BR112014010715B1 - Método para produção de n-butiraldeído - Google Patents

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Abstract

produção microbial de n-butiraldeído. a presente invenção refere-se a micro-organismos e os métodos de produção de n-butiraldeído com rendimentos incrementados em que um micro-organismo é projetado para realçar a conversão de uma fonte de carbono em n-butiraldeído. o n-butiraldeído é recuperado por um processo de separação de gás que ocorre durante o processo de conversão, propiciando um rendimento significativamente maior do produto do que a recuperação pós-fermentação do n-butiraldeído sozinho.

Description

[001] O presente pedido de patente reivindica a prioridade do pe dido de patente provisório U.S. do mesmo requerente que o presente com o número de série 61/555267, o qual foi depositado em 03 de novembro de 2011.
Campo da Invenção
[002] O campo da invenção é refere-se à produção de produtos químicos finos, e especialmente produção microbial de n-butiraldeído.
Antecedentes da Invenção
[003] Mais de 10 milhões de toneladas métricas de produtos oxo- químicos são consumidos anualmente para a síntese de uma ampla gama de produtos industriais e para o consumidor, incluindo plastifi- cantes, produtos anticongelantes, produtos para remoção do gelo de aeronaves e de pistas de pouso e decolagem, solventes, fluidos hidráulicos, tintas, lubrificantes, cosméticos, produtos químicos finos, e produtos farmacêuticos. Atualmente, a tecnologia dominante para a produção de produtos oxoquímicos C3-C15 é a hidroformilação, também conhecida como oxossíntese ou oxoprocesso. Esse processo químico catalítico envolve a adição de um grupo formila e um átomo de hidrogênio a um olefina (um hidrocarboneto com uma ligação carbono-carbono dupla) sob condições de temperatura e pressão elevadas. Os produtos oxoquímicos C4 derivados de propileno somam quase 73% do consumo mundial dos produtos oxoquímicos. A produção dos produtos oxoquímicos C4 requer o propileno como material de partida, o que torna o processo não sustentável. Os custos de energia substanciais para manter as condições de temperatura e pressão elevadas necessárias no processo de fabricação atual limitam a eficiência de energia total e desse modo é considerada como ambientalmente hostil.
[004] Portanto, novos métodos para a produção de produtos oxo- químicos C4 ao usar a conversão biológica de recursos renováveis tais como o açúcar e a celulose têm sido desenvolvidos e mais recentemente também preparados. Entre outras vantagens, deve ser observado que os substratos derivados de biomassa fixam o CO2 naturalmente, levando a um processo de produção de produto oxoquímico neutro de carbono.
[005] Uma outra abordagem para a obtenção de produtos oxo- químicos envolve a engenharia metabólica de micro-organismos para a obtenção de produtos químicos do interesse. Por exemplo, várias espécies de Clostridium (sem alteração genética) podem ser cultivadas para produzir 1-butanol. No entanto, todos ou quase todos esses processos conhecidos requerem a separação de 1-butanol e desse modo têm um elevado custo de recuperação. Cepas selecionadas de Clostridium foram projetadas metabolicamente para realçar a expressão de 1-butanol em relação a outros produtos, no entanto, a falta de ferramentas genéticas disponíveis para regular as vias metabólicas de Clostridium vem impedindo o progresso nessa avenida. Para burlar as dificuldades associadas com a engenharia metabólica de Clostridium, foram levadas em consideração várias espécies microbianas alternativas que são mais bem compreendidas e modificadas mais facilmente, incluindo Escherichia coli e Saccharomices cerevisiae, entre outras.
[006] Independente das dificuldades com Clostridium, Kouba et al. apresentaram no Pedido de Patente U.S. n°. 2012/0209021, aqui incorporado a título de referência em sua totalidade, um método de produção de n-butiraldeído ao usar bactérias solventogênicas recom- binante e micro-organismos recombinantes. Aqui, Kouba et al. descrevem um método de duas etapas que envolve Clostridium recombinante em que (1) a bactéria recombinante é cultivada e (2) o n-butiraldeído resultante é isolado do meio de cultura com a conclusão da fermenta- ção. Embora tal abordagem seja pelo menos conceptualmente desejável, vários inconvenientes, no entanto, continuam ocorrendo. Entre outras coisas, o rendimento de n-butiraldeído no sistema de Kouba é relativamente baixo.
[007] Desse modo, embora vários sistemas e métodos de produ ção de n-butiraldeído sejam conhecidos no estado da técnica, todos ou quase todos eles padecem de um ou mais inconvenientes. Consequentemente, ainda há uma necessidade quanto á provisão de sistemas e métodos aperfeiçoados para a produção microbial de n- butiraldeído.
Sumário da Invenção
[008] O objetivo da invenção refere-se a micro-organismos, mé todos e sistemas em que um micro-organismo é projetado geneticamente para produzir n-butiraldeído. Com mais preferência, tal produção é baseada no rendimento molar melhorado de acetil-CoA da conversão metabólica de vários sacarídeos, e especialmente a glicose. O acetil-CoA produzido dessa maneira é então condensado ao usar uma sequência de enzimas (de preferência recombinantes), e o produto da condensação é em seguida reduzido em etapas múltiplas em n- butiraldeído. É ainda mais preferível que uma ou mais desidrogenases microbiais de álcool sejam reduzidas ou eliminadas para impedir mais degradação de n-butiraldeído.
[009] Em outros aspectos particularmente preferidos, o n- butiraldeído produzido é removido por um processo de pulverização enquanto o micro-organismo é cultivado para obter (a) rendimentos cumulativos até então desconhecidos de n-butiraldeído, (b) um MCY50 de 24 horas ou menos, (c) uma concentração de n-butiraldeído dissolvido de 1,0 g/l ou menos, e/ou (d) um aumento líquido na densidade da célula em pelo menos 24 horas.
