JPH07508159A

JPH07508159A - エンド‐１，４‐β‐Ｄ‐グルカナーゼ

Info

Publication number: JPH07508159A
Application number: JP5514682A
Authority: JP
Inventors: ド・シルヴァ、ジャクリーン; ジャーマン、カール・ダドリー; アロウスミス、デイヴィド・アンドリュー; リード、ジョン・スペンス・グラント; エドワーズ、メアリー・エリザベス
Original assignee: ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシャープ
Priority date: 1992-02-28
Filing date: 1993-03-01
Publication date: 1995-09-14
Also published as: ZA931333B; DE69331226D1; KR950700405A; EP0628075A1; AU3572893A; MX9301120A; WO1993017101A1; CA2117608A1; ES2164655T3; EP0628075B1; KR100271594B1; ATE209677T1; US5767364A; AU3529597A; DE69331226T2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】エンド−１，４−−Ｄ−グルカナーゼ発明の分野本発明は、ある植物酵素をコードするヌクレオチド配列、当該ヌクレオチド配列を含有するベクター、当該ヌクレオチド配列を含有するトランスジェニック植物、上記酵素を生産するための組換えＤＮＡ法、並びに植物の性質を変化させる方法に関する。

発明の背景果物と野菜の細胞壁はほとんどが多糖であり、主成分はペクチンとセルロースとキシログルカンである（文献１）。強度と柔軟性の基本的性質を盛り込むことを試みた幾多の細胞壁のモデルが提案されている（文献２．　３．　４）。

キシログルカンは、α−１，６−キシロース側鎖によって広範に置換された１、４−β−グルカンであり、α−１，６−キシロース側鎖の一部は１．２−β−ガラクトシル化されている。キシログルカン類は双子葉植物の一次細胞壁に大量に存在するが、ある種の種子にも存在しており、そこで様々な役割を果たしている。

−次細胞壁のキシログルカンはフコシル化されている。かかるキシログルカンはセルロースミクロフィブリルと強固に水素結合しており、これを解離させるにハｌｌアルカリ又は強い膨潤剤を必要とする。キシログルカンはセルロースミクロフィブリル間で架橋を形成していて、このセルロース／キシログルカンネットワークが細胞壁の主たる耐荷重性／弾性ネットワークを形成していると考えられている。ＤＣＢで突然変異させた懸濁培養細胞（セルロースを欠く細胞壁）はキシログルカンをその培地中に放出するが、このことは通常はキシ６グルカンがセルロースと強固に結合していることを示唆している。

ＩＡＡ誘導増殖の際に、暗所で成長させたカポチャの胚軸部で一次細胞壁キシログルカンの加水分解が起こることが実証されている（文献１５）。細胞壁キシログルカンのエンド型加水分解は細胞の伸長に伴う細胞壁の弛緩に寄与しているものと考えられている（文献１６）。トマト果実の成熟の際にキシログルカンの平均分子量が低下することも報告されており、これは成熟過程に伴う組織の柔軟化に寄与しているらしい（文献１７）。

例えばノウゼンハレン（金運孔ともいう）などのある種の種子には、肥大子葉細胞壁の中に貯蔵されたキシログルカンが最大３０重量％含まれている。このようなキシログルカンは貯蔵多糖として働き、発芽時に速やかに解重合される。

発芽中のノウゼンハレンＣＴｒｏｐａｅｏｌｕｍ　ｍａＪｕｓ　Ｌ、’）の種子からキシログルカンに対して特異的に作用するエンド−１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ（すなわち、キシログルカナーゼ）が単離され、見掛上均一にまで精製されている（文献１１）。

この精製キシログルカナーゼは、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一ポリペプチドバンドを与え（見掛けの分子量２９〜３１ｋＤａ）、等電点電気泳動でも単一ポリペプチドバンドを与える（等電点５．０）。この酵素はキシログルカンに対して絶対的な特異性を示し、タマリンド種子キシログルカンの加水分解後に得られる最終生成物の分析によって決定したところでは、エンド型の作用を示す（文献１５）。この酵素の本来の基質はノウゼンハレンの子葉の貯蔵キシログルカンであるが、インヴイトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）ではフコース含有−次細胞壁キシログルカンをも加水分解することが報告されている（文献１１）。高い基質濃度でのキシログルカンエンド−トランスグリコシラーゼ（ＸＥＴと略す）活性が報告されている（文献１８）。

同様の酵素活性が他の植物組織中でも検出されており、エントウの茎の様々な部分での増殖速度と積極的に相関していることが報告されている（文献１９）。

ＸＥＴは、ミクロフィブリル間に存在するキシログルカン鎖の切断及び再結合に関与していて、この作用によって、植物細胞の伸長に必要な細胞壁の弛緩が起こるものと考えられている。ＸＥＴ活性はトマト果実でも実証されているが（キシログルカンオリゴ糖によって活性化され得るキシログルカナーゼ）、トマト果実では成熟過程の［ブレーカ−（ｂｒｅａｋｅｒ）Ｊ段階で最高値を示すと報告されており（文献２０）、柔軟化過程に関与しているらしい。

本願では、ノウゼンハレンからのキシログルカン特異的エンド−（１−４）−β −Ｄ−グルカナーゼ（キシログルカナーゼ／ＸＥＴと略す）遺伝子の単離について開示する。この新規ヌクレオチド配列にコードされた酵素はキシログルカンに対する特異性が高い（文献１１）。

発明の概要本発明の一つの態様では、キシログルカン特異的エンド−（１−４）−β−Ｄ− グルカナーゼ活性を有する酵素をコードするヌクレオチド配列にして、図９に示す配列ＮＸＧ　１　（配列番号＝１）のヌクレオチド３５〜９１９を含んでなる配列又はその機能的均等物が提供される。

当業者には明らかであると思われるが、本発明のヌクレオチド配列の機能的均等物には、たとえば、同一のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（ただし、遺伝暗号の縮重のために異なるヌクレオチド配列をもつもの）；実質的に同一ではあるが１又はそれ以上のアミノ酸が同類置換（すなわち、類似の性質をもつアミノ酸によるアミノ酸の置換）されたポリペプチドをコードする配列；実質的に同一（好ましくはアミノ酸相同性が５０％以上、より好ましくは６０％以上）ではあるが１又はそれ以上の副次的（ｍｉｎｏｒ）欠失又はトランケーション（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ、末端部の切詰め）の存在するポリペプチドをコードする配列、並びにヌクレオチド３５〜９１９の相補鎖と標準的条件下でハイブリッド形成する配列が含まれる。このような機能的均等物は一般に７５％以上のヌクレオチド配列の相同性を有し、好ましくは８５％以上の相同性を有する。機能的均等物の一つの具体例は図９に示す配列ＮＸＧ２（配列番号：２）である。

機能的均等物の具体例の一つは、本発明の配列に対応するアンチセンス配列を含んでなる配列である。アンチセンス配列は一般的には機能的均等物とはみなされてはいないが、本願の目的とするところでは、機能的均等物という用語はこのような配列も包含した意味で用いられる。

好ましくは、上記配列は、適当な宿主中での発現を可能にするようなプロモーターなどの５′側不翻訳領域をも含んでなる。

好ましくは、上記配列は、本発明の配列の３′末端に実質的に隣接した「終止」コドンを含んでなる適当な３′非翻訳領域をも含んでなる。かかる３′側非翻訳領域は、終止コドンの他に、ポリアデニル化シグナルのような他のシグナルを含んでいてもよい。好適には、３′非翻訳領域は、図１に示す配列ＮＸＧ１のヌクレオチド９２０〜１０５５を含んでなる。

