nukleinsäuresequenz kodierend für Ferredoxin-NADP(H)-Reduktase eine Sequenz kodierend für die C-terminale Zwei-Domänen-Region umfasst, nicht aber eine Sequenz kodierend für die Phycobilisom-Bindedomäne umfasst.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Nukleinsäuresequenz kodierend für ein cyanobakterielles FNR, SEQ ID Nr. 3 oder eine funktionelle Variante davon umfasst.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei das Nukleinsäurekonstrukt weiterhin eine regulatorische Sequenz umfasst.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei das Konstrukt weiterhin eine Chloroplasten-Zielsequenz umfasst.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Chloroplasten-Zielsequenz aus Erbsen FNR gewonnen wird.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Nukleinsäuresequenz kodierend für ein Flavodoxin-Polypeptid, SEQ ID Nr. 2 oder eine funktionelle Variante davon umfasst.
Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, wobei die Nukleinsäuresequenz kodierend für ein FNR-Polypeptid, SEQ ID Nr. 4 oder eine funktionelle Variante davon umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, wobei die Pflanze eine einkeimblättrige oder zweikeimblättrige Pflanze ist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Pflanze eine Getreidepflanze ist.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Pflanze Tabak oder Hopfen ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei der Stress ausgewählt ist aus biotischen oder abiotischen Stress.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei der Stress ausgewählt ist aus UV-Licht, extremen Temperaturen, Wassermangel, Versalzung, Dürre und pathogener Infektion.
Transgene Pflanze hergestellt durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24.
Transgene Pflanze mit einer erhöhten Stresstoleranz, die transgene Pflanze exprimierend eine Nukleinsäure kodierend für ein Flavodoxin-Polypeptid und eine Nukleinsäure kodierend für Ferredoxin-NADP(H)-Reduktase-Polypeptid, wobei die Nukleinsäuresequenzen bakteriellen Ursprungs sind.
Pflanze nach Anspruch 25 oder 26, wobei die Pflanze eine einkeimblättrige oder zweikeimblättrige Pflanze ist.
Transgene Pflanze nach Anspruch 27, wobei die Pflanze eine Getreidepflanze ist.
Pflanze nach Anspruch 28, wobei die Pflanze Tabak oder Hopfen ist.
Pflanze nach einem der Ansprüche 26 bis 29, wobei die Pflanze eine Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 und 4 oder eine funktionelle Variante davon exprimiert.
Nukleinsäurekonstrukt umfassend eine Nukleinsäuresequenz kodierend für ein Flavodoxin-Polypeptid und eine Nukleinsäuresequenz kodierend für ein Ferredoxin-NADP(H)-Reduktase-Polypeptid, wobei die Nukleinsäuresequenzen bakteriellen Ursprungs sind.
Konstrukt nach Anspruch 31, wobei das Bakterium ein Cyanobakterium ist.
Konstrukt nach einem der Ansprüche 31 bis 32, wobei das Konstrukt weiterhin eine Chloroplasten-Zielsequenz umfasst.
Konstrukt nach Anspruch 33, wobei die Chloroplasten-Zielsequenz aus Erbsen FNR gewonnen wird.
Konstrukt nach Anspruch 34, wobei die Nukleinsäuresequenz kodierend für ein Flavodoxin-Polypeptid, SEQ ID Nr. 2 oder eine funktionelle Variante davon umfasst.
Konstrukt nach Anspruch 34 oder 35, wobei die Nukleinsäuresequenz kodierend für ein FNR-Polypeptid, SEQ ID Nr. 4 oder eine funktionelle Variante davon umfasst.
Vektor, umfassend ein Konstrukt nach einem der Ansprüche 30 bis 36.
Wirtszelle, umfassend ein Konstrukt nach einem der Ansprüche 30 bis 36 oder einen Vektor nach Anspruch 37.
Pflanzenzelle, umfassend ein Konstrukt nach einem der Ansprüche 32 bis 36 oder einen Vektor nach Anspruch 37.
Transgene Pflanze, Pflanzenteil einschließlich Samen oder Pflanzenzelle transformiert mit einem Konstrukt nach einem der Ansprüche 32 bis 36 oder einen Vektor nach Anspruch 37 oder herstellbar durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, wobei die Pflanze oder Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure kodierend für ein Polypeptid, wie in Anspruch 31 bis 37 definiert, umfasst.
Transgene Pflanze nach Anspruch 40, wobei die Pflanze eine einkeimblättrige oder zweikeimblättrige Pflanze ist.
Transgene Pflanze nach Anspruch 41, wobei die Pflanze eine Getreidepflanze ist.
Transgene Pflanze nach Anspruch 42, wobei die Pflanze Tabak oder Hopfen ist.
Verwendung einer Pflanze nach einem der Ansprüche 40 bis 43 in dem Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhter Stresstoleranz.
Verfahren zur Reduzierung der Menge an ROS in einer Pflanze als Antwort auf Stress umfassend Exprimieren einer Nukleinsäure kodierend für ein Flavodoxin-Polypeptid und einer Nukleinsäure kodierend für Ferredoxin-NADP(H)-Reduktase-Polypeptid in einer Pflanze, wobei die Nukleinsäuresequenzen bakteriellen Ursprungs sind.
Verfahren zur Herstellung eines Produkts umfassend die Schritte des Anbauens der Pflanzen nach einem der Ansprüche 40 bis 43 und Produzieren des Produktes von oder durch die Pflanzen der Erfindung; oder Teile, einschließlich Samen, von diesen Pflanzen.
Verfahren zur Erhöhung der Stressantwort oder Toleranz von einer Pflanze umfassend Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz kodierend für ein Flavodoxin-Polypeptid und einer Nukleinsäuresequenz kodierend für Ferredoxin-NADP(H)-Reduktase-Polypeptid in einer Pflanze, wobei die Nukleinsäuresequenzen bakteriellen Ursprungs sind.