[0010] Em um aspecto especialmente preferido, um método de produção de n-butiraldeído inclui uma etapa de cultivo de um microorganismo (por exemplo, de preferência o gênero Escherichia (e em particular E. coli), Corynebacterium, Clostridium, Zymonomas, Salmonella, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Alcaligenes, Klesiella, Paenibacillus, Arthrobacter, Brevibacterium, Pichia, Candida, Hansenula, Synechococcus, Synechocystis, Anabae- na, Ralstonia, Lactococcus ou Saccharomyces) em um meio de cultura com uma fonte de carbono, em que o micro-organismo é projetado para expressar pelo menos um gene heterólogo e pela eliminação de pelo menos um gene nativo de modo a permitir a conversão da fonte de carbono em n-butiraldeído. Em uma outra etapa, o n-butiraldeído produzido é recuperado do meio de cultura por um processo de separação de gás até um rendimento cumulativo de n-butiraldeído de pelo menos 1,5 g/l, em que a etapa de recuperação é executada durante a etapa de cultivo.
[0011] Com mais preferência, o gene heterólogo é uma acetil-CoA acetil transferase, uma 3-hidroxiacil-CoA desidrogenase, uma crotonil- CoA hidratase, uma butiril-CoA desidrogenase, uma trans-enoil-CoA redutase e/ou uma butanal desidrogenase, ou o micro-organismo é modificado geneticamente para expressar um óperon artificial para permitir a expressão de atoB, crt, hbd e bldh. É ainda mais preferível de modo geral que o micro-organismo seja modificado geneticamente para ter reduzida ou abolida a expressão de ldhA, adhE, frdBC, pta e/ou iqhD.
[0012] Embora não fique limitador ao objeto da invenção, o pro cesso de separação de gás usa a pulverização com um gás separador a uma taxa de pulverização de pelo menos 1 volume do vaso por minuto, em que o tempo de cultura é de 24 horas ou menos. É ainda mais preferível que a etapa de recuperação seja executada a um rendimento cumulativo de 2,0 g/l ou antes de 40 horas do tempo de cultu- ra. Além disso, é contemplado que o n-butiraldeído pode ser reduzido em n-butanol na fase de vapor, ou que o n-butiraldeído seja condensado do gás separador e reduzido em n-butanol na fase líquida.
[0013] Visto de uma perspectiva, os autores da presente invenção também contemplam um método de produção de n-butiraldeído em que um micro-organismo é cultivado em um meio de cultura com uma fonte de carbono, em que o micro-organismo é projetado para expressar pelo menos um gene heterólogo e pela eliminação de pelo menos um gene nativo de modo a permitir a conversão da fonte de carbono em n-butiraldeído. Em uma outra etapa, o n-butiraldeído produzido é recuperado do meio de cultura por um processo de separação de gás que compreende uma etapa de pulverização sob condições eficazes para obter 50% de um rendimento cumulativo máximo (MCY50) em ou antes de 24 horas do tempo de cultivo, em que a etapa de recuperação é executada durante a etapa de cultivo. Com mais preferência, a etapa de cultivo é uma cultura descontínua por pelo menos 18 horas, e o MCY50 é recuperado em 20 horas ou menos (por exemplo, em que o MCY50 é de pelo menos 1 g/l).
[0014] Visto de uma outra perspectiva, os autores da presente in venção também contemplam um método de produção de n- butiraldeído em que um micro-organismo é cultivado em um meio de cultura com uma fonte de carbono, em que o micro-organismo é projetado para expressar pelo menos um gene heterólogo e pela eliminação de pelo menos um gene nativo de modo a permitir a conversão da fonte de carbono em n-butiraldeído. Em uma etapa adicional, o n- butiraldeído produzido é recuperado do meio de cultura por um processo de separação de gás (por exemplo, ao usar pulverização contínua) a uma taxa de pulverização eficaz para manter o n-butiraldeído dissolvido a uma concentração abaixo de uma concentração limite da viabilidade, em que a etapa de recuperação é executada durante a etapa de cultivo. Tal como antes, é preferível de modo geral que a pul-verização (contínua) seja a uma taxa de pulverização de pelo menos 1 volume do vaso por minuto, e/ou que a concentração dissolvida de n- butiraldeído seja mantida em ou abaixo de 1,0 g/l.
[0015] Portanto, os autores da presente invenção também con templam um método de produção de n-butiraldeído que inclui uma etapa de cultivo de um micro-organismo com uma fonte de carbono, em que o micro-organismo é projetado para expressar pelo menos um gene heterólogo e pela eliminação de pelo menos um gene nativo de modo a permitir a conversão da fonte de carbono em n-butiraldeído. Em uma etapa adicional, o n-butiraldeído produzido é recuperado do caldo de cultura por um processo de separação de gás a uma taxa de pulverização eficaz para impedir um declínio líquido da densidade da célula por até pelo menos 40 horas, em que a etapa de recuperação é executada durante a etapa de cultivo. Com mais preferência, a taxa de pulverização é eficaz para produzir um aumento líquido na densidade da célula por pelo menos 24 horas.
[0016] Vários objetivos, características, aspectos e vantagens do objeto da invenção tornar-se-ão mais aparentes a partir da descrição detalhada a seguir de modalidades preferidas, em conjunto com as figuras dos desenhos anexos em que os mesmos numerais representam os mesmos componentes.
Breve Descrição do Desenho
[0017] A Figura 1 é uma representação esquemática de uma via metabólica projetada exemplificadora para a conversão de glicose em n-butiraldeído.
[0018] A Figura 2A é um gráfico de barras exemplificador que ilus tra os resultados da produção de n-butiraldeído (g/l) a partir de glicose pela cepa EB10 metabolicamente projetada de E. coli versus a célula hospedeira EB11.
[0019] A Figura 2B é um gráfico de barras exemplificador que ilus tra os resultados da produção de n-butiraldeído (g/l) a partir de glicose pelas cepas EB11 metabolicamente projetadas de E. coli versus EB13.
