CN116547305A - 针对程序性死亡-1蛋白的单克隆抗体及其在医学中的用途 - Google Patents

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亚历山大·穆伊克
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Abstract

本公开内容涉及具有与免疫检查点蛋白程序性死亡‑1(PD‑1)例如人PD‑1结合之能力的抗体，或者编码这样的抗体的核酸。本公开内容还涉及包含所述抗体或核酸的组合物或试剂盒，以及这些抗体或核酸或组合物在医学领域优选在免疫治疗领域中例如以用于治疗癌症的用途。本发明还涉及用于在对象中诱导免疫应答的方法，其包括向所述对象提供具有与免疫检查点蛋白PD‑1(例如人PD‑1)结合之能力的抗体、或者编码这样的抗体的核酸、或者包含所述抗体或核酸的组合物。

Description

针对程序性死亡-1蛋白的单克隆抗体及其在医学中的用途
技术领域
本发明涉及具有与免疫检查点蛋白程序性死亡-1(programmed death-1，PD-1)例如人PD-1结合之能力的抗体，或者编码这样的抗体的核酸。本发明还涉及包含所述抗体或核酸的组合物或试剂盒，以及这些抗体或核酸或组合物在医学领域优选在免疫治疗领域中用于治疗癌症的用途。本发明还涉及用于在对象中诱导免疫应答的方法，其包括向所述对象提供具有与免疫检查点蛋白PD-1(例如人PD-1)结合之能力的抗体、或编码这样的抗体的核酸、或包含所述抗体或核酸的组合物。
背景技术
免疫治疗旨在增强或诱导患者中的特异性免疫应答以控制感染性或恶性疾病。日益增长数目的病原体相关抗原和肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)的鉴定导致广泛收集了用于免疫治疗的合适靶标。可通过主动或被动免疫接种策略特异性地靶向呈递来源于这些抗原的免疫原性肽(表位)的细胞。主动免疫接种倾向于诱导和扩增患者中的抗原特异性T细胞，其能够特异性识别并杀伤病变细胞。相比之下，被动免疫接种可依赖于在体外扩增的和任选地遗传改造的T细胞的过继性转移(过继性T细胞治疗)。
在脊椎动物中，免疫系统的进化产生基于两种防御类型(固有免疫和过继性免疫)的高度有效网络。与依赖于识别与病原体相关的共同分子模式的不变受体(invariantreceptor)的进化上古老的先天免疫系统相反，过继性免疫基于B细胞(B淋巴细胞)和T细胞(T淋巴细胞)上的高度特异性抗原受体和克隆选择(clonal selection)。免疫系统在癌症的发生、进展和治疗期间发挥至关重要的作用。CD8+T细胞和NK细胞可直接裂解肿瘤细胞，并且这些细胞的高肿瘤浸润通常被认为有利于多种肿瘤疾病的结局。CD4+T细胞通过IFNγ分泌或抗原呈递树突细胞(dendritic cell，DC)许可而有助于抗肿瘤免疫应答，其继而致敏和活化CD8+T细胞(Kreiter S.et al.Nature 520，692-6(2015))。CD8+T细胞对肿瘤细胞的识别和消除取决于通过I类主要组织相容性复合体(Major HistocompatibilityComplex，MHC)的抗原呈递。抗原特异性T细胞应答可通过疫苗接种来引发。可通过施用疫苗RNA即编码针对其将诱导免疫应答的抗原或表位的RNA来实现疫苗接种。
T细胞的活化不仅需要通过抗原受体(TCR)进行刺激，而且还需要通过缀合的刺激分子组(例如CD28)进行另外的刺激诱导。癌细胞可通过上调抑制性免疫检查点蛋白(例如T细胞上的PD-1和CTLA-4或肿瘤细胞、肿瘤间质或肿瘤微环境中其他细胞上的PD-L1)来避免和抑制免疫应答。已知CTLA4和PD-1传递抑制T细胞活化的信号。用单克隆抗体阻断这些蛋白质的活性，并因此恢复T细胞功能，已经实现了针对癌症的突破性治疗。
PD-1(也称为CD279)是在活化的T细胞、B细胞和单核细胞表面上表达的免疫调节受体。蛋白质PD-1具有两种天然存在的配体，称为PD-L1(也称为CD274)和PD-L2(也称为CD273)。广泛多种癌症表达PD-L1，包括黑素瘤、肺癌、肾癌、膀胱癌、食管癌、胃癌和其他癌症。因此，在癌症中，PD-1/PD-L1系统可通过PD-L1与PD-1的相互作用抑制T淋巴细胞的增殖、细胞因子的释放和细胞毒性，从而为癌细胞提供机会来避免T细胞介导的免疫应答。
适于调节PD-1/PD-L1轴活性的单克隆抗体是已知的。PD-1/PD-L1相互作用可被派姆单抗(pembrolizumab)(也称为MK-3475、兰洛利珠单抗(lambrolizumab)或Keytruda)抑制。适于该目的的另一种单克隆抗体是纳武单抗(nivolumab)(也称为ONO-4538、BMS-936558或Opdivo)。
针对癌症的基于抗体的治疗与常规药物相比具有更高特异性和更低副作用特性的潜力，并因此可相对于常规治疗是有利的。但通过激活免疫系统，免疫检查点抑制剂也可能在一些患者中引起自身免疫性副作用。另一些患者可能对治疗无响应。
此外，抗PD-1抗体具有减轻自身免疫病而不附带抑制正常免疫力的潜力。例如，与免疫毒素偶联的抗PD-1结合片段能够延迟自身免疫性糖尿病的疾病发作，并减轻小鼠中自身免疫性脑脊髓炎模型中的症状(Zhao P.et al.Nat Biomed Eng.3(4)：292-305(2019))。
因此，尽管具有与免疫检查点抑制剂治疗相关的显著益处，但仍然存在开发靶向这些检查点的改进的抗体并为免疫治疗(特别是癌症免疫治疗)提供另外的益处的未满足需求。
发明概述
本发明总体上提供了可用作用于治疗和/或预防疾病，例如癌症或感染性疾病的治疗剂的抗体。所述治疗旨在激活免疫系统和/或诱导免疫应答。
本发明的抗体显示出与PD-1，优选与人PD-1的结合特征，以及阻断PD-1/PD-L1相互作用的能力，因此使得它们能够诱导免疫应答。
本发明的抗体可具有以下特性中的一种或更多种：本发明的抗体(i)与PD-1结合，优选与其特异性结合；(ii)可对免疫细胞上的PD-1具有结合特性；(iii)可对PD-1表位具有结合特性；(iv)可对非人PD-1变体，特别是对来自小鼠、大鼠、兔和灵长类的PD-1变体具有结合特性；(v)可防止或降低PD-1对抑制性信号的诱导；(vi)可抑制PD-1的配体与PD-1的相互作用/结合，优选配体PD-L1与PD-1的相互作用/结合，从而阻断抑制性PD-1/PD-L1轴，例如，它们可抑制人PD-L1与人PD-1的结合；(vii)可抑制PD-L1或PD-L2的免疫抑制信号；(viii)可增强或启动免疫功能，优选通过增强或启动T细胞介导的免疫应答，优选通过诱导CD8+细胞增殖；(ix)可抑制癌症增殖；(x)可使肿瘤细胞耗竭和/或抑制癌症转移；和/或(xi)可使免疫细胞耗竭和/或减轻自身免疫病。
在下文中给出了尤其在序列表中示出的序列和SEQ ID NO。此外，参考了本文中所述的本发明抗体的一些具体实例，但本发明不限于此：MAB-19-0202、MAB-19-0208、MAB-19-0217、MAB-19-0223、MAB-19-0233、MAB-19-0603、MAB-19-0608、MAB-19-0613、MAB-19-0618、MAB-19-0583、MAB-19-0594和MAB-19-0598。本发明的这些示例性而非限制性抗体在本文中通过参考抗体的名称来命名。
在一个方面中，本发明涉及具有与PD-1结合的能力并从而优选地抑制PD-1的免疫抑制信号的抗体。
在本发明的另一个方面中，所述抗体使活化的免疫细胞耗竭，并从而改善自身免疫病。
本发明的抗体包含含有互补决定区3(HCDR3)的重链可变区(VH)，所述互补决定区3(HCDR3)具有或包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5中任一者中所示的序列。在一个实施方案中，重链可变区的HCDR3具有或包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10中任一者中所示的序列。
在一个实施方案中，所述抗体的重链可变区(VH)包含互补决定区2(HCDR2)，所述互补决定区2(HCDR2)具有或包含SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15中任一者中所示的序列。在一个实施方案中，HCDR2具有或包含SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20中任一者中所示的序列。
在一个实施方案中，所述抗体的重链可变区(VH)包含互补决定区1(HCDR1)，所述互补决定区1(HCDR1)具有或包含选自SYN、RYY、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22中所示的序列。在一个实施方案中，HCDR1具有或包含SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQID NO：26或SEQ ID NO：27中任一者中所示的序列。在一个实施方案中，HCDR1具有或包含SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：32中任一者中所示的序列。
在所述抗体的一个实施方案中，所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)，其中HCDR1序列选自具有或包含SYN、SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：28的序列，HCDR2序列选自具有或包含SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：16的序列，并且HCDR3序列选自具有或包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：6的序列。在所述抗体的一个实施方案中，所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)，其中HCDR1序列选自具有或包含RYY、SEQID NO：24或SEQ ID NO：29的序列，HCDR2序列选自具有或包含SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：17的序列，并且HCDR3序列选自具有或包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：7的序列。在所述抗体的一个实施方案中，所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)，其中HCDR1序列选自具有或包含RYY、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：30的序列，HCDR2序列选自具有或包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：18的序列，并且HCDR3序列选自具有或包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：8的序列。在所述抗体的一个实施方案中，所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)，其中HCDR1序列选自具有或包含SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：31的序列，HCDR2序列选自具有或包含SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：19的序列，并且HCDR3序列选自具有或包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：9的序列。在所述抗体的一个实施方案中，所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)，其中HCDR1序列选自具有或包含SEQ ID NO：NO：22、SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：32的序列，HCDR2序列选自具有或包含SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：20的序列，并且HCDR3序列选自具有或包含SEQID NO：5或SEQ ID NO：10的序列。
在所述抗体的一个实施方案中，所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别是或包含SYN、SEQ ID NO：11和SEQ IDNO：1。在所述抗体的一个实施方案中，所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别是或包含RYY、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：2。在所述抗体的一个实施方案中，所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别是或包含RYY、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：3。在所述抗体的一个实施方案中，所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别是或包含SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：14和SEQ IDNO：4。在所述抗体的一个实施方案中，所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别是或包含SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：5。
在一个实施方案中，所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别是或包含SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：16和SEQ IDNO：1。在一个实施方案中，所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别是或包含SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：2。在一个实施方案中，所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别是或包含SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：3。在一个实施方案中，所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别是或包含SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：4。在一个实施方案中，所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别是或包含SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：5。
在一个实施方案中，所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别是或包含SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：11和SEQ IDNO：6。在一个实施方案中，所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别是或包含SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：7。在一个实施方案中，所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别是或包含SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：8。在一个实施方案中，所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别是或包含SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：9。在一个实施方案中，所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别是或包含SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：10。
在上述方面的一个实施方案和另一个方面中，本发明涉及具有与PD-1结合之能力并从而优选地抑制PD-1的免疫抑制信号的抗体。所述抗体包含含有互补决定区3(LCDR3)的轻链可变区(VL)，所述互补决定区3(LCDR3)具有或包含SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQID NO：35、SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：37中任一者中所示的序列。
在一个实施方案中，所述抗体的轻链可变区(VL)包含互补决定区2(LCDR2)，所述互补决定区2(LCDR2)具有或包含选自QAS或DAS的序列。在一个实施方案中，所述轻链可变区(VL)包含互补决定区2(LCDR2)，所述互补决定区2(LCDR2)具有或含有SEQ ID NO：38、SEQID NO：39、SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：41中任一者中所示的序列。
在一个实施方案中，所述抗体的轻链可变区(VL)包含互补决定区1(LCDR1)，所述互补决定区1(LCDR1)具有或包含SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：46中任一者中所示的序列。在一个实施方案中，所述轻链可变区(VL)包含互补决定区1(LCDR1)，所述互补决定区1(LCDR1)具有或含有SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：51中任一者中所示的序列。
在一个实施方案中，所述抗体包含含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中LCDR1序列选自具有或包含SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：47的序列，LCDR2序列选自具有或包含QAS或SEQ ID NO：38的序列，并且LCDR3序列是具有或包含SEQ ID NO：33的序列。在一个实施方案中，所述抗体包含含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中LCDR1序列选自具有或包含SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：48的序列，LCDR2序列选自具有或包含DAS或SEQ ID NO：39的序列，并且LCDR3序列是具有或包含SEQ ID NO：34的序列。在一个实施方案中，所述抗体包含含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中LCDR1序列选自具有或包含SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：49的序列，LCDR2序列选自具有或包含DAS或SEQ ID NO：39的序列，并且LCDR3序列是具有或包含SEQ ID NO：35的序列。在一个实施方案中，所述抗体包含含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中LCDR1序列选自具有或包含SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：50的序列，LCDR2序列选自具有或包含DAS或SEQ IDNO：40的序列，并且LCDR3序列是具有或包含SEQ ID NO：36的序列。在一个实施方案中，所述抗体包含含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中LCDR1序列选自具有或包含SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：51的序列，LCDR2序列选自具有或包含DAS或SEQ ID NO：41的序列，并且LCDR3序列是具有或包含SEQ ID NO：37的序列。
在一个实施方案中，所述抗体包含含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别是或包含SEQ ID NO：42、QAS和SEQ ID NO：33。在一个实施方案中，所述抗体包含含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别是或包含SEQ ID NO：43、DAS和SEQ ID NO：34。在一个实施方案中，所述抗体包含含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别是或包含SEQ ID NO：44、DAS和SEQ ID NO：35。在一个实施方案中，所述抗体包含含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别是或包含SEQ ID NO：45、DAS和SEQ ID NO：36。在一个实施方案中，所述抗体包含含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别是或包含SEQ ID NO：46、DAS和SEQ ID NO：37。
在一个实施方案中，所述抗体包含含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别是或包含SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：38和SEQ IDNO：33。在一个实施方案中，所述抗体包含含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别是或包含SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：39和SEQ IDNO：34。在一个实施方案中，所述抗体包含含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别是或包含SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：39和SEQ IDNO：35。在一个实施方案中，所述抗体包含含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别是或包含SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：40和SEQ IDNO：36。在一个实施方案中，所述抗体包含含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别是或包含SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：41和SEQ IDNO：37。
在另一个方面中，本发明涉及具有与PD-1结合之能力的抗体，其中所述抗体包含本发明上述第一方面的重链可变区(VH)和/或本发明上述第二方面的轻链可变区(VL)。
在上述方面的一个实施方案中，所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)以及含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别包含或具有SYN、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：1中所示的序列，并且LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：42、QAS和SEQ ID NO：33中所示的序列。这样的抗体的一个具体但非限制性实例是MAB-19-0202。
在上述方面的一个实施方案中，所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)以及含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：1中所示的序列，并且LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：33中所示的序列。这样的抗体的一个具体但非限制性实例是MAB-19-0202。
在上述方面的一个实施方案中，所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)以及含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：6中所示的序列，并且LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：42、QAS和SEQ ID NO：33中所示的序列。这样的抗体的一个具体但非限制性实例是MAB-19-0202。
在上述方面的一个实施方案中，所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)以及含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别包含或具有RYY、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：2中所示的序列，并且LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：43、DAS和SEQ ID NO：34中所示的序列。这样的抗体的一个具体但非限制性实例是MAB-19-0208。
在上述方面的一个实施方案中，所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)以及含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：2中所示的序列，并且LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：34中所示的序列。这样的抗体的一个具体但非限制性实例是MAB-19-0208。
在上述方面的一个实施方案中，所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)以及含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：7中所示的序列，并且LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：43、DAS和SEQ ID NO：34中所示的序列。这样的抗体的一个具体但非限制性实例是MAB-19-0208。
在上述方面的一个实施方案中，所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)以及含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别包含或具有RYY、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：3中所示的序列，并且LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：44、DAS和SEQ ID NO：35中所示的序列。这样的抗体的一个具体但非限制性实例是MAB-19-0217。
在上述方面的一个实施方案中，所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)以及含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：3中所示的序列，并且LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：35中所示的序列。这样的抗体的一个具体但非限制性实例是MAB-19-0217。
在上述方面的一个实施方案中，所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)以及含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：8中所示的序列，并且LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：44、DAS和SEQ ID NO：35中所示的序列。这样的抗体的一个具体但非限制性实例是MAB-19-0217。
在上述方面的一个实施方案中，所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)以及含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：4中所示的序列，并且LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：45、DAS和SEQ ID NO：36中所示的序列。这样的抗体的一个具体但非限制性实例是MAB-19-0223。
在上述方面的一个实施方案中，所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)以及含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：4中所示的序列，并且LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：36中所示的序列。这样的抗体的一个具体但非限制性实例是MAB-19-0223。
在上述方面的一个实施方案中，所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)以及含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：9中所示的序列，并且LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：45、DAS和SEQ ID NO：36中所示的序列。这样的抗体的一个具体但非限制性实例是MAB-19-0223。
在上述方面的一个实施方案中，所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)以及含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：5中所示的序列，并且LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：46、DAS和SEQ ID NO：37中所示的序列。这样的抗体的一个具体但非限制性实例是MAB-19-0233。
在上述方面的一个实施方案中，所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)以及含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：5中所示的序列，并且LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：37中所示的序列。这样的抗体的一个具体但非限制性实例是MAB-19-0233。
在上述方面的一个实施方案中，所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)以及含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：10中所示的序列，并且LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：46、DAS和SEQ ID NO：37中所示的序列。这样的抗体的一个具体但非限制性实例是MAB-19-0233。
在上述方面的一个实施方案中，如本文中所述的包含一个或更多个CDR、CDR组或CDR组之组合的本发明的抗体包含所述CDR及其间插框架区(intervening frameworkregion)(本文中也称为框架区或FR)或所述框架区的部分。优选地，该部分将包含至少约50％的第一和第四框架区之一或二者，所述50％为第一框架区的C端50％和第四框架区的N端50％。通过重组DNA技术进行的本发明抗体的构建可导致将N端或C端残基引入由引入的接头编码的可变区，以促进克隆或其他操作步骤，包括引入接头以将本发明的可变区与另一些蛋白质序列(包括免疫球蛋白重链)、其他可变结构域(例如在双抗体的生产中)或蛋白质标签连接。
在上述方面的一个实施方案中，所述抗体包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含与SEQ ID NO：52至SEQ ID NO：56中任一者所示的VH序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在上述方面的一个实施方案中，所述抗体包含重链可变区(VH)，其中VH包含SEQ ID NO：52至SEQ ID NO：56中任一者中所示的序列。
在上述方面的一个实施方案中，所述抗体包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含与SEQ ID NO：57至SEQ ID NO：61中任一者所示的VL序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在上述方面的一个实施方案中，所述抗体包含轻链可变区(VL)，其中VL包含SEQ ID NO：57至SEQ ID NO：61中任一者中所示的序列。
在上述方面的一个实施方案中，所述抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含或具有SEQ ID NO：52中所示的序列，并且VL包含或具有SEQ ID NO：57中所示的序列。这样的抗体的一个具体但非限制性实例是MAB-19-0202。在上述方面的一个实施方案中，所述抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含或具有SEQ IDNO：53中所示的序列，并且VL包含或具有SEQ ID NO：58中所示的序列。这样的抗体的一个具体但非限制性实例是MAB-19-0208。在上述方面的一个实施方案中，所述抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含或具有SEQ ID NO：54中所示的序列，并且VL包含或具有SEQ ID NO：59中所示的序列。这样的抗体的一个具体但非限制性实例是MAB-19-0217。在上述方面的一个实施方案中，抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含或具有SEQ ID NO：55中所示的序列，并且VL包含或具有SEQ ID NO：60中所示的序列。这样的抗体的一个具体但非限制性实例是MAB-19-0223。在上述方面的一个实施方案中，所述抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含或具有SEQ ID NO：56中所示的序列，并且VL包含或具有SEQ ID NO：61中所示的序列。这样的抗体的一个具体但非限制性实例是MAB-19-0233。本发明还涵盖所述重链可变区(VH)和所述轻链可变区(VL)的变体以及这些变体VH和VL的相应组合。
本发明的抗体可来源于不同物种，包括但不限于兔、小鼠、大鼠、豚鼠和人。抗体可以是多克隆的或单克隆的。在一个实施方案或一个优选实施方案中，本发明的抗体是单克隆的。在一个实施方案中，本发明的抗体可包括其中来源于一种物种(优选人)的抗体恒定区与来源于另一物种的抗原结合位点组合的嵌合分子。在一个实施方案中，抗体是单克隆嵌合抗体，其中恒定区优选是人免疫球蛋白恒定部分，例如人IgG1/κ恒定部分。此外，在一个实施方案中，本发明的抗体包括人源化分子，优选单克隆人源化分子，其中来源于非人物种的抗体的抗原结合位点与人来源的恒定区和框架区组合。在一个实施方案中，本发明的抗体包含如本文中所述的一个或更多个CDR、CDR组或CDR组之组合，其在人抗体框架中包含所述CDR。在一个实施方案或一个优选实施方案中，本发明的抗体是单克隆人源化抗体，其中恒定区优选为人免疫球蛋白恒定部分，例如人IgG1/κ恒定部分。
在上述方面的一个实施方案中，所述抗体包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含与SEQ ID NO：62至SEQ ID NO：64中任一者所示的VH序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在上述方面的一个实施方案中，所述抗体包含重链可变区(VH)，其中VH包含SEQ ID NO：62至SEQ ID NO：64中任一者中所示的序列。在上述方面的一个实施方案中，所述抗体包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含与SEQ ID NO：65至SEQ ID NO：70中任一者中所示的VL序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在上述方面的一个实施方案中，所述抗体包含轻链可变区(VL)，其中VL包含SEQ ID NO：65至SEQ ID NO：70中任一者中所示的序列。
