CN105567621B - 一种促进细胞内辅酶nadph再生的基因工程集胞藻及其应用 - Google Patents

一种促进细胞内辅酶nadph再生的基因工程集胞藻及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种促进细胞内辅酶NADPH再生的集胞藻PCC6803工程藻及构建方法及应用。将催化辅酶NADPH再生的铁氧还蛋白‑NADP+还原酶FNR的基因petH通过同源重组得到重组质粒pKW‑Ω‑PpetE‑petH，再将该质粒转化到集胞藻PCC6803中，通过同源重组使FNR基因整合到集胞藻染色体DNA中，可通过Cu2+浓度调控FNR的高强度表达。通过该方法构建的工程藻可促进FNR过量表达，增加胞内FNR总酶活，极大的促进胞内辅酶NADPH再生效率。本发明方法得到的藻株通过促进微藻胞内辅酶NADPH的再生，可应用于对辅酶需求量大的生物催化与转化过程及生物技术领域中，具有广泛的应用前景。

Description

一种促进细胞内辅酶NADPH再生的基因工程集胞藻及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种促进细胞内辅酶NADPH再生的基因工程蓝藻开发及其应用。
背景技术
生化工程中，辅酶发挥着重要的作用，它为生物合成反应、分解代谢反应提供氧化还原所需的载体，并在细胞内的能量转化过程中扮演着重要角色。还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）是一种辅酶，其参与合成代谢，如氨基酸、脂类及核苷酸等细胞组成物质的合成，同时对细胞的正常生长和代谢都有着重要的影响；在生物转化中，利用工业微生物大规模生产非天然氨基酸、手性醇及类胡萝卜素、生物可降解聚合物和色素等其它精细化学品，需要通过表达依赖NADPH的特定氧化还原酶以促进目标代谢物合成；在代谢过程中，如何改变代谢支路减少副产物的形成，如何调控代谢途径获得目的产物等也需要辅酶的参与；在发酵过程中，要想扩大规模投入生产，减少副产物的形成、获得高收益、降低成本等都需要考虑到辅酶的作用。但是通过外源投加NADPH成本昂贵，并不适合工业化生产，而通过代谢调控技术提高胞内NADPH浓度，不仅降低了生产成本，也能更好的保证生物转化过程的正常进行。因此，从技术经济角度来看，对辅酶进行再生循环使用是很有必要的。
基于辅酶NADPH的代谢调控主要包括内源和外源调控两种方法，其中外源调控主要采用生化工程方法，通过添加外源代谢物、不同还原态碳源或烟酰胺辅酶前体等方式实现对NADPH代谢的调控，如针对循环代谢过程中的相关酶添加相应的抑制剂或促进剂以实现辅酶NADPH再生；而内源调控则通过基因工程和代谢工程手段，调控同NADPH代谢相关的酶和反应途径，主要包括过量表达NADPH代谢的相关酶、敲除NADPH代谢相关基因或引入特定代谢途径，如过量表达G6PDH可促进胞内NADPH/NADP+比率提高，胞内NADPH供应充足，使得代谢合成需依赖辅酶NADPH的反应产量得到提高；如过量表达NADH激酶或苹果酸酶可重组代谢流，提高NADPH浓度；如敲除EMP途径中的某些基因，可降低EMP途径代谢流，促进更多代谢流进入PPP途径以合成NADPH，提高NADPH浓度；如过量表达NADPH主要的代谢途径PPP途径中的某些NADPH合成关键酶是目前应用较广的NADPH代谢调控策略，但PPP途径代谢流增加会削弱TCA循环和糖酵解途径（EMP途径）代谢流，有时会不利于细胞生长，故应用此策略需综合考虑其他方面因素。
生物催化前手性羰基化合物不对称还原合成手性醇是指羰基还原酶或含有羰基还原酶的活性细胞，在还原型辅酶NAD(P)H的参与下，催化前手性羰基化合物不对称还原得到相应的手性醇，同时还原型辅酶NAD(P)H转化为氧化型辅酶NAD(P)+。在这个过程中，细胞内辅酶的含量直接影响羰基还原酶的活性，所以辅酶是至关重要的，且活性细胞内辅酶可通过细胞代谢过程再生并循环利用，因此通过调控细胞内辅酶代谢过程，或直接在活性细胞内建立辅酶代谢调控平台，促进辅酶再生，则能更好的控制辅酶浓度，增强生物催化不对称还原活性，提高手性羰基化合物不对称还原合成手性醇的合成效率。