[0020] As Figuras 3A-3C são gráficos de desempenho que mos tram a concentração de n-butiraldeído no fermentador (meio de cultura) versus o tempo e o rendimento cumulativo de n-butiraldeído (no gás de pulverização) (g/l) versus o tempo (horas) a taxas de pulverização de 0, 1 e 2 volumes do vaso por minuto (VVM).
[0021] A Figura 4 é um gráfico que ilustra a toxicidade de n- butiraldeído de acordo com uma modalidade do objeto da invenção, representada como unidades formadoras de colônia por microlitro versus o tempo (horas), a várias concentrações de n-butiraldeído.
[0022] A Figura 5 é uma representação da densidade de células OD600, representada como a absorbância de luz a 600 nanômetros, versus o tempo (horas) a taxas de pulverização de 0, 1 e 2 VVM.
Descrição Detalhada
[0023] Os autores da presente invenção descobriram agora que rendimentos incrementados de n-butiraldeído podem ser obtidos mediante a criação ou o cultivo de um micro-organismo projetado para produzir n-butiraldeído a partir de várias fontes de carbono enquanto o fermentador é pulverizado com gás (de preferência inerte) durante a reação de fermentação.
[0024] Deve ser apreciado que desta maneira o produto não vai poder acumular e coletado em seguida no final do processo. Ao invés disto, a pulverização durante a fermentação é usada para remover o n- butiraldeído, que pareceu aumentar inesperada a taxa de produção, prolongar a viabilidade e/ou a vida de produção dos micro-organismos projetados. Consequentemente, são obtidos rendimentos cumulativos significativamente mais elevados do que com a acumulação do produto no meio de fermentação. A pulverização durante a fermentação po- de ser contínua ou descontínua, a taxas variáveis ou constantes, em qualquer combinação razoável das mesmas.
[0025] Uma vez que removido do meio de fermentação, vários mé todos podem ser usados para recuperar o n-butiraldeído, incluindo a retenção na solução, a dissolução ou a adsorção em solvente, ou através da adsorção em um sorbente sólido. O produto recuperado dessa maneira pode então ser vendido como um produto ou ser convertido em um produto desejável através da oxidação, da redução ou da condensação.
[0026] Também deve ser apreciado que o micro-organismo proje tado pode ser obtido a partir de uma variedade de micro-organismos que são modificados para produzir o n-butiraldeído, incluindo várias bactérias, cianobactérias e fungos. Os micro-organismos projetados preferidos também foram modificados para inibir as reações a jusante ao usar o n-butiraldeído como um reagente, desse modo realçando ainda mais o rendimento do produto de n-butiraldeído. As fontes apropriadas de carbono incluem várias proteínas, carboidratos e lipídeos (todos puros ou misturas), e todas as suas misturas sintéticas ou artificiais (por exemplo, extratos de células, biomassa, biossólidos, etc.).
[0027] Em vista do acima exposto, e em um aspecto preferido do objeto da invenção, é contemplado de modo geral que um microorganismo recombinante, e especialmente E. coli, expressa um grupo de genes de modo a permitir a produção de n-butiraldeído. Mais tipicamente, a expressão recombinante inclui a expressão de pelo menos um gene que codifica um polipeptídeo que tem a atividade de acetil- CoA acetil transferase, a expressão de pelo menos um gene que codifica um polipeptídeo que tem a atividade da hidroxibutiril-CoA desidro- egenase, a expressão de pelo menos um gene que codifica um poli- peptídeo que tem a atividade da crotonil-CoA hidratase, a expressão de pelo menos um gene que codifica um polipeptídeo que tem a ativi- dade da trans-enoil-CoA redutase, e/ou a expressão de pelo menos um gene que codifica um polipeptídeo que tem a atividade da butanal desidrogenase. A Figura 1 ilustra uma via metabólica projetada exem- plificadora.
[0028] Consequentemente, deve ser apreciado que uma célula microbial projetada irá compreender qualquer combinação de enzimas nativas e heterólogas necessárias para produzir n-butiraldeído. Por exemplo, a célula pode compreender uma enzima nativa ou heteróloga de acetil-CoA acetil transferase, uma hidroxibutiril-CoA desidrogenase nativa ou heteróloga, uma crotonil-CoA hidratase nativa ou heteróloga, uma trans-enoil-CoA redutase nativa ou heteróloga, e/ou uma butiral- deído desidrogenase nativa ou heteróloga. Mais especificamente, a acetil-CoA acetil transferase pode ser qualquer enzima com a capacidade de catalisar a conversão de acetil-CoA em acetoacetil-CoA. Em algumas modalidades, a acetil-CoA acetil transferase tem um número de E.C. de 2.3.1.9. Um gene que codifica uma acetil-CoA acetil transferase exemplificadora é atoB de Escherichia coli (GenBank n°.: NP_416728.1, NC_000913.2). Do mesmo modo, a 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase pode ser qualquer enzima com a capacidade de catalisar a conversão de acetoacetil-CoA em 3-hidroxibutiril-CoA. Em algumas modalidades, a 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase tem um número de E.C. de 1.1.1.157. Uma 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase é hbd de Clostridium acetobutylicum (GenBank n°.: NP_349314.1, NC_003030.1). A crotonil-CoA hidratase pode ser qualquer enzima com a capacidade de catalisar a conversão de 3-hidroxibutiril-CoA em crotonil-CoA. Em algumas modalidades, a crotonil-CoA hidratase tem um número de E.C. de 4.2.1.55. Uma crotonil-CoA hidratase exemplifi- cadora é CRT de Clostridium acetobutylicum (GenBank n°.: NP_349318.1, NC_003030.1). A trans-enoil-CoA redutase pode ser qualquer enzima com a capacidade de catalisar a conversão do croto- nil-CoA em butiril-CoA. Em algumas modalidades, a trans-enoil-CoA redutase tem um número de E.C. de 1.3.1.38. Uma trans-enoil-CoA redutase exemplificadora é ter de Treponema denticola (GenBank n°.: NP_971211, NC_002967.9). A butanal desidrogenase pode ser qualquer enzima com a capacidade de catalisar a conversão de butiril em butiraldeído. Em algumas modalidades, a butanal desidrogenase tem um número de E.C. de 1.2.1.57. Uma butanal desidrogenase exempli- ficadora é NI-4 bldh de Clostridium saccharoperbutylacetonicum.
