ES2946180T3 - Procesos de biorreactores de múltiples etapas - Google Patents

Abstract

Se describen procesos y sistemas biológicos de etapas múltiples para convertir una fuente de carbono C1 en productos finales deseados. Los procesos comprenden dividir un sustrato gaseoso que contiene C1, en paralelo, entre múltiples etapas del biorreactor. Los productos líquidos se alimentan sucesivamente, en serie, desde una primera etapa del biorreactor hasta las etapas posteriores del biorreactor. Los carros de operación se simplifican al evitar el requisito de separación de microorganismos y reciclaje en cada etapa. Además, la transferencia de masa vapor-líquido general para las etapas combinadas es muy favorable, lo que conduce a una alta productividad del producto final con una productividad de metabolitos de subproductos comparativamente baja. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Procesos de biorreactores de múltiples etapas

Campo de la invención

Los aspectos de la invención se refieren a procesos para la fermentación microbiana de un sustrato que contiene C1 en productos finales, utilizando múltiples etapas en un biorreactor. En los procesos representativos, el sustrato que contiene C1 se divide entre las etapas para el procesamiento en fase gaseosa en paralelo, mientras que los productos líquidos pasan de una etapa a la siguiente, etapa sucesiva para el procesamiento en serie de la fase líquida.

Descripción de la técnica relacionada

Los problemas ambientales relacionados con las emisiones de gases de efecto invernadero (GEI) de los combustibles fósiles han llevado a un interés creciente en las fuentes de energía renovable. Como resultado, el etanol se está convirtiendo rápidamente en un importante combustible de transporte líquido rico en hidrógeno en todo el mundo. Se espera un crecimiento continuo en el mercado global para la industria del etanol como combustible en el futuro previsible, basado en un mayor énfasis en la producción de etanol en Europa, Japón y Estados Unidos, así como en varias naciones en desarrollo. Por ejemplo, en los Estados Unidos, el etanol se utiliza para producir E10, una mezcla al 10 % de etanol en gasolina. En mezclas E10, el componente de etanol actúa como agente oxigenante, mejorando la eficiencia de la combustión y reduciendo la producción de contaminantes del aire. En Brasil, el etanol satisface aproximadamente el 30 % de la demanda de combustible de transporte, como agente oxigenante mezclado con gasolina y como combustible puro por si mismo. Adicionalmente, la Unión Europea (UE) tiene objetivos obligatorios, para cada una de sus naciones miembros, para el consumo de combustibles de transporte sostenible como el etanol derivado de biomasa.

La gran mayoría del etanol como combustible se produce a través de procesos tradicionales de fermentación a base de levadura que utilizan hidratos de carbono derivados de cultivos, como la sacarosa extraída de la caña de azúcar o el almidón extraído de los cultivos de cereales, como principal fuente de carbono. Sin embargo, el costo de estas materias primas de hidratos de carbono está influenciado por su valor en el mercado para usos competitivos, es decir, como fuentes de alimento tanto para humanos como para animales. Adicionalmente, el cultivo de cultivos productores de almidón o sacarosa para la producción de etanol no es económicamente sostenible en todas las geografías, ya que esto es una función tanto de los valores locales de la tierra como del clima. Por estos motivos, es de particular interés desarrollar tecnologías para convertir recursos de carbono de menor costo y/o más abundantes en etanol combustible. A este respecto, el monóxido de carbono (CO) es uno de los principales subproductos ricos en energía de la combustión incompleta de materiales orgánicos como el carbón, el petróleo y productos derivados del petróleo. Los gases residuales ricos en CO son el resultado de una variedad de procesos industriales. Por ejemplo, la industria del acero en Australia produce y libera a la atmósfera más de 500.000 toneladas métricas de CO al año.

Más recientemente, las alternativas del proceso basadas en microorganismos (bacterias) para producir etanol a partir de CO a escala industrial se han convertido en un tema de interés comercial e inversión. La capacidad de los cultivos de microorganismos para crecer, siendo el CO la única fuente de carbono, fue descubierto por primera vez en 1903. Posteriormente se determinó que esta característica residía en el uso por parte de un organismo de la vía bioquímica de crecimiento autotrófico de la acetil coenzima A (acetil CoA) (también conocida como la vía Woods-Ljungdahl y la vía de la monóxido de carbono deshidrogenasa/acetil CoA sintasa (CODH/ACS)). Un gran número de organismos anaerobios, incluidos los organismos carboxidotróficos, fotosintéticos, metanogénicos y acetogénicos han demostrado desde entonces que metabolizan el CO. Las bacterias anaerobias, como las del género Clostridium, se sabe que producen etanol a partir de CO, CO₂ y H₂ a través de la vía bioquímica de la acetil CoA. Por ejemplo, varias cepas de Clostridiumljungdahlii que producen etanol a partir de gases se describen en los documentos WO 00/68407; EP 1117309 A1; US 5.173.429; US 5.593.886; US 6.368.819; WO 98/00558; y WO 02/08438. La bacteria Clostridium autoethanogenum sp también se sabe que produce etanol a partir de gases (Abrini et al., ARCHIVES OF MICROBIOLOGY 161: 345-351 (1994)).

Debido a que cada enzima de un organismo promueve su conversión biológica designada con una selectividad esencialmente perfecta, las rutas de síntesis microbiana pueden lograr mayores rendimientos con menores costos de energía en comparación con las rutas catalíticas convencionales. Por ejemplo, pueden reducirse los requisitos energéticos para la separación de subproductos, que resultan de reacciones secundarias no selectivas, de los productos deseados. Adicionalmente, los problemas relativos al envenenamiento de los catalizadores, debido a las impurezas en el medio de reacción, se reducen. A pesar de estas aparentes ventajas, sin embargo, la técnica debe abordar ciertos desafíos actualmente asociados con la síntesis microbiana de etanol a partir de CO, particularmente en términos de asegurar que la tasa de producción sea competitiva con otras tecnologías. Al usar CO como su fuente de carbono, las bacterias anaerobias descritas anteriormente producen etanol por fermentación, pero también producen al menos un metabolito, por ejemplo, CO2, metano, n-butanol y/o ácido acético. La formación de cualquiera de estos metabolitos tiene el potencial de afectar significativamente a la productividad y la viabilidad económica general de un proceso determinado, a medida que el carbono disponible se pierde en el(los) metabolito(s) y se compromete la eficiencia de producción del producto final deseado. Adicionalmente, a menos que un metabolito (p. ej., ácido acético) tenga valor por sí en el momento y lugar del proceso de fermentación microbiana, puede plantear un problema de eliminación de residuos. Se analizan varias propuestas para abordar la formación de productos distintos del producto final deseado en la fermentación anaerobia de gases que contienen CO para producir etanol en los documentos WO2007/117157, WO2008/115080 y WO2009/022925.

La tasa de producción de etanol, que es un determinante clave en cuanto a si un proceso de fermentación dado es económicamente atractivo, depende en gran medida del manejo de las condiciones adecuadas para el crecimiento bacteriano. Por ejemplo, se sabe por el documento WO2010/093262 que el sustrato que contiene CO debe proporcionarse a un cultivo microbiano a una velocidad que dé como resultado un crecimiento microbiano óptimo y/o la producción de metabolitos deseada. Si se proporciona sustrato insuficiente, el crecimiento microbiano se ralentiza y los rendimientos del producto de fermentación se desplazan hacia el ácido acético a expensas del etanol. Si se proporciona sustrato en exceso, puede producirse un crecimiento microbiano deficiente y/o muerte celular. En el documento WO2011/002318 se encuentra más información sobre las relaciones entre los parámetros operativos en estos procesos.

El documento US2013/078688 divulga procesos de bioconversión que permiten una alta conversión de sustrato gaseoso que contiene tanto monóxido de carbono como hidrógeno en compuestos oxigenados a través de las rutas de monóxido de carbono e hidrógeno utilizando fermentación anaerobia, profunda, en columna de burbujas de una manera rentable. El documento US 2010/105115 divulga procesos biológicos para producir uno o más productos deseados, incluyendo alcoholes tales como etanol y butanol. Los procesos comprenden realizar primeras y segundas fermentaciones de sustratos en primeros y segundos biorreactores, en donde cada fermentación produce uno o más productos deseados y/o uno o más subproductos que pueden utilizarse en la otra fermentación.

La técnica de los procesos biológicos para producir etanol a partir de CO y, en particular, las corrientes de desechos que contienen CO, como los efluentes gaseosos emitidos en la producción de acero, busca continuamente soluciones que mejoren la economía de los procesos y, por lo tanto, la competitividad de la industria. Según la práctica convencional, la separación y el reciclado de los microorganismos que se utilizan para llevar a cabo la conversión deseada se consideran esenciales para lograr una productividad aceptable en procesos continuos. Sistemas de separación de membrana adecuados, ya sea interna o externa al biorreactor, se sabe que son efectivos para este propósito. Sin embargo, membranas y sus alojamientos asociados, válvulas, instrumentación y los controles aumentan significativamente los costos generales de capital y operación. El cambio de membranas y las opciones de "limpieza in situ" (CIP), ya sea manual o automático, generalmente requieren una cantidad significativa de tiempo del operador, sustancias químicos y calentamiento (en el caso de la operación manual) o un costo de capital prohibitivamente alto (en el caso de operación la automática). Por ejemplo, algunos sistemas de biorreactores han requerido costosas soluciones enzimáticas para limpiar las membranas de reciclado celular, ya que la limpieza simple con solución cáustica (NaOH) ha resultado ser ineficaz en la práctica.

En general, las consideraciones importantes en los procesos biológicos de conversión de CO se relacionan con la búsqueda de mejoras que aumenten la flexibilidad operativa, mejoren la productividad del etanol y la calidad del producto, y/o utilicen CO de manera más eficiente. Lograr incluso avances modestos en cualquiera de estas áreas, sin afectar sustancialmente a los gastos de capital y operativos, puede tener implicaciones significativas en la escala industrial de operación.

Sumario de la invención

Los aspectos de la invención se refieren a mejoras en los procesos biológicos para la generación de productos finales útiles tales como etanol, generado a través de vías metabólicas de un microorganismo fijador de C1 que utiliza, como nutriente, una fuente de carbono C1 de un sustrato que contiene C1, como un gas residual industrial. Los procesos representativos implican tipos alternativos de operación que utilizan múltiples etapas de biorreactores interconectados y, en particular, una operación en la que es posible prescindir del gasto y la complejidad de separar el microorganismo carboxidotrófico para reciclarlo en al menos una de las etapas (por ejemplo, a al menos un biorreactor de las etapas), generalmente la mayoría de las etapas (por ejemplo, todas las etapas excepto la primera etapa y/o la última etapa o final), y a menudo todas las etapas, utilizado en el proceso general. Sorprendentemente, se ha demostrado que el uso de dicho sistema, y particularmente uno en el que un sustrato que contiene C1 se alimenta en paralelo a múltiples biorreactores, mientras que los productos líquidos se alimentan en serie, da como resultado una alta productividad general de etanol con una productividad correspondientemente baja de metabolitos no deseados como el ácido acético. Otras ventajas, incluida la utilización eficiente de la fuente de carbono C1 en general, así como una mayor flexibilidad y control del proceso, también se realizan.

La invención proporciona un proceso de múltiples etapas para convertir una fuente de carbono C1 en un producto final, comprendiendo el proceso alimentar un sustrato gaseoso que contiene C1, en paralelo, a una primera etapa de biorreactor y al menos a una segunda etapa de biorreactor del proceso de múltiples etapas; alimentar al menos una porción de un producto líquido de la primera etapa que comprende un microorganismo fijador de C1 utilizado en la primera etapa de biorreactor para metabolizar la fuente de carbono C1 y generar el producto final, en serie, desde la primera etapa de biorreactor hasta la segunda etapa de biorreactor; en donde al menos una de las etapas primera y segunda de biorreactor comprende un circuito de reciclado de líquido externo.

De esta forma, la composición del producto líquido recibido en cada etapa, o al menos una fracción líquida libre de biomasa (por ejemplo, una fracción del caldo líquido que no contiene microorganismos fijadores de C1) del mismo, puede representar la salida recibida de la etapa anterior aguas arriba. Por lo tanto, la composición del producto líquido recibido en cada etapa, a diferencia de la composición del gas, generalmente no es la misma y, de hecho, puede variar significativamente con respecto a las concentraciones del producto final deseado y otros metabolitos. Por ejemplo, la concentración del producto final deseado puede aumentar progresivamente en al menos algunas, y preferentemente, todas las etapas, en la dirección de las etapas aguas arriba a las sucesivas aguas abajo. Como alternativa o en combinación, otros metabolitos pueden disminuir progresivamente en algunas o todas estas etapas. Las realizaciones de la invención se refieren a procesos de múltiples etapas para convertir una fuente de carbono C1 de un sustrato que contiene C1 en un producto final deseado, en donde el proceso de múltiples etapas aumenta la especificidad del sistema para el producto final deseado.

Adicionalmente, ventajosamente se evita la separación y el reciclado del microorganismo fijador de C1 en al menos una de las etapas de biorreactor, de acuerdo con los procesos representativos descritos anteriormente. Esto contrasta directamente con los procesos biológicos "quimiostáticos" continuos convencionales que se entiende que requieren el reciclado celular para obtener niveles de productividad aceptables. Por consiguiente, el producto líquido alimentado a al menos una etapa (por ejemplo, el producto líquido de la primera etapa que se alimenta a la segunda etapa) puede comprender el microorganismo fijador de C1 utilizado en la etapa de biorreactor aguas arriba anterior (por ejemplo, la primera) y, por ejemplo, que no ha sido separado ni filtrado en esta etapa anterior. Este producto líquido generalmente comprende además medio de cultivo, el producto final deseado y otros metabolitos recibidos de la etapa previa anterior. Por lo tanto, de acuerdo con realizaciones preferidas, el producto líquido de al menos una etapa de biorreactor (por ejemplo, el producto líquido de la primera etapa) se alimenta a la etapa siguiente, sin el gasto y la complejidad adicionales que implica (1) la separación del microorganismo fijador de C1 (p. ej., mediante separación por membrana) seguido de (2) reciclado del microorganismo separado a la misma etapa de la que se retira. En realizaciones preferidas, los procesos se llevan a cabo sin ninguna separación del microorganismo fijador de C1 y/o reciclado a, cualquiera de las etapas de biorreactor, aunque el producto líquido retirado de una etapa final normalmente se separa de esta manera para recuperar el o los productos finales en un líquido libre de células. De acuerdo con algunas realizaciones, por lo tanto, el microorganismo fijador de C1 y/o el medio de cultivo celular pueden separarse del producto líquido de la etapa final y devolverse al proceso (por ejemplo, a una o más de las etapas de biorreactor).

