CN101307100B

CN101307100B - 一种抗菌肽的多肽片段及其核苷酸序列和应用

Info

Publication number: CN101307100B
Application number: CN2007100407272A
Authority: CN
Inventors: 胡又佳; 陈国泽; 杨涛; 朱春宝
Original assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry
Current assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry
Priority date: 2007-05-16
Filing date: 2007-05-16
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2027-05-16
Also published as: CN101307100A

Abstract

本发明公开了一种来自采采蝇(Glossina morsitans morsitans)抗菌肽Attacin的多肽片段attP1，其具有序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列及编码其的核苷酸序列。本发明也公开了含有该核苷酸序列的表达载体、转化体以及制备重组多肽片段attP1的方法。本发明多肽片段attP1有着与全长的抗菌肽Attacin相似的抗菌活性，但分子量由原来的23.0KDa减少到13.8KDa，从而得到一种新的、抗原性减弱的抗菌肽，更有利于制作医药产品、饲料添加剂、保鲜剂和化妆品等。

Description

一种抗菌肽的多肽片段及其核苷酸序列和应用

技术领域

本发明涉及一种来自采采蝇(Glossina morsitans morsitans)抗菌肽Attacin的多肽片段attP1，编码该多肽片段attP1的DNA序列，含有该DNA序列的表达载体、转化体和重组多肽片段attP1的制备方法，以及多肽片段attP1的用途。

背景技术

抗菌肽是20世纪70年代研究昆虫免疫系统时发现的一类具有抗菌特性的小分子多肽。昆虫抗菌肽具有分子量小、热稳定高、水溶性好、杀菌力强、抗菌谱广等优点，对细菌、真菌、病毒、肿瘤细胞均有明显的杀伤作用，而对正常真核细胞无毒害作用。这就使得研究人员对抗菌肽产生了浓厚的兴趣，并在诱导释放、抗菌机理、结构功能、重组表达等各个方面进行了深入的研究。

随着传统抗生素长期广泛使用及人为滥用等因素，细菌及其他微生物的耐药性问题日趋严重，一些常见的临床致病菌的耐药情况尤为突出。耐药菌问题已成为当今全球的公共健康问题。人们在对传统抗生素不断进行改造的同时，也积极研究和开发新型抗生素。抗菌肽具有对病原微生物的广谱性、选择毒性、不易产生耐药性等特点，被认为是解决细菌耐药性问题的有效途径之一。现已有将抗菌肽应用于保鲜剂、化妆品如护肤霜等方面的报道。

此外，随着人们对食品和环境质量的要求越来越高，对抗生素的副作用认识日益加深，抗生素在饲料业中的应用，已面临着淘汰或禁用的局面。应用无毒无公害的新型抗菌剂代替抗生素作饲料添加剂，已成为当前国内外饲料学科的一项重要内容。因此应用生物技术研究与开发新型抗菌剂——抗菌肽也是我国饲料科学界一项紧迫的任务。

Attacin是一类昆虫抗菌肽，一般由180～270个氨基酸残基组成。由于提取生物体内的天然抗菌肽工序繁、得率低，因此，进行抗菌肽的基因克隆表达研究并改良出具有无毒性、高效的新型抗菌肽显得至关重要。尤其是Attacin分子量比较大，作为药用的时候，具有比较强的免疫原性，故应用基因重组技术进行改造，降低分子量显得尤为迫切。

发明内容

本发明要解决的技术问题即是提供一种抗菌肽Attacin的多肽片段及编码其核苷酸序列，该多肽片段具有与全长Attacin相当的抗菌活性。

本发明人经过试验筛选出来自采采蝇(Glossina morsitans morsitans)的抗菌肽Attacin，其全长由180个氨基酸组成，cDNA序列共有540bp(GenBankAccession#：AY607104)。本发明截取其1-297位核苷酸序列，得到截短的多肽片段attP1的编码基因，然后将其导入表达载体，再转化宿主细胞得到转化体，培养转化体进行表达，利用载体上附加的His-tag进行截短的多肽片段attP1的分离纯化以及western blot验证，最后对纯化的attP1多肽进行抗菌活性实验。抗菌活性试验结果表明，截短的多肽片段attP1有着与全长的抗菌肽attacin相似的抗菌活性。