微藻可通过光合作用再生NADPH，而微藻光驱辅酶再生其本质是微藻叶绿体内光合作用的光反应过程中由铁氧还蛋白-NADP+还原酶（FNR）催化NADP+还原为NADPH的过程。已有一些研究报道，微藻作为一种新型生物催化剂，逐渐用于活性细胞催化前手性羰基化合物不对称还原得到手性醇。同时许多研究表明微藻作为生物催化剂在色素、类胡萝卜素、制药等生产过程中也具有广阔的应用前景。但由于在微藻细胞内辅酶再生效率不高、再生代谢过程不易调控等原因，导致生物催化过程中普遍存在不对称还原活性低、生产效率不高等问题，严重制约了微藻催化技术的发展。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种促进蓝藻（集胞藻）细胞内辅酶NADPH再生的基因工程技术及工程蓝藻，其含有可强化调控的整合到集胞藻染色体上的铁氧还蛋白-NADP+还原酶（FNR）的基因petH，通过Cu2+浓度调控FNR的表达。其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.M2016034。
本发明还提供了制备上述基因工程集胞藻的方法，包括以下步骤：
（1）将铁氧还蛋白-NADP+还原酶（ferredoxin-NADP oxidoreductase，FNR）的基因petH构建到含有Ω-PpetE片段的质粒pHB1524上，得到重组质粒pHB1524-petH，再通过PCR扩增得到Ω-PpetE-petH片段，并将其构建到集胞藻通用整合平台pKW1188质粒上得到重组质粒pKW-Ω-PpetE-petH。
（2）将重组质粒pKW-Ω-PpetE-petH转化到集胞藻PCC6803中得到可强化调控petH表达的藻株。
步骤（1）中所述的pKW-Ω-PpetE-petH通过如下步骤的方法制备：以集胞藻PCC6803的总DNA为模板，用petH 上游引物petH-3和下游引物petH-4通过PCR扩增得到如SEQ ID NO.1所示的petH 片段；通过petH上下游引物上的酶切位点Sal I和载体pHB1524上的同源序列，利用同源重组的方法，将petH插入载体pHB1524中，获得pHB1524-petH；以pHB1524-petH为模板，用Ω-PpetE-petH上游引物Pp-5和下游引物Pp-6通过PCR扩增得到Ω-PpetE-petH片段；通过Ω-PpetE-petH上下游引物上的酶切位点EcoR I和载体pKW1188上的同源序列，利用同源重组的方法，将Ω-PpetE-petH插入载体pKW1188中，获得重组质粒pKW- Ω-PpetE-petH；
步骤（2）中所述的转化方法为：培养集胞藻PCC6803藻细胞生长至OD730=0.7-0.9，室温条件下，离心收集藻细胞并用新鲜的BG-11培养基重悬沉淀；取藻细胞与重组质粒混合，光照混合孵育12-20h；孵育后涂布到含有抗生素的BG-11平板上，光照通风培养诱导转化；以筛选得到的表达藻株的DNA为模板，利用引物Ex1和Ex2进行PCR扩增鉴定，确定获得可强化调控petH表达的工程蓝藻：集胞藻PCC6803:: Ω-PpetE-petH。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC NO.M2016034，保藏时间是2016年1月13日，分类命名为集胞藻PCC6803:: Ω-PpetE-petH，即Synechocystis sp.PCC6803:: Ω-PpetE-petH。
本发明的进一步目的是提供促进细胞内辅酶NADPH再生的基因工程集胞藻在催化前手性羰基化合物不对称还原合成手性醇中的应用。
有益效果：
本发明方法构建了重组质粒pKW-Ω-PpetE-petH，经转化得到可强化调控petH表达的工程蓝藻：集胞藻PCC6803:: Ω-PpetE-petH，通过Cu2+诱导可促进集胞藻细胞内辅酶NADPH再生，经测定辅酶NADPH浓度提高两倍以上，FNR酶活提高一倍以上。解决了现有生物催化、生物转化、发酵过程中胞内辅酶NADPH再生效率低的问题，此方法可应用于生物催化、转化和发酵领域。
附图说明
图1是重组质粒pKW-Ω-PpetE-petH构建示意图；
图2是重组质粒pHB1524-petH酶切检测图；
M：1kb DNA Ladder；#1：质粒pHB1524线性化处理；#2、#3：重组质粒pHB1524-petH酶切图；#4：petH片段；L：100bp DNA Marker；
