KR100396210B1 - 고추 한별 품종의 글루칸가수분해효소 유전자 및 이를이용한 식물병 저항성 탐색방법 - Google Patents

고추 한별 품종의 글루칸가수분해효소 유전자 및 이를이용한 식물병 저항성 탐색방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고추 한별 품종의 글루칸가수분해효소 유전자 및 이를 이용한 식물병 저항성의 탐색방법에 관한 것으로, 고추식물의 세균병인 고추 세균성 점무늬병 (Xanthomonas campestrispv.vesicatoria)에 대해 저항성을 보이는 고추 한별 품종 (Capsicum annuumL. cv. Hanbyul) 유래의 글루칸가수분해효소 (glucanase) 유전자를 분리하고 그 유전자를 삽입시킨 재조합 벡터를 구축한 후 형질전환체를 제조하고, 식물병원균을 접종하여 감염시키거나 또는 식물병 저항성 유도물질로 알려진 화학물질들을 처리한 경우 글루칸가수분해효소 유전자 발현 기작을 조사함으로써 식물체의 병원균에 대한 방어반응의 표지 및 식물체의 식물병 저항성 탐색방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

고추 한별 품종의 글루칸가수분해효소 유전자 및 이를 이용한 식물병 저항성 탐색방법 {Glucanase gene of Capsicum annuum L.cv. hanbyul and probing method of resistance for plant disease}
본 발명은 고추 한별 품종의 글루칸가수분해효소 유전자 및 이를 이용한 식물병 저항성 탐색방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 고추의 세균병인 고추 세균성 점무늬병에 대해 저항성을 보이는 것으로 알려진 고추 한별 품종(Capsicum annuumL. cv. Hanbyul)으로부터 글루칸가수분해효소 (glucanase) 유전자를 분리하여 그 염기서열을 분석하고, 이 유전자를 이용하여 식물이 다른 식물병원균에 의해 감염된 경우, 또는 식물병 저항성 유도물질로 알려진 화학물질들을 처리했을 경우의 글루칸 가수분해효소 유전자 발현 기작을 조사함으로써 식물병 저항성을 탐색하고 고추식물에서의 병 발생에 따른 방어반응을 검색하는 방법에 관한 것이다.
고추의 세균성 점무늬병은 반점세균병, 더뎅이병으로도 불리며 고추의 잎, 줄기, 과실에 반점을 형성하는데, 특히 잎에 생긴 반점은 조기 낙엽을 유발하여 수확량을 감소시키는 것으로 알려져 있는 보편화된 고추 식물병이다.
유해한 해충 및 병원균에 의한 특정 농작물의 침해는 대부분의 식량을 재배 식물에 의존하고 있는 인류에게 있어 생존까지도 위협하고 있는 심각한 문제이다. 이러한 문제를 해결하고 나날이 새롭게 등장하고 있는 병원균으로부터 식물체를 보호하기 위하여 다양한 방제 방법이 사용되고 있다. 그 중, 가장 쉽고 간편한 식물병 방제법은 농약을 살포하는 것인데, 이는 맹독성이므로 병원균뿐만 아니라 기타 주변 생태계의 생물까지도 대량 살상하여 생태계를 파괴시키고 토양 및 수질을 오염시키는 등의 폐해가 있다. 따라서, 농약 살포 등의 화학적 방제수단 뿐만 아니라 식물이 처해 있는 환경 및 조건을 고려하여 물리적, 생물학적 방제법 등을 적절히 적용하는 것이 중요하며, 특히 식물병에 대한 저항성을 자체 보유하고 있는 식물 품종의 개량 및 육종과 재배를 통한 방제가 필요하다.
작물 생산에 있어 병해충의 발생에 따른 생산량의 감소는 일찍이 기록되어져 왔다. 병해충에 의한 피해를 감소시키기 위한 노력의 일환으로 다양한 작물-병원균의 상호작용을 대상으로 병 저항성 작물의 육성 프로그램들이 진행되어 왔으며, 병 저항성에 대한 이해 및 이의 실제적 응용을 위해 병 저항성 식물에서의 저항성 기작의 연구가 여러 가지 작물 및 모델식물을 대상으로 실시되어 왔다. 집중적으로 연구되고 있는 작물로는 담배, 토마토 및 벼가 그 대표 사례라 할 수 있으며, 잡초의 일종인 애기장대풀은 식물병 저항성 연구를 위한 모델 식물로서 세계적으로 사용되고 있다. 담배, 토마토와 함께 대표적인 가지과 식물인 고추는 우리나라에서 오랫동안 향신료, 양념 등으로 사용되어 벼, 배추와 함께 우리나라 국민의 식단을 이루는 주된 작물 중의 하나이다. 고추 재배 중에 보고된 우리나라에서의 병 발생은 바이러스병, 세균병 및 진균병에 대해 나타나 있으며, 고추식물에서 주요한 병으로는 난균류에 의한 역병과 진균에 의한 탄저병, 세균에 의한 세균성 점무늬병 등이 보고되어 왔다. 이런 현실에도 고추식물의 병 저항성 기작을 포함한 방어반응 및 환경적인 스트레스에 대한 반응에 대한 연구는 미비한 실정이다.
