JPH0994089A - シカクマメ由来キチナ−ゼ及びシカクマメ由来キチナ−ゼをコ−ドするｄｎａ - Google Patents
シカクマメ由来キチナ−ゼ及びシカクマメ由来キチナ−ゼをコ−ドするｄｎａInfo
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- JPH0994089A JPH0994089A JP7273735A JP27373595A JPH0994089A JP H0994089 A JPH0994089 A JP H0994089A JP 7273735 A JP7273735 A JP 7273735A JP 27373595 A JP27373595 A JP 27373595A JP H0994089 A JPH0994089 A JP H0994089A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 シカクマメに由来する新規なキチナ−ゼ、及
び遺伝子組換え技術を応用することによる、種々の宿主
細胞においる該キチナ−ゼの生産に利用される該キチナ
−ゼをコ−ドするＤＮＡの提供。 【解決手段】 下記するアミノ酸配列（Ｉ）： で示されるシカクマメ由来キチナ−ゼ、及び該ペプチド
鎖をコ−ドする核酸塩基配列を含んでなるシカクマメ由
来キチナ−ゼをコ−ドするＤＮＡ。
び遺伝子組換え技術を応用することによる、種々の宿主
細胞においる該キチナ−ゼの生産に利用される該キチナ
−ゼをコ−ドするＤＮＡの提供。 【解決手段】 下記するアミノ酸配列（Ｉ）： で示されるシカクマメ由来キチナ−ゼ、及び該ペプチド
鎖をコ−ドする核酸塩基配列を含んでなるシカクマメ由
来キチナ−ゼをコ−ドするＤＮＡ。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、シカクマメ由来キ
チナ−ゼ、具体的にはシカクマメ由来酸性キチナ−ゼ、
その成熟酵素のペプチド鎖をコ−ドする核酸塩基配列を
含んでなるシカクマメ由来キチナ−ゼをコ−ドするＤＮ
Ａ、並びに該シカクマメ由来キチナ−ゼ前駆体ペプチド
鎖をコ−ドする核酸塩基配列を含んでなるシカクマメ由
来キチナ−ゼ前駆体をコ−ドするＤＮＡに関するもので
ある。特には、該シカクマメ由来キチナ−ゼ前駆体ペプ
チド鎖に翻訳されるｍＲＮＡを基にして、逆転写して得
られるｃＤＮＡに関する。なお、該シカクマメ由来酸性
キチナ−ゼは、植物病原性細菌に対する抗菌作用を示す
ものである。
チナ−ゼ、具体的にはシカクマメ由来酸性キチナ−ゼ、
その成熟酵素のペプチド鎖をコ−ドする核酸塩基配列を
含んでなるシカクマメ由来キチナ−ゼをコ−ドするＤＮ
Ａ、並びに該シカクマメ由来キチナ−ゼ前駆体ペプチド
鎖をコ−ドする核酸塩基配列を含んでなるシカクマメ由
来キチナ−ゼ前駆体をコ−ドするＤＮＡに関するもので
ある。特には、該シカクマメ由来キチナ−ゼ前駆体ペプ
チド鎖に翻訳されるｍＲＮＡを基にして、逆転写して得
られるｃＤＮＡに関する。なお、該シカクマメ由来酸性
キチナ−ゼは、植物病原性細菌に対する抗菌作用を示す
ものである。
【０００２】
【従来の技術】植物は、病原性微生物の感染或いは環境
変化のストレスに対応して種々の抗菌活性を持つ蛋白質
を産出する。これらの蛋白質産出は植物免疫と呼ばれ、
その一つとして、真菌類の細胞壁を構成する主要成分の
一つであるキチンを分解する酵素、キチナ−ゼが知られ
ており、多くの植物で、その存在が確認されている。キ
チンは、Ｎ−アセチルグルコサミンのβ−グルコシド結
合による重合体であるが、キチナ−ゼ［ EC 3.2.1.14］
は、このキチンを加水分解する酵素とされる（図１を参
照）。
変化のストレスに対応して種々の抗菌活性を持つ蛋白質
を産出する。これらの蛋白質産出は植物免疫と呼ばれ、
その一つとして、真菌類の細胞壁を構成する主要成分の
一つであるキチンを分解する酵素、キチナ−ゼが知られ
ており、多くの植物で、その存在が確認されている。キ
チンは、Ｎ−アセチルグルコサミンのβ−グルコシド結
合による重合体であるが、キチナ−ゼ［ EC 3.2.1.14］
は、このキチンを加水分解する酵素とされる（図１を参
照）。
【０００３】植物は自身の細胞壁構成成分の中にはキチ
ンを含まないにも関わず、キチナ−ゼを有していること
から、植物病原菌感染に対する防御機構の一つとしてキ
チナ−ゼが機能していると考えられている。更に、傷や
低温などのストレスが植物体にかかった時にも、キチナ
−ゼは即座に植物体表面に分泌されるので、一種のスト
レス蛋白といわれている。その機構及び役割の詳細に関
しては未だ解明されていないが、植物病原菌の感染に対
する防御機構以外にも、個体の保持を行う働きを果たす
ことが予測されている。これらの観点から、植物の防御
機構の強化を目的として、キチナ−ゼ遺伝子を作物に導
入するという試みがなされている。
ンを含まないにも関わず、キチナ−ゼを有していること
から、植物病原菌感染に対する防御機構の一つとしてキ
チナ−ゼが機能していると考えられている。更に、傷や
低温などのストレスが植物体にかかった時にも、キチナ
−ゼは即座に植物体表面に分泌されるので、一種のスト
レス蛋白といわれている。その機構及び役割の詳細に関
しては未だ解明されていないが、植物病原菌の感染に対
する防御機構以外にも、個体の保持を行う働きを果たす
ことが予測されている。これらの観点から、植物の防御
機構の強化を目的として、キチナ−ゼ遺伝子を作物に導
入するという試みがなされている。
【０００４】即ち、キチンは、植物細胞の細胞壁には存
在せず、植物病原性糸状菌の細胞壁を構成する主要な多
糖類の一つであり、このキチンを分解するキチナ−ゼ
は、糸状菌の溶菌酵素としての利用が提案されている。
特に、植物由来のキチナ−ゼは、植物自体には、好まし
からざる作用を及ぼすことがないと考えられるので、植
物病原性糸状菌の感染予防への利用が有望とされてい
る。更には、植物由来のβ-1,3-グルカナ−ゼとキチナ
−ゼとを同時に作用させると、糸状菌の細胞壁系性が阻
害され、より有効に、これら菌の生育阻害ができるとさ
れている。
在せず、植物病原性糸状菌の細胞壁を構成する主要な多
糖類の一つであり、このキチンを分解するキチナ−ゼ
は、糸状菌の溶菌酵素としての利用が提案されている。
特に、植物由来のキチナ−ゼは、植物自体には、好まし
からざる作用を及ぼすことがないと考えられるので、植
物病原性糸状菌の感染予防への利用が有望とされてい
る。更には、植物由来のβ-1,3-グルカナ−ゼとキチナ
−ゼとを同時に作用させると、糸状菌の細胞壁系性が阻
害され、より有効に、これら菌の生育阻害ができるとさ
れている。
【０００５】しかしながら、既に知られている植物由来
のキチナ−ゼ相互を比較すると、数々の類似点はあるも
のの、類毎に相当の違いがあることもわかってきた。更
には、同一の植物種が産生するキチナ−ゼには複数種が
存在している。即ち、植物由来のキチナ−ゼのｃＤＮＡ
から予測されるアミノ酸配列を比較すると、少なくとも
３種類に識別でき、クラスＩ：Ｎ末にシステインを多く
含むドメインを有し、それ以降のアミノ酸配列には相同
性の高い領域が存在する主要部からなる塩基性キチナ−
ゼ、クラスII：クラスＩと類似する主要部は存在する
が、Ｎ末にシステインを多く含むドメインを欠如するキ
チナ−ゼ、及びクラスIII：クラスＩ及びクラスIIの主
要部とは大きく異なるが、相同的な別種のアミノ酸配列
を持つ酸性キチナ−ゼ、の３種が報告されている（図２
を参照）。また、単一の植物においても、これら複数種
類のキチナ−ゼの産生は組織特異性、生育期間依存性を
持つことも明らかになっている。
のキチナ−ゼ相互を比較すると、数々の類似点はあるも
のの、類毎に相当の違いがあることもわかってきた。更
には、同一の植物種が産生するキチナ−ゼには複数種が
存在している。即ち、植物由来のキチナ−ゼのｃＤＮＡ
から予測されるアミノ酸配列を比較すると、少なくとも
３種類に識別でき、クラスＩ：Ｎ末にシステインを多く
含むドメインを有し、それ以降のアミノ酸配列には相同
性の高い領域が存在する主要部からなる塩基性キチナ−
ゼ、クラスII：クラスＩと類似する主要部は存在する
が、Ｎ末にシステインを多く含むドメインを欠如するキ
チナ−ゼ、及びクラスIII：クラスＩ及びクラスIIの主
要部とは大きく異なるが、相同的な別種のアミノ酸配列
を持つ酸性キチナ−ゼ、の３種が報告されている（図２
を参照）。また、単一の植物においても、これら複数種
類のキチナ−ゼの産生は組織特異性、生育期間依存性を
持つことも明らかになっている。
【０００６】このキチナ−ゼ産生の組織特異性、生育期
間依存性を補うため、人為的に生産したキチナ−ゼを用
いて、植物自体の抗菌機構を高めることが期待されてい
る。この目的に沿い、キチナ−ゼを遺伝子組換えにより
生産するに必要なキチナ−ゼのペプチド鎖をコ−ドする
ＤＮＡの採取提供が望まれている。既に、いくつかの植
物において、キチナ−ゼの単離、該キチナ−ゼをコ−ド
するＤＮＡがクロ−ニングされているが、シカクマメ由
来酸性キチナ−ゼの存在の確認、その単離、特にはシカ
クマメ由来酸性キチナ−ゼをコ−ドするＤＮＡのクロ−
ニングは、未だ報告されていない。
間依存性を補うため、人為的に生産したキチナ−ゼを用
いて、植物自体の抗菌機構を高めることが期待されてい
る。この目的に沿い、キチナ−ゼを遺伝子組換えにより
生産するに必要なキチナ−ゼのペプチド鎖をコ−ドする
ＤＮＡの採取提供が望まれている。既に、いくつかの植
物において、キチナ−ゼの単離、該キチナ−ゼをコ−ド
するＤＮＡがクロ−ニングされているが、シカクマメ由
来酸性キチナ−ゼの存在の確認、その単離、特にはシカ
クマメ由来酸性キチナ−ゼをコ−ドするＤＮＡのクロ−
ニングは、未だ報告されていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明が解決しようと
する課題は、未だ単離されていない、新規なキチナ−ゼ
であるシカクマメ由来酸性キチナ−ゼ、及び該シカクマ
メ由来酸性キチナ−ゼをコ−ドするＤＮＡを提供するこ
とにある。従って、本発明の目的は、単離されるシカク
マメ由来酸性キチナ−ゼ、クロ−ニングによるシカクマ
メ由来酸性キチナ−ゼをコ−ドするＤＮＡの提供、更に
は、該成熟酵素である酸性キチナ−ゼの前駆体ペプチド
鎖をコ−ドするＤＮＡを提供することにある。即ち、シ
カクマメ由来酸性キチナ−ゼの成熟酵素を遺伝子組み換
え技術で生産するに不可欠な、未だクロ−ニングに成功
していない該成熟酵素をコ−ドする天然のＤＮＡ、加え
て、該キチナ−ゼの発現分泌に適するＮ末にシグナルペ
プチド配列を含む前駆体ペプチド鎖をコ−ドする天然の
ＤＮＡを提供すること、更には、該天然のＤＮＡを基
に、その核酸塩基配列を改変してなる該酸性キチナ−ゼ
の成熟酵素をコ−ドする人工的なＤＮＡ、或はその前駆
体ペプチド鎖をコ−ドする人工的なＤＮＡを提供するこ
とにある。
する課題は、未だ単離されていない、新規なキチナ−ゼ
であるシカクマメ由来酸性キチナ−ゼ、及び該シカクマ
メ由来酸性キチナ−ゼをコ−ドするＤＮＡを提供するこ
とにある。従って、本発明の目的は、単離されるシカク
マメ由来酸性キチナ−ゼ、クロ−ニングによるシカクマ
メ由来酸性キチナ−ゼをコ−ドするＤＮＡの提供、更に
は、該成熟酵素である酸性キチナ−ゼの前駆体ペプチド
鎖をコ−ドするＤＮＡを提供することにある。即ち、シ
カクマメ由来酸性キチナ−ゼの成熟酵素を遺伝子組み換
え技術で生産するに不可欠な、未だクロ−ニングに成功
していない該成熟酵素をコ−ドする天然のＤＮＡ、加え
て、該キチナ−ゼの発現分泌に適するＮ末にシグナルペ
プチド配列を含む前駆体ペプチド鎖をコ−ドする天然の
ＤＮＡを提供すること、更には、該天然のＤＮＡを基
に、その核酸塩基配列を改変してなる該酸性キチナ−ゼ
の成熟酵素をコ−ドする人工的なＤＮＡ、或はその前駆
体ペプチド鎖をコ−ドする人工的なＤＮＡを提供するこ
とにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決するべく、鋭意研究を進めた結果、シカクマメ
の組織培養で得られるカルスにおいて、キチナ−ゼが大
量に産出されることを見出し、更には、そのキチナ−ゼ
は酸性キチナ−ゼであることを確認した。この知見に基
づき、本発明者らは、シカクマメ（Prophocarpus tetra
gonolobus, 沖縄産 TPT-2）のカルスを培養し、キチナ
−ゼの産出誘導を行い、該キチナ−ゼのｍＲＮＡを多量
に採取し、対応するｃＤＮＡを単離して、酸性キチナ−
ゼの成熟酵素をコ−ドするｃＤＮＡであることを確認
し、本発明を完成するに至った。
題を解決するべく、鋭意研究を進めた結果、シカクマメ
の組織培養で得られるカルスにおいて、キチナ−ゼが大
量に産出されることを見出し、更には、そのキチナ−ゼ
は酸性キチナ−ゼであることを確認した。この知見に基
づき、本発明者らは、シカクマメ（Prophocarpus tetra
gonolobus, 沖縄産 TPT-2）のカルスを培養し、キチナ
−ゼの産出誘導を行い、該キチナ−ゼのｍＲＮＡを多量
に採取し、対応するｃＤＮＡを単離して、酸性キチナ−
ゼの成熟酵素をコ−ドするｃＤＮＡであることを確認
し、本発明を完成するに至った。
【０００９】即ち、本発明は、下記する（１）〜（６）
の各項に記載するものである。 （１） 下記するアミノ酸配列（Ｉ）［配列１］： Ala Gly Ile Ala Val Tyr Trp Gly Gln Asn Gly Gly Glu Gly Ser 1 5 10 15 Leu Ala Asp Thr Cys Asn Thr Gly Asn Tyr Glu Phe Val Asn Ile 20 25 30 Ala Phe Leu Ser Thr Phe Gly Ser Gly Gln Thr Pro Gln Leu Asn 35 40 45 Leu Ala Gly His Cys Asp Pro Ser Ser Asn Gly Cys Thr Gly Phe 50 55 60 Ser Ser Glu Ile Gln Thr Cys Gln Asn Arg Gly Ile Lys Val Leu 65 70 75 Leu Ser Leu Gly Gly Ser Ala Gly Thr Tyr Ser Leu Asn Ser Ala 80 85 90 Asp Asp Ala Thr Gln Leu Ala Asn Tyr Leu Trp Asp Asn Phe Leu 95 100 105 Gly Gly Gln Ser Gly Ser Arg Pro Leu Gly Asp Ala Val Leu Asp 110 115 120 Gly Val Asp Phe Asp Ile Glu Ser Gly Gly Ser Asn His Tyr Asp 125 130 135 Asp Leu Ala Arg Ala Leu Asn Ser Leu Ser Ser Gln Lys Lys Val 140 145 150 Tyr Leu Ser Ala Ala Pro Gln Cys Ile Ile Pro Asp Gln His Leu 155 160 165 Asp Ala Ala Ile Gln Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Val Trp Val Gln 170 175 180 Phe Tyr Asn Asn Pro Ser Cys Gln Tyr Ser Asn Gly Asp Thr Thr 185 190 195 Asn Leu Ile Asn Ser Trp Asn Gln Trp Ile Thr Val Pro Ala Ser 200 205 210 Leu Val Phe Met Gly Leu Pro Ala Ser Asp Ala Ala Ala Pro Ser 215 220 225 Gly Gly Phe Val Ser Thr Asp Val Leu Thr Ser Gln Val Leu Pro 230 235 240 Val Ile Lys Gln Ser Ser Lys Tyr Gly Gly Val Met Leu Trp Asp 245 250 255 Arg Phe Asn Asp Val Gln Thr Gly Tyr Ser Ala Ala Ile Ile Gly 260 265 270 Ser Ile Asn 273 で表されるペプチド鎖からなるシカクマメ由来キチナ−
ゼ。
の各項に記載するものである。 （１） 下記するアミノ酸配列（Ｉ）［配列１］： Ala Gly Ile Ala Val Tyr Trp Gly Gln Asn Gly Gly Glu Gly Ser 1 5 10 15 Leu Ala Asp Thr Cys Asn Thr Gly Asn Tyr Glu Phe Val Asn Ile 20 25 30 Ala Phe Leu Ser Thr Phe Gly Ser Gly Gln Thr Pro Gln Leu Asn 35 40 45 Leu Ala Gly His Cys Asp Pro Ser Ser Asn Gly Cys Thr Gly Phe 50 55 60 Ser Ser Glu Ile Gln Thr Cys Gln Asn Arg Gly Ile Lys Val Leu 65 70 75 Leu Ser Leu Gly Gly Ser Ala Gly Thr Tyr Ser Leu Asn Ser Ala 80 85 90 Asp Asp Ala Thr Gln Leu Ala Asn Tyr Leu Trp Asp Asn Phe Leu 95 100 105 Gly Gly Gln Ser Gly Ser Arg Pro Leu Gly Asp Ala Val Leu Asp 110 115 120 Gly Val Asp Phe Asp Ile Glu Ser Gly Gly Ser Asn His Tyr Asp 125 130 135 Asp Leu Ala Arg Ala Leu Asn Ser Leu Ser Ser Gln Lys Lys Val 140 145 150 Tyr Leu Ser Ala Ala Pro Gln Cys Ile Ile Pro Asp Gln His Leu 155 160 165 Asp Ala Ala Ile Gln Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Val Trp Val Gln 170 175 180 Phe Tyr Asn Asn Pro Ser Cys Gln Tyr Ser Asn Gly Asp Thr Thr 185 190 195 Asn Leu Ile Asn Ser Trp Asn Gln Trp Ile Thr Val Pro Ala Ser 200 205 210 Leu Val Phe Met Gly Leu Pro Ala Ser Asp Ala Ala Ala Pro Ser 215 220 225 Gly Gly Phe Val Ser Thr Asp Val Leu Thr Ser Gln Val Leu Pro 230 235 240 Val Ile Lys Gln Ser Ser Lys Tyr Gly Gly Val Met Leu Trp Asp 245 250 255 Arg Phe Asn Asp Val Gln Thr Gly Tyr Ser Ala Ala Ile Ile Gly 260 265 270 Ser Ile Asn 273 で表されるペプチド鎖からなるシカクマメ由来キチナ−
ゼ。
【００１０】（２） 前記するアミノ酸配列（Ｉ）で表
されるシカクマメ由来キチナ−ゼ成熟酵素のペプチド鎖
をコ−ドする核酸塩基配列を含んでなるシカクマメ由来
キチナ−ゼをコ−ドするＤＮＡ。
されるシカクマメ由来キチナ−ゼ成熟酵素のペプチド鎖
をコ−ドする核酸塩基配列を含んでなるシカクマメ由来
キチナ−ゼをコ−ドするＤＮＡ。
【００１１】（３） 前記するアミノ酸配列（Ｉ）をコ
−ドする核酸塩基配列が、下記する核酸塩基配列（Ｉ）
［配列２］： GCA GGA ATA GCT GTT TAC TGG GGC CAA AAC GGT GGA GAA GGA TCC 45 Ala Gly Ile Ala Val Tyr Trp Gly Gln Asn Gly Gly Glu Gly Ser 1 5 10 15 TTA GCA GAC ACT TGC AAC ACT GGA AAC TAC GAA TTT GTG AAC ATA Leu Ala Asp Thr Cys Asn Thr Gly Asn Tyr Glu Phe Val Asn Ile 90 20 25 30 GCT TTC TTG TCC ACT TTT GGC AGT GGC CAA ACT CCC CAA CTC AAC 135 Ala Phe Leu Ser Thr Phe Gly Ser Gly Gln Thr Pro Gln Leu Asn 35 40 45 CTT GCT GGT CAT TGT GAC CCC AGC AGC AAT GGC TGC ACT GGC TTC 180 Leu Ala Gly His Cys Asp Pro Ser Ser Asn Gly Cys Thr Gly Phe 50 55 60 AGC AGT GAG ATC CAA ACT TGT CAA AAC AGA GGG ATC AAA GTG TTG 225 Ser Ser Glu Ile Gln Thr Cys Gln Asn Arg Gly Ile Lys Val Leu 65 70 75 CTA TCT CTT GGA GGC AGT GCT GGA ACC TAC TCC CTC AAC TCA GCT 270 Leu Ser Leu Gly Gly Ser Ala Gly Thr Tyr Ser Leu Asn Ser Ala 80 85 90 GAT GAT GCC ACA CAA CTT GCA AAC TAC CTT TGG GAC AAT TTC CTC 315 Asp Asp Ala Thr Gln Leu Ala Asn Tyr Leu Trp Asp Asn Phe Leu 95 100 105 GGA GGC CAA TCT GGA TCA AGA CCA TTA GGT GAT GCT GTC TTA GAT 360 Gly Gly Gln Ser Gly Ser Arg Pro Leu Gly Asp Ala Val Leu Asp 110 115 120 GGG GTT GAC TTT GAC ATT GAA TCT GGT GGA AGT AAC CAT TAT GAT 405 Gly Val Asp Phe Asp Ile Glu Ser Gly Gly Ser Asn His Tyr Asp 125 130 135 GAT CTT GCA AGG GCA CTG AAT AGC TTG AGT TCA CAA AAG AAG GTG 450 Asp Leu Ala Arg Ala Leu Asn Ser Leu Ser Ser Gln Lys Lys Val 140 145 150 TAC TTG TCT GCA GCC CCA CAG TGC ATA ATC CCT GAT CAA CAC TTG 495 Tyr Leu Ser Ala Ala Pro Gln Cys Ile Ile Pro Asp Gln His Leu 155 160 165 GAT GCA GCC ATC CAA ACG GGG CTT TTT GAC TAT GTG TGG GTT CAG 540 Asp Ala Ala Ile Gln Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Val Trp Val Gln 170 175 180 TTC TAC AAC AAC CCT TCA TGC CAA TAC TCC AAT GGA GAC ACA ACC 585 Phe Tyr Asn Asn Pro Ser Cys Gln Tyr Ser Asn Gly Asp Thr Thr 185 190 195 AAT TTG ATC AAT TCA TGG AAC CAG TGG ATC ACA GTG CCA GCC TCC 630 Asn Leu Ile Asn Ser Trp Asn Gln Trp Ile Thr Val Pro Ala Ser 200 205 210 CTA GTC TTC ATG GGG CTT CCT GCA TCC GAT GCT GCT GCT CCA AGT 675 Leu Val Phe Met Gly Leu Pro Ala Ser Asp Ala Ala Ala Pro Ser 215 220 225 GGT GGC TTT GTG TCT ACT GAT GTG TTA ACT TCT CAA GTT CTT CCT 720 Gly Gly Phe Val Ser Thr Asp Val Leu Thr Ser Gln Val Leu Pro 230 235 240 GTC ATA AAA CAG TCT TCA AAG TAT GGT GGA GTC ATG CTC TGG GAC 765 Val Ile Lys Gln Ser Ser Lys Tyr Gly Gly Val Met Leu Trp Asp 245 250 255 AGG TTC AAC GAC GTT CAA ACT GGT TAC AGT GCT GCT ATT ATT GGA 810 Arg Phe Asn Asp Val Gln Thr Gly Tyr Ser Ala Ala Ile Ile Gly 260 265 270 AGT ATT AAT TGA 822 Ser Ile Asn *** で表されることを特徴とする前記（２）項に記載のシカ
クマメ由来キチナ−ゼをコ−ドするＤＮＡ。
−ドする核酸塩基配列が、下記する核酸塩基配列（Ｉ）
［配列２］： GCA GGA ATA GCT GTT TAC TGG GGC CAA AAC GGT GGA GAA GGA TCC 45 Ala Gly Ile Ala Val Tyr Trp Gly Gln Asn Gly Gly Glu Gly Ser 1 5 10 15 TTA GCA GAC ACT TGC AAC ACT GGA AAC TAC GAA TTT GTG AAC ATA Leu Ala Asp Thr Cys Asn Thr Gly Asn Tyr Glu Phe Val Asn Ile 90 20 25 30 GCT TTC TTG TCC ACT TTT GGC AGT GGC CAA ACT CCC CAA CTC AAC 135 Ala Phe Leu Ser Thr Phe Gly Ser Gly Gln Thr Pro Gln Leu Asn 35 40 45 CTT GCT GGT CAT TGT GAC CCC AGC AGC AAT GGC TGC ACT GGC TTC 180 Leu Ala Gly His Cys Asp Pro Ser Ser Asn Gly Cys Thr Gly Phe 50 55 60 AGC AGT GAG ATC CAA ACT TGT CAA AAC AGA GGG ATC AAA GTG TTG 225 Ser Ser Glu Ile Gln Thr Cys Gln Asn Arg Gly Ile Lys Val Leu 65 70 75 CTA TCT CTT GGA GGC AGT GCT GGA ACC TAC TCC CTC AAC TCA GCT 270 Leu Ser Leu Gly Gly Ser Ala Gly Thr Tyr Ser Leu Asn Ser Ala 80 85 90 GAT GAT GCC ACA CAA CTT GCA AAC TAC CTT TGG GAC AAT TTC CTC 315 Asp Asp Ala Thr Gln Leu Ala Asn Tyr Leu Trp Asp Asn Phe Leu 95 100 105 GGA GGC CAA TCT GGA TCA AGA CCA TTA GGT GAT GCT GTC TTA GAT 360 Gly Gly Gln Ser Gly Ser Arg Pro Leu Gly Asp Ala Val Leu Asp 110 115 120 GGG GTT GAC TTT GAC ATT GAA TCT GGT GGA AGT AAC CAT TAT GAT 405 Gly Val Asp Phe Asp Ile Glu Ser Gly Gly Ser Asn His Tyr Asp 125 130 135 GAT CTT GCA AGG GCA CTG AAT AGC TTG AGT TCA CAA AAG AAG GTG 450 Asp Leu Ala Arg Ala Leu Asn Ser Leu Ser Ser Gln Lys Lys Val 140 145 150 TAC TTG TCT GCA GCC CCA CAG TGC ATA ATC CCT GAT CAA CAC TTG 495 Tyr Leu Ser Ala Ala Pro Gln Cys Ile Ile Pro Asp Gln His Leu 155 160 165 GAT GCA GCC ATC CAA ACG GGG CTT TTT GAC TAT GTG TGG GTT CAG 540 Asp Ala Ala Ile Gln Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Val Trp Val Gln 170 175 180 TTC TAC AAC AAC CCT TCA TGC CAA TAC TCC AAT GGA GAC ACA ACC 585 Phe Tyr Asn Asn Pro Ser Cys Gln Tyr Ser Asn Gly Asp Thr Thr 185 190 195 AAT TTG ATC AAT TCA TGG AAC CAG TGG ATC ACA GTG CCA GCC TCC 630 Asn Leu Ile Asn Ser Trp Asn Gln Trp Ile Thr Val Pro Ala Ser 200 205 210 CTA GTC TTC ATG GGG CTT CCT GCA TCC GAT GCT GCT GCT CCA AGT 675 Leu Val Phe Met Gly Leu Pro Ala Ser Asp Ala Ala Ala Pro Ser 215 220 225 GGT GGC TTT GTG TCT ACT GAT GTG TTA ACT TCT CAA GTT CTT CCT 720 Gly Gly Phe Val Ser Thr Asp Val Leu Thr Ser Gln Val Leu Pro 230 235 240 GTC ATA AAA CAG TCT TCA AAG TAT GGT GGA GTC ATG CTC TGG GAC 765 Val Ile Lys Gln Ser Ser Lys Tyr Gly Gly Val Met Leu Trp Asp 245 250 255 AGG TTC AAC GAC GTT CAA ACT GGT TAC AGT GCT GCT ATT ATT GGA 810 Arg Phe Asn Asp Val Gln Thr Gly Tyr Ser Ala Ala Ile Ile Gly 260 265 270 AGT ATT AAT TGA 822 Ser Ile Asn *** で表されることを特徴とする前記（２）項に記載のシカ