本发明涵盖以下所有可能的组合：序列表的SEQ ID NO：62至64中所示的这些优选的重链可变区和序列表的SEQ ID NO：65至70中所示的这些优选的轻链可变区，或这些序列的相应变体。
在一个实施方案中，抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含或具有SEQ ID NO：62中所示的序列，并且VL包含或具有SEQ ID NO：65或SEQ ID NO：66或SEQID NO：67或SEQ ID NO：68中所示的序列，或这些序列的相应变体。例如，本发明的抗体可包含VH和VL，所述VH包含或具有SEQ ID NO：62中所示的序列，或其变体，所述VL包含或具有SEQ ID NO：65中所示的序列，或其变体。这样的抗体的一个具体但非限制性实例是MAB-19-0603。本发明的抗体的另一个实例可包含VH和VL，所述VH包含或具有SEQ ID NO：62中所示的序列，或其变体，所述VL包含或具有SEQ ID NO：66中所示的序列，或其变体。这样的抗体的一个具体但非限制性实例是MAB-19-0608。本发明的抗体的另一个实例可包含VH和VL，所述VH包含或具有SEQ ID NO：62中所示的序列，或其变体，所述VL包含或具有SEQ ID NO：67中所示的序列，或其变体。这样的抗体的一个具体但非限制性实例是MAB-19-0613。本发明的抗体的另一个实例可包含VH和VL，所述VH包含或具有SEQ ID NO：62中所示的序列，或其变体，所述VL包含或具有SEQ ID NO：68中所示的序列，或其变体。这样的抗体的一个具体但非限制性实例是MAB-19-0618。抗体MAB-19-0603、MAB-19-0608、MAB-19-0613和MAB-19-0618来源于MAB-19-0202。本发明还涵盖所述重链可变区(VH)和所述轻链可变区(VL)的变体以及这些变体VH和VL的相应组合。
在一个实施方案中，所述抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含或具有SEQ ID NO：63中所示的序列，或其变体，并且VL包含或具有SEQ ID NO：69或SEQID NO：70中所示的序列，或其相应的变体，或者其中VH包含或具有SEQ ID NO：64中所示的序列，或其变体，并且VL包含或具有SEQ ID NO：70中所示的序列，或其变体。例如，本发明的抗体可包含VH和VL，所述VH包含或具有SEQ ID NO：63中所示的序列，或其变体，所述VL包含或具有SEQ ID NO：69中所示的序列，或其变体。这样的抗体的一个具体但非限制性实例是MAB-19-0583。本发明的抗体的另一个实例可包含VH和VL，所述VH包含或具有SEQ ID NO：64中所示的序列，或其变体，所述VL包含或具有SEQ ID NO：70中所示的序列，或其变体。这样的抗体的一个具体但非限制性实例是MAB-19-0594。本发明的抗体的另一实例可包含VH和VL，所述VH包含或具有SEQ ID NO：63中所示的序列，或其变体，所述VL包含或具有SEQ IDNO：70中所示的序列，或其变体。这样的抗体的一个具体但非限制性实例是MAB-19-0598。抗体MAB-19-0583、MAB-19-0594和MAB-19-0598来源于MAB-19-0233。本发明还涵盖所述重链可变区(VH)和所述轻链可变区(VL)的变体以及这些变体VH和VL的相应组合。
在本发明的所有方面中，本发明的抗体可包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA4、分泌型IgA、IgD和IgE抗体及其组合，其中重链具有不同的同种型和/或亚类。在多个实施方案中，抗体是IgG1抗体，更特别地是IgG1、κ或IgG1、λ同种型(即，IgG1、κ、λ)、IgG2a抗体(例如，IgG2a、κ、λ)、IgG2b抗体(例如，IgG2b、κ、λ)、IgG3抗体(例如，IgG3、κ、λ)或IgG4抗体(例如，IgG4、κ、λ)。例如或在一个优选实施方案中，本发明的抗体，优选单克隆抗体是IgG1、κ同种型或λ同种型，优选包含人IgG1/κ或人IgG1/λ恒定部分，或者所述抗体，优选所述单克隆抗体来源于IgG1，λ(lambda)或IgG1，κ(kappa)抗体，优选来源于人IgG1，λ(lambda)或人IgG1，κ(kappa)抗体。
在本发明的一个实施方案中，结合剂是全长IgG1抗体。在本发明的一个实施方案中，结合剂是全长人IgG1抗体。在本发明的一个实施方案中，结合剂是在恒定区中具有一个或更多个突变的全长人IgG1抗体。
在本发明的一个实施方案中，抗体包含至少一个重链恒定区，其中在至少一个所述恒定区中，在对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234、L235、G237、D265、D270、K322、P329和P331的位置处的一个或更多个氨基酸分别不是L、L、G、D、D、K、P和P。例如，对应于根据EU编号的人IgG1重链中的第234位的氨基酸不是L，但优选选自F或A，并且对应于根据EU编号的人IgG1重链中的第235位的氨基酸不是L，但优选选自E或A。在本发明的一个实施方案中，对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234、L235和D265的位置已被替换。在本发明的一个实施方案中，对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234、L235和P331的位置已被替换。在本发明的一个实施方案中，对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234、L235和P329的位置已被替换。
在一个实施方案中，所述至少一个重链恒定区已被修饰，使得C1q与所述抗体的结合与野生型抗体相比降低，优选降低至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或100％，其中C1q结合优选通过ELISA确定。
在上述方面的一个实施方案中，抗体是单克隆抗体、嵌合或单克隆抗体、人源化抗体，或这样的抗体的片段。抗体可以是完整抗体或其抗原结合片段，包括例如Fab、F(ab’)2、Fv、单链Fv片段或双特异性抗体。此外，抗原结合片段可包含含有以下的结合结构域免疫球蛋白融合蛋白：(i)与免疫球蛋白铰链区多肽融合的结合结构域多肽(例如重链可变区或轻链可变区)，(ii)与铰链区融合的免疫球蛋白重链CH2恒定区，和(iii)与CH2恒定区融合的免疫球蛋白重链CH3恒定区。US 2003/0118592和US 2003/0133939中进一步公开了这样的结合结构域免疫球蛋白融合蛋白。
在上述方面的一个实施方案中，抗体是Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段或单链(scFv)抗体。单链可变片段(scFv)可以是免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)可变区的融合蛋白，与短接头肽，优选具有10至约25个氨基酸的短接头肽连接。接头可富含甘氨酸以用于柔性，也可富含丝氨酸或苏氨酸以用于溶解性，并且可将VH的N端与VL的C端连接，反之亦然。这种蛋白质通常保留了原始免疫球蛋白的特异性，尽管去除了恒定区并引入了接头。
本发明的抗体可能够诱导或可不能够诱导以下中的至少一种：补体依赖性细胞毒性(complement dependent cytotoxicity，CDC)介导的裂解、抗体依赖性细胞毒性(antibody dependent cellular cytotoxicity，ADCC)介导的裂解、凋亡、同型黏附和/或吞噬作用。在一个实施方案中，本发明的抗体诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如对表达PD-1的细胞的至少约20％至40％的CDC介导的裂解，优选约40％至50％的CDC介导的裂解，并且更优选超过50％的CDC介导的裂解。在一个实施方案中，本发明的抗体不诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)。作为替代或补充，为了诱导或不诱导CDC，本发明的抗体可在效应细胞(例如，单核细胞、单个核细胞、NK细胞和PMN)存在下诱导表达PD-1的细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。在一个实施方案中，本发明的抗体不诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。本发明的抗体可具有或可不具有在巨噬细胞存在下诱导凋亡、诱导细胞的同型黏附和/或诱导吞噬作用的能力。本发明的抗体可具有一种或更多种上述功能特性。优选地，本发明的抗体不诱导对表达PD-1的细胞的CDC介导的裂解和ADCC介导的裂解和/或不诱导对表达PD-1的细胞的ADCC介导的裂解。
在上述所有方面的一个实施方案中，能够与抗体结合的PD-1是人PD-1。在一个实施方案中，PD-1具有或包含SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：72中所示的氨基酸序列，或者PD-1具有与SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：72所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，或者是其免疫原性片段。在一个实施方案中，抗体具有与活细胞表面上存在的PD-1的天然表位结合的能力。
在上述方面的一个实施方案中，本发明的抗体可被衍生化、与其他结合特异性连锁或共表达。在另一个实施方案中，本发明的抗体可被衍生化、与另一种功能性分子，例如另一种肽或蛋白质(例如，Fab’片段)连接或与共表达。例如，本发明的抗体可与一种或更多种其他分子实体，例如另一种抗体功能性连接(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价缔合或其他方式)(例如，以产生双特异性或多特异性抗体)。
在上述方面的一个实施方案中，抗体是多特异性抗体，其包含与PD-1结合的第一抗原结合区和至少一个与另一抗原结合的另外的抗原结合区。在一个实施方案中，抗体是双特异性抗体，其包含与PD-1结合的第一抗原结合区和与另一抗原结合的第二抗原结合区。
在一个实施方案中，第一和第二结合臂来源于全长抗体，例如来源于如上所述的全长IgG1、λ(lambda)或IgG1、κ(kappa)抗体。在一个实施方案中，第一和第二结合臂来源于单克隆抗体。
例如或在一个优选实施方案中，第一和/或第二结合臂来源于IgG1、κ同种型或λ同种型，优选包含人IgG1/κ或人IgG1/λ恒定部分。第一和/或第二结合臂可在恒定区中包含一个或更多个突变，例如在对应于根据EU编号的人IgG1重链中的L234、L235、G237、D265、D270、K322、P329和P331之位置的位置处的一个或更多个氨基酸分别不是L、L、G、D、D、K、P和P。
在该方面中，在一个实施方案中，本发明提供了双特异性或多特异性分子，其包含至少一种针对PD-1的第一结合特异性(例如，抗PD-1抗体或其模拟物)，以及针对另一免疫检查点的第二或另外的结合特异性，以抑制或活化/刺激相应的其他检查点。可被靶向的其他检查点抑制剂包括但不限于CTLA4、PD-L1、TIM-3、KIR或LAG-3。可被第二结合特异性靶向的检查点活化剂包括但不限于CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、OX40、GITR或ICOS。双特异性或多特异性抗体或分子中结合特异性的优选组合包括，例如抗PD1和抗PD-L1或抗PD-1和抗CTLA4。
在一个实施方案中，本发明提供了双特异性或多特异性分子，其包含至少一种针对PD-1的第一结合特异性(例如，抗PD-1抗体或其模拟物)，以及针对作为替代或补充上述的第二或另外的结合特异性，提供抗血管生成活性。因此，第二或另外的结合特异性可使得能够靶向血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)或其受体VEGFR，例如VEGFR1、2、3。作为替代或补充，第二结合特异性可使得能够靶向PDGFR、c-Kit、Raf和/或RET。
在一个实施方案中，本发明提供了双特异性或多特异性分子，其包含至少一种针对PD-1的第一结合特异性(例如，抗PD-1抗体或其模拟物)，以及靶向肿瘤抗原的第二或另外的结合特异性，这使得本发明的抗体对癌细胞具有特异性。在本发明的一个实施方案中，癌细胞可选自黑素瘤、肺癌、肾细胞癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌和胃食管连接部癌(gastroesophageal junction cancer)、胰腺腺癌、卵巢癌和淋巴瘤。
在一个实施方案中，除肿瘤抗原特异性和抗PD-1结合特异性之外，本发明的多特异性抗体还可包含第三结合特异性。在一个实施方案中，第三结合特异性针对Fc受体，例如人Fc-γRI(CD64)或人Fc-α受体(CD89)。因此，本发明包括能够与以下结合的多特异性分子：PD-1、Fc-γR、Fc-αR或Fc-εR表达效应细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞多形核细胞(PMN))以及表达肿瘤抗原的靶标癌细胞。
与本发明的多特异性或双特异性抗体的PD-1结合的所述第一抗原结合区可包含与PD-L1和/或PD-L2竞争PD-1结合的抗体的重链可变区和轻链可变区。在多特异性或双特异性抗体的一个实施方案中，与PD-1结合的第一抗原结合区包含如本文中所示的重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)。
在上述方面的一个实施方案中，抗体可通过包括以下步骤的方法获得：用具有SEQID NO：71或SEQ ID NO：72所示的氨基酸序列的蛋白质或肽、或者其免疫原性片段、或者表达所述蛋白质或肽或其免疫原性片段的核酸或宿主细胞或病毒对动物进行免疫接种。优选地，由此获得的抗体对前述蛋白质、肽或其免疫原性片段具有特异性。核酸或宿主细胞或病毒可以是本文中公开的核酸或宿主细胞或病毒。
本发明还提供了来自如上所述的非人动物的分离的B细胞。然后分离的B细胞可通过与永生化细胞融合而永生化，以提供本发明抗体的来源(例如，杂交瘤)。这样的杂交瘤(即产生本发明的抗体的杂交瘤)也包括在本发明的范围内。
因此，在另一个方面中，本发明提供了能够产生上述所有方面的抗体的杂交瘤。如本文中所例举，本发明的抗体可从表达该抗体的杂交瘤直接获得，或者可被克隆并在宿主细胞(例如，CHO细胞或淋巴细胞)中重组表达。宿主细胞的另一些实例是微生物，例如大肠杆菌(E.coli)和真菌，例如酵母。或者，它们可在转基因非人动物或植物中重组产生。本发明的优选抗体是由上述杂交瘤、宿主细胞或病毒产生并可从中获得的抗体，及其嵌合和人源化形式。
在另一个方面中，本发明提供了缀合物，其包含与部分或试剂偶联的本发明的抗体。在该方面的一个实施方案中，所述部分或试剂选自放射性同位素、酶、染料、药物、毒素和细胞毒性剂。染料例如可以是荧光染料或荧光标签。在一个实施方案中，所述部分或试剂能够实现免疫细胞活化。例如，所述部分或试剂可以是与T细胞上的CD28相互作用的CD80。
本发明的抗体可与一种或更多种其他分子实体，例如对PD-1具有结合特异性的另一种抗体偶联或功能性连接(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价缔合或其他方式)。一种或更多种其他抗体优选是本发明的抗体。
因此，在另一个方面中，本发明提供了多聚体，其包含至少两个本发明的抗体、或至少两个本发明的缀合物、或者一个或更多个本发明的抗体与一个或更多个本发明的缀合物的混合物。在一个实施方案中，多聚体包含4至8个本发明的抗体或4至8个本发明的缀合物。本发明的多聚体的抗体或缀合物可通过肽彼此连接。本发明的多聚体的特征在于针对PD-1的抗原结合位点数目增加。
因此，本发明涵盖了多种抗体缀合物、双特异性和多特异性分子以及融合蛋白，所有这些均与表达PD-1的细胞结合并且可用于将其他分子靶向这样的细胞。
在另一个方面中，本发明还涉及包含编码本发明抗体或其片段的基因或核酸序列的核酸。编码的抗体链可以是本文中所述的链。
核酸可被包含在载体例如质粒、黏粒、病毒、噬菌体或例如遗传改造中常规使用的另一载体中。载体可包含其他基因，例如允许在合适的宿主细胞中和在合适的条件下选择载体的标记基因。此外，载体可包含允许在合适的宿主中正确表达编码区的表达控制元件。这样的控制元件是技术人员已知的并且可包括启动子、剪接盒和翻译起始密码子。优选地，本发明的核酸与上述表达控制序列有效连接，从而允许在真核或原核细胞中表达。确保在真核或原核细胞中表达的控制元件是本领域技术人员公知的。用于构建根据本发明的核酸分子、用于构建包含上述核酸分子的载体、用于将载体引入到适当选择的宿主细胞、用于引起或实现表达的方法是本领域公知的。
在一个实施方案中，核酸是RNA。
在一个实施方案中，核酸与至少一种对核酸具有稳定作用的试剂缔合。稳定作用可包括防止RNA降解。在本发明的一个实施方案中，至少一种试剂与所述RNA形成复合物和/或包围所述RNA。在一个实施方案中，至少一种试剂包含至少一种选自以下的试剂：RNA复合脂质、RNA复合聚合物和RNA复合肽或蛋白质。例如，至少一种试剂选自聚乙烯亚胺、鱼精蛋白、聚-L-赖氨酸、聚-L-精氨酸和组蛋白中的至少一种。
在另一个方面中，本发明提供了包含本发明核酸的载体。在一个实施方案中，载体是多层囊泡、单层囊泡或其混合物。在一个实施方案中，载体是脂质体，优选阳离子脂质体。脂质体可包含磷脂例如磷脂酰胆碱和/或甾醇例如胆固醇。在一个实施方案中，脂质体的粒径在约50nm至约200nm的范围内。在一个实施方案中，本文中所述的载体还包含用于位点特异性靶向的配体。所述配体例如是抗体。在一个实施方案中，配体(例如抗体)能够与癌细胞，特别是本文中所述的癌细胞结合。在一个实施方案中，载体在肿瘤细胞处释放RNA和/或进入肿瘤细胞。在一个实施方案中，配体(例如抗体)与和病变细胞例如肿瘤细胞的表面缔合的蛋白质结合。例如，配体或抗体可与疾病相关抗原的胞外部分结合。
本发明的另一个方面涉及包含本发明的核酸或包含本发明的载体的宿主细胞。宿主细胞可以是原核和/或真核宿主细胞。可将外源核酸和/或载体引入到这些宿主细胞中。在一个实施方案中，宿主细胞是真核宿主细胞，优选哺乳动物宿主细胞。在一个实施方案中，哺乳动物宿主细胞是CHO(Chinese hamster ovary，中国仓鼠卵巢)细胞、CHO细胞系的衍生物例如CHO-K1和CHO pro-3、或淋巴细胞。在一个实施方案中，哺乳动物宿主细胞选自小鼠骨髓瘤细胞例如NS0和Sp2/0，HEK293(人胚肾)细胞或其衍生物例如HEK293T、HEK293T/17和/或HEK293F，COS和Vero细胞(二者均为非洲绿猴肾)和/或HeLa(人宫颈癌)细胞。在一个实施方案中，哺乳动物宿主细胞选自HEK293、HEK293T和/或HEK293T/17细胞。宿主细胞的另一些实例是微生物，例如大肠杆菌和真菌例如酵母，例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或丝状真菌，例如脉孢菌属(Neurospora)和曲霉属(Aspergillus)宿主。
在另一个方面中，本发明提供了包含本发明的核酸或包含本发明的载体的病毒。
在另一个方面中，本发明提供了包含活性剂和可药用载体的组合物，优选药物组合物，其中所述活性剂是选自以下中的至少一种：
(i)本发明的抗体；
(ii)本发明的缀合物；
(iii)本发明的多聚体；
(iv)本发明的核酸；
(v)本发明的载体；
(vi)本发明的宿主细胞；和/或
(vii)本发明的病毒。
在一个实施方案中，药物组合物被配制成用于肠胃外施用，优选用于心血管施用，特别是静脉内或动脉内施用。
本发明的另一个方面涉及用于疾病的预防性和/或治疗性治疗的本发明的药物组合物。在药物用途的一个实施方案中，所述疾病是癌症生长和/或癌症转移。在药物用途的一个实施方案中，所述疾病的特征在于包含病变细胞或癌细胞，所述病变细胞或癌细胞的特征在于表达PD-L1和/或特征在于PD-L1与其表面缔合。在药物用途的一个实施方案中，药物组合物用于预防或治疗癌症的方法中。在药物用途的一个实施方案中，癌症选自黑素瘤、肺癌、肾细胞癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌和胃食管连接部癌、胰腺腺癌、卵巢癌、肾肿瘤、胶质母细胞瘤和淋巴瘤，优选霍奇金淋巴瘤。
在医学用途的一个实施方案中，药物组合物将被特异性地递送至靶器官或组织、积累在靶器官或组织中和/或保留在靶器官或组织中。在药物用途的一个实施方案中，靶器官或组织是癌组织，特别是本文中指定的癌组织。例如，病变器官或组织的特征可在于细胞表达疾病相关抗原和/或特征在于疾病相关抗原与其表面缔合。疾病相关抗原可以是肿瘤相关抗原。疾病相关抗原可与病变细胞例如肿瘤细胞的表面缔合。在药物用途的一个实施方案中，载体或病毒在靶器官或组织处释放核酸和/或进入靶器官或组织处的细胞。在药物用途的一个实施方案中，抗体将在靶器官或组织的细胞中表达。
在药物用途的一个实施方案中，治疗是单一治疗或组合治疗。优选地，组合治疗是选自化学治疗、分子靶向治疗、放射治疗和其他形式的免疫治疗中的至少一种治疗。其他形式的免疫治疗可靶向其他检查点抑制剂，从而抑制(拮抗剂)或活化/刺激(激动剂)相应的其他检查点。可被靶向的其他检查点抑制剂包括但不限于CTLA4、PD-L1、TIM-3、KIR或LAG-3，可被第二结合特异性靶向的检查点活化剂包括但不限于CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、OX40、GITR或ICOS。例如：结合特异性的优选组合包括抗PD1和抗PD-L1或者抗PD-1和抗CTLA4。作为替代或补充，免疫治疗可提供抗血管生成活性。例如，通过靶向血管内皮生长因子(VEGF)或其受体VEGFR(例如VEGFR1、2、3)。作为替代或补充，其可使得能够靶向PDGFR、c-Kit、Raf和/或RET。
本发明的抗体还可与一种或更多种疫苗组合使用，其中疫苗用于针对由病变细胞例如肿瘤细胞表达的抗原刺激免疫系统。例如，抗原可以是本文中指定的肿瘤抗原中的一种或更多种。可通过施用疫苗RNA即编码针对其将诱导免疫应答的抗原或表位的RNA来实现疫苗接种。或者，可施用包含用于诱导针对抗原的免疫应答的表位的肽或蛋白质。
因此，本发明还提供了包含以下的组合物，优选药物组合物：(i)包含用于在对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位的肽或蛋白质，或者编码所述肽或蛋白质的多核苷酸；和(ii)选自以下的至少一种：本发明的抗体、本发明的缀合物、本发明的多聚体、本发明的核酸、本发明的载体、本发明的宿主细胞，和/或本发明的病毒。
在一个实施方案中，组合物包含编码肽或蛋白质的RNA，所述肽或蛋白质包含用于在对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位。
在药物用途的一个实施方案中，对象是人。
在另一个方面中，本发明提供了在对象中治疗或预防疾病的方法，其包括向对象施用至少一种活性剂，其中所述活性剂是选自以下中的至少一种：
(i)本发明的抗体；
(ii)本发明的缀合物；
(iii)本发明的多聚体；
(iv)本发明的核酸；
(v)本发明的载体；
(vi)本发明的宿主细胞；和/或
(vii)本发明的病毒。
在所述方法的一个实施方案中，将本发明的药物组合物施用于对象。在所述方法的一个实施方案中，对象具有病变器官或组织，所述病变器官或组织的特征在于细胞表达PD-L1和/或特征在于PD-L1与其表面缔合。在所述方法的一个实施方案中，所述疾病是癌症生长和/或癌症转移。在所述方法的一个实施方案中，所述方法用于在患有癌症和/或癌症转移或处于发生癌症和/或癌症转移之风险中的对象中治疗或预防癌症生长和/或癌症转移。在所述方法的一个实施方案中，提供了有效量的活性剂。优选地，抗体以在0.1至20mg/kg的范围内、更优选在0.3至10mg/kg的范围内的剂量以一个或更多个剂量提供。所述剂量可例如每1至4周，还更优选每2至3周，例如每2或3周提供。
在所述方法的一个实施方案中，所述癌症选自黑素瘤、肺癌、肾细胞癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌和胃食管连接部癌、胰腺腺癌、卵巢癌、肾肿瘤、胶质母细胞瘤和淋巴瘤，优选霍奇金淋巴瘤。
在所述方法的一个实施方案中，将活性剂或药物组合物施用于心血管系统中，优选活性剂或药物组合物通过静脉内或动脉内施用例如施用到外周静脉中来施用。在所述方法的一个实施方案中，活性剂或药物组合物被特异性地递送至靶器官或组织、积累在靶器官或组织中和/或保留在靶器官或组织中。在所述方法的一个实施方案中，靶器官或组织是癌组织，特别是本文中指定的癌组织。例如，病变器官或组织的特征可在于细胞表达疾病相关抗原和/或特征在于疾病相关抗原与其表面缔合。疾病相关抗原可以是肿瘤相关抗原。疾病相关抗原可与病变细胞例如肿瘤细胞的表面缔合。在所述方法的一个实施方案中，载体、宿主细胞或病毒在靶器官或组织处释放核酸和/或进入靶器官或组织处的细胞，优选地，其中抗体在靶器官或组织的细胞中表达。
在所述方法的一个实施方案中，治疗是单一治疗或组合治疗。优选地，组合治疗是选自化学治疗、分子靶向治疗、放射治疗和其他形式的免疫治疗中的至少一种治疗。其他形式的免疫治疗包括疫苗接种，例如RNA疫苗接种和/或可靶向其他检查点抑制剂，从而抑制(拮抗剂)或活化/刺激(激动剂)相应的其他检查点。可被靶向的其他检查点抑制剂包括但不限于CTLA4、PD-L1、TIM-3、KIR或LAG-3。可被第二结合特异性靶向的检查点活化剂包括但不限于CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、OX40、GITR或ICOS。例如：结合特异性的优选组合包括抗PD1和抗PD-L1或者抗PD-1和抗CTLA4。作为替代或补充，免疫治疗可提供抗血管生成活性。例如，通过靶向血管内皮生长因子(VEGF)或其受体VEGFR(例如VEGFR1、2、3)。作为替代或补充，其可使得能够靶向PDGFR、c-Kit、Raf和/或RET。
在所述方法的一个优选实施方案中，治疗是组合治疗，其中所述治疗包括向对象施用：
(i)包含用于在对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位的肽或蛋白质，或者编码所述肽或蛋白质的多核苷酸；和
(ii)选自以下中的至少一种：本发明的抗体、本发明的缀合物、本发明的多聚体、本发明的核酸、本发明的载体、本发明的宿主细胞、和/或本发明的病毒。
在一个实施方案中，包含用于在对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位的肽或蛋白质或者编码所述肽或蛋白质的多核苷酸和(ii)中指定的至少一种活性化合物顺序施用。在一个实施方案中，(ii)中指定的至少一种活性化合物在施用包含用于在对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位的肽或蛋白质或者编码所述肽或蛋白质的多核苷酸之后施用。在一个实施方案中，(ii)中指定的至少一种活性化合物在施用包含用于在对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位的肽或蛋白质或者编码所述肽或蛋白质的多核苷酸之后6小时或更晚、12小时或更晚、或者24小时或更晚施用。在一个实施方案中，(ii)中指定的至少一种活性化合物在施用包含用于在对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位的肽或蛋白质或者编码所述肽或蛋白质的多核苷酸之后12小时至48小时之间施用。
在一个实施方案中，本发明的方法包括向对象施用编码包含用于在对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位的肽或蛋白质的RNA。
在所述方法的一个实施方案中，对象是人。
在另一个方面中，本发明提供了用于定性或定量检测样品中PD-1的试剂盒，其中所述试剂盒包含本发明的抗体或本发明的缀合物或本发明的多聚体。
在另一个方面中，本发明提供了本发明的抗体或本发明的缀合物或本发明的多聚体或本发明的试剂盒在确定样品中表达的PD-1的存在或量的方法中的用途，所述方法包括以下步骤：
(i)使样品与抗体或缀合物或多聚体接触，以及
(ii)检测抗体或缀合物或多聚体与PD-1之间复合物的形成和/或者确定复合物的量。
在一个实施方案中，试剂盒或方法允许进行定量和/或定性评价，例如进行PD-1的绝对和/或相对测量。
通过以下详细描述和权利要求书，本发明的其他特征和优点将变得明显。
附图简述
图1示出了嵌合抗PD-1抗体MAB-19-0202、MAB-19-0208、MAB-19-0217、MAB-19-0223和MAB-19-0233与重组人PD-1胞外结构域的结合。结合能力通过ELISA确定。以0.06ng/mL至1μg/mL的系列稀释度测试了嵌合抗PD-1抗体。使用抗hPD-1-Ni-hIgG4(具有纳武单抗的可变区)和抗hPD1-Pem-hIgG4(具有派姆单抗的可变区)作为参考抗体。数据符合4参数逻辑斯谛模型(4-parameter logistic model)。
图2示出了嵌合抗PD-1抗体MAB-19-0202、MAB-19-0208、MAB-19-0217、MAB-19-0223和MAB-19-0233与HEK-293-hPD-1的结合。使用CellInsight CX5高内涵成像仪装置评估结合。在0.07ng/mL至1μg/mL的系列稀释液中测试了嵌合抗PD-1抗体。使用抗hPD-1-Ni-hIgG4(具有纳武单抗的可变区)和抗hPD1-Pem-hIgG4(具有派姆单抗的可变区)作为参考抗体。RFU是相对荧光单位。数据符合4参数逻辑斯谛模型。
图3示出了嵌合抗PD-1抗体MAB-19-0202、MAB-19-0208、MAB-19-0217、MAB-19-0223和MAB-19-0233对PD-1/PD-L1相互作用的阻断，其使用PD-1/PD-L1阻断生物测定进行评估。在9ng/mL至6.67μg/mL的系列稀释液中测试了嵌合抗PD-1抗体。使用抗hPD-1-Ni-hIgG4(具有纳武单抗的可变区)和抗hPD1-Pem-hIgG4(具有派姆单抗的可变区)作为参考抗体。RLU是相对光单位。数据符合4参数逻辑斯谛模型。
图4示出了通过活性PD-1/PD-L1轴的抗原特异性T细胞测定测量的PD-1/PD-L1介导的T细胞抑制的释放。在存在0.6ng/mL至0.6μg/mL的嵌合抗PD1抗体MAB-19-0202、MAB-19-0208、MAB-19-0217、MAB-19-0223和MAB-19-0233的系列稀释液的情况下，将以密蛋白-6特异性TCR-和PD-1体外翻译的(IVT)-RNA电穿孔的CFSE标记的T细胞与经自体密蛋白-6-IVT-RNA电穿孔的未成熟树突细胞一起孵育五天。CD8+T细胞增殖通过流式细胞术测量。示出的数据是使用FlowJo软件计算的扩张指数(expansion indice)。误差棒(SD)表示实验中的变化(两次重复，使用来自一名供体的细胞)。使用派姆单抗(MSD，PZN 10749897)作为参考抗体。数据符合4参数逻辑斯谛模型。
图5示出了人源化抗PD-1抗体MAB-19-0603、MAB-19-0608、MAB-19-0613和MAB-19-0618以及亲本嵌合抗PD-1 MAB-19-0202与重组人PD-1胞外结构域的结合，其通过ELISA确定。在0.15ng/mL至2.5μg/mL的系列稀释液中测试了嵌合抗PD-1抗体。使用抗hPD-1-Ni-hIgG4(具有纳武单抗的可变区)和抗hPD1-Pem-hIgG4(具有派姆单抗的可变区)作为参考抗体。数据符合4参数逻辑斯谛模型。
图6示出了人源化抗PD-1抗体MAB-19-0583、MAB-19-0594和MAB-19-0598以及亲本嵌合抗PD-1MAB-19-0233与重组人PD-1胞外结构域的结合，其通过ELISA确定。在0.15ng/mL至2.5μg/mL的系列稀释液中测试了嵌合抗PD-1抗体。使用抗hPD-1-Ni-hIgG4(具有纳武单抗的可变区)和抗hPD1-Pem-hIgG4(具有派姆单抗的可变区)作为参考抗体。数据符合4参数逻辑斯谛模型。
图7示出了人源化抗PD-1抗体MAB-19-0603、MAB-19-0608、MAB-19-0613和MAB-19-0618以及亲本嵌合抗PD-1 MAB-19-0202与HEK-293-hPD-1的结合。使用CellInsight CX5高内涵成像仪装置评估结合。在0.1ng/mL至1μg/mL的系列稀释液中测试了嵌合抗PD-1抗体。使用抗hPD-1-Ni-hIgG4(具有纳武单抗的可变区)和抗hPD1-Pem-hIgG4(具有派姆单抗的可变区)作为参考抗体。RFU是相对荧光单位。数据符合4参数逻辑斯谛模型。
图8示出了人源化抗PD-1抗体MAB-19-0583、MAB-19-0594和MAB-19-0598以及亲本嵌合抗PD-1MAB-19-0233与HEK-293-hPD-1的结合，其使用CellInsight CX5高内涵成像仪装置评估。在0.1ng/mL至1μg/mL的系列稀释液中测试了嵌合抗PD-1抗体。使用抗hPD-1-Ni-hIgG4(具有纳武单抗的可变区)和抗hPD1-Pem-hIgG4(具有派姆单抗的可变区)作为参考抗体。RFU是相对荧光单位。数据符合4参数逻辑斯谛模型。
图9示出了人源化抗PD-1抗体MAB-19-0603、MAB-19-0608、MAB-19-0613和MAB-19-0618以及亲本嵌合抗PD-1 MAB-19-0202对PD-1/PD-L1相互作用的阻断，其使用PD-1/PD-L1阻断生物测定进行评估。在9ng/mL至6.67μg/mL的系列稀释液中测试了嵌合抗PD-1抗体。使用抗hPD-1-Ni-hIgG4(具有纳武单抗的可变区)和抗hPD1-Pem-hIgG4(具有派姆单抗的可变区)作为参考抗体。RLU是相对光单位。数据符合4参数逻辑斯谛模型。
图10示出了人源化抗PD-1抗体MAB-19-0583、MAB-19-0594和MAB-19-0598以及亲本嵌合抗PD-1 MAB-19-0233对PD-1/PD-L1相互作用的阻断，其使用PD-1/PD-L1阻断生物测定进行评估。在9ng/mL至6.67μg/mL的系列稀释液中测试了嵌合抗PD-1抗体。使用抗hPD-1-Ni-hIgG4(具有纳武单抗的可变区)和抗hPD1-Pem-hIgG4(具有派姆单抗的可变区)作为参考抗体。RLU是相对光单位。数据符合4参数逻辑斯谛模型。
图11示出了通过活性PD-1/PD-L1轴的抗原特异性T细胞测定测量的PD-1/PD-L1介导的T细胞抑制的释放。在存在0.6ng/mL至0.6μg/mL的人源化抗PD-1抗体MAB-19-0603、MAB-19-0608、MAB-19-0613和MAB-19-0618以及亲本嵌合抗PD-1 MAB-19-0202的情况下，将以密蛋白-6特异性TCR-和PD-1体外翻译的(IVT)-RNA电穿孔的CFSE标记的T细胞与经自体密蛋白-6-IVT-RNA电穿孔的未成熟树突细胞一起孵育五天。CD8+T细胞增殖通过流式细胞术测量。示出的数据是使用FlowJo软件计算的扩张指数。误差棒(SD)表示实验中的变化(两次重复，使用来自一名供体的细胞)。使用派姆单抗(MSD，PZN 10749897)作为参考抗体。数据符合4参数逻辑斯谛模型。
图12示出了体外表达的抗PD-1 RiboMab-19-0202和RiboMab-19-0233与转染到K562细胞中的全长人PD-1的结合。将贴壁的HEK293T/17细胞用3μg RiboMab-编码mRNA(重链与轻链之比为2∶1，每μL Lipofectamine MessengerMAX复合400ng mRNA)进行脂质转染，并且在孵育20小时之后收集上清液。用1μg编码全长人PD-1的mRNA对K562细胞进行电穿孔，并在电穿孔20小时之后用0.006％至100％的含RiboMab的上清液的系列稀释液进行处理。使用AlexaFluor488缀合的山羊抗人IgG Fc特异性(Fab’)2片段，通过流式细胞术检测RiboMab的结合。数据表示为n＝3次技术复制的几何平均荧光强度(geometric meanfluorescence intensity，gMFI)Alexa Fluor 488±标准偏差(SD)。
发明详述
尽管以下详细描述了本发明，但是应理解，本发明不限于本文中所述的特定方法、方案和试剂，因为这些可变化。还应理解，本文中使用的术语仅出于描述一些具体实施方案的目的，并且不旨在限制本发明的范围，本发明的范围将仅受所附权利要求书限制。除非另外限定，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。
在下文中，将描述本发明的要素。这些要素与一些具体实施方案一起列出，然而，应理解，其可以以任何方式且以任意数目组合以产生另外的实施方案。多种不同描述的实例和一些优选实施方案不应被理解为将本发明仅限于明确描述的一些实施方案。本说明书应理解为支持和涵盖将明确描述的实施方案与任何数目的所公开和/或优选要素组合的实施方案。此外，除非上下文另外指出，否则本申请中所有描述的要素的任何排列和组合均应认为被本申请的描述公开。
优选地，本文中使用的术语如“A multilingual glossary of biotechnologicalterms：(IUPAC Recommendations)”，H.G.W.Leuenberger，B.Nagel，and H.Eds.，(1995)Helvetica Chimica Acta，CH-4010 Basel，Switzerland中所述进行定义。