기주식물은 식물병에 대하여 여러 가지 세포내 대사를 작동시켜 방어기작을 작동시키게 된다. 이러한 방어기작에 의해 병원균의 감염초기에 병진전을 제한시킬 수 있는지의 여부에 의해 기주식물과 식물병원균간의 반응이 결정되어, 친화적반응과 불친화적반응으로 나뉘게 된다. 불친화적반응에서 식물의 인식작용에 의해 병원균의 침입을 인지하면 이에 대한 반응으로 감염부위의 세포에 국부적 세포 죽음과 같은 과민성 반응 (hypersensitive reaction), 켈러스 (callose)의 축적, 리그닌 (lignin)화에 의한 식물 세포벽의 비후화, 피토알렉신 (phytoalexin) 등의 여러 종류의 항균성 물질의 생성, 병 생성 관련 단백질 [pathogenesis related (PR) protein] 생성 등이 일어난다고 보고되고 있다. 또한, 이러한 방어 기작은 병원균의 침입뿐만 아니라 살리실산이나 아미노부티르산 등에 의해서도 나타난다고 보고되었다. 이러한 반응을 일반적으로 유도저항성이라고 하는데, 이 반응은 식물이 병원체에 대해 방어할 수 있는 능력에서 중요한 역할을 하는 신호전달경로로써 평가된다. 이 유도저항성은 신호전달에 대한 모형으로서 흥미가 있으며 실용적인 가치가 있다. 이 저항성을 일으키는 생화학적 변화를 이해함으로써 병 저항성이 증진되는 유전공학적 식물을 개발하거나 식물의 저항성 유전기작을 촉진하여 작동하는 식물보호 화학물질을 개발할 수 있다.
지난 수년동안 병 생성 관련 단백질-1 (PR-1), 키틴가수분해효소, 그리고 글루칸가수분해효소 등의 단백질이 항미생물적 효과를 가지고 있으며 이들 단백질이 식물의 병 방어반응에서 중요한 역할을 한다는 사실이 알려져 왔다. 특히, 글루칸가수분해효소의 경우에 역병균과 모잘록병균등을 포함하는 난균류등의 하등 미생물의 세포벽 구성성분인 베타-1,3-글루칸을 분해하는 능력을 가지고 있으며 또한 키틴가수분해효소와 함께 곰팡이의 생육을 억제 효과를 상승시킨다고 보고되었다. 그리고 글루칸가수분해효소의 작용에 의해 곰팡이나 식물의 세포벽으로부터 분해된 글루칸분해절편이 식물의 다양한 병 방어반응을 촉진시키는 신호전달물질로서의 역할을 한다고 보고되었다. 식물군에서 글루칸가수분해효소의 분포는 담배, 토마토, 감자, 애기장대풀 등에서와 같이 매우 다양하다.
상기의 사실에 착안하여 본 발명자들은 고추 세균성 점무늬병에 대해 저항성을 보이는 한별 품종의 고추식물에서 클로닝한 글루칸가수분해효소 유전자 및 이를 이용한 고추식물에서의 병 발생에 다른 방어반응을 검색하기 위한 방법을 착안하였다. 즉, 본 발명은 식물의 병 방어반응을 대표할 수 있는 글루칸가수분해효소 유전자를 분리하여 분자적 수준에서 고추식물의 병 방어반응을 이해하고, 이를 이용한 앞으로의 고추식물의 분자육종프로그램에서의 활용의 가능성을 제시하며 상기 글루칸가수분해효소 유전자의 발현을 확인케 하는 단계를 포함하는, 고추 식물의 병 저항성 유도물질의 탐색방법을 제시한 것이다.