クマメ由来キチナ−ゼをコ−ドするＤＮＡ。
【００１２】（４） 下記するアミノ酸配列（II）［配
列３］： Met Glu Ser Leu Lys Lys Ala Ser Leu Val Leu Phe Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Leu Ser Leu Phe Asn His Ser Asn Ala Ala Gly Ile Ala Val 20 25 30 Tyr Trp Gly Gln Asn Gly Gly Glu Gly Ser Leu Ala Asp Thr Cys 35 40 45 Asn Thr Gly Asn Tyr Glu Phe Val Asn Ile Ala Phe Leu Ser Thr 50 55 60 Phe Gly Ser Gly Gln Thr Pro Gln Leu Asn Leu Ala Gly His Cys 65 70 75 Asp Pro Ser Ser Asn Gly Cys Thr Gly Phe Ser Ser Glu Ile Gln 80 85 90 Thr Cys Gln Asn Arg Gly Ile Lys Val Leu Leu Ser Leu Gly Gly 95 100 105 Ser Ala Gly Thr Tyr Ser Leu Asn Ser Ala Asp Asp Ala Thr Gln 110 115 120 Leu Ala Asn Tyr Leu Trp Asp Asn Phe Leu Gly Gly Gln Ser Gly 125 130 135 Ser Arg Pro Leu Gly Asp Ala Val Leu Asp Gly Val Asp Phe Asp 140 145 150 Ile Glu Ser Gly Gly Ser Asn His Tyr Asp Asp Leu Ala Arg Ala 155 160 165 Leu Asn Ser Leu Ser Ser Gln Lys Lys Val Tyr Leu Ser Ala Ala 170 175 180 Pro Gln Cys Ile Ile Pro Asp Gln His Leu Asp Ala Ala Ile Gln 185 190 195 Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Val Trp Val Gln Phe Tyr Asn Asn Pro 200 205 210 Ser Cys Gln Tyr Ser Asn Gly Asp Thr Thr Asn Leu Ile Asn Ser 215 220 225 Trp Asn Gln Trp Ile Thr Val Pro Ala Ser Leu Val Phe Met Gly 230 235 240 Leu Pro Ala Ser Asp Ala Ala Ala Pro Ser Gly Gly Phe Val Ser 245 250 255 Thr Asp Val Leu Thr Ser Gln Val Leu Pro Val Ile Lys Gln Ser 260 265 270 Ser Lys Tyr Gly Gly Val Met Leu Trp Asp Arg Phe Asn Asp Val 275 280 285 Gln Thr Gly Tyr Ser Ala Ala Ile Ile Gly Ser Ile Asn 290 295 で表されるシカクマメ由来キチナ−ゼの前駆体ペプチド
鎖をコ−ドする核酸塩基配列を含んでなるシカクマメ由
来キチナ−ゼ前駆体をコ−ドするＤＮＡ。
列３］： Met Glu Ser Leu Lys Lys Ala Ser Leu Val Leu Phe Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Leu Ser Leu Phe Asn His Ser Asn Ala Ala Gly Ile Ala Val 20 25 30 Tyr Trp Gly Gln Asn Gly Gly Glu Gly Ser Leu Ala Asp Thr Cys 35 40 45 Asn Thr Gly Asn Tyr Glu Phe Val Asn Ile Ala Phe Leu Ser Thr 50 55 60 Phe Gly Ser Gly Gln Thr Pro Gln Leu Asn Leu Ala Gly His Cys 65 70 75 Asp Pro Ser Ser Asn Gly Cys Thr Gly Phe Ser Ser Glu Ile Gln 80 85 90 Thr Cys Gln Asn Arg Gly Ile Lys Val Leu Leu Ser Leu Gly Gly 95 100 105 Ser Ala Gly Thr Tyr Ser Leu Asn Ser Ala Asp Asp Ala Thr Gln 110 115 120 Leu Ala Asn Tyr Leu Trp Asp Asn Phe Leu Gly Gly Gln Ser Gly 125 130 135 Ser Arg Pro Leu Gly Asp Ala Val Leu Asp Gly Val Asp Phe Asp 140 145 150 Ile Glu Ser Gly Gly Ser Asn His Tyr Asp Asp Leu Ala Arg Ala 155 160 165 Leu Asn Ser Leu Ser Ser Gln Lys Lys Val Tyr Leu Ser Ala Ala 170 175 180 Pro Gln Cys Ile Ile Pro Asp Gln His Leu Asp Ala Ala Ile Gln 185 190 195 Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Val Trp Val Gln Phe Tyr Asn Asn Pro 200 205 210 Ser Cys Gln Tyr Ser Asn Gly Asp Thr Thr Asn Leu Ile Asn Ser 215 220 225 Trp Asn Gln Trp Ile Thr Val Pro Ala Ser Leu Val Phe Met Gly 230 235 240 Leu Pro Ala Ser Asp Ala Ala Ala Pro Ser Gly Gly Phe Val Ser 245 250 255 Thr Asp Val Leu Thr Ser Gln Val Leu Pro Val Ile Lys Gln Ser 260 265 270 Ser Lys Tyr Gly Gly Val Met Leu Trp Asp Arg Phe Asn Asp Val 275 280 285 Gln Thr Gly Tyr Ser Ala Ala Ile Ile Gly Ser Ile Asn 290 295 で表されるシカクマメ由来キチナ−ゼの前駆体ペプチド
鎖をコ−ドする核酸塩基配列を含んでなるシカクマメ由
来キチナ−ゼ前駆体をコ−ドするＤＮＡ。
【００１３】（５） 前記するアミノ酸配列（II）をコ
−ドする核酸塩基配列が、下記する核酸塩基配列（II）
［配列４］： ATG GAA TCC TTG AAG AAA GCC TCA CTT GTC TTA TTT CCT ATC TTG 45 Met Glu Ser Leu Lys Lys Ala Ser Leu Val Leu Phe Pro Ile Leu -25 -20 -15 GTC CTT TCC CTA TTC AAC CAT TCC AAT GCT GCA GGA ATA GCT GTT 90 Val Leu Ser Leu Phe Asn His Ser Asn Ala Ala Gly Ile Ala Val -10 -5 1 5 TAC TGG GGC CAA AAC GGT GGA GAA GGA TCC TTA GCA GAC ACT TGC 135 Tyr Trp Gly Gln Asn Gly Gly Glu Gly Ser Leu Ala Asp Thr Cys 10 15 20 AAC ACT GGA AAC TAC GAA TTT GTG AAC ATA GCT TTC TTG TCC ACT 180 Asn Thr Gly Asn Tyr Glu Phe Val Asn Ile Ala Phe Leu Ser Thr 25 30 35 TTT GGC AGT GGC CAA ACT CCC CAA CTC AAC CTT GCT GGT CAT TGT 225 Phe Gly Ser Gly Gln Thr Pro Gln Leu Asn Leu Ala Gly His Cys 40 45 50 GAC CCC AGC AGC AAT GGC TGC ACT GGC TTC AGC AGT GAG ATC CAA 270 Asp Pro Ser Ser Asn Gly Cys Thr Gly Phe Ser Ser Glu Ile Gln 55 60 65 ACT TGT CAA AAC AGA GGG ATC AAA GTG TTG CTA TCT CTT GGA GGC 315 Thr Cys Gln Asn Arg Gly Ile Lys Val Leu Leu Ser Leu Gly Gly 70 75 80 AGT GCT GGA ACC TAC TCC CTC AAC TCA GCT GAT GAT GCC ACA CAA 360 Ser Ala Gly Thr Tyr Ser Leu Asn Ser Ala Asp Asp Ala Thr Gln 85 90 95 CTT GCA AAC TAC CTT TGG GAC AAT TTC CTC GGA GGC CAA TCT GGA 405 Leu Ala Asn Tyr Leu Trp Asp Asn Phe Leu Gly Gly Gln Ser Gly 100 105 110 TCA AGA CCA TTA GGT GAT GCT GTC TTA GAT GGG GTT GAC TTT GAC 450 Ser Arg Pro Leu Gly Asp Ala Val Leu Asp Gly Val Asp Phe Asp 115 120 125 ATT GAA TCT GGT GGA AGT AAC CAT TAT GAT GAT CTT GCA AGG GCA 495 Ile Glu Ser Gly Gly Ser Asn His Tyr Asp Asp Leu Ala Arg Ala 130 135 140 CTG AAT AGC TTG AGT TCA CAA AAG AAG GTG TAC TTG TCT GCA GCC 540 Leu Asn Ser Leu Ser Ser Gln Lys Lys Val Tyr Leu Ser Ala Ala 145 150 155 CCA CAG TGC ATA ATC CCT GAT CAA CAC TTG GAT GCA GCC ATC CAA 585 Pro Gln Cys Ile Ile Pro Asp Gln His Leu Asp Ala Ala Ile Gln 160 165 170 ACG GGG CTT TTT GAC TAT GTG TGG GTT CAG TTC TAC AAC AAC CCT 630 Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Val Trp Val Gln Phe Tyr Asn Asn Pro 175 180 185 TCA TGC CAA TAC TCC AAT GGA GAC ACA ACC AAT TTG ATC AAT TCA 675 Ser Cys Gln Tyr Ser Asn Gly Asp Thr Thr Asn Leu Ile Asn Ser 190 195 200 TGG AAC CAG TGG ATC ACA GTG CCA GCC TCC CTA GTC TTC ATG GGG 720 Trp Asn Gln Trp Ile Thr Val Pro Ala Ser Leu Val Phe Met Gly 205 210 215 CTT CCT GCA TCC GAT GCT GCT GCT CCA AGT GGT GGC TTT GTG TCT 765 Leu Pro Ala Ser Asp Ala Ala Ala Pro Ser Gly Gly Phe Val Ser 220 225 230 ACT GAT GTG TTA ACT TCT CAA GTT CTT CCT GTC ATA AAA CAG TCT 810 Thr Asp Val Leu Thr Ser Gln Val Leu Pro Val Ile Lys Gln Ser 235 240 245 TCA AAG TAT GGT GGA GTC ATG CTC TGG GAC AGG TTC AAC GAC GTT 855 Ser Lys Tyr Gly Gly Val Met Leu Trp Asp Arg Phe Asn Asp Val 250 255 260 CAA ACT GGT TAC AGT GCT GCT ATT ATT GGA AGT ATT AAT TGA 897 Gln Thr Gly Tyr Ser Ala Ala Ile Ile Gly Ser Ile Asn *** 265 270 で表されることを特徴とする前記（４）項に記載のシカ
クマメ由来キチナ−ゼ前駆体をコ−ドするＤＮＡ。
−ドする核酸塩基配列が、下記する核酸塩基配列（II）
［配列４］： ATG GAA TCC TTG AAG AAA GCC TCA CTT GTC TTA TTT CCT ATC TTG 45 Met Glu Ser Leu Lys Lys Ala Ser Leu Val Leu Phe Pro Ile Leu -25 -20 -15 GTC CTT TCC CTA TTC AAC CAT TCC AAT GCT GCA GGA ATA GCT GTT 90 Val Leu Ser Leu Phe Asn His Ser Asn Ala Ala Gly Ile Ala Val -10 -5 1 5 TAC TGG GGC CAA AAC GGT GGA GAA GGA TCC TTA GCA GAC ACT TGC 135 Tyr Trp Gly Gln Asn Gly Gly Glu Gly Ser Leu Ala Asp Thr Cys 10 15 20 AAC ACT GGA AAC TAC GAA TTT GTG AAC ATA GCT TTC TTG TCC ACT 180 Asn Thr Gly Asn Tyr Glu Phe Val Asn Ile Ala Phe Leu Ser Thr 25 30 35 TTT GGC AGT GGC CAA ACT CCC CAA CTC AAC CTT GCT GGT CAT TGT 225 Phe Gly Ser Gly Gln Thr Pro Gln Leu Asn Leu Ala Gly His Cys 40 45 50 GAC CCC AGC AGC AAT GGC TGC ACT GGC TTC AGC AGT GAG ATC CAA 270 Asp Pro Ser Ser Asn Gly Cys Thr Gly Phe Ser Ser Glu Ile Gln 55 60 65 ACT TGT CAA AAC AGA GGG ATC AAA GTG TTG CTA TCT CTT GGA GGC 315 Thr Cys Gln Asn Arg Gly Ile Lys Val Leu Leu Ser Leu Gly Gly 70 75 80 AGT GCT GGA ACC TAC TCC CTC AAC TCA GCT GAT GAT GCC ACA CAA 360 Ser Ala Gly Thr Tyr Ser Leu Asn Ser Ala Asp Asp Ala Thr Gln 85 90 95 CTT GCA AAC TAC CTT TGG GAC AAT TTC CTC GGA GGC CAA TCT GGA 405 Leu Ala Asn Tyr Leu Trp Asp Asn Phe Leu Gly Gly Gln Ser Gly 100 105 110 TCA AGA CCA TTA GGT GAT GCT GTC TTA GAT GGG GTT GAC TTT GAC 450 Ser Arg Pro Leu Gly Asp Ala Val Leu Asp Gly Val Asp Phe Asp 115 120 125 ATT GAA TCT GGT GGA AGT AAC CAT TAT GAT GAT CTT GCA AGG GCA 495 Ile Glu Ser Gly Gly Ser Asn His Tyr Asp Asp Leu Ala Arg Ala 130 135 140 CTG AAT AGC TTG AGT TCA CAA AAG AAG GTG TAC TTG TCT GCA GCC 540 Leu Asn Ser Leu Ser Ser Gln Lys Lys Val Tyr Leu Ser Ala Ala 145 150 155 CCA CAG TGC ATA ATC CCT GAT CAA CAC TTG GAT GCA GCC ATC CAA 585 Pro Gln Cys Ile Ile Pro Asp Gln His Leu Asp Ala Ala Ile Gln 160 165 170 ACG GGG CTT TTT GAC TAT GTG TGG GTT CAG TTC TAC AAC AAC CCT 630 Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Val Trp Val Gln Phe Tyr Asn Asn Pro 175 180 185 TCA TGC CAA TAC TCC AAT GGA GAC ACA ACC AAT TTG ATC AAT TCA 675 Ser Cys Gln Tyr Ser Asn Gly Asp Thr Thr Asn Leu Ile Asn Ser 190 195 200 TGG AAC CAG TGG ATC ACA GTG CCA GCC TCC CTA GTC TTC ATG GGG 720 Trp Asn Gln Trp Ile Thr Val Pro Ala Ser Leu Val Phe Met Gly 205 210 215 CTT CCT GCA TCC GAT GCT GCT GCT CCA AGT GGT GGC TTT GTG TCT 765 Leu Pro Ala Ser Asp Ala Ala Ala Pro Ser Gly Gly Phe Val Ser 220 225 230 ACT GAT GTG TTA ACT TCT CAA GTT CTT CCT GTC ATA AAA CAG TCT 810 Thr Asp Val Leu Thr Ser Gln Val Leu Pro Val Ile Lys Gln Ser 235 240 245 TCA AAG TAT GGT GGA GTC ATG CTC TGG GAC AGG TTC AAC GAC GTT 855 Ser Lys Tyr Gly Gly Val Met Leu Trp Asp Arg Phe Asn Asp Val 250 255 260 CAA ACT GGT TAC AGT GCT GCT ATT ATT GGA AGT ATT AAT TGA 897 Gln Thr Gly Tyr Ser Ala Ala Ile Ile Gly Ser Ile Asn *** 265 270 で表されることを特徴とする前記（４）項に記載のシカ
クマメ由来キチナ−ゼ前駆体をコ−ドするＤＮＡ。
【００１４】（６） 下記する核酸塩基配列（III）
［配列５］： ATTC GAGGA TCCGG GTACC ATGGA TCAGA GCCTA GGAAC 39 ATG GAA TCC TTG AAG AAA GCC TCA CTT GTC TTA TTT CCT ATC TTG 84 Met Glu Ser Leu Lys Lys Ala Ser Leu Val Leu Phe Pro Ile Leu -25 -20 -15 GTC CTT TCC CTA TTC AAC CAT TCC AAT GCT GCA GGA ATA GCT GTT 129 Val Leu Ser Leu Phe Asn His Ser Asn Ala Ala Gly Ile Ala Val -10 -5 1 5 TAC TGG GGC CAA AAC GGT GGA GAA GGA TCC TTA GCA GAC ACT TGC 174 Tyr Trp Gly Gln Asn Gly Gly Glu Gly Ser Leu Ala Asp Thr Cys 10 15 20 AAC ACT GGA AAC TAC GAA TTT GTG AAC ATA GCT TTC TTG TCC ACT 219 Asn Thr Gly Asn Tyr Glu Phe Val Asn Ile Ala Phe Leu Ser Thr 25 30 35 TTT GGC AGT GGC CAA ACT CCC CAA CTC AAC CTT GCT GGT CAT TGT 264 Phe Gly Ser Gly Gln Thr Pro Gln Leu Asn Leu Ala Gly His Cys 40 45 50 GAC CCC AGC AGC AAT GGC TGC ACT GGC TTC AGC AGT GAG ATC CAA 309 Asp Pro Ser Ser Asn Gly Cys Thr Gly Phe Ser Ser Glu Ile Gln 55 60 65 ACT TGT CAA AAC AGA GGG ATC AAA GTG TTG CTA TCT CTT GGA GGC 354 Thr Cys Gln Asn Arg Gly Ile Lys Val Leu Leu Ser Leu Gly Gly 70 75 80 AGT GCT GGA ACC TAC TCC CTC AAC TCA GCT GAT GAT GCC ACA CAA 399 Ser Ala Gly Thr Tyr Ser Leu Asn Ser Ala Asp Asp Ala Thr Gln 85 90 95 CTT GCA AAC TAC CTT TGG GAC AAT TTC CTC GGA GGC CAA TCT GGA 444 Leu Ala Asn Tyr Leu Trp Asp Asn Phe Leu Gly Gly Gln Ser Gly 100 105 110 TCA AGA CCA TTA GGT GAT GCT GTC TTA GAT GGG GTT GAC TTT GAC 489 Ser Arg Pro Leu Gly Asp Ala Val Leu Asp Gly Val Asp Phe Asp 115 120 125 ATT GAA TCT GGT GGA AGT AAC CAT TAT GAT GAT CTT GCA AGG GCA 534 Ile Glu Ser Gly Gly Ser Asn His Tyr Asp Asp Leu Ala Arg Ala 130 135 140 CTG AAT AGC TTG AGT TCA CAA AAG AAG GTG TAC TTG TCT GCA GCC 579 Leu Asn Ser Leu Ser Ser Gln Lys Lys Val Tyr Leu Ser Ala Ala 145 150 155 CCA CAG TGC ATA ATC CCT GAT CAA CAC TTG GAT GCA GCC ATC CAA 624 Pro Gln Cys Ile Ile Pro Asp Gln His Leu Asp Ala Ala Ile Gln 160 165 170 ACG GGG CTT TTT GAC TAT GTG TGG GTT CAG TTC TAC AAC AAC CCT 669 Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Val Trp Val Gln Phe Tyr Asn Asn Pro 175 180 185 TCA TGC CAA TAC TCC AAT GGA GAC ACA ACC AAT TTG ATC AAT TCA 624 Ser Cys Gln Tyr Ser Asn Gly Asp Thr Thr Asn Leu Ile Asn Ser 190 195 200 TGG AAC CAG TGG ATC ACA GTG CCA GCC TCC CTA GTC TTC ATG GGG 730 Trp Asn Gln Trp Ile Thr Val Pro Ala Ser Leu Val Phe Met Gly 205 210 215 CTT CCT GCA TCC GAT GCT GCT GCT CCA AGT GGT GGC TTT GTG TCT 775 Leu Pro Ala Ser Asp Ala Ala Ala Pro Ser Gly Gly Phe Val Ser 220 225 230 ACT GAT GTG TTA ACT TCT CAA GTT CTT CCT GTC ATA AAA CAG TCT 810 Thr Asp Val Leu Thr Ser Gln Val Leu Pro Val Ile Lys Gln Ser 235 240 245 TCA AAG TAT GGT GGA GTC ATG CTC TGG GAC AGG TTC AAC GAC GTT 855 Ser Lys Tyr Gly Gly Val Met Leu Trp Asp Arg Phe Asn Asp Val 250 255 260 CAA ACT GGT TAC AGT GCT GCT ATT ATT GGA AGT ATT AAT TGA 897 Gln Thr Gly Tyr Ser Ala Ala Ile Ile Gly Ser Ile Asn *** 265 270 TTAAT TAGTT ATAAG CCAAC TATGA CATTC ACTTA TTTAA ATAAT 942 CACCA CCACT AGTTG GTATT GTTAC TATAC ACTAT ACATT GAATG 987 TGCTG TCAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA 1032 AAAAA AAGGG GGGGG GGCCA TGGTA CCCGG ATCCT CGAAT TC 1074 で表されることを特徴とする前記（５）項に記載のシカ
クマメ由来キチナ−ゼ前駆体をコ−ドするＤＮＡ。