[0029] Em outras modalidades preferidas, deve ser apreciado que os genes que não participam diretamente da produção de n- butiraldeído podem ser expressos para aumentar a produção/titulação de n-butiraldeído de modo a obter um balanço favorável em uma rea- ção de equilíbrio. Por exemplo, a célula pode compreender um formia- to desidrogenase nativa ou heteróloga para prover uma força de impulsão metabólica para a via de produção para o n-butiraldeído. A produção e a perda subsequente de CO2 impedem a reação reversível. O formiato desidrogenase pode ser qualquer enzima com a capacidade de catalisar a conversão de formato em CO2. Em algumas modalidades, o formiato desidrogenase tem um número de E.C. de 1.2.1.2. Um gene que codifica um formiato desidrogenase exemplificadora é fdh de Candida boidinii (GenBank n°.: AF004096, AJ245934, AJ011046, DQ458777). Outras modificações e linhagens de células apropriadas são descritas nos documentos de patente WO 2012/125688A2, EP2084287B1, US20120064590A1, WO2012061653A2, US8188250B2, WO2012004460A2, WO2012061653A9, US20110281314A1 WO2012045022A2 WO2012099934A2 WO2012109176A2 e WO2012125688A2, que são aqui incorporados a título de referência.
[0030] Consequentemente, deve ser observado que a produção do álcool em células contempladas será reduzida de maneira significativa em comparação às células correspondentes não modificadas. De pre-ferência, a produção de álcool é reduzida em cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais de cerca de 95% em massa ou volume em comparação àquele produzido em uma célula de controle não modificada. Com mais preferência, a produção de álcool é reduzida em cerca de 99%, e com mais preferência as células hospedeiras recombinantes contempladas não produzem nenhum álcool detectável. Em uma modalidade, um ou mais genes de desidro- genase de álcool são eliminados ou então desabilitados. Com mais preferência, todos os genes de desidrogenase de álcool são eliminados ou então desabilitados.
[0031] Com respeito à célula hospedeira, deve ser apreciado que o organismo particular não é crítico ao objeto da invenção, uma vez tal micro-organismo tenha uma capacidade de modificação recombinante e produção de n-butiraldeído. Portanto, os organismos apropriados incluem várias bactérias, cianobactérias ou fungos. Por exemplo, o micro-organismo em algumas modalidades pode pertencer a um gênero selecionado do grupo que consiste em Escherichia, Bacillus, Coryne- bacterium, Alcaligenus, Zymomonas, Clostridium, Lactobacillus, Syne- chococcus, Synechocistis, Saccharomyces, Pichia, Candida, Hansenu- la e Aspergillus. Em modalidades particularmente preferidas, o micro-organismo é Escherichia coli, Bacillus subtilis, Synechococcus elonga- tus, Ralstonia eutropha, ou Saccharomyces cerevisiae.
[0032] O micro-organismo recombinante pode ser preparado ao usar qualquer método conhecido de um elemento versado na técnica, e deve ser compreendido que as modificações podem incluir a inserção ou a eliminação de um ou mais genes conforme for julgado necessário para aumentar ou diminuir a atividade de uma via enzimática particular. Em algumas modalidades, um micro-organismo mutante também pode ser usado nos métodos da presente invenção, e pode ser ainda modificado recombinante tal como desejado. Desse modo, as modificações apropriadas irão incluir a mutagênese aleatória para pro-duzir padrões de expressão deficiente, ácidos nucleicos extracromos- somais (tipicamente plasmídios ou fagemídios) com elementos de con-trole apropriados para produzir a superexpressão controlada de uma ou mais enzimas, inserções genômicas com elementos de controle apropriados para produzir a superexpressão controlada de uma ou mais enzimas, etc.
[0033] No que diz respeito à produção real de n-butiraldeído, con templa-se, portanto, que os métodos apropriados incluem a fermentação de um micro-organismo projetado tal como aqui descrito sob condições que permitem que o micro-organismo use uma fonte de carbono para produzir desse modo o n-butiraldeído. O n-butiraldeído produzido dessa maneira é recuperado contemporaneamente e purificado ao usar métodos de separação de gás bem conhecidos (por exemplo, a pulverização de um gás inerte através do meio de cultura), e em seguida purificados ao usar métodos bem conhecidos (por exemplo, a condensação). Mais tipicamente, a concentração [grama/litro] do n- butiraldeído produzido no micro-organismo é substancialmente maior do que a concentração [grama/litro] do álcool produzido no microorganismo. Por exemplo, a taxa entre a concentração de n-butiraldeído em comparação à concentração de álcool é de pelo menos 80:20. Com mais preferência, a taxa é de 90:10, 95:5 ou 99:1.