好適には、上記配列は遺伝子の一部を含んでなる。

このような遺伝子の例はノウゼンハレンＣＴｒｏｐａｅｏｌｕｍ　ｍａｊｕｓＬ、）由来の遺伝子であり、そのｃＤＮＡは、今回、本発明者によってクローニングされ配列決定された。

本発明のもう一つの態様では、図９に示す配列又はその機能的均等物を含んでなるベクターが提供される。かかるベクター中において上記配列に適当なプロモーターを作動可能な状態で連結して大量の酵素を生産すれば望ましいであろう。

例えば、キシログルカナーゼはタマリンド種子由来のキシログルカンの修飾に有用であることが知られている。

したがって、本発明は、別の態様では、上記酵素を生産する方法にして、上記酵素をコードする配列又はその機能的均等物を適当なベクターに挿入する段階、宿主細胞を上記ベクターで形質転換する段階、宿主細胞を適当な培養条件下で増殖させて酵素を発現させる段階、続いて培地及び／又は宿主細胞から酵素を得る段階を含んでなる方法を提供する。

好ましくは、宿主細胞は微生物である。真核生物の宿主のほうが酵素を完全に機能的なコンホメーションで発現する可能性が高いので、宿主細胞が真核生物であるのも好ましいが、ただし、これは必須事項ではない。

好適なベクターは公知であり、これらを用いて本発明の配列を植物中に導入し発現させることができる。

かかる植物は、例えば、本発明のヌクレオチド配列を本来有していない植物であってもよい。或いは、本発明の配列は、そのような配列を既に１又はそれ以上有しているような植物に導入してもよい。このような１又はそれ以上の配列の導入によって、キシログルカナーゼの発現を変化させることができるはずである。

したがって、本発明の別の態様では、本発明の配列又はその機能的均等物の導入された植物が提供される。

当業者には容易に理解されると思われるが、本発明の配列又はその機能的均等物の発現を、かかる発現が本来起こらないような植物又はかかる発現が様々なレベルで起こっているような植物中で行うと、上記配列にコードされた酵素の活性によって植物の性質を変化させることができる。同様に、本発明の配列の相補鎖（これは機能的均等物の一例である）のｍＲＮＡへの転写によってアンチセンスＲＮＡを作ると、トランスジェニック植物中での内在性キシログルカン遺伝子の発現が妨げられることになり、その結果、キシログルカナーゼ活性のレベルを低下させることができる。

したがって、本発明のさらに別の態様では、植物又はその一部分の性質を変化させる方法にして、本発明の配列又はその機能的均等物を上記植物に導入して、キシログルカナーゼ活性のレベルを変化させることからなる方法が提供される。

このような改変植物は、好ましくは開業的に重要な植物（果実又は疏菜植物）で、本発明の方法を実行するに十分な知識が蓄積されていて、キシログルカンが構造的機能をもつもの（すなわち、双子葉植物、並びにイネ科以外の単子葉植物）である。このような植物としては、アルファルファ、リンゴ、ブロッコリー、キャベツ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、ワタ（綿）、クランベリー、キュウリ、ナス、アマ（亜麻）、ブドウ、セイヨウワサビ、キウィ、レタス、マンゴ− 、メロン、ナタネ、パパイヤ、エントウ、モモ、セイヨウナシ、コシヨウ、プラム、ポプラ、ジャガイモ、ラズベリー、ダイズ、トウヒ、イチゴ、サトウダイコン、サツマイモ、タバコ、トマト、クルミが挙げられる。

必ずしも植物全体の性質を変える必要はない。植物の一部分（例えば種子、果実）の性質を変えることが望ましい場合もある。これは、例えば、導入配列の転写を調節する組織特異的プロモーターを用いることによって達成できる。

本発明の方法は、その植物の関連部分におけるキシログルカナーゼ活性のレベル及びキシログルカンの平均分子量を変化させると期待される。さらに、キシログルカンの重要な構造的役割に鑑みれば、寸法、成長速度、テクスチャー又は成熟速度などの性質についても変化させることができると期待される。

以下、例示的な実施例及び添付図面を参照することによって本発明をさらに詳細に説明する。

添付図面について説明する。

図１及び図２は、抗キンログルカナーゼ抗体の粗標品（図ＩＡ）又はアフィニティー精製標品（図ＩＢ及び図２）をプローブとして用いた免疫プロットの写真である。

図３は、ノウゼンハレン種子ＲＮＡインヴイトロ翻訳産物（レーン５及び６）並びに当該翻訳産物と抗キンログルカナーゼ抗体との免疫沈降物（レーン１〜３）についての５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析の写真である。

図４は、ノウゼンハレン種子中でのキシログルカナーゼ発現レベルの時間経過を示したものである。

図５は、ノウゼンハレンｃＤＮＡクローン群の制限酵素分析の結果を示す。

図６は、ｃＤＮＡクローン２Ａのサブクローニング及び配列決定についての方法を示す。

図７は、様々なノウゼンハレンキンログルカナーゼｃＤＮＡクローン群の相関関係を示す。

図８は、キシログルカナーゼのコード鎖全体を含んでなるプラスミドの構築に用いた方法を示す。

図９は、キシログルカナーゼの完全なｃＤＮＡ配列のヌクレオチド配列（ＮＸＧＩ）、機能的均等物のヌクレオチド配列（ＮＸＧ２）、並びにこれらのヌクレオチド配列にコードされたアミノ酸配列ＣＮＸＧ１．配列番号：３）を示す。

図１０〜図１８は、センス型又はアンチセンス型の植物発現ベクターの構築に用いた各種プラスミド地図である。

キシログルカナーゼ活性は発芽後１２〜１４日目にピークを示し、キシログルカン貯蔵量の急速な低下と符合することが判明している。この事実が果たしてキシログルカナーゼのドウノボ合成を意味しているのか確認するために、ウェスタンブロッティング法を用いて発芽期間中のタンパク質レベルを定量した。

スターリング大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｓｔｉｒｌｉｎｇ）で調製した粗ポリクローナル抗体を用いて、発芽１２日口の種子の粗抽出物を（既知量の抗体と共に）ブロッティングした。強い交差反応を示すポリペプチドが３１ｋＤａに検出され、その量は種子の全タンパク質のおよそ０．５％に相当した。４５〜４６ｋＤａの第二のポリペプチドも粗血清と交差反応した（図１ａ）。

ゲル分画キシログルカナーゼ（３１ｋＤａ）を用いて、上記粗抗体標品をアフィニティー精製した。タンパク質（２５μｇ）を真空乾燥により濃縮し、ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）で分画して、上述の通りニトロセルロースフィルター上にブロッティングした。ニトロセルロースフィルターは０．１％ポンソーＳ　（Ｐｏｎｓｅａｕ　Ｓ；　１％酢酸中）で染色し、１％酢酸で脱染した。抗体の結合したニトロセルロース片を、トリス緩衝塩類溶液（ＴＢＳと略す）中で洗浄（５Ｘ５分）Ｌ、ＴＢＳと１５％ヘモグロビンと２．５％粗抗体からなる４℃の溶液中で２０時間インキュベートし、次いでＴＢＳで濯いだ。抗体を０．２ＭグリシンｐＨ２，８中に遊離させ、これをＩＭのＮａＯＨ溶液又は１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８）のいずれかで中和した。このようにしていったんアフィニティー精製した抗体は、種子抽出物のウェスタンブロッティングで分子量の大きなペプチドを検知しなくなるが（図１ｂ）、この事実は最初の抗原標品中にキシログルカナーゼとは免疫学的に無関係な微量の夾雑物が含まれていた可能性があることを示唆している。

至呈上記のアフィニティー精製抗体を使用して、発芽期間中のキシログルカナーゼレベルを定量した。そのレベル（タンパク量）は最初に急激に上昇し、発芽後約１１８目にピークを示した（図２）。この結果は、既に報告されている発芽中のノウゼンハレンにおけるキシログルカナーゼ活性のピークと一致し、種子の発芽の際にこの酵素がドウノボ合成されることを示唆している。

