CN107002012B - 多阶段生物反应器方法 - Google Patents
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Abstract
本发明描述了用于将C1碳源转化成所期望的终产物的多阶段生物学方法和系统。所述方法包括将气态含C1基质并行地在多个生物反应器阶段之间分配。将液体产物连续地从第一生物反应器阶段依次供给到下游生物反应器阶段。可以通过避免在每一个阶段分离微生物和再循环的要求来简化操作。此外,所述组合阶段的总体气液质量传递是非常有利的,从而产生高的终产物生产率,而有比较低的副产物代谢产物生产率。
Description
技术领域
本发明的方面涉及利用多个生物反应器阶段将含C1基质进行微生物发酵成终产物的方法。在代表性的方法中,将所述含C1基质并行地在所述阶段之间分配以进行气相处理,而将液体产物连续地从一个阶段通到下一个连续阶段以进行液相处理。
背景技术
对化石燃料温室气体(GHG)排放的环境关注已经引起对可再生能源的日益重视。因此,乙醇正迅速成为全世界主要的富氢液体运输燃料。基于在欧洲、日本、和美国以及几个发展中国家中对乙醇生产的重视增加,在可预见的未来,预期燃料乙醇行业的全球市场持续增长。举例来说,在美国,使用乙醇生产E10,即10%乙醇在汽油中的混合物。在E10共混物中,乙醇组分充当补氧剂,从而提高燃烧效率并且减少空气污染物的产生。在巴西,乙醇作为在汽油中共混的补氧剂以及其本身作为纯燃料满足了约30%的运输燃料需求。此外,欧盟(European Union,EU)已经为它的成员国中的每一个规定了消费诸如生物质衍生的乙醇之类的可持续运输燃料的目标。
绝大多数的燃料乙醇是经由传统的基于酵母的发酵工艺生产的,这些发酵工艺使用作物衍生的碳水化合物,如从甘蔗提取的蔗糖或从粮食作物提取的淀粉,作为主要的碳源。然而,这些碳水化合物原料的成本会受到它们的竞争用途(即作为人类和动物这两者的食物来源)在市场中的价值的影响。此外,用于生产乙醇的产生淀粉或蔗糖的作物的种植并非在所有地区均是经济上可持续的,这是因为这会随着当地土地价值和气候这两者而变化。出于这些原因,特别关注的是,开发使更低成本和/或更丰富的碳资源转化成燃料乙醇的技术。在这方面,一氧化碳(CO)是诸如煤、石油以及石油衍生产品之类的有机材料不完全燃烧的主要富含能量的副产物。富含CO的废气由多种工业过程产生。举例来说,据报道,澳大利亚的钢铁工业每年产生并且向大气中释放超过500,000公吨的CO。
最近,用于在工业规模上由CO生产乙醇的基于微生物(细菌)的工艺替代方案已经成为商业利益和投资的主题。微生物培养物能够在CO是唯一碳源的情况下生长的能力最初是在1903年被发现的。这一特征随后被确定为在于生物体对自养生长的乙酰辅酶A(乙酰CoA)生化途径(也被称为伍兹-扬达尔途径(Woods-Ljungdahl pathway)和一氧化碳脱氢酶/乙酰辅酶A合酶(CODH/ACS)途径)的使用。包括一氧化碳营养型生物体、光合生物体、产甲烷型生物体以及产乙酸型生物体在内的很多厌氧生物体从此被证实代谢CO。已知厌氧细菌,如来自梭菌属(Clostridium)的那些厌氧细菌经由乙酰辅酶A生化途径由CO、CO2以及H2产生乙醇。举例来说,由气体产生乙醇的扬氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)的各种菌株描述于WO 00/68407;EP 1117309A1;US 5,173,429;US 5,593,886;US 6,368,819;WO 98/00558;以及WO 02/08438中。细菌自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)菌种也已知可由气体产生乙醇(Abrini等,ARCHIVES OF MICROBIOLOGY 161:345-351(1994))。
由于生物体的每一种酶以基本上完全的选择性促进它的指定生物转化,因此与常规的催化途径相比,微生物合成途径可以用更低的能量成本实现更高的收率。举例来说,可以减少将由非选择性副反应产生的副产物与所期望的产物分离的能量需求。此外,减少对由于反应介质中的杂质所造成的催化剂中毒的担忧。然而,尽管有这些明显的优势,但是本领域必须解决目前与从CO进行的乙醇的微生物合成相关的某些挑战,特别是在确保生产速率可与其它技术竞争的方面。当使用CO作为它们的碳源时,上文所述的厌氧细菌通过发酵产生乙醇,但是它们还产生至少一种代谢产物,例如CO2、甲烷、正丁醇、和/或乙酸。这些代谢产物中的任一种的形成有可能显著影响给定工艺的生产率和整体经济可行性,这是因为可用碳损失到一种或多种代谢产物中并且所期望的终产物的生产效率受损。此外,除非代谢产物(例如乙酸)本身在微生物发酵过程的时间和地点具有价值,否则它可能引起废物处理问题。用于解决在制备乙醇的含有CO的气体的厌氧发酵中除所期望的终产物以外的产物的形成的各种提案论述于WO2007/117157、WO2008/115080以及WO2009/022925中。
乙醇生产速率是关于给定发酵工艺是否在经济上具有吸引力的关键决定因素,它高度取决于对细菌生长的适当条件进行管理。举例来说,从WO2010/093262已知的是,含CO基质必须以引起最佳的微生物生长和/或所期望的代谢产物产生的速率向微生物培养物提供。如果提供不足的基质,那么微生物生长减慢并且发酵产物收率以乙醇作为代价朝向乙酸偏移。如果提供过量的基质,那么可能导致不佳的微生物生长和/或细胞死亡。关于这些工艺中操作参数之间的关系的更多信息见于WO2011/002318中。
用于从CO,并且特别是含有CO的废物流,如钢铁生产中排放的气态排放物生产乙醇的生物学方法的技术正不断寻求改进过程经济学并且因此提高行业竞争力的解决方案。根据常规做法,用于实现所期望的转化的微生物的分离和再循环被认为对在连续过程中实现可接受的生产率来说是必要的。已知在生物反应器内部或外部的合适的膜分离系统有效用于这一目的。然而,膜和它们相关的外壳、阀门、仪器、以及控制显著增加了总体资金和操作成本。更换膜和“就地清洗”(CIP)选择方案(无论是手动还是自动)一般需要大量的操作时间、化学品、以及加热(在手动操作的情况下)或非常高的资金成本(在自动操作的情况下)。举例来说,一些生物反应器系统需要昂贵的酶溶液来清洗细胞再循环膜,这是因为在实践中已经发现使用苛性碱(NaOH)溶液进行简单的清洗是无效的。
总体而言,生物CO转化工艺中的重要考虑因素涉及发现提高操作灵活性、提高乙醇生产率和产品质量和/或更高效利用CO的改进方案。在这些领域中的任一个中实现即使是不太大的进步而基本上不影响资金和操作费用就能够对工业规模的操作具有显著的意义。
发明内容
本发明的方面涉及用于产生诸如乙醇的有用的终产物的生物学方法和相关系统的改进,所述终产物是经由利用来自诸如工业废气的含C1基质的C1碳源作为营养物质的C1固定微生物的代谢途径产生的。代表性的方法和系统涉及使用互连生物反应器的多个阶段的替代类型的操作,并且特别是如下的操作,其中有可能规避分离一氧化碳营养型微生物以再循环到在整个过程中使用的阶段中的至少一个(例如所述阶段中的至少一个生物反应器),一般大多数阶段(例如除第一阶段和/或最后一个阶段或最终阶段之外的所有阶段),并且常常是所有阶段的费用和复杂性。惊人的是,使用这样的系统,并且特别是其中将含C1基质并行地供给到多个生物反应器中,而连续地供给液体产物的系统已经被证实会产生高的总体乙醇生产率,而诸如乙酸的不期望的代谢产物的生产率相应较低。还实现了其它优势,包括高效的总体C1碳源利用以及提高的工艺灵活性和控制。
本发明的实施方案涉及用于将C1碳源转化成终产物的多阶段方法。代表性的方法包括将气态含C1基质并行地供给到所述方法的第一生物反应器阶段和至少第二生物反应器阶段中,这是例如通过将所述含C1基质在所述生物反应器阶段之间分配来实现的,以使得在每一个阶段接收的气体组成是相同的或基本上相同的并且代表所述被输入到所述方法中的含C1基质的气体组成。这样的方法还包括将第一阶段液体产物的至少一部分连续地从所述第一生物反应器阶段供给到所述第二生物反应器阶段中。以这种方式,所述在每一个阶段接收的液体产物或至少其不含生物质的液体级分(例如不含C1固定微生物的液体发酵液的级分)的组成可以代表从先前的上游阶段所接收的输出物。因此,不同于气体组成,所述在每一个阶段所接收的液体产物的组成一般不相同并且实际上可以在所期望的终产物和其它代谢产物的浓度方面有显著差异。举例来说,所期望的终产物的浓度可以沿从上游阶段到连续的下游阶段的方向在至少一些阶段,并且优选地所有阶段上逐渐增加。可替代地或组合地,其它代谢产物可以在这些阶段中的一些或全部上逐渐减少。本发明的实施方案涉及用于将来自含C1基质的C1碳源转化成所期望的终产物的多阶段方法,其中所述多阶段方法提高了所述系统对所述所期望的终产物的特异性。
此外,根据如上文所述的代表性方法,在所述生物反应器阶段中的至少一个中有利地避免了C1固定微生物的分离和再循环。这与常规的连续“恒化器”生物学方法直接形成对比,所述生物学方法被理解为需要细胞再循环以获得可接受的生产率水平。因此,被供给到至少一个阶段的液体产物(例如被供给到第二阶段的第一阶段液体产物)可以包含在先前(例如第一)上游生物反应器阶段中使用的并且例如在这一上游阶段中没有被分离或过滤的C1固定微生物。该液体产物一般还包含从所述先前上游阶段接收的培养基、所期望的终产物、以及其它代谢产物。因此,根据优选的实施方案,将至少一个生物反应器阶段的液体产物(例如第一阶段液体产物)供给到后续阶段而没有涉及以下各项的附加费用和复杂性:(1)分离C1固定微生物(例如使用膜分离),继而(2)将所述分离的微生物再循环到它被抽出的同一个阶段。在优选的实施方案中,执行方法而不进行任何将C1固定微生物从所述生物反应器阶段中的任一个中分离和/或再循环到所述生物反应器阶段中的任一个,尽管通常以这种方式分离从最终阶段中抽出的液体产物来回收不含细胞的液体中的一种或多种最终产物。因此,根据一些实施方案,可以将C1固定微生物和/或细胞培养基从最终阶段液体产物中分离并且返回到所述方法(例如所述生物反应器阶段中的一个或多个)中。