Los sistemas de múltiples etapas que son útiles para llevar a cabo los procesos de la invención pueden comprender una pluralidad de biorreactores. Los biorreactores comprenden una entrada de gas en un primer extremo y una salida de gas en un segundo extremo opuesto al primero, de manera que las entradas y salidas de gas permitan alimentar un sustrato gaseoso que contiene C1 a la pluralidad de biorreactores y eliminar los productos gaseosos, incluida la fuente de carbono C1 sin convertir, en paralelo. Los biorreactores, excluyendo un primer biorreactor y un biorreactor final (es decir, no el biorreactor aguas arriba más alejado, porque no se alimenta con producto líquido de otro biorreactor, o del biorreactor aguas abajo más alejado, porque el producto líquido extraído de este biorreactor no se alimenta a otro biorreactor), comprenden entradas y salidas de líquido separadas, para recibir un producto líquido, incluyendo microorganismos fijadores de C1 (biomasa), de un biorreactor adyacente, aguas arriba y transportar un producto líquido, incluyendo microorganismos fijadores de C1 (células o biomasa), a un biorreactor adyacente aguas abajo en serie.

En general, tanto las entradas como las salidas de líquido están próximas a los primeros extremos (es decir, los extremos en los que se recibe el sustrato gaseoso que contiene C1), de modo que el producto líquido se puede alimentar y retirar de, cerca del fondo de los biorreactores, por ejemplo, dentro del 25 % inferior o del 10 % inferior, de la longitud del reactor. Una salida de producto líquido, para recibir un producto líquido final del biorreactor final, está igualmente próximo al primer extremo del biorreactor final. Al definir ubicaciones de varias características con respecto a la "longitud del reactor", esta longitud se refiere a la de la sección que contiene el contenido del reactor (una mezcla de reactivos y productos de reacción), comúnmente considerado como el "volumen del reactor", o "volumen de trabajo del reactor" y esta longitud no incluye líneas de proceso (por ejemplo, líneas de entrada de alimentación o líneas de salida de producto) que pueden extenderse por encima o por debajo del volumen del reactor, o secciones de una columna u otro recipiente que alberga un reactor pero no contiene ningún contenido del reactor. Por ejemplo, en el caso de un reactor cilíndrico, la longitud del reactor se refiere a la longitud del eje del cilindro. El "10 % inferior" de la longitud del reactor se refiere a un intervalo de alturas, comenzando desde la parte inferior del reactor y extendiéndose hacia arriba por el 10 % de la longitud del reactor. El "10 % superior" de la longitud del reactor se refiere a un intervalo de alturas, comenzando desde la parte superior del reactor y extendiéndose hacia abajo por el 10 % de la longitud del reactor. Igualmente, el "1 %-10 % inferior" de la longitud del reactor se refiere a un intervalo de alturas, comenzando desde una altura que es el 1 % de la longitud del reactor por encima del fondo del reactor y se extiende hacia arriba hasta una altura que es el 10 % de la longitud del reactor por encima del fondo del reactor. El "25 %-45 %" superior de la longitud del reactor se refiere a un intervalo de alturas, comenzando desde una altura que es el 25 % de la longitud del reactor por debajo de la parte superior del reactor y se extiende hacia abajo hasta una altura que es el 45 % de la longitud del reactor por debajo de la parte superior del reactor.

Otras realizaciones de la invención se refieren a procesos biológicos de múltiples etapas para convertir C1 en un producto final deseado. Los procesos comprenden (i) dividir un sustrato gaseoso que contiene C1, en paralelo, entre múltiples etapas de biorreactor del proceso de múltiples etapas y (ii) alimentar sucesivamente productos líquidos que comprenden un microorganismo fijador de C1, en serie, desde una primera etapa de biorreactor hasta etapas de biorreactor aguas abajo en donde al menos una de las etapas de biorreactor comprende un circuito de reciclado de líquido externo. En una última etapa, un producto líquido de la etapa final se extrae de una etapa final de biorreactor. En determinadas realizaciones, el producto líquido de la etapa final se extrae de una fracción líquida libre de biomasa (por ejemplo, una fracción líquida que no contiene el microorganismo/biomasa fijador de C1).

La invención proporciona además un proceso biológico de múltiples etapas para convertir monóxido de carbono (CO) en etanol, comprendiendo el proceso: dividir un sustrato gaseoso que contiene CO, en paralelo, entre una pluralidad de etapas de biorreactor del proceso de múltiples etapas; alimentar sucesivamente productos líquidos que comprenden microorganismos carboxidotróficos, en serie, desde una primera etapa de biorreactor hasta etapas de biorreactor aguas abajo, retirar, desde una etapa final de biorreactor, un producto líquido de etapa final que tiene una fracción líquida que contiene microorganismos no carboxidotróficos que comprende al menos 50 gramos por litro (g/l) de etanol y tiene una relación en peso de etanol:ácido acético de al menos 50:1, en donde al menos una de las etapas de biorreactor del proceso de múltiples etapas comprende un circuito de reciclado de líquido externo.

En ciertas realizaciones, el producto líquido de la etapa final se extrae de una fracción líquida libre de biomasa. Los procesos particulares pueden comprender al menos cuatro etapas de biorreactor. Tales procesos representativos, asociados con esta forma de operación paralela de gas/líquido en serie, pueden lograr ventajosamente altos niveles de productividad con una mínima formación de subproductos. En otras realizaciones, la invención se refiere a un proceso biológico de múltiples etapas para convertir monóxido de carbono en 2,3-butanodiol, con productividad reducida de etanol. En ciertas realizaciones, el microorganismo carboxidotrófico se selecciona del grupo que consiste en Clostridium autoethanogenum, Clostridium ragsdalei y Clostridium Ijungdahlii.

En las realizaciones alternativas, la invención se refiere a un proceso biológico de múltiples etapas para convertir el monóxido de carbono (CO) en productos finales dependientes del crecimiento (por ejemplo, isopropanol). El proceso comprende (i) dividir un sustrato que contiene CO, en paralelo entre múltiples etapas del proceso de múltiples etapas, (ii) alimentar sucesivamente productos líquidos que comprenden microorganismos carboxidotróficos, en serie, desde una primera etapa de biorreactor hasta las etapas de biorreactor aguas abajo. Un producto líquido de etapa final, extraído de una etapa final de biorreactor, o al menos una fracción líquida libre de biomasa del mismo puede comprender al menos aproximadamente 10 g/l de isopropanol. En ciertas realizaciones, el microorganismo carboxidotrófico utilizado en el proceso de producción de isopropanol es una cepa recombinante de Clostridium autoethanogenum que tiene al menos una enzima heteróloga en una ruta de biosíntesis de isopropanol. El uso de un proceso de múltiples etapas de la presente invención proporciona un proceso para aumentar la productividad de los productos finales dependientes del crecimiento en comparación con los sistemas tradicionales de fermentación de dos reactores. De acuerdo con una realización de la invención, los productos finales dependientes del crecimiento se seleccionan del grupo que consiste en isopropanol, butanol, acetona, ácido 2-hidroxibutírico (2-HIBA) e isobutileno.

En general, como se analiza con mayor detalle a continuación, los procesos biológicos de múltiples etapas como se describe en el presente documento pueden mejorar la estabilidad de las operaciones de bioconversión y proporcionar una mayor flexibilidad para adaptar el rendimiento (por ejemplo, títulos de producto final y otros metabolitos) obtenidos en cada etapa para objetivos específicos. Incluso a productividades más bajas dependiendo del volumen del reactor, en relación con los procesos convencionales, los sistemas de construcción y control comparativamente más simples pueden compensar esto de manera efectiva desde un punto de vista económico, a través de reducciones de costos de capital y/u operación que se logran a escala comercial. Adicionalmente, una reducción de la productividad, "por reactor", permite una mayor flexibilidad en términos de dimensiones del biorreactor, de modo que se puedan emplear recipientes relativamente más cortos y más anchos, que tienen dimensiones más acordes con las de los tanques de almacenamiento disponibles. Por ejemplo, los biorreactores de una o más etapas (por ejemplo, al menos una de las etapas primera y segunda de biorreactor, al menos cuatro etapas de biorreactor, o todas las etapas de biorreactor) pueden tener una relación de largo a ancho (por ejemplo, diámetro) de menos de aproximadamente 15:1 (por ejemplo, de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 15:1), como menos de aproximadamente 10:1 (por ejemplo, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 10:1). Una asignación por productividad reducida, a su vez, permite el uso de presiones más bajas en procesos/sistemas como se describe en el presente documento. Por ejemplo, los biorreactores de una o más etapas (por ejemplo, al menos una de las etapas primera y segunda de biorreactor, al menos cuatro etapas de biorreactor, o todas las etapas de biorreactor) pueden funcionar a una presión inferior a aproximadamente 500 kilopascales (kPa) de presión manométrica (es decir, por encima de la presión atmosférica), tal como menos de aproximadamente 200 kPa de presión manométrica, o incluso menos de aproximadamente 100 kPa de presión manométrica. Los procesos y sistemas de múltiples etapas como se describe en el presente documento también pueden lograr ventajosamente una mayor utilización del gas, en relación con tales procesos convencionales, para un coeficiente de transferencia de masa dado.

En los procesos de múltiples etapas, las etapas de biorreactor descritas en el presente documento, o en alguna parte del mismo, pueden ser secciones separadas dentro de un solo recipiente. Por ejemplo, dicho recipiente (que puede ser un tanque estándar de la industria con un volumen de 50.000 a 3.000.000 litros), puede incluir estructuras internas que separan las etapas de biorreactor individuales y dirigen los flujos de vapor y líquido como se describe en el presente documento. Por ejemplo, las estructuras internas se pueden configurar para que fluyan gases y líquidos en paralelo y en serie, respectivamente, a través de las etapas. El uso de etapas de biorreactor dentro de un recipiente puede facilitar ciertas realizaciones operativas descritas en el presente documento, por ejemplo, operación con un flujo compartido de productos gaseosos, incluyendo una fuente de carbono C1 sin convertir, que sale de las etapas de biorreactor. De acuerdo con una realización, las etapas de biorreactor dentro de un recipiente pueden estar orientadas en una relación apilada, siendo la primera etapa de biorreactor la de mayor elevación y la etapa final de biorreactor la de menor elevación, utilizando así la gravedad para facilitar la transferencia de productos líquidos a través de las etapas. Las etapas de biorreactor totales asociadas, que pueden incluir biorreactores, dentro de un solo recipiente puede variar en número, y en realizaciones ilustrativas, un recipiente puede incluir de aproximadamente 4 a aproximadamente 12 etapas de biorreactor. Las estructuras internas pueden incluir tuberías asociadas y/u otros equipos descritos en el presente documento con referencia a las figuras 1 y 2 (por ejemplo, entradas de gas y líquido y sus conexiones, distribuidores de vapor y liquido, tubos ascendentes, tubos descendentes, circuitos de reciclado de líquido externo, entradas para medio de cultivo líquido y otros aditivos, etc.). Por lo tanto, tales estructuras internas pueden proporcionar una comunicación fluida general entre las etapas para lograr las configuraciones de flujo deseadas, incluyendo la circulación interna y/o circulación externa inducida utilizando circuitos de reciclado, como se describe con mayor detalle a continuación, creando de este modo las condiciones hidrodinámicas necesarias para lograr una alta transferencia de masa y mezcla a los caudales de gas diseñados. Dichos recipientes pueden estar equipados con circuitos de circulación de líquido adicionales, externos a todo el recipiente, p. ej., para la circulación de líquido entre las etapas de biorreactor que no son necesariamente adyacentes (es decir, inmediatamente aguas arriba de, o aguas abajo de, uno de otro). En algunas realizaciones, el número total de etapas de biorreactor requeridas para un proceso de conversión biológica dado puede exceder el número de etapas dentro de un recipiente, de modo que el proceso puede utilizar dos o más recipientes, uno o ambos de los cuales contienen una pluralidad (por ejemplo, dos o más) de las etapas de biorreactor.

El uso de múltiples etapas, los procesos biológicos como se describen en el presente documento proporcionan un mayor control sobre los parámetros de fermentación y los controles del proceso. Cada una de las etapas del proceso de múltiples etapas se puede operar en condiciones de proceso variables para proporcionar un resultado final deseado. Por ejemplo, ciertas etapas se pueden operar para promover el crecimiento y otras etapas se pueden optimizar hacia la productividad. El uso de procesos biológicos de múltiples etapas puede dar como resultado mejores títulos de productos, mayor especificidad para los productos finales deseados, absorción de gas mejorada y mayor flexibilidad hacia sustratos que contienen C1 de diversas composiciones.

Estas y otras realizaciones, los aspectos y ventajas relacionados con la presente invención son evidentes a partir de la siguiente descripción detallada.

Breve descripción de los dibujos

Se puede adquirir una comprensión más completa de las realizaciones ilustrativas de la presente invención y las ventajas de la misma haciendo referencia a la siguiente descripción en consideración de las figuras adjuntas, en donde las características similares se identifican con números de referencia similares (por ejemplo, el biorreactor 100a de la figura 1 y el biorreactor 100 de la figura 2).