里旦ノウゼンハレンの子葉（２ｇ）をドライアイス存在下でＭｏｕｌｉｎｅｘプレンダーで破砕し、次いで液体窒素存在下で乳鉢と乳棒で微粉状にした。ＲＮＡの単離を％　Ｌ　ＩＣＩ沈殿の再懸濁液をフェノール／クロロホルム（１：　１）で２度抽出した点を除いてはほぼＨａｌｌの方法（文献１２）にしたがって行った。

通常の操作では、発芽中のノウゼンハレンの子葉２ｇから５００μｇの分光学的に透明なＲＮＡが得られた。ＲＮＡはアガロースゲル電気泳動でほぼ無傷の状態にあると判断された。

Ａｍｅｒｓｈａｍ　ｒｎｔｅｒｎａｔｉｎａ１社から販売されている無細胞・ヌクレアーゼ欠損・小麦胚翻訳系を用いて、全ＲＮＡをインヴイトロで翻訳した。

通常の操作では、１Ｍ酢酸カリウム１２μ１１メチオニンを除（アミノ酸混合物８μｍ、３５３−メチオニン（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｎａ１社製。

８００Ｃ４／ｍｍｏ　１）１０μＬ　３４μｌのＨ，Ｏ及び小麦胚抽出物６０μ ｌを含有する混合物を調製した。１μｌの全ＲＮＡ（１０μｇ）をこの小麦胚混合物１４μｌと共に２５℃で６０分間インキュベートした。翻訳混合物（１０μ ｌ）を、１００μｌのＨ２０／ＳＤＳ混液（ＳＤＳ濃度０．１％、０．５％、１％又は２％）中で１分間煮沸し、次に１μｌの抗体の存在下又は非存在下で免疫沈降緩衝液（１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００，５０ｍＭトリス−塩酸、１）Ｈ８，Ｏ，０，３ＭＮａＣ１）９００μｌと２０℃で３時間インキュベートした。プロティンＡ−セファロース（Ｌｍｇ）を添加してインキュベーションをさらに１時間続け、しかる後に沈殿した抗原−抗体／プロティンＡ−セファロース複合体をベンチトップ型マイクロ遠心機で遠心分離した。このベレットを上記免疫沈降緩衝液で２回洗浄し、５０ｍＭｈリスー塩酸、ｐＨ８，０で１回洗浄した後、ＩＸＬａｅｍｍｌ　ｉ試料用緩衝液中で煮沸し、ＰＡＧＥにかけ°〔分析した。結果を図３に示す。この図は、２％ＳＤＳ存在下（レーン１）、１％ＳＤＳ存在下（レーン２）、０．５％ＳＤＳ存在下（レーン３）、０．１％ＳＤＳ存在下（レーン４）、ＳＤＳ非存在下（レーン５）又は抗体非存在下（レーン６）で、翻訳産物が免疫沈降するか否かを示している。レーン７は、タンパク分子量マーカーＣＡｍｅｒｓｈａｍ社製）と免疫沈降キシログルカナーゼを含んでいる。ＳＤＳ濃度が０．５％以上のとき、ＳＤＳゲル上での見掛けの分子量３３．５ｋＤａのポリペプチドだけが上記アフィニティー精製抗キシログルカナーゼ抗体で免疫沈降した（レーン１〜３．ゲルの半分よりやや下の位置）。

免疫沈降キシログルカナーゼは、種子抽出物中に検出される成熟タンパク質（３１ｋＤａ）よりも２．５ｋＤａだけ大きい。この知見は、キシログルカナーゼが前駆体として合成され、これを細胞壁へと導くようなＮ末端シグナルペプチドをもっていることと符合する。

図４発芽後８．９．１０及び１２日目のノウゼンハレンの種子から全ＲＮＡを単離した。１０μｇのＲＮＡをインヴイトロ翻訳して、得られた放射性標識キシログルカナーゼ前駆体を抗キシログルカナーゼ抗体及びプロティンＡ−セファロースビーズを用いて免疫沈降させた。ＰＡＧＥ後にフルオログラフィーと走査型レーザーデンシトメーター測定を行って、キシログルカナーゼ量を定量した。ヒストグラム形式で表したその結果（図４）は、キシログルカナーゼｍＲＮＡの量が発芽中に上昇して１２日目にピークに達することを示しており、キシログルカナーゼのタンパク量及び酵素活性レベルの結果と符合している。

図５１２日目の全ＲＮＡ１品を数多く保存しておき、ポリ（Ｕ）セファロースクロマトグラフィーで２０μｇのポリ（Ａ）”ＲＮＡを単離した。ポリ（Ｕ）セファロースはＢＲＬ社から入手したもので、カラムは製造業者の指示通りに組み立てた。結合用緩衝液（０，２Ｍ　ＮａＣ１，１０ｍＭ）リス−塩酸、Ｉ）Ｈ７，５，１ｍＭＥＤＴＡ、０．２％５ＤＳ）中でカラムにＲＮＡ（最大４ｍｇ）をのせ、次いで回収された両分のｏＤ２ｂ０が無視できる程度になるまで上記結合用緩衝液でカラムを洗浄した。次に、溶出緩衝液（９０％ホルムアミド、１０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ７，５，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．２％５ＤＳ）を流してカラムからポリ（Ａ）＋ＲＮＡを溶出し、エタノール沈殿で濃縮した。

２．５μｇのポリ（Ａ）”ＲＮＡを使用して、クローニングベクターλＺＡＰＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇａｎｅ社から購入し、製造業者の指示通り使用した）中でのｃＤＮＡライブラリーを作製した。このベクターの主な利点は、方向性をもったｃＤＮＡクローニングができる点と、インヴイボ切断により迅速にサブクローニングできる点にある。得られたライブラリーの力価はほぼ百方クローンであり、そのおよそ７５％は組換え体であった。

このライブラリーの一部（４００００クローン）を直ちにブレーティングし、増殖させた。

２０００クローンは大腸１ｆ（Ｅ、ｃｏｌ　１）ＳＵＲＥ細胞を用いてブレーティングし、咀抗キシログルカナーゼ抗体でスクリーニングした。４つの陽性反応クローンが見付かった。これらの陽性クローンに対応する保存ファージを回収し、ブレーティングとスクリーニングを数回行ってプラークを精製した。

プラスミドＤＮＡをインヴイボ切断して、限定的な制限酵素分析に付した（図５）。４つのクローンすべてが内部５ａ１１部位を含んでいることが判明した。

大きいほうの２つのクローンは、３′末端の近くにＨ４ｎｄｍ部位を有していた。

これら４つのクローンすべてのｃＤＮＡインサートをＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化して切り出し、キシログルカナーゼ特異的オリゴヌクレオチドをプローブとして用いてサザーンブロツティングした。

キシログルカナーゼペプチドＦｉｌ：　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ａｖｎ　ＴｙｒＩテＪ番号＝番号−４分）ＮＥＧＩオリゴヌクレオチド混合物：　ＴＴＡ　ＡＴＡ　ＴＡＣＣＡＮ　ＡＴＡ　ＴＴＡ　ＡＴＧＧ　ＧＧ１テ１番号＝５、及び標記の各位置の１以上の箇所にＧを有する各種変異体）４つのｃＤＮＡインサートはすべて上記キシログルカナーゼ特異的プローブとハイブリダイズした（結果図示せず）。

図６最も大きなりローン（２Ａ）をＭ１３サブクローニングしてＤＮＡ配列を決定した（図６）。６個の遺伝子特異的内部ＤＮＡプライマーを用いて、インサート（ＥｃｏＲＩ−Ｆ（ｉｎｄｆｌｒ）の配列を両方向から完全に決定した。配列決定された断片は鎖長が９１４塩基対で、５２８個のヌクレオチド（アミノ酸１７６残基）からなるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでいた。