除非另外指出，否则本发明的实施将采用生物化学、细胞生物学、免疫学和重组DNA技术的常规方法，其在本领域的文献中进行了说明(参见例如Molecular Cloning：ALaboratory Manual，2nd Edition，J.Sambrook et al.eds.，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor 1989)。
在本说明书和所附权利要求书通篇，除非上下文另外要求，否则词语“包括/包含”及其变化形式将被理解为意指包括所述成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，但是不排除任何其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，尽管在一些实施方案中可排除这样的其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，即主题在于包括所述成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组。除非本文中另外指出或者与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(尤其是在权利要求书的上下文中)使用的没有数量词修饰的名词应解释为涵盖一个/种和/或更多个/种。本文中值范围的记载仅旨在用作单独提及落入所述范围内的每个单独值的简写方法。除非本文中另外指出，否则每个单独值均被并入本说明书中，如同其在本文中被单独记载一样。
除非本文中另外指出或者另外与上下文明显矛盾，否则本文中所述的所有方法均可以以任何合适的顺序进行。本文中提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“例如”)的使用仅旨在更好地举例说明本发明，而不对另外要求保护的本发明的范围构成限制。本说明书中的语言均不应被解释为指示实施本发明所必需的任何未要求保护的要素。
在本说明书的正文通篇引用了数篇文件。本文中无论是在上文还是在下文引用的每篇文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书、指南等)均在此通过引用整体并入。本文中的内容均不应解释为承认本发明无权由于在先发明而先于这样的公开内容。
术语例如“降低/减少”或“抑制”涉及导致水平总体降低的能力，优选5％或更大、10％或更大、20％或更大、更优选50％或更大、并且最优选75％％或更大。术语“抑制”或类似短语包括完全抑制或基本上完全抑制，即降低至零或基本上降低至零。
术语例如“提高/增加”、“增强”、“促进”或“延长”优选地涉及提高/增加、增强、促进或延长约至少10％、优选至少20％、优选至少30％、优选至少40％、优选至少50％、优选至少80％、优选至少100％、优选至少200％，并且特别是至少300％。这些术语还可涉及从零或不可测量或不可检测的水平提高/增加、增强、促进或延长至大于零的水平或可测量或可检测的水平。
术语“PD-1”涉及程序性细胞死亡-1并且包括PD-1的任何变体、构象、同种型和物种同源物，其由细胞天然表达或由转染PD-1基因的细胞表达。优选地，“PD-1”涉及人PD-1，特别涉及具有序列表的SEQ ID NO：71所示的氨基酸序列(NCBI参考序列：NP_005009.2)的蛋白质，或涉及优选由序列表的SEQ ID NO：73所示的核酸序列(NCBI参考序列：NM_005018.2)编码的蛋白质。
术语“PD-1”包括人PD-1的翻译后修饰变体、同种型和物种同源物，其由细胞天然表达或在转染PD-1基因的细胞中/细胞上表达。
术语“PD-1变体”应涵盖(i)PD-1剪接变体，(ii)PD-1翻译后修饰变体，特别地包括具有不同N-糖基化状态的变体，(iii)PD-1构象变体。这样的变体可包括可溶性形式的PD-1。
PD-1是属于免疫球蛋白超家族的I型膜蛋白(The EMBO Journal(1992)，vol.11，issue 11，p.3887-3895)。人PD-1蛋白包含胞外结构域(由序列表中SEQ ID NO：71中所示序列的第24至170位的氨基酸构成)、跨膜结构域(SEQ ID NO：71中所示序列的第171至191位的氨基酸)和胞质结构域(SEQ ID NO：71中所示序列的第192至288位的氨基酸)。本文中使用的术语“PD-1片段”应涵盖PD-1蛋白的任何片段，优选免疫原性片段。该术语还涵盖例如，全长蛋白质的上述结构域或这些结构域的任何片段，特别是免疫原性片段。人PD-1蛋白的优选胞外结构域的氨基酸序列在序列表的SEQ ID NO：72中示出。
在本发明的上下文中，术语“胞外部分”或“胞外结构域”优选地是指朝向细胞的胞外空间并且优选地从所述细胞的外部接近(例如通过位于细胞外部的结合分子，例如抗体)的分子(例如，蛋白质)的一部分。优选地，该术语是指一个或更多个胞外环或结构域或者其片段。
术语“抗体”是指包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白或其抗原结合部分。术语“抗体”还包括抗体的所有重组形式，特别是本文中所述的抗体，例如在原核生物或真核细胞中表达的抗体、非糖基化抗体以及任何抗原结合抗体片段和衍生物，如下所述。每条重链包含重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区。每条轻链包含轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区。VH和VL区可被进一步细分为称为互补决定区(complementarity determining region，CDR)的高变区，其间散布有更保守的区域，称为框架区(framework region，FR)。每个VH和VL由从氨基端到羧基端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。
术语“人源化抗体”是指具有基本上来源于来自非人物种的免疫球蛋白的抗原结合位点的分子，其中所述分子的其余免疫球蛋白结构基于人免疫球蛋白的结构和/或序列。抗原结合位点可包含融合到恒定结构域上的完整可变结构域，或者仅包含接枝(graft)到可变结构域中适当框架区上的互补决定区(CDR)。抗原结合位点可以是野生型的，或者通过一个或更多个氨基酸替换进行修饰的，例如，进行修饰以使其与人免疫球蛋白更接近地类似。一些形式的人源化抗体保留了全部CDR序列(例如包含来自小鼠抗体的全部六个CDR的人源化小鼠抗体)。其他形式具有一个或更多个相对于原始抗体而言发生了改变的CDR。
术语“嵌合抗体”是指其中每个重链和轻链氨基酸序列的一部分与来源于特定物种或属于特定类别的抗体中的相应序列同源，而该链的其余区段与其他类别的相应序列同源的那些抗体。通常来说，轻链和重链二者的可变区均模拟来源于一个哺乳动物物种之抗体的可变区，而恒定部分与来源于其他哺乳动物物种的抗体序列同源。这样的嵌合形式的一个明显优点在于：该可变区可与来源于例如人细胞制备物的恒定区组合使用易于获得的B细胞或来自非人宿主生物体的杂交瘤由目前已知的来源方便地获得。尽管可变区具有易于制备且特异性不受来源影响的优点，但人恒定区在注射抗体时比来自非人来源的恒定区更太不可能引发人对象的免疫应答。然而，该定义不限于该具体实例。
本文中使用的术语抗体的“抗原结合部分”(或简称为“结合部分”)是指保留与抗原特异性结合之能力的抗体的一个或更多个片段。已经表明抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段来进行。术语抗体的“抗原结合部分”内涵盖的结合片段的一些实例包括：(i)Fab片段，其是由VL、VH、CL和CH结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，其是包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，其由VH和CH结构域组成；(iv)Fv片段，其由抗体单臂的VL和VH结构域组成，(v)dAb片段(Ward et al.，(1989)Nature341：544-546)，其由VH结构域组成；(vi)分离的互补决定区(CDR)，以及(vii)两个或更多个分离的CDR的组合，其可任选地通过合成接头连接。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，但其可使用重组方法通过能够使其制成单条蛋白链的合成接头连接，其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird et al.(1988)Science 242：423-426；和Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这样的单链抗体也旨在包含在术语抗体的“抗原结合部分”内。另一个实例是结合结构域免疫球蛋白融合蛋白，其包含(i)与免疫球蛋白铰链区多肽融合的结合结构域多肽，(ii)与铰链区融合的免疫球蛋白重链CH2恒定区，和(iii)与CH2恒定区融合的免疫球蛋白重链CH3恒定区。结合结构域多肽可以是重链可变区或轻链可变区。US 2003/0118592和US2003/0133939中进一步公开了结合结构域免疫球蛋白融合蛋白。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并且以与完整抗体相同的方式筛选用于效用的片段。
术语“表位”意指能够与抗体结合的蛋白质决定簇，其中术语“结合”在本文中优选地涉及特异性结合。表位通常由分子的化学活性表面基团(grouping)例如氨基酸或糖侧链组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象表位和非构象表位的区别在于，在变性溶剂的存在下，与前者的结合会丧失，但与后者的结合不会丧失。术语“表位”优选地是指分子中的抗原决定簇，即分子(例如抗原)中被免疫系统识别的部分或片段。例如，表位可以被T细胞、B细胞或抗体识别。抗原的表位可包含抗原的连续或不连续部分，并且长度可为约5至约100，例如约5至约50，更优选约8至约30，最优选约10至约25个氨基酸，例如，表位的长度可优选为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。在一个实施方案中，表位的长度为约10至约25个氨基酸。术语“表位”包括B细胞表位和T细胞表位。
术语“T细胞表位”是指当存在于MHC分子的情况下时被T细胞识别的蛋白质的部分或片段。术语“主要组织相容性复合体”和缩写“MHC”包括I类MHC和II类MHC分子，并且涉及存在于所有脊椎动物中的基因复合体。MHC蛋白或分子对于免疫反应中淋巴细胞与抗原呈递细胞或病变细胞之间的信号传导是重要的，其中MHC蛋白或分子结合肽表位并呈递它们以被T细胞上的T细胞受体识别。由MHC编码的蛋白质在细胞表面上表达，并将自身抗原(来自细胞本身的肽片段)和非自身抗原(例如，侵入的微生物的片段)二者展示给T细胞。在I类MHC/肽复合体的情况下，结合肽通常为约8至约10个氨基酸长，尽管更长或更短的肽可以是有效的。在II类MHC/肽复合体的情况下，结合肽通常为约10至约25个氨基酸长，并且特别地为约13至约18个氨基酸长，尽管更长和更短的肽可以是有效的。
术语“双特异性分子”旨在包括具有两种不同结合特异性的任何试剂，例如蛋白质、肽、或者蛋白质或肽复合体。例如，该分子可与(a)细胞表面抗原和(b)效应细胞表面上的Fc受体结合或相互作用。术语“多特异性分子”或“异特异性分子”旨在包括具有多于两种不同结合特异性的任何试剂，例如蛋白质、肽、或者蛋白质或肽复合体。例如，该分子可与(a)细胞表面抗原、(b)效应细胞表面上的Fc受体和(c)至少一种其他组分结合或相互作用。因此，本发明包括但不限于针对PD-1和其他靶标(例如效应细胞上的Fc受体)的双特异性、三特异性、四特异性和其他多特异性分子。术语“双特异性抗体”还包括双抗体。双抗体是二价双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单条多肽链上表达，但使用的接头太短而不能在同一条链上的两个结构域之间进行配对，从而迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点(参见例如，Holliger，P.，et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak，R.J.，et al.(1994)Structure 2：1121-1123)。
本发明还包括本文中所述抗体的衍生物。术语“抗体衍生物”是指抗体的任何经修饰形式，例如抗体与其他试剂或抗体的缀合物。如本文中使用的，如果抗体是通过对动物进行免疫接种或通过筛选免疫球蛋白基因文库从系统中获得的，则抗体“来源于”特定的种系序列，并且其中所选择的抗体与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少96％、97％、98％或99％同一性。通常来说，来源于特定种系序列的抗体将显示出与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不超过10个氨基酸差异，更优选地，不超过5个，或甚至更优选地，不超过4、3、2或1个氨基酸差异。
本文中使用的术语“异抗体”是指连接在一起的两个或更多个抗体、其衍生物或抗原结合区，其中至少两个具有不同的特异性。这些不同的特异性包括对效应细胞上的Fc受体的结合特异性，以及对靶细胞(例如肿瘤细胞)上的抗原或表位的结合特异性。
本文中所述的抗体可以是人抗体。本文中使用的术语“人抗体”旨在包含具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可包含不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机诱变或位点特异性诱变或者通过体内体细胞突变引入的突变)。
本文中使用的术语“单克隆抗体”是指单一分子组成的抗体分子的制备物。单克隆抗体展示出针对特定表位的单一结合特异性和亲和力。在一个实施方案中，单克隆抗体由杂交瘤产生，所示杂交瘤包括与永生化细胞融合的从非人动物例如小鼠获得的B细胞。
本文中使用的术语“重组抗体”包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有抗体，例如(a)从相对于免疫球蛋白基因是转基因的或转染色体的动物(例如，小鼠)或从其制备的杂交瘤中分离的抗体，(b)从转化以表达抗体的宿主细胞(例如，从转染瘤)分离的抗体，(c)从重组体的、组合的抗体文库分离的抗体，以及(d)通过涉及将免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他方式制备、表达、产生或分离的抗体。
本文中使用的术语“转染瘤”包括表达抗体的重组真核宿主细胞，例如CHO细胞、NS/0细胞、HEK293细胞、HEK293T细胞、HEK293T/17植物细胞或真菌，包括酵母细胞。
本文中使用的“异源抗体”相对于产生这样的抗体的转基因生物体进行定义。该术语是指这样的抗体，其具有对应于不由所述转基因生物体组成的生物体中存在的那些的氨基酸序列或编码核酸序列，并且通常来源于与所述转基因生物体不同的物种。
本文中使用的“异杂合抗体”是指具有不同生物体来源的轻链和重链的抗体。例如，具有与鼠轻链缔合的人重链的抗体是异杂合抗体。
本文中所述的抗体优选是分离的。本文中使用的“分离的抗体”旨在是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，与PD-1特异性结合的分离的抗体基本上不含特异性结合除PD-1之外的抗原的抗体)。然而，与人PD-1的表位、同工型或变体特异性结合的分离的抗体可与其他相关抗原例如来自其他物种(例如，PD-1物种同源物)的相关抗原具有交叉反应性。此外，分离的抗体可基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。在本发明的一个实施方案中，“分离的”单克隆抗体的组合涉及具有不同特异性并且在明确限定的组合物中组合的抗体。
本文中使用的“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如，IgM或IgG1)。
本文中使用的“同种型转换(isotype switching)”是指抗体的类别或同种型从一种Ig类别变为其他Ig类别之一的现象。
根据本发明，术语“结合”优选地涉及“特异性结合”。本文中使用的“特异性结合”是指抗体与预定抗原的结合。通常来说，抗体以对应于KD为约1×10-7M或更小的亲和力结合，并且以对应于为以下之KD的亲和力与预定抗原结合：比其对与除预定抗原或密切相关抗原之外的非特异性抗原(例如，BSA、酪蛋白)结合的亲和力低至少2个，优选至少3个，更优选至少4个数量级。本文中使用的术语“KD”(M)旨在是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。
当应用于对象时，本文中使用的术语“天然存在的”是指对象可存在于自然界中的事实。例如，存在于可从自然界来源分离的生物体(包括病毒)中并且未经人在实验室中有意修饰的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。
本文中使用的术语“重排的”是指重链或轻链免疫球蛋白基因座的构型，其中V区段在编码基本上完整的VH或VL结构域的构象中分别位于紧邻D-J或J区段。重排的免疫球蛋白(抗体)基因基因座可通过与种系DNA进行比较来鉴定；重排的基因座将具有至少一个重组的七聚体/九聚体同源元件。
在提及V区段时，本文中使用的术语“未重排的”或“种系构型”是指其中V区段未重组从而未与D或J区段紧邻的构型。
I.抗体作用的机制
尽管以下提供了关于本发明抗体的治疗效力的潜在机制的一些预期，但不应认为以任何方式限制本发明。
本文中所述的抗体优选地与免疫检查点PD-1相互作用。通过与PD-1结合，PD-1与其配体(PD-L1和PD-L2)的相互作用受到抑制。PD-L1例如在肿瘤细胞和肿瘤微环境的抗原呈递细胞上表达。PD-1与PD-L1的相互作用将导致消除免疫应答，优选T细胞介导的免疫应答，使得通过用本文中所述的抗体阻断PD-1，阻止或至少降低了免疫应答的这样的消除，或者换言之，诱导了免疫应答。
即使PD-1及其配体在阻止或降低免疫应答方面彼此相互作用，但是对于实现这种作用，PD-1阻断可能优于配体阻断。这是因为例如PD-L1的阻断可能仍导致免疫应答降低，因为表达PD-L2的病变细胞与表达PD-1的淋巴细胞之间的抑制性信号传导可有助于抑制免疫系统的免疫应答。
免疫系统具有通过两种不同方式(固有免疫和适应性免疫)来识别和破坏病变细胞的能力。固有组分由巨噬细胞、自然杀伤(natural killer，NK)细胞、单核细胞和粒细胞组成。这些细胞鉴定参与细胞转化的分子模式并释放多种细胞因子和炎性介质。固有应答缺乏对外来抗原的记忆能力，这是存在于适应性免疫应答中的特征。免疫系统的后一种组分也对外来抗原具有特异性，这是由淋巴细胞上受体的存在所赋予的。抗原呈递细胞(antigen presenting cell，APC)也在适应性应答中发挥作用-它们吞噬外来抗原并在主要组织相容性复合体的情况下将外来抗原呈递给淋巴细胞。CD4+T细胞带有识别II类MHC分子情况下的抗原的受体，然后使它们能够释放细胞因子并进一步活化CD8+淋巴细胞(CTL)或B细胞。CTL是细胞介导的免疫的一部分并且能够在识别在I类MHC分子的情况下呈递的抗原之后，通过凋亡或穿孔素介导的细胞裂解来消除细胞。普遍接受的是T细胞介导的免疫在抗肿瘤应答中发挥至关重要的作用。B细胞参与免疫球蛋白的释放并因此是体液免疫系统的一部分。
术语“免疫应答”是指针对靶标(例如抗原或表达抗原的细胞)的综合机体应答，并且优选地是指细胞免疫应答或细胞以及体液的免疫应答。免疫应答可以是保护性/防止性/预防性和/或治疗性的。
“诱导免疫应答”可意指在诱导之前不存在免疫应答，但其还可意指在诱导之前存在一定水平的免疫应答并且在诱导之后所述免疫应答增强。因此，“诱导免疫应答”也包括“增强免疫应答”。优选地，在对象中诱导免疫应答之后，所述对象被保护以免于发生疾病，例如癌症疾病，或者通过诱导免疫应答，疾病状况被改善。在这种情况下诱导免疫应答可意指改善对象的疾病状况、对象不发生转移或者处于发生癌症疾病之风险中的对象不发生癌症疾病。
术语“细胞免疫应答”和“细胞应答”或类似的术语是指针对细胞的免疫应答。固有细胞免疫应答由巨噬细胞、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞和粒细胞驱动。适应性细胞免疫应答的特征在于在I类或II类MHC的情况下呈递抗原，涉及充当“辅助者”或“杀手”的T细胞或T淋巴细胞。辅助T细胞(也称为CD4+T细胞)通过调节免疫应答发挥核心作用，而杀伤细胞(也称为细胞毒性T细胞、细胞溶解性T细胞、CD8+T细胞或CTL)杀伤病变细胞(例如癌细胞)，从而防止产生更多的病变细胞。在一些优选实施方案中，本发明涉及刺激针对表达一种或更多种肿瘤抗原并优选地将这样的肿瘤抗原呈递在I类MHC上的肿瘤细胞的抗肿瘤CTL应答。
根据本发明的“肿瘤抗原”涵盖作为抗体或T-淋巴细胞(T细胞)之靶标和/或诱导与抗体或T-淋巴细胞(T细胞)的免疫应答(例如特异性反应)的任何物质，优选肽或蛋白质。优选地，抗原包含至少一个表位，例如T细胞表位。肿瘤抗原或其T细胞表位优选由细胞呈递，优选由抗原呈递细胞呈递，所述抗原呈递细胞包括在MHC分子的情况下的病变细胞，特别是癌细胞，其导致针对所述抗原(包括表达所述抗原的细胞)的免疫应答。
本发明的抗体的特征在于它们与PD-1的结合特性并且优选它们抑制PD-1的免疫抑制性信号的能力。如发明概述和所附权利要求书中详述的，本发明的抗体的特征在于包含重链可变区(VH)和/或包含轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含具有或含有本文中所示序列的互补决定区3(HCDR3)，所述轻链可变区(VL)包含具有或含有本文中所示序列的互补决定区3(LCDR3)。在一些优选实施方案中，进一步指定了每个VH和VL的互补决定区1和2。
术语“重链可变区”(也称为“VH”)和“轻链可变区”(也称为“VL”)在此以其最一般的含义使用并且包含能够包含互补决定区(CDR)的任何序列，其间散布有其他区域，也称为框架区(FR)。框架区尤其将CDR隔开，使得它们能够形成抗原结合位点，特别是在VH和VL折叠和配对之后。优选地，每个VH和VL由从氨基端到羧基端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。即，术语“重链可变区”和“轻链可变区”不应被解释为限于这样的序列，因为它们可存在于天然抗体或本文中例举的VH和VL序列(序列表的SEQ ID NO：52至70)中。这些术语包括能够包含并适当定位CDR的任何序列，例如如来源于天然抗体的VL和VH区的序列或来源于序列表的SEQ ID NO：52至70中所示的序列的序列。本领域技术人员将理解，可特别地对框架区的序列进行修饰(包括关于氨基酸替换的变体和关于序列长度的变体(即，插入或缺失变体)二者)而分别不丧失VH和VL的特征。在一个优选实施方案中，任何修饰都限于框架区。但是，本领域技术人员也很清楚地知道以下事实：CDR、高变区和可变区也可被修饰而不丧失与PD-1结合的能力。例如，CDR区将与本文中指定的区域相同或高度同源。对于“高度同源”，预期了在CDR中可进行1至5(优选1至4，例如1至3或1或2)个替换。另外，可对高变区和可变区进行修饰以使得它们显示出与本文中具体公开的区域的显著同源性。
已通过使用两种不同的CDR鉴定方法鉴定了本文中指定的CDR。本文中使用的第一编号方案根据Kabat(Wu and Kabat，1970；Kabat et al.，1991)，第二方案是IMGT编号(Lefranc，1997；Lefranc et al.，2005)。在第三种方法中，使用了两种鉴定方案的交叉部分(intersection)。
关于本发明的单克隆嵌合抗体(MAB-19-0202、MAB-19-0208、MAB-19-0217、MAB-19-0223和MAB-19-0233)和单克隆人源化抗体的具体实例，各自的序列示于实施例的表1、2、4和5中。本发明的示例性人源化抗体MAB-19-0603、MAB-19-0608、MAB-19-0613和MAB-19-0618是MAB-19-0202的人源化变体，而本发明的示例性人源化抗体MAB-19-0583、MAB-19-0594和MAB-19-0598是MAB-19-0233的人源化变体。
本发明的抗体原则上可以是任何同种型的抗体。同种型的选择通常受所期望的Fc介导的效应物功能的指导，例如ADCC或CDC诱导，或对缺乏Fc介导的效应物功能的抗体(“惰性”抗体)的需求。示例性同种型是IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。可使用人轻链恒定区κ或λ中的一者。本发明抗体的效应物功能可通过同种型转换为例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM抗体而改变以用于多种治疗用途。在一个实施方案中，抗PD-1抗体具有降低或耗竭的效应物功能。在一个实施方案中，抗PD-1抗体不介导ADCC或CDC或者二者。在一个实施方案中，抗PD-1抗体具有IgG1同种型的恒定区，所述IgG1同种型的恒定区具有降低或耗竭的效应物功能。降低或耗竭的效应物功能可有助于避免对例如通常表达PD-1的T细胞的潜在毒性。
根据本发明的抗体可在Fc区中包含修饰。当抗体包含这样的修饰时，其可变为惰性或非活化抗体。本文中使用的术语“惰性”、“惰性的”或“非活化的”是指Fc区至少不能通过单个抗体的两个Fc区诱导FcR介导的靶抗原的交联、诱导Fc介导的FcR的交联、或结合任何Fc-γ受体，或者不能结合C1q。
可构建数种变体以使抗体的Fc区对与Fc-γ受体和C1q的相互作用无活性以用于治疗性抗体开发。可被修饰的氨基酸位置的实例，例如在IgG1同种型抗体中，包括位置L234、L235和P331。其组合，例如L234F/L235E/P331S，可导致与人CD64、CD32、CD16和C1q的结合显著降低(Xu et al.，2000，Cell Immunol.200(1)：16-26；Oganesyan et al.，2008，Acta Cryst.(D64)：700-4)。此外，L234F和L235E氨基酸替换可导致消除Fc区与Fc-γ受体和C1q的相互作用(Canfield et al.，1991，J.Exp.Med.(173)：1483-91；Duncan et al.，1988，Nature(332)：738-40)。D265A氨基酸替换可降低与全部Fcy受体的结合并防止ADCC(Shields et al.，2001，J.Biol.Chem.(276)：6591-604)。可通过对位置D270、K322、P329和P331进行突变来消除与C1q的结合。将这些位置突变为D270A或K322A或P329A或P331A可使抗体缺乏CDC活性(Idusogie EE，et al.，2000，J Immunol.164：4178-84)。或者，人IgG2和IgG4亚类被认为在其与C1q和Fcγ受体的相互作用中自然受损，尽管已报道了与Fc-γ受体的相互作用(Parren et al.，1992，J.Clin Invest.90：1537-1546；Bruhns et al.，2009，Blood 113：3716-3725)。可在两种同种型中进行消除这些残留的相互作用的突变，从而降低与FcR结合相关的不期望的副作用。对于IgG2，这些包括L234A和G237A，并且对于IgG4，这些包括L235E。另一个合适的惰性突变是P329G。在一个实施方案中，可使用L234、L235和P329惰性突变的组合，例如L234A、L235A和P329G的组合。
本发明的抗体可与传统化学治疗剂或攻击肿瘤的其他免疫治疗协同使用，例如通过使用靶向肿瘤抗原的其他抗体从而诱导针对这些肿瘤细胞的免疫应答或通过使用其他检查点抑制剂或活化剂或血管生成抑制剂。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性在本文中也称为“ADCC”。ADCC描述了本文中所述的效应细胞(特别是淋巴细胞)的细胞杀伤能力，其优选需要被抗体标记的靶细胞。
ADCC优选在抗体与肿瘤细胞上的抗原结合以及抗体Fc结构域与免疫效应细胞表面上的Fc受体(FcR)接合时发生。已经鉴定了数个Fc受体家族，并且特定的细胞群特征性地表达确定的Fc受体。ADCC可被视为直接诱导不同程度的直接肿瘤破坏的机制，其导致抗原呈递和诱导肿瘤指导的T细胞应答。优选地，ADCC的体内诱导将导致肿瘤指导的T细胞应答和宿主来源的抗体应答。
补体依赖性细胞毒性在本文中也称为“CDC”。CDC是可通过抗体指导的另一种细胞杀伤方法。IgM是用于补体活化的最有效的同种型。IgG1和IgG3二者在通过经典补体活化途径指导CDC方面也非常有效。优选地，在该级联中，抗原-抗体复合物的形成导致紧邻参与抗体分子(例如IgG分子)的CH2结构域的多个C1q结合位点暴露出来(C1q是补体C1的三种亚组分之一)。优选地，这些暴露的C1q结合位点将先前的低亲和力C1q-IgG相互作用转化为一种高亲和力相互作用，这触发了涉及一系列其他补体蛋白的级联事件，并且导致效应细胞趋化剂/活化剂C3a和C5a的蛋白水解释放。优选地，该补体级联最终形成膜攻击复合物，其在细胞膜中产生孔，有利于水和溶质自由地进入和离开细胞。
II.抗体的产生
本发明的抗体可通过多种技术产生，包括常规的单克隆抗体方法，例如，Kohlerand Milstein，Nature 256：495(1975)的标准体细胞杂交技术。尽管原则上优选体细胞杂交方法，但是也可使用其他用于产生单克隆抗体的技术，例如B淋巴细胞的病毒或致癌转化或者使用抗体基因文库的噬菌体展示技术。
用于制备分泌单克隆抗体的杂交瘤的优选动物系统是鼠系统。在小鼠中产生杂交瘤是非常完善的程序。免疫接种方案和用于分离经免疫接种的脾细胞以用于融合的技术是本领域已知的。融合伴侣(例如，鼠骨髓瘤细胞)和融合程序也是已知的。
用于制备分泌单克隆抗体的杂交瘤的另一些优选动物系统是大鼠系统和兔系统(例如，描述于Spieker-Polet et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：9348(1995)，另见Rossi et al.，Am.J.Clin.Pathol.124：295(2005))。
在又一个优选实施方案中，可使用携带部分人免疫系统而不是小鼠系统的转基因或转染色体小鼠来产生针对PD-1的人单克隆抗体。这些转基因和转染色体小鼠包括分别称为HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，并且在本文中统称为“转基因小鼠”。可如WO 2004/035607中有关CD20的详细描述在这样的转基因小鼠中进行人抗体的产生。
用于产生单克隆抗体的另一策略是直接从产生具有确定特性(definedstrategy)之抗体的淋巴细胞中分离编码抗体的基因，例如参见Babcock et al.，1996；Anovel strategy for generating monoclonal antibodies from single，isolatedlymphocytes producing antibodies of defined strategy。有关重组抗体改造的细节另见Welschof and Kraus，Recombinant antibodes for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8和Benny K.C.Lo Antibody Engineering ISBN 1-58829-092-1。
免疫接种
为了产生针对PD-1的抗体，可用来源于PD-1序列的载体缀合肽、重组表达的PD-1抗原或其片段的富集制备物和/或表达PD-1的细胞对动物(例如兔或小鼠)进行免疫接种，如所描述的。或者，可用编码全长人PD-1或其片段的DNA对兔或小鼠进行免疫接种。在使用PD-1抗原的纯化或富集制备物进行免疫接种不产生抗体的情况下，还可用表达PD-1的细胞(例如细胞系)对兔或小鼠进行免疫接种来促进免疫应答。
可用通过尾静脉或眶后取血获得的血浆和血清样品在免疫接种方案的全过程中监测免疫应答。具有足够的抗PD-1免疫球蛋白效价的兔或小鼠可用于融合。可在处死并移除脾之前3天，用表达PD-1的细胞经腹膜内或经静脉内对兔或小鼠加强接种，以提高分泌特异性抗体之杂交瘤的比例。
产生单克隆抗体的杂交瘤的产生
为了产生针对PD-1的产生单克隆抗体的杂交瘤，可分离来自经免疫接种动物(例如兔或小鼠)的脾细胞和淋巴结细胞并将其与合适的永生化细胞系，例如小鼠或兔骨髓瘤细胞系融合。然后可针对抗原特异性抗体的产生来筛选所得杂交瘤。然后可通过ELISA筛选单个孔中分泌抗体的杂交瘤。通过使用表达PD-1的细胞进行免疫荧光和FACS分析，可鉴定出对PD-1具有特异性的抗体。可将分泌抗体的杂交瘤重新平板接种(replate)，再次筛选，并且如果抗PD-1单克隆抗体仍呈阳性，则可通过有限稀释进行亚克隆。然后可在组织培养基中体外培养稳定的亚克隆以产生抗体用于表征。
产生单克隆抗体的转染瘤的产生
也可使用例如本领域公知的重组DNA技术和基因转染方法的组合在宿主细胞转染瘤中产生本发明的抗体(Morrison，S.(1985)Science 229：1202)。
例如，在一个实施方案中，可将目的基因(例如，抗体基因)连接到表达载体(例如真核表达质粒)，例如WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338 841中公开的GS基因表达系统或本领域公知的其他表达系统所使用的表达载体中。可将具有克隆的抗体基因的经纯化质粒引入真核宿主细胞中，所述真核宿主细胞例如CHO细胞、NS/0细胞、Sp2/0细胞、COS细胞、Vero细胞、HeLa细胞、HEK293T细胞、HEK293T/17或HEK293细胞，或者替代地其他真核细胞，像植物来源的细胞、真菌或酵母细胞。用于引入这些基因的方法可以是本领域所述的方法，例如电穿孔、lipofectine、lipofectamine等。在将这些抗体基因引入宿主细胞之后，可对表达该抗体的细胞进行鉴定和选择。这些细胞代表此后可扩大其表达水平并扩大规模以生产抗体的转染瘤。可从这些培养物上清液和/或细胞中分离和纯化重组抗体。
或者，克隆的抗体基因可在其他表达系统包括原核细胞，例如微生物，例如大肠杆菌中表达。此外，抗体可在转基因非人动物中产生，例如在绵羊和兔的乳汁中或雌禽(hen)的卵中产生，或者在转基因植物中产生；参见例如Verma，R.，et al.(1998)J.Immunol.Meth.216：165-181；Pollock，et al.(1999)J.Immunol.Meth.231：147-157；和Fischer，R.，et al.(1999)Biol.Chem.380：825-839。
本发明的抗体也可使用本领域技术人员公知的重组DNA技术在遗传修饰的病毒例如RNA病毒中产生。可用于挽救表达抗体或其片段的病毒颗粒的重组病毒基因组，可例如通过称为“反向遗传学”的方法获得。
使用部分抗体序列来表达完整抗体(即人源化和嵌合)。
a)嵌合
鼠或兔单克隆抗体可在人中用作治疗性抗体，但是由于这些抗体在重复应用时在人中可具有高度免疫原性，因此这可导致治疗作用降低。通过重链恒定区介导主要的免疫原性。如果对各个抗体进行嵌合或人源化，则鼠或兔抗体在人中的免疫原性可被降低或完全避免。嵌合抗体是不同部分来源于不同动物物种的抗体，例如具有来源于鼠或兔抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的那些。通过将鼠或兔抗体重链和轻链的可变区与人重链和轻链的恒定区连接来实现抗体的嵌合(例如，如Kraus et al.，在Methods in MolecularBiology series，Recombinant antibodies for cancer therapy，ISBN-0-89603-918-8中所述)。在一个优选实施方案中，通过将人κ-轻链恒定区与鼠或兔轻链可变区连接来产生嵌合抗体。在另一个优选实施方案中，可通过将人λ-轻链恒定区与鼠或兔轻链可变区连接来产生嵌合抗体。用于产生嵌合抗体的一些优选的重链恒定区是IgG1、IgG3和IgG4。用于产生嵌合抗体的另一些优选的重链恒定区是IgG2、IgA、IgD和IgM。
b)人源化
抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)的氨基酸残基与靶抗原相互作用。由于这个原因，在各抗体之间，CDR内的氨基酸序列比CDR外的序列更多样化。由于CDR序列负责大多数抗体-抗原相互作用，因此可通过构建表达载体来表达模拟特定天然存在的抗体之特性的重组抗体，所述表达载体包含来自所述特定天然存在抗体的CDR序列，其枝接到来自具有不同特性之不同抗体的框架序列上(参见，例如，Riechmann，L.et al.(1998)Nature 332：323-327；Jones，P.et al.(1986)Nature 321：522-525；和Queen，C.et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：10029-10033)。这样的框架序列可从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库获得。这些种系序列将不同于成熟的抗体基因序列，因为它们将不包含完整组装的可变基因，其是在B细胞成熟期间通过V(D)J连接而形成的。种系基因序列还将在均匀穿过可变区的个别处不同于高亲和力第二抗体库(secondary repertoireantibody)的序列。例如，框架区1的氨基端部分和框架区4的羧基端部分中的体细胞突变相对不频繁。此外，许多体细胞突变不显著改变抗体的结合特性。由于该原因，没有必要获得特定抗体的完整DNA序列来重建具有与原始抗体相似的结合特性的完整重组抗体(参见WO99/45962)。跨越CDR区的部分重链和轻链序列通常足以满足此目的。部分序列用于确定哪些种系可变和连接基因区段有助于重组抗体可变基因。然后使用该种系序列来填充可变区的缺失部分。重链和轻链前导序列在蛋白质成熟期间被切割，并对最终抗体的特性没有贡献。为了添加缺失的序列，可通过连接或PCR扩增将克隆的cDNA序列与合成寡核苷酸组合。或者，可将整个可变区合成为短的、重叠的寡核苷酸集，并通过PCR扩增组合以产生完全合成的可变区克隆。该过程具有某些优点，例如消除或包含或特定的限制性位点，或优化特定的密码子。