따라서, 본 발명의 목적은 상기의 사실들을 감안하여 고추 세균성 점무늬병에 대해 저항성을 보이는 고추 한별 품종에서 분리한 글루칸가수분해효소 유전자 CABGLU의 염기서열 및 그로부터 유추한 아미노산 서열을 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 글루칸가수분해효소 유전자를 삽입시켜 구축한 재조합 벡터 및 이 재조합 벡터를 대장균에 도입시켜 제조한 형질전환체를 제공하는 데 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 글루칸가수분해효소 유전자를 이용하여 병원균 감염, 비생물적 저항성 유도체에 의한 글루칸가수분해효소 유전자의 차별적 발현을 확인함으로써 식물체의 식물병 저항성을 탐색하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 상기 목적은 고추 한별 품종 (Capsicum annuum L. cv. Hanbyul)에 고추 세균성 점무늬병균 (Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)을 접종하여 감염시킨 고추 잎으로부터 mRNA를 분리한 후 역전사효소를 이용하여 cDNA를 제조하고 이를 공지된 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켜 cDNA 라이브러리를 제조한 후 이를 스크리닝하여 글루칸가수분해효소 유전자를 선발한 후 그 염기서열을 결정하고, 고추에 세균성 병원균, 진균성 병원균 및 비생물적 유도체인 에테폰, 살리실산, 메틸자스모네이트, β-아미노부티르산, 비티에이치 등을 접종 및 살포한 후 그 식물체의 RNA를 추출하여 전기영동하고 나이트란막으로 전이시킨 다음32P로 표지한 상기 본 발명 글루칸가수분해효소 유전자 프로브와 함께 반응시켜 그 유도 발현 정도를 탐색함으로써 달성하였다.
이하, 본 발명의 구성을 상세히 설명한다.
도 1은 고추 세균성 점무늬병 저항성 품종 고추 한별 품종(Capsicum annuumL. cv. Hanbyul)으로부터 클로닝한 글루칸가수분해효소 유전자의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 2는 고추 세균성 점무늬병 저항성 품종 고추 한별 품종(Capsicum annuumL. cv. Hanbyul)으로부터 클로닝한 글루칸가수분해효소 유전자로부터 유추한 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 3은 고추 한별 품종 (Capsicum annuumL. cv. Hanbyul)으로부터 클로닝한 글루칸가수분해효소 (glucanase) 유전자를 도입시켜 구축한 재조합 벡터 pCABGLU의 개열지도를 나타낸다.
도 4는 고추 세균성 점무늬병을 일으키는 잔토모나스 캄페스트리스 베지카토리아 (Xanthomonas campestrispv.vesicatoria)의 병원성 또는 비병원성균주를 한별 고추의 잎에 접종하였을 때 감염된 잎에서의 글루칸가수분해효소 유전자 발현 유도 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 고추역병을 일으키는 파이토프소라 캡시시 (Phytophthora capsici)의 병원성 또는 비병원성균주를 한별 고추의 줄기에 접종하였을 때의 글루칸가수분해효소 유전자 발현 유도 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 고추 한별의 엽면에 에테폰 10mM, 살리실산 5mM, 메틸 자스모네이트 100μM, 베타-아미노부티르산 19.4mM, 비티에이치 95.2μM를 각각 처리한 후의 글루칸가수분해효소 유전자 발현 유도 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 에테폰을 처리한 후 경과 시간에 따른 글루칸가수분해효소 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 메틸 자스모네이트를 처리한 후 경과 시간에 따른 글루칸가수분해효소 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 고추 한별 품종 (Capsicum annuumL. cv. Hanbyul)에 병원성이 약한 고추 세균성 점무늬병균 (Xanthomonas campestrispv.vesicatoria)을 접종하고 감염되어 과민성 반응을 보인 고추 잎의 mRMA와 병원균에 감염되지 않은 잎의 mRNA를 분리하는 단계; 