図７４つのキシログルカナーゼ１ｙｓｃペプチドＦｉｌ、Ｆ１３、Ｆ１４及びＦ２０（それぞれ、配列番号：４．　６．　７．　８）は上記の２ＡのＯＲＦ内に位置しており、それがキシログルカナーゼ特異的プローブと同一であることが確認できた（図７）。さらに、上記４つのペプチドすべてがそれらの推定アミノ酸配列の直前にリシン残基を有していた。

牛シａグルカナーゼ転写物の大きさはノーザンプロッティングの結果から約１．５ｋｂと推定され（データ図示せず）、上述のノウゼンハレンのインヴイトロ翻訳産物を免疫沈降させて得たキシログルカナーゼ前駆体をコードするのに十分な大きさであった。この３３．５ｋＤａタンパク質（約２９０個のアミノ酸残基からなる）は８７０ｂｐ程度のＯＲＦでコードされているはずである。これらの知見は、５゛翻訳開始シグナルが存在していないことと照らし合わせると、２Ａが部分的キシログルカナーゼクローンであって、５′コード領域及び５′非コード領域のかなりの部分が失われていることを示唆している。

ノウゼンハレンｃＤＮＡライブラリーからキシログルカン遺伝子全体を含むクローンを単離するために、オリゴヌクレオチド（Ｎ２Ｏ２）を合成した。このＮ２Ｏ２はクローン２Ａの５′末端（ヌクレオチド２〜３１）に対応する。

（添付の配列表の配列番号　９）Ｎ２Ｏ２：　ＣＣＡＧＧＴＡＴＴＧＴＴＣＣＧＡＧＡＡＡＴＴＣＡＡＴＡＴＣＧ　（７ンｆセ：ｚス）これを放射性標識し、−次ｃＤＮＡライブラリー及び増幅ｃＤＮＡライブラリー双方のスクリーニングに用いた。多数の「推定」陽性クローンが認められたが、それらはすべて以後のＮＥＧ５スクリーニングで脱落した。

増幅ｃＤＮＡライブラ’Ｊ−（−次りｏ−ン約４００００）の１０００００クローンを抗キンログルカナーゼ抗体でスクリーニングし、７８個の陽性クローンを同定した。取扱いの便宜上、これらを２０クローンを含む八と５８クローンを含むＢの２つのグループに分けた。

上記の抗体スクリーニングで得られた推定陽性クローンを含む２０種類の保存ファージ（グループＡ）を回収し、抗体スクリーニングを繰り返してプラーク精製した。プラーク精製ファージ保存株を次に５′特異的キンログルカナーゼオリゴヌクレオチドプローブＮＥＧ５でスクリーニングした。この２ｏクローンのうちの９クローンがＮＥＧ５陽性であった。これらのクローンのプラスミドＤＮＡをインヴイボ切断し、制限酵素ＢａｍＨＩ及び５ａｌｌで消化して分析した。これにより、上記９クローンのうちの８クローンに内部５ａｌｌ制限酵素部位が存在することが確認され、最も長い５″領域を有するクローン８．２を同定した。このクローン８．２のＢａｍＨＩ−３ａ　ｌ　Ｉ断片をＭｌ　３ｍｐ９にクローニングし、Ｍ１３ユニバーサルプライマーを用いて配列決定した。クローン８．２はクローン２Ａよりも４０ｂｐ長い（５′末端）ことが判明したく図７ｃ）。

第二の５′特異的キシログルカナーゼオリゴヌクレオチド（ＮＨＯ２）を合成した。このＮＨＯ２はクローン８．２のヌクレオチド４〜２６に対応する。

（添付の配列表の配列番号　１０）ＮＨＯ２：　ＣＣＴＧＧＡＴＡＧＴＣＴＴＧＡＴＴＡＴＴＣＧＡ　（アンチセンス）ＮＨＯ２はヌクレオチドＧＣを９７２３の割合で含有しており、ＺＡＰＩＩライブラリー中の大多数のキシログルカナーゼクローンの「上流」に位置する領域に対応する。このオリゴヌクレオチドは、■ＰＣＲ増幅、■ｍＲＮＡプライミング、又は■オリゴヌクレオチドスクリーニングのどの方法を用いても、全鎖長キシログルカナーゼｃＤＮＡの単離が容易に行えるように設計した。

上記抗体スクリーニングで得た推定陽性クローンを含む５８種類の保存ファージ（グループＢ）を回収した。陽性クローンのｃＤＮＡインサート（５′末端）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法で増幅した。これは１０〜５０％プラーク精製ファージ保存株５μｌ又は増幅ｃＤＮＡライブラリー保存株５μｌを使用して行った。ＰＣＲ産物は、ゲル精製ＤＮＡを１５μｌのＨ２Ｏに再懸濁することにより、繰返し増幅した。ＰＣＲ反応は、１００μｌの緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸。

ｐＨ８，３，５０ｍＭ　ＮａＣ１，１，５ｍＭ　ＭｇＣｈ、Ｏ，０１％［Ｗ／Ｖｌゼラチン）中で、５０ｐｍｏｌのセンス及びアンチセンスプライマー、２０　ｍ　ＭのｄＮＴＰ及び２．５単位のＴａｑポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて行った。

部分精製ファージ保存株及びゲル精製ＤＮＡは、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で２０秒間（アニーリング）及び７２℃で３０秒間（伸長）からなるサイクルを３０サイクル行った。

ｃＤＮＡライブラリー保存株を下記の段階を利用して増幅した。

−９５℃で２分間 −９５℃７２分間、５５℃７２０秒間、７２℃７２分間の１サイクル、＝　９５ ℃７３０秒間、５５℃７２０秒間、７２℃７２分間の５サイクル、＝　９５℃７３０秒間、５５℃７２０秒間、７２℃７３０秒間の２４サイクル、−７２℃で５分間、 −４℃に維持。

最初に、２１量体プライマ一対（ＧＣ含量約５０％）を使用した。

（添付の配列表の配列番号　１１）１）　ＸＰＣＲＩ：　ＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＣ（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター）１７１１番号　１２）２）　ＸＰＣＲ２：　ＴＧＴＴＧＴＴＧＧＣＴＣＡＡＣＴＧＡＣＣＡ　（７ンチセンスキシログル力ナー焔増幅ｃＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分析し、５つの最長クローンを同定した。

これら５つの最長クローンのｃＤＮＡインサート（５′末端）を、第二のＰＣＲ反応で増幅した。これらのクローンがクローン８．２よりも長いことを確認するために、ＸＰＣＲＩとＮＨＯ２をプライマーとして用いた。

クローン３．４　（ｐＳＫ３．４）のＢａｍＨＩ−３ａ　Ｉ　Ｉ断片をＭｌ　３ｍｐ９及びＭ１３ｍｌ）８にサブクローニングして、それぞれＭ１３ユニバーサルブライマーとＮＥＧ６プライマーを用いて配列決定した。キシログルカナーゼの同定は、クローン２Ａ及び８．２との配列のオーバーラツプによって行った。

クローン３．４のｃＤＮＡインサートはクローン８．２よりも７２ｂｐ長い（５ ′末端側）が、キンログルカナーゼＯＲＦ全体を含むほと長くはない（図７ｄ）。

増幅ＺＡＰＩＩライブラリー保存株を鋳型として用いて、ＸＰＣＲＩとＸＰＣＲ２をプライマーとして用いたキシログルカナーゼクローンのＰＣＲ増幅を行った。

この結果、このライブラリー中の大多数のキシログルカナーゼクローンが２Ａと同様の鎖長を有していて換言すれば部分的クローンであることが判明したが、このライブラリーにはもっと大きなりローンも少数含まれていることが判明した。