［配列５］： ATTC GAGGA TCCGG GTACC ATGGA TCAGA GCCTA GGAAC 39 ATG GAA TCC TTG AAG AAA GCC TCA CTT GTC TTA TTT CCT ATC TTG 84 Met Glu Ser Leu Lys Lys Ala Ser Leu Val Leu Phe Pro Ile Leu -25 -20 -15 GTC CTT TCC CTA TTC AAC CAT TCC AAT GCT GCA GGA ATA GCT GTT 129 Val Leu Ser Leu Phe Asn His Ser Asn Ala Ala Gly Ile Ala Val -10 -5 1 5 TAC TGG GGC CAA AAC GGT GGA GAA GGA TCC TTA GCA GAC ACT TGC 174 Tyr Trp Gly Gln Asn Gly Gly Glu Gly Ser Leu Ala Asp Thr Cys 10 15 20 AAC ACT GGA AAC TAC GAA TTT GTG AAC ATA GCT TTC TTG TCC ACT 219 Asn Thr Gly Asn Tyr Glu Phe Val Asn Ile Ala Phe Leu Ser Thr 25 30 35 TTT GGC AGT GGC CAA ACT CCC CAA CTC AAC CTT GCT GGT CAT TGT 264 Phe Gly Ser Gly Gln Thr Pro Gln Leu Asn Leu Ala Gly His Cys 40 45 50 GAC CCC AGC AGC AAT GGC TGC ACT GGC TTC AGC AGT GAG ATC CAA 309 Asp Pro Ser Ser Asn Gly Cys Thr Gly Phe Ser Ser Glu Ile Gln 55 60 65 ACT TGT CAA AAC AGA GGG ATC AAA GTG TTG CTA TCT CTT GGA GGC 354 Thr Cys Gln Asn Arg Gly Ile Lys Val Leu Leu Ser Leu Gly Gly 70 75 80 AGT GCT GGA ACC TAC TCC CTC AAC TCA GCT GAT GAT GCC ACA CAA 399 Ser Ala Gly Thr Tyr Ser Leu Asn Ser Ala Asp Asp Ala Thr Gln 85 90 95 CTT GCA AAC TAC CTT TGG GAC AAT TTC CTC GGA GGC CAA TCT GGA 444 Leu Ala Asn Tyr Leu Trp Asp Asn Phe Leu Gly Gly Gln Ser Gly 100 105 110 TCA AGA CCA TTA GGT GAT GCT GTC TTA GAT GGG GTT GAC TTT GAC 489 Ser Arg Pro Leu Gly Asp Ala Val Leu Asp Gly Val Asp Phe Asp 115 120 125 ATT GAA TCT GGT GGA AGT AAC CAT TAT GAT GAT CTT GCA AGG GCA 534 Ile Glu Ser Gly Gly Ser Asn His Tyr Asp Asp Leu Ala Arg Ala 130 135 140 CTG AAT AGC TTG AGT TCA CAA AAG AAG GTG TAC TTG TCT GCA GCC 579 Leu Asn Ser Leu Ser Ser Gln Lys Lys Val Tyr Leu Ser Ala Ala 145 150 155 CCA CAG TGC ATA ATC CCT GAT CAA CAC TTG GAT GCA GCC ATC CAA 624 Pro Gln Cys Ile Ile Pro Asp Gln His Leu Asp Ala Ala Ile Gln 160 165 170 ACG GGG CTT TTT GAC TAT GTG TGG GTT CAG TTC TAC AAC AAC CCT 669 Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Val Trp Val Gln Phe Tyr Asn Asn Pro 175 180 185 TCA TGC CAA TAC TCC AAT GGA GAC ACA ACC AAT TTG ATC AAT TCA 624 Ser Cys Gln Tyr Ser Asn Gly Asp Thr Thr Asn Leu Ile Asn Ser 190 195 200 TGG AAC CAG TGG ATC ACA GTG CCA GCC TCC CTA GTC TTC ATG GGG 730 Trp Asn Gln Trp Ile Thr Val Pro Ala Ser Leu Val Phe Met Gly 205 210 215 CTT CCT GCA TCC GAT GCT GCT GCT CCA AGT GGT GGC TTT GTG TCT 775 Leu Pro Ala Ser Asp Ala Ala Ala Pro Ser Gly Gly Phe Val Ser 220 225 230 ACT GAT GTG TTA ACT TCT CAA GTT CTT CCT GTC ATA AAA CAG TCT 810 Thr Asp Val Leu Thr Ser Gln Val Leu Pro Val Ile Lys Gln Ser 235 240 245 TCA AAG TAT GGT GGA GTC ATG CTC TGG GAC AGG TTC AAC GAC GTT 855 Ser Lys Tyr Gly Gly Val Met Leu Trp Asp Arg Phe Asn Asp Val 250 255 260 CAA ACT GGT TAC AGT GCT GCT ATT ATT GGA AGT ATT AAT TGA 897 Gln Thr Gly Tyr Ser Ala Ala Ile Ile Gly Ser Ile Asn *** 265 270 TTAAT TAGTT ATAAG CCAAC TATGA CATTC ACTTA TTTAA ATAAT 942 CACCA CCACT AGTTG GTATT GTTAC TATAC ACTAT ACATT GAATG 987 TGCTG TCAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA 1032 AAAAA AAGGG GGGGG GGCCA TGGTA CCCGG ATCCT CGAAT TC 1074 で表されることを特徴とする前記（５）項に記載のシカ
クマメ由来キチナ−ゼ前駆体をコ−ドするＤＮＡ。
【００１５】なお、上記するシカクマメ由来キチナ−ゼ
のアミノ酸配列（Ｉ）［配列１］は、シカクマメ由来キ
チナ−ゼ前駆体ペプチド鎖を示すアミノ酸配列（II）
［配列２］において、そのＮ末端の 1Met から２６残基
Ｃ末側に位置する 26Ala 以降、Ｃ末端の Asn までの２
７３残基からなるペプチド鎖に対応している。一方、前
駆体ペプチド鎖を示すアミノ酸配列（II）［配列２］の
Ｎ末端の 1Met から 25Ala までの２５残基からなる部
分ペプチド鎖は、シグナルペプチド配列にあたる。即
ち、シカクマメ由来酸性キチナ−ゼは、一旦、該シグナ
ルペプチド配列を含む前駆体ペプチド鎖として蛋白質に
翻訳された後、25Ala と 26Ala の間で切断を受け、成
熟酵素に変換される。
のアミノ酸配列（Ｉ）［配列１］は、シカクマメ由来キ
チナ−ゼ前駆体ペプチド鎖を示すアミノ酸配列（II）
［配列２］において、そのＮ末端の 1Met から２６残基
Ｃ末側に位置する 26Ala 以降、Ｃ末端の Asn までの２
７３残基からなるペプチド鎖に対応している。一方、前
駆体ペプチド鎖を示すアミノ酸配列（II）［配列２］の
Ｎ末端の 1Met から 25Ala までの２５残基からなる部
分ペプチド鎖は、シグナルペプチド配列にあたる。即
ち、シカクマメ由来酸性キチナ−ゼは、一旦、該シグナ
ルペプチド配列を含む前駆体ペプチド鎖として蛋白質に
翻訳された後、25Ala と 26Ala の間で切断を受け、成
熟酵素に変換される。
【００１６】一方、天然のシカクマメ由来キチナ−ゼに
翻訳されるｍＲＮＡから逆転写されるｃＤＮＡは、前記
する核酸塩基配列（III）［配列５］で表され、上記す
るアミノ酸配列（II）をコ−ドする核酸塩基配列とし
て、核酸塩基配列（II）［配列４］で表されるシカクマ
メ由来キチナ−ゼの前駆体ペプチド鎖をコ−ドするＤＮ
Ａを含んでおり、更には、係るアミノ酸配列に翻訳され
る領域に加えて、その３’末側、並びに５’末側に非翻
訳領域を含んでいる（図４を参照）。即ち、前記する核
酸塩基配列（Ｉ）は、該ｃＤＮＡの核酸塩基配列（II
I）中に存在するアミノ酸配列に翻訳される領域、核酸
塩基配列（II）の部分配列として存在するものである。
なお、これら核酸塩基配列（Ｉ）及び核酸塩基配列（I
I）は、参考のため、翻訳域の終末に存在するストップ
コドン TGA を含めて表記している。
翻訳されるｍＲＮＡから逆転写されるｃＤＮＡは、前記
する核酸塩基配列（III）［配列５］で表され、上記す
るアミノ酸配列（II）をコ−ドする核酸塩基配列とし
て、核酸塩基配列（II）［配列４］で表されるシカクマ
メ由来キチナ−ゼの前駆体ペプチド鎖をコ−ドするＤＮ
Ａを含んでおり、更には、係るアミノ酸配列に翻訳され
る領域に加えて、その３’末側、並びに５’末側に非翻
訳領域を含んでいる（図４を参照）。即ち、前記する核
酸塩基配列（Ｉ）は、該ｃＤＮＡの核酸塩基配列（II
I）中に存在するアミノ酸配列に翻訳される領域、核酸
塩基配列（II）の部分配列として存在するものである。
なお、これら核酸塩基配列（Ｉ）及び核酸塩基配列（I
I）は、参考のため、翻訳域の終末に存在するストップ
コドン TGA を含めて表記している。
【００１７】
【発明の実施の形態】本発明のシカクマメ由来キチナ−
ゼは、SDS-PAGE 法による分析で測定される分子量は 約
29,000 であり、また、等電点 pI は、 4.0 であり、
クラス IIIの酸性キチナ−ゼである。また、アミノ酸分
析により解析されるＮ末の部分アミノ酸配列は、下記す
る部分配列（IＶ）： Ala Gly Ile Ala Val Tyr Trp Gly Gln Asn Gly Gly Glu Gly Ser Leu Ala 1 5 10 15 で示される。即ち、Ｎ末にメチオニンを有しておらず、
シグナルペプチド配列を含む前駆体ペプチド鎖から、切
断を受け、成熟酵素に変換されたものである（図３を参
照）。
ゼは、SDS-PAGE 法による分析で測定される分子量は 約
29,000 であり、また、等電点 pI は、 4.0 であり、
クラス IIIの酸性キチナ−ゼである。また、アミノ酸分
析により解析されるＮ末の部分アミノ酸配列は、下記す
る部分配列（IＶ）： Ala Gly Ile Ala Val Tyr Trp Gly Gln Asn Gly Gly Glu Gly Ser Leu Ala 1 5 10 15 で示される。即ち、Ｎ末にメチオニンを有しておらず、
シグナルペプチド配列を含む前駆体ペプチド鎖から、切
断を受け、成熟酵素に変換されたものである（図３を参
照）。
【００１８】また、該キチナ−ゼ成熟酵素は、他の植物
由来の酸性キチナ−ゼと同じく、植物細胞外に分泌され
る可溶性蛋白質である。そのため、シカクマメのカルス
細胞を培養し、培地中に蓄積する該キチナ−ゼを、その
酵素活性を指標に分取し、更に、SDS-PAGE 法により分
子量 約 29,000 の部分として、単離精製することがで
きる。特には、カルス細胞を液体培養中で培養開始後、
30 日間程度を経過すると、急速に分泌量は増すのでこ
の時期に培地より分取するとよい。
由来の酸性キチナ−ゼと同じく、植物細胞外に分泌され
る可溶性蛋白質である。そのため、シカクマメのカルス
細胞を培養し、培地中に蓄積する該キチナ−ゼを、その
酵素活性を指標に分取し、更に、SDS-PAGE 法により分
子量 約 29,000 の部分として、単離精製することがで
きる。特には、カルス細胞を液体培養中で培養開始後、
30 日間程度を経過すると、急速に分泌量は増すのでこ
の時期に培地より分取するとよい。
【００１９】このキチナ−ゼ成熟酵素のアミノ酸配列
（Ｉ）を決定するには、先ず、該シカクマメ細胞より全
ＲＮＡを採取し、そのなかに含まれるｍＲＮＡを、poly
A+ RNA として精製する。このpoly A+ RNA 精製標品か
ら、相補する cDNA を逆転写して調製した後、両端に E
coR I アダプタ−を連結した cDNA は、 λgt10 ベクタ
−ア−ム に連結して、λファ−ジ粒子に構築する。こ
の過程で得られる cDNAライブラリ−より、上の部分配
列（IＶ）を参照して作製した下記する二種のプロ−ブ
１及び２： Probe 1 GCT GGT ATT GCT GTT TAT TGG GGT CAG AAT GG Probe 2 GTT TAT TGG GGT CAG AAT GGT GGT GAG GG を用いて、プラ−クハイブリダイゼ−ション法スクリ−
ニングにより陽性ファ−ジを選別する。この陽性ファ−
ジ粒子は、該キチナ−ゼのｍＲＮＡから調製される cDN
A が挿入されたものである。一旦、ファ−ジＤＮＡを制
限酵素により消化し、挿入された該キチナ−ゼのｍＲＮ
Ａから調製される cDNA に当るＤＮＡ断片を回収し、サ
ブクロ−ニングのため、汎用のプラスミドベクタ−に組
み込み、宿主大腸菌に導入して形質転換株を得る。
（Ｉ）を決定するには、先ず、該シカクマメ細胞より全
ＲＮＡを採取し、そのなかに含まれるｍＲＮＡを、poly
A+ RNA として精製する。このpoly A+ RNA 精製標品か
ら、相補する cDNA を逆転写して調製した後、両端に E
coR I アダプタ−を連結した cDNA は、 λgt10 ベクタ
−ア−ム に連結して、λファ−ジ粒子に構築する。こ
の過程で得られる cDNAライブラリ−より、上の部分配
列（IＶ）を参照して作製した下記する二種のプロ−ブ
１及び２： Probe 1 GCT GGT ATT GCT GTT TAT TGG GGT CAG AAT GG Probe 2 GTT TAT TGG GGT CAG AAT GGT GGT GAG GG を用いて、プラ−クハイブリダイゼ−ション法スクリ−
ニングにより陽性ファ−ジを選別する。この陽性ファ−
ジ粒子は、該キチナ−ゼのｍＲＮＡから調製される cDN
A が挿入されたものである。一旦、ファ−ジＤＮＡを制
限酵素により消化し、挿入された該キチナ−ゼのｍＲＮ
Ａから調製される cDNA に当るＤＮＡ断片を回収し、サ
ブクロ−ニングのため、汎用のプラスミドベクタ−に組
み込み、宿主大腸菌に導入して形質転換株を得る。
【００２０】該キチナ−ゼ成熟酵素の分子量 約 29,000
から予測されるアミノ酸残基数は、 290 程度であり、
更には、シグナルペプチド配列を含む前駆体ペプチド鎖
として、 cDNA 上にコ−ドされることを考慮し、前駆体
ペプチド鎖に翻訳されるべきオ−プンリ−ディング部分
として、1000 bps 程度を含むと推定される。この推定
の基に、サブクロ−ニングされた複数のＤＮＡ断片か
ら、分子量による選別を加え、その核酸塩基配列を解読
する。そのオ−プンリ−ディング部分に付いて、上記す
る部分配列（IＶ）と一致する部分を検索し、少なくと
も、該キチナ−ゼの前駆体ペプチド鎖をコ−ドする cDN
A を採取することができる。解読されたオ−プンリ−デ
ィング部分から翻訳されるアミノ酸配列としいて、前駆
体ペプチド鎖を示すアミノ酸配列（II）並びに、その部
分配列である、該キチナ−ゼ成熟酵素を示すアミノ酸配
列（Ｉ）がそれぞれ決定される。
から予測されるアミノ酸残基数は、 290 程度であり、
更には、シグナルペプチド配列を含む前駆体ペプチド鎖
として、 cDNA 上にコ−ドされることを考慮し、前駆体
ペプチド鎖に翻訳されるべきオ−プンリ−ディング部分
として、1000 bps 程度を含むと推定される。この推定
の基に、サブクロ−ニングされた複数のＤＮＡ断片か
ら、分子量による選別を加え、その核酸塩基配列を解読
する。そのオ−プンリ−ディング部分に付いて、上記す
る部分配列（IＶ）と一致する部分を検索し、少なくと
も、該キチナ−ゼの前駆体ペプチド鎖をコ−ドする cDN
A を採取することができる。解読されたオ−プンリ−デ
ィング部分から翻訳されるアミノ酸配列としいて、前駆
体ペプチド鎖を示すアミノ酸配列（II）並びに、その部
分配列である、該キチナ−ゼ成熟酵素を示すアミノ酸配
列（Ｉ）がそれぞれ決定される。
【００２１】上記の方法で、シカクマメのカルス細胞よ
り採取したｍＲＮＡから、該キチナ−ゼの前駆体ペプチ
ド鎖に翻訳されるｍＲＮＡ、実際には、それより逆転写
で調製されるｃＤＮＡを選別したところ、発明者らは、
前記の核酸塩基配列（III）で示されるものを得ること
ができた。その他のサブクロ−ンに関しても、それに挿
入されているｃＤＮＡに当るＤＮＡ断片の核酸塩基配列
を解読したところ、いずれも前記の核酸塩基配列（II
I）の部分配列であることが確認された。
り採取したｍＲＮＡから、該キチナ−ゼの前駆体ペプチ
ド鎖に翻訳されるｍＲＮＡ、実際には、それより逆転写
で調製されるｃＤＮＡを選別したところ、発明者らは、
前記の核酸塩基配列（III）で示されるものを得ること
ができた。その他のサブクロ−ンに関しても、それに挿
入されているｃＤＮＡに当るＤＮＡ断片の核酸塩基配列
を解読したところ、いずれも前記の核酸塩基配列（II
I）の部分配列であることが確認された。
【００２２】即ち、シカクマメ由来キチナ−ゼのアミノ
酸配列（Ｉ）をコ−ドするＤＮＡの対応する翻訳域は、
天然のシカクマメ由来キチナ−ゼのｍＲＮＡから調整さ
れるｃＤＮＡにおいては、具体的には、上に示す核酸塩
基配列（Ｉ）で表されている。更に、上記のシグナルペ
プチド配列を含む前駆体ペプチド鎖を示すアミノ酸配列
（II）は、天然のシカクマメ由来のｍＲＮＡから調整さ
れるｃＤＮＡにおいて、上に示す核酸塩基配列（II）で
表されている。尚、これら核酸塩基配列（Ｉ）及び核酸
塩基配列（II）には、参考のため、翻訳域の終末に存在
するストップコドン TGA を含めて表記している。ま
た、天然のカボチャ由来のｍＲＮＡから調整されるｃＤ
ＮＡには、上記の核酸塩基配列（II）で表される前駆体
ペプチド鎖に翻訳される領域に加えて、上に示す核酸塩
基配列（III）において、開始コドン ATG の上流部に位
置する上流非翻訳域、前期ストップコドン TGA の下流
部に位置する下流非翻訳域がそれぞれ含まれている。な
お、この下流非翻訳域には、ｍＲＮＡへの転写終了に関
与するポリアデニレ−ションシグナルと推定できる部
分、その更に下流には poly A 鎖が存在している。
酸配列（Ｉ）をコ−ドするＤＮＡの対応する翻訳域は、
天然のシカクマメ由来キチナ−ゼのｍＲＮＡから調整さ
れるｃＤＮＡにおいては、具体的には、上に示す核酸塩
基配列（Ｉ）で表されている。更に、上記のシグナルペ
プチド配列を含む前駆体ペプチド鎖を示すアミノ酸配列
（II）は、天然のシカクマメ由来のｍＲＮＡから調整さ
れるｃＤＮＡにおいて、上に示す核酸塩基配列（II）で
表されている。尚、これら核酸塩基配列（Ｉ）及び核酸
塩基配列（II）には、参考のため、翻訳域の終末に存在
するストップコドン TGA を含めて表記している。ま
た、天然のカボチャ由来のｍＲＮＡから調整されるｃＤ
ＮＡには、上記の核酸塩基配列（II）で表される前駆体
ペプチド鎖に翻訳される領域に加えて、上に示す核酸塩
基配列（III）において、開始コドン ATG の上流部に位
置する上流非翻訳域、前期ストップコドン TGA の下流
部に位置する下流非翻訳域がそれぞれ含まれている。な
お、この下流非翻訳域には、ｍＲＮＡへの転写終了に関
与するポリアデニレ−ションシグナルと推定できる部
分、その更に下流には poly A 鎖が存在している。
【００２３】本発明のキカクマメ由来キチナ−ゼをコ−
ドするＤＮＡは、上記する核酸塩基配列（Ｉ）で表され
るｃＤＮＡのみならず、この核酸塩基配列（Ｉ）を基
に、対応するアミノ酸配列（Ｉ）に翻訳されるべく、同
一のアミノ酸をコ−ドする別種コドンに変換してなる改
変されたＤＮＡであってもよい。このコドンの変換に際
して、アミノ酸配列（Ｉ）と核酸塩基配列（Ｉ）とを対
比参照すると、例えば、Asn をコ−ドするコドンとし
て、AAC 及び AAT の双方が利用されている。このよう
な該キチナ−ゼのｍＲＮＡへの転写に際し、天然に用い
られている範囲内で、相互に任意なコドンの変換を施し
ても、当該アミノ酸への翻訳において顕著な差異は生じ
ないと考えられる。即ち、コドンの変換による改変され
たＤＮＡにおいて、用いられるコドンは、当該天然の核
酸塩基配列（Ｉ）中において、各アミノ酸をコ−ドする
複数種のコドンの範囲内でコドンの変換を行うのがより
好ましい。更には、係るコドンの変換による改変された
ＤＮＡを利用して、遺伝子組換え技術を応用して、種々
の宿主細胞で遺伝子組換え型のシカクマメ由来キチナ−
ゼを産出させる際し、宿主細胞において、高い頻度で利
用されるコドンに変換すると一般に好ましいのは勿論の
ことである。
ドするＤＮＡは、上記する核酸塩基配列（Ｉ）で表され
るｃＤＮＡのみならず、この核酸塩基配列（Ｉ）を基
に、対応するアミノ酸配列（Ｉ）に翻訳されるべく、同
一のアミノ酸をコ−ドする別種コドンに変換してなる改
変されたＤＮＡであってもよい。このコドンの変換に際
して、アミノ酸配列（Ｉ）と核酸塩基配列（Ｉ）とを対
比参照すると、例えば、Asn をコ−ドするコドンとし
て、AAC 及び AAT の双方が利用されている。このよう
な該キチナ−ゼのｍＲＮＡへの転写に際し、天然に用い
られている範囲内で、相互に任意なコドンの変換を施し
ても、当該アミノ酸への翻訳において顕著な差異は生じ
ないと考えられる。即ち、コドンの変換による改変され
たＤＮＡにおいて、用いられるコドンは、当該天然の核
酸塩基配列（Ｉ）中において、各アミノ酸をコ−ドする
複数種のコドンの範囲内でコドンの変換を行うのがより
好ましい。更には、係るコドンの変換による改変された
ＤＮＡを利用して、遺伝子組換え技術を応用して、種々
の宿主細胞で遺伝子組換え型のシカクマメ由来キチナ−
ゼを産出させる際し、宿主細胞において、高い頻度で利
用されるコドンに変換すると一般に好ましいのは勿論の
ことである。
【００２４】また、本発明のシカクマメ由来キチナ−ゼ
の前駆体ペプチド鎖をコ−ドするＤＮＡは、上記するｍ
ＲＮＡから逆転写により得られる核酸塩基配列（II）で
表させるｃＤＮＡのみならず、この核酸塩基配列（II）
を基に、対応いするアミノ酸配列（II）に翻訳されるべ
く、同一のアミノ酸をコ−ドする別種コドンに変換して
なる改変されたＤＮＡであってもよい。なお、コドンの
変換を、上記したシカクマメ由来キチナ−ゼをコ−ドす
るＤＮＡにおけるコドン変換の手法に準じて行い、より
好ましい改変されたＤＮＡとすることができる。
の前駆体ペプチド鎖をコ−ドするＤＮＡは、上記するｍ
ＲＮＡから逆転写により得られる核酸塩基配列（II）で
表させるｃＤＮＡのみならず、この核酸塩基配列（II）
を基に、対応いするアミノ酸配列（II）に翻訳されるべ
く、同一のアミノ酸をコ−ドする別種コドンに変換して
なる改変されたＤＮＡであってもよい。なお、コドンの
変換を、上記したシカクマメ由来キチナ−ゼをコ−ドす
るＤＮＡにおけるコドン変換の手法に準じて行い、より
好ましい改変されたＤＮＡとすることができる。
【００２５】上記するサブクロ−ニングの工程では、核
酸塩基配列（III）で表されるＤＮＡは、その５’端、
及び３’端にそれぞれ合成した部分核酸塩基配列を付加
して、制限酵素 EcoRI の切断部位を設ける二重鎖ＤＮ
Ａとして、市販のプラスミドpBluescript II SK(＋) (S
tratagene 社製）のクロ−ニングサイト、制限酵素 Eco
RI の切断部位に挿入したプラスミド pWBACH01 を構築
した。図４に、該プラスミド pWBACH01 に挿入される、
核酸塩基配列（III）で示される二重鎖ＤＮＡ（シカク
マメ由来キチナ−ゼの前駆体ペプチド鎖をコ−ドするｃ
ＤＮＡを保持する）を示す。そのプラスミド pWBACH01
の構築は、常法に従い、制限酵素 EcoRIの切断部位を含
む合成プライマ−を用いたＰＣＲ法を応用して該配列の
両端に前記制限酵素の切断部位を付加し、プラスミド p
Bluescript II SK(＋) の断片と連結する工程に拠っ
た。また、該プラスミド pWBACH01 を大腸菌 JM109 株
に導入して、形質転換した大腸菌 EWBACH01 の菌株を得
た。該大腸菌 EWBACH01 の菌株は、識別のため呼称 E.
coli JM109 EWBACH01 を付与し、通産省工業技術院生命
工学工業技術研究所（生命研）に寄託される。なお、核
酸塩基配列（Ｉ）で表されるＤＮＡ、並びに核酸塩基配
列（II）で表されるＤＮＡは、核酸塩基配列（III）で
表されｃＤＮＡ中にその部分核酸塩基配列として存在す
るので、それぞれ該プラスミド pWBACH01 を用いて、対
応する部分をしかるべきプライマ−を利用するＰＣＲ法
を応用して再増幅することにより、容易に採取すること
ができる。
酸塩基配列（III）で表されるＤＮＡは、その５’端、
及び３’端にそれぞれ合成した部分核酸塩基配列を付加
して、制限酵素 EcoRI の切断部位を設ける二重鎖ＤＮ
Ａとして、市販のプラスミドpBluescript II SK(＋) (S
tratagene 社製）のクロ−ニングサイト、制限酵素 Eco
RI の切断部位に挿入したプラスミド pWBACH01 を構築
した。図４に、該プラスミド pWBACH01 に挿入される、
核酸塩基配列（III）で示される二重鎖ＤＮＡ（シカク
マメ由来キチナ−ゼの前駆体ペプチド鎖をコ−ドするｃ
ＤＮＡを保持する）を示す。そのプラスミド pWBACH01
の構築は、常法に従い、制限酵素 EcoRIの切断部位を含
む合成プライマ−を用いたＰＣＲ法を応用して該配列の
両端に前記制限酵素の切断部位を付加し、プラスミド p
Bluescript II SK(＋) の断片と連結する工程に拠っ
た。また、該プラスミド pWBACH01 を大腸菌 JM109 株
に導入して、形質転換した大腸菌 EWBACH01 の菌株を得
た。該大腸菌 EWBACH01 の菌株は、識別のため呼称 E.
coli JM109 EWBACH01 を付与し、通産省工業技術院生命
工学工業技術研究所（生命研）に寄託される。なお、核
酸塩基配列（Ｉ）で表されるＤＮＡ、並びに核酸塩基配
列（II）で表されるＤＮＡは、核酸塩基配列（III）で
表されｃＤＮＡ中にその部分核酸塩基配列として存在す
るので、それぞれ該プラスミド pWBACH01 を用いて、対
応する部分をしかるべきプライマ−を利用するＰＣＲ法
を応用して再増幅することにより、容易に採取すること
ができる。
【００２６】以下に、本発明を具体例により説明する。
即ち、本発明のシカクマメ由来キチナ−ゼ成熟酵素の単
離、該キチナ−ゼの前駆体ペプチドをコ−ドするＤＮ
Ａ、シカクマメ由来キチナ−ゼ成熟酵素をコ−ドするＤ
ＮＡを調整する方法、並びにその核酸塩基配列とそれが
コ−ドするアミノ酸配列、更には、得られたＤＮＡを含
むプラスミドの構築と、そのプラスミドを保持する形質
転換微生物を得る方法について詳しく説明する。
即ち、本発明のシカクマメ由来キチナ−ゼ成熟酵素の単
離、該キチナ−ゼの前駆体ペプチドをコ−ドするＤＮ
Ａ、シカクマメ由来キチナ−ゼ成熟酵素をコ−ドするＤ
ＮＡを調整する方法、並びにその核酸塩基配列とそれが
コ−ドするアミノ酸配列、更には、得られたＤＮＡを含
むプラスミドの構築と、そのプラスミドを保持する形質
転換微生物を得る方法について詳しく説明する。
【００２７】
【実施例１】 シカクマメ（Prophocarpus tetragonolobus, 沖縄産 TP
T-2）由来キチナ−ゼの単離 下記する手順により、シカクマメのカルス誘導、該カル
スの培養増殖を図り、カルス細胞より分泌されるキチナ
−ゼの存在を確認した。また、分泌されたキチナ−ゼを
培養液中から回収単離を行った。
T-2）由来キチナ−ゼの単離 下記する手順により、シカクマメのカルス誘導、該カル
スの培養増殖を図り、カルス細胞より分泌されるキチナ
−ゼの存在を確認した。また、分泌されたキチナ−ゼを
培養液中から回収単離を行った。
【００２８】〔カルス誘導〕シカクマメの実生の茎切片
を、ＳＭ培地（ショ糖 3.0 ％、寒天 0.8 ％、2,4-D 1.
0 mg/l、カイネチン 0.1 mg/l）に無菌的に植え、25 ℃
で暗所培養しカルスを誘導した。約１か月間の培養後、
ＳＭ培地 50 ml を 100 ml 容三角フラスコに入れ、オ
−トクレ−ブ処理した後、得られたカルス １ g (生体
重)を植え付け、引き続き、25 ℃で暗所培養し、増殖を
行った。この植え継ぎ操作を、１か月毎に繰り返し、カ
ルスの増殖・維持を行なった。
を、ＳＭ培地（ショ糖 3.0 ％、寒天 0.8 ％、2,4-D 1.
