KR100396209B1 - 고추 한별 품종의 키틴가수분해효소 유전자 및 이를이용한 식물병 저항성 탐색방법 - Google Patents

고추 한별 품종의 키틴가수분해효소 유전자 및 이를이용한 식물병 저항성 탐색방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고추 한별 품종의 키틴가수분해효소 유전자 및 이를 이용한 식물병 저항성의 탐색방법에 관한 것으로, 고추식물의 세균병인 고추 세균성 점무늬병 (Xanthomonas campestrispv.vesicatoria)에 대해 저항성을 보이는 고추 한별 품종 (Capsicum annuumL. cv. Hanbyul) 유래의 키틴가수분해효소 (chitinase) 유전자를 분리하고 그 유전자를 삽입시킨 재조합 벡터를 구축한 후 형질전환체를 제조하고, 식물병원균을 접종하여 감염시키거나 또는 식물병 저항성 유도물질로 알려진 화학물질들을 처리하거나 또는 염류를 처리한 경우 키틴가수분해효소 유전자 발현 기작을 조사함으로써 식물체의 병원균에 대한 방어반응의 표지 및 식물병 저항성 탐색방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

고추 한별 품종의 키틴가수분해효소 유전자 및 이를 이용한 식물병 저항성 탐색방법 {Chitinase gene of Capsicum annuum L. cv. Hanbyul and probing method of resistance for plant disease}
본 발명은 고추 한별 품종의 키틴가수분해효소 유전자 및 이를 이용한 식물병 저항성 탐색방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 고추의 세균병인 고추 세균성 점무늬병에 대해 저항성을 보이는 것으로 알려진 고추 한별 품종 (Capsicum annuumL. cv. Hanbyul)으로부터 키틴가수분해효소 (chitinase) 유전자를 분리하여 그 염기서열을 분석하고 이를 이용하여 식물이 다른 식물병원균에 의해 감염된 경우이거나 식물병 저항성 유도물질로 알려진 화학물질들을 처리했을 경우이거나 또는 염류를 처리한 경우에 키틴가수분해효소 유전자의 발현 기작을 조사함으로써 식물성 저항성을 탐색하고 고추식물에서의 병 발생에 따른 방어반응을 검색하는 방법에 관한 것이다.
고추의 세균성 점무늬병은 반점세균병, 더뎅이병으로도 불리며 고추의 잎, 줄기, 과실에 반점을 형성하는데, 특히 잎에 생긴 반점은 조기 낙엽을 유발하여 수확량을 감소시키는 것으로 알려져 있는 보편화된 고추 식물병이다.
유해한 해충 및 병원균에 의한 특정 농작물의 침해는 대부분의 식량을 재배 식물에 의존하고 있는 인류에게 있어 생존까지도 위협하고 있는 심각한 문제이다. 이러한 문제를 해결하고 나날이 새롭게 등장하고 있는 병원균으로부터 식물체를 보호하기 위하여 다양한 방제 방법이 사용되고 있다. 그 중, 가장 쉽고 간편한 식물병 방제법은 농약을 살포하는 것인데, 이는 맹독성이므로 병원균뿐만 아니라 기타 주변 생태계의 생물까지도 대량 살상하여 생태계를 파괴시키고 토양 및 수질을 오염시키는 등의 폐해가 있다. 따라서, 농약 살포 등의 화학적 방제수단 뿐만 아니라 식물이 처해 있는 환경 및 조건을 고려하여 물리적, 생물학적 방제법 등을 적절히 적용하는 것이 중요하며, 특히 식물병에 대한 저항성을 자체 보유하고 있는 식물 품종의 개량 및 육종과 재배를 통한 방제가 필요하다.