因此，本发明一种来自采采蝇(Glossina morsitans morsitans)抗菌肽Attacin的多肽片段attP1，其具有序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，共有99个氨基酸组成。显然，SEQ ID No.2是其成熟肽的氨基酸序列，根据本发明，所说的“多肽片段attP1”当然也包括本领域技术人员所知的将SEQID No.2序列中的氨基酸经过一个或多个氨基酸残基的取代或添加且具有相同酶活性的由其衍生的多肽或蛋白质，比如在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸，如与载体编码的氨基酸融合、前导序列、分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列等；一个或多个保守性氨基酸残基被取代；或成熟多肽与另一化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，如聚乙二醇)融合所形成的多肽；也可以是一个或氨基酸残基中具有取代基团的多肽。

其次，本发明还提供一种核苷酸序列，其是下列核苷酸序列之一：

1)编码上述多肽片段attP1的cDNA，可以是抗菌肽Attacin第1-297位核苷酸序列，如序列表中SEQ ID No.1所示；

2)与核苷酸序列1)完全互补的核苷酸序列。

再者，本发明还提供包括上述核苷酸序列的表达载体；优选地，该表达载体是由所述核苷酸序列连接于质粒pET28a构成的质粒pET28a-attP1。

另外，本发明提供了包括上述核苷酸序列的转化体。

本发明还提供一种重组上述多肽片段attP1的制备方法，其包括用上述表达载体转化宿主细胞，培养转化体，获得重组的多肽片段attP1。

其中，所述的宿主细胞优选为大肠杆菌，例如大肠杆菌E.coli BL21(DE3)菌株，相应地，得到的转化体为pET28a-attP1/E.coli BL21(DE3)。

本发明的多肽片段attP1有着与全长的抗菌肽Attacin相似的抗菌活性，但分子量由原来的23.0KDa减少到13.8KDa，从而得到一种新的、抗原性减弱的抗菌肽，更有利于制备成各种产品，例如抗菌药物、饲料添加剂、保鲜剂、化妆品等。

附图说明

图1为质粒pET28a-attP1的结构示意图。

图2显示本发明重组的多肽片段attP1的SDS-PAGE(左图)以及westernblot验证结果(右图)。其中，第1泳道为IPTG诱导前的基因工程菌pET28a-attP1/E.coli BL21(DE3)菌体，第2泳道为IPTG诱导3小时后的基因工程菌pET28a-attP1/E.coli BL21(DE3)菌体，第3泳道为诱导3小时后基因工程菌pET28a-attP1/E.coli BL21(DE3)超声破壁、离心后上清液，第4泳道为诱导3小时后基因工程菌pET28a-attP1/E.coli BL21(DE3)超声破壁、离心后沉淀，第5泳道为分离纯化后得到的attP1，M泳道为蛋白分子量标准。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。

实施例1多肽片段attP1编码基因的克隆和表达载体的构建

1.1截短的多肽片段attP1的编码基因的化学合成

根据报道的来自采采蝇(Glossina morsitans morsitans)的Attacin cDNA序列(GenBank Accession#：AY607104)，由上海生物工程技术服务有限公司化学合成其1～297核苷酸序列，得到截短的attP1的编码基因。

1.2表达载体的构建

以截短的attP1的编码基因为模版，利用以下两条引物进行PCR扩增。

attF5’-TTGGATCCCAATTTGGCGGCACAGTATC-3’(带下划线部分为BamH I酶切位点)

attRP5’-TCGAATTCTCAATGGGTGCGACTGTGAAAAG-3’(带下划线部分为EcoR I酶切位点)

20μl的PCR扩增体系中各组分的终浓度：0.1ng模板，0.5μmol/L引物，0.25mmol/L dNTP，10mmol/L Tris-Cl，50mmol/L KCl，0.75mmol/LMgCl₂，2.5U Taq酶，反应条件为94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸30秒，进行30个循环后72℃再延伸10分钟，最后4℃保存待用。PCR扩增产物经1％琼脂糖电泳回收后经BamH I与EcoR I酶切后插入pET-28a(+)(购自Novagen)的相应酶切位点中，构建了质粒pET28a-attP1，如图1所示。转化E.coli DH5α并测序，序列如SEQ ID No.1所示，其对应的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