0 mg/l、カイネチン 0.1 mg/l）に無菌的に植え、25 ℃
で暗所培養しカルスを誘導した。約１か月間の培養後、
ＳＭ培地 50 ml を 100 ml 容三角フラスコに入れ、オ
−トクレ−ブ処理した後、得られたカルス １ g (生体
重)を植え付け、引き続き、25 ℃で暗所培養し、増殖を
行った。この植え継ぎ操作を、１か月毎に繰り返し、カ
ルスの増殖・維持を行なった。
【００２９】〔キチナ−ゼの分泌〕カルス細胞からのキ
チナ−ゼ分泌は、次の操作で行った。予め培養増殖した
カルス 2 g (生体重)ずつを、ＳＭ液体培地（前記ＳＭ
培地より、寒天を除く組成） 50 ml を分注しておいた
200 ml 容三角フラスコにそれぞれ植え付け、旋回振盪
培養器を用いて、70 回転／分、25 ℃の条件で、暗所培
養した。この間、カルス細胞から分泌されるキチナ−ゼ
は、培養液中に蓄積する（図７を参照）。
チナ−ゼ分泌は、次の操作で行った。予め培養増殖した
カルス 2 g (生体重)ずつを、ＳＭ液体培地（前記ＳＭ
培地より、寒天を除く組成） 50 ml を分注しておいた
200 ml 容三角フラスコにそれぞれ植え付け、旋回振盪
培養器を用いて、70 回転／分、25 ℃の条件で、暗所培
養した。この間、カルス細胞から分泌されるキチナ−ゼ
は、培養液中に蓄積する（図７を参照）。
【００３０】〔粗酵素液の調製〕上記する条件で、30
日間液体培養した後、カルス細胞を分離するため、培養
液を濾紙（TOYO No.2）を用いて濾過した。回収した濾
液に、飽和硫安溶液を硫安濃度が飽和濃度の 50 ％に達
するまで、ゆっくり撹拌しながら徐々に滴下した。その
後、4 ℃で 2 時間放置した後、12,000 rpm、30 分間遠
心分離した。遠心後の上澄みを分取し、この上澄み液
に、飽和硫安溶液を硫安濃度が飽和濃度の 75 ％に達す
るまで更に加えた。次いで、4 ℃ で 2 時間放置した
後、12,000 rpm、30 分間遠心分離した。遠心後、沈殿
として得られる蛋白質に、少量の 100 mMリン酸ナトリ
ウム緩衝液（pH 5.5）を加えて溶解した。
日間液体培養した後、カルス細胞を分離するため、培養
液を濾紙（TOYO No.2）を用いて濾過した。回収した濾
液に、飽和硫安溶液を硫安濃度が飽和濃度の 50 ％に達
するまで、ゆっくり撹拌しながら徐々に滴下した。その
後、4 ℃で 2 時間放置した後、12,000 rpm、30 分間遠
心分離した。遠心後の上澄みを分取し、この上澄み液
に、飽和硫安溶液を硫安濃度が飽和濃度の 75 ％に達す
るまで更に加えた。次いで、4 ℃ で 2 時間放置した
後、12,000 rpm、30 分間遠心分離した。遠心後、沈殿
として得られる蛋白質に、少量の 100 mMリン酸ナトリ
ウム緩衝液（pH 5.5）を加えて溶解した。
【００３１】この蛋白質溶液を、Laemmli らの方法に従
い、SDS-PAGE 法により分析したところ、分子量 約 29,
000 の位置にほぼ単一なバンドが認められた。該蛋白質
溶液を、粗酵素液として、以下の方法で、キチナ−ゼ活
性を測定した。
い、SDS-PAGE 法により分析したところ、分子量 約 29,
000 の位置にほぼ単一なバンドが認められた。該蛋白質
溶液を、粗酵素液として、以下の方法で、キチナ−ゼ活
性を測定した。
【００３２】〔キチナ−ゼ活性測定〕キチナ−ゼ活性
は、グリコ−ルキチン（可溶化キチン）の分解による還
元糖の増大を指標として、Park-Johnson 法で測定し
た。調製グリコ−ルキチン（１ mg/ml）200 μl に、10
0 mM のリン酸ナトリウム緩衝液（pH 5.5） 200 μlを
加え、よく撹拌混合した。この液に、粗酵素液 10 μl
を加え、素早く撹拌混合した後、25 ℃で、30 分間イン
キュベ−トした。反応後、反応停止液として K3Fe(CN)6
溶液（1.8 g K3Fe(CN)6 / 0.5 M Na2CO3水溶液） 400
μl を加えて撹拌した後、30 分間沸騰水浴上につけ、
酵素の失活を図った。冷却後、分光光度計で 420 nm に
おける吸光度を測定し、粗酵素液に換え、蒸留水を加え
た参照との比較による 420 nm における吸光度の減少を
キチナ−ゼ活性の指標とした。この結果、上記する分子
量 約 29,000 の蛋白質はキチナ−ゼ活性を示すことが
確認された。
は、グリコ−ルキチン（可溶化キチン）の分解による還
元糖の増大を指標として、Park-Johnson 法で測定し
た。調製グリコ−ルキチン（１ mg/ml）200 μl に、10
0 mM のリン酸ナトリウム緩衝液（pH 5.5） 200 μlを
加え、よく撹拌混合した。この液に、粗酵素液 10 μl
を加え、素早く撹拌混合した後、25 ℃で、30 分間イン
キュベ−トした。反応後、反応停止液として K3Fe(CN)6
溶液（1.8 g K3Fe(CN)6 / 0.5 M Na2CO3水溶液） 400
μl を加えて撹拌した後、30 分間沸騰水浴上につけ、
酵素の失活を図った。冷却後、分光光度計で 420 nm に
おける吸光度を測定し、粗酵素液に換え、蒸留水を加え
た参照との比較による 420 nm における吸光度の減少を
キチナ−ゼ活性の指標とした。この結果、上記する分子
量 約 29,000 の蛋白質はキチナ−ゼ活性を示すことが
確認された。
【００３３】〔キチナ−ゼ分泌の経時的変化〕液体培養
開始後、経時的に培養液をサンプリングを行ない、培養
液の示すキチナ−ゼ活性を測定した。図５に示すごと
く、培養が進み、30 日目に到ると活性は最も高くな
り、１ 日目の活性の約 20 倍に達している。この間の
細胞数(重量)の増加と対比すると、培養後期において当
該キチナ−ゼは特異的に分泌されるものと判断された。
液体培地 10 ml から得られた粗酵素液より、該キチナ
−ゼを分離精製し、約 400 μg の酸性キチナ−ゼ精製
標品を得ることができた。また、該キチナ−ゼの等電点
pI は、 4.0 であり、酸性キチナ−ゼと推察された。
開始後、経時的に培養液をサンプリングを行ない、培養
液の示すキチナ−ゼ活性を測定した。図５に示すごと
く、培養が進み、30 日目に到ると活性は最も高くな
り、１ 日目の活性の約 20 倍に達している。この間の
細胞数(重量)の増加と対比すると、培養後期において当
該キチナ−ゼは特異的に分泌されるものと判断された。
液体培地 10 ml から得られた粗酵素液より、該キチナ
−ゼを分離精製し、約 400 μg の酸性キチナ−ゼ精製
標品を得ることができた。また、該キチナ−ゼの等電点
pI は、 4.0 であり、酸性キチナ−ゼと推察された。
【００３４】なお、該シカクマメ（Prophocarpus tetra
gonolobus, 沖縄産 TPT-2）は、このクラスIIIに類別さ
れる酸性キチナ−ゼに加えて、クラスＩに類別される塩
基性キチナ−ゼをも産生していることを確認した。図
５、６に示すごとく、該クラスＩの塩基性キチナ−ゼ
は、SDS-PAGE 法による分析において、分子量 約 33,00
0 のバンドを与えることが判った。該クラスＩの塩基性
キチナ−ゼは、主に、葉組織で生産されているが、クラ
スIIIの酸性キチナ−ゼは主に根組織で生産されている
ことが、図６に示す組織特異性の結果より判明した。ま
た、塩基性キチナ−ゼの等電点 pI は約 8 であり、両
者は容易に分離することができる。
gonolobus, 沖縄産 TPT-2）は、このクラスIIIに類別さ
れる酸性キチナ−ゼに加えて、クラスＩに類別される塩
基性キチナ−ゼをも産生していることを確認した。図
５、６に示すごとく、該クラスＩの塩基性キチナ−ゼ
は、SDS-PAGE 法による分析において、分子量 約 33,00
0 のバンドを与えることが判った。該クラスＩの塩基性
キチナ−ゼは、主に、葉組織で生産されているが、クラ
スIIIの酸性キチナ−ゼは主に根組織で生産されている
ことが、図６に示す組織特異性の結果より判明した。ま
た、塩基性キチナ−ゼの等電点 pI は約 8 であり、両
者は容易に分離することができる。
【００３５】更に、カルス組織においては、図６に示す
ごとく、塩基性キチナ−ゼは細胞組織内には存在するも
のの、培養液中には分泌されていないことが判る。ま
た、図５に示す結果に見出せるように、植え継ぎした
後、培養初期（３日間経過時）には、生産が確認される
が、培養期間が１５日間に達すると、その存在は確認さ
れない。一方、酸性キチナ−ゼは、細胞組織内に存在す
るのは勿論であるが、培養液中にも分泌されており、培
養期間が１５日間を超えるとその量は顕著に増してい
る。従って、３０日間の培養後、培養液から調製した蛋
白質溶液の示すキチナ−ゼ活性は、該酸性キチナ−ゼに
因るものであることが確認された。
ごとく、塩基性キチナ−ゼは細胞組織内には存在するも
のの、培養液中には分泌されていないことが判る。ま
た、図５に示す結果に見出せるように、植え継ぎした
後、培養初期（３日間経過時）には、生産が確認される
が、培養期間が１５日間に達すると、その存在は確認さ
れない。一方、酸性キチナ−ゼは、細胞組織内に存在す
るのは勿論であるが、培養液中にも分泌されており、培
養期間が１５日間を超えるとその量は顕著に増してい
る。従って、３０日間の培養後、培養液から調製した蛋
白質溶液の示すキチナ−ゼ活性は、該酸性キチナ−ゼに
因るものであることが確認された。
【００３６】〔アミノ末端側の部分アミノ酸配列〕該キ
チナ−ゼが、シカクマメの酸性キチナ−ゼであることを
確認する目的で、アミノ末端側の部分アミノ酸配列を分
析し、他の植物由来のキチナ−ゼとのアミノ酸配列との
比較を行った。アミノ酸配列の分析は、プロテインシ−
クエンサ−（Applied Biosystems 477A/120A型）により
決定した。予め、酸性キチナ−ゼ精製標品を、Microdia
lyzer（System 100、 PIERCE 社）を用いて２時間、４
℃で、30 分毎に透析液（蒸留水）を交換し透析した。
透析後、蛋白質 200 pmolを、プロテインシ−クエンサ
−にアプライし、アミノ末端側のアミノ酸配列の 17 残
基を決定した。
チナ−ゼが、シカクマメの酸性キチナ−ゼであることを
確認する目的で、アミノ末端側の部分アミノ酸配列を分
析し、他の植物由来のキチナ−ゼとのアミノ酸配列との
比較を行った。アミノ酸配列の分析は、プロテインシ−
クエンサ−（Applied Biosystems 477A/120A型）により
決定した。予め、酸性キチナ−ゼ精製標品を、Microdia
lyzer（System 100、 PIERCE 社）を用いて２時間、４
℃で、30 分毎に透析液（蒸留水）を交換し透析した。
透析後、蛋白質 200 pmolを、プロテインシ−クエンサ
−にアプライし、アミノ末端側のアミノ酸配列の 17 残
基を決定した。
【００３７】 シカクマメ由来キチナ−ゼのアミノ末端アミノ酸配列 Ala Gly Ile Ala Val Tyr Trp Gly Gln Asn Gly Gly Glu Gly Ser Leu Ala 1 5 10 15
【００３８】この決定されたアミノ末端側のアミノ酸配
列はメチオニンを含んでおらず、更に、他のキチナ−ゼ
とのアミノ酸配列を比較したところ、図３に示すよう
に、タバコ、アラビドプシスおよびキュウリに存在する
酸性側に等電点を持つ酸性キチナ−ゼ成熟酵素のアミノ
末端側のアミノ酸配列との間に高い相同性が認められ
た。まさしく、ここに分離したシカクマメ由来キチナ−
ゼは、酸性キチナ−ゼであることが確認され、前駆体ペ
プチド鎖として一旦翻訳された後、Ala のＮ末側で切断
を受け、成熟酵素に変換されるものであることも判っ
た。
列はメチオニンを含んでおらず、更に、他のキチナ−ゼ
とのアミノ酸配列を比較したところ、図３に示すよう
に、タバコ、アラビドプシスおよびキュウリに存在する
酸性側に等電点を持つ酸性キチナ−ゼ成熟酵素のアミノ
末端側のアミノ酸配列との間に高い相同性が認められ
た。まさしく、ここに分離したシカクマメ由来キチナ−
ゼは、酸性キチナ−ゼであることが確認され、前駆体ペ
プチド鎖として一旦翻訳された後、Ala のＮ末側で切断
を受け、成熟酵素に変換されるものであることも判っ
た。
【００３９】以上の結果より、シカクマメ（Prophocarp
us tetragonolobus, 沖縄産 TPT-2）由来キチナ−ゼ
は、SDS-PAGE 法による分析において、分子量 約 29,00
0 と測定され、等電点 pI は、 4.0 であり、該成熟酵
素蛋白質のアミノ末端側のアミノ酸配列は前記する図３
で示され、クラスIIIキチナ−ゼ（酸性キチナ−ゼ）に
分類されることが判明した。
us tetragonolobus, 沖縄産 TPT-2）由来キチナ−ゼ
は、SDS-PAGE 法による分析において、分子量 約 29,00
0 と測定され、等電点 pI は、 4.0 であり、該成熟酵
素蛋白質のアミノ末端側のアミノ酸配列は前記する図３
で示され、クラスIIIキチナ−ゼ（酸性キチナ−ゼ）に
分類されることが判明した。
【００４０】
【実施例２】 シカクマメ（Prophocarpus tetragonolobus, 沖縄産 TP
T-2）由来キチナ−ゼのｃＤＮＡ調製及び該ｃＤＮＡの
核酸塩基配列解読、該キチナ−ゼ前駆体ペプチド鎖のア
ミノ酸配列の決定 上記実施例１において、単離されたシカクマメ（Propho
carpus tetragonolobus, 沖縄産 TPT-2）由来キチナ−
ゼをコ−ドするＤＮＡを調製するべく、下記する手順に
従い、ｍＲＮＡから逆転写して得られるｃＤＮＡライブ
ラリ−より、目的のｃＤＮＡを選別した。次いで、該シ
カクマメ由来キチナ−ゼのｃＤＮＡの核酸塩基配列を解
読し、該シカクマメ由来キチナ−ゼの前駆体ペプチド鎖
に翻訳される核酸塩基配列、並びに対応する該キチナ−
ゼ前駆体ペプチド鎖のアミノ酸配列の決定を行った。更
には、該前駆体ペプチド鎖から生成する該キチナ−ゼ成
熟酵素のアミノ酸配列を解明した。
T-2）由来キチナ−ゼのｃＤＮＡ調製及び該ｃＤＮＡの
核酸塩基配列解読、該キチナ−ゼ前駆体ペプチド鎖のア
ミノ酸配列の決定 上記実施例１において、単離されたシカクマメ（Propho
carpus tetragonolobus, 沖縄産 TPT-2）由来キチナ−
ゼをコ−ドするＤＮＡを調製するべく、下記する手順に
従い、ｍＲＮＡから逆転写して得られるｃＤＮＡライブ
ラリ−より、目的のｃＤＮＡを選別した。次いで、該シ
カクマメ由来キチナ−ゼのｃＤＮＡの核酸塩基配列を解
読し、該シカクマメ由来キチナ−ゼの前駆体ペプチド鎖
に翻訳される核酸塩基配列、並びに対応する該キチナ−
ゼ前駆体ペプチド鎖のアミノ酸配列の決定を行った。更
には、該前駆体ペプチド鎖から生成する該キチナ−ゼ成
熟酵素のアミノ酸配列を解明した。
【００４１】〔プロ−ブの作製〕図３に示すシカクマメ
のキチナ−ゼのアミノ末端のアミノ酸配列と、これまで
に報告例のある数種のクラスIIIキチナ−ゼ（酸性キチ
ナ−ゼ）とを比較して（図３を参照）、特に保存性の高
い領域を含むよう考慮し、２種類のプロ−ブをデザイン
した。なお、プロ−ブ作製にあたり、アミノ酸をコ−ド
するコドンが複数存在するものに関しては、選択肢とな
る複数塩基のうち、Ｔ（チロシン）を、次いでＧ（グア
ニン）を優先して選択する方法を採用した。即ち、図３
に示すアミノ酸配列をコ−ドする核酸塩基配列に対応す
るものから、その部分核酸塩基配列に当たるプロ−ブ１
及び２を選択した。
のキチナ−ゼのアミノ末端のアミノ酸配列と、これまで
に報告例のある数種のクラスIIIキチナ−ゼ（酸性キチ
ナ−ゼ）とを比較して（図３を参照）、特に保存性の高
い領域を含むよう考慮し、２種類のプロ−ブをデザイン
した。なお、プロ−ブ作製にあたり、アミノ酸をコ−ド
するコドンが複数存在するものに関しては、選択肢とな
る複数塩基のうち、Ｔ（チロシン）を、次いでＧ（グア
ニン）を優先して選択する方法を採用した。即ち、図３
に示すアミノ酸配列をコ−ドする核酸塩基配列に対応す
るものから、その部分核酸塩基配列に当たるプロ−ブ１
及び２を選択した。
【００４２】 プロ−ブの作製 アミノ酸 Ala Gly Ile Ala Val Tyr Trp Gly Gln Asn Gly Gly Glu Gly (Ile) (Asn) mRNA GCU GGU AUU GCU GUU UAU UGG GGU CAG AAU GGU GGU GUG GGU C C C C C C C C C C C A A A A A A A A A AAA A A G G G G G G G G Probe 1 GCT GGT ATT GCT GTT TAT TGG GGT CAG AAT GG Probe 2 GTT TAT TGG GGT CAG AAT GGT GGT GAG GG
【００４３】〔オリゴヌクレオチドの合成〕前記するプ
ロ−ブ１及び２それぞれのオリゴヌクレオチド合成に
は、ＤＮＡ合成機を使用した。合成終了後、オリゴヌク
レオチドの結合したサポ−トを取り出し、減圧下にてア
セトニトリルを除去し、1 ml の28 ％ アンモニア水中
に、28℃において終夜放置した。そして、このオリゴヌ
クレオチドを含むアンモニア水を回収し、減圧下で遠心
を行い、アンモニアを除去した。残る水溶液からエタノ
−ル沈殿の後、沈殿として得られるオリゴヌクレオチド
を 50 μl のＴＥ緩衝液に溶解し、この未精製標品を下
記の方法で精製を加えて用いた。
ロ−ブ１及び２それぞれのオリゴヌクレオチド合成に
は、ＤＮＡ合成機を使用した。合成終了後、オリゴヌク
レオチドの結合したサポ−トを取り出し、減圧下にてア
セトニトリルを除去し、1 ml の28 ％ アンモニア水中
に、28℃において終夜放置した。そして、このオリゴヌ
クレオチドを含むアンモニア水を回収し、減圧下で遠心
を行い、アンモニアを除去した。残る水溶液からエタノ
−ル沈殿の後、沈殿として得られるオリゴヌクレオチド
を 50 μl のＴＥ緩衝液に溶解し、この未精製標品を下
記の方法で精製を加えて用いた。
【００４４】〔オリゴヌクレオチドの精製〕合成したオ
リゴヌクレオチドの精製は、変性ポリアクリルアミドゲ
ル上での電気泳動し、分離した複数のバンドより、相当
する核酸塩基配列長を持つバンドの切り出しにより行っ
た。先ず、15 ％ 変性ポリアクリルアミドゲルを作製
し、１×ＴＢＥ緩衝液を泳動緩衝液として 200 Ｖで30
分間予備通電を行った。上記のオリゴヌクレオチド未精
製標品に等量のホルムアミドを加え 90 ℃で 3 分間加
熱した後、前記のゲルにアプライし 250 Ｖで泳動し
た。泳動後、長波長の紫外線照射下でオリゴヌクレオチ
ドを含むバンド部分を検出し、ゲルを切り出した。この
切り出したゲルを透析チュ−ブ（Viskase）に入れ、0.2
×ＴＢＥ緩衝液中で 200 Ｖにて 2 時間通電し、電気
的にゲルからオリゴヌクレオチドを抽出した。逆の方向
に 2 分間通電した後、ＴＥ緩衝液に対して一晩透析を
行った。チュ−ブ内の溶液を回収し、次いで、フェノ−
ル・クロロホルム抽出によって得られた水層より、オリ
ゴヌクレオチドをエタノ−ル沈殿した。得られた沈殿の
精製オリゴヌクレオチドは適当量の滅菌水に溶解し、−
20 ℃で保存した。
リゴヌクレオチドの精製は、変性ポリアクリルアミドゲ
ル上での電気泳動し、分離した複数のバンドより、相当
する核酸塩基配列長を持つバンドの切り出しにより行っ
た。先ず、15 ％ 変性ポリアクリルアミドゲルを作製
し、１×ＴＢＥ緩衝液を泳動緩衝液として 200 Ｖで30
分間予備通電を行った。上記のオリゴヌクレオチド未精
製標品に等量のホルムアミドを加え 90 ℃で 3 分間加
熱した後、前記のゲルにアプライし 250 Ｖで泳動し
た。泳動後、長波長の紫外線照射下でオリゴヌクレオチ
ドを含むバンド部分を検出し、ゲルを切り出した。この
切り出したゲルを透析チュ−ブ（Viskase）に入れ、0.2
×ＴＢＥ緩衝液中で 200 Ｖにて 2 時間通電し、電気
的にゲルからオリゴヌクレオチドを抽出した。逆の方向
に 2 分間通電した後、ＴＥ緩衝液に対して一晩透析を
行った。チュ−ブ内の溶液を回収し、次いで、フェノ−
ル・クロロホルム抽出によって得られた水層より、オリ
ゴヌクレオチドをエタノ−ル沈殿した。得られた沈殿の
精製オリゴヌクレオチドは適当量の滅菌水に溶解し、−
20 ℃で保存した。
【００４５】〔オリゴヌクレオチドプロ−ブの５’末端
標識〕精製オリゴヌクレオチドの放射化標識は、次の手
順により行った。前記の方法で得られる精製オリゴヌク
レオチド 100 μg を含む溶液に、〔γ-32P〕dATP（370
KBp/μl, Amersham 社製）6 μl と 10×Protoruding
End Kinase Buffer 2μl、T4 Polynucleotide Kinase
（共に東洋紡 社製）2 μlを加え、全量を 20μlとし、
軽く混和した。その後、37 ℃で 30 分間以上インキュ
ベ−トした。反応液を 95 ℃で 3 分間加熱し、T4 Poly
nucleotide Kinaseを失活させ、急冷後、以降のハイブ
リダイゼ−ション操作に用いた。この操作により、オリ
ゴヌクレオチドの５’末端に 32P のリン酸化がなさ
れ、プロ−ブの放射化標識ができる。
標識〕精製オリゴヌクレオチドの放射化標識は、次の手
順により行った。前記の方法で得られる精製オリゴヌク
レオチド 100 μg を含む溶液に、〔γ-32P〕dATP（370
KBp/μl, Amersham 社製）6 μl と 10×Protoruding
End Kinase Buffer 2μl、T4 Polynucleotide Kinase
（共に東洋紡 社製）2 μlを加え、全量を 20μlとし、
軽く混和した。その後、37 ℃で 30 分間以上インキュ
ベ−トした。反応液を 95 ℃で 3 分間加熱し、T4 Poly
nucleotide Kinaseを失活させ、急冷後、以降のハイブ
リダイゼ−ション操作に用いた。この操作により、オリ
ゴヌクレオチドの５’末端に 32P のリン酸化がなさ
れ、プロ−ブの放射化標識ができる。
【００４６】〔シカクマメカルスの cDNA ライブラリ−
の作製〕培養 7 日目のシカクマメカルスから、ＳＤＳ
−フェノ−ル法によって全 RNAを抽出し、Oligotex-dT3
0 （宝酒造 社製）カラムを用いて、poly A+を保持する
mRNA に精製した。精製 mRNA を鋳型とした cDNA の合
成は、市販の逆転写キット cDNA Synthesis System Plu
s (Amersham 社製) を用いて、Okayama らの変法（ H.
Okayama and P. Berg , Mol. Cell Biol. 2 , 161 (198
2) を参照）により行った。調製した cDNA への、例え
ば、 EcoR I アダプタ−の連結は、市販のアダプタ−塩
基配列付加キット cDNA Cloning System (Amersham 社
製)を用いた。 EcoR I アダプタ−を連結した cDNA
は、さらに λgt10 ベクタ−ア−ム と連結させ、in vi
tro パッケ−ジングを行い、感染性のλファ−ジ粒子を
形成させた。該感染性のλファ−ジ粒子は、 mRNA を鋳
型として逆転写により調製された cDNA を保持してお
り、cDNA ライブラリ−を構成する。
の作製〕培養 7 日目のシカクマメカルスから、ＳＤＳ
−フェノ−ル法によって全 RNAを抽出し、Oligotex-dT3
0 （宝酒造 社製）カラムを用いて、poly A+を保持する
mRNA に精製した。精製 mRNA を鋳型とした cDNA の合
成は、市販の逆転写キット cDNA Synthesis System Plu
s (Amersham 社製) を用いて、Okayama らの変法（ H.