图3是重组质粒pKW-Ω-PpetE-petH酶切检测图；
M：1kb DNA Ladder；#1~#6：重组质粒pHB1524-petH酶切图；#7：质粒pKW1188线性化处理；#8：Ω-PpetE-petH片段；L：DL5000 DNA Marker;
图4是PCR检测Ω-PpetE-petH在集胞藻PCC6803基因组中的整合；
M：DL5000 DNA Marker；#1：集胞藻PCC6803:: Ω-PpetE-petH；#2：集胞藻PCC6803；L：100bp DNA Marker；
图5是petH的过表达菌株和野生型菌株用Cu2+诱导表达后FNR酶活检测结果图；
*表示和野生型菌株比较差异性不显著，**表示差异性显著，***表示差异性极显著；
图6是petH的过表达菌株和野生型菌株用Cu2+诱导表达后辅酶NADPH浓度检测结果图；
*表示和野生型菌株比较差异性不显著，**表示差异性显著，***表示差异性极显著；
图7是铜离子诱导集胞藻PCC6803:: Ω-PpetE-petH催化苯乙酮不对称还原生成手性苯乙醇产率和对映体过量值结果图；
*表示和野生型菌株比较差异性不显著，**表示差异性显著，***表示差异性极显著；
图8是铜离子诱导集胞藻PCC6803:: Ω-PpetE-petH催化乙酰乙酸乙酯不对称还原生成手性3-羟基丁酸乙酯产率和对映体过量值结果图；
*表示和野生型菌株比较差异性不显著，**表示差异性显著，***表示差异性极显著。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室指南》（New York:Cold Spring Harborlaboratory Press,2001)中所述的条件进行。
【实施例1】重组质粒pKW-Ω-PpetE-petH的构建
以集胞藻PCC6803总DNA为模板，将petH(核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示)通过PCR扩增获得，再通过同源重组插入到质粒pHB1524中，获得重组质粒pHB1524-petH；再以重组质粒pHB1524-petH为模板，将片段Ω-PpetE-petH通过PCR扩增获得，通过同源重组插入到质粒pKW1188中，获得重组质粒pKW-Ω-PpetE-petH。
（1）集胞藻PCC6803总DNA的提取
利用CTAB法提取集胞藻PCC6803的DNA，-20℃保存用于后续实验。
（2）PCR扩增petH和pHB1524酶切
PCR扩增反应体系：集胞藻PCC6803总DNA1μL，ePfuMix(1×)20μL，petH上游引物2μL，petH下游引物2μL，共25μL。petH上游引物petH-3为5’-CAAGAAGTATGTCAATCGTCGACATGTACAGTCCCGGTTACGTAGC-3’（SEQ NO.2）， petH下游引物petH-4为5’-AGCTTGCATGCCTGCAG GTCGACTTAGTAGGTTTCC ACGTGACAGC-3’ （SEQ NO.3），单划线序列为Sal I酶切位点，双划线为载体pHB1524插入位点处上下游载体同源序列。
PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃ 1min，58.6℃ 1min，72℃ 1min 50S，30个循环；最后延伸72℃ 10min。
将PCR产物petH通过琼脂糖凝胶电泳检测正确后，切胶回收-20℃保存备用；载体pHB1524（该载体是在克隆载体pMD18-T上插入片段Ω-PpetE得到）用Sal I进行单酶切线性化处理，线性化载体进行切胶回收用于后续重组反应。
（3）质粒pHB1524-petH的重组与转化
利用ClonExpressTM П 重组克隆试剂盒将线性化载体与目的基因进行重组。
在新鲜制备的E.coli DH5α感受态细胞中，加入10μL重组反应液，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min，42℃热激45~90S，冰水浴孵育2min，加入900μL LB培养基，37℃孵育10min充分复苏，37℃摇菌45min，将培养液在5000rpm离心3min后收集菌体，用100μL LB培养基重悬后涂布在含有氨苄青霉素25mg/L和壮观霉素25mg/L的LB平板上，在37℃恒温箱中过夜培养筛选重组子。