ＸＰＣＲＩとＮＥＣ６Ｂ（増幅産物のクローニングが容易になるように、ＮＨＯ２の５′末端にＢａｍＨＩ部位を有する）を用いて第二の増幅を行った。

（添付の４７１１表の配列番号　１３）ＮＨＯ２：　ＧＡＧＧＡＴＣＣＴＧＧＡＴＡＧＴＣＴＴ’ＧＡＴＴＡＴＴＣＧＡ　（７：／チセンス）ＮＥＣ６Ｂプライマーはクローン２人の５゛末端の上流に位置しているので、このライブラリーの少数の大キンログルカナーゼクローンに対して特異的であるはずである。ＰＣＲによって多数のバンドか得られたか、これをゲル精製して再度増幅して、サブクローニング用の純粋Ｄ　Ｎ　Ａを得た。４５０ｂｐ断片（１）と２５０ｂｐ断片（２〕をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化して、Ｍ１３ｍｐ８及びＭ１３ｍｐ９にクローニングした。大きい方の断片のＭ１３ｍｐ９へのクローニングによって、プラスミドｐＭ１３ＸＧＰＣＲ１が得られた。この大断片を配列決定したところ、ｃＤＮＡ部分は鎖長が３４６ｂｐであって、ｃＤＮＡクローン３４と７５ｂｐオーバーランプしていることが判明した。図７に、上述の３種類のｃＤＮＡクローン２Ａ、８．２及び３．４、並びに上記のＰＣＲ増幅ｃ　ＤＮＡ断片のオーバーラツプを示す。

図８ｐＭ１３ＸＧＰＣＲ１の二本鎖ＤＮＡ　（ＲＦ）を調製し、ｃＤＮＡの５′末端を保有するＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片を回収した。この断片を、ＥｃｏＲニーＢａｍＨＩで切断したｐＳＫ、３．４（このプラスミドはλ　ＺＡＰ　Ｉ　Ｉライブラリーから得られたｃＤＮＡクローン３．４のインヴイボ切断によって生じる）に、ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩアダプターを利用して連結し、ｐＳＫＮＸＧを作製した（図８）。

皿旦図９はノウゼンハレンの完全なキシログルカナーゼｃＤＮＡのヌクレオチド配列（ＮＸＧ１）を示す。ＮＸＧ１は、ＰＣＲ増幅ｃＤＮＡ断片（ヌクレオチド１〜３５３）及びｃＤＮＡクローン３．４（図７ｄ、　ヌクレオチド２７９〜１２２９）から得た。このように、ＰＣＲ断片とクローン３．４の間には７５ｂｐのオーバーラツプ（完全に相同）が存在する。これは約１３００ｂｐの長さで、８８５ｂｐ（アミノ酸２９５残基）のＯＲＦを含んでいる。四角で囲った部分は、図７ａに図示した４つのペプチドＦ２０、Ｆ１ａ、Ｆ１４及びＦｉｌの位置を示している。

図示した配列の開始コドンの１８ｂｐ上流にもう一つのインフレーム（読み枠の整合した）Ａ、ＴＧｌ−リプレットが存在する。このもう一つのＡＴＧコドンの５′側の配列は、植物翻訳開始シグナルのコンセンサス配列との関連が少ないものの、ここが開始部位である可能性は残る。仮にこのもう一つのＡＴＧコドンが実際の翻訳開始コドンであるとすると、その遺伝子産物は本発明の配列の機能的均等物を与えると予想される。

ＮＸＧ１にコードされたポリペプチド配列ＣＮＸＧＩ）についてもアミノ酸の一文字記号で図９に示した。比較のため、ＮＸＧ１とＮＸＧ２の配列の相違箇所を示しである。ＮＸＧ２はｃＤＮＡクローン２Ａ（図７ｂ、　ヌクレオチド４１〜９５４）とｃＤＮＡクローン８．２（図７ｃ、クローン２Ａよりも５′末端側が４０ｂｐ長い）から得られた機能的均等物である。

図１０〜図１８　ノウゼンハレンーキシログルヵナーゼ・センス及びアンチセンス配列のトランスジェニック植物中における発現ａ）　５ＬＪ２’ＬＮＯ３の構築ベクターｐＳＬＪ　１００６（文献１３）を制限酵素Ｃ１ａｌで消化した（図１０）。

その２００８ｂｐ　ＤＮＡ断片（β−グルクロニダーゼ［ＧＵＳ］遺伝子遺伝子クツバリン合成酵素９］３’終結配列）を回収し、それをＣＩａＩで線状化しておいたＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ＋に連結して、ｐＢＬＵＥ−ＧＵＳ−Ｎｏ９（図１１）を作製した。このベクターを制限酵素ＸｂａＩ及び５ｓｔＩで消化して、その１８５２ｂｐ　ＧＵＳ遺伝子断片を下記ポリリンカー配列（−ＸｂａＩ −ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ−３ｓｔＩ−ＢｇｌＩＩ−Ｃ１ａｌ−）：５’　ＣＴＡＧＡＧＡＡＴＴＣＴＣＧＡＧＡＧＣＴＣＡＧＡＴＣＴＡＴＣＧＡＴＡＧＣＴ　３ ’ｌテ１番号＝１４）３’　ＴＣＴＴＡＡＧＡＧＣＴＣＴＣＧＡＧＴＣＴＡＧＡＴＡＧＣＴＡ　５’ｌｔｊ番号：１５）で置き換えてｐＢＬＵＥ−Ｌ−ＮＯ３（図１２）を作製した。Ｃ１ａＩを用いてｐ　Ｂ　Ｌ　ＵＥ−Ｌ−Ｎｏ　Ｓカラ’）　ンｔｙ−Ｎｏ　Ｓ　（Ｌ−Ｎｏ　Ｓ）断片を回収し、コノ断片をｐｓＬＪ１００６の大きい方（ベクタ一部分）のＣ１ａＩ断片に連結することによって、ｐｓＬＪ２’ＬＮＯ３（図１３）を構築した。

ｂ）ｐＳＬＪＧＸＮ−３の構築ｐＳＫＮＸＧ（図１５．このプラスミドについては図８との関連で既に説明しである）由来のＸｂａＩ−８ａｌＩ　ＤＮＡ断片上に存在するノウゼンハレンのキシログルカナーゼコード領域を、酵素ＸｈｏＩ及びＸｂａｌで消化しておいたベクターｐｓＬＪ２’ＬＮＯ３ｉ、：挿入すルコとにより、ベクターｐ　Ｓ　Ｌ　Ｊ　ＧＸＮ−３（図１４）を作製した。

ｃ）　５ＬＪＧＸＮ−Ｘの構築ｐＳＫＮＸＧ由来のＸｂａＩ−３ａｉｌ　ＤＮＡ断片上に存在するノウゼンハレンのキシログルカナーゼコード領域を、ベクターｐｓＬＪ２’ＬＮＯ３の対応部位に挿入することにより、ベクターｐｓＬＪＧＸＮ−３（図１６）を作製した。

ｄ）　５ＬＪＮＸＧの構築プラスミドｐｓＫＮＸＧをＸｈｏＩ（付着末端は平滑末端化）及び５ｓｔＩで消化して、そのＮＸＧ断片を、ＥｃｏＲＩ（付着末端は平滑末端化）及び５ｓｔＩで消化したｐ　Ｂ　Ｌ　Ｕ　Ｅ−Ｌ−Ｎｏ　Ｓのベクタ一部分に挿入することにより、ベクターｐＢＬＵＥ−ＮＸＧ（図１７）を構築した。次にｐＢＬＵＥ−ＮＸＧ由来のＸｂａｌＤＮＡ断片上のキシログルカナーゼコード領域を、ＸｂａＩで線状化しておいたｐｓＬＪ２’ＬＮＯ３に挿入した。得られたクローンをスクリーニングしてセンス方向にキシログルカナーゼ遺伝子断片が挿入されているもの（ｐ　Ｓ　Ｌ　Ｊ　ＮＸＧ）を得た（図１８）。