[0034] A fonte de carbono pode ser qualquer fonte adequada de carbono apropriada para o micro-organismo selecionado, tal como a glicose, a frutose, a sacarose, o amido, a celulose, hemiceluloses, o glicerol, o dióxido de carbono, proteínas e/ou aminoácidos. Qualquer combinação das fontes de carbono acima e/ou outras apropriadas também podem ser usadas. O elemento versado na técnica poderá selecionar de imediato a fonte apropriada de carbono com base no tipo de organismo microbial selecionado. No entanto, as fontes de carbono particularmente preferidas incluem aquelas que são de carbono neutro. Desse modo, e entre outras escolhas apropriadas, as fontes de carbono irão incluir vários hidrolisados (hemicelulósicos, proteináceos, etc.) e açúcares crus. Exemplos
[0035] O exemplo a seguir demonstra a produção de n- butiraldeído a partir de glicose por uma cepa projetada de E. coli que tem os genes ldhA, adhE, frdBC e iqhD removidos, mas que contém os genes atoB-hbd-crt-ter-bldh-fdh. A cepa hospedeira projetada dessa maneira para a produção de n-butiraldeído, a cepao EB10 de E. coli, é um derivado de E. coli BW25113 (rrnBT14 ΔlacZWJ16 hsdR514 Δa- raBADAH33 ΔrhaBADLD78) com F' transduzido de azul XL-1 para prover lacIq e knockouts de gene nos genes ldhA, adhE, frdBC e iqhD. A cepa foi ainda otimizada com uma eliminação adicional de pta em EB10, resultando EB12.
[0036] Desse modo, as cepas podem ser caracterizadas tal como segue: EB10: BW25113 com knock-outs em ldhA, adhE, frdBC e iqhD. EB11: BW25113 com knock-outs em: ldhA, adhE, frdBC e iqhD (pEB73, pIM8, pCS138). EB12: BW25113 com knock-outs em: ldhA, adhE, frdBC, iqhD e pta. EB13: BW25113 com knock-outs em: ldhA, adhE, frdBC, iqhD e pta (pEB73, pIM8, pCS138).
[0037] Para este exemplo particular, três plasmídios foram cons truídos e usados para a produção de n-butiraldeído. O primeiro plasm- pídio tem um óperon artificial construído para a superexpressão dos genes atoB-crt-hbd-bldh com a sequência do promotor ÀPL e do operador lac. O segundo plasmídio tem um gene ter com a sequência do promotor ÀPL e do operador lac. O terceiro plasmídio tem o gene fdh com a sequência do promotor ÀPL e do operador lac. As células EB10 e EB12 são transformadas de modo a conter todos os três plasmídios para formar EB11 e EB13, respectivamente. As cepas resultantes da produção de n-butiraldeído projetadas foram nomeadas como E.coli EB11 e EB13, respectivamente. As cepas EB10 e EB11 de E. coli foram pré-cultivadas em tubos de ensaio contendo 3 ml do meio LB a 37°C durante toda a noite em um agitador giratório (250 rpm) com am- picilina (100 μg/ml), canamicina (50 μg/ml), e cloramfenicol (25 μg/ml), onde necessário. As culturas noturnas foram diluídas 1:100 em 5 ml do meio fresco com os mesmos antibióticos. O meio fresco é caldo terrífico (TB) (12 g de triptona, 24g de extrato de levedura, 2,31 g de KH2PO4, 12.54 g de K2HPO4, 4 ml de glicerol por litro de água) suplementado com glicose a 2%. As células foram desenvolvidas a um OD600 de 0,4 a 0,6 e induzidas então com 0,1 mM de isopropil-β-D- tiogalactosídeo (IPTG) para mais 1 a 2 horas aerobicamente a 37°C durante toda a noite em um agitador giratório (250 rpm). As culturas foram transferidas dos tubos de ensaio para tubos lacrados Vacutainer de 10-ml BD. O oxigênio foi evacuado e substituído pelo gás N2. A fermentação foi então prosseguida durante toda a noite por 24 horas a 37°C em um agitador giratório (250 rpm).
[0038] Produção em biorreator de n-butiraldeído: A cepa EB12 foi usada na fermentação para a produção em biorreator de n- butiraldeído. A pré-cultura noturna foi inoculada em meio LB contendo os antibióticos apropriados e colocada para crescer a 37°C em um agitador giratório a 250 rpm. A fermentação do n-butiraldeído foi executada em um biorreator de tanque agitado de 5 litros (Eppendorf, Hauppauge, NY, USA), ao usar um volume de trabalho de 2,0 litros. O biorreator foi inoculado com 23 ml da pré-cultura noturna, e 0,1 mM de IPTG foi adicionado no momento da inoculação para induzir a expressão das enzimas envolvidas na via de produção de n-butiraldeído. O oxigênio dissolvido (DO) durante o estágio aeróbico foi mantido em 20% com respeito à saturação do ar pela elevação da velocidade do agitador (de 200 rpm para 500 rpm). As células foram desenvolvidas a 30°C sob condições aeróbica no modo descontínuo até que a densidade ótica atingiu cerca de OD600 = 0,8. A seguir, a agitação foi ajustada em 350 rpm e o vvm especificado (volume de gás por volume de líquido por minuto) do nitrogênio foi borbulhado através do biorreator com dois objetivos: (i) mudar para as condições anaeróbicas e (ii) realizar a separação de gás in situ do n-butiraldeído. Com a mudança anaeróbica, a alimentação linear intermitente da solução de glicose (500 g/litro) foi iniciada para manter uma concentração de glicose entre 10 e 20 g/l. O n-butiraldeído evaporado foi condensado ao usar um condensador Graham e então passado através de uma série de três captores cheios de água (4°C). O pH foi controlado em 6,8 todas as vezes pela adição automática de uma solução de NaOH 5M. Nos pontos especificados do tempo, as amostras da fermentação foram coletadas para determinar o crescimento das células, a produção de n- butiraldeído e a concentração de glicose, e a água nos captores foi substituída. Os compostos de álcool produzidos pelas cepas analisadas foram identificados por meio de GC-MS. O sistema incluiu um sistema de GC de rede modelo 6890N (Agilent Technologies), um injetor modelo 7883B e um autoamostrador (Agilent Technologies) e um detector seletivo de massa de rede modelo 5973 (Agilent Technologies). Uma coluna capilar DB-5ms (30 m, 0,25 mm de diâmetro interno, 0,25 μm de espessura de película; Agilent Technologies) foi usada, com o hélio (1 ml/min-1) como gás carreador. Uma temperatura do forno é programada de 75°C (2,6 min) para 200°C a 30°C/min-1. O injetor e o detector são mantidos a 250°C. Os compostos de álcool são isolados por meio de extração com solvente. 300 microlitros do sobrenadante do caldo de cultura são extraídos após a centrifugação com 150 μl de tolueno de grau padrão de GC (Fluka). Uma amostra de 1 μl é injetada no modo de injeção dividida com uma taxa de divisão de 30:1.