상기 mRNA를 역전사시켜 cDNA를 제조하고 PCR 증폭시켜 cDNA 라이브러리를 제조하는 단계; 상기 cDNA 라이브러리로부터 개개의 cDNA 클론을 선발하여 나이트란막에 일정하게 흡착시키는 단계; 단일가닥 cDNA 탐침자를 이용하여 리버스노던하이브리다이제이션을 실시하는 단계; 상기 개개의 cDNA 유전자 클론 중 글루칸가수분해효소 유전자 CABGLU을 선발하고 그 염기서열을 결정하는 단계; 상기 글루칸가수분해효소 유전자 CABGLU를 페이즈미드 (phagemid) 벡터 pBluescript SK(-)에 삽입시켜 재조합 벡터 pCABGLU을 구축하는 단계; 상기 재조합 벡터 pCABGLU을 대장균에 도입시켜 형질전환체 에스케리치아 콜라이 CABGLU (Escherichia coliCABGLU)를 제조하는 단계; 고추 세균성 점무늬병균 중 식물체와친화적 반응을 하는 병원성균주 Ds1과 불친화적 반응을 하는 비병원성균주 Bv5-4a를 고추 잎에 접종하고 습실처리한 후 RNA를 분리하고 이 RNA를 전기영동한 후 나이트란막으로 전이시켜 상기 글루칸가수분해효소 유전자를32P로 표지한 프로브와 반응시킴으로써 고추 잎에서의 세균성 점무늬병균 감염에 의한 글루칸가수분해효소 유전자의 발현 유도를 확인하는 단계; 고추역병균 중 식물체와 친화적 반응을 하는 병원성균주 S197과 불친화적 반응을 하는 비병원성균주 CBS178.26를 고추 줄기에 접종한 후 RNA를 분리하고 이 RNA를 전기영동한 후 나이트란막으로 전이시켜 상기 글루칸가수분해효소 유전자를32P로 표지한 프로브와 반응시킴으로써 고추 줄기에서의 고추역병균 감염에 의한 글루칸가수분해효소 유전자의 발현 유도를 확인하는 단계; 식물체에 식물병 저항성을 유도한다고 알려진 에테폰, 살리실산, 메틸 자스모네이트, β-아미노부티르산, 비티에이치 등을 엽면 살포방법으로 처리하고 24시간 후 RNA를 분리하여 이 RNA를 전기영동한 후 나이트란막으로 전이시켜 상기 글루칸가수분해효소 유전자를32P로 표지한 프로브와 반응시킴으로써 식물병 저항성 유도물질에 의한 글루칸가수분해효소 유전자의 발현 유도를 확인하는 단계로 구성된다.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리 범위는 이들에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 고추 한별 품종 ( Capsicum annuum cv. Hanbyul) 유래의 글루칸가수분해효소 유전자 (glucanase) 분리 및 염기서열 결정
비병원성의 고추 세균성 점무늬병균 (Xanthomonas campestrispv.vesicatoria)을 접종하여 저항성이 유도된 고추 한별 품종에서 mRNA를 분리하고 이로부터 cDNA 라이브러리 (cDNA library)를 제조한 후 스크리닝하여 얻어진 글루칸가수분해효소 유전자를 분리하고 그 염기서열을 분석하였다.
한국산 고추 한별 품종 (Capsicum annuumL. cv. Hanbyul)에 비병원성의 고추 세균성 점무늬병균 (Xanthomonas campestrispv.vesicatoria)을 접종하고 18시간 동안 습실처리한 결과 세균성 점무늬병균에 감염되어 저항성 병반인 과민성 반응을 보인 고추 잎의 순화된 mRNA를 분리하고 이로부터 cDNA 라이브러리를 제작하였다. 제작한 cDNA 라이브러리로부터 개개의 cDNA 클론을 선발하여 이들을 나이트란막에 일정하게 흡착시킨 후, 건전한 고추 잎과 과민성 반응이 나타난 고추 잎으로부터 얻어진 단일가닥 cDNA 탐침자를 이용하여 리버스노던 하이브리다이제이션 (differential hybridization)을 수행하였다. 이 때 사용된 단일가닥 cDNA 탐침자를 제조하기 위해서 세균성 점무늬병균에 감염되어 저항성 병반인 과민성 반응을 보인 고추잎으로부터 total RNA를 분리하여 여기에 AMV-역전사효소 (reverse transcriptase)와 oligo d(t)18프라이머 (Roche사로부터 구입)와 dUTP -DIG이 함유되어 있는 dNTP 혼합물 (Roche사로부터 구입)을 혼합하여 25도에서 10분, 42도에서 60분, 99도에서 5분동안 반응하여 단일가닥 cDNA탐침자를 제조하였다. 이를 통하여 얻어진 과민성 반응에서 특이적으로 축적되는 결과를 보인 개개의 cDNA 클론 중 5'-말단의 염기서열을 통해 글루칸가수분해효소 유전자로 확인된 클론의 전체 염기서열을 결정하고 그 염기서열과 그로부터 유추한 아미노산 서열을 도 1 및 도 2에 나타내었다.