上述のＴ−ＤＮＡ構築体をアグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢｌ　４４０４株に導入し、これを利用して、植物形質転換の常法によりタバコの葉内盤状組織又はトマト子葉部分を形質転換した。無傷なＴ−ＤＮＡ断片が導入されたことがＰＣＲ／ゲノムサザーンブロプディング分析によって確認された（データ示さず）。

構成プロモーター配列又は適当な誘導プロモーター（例えば、発生段階による制御を受ける）配列の調節下におけるセンス配列の発現は、キシログルカナーゼｍＲＮＡの産生をもたらし、当該ｍＲＮＡの翻訳によってトランスジェニック植物中のキシログルカナーゼ酵素量が増大するであろう。

構成プロモーター配列又は誘導プロモーター配列の調節下におけるアンチセンス遺伝子の発現は、内在性キシログルカナーゼｍＲＮＡと相補的なｍＲＮＡの産生をもたらす。これらの互いに十分なレベルのＤＮＡ相同性を共有している内在性ｍＲＮＡとアンチセンスｍＲＮＡは、ＲＮＡ複合体を形成して、内在性ｍＲＮＡの正常な転写・プロセッシング・輸送又は翻訳を妨害するであろう。或いは、二本鎖ＲＮＡは不安定であるので、分解を受けるとも考えられる。

アンチセンス遺伝子技術が役に立つことは、ツクバネアサガオ（ペチュニアともいう）の花弁においてアンドシアニン産生能を欠失して着色孔の代りに無色の花をもたらす場合（文献１４）のように肉眼で視認し得る表現型レベルでも、トマト果実の成熟時にポリガラクツロニダーゼ量が変化してペクチンの解重合が低減する場合（文献８）のように生化学的レベルでも、実証されている。

この方法を利用すると、目的農作物のキシ西グルカン・エンド−キシログルカナーゼの量を変化差せることができる。ノウゼンハレン抗キシログルカナーゼ抗体を用いれば、形質転換された植物組織中のキシログルカナーゼレベルを決定することができる。キシログルカナーゼの変化のレベルは、表現型性質、例えば成長速度、器官脱離又はテクスチャー及び貯蔵特性（果実又は野菜のいずれに対しても）などの変化と相関させることができる。

を−風−Ｘ−！１４、ｖａｎｄｅｒＫｒｏｌｆｌｔＬ　Ｎａｔｕｒｅ、３３３．　８６６−８６９．　１９８８配列表（１）一般情報（１）出願人（Ａ）名称：ユニリーバ−・ピー−エル・シー（Ｂ）Ｊすの住所：ブラックフライヤーズ、ユニリーバ−・ハウス（Ｃ）都市名　ロンドン（Ｅ）国名：英国（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：ＥＣ４Ｐ　４ＢＱ（Ｇ）電話番号：（０７１）８２２　５２５２（Ｈ）７ｙクシミ＋Ｊ番号：（０７１）８２２　５９５４（Ａ）名称：ユニリーバ−・エヌ・ヴイ（Ｂ）通りの住所、ヴエーナ４５５（Ｃ）都市名、ロッテルダム（Ｅ）国名：オランダ（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：３０１３　ＡＬ（Ａ）名称、ド・シルヴア、ジャクリーン（Ｂ）通りの住所：ザ・ハイ・ストリート、ペアー・トウリー・カテゴリ（Ｃ）都市名　ペイヴナム（Ｄ）州名：ベッドフォードシャー（Ｅ）国名、英国（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）＋ＭＫ４３　７ＮＪ（Ａ）名称ニジヤーマン、カール・ディ（Ｂ）通りの住所：グレンフィールド・ドライブ４３（Ｃ）都市名ニゲレート・トップイントン（Ｄ）州名：ノーサンプトンシャー（Ｅ）国名：英国（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：ＮＮ９　７ＴＥ（Ａ）名称、アロウスミス、ディヴイド・ディ（Ｂ）通りの住所：クイーン・ストリート５９（Ｃ）都市名　ラッシュデン（Ｄ）州名、ノーサンプトンシャー（Ｅ）国名　英国（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：ＮＮｌ０　０ＡＹ（Ａ）　名称　リード、ンヨン・ニス・ンイ（Ｂ）通りの住所　ロン−・ロード、アビイヴユ−６（Ｃ）都市名　スターリング（Ｄ）州名、スターリングツヤ− （Ｅ）国名６英国（Ｆ）郵便番号（Ｚ　Ｉ　Ｐ）・ＦＫ９　５ＪＺ（、へ）名称　エドワ〜ズ、メアリー・イー（Ｂ）通りの住所　ロノー・ロード、アビイヴユ−６（Ｃ）都市名　スターリング（Ｄ）州名　スターリングシャー（Ｅ）国名　英国（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：ＦＫ９　５ＪＺ（ユ１、発明の名称　組換え植物酵素（ｉｉｉ）配列の数　１５（１ｖ）　コンピューター可読形式（八）記録媒体　フロッピーディスク（、Ｂ）コンピューター　ＩＢＭＰＣコンパチブルＣ）！ｊｊ作システム：　ＰＣ−ＤＯ３／ＭＳ−ＤＯ３（Ｄ）ソフトウェア：Ｐａｔｅｎｔｌｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　＃１．０゜ヴアージョン１１．２５（ＥＰＯ）（２）配列番号：１に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ・１２２９塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー・直鎖状（１１）配列の種類：ｃＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイポセティカル配列：Ｎ。