本发明的其它实施方案涉及多阶段系统,所述多阶段系统包括多个生物反应器。所述生物反应器包括第一端处的气体入口和与所述第一端相对的第二端处的气体出口,以使得所述气体入口和气体出口允许并行地将气态含C1基质供给到所述多个生物反应器中以及去除包括未转化的C1碳源的气态产物。不包括第一生物反应器和最终生物反应器(即,不是最上游的生物反应器,这是因为它不被供给来自另一个生物反应器的液体产物;或最下游的生物反应器,这是因为从这个生物反应器抽出的液体产物不被供给到另一个生物反应器)的生物反应器包括单独的液体入口和液体出口,以用于连续地从相邻的上游生物反应器接收包括C1固定微生物(生物质)的液体产物以及将包括C1固定微生物(细胞或生物质)的液体产物输送到相邻的下游生物反应器。
一般来说,液体入口和液体出口这两者都靠近第一端(即接收气态含C1基质的末端),以使得液体产物可以被供给到生物反应器的底部附近并且从生物反应器的底部附近抽出,例如反应器长度的底部25%内、或底部10%内。用于从最终生物反应器接收最终液体产物的液体产物出口同样靠近最终生物反应器的第一端。在限定各种特征相对于“反应器长度”的位置时,这一长度指的是容纳反应器内容物(反应物和反应产物的混合物)的区段的长度,该区段通常被认为是“反应器容积”或“反应器工作容积”并且这一长度不包括可以延伸到反应器容积上方或下方的工艺管线(例如进料入口管线或产物出口管线)或容纳反应器,但是不容纳任何反应器内容物的塔或其它容器的区段。举例来说,在圆柱形反应器的情况下,反应器长度指的是圆柱形的轴线的长度。反应器长度的“底部10%”指的是高度的范围,所述范围从反应器的底部开始并且向上延伸反应器长度的10%。反应器长度的“顶部10%”指的是高度的范围,所述范围从反应器的顶部开始并且向下延伸反应器长度的10%。同样,反应器长度的“底部1%-10%”指的是高度的范围,所述范围从比反应器的底部高了反应器长度的1%的高度开始并且向上延伸到比反应器的底部高了反应器长度的10%的高度。反应器长度的“顶部25%-45%”指的是高度的范围,所述范围从比反应器的顶部低了反应器长度的25%的高度开始并且向下延伸到比反应器的顶部低了反应器长度的45%的高度。
本发明的另外的实施方案涉及用于将C1转化成所期望的终产物的多阶段生物学方法。所述方法包括(i)将气态含C1基质并行地在所述多阶段方法的多个生物反应器阶段之间分配;以及(ii)将包含C1固定微生物的液体产物连续地从第一生物反应器阶段依次供给到下游生物反应器阶段。在最终阶段中,从最终生物反应器阶段抽出最终阶段液体产物。在某些实施方案中,从不含生物质的液体级分(例如不含C1固定微生物/生物质的液体级分)抽出最终阶段液体产物。
在具体实施方案中,本发明涉及一种用于将一氧化碳(CO)转化成乙醇的多阶段生物学方法。所述方法包括(i)将含CO基质并行地在所述多阶段方法的多个阶段之间分配;(ii)将包含一氧化碳营养型微生物的液体产物连续地从第一生物反应器阶段依次供给到下游生物反应器阶段。从最终生物反应器阶段抽出的最终阶段液体产物可以包含至少约50克/升(g/l)的乙醇并且具有至少约50:1的乙醇:乙酸重量比。在某些实施方案中,从不含生物质的液体级分中抽出最终阶段液体产物。具体方法可以包括至少四个生物反应器阶段。与这种并行气体/连续液体操作方式相关的这些代表性方法可以有利地实现高水平的生产率而有最低限度的副产物形成。在其它实施方案中,本发明涉及一种用于将一氧化碳转化成2,3-丁二醇的多阶段生物学方法,该方法具有降低的乙醇生产率。在某些实施方案中,所述一氧化碳营养型微生物选自由以下各项组成的组:自产乙醇梭菌、拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)以及扬氏梭菌。
在替代性实施方案中,本发明涉及一种用于将一氧化碳(CO)转化成生长依赖性终产物(例如异丙醇)的多阶段生物学方法。所述方法包括(i)将含CO基质并行地在所述多阶段方法的多个阶段之间分配;(ii)将包含一氧化碳营养型微生物的液体产物连续地从第一生物反应器阶段依次供给到下游生物反应器阶段。从最终生物反应器阶段抽出的最终阶段液体产物或至少其不含生物质的液体级分可以包含至少约10g/l的异丙醇。在某些实施方案中,异丙醇生产方法中所用的一氧化碳营养型微生物是重组自产乙醇梭菌菌株,所述菌株具有异丙醇生物合成途径中的至少一种异源酶。与传统的双反应器发酵系统相比,使用本发明的多阶段方法提供了用于提高生长依赖性终产物的生产率的方法。根据本发明的一个实施方案,生长依赖性终产物选自由以下各项组成的组:异丙醇、丁醇、丙酮、2-羟基丁酸(2-HIBA)、以及异丁烯。
总体而言,如下文所更详细论述,如本文所述的多阶段生物学方法可以提高生物转化操作的稳定性并且提供更大的灵活性以针对具体目标调控在每一个阶段所实现的性能(例如终产物和其它代谢产物的滴度)。即使相对于常规方法,在反应器容积基础上生产率较低,相对更简单的构造和控制系统也可以从经济角度,经由在商业规模上实现的资金成本和/或操作成本降低来有效地弥补这一点。此外,在“每个反应器”基础上生产率的降低允许在生物反应器尺寸方面的灵活性提高,以使得可以使用相对更短和更宽的容器,所述容器具有与可用储罐的尺寸更一致的尺寸。举例来说,一个或多个阶段(例如第一生物反应器阶段和第二生物反应器阶段中的至少一个、至少四个生物反应器阶段、或所有生物反应器阶段)的生物反应器可以具有小于约15:1(例如约2:1至约15:1),如小于约10:1(例如约5:1至约10:1)的长度与宽度(例如直径)的比率。允许生产率降低进而容许在如本文所述的方法/系统中使用更低的压力。举例来说,一个或多个阶段(例如第一生物反应器阶段和第二生物反应器阶段中的至少一个、至少四个生物反应器阶段、或所有生物反应器阶段)的生物反应器可以在小于约500千帕(kPa)表压(即高于大气压),如小于约200kPa表压或甚至小于约100kPa表压的压力操作。对于给定的质量传递系数,如本文所述的多阶段方法和系统还可以相对于这些常规方法有利地实现更大的气体利用率。
在多阶段方法中,本文所述的生物反应器阶段或其某一部分可以是单个容器内分开的区段。举例来说,这样的容器(它可以是具有50,000升-3,000,000升的容积的工业标准罐)可以包括内部结构,所述内部结构将单个生物反应器阶段分开并且引导如本文所述的蒸气流和液体流。举例来说,所述内部结构可以被配置成使气体和液体分别并行地和连续地流过所述阶段。使用容器内的生物反应器阶段可以促进本文所述的某些操作实施方案,例如使用离开生物反应器阶段的包括未转化的C1碳源的共用气态产物流进行的操作。根据一个实施方案,容器内的生物反应器阶段可以按堆叠关系定向,其中第一生物反应器阶段在高程上是最高的并且最终生物反应器阶段在高程上是最低的,从而利用重力来帮助液体产物转移通过所述阶段。在单个容器内可以包括生物反应器的全部连接的生物反应器阶段在数量上可以在一定范围内,并且在示例性实施方案中,容器可以包括约4个至约12个生物反应器阶段。内部结构可以包括本文参考图1和图2所述的相关管道和/或其它设备(例如气体入口和液体入口以及它们的连接部、蒸气和液体分配器、提升管、下降管、外部液体再循环回路、液体培养基和其它添加剂的入口等)。这样的内部结构因此可以提供所述阶段之间的总体流体连通以实现所期望的流动配置,包括所引起的内部循环和/或使用再循环回路的外部循环,如下文更详细描述的那样,从而形成实现高度质量传递和以所设计的气体流速混合所需的流体动力学条件。这样的容器可以配有在整个容器外部的另外的液体循环回路,例如以用于不一定相邻(即彼此紧邻的上游或下游)的生物反应器阶段之间的液体循环。在一些实施方案中,给定生物转化方法所需的生物反应器阶段的总数可以超过容器内阶段的数目,以使得所述方法可以利用两个或更多个容器,其中一个或这两者容纳多个(例如两个或更多个)生物反应器阶段。
使用如本文所述的多阶段生物学方法提供了对发酵参数和过程控制的更大控制。所述多阶段方法的阶段中的每一个可以在不同的工艺条件下操作以提供所期望的最终结果。举例来说,某些阶段可以被操作以促进生长,并且其它阶段可以针对生产率来优化。使用多阶段生物学方法可以产生更好的产物滴度、对所期望的终产物的更大的特异性、提高的气体吸收、以及对具有各种组成的含C1基质的更大的灵活性。
根据以下具体实施方式,与本发明有关的这些和其它实施方案、方面、以及优势是显而易见的。
附图说明
对本发明的示例性实施方案和其优势的更完全的了解可以通过在考虑到附图的情况下参考以下说明来获得,其中相似的特征由相似的附图标记来标识(例如图1的生物反应器100a和图2的生物反应器100)。
图1描绘了利用至少两个上游生物反应器和两个下游生物反应器的代表性方法,其中为了简单起见,省略了相似的居间生物反应器。
图2描绘了如图1中所示的代表性生物反应器的特写视图,并且提供了与内部结构和液体循环有关的另外的细节。
图3是示出了在40+天的操作期间,利用六个生物反应器阶段的本文所述的生物学方法的最终液体产物的所取样品中,乙醇和一氧化碳营养型微生物以及副产物代谢产物乙酸和2,3-丁二醇的浓度的图表。