Okayama and P. Berg , Mol. Cell Biol. 2 , 161 (198
2) を参照）により行った。調製した cDNA への、例え
ば、 EcoR I アダプタ−の連結は、市販のアダプタ−塩
基配列付加キット cDNA Cloning System (Amersham 社
製)を用いた。 EcoR I アダプタ−を連結した cDNA
は、さらに λgt10 ベクタ−ア−ム と連結させ、in vi
tro パッケ−ジングを行い、感染性のλファ−ジ粒子を
形成させた。該感染性のλファ−ジ粒子は、 mRNA を鋳
型として逆転写により調製された cDNA を保持してお
り、cDNA ライブラリ−を構成する。
【００４７】〔ファ−ジプレ−ティングセルの調製〕フ
ァ−ジプレ−ティングセルに用いる、宿主の大腸菌 NM5
14 株のグリセロ−ルストックを滅菌爪楊枝でかきと
り、0.4 ％ マルト−スを含むＬＢ培地 10 mlに植菌
し、37 ℃で一晩振盪培養を行った。得られた前培養液
の 1 ml を、0.4％ マルト−スを含むＬＢ培地 50 mlに
移し、さらに 3 時間振盪培養を行った。氷上で培養液
を冷却した後、3000 rpm、4 ℃で 10 分間遠心し、集菌
した。得られた菌体を、予め氷冷しておいた 10 mM MgS
O4溶液 15 ml に懸濁し、よく混和した後、4 ℃に保存
した。
ァ−ジプレ−ティングセルに用いる、宿主の大腸菌 NM5
14 株のグリセロ−ルストックを滅菌爪楊枝でかきと
り、0.4 ％ マルト−スを含むＬＢ培地 10 mlに植菌
し、37 ℃で一晩振盪培養を行った。得られた前培養液
の 1 ml を、0.4％ マルト−スを含むＬＢ培地 50 mlに
移し、さらに 3 時間振盪培養を行った。氷上で培養液
を冷却した後、3000 rpm、4 ℃で 10 分間遠心し、集菌
した。得られた菌体を、予め氷冷しておいた 10 mM MgS
O4溶液 15 ml に懸濁し、よく混和した後、4 ℃に保存
した。
【００４８】〔ファ−ジＤＮＡのメンブレンへの転写、
固定化〕調製したプレ−ティングセルに、希釈した感染
性のλファ−ジ粒子を吸着させた後、トップアガロ−ス
を用いてＬＢプレ−ト上に蒔き、37 ℃で 8 時間培養し
た。プラ−クが形成されたＬＢプレ−トにナイロンメン
ブレン（Biodyne, Pall社製）をかぶせ、10 分間静置し
ファ−ジＤＮＡをメンブレン上に転写した。その後、メ
ンブレンを、変性液、中和液、２×ＳＳＣで湿潤させた
３ＭＭ濾紙（Whatman 社製）上にそれぞれ10分間ずつ静
置し、順次移し変えて処理を行った。次いで、１ 時間
ほど乾いた濾紙上で風乾させた後、80 ℃で 2 時間ベ−
キングしファ−ジＤＮＡを固定化した。このメンブレン
は、デシケ−タ−中で保存するか、或はすぐにプレハイ
ブリダイゼ−ション処理に供した。なお、前記するプラ
−クのレプリカに加え、別にナイロンメンブレン上への
レプリカ １枚を調製した。この２枚目のレプリカで
は、転写時間は１枚目よりも長くし 15 分間とした。以
降の固定化は同じ処理を施した。
固定化〕調製したプレ−ティングセルに、希釈した感染
性のλファ−ジ粒子を吸着させた後、トップアガロ−ス
を用いてＬＢプレ−ト上に蒔き、37 ℃で 8 時間培養し
た。プラ−クが形成されたＬＢプレ−トにナイロンメン
ブレン（Biodyne, Pall社製）をかぶせ、10 分間静置し
ファ−ジＤＮＡをメンブレン上に転写した。その後、メ
ンブレンを、変性液、中和液、２×ＳＳＣで湿潤させた
３ＭＭ濾紙（Whatman 社製）上にそれぞれ10分間ずつ静
置し、順次移し変えて処理を行った。次いで、１ 時間
ほど乾いた濾紙上で風乾させた後、80 ℃で 2 時間ベ−
キングしファ−ジＤＮＡを固定化した。このメンブレン
は、デシケ−タ−中で保存するか、或はすぐにプレハイ
ブリダイゼ−ション処理に供した。なお、前記するプラ
−クのレプリカに加え、別にナイロンメンブレン上への
レプリカ １枚を調製した。この２枚目のレプリカで
は、転写時間は１枚目よりも長くし 15 分間とした。以
降の固定化は同じ処理を施した。
【００４９】〔ハイブリダイゼ−ション及び洗浄〕プレ
ハイブリダイゼ−ションを 65 ℃で 2 時間以上施した
メンブレンレプリカを、ハイブリダイゼ−ション溶液 4
0 ml と上記の標識プロ−ブを入れたタッパ−容器に浸
して、 44 ℃で 16 時間以上インキュベ−トした。イン
キュベ−ト後、ハイブリダイゼ−ションしなかった標識
プロ−ブを除くため、最初は 45 ℃の 6×SSC - 0.1 ％
SDS で数回洗浄した。標識プロ−ブの除去された程度
をサ−ベイメ−タ−でカウントの減少を確認しながら、
引き続き温度を徐々に上げ、洗浄を繰り返した。
ハイブリダイゼ−ションを 65 ℃で 2 時間以上施した
メンブレンレプリカを、ハイブリダイゼ−ション溶液 4
0 ml と上記の標識プロ−ブを入れたタッパ−容器に浸
して、 44 ℃で 16 時間以上インキュベ−トした。イン
キュベ−ト後、ハイブリダイゼ−ションしなかった標識
プロ−ブを除くため、最初は 45 ℃の 6×SSC - 0.1 ％
SDS で数回洗浄した。標識プロ−ブの除去された程度
をサ−ベイメ−タ−でカウントの減少を確認しながら、
引き続き温度を徐々に上げ、洗浄を繰り返した。
【００５０】〔陽性プラ−クの検出及び回収〕ラップを
貼った台紙上に洗浄したメンブレンを並べ、さらに上か
らラップで覆い、Ｘ線フィルム（富士写真フィルム工業
社製）と重ねて、露光カセットに入れた。 -80 ℃で数
日間、オ−トラジオグラフィを行った後、放射線に感光
したＸ線フィルムを現像して、標識プロ−ブとハイブリ
ダイゼ−ションしていた陽性スポットを検出した。この
オ−トラジオグラフィとマスタ−プレ−ト（プラ−クが
形成されたＬＢプレ−ト）を重ね合わせ、陽性プラ−ク
を確認した。陽性プラ−クそれぞれを、滅菌したチップ
で培地ごとくり抜き、個々をＳＭ緩衝液に懸濁し、クロ
ロホルムを数滴加え、4 ℃で保存した。
貼った台紙上に洗浄したメンブレンを並べ、さらに上か
らラップで覆い、Ｘ線フィルム（富士写真フィルム工業
社製）と重ねて、露光カセットに入れた。 -80 ℃で数
日間、オ−トラジオグラフィを行った後、放射線に感光
したＸ線フィルムを現像して、標識プロ−ブとハイブリ
ダイゼ−ションしていた陽性スポットを検出した。この
オ−トラジオグラフィとマスタ−プレ−ト（プラ−クが
形成されたＬＢプレ−ト）を重ね合わせ、陽性プラ−ク
を確認した。陽性プラ−クそれぞれを、滅菌したチップ
で培地ごとくり抜き、個々をＳＭ緩衝液に懸濁し、クロ
ロホルムを数滴加え、4 ℃で保存した。
【００５１】ここに回収された、スクリ−ニングで陽性
と判断されたファ−ジは、何れも、図３に示すプロ−ブ
１及び２の核酸塩基配列と相補的な配列を有している。
従って、選別されたファ−ジのＤＮＡには、シカクマメ
の酸性キチナ−ゼをコ−ドするｃＤＮＡ、少なくとも、
シカクマメ酸性キチナ−ゼのｍＲＮＡにおける翻訳域の
大部分に相補的な配列がインサ−トＤＮＡとして含むこ
とが判る。
と判断されたファ−ジは、何れも、図３に示すプロ−ブ
１及び２の核酸塩基配列と相補的な配列を有している。
従って、選別されたファ−ジのＤＮＡには、シカクマメ
の酸性キチナ−ゼをコ−ドするｃＤＮＡ、少なくとも、
シカクマメ酸性キチナ−ゼのｍＲＮＡにおける翻訳域の
大部分に相補的な配列がインサ−トＤＮＡとして含むこ
とが判る。
【００５２】〔ファ−ジＤＮＡの調整〕前記のプラ−ク
ハイブリダイゼ−ション法スクリ−ニングにより選別さ
れた陽性ファ−ジを、前記のプレ−ティングセル（大腸
菌 NM514 株）に吸着させ、5 mM の CaCl2 を含むＬＢ
培地中で振盪培養した。宿主の溶菌が起こり、培養液が
透明になったところでクロロホルムを数滴加え、さらに
5 分間振盪した。3000rpm で 10 分 間遠心し、上清に
数滴のクロロホルムを加え、ファ−ジライセ−トを得
た。このライセ−トに、20 ％ の PEG と 2 M の NaCl
を含むＳＭ緩衝液を等量加え混和した後、氷中で１時間
置いた。3000 rpm、20 分間の遠心でファ−ジ粒子を集
め、上清を除いた後、沈殿をＳＭ緩衝液に懸濁した。こ
れに DNaseI、RNase A（共に Sigma 社製）を加え、混
入する宿主大腸菌に由来する DNA、RNA を分解した。、
クロロホルム抽出により DNase I、RNase Aを失活除去
した後、ファ−ジ粒子を含む水層を回収した。Proteina
se K（Merk 社製）によってファ−ジ粒子のコ−ト蛋白
質を壊し、フェノ−ル抽出によって蛋白質を除去した
後、水層からイソプロパノ−ル沈殿を行い、沈殿を適当
量のＴＥ緩衝液に溶解し、ファ−ジＤＮＡ液とした。
ハイブリダイゼ−ション法スクリ−ニングにより選別さ
れた陽性ファ−ジを、前記のプレ−ティングセル（大腸
菌 NM514 株）に吸着させ、5 mM の CaCl2 を含むＬＢ
培地中で振盪培養した。宿主の溶菌が起こり、培養液が
透明になったところでクロロホルムを数滴加え、さらに
5 分間振盪した。3000rpm で 10 分 間遠心し、上清に
数滴のクロロホルムを加え、ファ−ジライセ−トを得
た。このライセ−トに、20 ％ の PEG と 2 M の NaCl
を含むＳＭ緩衝液を等量加え混和した後、氷中で１時間
置いた。3000 rpm、20 分間の遠心でファ−ジ粒子を集
め、上清を除いた後、沈殿をＳＭ緩衝液に懸濁した。こ
れに DNaseI、RNase A（共に Sigma 社製）を加え、混
入する宿主大腸菌に由来する DNA、RNA を分解した。、
クロロホルム抽出により DNase I、RNase Aを失活除去
した後、ファ−ジ粒子を含む水層を回収した。Proteina
se K（Merk 社製）によってファ−ジ粒子のコ−ト蛋白
質を壊し、フェノ−ル抽出によって蛋白質を除去した
後、水層からイソプロパノ−ル沈殿を行い、沈殿を適当
量のＴＥ緩衝液に溶解し、ファ−ジＤＮＡ液とした。
【００５３】〔インサ−トＤＮＡの確認〕得られたファ
−ジＤＮＡ液の適当量を、制限酵素 EcoR I、BamH I、K
pn I （東洋紡 社製、又は宝酒造 社製）でそれぞれ消
化し、それぞれＤＮＡ断片液を得た。これらＤＮＡ断片
を、1×TAE 緩衝液を泳動緩衝液として 1.0 ％ アガロ
−スゲルで電気泳動を行った。1 μg/ml の臭化エチジ
ウムを含む 1×TAE 緩衝液中にゲルを浸し、紫外線照射
下でファ−ジＤＮＡから前記制限酵素 EcoR I、BamH
I、Kpn I で切断されたインサ−トＤＮＡ由来のＤＮＡ
断片を検出し、分子量の確認を行った。なお、アガロ−
スゲル電気泳動の際、移動度を示す色素マ−カ−とし
て、0.25 ％ BPB と 0.25％ XC を含む 30 ％ グリセロ
−ル溶液を試料に混ぜて（試料サンプルの 1/5 量）ア
プライし、分子量のサイズマ−カ−として、λ/Hind II
I digest（東洋紡 社製）を同時に泳動した。図８の So
uthern blot の結果に示すごとく、制限酵素 EcoR I、B
amH I、Kpn I で消化した際、それぞれ単一のインサ−
トＤＮＡ由来のＤＮＡ断片が存在することを確認するこ
とができる。
−ジＤＮＡ液の適当量を、制限酵素 EcoR I、BamH I、K
pn I （東洋紡 社製、又は宝酒造 社製）でそれぞれ消
化し、それぞれＤＮＡ断片液を得た。これらＤＮＡ断片
を、1×TAE 緩衝液を泳動緩衝液として 1.0 ％ アガロ
−スゲルで電気泳動を行った。1 μg/ml の臭化エチジ
ウムを含む 1×TAE 緩衝液中にゲルを浸し、紫外線照射
下でファ−ジＤＮＡから前記制限酵素 EcoR I、BamH
I、Kpn I で切断されたインサ−トＤＮＡ由来のＤＮＡ
断片を検出し、分子量の確認を行った。なお、アガロ−
スゲル電気泳動の際、移動度を示す色素マ−カ−とし
て、0.25 ％ BPB と 0.25％ XC を含む 30 ％ グリセロ
−ル溶液を試料に混ぜて（試料サンプルの 1/5 量）ア
プライし、分子量のサイズマ−カ−として、λ/Hind II
I digest（東洋紡 社製）を同時に泳動した。図８の So
uthern blot の結果に示すごとく、制限酵素 EcoR I、B
amH I、Kpn I で消化した際、それぞれ単一のインサ−
トＤＮＡ由来のＤＮＡ断片が存在することを確認するこ
とができる。
【００５４】〔インサートＤＮＡ断片の精製〕分子量の
確認されたインサートＤＮＡ断片の精製は、電気泳動し
たアガロースゲルから該当するバンドの切り出しによ
り、単離することで行った。大量のファージＤＮＡを E
coR I、BamH I、Kpn I の何れかの制限酵素で消化し、
制限酵素の失活、サンプルの濃縮のためにエタノール沈
澱を行なった後、 1.0 ％ アガロースゲルを用いて電気
泳動した。泳動後、ゲルを臭化エチジウム溶液で染色
し、蒸留水で洗浄後、長波長の紫外線照射下で目的の分
子量を持つインサートＤＮＡ断片を切り出した。切り出
したゲル片は透過膜付きのチューブ（ウルトラフリーC3
GV, Millipore 社製）に回収し、一旦凍らせた後、滅菌
チップで突いて細かく破砕した。100 μｌのＴＥ緩衝液
にを加え、8000 rpmで 10 分間遠心する操作を数回繰り
返し、ゲルからインサートＤＮＡ断片を分離した。溶出
した液に、1/10 量の 3 M 酢酸ナトリウムと２倍量のエ
タノールを加え、エタノール沈澱を行なった後、適当量
のＴＥ緩衝液に溶解した。
確認されたインサートＤＮＡ断片の精製は、電気泳動し
たアガロースゲルから該当するバンドの切り出しによ
り、単離することで行った。大量のファージＤＮＡを E
coR I、BamH I、Kpn I の何れかの制限酵素で消化し、
制限酵素の失活、サンプルの濃縮のためにエタノール沈
澱を行なった後、 1.0 ％ アガロースゲルを用いて電気
泳動した。泳動後、ゲルを臭化エチジウム溶液で染色
し、蒸留水で洗浄後、長波長の紫外線照射下で目的の分
子量を持つインサートＤＮＡ断片を切り出した。切り出
したゲル片は透過膜付きのチューブ（ウルトラフリーC3
GV, Millipore 社製）に回収し、一旦凍らせた後、滅菌
チップで突いて細かく破砕した。100 μｌのＴＥ緩衝液
にを加え、8000 rpmで 10 分間遠心する操作を数回繰り
返し、ゲルからインサートＤＮＡ断片を分離した。溶出
した液に、1/10 量の 3 M 酢酸ナトリウムと２倍量のエ
タノールを加え、エタノール沈澱を行なった後、適当量
のＴＥ緩衝液に溶解した。
【００５５】なお、該酸性キチナ−ゼの分子量は約 29,
000 であるので、この成熟酵素のペプチト鎖は、 290
アミノ酸程度からなると推定でき、以降のサブクロ−ニ
ングには、核酸塩基配列が 1 Kbp 前後であると推断し
た。得られたインサートＤＮＡ断片の内、核酸塩基配列
が 1 Kbp 前後であるものを選択し、そのサブクロ−ニ
ングを下記の方法で行った。
000 であるので、この成熟酵素のペプチト鎖は、 290
アミノ酸程度からなると推定でき、以降のサブクロ−ニ
ングには、核酸塩基配列が 1 Kbp 前後であると推断し
た。得られたインサートＤＮＡ断片の内、核酸塩基配列
が 1 Kbp 前後であるものを選択し、そのサブクロ−ニ
ングを下記の方法で行った。
【００５６】〔インサートＤＮＡ断片とプラスミドベク
ターとのライゲーション〕上で精製したインサートＤＮ
Ａ断片をサブクロ−ニングするべく、プラスミドベクタ
ーのクロ−ニングサイトに Ligation Kit Ver.1.0 （宝
酒造 社製）を使用し、挿入した。インサートＤＮＡ断
片と、該断片の消化に用いた制限酵素でプラスミドベク
ター pBluescript II SK(＋)を消化し粘着末端を突出さ
せた断片とを、モル比 １：１ となる量に調整混合し、
キットに付属の緩衝液、リガ−ゼ酵素を加え 16 ℃で 1
6 時間反応を行なった。
ターとのライゲーション〕上で精製したインサートＤＮ
Ａ断片をサブクロ−ニングするべく、プラスミドベクタ
ーのクロ−ニングサイトに Ligation Kit Ver.1.0 （宝
酒造 社製）を使用し、挿入した。インサートＤＮＡ断
片と、該断片の消化に用いた制限酵素でプラスミドベク
ター pBluescript II SK(＋)を消化し粘着末端を突出さ
せた断片とを、モル比 １：１ となる量に調整混合し、
キットに付属の緩衝液、リガ−ゼ酵素を加え 16 ℃で 1
6 時間反応を行なった。
【００５７】なお、インサートＤＮＡ断片とベクター断
片との量比は、アガロース電気泳動によって求めた個々
の分子量を比較し、算定した。インサートＤＮＡ断片と
ベクター断片が連結されたサブクロ−ニングプラスミド
ベクターは、宿主の大腸菌に下記の手順で導入した。
片との量比は、アガロース電気泳動によって求めた個々
の分子量を比較し、算定した。インサートＤＮＡ断片と
ベクター断片が連結されたサブクロ−ニングプラスミド
ベクターは、宿主の大腸菌に下記の手順で導入した。
【００５８】〔コンピテントセルの調製〕M9 最少培地
で選択した大腸菌 JM109 株のシングルコロニー数個を
採取し、SOB 培地 50 ml に植菌し、18 ℃で約 50 時間
振盪培養した。培養液を氷上で 10分間冷却し、3000 rp
m、4 ℃で 10 分間遠心後、集菌した。この菌体を予め
氷冷しておいた Transformation buffer 17 ml （1/3
量）にゆっくりと懸濁し、10分間氷上に置いた。この懸
濁液を再度遠心し、集菌した菌体を、Transformationbu
ffer 4mlに懸濁した後、DMSO 280 μl （7 ％ 量）を加
え混和した。菌懸濁液を、氷上に 10 分間置き、200 μ
l ずつ分注し、それぞれ液体窒素温度で保存した。
で選択した大腸菌 JM109 株のシングルコロニー数個を
採取し、SOB 培地 50 ml に植菌し、18 ℃で約 50 時間
振盪培養した。培養液を氷上で 10分間冷却し、3000 rp
m、4 ℃で 10 分間遠心後、集菌した。この菌体を予め
氷冷しておいた Transformation buffer 17 ml （1/3
量）にゆっくりと懸濁し、10分間氷上に置いた。この懸
濁液を再度遠心し、集菌した菌体を、Transformationbu
ffer 4mlに懸濁した後、DMSO 280 μl （7 ％ 量）を加
え混和した。菌懸濁液を、氷上に 10 分間置き、200 μ
l ずつ分注し、それぞれ液体窒素温度で保存した。
【００５９】〔形質転換〕液体窒素温度で保存した菌懸
濁液を、氷上でゆっくりと溶かした後、このコンピテン
トセル懸濁液 100 μl に、上記のライゲーション反応
液（20 μl 以下）を加え、30 分間氷冷した。42 ℃で
40 秒間ヒートショックを与え、氷上に5分間放置した。
その後、SOC 培地 500 μl を加え、37 ℃で１ 時間培
養した。この培養液の適当量を、アンピシリン、カナマ
イシン、X−gal、IPTG (イソプロピル-β-D-チオガラク
シド) を添加したＬＢプレート上に広げ、37 ℃で一晩
培養した。該ＬＢプレート上、生育した白色コロニー形
成して生育する菌が、その保持するプラスミドに目的の
インサートＤＮＡ断片が挿入されているかを、以下の操
作で確認した。
濁液を、氷上でゆっくりと溶かした後、このコンピテン
トセル懸濁液 100 μl に、上記のライゲーション反応
液（20 μl 以下）を加え、30 分間氷冷した。42 ℃で
40 秒間ヒートショックを与え、氷上に5分間放置した。
その後、SOC 培地 500 μl を加え、37 ℃で１ 時間培
養した。この培養液の適当量を、アンピシリン、カナマ
イシン、X−gal、IPTG (イソプロピル-β-D-チオガラク
シド) を添加したＬＢプレート上に広げ、37 ℃で一晩
培養した。該ＬＢプレート上、生育した白色コロニー形
成して生育する菌が、その保持するプラスミドに目的の
インサートＤＮＡ断片が挿入されているかを、以下の操
作で確認した。
【００６０】〔プラスミドＤＮＡの調製〕プラスミドに
インサートＤＮＡ断片が挿入されているか否かは、ボイ
ル法によりの確認した。上記の形質転換操作で得られた
白色コロニーの菌を、再びアンピシリンを添加したＬＢ
培地に植菌し、一晩振盪培養を行った。培養液 1.5 ml
をエッペンチューブに取り、1000 rpm、4 ℃で１分間遠
心して菌体を回収した。この回収した菌体に、菌体を破
壊する目的で、 STET 溶液 150 μl と10 mg/ml のリゾ
チーム（生化学工業 社製）溶液 15 μl を加え、ボル
テックスで懸濁した後、しばらく室温に放置した。次い
で、沸騰湯浴中で 40 秒間煮沸し、1500 rpmで 15 分間
遠心した後、生じたガム状の沈殿を爪楊枝で除去した。
残った上清に 60 mg/ml NaOH 水溶液 100 μl を加え、
60 ℃で 20 分間アルカリ条件下に置き、フェノール抽
出、クロロホルム抽出で蛋白質を除去した。その後、こ
の水溶液からエタノール沈殿を行い、プラスミドを回収
した。得られた沈殿はＴＥ緩衝液に溶解し、適当量を取
り分け、当該インサートＤＮＡ断片の調製に用いた制限
酵素で消化した後、ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳
動で分離した。なお、目的の長さのインサートＤＮＡ断
片を確認できたコロニーについては、培養液に終濃度が
30 ％となるようにグリセロールを加え、グリセロール
ストックに調製し、-30 ℃ 又は -80 ℃にて保存した。
インサートＤＮＡ断片が挿入されているか否かは、ボイ
ル法によりの確認した。上記の形質転換操作で得られた
白色コロニーの菌を、再びアンピシリンを添加したＬＢ
培地に植菌し、一晩振盪培養を行った。培養液 1.5 ml
をエッペンチューブに取り、1000 rpm、4 ℃で１分間遠
心して菌体を回収した。この回収した菌体に、菌体を破
壊する目的で、 STET 溶液 150 μl と10 mg/ml のリゾ
チーム（生化学工業 社製）溶液 15 μl を加え、ボル
テックスで懸濁した後、しばらく室温に放置した。次い
で、沸騰湯浴中で 40 秒間煮沸し、1500 rpmで 15 分間
遠心した後、生じたガム状の沈殿を爪楊枝で除去した。
残った上清に 60 mg/ml NaOH 水溶液 100 μl を加え、
60 ℃で 20 分間アルカリ条件下に置き、フェノール抽
出、クロロホルム抽出で蛋白質を除去した。その後、こ
の水溶液からエタノール沈殿を行い、プラスミドを回収
した。得られた沈殿はＴＥ緩衝液に溶解し、適当量を取
り分け、当該インサートＤＮＡ断片の調製に用いた制限
酵素で消化した後、ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳
動で分離した。なお、目的の長さのインサートＤＮＡ断
片を確認できたコロニーについては、培養液に終濃度が
30 ％となるようにグリセロールを加え、グリセロール
ストックに調製し、-30 ℃ 又は -80 ℃にて保存した。
【００６１】〔一本鎖ＤＮＡの調製〕インサートＤＮＡ
断片をサブクロ−ニングした形質転換株のグルセロール
ストックを滅菌爪楊枝でかき取り、アンピシリンを添加
したＬＢ培地で２時間ほど培養した。その後、ヘルパー
ファージ KO7 を感染させ、さらに３時間培養し、アン
ピシリンとカナマイシンを添加した２×ＹＴ培地を加
え、37 ℃で 16 時間、激しく振盪培養を行った。この
培養液を遠心して、宿主菌体の混入のないように上清を
回収し、1/5 量の2.5 M NaOHを含む 20 ％ ＰＥＧ 溶液
を加えよく混和した後、30 分間室温で放置した。次い
で、遠心して上清を完全に取り除き、ファージを含む沈
殿をＴＥ緩衝液に懸濁した。フェノール抽出、クロロホ
ルム抽出によりコート蛋白質を除去した後、エタノール
沈殿を行い、一本鎖ＤＮＡを回収した。回収された一本
鎖ＤＮＡも沈殿を適当量の滅菌水に溶解し、アガロース
ゲル電気泳動でその分子量を測定確認した後、塩基配列
決定に際し、鋳型 DNA として用いた。
断片をサブクロ−ニングした形質転換株のグルセロール
ストックを滅菌爪楊枝でかき取り、アンピシリンを添加
したＬＢ培地で２時間ほど培養した。その後、ヘルパー
ファージ KO7 を感染させ、さらに３時間培養し、アン
ピシリンとカナマイシンを添加した２×ＹＴ培地を加
え、37 ℃で 16 時間、激しく振盪培養を行った。この
培養液を遠心して、宿主菌体の混入のないように上清を
回収し、1/5 量の2.5 M NaOHを含む 20 ％ ＰＥＧ 溶液
を加えよく混和した後、30 分間室温で放置した。次い
で、遠心して上清を完全に取り除き、ファージを含む沈
殿をＴＥ緩衝液に懸濁した。フェノール抽出、クロロホ
ルム抽出によりコート蛋白質を除去した後、エタノール
沈殿を行い、一本鎖ＤＮＡを回収した。回収された一本
鎖ＤＮＡも沈殿を適当量の滅菌水に溶解し、アガロース
ゲル電気泳動でその分子量を測定確認した後、塩基配列
決定に際し、鋳型 DNA として用いた。
【００６２】〔塩基配列の決定〕サブクロ−ニングによ
り得られた、上記の一本鎖ＤＮＡの塩基配列決定は、ダ
イデオキシ法を原理とした Sequanase Ver.2.0 Sequenc
ing Kit (USB 社製)を用いて行った。一本鎖ＤＮＡとシ
ーケン用プライマーを混ぜ、 65 ℃で２ 分間加熱後 30
分以上放置しアニールさせた。これに Labeling mix
と[α−32P]dCTP(370 KBq/μl, Amersham 社製)を加
え、Sequenase による伸長反応を３分間ほど行った後、
４種のダイデオキシヌクレオチドに分注して伸長反応を
停止させた。加熱変性後、６％変性ポリアクリルアミド
にアプライした。泳動が終了したら、ゲルドライをした
後、室温で一晩オートラジオグラフィを行いシーケンス
ラダーを得た。インサートＤＮＡ断片の分子量の異な
る、複数のサブクロ−ニングについて、それぞれ得られ
た一本鎖ＤＮＡを用い、その塩基配列を決定し、相互に
比較した。
り得られた、上記の一本鎖ＤＮＡの塩基配列決定は、ダ
イデオキシ法を原理とした Sequanase Ver.2.0 Sequenc
ing Kit (USB 社製)を用いて行った。一本鎖ＤＮＡとシ
ーケン用プライマーを混ぜ、 65 ℃で２ 分間加熱後 30
分以上放置しアニールさせた。これに Labeling mix
と[α−32P]dCTP(370 KBq/μl, Amersham 社製)を加
え、Sequenase による伸長反応を３分間ほど行った後、
４種のダイデオキシヌクレオチドに分注して伸長反応を
停止させた。加熱変性後、６％変性ポリアクリルアミド
にアプライした。泳動が終了したら、ゲルドライをした
後、室温で一晩オートラジオグラフィを行いシーケンス
ラダーを得た。インサートＤＮＡ断片の分子量の異な
る、複数のサブクロ−ニングについて、それぞれ得られ
た一本鎖ＤＮＡを用い、その塩基配列を決定し、相互に
比較した。
【００６３】即ち、上述した一連の過程を経て、シカク
マメのカルスより分離した mRNA から cDNA を調製し
て、該 cDNA をλファ−ジ λgt10 のベクタ−ア−ムに
連結し、λgt10 ｃＤＮＡライブラリーを作製し、総数
225,000 のプラークを得た。このｃＤＮＡライブラリー
より、シカクマメ由来のクラスIIIキチナーゼ蛋白質の
Ｎ末端のアミノ酸配列をもとに作製した二種のオリゴヌ
クレオチドプローブ、プローブ１及び２を用い、プラー
クハイブリダイゼーションにより一次スクリーニングを
行ったところ、 50 個のクローンが陽性と判定された。
この 50 個のクローンに付いて、更に二次、三次スクリ
ーニングを行い、９個の陽性クローンを選別した。この
９個のクローンは、すべて異なる分子量のインサートｃ
ＤＮＡを保持していた。
マメのカルスより分離した mRNA から cDNA を調製し
て、該 cDNA をλファ−ジ λgt10 のベクタ−ア−ムに
連結し、λgt10 ｃＤＮＡライブラリーを作製し、総数
225,000 のプラークを得た。このｃＤＮＡライブラリー
より、シカクマメ由来のクラスIIIキチナーゼ蛋白質の
Ｎ末端のアミノ酸配列をもとに作製した二種のオリゴヌ
クレオチドプローブ、プローブ１及び２を用い、プラー
クハイブリダイゼーションにより一次スクリーニングを
行ったところ、 50 個のクローンが陽性と判定された。
この 50 個のクローンに付いて、更に二次、三次スクリ
ーニングを行い、９個の陽性クローンを選別した。この
９個のクローンは、すべて異なる分子量のインサートｃ
ＤＮＡを保持していた。
【００６４】一旦、この９種のｃＤＮＡをプラスミドに
サブクローニングし、一本鎖ＤＮＡを調製し、その塩基
配列を決定したところ、２種のサブクローンが、塩基配
列に一致が見られ、且つオリゴヌクレオチドプローブの
プローブ１及び２と類似の塩基配列が存在していた。こ
の２種のサブクローンのうち、分子量のより大きいサブ
クローンについて決定した全核酸塩基配列は、図４に示
すものであった。即ち、核酸塩基配列（II）に示すもの
であり、オープンリーディングフレーム（ORF）中に、
図３に示すシカクマメ由来のクラスIII酸性キチナーゼ
成熟酵素のＮ末端のアミノ酸配列と一致する部分が存在
していた。
サブクローニングし、一本鎖ＤＮＡを調製し、その塩基
配列を決定したところ、２種のサブクローンが、塩基配
列に一致が見られ、且つオリゴヌクレオチドプローブの
プローブ１及び２と類似の塩基配列が存在していた。こ
の２種のサブクローンのうち、分子量のより大きいサブ
クローンについて決定した全核酸塩基配列は、図４に示
すものであった。即ち、核酸塩基配列（II）に示すもの
であり、オープンリーディングフレーム（ORF）中に、
図３に示すシカクマメ由来のクラスIII酸性キチナーゼ
成熟酵素のＮ末端のアミノ酸配列と一致する部分が存在
していた。
【００６５】〔クラスIIIキチナーゼｃＤＮＡの塩基配
列及びキチナーゼ蛋白質の一次構造〕クローニングされ
た核酸塩基配列（II）に示すｃＤＮＡは、1065 塩基対
のヌクレオチドで構成されており、その３’末端には４
５塩基対の poly A 配列が存在していた。この poly A
配列から５３塩基上流には polyadenilation signal(AA
TAA) が認められた。
列及びキチナーゼ蛋白質の一次構造〕クローニングされ
た核酸塩基配列（II）に示すｃＤＮＡは、1065 塩基対
のヌクレオチドで構成されており、その３’末端には４
５塩基対の poly A 配列が存在していた。この poly A
配列から５３塩基上流には polyadenilation signal(AA
TAA) が認められた。
【００６６】５’末端から１７塩基下流にある ATG を
開始コドンとする 897 塩基のオープンリーディングフ
レーム（ORF）が見い出され、この ORF によりコ−ドさ
れるアミノ酸配列から予想されるペプチド鎖の分子量は
31,613 であり、SDS-PAGE 法で評価された成熟酵素の
分子量 約 29,000 より、2,500 程度大きな値であっ
た。成熟酵素のＮ末端アミノ酸配列と一致するアミノ酸
配列が、 ORF の開始コドン Met から２５アミノ酸残基
下流に存在しており、この２５アミノ酸残基からなる部
分ペプチド鎖は、成熟酵素として分泌される際に、切断
を受けるものと考えられる。一般にシグナル配列と呼ば
れる部分であり、このシグナル配列を含め、一旦、前駆
体ペプチド鎖として翻訳されると判断した。該シグナル
配列を除いた、２７３アミノ酸残基部分の分子量は 28,
860 であり、先の SDS-PAGE 法で評価された結果とよく
一致している。また、 Kyte と Doolitle の方法（ J.