[0039] Os compostos de álcool produzidos foram quantificados por um cromatógrafo de gás equipado com um detector de ionização de chama. O sistema era um cromatógrafo de gás modelo 7890A (Agilent Technologies) e um autoamostrador modelo 7693 (Agilent Technologies). A separação dos compostos de álcool é realizada pela coluna capilar A DB-FFAP (30 m, 0,32 mm de diâmetro interno, 0,25 μm de espessura de película; Agilent Technologies). A temperatura do forno de GC foi inicialmente mantida a 85°C por 2 minutos e elevada com um gradiente de 45°C/min até 235°C e mantida por 3 minutos. O hélio foi usado como gás de carreador com (14 libras por polegada quadrada) de pressão de entrada. O injetor e o detector foram mantidos em 225°C. Uma amostra de 1 μl foi injetada a uma taxa de divisão de 25:1. O 1-pentanol é usado como padrão interno. Os resultados exem- plificadores que comparam EB10 com a cepa de produção EB11 são mostrados na figura 2A, e o efeito de uma mutação adicional de knockout em pta na cepa de produção EB13 (em relação à cepa de produção EB11) é mostrado na Figura 2B. Tal como é imediatamente aparente, o n-butiraldeído (227 mg/l) pode ser produzido a partir do caldo que contém a tensão projetada a partir da cepa EB11, mas não do caldo que contém apenas EB10. Além disso, é imediatamente aparente que os níveis de produção são aumentados inesperada e significativamente pela eliminação de pta (fosfotransacetilase ou fosfato acetil transferase).
[0040] As Figuras 3A-3C mostram a concentração de n- butiraldeído produzido no fermentador versus o tempo de cultura ao usar EB13 e o rendimento cumulativo de n-butiraldeído versus o tempo de cultura a taxas de pulverização de 0, 1 e 2 VVM. Com referência à Figura 3A, não há nenhum ocorrência de pulverização (0 VVM). A concentração de n-butiraldeído alcança um máximo de cerca de 0,200,25 g/l no fermentador depois de cerca de 20 horas, e então declina até atingir zero por cerca de 40 horas. Nas Figuras 3B-3C, as taxas de pulverização são de 1 e 2 VVM, respectivamente, e a concentração máxima de n-butiraldeído presente no fermentador é mais ou menos a mesma que sem nenhuma pulverização, isto é, cerca de 0,20-0,25 g/l ou antes de 20 horas. Os resultados descritos nos exemplos e mostrados na Figura 2 são consistentes com esta observação; 0,227 g/l de n- butiraldeído foi recuperado após 24 horas do tempo de cultura.
[0041] Com referência outra vez às Figuras 3B-3C, no entanto, o rendimento cumulativo de n-butiraldeído é aumentado de maneira sig-nificativa pela pulverização durante a fermentação. A uma taxa de pul-verização de 1 VVM, por exemplo, o rendimento cumulativo total é maior do que a concentração máxima aparente sem nenhuma pulverização. Neste exemplo, o produto é coletado com uma pulverização por cerca de 90 horas e o rendimento total é de cerca de 1,9 g/l. A uma taxa de pulverização de 2 VVM, o produto é coletado pela mesma quantidade de tempo, mas com um rendimento cumulativo máximo (MCY) de cerca de 2,25 g/l.
[0042] Essa concentração máxima aparente de 0,20-0,25 g/l no meio de fermentação é um tanto surpreendente. A solubilidade de n- butiraldeído na água é de cerca de 70 g/l, de modo que pode ser razo-avelmente esperado que o n-butiraldeído máximo no fermentador deva aumentar linearmente até um valor máximo substancialmente mais elevado. Também é surpreendente que, quando um gás inerte é pulve-rizado através do meio de cultura, quantidades significativas de n- butiraldeído são removidas apesar da sua alta solubilidade. Desse modo, um rendimento de massa elevada desejável pode ser obtido pela pulverização de modo apropriado. Com referência à Figura 3C em particular, deve ser apreciado que a metade do rendimento cumulativo máximo (MCY50) é adquirida em cerca de 20 horas, que é mais ou menos o mesmo tempo em que a concentração máxima de n- butiraldeído é alcançada no fermentador. Desse modo, a pulverização simultânea a 2 VVM resulta em cerca de cinco vezes o produto na mesma quantidade de tempo, e outras cinco vezes o produto coletado em cerca das 70 horas seguintes.
[0043] Retornando à Figura 4, o número de unidades formadoras de colônia por μl de E. coli projetado é mostrado como uma função do tempo depois da adição de várias concentrações de n-butiraldeído (NBAL) serem adicionadas (teste de incubação) em um tubo lacrado para impedir a evaporação de n-butiraldeído. Em todos os casos, incluindo o caso em que nenhuma adição é feita, o número de unidades formadoras de colônia tende para um valor mínimo (por exemplo, célula não mais viáveis) depois de cerca de 24 horas. Para uma concentração de 1,0 g/l, o gráfico mostra um aumento líquido nas unidades formadoras de colônia um pouco depois de 5 horas, mas concentrações de 1,2 g/l ou mais mostram uma diminuição líquida até mesmo a 4,5 horas. Esses dados sugerem que há uma concentração limite da viabilidade de n-butiraldeído em que há uma produção máxima de n- butiraldeído e um tempo de viabilidade máximo para as células. O rendimento realçado do n-butiraldeído obtido ao usar um método de pulverização concomitante de acordo com a presente invenção parece ser consistente com a análise da viabilidade.