작물 생산에 있어 병해충의 발생에 따른 생산량의 감소는 일찍이 기록되어져 왔다. 병해충에 의한 피해의 줄이려는 노력의 일환으로 다양한 작물-병원균의 상호작용을 대상으로 병 저항성 작물의 육성 프로그램들이 진행되어져 왔으며, 병 저항성에 대한 이해 및 이의 실제적 응용을 위해 병 저항성 식물에서의 저항성 기작의연구가 여러 가지 작물 및 모델식물을 대상으로 실시되어져 왔다. 집중적으로 연구되고 있는 작물로는 담배, 토마토 및 벼가 그 대표 사례라 할 수 있으며, 잡초의 일종인 애기장대풀은 식물병 저항성 연구를 위한 모델 식물로서 세계적으로 사용되고 있다. 담배, 토마토와 함께 대표적인 가지과 식물인 고추는 우리나라에서 오랜동안 향신료, 양념 등으로 사용되어져 벼, 배추와 함께 우리나라 국민의 식단을 이루는 주된 작물 중의 하나이다. 고추 재배 중에 보고된 우리나라에서의 병 발생은 바이러스병, 세균병, 및 진균병에 대해 나타나 있으며, 고추식물에서 주요한 병으로는 난균류에 의한 역병과 진균에 의한 탄저병, 세균에 의한 세균성 점무늬병 등이 보고되어져 왔다. 이런 현실에도 고추식물의 병 저항성 기작을 포함한 방어반응 및 환경적인 스트레스에 대한 반응에 대한 연구는 미비한 실정이다.
식물병 발생에 대한 방어반응시 건전한 식물에서는 미량으로 존재하거나 발견되지 않는 단백질들이 병 감염시 특이적으로 증가되거나 나타난다. 이를 병 생성관련 단백질 (pathogenesis-related protein)이라 부르는데, 고추식물에서 역병 또는 세균성 점무늬병의 발생시 다양한 종류의 병 생성 관련 단백질이 관찰되었으며, 이들 중에서 키틴가수분해효소와 글루칸가수분해효소에 대한 연구로 식물병 방어반응에서 이들의 발현 및 축적은 저항성 반응과 감수성 반응에서 차별적으로 관찰되었다. 특히 식물병원곰팡이의 세포벽의 주요 구성 성분이 키틴이라는 사실과 이 키틴이 식물체 내에서는 발견되지 않는다는 사실은 키틴가수분해효소가 식물의 병원균에 대한 방어 반응에 중요한 역할을 하리라는 생각을 뒷받침하였다.
다른 식물들에서 많은 수의 키틴가수분해효소 유전자들이 발견되고 분리되었는데, 이들의 발현은 식물병원균에 의한 감염뿐만 아니라 비생물적인 요인들, 즉 물리적인 상처와 염류, 자외선 등의 환경적인 요인들, 여러 가지 식물생장조절물질들을 포함하는 화학물질의 처리에 대해서도 그 발현이 유도되는 것으로 알려 졌다. 이러한 키틴가수분해효소 유전자를 다른 작물에 도입시켜 병원균의 침입에 대해 증가된 저항성을 부여하는 방법으로 이 유전자는 병 저항성 작물의 분자육종 기술에서 이용되는 주요한 유전자임이 밝혀졌다.
상기의 사실에 착안하여 본 발명자들은 고추 세균성 점무늬병에 대해 저항성을 보이는 한별 품종의 고추식물에서 클로닝한 키틴가수분해효소 유전자 및 이를 이용한 고추식물에서의 병 발생에 따른 방어반응 및 염류에 대한 반응을 검색하기 위한 방법을 착안하였다. 즉, 본 발명은 식물의 병 방어반응을 보여줄 수 있는 키틴가수분해효소의 유전자를 분리하여 분자적 수준에서 고추식물의 방어반응을 이해하고, 이를 이용한 앞으로의 고추분자육종 프로그램에서의 활용의 가능성을 제시하며 상기 키틴분해효소 유전자의 발현을 확인케 하는 단계를 포함하는, 고추식물의 병 저항성 유도물질의 탐색방법을 제시한 것이다.
따라서, 본 발명의 목적은 고추 세균성 점무늬병에 대해 저항성을 보이는 한별 품종 유래의 키틴가수분해효소 유전자의 염기서열 및 그로부터 유추한 아미노산 서열을 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 고추 한별 품종 유래의 키틴가수분해효소 유전자를 삽입시켜 구축한 재조합 벡터 및 이 재조합 벡터를 대장균에 도입시켜 제조한 형질전환체를 제공하는 데 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 키틴가수분해효소 유전자를 이용하여 병원균 감염, 비생물적 저항성 유도체및 염류에 의한 키틴가수분해효소 유전자의 차별적 발현을 확인함으로써 식물체의 식물병 저항성을 탐색하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 상기 목적은 고추 한별 품종 (Capsicum annuumL. cv. Hanbyul)에 고추 세균성 점무늬병균 (Xanthomonas campestrispv.vesicatoria)을 접종하여 감염시킨 고추 잎으로부터 mRNA를 분리한 후 역전사시켜 cDNA를 제조하고 프라이머를 제작한 후 이를 이용하여 상기 DNA를 증폭시켜 cDNA 라이브러리 제조하고 이를 스크리닝하여 키틴가수분해효소 유전자를 선발한 후 그 염기서열을 결정하고, 고추에 고추 세균성 점무늬병균, 고추역병균 및 비생물적 유도체인 에테폰, 살리실산, 메틸 자스모네이트, DL-β-아미노부티르산, 비티에이치를 접종 및 살포하고 염류를 뿌리에 처리한 후 그 식물체의 RNA를 분리하고 이 RNA를 상기 키틴가수분해효소 유전자를 제한효소로 절단하여 γ-32P로 표지한 프로브와 반응시키는 노던 블러팅을 수행하여 키틴가수분해효소 유전자의 유도 발현 정도를 탐색함으로써 달성하였다.