La figura 1 representa un proceso representativo que utiliza al menos dos biorreactores aguas arriba y dos biorreactores aguas abajo, omitiendo biorreactores intermedios similares por simplicidad.

La figura 2 representa una vista en primer plano de un biorreactor representativo como se muestra en la figura 1, y proporciona detalles adicionales relacionados con las estructuras internas y la circulación de líquidos.

La figura 3 es un gráfico que muestra las concentraciones de etanol y de microorganismos carboxidotróficos, así como los subproductos metabolitos de ácido acético y 2,3-butanodiol, durante un período de operación de 40 días, en muestras tomadas del producto líquido final de un proceso biológico descrito en el presente documento, utilizando seis etapas de biorreactor.

La figura 4 un gráfico de las concentraciones medidas de etanol y los subproductos metabolitos de ácido acético y 2,3-butanodiol, en muestras tomadas de productos líquidos de cada una de las seis etapas de biorreactor, en el día 23 del período de operación de 40 días, para las cuales las concentraciones del producto líquido final se representan en la figura 3.

La figura 5A es un gráfico que muestra el perfil de metabolitos de una fermentación de isopropanol.

La figura 5B es un gráfico que muestra las tasas de productividad de isopropanol.

Las figuras 1-5 deben entenderse como una ilustración de la divulgación y/o los principios implicados. Para facilitar la explicación y comprensión, los esquemas de flujo de proceso simplificados y el equipo se representan en las figuras 1 y 2, y estas figuras no están necesariamente dibujadas a escala. Los detalles incluidas las válvulas, instrumentación y otros equipos y sistemas que no son esenciales para la comprensión de la divulgación no se muestran. Como es evidente para un experto en la materia que tenga conocimiento de la presente divulgación, los métodos para la conversión biológica de sustratos que contienen C1 de acuerdo con otras realizaciones de la invención, tendrán configuraciones y componentes determinados, en parte, por su uso específico.

Descripción detallada

La presente invención se refiere a procesos para producir un producto final deseado, alimentando una fuente de carbono C1 en un sustrato gaseoso que contiene C1 en paralelo a las múltiples etapas de biorreactor que se utilizan, a su vez, para procesar productos líquidos de estas etapas en serie. Durante la operación, cada uno de los biorreactores comprende un medio de cultivo líquido que contiene un microorganismo fijador de C1. Además del producto final deseado, los procesos como se describen en el presente documento generan adicionalmente metabolitos no deseados o menos deseados. Los microorganismos representativos de loa fijación de C1, son los del género Moorella, Clostridia, Ruminococcus, Acetobacterium, Eubacterium, Butyribacterium, Oxobacter, Methanosarcina, Methanosarcina, y Desulfotomaculum. Ejemplos particulares de microorganismos que son Clostridia incluyen C. ljundahlii, C. autoethanogenum, C. ragsdalei, y C. beijerenckei.

Los sustratos representativos que contienen C1 incluyen, en términos generales, cualquier gas que contenga una fuente de carbono C1, en donde al menos una fuente de carbono C1 seleccionada del grupo que consiste en CO, CO₂ y CH4, puede ponerse a disposición de una o más cepas de microorganismos fijadores de C1 para su crecimiento y/o fermentación. Dichos sustratos que contienen C1 preferentemente no incluyen contaminantes en la medida en que tales contaminantes puedan tener un efecto adverso sobre el crecimiento del microorganismo fijador de C1 (por ejemplo, uno o más contaminantes no están presentes en concentraciones o cantidades tales que la tasa de crecimiento se reduce en más del 10 % en un conjunto determinado de condiciones, en comparación con la tasa de crecimiento en las mismas condiciones, pero sin el(los) contaminante(s)).

Los sustratos representativos que contienen C1 como se describe en el presente documento, incluyen ampliamente cualquier fuente de carbono C1. Una fuente de carbono C1 se refiere a una molécula de carbono que sirve como fuente de carbono parcial o única para los microorganismos de la invención. Por ejemplo, una fuente de carbono C1 puede comprender uno o más de Co , CO2, CH4. Preferentemente, la fuente de carbono C1 comprende uno o ambos CO y CO2. El sustrato puede comprender además otros componentes que no sean carbono, como H₂, N₂ o electrones.

El sustrato que contiene C1 puede contener una proporción significativa de CO, preferentemente al menos aproximadamente del 5 % a aproximadamente el 99,5 % de CO por volumen. Dichos sustratos a menudo se producen como productos de desecho de procesos industriales tales como procesos de fabricación de acero o procesos de fabricación de productos no ferrosos. Otros procesos en los que se generan sustratos gaseosos que contienen CO incluyen procesos de refinación de petróleo, procesos de producción de biocombustibles (por ejemplo, procesos de pirólisis y procesos de hidroconversión de ácidos grasos/triglicéridos), procesos de gasificación de carbón y biomasa, procesos de producción de energía eléctrica, procesos de producción de negro de humo, procesos de producción de amoníaco, procesos de producción de metanol y procesos de fabricación de coque. Una serie de efluentes de la industria química, así como gases de síntesis (que contienen CO y H₂) producidos a partir de una variedad de sustratos, también pueden servir como posibles sustratos que contienen CO. Los ejemplos específicos incluyen efluentes de la producción de fosfato y cromato. Ventajosamente, los residuos (por ejemplo, gases residuales) de estos procesos pueden usarse como se describe en el presente documento para la producción beneficiosa de productos finales útiles tales como etanol.

El sustrato y/o la fuente de carbono C1 puede ser o puede derivarse de un gas residual o de escape obtenido como subproducto de un proceso industrial o de alguna otra fuente, como los gases de escape de los automóviles o la gasificación de biomasa. En ciertas realizaciones, el proceso industrial se selecciona del grupo que consiste en la fabricación de productos de metales ferrosos, como la fabricación de una acería, fabricación de productos no ferrosos, procesos de refinación de petróleo, gasificación del carbón, producción de energía eléctrica, producción de negro de carbón, producción de amoníaco, producción de metanol y fabricación de coque. En estas realizaciones, el sustrato y/o la fuente de carbono C1 pueden ser capturados del proceso industrial antes de ser emitidos a la atmósfera, usando cualquier método conveniente.

El sustrato y/o fuente de carbono C1 puede ser o puede derivarse de gas de síntesis, como el gas de síntesis obtenido por gasificación de carbón o residuos de refinería, gasificación de biomasa o material lignocelulósico, o reformado de gas natural. En otra realización, el gas de síntesis puede obtenerse de la gasificación de residuos sólidos urbanos o de residuos sólidos industriales.

En relación con los sustratos y/o fuentes de carbono C1, la expresión "derivado de" se refiere a un sustrato y/o una fuente de carbono C1 que se modifica o mezcla de alguna manera. Por ejemplo, el sustrato y/o la fuente de carbono C1 pueden tratarse para agregar o eliminar ciertos componentes o pueden mezclarse con corrientes de otros sustratos y/o fuentes de carbono C1.

La composición del sustrato puede tener un impacto significativo en la eficiencia y/o el costo de la reacción. Por ejemplo, la presencia de oxígeno (O₂) puede reducir la eficiencia de un proceso de fermentación anaerobia. Dependiendo de la composición del sustrato, puede ser deseable tratar, restregar o filtrar el sustrato para eliminar cualquier impureza no deseada, como toxinas, componentes no deseados, o partículas de polvo, y/o aumentar la concentración de componentes deseables.

El sustrato generalmente comprende al menos una cierta cantidad de CO, tal como aproximadamente 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 % en moles de CO. El sustrato puede comprender una cantidad de CO, tal como de aproximadamente 20-80, 30-70 o 40-60 % en moles de C^o . Preferentemente, el sustrato comprende de aproximadamente 40-70 % en moles de CO (por ejemplo, gas de acería o de alto horno), aproximadamente 20-30 % en moles de CO (por ejemplo, gas de horno de oxígeno básico) o aproximadamente 15-45 % en moles de CO (por ejemplo, gas de síntesis). En algunas realizaciones, el sustrato puede comprender una cantidad relativamente baja de CO, tal como aproximadamente 1-10 o 1-20 % en moles de CO. El microorganismo de la invención normalmente convierte al menos una parte del CO del sustrato en un producto. En algunas realizaciones, el sustrato no comprende nada o sustancialmente nada de CO.

El sustrato puede comprender alguna cantidad de H₂. Por ejemplo, el sustrato puede comprender aproximadamente 1, 2, 5, 10, 15, 20 o 30 % en moles de H₂. En algunas realizaciones, el sustrato puede comprender una cantidad relativamente alta de H₂, tal como aproximadamente 60, 70, 80 o 90 % en moles de H₂. En realizaciones adicionales, el sustrato no comprende nada o sustancialmente nada de H2.

El sustrato puede comprender alguna cantidad de CO2. Por ejemplo, el sustrato puede comprender aproximadamente 1-80 o 1-30 % en moles de CO2. En algunas realizaciones, el sustrato puede comprender menos de aproximadamente 20, 15, 10 o 5 % en moles de CO2. En otra realización, el sustrato no comprende nada o sustancialmente nada de CO2.

Aunque el sustrato es normalmente gaseoso, el sustrato también se puede proporcionar en formas alternativas. Por ejemplo, el sustrato puede disolverse en un líquido saturado con un gas que contiene CO utilizando un generador de dispersión de microburbujas. A modo de ejemplo adicional, el sustrato se puede adsorber sobre un soporte sólido.

Un "microorganismo" es un organismo microscópico, especialmente una bacteria, arquea, virus u hongo. El microorganismo de la invención es normalmente una bacteria. Como se utiliza en el presente documento, la mención de "microorganismo" debe considerarse que abarca "bacteria".

El microorganismo de la invención puede clasificarse adicionalmente en función de las características funcionales. Por ejemplo, el microorganismo de la invención puede ser o puede derivar de un microorganismo fijador de C1, un anaerobio, un acetógeno, un etanológeno, un carboxidotrofo y/o un metanotrofo. La Tabla 1 proporciona una lista representativa de microorganismos e identifica sus características funcionales.

continuación

1 Acetobacterium woodii puede producir etanol a partir de fructosa, pero no de gas.

2 Se ha descrito que Acetobacterium woodii puede crecer en CO, pero la metodología es cuestionable.

3 No se ha investigado si Clostridium magnum puede crecer en CO.

4 Una cepa de Moorella thermoacetica, Moorella sp. HUC22-1, se ha descrito que produce etanol a partir de gas.

5 No se ha investigado si Sporomusa ovata puede crecer en CO.

6 No se ha investigado si Sporomusa silvacetica puede crecer en CO.

7 No se ha investigado si Sporomusa sphaeroides puede crecer en CO.

"C1" se refiere a una molécula de un carbono, por ejemplo, CO, CO2, CH4o CH3OH. "C1-oxigenado" se refiere a una molécula de un carbono que también comprende al menos un átomo de oxígeno, por ejemplo, CO, CO₂ o CH3OH. "Fuente de carbono C1" se refiere a una molécula de carbono que sirve como fuente de carbono parcial o única para el microorganismo de la invención. Por ejemplo, una fuente de carbono C1 puede comprender uno o más de CO, CO2, CH4. Preferentemente, la fuente de carbono C1 comprende uno o ambos CO y CO2. Un "microorganismo fijador de C1" es un microorganismo que tiene la capacidad de producir uno o más productos a partir de una fuente de carbono C1. Normalmente, el microorganismo de la invención es una bacteria fijadora de C1. En una realización preferida, el microorganismo de la invención se deriva de un microorganismo fijador de C1 identificado en la Tabla 1.

Un "anaerobio" es un microorganismo que no requiere oxígeno para crecer. Un anaerobio puede reaccionar negativamente o incluso morir si el oxígeno está presente por encima de cierto umbral. Normalmente, el microorganismo de la invención es un anaerobio. En una realización preferida, el microorganismo de la invención se deriva de un anaerobio identificado en la Tabla 1.

Un "acetógeno" es un microorganismo que produce o es capaz de producir acetato (o ácido acético) como producto de la respiración anaerobia. Normalmente, los acetógenos son bacterias anaerobias obligadas que utilizan la vía de Wood-Ljungdahl como mecanismo principal para la conservación de energía y para la síntesis de acetil-CoA y productos derivados de la acetil-CoA, como el acetato (Ragsdale, Biochim Biophys Acta, 1784: 1873-1898, 2008). Los acetógenos utilizan la vía de la acetil-CoA como (1) mecanismo para la síntesis reductora de acetil-CoA a partir de CO2, (2) aceptador de electrones terminal, proceso de conservación de energía, (3) mecanismo para la fijación (asimilación) de CO₂ en la síntesis de carbono celular (Drake, procariontes acetogénicos, En: The Prokaryotes, 3a edición, p. 354, Nueva York, NY, 2006). Todos los acetógenos naturales son fijadores de C1, anaerobios, autótrofos y no metanotróficos. Normalmente, el microorganismo de la invención es un acetógeno. En una realización preferida, el microorganismo de la invención se deriva de un acetógeno identificado en la Tabla 1.

Un "etanológeno" es un microorganismo que produce o es capaz de producir etanol. Normalmente, el microorganismo de la invención es un etanológeno. En una realización preferida, el microorganismo de la invención se deriva de un etanológeno identificado en la Tabla 1.

Un "autótrofo" es un microorganismo capaz de crecer en ausencia de carbono orgánico. En cambio, los autótrofos usan fuentes de carbono inorgánico, como CO y/o CO2. Normalmente, el microorganismo de la invención es un autótrofo. En una realización preferida, el microorganismo de la invención se deriva de un autótrofo identificado en la Tabla 1.

Un "carboxidotrofo" es un microorganismo capaz de utilizar CO como única fuente de carbono. Normalmente, el microorganismo de la invención es un carboxidotrofo. En una realización preferida, el microorganismo de la invención se deriva de un carboxidotrofo identificado en la Tabla 1.