图4是在40+天的操作期的第23天,在来自六个生物反应器阶段中的每一个的液体产物的所取样品中,乙醇以及副产物代谢产物乙酸和2,3-丁二醇的测量浓度的图表,其中最终液体产物浓度描绘于图3中。
图5A是示出了异丙醇发酵的代谢产物谱的图表。
图5B是示出了异丙醇生产速率的图表。
图1-5应当被理解成呈现了本公开和/或所涉及的原理的图示。为了便于说明和理解,简化的工艺流程方案和设备描绘于图1和图2中,并且这些图不一定按比例绘制。对于理解本公开来说并非必要的包括阀门、仪器、以及其它设备和系统在内的细节没有被示出。如对于了解本公开的本领域技术人员来说显而易见的那样,根据本发明的其它实施方案的用于含C1基质的生物转化的方法将具有如下的配置和部件,所述配置和部件是部分地由它们的具体用途来确定的。
具体实施方式
本发明涉及用于产生所期望的终产物的方法,所述方法是通过将气态含C1基质中的C1碳源并行地供给到多个生物反应器阶段中来实现的,所述生物反应器阶段进而被用于连续地处理这些阶段的液体产物。在操作中,所述生物反应器中的每一个包括含有C1固定微生物的液体培养基。除了所期望的终产物之外,如本文所述的方法另外还产生不期望的或不太期望的代谢产物。代表性的C1固定微生物是来自穆尔氏菌属(Moorella)、梭菌属、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、醋酸杆菌属(Acetobacterium)、真杆菌属(Eubacterium)、丁酸杆菌属(Butyribacterium)、产醋杆菌属(Oxobacter)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、甲烷八叠球菌属以及脱硫肠状菌属(Desulfotomaculum)的那些微生物。梭菌属微生物的具体实例包括扬氏梭菌、自产乙醇梭菌、拉氏梭菌、以及拜氏梭菌(C.beijerenckei)。
代表性的含C1基质广泛地包括任何含有C1碳源的气体,其中选自由CO、CO2以及CH4组成的组的至少一种C1碳源可以被提供给C1固定微生物的一种或多种菌株以进行生长和/或发酵。这样的含C1基质优选地不包括达到这样的程度的污染物,在所述程度下,这些污染物可能对C1固定微生物的生长有不利影响(例如一种或多种污染物不以如下的浓度或量存在,与在相同的条件下,但是在没有所述一种或多种污染物的情况下的生长速率相比,所述浓度或量会使得在给定的一组条件下生长速率降低超过10%)。
代表性的如本文所述的含C1基质广泛地包括任何C1碳源。C1碳源指的是用作本发明的微生物的部分或唯一碳源的一碳分子。举例来说,C1碳源可以包含CO、CO2、CH4中的一种或多种。优选地,C1碳源包含CO和CO2中的一种或这两者。所述基质还可以包含其它非碳组分,如H2、N2或电子。
所述含C1基质可以含有显著比例的CO,优选地至少约5体积%至约99.5体积%的CO。这样的基质常常是作为工业过程,如钢铁制造过程或非铁产品制造过程的废产物产生的。其中产生气态含CO基质的其它过程包括石油炼制过程、生物燃料生产过程(例如热解过程和脂肪酸/甘油三酯加氢转化过程)、煤和生物质的气化过程、电力生产过程、炭黑生产过程、氨生产过程、甲醇生产过程以及焦炭制造过程。许多化学工业排放物以及由多种基质产生的合成气(含有CO和H2这两者)同样可以用作潜在的含CO基质。具体实例包括来自磷酸盐和铬酸盐的生产的排放物。有利的是,可以如本文所述使用来自这些过程的废物(例如废气)来有益地生产诸如乙醇的有用终产物。
所述基质和/或C1碳源可以是或可以衍生自作为工业过程的副产物或从某种其它来源,如从汽车尾气或生物质气化获得的废气或尾气。在某些实施方案中,所述工业过程选自由以下各项组成的组:铁金属产品制造(如钢厂制造)、非铁产品制造、石油炼制过程、煤的气化、电力生产、炭黑生产、氨生产、甲醇生产、以及焦炭制造。在这些实施方案中,所述基质和/或C1碳源可以在将它排放到大气中之前,使用任何简便的方法从工业过程捕集。
所述基质和/或C1碳源可以是或可以衍生自合成气,如通过煤或炼油厂残渣的气化、生物质或木质纤维素材料的气化、或天然气的重整所获得的合成气。在另一个实施方案中,所述合成气可以由城市固体废物或工业固体废物的气化而获得。
关于基质和/或C1碳源,术语“衍生自”指的是以某种方式改性或共混的基质和/或C1碳源。举例来说,所述基质和/或C1碳源可以经过处理以添加或去除某些组分或可以与其它基质和/或C1碳源的物流共混。
所述基质的组成可能对反应的效率和/或成本具有显著的影响。举例来说,氧气(O2)的存在可能会降低厌氧发酵过程的效率。根据所述基质的组成,可能期望处理、洗涤、或过滤基质以去除任何不期望的杂质,如毒素、不期望的组分、或尘粒、和/或提高所期望的组分的浓度。
所述基质一般包含至少一定量的CO,如约1摩尔%、2摩尔%、5摩尔%、10摩尔%、20摩尔%、30摩尔%、40摩尔%、50摩尔%、60摩尔%、70摩尔%、80摩尔%、90摩尔%、或100摩尔%的CO。所述基质可以包含一定范围的CO,如约20摩尔%-80摩尔%、30摩尔%-70摩尔%、或40摩尔%-60摩尔%的CO。优选地,所述基质包含约40摩尔%-70摩尔%的CO(例如钢厂气或高炉气)、约20摩尔%-30摩尔%的CO(例如碱性氧气转炉气)、或约15摩尔%-45摩尔%的CO(例如合成气)。在一些实施方案中,所述基质可以包含相对低量的CO,如约1摩尔%-10摩尔%或1摩尔%-20摩尔%的CO。本发明的微生物通常将基质中CO的至少一部分转化成产物。在一些实施方案中,所述基质不含或基本上不含CO。
所述基质可以包含一定量的H2。举例来说,所述基质可以包含约1摩尔%、2摩尔%、5摩尔%、10摩尔%、15摩尔%、20摩尔%、或30摩尔%的H2。在一些实施方案中,所述基质可以包含相对高量的H2,如约60摩尔%、70摩尔%、80摩尔%、或90摩尔%的H2。在另外的实施方案中,所述基质不含或基本上不含H2。
所述基质可以包含一定量的CO2。举例来说,所述基质可以包含约1摩尔%-80摩尔%或1摩尔%-30摩尔%的CO2。在一些实施方案中,所述基质可以包含少于约20摩尔%、15摩尔%、10摩尔%、或5摩尔%的CO2。在另一个实施方案中,所述基质不含或基本上不含CO2。
尽管所述基质通常是气态的,但是所述基质也可以替代形式提供。举例来说,可以使用微泡分散发生器将基质溶解在用含CO气体饱和的液体中。还举例来说,可以使基质吸附到固体载体上。
“微生物”是微观生物体,特别是细菌、古菌、病毒、或真菌。本发明的微生物通常是细菌。如本文所用的表述“微生物”应当被认为涵盖“细菌”。
本发明的微生物可以基于功能特征被进一步分类。举例来说,本发明的微生物可以是或可以衍生自C1固定微生物、厌氧菌、产乙酸菌、产乙醇菌、一氧化碳营养菌、和/或甲烷营养菌。表1提供了微生物的代表性列表并且标识了它们的功能特征。
1伍氏醋酸杆菌可以由果糖产生乙醇,但是不能由气体产生乙醇。
2已经报道伍氏醋酸杆菌可以依靠CO生长,但是方法是有问题的。
3尚未研究马氏梭菌是否可以依靠CO生长。
4热醋穆尔氏菌的一种菌株穆尔氏菌属菌种HUC22-1已经被报道由气体产生乙醇。
5尚未研究卵形鼠孢菌是否可以依靠CO生长。
6尚未研究银醋鼠孢菌是否可以依靠CO生长。
7尚未研究球形鼠孢菌是否可以依靠CO生长。
“C1”指的是一碳分子,例如CO、CO2、CH4、或CH3OH。“C1含氧化合物”指的是还包含至少一个氧原子的一碳分子,例如CO、CO2或CH3OH。“C1碳源”指的是用作本发明的微生物的部分或唯一碳源的一碳分子。举例来说,C1碳源可以包含CO、CO2、CH4中的一种或多种。优选地,C1碳源包含CO和CO2之一或这两者。“C1固定微生物”是具有由C1碳源产生一种或多种产物的能力的微生物。通常,本发明的微生物是C1固定细菌。在一个优选的实施方案中,本发明的微生物衍生自表1中所标识的C1固定微生物。
“厌氧菌”是不需要氧气来生长的微生物。如果存在高于一定阈值的氧气,那么厌氧菌可能起不利反应或甚至死亡。通常,本发明的微生物是厌氧菌。在一个优选的实施方案中,本发明的微生物衍生自表1中所标识的厌氧菌。
“产乙酸菌”是产生或能够产生乙酸盐(或乙酸)作为厌氧呼吸产物的微生物。通常,产乙酸菌是专性厌氧细菌,它们使用伍德-扬达尔途径作为它们用于能量保存以及合成乙酰辅酶A和乙酰辅酶A衍生产物,如乙酸盐的主要机制(Ragsdale,Biochim BiophysActa,1784:1873-1898,2008)。产乙酸菌使用乙酰辅酶A途径作为(1)从CO2还原性合成乙酰辅酶A的机制;(2)末端电子接受、能量保存过程;(3)在细胞碳的合成中固定(同化)CO2的机制(Drake,《产乙酸原核生物(Acetogenic Prokaryotes)》,《原核生物(TheProkaryotes)》,第3版,第354页,纽约州纽约(New York,NY),2006)。所有天然存在的产乙酸菌均是C1固定的、厌氧的、自养的、以及非甲烷营养的。通常,本发明的微生物是产乙酸菌。在一个优选的实施方案中,本发明的微生物衍生自表1中所标识的产乙酸菌。
“产乙醇菌”是产生或能够产生乙醇的微生物。通常,本发明的微生物是产乙醇菌。在一个优选的实施方案中,本发明的微生物衍生自表1中所标识的产乙醇菌。
“自养菌”是能够在不存在有机碳的情况下生长的微生物。相反,自养菌使用无机碳源,如CO和/或CO2。通常,本发明的微生物是自养菌。在一个优选的实施方案中,本发明的微生物衍生自表1中所标识的自养菌。
“一氧化碳营养菌”是能够利用CO作为唯一碳源的微生物。通常,本发明的微生物是一氧化碳营养菌。在一个优选的实施方案中,本发明的微生物衍生自表1中所标识的一氧化碳营养菌。