이하, 본 발명의 구성을 상세히 설명한다.
도 1은 고추 세균성 점무늬병 저항성 품종 한별 고추 (Capsicum annuumL. cv. Hanbyul)로부터 클로닝한 키틴가수분해효소 유전자의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 2는 고추 세균성 점무늬병 저항성 품종 한별 고추(Capsicum annuumL. cv. Hanbyul)로부터 클로닝한 키틴가수분해효소 유전자로부터 유추한 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 3은 고추 한별 품종 (Capsicum annuumL. cv. Hanbyul)으로부터 클로닝한 키틴가수분해효소 유전자 (chitinase)를 도입시켜 구축한 재조합 벡터 pCAChi2의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 4는 고추 세균성 점무늬병을 일으키는 잔토모나스 캄페스트리스 패소바 베지카토리아 (Xanthomonas campestrispv.vesicatoria)의 병원성 또는 비병원성 균주를 고추식물의 잎에 접종하였을 때의 키틴가수분해효소 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 고추역병을 일으키는 파이토프소라 캡시시의 병원성 또는 비병원성 균주를 고추식물의 줄기에 접종하였을 때의 키틴가수분해효소 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 고추식물의 엽면에 에테폰 10mM, 메틸 자스모네이트 25μM, DL-β-아미노부티르산 1000㎍/mL, 비티에이치 20㎍/mL, 살리실산 5mM를 각각 처리한 후의 키틴가수분해효소 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 에테폰을 처리한 후 시간에 따른 키틴가수분해효소 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 염화나트륨을 고추식물의 뿌리에 처리한 후 그 식물의 잎과 줄기에서 발현되는 키틴가수분해효소 유전자의 발현 유도 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 고추 한별 품종 (Capsicum annuumL. cv. Hanbyul)에 비병원성의 고추 세균성 점무늬병균 (Xanthomonas campestrispv.vesicatoriastrain BV5-4a)을 접종하고 감염되어 과민성 반응을 보인 고추 잎의 RNA를 추출하고 그로부터 mRNA를 분리한 후 이를 주형으로 하여 cDNA를 제작하는 단계; 기타 작물 유래의 키틴가수분해효소의 아미노산 서열에 근거하여 프라이머를 제작하고 상기 DNA를 PCR 증폭시켜 cDNA 라이브러리를 제조하는 단계; 상기 DNA 조각에 디옥시제닌 (dioxygenin) 처리하여 표지한 프로브를 사용하여 cDNA 라이브러리 스크리닝을 실시하여 키틴가수분해효소 유전자 CAChi2를 선발하고 그 염기서열을 결정하는 단계; 상기 키틴가수분해효소 유전자 CAChi2를 phagemid 벡터 pBluescript SK(-)에 삽입시켜 재조합 벡터 pCAChi2를 구축하는 단계; 상기 재조합 벡터 pCAChi2를 대장균에 도입시켜 형질전환체Escherichia coliCAChi2를 제조하는 단계; 고추 세균성 점무늬병균 중 병원성균주 Ds1과 비병성균주 Bv5-4a를 고추 잎에 접종하고 습실처리한 후 RNA를 분리하고 이 RNA를 상기 키틴가수분해효소 유전자를 제한효소로 절단하여 γ-32P로 표지한 프로브와 반응시키는 노던 블러팅을 수행하여 고추 잎에서의 세균성 