Un "metanotrofo" es un microorganismo capaz de utilizar metano como única fuente de carbono y energía. En ciertas realizaciones, el microorganismo de la invención se deriva de un metanotrofo.

Mas ampliamente, el microorganismo de la invención puede derivar de cualquier género o especie identificado en la Tabla 1.

En una realización preferida, el microorganismo de la invención se deriva del grupo de Clostridia que comprende la especie Clostridium autoethanogenum, Clostridium jungdahlii y Clostridium ragsdalei. Estas especies fueron descritas y caracterizadas por primera vez por Abrini, Arch Microbiol, 161: 345-351, 1994 (Clostridium autoethanogenum), Tanner, Int J System Bacteriol, 43: 232-236, 1993 (Clostridium ljungdahlii), y Hulinke, el documento WO 2008/028055 (Clostridium ragsdalei).

Estas tres especies tienen muchas similitudes. En particular, estas especies son todos miembros fijadores de C1, anaerobios, acetogénicos, etanologénicos y carboxidotróficos del género Clostridium. Estas especies tienen genotipos y fenotipos similares y modos de conservación de energía y metabolismo fermentativo. Además, estas especies se agrupan en el grupo I de homología de ARNr clostridial con ADN de ARNr 16S que es más del 99 % idéntico, tienen un contenido de ADN G C de aproximadamente 22-30 % en moles, son grampositivas, tienen morfología y tamaño similares (células de crecimiento logarítmico entre 0,5-0,7 x 3-5 |jm), son mesófilos (crecen de manera óptima a 30­ 37 °C), tienen intervalos de pH similares de aproximadamente 4-7,5 (con un pH óptimo de aproximadamente 5,5-6), carecen de citocromos y conservan energía a través de un complejo Rnf. Asimismo, en estas especies se ha demostrado la reducción de ácidos carboxílicos a sus correspondientes alcoholes (Perez, Biotechnol Bioeng, 110:1066-1077, 2012). Es importante destacar que, estas especies también muestran un fuerte crecimiento autótrofo en gases que contienen CO, producen etanol y acetato (o ácido acético) como principales productos de fermentación, y producen pequeñas cantidades de 2,3-butanodiol y ácido láctico en ciertas condiciones.

Sin embargo, estas tres especies también muestran una serie de diferencias. Estas especies fueron aisladas de diferentes fuentes: Clostridium autoethanogenum de tripa de conejo, Clostridium ljungdahlii de residuos de corral de pollos y Clostridium ragsdalei de sedimentos de agua dulce. Estas especies difieren en la utilización de varios azúcares (por ejemplo, ramnosa, arabinosa), ácidos (por ejemplo, gluconato, citrato), aminoácidos (por ejemplo, arginina, histidina), y otros sustratos (por ejemplo, betaína, butanol). Además, estas especies difieren en la auxotrofia de ciertas vitaminas (por ejemplo, tiamina, biotina). Estas especies muestran diferencias en las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de los genes y proteínas de la ruta de Wood-Ljungdahl, aunque se ha observado que la organización general y el número de estos genes y proteínas es el mismo en todas las especies (Kopke, Curr Opin Biotechnol, 22: 320-325, 2011).

Así, en resumen, muchas de las características de Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii o Clostridium ragsdalei no son específicos de esa especie, pero son características bastante generales para este grupo de miembros fijadores de C1, anaerobios, acetogénicos, etanologénicos y carboxidotróficos del género Clostridium. Sin embargo, ya que estas especies son, de hecho, distintas, la modificación o manipulación genética de una de estas especies puede no tener un efecto idéntico en otra de estas especies. Por ejemplo, se pueden observar diferencias en el crecimiento, el rendimiento o la producción del producto.

El microorganismo de la invención también puede derivar de un aislado o mutante de Clostridium autoethanogenum, Clostridium jungdahlii o Clostridium ragsdalei. Los aislados y mutantes de Clostridium autoethanogenum incluyen JA1-1 (DSM10061) (Abrini, Arch Microbiol, 161: 345-351,1994), LBS1560 (DSM19630) (WO 2009/064200) y LZ1561 (DSM23693). Los aislados y mutantes de Clostridium ljungdahlii incluyen ATCC 49587 (Tanner, Int J Syst Bacteriol, 43: 232-236, 1993), PETCT (DSM13528, ATCC 55383), ERI-2 (ATCC 55380) (US 5.593.886), C-01 (ATCC 55988) (US 6.368.819), O-52 (ATCC 55989) (US 6.368.819), y OTA-1 (Tirado-Acevedo, Production of bioethanol from synthesis gas using Clostridium ljungdahlii, Tesis doctoral, North Carolina State University, 2010). Los aislados y mutantes de Clostridium ragsdalei incluyen PI 1 (ATCC BAA-622, ATCC PTA-7826) (WO 2008/028055).

El microorganismo de la invención se puede cultivar para producir uno o más productos. Por ejemplo, Clostridium autoethanogenum produce o puede modificarse para producir etanol (WO 2007/117157), acetato (WO 2007/117157), butanol (WO 2008/115080 y WO 2012/053905), butirato (WO 2008/115080), 2,3-butanodiol (WO 2009/151342), lactato (WO 2011/112103), buteno (WO 2012/024522), butadienos (WO 2012/024522), metiletilcetona (2-butanona) (WO 2012/024522 y WO 2013/185123), etileno (WO 2012/026833), acetona (WO 2012/115527), isopropanol (WO 2012/115527), lípidos (WO 2013/036147), 3-hidroxipropionato (3-HP) (WO 2013/180581), isopreno (WO 2013/180584), ácidos grasos (WO 2013/191567), 2-butanol (WO 2013/185123), 1,2-propanodiol (WO 2014/0369152) y 1-propanol (WO 2014/0369152). Además de uno o más productos objetivo, el microorganismo de la invención también puede producir etanol, acetato y/o 2,3-butanodiol. En ciertas realizaciones, la propia biomasa microbiana puede considerarse un producto.

En el contexto de un metabolito ácido que es el ácido acético, la expresión "ácido acético" o el término "acetato" se refieren al acetato total presente en el medio de cultivo, ya sea en su forma aniónica (disociada) (es decir, como ion acetato o CH3COO-) o en forma de ácido acético molecular libre (CH3COOH), dependiendo la proporción de estas formas del pH del sistema. Como se describe a continuación, se puede usar un agente neutralizante básico como hidróxido de sodio acuoso (NaOH) para controlar el pH del medio de cultivo en un biorreactor dado (por ejemplo, a un valor de punto de ajuste de pH que puede ser cualquier valor de pH específico entre pH=4,5 y pH=8,0), neutralizando el ácido acético. Los intervalos de pH representativos en los que se mantienen los biorreactores para llevar a cabo los procesos descritos en el presente documento son de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 8,0, tal como de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,5.

"Producto líquido", como se utiliza en el presente documento, se refiere a una corriente de líquido que se alimenta a al menos una etapa del proceso de múltiples etapas (por ejemplo, un producto líquido de primera etapa que se alimenta a una segunda etapa). El producto líquido contiene (i) medio de cultivo que contiene microorganismos fijadores de C1, (ii) producto final deseado y (iii) otros metabolitos. El producto líquido puede contener además un sustrato que contiene C1 disuelto. El "producto líquido de la etapa final", como se utiliza en el presente documento, es un producto líquido extraído de la etapa final del reactor de un proceso de múltiples etapas. El producto líquido de la etapa final normalmente se extrae de una fracción líquida de porción libre de biomasa de la etapa final.

"Productos finales" o "productos finales deseados" como se utiliza en el presente documento se refiere a metabolitos producidos por los microorganismos de la invención. Los microorganismos de la invención pueden cultivarse para producir uno o más productos seleccionados del grupo que consiste en etanol, acetato, butanol, butirato, 2,3-butanodiol, lactato, butano, butadieno, metiletilcetona (2-butanona), etileno, acetona, isopropanol, lípidos, 3-hidroxipropionato (3-HP), isopreno, ácidos grasos, 2-butanol, 1,2-propanodiol y 1-propanol. Los "productos dependientes del crecimiento" como se utiliza en el presente documento se refieren a metabolitos que presentan una tasa de producción que es directamente proporcional a la tasa de producción de biomasa. Los ejemplos de productos dependientes del crecimiento incluyen, pero sin limitación, isopropanol, acetato, acetona, ácido 2-hidroxibutírico (2-HIBA) e isobutileno.

Uno de los beneficios del proceso del reactor de múltiples etapas es la capacidad de adaptar el proceso de fermentación a al menos un producto final deseado. Se entendería, que dependiendo de los parámetros de proceso proporcionados, un producto final deseado en un proceso de fermentación, puede ser un metabolito no deseado en un proceso de fermentación diferente operado en condiciones de proceso diferentes. Por ejemplo, en un proceso de varias etapas dirigido a la producción de etanol, el etanol es un producto final deseado, sin embargo, en un proceso de varias etapas dirigido a la producción de isopropanol, el isopropanol es el producto final deseado y el etanol es un metabolito subproducto.

Como se describe a continuación, un tipo específico de biorreactor que es particularmente útil en la práctica de la presente invención es un reactor de circuito circulante que se basa en un gradiente de densidad entre una sección de densidad relativamente baja dentro de un tubo ascendente y una sección de densidad relativamente alta dentro de uno o más, tubos de bajada internos o externos. Tanto la sección de subida como la de bajada incluyen un medio de cultivo líquido en una zona de fase líquida continua, pero el sustrato gaseoso que contiene CO se distribuye normalmente (por ejemplo, se rocía) en la parte inferior de la sección de subida. Las burbujas de gas ascendentes se limitan a esta sección durante su movimiento ascendente a través de la zona de fase líquida continua, hasta que cualquier gas no consumido y no disuelto se libere en una zona de fase gaseosa continua (es decir, espacio de vapor o espacio de cabeza) por encima del nivel del líquido. La circulación del líquido hacia abajo, a través de un tubo descendente de líquido interno o externo, puede ser inducida o asistida por una bomba de circuito. En algunos casos, sin embargo, no se usa una bomba de circuito para al menos uno de la pluralidad de biorreactores, y a menudo no se usa una bomba de circuito para la mayoría o incluso para todos los biorreactores, confiando así únicamente en la circulación inducida por la densidad y conservando ventajosamente los costes de energía.

El término "biorreactor", así como cualquier biorreactor que pueda incluirse como parte de una "etapa de biorreactor", no se limita a un reactor de circuito circulante, sino que incluye cualquier recipiente adecuado, o sección dentro de un recipiente, para mantener un volumen líquido de medio de cultivo con microorganismo carboxidotrófico que pueda ser utilizado para llevar a cabo los procesos biológicos descritos en el presente documento, que también pueden denominarse procesos de fermentación en la medida en que generalmente se llevan a cabo de forma anaerobia. Los tipos particulares de biorreactores pueden incluir cualquier recipiente adecuado para el contacto de dos fases (gaslíquido), por ejemplo, reactores de flujo a contracorriente (por ejemplo, con una fase de vapor que fluye hacia arriba y una fase líquida que fluye hacia abajo) o reactores de flujo a favor de la corriente (por ejemplo, con fases gaseosas y líquidas que fluyen hacia arriba). En tales recipientes de contacto de dos fases, es posible que la fase líquida sea la fase continua, como en el caso de las burbujas de gas que fluyen a través de una columna de líquido en movimiento. Por otra parte, es posible que la fase de vapor sea la fase continua, como en el caso de un líquido disperso (por ejemplo, en forma de gotas) que fluyen a través de un espacio de vapor. En algunas realizaciones, descritas más detalladamente a continuación, pueden usarse diferentes zonas de un biorreactor para contener una fase líquida continua y una fase gaseosa continua.

Los ejemplos específicos de biorreactores incluyen reactores de tanque agitado continuo (CSTR), reactores de células inmovilizadas (ICR), reactores de lecho de goteo (TBR), reactor de biopelícula de lecho móvil (MBBR), columnas de burbujas, fermentadores de levantamiento artificial por gas y reactores de membrana como los biorreactores de membrana de fibra hueca (HFMBR). Los biorreactores adecuados pueden incluir mezcladores estáticos u otros recipientes y/o dispositivos (por ejemplo, torres o disposiciones de tuberías), adecuados para poner en contacto el sustrato gaseoso que contiene C1 con el medio de cultivo bacteriano líquido (por ejemplo, con cinéticas de disolución y transporte de masa favorables para llevar a cabo la conversión biológica). Las expresiones "pluralidad de biorreactores" o biorreactores que pueden incluirse en una "pluralidad de etapas de biorreactor" pretenden incluir biorreactores de más de un solo tipo, aunque en algunos casos la pluralidad de biorreactores puede ser de un solo tipo (por ejemplo, reactores de circuito circulante).

Algunas corrientes de proceso adecuadas, parámetros operativos y equipo para su uso en los procesos biológicos descritos en el presente documento se describen en el documento US2011/0212433.

La presente invención está más particularmente asociada con el descubrimiento de procesos biológicos para convertir fuentes de carbono C1 en productos finales valiosos, que implican configuraciones de procesamiento de líquidos en serie y gas en paralelo, como se describe en el presente documento, utilizando una pluralidad de etapas de biorreactor. Ventajosamente, se pueden evitar uno o más sistemas de membranas para la separación de células (microorganismos o biomasa) y el reciclado en una etapa de biorreactor determinada, logrando al mismo tiempo una alta productividad general (por ejemplo, más de dos o más biorreactores) del producto final deseado con una formación general muy baja de subproductos.