“甲烷营养菌”是能够利用甲烷作为碳和能量的唯一来源的微生物。在某些实施方案中,本发明的微生物衍生自甲烷营养菌。
更广泛来说,本发明的微生物可以衍生自表1中所标识的任何属或菌种。
在一个优选的实施方案中,本发明的微生物衍生自包括菌种自产乙醇梭菌、扬氏梭菌、以及拉氏梭菌的梭菌属的集群。这些菌种是由Abrini,Arch Microbiol,161:345-351,1994(自产乙醇梭菌);Tanner,Int J System Bacteriol,43:232-236,1993(扬氏梭菌);以及Huhnke,WO 2008/028055(拉氏梭菌)首先报道和表征的。
这三种菌种具有许多相似性。具体来说,这些菌种均是梭菌属的C1固定的、厌氧的、产乙酸型、产乙醇型、以及一氧化碳营养型成员。这些菌种具有相似的基因型和表型以及能量保存和发酵代谢的模式。此外,这些菌种聚集在具有大于99%同一的16S rRNA DNA的梭菌rRNA同源组I中;具有约22摩尔%-30摩尔%的DNA G+C含量;是革兰氏阳性的;具有相似的形态和尺寸(0.5-0.7×3-5μm的对数生长细胞);是嗜温的(在30℃-37℃最佳生长);具有约4-7.5的相似的pH值范围(最佳pH值是约5.5-6);缺乏细胞色素;并且经由Rnf复合物保存能量。此外,已经证实在这些菌种中羧酸被还原成它们相应的醇(Perez,BiotechnolBioeng,110:1066-1077,2012)。重要的是,这些菌种还均显示出依靠含CO气体的强自养生长,产生乙醇和乙酸盐(或乙酸)作为主要发酵产物,并且在某些条件下产生少量的2,3-丁二醇和乳酸。
然而,这三种菌种也具有许多差异。这些菌种是从不同的来源分离的:自产乙醇梭菌来自兔肠道,扬氏梭菌来自鸡舍废物,并且拉氏梭菌来自淡水沉积物。这些菌种在对各种糖(例如鼠李糖、阿拉伯糖)、酸(例如葡萄糖酸盐、柠檬酸盐)、氨基酸(例如精氨酸、组氨酸)、以及其它基质(例如甜菜碱、丁醇)的利用率方面有所不同。此外,这些菌种在对某些维生素(例如硫胺素、生物素)的营养缺陷方面有所不同。这些菌种在伍德-扬达尔途径基因和蛋白质的核酸序列和氨基酸序列上具有差异,尽管已经发现这些基因和蛋白质的一般组织和数量在所有菌种中是相同的(Curr Opin Biotechnol,22:320-325,2011)。
因此,综上所述,自产乙醇梭菌、扬氏梭菌、或拉氏梭菌的特征中有许多不是该菌种特有的,而相反是梭菌属的这一群C1固定的、厌氧的、产乙酸型、产乙醇型、以及一氧化碳营养型成员的一般特征。然而,由于这些菌种实际上是不同的,因此对这些菌种之一的遗传修饰或操纵在这些菌种中的另一种中可能没有相同的效果。举例来说,可以观测到生长、性能、或产物产生的差异。
本发明的微生物还可以衍生自自产乙醇梭菌、扬氏梭菌、或拉氏梭菌的分离株或突变株。自产乙醇梭菌的分离株和突变株包括JA1-1(DSM10061)(Abrini,Arch Microbiol,161:345-351,1994)、LBS1560(DSM19630)(WO 2009/064200)、以及LZ1561(DSM23693)。扬氏梭菌的分离株和突变株包括ATCC 49587(Tanner,Int J Syst Bacteriol,43:232-236,1993)、PETCT(DSM13528、ATCC 55383)、ERI-2(ATCC 55380)(US 5,593,886)、C-01(ATCC55988)(US 6,368,819)、O-52(ATCC 55989)(US 6,368,819)、以及OTA-1(Tirado-Acevedo,《使用扬氏梭菌从合成气体产生生物乙醇(Production of bioethanol from synthesisgas using Clostridium ljungdahlii)》,PhD thesis,北卡罗来纳州立大学(NorthCarolina State University),2010)。拉氏梭菌的分离株和突变株包括PI 1(ATCC BAA-622、ATCC PTA-7826)(WO 2008/028055)。
可以培养本发明的微生物以产生一种或多种产物。举例来说,自产乙醇梭菌产生或可以被工程化以产生乙醇(WO 2007/117157)、乙酸盐(WO 2007/117157)、丁醇(WO 2008/115080和WO 2012/053905)、丁酸盐(WO 2008/115080)、2,3-丁二醇(WO 2009/151342)、乳酸盐(WO 2011/112103)、丁烯(WO 2012/024522)、丁二烯(WO 2012/024522)、甲基乙基酮(2-丁酮)(WO 2012/024522和WO 2013/185123)、乙烯(WO 2012/026833)、丙酮(WO 2012/115527)、异丙醇(WO 2012/115527)、脂质(WO 2013/036147)、3-羟基丙酸盐(3-HP)(WO2013/180581)、异戊二烯(WO 2013/180584)、脂肪酸(WO 2013/191567)、2-丁醇(WO 2013/185123)、1,2-丙二醇(WO 2014/0369152)、以及1-丙醇(WO 2014/0369152)。除了一种或多种目标产物之外,本发明的微生物还可以产生乙醇、乙酸盐、和/或2,3-丁二醇。在某些实施方案中,微生物生物质本身可以被认为是产物。
在酸性代谢产物是乙酸的背景下,术语“乙酸”或“乙酸盐”指的是培养基中存在的总乙酸盐,其呈它的阴离子(解离)形式(即作为乙酸根离子或CH3COO-)或呈游离分子乙酸(CH3COOH)的形式,其中这些形式的比率取决于系统的pH值。如下文所述,可以使用碱性中和剂,如氢氧化钠(NaOH)水溶液通过中和乙酸来控制给定生物反应器中培养基的pH值(例如达到pH值设定点值,该pH值设定点值可以是pH值=4.5至pH值=8.0的任何特定的pH值)。生物反应器被维持以进行本文所述的方法的代表性的pH值范围是约4.0至约8.0,如约5.0至约6.5。
如本文所用的“液体产物”指的是被供给到多阶段方法的至少一个阶段的液流(例如被供给到第二阶段的第一阶段液体产物)。液体产物含有(i)含有C1固定微生物的培养基;(ii)所期望的终产物;以及(iii)其它代谢产物。所述液体产物还可以含有溶解的含C1基质。如本文所用的“最终阶段液体产物”是从多阶段方法的最终反应器阶段中抽出的液体产物。最终阶段液体产物通常是从最终阶段的液体级分的不含生物质的部分中抽出的。
如本文所用的“终产物”或“所期望的终产物”指的是由本发明的微生物产生的代谢产物。可以培养本发明的微生物以产生选自由以下各项组成的组的一种或多种产物:以产生乙醇、乙酸盐、丁醇、丁酸盐、2,3-丁二醇、乳酸盐、丁烷、丁二烯、甲基乙基酮(2-丁酮)、乙烯、丙酮、异丙醇、脂质、3-羟基丙酸盐(3-HP)、异戊二烯、脂肪酸、2-丁醇、1,2-丙二醇、以及1-丙醇。如本文所用的“生长依赖性产物”指的是表现出与生物质的产生速率成正比的产生速率的代谢产物。生长依赖性产物的实例包括但不限于异丙醇、乙酸盐、丙酮、2-羟基丁酸(2-HIBA)以及异丁烯。
所述多阶段反应器方法的益处之一是能够朝向至少一种所期望的终产物调控发酵过程的能力。应当了解的是,根据所提供的工艺参数,在一个发酵过程中所期望的终产物可能是在不同的工艺条件下操作的不同发酵过程中不期望的代谢产物。举例来说,在针对乙醇生产的多阶段方法中,乙醇是所期望的终产物,然而,在针对异丙醇生产的多阶段方法中,异丙醇是所期望的终产物,并且乙醇是副产物代谢产物。
如下文所述,在实施本发明中特别有用的特定类型的生物反应器是循环回路反应器,所述反应器依赖于提升管内相对低密度区段与一个或多个内部或外部下降管内相对高密度区段之间的密度梯度。提升管区段和下降管区段这两者在连续液相区域中包括液体培养基,但是气态含CO基质通常被分配(例如喷射)到提升管区段的底部中。上升的气泡在它们向上移动穿过连续液相区域期间被局限于这一区段,直到任何未消耗和未溶解的气体被释放到液位上方的连续气相区域(即蒸气空间或顶部空间)中为止。通过内部或外部液体下降管的向下液体循环可以由回路泵引起或辅助。然而,在一些情况下,多个生物反应器中的至少一个不使用回路泵,并且常常,大部分或甚至全部的生物反应器不使用回路泵,从而仅仅依赖于密度引起的循环并且有利地节约能量成本。
术语“生物反应器”以及可以作为“生物反应器阶段”的一部分包括的任何生物反应器不限于循环回路反应器,而是更广泛地包括用于维持具有可以用于进行本文所述的生物学方法的一氧化碳营养型微生物的培养基的液体体积的任何合适的容器、或容器内的区段,就所述生物学方法一般是在厌氧条件下进行来说,它们也可以被称为发酵方法。特定类型的生物反应器可以包括适用于两相(气体-液体)接触的任何容器,例如逆流流动反应器(例如具有向上流动的气相和向下流动的液相)或顺流流动反应器(例如具有向上流动的气相和液相)。在这样的两相接触容器中,液相有可能是连续相,如在气泡流过移动的液体柱的情况下那样。除此以外,气相有可能是连续相,如在分散的液体(例如呈液滴的形式)流过蒸气空间的情况下那样。在一些实施方案中,如下文更充分描述的那样,生物反应器的不同区域可以用于容纳连续液相和连续气相。
生物反应器的具体实例包括连续搅拌釜式反应器(CSTR)、固定化细胞反应器(ICR)、滴流床反应器(TBR)、移动床生物膜反应器(MBBR)、鼓泡塔、气升式发酵罐、以及膜反应器,如中空纤维膜生物反应器(HFMBR)。合适的生物反应器可以包括静态混合器、或适用于使气态含C1基质与液体细菌培养基接触(例如具有对于进行生物转化有利的溶解和质量转移动力学)的其它容器和/或装置(例如塔或管道布置)。短语“多个生物反应器”或可以被包括在“多个生物反应器阶段”中的生物反应器意在包括多于单一类型的生物反应器,尽管在一些情况下,多个生物反应器可以是一种类型(例如循环回路反应器)。