来自杂交瘤的重链和轻链转录物的核苷酸序列用于设计重叠的合成寡核苷酸集以产生具有与天然序列相同的氨基酸编码能力的合成V序列。合成的重链和κ链序列可在三个方面与天然序列不同：重复的核苷酸碱基串被打断以促进寡核苷酸合成和PCR扩增；根据Kozak规则(Kozak，1991，J.Biol.Chem.266：19867-19870)并入最佳的翻译起始位点；以及HindIII位点被设计在翻译起始位点的上游。
对于重链可变区和轻链可变区二者，优化的编码链序列和相应的非编码链序列大约在相应的非编码寡核苷酸的中点处被分解成30至50个核苷酸。因此，对于每条链，可将寡核苷酸组装成跨越150至400个核苷酸区段的重叠双链集。然后将合并物(pool)用作模板以产生150至400个核苷酸的PCR扩增产物。通常来说，单个可变区寡核苷酸集将被分解成两个合并物，这两个合并物被分别扩增以产生两个重叠的PCR产物。然后将这些重叠产物通过PCR扩增进行组合以形成完整的可变区。还可期望的是在PCR扩增中包含重链或轻链恒定区的重叠片段，以产生可轻松克隆到表达载体构建体中的片段。
然后将重建的嵌合或人源化重链和轻链可变区与克隆的启动子序列、前导序列、翻译起始序列、恒定区序列、3’非翻译序列、聚腺苷酸化序列和转录终止序列组合以形成表达载体构建体。可将重链和轻链表达构建体组合成单载体，共转染、连续转染或分别转染到宿主细胞中，然后融合以形成表达两条链的宿主细胞。技术人员可获得用于构建针对人IgGκ表达载体的质粒。可构建质粒使得经PCR扩增的V重链和Vκ轻链cDNA序列可用于重建完整的重链和轻链微基因(minigene)。这些质粒可用于完整地表达人或嵌合的IgG1、κ或IgG4、κ抗体。可构建类似的质粒用于表达其他重链同种型，或用于表达包含λ轻链的抗体。
因此，根据本发明，本发明的抗PD-1抗体的结构特征可用于产生结构相关的人源化抗PD-1抗体，其保留本发明的抗体的至少一种功能特性，例如与PD-1结合。更特别地，本文中公开的一个或更多个CDR区可与已知的人框架区和CDR重组组合以产生本发明的另外的、重组改造的人源化抗PD-1抗体。
III.抗体的表征
与表达抗原的细胞结合
抗体结合PD-1和/或阻断PD-1/配体相互作用的能力可使用标准结合测定、报道基因阻断测定、T细胞增殖测定等来确定，例如实施例中所示的那些。
抗体结合的表征
为了纯化抗PD-1抗体，选择的杂交瘤可在两升旋式烧瓶(spinner-flask)中培养以进行单克隆抗体纯化。或者，可在基于透析的生物反应器中产生抗PD-1抗体。可过滤上清液，并且如果必要的话，在用蛋白G-琼脂糖凝胶(G-sepharose)或蛋白A-琼脂糖凝胶(A-sepharose)进行亲和色谱之前进行浓缩。可通过凝胶电泳和高效液相色谱来检查洗脱的IgG以确保纯度。可将缓冲液交换到PBS中，并且可使用1.43消光系数通过OD280来确定浓度。可将单克隆抗体等分并储存在-80℃下。为了确定所选择的抗PD-1单克隆抗体是否与独特的表位结合，可使用位点定向或多位点定向诱变。
确定PD-1结合特异性
抗PD-1抗体与PD-1的结合效力可通过ELISA技术来确定。例如，可将PD-1/Fc嵌合体包被在微量滴定板上。在封闭之后，可添加待测试的抗PD-1抗体并孵育。然后，在进行洗涤程序之后，可添加与例如辣根过氧化物酶偶联的抗人IgG以用于检测。
可使用异位表达PD-1的HEK-293细胞来分析抗PD-1抗体与细胞表面表达的PD-1的结合能力。可将抗PD-1抗体以不同浓度添加至这些细胞并孵育。然后可添加与荧光标签缀合的抗Ig抗体，并且可记录细胞相关的免疫荧光信号。
确定阻断能力
可使用PD-1/PD-L1阻断生物测定来分析抗PD-1抗体阻断PD-1/PD-L1相互作用的效力。可将表达PD-L1的细胞与不同浓度的待测试抗体一起孵育。在添加表达PD-1的效应细胞并孵育由此获得的混合物之后，例如可添加萤光素酶测定试剂并且可确定发光。可按照制造商的说明来使用PD-1/PD-L1阻断生物测定(Promega，目录号J12150)或同类试剂盒。
为了表征抗PD1抗体在活性PD-1/PD-L1轴的抗原特异性测定中诱导T细胞增殖的能力，可产生表达肿瘤抗原的树突细胞(DC)。这样的测定在下文实施例5中以非限制性方式详细描述。
流式细胞术分析和免疫荧光显微术
为了证明经免疫接种动物血清中抗PD-1抗体的存在或单克隆抗体与表达PD-1的活细胞的结合，可以以技术人员公知的方式使用流式细胞术或免疫荧光显微术分析。
表位作图
对被本发明的抗体识别的表位进行作图可按照Glenn E.Morris的“EpitopeMapping Protocols”，Methods in Molecular Biology ISBN-089603-375-9和OlwynM.R.Westwood，Frank C.Hay的，，Epitope Mapping：A Practical Approach“，PracticalApproach Series，248中的详细描述进行。
IV.与PD-1结合的双特异性/多特异性抗体
在本发明的另一个实施方案中，针对PD-1的抗体可被衍生化或连接至另一功能性分子，例如另一肽或蛋白质(例如，Fab’片段)以产生与多个结合位点或靶表位结合的双特异性或多特异性分子。例如，本发明的抗体可与一种或更多种其他结合分子，例如另一种抗体、肽或结合模拟物功能性连接(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价缔合或其他方式)。
因此，本发明包括双特异性和多特异性分子，其包含至少一种针对PD-1的第一结合特异性和针对第二靶表位(或针对其他靶表位)的第二结合特异性(或另外的结合特异性)。
第二结合特异性可针对另一个免疫检查点，从而抑制或活化/刺激相应的检查点。可被靶向的其他检查点抑制剂包括但不限于CTLA4、PD-L1、TIM-3、KIR或LAG-3。可被第二结合特异性靶向的检查点活化剂包括但不限于CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、OX40、GITR或ICOS。因此，本发明包括既能够结合至少一种其他检查点又能够通过相应结合抑制PD-1的双特异性和多特异性分子。第二结合特异性可以是拮抗性的，例如抗CTLA4、抗PD-L1、抗TIM-3、抗KIR或抗LAG-3，或者可以是激动性的，例如抗CD27、抗CD28、抗CD40、抗CD122、抗CD137、抗OX40、抗GITR或抗ICOS。本发明还涵盖能够与PD-1结合并且除此之外还与至少一种其他免疫检查点结合的多特异性分子。结合特异性的优选组合包括抗PD1和抗PD-L1或抗PD-1和抗CTLA4。
例如，CD28提供了可能是T细胞活化所必需的刺激性诱导。这同样适用于例如CD137。CD137(4-1BB，TNFRSF9)是肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)受体(tumornecrosis factor receptor，TNFR)超家族的成员。CD137是CD8+和CD4+T细胞、调节性T细胞(Treg)、自然杀伤(NK)和NKT细胞、B细胞和中性粒细胞上的共刺激分子。在T细胞上，CD137不是组成型表达的，而是在T细胞受体(T-cell receptor，TCR)活化之后诱导的。通过其天然配体4-1BBL或激动剂抗体的刺激导致使用TNFR相关因子(TRAF)-2和TRAF-1作为适配体的信号传导。经由CD137的早期信号传导涉及K-63多泛素化反应，其最终导致核因子(NF)-κB和丝裂原活化蛋白(mitogen-activated protein，MAP)-激酶途径的激活。信号传导导致提高的T细胞共刺激、增殖、细胞因子产生、成熟和延长的CD8+T细胞存活。已表明针对CD137的激动性抗体在多种临床前模型中促进了T细胞的抗肿瘤控制(Murillo etal.2008Clin.Cancer Res.14(21)：6895-6906)。刺激CD137的抗体可诱导T细胞的存活和增殖，从而增强抗肿瘤免疫应答。现有技术中已经公开了刺激CD137的抗体，并且包括乌瑞芦单抗(urelumab)，其是人IgG4抗体(WO 2005/035584)和乌托鲁单抗(utomilumab)，其是人IgG2抗体(Fisher et al.2012 Cancer Immunol.Immunother.61：1721-1733)。
或者，第二结合特异性可提供抗血管生成活性。因此，第二结合特异性可使得能够靶向血管内皮生长因子(VEGF)或其受体VEGFR(例如VEGFR1、2、3)。作为替代或补充，第二结合特异性可使得能够靶向PDGFR、c-Kit、Raf和/或RET。
本发明还涵盖了本发明的双特异性或多特异性分子的第二或另外的结合特异性可针对肿瘤抗原并且能够与肿瘤抗原结合。肿瘤抗原可以是表面抗原或在MHC环境中呈递的抗原。结合特异性可例如基于B细胞受体(抗体)或T细胞受体。
本文中使用的术语“肿瘤抗原”是指癌细胞的组分，其可来源于细胞质、细胞表面和细胞核。特别地，它是指在细胞内产生的或作为肿瘤细胞上的表面抗原的那些抗原。肿瘤抗原通常优先地由癌细胞表达(例如，与非癌细胞相比，其在癌细胞中以更高的水平表达)，并且在一些情况下，其仅由癌细胞表达。肿瘤抗原的一些实例包括但不限于p53，ART-4，BAGE，β-联蛋白/m，Bcr-abL CAMEL，CAP-1，CASP-8，CDC27/m，CDK4/m，CEA，密蛋白(claudin)家族的细胞表面蛋白，例如密蛋白-6，密蛋白-18.2和密蛋白-12，c-MYC，CT，Cyp-B，DAM，ELF2M，ETV6-AML1，G250，GAGE，GnT-V，Gap 100，HAGE，HER-2/neu，HPV-E7，HPV-E6，HAST-2，hTERT(或hTRT)，LAGE，LDLR/FUT，MAGE-A，优选MAGE-A1，MAGE-A2，MAGE-A3，MAGE-A4，MAGE-A5，MAGE-A6，MAGE-A7，MAGE-A8，MAGE-A9，MAGE-A10，MAGE-A11，或MAGE-A12，MAGE-B，MAGE-C，MART-1/Melan-A，MC1R，肌球蛋白/m，MUC1，MUM-1，MUM-2，MUM-3，NA88-A，NF1，NY-ESO-1，NY-BR-1，pl90 minor BCR-abL，Pml/RARa，PRAME，蛋白酶3，PSA，PSM，RAGE，RU1或RU2，SAGE，SART-1或SART-3，SCGB3A2，SCP1，SCP2，SCP3，SSX，存活蛋白(SURVIVIN)，TEL/AML1，TPI/m，TRP-1，TRP-2，TRP-2/INT2，TPTE，WT和WT-1。
在一个实施方案中，待被靶向的第二抗原选自以下：
NY-ESO-1(UniProt P78358)，酪氨酸酶(UniProt P14679)，MAGE-A3(UniProtP43357)，TPTE(UniProt P56180)，KLK2(UniProt P20151)，PSA(KLK3)(UniProt P07288)，PAP(ACPP，UniProt P15309)，HOXB13(UniProt Q92826)，NKX3-1(UniProt Q99801)，HPV16E6/E7(UniProt P03126/P03129)；HPV18 E6/E7(UniProt P06463/P06788)；HPV31 E6/E7(UniProt P17386/P17387)；HPV33 E6/E7(UniProt P06427/P06429)；HPV45 E6/E7(UniProt P21735/P21736)；HPV58 E6/E7(UniProt P26555/P26557)，PRAME(UniProtP78395)，ACTL8(UniProt Q9H568)，CXorf61(KKLC1，UniProt Q5H943)，MAGE-A9B(UniProtP43362)，CLDN6(UniProt P56747)，PLAC1(UniProt Q9HBJ0)和p53(UniProt P04637)。
涉及这些抗原的治疗方法可旨在治疗癌症，其中癌细胞的特征在于表达相应的抗原。也可使用本文中所述的抗原，特别是NY-ESO-1、酪氨酸酶、MAGE-A3、TPTE、KLK2、PSA(KLK3)、PAP(ACPP)、HOXB13、NKX3-1、HPV16 E6/E7；HPV18 E6/E7；HPV31 E6/E7；HPV33 E6/E7；HPV45 E6/E7；HPV58 E6/E7、PRAME、ACTL8、CXorf61(KKLC1)、MAGE-A9B、CLDN6、PLAC1和p53的组合。涉及这样的抗原组合的治疗方法可旨在治疗癌症，其中癌细胞的特征在于表达相应的抗原组合中的两种或更多种抗原，或者其中患有某种待治疗癌症的患者的大部分(例如，至少80％、至少90％或甚至更多)的癌细胞表达组合中的一种或更多种相应抗原。这样的组合可包含至少2种、至少3种、至少4种、至少5种或至少6种抗原的组合。因此，所述组合可包含3、4、5、6、7或8种抗原。
对于皮肤黑素瘤的治疗，另外的一种或更多种结合特异性可至少靶向以下抗原之一：NY-ESO-1、酪氨酸酶、MAGE-A3和/或TPTE。
对于前列腺癌的治疗，另外的一种或更多种结合特异性可至少靶向以下抗原之一：KLK2、PSA(KLK3)、PAP(ACPP)、HOXB13和/或NKX3-1。
对于乳腺癌的治疗，另外的一种或更多种结合特异性可至少靶向以下抗原之一：PRAME、ACTL8、CXorf61(KKLC1)、MAGEA3、MAGE-A9B、CLDN6、NY-ESO-1和/或PLAC1。
对于卵巢癌的治疗，另外的一种或更多种结合特异性可至少靶向以下抗原之一：CLDN6、p53和/或PRAME。
除肿瘤抗原特异性和抗PD-1结合特异性之外，本发明的双特异性和多特异性分子还可包含第三结合特异性。在一个实施方案中，第三结合特异性针对Fc受体，例如人Fc-γRI(CD64)或人Fc-α受体(CD89)。因此，本发明包括能够与以下结合的多特异性分子：PD-1、表达效应细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞多形核细胞(PMN))的Fc-γR、Fc-αR或Fc-εR以及表达肿瘤抗原的靶标癌细胞。这些多特异性分子可触发Fc受体介导的效应细胞活性，例如表达肿瘤抗原的细胞的吞噬作用、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、细胞因子释放或超氧阴离子的产生。
在另一个实施方案中，第三结合特异性是抗增强因子(EF)部分，例如与参与细胞毒性活性的表面蛋白结合并由此提高针对靶细胞的免疫应答的分子。“抗增强因子部分”可以是抗体、功能性抗体片段或配体，其与给定分子，例如抗原或受体结合，并由此导致增强Fc受体或靶细胞抗原的结合决定簇的作用。“抗增强因子部分”可结合Fc受体或靶细胞抗原。或者，抗增强因子部分可结合与第一和第二结合特异性结合的实体不同的实体。例如，抗增强因子部分可结合细胞毒性T细胞(例如，通过CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1或导致提高的针对靶细胞的免疫应答的其他免疫细胞)。
在一个实施方案中，本发明的双特异性和多特异性分子包含作为结合特异性的至少一种抗体，包括例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或单链Fv。抗体也可以是轻链或重链二聚体，或其任何最小片段，例如Fv或单链构建体，如Ladner et al.，US 4,946,778中所述。抗体也可以是结合结构域免疫球蛋白融合蛋白，如US 2003/0118592和US 2003/0133939中所公开。
本文中使用的术语“效应细胞”是指参与与免疫应答的认知和活化阶段相反的免疫应答的效应阶段的免疫细胞。示例性的免疫细胞包括髓样或淋巴来源的细胞，例如，淋巴细胞(例如，B细胞和T细胞包括溶细胞性T细胞(CTL)、杀伤细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、多形核细胞、粒细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞。一些效应细胞表达特定的Fc受体并执行特定的免疫功能。在一些优选实施方案中，效应细胞能够诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，例如能够诱导ADCC的嗜中性粒细胞。例如，表达FcR的自然杀伤细胞、单核细胞、巨噬细胞参与靶细胞的特异性杀伤并将抗原呈递至免疫系统的其他组分，或与呈递抗原的细胞结合。在另一些实施方案中，效应细胞可吞噬靶抗原、靶细胞或微生物。效应细胞上特定FcR的表达可由体液因子(例如细胞因子)调节。例如，已发现Fc-γRI的表达被干扰素γ(IFN-γ)上调。这种增强的表达提高了携带Fc-γRI的细胞针对靶标的细胞毒性活性。效应细胞可吞噬靶抗原或靶细胞或者使其裂解。
“靶细胞”将意指对象(例如，人或动物)中可被本发明的抗体靶向的任何不期望的细胞。在一些优选实施方案中，靶细胞是肿瘤细胞。
本发明的双特异性和多特异性分子可使用化学技术(参见，例如D.M.Kranz etal.(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：5807)、“polydoma”技术(参见US 4,474,893，toReading)或重组DNA技术来制备。
特别地，可通过使用本领域已知的方法将组成性结合特异性，例如，抗CTLA4和抗PD-1结合特异性缀合来制备本发明的双特异性和多特异性分子。例如，双特异性和多特异性分子的每种结合特异性可分别产生，并随后彼此缀合。当结合特异性是蛋白质或肽时，可使用多种偶联剂或交联剂进行共价缀合。交联剂的一些实例包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻苯二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)和磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)(参见例如，Karpovsky et al.(1984)J.Exp.Med.160：1686；Liu，MA et al.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648)。其他方法包括Paulus(Behring Ins.Mitt.(1985)No.78，118-132)；Brennan et al.(Science(1985)229：81-83)和Glennie et al.(J.Immunol.(1987)139：2367-2375)所述的那些。优选的缀合剂是SATA和磺基-SMCC，二者均可从Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)获得。
当结合特异性是抗体时，它们可通过两条重链的C端铰链区的巯基键合缀合。在一个特别优选的实施方案中，铰链区被修饰为在缀合之前包含奇数个巯基残基，优选一个巯基残基。
或者，两种结合特异性可在同一载体中编码，并在同一宿主细胞中表达和组装。在双特异性和多特异性分子是mAb×mAb、mAb×Fab、Fab×F(ab’)2或配体×Fab融合蛋白的情况下，该方法特别有用。本发明的双特异性和多特异性分子，例如双特异性分子，可以是单链分子，例如单链双特异性抗体、包含一个单链抗体和结合决定簇的单链双特异性分子，或包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性和多特异性分子也可以是单链分子或可包含至少两个单链分子。用于制备双特异性和多特异性分子的方法描述于例如US 5,260,203；US 5,455,030；US 4,881,175；US 5,132,405；US 5,091,513；US 5,476,786；US5,013,653；US 5,258,498；和US 5,482,858中。因此，本发明涵盖所有这些抗体形式。
双特异性和多特异性分子与其特定靶标的结合可通过酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、放射免疫测定(radioimmunoassay，RIA)、FACS分析、生物测定(例如，生长抑制)或Western印迹测定来确定。这些测定中的每一种通常通过使用对目的复合物具有特异性的经标记物质(例如，抗体)来检测特别感兴趣的蛋白质-抗体复合物的存在。例如，可使用例如识别并特异性结合抗体-FcR复合物的酶联抗体或抗体片段来检测FcR-抗体复合物。或者，可使用多种其他免疫测定中的任一种来检测复合物。例如，抗体可被放射性地标记并用于放射免疫测定(RIA)(参见，例如，Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays，Seventh Training Course on Radioligand AssayTechniques，The Endocrine Society，March，1986)。放射性同位素可通过例如使用γ-计数器或闪烁计数器或通过放射自显影方法来检测。
V.免疫缀合物
在另一个方面中，本发明的特征在于与部分或试剂缀合的抗PD-1抗体。这样的缀合物在本文中也称为“免疫缀合物”。
所述部分或试剂可以是与抗体结合的酶。这样的抗体可用于酶免疫测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)或酶倍增免疫测定技术(Enzyme multiplication immunoassaytechnique，EMIT)，或例如Western印迹。
作为替代或补充，放射性核素(放射性同位素)可作为部分或试剂与抗体结合。这样的缀合物可用于治疗，但也可用于诊断目的(放射免疫测定、正电子发射断层扫描(“免疫-PET”))。放射性核素可通过络合剂与抗体缀合。本发明的抗体还可与放射性同位素，例如碘-131、钇-90或铟-111缀合，来产生用于治疗病症例如癌症的细胞毒性放射性药物。根据本发明的抗体可与接头-螯合剂例如tiuxetan连接，所述tiuxetan允许抗体与放射性同位素缀合。
作为替代或补充，所述部分或试剂可以是标签，例如荧光标签，也称为荧光标记或荧光探针。溴化乙锭、荧光素和绿色荧光蛋白是常见的标签。
本发明还涵盖包含治疗部分或治疗剂的缀合物。治疗部分或治疗剂可以是细胞因子或CD80，其与CD28结合，导致在T细胞应答中产生共刺激信号。治疗部分或治疗剂也可以是细胞毒素或药物(例如，免疫抑制剂)。包含一种或更多种细胞毒素的免疫缀合物被称为“免疫毒素”。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害并特别地杀伤细胞的任何试剂。一些实例包括泰素(taxol)、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙啶、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙碱(colchicin)、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素(anthracin)二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素，及其类似物或同源物。
适于形成本发明的免疫缀合物的合适的治疗剂包括但不限于：抗代谢物(例如，甲氨喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶达卡巴嗪(decarbazine))、烷化剂(例如，氮芥(mechlorethamine)、塞替派苯丁酸氮芥(thioepachlorambucil)、美法仑(melphalan)、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司丁(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺式-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类(例如，柔红霉素(原名道诺霉素)和多柔比星)、抗生素类(例如，更生霉素(原名放线菌素)、博来霉素、光辉霉素和安曲霉素(AMC))以及抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。在一个优选实施方案中，治疗剂是细胞毒性剂或放射毒性剂。在另一个实施方案中，治疗剂是免疫抑制剂。在又一个实施方案中，治疗剂是GM-CSF。在一个优选实施方案中，治疗剂是多柔比星、顺铂、博来霉素、硫酸盐/酯、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、环磷酰胺或蓖麻毒蛋白A。
本发明的抗体缀合物可用于修饰给定的生物应答，并且药物部分不应被解释为限于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有期望生物活性的蛋白质或多肽。这样的蛋白质可包括，例如，具有酶促活性的毒素或其活性片段，例如相思豆毒蛋白(abrin)、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质，例如肿瘤坏死因子或干扰素-γ；或者，生物应答调节剂，例如如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其他生长因子。
用于将这样的治疗部分与抗体缀合的技术是公知的，参见，例如，Arnon et al.，″Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy″，在Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy中，Reisfeld et al.(eds.)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom et al.，″Antibodies For Drug Delivery″，在Controlled Drug Delivery(2nd Ed.)中，Robinson et al.(eds.)，pp.623-53(MarcelDekker，Inc.1987)；Thorpe，″Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In CancerTherapy：A Review″，在Monoclonal Antibodies′84：Biological And ClinicalApplications中，Pincheraet al.(eds.)，pp.475-506(1985)；″Analysis，Results，AndFuture Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In CancerTherapy″，在Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy中，Baldwinet al.(eds.)，pp.303-16(Academic Press 1985)以及Thorpe et al.，″The PreparationAnd Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates″，Immunol.Rev.，62：119-58(1982)。缀合物的部分，例如治疗部分，或试剂可通过接头序列与抗体缀合。合适的接头序列是技术人员已知的。
VI.编码抗体的核酸
在另一个方面中，本发明还涉及包含编码本文中所述的抗体或其部分(例如抗体链)的基因或核酸序列的核酸或核酸分子。
本文中使用的术语“核酸分子”或“核酸”旨在包括脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)或核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)分子。根据本发明，核酸包括基因组DNA、cDNA、mRNA、重组产生和化学合成的分子。根据本发明，核酸可作为单链或双链和线性或共价环状闭合的分子存在。例如，核酸是双链DNA。
根据本发明描述的核酸优选地已被分离。根据本发明，术语“分离的核酸”意指核酸是(i)在体外扩增的，例如通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)，(ii)通过克隆重组产生的，(iii)纯化的，例如通过切割和凝胶电泳分级，或(iv)合成的，例如通过化学合成。分离的核酸是可用于通过重组DNA技术进行操作的核酸。
根据本发明，核酸可单独存在或与其他核酸组合存在，其可以是同源或异源的。在一些优选实施方案中，核酸与表达控制序列功能性连接，所述表达控制序列相对于所述核酸可以是同源的或异源的。术语“同源”意指核酸也与天然表达控制序列功能性连接，并且术语“异源”意指核酸未与天然表达控制序列功能性连接。
如果核酸，例如表达RNA和/或蛋白质或肽的核酸，和表达控制序列以以下这样的方式彼此共价连接，则该核酸彼此“功能性”连接：所述核酸的表达或转录受所述表达控制序列的控制或影响。如果将核酸翻译成功能性蛋白质，则在表达控制序列与编码序列的功能性连接的情况下，诱导所述表达控制序列导致所述核酸的转录，而不引起编码序列的移码或者所述编码序列不能被翻译成期望的蛋白质或肽。
根据本发明，术语“表达控制序列”包含启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因的转录或mRNA的翻译的其他控制元件。在本发明的一些具体实施方案中，可调节表达控制序列。表达控制序列的确切结构可根据物种或细胞类型而变化，但通常包含分别参与转录和翻译起始的5’-非转录序列和5’-和3’-非翻译序列(5’-UTR；3’-UTR)，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。更特别地，5’-非转录表达控制序列包含启动子区，其包含用于功能性连接的核酸之转录控制的启动子序列。表达控制序列还可包含增强子序列或上游活化子序列。
根据本发明，术语“启动子”或“启动子区”涉及位于被表达核酸序列上游(5’)的核酸序列，并通过为RNA-聚合酶提供识别和结合位点控制该序列的表达。“启动子区”还可包含针对参与基因的转录调节的其他因子的识别和结合位点。启动子可控制原核或真核基因的转录。此外，启动子可以是“诱导型的”并且可响应于诱导剂启动转录或者如果转录不受诱导剂的控制，则其可以是“组成型的”。如果不存在诱导剂，则受诱导型启动子控制的基因不表达或仅表达很小程度。在存在诱导剂的情况下，基因被开启或转录水平提高。一般而言，这是通过特定转录因子的结合介导的。
根据本发明优选的启动子包括针对SP6、T3和T7聚合酶的启动子、人U6 RNA启动子、CMV启动子及其人工杂合启动子(例如，CMV)，其中一部分或多部分与其他细胞蛋白例如如人GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)之基因的启动子的一部分或多部分融合，并且包括或不包括另外的内含子。
根据本发明，术语“表达”以其最一般的含义使用，并且包含RNA或RNA和蛋白质/肽的产生。其还包括核酸的部分表达。此外，表达可瞬时或稳定地进行。
在一个优选实施方案中，根据本发明的核酸分子存在于载体中，其在适当情况下具有控制核酸表达的启动子。术语“载体”在此以其最一般的含义使用，并且包含用于核酸的任何中间载剂，其能够使所述核酸例如被引入到原核和/或真核细胞中并且在适当时被整合到基因组中。这种类型的载体优选在细胞中复制和/或表达。载体不但包含质粒、噬菌粒、噬菌体或病毒基因组，而且还包含脂质体。本文中使用的术语“质粒”通常涉及染色体外遗传物质的构建体，通常是环状DNA双链体，其可独立于染色体DNA复制。
使用重组技术用于克隆或表达的载体是本领域已知的，并且包含例如基于质粒的表达载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体或杆状病毒载体。载体的一些实例包含pGEX、pET、pLexA、pBI、pVITRO、pVIVO和pST，例如pST4。
载体可以是IVT载体。IVT载体可以以标准化方式用作体外转录的模板。这样的IVT载体可具有以下结构：能够实现RNA转录的5’RNA聚合酶启动子，随后是侧翼为3’和/或5’非翻译区(untranslated region，UTR)的目的基因，以及含有A核苷酸的3’多腺苷酸盒。另外任选地，这样的载体可包含编码信号肽的核酸序列，所述信号肽用于分泌所编码的蛋白质。在体外转录之前，可通过II型限制性酶(识别序列对应于切割位点)在多腺苷酸盒的下游使环状质粒线性化。因此，多腺苷酸盒对应于转录物中后面的poly(A)序列。在一个实施方案中，载体是基于pST4的IVT载体，优选地包含5’-UTR、3’-UTR和3’多腺苷酸盒。任选地，IVT载体还可包含编码信号肽的盒。
作为5’-UTR序列，可使用人α-珠蛋白mRNA的5’-UTR序列，任选地具有“Kozak序列”或优化的“Kozak序列”以提高翻译效率。5’-UTR序列可以是智人(Homo sapiens)血红蛋白亚基α1的序列。5’-UTR序列的合适序列在序列表的SEQ ID NO：94和95(“Kozak序列”)中例举。或者，5’-UTR可以是序列表的SEQ ID NO：94和95中描述的序列的变体。
作为3’-UTR序列，可使用人β-珠蛋白mRNA的两个重复的3’-UTR，并任选地置于编码序列与poly(A)尾之间，以确保更高的最大蛋白质水平和延长的mRNA持久性。或者，3’-UTR可以是来源于“分裂的氨基端增强子”(AES)mRNA(称为F)和线粒体编码的12S核糖体RNA(称为I)的两种序列元件(FI元件)的组合。这些通过对赋予RNA稳定性和增强总蛋白表达的序列进行离体选择过程来鉴定(参见WO 2017/060314，其通过引用并入本文)。3’-UTR序列的合适序列在序列表的SEQ ID NO：101和102中例举，其可用于形成’FI’-元件。或者，3’-UTR可以是序列表的SEQ ID NO：101和102中描述的序列的变体。
在一个实施方案中，IVT核酸载体还可编码/包含poly(A)-尾，优选如本文中进一步指定的poly(A)-尾。例如，可使用测量长度为110个核苷酸的poly(A)尾，其由以下组成：30个腺苷残基的区段(stretch)，随后是10个核苷酸的接头序列(随机核苷酸)和另外70个腺苷残基。该poly(A)尾序列被设计成增强树突细胞中的RNA稳定性和翻译效率(参见WO2016/005324 A1，其通过引用并入本文中)。
在一个实施方案中，载体可包含编码用于蛋白质分泌的信号肽的核酸序列。分泌信号肽可以是智人MHC I类复合体分泌信号肽，例如husec-HLAI-Cw(opt)(GenBank：BAF96505.1)。
前述元件可以以以下顺序位于载体中：
(i)5’-UTR-‘Kozac序列’-编码抗体或抗体链或者其片段的核酸序列-3’-UTR-poly(A)-尾；或者
(ii)5’-UTR-‘Kozac序列’-分泌信号肽-编码抗体或抗体链或者其片段的核酸序列-3’-UTR-poly(A)-尾。
用于表达抗体的载体类型可以是其中抗体重链和轻链存在于不同载体中的载体类型，或其中重链和轻链存在于同一载体中的载体类型。
在一个实施方案中，由核酸编码的抗体可以是选自以下的抗体：IgG1、IgG2(优选IgG2a和IgG2b)、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、分泌型IgA、IgD和IgE抗体。在一个实施方案中，抗体是Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段或单链(scFv)抗体。例如，编码抗体或抗体链的核酸序列可包含编码本文中所述抗体，例如MAB-19-0202、MAB-19-0208、MAB-19-0217、MAB-19-0223、MAB-19-0233、MAB-19-0603、MAB-19-0608、MAB-19-0613、MAB-19-0618、MAB-19-0583、MAB-19-0594、MAB-19-0598)，或这些抗体中一者的重链或轻链的核酸序列。在一个实施方案中，核酸包含编码本文中所述的抗体链的核酸序列。
抗体链可以是重链(H链)或轻链(L链)，各自优选地如本文中所述。在一个实施方案中，H链包含重链可变区(VH)和重链恒定区，其中重链恒定区可包含重链CH1恒定区或重链CH1恒定区、重链CH2恒定区和重链CH3恒定区的组合。在一个实施方案中，CH1恒定结构域和CH2恒定结构域可通过位于CH1恒定结构域与CH2恒定结构域之间的铰链区连接。
在一个实施方案中，L链包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区，其中轻链恒定区可以是CLκ恒定结构域或CLλ恒定结构域。
在一个实施方案中，编码抗体或抗体链的核酸包含编码重链可变区(VH)的核酸序列，所述重链可变区(VH)包含本文中所例举的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列中的至少一者(序列表的SEQ ID NO：1至32、SYN、RYY)。也就是说，所述核酸可包含编码如本文中所例举的HCDR1、HCDR2或HCDR3序列的核酸序列，或者所述核酸可包含编码重链可变区(VH)的核酸序列，所述重链可变区(VH)包含如本文中限定的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的任何组合。单独的HCDR1至HCDR3序列的优选组合如上文关于各氨基酸序列所指定。该教导相应地适用于核酸序列。