En ejemplos particulares, la invención está asociada con procesos para convertir CO en etanol, utilizando un proceso de múltiples etapas como se describe en el presente documento. En ciertas realizaciones, el microorganismo fijador de C1 es un microorganismo carboxidotrófico. Más específicamente, el microorganismo carboxidotrófico se selecciona del grupo que consiste en Clostridium autoethanogenum, Clostridium ragsdalei y Clostridium Ijungdahlii. En realizaciones particulares, el microorganismo carboxidotrófico es Clostridium autoethanogenum cepa DSM23693. Concentraciones representativas de etanol en un producto líquido de etapa intermedia o en un producto líquido de etapa final, extraído de una etapa de biorreactor colocada aguas abajo de otras etapas (por ejemplo, la etapa final de biorreactor) son generalmente de al menos aproximadamente 40 gramos por litro (gramos/litro o g/l) (por ejemplo, de aproximadamente 40 a aproximadamente 95 g/l), normalmente al menos aproximadamente 50 g/l (por ejemplo, de aproximadamente 50 a aproximadamente 80 g/l), y a menudo al menos aproximadamente 60 g/l (por ejemplo, de aproximadamente 60 a aproximadamente 75 g/l). Las proporciones ponderales representativas de etanol:ácido acético en tal producto líquido de etapa intermedia o producto líquido de etapa final son generalmente al menos aproximadamente 50:1 (por ejemplo, de aproximadamente 50:1 a aproximadamente 1000: 1), normalmente al menos aproximadamente 75:1 (por ejemplo, de aproximadamente 75:1 a aproximadamente 500:1), y a menudo al menos aproximadamente 100:1 (por ejemplo, de aproximadamente 100:1 a aproximadamente 250:1). Estas características del producto líquido pueden referirse, más particularmente, al producto líquido extraído de un biorreactor de etapa intermedia o del biorreactor de etapa final, y después de una separación (por ejemplo, filtración por membrana) para eliminar el microorganismo carboxidotrófico (células o biomasa). En general, los métodos analíticos (por ejemplo, cromatógrafo de gases (GC) o cromatografía líquida de alta presión, HPLC) utilizados para determinar las concentraciones de metabolitos requieren muestras libres de células.

Además de lograr una alta productividad general de etanol con una mínima formación general de subproductos, Los procesos de múltiples etapas como se describe en el presente documento pueden proporcionar además una utilización de CO general favorable. La utilización total de CO se refiere al porcentaje de CO que se introduce en el proceso de múltiples etapas (por ejemplo, la entrada total de CO a los biorreactores) y se utiliza en la conversión a los productos deseados (por ejemplo, etanol) y otros metabolitos del microorganismo. Si la composición combinada de todas las corrientes de gas que salen del proceso (es decir, los productos gaseosos) se conoce o se puede calcular (por ejemplo, basado en los caudales y las composiciones de las corrientes de gas individuales que salen de cada uno de los biorreactores utilizados), entonces la utilización total de CO se puede calcular como:

1 -(tasa de CO que sale del proceso de múltiples etapas)/(tasa de entrada de CO al proceso de múltiples etapas)

La utilización total de CO se determina "por pasada" o "una vez pasado", sin tener en cuenta el uso del reciclado de productos gaseosos (y el gasto adicional) que puede proporcionar valores de utilización total más altos. De acuerdo con realizaciones representativas, la utilización de CO por el microorganismo carboxidotrófico es generalmente al menos aproximadamente el 35 % (por ejemplo, de aproximadamente el 35 % a aproximadamente el 85 %), normalmente al menos aproximadamente el 50 % (por ejemplo, de aproximadamente el 50 % a aproximadamente el 80 %), y a menudo al menos aproximadamente el 60 % (por ejemplo, de aproximadamente el 60 % a aproximadamente el 75 %). En algunos casos, la utilización de CO puede ser de al menos un 70 %.

De acuerdo con una realización de la invención, los parámetros de fermentación del proceso de múltiples etapas se ajustan para aumentar la producción de al menos un producto dependiente del crecimiento. En una realización, los parámetros de fermentación del proceso de múltiples etapas se ajustan para aumentar la especificidad del proceso para el isopropanol. En ejemplos particulares, la invención está asociada con procesos para convertir CO en isopropanol, utilizando un proceso de múltiples etapas como se describe en el presente documento. En ciertas realizaciones, el microorganismo fijador de C1 es una cepa recombinante de Clostridium autoethanogenum. En determinadas realizaciones, el microorganismo recombinante está adaptado para expresar o sobreexpresar al menos una enzima de la ruta de biosíntesis de isopropanol.

Las realizaciones de la presente invención se refieren a métodos para aumentar la productividad de metabolitos que presenten una tasa de producción que es directamente proporcional a la tasa de producción de biomasa (por ejemplo, productos dependientes del crecimiento). Como se demuestra en las Figuras 5A y 5B, la tasa de producción de acetona y/o isopropanol está asociada a la fase de crecimiento de la fermentación. Como se demuestra en los gráficos, la figura 5A muestra una fuerte correlación entre las concentraciones de acetato e isopropanol en un proceso de fermentación, en un CSTR. Las concentraciones de acetato e isopropanol aumentan durante la fase de crecimiento inicial de la fermentación (días 1 y 2). A medida que la fase de crecimiento comienza a nivelarse, descienden las concentraciones de acetato e isopropanol. La figura 5B muestra la relación entre la productividad de isopropanol y la tasa de crecimiento. Está claramente demostrado que el isopropanol alcanza su mayor productividad a la mayor tasa de crecimiento.

Se ha demostrado que la enzima CtfAB cataliza la formación de acetoacetato mediante la transferencia de la fracción CoA de la acetoacetil-CoA al acetato, lo que conduce a la formación de acetoacetato y acetil-CoA. La actividad de esta enzima depende de la disponibilidad de acetato. Se ha descrito que los valores de Km de CtfAB para el acetato oscilan entre 24 mM (1,4 g/l) y 1200 mM (71 g/l). El valor de Km es la concentración de sustrato a la que la enzima funciona a la mitad de su velocidad máxima. Por lo tanto, para que CtfAB esté activa a la mitad de su velocidad máxima, se requiere entre 1,4-71 g/l de acetato. Los inventores estiman que se requieren al menos 14 g/l de acetato en la célula, para asegurar que el acetato no sea el sustrato limitante en un proceso de fermentación de isopropanol.

El proceso de biorreactor de múltiples etapas, como lo proporciona la presente invención proporcionan una mayor adaptabilidad del proceso. Al ajustar los parámetros de proceso a varias etapas del proceso de múltiples etapas, el resultado deseado puede variar. Por ejemplo, el proceso de múltiples etapas se puede adaptar para tener una mayor especificidad de producto hacia los productos finales deseados (por ejemplo, etanol o 2,3-butanodiol, o productos dependientes del crecimiento como el isopropanol). Los ejemplos de parámetros del proceso que se pueden controlar o ajustar a lo largo del proceso del biorreactor de múltiples etapas incluyen la composición del sustrato que contiene C1, los caudales de sustrato que contienen C1, la temperatura, la presión, las tasas de dilución bacteriana y la composición de los medios de cultivo líquidos.

Los ejemplos de manipulaciones adecuadas incluyen, proporcionar sustrato que contiene C1 a diferentes etapas del proceso de múltiples etapas a diferentes caudales, proporcionar sustratos que contienen C1 que tienen una composición variable para diferentes etapas del proceso de múltiples etapas, proporcionar medios de cultivo líquidos que tengan una composición variable para las diferentes etapas del proceso de múltiples etapas (por ejemplo, proporcionar un medio de cultivo líquido que tenga una composición limitada para al menos las etapas del proceso de múltiples etapas), alterar la temperatura entre diferentes etapas de un sistema de múltiples etapas (por ejemplo, disminuir la temperatura desde la primera etapa del reactor y las etapas posteriores del reactor), alterar la tasa de dilución bacteriana entre las etapas del proceso del reactor de múltiples etapas), alterar la tasa de mezcla dentro de cada etapa del proceso de múltiples etapas (por ejemplo, alterando la velocidad de la bomba de los dispositivos de distribución de líquidos, o modificando el diseño o las dimensiones internas del reactor).

Es importante destacar que, como se ha descrito anteriormente, los parámetros de rendimiento anteriores se pueden lograr en procesos de biorreactores de múltiples etapas en los que no es necesario separar y reciclar microorganismos carboxidotróficos que se extraen en el producto líquido de un biorreactor (aguas arriba) y se alimentan a otro biorreactor (aguas abajo), como se realiza en los procesos de conversión biológica continua convencionales. En general, por lo tanto, el producto líquido extraído de una etapa de biorreactor corriente arriba y alimentado a una etapa de biorreactor determinada puede comprender microorganismos carboxidotróficos utilizados en la etapa de biorreactor corriente arriba (anterior), ya que este microorganismo no se separa de uno o más, y preferentemente de todos, los productos líquidos que se transfieren de una etapa a la siguiente en serie. Los productos líquidos que se alimentan a una etapa de biorreactor determinada generalmente comprenden además medio de cultivo, el producto final deseado y otros metabolitos recibidos de la etapa anterior (aguas arriba).

Por lo tanto, de acuerdo con las realizaciones descritas en el presente documento que evitan ventajosamente el uso de la separación y el reciclado de células convencionales (por ejemplo, sistemas de membrana), el producto líquido extraído de una etapa de biorreactor corriente arriba no se somete a la separación de microorganismos carboxidotróficos y al reciclado del microorganismo carboxidotrófico separado a la etapa de biorreactor corriente arriba de la que se extrajo. Este rasgo distintivo de los procesos y el sistema descritos en el presente documento, sin embargo, no excluye el uso de varios pasos intermedios, después de la extracción del producto líquido de una etapa anterior y antes de alimentarlo a una etapa de biorreactor determinada, pasos que pueden o no afectar a la composición del producto líquido. Dichos pasos intermedios incluyen, por ejemplo, (i) separar una porción del producto líquido (por ejemplo, con fines de muestreo), opcionalmente en combinación con la filtración de la porción separada (por ejemplo, según sea necesario para realizar un método analítico), (ii) mezclar el producto líquido (por ejemplo, con medio de cultivo, nutrientes particulares o aditivos de proceso tales como tensioactivos) y/o (iii) hacer reaccionar el producto líquido (por ejemplo, con agente neutralizante, como NH4OH o NaOH, para aumentar el pH). En algunas realizaciones, sin embargo, el producto líquido extraído de una etapa de biorreactor determinada puede alimentarse a una etapa de biorreactor determinada sin pasar por (i), (ii) y/o (iii), descritas anteriormente, o sin someterse a ninguna combinación de estos.

La figura 1 representa un proceso de bioconversión de múltiples etapas representativo de acuerdo con una realización particular de la presente divulgación, que comprende al menos cuatro etapas interconectadas de biorreactor (10a, 10b,... 10y, 10z), utilizándose la línea discontinua entre la segunda y la tercera etapas (10a, 10y) para indicar que pueden incorporarse una o más etapas intermedias adicionales en un sistema de múltiples etapas de manera similar y con equipos y conexiones similares. Como se describe más detalladamente a continuación, el sustrato gaseoso que contiene C1 se puede alimentar en paralelo a las etapas, mientras que los productos líquidos, que pueden incluir biomasa, pueden alimentarse sucesivamente de una primera etapa de biorreactor (10a) a una etapa final de biorreactor (10z), del cual se puede retirar un producto líquido de la etapa final, que tenga las características representativas en este producto líquido, o al menos en una fracción libre de biomasa del mismo, como se ha descrito con anterioridad.

De acuerdo con procesos representativos, el sustrato gaseoso que contiene C1 se alimenta a las etapas de biorreactor a través de las entradas de gas (12a, 12b, 12y, 12z) colocadas cerca de los extremos inferiores de los biorreactores (100a, 100b, 100y, 100z) que se extienden verticalmente de cada etapa de biorreactor. Por ejemplo, las entradas de gas pueden extenderse en sus respectivos biorreactores dentro del 25 % inferior, y preferentemente dentro del 10 % inferior, de la longitud de sus respectivos biorreactores. Las entradas de gas normalmente se extenderán a sus respectivos biorreactores, a dispositivos de distribución de gas que pueden disponerse centralmente dentro de los biorreactores a una altura que corresponde generalmente a estos porcentajes de longitud del reactor. Los dispositivos particulares de distribución de gas incluyen rociadores (14a, 14b, 14y, 14z), con los que las entradas de gas pueden estar en comunicación fluida, dentro de uno o más de los biorreactores, próximos a sus respectivos primeros extremos. Los productos gaseosos, incluida la fuente de carbono C1 sin convertir y cualquier impureza gaseosa del sustrato que contiene C1 (por ejemplo, H₂), que no se utilizan en la reacción de bioconversión, se retiran de cada biorreactor y salen por las salidas de gas (16a, 16b, 16y, 16z) colocadas cerca de los extremos superiores de los biorreactores, opuestos a los extremos inferiores. Las salidas de gas pueden extenderse en sus respectivos biorreactores dentro del 25 % superior, y preferentemente dentro del 10 % superior, de la longitud de sus respectivos biorreactores, o de lo contrario podrán extraerse productos gaseosos de la parte superior de sus respectivos biorreactores, sin que las salidas de gas se extiendan a sus respectivos biorreactores.

Los biorreactores intermedios (100b, 100y) cada uno incluye entradas de líquido (18b, 18y) y salidas de líquido (20b, 20y) que pueden recibir el producto líquido extraído del biorreactor aguas arriba inmediatamente adyacente y transportar el producto líquido al biorreactor aguas abajo inmediatamente adyacente. Por ejemplo, el biorreactor 100b de la segunda etapa tiene una entrada de líquido 18b para recibir el producto líquido retirado del biorreactor 100a de la primera etapa (por ejemplo, a través de su salida de líquido 20a) y salida de líquido 20b para transportar el producto líquido a un biorreactor (no mostrado) de una tercera etapa (por ejemplo, a través de su entrada de líquido, que no se muestra). El biorreactor 100a, (es decir, el biorreactor de la primera etapa 10a) no tiene un biorreactor aguas arriba, y por lo tanto carece de una entrada de líquido que es específicamente para recibir el producto líquido de un biorreactor adyacente aguas arriba. El biorreactor 100z (es decir, el biorreactor de la etapa final 10z) no tiene un biorreactor aguas abajo y, por lo tanto, carece de una salida de líquido específicamente para transportar el producto líquido a un biorreactor adyacente, aguas abajo. Sin embargo, el biorreactor final 100z incluye una salida de producto líquido 50 para extraer un producto líquido de etapa final, que, por ejemplo, tiene las características representativas en términos de su composición, como se ha descrito con anterioridad. La transferencia de producto líquido (o "caldo") hacia/desde etapas sucesivas a través de entradas y salidas (20a...20y y 18a... 18z) puede ocurrir a través de tuberías abiertas de diámetro pequeño (por ejemplo, que tienen diámetros interiores de aproximadamente 1 mm a aproximadamente 12 mm) en comunicación fluida con estas entradas y salidas.