Kyteand R. F. Doolittle ; J. Mol. Biol. 157, 105
(1982) を参照）に従って、ハイドロパシー分析を行っ
た結果（図１３を参照）、分泌のためのシグナル配列と
予想される２５アミノ酸残基の部分ペプチド鎖は、非常
に疎水性に富んでいることが分かり、従来報告されてい
るシグナル配列の特徴を有している。
開始コドンとする 897 塩基のオープンリーディングフ
レーム（ORF）が見い出され、この ORF によりコ−ドさ
れるアミノ酸配列から予想されるペプチド鎖の分子量は
31,613 であり、SDS-PAGE 法で評価された成熟酵素の
分子量 約 29,000 より、2,500 程度大きな値であっ
た。成熟酵素のＮ末端アミノ酸配列と一致するアミノ酸
配列が、 ORF の開始コドン Met から２５アミノ酸残基
下流に存在しており、この２５アミノ酸残基からなる部
分ペプチド鎖は、成熟酵素として分泌される際に、切断
を受けるものと考えられる。一般にシグナル配列と呼ば
れる部分であり、このシグナル配列を含め、一旦、前駆
体ペプチド鎖として翻訳されると判断した。該シグナル
配列を除いた、２７３アミノ酸残基部分の分子量は 28,
860 であり、先の SDS-PAGE 法で評価された結果とよく
一致している。また、 Kyte と Doolitle の方法（ J.
Kyteand R. F. Doolittle ; J. Mol. Biol. 157, 105
(1982) を参照）に従って、ハイドロパシー分析を行っ
た結果（図１３を参照）、分泌のためのシグナル配列と
予想される２５アミノ酸残基の部分ペプチド鎖は、非常
に疎水性に富んでいることが分かり、従来報告されてい
るシグナル配列の特徴を有している。
【００６７】核酸塩基配列（II）に示すｃＤＮＡが、シ
カクマメ由来のクラスIII酸性キチナーゼの前駆体ペプ
チド鎖をコ−ドするものであることは、該酸性キチナー
ゼの分泌と時を同じくして増量するｍＲＮＡを、プロー
ブ１及び２を用いて Northern blot 法で分析したとこ
ろ、例えば、図９に示すごとく、約 1.2 kb に見出され
ることからも確認される。同じく、該酸性キチナーゼの
生産における組織特異性と沿うごとく、図６に示すよう
に、 Northern blot 法で分析される約 1.2 kbのｍＲＮ
Ａへの転写も組織特異性を有している。該ｃＤＮＡにコ
−ドされている前駆体ペプチド鎖のアミノ酸配列（II）
と、既に報告されている数種の植物由来のクラスIII酸
性キチナーゼのアミノ酸配列とを比較すると、図１０に
示すように相同性を有することが示された。特に、ヒヨ
コマメ、アズキ、キュウリ、タバコのクラスIII酸性キ
チナーゼとの間には、それぞれ 75.7 ％、69.7 ％、63.
6％、62.2 ％という高い相同性が認められた。図１１に
示すように、これらのクラスIII酸性キチナーゼの等電
点は何れも、凡そ 4.1 〜4.4 の範囲であるが、シカク
マメ由来のクラスIII酸性キチナーゼの成熟蛋白質も pI
=4.00 と僅かな差違があるものの、酸性キチナーゼに共
通する特徴を有している。更には、シカクマメ由来のク
ラスIII酸性キチナーゼは、糸状菌の一種である Rhizop
us oligospous のキチナーゼとも若干の相同性（35.9
％）が認められた。特に、これらキチナーゼの活性ドメ
インとされている領域に限定すれば、図１２に例示する
ように、酵母や細菌のキチナーゼとの間でも相同性が認
められた。
カクマメ由来のクラスIII酸性キチナーゼの前駆体ペプ
チド鎖をコ−ドするものであることは、該酸性キチナー
ゼの分泌と時を同じくして増量するｍＲＮＡを、プロー
ブ１及び２を用いて Northern blot 法で分析したとこ
ろ、例えば、図９に示すごとく、約 1.2 kb に見出され
ることからも確認される。同じく、該酸性キチナーゼの
生産における組織特異性と沿うごとく、図６に示すよう
に、 Northern blot 法で分析される約 1.2 kbのｍＲＮ
Ａへの転写も組織特異性を有している。該ｃＤＮＡにコ
−ドされている前駆体ペプチド鎖のアミノ酸配列（II）
と、既に報告されている数種の植物由来のクラスIII酸
性キチナーゼのアミノ酸配列とを比較すると、図１０に
示すように相同性を有することが示された。特に、ヒヨ
コマメ、アズキ、キュウリ、タバコのクラスIII酸性キ
チナーゼとの間には、それぞれ 75.7 ％、69.7 ％、63.
6％、62.2 ％という高い相同性が認められた。図１１に
示すように、これらのクラスIII酸性キチナーゼの等電
点は何れも、凡そ 4.1 〜4.4 の範囲であるが、シカク
マメ由来のクラスIII酸性キチナーゼの成熟蛋白質も pI
=4.00 と僅かな差違があるものの、酸性キチナーゼに共
通する特徴を有している。更には、シカクマメ由来のク
ラスIII酸性キチナーゼは、糸状菌の一種である Rhizop
us oligospous のキチナーゼとも若干の相同性（35.9
％）が認められた。特に、これらキチナーゼの活性ドメ
インとされている領域に限定すれば、図１２に例示する
ように、酵母や細菌のキチナーゼとの間でも相同性が認
められた。
【００６８】
【発明の効果】本発明のシカクマメ由来キチナ−ゼをコ
−ドするＤＮＡ、或いはシカクマメ由来キチナ−ゼの前
駆体ペプチド鎖をコ−ドするＤＮＡは、シカクマメ自体
の抗菌機構（植物免疫）に重要なクラスIIIの酸性キチ
ナ−ゼを人為的に組換え技術を利用して生産する際、利
用できる。特には、それ自体が固有のキチナ−ゼを産出
する宿主細胞、或いは子嚢菌や担子菌類に属する糸状菌
細胞壁溶解菌、例えば、Bacillus （バチルス）属、Str
eptomyces （ストレプトマイセス）属などに属するキチ
ナ−ゼを産出する真菌を、係るＤＮＡを挿入した発現プ
ラスミドベクタ−を用いて形質転換させ、これら宿主細
胞を培養してシカクマメ由来キチナ−ゼを産出する際に
も利用できる。即ち、本発明のシカクマメ由来キチナ−
ゼをコ−ドするＤＮＡ、或いはシカクマメ由来キチナ−
ゼの前駆体ペプチド鎖をコ−ドするＤＮＡは、スプライ
シングにより除去されるイントロン部分を含まず、又そ
のコ−ドするアミノ酸配列中には、シグナルペプチドと
の開裂部分を除き、細胞内に存在する種々のエンドペプ
チダ−ゼで容易に消化される開裂部をそのコ−ドするア
ミノ酸配列中に有していないので種々の宿主細胞におい
て、遺伝子組換え技術を利用して生産させることができ
る利点を持つ。
−ドするＤＮＡ、或いはシカクマメ由来キチナ−ゼの前
駆体ペプチド鎖をコ−ドするＤＮＡは、シカクマメ自体
の抗菌機構（植物免疫）に重要なクラスIIIの酸性キチ
ナ−ゼを人為的に組換え技術を利用して生産する際、利
用できる。特には、それ自体が固有のキチナ−ゼを産出
する宿主細胞、或いは子嚢菌や担子菌類に属する糸状菌
細胞壁溶解菌、例えば、Bacillus （バチルス）属、Str
eptomyces （ストレプトマイセス）属などに属するキチ
ナ−ゼを産出する真菌を、係るＤＮＡを挿入した発現プ
ラスミドベクタ−を用いて形質転換させ、これら宿主細
胞を培養してシカクマメ由来キチナ−ゼを産出する際に
も利用できる。即ち、本発明のシカクマメ由来キチナ−
ゼをコ−ドするＤＮＡ、或いはシカクマメ由来キチナ−
ゼの前駆体ペプチド鎖をコ−ドするＤＮＡは、スプライ
シングにより除去されるイントロン部分を含まず、又そ
のコ−ドするアミノ酸配列中には、シグナルペプチドと
の開裂部分を除き、細胞内に存在する種々のエンドペプ
チダ−ゼで容易に消化される開裂部をそのコ−ドするア
ミノ酸配列中に有していないので種々の宿主細胞におい
て、遺伝子組換え技術を利用して生産させることができ
る利点を持つ。
配列番号：１ 配列の長さ： 273 配列の型：アミノ酸 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：蛋白質 起源 シカクマメ（Prophocarpus tetragonolobus, 沖縄産 TP
T-2） 配列 Ala Gly Ile Ala Val Tyr Trp Gly Gln Asn Gly Gly Glu Gly Ser 1 5 10 15 Leu Ala Asp Thr Cys Asn Thr Gly Asn Tyr Glu Phe Val Asn Ile 20 25 30 Ala Phe Leu Ser Thr Phe Gly Ser Gly Gln Thr Pro Gln Leu Asn 35 40 45 Leu Ala Gly His Cys Asp Pro Ser Ser Asn Gly Cys Thr Gly Phe 50 55 60 Ser Ser Glu Ile Gln Thr Cys Gln Asn Arg Gly Ile Lys Val Leu 65 70 75 Leu Ser Leu Gly Gly Ser Ala Gly Thr Tyr Ser Leu Asn Ser Ala 80 85 90 Asp Asp Ala Thr Gln Leu Ala Asn Tyr Leu Trp Asp Asn Phe Leu 95 100 105 Gly Gly Gln Ser Gly Ser Arg Pro Leu Gly Asp Ala Val Leu Asp 110 115 120 Gly Val Asp Phe Asp Ile Glu Ser Gly Gly Ser Asn His Tyr Asp 125 130 135 Asp Leu Ala Arg Ala Leu Asn Ser Leu Ser Ser Gln Lys Lys Val 140 145 150 Tyr Leu Ser Ala Ala Pro Gln Cys Ile Ile Pro Asp Gln His Leu 155 160 165 Asp Ala Ala Ile Gln Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Val Trp Val Gln 170 175 180 Phe Tyr Asn Asn Pro Ser Cys Gln Tyr Ser Asn Gly Asp Thr Thr 185 190 195 Asn Leu Ile Asn Ser Trp Asn Gln Trp Ile Thr Val Pro Ala Ser 200 205 210 Leu Val Phe Met Gly Leu Pro Ala Ser Asp Ala Ala Ala Pro Ser 215 220 225 Gly Gly Phe Val Ser Thr Asp Val Leu Thr Ser Gln Val Leu Pro 230 235 240 Val Ile Lys Gln Ser Ser Lys Tyr Gly Gly Val Met Leu Trp Asp 245 250 255 Arg Phe Asn Asp Val Gln Thr Gly Tyr Ser Ala Ala Ile Ile Gly 260 265 270 Ser Ile Asn 273 配列番号：２ 配列の長さ： 822 配列の型：核酸 鎖の数：両形態（both） トポロジ−：直鎖状 配列の種類： cDNA to mRNA 起源シカクマメ（Prophocarpus tetragonolobus, 沖縄
産 TPT-2） 配列 GCA GGA ATA GCT GTT TAC TGG GGC CAA AAC GGT GGA GAA GGA TCC 45 Ala Gly Ile Ala Val Tyr Trp Gly Gln Asn Gly Gly Glu Gly Ser 1 5 10 15 TTA GCA GAC ACT TGC AAC ACT GGA AAC TAC GAA TTT GTG AAC ATA Leu Ala Asp Thr Cys Asn Thr Gly Asn Tyr Glu Phe Val Asn Ile 90 20 25 30 GCT TTC TTG TCC ACT TTT GGC AGT GGC CAA ACT CCC CAA CTC AAC 135 Ala Phe Leu Ser Thr Phe Gly Ser Gly Gln Thr Pro Gln Leu Asn 35 40 45 CTT GCT GGT CAT TGT GAC CCC AGC AGC AAT GGC TGC ACT GGC TTC 180 Leu Ala Gly His Cys Asp Pro Ser Ser Asn Gly Cys Thr Gly Phe 50 55 60 AGC AGT GAG ATC CAA ACT TGT CAA AAC AGA GGG ATC AAA GTG TTG 225 Ser Ser Glu Ile Gln Thr Cys Gln Asn Arg Gly Ile Lys Val Leu 65 70 75 CTA TCT CTT GGA GGC AGT GCT GGA ACC TAC TCC CTC AAC TCA GCT 270 Leu Ser Leu Gly Gly Ser Ala Gly Thr Tyr Ser Leu Asn Ser Ala 80 85 90 GAT GAT GCC ACA CAA CTT GCA AAC TAC CTT TGG GAC AAT TTC CTC 315 Asp Asp Ala Thr Gln Leu Ala Asn Tyr Leu Trp Asp Asn Phe Leu 95 100 105 GGA GGC CAA TCT GGA TCA AGA CCA TTA GGT GAT GCT GTC TTA GAT 360 Gly Gly Gln Ser Gly Ser Arg Pro Leu Gly Asp Ala Val Leu Asp 110 115 120 GGG GTT GAC TTT GAC ATT GAA TCT GGT GGA AGT AAC CAT TAT GAT 405 Gly Val Asp Phe Asp Ile Glu Ser Gly Gly Ser Asn His Tyr Asp 125 130 135 GAT CTT GCA AGG GCA CTG AAT AGC TTG AGT TCA CAA AAG AAG GTG 450 Asp Leu Ala Arg Ala Leu Asn Ser Leu Ser Ser Gln Lys Lys Val 140 145 150 TAC TTG TCT GCA GCC CCA CAG TGC ATA ATC CCT GAT CAA CAC TTG 495 Tyr Leu Ser Ala Ala Pro Gln Cys Ile Ile Pro Asp Gln His Leu 155 160 165 GAT GCA GCC ATC CAA ACG GGG CTT TTT GAC TAT GTG TGG GTT CAG 540 Asp Ala Ala Ile Gln Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Val Trp Val Gln 170 175 180 TTC TAC AAC AAC CCT TCA TGC CAA TAC TCC AAT GGA GAC ACA ACC 585 Phe Tyr Asn Asn Pro Ser Cys Gln Tyr Ser Asn Gly Asp Thr Thr 185 190 195 AAT TTG ATC AAT TCA TGG AAC CAG TGG ATC ACA GTG CCA GCC TCC 630 Asn Leu Ile Asn Ser Trp Asn Gln Trp Ile Thr Val Pro Ala Ser 200 205 210 CTA GTC TTC ATG GGG CTT CCT GCA TCC GAT GCT GCT GCT CCA AGT 675 Leu Val Phe Met Gly Leu Pro Ala Ser Asp Ala Ala Ala Pro Ser 215 220 225 GGT GGC TTT GTG TCT ACT GAT GTG TTA ACT TCT CAA GTT CTT CCT 720 Gly Gly Phe Val Ser Thr Asp Val Leu Thr Ser Gln Val Leu Pro 230 235 240 GTC ATA AAA CAG TCT TCA AAG TAT GGT GGA GTC ATG CTC TGG GAC 765 Val Ile Lys Gln Ser Ser Lys Tyr Gly Gly Val Met Leu Trp Asp 245 250 255 AGG TTC AAC GAC GTT CAA ACT GGT TAC AGT GCT GCT ATT ATT GGA 810 Arg Phe Asn Asp Val Gln Thr Gly Tyr Ser Ala Ala Ile Ile Gly 260 265 270 AGT ATT AAT TGA 822 Ser Ile Asn *** 配列番号：３ 配列の長さ： 298 配列の型：アミノ酸 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：蛋白質 起源 シカクマメ（Prophocarpus tetragonolobus, 沖縄産 TP
T-2） 配列の特徴 特徴を表す記号： sig peptide 存在位置： 1..25 配列 Met Glu Ser Leu Lys Lys Ala Ser Leu Val Leu Phe Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Leu Ser Leu Phe Asn His Ser Asn Ala Ala Gly Ile Ala Val 20 25 30 Tyr Trp Gly Gln Asn Gly Gly Glu Gly Ser Leu Ala Asp Thr Cys 35 40 45 Asn Thr Gly Asn Tyr Glu Phe Val Asn Ile Ala Phe Leu Ser Thr 50 55 60 Phe Gly Ser Gly Gln Thr Pro Gln Leu Asn Leu Ala Gly His Cys 65 70 75 Asp Pro Ser Ser Asn Gly Cys Thr Gly Phe Ser Ser Glu Ile Gln 80 85 90 Thr Cys Gln Asn Arg Gly Ile Lys Val Leu Leu Ser Leu Gly Gly 95 100 105 Ser Ala Gly Thr Tyr Ser Leu Asn Ser Ala Asp Asp Ala Thr Gln 110 115 120 Leu Ala Asn Tyr Leu Trp Asp Asn Phe Leu Gly Gly Gln Ser Gly 125 130 135 Ser Arg Pro Leu Gly Asp Ala Val Leu Asp Gly Val Asp Phe Asp 140 145 150 Ile Glu Ser Gly Gly Ser Asn His Tyr Asp Asp Leu Ala Arg Ala 155 160 165 Leu Asn Ser Leu Ser Ser Gln Lys Lys Val Tyr Leu Ser Ala Ala 170 175 180 Pro Gln Cys Ile Ile Pro Asp Gln His Leu Asp Ala Ala Ile Gln 185 190 195 Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Val Trp Val Gln Phe Tyr Asn Asn Pro 200 205 210 Ser Cys Gln Tyr Ser Asn Gly Asp Thr Thr Asn Leu Ile Asn Ser 215 220 225 Trp Asn Gln Trp Ile Thr Val Pro Ala Ser Leu Val Phe Met Gly 230 235 240 Leu Pro Ala Ser Asp Ala Ala Ala Pro Ser Gly Gly Phe Val Ser 245 250 255 Thr Asp Val Leu Thr Ser Gln Val Leu Pro Val Ile Lys Gln Ser 260 265 270 Ser Lys Tyr Gly Gly Val Met Leu Trp Asp Arg Phe Asn Asp Val 275 280 285 Gln Thr Gly Tyr Ser Ala Ala Ile Ile Gly Ser Ile Asn 290 295 配列番号：４ 配列の長さ： 897 配列の型：核酸 鎖の数：両形態（both） トポロジ−：直鎖状 配列の種類： cDNA to mRNA 起源 シカクマメ（Prophocarpus tetragonolobus, 沖縄産 TP
T-2） 配列 ATG GAA TCC TTG AAG AAA GCC TCA CTT GTC TTA TTT CCT ATC TTG 45 Met Glu Ser Leu Lys Lys Ala Ser Leu Val Leu Phe Pro Ile Leu -25 -20 -15 GTC CTT TCC CTA TTC AAC CAT TCC AAT GCT GCA GGA ATA GCT GTT 90 Val Leu Ser Leu Phe Asn His Ser Asn Ala Ala Gly Ile Ala Val -10 -5 15 ＴＡＣ ＴＧＧ ＧＧＣ ＣＡＡ ＡＡＣ ＧＧＴ ＧＧＡ ＧＡＡ ＧＧＡ
ＴＣＣ ＴＴＡ ＧＣＡ ＧＡＣ ＡＣＴ ＴＧＣ １３５ Ｔｙｒ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｙ
Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｃｙｓ 10 15 20 AAC ACT GGA AAC TAC GAA TTT GTG AAC ATA GCT TTC TTG TCC ACT 180 Asn Thr Gly Asn Tyr Glu Phe Val Asn Ile Ala Phe Leu Ser Thr 25 30 35 TTT GGC AGT GGC CAA ACT CCC CAA CTC AAC CTT GCT GGT CAT TGT 225 Phe Gly Ser Gly Gln Thr Pro Gln Leu Asn Leu Ala Gly His Cys 40 45 50 GAC CCC AGC AGC AAT GGC TGC ACT GGC TTC AGC AGT GAG ATC CAA 270 Asp Pro Ser Ser Asn Gly Cys Thr Gly Phe Ser Ser Glu Ile Gln 55 60 65 ACT TGT CAA AAC AGA GGG ATC AAA GTG TTG CTA TCT CTT GGA GGC 315 Thr Cys Gln Asn Arg Gly Ile Lys Val Leu Leu Ser Leu Gly Gly 70 75 80 AGT GCT GGA ACC TAC TCC CTC AAC TCA GCT GAT GAT GCC ACA CAA 360 Ser Ala Gly Thr Tyr Ser Leu Asn Ser Ala Asp Asp Ala Thr Gln 85 90 95 CTT GCA AAC TAC CTT TGG GAC AAT TTC CTC GGA GGC CAA TCT GGA 405 Leu Ala Asn Tyr Leu Trp Asp Asn Phe Leu Gly Gly Gln Ser Gly 100 105 110 TCA AGA CCA TTA GGT GAT GCT GTC TTA GAT GGG GTT GAC TTT GAC 450 Ser Arg Pro Leu Gly Asp Ala Val Leu Asp Gly Val Asp Phe Asp 115 120 125 ATT GAA TCT GGT GGA AGT AAC CAT TAT GAT GAT CTT GCA AGG GCA 495 Ile Glu Ser Gly Gly Ser Asn His Tyr Asp Asp Leu Ala Arg Ala 130 135 140 CTG AAT AGC TTG AGT TCA CAA AAG AAG GTG TAC TTG TCT GCA GCC 540 Leu Asn Ser Leu Ser Ser Gln Lys Lys Val Tyr Leu Ser Ala Ala 145 150 155 CCA CAG TGC ATA ATC CCT GAT CAA CAC TTG GAT GCA GCC ATC CAA 585 Pro Gln Cys Ile Ile Pro Asp Gln His Leu Asp Ala Ala Ile Gln 160 165 170 ACG GGG CTT TTT GAC TAT GTG TGG GTT CAG TTC TAC AAC AAC CCT 630 Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Val Trp Val Gln Phe Tyr Asn Asn Pro 175 180 185 TCA TGC CAA TAC TCC AAT GGA GAC ACA ACC AAT TTG ATC AAT TCA 675 Ser Cys Gln Tyr Ser Asn Gly Asp Thr Thr Asn Leu Ile Asn Ser 190 195 200 TGG AAC CAG TGG ATC ACA GTG CCA GCC TCC CTA GTC TTC ATG GGG 720 Trp Asn Gln Trp Ile Thr Val Pro Ala Ser Leu Val Phe Met Gly 205 210 215 CTT CCT GCA TCC GAT GCT GCT GCT CCA AGT GGT GGC TTT GTG TCT 765 Leu Pro Ala Ser Asp Ala Ala Ala Pro Ser Gly Gly Phe Val Ser 220 225 230 ACT GAT GTG TTA ACT TCT CAA GTT CTT CCT GTC ATA AAA CAG TCT 810 Thr Asp Val Leu Thr Ser Gln Val Leu Pro Val Ile Lys Gln Ser 235 240 245 TCA AAG TAT GGT GGA GTC ATG CTC TGG GAC AGG TTC AAC GAC GTT 855 Ser Lys Tyr Gly Gly Val Met Leu Trp Asp Arg Phe Asn Asp Val 250 255 260 CAA ACT GGT TAC AGT GCT GCT ATT ATT GGA AGT ATT AAT TGA 897 Gln Thr Gly Tyr Ser Ala Ala Ile Ile Gly Ser Ile Asn *** 265 270 配列番号：５ 配列の長さ： 1074 配列の型：核酸 鎖の数：両形態（both） トポロジ−：直鎖状 配列の種類： cDNA to mRNA 起源 シカクマメ（Prophocarpus tetragonolobus, 沖縄産 TP
T-2） 配列 ATTC GAGGA TCCGG GTACC ATGGA TCAGA GCCTA GGAAC 39 ATG GAA TCC TTG AAG AAA GCC TCA CTT GTC TTA TTT CCT ATC TTG 84 Met Glu Ser Leu Lys Lys Ala Ser Leu Val Leu Phe Pro Ile Leu -25 -20 -15 GTC CTT TCC CTA TTC AAC CAT TCC AAT GCT GCA GGA ATA GCT GTT 129 Val Leu Ser Leu Phe Asn His Ser Asn Ala Ala Gly Ile Ala Val -10 -5 1 5 TAC TGG GGC CAA AAC GGT GGA GAA GGA TCC TTA GCA GAC ACT TGC 174 Tyr Trp Gly Gln Asn Gly Gly Glu Gly Ser Leu Ala Asp Thr Cys 10 15 20 AAC ACT GGA AAC TAC GAA TTT GTG AAC ATA GCT TTC TTG TCC ACT 219 Asn Thr Gly Asn Tyr Glu Phe Val Asn Ile Ala Phe Leu Ser Thr 25 30 35 TTT GGC AGT GGC CAA ACT CCC CAA CTC AAC CTT GCT GGT CAT TGT 264 Phe Gly Ser Gly Gln Thr Pro Gln Leu Asn Leu Ala Gly His Cys 40 45 50 GAC CCC AGC AGC AAT GGC TGC ACT GGC TTC AGC AGT GAG ATC CAA 309 Asp Pro Ser Ser Asn Gly Cys Thr Gly Phe Ser Ser Glu Ile Gln 55 60 65 ACT TGT CAA AAC AGA GGG ATC AAA GTG TTG CTA TCT CTT GGA GGC 354 Thr Cys Gln Asn Arg Gly Ile Lys Val Leu Leu Ser Leu Gly Gly 70 75 80 AGT GCT GGA ACC TAC TCC CTC AAC TCA GCT GAT GAT GCC ACA CAA 399 Ser Ala Gly Thr Tyr Ser Leu Asn Ser Ala Asp Asp Ala Thr Gln 85 90 95 CTT GCA AAC TAC CTT TGG GAC AAT TTC CTC GGA GGC CAA TCT GGA 444 Leu Ala Asn Tyr Leu Trp Asp Asn Phe Leu Gly Gly Gln Ser Gly 100 105 110 TCA AGA CCA TTA GGT GAT GCT GTC TTA GAT GGG GTT GAC TTT GAC 489 Ser Arg Pro Leu Gly Asp Ala Val Leu Asp Gly Val Asp Phe Asp 115 120 125 ATT GAA TCT GGT GGA AGT AAC CAT TAT GAT GAT CTT GCA AGG GCA 534 Ile Glu Ser Gly Gly Ser Asn His Tyr Asp Asp Leu Ala Arg Ala 130 135 140 CTG AAT AGC TTG AGT TCA CAA AAG AAG GTG TAC TTG TCT GCA GCC 579 Leu Asn Ser Leu Ser Ser Gln Lys Lys Val Tyr Leu Ser Ala Ala 145 150 155 CCA CAG TGC ATA ATC CCT GAT CAA CAC TTG GAT GCA GCC ATC CAA 624 Pro Gln Cys Ile Ile Pro Asp Gln His Leu Asp Ala Ala Ile Gln 160 165 170 ACG GGG CTT TTT GAC TAT GTG TGG GTT CAG TTC TAC AAC AAC CCT 669 Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Val Trp Val Gln Phe Tyr Asn Asn Pro 175 180 185 TCA TGC CAA TAC TCC AAT GGA GAC ACA ACC AAT TTG ATC AAT TCA 624 Ser Cys Gln Tyr Ser Asn Gly Asp Thr Thr Asn Leu Ile Asn Ser 190 195 200 TGG AAC CAG TGG ATC ACA GTG CCA GCC TCC CTA GTC TTC ATG GGG 730 Trp Asn Gln Trp Ile Thr Val Pro Ala Ser Leu Val Phe Met Gly 205 210 215 CTT CCT GCA TCC GAT GCT GCT GCT CCA AGT GGT GGC TTT GTG TCT 775 Leu Pro Ala Ser Asp Ala Ala Ala Pro Ser Gly Gly Phe Val Ser 220 225 230 ACT GAT GTG TTA ACT TCT CAA GTT CTT CCT GTC ATA AAA CAG TCT 810 Thr Asp Val Leu Thr Ser Gln Val Leu Pro Val Ile Lys Gln Ser 235 240 245 TCA AAG TAT GGT GGA GTC ATG CTC TGG GAC AGG TTC AAC GAC GTT 855 Ser Lys Tyr Gly Gly Val Met Leu Trp Asp Arg Phe Asn Asp Val 250 255 260 CAA ACT GGT TAC AGT GCT GCT ATT ATT GGA AGT ATT AAT TGA 897 Gln Thr Gly Tyr Ser Ala Ala Ile Ile Gly Ser Ile Asn *** 265 270 TTAAT TAGTT ATAAG CCAAC TATGA CATTC ACTTA TTTAA ATAAT 942 CACCA CCACT AGTTG GTATT GTTAC TATAC ACTAT ACATT GAATG 987 TGCTG TCAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA 1032 AAAAA AAGGG GGGGG GGCCA TGGTA CCCGG ATCCT CGAAT TC 1074