（4）质粒pHB1524-petH的鉴定
利用菌落PCR快速检测质粒重组是否成功。用无菌枪头将单个菌落挑至50μL LB培养基中混匀，直接取1μL作为PCR模板，进行PCR验证，初步判断重组是否成功。
将判断为初步重组成功的菌液摇瓶培养，提取质粒，后经Sal I酶切鉴定确认，为阳性克隆，如图2所示。
将阳性转化子对应的菌液活化后送去测序，测序序列结果显示插入的petH片段长度为1242bp，在NCBI中通过BLAST比对，比对一致表明重组质粒pHB1524-petH构建成功。
（5）质粒的提取
取2个装有25mL LB培养基（酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L）的锥形瓶中，将含有pHB1524-petH、pKW1188质粒的单菌落分别加入到含有相应抗生素的培养基中，在37℃、150rpm下摇床过夜培养，按照SDS裂解法提取质粒，质粒提取完后标记备用。
（6）PCR扩增Ω-PpetE-petH和pKW1188酶切
PCR扩增反应体系：质粒pHB1524-petH 1μL，ePfuMix(1×)20μL，Ω-PpetE-petH上游引物Pp-5 2μL，Ω-PpetE-petH下游引物Pp-6 2μL，共25μL。Ω-PpetE-petH上游引物为5’-CTTTGATGGTTATATGGGAATTCTTAGTA GGTTTCCACGTGCCAG-3’ （SEQ NO.4），下游引物为5’-GGTGCCATCCATACCGGGAATTCAGGAAACAGCTATGACCATGATTACG - 3’ （SEQ NO.5），单划线序列为EcoR I酶切位点，双划线为载体pKW1188插入位点处上下游载体同源序列。
PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃ 1min，61.8℃ 1min，72℃ 3min 50S，30个循环；最后延伸72℃ 10min。
将PCR产物Ω-PpetE-petH通过琼脂糖凝胶电泳检测正确后，切胶回收-20℃保存备用；载体pKW1188（含有集胞藻PCC6803同源整合片段）用EcoR I进行单酶切线性化处理，线性化载体进行切胶回收用于后续重组反应。
（7）质粒pKW-Ω-PpetE-petH的重组及转化
利用ClonExpressTM П 重组克隆试剂盒将线性化载体与目的基因进行重组。
在新鲜制备的E.coli DH5α感受态细胞中，加入10μL重组反应液，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min，42℃热激45~90S，冰水浴孵育2min，加入900μL LB培养基，37℃孵育10min充分复苏，37℃摇菌45min，将培养液在5000rpm离心3min后收集菌体，用100μL LB培养基重悬后涂布在含有氨苄青霉素25mg/L和壮观霉素25mg/L的LB平板上，在37℃恒温箱中过夜培养筛选重组子。
（8）克隆鉴定
利用菌落PCR快速检测重组是否成功。用无菌枪头将单个菌落挑至50μL LB培养基中混匀，直接取1μL作为PCR模板，进行PCR验证，初步判断重组是否成功。
将判断为初步重组成功的菌液摇瓶培养，提取质粒，后经EcoR I酶切鉴定确认，为阳性克隆，如图3所示。
将阳性转化子对应的菌液活化后送去测序，测序序列结果显示插入的Ω-PpetE-petH片段长度为4kb，在NCBI中通过BLAST比对，比对一致表明重组质粒pKW-Ω-PpetE-petH构建成功。
【实施例2 】集胞藻PCC6803:: Ω-PpetE-petH的构建和诱导表达
（1）集胞藻PCC6803的转化
取30mL培养至OD730=0.7-0.9的集胞藻PCC6803（WT）菌液于离心管中，5000rpm离心5min；收集藻细胞，用新鲜的BG-11培养基悬浮沉淀，每管0.1mL分装于EP管中；取5μL重组质粒pKW-Ω-PpetE-petH于悬浮液中，藻细胞和重组质粒的混合物在30℃、2000Lux的光照条件下温育16h；孵育后的混合物涂布到含有壮观霉素10mg/L~250mg/L的BG-11平板上，30℃、2000Lux的光照条件下筛选诱导转化子长出，经过液体培养基传代培养后用PCR法鉴定转化子。