점무늬병균 감염에 의한 키틴가수분해효소 유전자의 발현 유도를 확인하는 단계; 고추역병균 중 병원성균주 S197과 비병원성균주 CBS178.26를 배양시킨 유주자 현탁액을 고추 줄기에 접종하고 그로부터 RNA를 분리하고 이 RNA를 상기 키틴가수분해효소 유전자를 제한효소로 절단하여 γ-32P로 표지한 프로브와 반응시키는 노던 블러팅을 수행하여 고추 잎에서의 고추역병균에 의한 키틴가수분해효소 유전자의 발현 유도를 확인하는 단계; 식물체에 병 저항성을 유도한다고 알려진 에테폰, 메틸 자스모네이트, DL-β-아미노부티르산, 비티에이치, 살리실산 등을 엽면 살포방법으로 살포하고 그로부터 RNA를 분리하고 이 RNA를 상기 키틴가수분해효소 유전자를 제한효소로 절단하여 γ-32P로 표지한 프로브와 반응시키는 노던 블러팅을 수행하여 식물병 저항성 유도물질에 의한 키틴가수분해효소 유전자의 발현 유도를 확인하는 단계; 고추의 뿌리를 염화나트륨 용액에 담가 그로부터 RNA를 분리하고 이 RNA를 상기 키틴가수분해효소 유전자를 제한효소로 절단하여 γ-32P로 표지한 프로브와 반응시키는 노던 블러팅을 수행하여 염류가 키틴가수분해효소 유전자의 유도 발현에 미치는 영향을 조사하는 단계로 구성된다.
이하, 본 발명의 구성을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 고추 한별 품종 ( Capsicum annuum cv. Hanbyul) 유래의 키틴가수분해효소 유전자 분리 및 염기서열 결정
고추 세균성 점무늬병의 비병원성균에 감염되어 저항성이 유도된 고추 한별 품종에서 mRNA를 분리하고 이로부터 cDNA 라이브러리 (cDNA Library)를 제조한 후 스크리닝하여 얻어진 키틴가수분해효소 (chitinase) 유전자를 분리하고 그 염기서열을 분석하였다.
한국산 고추 한별 품종 (Capsicum annuumcv. Hanbyul)에 플로리다대학교 식물병리학과 스톨(Stall) 박사로부터 얻은 고추 세균성 점무늬병의 비병원성균 (Xanthomonas campestrispv.vesicatoriastrain BV5-4a)을 접종하고 습실처리하여 저항성이 유도된 식물체를 과민성반응이 나오는 시간에 습상에서 꺼내어 잎을 수거하였다. 이 잎 표본으로부터 RNA를 추출하고, mRNA을 다시 분리한 후 이를 주형으로 하여 cDNA 라이브러리를 제작하였다. 키틴가수분해효소 유전자를 고추의 게놈 DNA로부터 증폭시키기 위해 두 개의 프라이머를 주문, 제작하였는데, 토마토, 담배, 감자 등의 가지과 작물에서 보고되어 있는 키틴가수분해효소의 아미노산 서열에서 각 아미노산 서열 중 가장 보존이 잘 되어 있는 부분을 기초로 하여 프라이머를 제작하였다. 이 두 개의 프라이머의 이름을 각각 CLASS2N과 CLASS2C로 명명하였고, 이들의 염기서열은 5'-AACAACCC(A/T)GATTTAGT(A/G)GC-3' (이상 CLASS2N의 염기서열)와 5'-GTTCCTTT(A/G)GTTGTTACAGT-3' (이상 CLASS2C의 염기서열)이며, 여기서 괄호 안에 표기된 염기는 두가지 염기 중 하나를 사용한 두가지 종류의 프라이머의 혼합체임을 나타낸다. 이 프라이머를 이용하여 상기 추출 DNA를 주형으로 하여 약 300 염기쌍의 키틴가수분해효소 유전자의 부분적인 염기서열을 분리하였다. PCR 증폭을 통해 얻어진 DNA 조각을 디옥시제닌 (dioxygenin) 처리하여 표지한 프로브를 사용하여 cDNA 라이브러리를 스크리닝하였다. 그 결과 얻어진 클론들의 염기서열을 결정하여 1004 염기쌍으로 이루어진 class lI의 고추 한별 품종의 키틴가수분해효소 유전자의 cDNA인 CAChi2를 획득하였다.