본 발명 고추 글루칸가수분해효소 (glucanase) 유전자 CABGLU는 모두 1332 bp의 염기서열로 구성되어있으며, 총 359개의 아미노산으로 이루어져 있다. 이들 아미노산 서열을 다른 식물의 유전자와 비교해 보면, 한별 품종으로부터 유래된 글루칸가수분해효소 유전자는 담배의 글루칸가수분해효소 유전자와는 77.4 %, 감자 유전자와는 64.6 %, 토마토 유전자와는 58.7 %의 비교적 높은 상동성을 보였으며 등전점 9.46의 염기성인 단백질로 밝혀졌다. 반면, 산성인 토마토의 글루칸가수분해효소 유전자와는 42.6 %의 낮은 상동성을 보여 고추 한별 품종으로부터 분리한 본 발명 글루칸가수분해효소는 염기성의 단백질임을 예상할 수 있다. 이를 기초로 할 때, 상기와 같이 클로닝된 고추 한별 품종의 글루칸가수분해효소 유전자는 다른 식물체에 존재하는 단백질 유전자와 구별되는 신규의 글루칸가수분해효소 유전자임을 알 수 있다.
실시예 2 : 스크리닝을 통해 얻어진 상기 페이즈미드 (phagemid) 상태의 글루칸가수분해효소 유전자를 대장균 ( E. coli )에 도입 (transformation)하여 형질전환체를 제조하는 과정 및 보관하는 방법
상기 본 발명 글루칸가수분해효소 유전자 CABGLU를 stratagene에서 제공하는 pBluescript SK(-) phagemid 벡터에 도입시켜 재조합 벡터 pCABGLU를 구축하고 그 개열지도를 도 3에 나타내었다.
Stratagene에서 제공하는E. coli균주인 XL1-Blue MRF'균주와 SOLR 균주를 30℃, LB 액체배지에서 하룻밤 진탕배양하여 여기에서 0.5 ㎖를 다시 50 ㎖ LB액체배지에 넣고 37℃에서 2-3시간동안 진탕배양했다 (OD600=0.2-0.5). XL1-Blue MRF'을 원심분리 (1,500 ×g)하여 10mM MgSO4로 OD600값이 1.0이 되도록 희석했다. 이 균주 200㎕, 스크리닝을 통해 얻어진 상기 phage stock 250㎕, ExAssist helper phage 1㎕를 50㎖ conical 튜브에 넣고 37℃에서 15분간 진탕배양했다. 여기에 다시 3㎖의 LB 액체배지를 처리하고 37℃에서 2시간동안 진탕배양하고 70℃에서 15분간 처리한후 원심분리 (4000 ×g)했다. 다시 새로운 튜브에 상등액 100㎕와 OD600값이 1.0으로 맞추어진 SOLR 균주를 넣고 37℃에서 15분간 배양하고 앰피실린 (ampicillin)이 50㎍/㎖ 농도로 첨가된 LB 한천 배지에 10-50㎕를 깔고 37℃ 하룻밤동안 배양하여 균총을 형성시킨다. 이 균은 상기 글루칸가수분해효소 유전자가 삽입된 것으로 이것을 5㎖ LB액체배지에서 15시간 배양하여 812.5μl와 80% 글라이세롤 187.5㎕넣고 -70℃에서 보관했다.
상기 본 발명 균주를 에스케리치아 콜라이 GABGLU (Ecsherichia coliCABGLU)라 명명하고, 2000년 10월 2일자로 기탁번호 KFCC 11216으로 한국종균협회에 기탁하였다.