（2）鉴定集胞藻PCC6803:: Ω-PpetE-petH
如图4所示，利用slr0168基因内的两个引物Ex1和Ex2，分别以集胞藻PCC6803::Ω-PpetE-petH和集胞藻PCC6803（WT）的基因组DNA为模板进行PCR扩增，结果显示Ω-PpetE-petH正确插入在slr0168基因中，只能检测到4.5kb左右的PCR带，而看不到0.7kb左右的野生型带，可判断集胞藻PCC6803:: Ω-PpetE-petH构建成功。其中，引物Ex1为5' -CCAGTAAGGTCACCCATCGT- 3'（SEQ NO.6）；引物Ex2为5'- TTCCAGGCCACATTGTTGTC -3’ （SEQNO.7）。
该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC NO.M2016034，保藏时间是2016年1月13日，分类命名为集胞藻PCC6803:: Ω-PpetE-petH，即Synechocystis sp. PCC6803:: Ω-PpetE-petH。
（3）petH诱导表达
将集胞藻PCC6803:: Ω-PpetE-petH先在不含有铜离子的培养基中传两代，消耗掉藻细胞内残留的铜离子，然后在培养基中添加不同浓度的铜离子，检测FNR粗酶液活性和NADPH浓度。
【实施例3】 FNR粗酶液活性和NADPH浓度的检测
（1）FNR粗酶液的提取
取1mL在铜离子400nmol/L下培养的藻液，加入预冷的提取液（50mM Tris-HC1，0.1mM EDTA，0.1mMβ-巯基乙醇 (pH8.0)，1uM PMSF）混合，超声波破碎，6次循环，每次45s，25000×g离心30min，4℃，取上清液待检测。
（2）FNR粗酶液活性检测
取1mL粗酶液在25℃条件下与4mL的反应液（0.5mM NADP+，0.019mM DCPIP，50mMTris-HCl (pH8.0)）混合反应，每隔30s测OD340nm，2min。定义铁氧还蛋白-NADP+还原酶（FNR）酶活为每分钟得到1 μmol/L NADPH所需的酶量为一个酶活单位（U），如图5所示，经400nmol/L的铜离子处理后的集胞藻PCC6803:: Ω-PpetE-petH相比集胞藻PCC6803的FNR酶活提高了一倍。
（3）NADPH浓度测定
取30ml在铜离子400nmol/L下培养的藻液，13000rmp/min离心5min收集藻细胞，向收集的藻细胞加入8ml提取液（0.1mol/l Tris-HCl，pH 8.0, 10mmol/l EDTA, 0.05%(v/v)Triton X-100），充分震荡使藻细胞重新悬浮，然后超声波破碎5min，破碎功率400W，破碎3s，间隔3s，最后 12000rmp/min离心5min，取上清利用HPLC法检测，检测条件为：C18色谱柱，流动相为V(甲醇)：V(超纯水):V(K2HPO4-KH2PO4)=75：20：5，pH=7.2，流速为0.8ml/min，柱温25℃，检测波长340nm，进样体积为20μl，根据峰面积和标准曲线，计算NADPH浓度。如图6所示，经400nmol/L的铜离子处理后的集胞藻PCC6803:: Ω-PpetE-petH相比集胞藻PCC6803的NADPH浓度提高了两倍。
【实施例4】铜离子诱导集胞藻PCC6803:: Ω-PpetE-petH催化苯乙酮不对称还原生成手性苯乙醇
（1）藻种培养
将集胞藻PCC6803:: Ω-PpetE-petH在不含铜离子的培养基中传代培养，传两代后将藻体内的铜离子消耗干净后，分别在含有不同浓度铜离子的培养基中培养，采用GXZ型智能光照培养箱，使其培养条件为温度控制在28±2 ℃；全天光照，光照强度为2000Lux；向培养体系中连续通入空气和CO2的混合气体，CO2的比例为5%（v/v），通气速率为0.8 L/min；培养时间为6天。此时藻种液的OD730nm≥3.0，将微藻种子液保存在光照培养箱中以待接种。
（2）集胞藻PCC6803:: Ω-PpetE-petH催化苯乙酮不对称还原生成手性苯乙醇