在一个实施方案中，核酸包含编码轻链可变区(VL)的核酸序列，所述轻链可变区(VL)包含本文中所例举的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列中的至少一者(序列表的SEQ ID NO：33至51、QAS、DAS)。也就是说，所述核酸可包含编码如本文中所例举的LCDR1、LCDR2或LCDR3序列的核酸序列，或者所述核酸可包含编码轻链可变区(VL)的核酸序列，所述轻链可变区(VL)包含如本文中限定的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的任何组合。单独的LCDR1至LCDR3序列的优选组合如上文关于各氨基酸序列所指定。该教导相应地适用于核酸序列。
在一个实施方案中，核酸包含编码如本文中所例举的VH和VL序列的核酸序列(序列表的SEQ ID NO：52至70)。
在一个实施方案中，核酸包含如序列表的SEQ ID NO：74至92中所示的核酸序列。
在一个实施方案中，提供了核酸或包含核酸的载体，例如RNA或基于RNA的载体，或适于体外转录的载体，其包含编码与PD-1结合的抗体之重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)的核酸序列，其中该核酸与序列表的SEQ ID NO：74至92中所示的核酸序列之一具有至少70％同一性，并且编码序列表的SEQ ID NO：1至32和SEQ ID NO：33至51中所示的相应HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列和/或LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
在一个实施方案中，变体核酸序列与SEQ ID NO：74至SEQ ID NO：92中所示的核酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性。在一个实施方案中，核苷酸和核苷酸类似物被认为是相同的，以用于确定同一性程度。例如，尿苷(U)和假尿苷(例如m1ψ)被认为是相同的，以用于确定同一性程度。
在一个实施方案中，变体核酸序列包含/编码如本文中指定的相应CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列中的一种或更多种。换言之，编码重链可变区(VH)的变体核酸序列可包含/编码如本文中指定的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列中的一种或更多种，其中对于CDR序列的特定组合，参考本文中的相应公开内容。例如，变体核酸序列可包含/编码如本文中指定的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列。
编码轻链可变区(VL)的变体核酸序列可包含/编码如本文中指定的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列中的一种或更多种，其中对于CDR序列的特定组合，参考本文中的相应公开内容。例如，变体核酸序列可包含/编码如本文中指定的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
变体核酸序列可编码重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)，其能够提供与分别由亲本序列的重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)所提供的相同的结合特异性和/或功能。
在一个实施方案中，提供了编码与PD-1结合的抗体的重链可变区(VH)的核酸，该重链可变区(VH)具有包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列的氨基酸序列，其中编码VH的核酸序列与SEQ ID NO：74具有至少70％同一性，并且其中所编码的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列：
(i)分别选自SYN、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：1；
(ii)分别选自SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：1；或者
(iii)分别选自SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：6。
在一个实施方案中，提供了编码与PD-1结合的抗体的轻链可变区(VL)的核酸，该轻链可变区(VL)具有包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列的氨基酸序列，其中编码VL的核酸序列与SEQ ID NO：79具有至少70％同一性，并且其中所编码的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列：
(i)分别选自SEQ ID NO：42、QAS和SEQ ID NO：33；或者
(ii)分别选自SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：33。
在一个实施方案中，上述VH变体与SEQ ID NO：74中所示的核酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性。在一个实施方案中，上述VL变体与SEQ ID NO：79中所示的核酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性。
在一个实施方案中，提供了编码与PD-1结合的抗体的重链可变区(VH)的核酸，该重链可变区(VH)具有包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列的氨基酸序列，其中编码VH的核酸序列与SEQ ID NO：75具有至少70％同一性，并且其中所编码的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列：
(i)分别选自RYY、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：2；
(ii)分别选自SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：2；或者
(iii)分别选自SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：7。
在一个实施方案中，提供了编码与PD-1结合的抗体的轻链可变区(VL)的核酸，该轻链可变区(VL)具有包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列的氨基酸序列，其中编码VL的核酸序列与SEQ ID NO：80具有至少70％同一性，并且其中所编码的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列：
(i)分别选自SEQ ID NO：43、DAS和SEQ ID NO：34；或者
(ii)分别选自SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：34。
在一个实施方案中，上述VH变体与SEQ ID NO：75中所示的核酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性。在一个实施方案中，上述VL变体与SEQ ID NO：80中所示的核酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性。
在一个实施方案中，提供了编码与PD-1结合的抗体的重链可变区(VH)的核酸，该重链可变区(VH)具有包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列的氨基酸序列，其中编码VH的核酸序列与SEQ ID NO：76具有至少70％同一性，并且其中所编码的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列：
(i)分别选自RYY、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：3；
(ii)分别选自SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：3；或者
(iii)分别选自SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：8。
在一个实施方案中，提供了编码与PD-1结合的抗体的轻链可变区(VL)的核酸，该轻链可变区(VL)具有包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列的氨基酸序列，其中编码VL的核酸序列与SEQ ID NO：81具有至少70％同一性，并且其中所编码的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列：
(i)分别选自SEQ ID NO：44、DAS和SEQ ID NO：35；或者
(ii)分别选自SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：35。
在一个实施方案中，上述VH变体与SEQ ID NO：76中所示的核酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性。在一个实施方案中，上述VL变体与SEQ ID NO：81中所示的核酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性。
在一个实施方案中，提供了编码与PD-1结合的抗体的重链可变区(VH)的核酸，该重链可变区(VH)具有包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列的氨基酸序列，其中编码VH的核酸序列与SEQ ID NO：77具有至少70％同一性，并且其中所编码的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列：
(i)分别选自SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：4；
(ii)分别选自SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：4；或者
(iii)分别选自SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：9。
在一个实施方案中，提供了编码与PD-1结合的抗体的轻链可变区(VL)的核酸，该轻链可变区(VL)具有包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列的氨基酸序列，其中编码VL的核酸序列与SEQ ID NO：82具有至少70％同一性，并且其中所编码的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列：
(i)分别选自SEQ ID NO：45、DAS和SEQ ID NO：36；或者
(ii)分别选自SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：36。
在一个实施方案中，上述VH变体与SEQ ID NO：77中所示的核酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性。在一个实施方案中，上述VL变体与SEQ ID NO：82中所示的核酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性。
在一个实施方案中，提供了编码与PD-1结合的抗体的重链可变区(VH)的核酸，该重链可变区(VH)具有包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列的氨基酸序列，其中编码VH的核酸序列与SEQ ID NO：78具有至少70％同一性，并且其中所编码的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列：
(i)分别选自SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：5；
(ii)分别选自SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：5；或者
(iii)分别选自SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：10。
在一个实施方案中，提供了编码与PD-1结合的抗体的轻链可变区(VL)的核酸，该轻链可变区(VL)具有包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列的氨基酸序列，其中编码VL的核酸序列与SEQ ID NO：83具有至少70％同一性，并且其中所编码的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列：
(i)分别选自SEQ ID NO：46、DAS和SEQ ID NO：37；或者
(ii)分别选自SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：37。
在一个实施方案中，上述VH变体与SEQ ID NO：78中所示的核酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性。在一个实施方案中，上述VL变体与SEQ ID NO：83中所示的核酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性。
在一个实施方案中，核酸包含编码如下所示且如序列表中SEQ ID NO：74所示的重链可变区(VH)的核酸序列，或是其片段。在一个实施方案中，重链可变区(VH)是SEQ ID NO：74所示的序列的变体。
在上述核酸序列和对应氨基酸序列中，根据Kabat编号的互补决定区(CDR)通过蛇形线表示，带有下划线的核苷酸或氨基酸表示根据IMGT编号的CDR。粗体字母表示Kabat和IMGT编号的相交部分。
在一个实施方案中，核酸包含编码如下所示且如序列表中SEQ ID NO：75所示的重链可变区(VH)的核酸序列，或是其片段。在一个实施方案中，重链可变区(VH)是SEQ ID NO：75所示的序列的变体。
在上述核酸序列和对应氨基酸序列中，根据Kabat编号的互补决定区(CDR)通过蛇形线表示，带有下划线的核苷酸或氨基酸表示根据IMGT编号的CDR。粗体字母表示Kabat和IMGT编号的相交部分。
在一个实施方案中，核酸包含编码如下所示且如序列表中SEQ ID NO：76所示的重链可变区(VH)的核酸序列，或是其片段。在一个实施方案中，重链可变区(VH)是SEQ ID NO：76所示的序列的变体。
在上述核酸序列和对应氨基酸序列中，根据Kabat编号的互补决定区(CDR)通过蛇形线表示，带有下划线的核苷酸或氨基酸表示根据IMGT编号的CDR。粗体字母表示Kabat和IMGT编号的相交部分。
在一个实施方案中，核酸包含编码如下所示且如序列表中SEQ ID NO：77所示的重链可变区(VH)的核酸序列，或是其片段。在一个实施方案中，重链可变区(VH)是SEQ ID NO：77所示的序列的变体。
在上述核酸序列和对应氨基酸序列中，根据Kabat编号的互补决定区(CDR)通过蛇形线表示，带有下划线的核苷酸或氨基酸表示根据IMGT编号的CDR。粗体字母表示Kabat和IMGT编号的相交部分。
在一个实施方案中，核酸包含编码如下所示且如序列表中SEQ ID NO：78所示的重链可变区(VH)的核酸序列，或是其片段。在一个实施方案中，重链可变区(VH)是SEQ ID NO：78所示的序列的变体。
在上述核酸序列和对应氨基酸序列中，根据Kabat编号的互补决定区(CDR)通过蛇形线表示，带有下划线的核苷酸或氨基酸表示根据IMGT编号的CDR。粗体字母表示Kabat和IMGT编号的相交部分。
在一个实施方案中，核酸包含编码如下所示且如序列表中SEQ ID NO：84所示的重链可变区(VH)的核酸序列，或是其片段。在一个实施方案中，重链可变区(VH)是SEQ ID NO：84所示的序列的变体。
在上述核酸序列和对应氨基酸序列中，根据Kabat编号的互补决定区(CDR)通过蛇形线表示，带有下划线的核苷酸或氨基酸表示根据IMGT编号的CDR。粗体字母表示Kabat和IMGT编号的相交部分。
在一个实施方案中，核酸包含编码如下所示且如序列表中SEQ ID NO：85所示的重链可变区(VH)的核酸序列，或是其片段。在一个实施方案中，重链可变区(VH)是SEQ ID NO：85所示的序列的变体。
在上述核酸序列和对应氨基酸序列中，根据Kabat编号的互补决定区(CDR)通过蛇形线表示，带有下划线的核苷酸或氨基酸表示根据IMGT编号的CDR。粗体字母表示Kabat和IMGT编号的相交部分。
在一个实施方案中，核酸包含编码如下所示且如序列表中SEQ ID NO：86所示的重链可变区(VH)的核酸序列，或是其片段。在一个实施方案中，重链可变区(VH)是SEQ ID NO：86所示的序列的变体。
在上述核酸序列和对应氨基酸序列中，根据Kabat编号的互补决定区(CDR)通过蛇形线表示，带有下划线的核苷酸或氨基酸表示根据IMGT编号的CDR。粗体字母表示Kabat和IMGT编号的相交部分。
在一个实施方案中，核酸包含编码如下所示且如序列表中SEQ ID NO：79所示的轻链可变区(VL)的核酸序列，或是其片段。在一个实施方案中，轻链可变区(VH)是SEQ ID NO：79所示的序列的变体。
在上述核酸序列和对应氨基酸序列中，根据Kabat编号的互补决定区(CDR)通过蛇形线表示，带有下划线的核苷酸或氨基酸表示根据IMGT编号的CDR。粗体字母表示Kabat和IMGT编号的相交部分。
在一个实施方案中，核酸包含编码如下所示且如序列表中SEQ ID NO：80所示的轻链可变区(VL)的核酸序列，或是其片段。在一个实施方案中，轻链可变区(VH)是SEQ ID NO：80所示的序列的变体。
在上述核酸序列和对应氨基酸序列中，根据Kabat编号的互补决定区(CDR)通过蛇形线表示，带有下划线的核苷酸或氨基酸表示根据IMGT编号的CDR。粗体字母表示Kabat和IMGT编号的相交部分。
在一个实施方案中，核酸包含编码如下所示且如序列表中SEQ ID NO：81所示的轻链可变区(VL)的核酸序列，或是其片段。在一个实施方案中，轻链可变区(VH)是SEQ ID NO：81所示的序列的变体。
在上述核酸序列和对应氨基酸序列中，根据Kabat编号的互补决定区(CDR)通过蛇形线表示，带有下划线的核苷酸或氨基酸表示根据IMGT编号的CDR。粗体字母表示Kabat和IMGT编号的相交部分。
在一个实施方案中，核酸包含编码如下所示且如序列表中SEQ ID NO：82所示的轻链可变区(VL)的核酸序列，或是其片段。在一个实施方案中，轻链可变区(VH)是SEQ ID NO：82所示的序列的变体。
在上述核酸序列和对应氨基酸序列中，根据Kabat编号的互补决定区(CDR)通过蛇形线表示，带有下划线的核苷酸或氨基酸表示根据IMGT编号的CDR。粗体字母表示Kabat和IMGT编号的相交部分。
在一个实施方案中，核酸包含编码如下所示且如序列表中SEQ ID NO：83所示的轻链可变区(VL)的核酸序列，或是其片段。在一个实施方案中，轻链可变区(VH)是SEQ ID NO：83所示的序列的变体。
在上述核酸序列和对应氨基酸序列中，根据Kabat编号的互补决定区(CDR)通过蛇形线表示，带有下划线的核苷酸或氨基酸表示根据IMGT编号的CDR。粗体字母表示Kabat和IMGT编号的相交部分。
在一个实施方案中，核酸包含编码如下所示且如序列表中SEQ ID NO：87所示的轻链可变区(VL)的核酸序列，或是其片段。在一个实施方案中，轻链可变区(VH)是SEQ ID NO：87所示的序列的变体。
在上述核酸序列和对应氨基酸序列中，根据Kabat编号的互补决定区(CDR)通过蛇形线表示，带有下划线的核苷酸或氨基酸表示根据IMGT编号的CDR。粗体字母表示Kabat和IMGT编号的相交部分。
在一个实施方案中，核酸包含编码如下所示且如序列表中SEQ ID NO：88所示的轻链可变区(VL)的核酸序列，或是其片段。在一个实施方案中，轻链可变区(VH)是SEQ ID NO：88所示的序列的变体。
在上述核酸序列和对应氨基酸序列中，根据Kabat编号的互补决定区(CDR)通过蛇形线表示，带有下划线的核苷酸或氨基酸表示根据IMGT编号的CDR。粗体字母表示Kabat和IMGT编号的相交部分。
在一个实施方案中，核酸包含编码如下所示且如序列表中SEQ ID NO：89所示的轻链可变区(VL)的核酸序列，或是其片段。在一个实施方案中，轻链可变区(VH)是SEQ ID NO：89所示的序列的变体。
在上述核酸序列和对应氨基酸序列中，根据Kabat编号的互补决定区(CDR)通过蛇形线表示，带有下划线的核苷酸或氨基酸表示根据IMGT编号的CDR。粗体字母表示Kabat和IMGT编号的相交部分。
在一个实施方案中，核酸包含编码如下所示且如序列表中SEQ ID NO：90所示的轻链可变区(VL)的核酸序列，或是其片段。在一个实施方案中，轻链可变区(VH)是SEQ ID NO：90所示的序列的变体。
在上述核酸序列和对应氨基酸序列中，根据Kabat编号的互补决定区(CDR)通过蛇形线表示，带有下划线的核苷酸或氨基酸表示根据IMGT编号的CDR。粗体字母表示Kabat和IMGT编号的相交部分。
在一个实施方案中，核酸包含编码如下所示且如序列表中SEQ ID NO：91所示的轻链可变区(VL)的核酸序列，或是其片段。在一个实施方案中，轻链可变区(VH)是SEQ ID NO：91所示的序列的变体。
在上述核酸序列和对应氨基酸序列中，根据Kabat编号的互补决定区(CDR)通过蛇形线表示，带有下划线的核苷酸或氨基酸表示根据IMGT编号的CDR。粗体字母表示Kabat和IMGT编号的相交部分。
在一个实施方案中，核酸包含编码如下所示且如序列表中SEQ ID NO：92所示的轻链可变区(VL)的核酸序列，或是其片段。在一个实施方案中，轻链可变区(VH)是SEQ ID NO：92所示的序列的变体。
在上述核酸序列和对应氨基酸序列中，根据Kabat编号的互补决定区(CDR)通过蛇形线表示，带有下划线的核苷酸或氨基酸表示根据IMGT编号的CDR。粗体字母表示Kabat和IMGT编号的相交部分。
本文中关于特定核酸和氨基酸序列(例如序列表中所示的那些)给出的教导将被解释为也涉及产生与所述特定序列在功能上等同之序列的所述特定序列的修饰，例如，表现出与特定氨基酸序列之特性相同或类似特性的氨基酸序列，以及编码表现出与特定核酸序列所编码的氨基酸序列之特性相同或类似特性的氨基酸序列的核酸序列。一个重要的特性是保留抗体与其靶标的结合或维持抗体的所期望的效应物功能。优选地，相对于特定序列进行修饰的序列，当其替代了抗体中的特定序列时，保留了所述抗体与PD-1的结合，并且优选地保留了如本文中所述的所述抗体的功能，例如，抑制表达PD-1的细胞上PD-1的免疫抑制、CDC介导的裂解或ADCC介导的裂解。
例如，如本文中所述，核酸和氨基酸序列的变体编码或提供抗体或抗原结合片段，其提供以下特性中的至少一种：
(i)能够与PD-1(例如人PD-1)结合，优选特异性结合；
(ii)能够阻断PD-1与其配体的结合；
(iii)能够与亲本抗体所结合的相同抗原结合，优选地以足以提供诊断和/或治疗用途的亲和力；和/或
(iv)能够提供降低或耗竭的效应物功能。
本领域技术人员将理解，特别是CDR、高变区和可变区的序列可被修饰而不丧失结合PD-1的能力。例如，CDR区将与本文中指定的区域相同或高度同源。对于“高度同源”，预期了在CDR中可进行1至5个、优选1至4个、例如1至3或1或2个替换。另外，可修饰高变区和可变区，使得其显示出与本文中具体公开的区域的显著同源性。
应当理解，本文中所述的核酸也包括为了优化特定宿主细胞或生物体中的密码子使用而修饰的核酸。生物体之间密码子使用的差异可导致多种关于异源基因表达的问题。通过改变原始序列的一个或更多个核苷酸进行的密码子优化可在其中待表达核酸的同源或异源宿主中导致所述核酸表达的优化，特别是翻译效力的优化。例如，如果根据本发明待使用来源于人并编码抗体的恒定区和/或框架区的核酸，例如用于制备嵌合或人源化抗体，则为了优化密码子使用可优选地修饰所述核酸，特别是如果所述核酸、任选地与异源核酸(例如来源于如本文中所述的其他生物体的核酸)融合的所述核酸待在来自与人不同的生物体(例如小鼠或仓鼠)的细胞中表达。例如，可对编码人轻链和重链恒定区的核酸序列进行修饰，以使其包含引起密码子使用优化但不引起氨基酸序列改变的一个或更多个，优选至少1、2、3、4、5、10、15、20个并且优选多至10、15、20、25、30、50、70或100个或更多个核苷酸替换。
根据本发明的“核酸”可以是RNA，更优选体外转录的RNA(in vitro transcribedRNA，IVT RNA)或合成RNA。核酸可用于引入到细胞中，即转染细胞，特别是以RNA的形式，其可通过从DNA模板体外转录来制备。此外，可在应用之前通过稳定序列、加帽和多腺苷酸化来修饰RNA。
术语“遗传物质”包括分离的核酸(DNA或RNA)、双螺旋的一部分、染色体的一部分、或者生物体或细胞的整个基因组，特别是其外显子组或转录物组。
术语“突变”是指与参照相比，核酸序列的变化或差异(核苷酸替换、添加或缺失)。“体细胞突变”可发生在除了生殖细胞(精子和卵子)之外的任何身体细胞中，并因此不传递至儿童。这些改变可以(但不总是)导致癌症或其他疾病。优选地，突变是非同义突变。术语“非同义突变”是指导致翻译产物中氨基酸变化(例如氨基酸替换)的突变，优选核苷酸替换。
根据本发明，术语“突变”包括点突变、插失(Indel)、融合、染色体碎裂(chromothripsis)和RNA编辑。
根据本发明，术语“插失”描述特殊的突变种类，其定义为导致共定位的插入和缺失以及核苷酸净增多或损失的突变。在基因组的编码区中，除非插失的长度是3的倍数，否则其产生移码突变。插失可与点突变形成对比，其中插失从序列中插入和缺失核苷酸，点突变是替代一个核苷酸的替换形式。
根据本发明，术语“染色体碎裂”是指通过单个灾难性事件(devastating event)，基因组的特定区域被破碎并然后拼接在一起的遗传现象。
根据本发明，术语“RNA编辑”是指其中通过碱基组成的化学变化来改变RNA分子中的信息内容的分子过程。RNA编辑包括核苷修饰，例如胞苷(C)到尿苷(U)和腺苷(A)到肌苷(I)的脱氨基，以及非模板的核苷酸添加和插入。mRNA中的RNA编辑有效地改变所编码蛋白质的氨基酸序列，使得其与由基因组DNA序列预测的不同。
根据本发明，“参照”可用于关联和比较从肿瘤试样获得的结果。通常，“参照”可基于一种或更多种正常试样，特别是不受癌症疾病影响的试样获得，所述试样从患者或者一个或更多个不同个体，优选健康个体，特别是相同物种的个体获得。“参照”可通过测试足够大量的正常试样而根据经验确定。
在本发明的上下文中，术语“RNA”涉及包含核糖核苷酸残基并且优选完全或基本上由核糖核苷酸残基构成的分子。“核糖核苷酸”是指在β-D-呋喃核糖基的2’-位具有羟基的核苷酸。术语“RNA”包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA例如部分或完全纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成RNA、以及重组产生的RNA例如通过一个或更多个核苷酸的添加、缺失、替换和/或改变而不同于天然存在RNA的经修饰RNA。这样的改变可包括将非核苷酸物质添加至例如RNA的末端或内部，例如在RNA的一个或更多个核苷酸处。RNA分子中的核苷酸还可包含非标准核苷酸，例如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可被称为类似物或天然存在RNA的类似物。
根据本发明，术语“RNA”包括并优选涉及“mRNA”。术语“mRNA”意指“信使RNA”并且涉及通过使用DNA模板并编码肽或多肽而产生的“转录物”。用于控制转录的启动子可以是任何RNA聚合酶的任何启动子。用于体外转录的DNA模板可通过克隆核酸，特别是cDNA，并将其引入到用于体外转录的合适载体中来获得。cDNA可通过RNA的反转录来获得。通常，mRNA包含5’-UTR、蛋白质编码区和3’-UTR。mRNA在细胞内和体外仅具有有限的半衰期。在本发明的上下文中，mRNA可通过从DNA模板体外转录而产生。体外转录方法是技术人员已知的。例如，存在多种可商购的体外转录试剂盒。
根据本发明，可以根据需要修改RNA的稳定性和翻译效率。具有提高的稳定性和改善的翻译效率的RNA分子可例如对本发明的经RNA编码的抗体是有利的。例如，通过一种或更多种具有稳定作用和/或提高RNA翻译效率的修饰，可稳定RNA并提高其翻译。例如，PCT/EP2006/009448中描述了这样的修饰，其通过引用并入本文。为了提高根据本发明使用的RNA的表达，可在编码区即编码所表达肽或蛋白质的序列内对其进行修饰，优选地不改变所表达肽或蛋白质的序列，从而提高GC含量以提高mRNA稳定性并进行密码子优化，并因此增强细胞中的翻译。
在本发明中使用的RNA的上下文中，术语“修饰”包括对所述RNA中非天然存在的RNA的任何修饰。
在本发明的一个实施方案中，根据本发明使用的RNA不具有未加帽的5’-三磷酸。这样的未加帽的5’-三磷酸的去除可通过用磷酸酶处理RNA来实现。
根据本发明的RNA可具有经修饰的核糖核苷酸，以提高其稳定性和/或降低细胞毒性。例如，在一个实施方案中，在根据本发明使用的RNA中，5-甲基胞苷部分地或完全地、优选完全地替换胞苷。作为替代或补充，在一个实施方案中，在根据本发明使用的RNA中，假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5U)部分地或完全地、优选完全地替换尿苷。
本文中使用的术语“尿苷”描述了可存在于RNA中的核苷之一。尿苷的结构为：
UTP(尿苷5’-三磷酸)具有以下结构：
假UTP(假尿苷5’-三磷酸)具有以下结构：
“假尿苷”是作为尿苷的异构体的经修饰核苷的一个实例，其中尿嘧啶通过碳-碳键而不是氮-碳糖苷键与戊糖环连接。
另一种示例性的经修饰核苷为N1-甲基-假尿苷(m1Ψ)，其具有以下结构：
N1-甲基-假-UTP具有以下结构：
另一种示例性的经修饰核苷为5-甲基-尿苷(m5U)，其具有以下结构：
在一些实施方案中，本文中所述的RNA中的一个或更多个尿苷被经修饰核苷替代。在一些实施方案中，经修饰核苷是经修饰尿苷。
在一些实施方案中，替代尿苷的经修饰尿苷是假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5U)。
在一些实施方案中，替代RNA中的一个或更多个尿苷的经修饰核苷可以是以下中的任意一个或更多个：3-甲基-尿苷(m3U)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-氮杂-尿苷、6-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-尿苷(s2U)、4-硫代-尿苷(s4U)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基-尿苷(ho5U)、5-氨基烯丙基-尿苷、5-卤代-尿苷(例如，5-碘代-尿苷或5-溴代-尿苷)、尿苷5-羟乙酸(cmo5U)、尿苷5-羟乙酸甲酯(mcmo5U)、5-羧甲基-尿苷(cm5U)、1-羧甲基-假尿苷、5-羧基羟甲基-尿苷(chm5U)、5-羧基羟甲基-尿苷甲酯(mchm5U)、5-甲氧基羰基甲基-尿苷(mcm5U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代-尿苷(mcm5s2U)、5-氨甲基-2-硫代-尿苷(nm5s2U)、5-甲基氨甲基-尿苷(mnm5U)、1-乙基-假尿苷、5-甲基氨甲基-2-硫代-尿苷(mnm5s2U)、5-甲基氨甲基-2-硒代-尿苷(mnm5se2U)、5-氨甲酰基甲基-尿苷(ncm5U)、5-羧甲基氨甲基-尿苷(cmnm5U)、5-羧甲基氨甲基-2-硫代-尿苷(cmnm5s2U)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-尿苷(τm5U)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷(τm5s2U)、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷)、5-甲基-2-硫代-尿苷(m5s2U)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮杂-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮杂-假尿苷、二氢尿苷(D)、二氢假尿苷、5，6-二氢尿苷、5-甲基-二氢尿苷(m5D)、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷(acp3U)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基氨甲基)尿苷(inm5U)、5-(异戊烯基氨甲基)-2-硫代-尿苷(inm5s2U)、α-硫代-尿苷、2’-O-甲基-尿苷(Um)、5，2’-O-二甲基-尿苷(m5Um)、2’-O-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫代-2’-O-甲基-尿苷(s2Um)、5-甲氧基羰基甲基-2’-O-甲基-尿苷(mcm5Um)、5-氨甲酰基甲基-2’-O-甲基-尿苷(ncm5Um)、5-羧甲基氨甲基-2’-O-甲基-尿苷(cmnm5Um)、3，2’-O-二甲基-尿苷(m3Um)、5-(异戊烯基氨甲基)-2’-O-甲基-尿苷(inm5Um)、1-硫代-尿苷、脱氧胸苷、2’-F-阿糖-尿苷、’-F-尿苷、2’-OH-阿糖-尿苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷、5-[3-(1-E-丙烯基氨基)尿苷或本领域中已知的任何其他经修饰尿苷。
在一些实施方案中，至少一种RNA包含代替至少一个尿苷的经修饰核苷。在一些实施方案中，至少一种RNA包含代替每个尿苷的经修饰核苷。在一些实施方案中，每种RNA均包含代替至少一个尿苷的经修饰核苷。在一些实施方案中，每种RNA均包含代替每个尿苷的经修饰核苷。
在一些实施方案中，经修饰核苷独立地选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方案中，经修饰核苷包含假尿苷(ψ)。在一些实施方案中，经修饰核苷包含N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在一些实施方案中，经修饰核苷包含5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方案中，至少一种RNA可包含多于一种类型的经修饰核苷，并且所述经修饰核苷独立地选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方案中，经修饰核苷包含假尿苷(ψ)和N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在一些实施方案中，经修饰核苷包含假尿苷(ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方案中，经修饰核苷包含N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方案中，经修饰核苷包含假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。
在一个实施方案中，RNA包含其他经修饰核苷或包含另一些经修饰核苷，例如经修饰胞苷。例如，在一个实施方案中，在RNA中5-甲基胞苷部分地或完全地、优选完全地替换胞苷。在一个实施方案中，RNA包含5-甲基胞苷和选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)中的一种或更多种。在一个实施方案中，RNA包含5-甲基胞苷和N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在一些实施方案中，RNA包含代替每个胞苷的5-甲基胞苷和代替每个尿苷的N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。
在一个实施方案中，术语“修饰”涉及提供具有5’-帽或5’-帽类似物的RNA。术语“5’-帽”是指存在于mRNA分子的5’-末端的帽结构，并且通常由通过不寻常的5’至5’三磷酸键联与mRNA连接的鸟苷核苷酸组成。在一个实施方案中，该鸟苷在7-位被甲基化。术语“常规5’-帽”是指天然存在的RNA 5’-帽，优选7-甲基鸟苷帽(m7G)。在本发明的上下文中，术语“5’-帽”包括5’-帽类似物，其类似于RNA帽结构，并且被修饰以具有稳定RNA和/或增强RNA翻译(如果与其连接的话)的能力，优选在体内和/或在细胞中。
提供具有5’-帽或5’-帽类似物的RNA可通过在存在所述5’-帽或5’-帽类似物的情况下体外转录DNA模板来实现，其中所述5’-帽共转录并入到所产生的RNA链中，或者可例如通过体外转录来产生RNA，并且可在转录之后使用加帽酶(例如痘苗病毒的加帽酶)将5’-帽与RNA连接。
在一些实施方案中，RNA的构件单元帽是m2 7，3’-OGppp(m1 2’-O)ApG(有时也称为m2 7，3’ OG(5’)ppp(5’)m2’-OApG)，其具有以下结构：