用于本文所述的生物学方法中的一些合适的工艺物流、操作参数、以及设备描述于美国专利申请公开号US2011/0212433中,该美国专利申请公开在此以引用的方式整体并入本文。
本发明更具体地说与利用多个生物反应器阶段将C1碳源转化成有价值的终产物的生物学方法的发现相关,所述生物学方法涉及如本文所述的并行气体、连续液体处理配置。有利的是,可以避免用于细胞(微生物或生物质)分离和再循环到给定的生物反应器阶段的一个或多个膜系统,同时实现所期望的终产物的高总体生产率(例如经过两个或更多个生物反应器),而有非常低的总体副产物形成。
在具体实施例中,本发明与使用如本文所述的多阶段方法将CO转化成乙醇的方法有关。在某些实施方案中,C1固定微生物是一氧化碳营养型微生物。更确切地说,所述一氧化碳营养型微生物选自由以下各项组成的组:自产乙醇梭菌、拉氏梭菌、以及扬氏梭菌。在具体实施方案中,所述一氧化碳营养型微生物是自产乙醇梭菌菌株DSM23693。从被定位在其它阶段下游的生物反应器阶段(例如最终生物反应器阶段)中抽出的中间阶段液体产物或最终阶段液体产物中代表性的乙醇浓度一般是至少约每升40克(克/升或g/l)(例如约40g/l至约95g/l),通常至少约50g/l(例如约50g/l至约80g/l),并且常常至少约60g/l(例如约60g/l至约75g/l)。在这样的中间阶段液体产物或最终阶段液体产物中代表性的乙醇:乙酸重量比一般是至少约50:1(例如约50:1至约1000:1),通常至少约75:1(例如约75:1至约500:1),并且常常至少约100:1(例如约100:1至约250:1)。液体产物的这些特征更具体地说可以指从中间阶段生物反应器或最终阶段生物反应器中抽出并且在分离(例如膜过滤)以去除一氧化碳营养型微生物(细胞或生物质)之后的液体产物。一般来说,用于确定代谢产物浓度的分析方法(例如气相色谱(GC)或高压液相色谱(HPLC)需要不含细胞的样品。
除了实现高的总体乙醇生产率而有最低限度的总体副产物形成之外,如本文所述的多阶段方法还可以提供有利的总CO利用率。总CO利用率指的是被输入到多阶段过程中(例如被输入到生物反应器中的总CO)并且被用于转化成微生物的一种或多种所期望的产物(例如乙醇)和其它代谢产物的CO的百分比。如果离开所述过程的所有气流(即气态产物)的组合组成是已知的或可以计算(例如基于离开所使用的生物反应器中的每一个的一个或多个单独气流的流速和组成),则总CO利用率可以被计算为:
1-(离开所述多阶段过程的CO的速率)/(被输入到所述多阶段过程中的CO的速率)
总CO利用率是在“每次通过”或“单程”基础上确定的,而不说明可以提供更高的总利用率值的气态产物再循环(和附加费用)的使用。根据代表性实施方案,一氧化碳营养型微生物的CO利用率一般是至少约35%(例如约35%至约85%),通常至少约50%(例如约50%至约80%),并且常常至少约60%(例如约60%至约75%)。在一些情况下,CO利用率可以是至少约70%。
根据本发明的一个实施方案,调整所述多阶段方法的发酵参数以提高至少一种生长依赖性产物的产量。在一个实施方案中,调整所述多阶段方法的发酵参数以提高所述方法对异丙醇的特异性。在具体实施例中,本发明与使用如本文所述的多阶段方法将CO转化成异丙醇的方法有关。在某些实施方案中,C1固定微生物是重组自产乙醇梭菌菌株。在某些实施方案中,所述重组微生物被适配成表达或过表达异丙醇生物合成途径中的至少一种酶。
本发明的实施方案涉及用于提高代谢产物的生产率的方法,所述代谢产物表现出与生物质的产生速率成正比的产生速率(例如生长依赖性产物)。如图5A和5B中所示,丙酮和/或异丙醇的生产速率与发酵的生长阶段相关。如图表中所示的那样。图5A示出了在CSTR中发酵过程中乙酸盐浓度与异丙醇浓度之间的强相关性。乙酸盐浓度和异丙醇浓度这两者在发酵的初始生长阶段(第1天和第2天)期间均增加。随着生长阶段开始平缓,乙酸盐浓度和异丙醇浓度这两者均下降。图5B示出了异丙醇的生产率与生长速率之间的关系。清楚地表明,异丙醇在最高的生长速率下达到它的最高生产率。
已经证实酶CtfAB通过将辅酶A部分从乙酰乙酰辅酶A转移到乙酸盐,从而引起乙酰乙酸盐和乙酰辅酶A的形成来催化乙酰乙酸盐的形成。这一酶活性取决于乙酸盐的可用性。已经报道CtfAB对乙酸盐的Km值是24mM(1.4g/L)至1200mM(71g/L)。KM值是酶以它的最大速率的一半起作用时的底物浓度。因此,为了使CtfAB具有活性以达到它的最大速率的一半,需要1.4g/L-71g/L的乙酸盐。本申请的发明人估计在细胞中需要至少14g/L的乙酸盐,以确保乙酸盐不是异丙醇发酵过程中的限制性底物。
如本发明所提供的多阶段生物反应器方法提供了所述方法的更大适应性。通过对所述多阶段方法的各个阶段进行工艺参数调整,可以改变所期望的结果。举例来说,可以调控所述多阶段方法以对所期望的终产物(例如乙醇、或2,3-丁二醇、或生长依赖性产物,如异丙醇)具有更大的产物特异性。在整个多阶段生物反应器方法中可以控制或调整的工艺参数的实例包括含C1基质组成、含C1基质流速、温度、压力、细菌稀释率、以及液体培养基组成。
合适的操纵的实例包括以不同的流速向多阶段方法的不同阶段提供含C1基质;向多阶段方法的不同阶段提供具有不同组成的含C1基质;向多阶段方法的不同阶段提供具有不同组成的液体培养基(例如向多阶段方法的至少阶段提供具有有限组成的液体培养基);改变多阶段系统的不同阶段之间的温度(例如从第一反应器阶段和后续反应器阶段降低温度);改变多阶段反应器方法的阶段之间的细菌稀释率;改变多阶段方法的每一个阶段内的混合速率(例如通过改变液体分配装置的泵速、或通过修改内部反应器设计或尺寸)。
重要的是,如上文所述,上述性能参数可以在多阶段生物反应器方法中实现,其中不需要如在常规的连续生物转化方法中所实施的那样,分离和再循环在一个(上游)生物反应器的液体产物中抽出并且供给到另一个(下游)生物反应器中的一氧化碳营养型微生物。一般来说,因此,从上游生物反应器阶段中抽出并且供给到给定生物反应器阶段中的液体产物可以包含上游(先前)生物反应器阶段中所用的一氧化碳营养型微生物,这是因为不将该微生物从正连续地从一个阶段转移到下一个阶段的液体产物中的一个或多个,并且优选地全部中分离。被供给到给定生物反应器阶段中的液体产物一般还包含从上游(先前)阶段接收的培养基、所期望的终产物、以及其它代谢产物。
因此,根据本文所述的有利地避免使用常规的细胞分离和再循环(例如膜)系统的实施方案,从上游生物反应器阶段中抽出的液体产物不经受一氧化碳营养型微生物的分离以及所分离的一氧化碳营养型微生物向从中它被抽出的上游生物反应器阶段中的再循环。然而,本文所述的方法和系统的这一表征性特征并不排除在从上游阶段中抽出液体产物之后并且在将它供给到给定的生物反应器阶段中之前使用各种中间步骤,这些步骤可能影响或可能不影响液体产物的组成。这些中间步骤包括例如(i)分离液体产物的一部分(例如用于取样目的),任选地与过滤所述分离的部分(例如,如执行分析方法所需)组合;(ii)将液体产物(例如与培养基、特定营养物质、或工艺添加剂,如表面活性剂)混合;和/或(iii)使液体产物反应(例如与中和剂,如NH4OH或NaOH反应以提高pH值)。然而,在一些实施方案中,可以将从给定的生物反应器阶段中抽出的液体产物供给到给定的生物反应器阶段中而不经历上文所述的(i)、(ii)、和/或(iii),或不经历这些的某种组合。
图1描绘了根据本公开的一个具体实施方案的代表性的多阶段生物转化方法,该方法包括至少四个互连的生物反应器阶段(10a、10b、……、10y、10z),第二阶段(10a)与第三阶段(10y)之间的虚线用于指示一个或多个另外的中间阶段可以按类似方式并且用相似的设备和连接并入到给定的多阶段系统中。如下文更充分描述的那样,可以将气态含C1基质并行地供给到所述阶段中,而可以将可以包括生物质的液体产物从第一生物反应器阶段(10a)依次供给到最终生物反应器阶段(10z),可以从所述最终生物反应器阶段中抽出最终阶段液体产物,所述最终阶段液体产物具有如上文所述的这一液体产物或至少其不含生物质的级分的代表性特征。
根据代表性的方法,将气态含C1基质经由气体入口(12a、12b、12y、12z)供给到生物反应器阶段中,所述气体入口被定位在每一个生物反应器阶段的垂直延伸的生物反应器(100a、100b、100y、100z)的底端附近。举例来说,气体入口可以在它们对应的生物反应器的长度的底部25%内,并且优选地底部10%内延伸到它们对应的生物反应器中。气体入口通常将延伸到它们对应的生物反应器中,延伸到气体分配装置,所述气体分配装置可以在生物反应器内居中设置在一般对应于反应器长度的这些百分比内的高度处。特定的气体分配装置包括喷射器(14a、14b、14y、14z),所述气体入口可以与所述喷射器处于流体连通,所述喷射器在所述生物反应器中的一个或多个内,靠近它们对应的第一端。包括在生物转化反应中没有被利用的未转化的C1碳源和含C1基质的任何气态杂质(例如H2)的气态产物从每一个生物反应器中抽出并且经由气体出口(16a、16b、16y、16z)离开,所述气体出口被定位在生物反应器的与底端相对的顶端附近。所述气体出口可以在它们对应的生物反应器的长度的顶部25%内,并且优选地顶部10%内延伸到它们对应的生物反应器中,或相反,气态产物可以从它们对应的生物反应器的顶部抽出,而完全没有延伸到它们对应的生物反应器中的气体出口。