실시예 3 : 식물병원균에 의한 고추식물의 글루칸가수분해효소 유전자의 유도 발현
제1단계. 고추 세균성 점무늬병균 Ds1 및 Bv5-4a에 의한 글루칸가수분해효소 유전자의 유도 발현
고추 세균성 점무늬병균 중 고추식물의 한별 품종과 친화적 반응을 나타내는 병원성균주 Ds1(고려대학교 생명환경과학대학 부속 덕소농장에서 분리한 병원성 균주)과 불친화적 반응을 나타내는 비병원성균주 Bv5-4a(플로리다대학교 식물병리학과 스톨(Stall) 박사로부터 얻음)를 배양한 후 5X108cfu/㎖의 농도로 6엽기 식물체에 진공펌프와 연결된 분무기를 이용하여 인필트레이션 (infiltration)하여 접종하고 18시간 동안 습실처리한 후 6, 12, 18, 24, 30 시간 후에 각각 고추 잎을 취하여 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA를 포름알데히드를 함유하는 겔 상에서 전기영동한 후 나이트란막 (Hybond N+)으로 전이시켰다. 실시예 1에서 수득된 글루칸가수분해효소 유전자가 삽입되어 있는 재조합 플라스미드 벡터 pCABGLU를 제한효소EcoRI 및XhoI으로 각각 절단하고 삽입 DNA만을 회수하여32P로 표지한 후, 이를 반응액 [0.25 M 인산완충액, 7% SDS, 1mM EDTA, 5% 덱스트란 황산염 (dextran sulfate)]에 첨가하고 65℃, 16-24시간 동안 배양하여 하이브리다이제이션 (hybridization)을 수행하였다.32P로 표지된 상기 DNA 프로브가 나이트란막에 붙어있는 mRNA에 붙게 되고 이 나이트란막 위에 X-ray 필름을 얹게 되면32P로 표지된 DNA가 X-ray 필름을 감광시켜 이것으로 발현정도를 알아볼 수 있게 하였다. 그 결과, 친화적 불친화적 상호반응 모두에서 글루칸가수분해효소 유전자가 유도 발현됨을 알 수 있었다 (도 4).
고추 세균성 점무늬병원균의 상이한 균주를 고추식물의 잎에 접종하였을 때감염된 잎 조직에서 글루칸가수분해효소 유전자가 유도 발현되었다. 또한, 병원성균과 비병원성균에 대해 글루칸가수분해효소 유전자의 발현은 차별적으로 나타난다는 것을 알 수 있었다. 병원성균이 감염된 잎에서는 접종 후 18시간째부터 발현이 시작되어 24시간째 급격히 증가하며 30시간까지 그 정도가 유지되는 것으로 확인되었으며 반면에 비병원성균이 감염된 잎에서의 발현은 병원성균이 접종된 경우와 유사한 양상을 보이나 감염 후 24시간부터 글루칸가수분해효소의 유전자 발현양이 병원성균이 침입된 경우와는 확연히 차이나게 증가하였음을 알 수 있었다.
제2단계. 고추역병균 S197과 CBS178.26에 의한 글루칸가수분해효소 유전자의 유도 발현
고추역병균 중 식물에 친화적 반응을 나타내는 병원성균주 S197(한국 고추 역병균 발생포장에서 분리한 균주) 와 불친화적 반응을 나타내는 비병원성균주 CBS178.26(네덜란드 Utrecht에 소재한 균주보관소 Centraalbureau voor Schimmelcultures에서 입수함) 을 고추 줄기에 접종하고 날짜별로 샘플링하여 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA를 포름알데히드를 함유하는 겔 상에서 전기영동한 후 나이트란막 (Hybond N+)으로 옮겨준 후 실시예 1에서 수득된 글루칸가수분해효소 유전자가 삽입되어 있는 재조합 플라스미드 벡터 pCABGLU를 제한효소EcoRI 및XhoI으로 각각 절단하고 삽입 DNA만을 회수하여32P로 표지한 후, 반응액 [0.25 M 인산완충액, 7% SDS, 1mM EDTA, 5% 덱스트란 황산염 (dextran sulfate)]에서 65℃, 16-24시간 동안 배양하였다. 그 결과, 건전한 고추 줄기에서 낮은 수준으로 발현되는 글루칸가수분해효쇼 유전자가 친화적반응에서는 그 양이 증가하였다가 2일 후부터 줄어들었고 불친화적 반응에서는 3일째까지 증가한 후 그 양이 서서히 감소하는 것을 알 수 있었다 (도 5).
고추역병균의 병원성, 비병원성균을 고추 줄기에 접종하였을 경우에도 고추 글루칸가수분해효소 유전자가 고추 줄기에서 특이적으로 유도 발현됨을 알 수 있었다. 병원성균의 줄기 감염시 글루칸가수분해효소 유전자의 발현수준은 2일째까지 증가하였다가 식물이 죽어가는 3일째부터 급격히 줄어들었으며, 비병원성균의 줄기 감염시에는 접종 후 3일째까지 증가하는 경향을 보인 후 서서히 감소하는 경향을 나타내었다 .
이와 같이, 병에 대하여 저항성을 나타내는 식물체는 병원체의 침입 및 감염시 다양한 방어반응을 나타내는데, 여러가지 세균성 병원균 및 난균류 병원균의 침입시 고추 식물의 잎과 줄기에서 글루칸가수분해효소 유전자가 유도 발현됨을 알 수 있다. 이 글루칸가수분해효소 유전자의 유도와 발현은 감염된 부위에 나타나는 국부저항성 및 전신획득저항성을 나타내주는 분자적 표지로 볼 수 있다. 또한, 본 발명 글루칸가수분해효소를 이용하면 식물병 저항성을 유도할 수 있고 식물병 방제에도 적용함으로써 식물병을 방제할 수 있다.