T-2） 配列 Ala Gly Ile Ala Val Tyr Trp Gly Gln Asn Gly Gly Glu Gly Ser 1 5 10 15 Leu Ala Asp Thr Cys Asn Thr Gly Asn Tyr Glu Phe Val Asn Ile 20 25 30 Ala Phe Leu Ser Thr Phe Gly Ser Gly Gln Thr Pro Gln Leu Asn 35 40 45 Leu Ala Gly His Cys Asp Pro Ser Ser Asn Gly Cys Thr Gly Phe 50 55 60 Ser Ser Glu Ile Gln Thr Cys Gln Asn Arg Gly Ile Lys Val Leu 65 70 75 Leu Ser Leu Gly Gly Ser Ala Gly Thr Tyr Ser Leu Asn Ser Ala 80 85 90 Asp Asp Ala Thr Gln Leu Ala Asn Tyr Leu Trp Asp Asn Phe Leu 95 100 105 Gly Gly Gln Ser Gly Ser Arg Pro Leu Gly Asp Ala Val Leu Asp 110 115 120 Gly Val Asp Phe Asp Ile Glu Ser Gly Gly Ser Asn His Tyr Asp 125 130 135 Asp Leu Ala Arg Ala Leu Asn Ser Leu Ser Ser Gln Lys Lys Val 140 145 150 Tyr Leu Ser Ala Ala Pro Gln Cys Ile Ile Pro Asp Gln His Leu 155 160 165 Asp Ala Ala Ile Gln Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Val Trp Val Gln 170 175 180 Phe Tyr Asn Asn Pro Ser Cys Gln Tyr Ser Asn Gly Asp Thr Thr 185 190 195 Asn Leu Ile Asn Ser Trp Asn Gln Trp Ile Thr Val Pro Ala Ser 200 205 210 Leu Val Phe Met Gly Leu Pro Ala Ser Asp Ala Ala Ala Pro Ser 215 220 225 Gly Gly Phe Val Ser Thr Asp Val Leu Thr Ser Gln Val Leu Pro 230 235 240 Val Ile Lys Gln Ser Ser Lys Tyr Gly Gly Val Met Leu Trp Asp 245 250 255 Arg Phe Asn Asp Val Gln Thr Gly Tyr Ser Ala Ala Ile Ile Gly 260 265 270 Ser Ile Asn 273 配列番号：２ 配列の長さ： 822 配列の型：核酸 鎖の数：両形態（both） トポロジ−：直鎖状 配列の種類： cDNA to mRNA 起源シカクマメ（Prophocarpus tetragonolobus, 沖縄
産 TPT-2） 配列 GCA GGA ATA GCT GTT TAC TGG GGC CAA AAC GGT GGA GAA GGA TCC 45 Ala Gly Ile Ala Val Tyr Trp Gly Gln Asn Gly Gly Glu Gly Ser 1 5 10 15 TTA GCA GAC ACT TGC AAC ACT GGA AAC TAC GAA TTT GTG AAC ATA Leu Ala Asp Thr Cys Asn Thr Gly Asn Tyr Glu Phe Val Asn Ile 90 20 25 30 GCT TTC TTG TCC ACT TTT GGC AGT GGC CAA ACT CCC CAA CTC AAC 135 Ala Phe Leu Ser Thr Phe Gly Ser Gly Gln Thr Pro Gln Leu Asn 35 40 45 CTT GCT GGT CAT TGT GAC CCC AGC AGC AAT GGC TGC ACT GGC TTC 180 Leu Ala Gly His Cys Asp Pro Ser Ser Asn Gly Cys Thr Gly Phe 50 55 60 AGC AGT GAG ATC CAA ACT TGT CAA AAC AGA GGG ATC AAA GTG TTG 225 Ser Ser Glu Ile Gln Thr Cys Gln Asn Arg Gly Ile Lys Val Leu 65 70 75 CTA TCT CTT GGA GGC AGT GCT GGA ACC TAC TCC CTC AAC TCA GCT 270 Leu Ser Leu Gly Gly Ser Ala Gly Thr Tyr Ser Leu Asn Ser Ala 80 85 90 GAT GAT GCC ACA CAA CTT GCA AAC TAC CTT TGG GAC AAT TTC CTC 315 Asp Asp Ala Thr Gln Leu Ala Asn Tyr Leu Trp Asp Asn Phe Leu 95 100 105 GGA GGC CAA TCT GGA TCA AGA CCA TTA GGT GAT GCT GTC TTA GAT 360 Gly Gly Gln Ser Gly Ser Arg Pro Leu Gly Asp Ala Val Leu Asp 110 115 120 GGG GTT GAC TTT GAC ATT GAA TCT GGT GGA AGT AAC CAT TAT GAT 405 Gly Val Asp Phe Asp Ile Glu Ser Gly Gly Ser Asn His Tyr Asp 125 130 135 GAT CTT GCA AGG GCA CTG AAT AGC TTG AGT TCA CAA AAG AAG GTG 450 Asp Leu Ala Arg Ala Leu Asn Ser Leu Ser Ser Gln Lys Lys Val 140 145 150 TAC TTG TCT GCA GCC CCA CAG TGC ATA ATC CCT GAT CAA CAC TTG 495 Tyr Leu Ser Ala Ala Pro Gln Cys Ile Ile Pro Asp Gln His Leu 155 160 165 GAT GCA GCC ATC CAA ACG GGG CTT TTT GAC TAT GTG TGG GTT CAG 540 Asp Ala Ala Ile Gln Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Val Trp Val Gln 170 175 180 TTC TAC AAC AAC CCT TCA TGC CAA TAC TCC AAT GGA GAC ACA ACC 585 Phe Tyr Asn Asn Pro Ser Cys Gln Tyr Ser Asn Gly Asp Thr Thr 185 190 195 AAT TTG ATC AAT TCA TGG AAC CAG TGG ATC ACA GTG CCA GCC TCC 630 Asn Leu Ile Asn Ser Trp Asn Gln Trp Ile Thr Val Pro Ala Ser 200 205 210 CTA GTC TTC ATG GGG CTT CCT GCA TCC GAT GCT GCT GCT CCA AGT 675 Leu Val Phe Met Gly Leu Pro Ala Ser Asp Ala Ala Ala Pro Ser 215 220 225 GGT GGC TTT GTG TCT ACT GAT GTG TTA ACT TCT CAA GTT CTT CCT 720 Gly Gly Phe Val Ser Thr Asp Val Leu Thr Ser Gln Val Leu Pro 230 235 240 GTC ATA AAA CAG TCT TCA AAG TAT GGT GGA GTC ATG CTC TGG GAC 765 Val Ile Lys Gln Ser Ser Lys Tyr Gly Gly Val Met Leu Trp Asp 245 250 255 AGG TTC AAC GAC GTT CAA ACT GGT TAC AGT GCT GCT ATT ATT GGA 810 Arg Phe Asn Asp Val Gln Thr Gly Tyr Ser Ala Ala Ile Ile Gly 260 265 270 AGT ATT AAT TGA 822 Ser Ile Asn *** 配列番号：３ 配列の長さ： 298 配列の型：アミノ酸 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：蛋白質 起源 シカクマメ（Prophocarpus tetragonolobus, 沖縄産 TP
T-2） 配列の特徴 特徴を表す記号： sig peptide 存在位置： 1..25 配列 Met Glu Ser Leu Lys Lys Ala Ser Leu Val Leu Phe Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Leu Ser Leu Phe Asn His Ser Asn Ala Ala Gly Ile Ala Val 20 25 30 Tyr Trp Gly Gln Asn Gly Gly Glu Gly Ser Leu Ala Asp Thr Cys 35 40 45 Asn Thr Gly Asn Tyr Glu Phe Val Asn Ile Ala Phe Leu Ser Thr 50 55 60 Phe Gly Ser Gly Gln Thr Pro Gln Leu Asn Leu Ala Gly His Cys 65 70 75 Asp Pro Ser Ser Asn Gly Cys Thr Gly Phe Ser Ser Glu Ile Gln 80 85 90 Thr Cys Gln Asn Arg Gly Ile Lys Val Leu Leu Ser Leu Gly Gly 95 100 105 Ser Ala Gly Thr Tyr Ser Leu Asn Ser Ala Asp Asp Ala Thr Gln 110 115 120 Leu Ala Asn Tyr Leu Trp Asp Asn Phe Leu Gly Gly Gln Ser Gly 125 130 135 Ser Arg Pro Leu Gly Asp Ala Val Leu Asp Gly Val Asp Phe Asp 140 145 150 Ile Glu Ser Gly Gly Ser Asn His Tyr Asp Asp Leu Ala Arg Ala 155 160 165 Leu Asn Ser Leu Ser Ser Gln Lys Lys Val Tyr Leu Ser Ala Ala 170 175 180 Pro Gln Cys Ile Ile Pro Asp Gln His Leu Asp Ala Ala Ile Gln 185 190 195 Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Val Trp Val Gln Phe Tyr Asn Asn Pro 200 205 210 Ser Cys Gln Tyr Ser Asn Gly Asp Thr Thr Asn Leu Ile Asn Ser 215 220 225 Trp Asn Gln Trp Ile Thr Val Pro Ala Ser Leu Val Phe Met Gly 230 235 240 Leu Pro Ala Ser Asp Ala Ala Ala Pro Ser Gly Gly Phe Val Ser 245 250 255 Thr Asp Val Leu Thr Ser Gln Val Leu Pro Val Ile Lys Gln Ser 260 265 270 Ser Lys Tyr Gly Gly Val Met Leu Trp Asp Arg Phe Asn Asp Val 275 280 285 Gln Thr Gly Tyr Ser Ala Ala Ile Ile Gly Ser Ile Asn 290 295 配列番号：４ 配列の長さ： 897 配列の型：核酸 鎖の数：両形態（both） トポロジ−：直鎖状 配列の種類： cDNA to mRNA 起源 シカクマメ（Prophocarpus tetragonolobus, 沖縄産 TP
T-2） 配列 ATG GAA TCC TTG AAG AAA GCC TCA CTT GTC TTA TTT CCT ATC TTG 45 Met Glu Ser Leu Lys Lys Ala Ser Leu Val Leu Phe Pro Ile Leu -25 -20 -15 GTC CTT TCC CTA TTC AAC CAT TCC AAT GCT GCA GGA ATA GCT GTT 90 Val Leu Ser Leu Phe Asn His Ser Asn Ala Ala Gly Ile Ala Val -10 -5 15 ＴＡＣ ＴＧＧ ＧＧＣ ＣＡＡ ＡＡＣ ＧＧＴ ＧＧＡ ＧＡＡ ＧＧＡ
ＴＣＣ ＴＴＡ ＧＣＡ ＧＡＣ ＡＣＴ ＴＧＣ １３５ Ｔｙｒ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｙ
Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｃｙｓ 10 15 20 AAC ACT GGA AAC TAC GAA TTT GTG AAC ATA GCT TTC TTG TCC ACT 180 Asn Thr Gly Asn Tyr Glu Phe Val Asn Ile Ala Phe Leu Ser Thr 25 30 35 TTT GGC AGT GGC CAA ACT CCC CAA CTC AAC CTT GCT GGT CAT TGT 225 Phe Gly Ser Gly Gln Thr Pro Gln Leu Asn Leu Ala Gly His Cys 40 45 50 GAC CCC AGC AGC AAT GGC TGC ACT GGC TTC AGC AGT GAG ATC CAA 270 Asp Pro Ser Ser Asn Gly Cys Thr Gly Phe Ser Ser Glu Ile Gln 55 60 65 ACT TGT CAA AAC AGA GGG ATC AAA GTG TTG CTA TCT CTT GGA GGC 315 Thr Cys Gln Asn Arg Gly Ile Lys Val Leu Leu Ser Leu Gly Gly 70 75 80 AGT GCT GGA ACC TAC TCC CTC AAC TCA GCT GAT GAT GCC ACA CAA 360 Ser Ala Gly Thr Tyr Ser Leu Asn Ser Ala Asp Asp Ala Thr Gln 85 90 95 CTT GCA AAC TAC CTT TGG GAC AAT TTC CTC GGA GGC CAA TCT GGA 405 Leu Ala Asn Tyr Leu Trp Asp Asn Phe Leu Gly Gly Gln Ser Gly 100 105 110 TCA AGA CCA TTA GGT GAT GCT GTC TTA GAT GGG GTT GAC TTT GAC 450 Ser Arg Pro Leu Gly Asp Ala Val Leu Asp Gly Val Asp Phe Asp 115 120 125 ATT GAA TCT GGT GGA AGT AAC CAT TAT GAT GAT CTT GCA AGG GCA 495 Ile Glu Ser Gly Gly Ser Asn His Tyr Asp Asp Leu Ala Arg Ala 130 135 140 CTG AAT AGC TTG AGT TCA CAA AAG AAG GTG TAC TTG TCT GCA GCC 540 Leu Asn Ser Leu Ser Ser Gln Lys Lys Val Tyr Leu Ser Ala Ala 145 150 155 CCA CAG TGC ATA ATC CCT GAT CAA CAC TTG GAT GCA GCC ATC CAA 585 Pro Gln Cys Ile Ile Pro Asp Gln His Leu Asp Ala Ala Ile Gln 160 165 170 ACG GGG CTT TTT GAC TAT GTG TGG GTT CAG TTC TAC AAC AAC CCT 630 Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Val Trp Val Gln Phe Tyr Asn Asn Pro 175 180 185 TCA TGC CAA TAC TCC AAT GGA GAC ACA ACC AAT TTG ATC AAT TCA 675 Ser Cys Gln Tyr Ser Asn Gly Asp Thr Thr Asn Leu Ile Asn Ser 190 195 200 TGG AAC CAG TGG ATC ACA GTG CCA GCC TCC CTA GTC TTC ATG GGG 720 Trp Asn Gln Trp Ile Thr Val Pro Ala Ser Leu Val Phe Met Gly 205 210 215 CTT CCT GCA TCC GAT GCT GCT GCT CCA AGT GGT GGC TTT GTG TCT 765 Leu Pro Ala Ser Asp Ala Ala Ala Pro Ser Gly Gly Phe Val Ser 220 225 230 ACT GAT GTG TTA ACT TCT CAA GTT CTT CCT GTC ATA AAA CAG TCT 810 Thr Asp Val Leu Thr Ser Gln Val Leu Pro Val Ile Lys Gln Ser 235 240 245 TCA AAG TAT GGT GGA GTC ATG CTC TGG GAC AGG TTC AAC GAC GTT 855 Ser Lys Tyr Gly Gly Val Met Leu Trp Asp Arg Phe Asn Asp Val 250 255 260 CAA ACT GGT TAC AGT GCT GCT ATT ATT GGA AGT ATT AAT TGA 897 Gln Thr Gly Tyr Ser Ala Ala Ile Ile Gly Ser Ile Asn *** 265 270 配列番号：５ 配列の長さ： 1074 配列の型：核酸 鎖の数：両形態（both） トポロジ−：直鎖状 配列の種類： cDNA to mRNA 起源 シカクマメ（Prophocarpus tetragonolobus, 沖縄産 TP
T-2） 配列 ATTC GAGGA TCCGG GTACC ATGGA TCAGA GCCTA GGAAC 39 ATG GAA TCC TTG AAG AAA GCC TCA CTT GTC TTA TTT CCT ATC TTG 84 Met Glu Ser Leu Lys Lys Ala Ser Leu Val Leu Phe Pro Ile Leu -25 -20 -15 GTC CTT TCC CTA TTC AAC CAT TCC AAT GCT GCA GGA ATA GCT GTT 129 Val Leu Ser Leu Phe Asn His Ser Asn Ala Ala Gly Ile Ala Val -10 -5 1 5 TAC TGG GGC CAA AAC GGT GGA GAA GGA TCC TTA GCA GAC ACT TGC 174 Tyr Trp Gly Gln Asn Gly Gly Glu Gly Ser Leu Ala Asp Thr Cys 10 15 20 AAC ACT GGA AAC TAC GAA TTT GTG AAC ATA GCT TTC TTG TCC ACT 219 Asn Thr Gly Asn Tyr Glu Phe Val Asn Ile Ala Phe Leu Ser Thr 25 30 35 TTT GGC AGT GGC CAA ACT CCC CAA CTC AAC CTT GCT GGT CAT TGT 264 Phe Gly Ser Gly Gln Thr Pro Gln Leu Asn Leu Ala Gly His Cys 40 45 50 GAC CCC AGC AGC AAT GGC TGC ACT GGC TTC AGC AGT GAG ATC CAA 309 Asp Pro Ser Ser Asn Gly Cys Thr Gly Phe Ser Ser Glu Ile Gln 55 60 65 ACT TGT CAA AAC AGA GGG ATC AAA GTG TTG CTA TCT CTT GGA GGC 354 Thr Cys Gln Asn Arg Gly Ile Lys Val Leu Leu Ser Leu Gly Gly 70 75 80 AGT GCT GGA ACC TAC TCC CTC AAC TCA GCT GAT GAT GCC ACA CAA 399 Ser Ala Gly Thr Tyr Ser Leu Asn Ser Ala Asp Asp Ala Thr Gln 85 90 95 CTT GCA AAC TAC CTT TGG GAC AAT TTC CTC GGA GGC CAA TCT GGA 444 Leu Ala Asn Tyr Leu Trp Asp Asn Phe Leu Gly Gly Gln Ser Gly 100 105 110 TCA AGA CCA TTA GGT GAT GCT GTC TTA GAT GGG GTT GAC TTT GAC 489 Ser Arg Pro Leu Gly Asp Ala Val Leu Asp Gly Val Asp Phe Asp 115 120 125 ATT GAA TCT GGT GGA AGT AAC CAT TAT GAT GAT CTT GCA AGG GCA 534 Ile Glu Ser Gly Gly Ser Asn His Tyr Asp Asp Leu Ala Arg Ala 130 135 140 CTG AAT AGC TTG AGT TCA CAA AAG AAG GTG TAC TTG TCT GCA GCC 579 Leu Asn Ser Leu Ser Ser Gln Lys Lys Val Tyr Leu Ser Ala Ala 145 150 155 CCA CAG TGC ATA ATC CCT GAT CAA CAC TTG GAT GCA GCC ATC CAA 624 Pro Gln Cys Ile Ile Pro Asp Gln His Leu Asp Ala Ala Ile Gln 160 165 170 ACG GGG CTT TTT GAC TAT GTG TGG GTT CAG TTC TAC AAC AAC CCT 669 Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Val Trp Val Gln Phe Tyr Asn Asn Pro 175 180 185 TCA TGC CAA TAC TCC AAT GGA GAC ACA ACC AAT TTG ATC AAT TCA 624 Ser Cys Gln Tyr Ser Asn Gly Asp Thr Thr Asn Leu Ile Asn Ser 190 195 200 TGG AAC CAG TGG ATC ACA GTG CCA GCC TCC CTA GTC TTC ATG GGG 730 Trp Asn Gln Trp Ile Thr Val Pro Ala Ser Leu Val Phe Met Gly 205 210 215 CTT CCT GCA TCC GAT GCT GCT GCT CCA AGT GGT GGC TTT GTG TCT 775 Leu Pro Ala Ser Asp Ala Ala Ala Pro Ser Gly Gly Phe Val Ser 220 225 230 ACT GAT GTG TTA ACT TCT CAA GTT CTT CCT GTC ATA AAA CAG TCT 810 Thr Asp Val Leu Thr Ser Gln Val Leu Pro Val Ile Lys Gln Ser 235 240 245 TCA AAG TAT GGT GGA GTC ATG CTC TGG GAC AGG TTC AAC GAC GTT 855 Ser Lys Tyr Gly Gly Val Met Leu Trp Asp Arg Phe Asn Asp Val 250 255 260 CAA ACT GGT TAC AGT GCT GCT ATT ATT GGA AGT ATT AAT TGA 897 Gln Thr Gly Tyr Ser Ala Ala Ile Ile Gly Ser Ile Asn *** 265 270 TTAAT TAGTT ATAAG CCAAC TATGA CATTC ACTTA TTTAA ATAAT 942 CACCA CCACT AGTTG GTATT GTTAC TATAC ACTAT ACATT GAATG 987 TGCTG TCAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA 1032 AAAAA AAGGG GGGGG GGCCA TGGTA CCCGG ATCCT CGAAT TC 1074
【図１】 キチン及びキチナ−ゼ (EC 3.2.1.14) の役
割を示す。
割を示す。
【図２】 植物由来のキチナ−ゼの類別とその一次構造
並びに各種機能をもつドメインの存在位置の比較を示
す。
並びに各種機能をもつドメインの存在位置の比較を示
す。
【図３】 シカクマメ由来の酸性キチナ−ゼ成熟酵素の
Ｎ末アミノ酸配列と他のシカクマメ由来のキチナ−ゼ成
熟酵素との相同性、該Ｎ末用のプロ−ブの塩基配列を示
す。
Ｎ末アミノ酸配列と他のシカクマメ由来のキチナ−ゼ成
熟酵素との相同性、該Ｎ末用のプロ−ブの塩基配列を示
す。
【図４】 シカクマメ由来酸性キチナ−ゼのｍＲＮＡか
ら調製されたｃＤＮＡの塩基配列とそこに存在するオ−
プンリ−ディングフレ−ムを示す。
ら調製されたｃＤＮＡの塩基配列とそこに存在するオ−
プンリ−ディングフレ−ムを示す。
【図５】 シカクマメ由来酸性キチナ−ゼ成熟酵素並び
にそのｍＲＮＡ量の培養時間経過に伴う変化を示す。
にそのｍＲＮＡ量の培養時間経過に伴う変化を示す。
【図６】 シカクマメ由来酸性キチナ−ゼ成熟酵素並び
にそのｍＲＮＡ量の生産量の組織依存性を示す。
にそのｍＲＮＡ量の生産量の組織依存性を示す。
【図７】 シカクマメ由来酸性キチナ−ゼ成熟酵素分泌