中间生物反应器(100b、100y)各自包括液体入口(18b、18y)和液体出口(20b、20y),它们可以接收从紧邻的上游生物反应器中抽出的液体产物并且将液体产物输送到紧邻的下游生物反应器中。举例来说,第二阶段的生物反应器100b具有用于接收从第一阶段的生物反应器100a(例如经由它的液体出口20a)中抽出的液体产物的液体入口18b以及用于将液体产物输送到第三阶段的生物反应器(未示)(例如经由它的液体入口(未示))中的液体出口20b。生物反应器100a(即第一阶段10a的生物反应器)没有上游生物反应器,并且因此没有特定用于从相邻的上游生物反应器接收液体产物的液体入口。生物反应器100z(即最终阶段10z的生物反应器)没有下游生物反应器,并且因此没有特定用于将液体产物输送到相邻的下游生物反应器中的液体出口。然而,最终生物反应器100z包括用于抽出最终阶段液体产物的液体产物出口50,所述最终阶段液体产物例如具有如上文所述的它的组成方面的代表性特征。可以经由与这些入口和出口处于流体连通的小口径开管(例如具有约1mm至约12mm的内径)将液体产物(或“发酵液”)经由入口和出口(20a……20y和18a……18z)转移到连续阶段中/从连续阶段中转移出。
如同中间阶段的生物反应器的液体出口(20b、20y)的情况一样,最终阶段的生物反应器100z的液体产物出口50被定位在生物反应器的底端附近。在从生物反应器100z中抽出最终阶段液体产物之后,可以将在液体产物出口50中抽出的最终阶段液体产物通到高度H并且任选地延伸到高度H上方,所述高度H对应于工作无气液位(即将在没有气体滞留的情况下存在的液位)。也就是说,最终阶段液体产物延伸到的最高高程E可以等于或高于高度H。高度H可以是可调的,并且可以基本上对应于虹吸截断器75或其它类型的液体分支点的高度H。在图1的实施方案中,因此,液体产物出口50与虹吸截断器75处于流体连通,该虹吸截断器75相对于多阶段方法的生物反应器(100a、100b……100y、100z)在高度上是可调的。可以调节高程E和高度H以控制最终阶段的生物反应器100z以及优选地其它生物反应器的液位或液压头达到这样的程度以使得它们可以液压连接,而不破坏将液体产物连续地从一个阶段转移到下一个阶段的液体入口和液体出口(20a……20y和18a……18z)中的液体充满(或连续液相)状态。高程E和/或高度H因此可以控制一个或多个,并且优选地所有生物反应器(100a……100z)中的液位,并且特别可以控制它们对应的生物反应器中的气体/液体界面(22a……22z)的液位。
在图1中所描绘的具体实施方案中,液体入口(18b、18y)和液体出口(20b、20y)优选地被定位在对应的气体入口(12b、12y)和喷射器(14b、14y)下方的静止区段中以允许液体被供给到给定的生物反应器阶段的这一区段或反应器位置以及从该区段或反应器位置抽出。然而,入口和出口也有可能沿着它们对应的生物反应器的长度被定位在别处,这取决于用于供给和抽出液体产物的所期望的位置。在一个替代性实施方案中,例如,液体出口可以被定位在气体/液体界面(22a、22b、22y、22z)的液位处或附近,或者否则可能破坏生物反应器阶段之间的虹吸效应或液体充满状态,以允许一个或多个生物反应器中独立的液位控制。
也如图1中所示,一个或多个,例如所有生物反应器(100a、100b……100y、100z)可以包括外部液体再循环回路(25a、25b……25y、25z)(即在它们对应的生物反应器外部)以提高给定生物反应器内的混合/均匀性和/或提高气液质量传递的速率。使用外部液体再循环回路(25a、25b……25y、25z),包括培养基和C1固定微生物的液体产物可以从给定生物反应器的底部区段(例如从生物反应器的长度的底部10%内;从气体分配装置,如喷射器(14a、14b、14y或14z)下方;和/或从液体入口或液体出口下方)抽出,并且在生物反应器外部再循环到生物反应器的顶部区段(例如到生物反应器的顶部10%内和/或到界定连续气相区域与连续液相区域之间的边界的气体/液体界面(22a、22b、22y、或22z)上方)。外部反应器液体再循环回路可以包括对应的外部液体再循环泵(30a、30b、30y、30z)以例如在能量使用与质量传递速率提高之间的最佳折衷下按所期望的速率提供外部液体循环。
方便的是,外部液体再循环回路(25a、25b……25y、25z)可以提供生物反应器液体取样/分析的位置,并且还被配置用于生物反应器控制。举例来说,第一阶段和第二阶段的生物反应器100a和100b包括对应的外部液体再循环回路25a和25b,可以经由碱性中和剂入口35a和35b将碱性中和剂(例如碱水溶液,如NH4OH或NaOH)添加到所述回路中。向一个或多个给定的生物反应器,例如生物反应器100a、100b中添加碱性中和剂可以使用合适的反馈控制回路来单独控制,所述反馈控制回路包括例如测量(例如连续地或间歇地)外部液体再循环回路25a和25b内生物反应器液体的pH值的pH值分析仪40a、40b。这样的控制回路还包括必要的硬件(例如控制阀或可变速率进料泵(未示))和软件(例如计算机程序)以将测量的pH值与给定生物反应器的设定点值比较,然后控制碱性中和剂的流动以实现或维持设定点。因此,所述生物反应器中的一个或多个(例如全部)的外部再循环回路可以与对应的一个或多个(例如所有)碱性中和入口处于流体连通并且包括用于独立地控制一个或多个(例如所有)对应的生物反应器内的pH值的仪器。
此外,一个或多个生物反应器(100a、100b……100y、100z)的外部液体再循环回路(25a、25b……25y、25z)可以包括温度变送器(41a、41b、41y、41z),所述温度变送器测量(例如连续地或间歇地)对应的生物反应器(100a、100b……100y、100z)的外部液体再循环回路25a和25b内液体的温度,这样的温度代表了生物反应器的操作温度。因此可以使用控制回路来实现单独的生物反应器温度控制,除了温度变送器(41a、41b、41y、41z)之外,所述控制回路还包括加热器或热交换器(42a、42b、42y、42z)和必要的软件(例如计算机程序)以将测量的温度与给定的生物反应器的设定点温度比较,然后控制加热器或热交换器(42a、42b……42y、42z)的操作以实现或维持设定点。特定类型的热交换器包括具有管中管和蜂窝夹套构造的那些热交换器。此外,一个或多个生物反应器(例如如图1中所描绘的第一阶段和第二阶段的生物反应器100a和100b)的外部液体再循环回路(25a、25b……25y、25z)可以包括液体培养基入口45a和45b、或用于独立地以相同的或不同的速率将其它液体稀释剂、试剂(例如表面活性剂)、和/或营养物质引入到一个或多个生物反应器中的入口。因此,所述生物反应器中的一个或多个(例如全部)的外部再循环回路可以与对应的一个或多个加热器或热交换器处于流体连通并且包括用于独立地控制一个或多个对应的生物反应器内的温度的仪器。
所述生物反应器阶段中的两个或更多个(例如第一生物反应器阶段和第二生物反应器阶段10a、10b)因此可以具有可独立控制的工艺操作变量,包括需要在外部液体再循环回路上对生物反应器液体产物进行取样/分析的那些变量,如上文所述。代表性的工艺操作变量包括液体培养基添加速率、气态含CO基质进料速率、反应器温度、反应器pH值、以及其组合。如本文所述的多阶段方法的一个重要优势源于在将C1固定微生物转移到连续生物反应器阶段中时独立地控制它的生长的能力。对细菌生长以及终产物和其它代谢产物的产生的管理可以通过将给定的生物反应器阶段的条件(例如上文所述的工艺操作变量)调控到给定的处理目标来实现。举例来说,根据一个实施方案,将相对高速率的液体培养基添加到第一阶段的生物反应器中以促进高细菌生长速率并且还为多阶段生物反应器系统的其余部分建立稳定的均匀培养物。可以将相对更低速率的液体培养基添加到下游生物反应器中,所述下游生物反应器具有更确定的细胞培养物,适用于实现终产物的高生产速率。以这种方式,可以有利地将细菌生长与产物产生分开或脱离。总体而言,可以更一般了解的是,本文所述的系统在控制C1固定微生物在它在每一个连续反应器中经历不同的生长阶段时的代谢方面提供了高自由度数。这些控制特征允许所述多阶段生物转化过程被操作而有具有如上文所述的特征的最终阶段液体产物。
以相同方式,可以在一个或多个生物反应器(100a、100b……100y、100z)中,经由使用独立的液位控制设备和仪器(例如控制阀、液位传感器、以及变送器)来独立地控制气体/液体界面(22a、22b……22y、22z)的液位或高度。然而,也有可能有利地避免实施这样的设备和仪器的附加费用和复杂性,这是通过进行多阶段方法以使得至少一个生物反应器中的液位取决于它对应的下游生物反应器中的液位,例如通过具有控制所述系统的所有生物反应器中的液位的单一液位控制来实现。根据操作图1的生物反应器(100a、100b……100y、100z)的系统的特定模式,将液体培养基经由入口45a添加到第一阶段的生物反应器100a中并且它通过溢流或以其它方式流过所有的反应器,如由流体静压头所控制,例如,所述流体静压头可以通过改变最终阶段液体产物达到或延伸到的最高高程E来控制。