Como en el caso de las salidas de líquido (20b, 20y) de biorreactores de etapas intermedias, la salida de producto líquido 50 del biorreactor 100z de la etapa final está situada próxima al extremo inferior del biorreactor. Tras su extracción del biorreactor 100z, el producto líquido de la etapa final que se extrae en la salida de producto líquido 50 puede pasar a, y opcionalmente extenderse por encima, altura h, correspondiente al nivel del líquido de trabajo, sin gas (es decir, el nivel de líquido que existiría sin retención de gas). Es decir, la elevación más alta E hasta la que se extiende el producto líquido de la etapa final puede estar en o por encima de la altura H. La altura H puede ser ajustable y puede corresponder sustancialmente a la altura H del interruptor de sifón 75 u otro tipo de punto de extracción de líquido. En la realización de la figura 1, por lo tanto, la salida de producto líquido 50 está en comunicación fluida con el interruptor de sifón 75 que es ajustable en altura, respecto a los biorreactores (100a, 100b... 100y, 100z) del proceso de varias etapas. La elevación E y la altura H pueden regularse para gobernar el nivel de líquido o cabeza hidráulica del biorreactor 100z de la etapa final, y preferentemente de otros biorreactores, en la medida en que puedan estar unidos hidráulicamente, sin interrupción de una condición de lleno de líquido (o fase líquida continua) en las entradas y salidas de líquido (20a...20y y 18a... 18z) transfiriendo producto líquido en serie de una etapa a la siguiente. Por lo tanto, la elevación E y/o la altura H pueden regir el nivel de líquido en uno o más, y preferentemente en todos, los biorreactores (100a... 100z), y en particular pueden regir los niveles de interfaces gas/líquido (22a...22z) en sus respectivos biorreactores.

En la realización específica representada en la figura 1, las entradas de líquido (18b, 18y) y salidas de líquido (20b, 20y) se colocan preferentemente en una sección de reposo por debajo de las respectivas entradas de gas (12b, 12y) y los rociadores (14b, 14y), para permitir que el líquido sea alimentado y extraído de, esta sección o ubicación del reactor de una etapa de biorreactor determinada. También es posible, sin embargo, que las entradas y salidas se ubiquen en otros lugares a lo largo de sus respectivos biorreactores, dependiendo de las ubicaciones deseadas para la alimentación y extracción de productos líquidos. En una realización alternativa, por ejemplo, las salidas de líquido pueden colocarse en o cerca de los niveles de las interfaces gas/líquido (22a, 22b, 22y, 22z), de no ser así, pueden interrumpir el efecto de sifón o el estado de lleno de líquido entre las etapas de biorreactor, para permitir el control independiente del nivel de líquido en uno o más biorreactores.

Como también se muestra en la figura 1, uno o más, por ejemplo todos, los biorreactores (100a, 100b... 100y, 100z) pueden incluir circuitos de reciclado de líquido externo (25a, 25b ... 25y, 25z) (es decir, externos a sus respectivos biorreactores) para mejorar la mezcla/uniformidad dentro de un biorreactor dado y/o mejorar la tasa de transferencia de masa vapor-líquido. Utilizando circuitos de reciclado de líquido externo (25a, 25b ...25y, 25z), el producto líquido, incluidos el medio de cultivo y el microorganismo fijador de C1, pueden ser extraídos de una sección inferior de un biorreactor dado (por ejemplo, desde dentro del 10 % inferior de la longitud del biorreactor; desde debajo de los dispositivos de distribución de gas, como los rociadores (14a, 14b, 14y o 14z); y/o por debajo de las entradas de líquido o salidas de líquido) y reciclado externamente al biorreactor, a una sección superior del biorreactor (por ejemplo, dentro del 10 % superior del biorreactor y/o a las interfaces gas/líquido anteriores (22a, 22b, 22y, o 22z) que delimitan los límites entre una zona de fase gaseosa continua y una zona de fase líquida continua). Los circuitos de reciclado de líquido del reactor externo pueden incluir las respectivas bombas de reciclado de líquido externo (30a, 30b, 30y, 30z) para proporcionar la circulación del líquido externo a la velocidad deseada, por ejemplo, en una compensación óptima entre el uso de energía y la mejora de la tasa de transferencia de masa.

Convenientemente, los circuitos de reciclado de líquido externo (25a, 25b...25y, 25z) pueden proporcionar ubicaciones para el muestreo/análisis de líquidos del biorreactor y también pueden configurarse para el control del biorreactor. Por ejemplo, los biorreactores 100a y 100b de las etapas primera y segunda incluyen los respectivos circuitos de reciclado de líquido externo 25a y 25b, a los que se puede añadir un agente neutralizante básico (por ejemplo, una base acuosa como NH4OH o NaOH) a través de las entradas de agente neutralizante básico 35a y 35b. La adición de un agente neutralizante básico al biorreactor o biorreactores dados, por ejemplo los biorreactores 100a, 100b puede controlarse por separado usando circuitos de control de retroalimentación adecuados, que incluyen, por ejemplo, analizadores de pH 40a, 40b que miden (por ejemplo, continua o intermitentemente) el valor de pH del líquido del biorreactor dentro de los circuitos de reciclado de líquido externo 25a y 25b. Dichos circuitos de control también incluyen el hardware necesario (por ejemplo, válvulas de control o bombas de alimentación de tasa variable, no se muestra) y software (por ejemplo, programas informáticos) para comparar el valor de pH medido con un valor de punto de ajuste para un biorreactor dado y luego controlar el flujo de agente neutralizante básico para alcanzar o mantener el punto de ajuste. Por lo tanto, los circuitos de reciclado externo de uno o más (por ejemplo, todos), de los biorreactores pueden estar en comunicación fluida con las respectivas, una o más (por ejemplo, todas), entradas de neutralización básicas y comprenden instrumentación para controlar independientemente el pH dentro del uno o más (por ejemplo, todos), de los respectivos biorreactores.

Asimismo, los circuitos de reciclado de líquido externo (25a, 25b... 25y, 25z) de uno o más biorreactores (100a, 100b...

100y, 100z) pueden incluir transmisores de temperatura (41a, 41b, 41y, 41z) que miden (por ejemplo, continua o intermitentemente) las temperaturas del líquido dentro de los circuitos de reciclado de líquido externo 25a y 25b de los biorreactores respectivos (100a, 100b... 100y, 100z), siendo tales temperaturas representativas de las temperaturas de funcionamiento de los biorreactores. Por lo tanto, se puede lograr un control de temperatura del biorreactor separado utilizando circuitos de control que incluyen, además de transmisores de temperatura (41a, 41b, 41y, 41z), calentadores o intercambiadores de calor (42a, 42b, 42y, 42z) y el software necesario (por ejemplo, programas informáticos) para comparar la temperatura medida con una temperatura de punto de ajuste para un biorreactor determinado y, a continuación, controlar el funcionamiento de los calentadores o intercambiadores de calor (42a, 42b...42y, 42z) para alcanzar o mantener el punto de ajuste. Los tipos específicos de intercambiadores de calor incluyen aquellos que tienen construcciones de camisa de tubo en tubo y con hoyuelos. Adicionalmente, los circuitos de reciclado de líquido externo (25a, 25b...25y, 25z) de uno o más biorreactores (por ejemplo, los biorreactores 100a y 100b de la primera y segunda etapas como se muestra en la figura 1) pueden incluir entradas de medio de cultivo líquido 45a y 45b, o entradas para introducir otros diluyentes líquidos, reactivos (por ejemplo, tensioactivos) y/o nutrientes, al uno o más biorreactores independientemente a velocidades iguales o variables. Por lo tanto, los circuitos de reciclado externo de uno o más (por ejemplo, todos), de los biorreactores pueden estar en comunicación fluida con los respectivos, uno o más, calentadores o intercambiadores de calor y comprenden instrumentación para controlar independientemente las temperaturas dentro de uno o más, de los respectivos biorreactores.

Dos o más de las etapas de biorreactor (por ejemplo, primera y segunda etapa de biorreactor 10a, 10b) por lo tanto, pueden tener variables operativas del proceso controlables independientemente, incluidos aquellos que requieren muestreo/análisis del producto líquido del biorreactor en los circuitos de reciclado de líquido externo, como se ha descrito con anterioridad. Las variables operativas representativas del proceso incluyen la tasa de adición del medio de cultivo líquido, velocidad de alimentación del sustrato que contiene CO gaseoso, temperatura del reactor, pH del reactor, y combinaciones de los mismos. Una ventaja importante de los procesos de múltiples etapas como se describe en el presente documento surge de la capacidad de controlar de forma independiente el crecimiento del microorganismo fijador de C1 a medida que se transfiere a las etapas sucesivas del biorreactor. El manejo del crecimiento bacteriano, así como la producción del producto final y otros metabolitos, se puede lograr adaptando las condiciones de una etapa de biorreactor determinada (por ejemplo, las variables operativas del proceso descritas anteriormente) a un objetivo de procesamiento dado. Por ejemplo, de acuerdo con una realización, se agrega una tasa relativamente alta de medio de cultivo líquido al biorreactor de la primera etapa para promover una alta tasa de crecimiento bacteriano y también establecer un cultivo homogéneo estable para el resto del sistema de biorreactor de múltiples etapas. Se pueden agregar tasas comparativamente más bajas de medio de cultivo líquido a los biorreactores aguas abajo, que tienen cultivos celulares más establecidos, adecuados para lograr altas tasas de producción del producto final. De esta forma, el crecimiento bacteriano se puede separar o desacoplar ventajosamente de la generación del producto. En general, se puede apreciar de forma más general que los sistemas descritos en el presente documento ofrecen un elevado número de grados de libertad, en términos de controlar el metabolismo del microorganismo fijador de C1 a medida que avanza a través de diferentes fases de crecimiento en cada reactor sucesivo. Estas características de control permiten que los procesos de conversión biológica de múltiples etapas funcionen con un producto líquido de etapa final que tiene las características descritas anteriormente.

De la misma manera, los niveles de líquido, o alturas de las interfaces gas/líquido (22a, 22b ... 22y, 22z) puede controlarse independientemente en uno o más biorreactores (100a, 100b... 100y, 100z), mediante el uso de equipos e instrumentación de control de nivel de líquido separados (por ejemplo, válvulas de control, sensores de nivel y transmisores). Sin embargo, también es posible evitar, ventajosamente, el gasto adicional y la complejidad de implementar dicho equipo e instrumentación, llevando a cabo los procesos de múltiples etapas de manera que el nivel de líquido en al menos un biorreactor depende del nivel de líquido en su respectivo biorreactor aguas abajo, por ejemplo, al tener un control de nivel único que controle los niveles de líquido en todos los biorreactores del sistema. De acuerdo con un modo particular de operar el sistema de biorreactores (100a, 100b... 100y, 100z) de la figura 1, el medio de cultivo líquido se agrega al biorreactor 100a de la primera etapa a través de la entrada 45a y fluye a través de todos los reactores por desbordamiento o de otra manera según lo determine la cabeza hidrostática, la cual, por ejemplo, puede controlarse variando la elevación más alta E a la que alcanza o se extiende el producto líquido de la etapa final.

De acuerdo con un posible procedimiento para iniciar el proceso, el biorreactor 100a de la primera etapa puede inocularse o cargarse inicialmente con un microorganismo fijador de C1, que, después de un período de crecimiento por lotes en cultivo, alcanza una concentración suficientemente alta, de manera que se pueda iniciar la adición continua de medio de cultivo líquido. El producto líquido de la primera etapa se transporta luego a etapas sucesivas, por ejemplo por desbordamiento de la primera etapa a la segunda etapa, seguido de desbordamiento de la segunda etapa a la tercera etapa, etc. El nivel de líquido del sistema puede determinarse en última instancia por el nivel al que se extrae el producto líquido de la etapa final (también denominado nivel de "sangrado" de la etapa final de biorreactor). El sustrato gaseoso que contiene C1 se agrega a cada reactor por separado, aunque es posible un espacio de cabeza compartido, en el que se combinan los vapores que salen de las zonas de fase líquida continua (por ejemplo, en el caso de que se disponga más de una etapa de biorreactor dentro de un solo recipiente, como en una disposición apilada), y, de acuerdo con algunas realizaciones, puede reducir la formación de espuma. El producto final deseado de la fermentación, así como otros metabolitos, se recuperan del producto líquido de la etapa final, se retiran de la etapa final de biorreactor. El producto líquido de la etapa final se puede separar (por ejemplo, por filtración de membrana) para eliminar el producto final y los metabolitos, y luego el microorganismo fijador de C1 y posiblemente otros sólidos, antes de esta recuperación. Parte o la totalidad del permeado líquido que se recupera de esta separación (o medio base) puede reciclarse para su uso en una etapa de biorreactor, por ejemplo, se puede agregar al biorreactor de primera etapa, opcionalmente después de la adición de nutrientes.