实施例2转化体的构建

将实施例1的表达载体pET28a-attP1再转化E.coli BL21(DE3)，在含100μg/ml氨苄青霉素的LB抗性平板上长出来的转化子，提取质粒后用BamHI与EcoR I双酶切验证，得到转化体——基因工程菌pET28a-attP1/E.coliBL21(DE3)。

实施例3重组多肽片段attP1的表达和分离纯化

取1ml过夜培养的实施例2的转化体pET28a-attP1/E.coli BL21(DE3)接种含100μg/ml卡那霉素的100ml LB培养基，在37℃培养2小时使OD₆₀₀到达0.5～0.7，这时加入IPTG至终浓度1mM，诱导3小时后离心收集菌体沉淀。菌体沉淀加4ml的NTA-20溶液[20mM Tris-Cl，500mM NaCl，10％(v/v)甘油，20mM咪唑]重悬，超声破壁后4℃离心20分钟，取上清加入0.5ml的Ni-NTA树脂(购自申能博彩公司)，振荡1小时后装入层析柱(Novagen，Cat.No.69673-3)。待上清从柱子上流干后用15ml的NTA-20洗柱，使非特异结合的杂蛋白洗下来。最后用2ml的NTA-200[20mM Tris-Cl，500mMNaCl，10％(v/v)甘油，200mM咪唑]洗脱目的蛋白。100ml培养物中可以获得约0.5mg目的蛋白。目的蛋白用SDS-PAGE以及western blot验证，结果如图2所示。

实施例4多肽片段attP1的透析和浓缩

把实施例3分离纯化到的目的蛋白加到透析袋(购自SIGMA公司，截留分子量12KD)中，4℃透析24小时，其中更换一次透析液。透析后的目的蛋白用超滤管(购自MILLIPORE公司，Amicon Ultra10K device)超滤浓缩，然后过滤除菌待用。

实施例5抗菌活性试验

将过夜培养的大肠埃希菌(Escherichia coli)ATCC15222、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)ATCC27508稀释到约2×106cfu/ml，然后加入等体积的实施例4的过滤除菌的attP1多肽蛋白。37℃孵育2小时后，稀释1000倍后涂布LB agar平板，37℃培养48小时后数单菌落，结果如下：

可见，本发明多肽片段attP1也具有抗菌活性，且与其全长的抗菌肽Attacin的抗菌活性基本相当。

序列表

<110>上海医药工业研究院

<120>一种抗菌肽的多肽片段及其核苷酸序列和应用

<130>P4-071111C

<160>4

<170>PatentIn version3.3

<210>1

<211>300

<212>DNA

<213>采采蝇(Glossina morsitans morsitans)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(300)

<400>1

<210>2

<211>99

<212>PRT

<213>采采蝇(Glossina morsitans morsitans)

<400>2

<210>3

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物

<400>3

<210>4

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物

<400>4

Claims

1.一种来自采采蝇(Glossina morsitans morsitans)抗菌肽Attacin的多肽片段attP1，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。

2.一种分离的核苷酸序列，其是下列核苷酸序列之一：

1)编码如权利要求1所述的多肽片段attP1的核苷酸序列；

2)与核苷酸序列1)完全互补的核苷酸序列。

3.如权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于其序列是序列表中SEQID No.1所示的碱基序列。

4.包括编码氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的多肽片段attP1的核苷酸序列的表达载体。

5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于该表达载体是由所述核苷酸序列连接于质粒pET28a构成的质粒pET28a-attP1。

6.包括如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的表达载体。

7.如权利要求6所述的表达载体，其特征在于该表达载体是由所述核苷酸序列连接于质粒pET28a构成的。

8.包括如权利要求2所述的核苷酸序列的转化体。

9.包括如权利要求3所述的核苷酸序列的转化体。

10.一种重组多肽片段attP1的制备方法，其包括用权利要求4所述的表达载体转化宿主细胞，培养转化体，获得重组的多肽片段attP1。

11.如权利要求10所述的制备方法，其特征在于所述的宿主细胞为大肠杆菌。

12.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于所述的宿主细胞为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)菌株。

13.如权利要求1所述的多肽片段attP1在制备抗菌药物、饲料添加剂、保鲜剂或化妆品中的应用。