取在铜离子400nmol/L下培养到OD730 nm≥3.0时的藻液80ml，加入20μL底物苯乙酮进行光照恒温摇床培养催化反应，使用HZ200LB型恒温摇床，使光照强度为2000 Lux，温度为30 ℃，摇床转速为150 r/min，反应5天。反应完成后，取0.8 mL反应藻液、0.8 mL乙酸乙酯和0.4 μL内标物苯甲醛于2 mL 离心管中，充分摇匀振荡3 min，8000 r/min×10 min离心促进分层，取上清。萃取2 次，将两次萃取的上清液混合于2 mL离心管中，加无水硫酸钠干燥，置于4 ℃冰箱保存，待分析。
（3）产物分析
采用气相色谱（岛津GC-2010）对产物进行定性和定量分析。色谱柱为Rt-bDExm，长度为30m，内径为0.25mm，膜厚为0.25μm的毛细管手性柱，检测器为氢离子火焰检测器（FID）。色谱条件为：以N2为流动相，流速1.5 ml/min，分流比10:1，进样口温度为220℃，检测器温度为230 ℃；柱温采用程序升温，初温60℃，保留0min，进样体积1μl，以4.5℃/min升温至135℃，再保留0.3min。以苯甲醛为内标物的内标法定量计算底物、产物浓度。如图7所示，经400nmol/L的铜离子处理后的集胞藻PCC6803:: Ω-PpetE-petH相比集胞藻PCC6803催化苯乙酮不对称还原生产手性醇的产率得到了提高，对映体过量值接近99%，两者存在显著性差异。
【实施例5】铜离子诱导集胞藻PCC6803:: Ω-PpetE-petH催化乙酰乙酸乙酯不对称还原生成手性3-羟基丁酸乙酯
（1）藻种培养
将集胞藻PCC6803:: Ω-PpetE-petH在不含铜离子的培养基中传代培养，传两代后将藻体内的铜离子消耗干净后，分别在含有不同浓度铜离子的培养基中培养，采用GXZ型智能光照培养箱，使其培养条件为温度控制在28±2 ℃；全天光照，光照强度为2000Lux；向培养体系中连续通入空气和CO2的混合气体，CO2的比例为5%（v/v），通气速率为0.8 L/min；培养时间为6天。此时藻种液的OD730nm≥3.0，将微藻种子液保存在光照培养箱中以待接种。
（2）集胞藻PCC6803:: Ω-PpetE-petH催化乙酰乙酸乙酯不对称还原生成手性3-羟基丁酸乙酯
取在铜离子400nmol/L下培养到OD730 nm≥3.0时的藻液80ml，加入200μL底物乙酰乙酸乙酯进行光照恒温摇床培养催化反应，使用HZ200LB型恒温摇床，使光照强度为2000Lux，温度为30 ℃，摇床转速为150 r/min，反应3天。反应结束后，取0.8 mL反应藻液、0.8mL正己烷和1.9 μL内标物正辛醇于2 mL 离心管中，充分摇匀振荡3 min，8000 r/min×10min离心促进分层，取上清。萃取2 次，将两次萃取的上清液混合于2 mL离心管中，加无水硫酸钠干燥，置于4 ℃冰箱保存，待分析。
（3）产物分析
采用岛津GC-2010气相色谱仪对底物乙酰乙酸乙酯和产物3-羟基丁酸乙酯的浓度进行检测。由于该气相色谱检测法不能检测出产物的两种对映体，因此，采用Agilent 1100液相色谱仪对产物S-3羟基丁酸乙酯和R-3-羟基丁酸乙酯的浓度进行检测。
采用气相色谱（岛津GC-2010）对产物进行定性和定量分析。色谱柱为Rtx-WAX，长度为30m，内径为0.32mm，膜厚为0.25μm的毛细管手性柱，检测器为氢离子火焰检测器（FID）。色谱条件为：以N2为流动相，流速1.5 ml/min，分流比15:1，进样口温度为220℃，检测器温度为230 ℃；柱温采用程序升温，初温80℃，保留3min，进样体积1μl，以8℃/min升温至120℃，再保留4min。以正辛醇为内标物的内标法定量计算底物、产物浓度。
采用液相色谱检测产物对映体过量值。用不同浓度的外消旋3-羟基丁酸乙酯标准样品，分别进行液相色谱检测，然后绘制峰面积与标准样品浓度关系的标准曲线。检测条件为：使用chiralcel OD-H手性柱（大赛璐化学工业株式会社），以49/1的正己烷/异丙醇为流动相，流速1.5 mL/min，检测温度为30 ℃，检测波长为210 nm，手动进样20 μL。
图8所示，经400nmol/L的铜离子处理后的集胞藻PCC6803:: Ω-PpetE-petH相比集胞藻PCC6803催化乙酰乙酸乙酯不对称还原生成手性3-羟基丁酸乙酯的产率和和对映体过量值都得到了提高，两者存在显著性差异。
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<110> 武汉科技大学