根据开始所述方法的一种可能的程序,最初可以向第一阶段的生物反应器100a中接种或加入C1固定微生物,所述微生物在培养中分批生长期之后,实现足够高的浓度,以使得可以开始液体培养基的连续添加。然后将第一阶段液体产物输送到连续阶段,这例如是通过从第一阶段溢流到第二阶段,继而从第二阶段溢流到第三阶段等等来实现的。系统的液位最终可以由抽出最终阶段液体产物的液位(也被称为从最终生物反应器阶段“排放”的液位)来决定。分别将气态含C1基质添加到每一个反应器中,尽管共用的顶部空间是可能的,并且根据一些实施方案,可以减少发泡,在所述顶部空间中,离开连续液相区域的蒸气组合(例如在单个容器内,诸如以堆叠的布置设置多于一个生物反应器阶段的情况下)。从最终阶段液体产物中回收发酵的所期望的终产物以及其它代谢产物,所述最终阶段液体产物是从最终生物反应器阶段中抽出的。可以在该回收之前分离(例如通过膜过滤)最终阶段液体产物以去除终产物和代谢产物,然后去除C1固定微生物和可能的其它固体。可以将由该分离回收的液体渗透物(或基础培养基)中的一些或全部再循环以用于生物反应器阶段中,例如,可以将它添加到第一阶段生物反应器中,任选地在添加营养物质之后添加到第一阶段生物反应器中。
图2描绘了一种可能类型的生物反应器100,即循环回路生物反应器,它可以被并入多阶段方法的生物反应器阶段10中,所述方法包括图1中所描绘的方法。许多相同的特征如图1中所示(并且使用相同的附图标记来标识),除了可以特定用于促进所期望的蒸气和液体流动特征、循环、以及相间的分配/质量传递的一些反应器内部结构之外。如图2中更清楚示出的那样,生物反应器100用两个区域操作,这两个区域可通过它们的连续相和分散相来区分。连续气相区域A具有分散的液相,这是因为液体产物经由一个或多个液体分配装置,如喷淋头110进入这个区域(也被称为顶部空间)中,所述喷淋头110具有多个开口以用于分散从外部液体再循环回路25供给的向下流动的液体产物(例如呈向下膨胀锥形轮廓)。
连续液相区域B具有分散的气相,这是因为含C1基质经由一个或多个气体分配装置,如喷射器14进入这个区域中,所述喷射器14具有多个开口以用于分散从气体入口12供给的向上流动的含C1基质。气体/液体界面22界定了连续气相区域A与连续液相区域B之间的边界。连续液相区域B可以占据生物反应器100的大部分容积,并且例如它可以被完全设置在反应器长度的底部90%、底部80%、或底部75%内。因此,气体/液体界面22可以位于反应器长度的顶部25%、顶部20%、或顶部10%内。在一些情况下,泡沫层(未示)可能存在于气体/液体界面上方,并且为了本公开的目的,存在于连续气相区域A中。
因此,根据图2的具体实施方案,将经由外部液体再循环回路25再循环的液体产物(或“发酵液”)引入连续气相区域A中。可以将该液体产物从生物反应器的底部区段(如上文所述从其抽出液体产物)通到生物反应器的顶部区段(例如通到生物反应器100的长度的顶部10%内以及通到用于引入所述液体产物的一个或多个液体分配装置(如喷淋头110)上方)。如上文关于图1所述,除了提高液体循环和液相与气相之间的质量传递之外,外部液体再循环回路25还可以被配置成执行工艺控制功能。举例来说,可以使经由外部再循环回路25再循环的液体产物通过外部热交换器42(例如,在引入连续气相区域A中之前)以控制生物反应器100的温度。此外,可以例如经由碱性中和剂入口35将碱性中和剂添加到该液体产物中,以控制生物反应器100的pH值。在如图1中所示的多个生物反应器的情况下,所述生物反应器中的一个或多个(例如全部)的外部再循环回路可以用于将在生物反应器的一个或多个对应的第一端附近抽出的液体产物再循环到一个或多个对应的连续气相区域中靠近一个或多个对应的第二端(与第一端相对设置)的液体分配器中。
可以将经由喷射器14引入的含C1基质供给到提升管120中,该提升管120被设置在连续液相区域B内,例如相对于生物反应器100同心设置,并且将上升的气泡局限于该区域的中央区域。在离开提升管120的顶部之后,在连续液相区域B中没有溶解或利用的剩余气体继续向上流动并且在气体/液体界面22处脱离该区域。由于提升管120中的气体滞留,因此提升管120内的总体密度小于下降管130中的密度,气泡基本上脱离该下降管130。如图2中所示,下降管130可以相对于提升管120环状地设置,尽管其它配置也可能用于提供连续液相区域B内具有不同密度的区域。举例来说,多个垂直延伸的下降管可以分布在整个该区域中,从反应器长度的底部1%-10%内延伸到反应器长度的顶部25%-45%内。如还在该区域中使用箭头指示整体液体流动方向所示,生物反应器100在连续液相区域B中以内部液体循环来操作,该液体循环就是由密度差所引起的,并且引起提升管120中向上的液体流动和下降管130中向下的液体流动,这两者均在生物反应器100的内部。根据一些实施方案,可以使用多于一个提升管和/或多于一个下降管来控制液体循环。
在气体/液体界面22处脱离的气体继续向上流动(整体上)穿过连续气相区域A,其中它与经由喷淋头110或其它液体分配装置引入该区域中的液体产物接触。以这种方式,生物反应器100在该区域中以逆流的气体流动和液体流动(向上流动的气体和向下流动的液体)来操作,该区域被设置在如上文所述以内部液体循环操作的连续液相区域B上方。这两个区域均可以包括气液接触装置。由于在这些区域中实现相间质量传递的方式的差异,因此区域A中的气液接触装置125A可以不同于区域B中的气液接触装置125B,例如就它们的几何形状(例如直径和/或厚度)和/或它们开口的配置(例如在尺寸、形状、间距、和/或总数方面)来说。根据一些实施方案,在不同的区域中可以使用完全不同类型的气液接触装置(例如穿孔板和散堆填料,如拉西环(Raschig ring))。同样,在单个区域内可以使用不同或完全不同类型的气液接触装置。
如本领域技术人员可以了解的那样,考虑到本说明书,本文所述的多阶段方法和系统与许多操作优势有关,包括以下各项中的任一个、任何组合、或全部:(1)稳健的发酵(厌氧生物转化)而复杂性降低:相对于常规方法,如本文所述的多阶段方法是操作更简单的并且具有显著更大的“操作范围”或操作可行的条件范围。这是因为对每一个单独的生物反应器的生产率要求相对较低,以及所有反应器(除第一阶段的生物反应器以外)从紧邻的上游反应器接收连续进料,从而使发酵稳定。这有利地解决了本领域的主要目标之一,即如长期稳定的商业操作所需的规模上的操作稳健性。(2)显著的自由度数:这允许在细菌培养物在每一个生物反应器中经历不同的生长阶段时对它的代谢进行更大的控制。可以调控每一个阶段的条件(例如气体供应速率、温度、和/或pH值设定点)以控制发酵输出,如代谢产物比率。这可以产生高并且稳定的终产物滴度。举例来说,本申请的发明人已经证实高并且稳定的乙醇滴度(在连续实验室测试中,是>60克/升)、非常有利并且稳定的最终液体产物乙醇:乙酸盐重量比(在连续实验室测试中,是100+)。因此,可以实现可能非常大的成本节约,这与培养基和水再循环系统的使用有关,其中乙酸盐副产物是直接再循环的主要障碍。(3)将生长与产物产生分开的能力:这对于在其中可以在生长之后的随后阶段添加诱导剂的方法中,由遗传工程细胞产生生物终产物来说是一个显著的益处。益处是因为有可能使用高稀释率(即添加液体培养基的速率)在第一生物反应器阶段中具有高生长速率,这为系统的其余部分建立稳定的均匀培养物。(4)在不需要细胞再循环系统的情况下大量节约资金成本:在这方面,膜、外壳、阀门以及相关的仪器和控制占生物反应器的总成本的显著部分,特别是在商业规模上。还显著降低了细菌细胞再循环要求(例如再循环泵输送量),并且可能仅需要操作外部再循环回路所需的适度能量(例如经由如上文所述的喷淋头或其它液体分配器)。(5)以降低的成本进行的简化和更稳健的操作:这是因为在每一个生物反应器阶段不需要膜分离和分离的细胞的再循环。与更换膜和手动就地清洗(CIP)相关的在操作时间、CIP化学品、以及加热方面的成本是显著的。在这方面,自动CIP选择方案具有非常高的资金成本,用于清洗细胞再循环膜的酶溶液也是昂贵的,并且简单的NaOH清洗程序常常无效。(6)更大容积、更短的、和更矮胖的气升式回路反应器设计:这样的设计可以容易地通过配有内部零件的现有工业标准集液罐来实现。这是因为对生物反应器的生产率要求较低,并且允许在生物反应器制造中大量节约成本的可能性。根据一些实施方案,如本文所述的方法和系统可以单独依靠气升循环效应来有效操作,而不使用外部再循环或回路泵,并且因此还规避了相关的外部再循环管道和设备。在每一个阶段之间利用简单的溢流/液压头液位控制的实施方案中,控制阀和管道的资金支出的进一步减少是可能的。(7)使用低的操作压力:这是对单独的生物反应器的生产率要求较低的另一个益处。在这一点上,除非对气体加压,否则高气体滞留限制了生物反应器的气体流速。降低操作压力的能力有降低压缩成本的作用。
以下实施例作为本发明的代表被阐述。这些实施例不应当被视为限制本发明的范围,这是因为鉴于本公开和所附权利要求书,这些和其它等同实施方案将是显而易见的。
实施例1
实验设置
使用具有包括生物反应器的六个阶段的测试装备来对如本文所述的多阶段生物转化方法进行长期评价,所述阶段各自具有1.5升的工作容积(所述系统的总反应器容积是9升)。确切地说,这些方法使用逆流液体下流回路反应器,所述反应器具有具约1.2米高度和50毫米直径并且由透明PVC塑料构建以用于观测流体动力学的主塔。第五阶段和第六阶段具有略微更高的主塔。在每一个塔的底部处使用塑料的低压离心泵(水族箱,泵输送量:500L//h-2000L//h)将液体再循环到塔顶部处的全锥形喷淋头液体分配器。跨每一个喷淋头的压降是低的,约为20kPa-40kPa。
气体分别并且在塔底部附近,经由烧结不锈钢喷射器进入每一个生物反应器阶段中。未利用的和未溶解的气体在每一个塔的顶部处,在喷淋头上方离开。所有六个阶段都是在接近大气压下运行的。每一个阶段通过小口径不锈钢管线(1.5mm内径的管)与下一个阶段进行流体连接(用于转移液体产物),所述管线附接在每一个主塔的底部处,在它们对应的喷射器正下方。将液体培养基供给到第一阶段,并且仅仅通过液压头转移穿过生物反应器阶段的系统。使用最终阶段或第六阶段来使用在高程上可调的液体分支点控制整个系统中的反应器液位。每一个阶段都装备有独立的定量化学品管线和温度控制。除了最后两个阶段(即第五阶段和第六阶段)之外,所述阶段还装备有pH值测量和控制系统。