La figura 2 representa un posible tipo de biorreactor 100, concretamente, un biorreactor de circuito circulante, que se puede incorporar en una etapa de biorreactor 10 de un proceso de múltiples etapas, incluyendo el proceso representado en la figura 1. Muchas de las mismas características se muestran en la figura 1 (e identificadas con los mismos números de referencia), con la excepción de algunas de las estructuras internas del reactor que pueden usarse específicamente para promover las características deseadas de flujo de vapor y líquido, circulación y distribución/transferencia de masa entre las fases. Como se muestra más claramente en la figura 2, el biorreactor 100 opera con dos zonas que se distinguen por sus fases continua y dispersa. La zona de fase de vapor continua A tiene una fase líquida dispersa, debido al producto líquido que entra en esta zona (también denominada espacio de cabeza) a través de uno o más dispositivos de distribución de líquido, como un cabezal de ducha 110 que tiene una pluralidad de aberturas para dispersar el producto líquido que fluye hacia abajo (por ejemplo, en un perfil de cono que se expande hacia abajo), alimentado desde el circuito de reciclado de líquido externo 25.

La zona de fase líquida continua B tiene una fase gaseosa dispersa, debido al sustrato que contiene C1 que entra a esta zona a través de uno o más dispositivos de distribución de gas, como el rociador 14, que tiene una pluralidad de aberturas para dispersar un sustrato que contiene C1 que fluye hacia arriba, alimentado desde la entrada de gas 12. La interfaz gas/líquido 22 delimita el límite entre la zona de fase gaseosa continua A y la zona de fase líquida continua B. La zona de fase líquida continua B puede ocupar la mayor parte del volumen del biorreactor 100, y, por ejemplo, se puede disponer en su totalidad dentro del 90 % inferior, el 80 % inferior, o el 75 % inferior de la longitud del reactor. Por consiguiente, la interfaz de gas/líquido 22 puede estar ubicada dentro del 25 % superior, el 20 % superior, o el 10 % superior de la longitud del reactor. En algunos casos, una capa de espuma (no se muestra) puede residir sobre la interfaz gas/líquido y, a los efectos de esta divulgación, reside en la zona de fase gaseosa continua A.

Por lo tanto, de acuerdo con la realización específica de la figura 2, el producto líquido (o "caldo") reciclado a través del circuito de reciclado de líquido externo 25 se introduce en la zona de fase de vapor continua A. Este producto líquido puede pasar desde la sección inferior del biorreactor, de la cual se retira el producto líquido como se ha descrito anteriormente, a una sección superior del biorreactor (por ejemplo, hasta dentro del 10 % superior de la longitud del biorreactor 100 y hasta el dispositivo o dispositivos de distribución de líquido superiores, como el cabezal de ducha 110, por donde se introduce el producto líquido). Como se ha descrito anteriormente con respecto a la figura 1, el circuito de reciclado de líquido externo 25, además de mejorar la circulación de líquidos y la transferencia de masa entre las fases líquida y de vapor, se puede configurar para realizar funciones de control de procesos. Por ejemplo, el producto líquido, reciclado a través del circuito de reciclado externo 25, puede pasar a través del intercambiador de calor externo 42 (por ejemplo, antes de ser introducido en la zona A de la fase de vapor continua) para el control de la temperatura del biorreactor 100. Por otra parte, se puede añadir un agente neutralizante básico a este producto líquido, por ejemplo a través de la entrada de agente neutralizante básico 35, para controlar el pH del biorreactor 100. En el caso de una pluralidad de biorreactores como se muestra en la figura 1, los circuitos de reciclado externo de uno o más (por ejemplo, todos), de los biorreactores pueden utilizarse para reciclar productos líquidos, retirados próximos a uno o más, respectivos, primeros extremos de los biorreactores, a distribuidores de líquido en una o más, respectivas zonas continuas de fase de vapor próximas a uno o más, respectivos segundos extremos (dispuestos frente a los primeros extremos).

El sustrato que contiene C1, introducido a través del rociador 14, puede ser alimentado a un tubo ascendente 120 que está dispuesto dentro de la zona de fase líquida continua B, por ejemplo concéntricamente con respecto al biorreactor 100, y limita las burbujas de gas ascendentes a una región central de esta zona. Después de salir de la parte superior del tubo ascendente 120, el gas restante, no disuelto o utilizado en la zona de fase líquida continua B, continúa fluyendo hacia arriba y se libera de esta zona en la interfaz gas/líquido 22. Debido a la retención de gas en el tubo ascendente 120, la densidad total dentro del tubo ascendente 120 es menor que la densidad en el tubo descendente 130, del que se desprenden sustancialmente las burbujas de gas. Como se muestra en la figura 2, el tubo descendente 130 puede disponerse anularmente con respecto al tubo ascendente 120, aunque son posibles otras configuraciones para proporcionar regiones dentro de la zona de fase líquida continua B de diferente densidad. Por ejemplo, una pluralidad de tubos de bajada que se extienden verticalmente pueden distribuirse a lo largo de esta zona, que se extiende desde el 1 %-10 % inferior de la longitud del reactor hasta el 25 %-45 % superior de la longitud del reactor. Como también se muestra usando flechas en esta zona para indicar la dirección del grueso del flujo de líquido, el biorreactor 100 opera con circulación interna de líquido en la zona de fase líquida continua B, que es inducida por las diferencias de densidad, y da como resultado un flujo de líquido ascendente en el tubo ascendente 120 y un flujo de líquido descendente en el tubo descendente 130, siendo ambos internos al biorreactor 100. De acuerdo con algunas realizaciones, se puede usar más de un tubo ascendente y/o más de un tubo descendente para controlar la circulación del líquido.

El gas que se libera en la interfaz gas/líquido 22 continúa fluyendo hacia arriba (el grueso) a través de la zona de fase de vapor continua A, donde entra en contacto con producto líquido introducido en esta zona a través del cabezal de ducha 110 u otro dispositivo de distribución de líquido. De esta forma, el biorreactor 100 funciona con flujos de gas y líquido a contracorriente (gas que fluye hacia arriba y líquido que fluye hacia abajo) en esta zona, que se dispone por encima de la zona de fase líquida continua B, operando con circulación interna del líquido como se ha descrito anteriormente. Ambas zonas pueden comprender dispositivos de contacto líquido-vapor. Debido a las diferencias en cómo se efectúa la transferencia de masa entre las fases en estas zonas, los dispositivos de contacto vapor-líquido 125A en la zona A pueden diferir de los dispositivos de contacto vapor-líquido 125B en la zona B, por ejemplo con respecto a su geometría (por ejemplo, diámetro y/o espesor) y/o configuración de sus aberturas (por ejemplo, en términos de tamaño, forma, espaciado y/o número total). De acuerdo con algunas realizaciones, tipos completamente diferentes de dispositivos de contacto vapor-líquido (por ejemplo, placas perforadas y materiales de relleno aleatorios como anillos Raschig) se pueden utilizar en las diferentes zonas. Asimismo, los dispositivos de contacto vapor-líquido que difieren, o que son de tipos completamente diferentes, pueden utilizarse dentro de una sola zona.

Como puede resultar evidente para los expertos en la materia, teniendo en cuenta la presente memoria descriptiva, los procesos y sistemas de múltiples etapas descritos en el presente documento están asociados con una serie de ventajas operativas, incluyendo cualquiera, cualquier combinación, o todas las siguientes, (1) fermentación robusta (bioconversión anaerobia) con complejidad reducida: En relación con los procesos convencionales, los procesos de múltiples etapas como se describen en el presente documento son más simples de operar y tienen un "entorno operativo" significativamente mayor o intervalo de condiciones bajo las cuales la operación es factible. Esto se debe a los requisitos de productividad relativamente bajos para cada biorreactor individual y la alimentación continua que todos los reactores (excepto el biorreactor de la primera etapa) reciben del reactor inmediatamente aguas arriba, estabilizando la fermentación. Esto aborda ventajosamente uno de los principales objetivos de esta técnica, a saber, robustez operativa a escala, según sea necesario a largo plazo, operación comercial estable. (2) un número significativo de grados de libertad: Esto permite un mayor control del metabolismo de un cultivo bacteriano a medida que avanza a través de diferentes fases de crecimiento en cada biorreactor. Las condiciones en cada etapa (por ejemplo, tasa de suministro de gas, temperatura y/o punto de ajuste de pH), se pueden adaptar para controlar las salidas de fermentación, como las proporciones de metabolitos. Esto puede dar como resultado títulos de productos finales altos y estables. Por ejemplo, los inventores han demostrado títulos de etanol altos y estables (> 60 gramos/litro en pruebas continuas de laboratorio), relaciones en peso de etanol:acetato del producto líquido final muy favorables y estables (100+ en pruebas continuas de laboratorio). Por consiguiente, se puede lograr un ahorro de costos potencialmente muy grande, relacionados con el uso de medios de cultivo y sistemas de reciclado de agua, donde el subproducto acetato es el principal obstáculo para el reciclado directo. (3) la capacidad de separar el crecimiento de la generación de productos: Este es un beneficio significativo para la producción de productos finales biológicos a partir de células modificadas genéticamente, en procesos en los que se puede añadir un inductor en etapas posteriores, después del crecimiento. Los beneficios resultan de la posibilidad de tener una alta tasa de crecimiento en la primera etapa de biorreactor, utilizando una alta tasa de dilución (es decir, tasa de adición de medio de cultivo líquido), lo que establece un cultivo homogéneo estable para el resto del sistema. (4) un gran ahorro en el costo de capital, sin el requisito de un sistema de reciclado de células: A este respecto, las membranas, los alojamientos, las válvulas y los instrumentos y controles asociados representan una parte significativa del costo total de los biorreactores, especialmente a escala comercial. Los requisitos de reciclado de células bacterianas (por ejemplo, el trabajo de la bomba de reciclado) también se reducen significativamente y pueden requerir solo la energía modesta necesaria para operar los circuitos de reciclado externos (por ejemplo, a través de un cabezal de ducha u otro distribuidor de líquido como se ha descrito anteriormente). (5) operación simplificada y más robusta, a costo reducido: Esto se debe a que no se requiere la separación por membrana ni el reciclado de las células separadas en cada etapa de biorreactor. Los costos asociados con el cambio de membranas y la limpieza manual en el lugar (CIP) son significativos, en términos de tiempo del operador, productos químicos CIP y calefacción. A este respecto, las opciones CIP automáticas tienen un costo de capital prohibitivamente alto, las soluciones enzimáticas para limpiar las membranas de reciclado de células son igualmente caras, y los procedimientos simples de limpieza con NaOH suelen ser ineficaces. (6) Diseños de reactores de circuito de circuito aéreo más cortos, más compactos y de mayor volumen: Dichos diseños pueden obtenerse fácilmente con los tanques a granel estándar de la industria existentes, equipados con elementos internos. Esto resulta de requisitos de productividad más bajos para los biorreactores, y permite la posibilidad de ahorros sustanciales en costos en la fabricación de biorreactores. De acuerdo con algunas realizaciones, los procesos y sistemas descritos en el presente documento pueden operar de manera efectiva solo con un efecto de circulación aérea solo, sin el uso de una bomba de circuito o reciclado externo y, en consecuencia, también renunciando a las tuberías y equipos de reciclado externos. Son posibles reducciones adicionales en los gastos de capital en válvulas de control y tuberías, en realizaciones que utilizan un control de nivel de cabeza de líquido/desbordamiento simple entre cada etapa. (7) El uso de bajas presiones de operación: Este es un beneficio adicional de los requisitos de productividad más bajos, para los biorreactores individuales. En este punto, la alta retención de gas limita la tasa de flujo de gas a un biorreactor, a menos que el gas esté presurizado. La capacidad de reducir la presión operativa tiene el efecto de reducir los costos de compresión.

Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la presente invención.

EJEMPLO 1

A. Configuración experimental

Se usó un equipo de prueba que tiene seis etapas que comprende biorreactores, cada uno con un volumen de trabajo de 1,5 litros (para un volumen total del reactor de 9 litros para el sistema) para la evaluación ampliada de un proceso de conversión biológica de múltiples etapas como se describe en el presente documento. De manera específica, estos procesos utilizan reactores con circuito de flujo descendente de líquido contracorriente que tienen columnas principales de aproximadamente 1,2 metros de altura y 50 milímetros de diámetro y están construidos con plástico de PVC transparente para la observación de la hidrodinámica. Las etapas quinta y sexta tenían columnas principales algo más altas. Se usó una bomba centrífuga de baja presión de plástico, (para acuarios, 500-2000l/h) en la parte inferior de cada columna se para reciclar líquido a un distribuidor de líquido de cabeza de ducha de cono completo en la parte superior de la columna. La caída de presión en cada cabezal de ducha era baja, del orden de 20-40 kPa.

El gas entró en cada etapa de biorreactor por separado y cerca de la parte inferior de las columnas, a través de rociadores de acero inoxidable sinterizado. El gas no utilizado y no disuelto salió por la parte superior de cada columna, por encima del cabezal de la ducha. Las seis etapas se realizaron a una presión casi atmosférica. Cada etapa estaba conectada de forma fluida con la siguiente (para la transferencia de productos líquidos) mediante líneas de acero inoxidable de pequeño calibre (tubo de 1,5 mm de diámetro interior), conectadas en la parte inferior de cada columna principal, justo debajo de sus respectivos rociadores. El medio de cultivo líquido se alimentó a la primera etapa y se transfirió a través del sistema de etapas de biorreactor solo mediante cabeza líquida. La etapa final o sexta se utilizó para controlar los niveles de líquido del reactor en todo el sistema, usando un punto de despegue de líquido que era ajustable en elevación. Cada etapa estaba equipada con líneas separadas de dosificación de sustancias químicas y control de temperatura. Aparte de las dos etapas finales (es decir, las etapas quinta y sexta), las etapas también estaban equipadas con sistemas de medición y control de pH.