<120> 一种促进细胞内辅酶NADPH再生的基因工程集胞藻及其应用
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1242
<212> DNA
<213> Synechocystis sp.
<400> 1
atgtacagtc ccggttacgt agcgacttca tcccgccaga gcgatgccgg taatcgttta 60
ttcgtttatg aggtaatcgg cctgagtcag agcaccatga ctgatggctt agactatccc 120
atccgccgta gtggcagcac gttcatcacc gtccccctaa agcggatgaa ccaagaaatg 180
cgacgcatta cccggatggg aggaaaaatt gtcagcatta agcctctaga gggagattcg 240
cctttacccc acaccgaggg cattgctaaa cccagtcaat ccgagggaag tggttcagaa 300
gcggtggcta atccagcccc tgaatctaac aaaaccatga caacaacccc caaagaaaaa 360
aaagctgacg atattcccgt caatatttat cgtcccaaaa ctccctacat cggcaaagtt 420
ttagaaaatt atcctttggt aagggaaggg gccattggca cagtacaaca cctcacgttt 480
gacctctccg ctggggatct ccgttaccta gaagggcaaa gtatcggtat cattcccccc 540
ggggaagatg ataagggcaa accccataag ttgcgcctgt attccattgc ttccaccaga 600
cacggtgatt ttggcgacga caaaaccgtt tccctctgtg tgcgccaatt ggaatatcaa 660
aacgaagccg gggaaaccgt acaaggggtc tgctccacct acctgtgcaa catcaaggaa 720
ggggacgaca ttgctattac tggccccgtt ggcaaggaaa tgctcttacc cccagacgaa 780
gatgccaaca ttgtgatgct ggccaccggc accggcattg cccccttccg ggccttcctg 840
tggcgtatgt tcaaggaaca acacgaagat tacaaattta aaggcctagc ttggctcatc 900
tttggcattc ccaaatcaga aaatattctc tataaagatg atttggaaaa aatggcagcg 960
gaatttcccg ataatttccg cttaacctat gccatcagcc gggagcaaca aaatgcggag 1020
ggcggccgga tgtatatcca gcaccgggtg gcggaaaatg ctgaagaact gtggaatttg 1080
atgcaaaacc ccaaaaccca cacttatatg tgtggtctca aaggcatgga acccggcatt 1140
gatgaagcgt tcactgccct agcggaacaa aatggcaagg agtggaccac tttccaacgg 1200
gaaatgaaaa aagagcaccg ctggcacgtg gaaacctact aa 1242
<210> 2
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
caagaagtat gtcaatcgtc gacatgtaca gtcccggtta cgtagc 46
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
agcttgcatg cctgcaggtc gacttagtag gtttccacgt gacagc 46
<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctttgatggt tatatgggaa ttcttagtag gtttccacgt gccag 45