下面是示例性的帽1(Cap1)RNA，其包含RNA和m2 7，3’OG(5’)ppp(5’)m2’-OApG：
下面是另一个示例性的帽1 RNA(无帽类似物)：
在一些实施方案中，在一个实施方案中使用具有以下结构的帽类似物抗反向帽(ARCA帽(m2 7，3’OG(5’)ppp(5’)G))用“帽0(Cap0)”结构来修饰RNA：
下面是包含RNA和m2 7，3’OG(5’)ppp(5’)G的示例性帽0 RNA：
/>
在一些实施方案中，使用具有以下结构的帽类似物β-S-ARCA(m2 7，2’OG(5’)ppSp(5’)G)来产生“帽0”结构：
下面是包含β-S-ARCA(m2 7，2’OG(5’)ppSp(5’)G)和RNA的示例性帽0 RNA：
特别优选的帽包含5’-帽m2 7，2’OG(5’)ppSp(5’)G。在一些实施方案中，本文中所述的至少一种RNA包含5’-帽m2 7，2’OG(5’)ppSp(5’)G。在一些实施方案中，本文中所述的每种RNA均包含5’帽m2 7，2’OG(5’)ppSp(5’)G。
在一些实施方案中，根据本公开内容的RNA包含5’-UTR和/或3’-UTR。
RNA可包含另外的修饰。例如，本发明中使用的RNA的另外的修饰可以是延伸或截短天然存在的poly(A)尾或者改变5’-或3’-非翻译区(untranslated region，UTR)，例如引入与所述RNA的编码区不相关的UTR，例如用来源于珠蛋白基因的3’-UTR的一个或更多个、优选两个拷贝交换现有的3’-UTR，或者插入来源于珠蛋白基因的3’-UTR的一个或更多个、优选两个拷贝；所述珠蛋白基因例如α2-珠蛋白、α1-珠蛋白、β-珠蛋白，优选β-珠蛋白，更优选人β-珠蛋白。
术语“非翻译区”或“UTR”涉及DNA分子中被转录但未被翻译成氨基酸序列的区域，或涉及RNA分子(例如mRNA分子)中的相应区域。非翻译区(UTR)可存在于开放阅读框的5’(上游)(5’-UTR)和/或开放阅读框的3’(下游)(3’-UTR)。5’-UTR(如果存在的话)位于5’末端，蛋白质编码区的起始密码子的上游。5’-UTR位于5’-帽(如果存在的话)的下游，例如直接与5’帽邻近。3’-UTR(如果存在的话)位于3’末端，蛋白质编码区的终止密码子的下游，但是术语“3’-UTR”优选不包含poly-A序列。因此，3’-UTR位于poly-A序列(如果存在的话)的上游，例如直接与poly-A序列邻近。优选的5’-UTR和3’-UTR序列元件的一些实例在本文中详细描述，通过序列表中的SEQ ID NO：94、95、101和102例示，并在本公开内容中提及。
具有未掩蔽的poly-A序列的RNA比具有掩蔽的poly-A序列的RNA更有效地翻译。术语“poly(A)尾”或“poly-A序列”涉及腺嘌呤(A)残基的不间断或间断序列，其通常位于RNA分子的3’末端；以及“未掩蔽的poly-A序列”意指以poly-A序列的A结束并且后面不是位于poly-A序列3’末端(即下游)的A以外的核苷酸的位于RNA分子3’末端的poly-A序列。不间断的poly-A尾的特征在于连续的腺苷酸残基。实际上，不间断的poly-A尾是典型的。本文中公开的RNA可具有在转录之后通过模板非依赖性RNA聚合酶与RNA的游离3’末端连接的poly-A尾或由DNA编码并由模板依赖性RNA聚合酶转录的poly-A尾。此外，约120个碱基对的长poly-A序列引起RNA的最佳转录物稳定性和翻译效率。
因此，为了提高根据本发明使用的RNA的稳定性和/或表达，可对其进行修饰以与poly-A序列结合而存在，优选长度为10至500，更优选30至300，甚至更优选65至200，并且尤其是100至150个腺苷残基。在一个尤其优选的实施方案中，poly-A序列的长度为约120个腺苷残基。为了进一步提高根据本发明使用的RNA的稳定性和/或表达，poly-A序列可以是未掩蔽的。
在一些实施方案中，基于在与编码链互补的链中包含重复的dT核苷酸(脱氧胸苷酸)的DNA模板，在RNA转录期间，例如在制备体外转录的RNA期间，连接poly-A尾。编码poly-A尾的DNA序列(编码链)被称为poly(A)盒。
在一些实施方案中，存在于DNA编码链中的poly(A)盒基本上由dA核苷酸组成，但被四种核苷酸(dA、dC、dG和dT)的随机序列中断。这样的随机序列的长度可以是5至50、10至30或10至20个核苷酸。这样的盒公开于WO 2016/005324 A1中，其在此通过引用并入。WO2016/005324 A1中公开的任何poly(A)盒均可用于本发明。涵盖以下：基本上由dA核苷酸组成但被具有均等分布的四种核苷酸(dA、dC、dG、dT)并且长度为例如5至50个核苷酸的随机序列中断的poly(A)盒显示，在DNA水平上质粒DNA在大肠杆菌(E.coli)中的恒定增殖，而在RNA水平上仍与对于支持RNA稳定性和翻译效率的有益特性相关。因此，在一些实施方案中，本文中所述的RNA分子中包含的poly-A尾基本上由A核苷酸组成，但是被四种核苷酸(A、C、G、U)的随机序列中断。这样的随机序列的长度可以是5至50、10至30或10至20个核苷酸。在一个实施方案中，poly(A)盒包含以下或由以下组成：30个腺嘌呤核苷酸、接头(L)和另外70个腺嘌呤核苷酸，本文中也称为“A30LA70”poly(A)尾(如序列表中SEQ ID NO.103所例示的)。
用于产生抗PD-1抗体的重链的RNA可具有以下结构：
(i)5’-帽-5’-UTR-‘Kozac序列’-编码重链可变区的核酸序列-编码重链恒定区的核酸序列-3’-UTR-poly(A)尾；或
(ii)5’-帽-5’-UTR-‘Kozac序列’-分泌信号肽-编码重链可变区的核酸序列-编码重链恒定区的核酸序列-3’-UTR-poly(A)尾。
用于产生抗PD-1抗体的轻链的RNA可具有以下结构：
(i)5’-帽-5’-UTR-‘Kozac序列’-编码轻链可变区的核酸序列-编码轻链恒定区的核酸序列-3’-UTR-poly(A)尾；或
(ii)5’-帽-5’-UTR-‘Kozac序列’-分泌信号肽-编码轻链可变区的核酸序列-编码轻链恒定区的核酸序列-3’-UTR-poly(A)尾。
单独元件的一些优选实施方案如上文中所述。例如，3’-UTR可以是FI元件，以及poly(A)尾可以是A30LA70元件。
在本上下文中，“基本上由......组成”意指poly-A尾中的大多数核苷酸，通常按poly-A尾中核苷酸的数目计至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％是A核苷酸，但允许其余核苷酸是除A核苷酸之外的核苷酸，例如U核苷酸(尿苷酸)、G核苷酸(鸟苷酸)或C核苷酸(胞苷酸)。在本上下文中，“由......组成”意指poly-A尾中的所有核苷酸，即按poly-A尾中核苷酸的数目计100％是A核苷酸。术语“A核苷酸”或“A”是指腺苷酸。
在一些实施方案中，除A核苷酸之外无核苷酸在其3’末端侧接poly-A尾，即，poly-A尾在其3’末端未被除A之外的核苷酸掩蔽或跟随。
在一些实施方案中，至少一种RNA包含poly-A尾。在一些实施方案中，每种RNA均包含poly-A尾。在一些实施方案中，poly-A尾可包含至少20个、至少30个、至少40个、至少80个、或至少100个、并且多至500个、多至400个、多至300个、多至200个、或多至150个核苷酸。在一些实施方案中，poly-A尾可基本上由至少20个、至少30个、至少40个、至少80个、或至少100个、并且多至500个、多至400个、多至300个、多至200个、或多至150个核苷酸组成。在一些实施方案中，poly-A尾可由至少20个、至少30个、至少40个、至少80个、或至少100个、并且多至500个、多至400个、多至300个、多至200个、或多至150个核苷酸组成。在一些实施方案中，poly-A尾包含至少100个核苷酸。在一些实施方案中，poly-A尾包含约150个核苷酸。在一些实施方案中，poly-A尾包含约120个核苷酸。
另外，将3’-非翻译区(UTR)并入到RNA分子的3’-非翻译区中可引起翻译效率的增强。通过并入两个或更多个这样的3’-非翻译区可实现协同作用。3’-非翻译区对于引入其的RNA可以是自体的或异源的。在一个具体实施方案中，3’-非翻译区来源于人β-珠蛋白基因。
上述修饰即poly-A序列的并入、poly-A序列的未掩蔽以及一个或更多个3’-非翻译区的并入的组合，对RNA的稳定性和翻译效率的提高具有协同影响。
术语RNA的“稳定性”涉及RNA的“半衰期”。“半衰期”涉及消除分子的一半活性、量或数目所需的时间。在本发明的上下文中，RNA的半衰期指示所述RNA的稳定性。RNA的半衰期可影响RNA的“表达持续时间”。可预期具有长半衰期的RNA将在延长的时间段内表达。
当然，如果根据本发明期望降低RNA的稳定性和/或翻译效率，则可修饰RNA以干扰如上所述提高RNA的稳定性和/或翻译效率的元件的功能。
根据本发明，术语“表达”以其最一般的含义使用，并且包括产生RNA和/或肽、多肽或蛋白质，例如，通过转录和/或翻译。关于RNA，术语“表达”或“翻译”特别地涉及产生肽、多肽或蛋白质。其还包括核酸的部分表达。此外，表达可以是瞬时的或稳定的。根据本发明，如果通过用于蛋白质检测的常规技术(例如使用与PD-1抗体特异性结合的抗体的技术)可在细胞或其裂解物中检测到抗体，则该抗体在细胞中表达。
在本发明的上下文中，术语“转录”涉及其中DNA序列中的遗传密码转录成RNA的过程。随后，RNA可翻译成蛋白质。根据本发明，术语“转录”包括“体外转录”，其中术语“体外转录”涉及其中在无细胞系统中，优选使用合适的细胞提取物在体外合成RNA、特别是mRNA的过程。优选地，将克隆载体应用于转录物的产生。这些克隆载体通常被称为转录载体，并且根据本发明被术语“载体”所涵盖。根据本发明，本发明中使用的RNA优选为体外转录RNA(IVT-RNA)并且可通过合适的DNA模板的体外转录获得。用于控制转录的启动子可以是任何RNA聚合酶的任何启动子。RNA聚合酶的一些具体实例是T7、T3和SP6RNA聚合酶。优选地，根据本发明的体外转录由T7或SP6启动子控制。用于体外转录的DNA模板可通过克隆核酸、特别是cDNA，并将其引入到用于体外转录的合适载体中而获得。cDNA可通过RNA的反转录获得。
根据本发明，术语“翻译”涉及细胞核糖体中的过程，通过该过程，信使RNA链指导氨基酸序列的组装，以产生肽、多肽或蛋白质。
根据本发明可与核酸功能性地连接的表达控制序列或调节序列相对于核酸可以是同源或异源的。如果编码序列和调节序列共价结合在一起，则它们“功能性地”连接在一起，使得编码序列的转录或翻译在调节序列的控制或影响下。如果编码序列待被翻译成功能性蛋白质，并且调节序列与编码序列功能性连接，则调节序列的诱导引起编码序列的转录，而不引起编码序列中阅读框的移位或者编码序列不能被翻译成所期望的蛋白质或肽。
根据本发明，术语“表达控制序列”或“调节序列”包括启动子、核糖体结合序列和其他控制元件，其控制核酸的转录或衍生RNA的翻译。在本发明的某些实施方案中，可控制调节序列。调节序列的精确结构可根据物种或根据细胞类型而变化，但通常包含参与启动转录或翻译的5’-非转录序列以及5’-和3’-非翻译序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。特别地，5’-非转录调节序列包含启动子区，所述启动子区包含用于功能性结合基因的转录控制的启动子序列。调节序列也可包含增强子序列或上游激活子序列。
优选地，根据本发明，待在细胞中表达的RNA被引入到所述细胞中。在根据本发明的方法的一个实施方案中，待引入到细胞中的RNA是通过体外转录合适的DNA模板来获得的。
根据本发明，术语例如“能够表达的RNA”和“编码RNA”在本文中可互换使用，并且关于特定的肽或多肽，意指RNA如果存在于合适的环境中、优选在细胞内，则其可被表达以产生所述肽或多肽。优选地，根据本发明的RNA能够与细胞翻译机器相互作用，以提供其能够表达的肽或多肽。
术语例如“转移”、“引入”或“转染”在本文中可互换使用，并且涉及将核酸，特别是外源或异源核酸，特别是RNA引入到细胞中。根据本发明，细胞可形成器官、组织和/或生物体的一部分。根据本发明，核酸的施用是以裸核酸或与施用试剂组合来实现的。优选地，核酸的施用是以裸核酸的形式。优选地，RNA与稳定物质例如RNA酶抑制剂组合施用。本发明还设想将核酸重复引入到细胞中，以允许延长的时间段内的持续表达。
可用可与核酸例如RNA缔合的任何载体来转染细胞，所述缔合例如通过与RNA形成复合物或形成其中封装或包封RNA的囊泡，导致与裸RNA相比RNA的稳定性提高。根据本发明可用的载体包括例如：包含脂质的载体，例如阳离子脂质、脂质体，特别是阳离子脂质体，和胶束，和纳米粒例如脂质复合物颗粒。阳离子脂质可与带负电荷的核酸形成复合物。根据本发明，可使用任何阳离子脂质。
可被转染的细胞也包括宿主细胞，其将成为重组体。本文中使用的术语“重组宿主细胞”旨在是指其中已引入了重组表达载体的细胞。应理解，这样的术语不仅旨在是指特定的对象细胞，而且还指这样的细胞的子代。因为某些修饰可由于突变或环境影响而在后代产生中发生，所以这样的子代实际上可与亲本细胞不同，但仍包括在本文中使用的术语“重组宿主细胞”的范围内。宿主细胞和重组宿主细胞包括例如转染瘤，例如CHO细胞、NS/0细胞、Sp2/0细胞、COS细胞、Vero细胞、HeLa细胞、HEK293细胞、HEK293T细胞、HEK293T/17细胞和淋巴细胞。
可在多种培养基中培养用于产生如本文中所限定的抗体的宿主细胞，所述培养基可商购并且是技术人员公知的。这些培养基中的任一种均可根据需要补充激素和/或其他生长因子。
在本公开内容的某些实施方案中，本文中所述的RNA可存在于RNA脂质复合物颗粒中。在肠胃外施用之后，特别是在静脉内施用之后，本文中所述的RNA脂质复合物颗粒和包含RNA脂质复合物颗粒的组合物可用于将RNA递送至靶组织。可使用脂质体来制备RNA脂质复合物颗粒，所述脂质体可通过将脂质在乙醇中的溶液注射到水或合适的水相中而获得。在一个实施方案中，水相具有酸性pH。在一个实施方案中，水相包含例如约5mM的量的乙酸。在一个实施方案中，脂质体和RNA脂质复合物颗粒包含至少一种阳离子脂质和至少一种另外的脂质。在一个实施方案中，所述至少一种阳离子脂质包含1，2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)和/或1，2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)。在一个实施方案中，所述至少一种另外的脂质包含1，2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、胆固醇(Chol)和/或1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)。在一个实施方案中，所述至少一种阳离子脂质包含1，2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)并且所述至少一种另外的脂质包含1，2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。在一个实施方案中，脂质体和RNA脂质复合物颗粒包含1，2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)和1，2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。通过将脂质体与RNA混合，脂质体可用于制备RNA脂质复合物颗粒。
在一个实施方案中，RNA脂质复合物颗粒的平均直径为约200nm至约1000nm、约200nm至约800nm、约250至约700nm、约400至约600nm、约300nm至约500nm、或约350nm至约400nm。在一个实施方案中，所述RNA脂质复合物颗粒的平均直径为约250nm至约700nm。在另一个实施方案中，所述RNA脂质复合物颗粒的平均直径为约300nm至约500nm。在一个示例性实施方案中，所述RNA脂质复合物颗粒的平均直径为约400nm。
RNA脂质复合物颗粒可表现出小于约0.5、小于约0.4、或小于约0.3的多分散性指数。举例来说，RNA脂质复合物颗粒可表现出为约0.1至约0.3的多分散性指数。
脂质溶液、脂质体和RNA脂质复合物颗粒可包含阳离子脂质。本文中使用的“阳离子脂质”是指具有净正电荷的脂质。阳离子脂质通过与脂质基质的静电相互作用结合带负电荷的RNA。一般来说，阳离子脂质具有亲脂性部分，例如甾醇、酰基或二酰基链，并且脂质的头基通常携带正电荷。阳离子脂质的一些实例包括但不限于1，2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)、二甲基双二十八烷基铵(DDAB)、1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)、1，2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)、1，2-二酰氧基-3-二甲基铵丙烷、1，2-二烷氧基-3-二甲基铵丙烷、双十八烷基二甲基氯化铵(DODAC)、2，3-二(十四烷氧基)丙基-(2-羟乙基)-二甲基铵(2，3-di(tetradecoxy)propyl-(2-hydroxyethyl)-dimethylazanium，DMRIE)、1，2-二豆蔻酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱(DMEPC)、1，2-二豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷(DMTAP)、1，2-二油氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DORIE)、和2，3-二油酰氧基N-[2(精胺甲酰胺)乙基]-N，N-二甲基-1-三氟乙酸丙铵(DOSPA)。优选的是DOTMA、DOTAP、DODAC和DOSPA。在一些具体实施方案中，阳离子脂质是DOTMA和/或DOTAP。
可并入另外的脂质以调整总的正负电荷比和RNA脂质复合物颗粒的物理稳定性。在某些实施方案中，所述另外的脂质是中性脂质。本文中使用的“中性脂质”是指净电荷为零的脂质。中性脂质的一些实例包括但不限于1，2-二-(9Z-十八烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)、二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、胆固醇和脑苷脂。在一些具体实施方案中，另外的脂质是DOPE、胆固醇和/或DOPC。
在某些实施方案中，RNA脂质复合物颗粒包含阳离子脂质和另外的脂质二者。在一个示例性实施方案中，阳离子脂质是DOTMA，并且另外的脂质是DOPE。不希望受到理论的束缚，与所述至少一种另外的脂质的量相比，所述至少一种阳离子脂质的量可影响重要的RNA脂质复合物颗粒特征，例如电荷、颗粒尺寸、稳定性、组织选择性和RNA的生物活性。因此，在一些实施方案中，所述至少一种阳离子脂质与所述至少一种另外的脂质的摩尔比为约10∶0至约1∶9、约4∶1至约1∶2、或约3∶1至约1∶1。在一些具体实施方案中，摩尔比可以为约3∶1、约2.75∶1、约2.5∶1、约2.25∶1、约2∶1、约1.75∶1、约1.5∶1、约1.25∶1、或约1∶1。在一个示例性实施方案中，所述至少一种阳离子脂质与所述至少一种另外的脂质的摩尔比为约2∶1。
RNA脂质复合物颗粒的电荷是所述至少一种阳离子脂质中存在的电荷与RNA中存在的电荷的总和。电荷比是所述至少一种阳离子脂质中存在的正电荷与RNA中存在的负电荷的比。至少一种阳离子脂质中存在的正电荷与RNA中存在的负电荷的电荷比通过以下方程来计算：电荷比＝[(阳离子脂质浓度(mol))*(阳离子脂质中的正电荷总数)]/[(RNA浓度(mol))*(RNA中的负电荷总数)]。RNA的浓度和至少一种阳离子脂质的量可由本领域技术人员使用常规方法来确定。在一个实施方案中，在生理pH下RNA脂质复合物颗粒中的正电荷与负电荷的电荷比为约1.6∶2至约1∶2或约1.6∶2至约1.1∶2。在一些具体实施方案中，在生理pH下RNA脂质复合物颗粒中的正电荷与负电荷的电荷比为约1.6∶2.0、约1.5∶2.0、约1.4∶2.0、约1.3∶2.0、约1.2∶2.0、约1.1∶2.0或约1∶2.0。
RNA脂质复合物颗粒可例如通过例如经使用乙醇注射技术将RNA与脂质体或与至少一种阳离子脂质混合来获得。根据本发明，所获得的组合物可包含盐，例如氯化钠。不希望受到理论的束缚，氯化钠在与至少一种阳离子脂质混合之前，用作用于预处理RNA的离子渗量浓度剂(ionic osmolality agent)。在本公开内容中，某些实施方案考虑了氯化钠的替代有机盐或无机盐。替代盐包括但不限于：氯化钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、乙酸钾、碳酸氢钾、硫酸钾、乙酸钾、磷酸二钠、磷酸二氢钠、乙酸钠、碳酸氢钠、硫酸钠、乙酸钠、氯化锂、氯化镁、磷酸镁、氯化钙和乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)钠盐。
一般而言，包含RNA脂质复合物颗粒的组合物可包含浓度优选为0mM至约500mM、约5mM至约400mM或约10mM至约300mM的氯化钠。在一个实施方案中，包含RNA脂质复合物颗粒的组合物包含对应于这样的氯化钠浓度的离子强度。
术语“离子强度”是指特定溶液中不同种类的离子物质的数目与其各自电荷之间的数学关系。因此，离子强度I在数学上由下式表示：
其中c是特定离子物质的摩尔浓度，并且z是其电荷的绝对值。总和∑取自溶液中所有不同种类的离子(i)。
根据本公开内容，在一个实施方案中，术语“离子强度”涉及单价离子的存在。关于二价离子，特别是二价阳离子的存在，在一个实施方案中，其浓度或有效浓度(游离离子的存在)由于螯合剂的存在而足够低以防止RNA的降解。在一个实施方案中，二价离子的浓度或有效浓度低于用于水解RNA核苷酸之间的磷酸二酯键的催化水平。在一个实施方案中，游离二价离子的浓度为20μM或更小。在一个实施方案中，不存在或基本上不存在游离二价离子。
这些组合物可作为替代或补充地包含稳定剂以在冷冻、冻干、喷雾干燥或储存例如储存经冷冻、经冻干或经喷雾干燥的组合物期间避免产品品质的大量损失，并且特别是避免RNA活性的大量损失。经冻干或经喷雾干燥的组合物可在使用之前进行重构。在一个实施方案中，稳定剂是碳水化合物。本文中使用的术语“碳水化合物”是指并且涵盖单糖、二糖、三糖、寡糖和多糖。在本公开内容的一些实施方案中，稳定剂为甘露糖、葡萄糖、蔗糖或海藻糖。根据本发明，RNA脂质复合物颗粒组合物可具有适合于组合物的稳定性，特别是RNA脂质复合物颗粒的稳定性和RNA的稳定性的稳定剂浓度。
术语“冷冻”涉及液体的固化，通常伴随着热量的去除。
术语“冻干”或其变化形式是指通过将物质冷冻并随后降低周围压力以使该物质中的冷冻介质直接从固相升华至气相而进行的物质的冷冻干燥。
术语“喷雾干燥”是指通过将(加热的)气体与在容器(喷雾干燥器)内雾化(喷雾)的流体混合来使物质喷雾干燥，其中来自所形成的液滴的溶剂蒸发，导致干燥粉末。
术语“重构”涉及向干燥产品添加溶剂(例如水)以使其返回液体状态，例如其原始液体状态。
根据本发明，RNA脂质复合物颗粒组合物可具有适合于RNA脂质复合物颗粒的稳定性，并且特别是适合于RNA的稳定性的pH。在一个实施方案中，本文中所述的RNA脂质复合物颗粒组合物的pH为约5.5至约7.5。
根据本发明，组合物可包含至少一种缓冲剂。不希望受到理论的束缚，缓冲剂的使用在组合物的制造、储存和使用期间维持组合物的pH。在本发明的某些实施方案中，缓冲剂可以是碳酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、[三(羟甲基)甲基-氨基]丙烷磺酸(TAPS)、2-(双(2-羟乙基)氨基)乙酸(Bicine)、2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1，3-二醇(Tris)、N-(2-羟基-1，1-双(羟甲基)乙基)甘氨酸(Tricine)、3-[[1，3-二羟基-2-(羟甲基)丙烷-2-基]氨基]-2-羟基丙烷-1-磺酸(TAPSO)、2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙烷磺酸(HEPES)、2-[[1，3-二羟基-2-(羟甲基)丙烷-2-基]氨基]乙烷磺酸(TES)、1，4-哌嗪二乙烷磺酸(PIPES)、二甲基次胂酸、2-吗啉-4-基乙烷磺酸(MES)、3-吗啉-2-羟基丙烷磺酸(MOPSO)或磷酸缓冲盐水(PBS)。另一些合适的缓冲剂可以是乙酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐和磷酸盐。在一个实施方案中，缓冲剂是HEPES。在一个实施方案中，缓冲剂的浓度为约2.5mM至约15mM。
本发明的某些实施方案考虑使用螯合剂。螯合剂是指能够与金属离子形成至少两个配位共价键从而产生稳定的水溶性络合物的化学化合物。不希望受到理论的束缚，螯合剂降低了游离二价离子的浓度，其可另外地诱导加速的RNA降解。合适的螯合剂的一些实例包括但不限于：乙二胺四乙酸(EDTA)、EDTA盐、去铁敏B(desferrioxamine B)、去铁胺(deferoxamine)、二硫代氨基甲酸钠(dithiocarb sodium)、青霉胺、戊酸钙、戊酸钠盐、琥巯酸(succimer)、曲恩汀(trientine)、氨三乙酸(nitrilotriacetic acid)、反式-二氨基环己烷四乙酸(DCTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、双(氨基乙基)乙二醇醚-N，N，N’，N’-四乙酸、亚氨基二乙酸、柠檬酸、酒石酸、富马酸，或其盐。在某些实施方案中，螯合剂是EDTA或EDTA盐。在一个示例性实施方案中，螯合剂是EDTA二水合二钠。在一些实施方案中，EDTA的浓度为约0.05mM至约5mM。
包含RNA脂质复合物颗粒的组合物可以是液体或固体。固体的一些非限制性实例包括冷冻形式或经冻干的形式。在一个优选实施方案中，组合物是液体。
如果作为脂质复合物颗粒提供，则编码抗体的RNA与编码破坏免疫耐受的氨基酸序列的RNA以约4∶1至约16∶1、约6∶1至约14∶1、约8∶1至约12∶1、或约10∶1的比例共配制成颗粒，例如脂质复合物颗粒。
在本公开内容的上下文中，术语“颗粒”涉及由分子或分子复合物形成的结构化实体。在一个实施方案中，术语“颗粒”涉及微米或纳米尺寸的结构，例如微米或纳米尺寸的密实结构。
在本公开内容的上下文中，术语“RNA脂质复合物颗粒”涉及包含脂质(特别是阳离子脂质)和RNA的颗粒。带正电荷的脂质体与带负电荷的RNA之间的静电相互作用导致RNA脂质复合物颗粒的络合和自发形成。带正电荷的脂质体通常可使用阳离子脂质(例如DOTMA)和另外的脂质(例如DOPE)来合成。在一个实施方案中，所述RNA脂质复合物颗粒是纳米粒。
本公开内容中使用的“纳米粒”是指包含RNA和至少一种阳离子脂质并且具有适合于静脉内施用的平均直径的颗粒。
术语“平均直径”是指颗粒的平均流体动力学直径，如通过动态光散射(dynamiclight scattering，DLS)以及使用所谓的累积量算法(cumulant algorithm)进行数据分析而测量的，其提供了具有长度维度的所谓的Z平均值和无量纲的多分散性指数(polydispersity index，PI)的结果(Koppel，D.，J.Chem.Phys.57，1972，pp 4814-4820，ISO 13321)。在此，颗粒的“平均直径”、“直径”或“尺寸”与该Z平均值的值同义使用。
术语“多分散性指数”在本文中用作颗粒(例如，纳米粒)系综(ensemble)的尺寸分布的量度。基于动态光散射测量通过所谓的累积量分析来计算多分散性指数。
术语“乙醇注射技术”是指其中通过针将包含脂质的乙醇溶液快速注射到水溶液中的过程。该作用将脂质分散在整个溶液中并促进脂质结构形成，例如脂质囊泡形成例如脂质体形成。一般来说，本文中所述的RNA脂质复合物颗粒可通过将RNA添加至胶体脂质体分散体来获得。在一个实施方案中，使用乙醇注射技术，如下形成这样的胶体脂质体分散体：在搅拌下将包含脂质(例如阳离子脂质(如DOTMA)和另外的脂质)的乙醇溶液注射到水溶液中。在一个实施方案中，本文中所述的RNA脂质复合物颗粒无需挤出步骤即可获得。
术语“挤出”及其变化形式是指产生具有固定的截面轮廓的颗粒。特别地，其是指颗粒的小型化，由此迫使颗粒通过具有限定孔的滤器。
根据本发明，还可通过使用编码抗体或来源于抗体的抗体片段的重组宿主细胞(优选如上文指定的那些)或重组病毒来提供/施用目的核酸，而不是通过使用载体提供/施用核酸，所述载体如包括例如包含脂质的载体例如阳离子脂质、脂质体、特别是阳离子脂质体、和胶束、和纳米粒，例如脂质复合物颗粒。
这些病毒可以是DNA或RNA病毒。数种病毒载体已显示出关于其增强恶性疾病之免疫治疗的潜力的有前景的结果。可使用有复制能力的病毒和无复制能力的病毒，其中后者组是优选的。疱疹病毒、腺病毒、痘苗病毒、呼肠孤病毒和新城疫病毒(New Castle Diseaseviruse)是根据本发明可用的优选病毒的一些实例。在一个实施方案中，病毒或病毒载体选自腺病毒、腺相关病毒、痘病毒包括痘苗病毒和减毒痘病毒、塞姆利基森林病毒(SemlikiForest virus)、呼肠孤病毒、逆转录病毒、新城疫病毒、辛德毕斯病毒(Sindbis virus)和Ty病毒样颗粒。特别优选的是腺病毒和逆转录病毒。逆转录病毒通常是复制缺陷型的(即，其不能产生感染性颗粒)。
在体外或体内将核酸引入到细胞中的方法包括核酸磷酸钙沉淀的转染、与DEAE缔合的核酸的转染、使用携带目的核酸的上述病毒的转染或感染、脂质体介导的转染等。在一些具体实施方案中，优选的是将核酸导向特定细胞。在一些这样的实施方案中，用于将核酸施用于细胞的载体(例如，逆转录病毒或脂质体)可具有结合靶向控制分子。例如，分子例如对靶细胞表面膜蛋白具有特异性的抗体或靶细胞上受体的配体可并入到核酸载体中或与核酸载体连接。一些优选的抗体包括选择性结合肿瘤抗原的抗体。如果期望通过脂质体施用核酸，则可将与和胞吞作用相关的表面膜蛋白结合的蛋白质并入到脂质体制剂中，以使靶向控制和/或摄取成为可能。这样的蛋白质包括对特定细胞类型具有特异性的衣壳蛋白或其片段、针对内化蛋白质的抗体、寻址胞内位点的蛋白质等。
优选地，将编码肽或多肽的RNA引入到细胞中，特别是体内存在的细胞中，导致所述肽或多肽在该细胞中表达。在一些具体实施方案中，使核酸靶向特定细胞是优选的。在一些这样的实施方案中，用于将核酸施用于细胞的载体(例如，逆转录病毒或脂质体)显示为靶向分子。例如，分子例如对靶细胞表面膜蛋白具有特异性的抗体或靶细胞上受体的配体可并入到核酸载体中或可与核酸载体结合。在通过脂质体施用核酸的情况下，可将与和胞吞作用相关的表面膜蛋白结合的蛋白质并入到脂质体制剂中，以能够靶向和/或摄取。这样的蛋白质涵盖对特定细胞类型具有特异性的衣壳蛋白或其片段、针对内化蛋白质的抗体、靶向胞内位置的蛋白质等。
应理解，除非本文中另有说明或与上下文明显矛盾，否则在本文中第VI点下提供的关于编码抗体的核酸的教导相应地适用于编码包含抗原表位的肽或蛋白质的核酸/多核苷酸。WO 2013/143683中描述了可有益地用于在抗原呈递细胞中表达RNA的脾靶向RNA脂质复合物颗粒，其通过引用并入本文。
本文中提供的用于产生抗PD-1抗体的核酸或载体(例如RNA或基于RNA的载体)可通过体外转录方法产生。
这样的方法包括使用标准克隆技术将如上文中所限定的重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)的DNA序列(例如序列表中的SED ID NO：74至92)任选地在免疫球蛋白恒定部分的N端插入到IVT载体(例如pST4载体)中的步骤。载体可包含如本文中限定的5’-UTR、如本文中限定的3’-UTR(例如FI元件)、如上文中限定的poly(A)尾(例如包含30个腺嘌呤核苷酸的poly(A)尾)、接头(L)和另外的(A30LA70)。另外，IVT载体可任选地包含编码分泌信号肽(例如如本文中限定的分泌信号肽)的核酸序列。
为了产生用于体外转录的模板，可使用例如限制性内切核酸酶在poly(A)尾编码区的下游将质粒DNA线性化，从而产生例如通过使用T7 RNA聚合酶转录mRNA的模板。
在体外转录期间，RNA可被修饰以使免疫原性最小化，并且RNA可在其5’末端被加帽。
由此获得的任选地加帽的RNA用于转染宿主细胞，例如NS0细胞、Sp2/0细胞、HEK293细胞或其衍生物(例如HEK293T、HEK293T/17和/或HEK293F)、COS细胞、Vero细胞和/或HeLa细胞。在一个实施方案中，哺乳动物宿主细胞选自HEK293、HEK293T和/或HEK293T/17细胞。对于转染，可使用脂质体，例如如上文中所述的脂质体。
转染细胞用于表达抗体或抗体链或其片段。为了表达抗PD-1抗体的H链和L链二者，优选用两种类型的RNA，即各自编码抗PD-1抗体的H链和L链的单独RNA转染宿主细胞。
抗PD-1抗体可在胞内、在周质间隙中产生，或可直接分泌到培养基中。如果抗体在胞内产生，则随后可裂解细胞并例如通过离心或超滤去除细胞碎片。技术人员熟悉用于分离胞内产生的抗体的合适方法。这同样适用于用于分离分泌至周质间隙的抗体的方法。当例如通过使用分泌信号肽将抗体分泌到培养基中时，可首先浓缩来自这样的表达系统的上清液，例如通过使用可商购的蛋白质浓缩过滤器。前述步骤中的任一项中可包括蛋白酶抑制剂例如PMSF以抑制蛋白水解，并且可包括抗生素以阻止污染物的生长。从经转染宿主细胞中制备的抗PD-1抗体可被纯化，例如通过使用色谱(例如亲和色谱)、凝胶电泳、流式细胞术和/或透析。
VII.药物组合物
在另一个方面中，本发明提供了组合物，例如药物组合物，其包含本发明的抗体中的一种或组合，包括缀合物和/或多聚体；和/或包含本发明的包含编码抗体的核酸序列的核酸中的一种或组合，包括包含所述核酸的宿主细胞或载体。可根据常规技术(例如在Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版，Gennaro，编辑，MackPublishing Co.，Easton，PA，1995中公开的那些)，将药物组合物与可药用载体或稀释剂以及任何其他已知的辅料和赋形剂一起配制。在一个实施方案中，组合物包含多种(例如，两种或更多种)分离的抗体的组合。在另一个实施方案中，组合物包含多种(例如，两种或更多种)核酸、载体或宿主细胞的组合。
本文中使用的“可药用载体”包括任何和所有生理学上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。优选地，载体适合于心血管(例如，静脉内或动脉内)、肌内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或输注)。根据施用途径，活性化合物，即抗体、双特异性和多特异性分子、核酸、载体可被包被在材料中以保护化合物免受酸和其他可使化合物失活的自然条件的作用。
“可药用物质”是指保留母体化合物的所期望的生物活性且不赋予任何不期望的毒理学作用的物质(参见例如Berge，S.M.，et al.(1977)J.Pharm.Sci.66：1-19)。
载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、盐水和水性缓冲溶液、植物油(例如橄榄油)和可注射的有机酯(例如油酸乙酯)、及其合适的混合物。适当的流动性可例如通过使用包衣例如卵磷脂、通过在分散体的情况下维持所需的颗粒尺寸、以及通过使用表面活性剂来维持。
本发明的载体或组合物还可包含可药用盐。可包含的可药用盐的一些实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括来源于无毒无机酸(例如，盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等)的那些，以及来源于无毒有机酸(例如，脂族一元和二元羧酸、经苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等)的那些。碱加成盐包括来源于碱土金属(例如钠、钾、镁、钙等)的那些，以及来源于无毒有机胺(例如N，N’-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等)的那些。
本发明的组合物还可包含抗氧化剂。可药用抗氧化剂的一些实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚(butylated hydroxyanisole，BHA)、丁基化羟基甲苯(butylated hydroxytoluene，BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraaceticacid，EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
本发明的组合物还可包含辅料，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可通过灭菌程序和通过包含多种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸等)二者来确保阻止微生物的存在。还可期望在组合物中包含等张剂，例如糖、多元醇(例如甘露糖醇、山梨糖醇)、或氯化钠。另外，可注射药物形式的延长吸收可通过包含延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸盐和明胶)来实现。
可药用载体包括无菌水溶液或分散体以及用于临时制备无菌可注射溶液剂或分散体的无菌粉末。这样的介质和药剂用于药物活性物质的用途是本领域中已知的。除非任何常规介质或药剂均与活性化合物不相容，否则其在本发明药物组合物中的使用也在考虑之内。也可将补充活性化合物并入到组合物中。
药物组合物在制备和储存条件下通常必须是无菌且稳定的。组合物可被配制成溶液剂、微乳剂、脂质体或适合于高药物浓度的其他有序结构。