EJEMPLO 2

Operación de prueba inicial

Se diseñó una operación inicial para probar la efectividad de un sistema de biorreactor de múltiples etapas para la conversión biológica de CO en un sustrato gaseoso que contiene CO en etanol y otros metabolitos, en presencia de un medio de cultivo bacteriano que contiene C. autoethanogenum. Se empleó una versión simplificada del equipo de prueba como se describe en el Ejemplo 1, sin rociadores de ducha con espacio de cabeza, es decir, la zona de fase de vapor continua era un tubo abierto. Tampoco se utilizaron rociadores, es decir, el gas se introdujo en la zona de fase líquida continua a través de un tubo abierto, de 3 mm de diámetro interior. Se carecía de control de temperatura en los biorreactores de la quinta y sexta etapa, y el control del nivel de líquido se mantenía con un sistema de líquido de desbordamiento simple (salida de gas compartida). La operación de bioconversión logró un crecimiento bacteriano estable durante 2 semanas, eventualmente alcanzando un punto de operación de >43 gramos/litro de producción de etanol con <2 gramos/litro de producción de acetato, basado en el producto líquido de la etapa final extraído del biorreactor de la sexta etapa. La tasa de dilución en el estado estacionario, o la adición de medio de cultivo líquido, fue de aproximadamente 2,5 mililitros por minuto (o aproximadamente 2,3 volúmenes de reactor por día para cada biorreactor). Estos resultados validaron el sistema para el control de nivel de líquido de desbordamiento, aunque se observó que algunos tensioactivos generadores de transferencia de masa se eliminaban en el nivel de líquido superior de las etapas de biorreactor iniciales, reduciendo la transferencia de masa.

EJEMPLO 3

Operación modificada, basada en observaciones hidrodinámicas

En una segunda operación, se hicieron modificaciones para obtener el equipo de prueba sustancialmente como se describe en el Ejemplo 1. Estas modificaciones, basadas en la evaluación hidrodinámica de la prueba en el Ejemplo 2, incluido el establecimiento de conexiones "sólo líquido" entre las etapas, con una tubería de acero inoxidable de diámetro interior de 1,5 mm, acoplada a la parte inferior de las columnas. Se determinó que este diámetro era lo suficientemente pequeño para evitar la retromezcla a las tasas operativas de adición del medio de cultivo (tasas de dilución). En vista de estas conexiones de líquido en los fondos de los reactores, se añadió una salida de altura ajustable para el producto líquido de la etapa final, saliendo del sexto biorreactor, para el control del nivel de líquido en todo el sistema. Asimismo, se agregaron rociadores de ducha de espacio de cabeza de cono completo a todos los biorreactores para la distribución de líquidos, y se agregaron sistemas de control de temperatura en los circuitos externos de reciclado de líquidos de las dos etapas finales del reactor. Se proporcionaron salidas de gases separadas para cada uno de los seis biorreactores, en lugar de tener los productos gaseosos, que contienen CO no utilizado, combinados como se describe en el Ejemplo 2.

Se realizó una prueba de 48 días de la reacción de conversión biológica descrita en el Ejemplo 2 con operación estable. En condiciones continuas, la productividad y la calidad del producto fueron muy favorables. Por ejemplo, durante un período de 10 días, los parámetros operativos en el estado estacionario (por ejemplo, las presiones, las temperaturas, los caudales, los valores de pH, etc.) lograron un título de etanol de producto líquido en la etapa final con un promedio de más de 61 gramos/litro y un título de acetato (ácido acético) con un promedio de solo 0,6 gramos/litro (aproximadamente una proporción 100:1 p/p o mayor, de etanol/ácido acético). El título promedio de 2,3-butanodiol fue de 8,4 gramos/litro. Estos resultados se lograron con la adición de medio de cultivo líquido de aproximadamente 2.5 mililitros por minuto (o una tasa de dilución de aproximadamente 2,3 volúmenes de reactor por día para cada biorreactor). Es importante destacar que, tras más de 33 días de operación continua, los títulos de etanol estuvieron sistemáticamente por encima de 50 gramos/litro, con títulos sorprendentemente altos de más de 70 gramos/litro durante 3 días, e incluso un título máximo de 76 gramos/litro durante la operación. Cuando se aumentó la tasa de adición de medio de cultivo a la segunda, tercera y cuarta etapas de biorreactor, para obtener una tasa de dilución de 3.5 volúmenes de reactor por día en el biorreactor final, se obtuvieron más de 50 gramos/litro de etanol en el producto líquido de la etapa final. El rendimiento logrado durante esta operación extendida se ilustra en la figura 3, que proporciona las concentraciones, en el producto líquido de la etapa final, de etanol y otros metabolitos, concretamente, ácido acético y 2,3-butanodiol, así como la concentración de microorganismos (biomasa). El perfil de metabolitos (etanol, ácido acético y concentraciones de 2,3-butanodiol) para los productos líquidos de cada etapa se ilustra en la figura 4, basado en muestras de productos líquidos tomadas a los 23 días en funcionamiento. La figura 4 muestra, en particular, las concentraciones de etanol rápidamente crecientes obtenidas en etapas sucesivas, y al mismo tiempo, solo un aumento muy modesto en la concentración de 2,3-butanodiol y una disminución en la concentración de acetato (ácido acético). Los resultados de esta operación incluyeron utilizaciones de CO de la etapa de biorreactor individual de 65-75 % durante la operación estable al comienzo de la prueba de 48 días, que aumentó a 80-90 % en períodos de tiempo posteriores cuando se lograron títulos de producto de etanol más altos. Estos resultados son indicativos de coeficientes de transferencia de masa muy altos para reactores de columna/circuito de esta escala.

Ventajosamente, se lograron altos títulos del producto final etanol y la operación excepcionalmente estable, al menos en parte, a través del posicionamiento de las líneas de transferencia de líquido en los fondos de los reactores y la adición de los distribuidores de líquido en los espacios de cabeza del reactor. Esto tuvo el efecto de reducir algunos inconvenientes relacionados con la formación de espuma y la transferencia preferencial de aditivos químicos desde la parte superior de la fase líquida. En general, tanto la transferencia de masa como el control operativo se mejoraron significativamente, como resultado de las modificaciones realizadas entre las pruebas realizadas en los ejemplos 2 y 3. Adicionalmente, los niveles de la interfase gas-líquido estuvieron sistemáticamente en la parte superior de sus respectivas columnas/reactores, y se controlaron más fácilmente, independientemente del inventario de líquido real (volumen de líquido real). Por lo tanto, la cantidad de retención pudo ser controlada directamente por el líquido existente, que, en el caso del sistema de biorreactor multietapa utilizado en el Ejemplo 3, a su vez se reguló mediante una línea de drenaje externa. Esta línea, utilizada para retirar el producto líquido final de la etapa de biorreactor, estaba conectada a un interruptor de sifón de altura ajustable, permitiendo así que la fase líquida dentro de las columnas se ajuste a cualquier nivel deseado. Se obtuvieron resultados particularmente buenos con una altura de cabeza de líquido que se extendía aproximadamente hasta el 30-50 % superior de la longitud del reactor (por ejemplo, nominalmente 40 % de retención).

Partiendo de los resultados obtenidos en los Ejemplos 2 y 3, los procesos y sistemas descritos en el presente documento tienen un potencial excepcionalmente alto para mejorar la transferencia de masa vapor-líquido, con unos requisitos relativamente bajos, o incluso ninguno, en términos de entrada de energía adicional y/o gastos de capital. La operación se simplifica y se pueden lograr ahorros de costos, por ejemplo, renunciando a los gastos asociados con al menos algunos sistemas de separación por membrana y/o sistemas de control de nivel (y medidores de flujo asociados, bombas, válvulas de control y otros instrumentos y equipos.

En general, los aspectos de la invención se refieren a procesos de biorreactores de múltiples etapas, que utilizan configuraciones particulares de flujo de vapor y líquido como se ha descrito anteriormente, que conducen a una serie de ventajas de proceso, particularmente con respecto a lograr una alta productividad del producto final deseado, junto con la simplicidad de fabricación de los sistemas asociados.

Claims (18)

REIVINDICACIONES

1. Un proceso de múltiples etapas para convertir una fuente de carbono C1 en un producto final, comprendiendo el proceso:

alimentar un sustrato gaseoso que contiene C1, en paralelo, a una primera etapa de biorreactor y al menos a una segunda etapa de biorreactor del proceso de múltiples etapas;

alimentar al menos una porción de un producto líquido de la primera etapa que comprende un microorganismo fijador de C1 utilizado en la primera etapa de biorreactor para metabolizar la fuente de carbono C1 y generar el producto final, en serie, desde la primera etapa de biorreactor hasta la segunda etapa de biorreactor; en donde al menos una de las etapas primera y segunda de biorreactor comprende un circuito de reciclado de líquido externo.

2. El proceso de la reivindicación 1, en donde el producto líquido de la primera etapa se alimenta a la segunda etapa de biorreactor, sin separación del microorganismo fijador de C1 y reciclado del microorganismo fijador de C1 separado a la primera etapa de biorreactor.

3. El proceso de la reivindicación 1, que comprende al menos cuatro etapas de biorreactor en las que el sustrato gaseoso que contiene C1 se alimenta en paralelo a las etapas, y los productos líquidos, incluyendo el producto líquido de la primera etapa, se alimentan sucesivamente desde la primera etapa de biorreactor hasta la etapa final de biorreactor y luego se retiran de la etapa final de biorreactor.

4. El proceso de la reivindicación 3, en donde:

(i) una utilización global de C1 de las al menos cuatro etapas de biorreactor es de al menos el 60 %;

(ii) un producto líquido de etapa final, tras su retirada de la etapa final de biorreactor, se pasa a una altura ajustable que rige el nivel de líquido en cada etapa de biorreactor; o

(iii) las al menos cuatro etapas de biorreactor funcionan a una presión inferior a 200 kilopascales (kPa) por encima de la presión atmosférica.

5. El proceso de la reivindicación 1, en donde el producto final es etanol y, además del etanol, el microorganismo fijador de C1 genera ácido acético como metabolito, comprendiendo además el proceso extraer un producto líquido de la etapa final de una etapa final de biorreactor del proceso de múltiples etapas, en donde una fracción líquida libre de biomasa del producto líquido de la etapa final comprende al menos 50 gramos por litro (g/l) de etanol.

6. El proceso de la reivindicación 5, en donde la fracción líquida libre de biomasa del producto líquido de la etapa final tiene una relación en peso de etanol:ácido acético de al menos 50:1.

7. El proceso de la reivindicación 1, en donde el producto final es un producto dependiente del crecimiento seleccionado del grupo que consiste en isopropanol, butanol, acetato, acetona, ácido 2-hidroxiisobutírico e isobutileno.

8. El proceso de la reivindicación 7, en donde el producto final es isopropanol, comprendiendo además el proceso extraer un producto líquido de la etapa final de una etapa final de biorreactor del proceso de múltiples etapas, en donde una fracción líquida libre de biomasa del producto líquido de la etapa final comprende al menos 10 gramos por litro (g/l) de isopropanol.

9. El proceso de la reivindicación 1, en donde:

(i) las etapas primera y segunda de biorreactor tienen al menos una variable operativa del proceso controlable independientemente seleccionada del grupo que consiste en la tasa de adición del medio de cultivo líquido, tasa de alimentación del sustrato gaseoso que contiene C1, temperatura del reactor, pH del reactor y combinaciones de los mismos; o

(ii) al menos una de las etapas primera y segunda de biorreactor comprende un biorreactor que tiene una relación entre su longitud y su anchura de menos de 10:1.

10. El proceso de la reivindicación 1, en donde el biorreactor de circuito de reciclado de líquido externo funciona con circulación interna de líquido en una zona de fase líquida continua.

11. El proceso de la reivindicación 10, en donde,

(i) en la zona de fase líquida continua, el líquido fluye hacia arriba en un tubo ascendente interno y hacia abajo en uno o más tubos descendentes internos; o

(ii) el biorreactor de circuito de reciclado de líquido externo opera con flujos de gas y líquido a contracorriente en una zona de fase de vapor continua, por encima de la zona de fase líquida continua.

12. El proceso de la reivindicación 11, en donde

(i) la zona de fase líquida continua está dentro del 75 % inferior de la longitud del biorreactor de circuito de reciclado de líquido externo; o

(ii) la zona de fase líquida continua y la zona de fase gaseosa continua comprenden dispositivos de contacto vaporlíquido, en donde los dispositivos de la zona de fase líquida continua difieren de los dispositivos de la zona de fase de vapor continua.

13. El proceso de la reivindicación 11, en donde el producto líquido, reciclado a través de un circuito de reciclado de líquido externo, llega a la zona de fase de vapor continua.

14. El proceso de la reivindicación 13, en donde

(i) el producto líquido que se recicla a través del circuito de reciclado externo, se hace pasar a través de un intercambiador de calor externo para controlar la temperatura del biorreactor de circuito de reciclado de líquido externo; o

(ii) se agrega un agente neutralizante básico al producto líquido que se recicla a través del circuito de reciclado de líquido externo, para controlar el pH del biorreactor de circuito de reciclado de líquido externo.

15. Un proceso biológico de múltiples etapas, para convertir CO en etanol, comprendiendo el proceso:

dividir un sustrato gaseoso que contiene CO, en paralelo, entre una pluralidad de etapas de biorreactor del proceso de múltiples etapas;

alimentar sucesivamente productos líquidos que comprenden microorganismos carboxidotróficos, en serie, desde una primera etapa de biorreactor hasta etapas de biorreactor aguas abajo,

retirar, desde una etapa final de biorreactor, un producto líquido de etapa final que tiene una fracción líquida que contiene microorganismos no carboxidotróficos que comprende al menos 50 gramos por litro (g/l) de etanol y que tiene una relación en peso de etanol:ácido acético de al menos 50:1;

en donde al menos una de las etapas de biorreactor del proceso de múltiples etapas comprende un circuito de reciclado de líquido externo.

16. El proceso de la reivindicación 15, que comprende al menos cuatro etapas de biorreactor.

17. El proceso de la reivindicación 15, en donde dos o más de la pluralidad de etapas de biorreactor son secciones separadas dentro de un solo recipiente.

18. El proceso de la reivindicación 1, en donde el circuito de reciclado de líquido externo recicla el producto líquido de una sección inferior de un biorreactor externamente al biorreactor hasta una sección superior del biorreactor.