이 유전자에서 유추한 아미노산 서열을 다른 작물에서 발견된 키틴분해효소의 아미노산 서열과 비교한 결과, 감자, 토마토, 담배의 class II 키틴가수분해효소의 아미노산 서열과 각각 79%, 76%, 71% 의 상동성을 나타내었다. 즉, 상기와 같이 클로닝된 한별 품종의 class II 키틴가수분해효소 유전자는 기존에 보고된 다른 식물체에 존재하는 키틴분해효소 유전자와는 구별되는 신규의 유전자임을 알 수 있을 뿐 아니라, 고추 식물체에서는 최초로 분리된 키틴가수분해효소 유전자임을 알 수 있었다 (도 1 및 도 2).
실시예 2 : 스크리닝을 통해 얻어진 상기 phagemid 상태의 키틴가수분해효소 유전자를 대장균 ( E. coli )에 도입 (transformation)시켜 형질전환체를 제조하는 과정 및 보관하는 방법
상기 본 발명 키틴가수분해효소 유전자 CAChi2를 stratagene에서 제공하는 pBluescript SK(-) phagemid 벡터에 도입시켜 재조합 벡터 pCAChi2을 구축하고 그 개열지도를 도 3에 나타내었다.
Stratagene에서 제공하는E. coli균주인 XL1-Blue MRF'균주와 SOLR 균주를 30℃, LB 액체배지에서 하룻밤 진탕배양하여 여기에서 0.5 ㎖를 다시 50 ㎖ LB액체배지에 넣고 37℃에서 2-3시간동안 진탕배양했다 (OD600=0.2-0.5). XL1-Blue MRF'을 원심분리 (1,500 ×g)하여 10mM MgSO4로 OD600값이 1.0이 되도록 희석했다. 이 균주 200μl, 스크리닝을 통해 얻어진 상기 phage stock 250μl, ExAssist helper phage 1μl를 50㎖ conical 튜브에 넣고 37℃에서 15분간 진탕배양했다. 여기에 다시 3㎖의 LB 액체배지를 처리하고 37℃에서 2시간동안 진탕배양하고 70℃에서 15분간 처리한후 원심분리 (4000 ×g)했다. 다시 새로운 튜브에 상등액 100μl와 OD600값이 1.0으로 맞추어진 SOLR 균주를 넣고 37℃에서 15분간 배양하고 앰피실린 (ampicillin)이 50μg/㎖ 농도로 첨가된 LB 한천 배지에 10-50μl를 깔고 37℃ 하룻밤동안 배양하여 균총을 형성시킨다. 이 균은 상기 키틴가수분해효소 유전자가 삽입된 것으로 이것을 5㎖ LB액체배지에서 15시간 배양하여 812.5μl와 80% 글라이세롤 187.5μl넣고 -70℃에서 보관하였다.
상기 본 발명 균주를 Escherichia coli CAChi2라 명명하고, 2000년 9월 20일자로 기탁번호 KFCC 11213로 한국종균협회에 기탁하였다.
실시예 3 : 식물병원균에 의한 고추식물의 키틴가수분해효소 유전자의 유도 발현
유도 발현을 위한 하기의 모든 과정은 노던 블러팅 (Northern blotting)을 통하여 이루어졌으며, 이때 사용된 프로브는 분리된 상기 클론을 제한 효소EcoRI과XhoI으로 절단하고 삽입 DNA만을 회수한 후 γ-32P로 표지하고 이를 반응액 [1 mM EDTA, 7 % SDS, 0.25 M Na2HPO4, 5 % 덱스트란 인산염 (dextran sulfate)]에 첨가하여 준비하고, 준비된 상기 프로브를 65℃에서 24시간동안 하이브리다이제이션 (hybridization)시켜 수행하였다.
제1단계. 고추 세균성 점무늬병균 Ds1과 Bv5-4a에 의한 키틴가수분해효소 유전자의 유도 발현
고추 세균성 점무늬병균 중 병원성균주 Ds1(고려대학교 생명환경과학대학 부속 덕소농장에서 분리한 병원성 균주)과 비병성균주 Bv5-4a를 배양하여 5×108cfu/mL의 농도로 1분지기 고추식물 잎 뒷면에 인필트레이션 (infiltration)하여 접종하고 18시간동안 습실처리한 후 6, 12, 18, 24, 30 시간 후에 잎을 채취하여 이로부터 RNA를 분리하여 상기 분리된 키틴가수분해효소 유전자를 제한효소EcoRI 및XhoI으로 각각 절단하고 삽입 DNA만을 회수하여 γ-32P로 표지한 후 이를 반응액 [0.25 M 인산 완충액, 7% SDS, 1mM EDTA, 5% 덱스트란 황산염 (dextran sulfate)]에 첨가하고 65℃, 24시간 동안 배양하여 하이브리다이제이션시키는 노던 블러팅을 수행하였다.