[0044] A Figura 5 é uma representação da densidade de célula OD600, representada como absorbância a 600 nm, versus o tempo (horas) a taxas de pulverização de 0, 1 e 2 VVM. Em cada caso, os dados mostram um aumento na densidade de célula a 15 horas. Em 24 horas, no entanto, a pulverização da amostra a 0 VVM mostra uma diminuição marcante na densidade da célula, ao passo que as amostras a 1 e 2 VVM continuam a exibir aumentos na densidade da célula. A cerca de 40 horas, as amostras a 1 e 2 VVM continuam a exibir um aumento líquido, e depois de 89 horas a amostra a 1 VVM exibe um declínio líquido, mas a amostra a 2 VVM continua a exibir um aumento líquido.
[0045] Os dados da densidade da célula parecem ser consistentes com a análise da viabilidade e os dados do rendimento. Em particular, o MCY50 a 24 horas parece ser consistente com as célula viáveis que estão produzindo ativamente o n-butiraldeído a uma taxa máxima. Depois de 24 horas, a produção de n-butiraldeído continua a uma taxa reduzida até um rendimento máximo ser alcançado.
[0046] Claramente, a pulverização durante a produção do n- butiraldeído propicia rendimentos significativamente aumentados de n- butiraldeído. Sem quer ficar limitado a qualquer método ou mecanismo particular, os autores da presente invenção supõem que o produto de n-butiraldeído inibe a sua produção continuada acima de um rendimento mínimo. Esse rendimento mínimo, que é mais ou menos igual à concentração máxima de n-butiraldeído no sistema não pulverizado, é significativamente mais baixo do que o que se deve esperar ao levar em consideração a solubilidade do n-butiraldeído.
[0047] Com respeito à prevenção da inibição da produção de n- butiraldeído, várias abordagens são, portanto contempladas. Devido ao fato que os dados parecem mostrar que o MCY aumenta com as taxas aumentadas de pulverização, seria razoável concluir que as taxas de pulverização maiores do que 2 VVM devem produzir aumentos maiores no MCY. Desse modo, as taxas de pulverização de pelo menos 2,0 VVM, mais tipicamente de pelo menos 2,5 VVM, e ainda mais tipicamente de pelo menos 3,0 VVM são consideradas como apropriadas.
[0048] Uma outra abordagem consiste em reconhecer que se o produto de n-butiraldeído for dissolvido na fase líquida quando produzido, quando ocorre a pulverização, é a interface gás-líquido onde o produto pode ser removido. Se a razão de superfície gás-líquido dessa interface for aumentada, um aumento na quantidade de produto removida pode ser esperado. Um aumento na taxa de pulverização (e/ou configuração diferente do pulverizador) deve prover bolhas menores, o que deve aumentar a razão de superfície gás-líquido. Similarmente, o aumento da velocidade do impulsor deve romper as bolhas de gás, também produzindo uma razão de superfície gás-líquido aumentada. Qualquer combinação desses métodos deve produzir um aumento na quantidade do produto, na sua taxa de produção, ou ambas.
[0049] Além simplesmente da modificação do processo de pulveri zação, os dados sugerem outras soluções potenciais para aumentar o MCY de n-butiraldeído. No que diz respeito a micro-organismos tais como E. coli modificado, as variações na temperatura podem afetar as taxas de produção. A redução da temperatura no fermentador deve resultar muito provavelmente em um produto de gene mais recombi- nante, embora a uma taxa mais baixa. Presumivelmente, há uma taxa ideal de pulverização associada com uma determinada temperatura do fermentador para obter rendimentos máximos. Por outro lado, a tempe-ratura pode ser aumentada até níveis em ou perto do ponto de ebulição do n-butiraldeído e podem ser escolhidos micro-organismos meta- bolicamente projetados que devem crescer sob essas condições. Isto seria mais como uma reação de destilação em que o n-butiraldeído deve ser produzido em ou perto da fase de vapor e se retirar da solução. Isto também pode ajudar a manter uma concentração baixa do produto no fermentador, diminuindo os efeitos potenciais de toxicidade observados acima. Dependendo da temperatura do sistema, a pulverização a uma taxa apropriada também deve poder ajudar na remoção do produto.
[0050] A pressão de sistema pode ser variada, com um protocolo de pulverização apropriado. Por exemplo, a pressão no vaso pode ser diminuída, realçando a liberação de n-butiraldeído. A pressão do gás de pulverização também pode ser abaixada, ou então ser usado um processo intermitente de pulverização, ou uma combinação desses métodos para obter um MCY ideal.
[0051] Estes exemplos utilizaram um método de fermentação des contínuo. Também poderia ser previsto o uso de um método de fer-mentação contínuo ao invés disto, em que o líquido fresco (meio de cultura) é introduzido no reator à mesma razão em que o meio usado é extraído do fermentador, enquanto é pulverizado o reator. Neste exemplo, o meio usado contém o produto e células de microorganismos. O produto é coletado então do próprio fermentador, e o meio usado pode ser pulverizado outra vez para obter quaisquer quantidades residuais do produto. Consequentemente, as concentrações do produto podem ser mantidas no meio abaixo de uma concentração limite da viabilidade.
[0052] O próprio desenho do fermentador pode ser modificado pa ra prover a coleta do produto de uma maneira diferente. Por exemplo, um fermentador de película fina ou um fermentador de fibras ocas pode ser empregado, colocando o produto no meio, o qual pode então ser vaporizado para remover o produto. Alternativamente, os micro-organismos projetados podem ser imobilizados em um gel ou em um meio do tipo alginato (vide, por exemplo, o documento de patente WO2012/004460), e o meio de cultura pode ser continuamente passado transversalmente ou através do meio que contém os microorganismos e ser exposto ao gás de pulverização imediatamente em seguida. Isso deve minimizar a exposição dos micro-organismos projetados a concentrações aumentadas do produto, porque o produto deve continuar a fluir depois dos micro-organismos com o meio de cultura e ser removido praticamente de imediato. Alternativamente, a fase líquida que contém o produto pode ser colocada em um outro recipiente que estiver sendo submetido ao processo de pulverização enquanto a fermentação progride.