本发明的组合物可通过本领域已知的多种方法施用。如本领域技术人员将理解的，施用途径和/或方式将根据所期望结果而变化。活性化合物可用将防止化合物迅速释放的载体来制备，例如控释制剂，包括植入物、经皮贴剂和微囊化递送系统。可使用生物可降解的生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这样的制剂的方法通常是本领域技术人员已知的。参见，例如，Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
为了通过某些施用途径施用本发明的化合物(例如，抗体或者核酸或者载体或者核酸或载体的组合)，可能有必要用阻止其失活的材料包被化合物或与该化合物共施用。例如，可在合适的载体例如脂质体或稀释剂中将化合物施用于对象。可药用稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。脂质体包括水包油包水(water-in-oil-in-water)CGF乳剂以及常规脂质体(Strejan et al.(1984)J.Neuroimmunol.7：27)。
无菌可注射溶液可通过将活性化合物以所需的量与上面列举的成分中的一种或组合根据需要并入合适的溶剂中随后灭菌微过滤来制备。
通常，分散体是通过将活性化合物并入到无菌载剂中来制备的，所述无菌载剂包含基本分散介质和来自以上列举那些的所需的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其产生活性成分加上来自其先前经无菌过滤溶液的任何另外的期望成分的粉末。
调整给药方案以提供最佳的期望响应(例如，治疗响应)。例如，可施用单次推注(single bolus)，可随时间施用数个分开的剂量，或者可根据治疗情况的紧急程度所指示的按比例降低或提高剂量。为了易于施用和剂量均匀性，以剂量单位形式配制肠胃外组合物是尤其有利的。本文中使用的剂量单位形式是指适合作为用于待治疗对象的单位剂量的物理分散单元；每个单元包含经计算与所需药物载体缔合产生期望治疗作用的预定量活性化合物。本发明的剂量单位形式的规格由以下指示并且直接取决于以下：(a)活性化合物的独特特征和待实现的特定治疗作用，以及(b)复配这样的活性化合物用于在个体中治疗敏感性的领域中固有的局限性。
本发明的药物制剂包括适合于经口、经鼻、表面(包括口含和舌下)、经直肠、经阴道和/或肠胃外施用的药物制剂。制剂可方便地以单位剂型存在，并且可通过药剂学领域已知的任何方法制备。产生单一剂型的活性成分的量将根据被治疗对象和特定施用方式而变化。产生单一剂型的活性成分的量将通常是产生治疗作用的组合物的量。
本发明组合物的表面或经皮施用的剂型包括散剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、乳膏剂、洗剂、凝胶剂、溶液剂、贴剂和吸入剂。活性化合物可在无菌条件下与可药用载体以及与可能需要的任何防腐剂或者其他辅料或赋形剂混合。
本文中使用的词组“肠胃外施用”和“肠胃外地施用”意指除了肠内和表面施用之外的施用方式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、椎管内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
在一个实施方案中，抗PD-1抗体待作为蛋白质施用，其中该抗体可从杂交瘤、转染瘤或通过体外转录获得，如本文中所述。在一个实施方案中，抗PD-1抗体待作为如本文中所限定的一种或更多种核酸或者一种或更多种载体施用，例如作为RNA或脂质体来施用，所述脂质体包含该RNA或者编码抗体或者抗体链或者这样的抗体或链的片段的一种或更多种RNA。
在一个实施方案中，本发明的抗体是通过皮下注射以结晶形式施用的，参见Yanget al.(2003)PNAS，100(12)：6934-6939。
当本发明的化合物作为药物施用于人和动物时，它们可单独给予或作为药物组合物给予，所述药物组合物包含与可药用载体组合的例如约0.01％至约99％的活性成分，优选约0.1％至约90％的活性成分，最优选约1％至约50％的活性成分，所述可药用载体优选如上指定的可药用载体。另外，还可另外包含辅料和/或赋形剂，例如抗氧化剂或防腐剂。
无论所选择的施用途径如何，可以以合适的水合形式使用的本发明化合物和/或本发明药物组合物通过本领域技术人员已知的常规方法被配制成可药用剂型。
药物组合物可以用本领域已知的医疗装置来施用。例如，在一个优选实施方案中，本发明的药物组合物可以用无针皮下注射装置来施用，所述装置例如在US 5,399,163、US5,383,851、US 5,312,335、US 5,064,413、US 4,941,880、US 4,790,824或US 4,596,556中公开的装置。可用于本发明的公知的植入物和模块的一些实例包括在以下中描述的那些：US 4,487,603，其公开了用于以受控速率分配药物的可植入微输注泵；US 4,486,194，其公开了用于通过皮肤施用药物的治疗装置；US 4,447,233，其公开了用于以精确的输注速率递送药物的药物输注泵；US 4,447,224，其公开了用于连续药物递送的可变流量可植入输注设备；US 4,439,196，其公开了具有多室隔室的渗透药物递送系统；以及US 4,475,196，其公开了渗透药物递送系统。
许多其他这样的植入物、递送系统和模块是本领域技术人员已知的。在某些实施方案中，本发明的抗体可被配制成确保在体内适当分布。例如，血脑屏障(blood-brainbarrier，BBB)排除了许多高度亲水的化合物。为了确保本发明的治疗化合物穿过BBB(如果期望的话)，它们可被配制成例如在脂质体中。对于制备脂质体的方法，参见例如US 4,522,811、US 5,374,548和US 5,399,331。脂质体可包含一种或更多种选择性运输到特定细胞或器官中的部分，并因此增强靶向药物递送(参见例如，V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685)。一些示例性的靶向部分包括叶酸或生物素(参见例如，Low etal.的US 5,416,016)、甘露糖苷(Umezawa et al.，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)、抗体(P.G.Bloeman et al.(1995)FEBSLett.357：140；M.Owais et al.(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180)、和表面活性剂蛋白A受体(Briscoe et al.(1995)Am.J.Physiol.1233：134)。
在本发明的一个实施方案中，本发明的治疗化合物被配制成在脂质体中。在一个更优选的实施方案中，脂质体包含靶向部分。在一个最优选的实施方案中，脂质体中的治疗化合物是通过推注递送至接近所期望区域的部位，例如肿瘤部位。组合物必须是达到存在易注射性的程度的流体。其在制备和储存条件下必须是稳定的，并且必须阻止微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。
在另一个实施方案中，本发明的抗体可被配制成用于阻止或降低其穿过胎盘的运输。这可通过本领域已知的方法完成，例如通过抗体的聚乙二醇化或通过使用F(ab)2’片段。可进一步参考Cunningham-Rundles C，Zhuo Z，Griffith B，Keenan J.(1992)，″Biological activities of polyethylene-glycol immunoglobulinconjugates.Resistance to enzymatic degradation.″J.Immunol.Methods，152：177-190；和Landor M.(1995)，″Maternal-fetal transfer of immunoglobulins″，Ann.Allergy Asthma Immunol.74：279-283。
组合物必须是无菌的并且是达到该组合物可通过注射器递送的程度的流体。除了水之外，载体可以是等张缓冲盐水溶液、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、及其合适的混合物。适当的流动性可例如通过使用包衣例如卵磷脂、通过在分散体的情况下维持所需的颗粒尺寸、以及通过使用表面活性剂来维持。在许多情况下，优选在组合物中包含等张剂，例如糖、多元醇(例如甘露糖醇或山梨糖醇)和氯化钠。可注射组合物的长期吸收可通过在组合物中包含延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸铝或明胶)来实现。
当活性化合物被适当保护时，如上所述，化合物可与例如惰性稀释剂或可吸收的可食用载体一起经口施用。
VIII.本发明的用途和方法
本发明的抗体、缀合物、多聚体、核酸、载体、宿主细胞和病毒具有多种治疗用途，其包括涉及表达PD-1或其配体(PD-L1和/或PD-L2)的细胞的疾病的治疗。
因此，在另一个方面中，本发明涉及本发明的抗体、缀合物、多聚体、核酸、载体、宿主细胞、病毒或组合物的医学用途。在这方面，本发明提供了用于疾病治疗，例如用于肿瘤/癌症治疗的抗体、缀合物、多聚体、核酸、载体、宿主细胞、病毒或组合物，优选药物组合物。本文中使用的表达“用于疾病治疗，例如用于肿瘤/癌症治疗”也可替换为“用作药物，尤其是在癌症治疗的方法中”；或者所述产品在制备用于在人(或更一般地，有此需要的对象)中进行治疗的所述方法中使用的药物制剂中的用途。
在下文中，当描述本发明的优选用途和方法时，参考本发明的抗体。但应理解，除非本文中另有说明或与上下文明显矛盾，否则该教导也适用于包含抗体或编码抗体的其他活性剂，即本发明的缀合物、多聚体、核酸、载体、宿主细胞、病毒或组合物。
例如，可将抗体或核酸施用于培养中的细胞，例如体外或离体；或施用于对象，优选人对象，例如体内，以治疗或预防多种疾病例如本文中所述的那些。
本文中使用的术语“对象”旨在包括对针对PD-1的抗体有响应的人和非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类、羊、狗、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。优选的对象包括患有可通过杀伤患病细胞来改正或改善的病症的人患者。
根据本发明，术语“疾病”是指任何病理状态，包括癌症或肿瘤，特别是本文中所述的那些形式的肿瘤或癌症，或自身免疫病。
“肿瘤”或“癌症”意指一组异常的细胞或组织，其通过迅速的不受控制的细胞增殖而生长并且在引发新生长的刺激停止之后继续生长。肿瘤显示出部分或完全缺失与正常组织的功能协调和结构组织，并且通常形成独特的组织团块，其可以是良性的或恶性的。根据本公开内容的这些术语也包括转移疾病。出于本发明的目的，术语“癌症”和“癌症疾病”可与术语“肿瘤”和“肿瘤疾病”互换使用。
“转移”意指癌细胞从其原始部位扩散到机体的其他部分。转移的形成是非常复杂的过程，并且取决于恶性细胞从原发性肿瘤脱离、侵袭胞外基质、渗透内皮基底膜以进入体腔和血管，并随后在通过血液运输之后，浸润靶器官。最后，新肿瘤在靶部位的生长取决于血管生成。由于肿瘤细胞或组分可残留并发展出转移潜力，因此即使在去除原发性肿瘤之后仍经常发生肿瘤转移。在一个实施方案中，根据本发明的术语“转移”涉及“远端转移”，其涉及远离原发性肿瘤和区域性淋巴结系统的转移。
术语“疾病的治疗”包括治愈、缩短持续时间、改善、预防、减缓或抑制进展或恶化，或者预防或延缓疾病或其症状的发作。
根据本发明，样品可以是根据本发明可用的任何样品，特别是生物样品，例如组织样品包括体液和/或细胞样品，并且可以以常规方式获得，例如通过组织活检包括穿孔活检，以及通过采集血液、支气管抽吸物、痰、尿、粪便或其他体液来获得。根据本发明，术语“生物样品”还包括生物样品的级分。
本文中讨论的治疗和用途中的治疗作用优选地通过本发明抗体介导细胞杀伤的功能特性来实现，例如通过抑制表达PD-1的细胞上的PD-1的免疫抑制信号、优选通过形成抗体与PD-1的复合物和/或通过诱导免疫应答、更优选通过T细胞介导的免疫应答来实现。
在一个实施方案中，抗PD-1抗体作为蛋白质施用，其中抗体可从杂交瘤、转染瘤或通过体外转录获得，如本文中所述。在一个实施方案中，抗PD-1抗体作为如本文中所限定的一种或更多种核酸或一种或更多种载体，例如作为RNA或脂质体来施用，所述脂质体包含该RNA或者编码抗体或者抗体链或者这样的抗体或链的片段的一种或更多种RNA。
最初可在体外测试本发明抗体的与治疗或诊断用途相关的结合活性。例如，可使用如本文中所述的结合测定、报道基因阻断测定和/或T细胞增殖测定来测试抗体。
本发明的抗体可用于在体内或体外引发以下生物活性中的一种或更多种：与PD-1结合，优选与PD-1特异性结合；具有与癌细胞或正常细胞上PD-1的结合特性；具有与PD-1表位的结合特性；具有与非人PD-1变体，特别是来自小鼠、大鼠、兔和灵长类的PD-1变体的结合特性；阻止或降低PD-1对抑制信号的诱导；抑制PD-1配体与PD-1，优选配体PD-L1与PD-1的相互作用/结合，例如，抑制人PD-L1与人PD-1的结合；抑制PD-L1或PD-L2的免疫抑制信号；增强或启动免疫功能(通过这种机制)，优选地通过增强或启动T细胞介导的免疫应答；抑制癌症增殖；和/或耗竭肿瘤细胞和/或抑制癌症转移。
抗体也可介导吞噬作用或ADCC、在存在补体的情况下介导CDC和/或介导患病细胞的凋亡。
在一个实施方案中，本发明的抗体可用于治疗患有肿瘤疾病的对象。这些肿瘤包括实体瘤和/或血液恶性病。可治疗和/或预防的肿瘤疾病的一些实例涵盖所有癌症和肿瘤实体，其包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。更特别地，这样的癌症的一些实例包括骨癌、血癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、性器官和生殖器官癌、霍奇金病(Hodgkin’s Disease)(霍奇金淋巴瘤)、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、膀胱癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(centralnervous system，CNS)赘生物、神经外胚层癌症、脊椎轴肿瘤(spinal axis tumor)、胶质瘤、脑脊膜瘤和垂体腺瘤。这些癌症可能处于早期、中期或晚期，例如转移。在一个实施方案中，待治疗的癌症处于晚期。
特别容易受PD-1途径阻断治疗影响的癌症的一些实例包括但不限于：黑素瘤，包括转移性黑素瘤；淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤；肺癌，包括非小细胞肺癌(non-small celllung cancer，NSCLC)例如晚期NSCLC、和小细胞肺癌；肾细胞癌；膀胱癌；乳腺癌，包括晚期三阴性乳腺癌；胃和胃食管连接部癌；胰腺腺癌；和卵巢癌。
体内和体外施用本发明组合物的合适途径是本领域公知的，并且可由普通技术人员选择。本发明组合物可全身或局部施用。例如，其可经口或肠胃外施用。在这方面，也可参考上文的相应公开内容。
由于产生的协同作用，在癌症治疗中的组合策略可以是期望的，它可比单一治疗方法的影响要强得多。因此，本发明还涵盖了本发明的抗体或药物组合物也可在组合治疗中施用，即与其他药剂组合施用。
本发明的抗PD-1抗体可与一种或其他更多种治疗剂(例如，细胞毒性剂、放射毒性剂、抗血管生成剂或和免疫抑制剂)共施用，以降低针对本发明抗体的免疫应答的诱导。抗体可与药剂连接(作为免疫复合物)或可与药剂分开施用。在后一种情况(分开施用)下，抗体可在药剂之前、在药剂之后或与药剂同时施用，或者可与其他已知治疗(例如，抗癌治疗，例如放射)共施用。这样的治疗剂尤其包括抗肿瘤剂例如上文所列出的。本发明的抗PD-1抗体与化学治疗剂的共施用提供了两种抗癌剂，其通过不同的机制产生对肿瘤细胞的细胞毒性作用来运作。这样的共施用可解决由于对药物的抗性的发生或肿瘤细胞抗原性的改变而导致的问题，这使它们不与抗体反应。
本发明的抗体或组合物可与化学治疗结合使用。用于化学治疗的治疗剂包括但不限于一种或更多种化学治疗剂，例如，紫杉醇(Taxol)衍生物、泰索帝(taxotere)、吉西他滨、抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶达卡巴嗪(decarbazine))、烷基化剂(例如，氮芥(mechlorethamine)、塞替派苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、美法仑(melphalan)、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类(例如，柔红霉素(原名道诺霉素)和多柔比星(Adriamycin))、抗生素类(例如，更生霉素(dactinomycin)(原名放线菌素)、博来霉素、光辉霉素和氨茴霉素(anthramycin，AMC))和抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。在一个优选的实施方案中，治疗剂是细胞毒性剂或放射毒性剂。在另一个实施方案中，治疗剂是免疫抑制剂。在又一个实施方案中，治疗剂是GM-CSF。在一个优选的实施方案中，治疗剂是多柔比星、顺铂(Platinol)、博来霉素、硫酸盐、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、环磷酰胺(Cytoxan、Procytox、Neosar)或蓖麻毒蛋白A。
在另一个实施方案中，本发明的抗体可与化学治疗剂组合施用，所述化学治疗剂优选地在患有特别容易受PD-1途径阻断影响的癌症的患者中显示出治疗效力，所述癌症例如：黑素瘤，包括转移性黑素瘤；霍奇金淋巴瘤；肺癌，包括非小细胞肺癌(NSCLC)例如晚期NSCLC、和小细胞肺癌；肾细胞癌；膀胱癌；晚期三阴性乳腺癌，包括晚期三阴性乳腺癌；胃和胃食管连接部癌；胰腺腺癌；或卵巢癌。
在一个实施方案中，本发明的抗体或药物组合物与免疫治疗剂一起施用。本文中使用的“免疫治疗剂”涉及可参与激活特异性免疫应答和/或免疫效应物功能的任何试剂。本公开内容考虑了抗体作为免疫治疗剂的用途。不希望受到理论的束缚，抗体能够通过多种机制来实现针对癌细胞的治疗性作用，包括诱导凋亡、阻断信号转导途径的组分或抑制肿瘤细胞的增殖。在某些实施方案中，抗体是单克隆抗体。单克隆抗体可通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell mediated cytotoxicity，ADCC)来诱导细胞死亡，或结合补体蛋白，导致直接的细胞毒性，称为补体依赖性细胞毒性(complementdependent cytotoxicity，CDC)。可与本公开内容组合使用的抗癌抗体和潜在抗体靶标(在括号里)的一些非限制性实例包括：阿巴伏单抗(CA-125)、阿昔单抗(CD41)、阿达木单抗(EpCAM)、阿夫土珠单抗(Afutuzumab)(CD20)、培化阿珠单抗(Alacizumab pegol)(VEGFR2)、喷替酸阿妥莫单抗(CEA)、阿麦妥昔单抗(Amatuximab)(MORAb-009)、马安那莫单抗(TAG-72)、阿泊珠单抗(HLA-DR)、阿昔莫单抗(CEA)、阿特珠单抗(Atezolizumab)(PD-L1)、巴维昔单抗(磷脂酰丝氨酸)、贝妥莫单抗(CD22)、贝利木单抗(BAFF)、贝伐珠单抗(VEGF-A)、莫比伐单抗(Bivatuzumab mertansine)(CD44v6)、博纳吐单抗(Blinatumomab)(CD 19)、布妥昔单抗(CD30 TNFRSF8)、莫坎妥珠单抗(黏蛋白CanAg)、雷坎妥珠单抗(MUC1)、卡罗单抗喷地肽(前列腺癌细胞)、卡鲁单抗(Carlumab)(CNT0888)、卡妥索单抗(EpCAM、CD3)、西妥昔单抗(EGFR)、泊西他珠单抗(Citatuzumab bogatox)(EpCAM)、西妥木单抗(IGF-1受体)、克劳西单抗(Claudiximab)(密蛋白)、替坦司可利妥珠单抗(Clivatuzumab tetraxetan)(MUC1)、西他土珠单抗(TRAIL-R2)、达西珠单抗(CD40)、达罗土珠单抗(Dalotuzumab)(胰岛素样生长因子I受体)、地诺单抗(RANKL)、地莫单抗(B-淋巴瘤细胞)、多兹图单抗(Drozitumab)(DR5)、依美昔单抗(GD3神经节苷脂)、依决洛单抗(EpCAM)、埃罗妥珠单抗(SLAMF7)、依那妥珠单抗(PDL192)、恩司昔单抗(Ensituximab)(NPC-1C)、依帕珠单抗(CD22)、厄妥索单抗(HER2/neu、CD3)、伊瑞西珠单抗(整合素αvβ3)、法勒珠单抗(Farletuzumab)(叶酸受体1)、FBTA05(CD20)、芬克拉妥珠单抗(Ficlatuzumab)(SCH 900105)、芬妥木单抗(Figitumumab)(IGF-1受体)、弗拉伏妥单抗(Flanvotumab)(糖蛋白75)、夫苏木单抗(Fresolimumab)(TGF-β)、加利昔单抗(Galiximab)(CD80)、盖尼塔单抗(IGF-I)、吉妥单抗奥唑米星(CD33)、吉伏珠单抗(Gevokizumab)(ILIβ)、吉瑞妥昔单抗(Girentuximab)(碳酸酐酶9(CA-IX))、格莱木单抗-维多汀(Glembatumumab vedotin)(GPNMB)、替伊莫单抗(CD20)、依库单抗(Icrucumab)(VEGFR-1)、伊戈伏单抗(CA-125)、依坦希单抗(Indatuximab ravtansine)(SDC1)、英妥木单抗(Intetumumab)(CD51)、奥英妥珠单抗(CD22)、伊匹单抗(CD 152)、伊妥木单抗(Iratumumab)(CD30)、拉贝珠单抗(CEA)、来沙木单抗(TRAIL-R2)、利韦单抗(乙型肝炎表面抗原)、林妥珠单抗(CD33)、洛妥珠单抗(Lorvotuzumab mertansine)(CD56)、鲁卡木单抗(CD40)、鲁昔单抗(CD23)、马帕木单抗(TRAIL-R1)、马妥珠单抗(EGFR)、美泊利单抗(IL5)、米拉珠单抗(Milatuzumab)(CD74)、米妥莫单抗(GD3神经节苷脂)、莫加珠单抗(Mogamulizumab)(CCR4)、莫妥莫单抗(Moxetumomab pasudotox)(CD22)、他那可单抗(C242抗原)、他那莫单抗(5T4)、纳那妥单抗(Namatumab)(RON)、耐昔妥珠单抗(Necitumumab)(EGFR)、尼妥珠单抗(EGFR)、纳武单抗(IgG4)、奥法木单抗(CD20)、奥拉单抗(Olaratumab)(PDGF-R a)、奥纳珠单抗(Onartuzumab)(人分散因子受体激酶)、莫奥珠单抗(Oportuzumab monatox)(EpCAM)、奥戈伏单抗(CA-125)、欧西鲁单抗(Oxelumab)(OX-40)、帕尼单抗(EGFR)、帕曲妥单抗(Patritumab)(HER3)、培妥莫单抗(Pemtumomab)(MUC1)、帕妥珠单抗(HER2/neu)、平妥单抗(腺癌抗原)、普托木单抗(波形蛋白)、雷妥莫单抗(Racotumomab)(N-羟乙酰神经氨酸)、雷德图单抗(Radretumab)(纤连蛋白额外结构域-B)、雷韦单抗(狂犬病病毒糖蛋白)、雷莫芦单抗(VEGFR2)、利妥木单抗(Rilotumumab)(HGF)、利妥昔单抗(CD20)、罗妥木单抗(Robatumumab)(IGF-1受体)、沙玛立珠单抗(Samalizumab)(CD200)、西罗珠单抗(FAP)、司妥昔单抗(IL6)、他贝鲁单抗(Tabalumab)(BAFF)、他珠单抗(甲胎蛋白)、帕他普莫单抗(CD19)、替妥莫单抗(Tenatumomab)(生腱蛋白C)、替妥木单抗(Teprotumumab)(CD221)、西木单抗(CTLA4)、替加珠单抗(TRAIL-R2)、TNX-650(IL13)、托西莫单抗(CD20)、曲妥珠单抗(HER2/neu)、TRBS07(GD2)、替西木单抗(CTLA4)、西莫白介素图考珠单抗(tucotuzumabcelmoleukin)(EpCAM)、优利妥昔单抗(Ublituximab)(MS4A1)、乌瑞鲁单抗(Urelumab)(4-1BB)、伏洛昔单抗(整合素α5β1)、伏妥莫单抗(肿瘤抗原CTAA 16.88)、扎妥木单抗(EGFR)和扎木单抗(CD4)。
例如，根据本发明，另外用一种或更多种靶向另外的免疫检查点的抗体治疗施用了本发明抗体的对象。通过阻断抗原呈递细胞与T淋巴细胞之间的抑制性相互作用来活化肿瘤防御的免疫检查点抑制剂包括但不限于抗PD-L1、抗CTLA4、抗TIM-3、抗KIR和/或抗LAG-3。还涵盖刺激活化检查点(例如CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、OX40、GITR或ICOS)的免疫治疗剂，即，例如抗CD27、抗CD28、抗CD40、抗CD122、抗CD137、抗OX40、抗GITR和/或抗ICOS。特别优选的组合治疗包括但不限于：抗PD1和抗PD-L1的组合，从而通过靶向两种组分来提高效率和对PD1途径的阻断；或者抗PD-1和抗CTLA4的组合，以阻止PD1途径和CTLA4途径二者的阻断。
在本发明的另一个具体实施方案中，另外用抗血管生成剂治疗施用了抗体的对象，所述抗血管生成剂包括靶向血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor，VEGF)或其受体VEGFR的抗体、以及一种或更多种抑制血管生成的化合物。用这些药物进行的预处理或这些药物的平行应用可改善抗体在大量肿瘤(bulk tumor)中的渗透。
例如，抗血管生成剂可靶向VEGF。合适的VEGF抑制剂是贝伐珠单抗。另一些实例包括但不限于抑制VEGFR1、2、3、PDGFR、c-Kit、Raf和/或RET的多激酶抑制剂(例如舒尼替尼(Sunitinib)、索拉非尼(Sorafenib)、帕唑帕尼(Pazopanib))。
在本发明的另一个具体实施方案中，另外用抑制生长因子受体信号传导的化合物治疗施用了抗体的对象，所述化合物包括与EGFR受体结合的单克隆抗体以及抑制由EGFR受体启动的信号传导的化合物。
在另一个实施方案中，这样的治疗剂包括导致调节性T细胞耗竭或功能失活的药剂，例如低剂量环磷酰胺、和/或抗IL2或抗IL2受体抗体。
在又一个实施方案中，本发明的抗体可与一种或更多种选自抗CD25抗体、抗EPCAM抗体和抗CD40抗体的抗体组合施用。
在又一个实施方案中，本发明的抗体可与抗C3b(i)抗体组合施用，以增强补体激活。
在另一个实施方案中，本发明的抗体可与疫苗接种治疗组合施用，即与至少一种包含用于在对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位的肽或蛋白质，或者至少一种编码该肽或蛋白质的多核苷酸/核酸组合施用。
术语“抗原”涉及包含免疫应答或免疫效应分子例如抗体所针对的和/或待针对的表位的药剂。特别地，术语“抗原”包括蛋白质和肽。在一个实施方案中，抗原是疾病相关抗原，例如肿瘤抗原。
术语“疾病相关抗原”以其最广泛的含义使用，是指与疾病相关的任何抗原，其优选包含将刺激宿主的免疫系统以产生针对疾病的细胞抗原特异性免疫应答和/或体液抗体应答的表位。疾病相关抗原、其表位或靶向疾病相关抗原或表位的药剂(例如诱导免疫应答的肽或蛋白质)因此可用于治疗目的，特别是用于疫苗接种。疾病相关抗原可与微生物感染相关(通常是微生物抗原)或与癌症(通常是肿瘤)相关。
在一个实施方案中，免疫应答待针对的抗原(即疾病相关抗原)是肿瘤抗原，优选如本文中所指定的。更优选地，至少一种肿瘤抗原选自：
NY-ESO-1(UniProt P78358)，酪氨酸酶(UniProt P14679)，MAGE-A3(UniProtP43357)，TPTE(UniProt P56180)，KLK2(UniProt P20151)，PSA(KLK3)(UniProt P07288)，PAP(ACPP，UniProt P15309)，HOXB13(UniProt Q92826)，NKX3-1(UniProt Q99801)，HPV16E6/E7(UniProt P03126/P03129)；HPV18 E6/E7(UniProt P06463/P06788)；HPV31 E6/E7(UniProt P17386/P17387)；HPV33 E6/E7(UniProt P06427/P06429)；HPV45 E6/E7(UniProt P21735/P21736)；HPV58 E6/E7(UniProt P26555/P26557)，PRAME(UniProtP78395)，ACTL8(UniProt Q9H568)，CXorf61(KKLC1，UniProt Q5H943)，MAGE-A9B(UniProtP43362)，CLDN6(UniProt P56747)，PLAC1(UniProt Q9HBJ0)，和p53(UniProt P04637)。
用于疫苗接种的肽或蛋白质(即疫苗抗原)可包含所述抗原或其表位。在一个实施方案中，疫苗抗原以编码疫苗抗原的RNA的形式施用。涉及这些抗原的治疗方法可旨在治疗癌症，其中癌细胞的特征在于表达相应的抗原。也可使用本文中所述的抗原，特别是
NY-ESO-1，酪氨酸酶，MAGE-A3，TPTE，KLK2，PSA(KLK3)，PAP(ACPP)，HOXB13，NKX3-1，HPV16 E6/E7；HPV18 E6/E7；HPV31 E6/E7；HPV33 E6/E7；HPV45 E6/E7；HPV58 E6/E7，PRAME，ACTL8，CXorf61(KKLC1)，MAGE-A9B，CLDN6，PLAC1和p53的组合。
涉及这样的抗原组合的治疗方法可旨在治疗癌症，其中癌细胞的特征在于表达相应抗原组合中的两种或更多种抗原，或者其中待治疗的患有某种癌症的患者中的大部分(例如，至少80％、至少90％或甚至更多)的癌细胞表达组合中相应抗原中的一种或更多种。这样的组合可包含至少2种、至少3种、至少4种、至少5种或至少6种抗原的组合。因此，组合可包含3、4、5、6、7或8种抗原。在这种情况下，可通过施用包含所述抗原或其表位的肽或蛋白质(即疫苗抗原)、或者编码该肽或蛋白质的RNA来解决组合中的各抗原。在一个特别优选的实施方案中，通过施用编码包含抗原的肽或蛋白质的RNA来解决组合中的各抗原。因此，疫苗接种可涵盖施用不同的RNA分子，其中所述不同的RNA分子中的每种编码包含抗原组合中抗原的肽或蛋白质。组合中的不同疫苗抗原或编码不同疫苗抗原的RNA可以以混合物、顺序或其组合的形式施用。
在一个实施方案中，抗原组合包含以下、优选由以下组成：NY-ESO-1、酪氨酸酶、MAGE-A3和TPTE。该组合可用于治疗皮肤黑素瘤。
在一个实施方案中，抗原组合包含以下、优选由以下组成：KLK2、PSA(KLK3)、PAP(ACPP)、HOXB13和NKX3-1。该组合可用于治疗前列腺癌。
在一个实施方案中，抗原组合包含以下、优选由以下组成：PRAME、ACTL8、CXorf61(KKLC1)、MAGEA3、MAGE-A9B、CLDN6、NY-ESO-1和PLAC1。该组合可用于治疗乳腺癌，例如三阴性乳腺癌，特别是雌激素受体阴性和孕酮受体阴性和HER2阴性乳腺癌。
在一个实施方案中，抗原组合包含以下、优选由以下组成：CLDN6、p53和PRAME。该组合可用于治疗卵巢癌，例如上皮卵巢癌。
本文中所述的疫苗可由一种或更多种靶向在疾病例如癌症中表达的一种或更多种抗原的RNA组成。活性成分可以是单链mRNA，其在进入抗原呈递细胞(APC)之后被翻译成相应的蛋白质。除了编码抗原序列的野生型序列或经密码子优化的序列之外，RNA可包含针对RNA的关于稳定性和翻译效率的最大效力而优化的一种或更多种结构元件(5’-帽、5’-UTR、3’-UTR、poly(A)尾)。在一个实施方案中，RNA包含所有这些元件。在一个实施方案中，β-S-ARCA(D1)可用作在RNA药物物质5’末端的特定加帽结构。作为5’-UTR序列，可使用人α-珠蛋白mRNA的5’-UTR序列，其任选地具有经优化的“Kozak序列”以提高翻译效率。作为3’-UTR序列，可使用位于编码序列与poly(A)尾之间的人β-珠蛋白mRNA的两个重复的3’-UTR，以确保较高的最大蛋白质水平和延长的mRNA持久性。作为替代，3’-UTR可以是来源于“分裂的氨基端增强子”(AES)mRNA(称为F)和线粒体编码的12S核糖体RNA(称为I)的两个序列元件的组合(FI元件)。这些通过对赋予RNA稳定性和增强总蛋白表达的序列进行离体选择过程来鉴定(参见WO 2017/060314，其通过引用并入本文)。此外，可使用测量长度为110个核苷酸的poly(A)尾，其由以下区段组成：30个腺苷残基，随后是(随机核苷酸的)10个核苷酸的接头序列和另外70个腺苷残基。这种poly(A)尾序列被设计成用于在树突细胞中增强RNA稳定性和翻译效率。
此外，sec(分泌信号肽)和/或MITD(MHC I类运输结构域)可以以相应元件分别翻译成N端或C端标签的方式与抗原编码区融合。来源于编码人MHC I类复合物(HLA-B51、单倍型A2、B27/B51、Cw2/Cw3)的序列的融合蛋白标签已显示改善抗原加工和呈递。Sec可对应于编码分泌信号肽的78bp片段，其引导新生多肽链易位到内质网中。MITD可对应于MHC I类分子的跨膜和胞质结构域，也称为MHC I类运输结构域。具有其自身分泌信号肽和跨膜结构域的抗原例如CLDN6可不需要添加融合标签。编码主要由如通常用于融合蛋白的氨基酸甘氨酸(glycine，G)和丝氨酸(serine，S)组成的短接头肽的序列可用作GS/接头。
可将抗原与辅助表位组合施用以破坏免疫耐受。辅助表位可以是破伤风类毒素来源的，例如来源于破伤风梭菌(Clostridium tetani)的破伤风类毒素(tetanus toxoid，TT)的P2P16氨基酸序列。这些序列可通过在致敏期间提供肿瘤非特异性T细胞辅助来支持克服用于有效诱导对自身抗原的免疫应答的自身耐受机制。破伤风类毒素重链包含可与MHC II类等位基因混杂结合并在几乎所有经破伤风疫苗接种的个体中诱导CD4+记忆T细胞的表位。另外，已知TT辅助表位与肿瘤相关抗原的组合与施加单独的肿瘤相关抗原相比通过在致敏期间提供CD4+介导的T细胞辅助来改善免疫刺激。为了降低刺激CD8+T细胞的风险，可使用已知包含混杂结合辅助表位的两种肽序列(例如P2和P16)以确保与尽可能多的MHCII类等位基因结合。
在一个实施方案中，疫苗抗原包含破坏免疫耐受的氨基酸序列。在一个实施方案中，破坏免疫耐受的氨基酸序列包含辅助表位，优选破伤风类毒素来源的辅助表位。破坏免疫耐受的氨基酸序列可直接或通过接头隔开地与疫苗序列(例如抗原序列)的C端融合。任选地，破坏免疫耐受的氨基酸序列可连接疫苗序列和MITD。在疫苗抗原以编码疫苗抗原的RNA形式施用的情况下，破坏免疫耐受的氨基酸序列可以是RNA编码的。在一个实施方案中，将靶向抗原的RNA与编码辅助表位的RNA一起施加以增强产生的免疫应答。该编码辅助表位的RNA可包含抗原编码RNA的上述针对RNA关于稳定性和翻译效率的最大效力而优化的结构元件(5’-帽、5’-UTR、3’-UTR、poly(A)尾)。此外，sec(分泌信号肽)和/或MITD(MHC I类运输结构域)可以以相应元件分别翻译成N端或C端标签的方式与辅助表位编码区融合，如上文中针对抗原编码RNA所述。在一个实施方案中，将RNA与编码破伤风类毒素(TT)来源的辅助表位P2和P16(P2P16)的另外的RNA共施用，以增强产生的免疫应答。
疫苗RNA可与脂质体复合以产生用于静脉内(intravenous，i.v.)施用的在血清中稳定的RNA脂质复合物(RNA(LIP))。如果使用不同RNA的组合，则RNA可分别与脂质体复合以产生用于静脉内(i.v.)施用的在血清中稳定的RNA脂质复合物(RNA(LIP))。RNA(LIP)靶向淋巴器官中的抗原呈递细胞(APC)，这导致对免疫系统的强效刺激。
在一个实施方案中，将疫苗RNA与编码破坏免疫耐受的氨基酸序列的RNA共配制成脂质复合物颗粒。
本文中使用的“肿瘤抗原”或“癌症抗原”包括(i)肿瘤特异性抗原，(ii)肿瘤相关抗原，(iii)肿瘤上的胚胎抗原，(iv)肿瘤特异性膜抗原，(v)肿瘤相关膜抗原，(vi)生长因子受体，和(xi)与癌症相关的任何其他类型的抗原或物质。
任何肿瘤抗原(优选由肿瘤细胞表达)都可通过本文中公开的疫苗接种来靶向。在一个实施方案中，肿瘤抗原由肿瘤细胞呈递，并因此可被T细胞靶向。如本文中所公开的疫苗接种优选地活化对MHC呈递的肿瘤抗原具有特异性的T细胞。肿瘤抗原可以是肿瘤特异性抗原(tumor-specific antigen，TSA)或肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)。TSA是肿瘤细胞独有的，并且不在体内的其他细胞上出现。TAA不是肿瘤细胞独有的，并且相反地在无法诱导对抗原的免疫耐受状态的条件下也在正常细胞上表达。抗原在肿瘤上的表达可在使得免疫系统能够对抗原作出应答的条件下发生。TAA可以是在胚胎发育期间在正常细胞上表达的抗原，此时免疫系统是未成熟的并且不能作出应答，或者TAA可以是通常以极低水平存在于正常细胞上但在肿瘤细胞上以高得多的水平表达的抗原。
肽和蛋白质抗原的长度可以为2至100个氨基酸，包括例如至少5个氨基酸、至少10个氨基酸、至少15个氨基酸、至少20个氨基酸、至少25个氨基酸、至少30个氨基酸、至少35个氨基酸、至少40个氨基酸、至少45个氨基酸或至少50个氨基酸。在一些实施方案中，肽可大于50个氨基酸。在一些实施方案中，肽可大于100个氨基酸。
肽或蛋白质抗原可以是可诱导或提高免疫系统产生针对靶抗原(例如，疾病相关抗原)的抗体和T细胞应答的能力的任何肽或蛋白质。
在又一个实施方案中，本发明的抗体可与放射治疗和/或自体外周干细胞或骨髓移植结合施用。