도 4는 고추 세균성 점무늬병을 일으키는 잔토모나스 캄페스트리스 패소바 베지카토리아 (Xanthomonas campestrispv.vesicatoria)의 병원성 또는 비병원성 균주를 고추식물의 잎에 접종했을 때의 키틴가수분해효소 유전자의 발현을 나타낸 것인데, 감수성 반응과 저항성 반응은 각각 병원성 균주와 비병원성 균주로 접종된 것을 나타내며, 25S 리모솜 RNA (25S rRNA)은 각 시간대에 동일양의 RNA시료가 사용되었음을 나타낸다.
고추 세균성 점무늬병의 감염시 병원성균의 감염에 의한 고추식물의 감수성 반응 실험 결과, 키틴가수분해효소 유전자는 접종 후 18시간째에 처음으로 유도되었으며 30시간째까지 약간의 증가를 보이며 발현되었다. 이에 반해, 비병원성균의 감염에 의한 고추식물의 저항성 반응 실험 결과, 이 유전자는 접종 후 12시간째에 낮은 수준의 발현이 검색되었으며 과민성 반응이 나타나는 18시간째 이후 그 증가는 급격히 늘어났다.
제2단계. 고추역병균 S197과 CBS178.26에 의한 키틴가수분해효소 유전자의 유도 발현
고추역병균 중 병원성 균주 S197(한국 고추 역병균 발생포장에서 분리한 균주)과 비병원성 균주 CBS178.26(네덜란드 Utrecht에 소재한 균주보관소 Centraalbureau voor Schimmelcultures에서 입수한 균주)를 배양한 후 3일간 광처리하여 유주자낭을 형성시킨 후 물을 부어 4℃에서 1시간동안 처리하고 상온에서 1시간동안 배양하여 유주자가 유주낭으로부터 유출되도록 하였다. 105유주자/mL의 농도로 유주자 현탁액을 준비하고 이를 살균된 솜에 적셔 이를 상처를 낸 6 엽기 고추식물의 줄기에 감고 셀로판테이프를 감아 습한 상태를 유지시켜 주었다. 접종 후 1, 2, 3, 4 일에 접종된 고추 줄기를 채취하여 RNA를 분리하고 상기 분리된 키틴가수분해효소 유전자를 제한효소EcoRI 및XhoI으로 각각 절단하고 삽입 DNA만을 회수하여 γ-32P로 표지한 후 이를 반응액 [0.25 M 인산 완충액, 7% SDS, 1mM EDTA, 5% 덱스트란 황산염 (dextran sulfate)]에 첨가하고 65℃, 24시간 동안 배양하여 하이브리다이제이션시키는 노던 블러팅을 수행하였다. 도 5는 고추역병을 일으키는 파이토프소라 캡시시 (Phytophthora capsici)의 병원성 또는 비병원성 균주를 고추식물의 줄기에 접종했을 때의 키틴분해효소 유전자의 발현을 나타낸 것이며 감수성 반응과 저항성반응은 각각 병원성 균주와 비병원성 균주로 접종된 것을 나타내며, 25S rRNA는 각 시간대에 동일양의 RNA 시료가 사용되었음을 나타낸다.
고추역병균의 감염시 병원성균에 의한 감수성 반응에서는 접종 후 1일째에발현되어 2일째는 증가를 보이다가 식물이 죽어가기 시작하는 3일째부터는 발현이 나타나지 않았다. 이에 반해, 비병원성균에 의한 저항성 반응과정에서는 이 키틴가수분해효소 유전자가 접종 후 1일째에 나타난 후 2일째는 감수성반응에서의 발현보다 높게 나타나고 3일째 약간의 증가를 보이다가 4일째에는 1일째 수준으로 발현양이 감소된 것을 확인 할 수 있었다 (도 5).