실시예 4 : 식물체의 비생물적 유도체에 의한 글루칸가수분해효소 유전자의 발현 유도
제1단계. 병 저항성 유도 물질에 의한 글루칸가수분해효소 유전자의 발현 유도
고추식물체에서 어떠한 신호전달경로를 통해 글루칸가수분해효소 유전자가 유도 발현되는지를 확인하기 위하여 다른 식물체에서 식물병 저항성 유도 물질로 알려진 물질들을 고추식물체에 외부적으로 처리하였다.
식물체에 병 저항성을 유도한다고 알려진 에테폰 (ethephon) 10mM, 살리실산 (salicylic acid) 5mM, 메틸 자스모네이트 (methyl jasmonate) 100μM, β-아미노부티르산 (DL-β-amino-n-butyric acid) 19.4mM, 비티에이치 (benzothiadia -zole, BTH) 95.2μM을 엽면 살포방법으로 처리하고 24시간이 지난 후 식물체로부터 총 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA를 포름알데히드를 함유하는 겔 상에서 전기영동한 후 나이트란막 (Hybond N+)으로 옳겨준 후, 실시예 1에서 수득된 글루칸가수분해효소 유전자가 삽입되어 있는 재조합 플라스미드 벡터 pCABGLU를 제한효소EcoRI 및XhoI으로 각각 절단하고 삽입 DNA만을 회수하여32P로 표지한 후, 반응액 [0.25 M 인산완충액, 7% SDS, 1mM EDTA, 5% 덱스트란 황산염 (dextran sulfate)]에서 65℃, 16-24시간 동안 배양하였다.
그 결과, 글루칸가수분해효소 유전자는 에테폰, 메틸 자스모네이트에서 강하게 발현 유도되었으며 살리실산 및 비티에이치, 그리고 베타-아미노부티르산에 의해서는 유도 및 발현되지 않음을 알 수 있었다 (도 6). 또한, 에테폰이 에칠렌으로 분해되는 과정에서 생성되는 부산물인 염산과 아인산이 글루칸가수분해효소 유전자의 유도에 영향을 주는지를 알아보기 위한 실험에서는 이들 부산물이 전혀 영향을 미치지 못하는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과로 글루칸가수분해효소 유전자의 발현은 기존에 알려진 살리실산 신호전달 과정보다는 에틸렌이나 메틸 자스모네이트에 의한 신호전달 과정과 관계가 있다는 것을 알 수 있다.
제2단계. 병 저항성을 유도하는 에테폰에 의한 글루칸가수분해효소 유전자의 발현 유도
에틸렌을 발생시키는 화학물질인 에테폰을 처리한 후 시간별로 글루칸가수분해효소 유전자가 어떻게 축적되는지를 조사하기 위하여 고추잎에 에테폰을 10mM 처리하고 2, 6, 12, 18, 24시간 후에 고추잎을 취하여 총 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA를 포름알데히드를 함유하는 겔 상에서 전기영동한 후 나이트란막 (Hybond N+)으로 옮겨준 후, 실시예 1에서 수득된 글루칸가수분해효소 유전자가 삽입되어 있는 재조합 플라스미드 벡터 pCABGLU를 제한효소EcoRI 및XhoI으로 각각 절단하고 삽입 DNA만을 회수하여32P로 표지한 후, 반응액 [0.25 M 인산 완충액, 7% SDS, 1mM EDTA, 5% 덱스트란 황산염 (dextran sulfate)]에서 65℃, 16-24시간 동안 배양했다.
그 결과, 글루칸가수분해효소 유전자는 처리 후 6시간째부터 축적되기 시작하여 18시간까지 증가한 후 24시간까지 그 발현 수준을 유지하였다. 에테폰을 처리한 후 시간대별로 조사한 글루칸가수분해효소 유전자의 발현 결과를 도 7에 나타내었다.