[0053] Além disso, é contemplado que os próprios meios de cultu ra podem ser aumentados com um componente que adsorve o n- butiraldeído, tais como crivos moleculares, ou um fluido divisor imiscí- vel em água que de preferência dissolve o n-butiraldeído. Estes devem ter o efeito de remover o n-butiraldeído dos micro-organismos, de acordo com o conceito de que a remoção do n-butiraldeído do meio de cultura deve aumentar o seu MCY.
[0054] Deve ser aparente aos elementos versados na técnica que muito mais modificações além daquelas já descritas são possíveis sem que se desvie dos conceitos da presente invenção. O objeto da invenção, portanto, não deve ser restringido exceto quanto ao caráter das reivindicações anexas. Além disso, na interpretação de ambos o relatório descritivo e das reivindicações, todos os termos devem ser interpretados na mais ampla maneira possível consistente com o contexto. Em particular, os termos "compreende" e "que compreende" devem ser interpretado como se referindo a elementos, componentes ou etapas de uma maneira não exclusiva, indicando que os elementos, os componentes ou as etapas mencionados podem estar presentes, ou ser utilizados ou combinados com outras elementos, componentes ou etapas que não são expressamente mencionados. Onde as reivindicações do relatório descritivo se referem a pelo menos um de alguma coisa selecionada do grupo que consiste em A, B, C... e N, o texto deve ser interpretado como requerendo somente um elemento do grupo, não A mais N, ou B mais N, etc.

Claims (16)

1. Método para produção de n-butiraldeído, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) o cultivo de um microrganismo projetado em um meio de cultura com uma fonte de carbono, em que o microrganismo projetado expressa pelo menos um gene heterólogo para permitir a conversão no microrganismo projetado de acetil-CoA em acetoacetil-CoA, aceto- acetil-CoA em 3-hidroxibutiril-CoA, 3-hidroxibutiril-CoA em crotonil- CoA, crotonil-CoA em butiril-CoA e butiril-CoA em n-butiraldeído, e o microrganismo projetado é projetado ainda para a deleção de um gene que codifica butanol desidrogenase e pelo menos um outro gene nativo que codifica álcool desidrogenase nativo para permitir uma conversão aumentada da fonte de carbono em n-butiraldeído; (b) a recuperação do n-butiraldeído produzido do meio de cultura por um processo de separação de gás que mantém concentra-ções dissolvidas de n-butiraldeído em ou abaixo de 1,0 g/L para obter um rendimento cumulativo de n-butiraldeído de pelo menos 1,5 g/L; em que a etapa de recuperação é executada durante a etapa de cultivo em que a densidade celular aumenta enquanto o microrganismo produz n-butiraldeído; e (c) a redução do n-butiraldeído em n-butanol na fase de va-por; ou (d) a condensação do n-butiraldeído e a redução do n- butiraldeído em n-butanol na fase líquida; em que pelo menos um gene heterólogo é selecionado a partir do grupo que consiste em um gene que codifica uma acetil-CoA acetiltransferase, uma 3-hidroxiacil-CoA desidrogenase, uma crotonil- CoA hidratase, uma butiril-CoA desidrogenase, uma trans-enoil-CoA redutase e uma butanal desidrogenase; e em que o microrganismo pertence a um gênero selecionado a partir do grupo que consiste em Escherichia, Corynebacterium, Clos-tridium, Zymonomas, Salmonella, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Alcaligenes, Klesiella, Paenibacillus, Arthrobacter, Brevibacterium, Pichia, Candida, Hansenula, Synecho- coccus, Synechocystis, Anabaena, Ralstonia, Lactococcus e Saccha- romyces.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o microrganismo é Escherichia coli e o microrganismo é modificado geneticamente para expressar um óperon artificial para permitir a expressão de atoB, crt, hbd e bldh.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o microrganismo é Escherichia coli e o microrganismo é modificado geneticamente para ter abolida a expressão de pelo menos um gene selecionado dentre o grupo que consiste em ldhA, adhE, frdBC, pta e iqhD.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o processo de separação de gás compreende a pul-verização com um gás separador a uma taxa de pulverização de pelo menos 1 volume do vaso por minuto, e em que o tempo de cultura é de 24 horas ou menos.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de recuperação é executada a um rendimento cumulativo de 2,0 g/l ou antes de 40 horas do tempo de cultura.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o microrganismo é Escherichia coli.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o n-butiraldeído é reduzido em n-butanol na fase de vapor.
8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o n-butiraldeído é condensado e reduzido em n- butanol na fase líquida.
9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o processo de separação de gás compreende ainda uma etapa de pulverização sob condições eficazes para fornecer 50% de um rendimento cumulativo máximo (MCY50) em ou antes do tempo de cultura de 24 horas.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a etapa de cultivo compreende o cultivo em uma cultura descontínua por pelo menos 18 horas.
11. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o MCY50 é recuperado em 20 horas ou menos.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o MCY50 é de pelo menos 1 g/l.
13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o processo de separação de gás usa a pulverização contínua.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a pulverização contínua é a uma taxa de pulverização de pelo menos 1 volume do vaso por minuto.
15. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o processo de separação de gás mantém as concen-trações de n-butiraldeído dissolvido em ou abaixo de 1,0 g/L para evitar um declínio líquido da densidade celular por até pelo menos 40 horas.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a taxa de pulverização é eficaz para produzir um aumento líquido na densidade da célula por pelo menos 24 horas.
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