이와 같이, 고추 세균성 점무늬병균과 고추역병균에 감염되었을 때 고추식물의 잎과 줄기 조직에서 각각 키틴가수분해효소 유전자가 유도 발현되었음을 알 수 있다. 또한, 각각의 병원균 감염시 비병원성균과 병원성균에 대해 키틴가수분해효소 유전자의 발현은 차별적으로 나타난다는 것을 알 수 있다. 병원균의 감염에 대해 식물체가 발현하는 병 발생 관련 유전자의 축적 및 이 유전자들에 의한 단백질의 축적은 병 발생 과정동안의 방어 반응들 중 뚜렷한 현상이다. 이 병 발생 관련 유전자들 중 키틴가수분해효소 유전자의 유도 발현은 국부저항성 (local resistance) 및 전신획득저항성 (systemic acquired resistance)을 나타내어 줄 수 있는 분자적 표지로 볼 수 있다. 또한, 본 발명 키틴가수분해효소 유전자 산물을 이용하면 식물병 저항성을 유도할 수 있고 식물병 방제에도 적용함으로써 식물병을 방제할 수 있다.
실시예 4 : 식물체의 비생물적 유도체에 의한 키틴가수분해효소 유전자의 유도 발현
고추식물체에서 어떠한 신호전달경로를 통해 키틴가수분해효소 유전자가 유도 발현되는지를 확인하기 위하여 다른 식물체에서 병 발생 관련 유전자의 유도체로 알려진 에테폰 (ethephon), 메틸 자스모네이트 (methyl jasmonate), DL-β-아미노부티르산 (DL-β-amino-n-butyric acid), 비티에이치 (benzothiadiazole, BTH), 살리실산 (salicylic acid) 등을 고추식물체에 외부적으로 처리하여 24 시간 후 노던 블러팅을 실시하였다.
6 엽기의 고추식물을 준비하여 각각의 비생물적 유도체들을 엽면 살포방법으로 처리하여 주었다. 10 mM 에테폰, 25 μM 메틸 자스모네이트, 1,000 ㎍/mL DL-β-아미노부티르산, 20 ㎍/mL 비티에이치, 5 mM 살리실산을 고추식물에 처리하여 주었다. 에테폰과 메틸 자스모네이트를 처리한 후에는 비닐 봉지를 씌워주었다. 각각의 화학물질을 처리해준 후 24 시간 후에 고추식물의 잎을 채취한 후 이로부터 RNA를 분리하여 상기 실시예 2의 방법으로 노던 블러팅을 실시하였다. 특히 에테폰을 처리해 준 고추식물의 경우, 처리 후 2, 6, 12, 18, 24, 48 시간으로 시간대 시료를 준비하고 이로부터 RNA를 분리하여 노던 블러팅에 활용하였다.
그 결과, 고추의 키틴가수분해효소 유전자는 에틸렌을 생성시키는 물질인 에테폰에 의해 가장 많이 발현이 유도된다는 것을 확인하였다. 비티에이치는 상대적으로 낮은 수준의 발현을 유도하였으며, 그 밖의 처리가 시도된 화학물질인 메틸 자스모네이트, DL-β-아미노부티르산, 살리실산에 대해서는 고추가수키틴분해효소 유전자의 발현을 유도하지 않음을 확인하였다 (도 6).
에테폰을 처리한 후 시간별로 키틴가수분해효소 유전자의 발현을 확인하여 이 유전자의 발현이 시간에 따라 어떻게 나타나는지 관찰하였다. 처리 후 18 시간후에 처음으로 나타나고 24시간에 급격히 증가하다가 48 시간 후에는 약간 감소하는 경향을 보였다 (도 7).
실시예 5 : 염류에 의한 키틴가수분해효소 유전자의 유도 발현
작물 재배에 있어 환경적인 스트레스 중의 하나인 염류가 고추식물에서의 키틴가수분해효소 유전자의 유도발현에 미치는 영향을 노던 블러팅을 통하여 관찰하였다.
키틴가수분해효소 유전자의 발현을 시간대로 관찰하기 위해 4 엽기의 고추식물을 폿트에서 조심스럽게 꺼내어 200 mM의 염화나트륨 용액에 뿌리를 담가 처리하고 처리한지 1, 2, 6, 12, 18, 24 시간째에 각각 잎과 줄기를 채취하여 노던 블러팅에 활용하였고, 발현을 위한 효과적인 농도를 조사하기 위해 0, 1, 10, 100, 200 mM의 염화나트륨 용액에 4 엽기 고추식물을 처리하여 18 시간만에 각각 잎과 줄기를 채취하여 상기 실시예 2의 방법으로 노던 블러팅을 실시하였다.