<210> 5
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ggtgccatcc ataccgggaa ttcaggaaac agctatgacc atgattacg 49
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ccagtaaggt cacccatcgt 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ttccaggcca cattgttgtc 20

Claims (1)

1.一种基因工程集胞藻PCC6803:: Ω-PpetE-petH，即Synechocystis sp. PCC6803::Ω-PpetE-petH在催化前手性羰基化合物苯乙酮不对称还原合成手性醇苯乙醇中的应用，其特征在于，将集胞藻PCC6803:: Ω-PpetE-petH在不含铜离子的培养基中传代培养，传两代后将藻体内的铜离子消耗干净后，在含有400nmol/L铜离子的培养基中培养，采用GXZ型智能光照培养箱，使其培养条件为温度控制在28±2 ℃，全天光照，光照强度为2000Lux；向培养体系中连续通入空气和CO2的混合气体，CO2的比例为5%（v/v），通气速率为0.8 L/min；培养到藻种液的OD730nm≥3.0，将集胞藻种子液保存在光照培养箱中以待接种；取在铜离子400nmol/L下培养到OD730 nm≥3.0时的藻液，加入底物苯乙酮进行光照恒温摇床培养催化反应，使用HZ200LB型恒温摇床，使光照强度为2000 Lux，温度为30 ℃，摇床转速为150 r/min，反应完全后，获得含手性醇的混合液；
所述基因工程集胞藻PCC6803:: Ω-PpetE-petH的制备方法包括如下步骤：
（1）以集胞藻PCC6803的总DNA为模板，用petH 上游引物petH-3和下游引物petH-4通过PCR扩增得到如SEQ ID NO.1所示的petH 片段，上游引物petH-3和下游引物petH-4的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；
（2）通过petH上下游引物上的酶切位点Sal I和质粒pHB1524上的同源序列，利用同源重组的方法，将petH插入质粒pHB1524中，获得重组质粒pHB1524-petH；
（3）以重组质粒pHB1524-petH为模板，用Ω-PpetE-petH上游引物Pp-5和下游引物Pp-6通过PCR扩增得到Ω-PpetE-petH片段，上游引物Pp-5和下游引物Pp-6的核苷酸序列如SEQID NO.4和SEQ ID NO.5所示；
（4）通过Ω-PpetE-petH上下游引物上的酶切位点EcoR I和质粒pKW1188上的同源序列，利用同源重组的方法，将Ω-PpetE-petH插入质粒pKW1188中，获得重组质粒pKW- Ω-PpetE-petH；
（5）培养集胞藻PCC6803藻细胞生长至OD730=0.7-0.9，室温条件下，离心收集藻细胞并用新鲜的BG-11培养基重悬沉淀；
（6）取藻细胞与步骤（4）获得的重组质粒pKW- Ω-PpetE-petH混合，光照混合孵育12-20h；
（7）孵育后涂布到含有抗生素的BG-11平板上，光照通风培养诱导转化；
（8）以得到的表达藻株的DNA为模板，利用引物Ex1和Ex2进行PCR扩增鉴定，获得可强化调控petH的工程蓝藻：集胞藻PCC6803:: Ω-PpetE-petH，引物Ex1和Ex2的核苷酸序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；该菌株保藏号为CCTCC NO.M2016034。
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《蓝细菌Synechococcus sp.PCC 7002 petH 基因的高效表达及其产物的纯化》;李荣贵等;《植物学报》;19980930;第40卷(第9期);全文 *
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