实施例2
初始试用操作
初始操作被设计成测试多阶段生物反应器系统在含有自产乙醇梭菌的细菌培养基存在下,将气态含CO基质中的CO生物转化成乙醇和其它代谢产物的有效性。使用如实施例1中所述的测试装备的简化型式,它没有顶部空间喷头,即连续气相区域是开管。也不使用任何喷射器,即将气体经由开放的3mm内径的管引入连续液相区域中。没有对第五阶段和第六阶段的生物反应器的温度控制,并且使用简单的溢流液体系统(共用的气体出口)来维持液位控制。基于从第六阶段的生物反应器中抽出的最终阶段液体产物,生物转化操作在2周内实现了稳定的细菌生长,最终达到>43克/升的乙醇产量的操作点,而乙酸盐产量<2克/升。稳定阶段稀释率、或液体培养基的添加量是每分钟约2.5毫升(或每一个生物反应器每天约2.3倍反应器容积)。这些结果验证了用于溢流液位控制的系统,尽管观测到一些质量传递产生表面活性剂在塔顶液位中从初始生物反应器阶段中被去除,从而减少了质量传递。
实施例3
基于流体动力学观测的改动操作
在第二次操作中,进行改动以得到基本上如实施例1中所述的测试装备。这些改动是基于实施例2中测试的流体动力学评价,包括使用附接在塔的底部处的1.5mm内径的不锈钢管在阶段之间建立“仅液体”连接。该直径被确定为小到足以防止在培养基添加的操作速率(稀释率)下发生回混。鉴于反应器的底部处的这些液体连接,添加用于离开第六生物反应器的最终阶段液体产物的可调高度出口以在整个系统中进行液位控制。此外,将全锥形顶部空间喷头添加到所有的生物反应器中以进行液体分配,并且在最后两个反应器阶段的外部液体再循环回路上添加温度控制系统。为六个生物反应器中的每一个提供单独的气体排放,而不是如实施例2中所述,具有组合的含有未利用的CO的气态产物。
以稳定操作进行实施例2中所述的生物转化反应的48天测试。在连续条件下,生产率和产品质量都是非常有利的。举例来说,在10天的时间内,稳态操作参数(例如压力、温度、流速、pH值等)实现平均大于61克/升的最终阶段液体产物乙醇滴度和平均仅0.6克/升的乙酸盐(乙酸)滴度(约100:1w/w的乙醇/乙酸比率或更大)。2,3-丁二醇滴度平均为8.4克/升。这些结果是用每分钟约2.5毫升的液体培养基添加量(或每一个生物反应器每天约2.3倍反应器容积的稀释率)实现的。重要的是,在33天的连续操作期间,乙醇滴度始终高于50克/升,其中有3天达到高于70克/升的惊人高的滴度,并且甚至在操作期间,峰值滴度是76克/升。当增加向第二生物反应器阶段、第三生物反应器阶段、以及第四生物反应器阶段的培养基添加速率以获得最终生物反应器中每天3.5倍反应器容积的稀释率时,在最终阶段液体产物中获得超过50克/升的乙醇。在这一长期操作期间实现的性能图示于图3中,该图3提供了最终阶段液体产物中乙醇和其它代谢产物,即乙酸和2,3-丁二醇的浓度以及微生物(生物质)浓度。基于在运转23天时取出的液体产物样品,每一个阶段的液体产物的代谢产物谱(乙醇、乙酸、以及2,3-丁二醇浓度)图示于图4中。图4具体来说示出了在连续阶段获得的快速增加的乙醇浓度,以及同时,2,3-丁二醇浓度只有非常少量的增加和乙酸盐(乙酸)浓度的降低。来自该操作的结果包括在48天测试开始时在稳定操作期间65%-75%的单个生物反应器阶段CO利用率,它在随后的时间段内在实现更高的乙醇产物滴度时增加到80%-90%。这些结果表明了这一规模的塔/回路反应器的非常高的质量传递系数。
有利的是,实现了终产物乙醇的高滴度和非常稳定的操作,这至少部分地是经由将液体输送管线定位在反应器的底部处并且在反应器顶部空间中添加液体分配器来实现的。这具有减少与泡沫积聚和优先将化学添加剂从液相的顶部转移出相关的一些缺点的作用。总体而言,由于在实施例2和实施例3中进行的测试之间作出的改动,因此质量传递和操作控制这两者得到显著提高。此外,气液界面液位始终处在它们对应的塔/反应器的顶部处,并且更容易控制,无论实际的液体存量(实际液体体积)如何。因此,滞留量可以直接通过液体存量来控制,该液体存量在实施例3中所用的多阶段生物反应器系统的情况下进而使用外部排放管线来调节。用于抽出最终生物反应器阶段液体产物的这一管线连接到可调高度虹吸截断器,从而允许塔内的液相被设定到任何所期望的液位。使用大约延伸到反应器长度的顶部30%-50%的液压头高度(例如,标称40%的滞留量)获得了特别好的结果。
基于实施例2和实施例3中所获得的结果,如本文所述的方法和系统具有提高气液质量传递的非常高的潜能,而在额外的能量输入和/或资金支出方面有相对低的要求,或甚至无要求。操作被简化,并且可以实现成本节约,这例如是通过规避与至少一些膜分离系统和/或液位控制系统(和相关的流量计、泵、控制阀、以及其它仪器和设备)相关的费用来实现的。
总体而言,本发明的方面涉及利用如上文所述的特定蒸气和液体流动配置的多阶段生物反应器方法,所述方法产生许多工艺优势,特别是在实现所期望的终产物的高生产率联同相关系统的制造的简单性方面。本领域技术人员在拥有从本公开获得的知识的情况下将认识到可以作出各种改变而不脱离本发明的范围。
Claims (24)
1.一种用于将CO碳源转化成终产物的多阶段方法,所述方法包括:
将气态含CO基质并行地供给到所述多阶段方法的第一生物反应器阶段和至少第二生物反应器阶段中;
将第一阶段液体产物的至少一部分连续地从所述第一生物反应器阶段供给到所述第二生物反应器阶段中;
其中所述第一阶段液体产物包含在所述第一生物反应器阶段中用于代谢CO并且产生所述终产物的CO固定微生物。
2.如权利要求1所述的方法,其中将所述第一阶段液体产物供给到所述第二生物反应器阶段中,而不分离所述CO固定微生物。
3.如权利要求1所述的方法,所述方法包括至少四个生物反应器阶段,其中将所述气态含CO基质并行地供给到所述阶段中,并且将包括所述第一阶段液体产物的液体产物从所述第一生物反应器阶段依次供给到最终生物反应器阶段中,然后从所述最终生物反应器阶段中抽出。
4.如权利要求3所述的方法,其中所述至少四个生物反应器阶段的总CO利用率是至少60%。
5.如权利要求3所述的方法,其中在比大气压高小于200千帕(kPa)的压力操作所述至少四个生物反应器阶段。
6.如权利要求1所述的方法,其中所述终产物是乙醇并且除了乙醇之外,所述CO固定微生物还产生乙酸作为代谢产物。
7.如权利要求6所述的方法,所述方法还包括从所述多阶段方法的最终生物反应器阶段中抽出最终阶段液体产物,其中所述最终阶段液体产物的不含生物质的液体级分包含至少50克/升(g/l)的乙醇。
8.如权利要求7所述的方法,其中所述最终阶段液体产物的不含生物质的液体级分具有至少50:1的乙醇:乙酸重量比。
9.如权利要求1所述的方法,其中所述终产物是选自由以下各项组成的组的生长依赖性产物:异丙醇、丁醇、乙酸盐、丙酮、2-羟基异丁酸以及异丁烯。
10.如权利要求9所述的方法,所述方法还包括从所述多阶段方法的最终生物反应器阶段中抽出最终阶段液体产物,其中所述最终阶段液体产物的不含生物质的液体级分包含至少10克/升(g/l)的异丙醇。
11.如权利要求1所述的方法,其中所述第一生物反应器阶段和所述第二生物反应器阶段具有选自由以下各项组成的组的至少一个可独立控制的工艺操作变量:液体培养基添加速率、气态含CO基质进料速率、反应器温度、反应器pH值、以及其组合。
12.如权利要求1所述的方法,其中所述第一生物反应器阶段和所述第二生物反应器阶段中的至少一个包括生物反应器,所述生物反应器具有小于10:1的它的长度与它的宽度的比率。
13.如权利要求1所述的方法,其中所述第一生物反应器阶段和所述第二生物反应器阶段中的至少一个包括循环回路生物反应器。
14.如权利要求13所述的方法,其中所述循环回路生物反应器在连续液相区域中以内部液体循环操作。
15.如权利要求14所述的方法,其中在所述连续液相区域中,液体在内部提升管中向上流动并且在一个或多个内部下降管中向下流动。
16.如权利要求14所述的方法,其中所述循环回路生物反应器在所述连续液相区域上方的连续气相区域中以逆流的气体流动和液体流动来操作。
17.如权利要求16所述的方法,其中所述连续液相区域在所述循环回路生物反应器的长度的底部75%内。
18.如权利要求16所述的方法,其中所述连续液相区域和所述连续气相区域包括气液接触装置,其中连续液相区域装置不同于连续气相区域装置。
19.如权利要求16所述的方法,其中经由外部再循环回路再循环的液体产物到达所述连续气相区域。
20.如权利要求19所述的方法,其中使所述经由所述外部再循环回路再循环的液体产物通过外部热交换器以控制所述循环回路生物反应器的温度。
21.如权利要求19所述的方法,其中将碱性中和剂添加到所述经由所述外部再循环回路再循环的液体产物中以控制所述循环回路生物反应器的pH值。
22.一种用于将CO转化成乙醇的多阶段生物学方法,所述方法包括:
将气态含CO基质并行地在所述多阶段方法的多个生物反应器阶段之间分配;
将包含一氧化碳营养型微生物的液体产物连续地从第一生物反应器阶段依次供给到下游生物反应器阶段;
从最终生物反应器阶段中抽出最终阶段液体产物,所述最终阶段液体产物具有不含一氧化碳营养型微生物的液体级分,所述液体级分包含至少50克/升(g/l)的乙醇并且具有至少50:1的乙醇:乙酸重量比。
23.如权利要求22所述的方法,所述方法包括至少四个生物反应器阶段。
24.如权利要求22所述的方法,其中所述多个生物反应器阶段中的两个或更多个是单个容器内分开的区段。
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