고추 뿌리를 200 mM의 염화나트륨 (NaCl) 용액에 처리하여 잎과 줄기에서 각각 키틴가수분해효소 유전자가 유도됨을 알 수 있었다. 6시간만에 처음 발현을 보이다가 18시간째까지 그 양이 증가되었다. 잎 조직에서는 24시간째에 그 양이 줄었으나 줄기조직에서는 12시간째 이후로 키틴가수분해효소 유전자의 발현이 크게 증가되었다. 0, 1, 10, 100, 200 mM의 다양한 농도의 염화나트륨의 용액에 처리하면 100 mM 이상의 농도에서 이 키틴가수분해효소 유전자의 발현이 유도됨을 관찰하였다. 잎 조직에서는 물을 처리한 '농도 0'에서 어떠한 발현도 나타나지 않았으나,줄기의 경우 낮은 수준의 발현이 검색된 후 10 mM 처리식물에서까지 그 수준이 유지되었다. 이 결과는 고추 키틴가수분해효소 유전자의 발현이 염화나트륨에 의한 스트레스에 대해 잎과 줄기 조직에서 다르게 나타나는 것을 보여주는 것이다 (도 8).
이상의 실시예를 통하여 명백한 바와 같이, 본 발명은 고추 세균성 점무늬병에 대해 저항성을 보이는 고추 한별 품종 (Capsicum annuumL. cv. Hanbyul)으로부터 식물병 방어반응을 보이는 키틴가수분해효소 유전자를 분리하여 그 염기서열을 결정함으로써 식물체 방어반응의 표지 및 식물병 저항성 작물의 분자육종을 위한 유전재료로 사용할 수 있고 또한, 고추 세균성 점무늬병균, 고추역병균, 비생물적 유도체 및 염류에 의한 상기 키틴가수분해효소 유전자의 유도 발현 정도를 측정는 방법을 제공하고, 저항성을 일으키는 생화학적 변화를 분자적 수준에서 이해함으로써 이를 이용하여 병 저항성이 증진된 고추분자육종을 개발하거나 상기 키틴가수분해효소 유전자의 발현을 확인하는 과정을 포함한 고추식물의 병 저항성의 탐색방법 및 식물의 저항성 유전 기작을 촉진하는 식물보호 화학물질을 개발할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 농산업 및 식물종자산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (7)

  1. 고추 한별 품종 (Capsicum annuumL. cv. Hanbyul) 유래의 식물병 저항성 키틴가수분해효소를 코딩하는 하기의 유전자 CAChi2의 염기서열.
  2. 상기 제 1항 기재의 고추 한별 품종 (Capsicum annuumL. cv. Hanbyul) 유래의 식물병 저항성 키틴가수분해효소 유전자 CAChi2에 의해 코딩되는 하기의 아미노산 서열.
  3. 상기 제 1항 기재의 고추 한별 품종 (Capsicum annuumL. cv. Hanbyul) 유래의 식물병 저항성 키틴가수분해효소 유전자 CAChi2를 pBluescript SK(-) 에 삽입시켜 구축한 재조합 벡터 pCAChi2.
  4. 고추 한별 품종 (Capsicum annuumL. cv. Hanbyul) 유래의 식물병 저항성 키틴가수분해효소 유전자 CAChi2를 포함하는 상기 제 3항 기재의 재조합 벡터 pCAChi2를 대장균 숙주세포에 도입시킨 것을 특징으로 하는 형질전환체Escherichia coliCAChi2 (KFCC 11213).
  5. 병원균 또는 비생물적 화학물질 또는 염화나트륨을 접종 또는 처리한 고추 식물체로부터 RNA를 분리한 후 상기 제 1항 기재의 키틴가수분해효소 유전자를 제한효소로 절단하고 γ-32P로 표지한 프로브와 반응시키는 노던 블럿팅을 수행하여 병원균 감염 또는 비생물적 화학물질 또는 염화나트륨 처리에 대한 키틴가수분해효소 유전자의 차별적 발현을 확인함을 특징으로 하는 고추의 식물병 저항성 탐색방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 병원균이 고추 세균성 점무늬병균, 고추역병균임을 특징으로 하는 고추의 식물병 저항성 탐색방법.
  7. 제 5항에 있어서, 상기 비생물적 화학물질이 에테폰임을 특징으로 하는 고추의 식물병 저항성 탐색방법.
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