（ｉｖ）アンチセンス＝ＮＯ（ｘｌ）配列・配列番号・１・ＣＣＴＴＡＴＴＣＡＣＴＴＣＡＣＡＡＡＴＧ　ＣＣＴＴＣＴＣＣＣＴ　ＣＣＡＴＡＡＴＧＣＣＴＣＣＴ＾＾ＣＡＴＴ　ＣＴＡＴＣＣＡＴＴＴ@６０丁ＴＣＴＴＣＡＴＣＴ　ＴＣＴＴＣＣＴＡＴＴ　ＣＴＡＡＴＧＴＴＴＴ　ＣＴＴＣＡＡＧＣＴＧ　ＴＴＴＧＧＧＴＣＡＧ　ＧＧＣＣＣＡＣＣsＴ　１２０ＣＡＣＣＡＧＧＡＴＡ　ＴＴＡＣＣＣＴＡＧＴ　ＡＧＣＣＡＡＡＴＣＡ　ＣＴＴＣＣＣＴＡＧＧ　ＣＴＴＴＧＡＴＣＡＡ　ＧＧＣＴＡＴＡＣ`Ａ　１８０ＡＴＴＴＡＴＧＧＧＧ　ＴＣＣＴＣＡＡＣＡＴ　ＣＡＡＡＧＧＧＴＡＧ　ＡＣＣＡＡＧＧＣＴＣＡＴＴＡＡＣＡＡＴＡ　ＴＧＧＣＴＴＧＡＴ■@２４０ＣＴＡＣＣＴＣＡＧＧ　ＡＡＧＴＧＧＡＴＴＣＡＡＡＴＣＧＡＴＴＡ　ＡＣＣＧＡＴＡＴＣＧ　ＣＴＣＴＧＧＴＴＡＣＴＴＣＧＧＴＧＣＴ＾@３００Ａ丁ＡＴＴＡＡＧＴＴ　、八ＣＡＡＴＣＴＧＧＡ　ＴＡＣＡＣＴＧＣＡＧ　ＧＡＧＴＣＡＴＴＡＣＡＴＣＴＴＴＣＴＡＴ　ＣＴＴＴＣＧＡＡsＡ　３６０ＡＣＣＡＡＧＡＣＴＡ　ＴＣＣＡＧＧＡＡＡＡ　ＣＡＴＧＡＴＧＡＧＡ　ＴＣＧＡＴＡＴＴＧＡ　ＡＴＴＣＣＴＣＧＧＡ　ＡＣＡＡＴＡＣＣbＧ　４２０ＧＡＡＡＧＣＣＧＴＡ　ＴＡＣＡＴＴＧＣＡＧ　ＡＣＧＡＡＴＧＴＴＴ　ＴＴＡＴＡＧＡＡＧＧ　ＡＡＧＴＧＧＡＧＡＴ　ＴＡＣＡＡＴＡＴ`＾　４８０ＴＣＧＧＡＡＧＧＧＡ　ＡＡＴＧＡＧＡＡＴＴ　ＣＡＴＴＴＡＴＧＧＴ　ＴＴＧＡＴＣＣＡＡＣＡＣＡＡＧＡＴＴＡＴ　ＣＡＴＡＡＣＴＡＴf　５４０ＣＴＡＴＴＴＡＴＴＧ　ＧＡＣＡＣＣ＾＾ＧＴ　ＧＡＧＡＴＣＡＴＡＴ　ＴＴＴＴＴＧＴＣＧＡ　ＴＧＡＴＧＴＡＣＣＧ　ＡＴＡＡＧＧＡＧfＴ　６００６へＣＣＣ’ＬへＧＡ、へ＾ＧＡＧＣＧＡＴＧＣＴＡＣＡＴＴＴＣＣＴＴＴＧＡＧＡＣＣＧＴＴＡＴＧＧＧＴＧＴＡＣＧＧＧＴＣＧＧＴＧＴU６０ＧＧＧ、八ＣＧＣＧＴＣＴＴＣＴＴＧＧＧＣＴ　ＡＣＴＧＡＡＡＡＣＧ　ＧＴＡＡＡＴＡＣ＾＾＾ＧＣＣＧＡＴＴＡＴ　ＣＧＡＴＡＣＣＡＡb７２０ＣＴＴＴＴＧＴＴＧＧ　ＡＡＡＧＴＡＣＧＡＡ　ＧＡＴＴＴＣＡＡＧＴ　ＴＡＧＧＴＴＣＧＴＧ　Ｃ，へＣＣＧＴＧＧＡＡ　ＧＣＧＧＣＴＴbＧＴ　７８０ＣＴＴＧＣＡＡＴＣＣＧＧＣＴＴＣＧＧＴＡ　ＴＣＡＣＣＴＴＡＴＧ　ＧＴＣＡＧＴＴＧＡＧ　ＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡ　ＧＴＣＧＣＧＧＣＧO　８４０ＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴ　ＴＣＡＧＡＡＡＡＡＴ　ＴＡＣＡＴＧＧＴＴＴ　ＡＴＡＡＴＴＡＴＴＧ　ｒｃＡＴｃＡｃｃｃｃ　ＡＣＡＣＧＡＧＡbＣ９００＾ＣＡＣＧＴＴＡＡＣＡＣＣＣＧＡＧＴＧＴ　ＴＡＡＧＡＴＴＴＣＡ　ＴＧＴＣＧＡＣＴＡＡ　ＡＡＡＡＡＣＡＣＡＧ　ＣＡ＾＾ＡＧＡＡＣ`　９６０ＡＡＡＡＧＴＴＴＴＡ　ＴＧＧＧＴＴＴＣ＾＾Ｔ＾＾ＴＴＴＴＴＣＴ　ＧＡＡＡＡＡＡＡ＾＾ＴＧＡＴＴＴＴＴＣＴ　ＡＴＴＴＧＧＡＴＴＴ@１０２０ＡＡＴＴＴＧＡＴＡＡ　ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ　ＡＧＧＧＴＴＴＧＴＴ　ＧＴＴＧＴＴＧＴＴＧ　ＴＴＴＡＡＴＡＡＴＧ　ＧＡＴＧＡＣＴＴfＡ　１０８０（２）配列番号：２に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ＝９３８塩基対（Ｂ）配列の型・核酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ（ｆｉｉ）ハイポセティカル配列・Ｎｏ（ｘｌ）配列：配列番号＝２＝ＴＡＣＡＡＴＡＴＡＡ　ＴＣＧＧＡＡＧＡＧＡ　ＡＴＴＧＡＧＡＡＴＴ　ＣＡＴＴＴＡＴＧＧＴ　ＴＴＧＡＴＣＣＡＡＣＡＣＡＡＧＡＴＴＡs　１８０ＧＧＧＴＣＧＧＴＧＴ　ＧＧＧＡＣＧＣＧＴＣＴＴＣＴＴＧＧＧＣＴ　ＡＣＴＧＡＡＡＡＣＧ　ＧＴＡＡＡＴＡＣＡＡ　ＡＧＣＣＧＡＴＴＡs　３６０ＣＡＡＡＡＧＡＡＣＡ　ＡＡＡＴＧＴＴＴＴＡ　ＴＧＧＧＴＴＴＣＡＡ　ＴＡＴＴＴＴＴＴＣＴ　ＧＡＡＡＡＡＡ＾＾Ｔ　ＧＡＴＴＴＴＣＴ`Ｔ　６６０ＴＴＧＧＡＴＴＴＡＡ　ＴＴτＧＡＴＡＡＡＡ　ＡＡＡＡＧＧＧＴＴＴ　ＧＴＴＧＴＴＧＴＴＧ　ＴＴＧＴＴＧＴＴＴＡ　ＡＴＡＡＴＧＧＡsＧ　７２０ＡＣＴＴＧＡＧＡＴＧ　ＧＧＴＣＴＡＣＴＴＧ　ＣＣＡＡＧＡＡＡＡＡ　ＧＧＴＧＣＡＡＧＡＧ　ＴＴＧＴＴＧＧＧＣＧ　ＡＴＣＧＴＣＣＡ`Ｇ　７８０ＣＡＴＴＣＡＡＧＡＡ　ＣＴＴＴＧＡＡＧＧＴ　ＴＡＴＧＴＴＧＴＧＴ　ＧＣＴＧＴＴＴＴＴＴ　ＴＴＴＴＡＡＴＡＴＡ　ＴＧＴＡＴＡＡＴ■f３４０（２）配列番号；３に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ＝２９５アミノ酸（Ｂ）配列の型二アミノ酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：不明（１１）配列の種類、タンパク質（ｉｉｉ）ハイポセティカル配列二Ｎ０（ｘｉ）配列：配列番号；３：Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕｌ　５　１０　１５Ｍｅｔ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　ＴｙｒＴｙｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ１１ｅ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　ＡｒｇＴｙｒ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　ＴｙｒＴｈｒ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｔｙｒｌｏｏ　１０５　１１０Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｈｉｓ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　ＧｌｕＳｅｒ　Ａ°ｐ↑’ ｊ、ａ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｑｒ３　Ｐｒｏ　Ｌｏｕ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｔａｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｖａ■ （２）配列番号：４に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸（Ｂ）配列の型二アミノ酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：不明（１１）配列の種類：ペプチド（ｉｉｉ）ハイポセティカル配列：Ｎ０（１ｖ）アンチセンス二Ｎ０（Ｖ）フラグメント型：中間部フラグメント（ｘｉ）配列：配列番号＝４＝（２）配列番号＝５に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２０塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（１１）配列の種類：ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉｉｉ）ハイポセテイカル配列＝ＮＯ（ｉｖ）アンチセンス：Ｙｅｓ（ｘｌ）配列：配列番号：５：ＴＴＡＡＴＡＴＡＣＣＡＮＡＴＡＴＴＡＡＴ　２０（２）配列番号：６に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ、１５アミノ酸（Ｂ）配列の型二アミノ酸（Ｃ）鎖の数・−重鎖（Ｄ）トポロジー：不明（ｉｉ）配列の種類；ペプチド（ｉｉｉ）ハイポセテイカル配列＝Ｎ。