제3단계. 병 저항성을 유도하는 메틸 자스모네이트에 의한 글루칸가수분해효소 유전자의 유도 발현
글루칸가수분해효소 유전자의 발현에 있어서 메틸 자스모네이트의 농도별, 시간별 영향을 알기 위하여 고추에 메틸 자스모네이트 100μM을 처리하고 2, 6, 12, 18, 24시간 후에 총 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA를 포름알데히드를 함유하는 겔 상에서 전기영동한 후 나이트란막 (Hybond N+)으로 옳겨준 후, 실시예 1에서 수득된 글루칸가수분해효소 유전자가 삽입되어 있는 재조합 플라스미드 벡터 pCABGLU를 제한효소EcoRI 및XhoI으로 각각 절단하고 삽입 DNA만을 회수하여32P로 표지한 후, 반응액 [0.25 M 인산완충액, 7% SDS, 1mM EDTA, 5% 덱스트란 황산염 (dextran sulfate)]에서 65℃, 16-24시간 동안 배양하였다.
그 결과, 메틸 자스모네이트 처리 후 12 시간째에 글루칸가수분해효소 유전자의 발현이 시작되며 그 후 24시간까지 그 발현양이 유지됨을 알 수 있었다 (도 8).
이와 같이, 고추에서 저항성 반응인 과민성 반응에서 발현이 유도되고 항 미생물 효과가 있다고 알려진 본 발명의 글루칸가수분해효소 유전자 산물을 이용하면 식물병 저항성을 유도할 수 있고 식물병 방제에 적용함으로써 식물병을 방제할 수 있다.
이상의 실시예를 통하여 명백한 바와 같이, 본 발명은 고추 세균성 점무늬병에 대해 저항성을 보이는 고추 한별 품종 (Capsicum annuumL. cv. Hanbyul)으로부터 식물병 방어반응을 보이는 글루칸가수분해효소의 유전자를 분리하여 그 염기서열을 결정함으로써 식물체 방어반응의 표지 및 식물병 저항성 작물의 분자육종을 위한 유전재료로 사용할 수 있고 또한, 고추 세균성 점무늬병균, 고추역병균 및 비생물적 유도체에 의한 상기 글루칸가수분해효소 유전자의 유도 발현 정도를 측정하는 방법을 제공하고, 저항성을 일으키는 식물체의 생화학적 변화를 분자적 수준에서 이해함으로써 이를 이용하여 병 저항성이 증진된 고추분자육종을 개발하거나 상기 글루칸가수분해효소 유전자의 발현을 확인하는 과정을 포함한 고추식물의 식물병 저항성의 탐색방법 및 식물의 저항성 유전 기작을 촉진하는 식물보호 화학물질을 개발할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 농산업 및 식물종자산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (7)

  1. 고추 한별 품종 (Capsicum annuumL. cv. Hanbyul) 유래의 식물병 저항성 글루칸가수분해효소를 코딩하는 하기의 유전자 CABGLU의 염기서열.
  2. 상기 제 1항 기재의 고추 한별 품종 (Capsicum annuumL. cv. Hanbyul) 유래의 식물병 저항성 글루칸가수분해효소 유전자 CABGLU에 의해 코딩되는 하기의 아미노산 서열.
  3. 상기 제 1항 기재의 고추 한별 품종 (Capsicum annuumL. cv. Hanbyul) 유래의 식물병 저항성 글루칸가수분해효소 유전자 CABGLU을 pBluescript SK(-)에 삽입시켜 구축한 재조합 벡터 pCABGLU.
  4. 고추 한별 품종 (Capsicum annuumL. cv. Hanbyul) 유래의 식물병 저항성 글루칸가수분해효소 유전자 CABGLU을 포함하는 상기 제 3항 기재의 재조합 벡터 pCABGLU을 대장균 숙주세포에 도입시킨 것을 특징으로 하는 형질전환체 대장균 CABGLU (Eherichia coliCABGLU) (KFCC 11216).
  5. 병원균 또는 비생물적 화학물질을 접종 또는 처리한 고추 식물체로부터 RNA를 분리하여 전기영동시키고 나이트란막으로 전이시킨 후32P로 표지한 상기 제 1항 기재의 글루칸가수분해효소 유전자 프로브와 반응시켜 병원균 감염 또는 비생물적 화학물질의 처리에 대한 글루칸가수분해효소 유전자의 차별적 발현을 확인함을 특징으로 하는 고추의 식물병 저항성 탐색방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 병원균이 고추 세균성 점무늬병균 또는 고추역병균임을 특징으로 하는 고추의 식물병 저항성 탐색방법.
  7. 제 5항에 있어서, 상기 비생물적 화학물질이 에테폰 또는 메틸 자스모네이트임을 특징으로 하는 고추의 식물병 저항성 탐색방법.
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