量のカルス培養液中、カルス細胞、根組織、ＳＡ(サリ
チル酸)発現誘導、外的組織傷害刺激による発現誘導に
よる違いを比較する。
量のカルス培養液中、カルス細胞、根組織、ＳＡ(サリ
チル酸)発現誘導、外的組織傷害刺激による発現誘導に
よる違いを比較する。
【図８】 サブクロ−ニングされたファ−ジＤＮＡ中の
制限酵素 EcoR I、BamH I、Kpn I で切断されたインサ
−トＤＮＡ由来のＤＮＡ断片に対する Southern blot
の結果に示す。
制限酵素 EcoR I、BamH I、Kpn I で切断されたインサ
−トＤＮＡ由来のＤＮＡ断片に対する Southern blot
の結果に示す。
【図９】 シカクマメ由来酸性キチナ−ゼ成熟酵素並び
にそのｍＲＮＡ量の生産量の外的因子に依存する誘導性
を示す。
にそのｍＲＮＡ量の生産量の外的因子に依存する誘導性
を示す。
【図１０】 シカクマメ由来酸性キチナ−ゼ前駆体と数
種の植物由来のクラスIII酸性キチナーゼ前駆体のアミ
ノ酸配列間の相同性を示す。
種の植物由来のクラスIII酸性キチナーゼ前駆体のアミ
ノ酸配列間の相同性を示す。
【図１１】 シカクマメ由来酸性キチナ−ゼ成熟酵素と
数種の植物由来のクラスIII酸性キチナーゼ、クラスＩ
塩基性キチナーゼの分子量と等電点を比較する。
数種の植物由来のクラスIII酸性キチナーゼ、クラスＩ
塩基性キチナーゼの分子量と等電点を比較する。
【図１２】 シカクマメ由来キチナ−ゼ成熟酵素の活性
ドメインとされる領域の部分アミノ酸配列と他のキチナ
−ゼの当該領域とを比較する。
ドメインとされる領域の部分アミノ酸配列と他のキチナ
−ゼの当該領域とを比較する。
【図１３】 シカクマメ由来酸性キチナ−ゼの前駆体ペ
プチド鎖のハイドロパシー分析とシグナル配列及び活性
ドメイン位置を対比する。
プチド鎖のハイドロパシー分析とシグナル配列及び活性
ドメイン位置を対比する。
Claims (6)
- 【請求項１】 下記するアミノ酸配列（Ｉ）［配列
１］： Ala Gly Ile Ala Val Tyr Trp Gly Gln Asn Gly Gly Glu Gly Ser 1 5 10 15 Leu Ala Asp Thr Cys Asn Thr Gly Asn Tyr Glu Phe Val Asn Ile 20 25 30 Ala Phe Leu Ser Thr Phe Gly Ser Gly Gln Thr Pro Gln Leu Asn 35 40 45 Leu Ala Gly His Cys Asp Pro Ser Ser Asn Gly Cys Thr Gly Phe 50 55 60 Ser Ser Glu Ile Gln Thr Cys Gln Asn Arg Gly Ile Lys Val Leu 65 70 75 Leu Ser Leu Gly Gly Ser Ala Gly Thr Tyr Ser Leu Asn Ser Ala 80 85 90 Asp Asp Ala Thr Gln Leu Ala Asn Tyr Leu Trp Asp Asn Phe Leu 95 100 105 Gly Gly Gln Ser Gly Ser Arg Pro Leu Gly Asp Ala Val Leu Asp 110 115 120 Gly Val Asp Phe Asp Ile Glu Ser Gly Gly Ser Asn His Tyr Asp 125 130 135 Asp Leu Ala Arg Ala Leu Asn Ser Leu Ser Ser Gln Lys Lys Val 140 145 150 Tyr Leu Ser Ala Ala Pro Gln Cys Ile Ile Pro Asp Gln His Leu 155 160 165 Asp Ala Ala Ile Gln Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Val Trp Val Gln 170 175 180 Phe Tyr Asn Asn Pro Ser Cys Gln Tyr Ser Asn Gly Asp Thr Thr 185 190 195 Asn Leu Ile Asn Ser Trp Asn Gln Trp Ile Thr Val Pro Ala Ser 200 205 210 Leu Val Phe Met Gly Leu Pro Ala Ser Asp Ala Ala Ala Pro Ser 215 220 225 Gly Gly Phe Val Ser Thr Asp Val Leu Thr Ser Gln Val Leu Pro 230 235 240 Val Ile Lys Gln Ser Ser Lys Tyr Gly Gly Val Met Leu Trp Asp 245 250 255 Arg Phe Asn Asp Val Gln Thr Gly Tyr Ser Ala Ala Ile Ile Gly 260 265 270 Ser Ile Asn 273 で表されるペプチド鎖からなるシカクマメ由来キチナ−
ゼ。 - 【請求項２】 前記するアミノ酸配列（Ｉ）で表される
シカクマメ由来キチナ−ゼ成熟酵素のペプチド鎖をコ−
ドする核酸塩基配列を含んでなるシカクマメ由来キチナ
−ゼをコ−ドするＤＮＡ。 - 【請求項３】 前記するアミノ酸配列（Ｉ）をコ−ドす
る核酸塩基配列が、下記する核酸塩基配列（Ｉ）［配列
２］： GCA GGA ATA GCT GTT TAC TGG GGC CAA AAC GGT GGA GAA GGA TCC 45 Ala Gly Ile Ala Val Tyr Trp Gly Gln Asn Gly Gly Glu Gly Ser 1 5 10 15 TTA GCA GAC ACT TGC AAC ACT GGA AAC TAC GAA TTT GTG AAC ATA Leu Ala Asp Thr Cys Asn Thr Gly Asn Tyr Glu Phe Val Asn Ile 90 20 25 30 GCT TTC TTG TCC ACT TTT GGC AGT GGC CAA ACT CCC CAA CTC AAC 135 Ala Phe Leu Ser Thr Phe Gly Ser Gly Gln Thr Pro Gln Leu Asn 35 40 45 CTT GCT GGT CAT TGT GAC CCC AGC AGC AAT GGC TGC ACT GGC TTC 180 Leu Ala Gly His Cys Asp Pro Ser Ser Asn Gly Cys Thr Gly Phe 50 55 60 AGC AGT GAG ATC CAA ACT TGT CAA AAC AGA GGG ATC AAA GTG TTG 225 Ser Ser Glu Ile Gln Thr Cys Gln Asn Arg Gly Ile Lys Val Leu 65 70 75 CTA TCT CTT GGA GGC AGT GCT GGA ACC TAC TCC CTC AAC TCA GCT 270 Leu Ser Leu Gly Gly Ser Ala Gly Thr Tyr Ser Leu Asn Ser Ala 80 85 90 GAT GAT GCC ACA CAA CTT GCA AAC TAC CTT TGG GAC AAT TTC CTC 315 Asp Asp Ala Thr Gln Leu Ala Asn Tyr Leu Trp Asp Asn Phe Leu 95 100 105 GGA GGC CAA TCT GGA TCA AGA CCA TTA GGT GAT GCT GTC TTA GAT 360 Gly Gly Gln Ser Gly Ser Arg Pro Leu Gly Asp Ala Val Leu Asp 110 115 120 GGG GTT GAC TTT GAC ATT GAA TCT GGT GGA AGT AAC CAT TAT GAT 405 Gly Val Asp Phe Asp Ile Glu Ser Gly Gly Ser Asn His Tyr Asp 125 130 135 GAT CTT GCA AGG GCA CTG AAT AGC TTG AGT TCA CAA AAG AAG GTG 450 Asp Leu Ala Arg Ala Leu Asn Ser Leu Ser Ser Gln Lys Lys Val 140 145 150 TAC TTG TCT GCA GCC CCA CAG TGC ATA ATC CCT GAT CAA CAC TTG 495 Tyr Leu Ser Ala Ala Pro Gln Cys Ile Ile Pro Asp Gln His Leu 155 160 165 GAT GCA GCC ATC CAA ACG GGG CTT TTT GAC TAT GTG TGG GTT CAG 540 Asp Ala Ala Ile Gln Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Val Trp Val Gln 170 175 180 TTC TAC AAC AAC CCT TCA TGC CAA TAC TCC AAT GGA GAC ACA ACC 585 Phe Tyr Asn Asn Pro Ser Cys Gln Tyr Ser Asn Gly Asp Thr Thr 185 190 195 AAT TTG ATC AAT TCA TGG AAC CAG TGG ATC ACA GTG CCA GCC TCC 630 Asn Leu Ile Asn Ser Trp Asn Gln Trp Ile Thr Val Pro Ala Ser 200 205 210 CTA GTC TTC ATG GGG CTT CCT GCA TCC GAT GCT GCT GCT CCA AGT 675 Leu Val Phe Met Gly Leu Pro Ala Ser Asp Ala Ala Ala Pro Ser 215 220 225 GGT GGC TTT GTG TCT ACT GAT GTG TTA ACT TCT CAA GTT CTT CCT 720 Gly Gly Phe Val Ser Thr Asp Val Leu Thr Ser Gln Val Leu Pro 230 235 240 GTC ATA AAA CAG TCT TCA AAG TAT GGT GGA GTC ATG CTC TGG GAC 765 Val Ile Lys Gln Ser Ser Lys Tyr Gly Gly Val Met Leu Trp Asp 245 250 255 AGG TTC AAC GAC GTT CAA ACT GGT TAC AGT GCT GCT ATT ATT GGA 810 Arg Phe Asn Asp Val Gln Thr Gly Tyr Ser Ala Ala Ile Ile Gly 260 265 270 AGT ATT AAT TGA 822 Ser Ile Asn *** で表されることを特徴とする請求項２に記載のシカクマ
メ由来キチナ−ゼ前駆体をコ−ドするＤＮＡ。 - 【請求項４】 下記するアミノ酸配列（II）［配列
３］： Met Glu Ser Leu Lys Lys Ala Ser Leu Val Leu Phe Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Leu Ser Leu Phe Asn His Ser Asn Ala Ala Gly Ile Ala Val 20 25 30 Tyr Trp Gly Gln Asn Gly Gly Glu Gly Ser Leu Ala Asp Thr Cys 35 40 45 Asn Thr Gly Asn Tyr Glu Phe Val Asn Ile Ala Phe Leu Ser Thr 50 55 60 Phe Gly Ser Gly Gln Thr Pro Gln Leu Asn Leu Ala Gly His Cys 65 70 75 Asp Pro Ser Ser Asn Gly Cys Thr Gly Phe Ser Ser Glu Ile Gln 80 85 90 Thr Cys Gln Asn Arg Gly Ile Lys Val Leu Leu Ser Leu Gly Gly 95 100 105 Ser Ala Gly Thr Tyr Ser Leu Asn Ser Ala Asp Asp Ala Thr Gln 110 115 120 Leu Ala Asn Tyr Leu Trp Asp Asn Phe Leu Gly Gly Gln Ser Gly 125 130 135 Ser Arg Pro Leu Gly Asp Ala Val Leu Asp Gly Val Asp Phe Asp 140 145 150 Ile Glu Ser Gly Gly Ser Asn His Tyr Asp Asp Leu Ala Arg Ala 155 160 165 Leu Asn Ser Leu Ser Ser Gln Lys Lys Val Tyr Leu Ser Ala Ala 170 175 180 Pro Gln Cys Ile Ile Pro Asp Gln His Leu Asp Ala Ala Ile Gln 185 190 195 Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Val Trp Val Gln Phe Tyr Asn Asn Pro 200 205 210 Ser Cys Gln Tyr Ser Asn Gly Asp Thr Thr Asn Leu Ile Asn Ser 215 220 225 Trp Asn Gln Trp Ile Thr Val Pro Ala Ser Leu Val Phe Met Gly 230 235 240 Leu Pro Ala Ser Asp Ala Ala Ala Pro Ser Gly Gly Phe Val Ser 245 250 255 Thr Asp Val Leu Thr Ser Gln Val Leu Pro Val Ile Lys Gln Ser 260 265 270 Ser Lys Tyr Gly Gly Val Met Leu Trp Asp Arg Phe Asn Asp Val 275 280 285 Gln Thr Gly Tyr Ser Ala Ala Ile Ile Gly Ser Ile Asn 290 295 で表されるシカクマメ由来キチナ−ゼの前駆体ペプチド
鎖をコ−ドする核酸塩基配列を含んでなるシカクマメ由
来キチナ−ゼ前駆体をコ−ドするＤＮＡ。 - 【請求項５】 前記するアミノ酸配列（II）をコ−ドす
る核酸塩基配列が、下記する核酸塩基配列（II）［配列
４］： ATG GAA TCC TTG AAG AAA GCC TCA CTT GTC TTA TTT CCT ATC TTG 45 Met Glu Ser Leu Lys Lys Ala Ser Leu Val Leu Phe Pro Ile Leu -25 -20 -15 GTC CTT TCC CTA TTC AAC CAT TCC AAT GCT GCA GGA ATA GCT GTT 90 Val Leu Ser Leu Phe Asn His Ser Asn Ala Ala Gly Ile Ala Val -10 -5 1
5 TAC TGG GGC CAA AAC GGT GGA GAA GGA TCC TTA GCA GAC ACT TGC 135 Tyr Trp Gly Gln Asn Gly Gly Glu Gly Ser Leu Ala Asp Thr Cys 10 15 20 AAC ACT GGA AAC TAC GAA TTT GTG AAC ATA GCT TTC TTG TCC ACT 180 Asn Thr Gly Asn Tyr Glu Phe Val Asn Ile Ala Phe Leu Ser Thr 25 30 35 TTT GGC AGT GGC CAA ACT CCC CAA CTC AAC CTT GCT GGT CAT TGT 225 Phe Gly Ser Gly Gln Thr Pro Gln Leu Asn Leu Ala Gly His Cys 40 45 50 GAC CCC AGC AGC AAT GGC TGC ACT GGC TTC AGC AGT GAG ATC CAA 270 Asp Pro Ser Ser Asn Gly Cys Thr Gly Phe Ser Ser Glu Ile Gln 55 60 65 ACT TGT CAA AAC AGA GGG ATC AAA GTG TTG CTA TCT CTT GGA GGC 315 Thr Cys Gln Asn Arg Gly Ile Lys Val Leu Leu Ser Leu Gly Gly 70 75 80 AGT GCT GGA ACC TAC TCC CTC AAC TCA GCT GAT GAT GCC ACA CAA 360 Ser Ala Gly Thr Tyr Ser Leu Asn Ser Ala Asp Asp Ala Thr Gln 85 90 95 CTT GCA AAC TAC CTT TGG GAC AAT TTC CTC GGA GGC CAA TCT GGA 405 Leu Ala Asn Tyr Leu Trp Asp Asn Phe Leu Gly Gly Gln Ser Gly 100 105 110 TCA AGA CCA TTA GGT GAT GCT GTC TTA GAT GGG GTT GAC TTT GAC 450 Ser Arg Pro Leu Gly Asp Ala Val Leu Asp Gly Val Asp Phe Asp 115 120 125 ATT GAA TCT GGT GGA AGT AAC CAT TAT GAT GAT CTT GCA AGG GCA 495 Ile Glu Ser Gly Gly Ser Asn His Tyr Asp Asp Leu Ala Arg Ala 130 135 140 CTG AAT AGC TTG AGT TCA CAA AAG AAG GTG TAC TTG TCT GCA GCC 540 Leu Asn Ser Leu Ser Ser Gln Lys Lys Val Tyr Leu Ser Ala Ala 145 150 155 CCA CAG TGC ATA ATC CCT GAT CAA CAC TTG GAT GCA GCC ATC CAA 585 Pro Gln Cys Ile Ile Pro Asp Gln His Leu Asp Ala Ala Ile Gln 160 165 170 ACG GGG CTT TTT GAC TAT GTG TGG GTT CAG TTC TAC AAC AAC CCT 630 Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Val Trp Val Gln Phe Tyr Asn Asn Pro 175 180 185 TCA TGC CAA TAC TCC AAT GGA GAC ACA ACC AAT TTG ATC AAT TCA 675 Ser Cys Gln Tyr Ser Asn Gly Asp Thr Thr Asn Leu Ile Asn Ser 190 195 200 TGG AAC CAG TGG ATC ACA GTG CCA GCC TCC CTA GTC TTC ATG GGG 720 Trp Asn Gln Trp Ile Thr Val Pro Ala Ser Leu Val Phe Met Gly 205 210 215 CTT CCT GCA TCC GAT GCT GCT GCT CCA AGT GGT GGC TTT GTG TCT 765 Leu Pro Ala Ser Asp Ala Ala Ala Pro Ser Gly Gly Phe Val Ser 220 225 230 ACT GAT GTG TTA ACT TCT CAA GTT CTT CCT GTC ATA AAA CAG TCT 810 Thr Asp Val Leu Thr Ser Gln Val Leu Pro Val Ile Lys Gln Ser 235 240 245 TCA AAG TAT GGT GGA GTC ATG CTC TGG GAC AGG TTC AAC GAC GTT 855 Ser Lys Tyr Gly Gly Val Met Leu Trp Asp Arg Phe Asn Asp Val 250 255 260 CAA ACT GGT TAC AGT GCT GCT ATT ATT GGA AGT ATT AAT TGA 897 Gln Thr Gly Tyr Ser Ala Ala Ile Ile Gly Ser Ile Asn *** 265 270 で表されることを特徴とする請求項４に記載のシカクマ
メ由来キチナ−ゼ前駆体をコ−ドするＤＮＡ。 - 【請求項６】 下記する核酸塩基配列（III）［配列
５］： ATTC GAGGA TCCGG GTACC ATGGA TCAGA GCCTA GGAAC 39 ATG GAA TCC TTG AAG AAA GCC TCA CTT GTC TTA TTT CCT ATC TTG 84 Met Glu Ser Leu Lys Lys Ala Ser Leu Val Leu Phe Pro Ile Leu -25 -20 -15 GTC CTT TCC CTA TTC AAC CAT TCC AAT GCT GCA GGA ATA GCT GTT 129 Val Leu Ser Leu Phe Asn His Ser Asn Ala Ala Gly Ile Ala Val -10 -5 1 5 TAC TGG GGC CAA AAC GGT GGA GAA GGA TCC TTA GCA GAC ACT TGC 174 Tyr Trp Gly Gln Asn Gly Gly Glu Gly Ser Leu Ala Asp Thr Cys 10 15 20 AAC ACT GGA AAC TAC GAA TTT GTG AAC ATA GCT TTC TTG TCC ACT 219 Asn Thr Gly Asn Tyr Glu Phe Val Asn Ile Ala Phe Leu Ser Thr 25 30 35 TTT GGC AGT GGC CAA ACT CCC CAA CTC AAC CTT GCT GGT CAT TGT 264 Phe Gly Ser Gly Gln Thr Pro Gln Leu Asn Leu Ala Gly His Cys 40 45 50 GAC CCC AGC AGC AAT GGC TGC ACT GGC TTC AGC AGT GAG ATC CAA 309 Asp Pro Ser Ser Asn Gly Cys Thr Gly Phe Ser Ser Glu Ile Gln 55 60 65 ACT TGT CAA AAC AGA GGG ATC AAA GTG TTG CTA TCT CTT GGA GGC 354 Thr Cys Gln Asn Arg Gly Ile Lys Val Leu Leu Ser Leu Gly Gly 70 75 80 AGT GCT GGA ACC TAC TCC CTC AAC TCA GCT GAT GAT GCC ACA CAA 399 Ser Ala Gly Thr Tyr Ser Leu Asn Ser Ala Asp Asp Ala Thr Gln 85 90 95 CTT GCA AAC TAC CTT TGG GAC AAT TTC CTC GGA GGC CAA TCT GGA 444 Leu Ala Asn Tyr Leu Trp Asp Asn Phe Leu Gly Gly Gln Ser Gly 100 105 110 TCA AGA CCA TTA GGT GAT GCT GTC TTA GAT GGG GTT GAC TTT GAC 489 Ser Arg Pro Leu Gly Asp Ala Val Leu Asp Gly Val Asp Phe Asp 115 120 125 ATT GAA TCT GGT GGA AGT AAC CAT TAT GAT GAT CTT GCA AGG GCA 534 Ile Glu Ser Gly Gly Ser Asn His Tyr Asp Asp Leu Ala Arg Ala 130 135 140 CTG AAT AGC TTG AGT TCA CAA AAG AAG GTG TAC TTG TCT GCA GCC 579 Leu Asn Ser Leu Ser Ser Gln Lys Lys Val Tyr Leu Ser Ala Ala 145 150 155 CCA CAG TGC ATA ATC CCT GAT CAA CAC TTG GAT GCA GCC ATC CAA 624 Pro Gln Cys Ile Ile Pro Asp Gln His Leu Asp Ala Ala Ile Gln 160 165 170 ACG GGG CTT TTT GAC TAT GTG TGG GTT CAG TTC TAC AAC AAC CCT 669 Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Val Trp Val Gln Phe Tyr Asn Asn Pro 175 180 185 TCA TGC CAA TAC TCC AAT GGA GAC ACA ACC AAT TTG ATC AAT TCA 624 Ser Cys Gln Tyr Ser Asn Gly Asp Thr Thr Asn Leu Ile Asn Ser 190 195 200 TGG AAC CAG TGG ATC ACA GTG CCA GCC TCC CTA GTC TTC ATG GGG 730 Trp Asn Gln Trp Ile Thr Val Pro Ala Ser Leu Val Phe Met Gly 205 210 215 CTT CCT GCA TCC GAT GCT GCT GCT CCA AGT GGT GGC TTT GTG TCT 775 Leu Pro Ala Ser Asp Ala Ala Ala Pro Ser Gly Gly Phe Val Ser 220 225 230 ACT GAT GTG TTA ACT TCT CAA GTT CTT CCT GTC ATA AAA CAG TCT 810 Thr Asp Val Leu Thr Ser Gln Val Leu Pro Val Ile Lys Gln Ser 235 240 245 TCA AAG TAT GGT GGA GTC ATG CTC TGG GAC AGG TTC AAC GAC GTT 855 Ser Lys Tyr Gly Gly Val Met Leu Trp Asp Arg Phe Asn Asp Val 250 255 260 CAA ACT GGT TAC AGT GCT GCT ATT ATT GGA AGT ATT AAT TGA 897 Gln Thr Gly Tyr Ser Ala Ala Ile Ile Gly Ser Ile Asn *** 265 270 TTAAT TAGTT ATAAG CCAAC TATGA CATTC ACTTA TTTAA ATAAT 942 CACCA CCACT AGTTG GTATT GTTAC TATAC ACTAT ACATT GAATG 987 TGCTG TCAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA 1032 AAAAA AAGGG GGGGG GGCCA TGGTA CCCGG ATCCT CGAAT TC 1074 で表されることを特徴とする請求項５に記載のシカクマ
メ由来キチナ−ゼ前駆体をコ−ドするＤＮＡ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7273735A JPH0994089A (ja) | 1995-09-28 | 1995-09-28 | シカクマメ由来キチナ−ゼ及びシカクマメ由来キチナ−ゼをコ−ドするｄｎａ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7273735A JPH0994089A (ja) | 1995-09-28 | 1995-09-28 | シカクマメ由来キチナ−ゼ及びシカクマメ由来キチナ−ゼをコ−ドするｄｎａ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0994089A true JPH0994089A (ja) | 1997-04-08 |
Family
ID=17531841
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7273735A Pending JPH0994089A (ja) | 1995-09-28 | 1995-09-28 | シカクマメ由来キチナ−ゼ及びシカクマメ由来キチナ−ゼをコ−ドするｄｎａ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0994089A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100396209B1 (ko) * | 2000-09-26 | 2003-09-17 | 학교법인고려중앙학원 | 고추 한별 품종의 키틴가수분해효소 유전자 및 이를이용한 식물병 저항성 탐색방법 |
| CN113684197A (zh) * | 2021-09-13 | 2021-11-23 | 山东省花生研究所 | 一种花生几丁质酶及其应用 |
-
1995
- 1995-09-28 JP JP7273735A patent/JPH0994089A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100396209B1 (ko) * | 2000-09-26 | 2003-09-17 | 학교법인고려중앙학원 | 고추 한별 품종의 키틴가수분해효소 유전자 및 이를이용한 식물병 저항성 탐색방법 |
| CN113684197A (zh) * | 2021-09-13 | 2021-11-23 | 山东省花生研究所 | 一种花生几丁质酶及其应用 |
| CN113684197B (zh) * | 2021-09-13 | 2023-09-15 | 山东省花生研究所 | 一种花生几丁质酶及其应用 |
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