（Ｖ）フラグメント型；中間部フラグメント（ｘｌ）配列・配列番号：６：（２）配列番号＝７に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１９アミノ酸（Ｂ）配列の型二アミノ酸（Ｃ）鎖の数、−重鎖（ｐ）トポロジー・不明（１１）配列の種類　ペプチド（ｉｉｉ）ハイポセティカル配列二Ｎ０（Ｖ）フラグメント型・中間部フラグメント（ｘｌ）配列、配列番号・７：Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ＾Ｉａ　５ｅｒＶａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｒ。

（２）配列番号、８に関する情報。

（１）配列の特徴。

（Ａ）配列の長さ＝１０アミノ酸（Ｂ）配列の型　アミノ酸（Ｃ）鎖の数　−重鎖（Ｄ）トポロン−二不明（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｉｉｉ）ハイボセティカル配列−ＮＯ（Ｖ）フラグメント型：中間部フラグメント（ｘｌ）配列：配列番号二８゜（２）配列番号：９に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（＾）配列の長さ：３０塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数　−重鎖（Ｄ）トポロンー：直鎖状（１１）配列の種類：　ｃＤＮＡ　ｔ　ｏ　ｍＲＮＡ（ｉｉｉ）ハイボセティカル配列、Ｎ０（１ｖ）アンチセンス：Ｙｅｓ（Ｘｌ）配列　配列番号・９゜ＣＣＡＧＧＴＡＴＴＧ　丁ＴＣＣＧＡＧＡＡＡ　ＴＴＣＡＡＴＡＴＣＧ　３０（２）配列番号：１０に関する情報：（１）配列の特徴：（＾）配列の長さ、２３塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（１１）配列の種類：ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮＡ（ｉｉｉ）ハイポセティカル配列−ＮＯ（１ｖ）アンチセンス：Ｙｅｓ（ｘｌ）配列：配列番号、１０・ＣＣＴＧＧＡＴＡＧＴ　ＣＴＴＧＡＴＴＡＴＴ　ＣＧ＾　２３（２）配列番号：１１に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２１塩基対（Ｂ）配列の型、核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー　直鎖状（１１）配列の種類：ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮＡ（ｉｉｉ）ハイポセテイカル配列；Ｎ。

（１ｖ）アンチセンス二Ｎ０（ｘｌ）配列　配列番号：１１・ＧＡＣＣ，〜ＴＧＡＴＴ　ＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴ　Ｃ２１（２）配列番号、１２に関する情報・（１）配列の特徴：（、へ）配列の長さ・２１塩基対（Ｂ）配列の型、核酸（Ｃ）鎖の数・−重鎖（Ｄ）トポロジー　直鎖状（１１）配列の種類：ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮＡ１ｉｉ）ハイポセテイカル配列 −Ｎ。

（ｉｖ）アンチセンス：Ｙｅｓ（ｘｌ）配列：配列番号＝１２・ＴＧＴＴＧＴＴＧＧＣＴＣＡＡＣＴＧＡＣＣＡ　２１（２）配列番号：１３に関する情報：（１）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２９塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（１１）配列の種類：ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮＡ（ｉｉｉ）ハイポセティカル配列；Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス二Ｎ０（ｘｌ）配列：配列番号：１３：ＧＡＧＧＡＴＣＣＴＧ　ＧＡＴＡＧＴＣＴＴＧ　ＡＴＴＡＴＴＣＧ＾　２９（２）配列番号＝１４に関する情報：（１）配列の特徴：（八）配列の長さ：３７塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー・直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮＡ（ｉｉｉ）ハイポセテイカル配列＝ＮＯ（Ｘｌ）配列、配列番号；１４゜ＣＴＡＧＡＧＡＡＴτＣＴＣＧＡＧＡＧＣＴ　ＣＡＧＡＴＣＴＡＴＣＧＡＴＡＧＣＴ　３７（２）配列番号：１５に関する情報；（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２９塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数−一本鎖（Ｄ）トポロジー；直鎖状（１１）配列の種類：ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮＡ（ｉｉｉ）ハイポセティカル配列＝ＮＯ（ｘｌ）配列：配列番号＝１５：ＡＴＣＧＡＴＡＧＡＴ　ＣＴＧＡＧＣＴＣＴＣＧＡＧＡＡＴＴＣＴ　２９１２３４５６７Ｂ９１０Ｆｉｇ、　２トーーーーーー９７０８６０−一→ 〈フト ’Ｄ　ｆｌ　Ｕ　−〇　〇、ｌ＋− ＰｓｔＩ　Ｓａ１１国際調査報告国際調査報告フロントページの続き（７２）発明者　ジャーマン、カール・ダドリー英国、エヌエヌ９・７テイーイー、ノーサンプトンシャー、グレート・トップイントン、グレンフィールド・ドライブ　４３（７２）発明者　アロウスミス、デイライト・アンドリュー英国、エヌエヌ１０・０エイワイ、ノーサンプトンシャー、ラッシュデン、クイーン・ストリート　５９（７２）発明者　リード、ジョン・スペシス・グランド英国、エフケイ９・５ジエイゼツド、スターリング、ロジー・ロード、アビイヴユー（７２）発明者　エドワーズ、メアリー・エリザベス英国、エフケイ９・５ジエイゼツド、スターリング、ロジー・ロード、アビイヴユー

Claims

【特許請求の範囲】

１．キシログルカン特異的エンド−（１−４）−β−Ｄ−グルカナーゼ活性を有する酸素をコードするヌクレオチド配列にして、図９に示す配列（配列番号：１）のヌクレオチド３５〜９１９を含んでなる配列又はその機能的均等物。
２．請求項１記載の配列にして、さらに５′側不翻訳領域をも含んでなることを特徴とする配列。
３．請求項１又は請求項２記載の配列にして、さらに３′側不翻訳領域をも含んでなることを特徴とする配列。
４．請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の配列にして、ＴｒｏｐａｅｏｌｕｍｍａｊｕｓＬ．由来の配列を含んでなることを特徴とする配列。
５．請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の配列を含んでなるベクター。
６．請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の配列が導入された植物又はその一部分。
７．植物又はその一部分の性質を変化させる方法にして、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の配列を導入することを含んでなる方法。
８．請求項７記載の方法にして、変化させる性質が、寸法、テクスチャー又は成熱速度であることを特徴とする方法。
９．請求項７又は請求項８記載の方法にして、果実又は蔬菜植物の性質を変化させることを特徴とする方法。
１０．請求項７乃至請求項９のいずれか１項記載の方法にして、トマト植物又はその一部分の性質を変化させることを特徴とする方法。
１１．キシログルカン特異的エンド−（１−４）−β−Ｄ−グルカナーゼ活性を有する酵素を生産する方法にして、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の配列を適当なベクターに挿入する段階、適当な宿主細胞を上記ベクターで形質転換する段階、上記形質転換宿主細胞を適当な培養条件下で増殖させて酵素を発現させる段階、及び培地及び／又は宿主細胞から酵素を得る段階を含んでなる方法
１２．請求項１１記載の方法にして、前記宿主細胞が徴生物であることを特徴とする方法。
１３．請求項１１又は請求項１２記載の方法にして、前記宿主細胞が真核生物であることを特徴とする方法。