本发明还涵盖了包含本发明组合物与至少一种抗炎剂或至少一种免疫抑制剂的组合治疗。在一个实施方案中，这样的治疗剂包括一种或更多种抗炎剂，例如甾体药物或NSAID(非甾体抗炎药)。一些优选的药剂包括例如：阿司匹林(aspirin)和其他水杨酸盐、Cox-2抑制剂例如罗非昔布(rofecoxib)(Vioxx)和塞来昔布(celecoxib)(Celebrex)，NASID例如布洛芬(ibuprofen)(Motrin，Advil)、非诺洛芬(fenoprofen)(Nalfon)、萘普生(Naprosyn)、舒林酸(sulindac)(Clinoril)、双氯芬酸(Voltaren)、吡罗昔康(piroxicam)(Feldene)、酮洛芬(ketoprofen)(Orudis)、二氟尼柳(diflunisal)(Dolobid)、萘丁美酮(nabumetone)(Relafen)、依托度酸(etodolac)(Lodine)、奥沙普嗪(oxaprozin)(Daypro)和吲哚美辛(indomethacin)(Indocin)。根据本发明的组合治疗还可包含以下的组合：(i)本发明的抗体与(ii)如上所述的疫苗接种处理/治疗，和(iii)至少一种抗炎剂或至少一种免疫抑制剂。
本发明的双特异性和多特异性分子可用于与另外的免疫检查点相互作用。从而抑制或激活/刺激相应的另外的检查点。可被靶向的另外的检查点抑制剂包括但不限于CTLA4、PD-L1、TIM-3、KIR或LAG-3，可被第二结合特异性靶向的检查点激活剂包括但不限于CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、OX40、GITR或ICOS。结合特异性的一些优选组合包括抗PD1和抗PD-L1或抗PD-1和抗CTLA4。
作为替代或补充，本发明的双特异性或多特异性分子可用于通过靶向例如血管内皮生长因子(VEGF)或其受体VEGFR(例如VEGFR1、2、3)来提供抗血管生成活性。第二结合特异性可也能够靶向PDGFR、c-Kit、Raf和/或RET。
作为替代或补充，本发明的双特异性或多特异性分子可用于靶向肿瘤抗原，优选如上指定的肿瘤抗原，这使本发明的抗体能够对癌细胞具有特异性。
优选地，除了肿瘤抗原特异性和抗PD-1结合特异性之外，本发明的多特异性抗体还可用于调节效应细胞上的Fc-γR或Fc-αR水平，例如通过加帽和消除细胞表面上的受体。抗Fc受体的混合物也可用于该目的。
对于本发明的用途和方法，可包含在药物组合物，优选如上所述的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可变化，以便获得有效实现特定患者、组合物、和施用方式的期望治疗响应而对患者无毒的活性成分的量。选择的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所采用的本发明的特定组合物的活性、施用途径、施用时间、所采用的特定化合物的排泄速率、治疗持续时间、与所采用特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或物质、所治疗患者的年龄、性别、体重、病情、一般健康状况和既往病史，以及医学领域中公知的类似因素。
具有本领域普通技术的医师或兽医可容易地确定和开出所需药物组合物的有效量。例如，医生或兽医可以以低于实现所期望治疗效果所需的水平开始在药物组合物中使用的本发明化合物的剂量，并逐渐提高剂量直至实现所期望效果。一般而言，本发明组合物的合适日剂量将是有效产生治疗效果的最低剂量的化合物的量。这样的有效剂量将通常取决于上述因素。优选的是，施用是静脉内的、肌内的、腹膜内的或皮下的，优选地靠近靶部位施用。如果期望的话，治疗组合物的有效日剂量可以作为两个、三个、四个、五个、六个或更多个亚剂量在全天以适当的间隔分开施用来施用，任选地以单位剂型施用。虽然本发明的化合物可单独施用，但优选将化合物作为药物组合物(制剂)施用。
在一个实施方案中，本发明的抗体可通过输注，优选长时间(例如超过24小时)内缓慢连续输注施用，以降低毒副作用。施用也可通过在2至24小时例如2至12小时的时间内的连续输注进行。这样的方案可根据需要重复一次或更多次，例如在6个月或12个月之后。可通过使用靶向抗PD-1抗体的抗独特型抗体来测量生物样品中在施用之后的循环抗PD-1抗体的量来确定或调整剂量。
在又一个实施方案中，通过维持治疗来施用抗体，例如如每周一次，持续6个月或更长时间。
肿瘤治疗的“治疗有效剂量”可通过完全或部分的客观肿瘤响应来测量。完全响应(complete response，CR)被定义为没有疾病的临床证据、放射学证据或其他证据。部分响应(partial response，PR)是由聚集肿瘤尺寸减少大于50％引起的。进展的中位时间是表征客观肿瘤响应的持久性的量度。
肿瘤治疗的“治疗有效剂量”也可通过其稳定疾病进展的能力来测量。化合物抑制癌症的能力可在预测对人肿瘤的效力的动物模型系统中进行评价。作为替代，组合物的该特性可通过本领域技术人员已知的体外测定来检测化合物抑制细胞生长或凋亡的能力来评价。治疗有效量的治疗化合物可在对象中减小肿瘤尺寸或者改善症状。本领域普通技术人员将能够基于这样的因素如对象的尺寸、对象症状的严重程度以及所选择的特定组合物或施用途径来确定这样的量。
因此，在另一个方面中，本发明涉及本发明的抗体、缀合物、多聚体、核酸、载体、宿主细胞、病毒或组合物的医学用途。在这方面，本发明提供了用于疾病治疗，例如用于肿瘤/癌症治疗的抗体、缀合物、多聚体、核酸、载体、宿主细胞、病毒或组合物，优选药物组合物。本文中使用的表达“用于疾病治疗，例如用于肿瘤/癌症治疗”也可替换为“用作药物，尤其是在癌症治疗的方法中”；或所述产品在制备用于在人(或更一般地，有此需要的对象)中进行治疗的所述方法中使用的药物制剂中的用途。
作为本发明的抗体、缀合物、多聚体、核酸、载体、宿主细胞、病毒或组合物在肿瘤/癌症治疗中的用途的替代，本发明的抗体、缀合物、多聚体、核酸、载体、宿主细胞、病毒或组合物可用于治疗需要治疗对免疫应答的诱导的其他疾病。因此，本发明的抗体、缀合物、多聚体、核酸、载体、宿主细胞、病毒或组合物可对感染治疗有效。感染治疗可包括例如感染人肝炎病毒(乙型肝炎、丙型肝炎、甲型肝炎或戊型肝炎)、人逆转录病毒、人免疫缺陷病毒(HIV1、HIV2)、人T白血病病毒(HTLV1、HTLV2)、或人淋巴细胞型病毒、单纯疱疹病毒1型或2型、EB病毒、巨细胞病毒、水痘-带状疱疹病毒、人疱疹病毒包括人疱疹病毒6、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、日本脑炎病毒、腮腺炎病毒、流感病毒、腺病毒、肠病毒、鼻病毒、发生严重急性呼吸综合征(severely acute respiratory syndrome，SARS)的病毒、埃博拉病毒(ebola virus)、西尼罗病毒(west nile virus)、或经人工修饰的这些病毒。
还进一步作为本发明的抗体、缀合物、多聚体、核酸、载体、宿主细胞、病毒或组合物在肿瘤/癌症治疗中的用途的替代，本发明的抗体、缀合物、多聚体、核酸、载体、宿主细胞、病毒或组合物可用于治疗需要治疗活化免疫细胞耗竭的其他疾病。因此，本发明的抗体、缀合物、多聚体、核酸、载体、宿主细胞、病毒或组合物可有效用于治疗自身免疫病。自身免疫病可包括例如乳糜泻、炎性肠病、多发性硬化、类风湿关节炎和系统性红斑狼疮。
除非上下文另有说明，否则关于上文公开的与癌症治疗相关的本发明用途和方法的一些优选实施方案的公开内容也适用于感染性疾病或自身免疫病的治疗。
包含本发明的抗体、缀合物或多聚体以及使用说明的试剂盒也在本发明的范围内。试剂盒还可包含一种或更多种另外的试剂，例如靶向本发明抗PD-1抗体的抗体、酶底物或其他底物、用于获得显色的酶等。本发明的试剂盒可用于样品中PD-1的定性或定量检测。
在一个具体实施方案中，本发明提供了用于检测样品中PD-1抗原的存在或测量PD-1抗原的量的方法，其包括在允许抗体或其部分与PD-1之间形成复合物的条件下，使样品和对照样品与特异性结合PD-1的抗体接触，所述抗体优选为如本文中所公开的抗体。然后检测复合物的形成，其中与对照样品相比样品之间不同的复合物形成表明样品中PD-1抗原的存在。
在又一个实施方案中，本发明提供了用于在体内或体外检测表达PD-1的细胞的存在或量化表达PD-1的细胞的量的方法。所述方法包括(i)向对象施用与可检测标志物缀合的本发明抗体；(ii)将对象暴露于用于检测所述可检测标志物的手段，以鉴定包含表达PD-1的细胞的区域。
如上所述的方法特别地可用于诊断PD-1相关疾病和/或定位PD-1相关疾病。优选地，高于对照样品中PD-1的量的样品中PD-1的量，表明该样品所来源的对象，特别是人中存在PD-1相关疾病。
在又一个实施方案中，本发明的缀合物可用于通过将化合物(例如，治疗剂、标记等)与抗体连接而将这样的化合物靶向至细胞，所述细胞具有在其表面上表达的PD-1。因此，本发明还提供了用于离体或体外定位表达PD-1的细胞的方法。
本文中在描述蛋白质或肽、结构和功能时，提及氨基酸。在本说明书中，氨基酸残基通过使用以下缩写来表示。此外，除非明确地另外指出，否则肽和蛋白质的氨基酸序列从N端至C端(左端至右端)识别，N端被识别为第一残基。氨基酸通过其3字母缩写、1字母缩写或全称来指定，如下。Ala：A：丙氨酸；Asp：D：天冬氨酸；Glu：E：谷氨酸；Phe：F：苯丙氨酸；Gly：G：甘氨酸；His：H：组氨酸；Ile：I：异亮氨酸；Lys：K：赖氨酸；Leu：L：亮氨酸；Met：M：甲硫氨酸；Asn：N：天冬酰胺；Pro：P：脯氨酸；Gln：Q：谷氨酰胺；Arg：R：精氨酸；Ser：S：丝氨酸；Thr：T：苏氨酸；Val：V：缬氨酸；Trp：W：色氨酸；Tyr：Y：酪氨酸；Cys：C：半胱氨酸。
本文中关于特定氨基酸序列(例如，序列表中示出的那些)给出的教导将被解释为也涉及产生与所述特定序列在功能上等同之序列的所述特定序列的变体，例如表现出与特定氨基酸序列的特性相同或类似特性的氨基酸序列。
根据本发明，术语“变体”特别地是指突变体、剪接变体、构象体(conformation)、同种型、等位基因变体、物种变体和物种同源物，特别是天然存在的那些。等位基因变体涉及基因正常序列的改变，其重要性通常不清楚。完整的基因测序通常鉴定给定基因的许多等位基因变体。物种同源物是与给定核酸或氨基酸序列具有不同起源物种的核酸或氨基酸序列。术语“变体”应涵盖任何翻译后经修饰变体和构象变体。
出于本发明的目的，氨基酸序列的“变体”包括氨基酸插入变体、氨基酸添加变体、氨基酸缺失变体和/或氨基酸替换变体。
优选地，给定氨基酸序列与作为所述给定氨基酸序列的变体的氨基酸序列之间的相似性，优选同一性的程度将为至少约60％、65％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。相似性或同一性的程度优选地针对为参考氨基酸序列的全长的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的氨基酸区域给出。例如，如果参考氨基酸序列由200个氨基酸组成，则相似性或同一性的程度优选地针对至少约20个、至少约40个、至少约60个、至少约80个、至少约100个、至少约120个、至少约140个、至少约160个、至少约180个或约200个氨基酸，优选连续氨基酸给出。在一些优选实施方案中，相似性或同一性的程度针对参考氨基酸序列的全长给出。用于确定序列相似性，优选序列同一性的比对可使用本领域已知的工具，优选地使用最佳序列比对，例如，使用Align，使用标准设置，优选EMBOSS：：needle，矩阵：Blosum62，空位开放(Gap Open)10.0，空位延伸(Gap Extend)0.5来完成。
“序列相似性”表示相同或代表保守氨基酸替换的氨基酸的百分比。两个氨基酸序列之间的“序列同一性”表明序列之间相同氨基酸的百分比。
术语“百分比同一性”旨在表示待比较的两个序列之间在最佳比对之后获得的相同的氨基酸残基的百分比，该百分比是纯统计学的，并且两个序列之间的差异是随机分布的并且在其全长上。两个氨基酸序列之间的序列比较常规上是通过在最佳地对其比对之后对这些序列进行比较来进行的，所述比较是通过区段或通过“比较窗口”进行的，以便鉴定和比较序列相似性的局部区域。除手工产生之外，用于比较的序列的最佳比对还可通过以下产生：通过Smith and Waterman，1981，Ads App.Math.2，482的局部同源性算法的手段，通过Needleman and Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48，443的局部同源性算法的手段，通过Pearson and Lipman，1988，Proc.Natl Acad.Sci.USA 85，2444的相似性搜索法的手段，或使用这些算法的计算机程序(在Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wis.)的手段。
百分比同一性通过以下来计算：确定待比较的两个序列之间相同的位置的数目，将该数目除以所比较的位置的数目，并将获得的结果乘以100，以便获得这两个序列之间的百分比同一性。
关于核酸分子，术语“变体”包括简并核酸序列，其中根据本发明的简并核酸是由于遗传密码的简并性而在密码子序列上不同于参考核酸的核酸。
此外，根据本发明的给定核酸序列的“变体”包含含有单个或多个例如至少2个、至少4个或至少6个，并且优选多至3个、多至4个、多至5个、多至6个、多至10个、多至15个或多至20个核苷酸替换、缺失和/或添加的核酸序列。
优选地，给定核酸序列与作为所述给定核酸序列的变体的核酸序列之间的同一性程度为至少70％，优选至少75％，优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％或最优选至少95％、96％、97％、98％或99％。优选给出至少约30、至少约50、至少约70、至少约90、至少约100、至少约150、至少约200、至少约250、至少约300或至少约400个核苷酸的区域的同一性程度。在一些优选实施方案中，同一性的程度针对参考核酸序列的全长给出。
两个核酸序列之间的“序列同一性”表示序列之间相同的核苷酸的百分比。
术语“百分比同一性”旨在表示待比较的两个序列之间在最佳比对之后获得的相同的核苷酸的百分比，该百分比是纯统计学的，并且两个序列之间的差异是随机分布的并且在其全长上。两个核苷酸序列之间的序列比较常规上是通过在最佳地对其比对之后对这些序列进行比较来进行的，所述比较是通过区段或通过“比较窗口”进行的，以便鉴定和比较序列相似性的局部区域。除手工产生之外，用于比较的序列的最佳比对还可通过以下产生：通过Smith and Waterman，1981，Ads App.Math.2，482的局部同源性算法的手段，通过Needleman and Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48，443的局部同源性算法的手段，通过Pearsonand Lipman，1988，Proc.Natl Acad.Sci.USA 85，2444的相似性搜索法的手段，或使用这些算法的计算机程序(在Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wis.)的手段。
百分比同一性通过以下来计算：确定待比较的两个序列之间相同的位置的数目，将该数目除以所比较的位置的数目，并将获得的结果乘以100，以便获得这两个序列之间的百分比同一性。
术语“部分”、“片段”和“一部分”在本文中可互换使用，并且是指结构的连续或不连续级分。关于特定结构，例如氨基酸序列或者蛋白质或核酸序列，术语其“部分”、“片段”和“一部分”可指定为所述结构的连续或不连续级分。优选地，结构例如氨基酸序列或核酸序列的“部分”、“片段”和“一部分”优选包含以下、优选由以下组成：完整结构或氨基酸序列或核酸序列的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％。结构的一部分、部分或片段优选包含所述结构的一种或更多种功能特性。例如，表位、肽或蛋白质的一部分、部分或片段优选地与其所来源的表位、肽或蛋白质在免疫学上等同。如果该一部分、部件或片段是不连续级分，则所述不连续级分优选由结构的2、3、4、5、6、7、8或更多个部分构成，各部分是该结构的连续元件。例如，氨基酸序列的不连续级分可由所述氨基酸序列的2、3、4、5、6、7、8或更多，优选不超过4个部分构成，其中各部分优选包含氨基酸序列的至少5个连续氨基酸、至少10个连续氨基酸、优选至少20个连续氨基酸、优选至少30个连续氨基酸。
以下通过附图和实施例详细描述了本发明，这些附图和实施例仅用于举例说明目的并且不解释为对本发明范围的限制。由于描述和实施例，本领域技术人员可获得同样包括在本发明中的另一些实施方案。
序列
在本公开内容中，参考了以下序列和SEQ ID NO：
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实施例
本文中使用的技术和方法在本文中描述，或者以本身已知的方式进行，如例如Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版(1989)Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y中所述。除非特别地指出，否则所有方法包括试剂盒和试剂的使用都是根据制造商的信息进行的。
实施例1：抗人PD-1抗体的产生
用经重组人His标记的PD-1蛋白(R&D Systems，目录号8986-PD)免疫接种三只新西兰白兔。如实施例2至4中所述，通过人PD-1酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)、细胞的人PD-1结合测定并通过人PD-1/PD-L1阻断生物测定来分选来自血液的单个B细胞并针对PD-1特异性抗体的产生筛选上清液。从筛选的阳性B细胞中提取RNA并进行测序。重链和轻链的可变区是基因合成，并且是包含突变L234A和L235A(LALA)的人免疫球蛋白恒定部分(IgG1/κ)的N端克隆的，以使与pCEP4表达载体(ThermoFisher，目录号V04450)中Fcg受体的相互作用最小。嵌合PD-1抗体的可变区序列在下表中示出。表1示出了重链的可变区，而表2示出了轻链的可变区。在这两种情况下，限定了根据Kabat编号的框架区(framing region，FR)以及互补决定区(CDR)。带有下划线的氨基酸表示根据IMGT编号的CDR。粗体字母表示Kabat和IMGT编号的相交部分。
表1：
表2：
使用293-free转染试剂(Novagen/Merck)的HEK293-FreeStyle细胞瞬时转染由Tecan Freedom Evo装置进行。使用带有板自动进样器的Dionex Ultimate 3000 HPLC上的亲和色谱从细胞上清液中纯化嵌合抗体。使用蛋白A亲和色谱从细胞培养上清液中纯化所产生的嵌合抗体。将抗体用pH 2.5的100mM甘氨酸洗脱，并用pH 9的1M Tris中和，以实现最终pH为6至7。纯化的抗体用于进一步分析，特别是通过如实施例2至5中所述的人PD-1ELISA、细胞的人PD-1结合测定、人PD-1/PD-L1阻断生物测定和T细胞增殖测定进行的再测试。两种嵌合兔抗体MAB-19-0202和MAB-19-0233被鉴定为表现最好的克隆，并随后被人源化。人源化抗体序列由Fusion Antibodies(Belfast，Ireland)产生。重组人源化序列的人源化轻链和重链相对于抗体ID的分配在表3中列出。人源化轻链和重链的可变区序列在表4和5中示出。表4示出了重链的可变区，而表5示出了轻链的可变区。在这两种情况下，限定了根据Kabat编号的框架区(FR)以及互补决定区(CDR)。带有下划线的氨基酸表示根据IMGT编号的CDR。
表3：
表4：
表5：
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如上所述克隆并产生重组人源化hIgG1-LALA抗体，并同样通过如实施例2至5中所述的人PD-1 ELISA、细胞的人PD-1结合测定、PD-1/PD-L1阻断生物测定和T细胞增殖测定进行分析。
实施例2：人PD-1 ELISA
通过ELISA测定了嵌合和人源化抗PD-1抗体与重组人PD-1胞外结构域的结合效力。在室温下，将重组人PD-1人FC嵌合体(R&D Systems)以PBS(Vendor)中0.625μg/mL的浓度包被在384孔MaxiSorpTM平底板(Nunc)上，持续60分钟。将经包被的板用PBS(0.1％吐温)(PBS-T)洗涤三次，通过与PBS(2％BSA、0.05％吐温)在室温下孵育60分钟来封闭，并用PBS-T另外洗涤三次。在PBS(0.5％BSA、0.05％吐温)(ELISA缓冲液)中添加浓度为1,000至0.06ng/mL或2,500至0.15ng/mL的抗PD-1抗体，并将板在室温下孵育60分钟。作为参照抗体，使用了抗hPD-1-Ni-hIgG4(InvivoGen；目录号hpd1ni-mab114；具有纳武单抗(Nivolumab)的可变区)和抗hPD1-Pem-hIgG4(InvivoGen；目录号hpd1pe-mab14；具有派姆单抗(Pembrolizumab)的可变区)。在用PBS-T洗涤3次之后，将辣根过氧化物酶偶联的山羊抗人IgG(Fab’)2片段(AbD Serotec；目录号STAR126P)以1∶5,000的稀释度添加在ELISA缓冲液中。将板在室温下孵育60分钟，并用PBS-T洗涤6次，然后添加TMB溶液(Thermo FisherScientific)。在10分钟之后，添加HCl，并使用Tecan Infnite M1000读数器记录450和620nm波长下的吸光度。用4参数逻辑模型拟合数据，并使用GraphPad Prism 8.4.3(GraphPad Software，San Diego，CA，USA)计算EC50值。
将嵌合抗PD-1抗体MAB-19-0202、MAB-19-0208、MAB-19-0217、MAB-19-0223和MAB-19-0233与人PD-1的结合曲线与参照抗体抗hPD-1-Ni-hIgG4和抗hPD1-Pem-hIgG4进行比较，如图1中所示。对EC50值的分析揭示了抗体MAB-19-0202、MAB-19-0208、MAB-19-0223和MAB-19-0233的较低EC50值(表6)。在嵌合抗体MAB-19-0202和MAB-19-0233人源化之后，用人源化变体和亲本嵌合抗体重复该测定(图5和6)。两种嵌合和人源化抗hPD-1抗体的EC50值全部低于两种参照抗体的EC50值(表7)。
实施例3：HEK-293-hPD-1细胞结合
使用异位表达全长人-PD1的HEK-293细胞(BPS Biosciences目录号60680)分析嵌合和人源化抗PD-1抗体与细胞表面表达的hPD-1的结合。细胞培养物在含有10％FCS、1×MEM NEAA、1mM丙酮酸钠和100μg/mL潮霉素B的MEM中生长。当平板接种细胞用于测试抗体结合时，省略潮霉素B。在具有透明底的黑色384孔细胞培养基处理板中每孔接种20μL培养基中的1,000个细胞，并将其在37℃和5％CO2下孵育2小时。在5μL培养基中添加抗PD-1抗体至最终浓度为1,000至0.06ng/mL或620至0.45ng/mL。作为参照抗体，使用了抗hPD-1-Ni-hIgG4和抗hPD1-Pem-hIgG4。在37℃和5％CO2下孵育18小时之后，将板用25μL PBS(0.05％吐温20)(细胞洗涤缓冲液)洗涤一次，并添加20μL培养基中的浓度为0.8μg/mL的Alexa-Fluor-488-缀合的AffiniPure山羊抗人IgG F(ab’)2片段(Vendor)。将板在37℃和5％CO2下在黑暗中孵育4小时，用25μL细胞洗涤缓冲液洗涤一次，并用含有5μg/ml Hoechst(Invitrogen)的20μL培养基孵育10分钟。使用CellInsight CX5高内涵成像装置(ThermoFisher)记录细胞相关免疫荧光信号。用4参数逻辑模型拟合数据，并使用GraphPad Prism8.4.3计算EC50值。
将嵌合抗PD-1抗体MAB-19-0202、MAB-19-0208、MAB-19-0217、MAB-19-0223和MAB-19-0233与人PD-1的细胞结合的结合曲线与参照抗体抗hPD-1-Ni-hIgG4和抗hPD1-Pem-hIgG4进行比较，如图2中所示。对EC50值的分析揭示了抗体MAB-19-0217和MAB-19-0223的较低EC50值(表6)。由于不完全拟合，无法计算MAB-19-0202的EC50值(n.a.不适用)。在嵌合抗体MAB-19-0202和MAB-19-0233人源化之后，用人源化变体和亲本嵌合抗体重复该测定(图7和8)。在该实验中，两种嵌合和人源化抗hPD-1抗体(除了MAB-19-0594之外)的EC50值全部低于两种参照抗体(表7)。
实施例4：人PD-1/PD-L1阻断生物测定
使用PD-1/PD-L1阻断生物测定(Promega；目录号#J1250)根据制造商的说明分析了嵌合和人源化抗PD-1抗体阻断PD-1/PD-L1相互作用的效力。简言之，将500μL表达PD-L1的人工APC aAPC/CHO-K1细胞悬液添加至14.5mL细胞回收培养基(90％Ham’s F-12(Promega；目录号J123A)+10％胎牛血清(Promega；目录号J121A))，并在平底384孔分析板的每个孔中接种25μL细胞悬液。在37℃和5％CO2下孵育过夜之后，除去培养基，并将抗体以40,000至18ng/mL或20,000至9ng/mL的浓度添加在10μL HAM’s F-12(1％FBS)中。作为参照抗体，使用了抗hPD-1-Ni-hIgG4和抗hPD1-Pem-hIgG4。将表达PD-1的效应细胞(Promega；目录号J115A)解冻并重悬在HAM’s F-12(1％FBS)中。将10μL效应细胞悬液添加至各孔，并将板在37℃和5％CO2下孵育6小时。将板平衡至室温10分钟，并将20μL Bio-Glo萤光素酶测定试剂添加至各孔。在室温下孵育15分钟之后，使用Tecan Infinite M1000读数器测量发光。用4参数逻辑模型拟合数据，并使用GraphPad Prism 8.4.3计算EC50值。
将嵌合抗PD-1抗体MAB-19-0202、MAB-19-0208、MAB-19-0217、MAB-19-0223和MAB-19-0233的PD-1：PD-L1阻断活性与参照抗体抗hPD-1-Ni-hIgG4和抗hPD1-Pem-hIgG4进行比较，如图3中所示。这也反映在IC50值中(表6)。MAB-19-0202和MAB-19-0233的表现明显比两种参照抗体好，导致与两种参照抗体相比更低的IC50值。
在嵌合抗体MAB-19-0202和MAB-19-0233人源化之后，用人源化变体和亲本嵌合抗体重复该测定(图9和10)。MAB-19-0202以及衍生的人源化抗体再次优于两种参照抗体(图9和表2)。MAB-19-0233和衍生的人源化抗体的表现与参照抗体相当(图10和表7)。
实施例5：具有活性PD-1/PD-L1轴的抗原特异性CD8+T细胞增殖测定以在基于原代 细胞的设置中测量抗人PD-1抗体的功能活性
为了在具有活性PD-1/PD-L1轴的抗原特异性测定中测量嵌合和人源化抗PD1抗体对T细胞增殖的诱导，用密蛋白-6体外转录RNA(IVT-RNA)转染树突细胞(DC)以表达密蛋白-6抗原。用PD-1IVT-RNA和密蛋白-6特异性HLA-A2限制性T细胞受体(TCR)转染T细胞。该TCR可识别DC上HLA-A2中存在的密蛋白-6来源的表位。抗PD1抗体可阻断在单核细胞来源的DC上内源性表达的PD-L1与T细胞上的PD-1之间的抑制性PD-1/PD-L1相互作用，导致T细胞增殖增强。
HLA-A2+外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)从健康供体(Transfusionszentrale，University Hospital，Mainz，Germany)获得。通过磁激活细胞分选(magnetic-activated cell sorting，MACS)技术使用抗CD14微珠(Miltenyi；目录号130-050-201)根据制造商的说明从PBMC中分离单核细胞。将外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte)(PBL，CD14阴性级分)冷冻以用于未来的T细胞分离。为了分化成未成熟的DC(immature DC，iDC)，将1×106个单核细胞/ml在RPMI GlutaMAX(Lifetechnologies GmbH，目录号61870-044)中培养五天，所述RPMI GlutaMAX包含5％人AB血清(Sigma-Aldrich Chemie GmbH，目录号H4522-100ML)、丙酮酸钠(Life technologiesGmbH，目录号11360-039)、非必需氨基酸(Life technologies GmbH，目录号11140-035)、100IU/mL青霉素-链霉素(Life technologies GmbH，目录号15140-122)、1,000IU/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF；Miltenyi，目录号130-093-868)和1,000IU/mL的白介素-4(IL-4；Miltenyi，目录号130-093-924)。在这五天期间，用新鲜培养基替换了一半培养基一次。通过收集非贴壁细胞来收获iDC，并通过用含有2mM EDTA的PBS在37℃下孵育10分钟来分离贴壁细胞。在洗涤之后，将iDC在含有10％v/v DMSO(AppliChem GmbH，目录号A3672，0050)+50％v/v人AB血清的RPMI GlutaMAX中冷冻，用于未来的抗原特异性T细胞测定。
在抗原特异性CD8+T细胞增殖测定开始之前一天，将来自同一供体的冷冻PBL和iDC解冻。通过MACS技术使用抗CD8微珠(Miltenyi，目录号130-045-201)根据制造商的说明从PBL中分离CD8+T细胞。使用830电穿孔系统装置(BTX；500V，1×3毫秒脉冲)在4-mm电穿孔比色皿(VWR International GmbH，目录号732-0023)中在250μL X-vivo15(Biozym Scientific GmbH，目录号881026)中将约10×106个至15×106个CD8+T细胞用10μg编码密蛋白-6特异性鼠TCR(HLA-A2限制性；在WO 2015/150327 A1中描述)α链的体外翻译(IVT)-RNA加10μg编码密蛋白-6特异性鼠TCR的β链的IVT-RNA加10μg编码PD-1的IVT-RNA进行电穿孔。在电穿孔之后，立即将细胞转移到补充有5％人AB血清的新鲜IMDM培养基(LifeTechnologies GmbH，目录号12440-061)中，并在37℃、5％CO2下静置至少1小时。使用在PBS中的1.6μM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(carboxyfluorescein succinimidyl ester)(CFSE；Invitrogen，目录号C34564)根据制造商的说明来标记T细胞，并在补充有5％人AB血清的IMDM培养基中孵育，O/N。
使用如上所述的电穿孔系统(300V，1×12毫秒脉冲)在250μL X-Vivo15培养基中将多至5×106个经解冻iDC用3μg编码全长密蛋白-6的IVT-RNA进行电穿孔，并将其在补充有5％人AB血清的IMDM培养基中孵育，O/N。
第二天，收获细胞。通过流式细胞术检查DC上密蛋白-6和PD-L1的细胞表面表达以及T细胞上TCR和PD-1的细胞表面表达。用Alexa647缀合的CLDN6特异性抗体(非可商购；内部生产)并用抗人CD274抗体(PD-L1，eBioscienes，目录号12-5983)对DC进行染色，以及用抗小鼠TCRβ链抗体(Becton Dickinson GmbH，目录号553174)并用抗人CD279抗体(PD-1，eBioscienes，目录号17-2799)对T细胞进行染色。将5,000个经电穿孔的DC与50,000个经电穿孔经CFSE标记的T细胞一起在96孔圆底板中在补充有5％人AB血清的IMDM GlutaMAX中在存在嵌合和人源化抗hPD-1抗体和参照抗体派姆单抗(MSD；PZN 10749897，购自PhoenixApotheke Mainz)的情况下进行孵育。在5天之后通过流式细胞术测量T细胞增殖。数据在FACSCantoTM或FACSCelestaTM流式细胞仪(BD Biosciences)上获得。使用FlowJoTM软件V10.3分析数据。使用来自FlowJo的增殖建模工具进行基于CFSE稀释的增殖分析，自动拟合生成峰并计算扩增指数值。用4参数逻辑模型拟合数据，并使用GraphPad Prism 8.4.3计算EC50值。
通过该T细胞增殖测定，在0.2ng/mL至0.6μg/mL的浓度范围内测试了来源于MAB-19-0202的所有嵌合抗体和人源化抗hPD-1抗体。它们所有都能够阻断抑制性PD-1/PD-L1轴，并诱导CD8+T细胞的强烈增殖。这由扩增指数的提高来反映。如图4和图11中所示，拟合的剂量-响应曲线揭示了由所有测试的针对派姆单抗的嵌合和人源化抗体诱导的增殖的提高相当。
表
表6：针对嵌合抗体，通过ELISA(图1)和通过HEK-293-hPD-1细胞结合测定(图2)测量的hPD-1结合的EC50值，以及通过报道物测定(图3)测量的PD-1：PDL-1阻断的IC50值。N.a.不适用：EC50值不可计算。
表7：针对人源化抗体和亲本嵌合抗体，通过ELISA(图5和6)和通过HEK-293-hPD-1细胞结合测定(图7和8)测量的hPD-1结合的EC50值，以及通过报道物测定(图9和10)测量的PD-1：PDL-1阻断的IC50值。N.a.不适用：EC50值不可计算。
实施例6：通过体外转录产生抗人PD-1 RiboMab
为了通过体外转录的信使RNA(in vitro transcribed messenger RNA，IVT-mRNA)产生抗PD-1 RiboMab，我们使用标准克隆技术将MAB-19-0202-LC(SEQ ID NO：79)、MAB-19-0233-LC(SEQ ID NO：83)、MAB-19-0202-HC(SEQ ID NO：74)和MAB-19-0233-HC(SEQID NO：78)的DNA序列(具有突变L234A、L235A和P329G的人免疫球蛋白恒定部分(IgG1κ)的N端)插入到IVT-mRNA模板载体pST4-hAg-MCS-FI-A30LA70(BioNTech SE)中。该载体包含如别处所述的人α珠蛋白(hAg)5’非翻译区(UTR)前导序列和如专利申请PCT/EP2016/073814中描述的3’FI元件。poly(A)尾由30个腺嘌呤核苷酸、接头(L)和另外70个腺嘌呤核苷酸组成(A30LA70，PCT/EP2015/065357)。克隆以下构建体用于形成抗PD-1 RiboMab：
RiboMab-19-0202：
重链：pST4-hAg-husec(opt)-抗-PD1-0202-HC-hIgG1-LALA-PG-FI-A30LA70，具有如下所示且如序列表中SEQ ID NO：93所示的核酸序列：
在序列表中SEQ ID NO：93所示的序列中，包含以下元件：
5’-UTR(“hAg”)，其具有如下所示且如序列表中SEQ ID NO：94所示的核酸序列。
“Kozac序列”，其具有如下所示且如序列表中SEQ ID NO：95所示的核酸序列。
GCCACC(SEQ ID NO：95)
分泌信号肽序列(“husec(opt)”)，其具有如下所示且如序列表中SEQ ID NO：96所示的核酸序列。
重链可变结构域(“抗PD1-0202-HC”)，其具有如序列表中SEQ ID NO：74所示的核酸序列。
恒定结构域CH1，其具有如下所示且如序列表中SEQ ID NO：97所示的核酸序列。
铰链区，其具有如下所示且如序列表中SEQ ID NO：98所示的核酸序列。
恒定结构域CH2，其具有如下所示且如序列表中SEQ ID NO：99所示的核酸序列。
恒定结构域CH3，其具有如下所示且如序列表中SEQ ID NO：100所示的核酸序列。
“F元件”，其具有如下所示且如序列表中SEQ ID NO：101所示的核酸序列。
“I-元件”，其具有如下所示且如序列表中SEQ ID NO：102所示的核酸序列。
poly(A)尾(“A30LA70”)，其具有如下所示且如序列表中SEQ ID NO：103所示的核酸序列。
轻链：pST4-hAg-husec(opt)-抗-PD1-0202-LC-hIgG1-FI-A30LA70，其具有如下所示且如序列表中SEQ ID NO：104所示的核酸序列：
在该序列中，元件如下：5’-UTR，其包含“Kozac序列”，如序列表中SEQ ID NO：94和95所示；分泌信号肽序列(“husec(opt)”)，如序列表中SEQ ID NO：96所示；轻链可变结构域(“抗PD1-0202-LC”)，其具有如序列表中SEQ ID NO：79所示的核酸序列；恒定结构域(CLκ)，其具有如下所示且如序列表中SEQ ID NO：105所示的核酸序列；“F元件”，如序列表中SEQID NO：101所示；“I元件”，如序列表中SEQ ID NO：102所示；以及poly(A)尾(“A30LA70”)，如序列表中SEQ ID NO：103所示。
RiboMab-19-0233：
重链：pST4-hAg-husec(opt)-抗-PD1-0233-HC-hIgG1-LALA-PG-FI-A30LA70，其具有如下所示且如序列表中SEQ ID NO：106所示的核酸序列：
轻链：pST4-hAg-husec(opt)-抗-PD1-0233-HC-hIgG1-LALA-PG-FI-A30LA70，其具有如下所示且如序列表中SEQ ID NO：107所示的核酸序列：
/>
为了产生用于体外转录的模板，使用II类限制性内切核酸酶在poly(A)尾编码区的下游将质粒DNA线性化，从而产生模板以转录mRNA而没有另外的核苷酸经过(past)poly(A)尾(Holtkamp et al.(2006)Blood 108(13)，4009-4017)。纯化线性化的模板DNA，并使用T7 RNA聚合酶对其进行体外转录，基本上如前所述(Grudzien-Nogalska et al.(2013)Methods Mol Biol.969：55-72)。为了使免疫原性最小化，并入了N1-甲基假尿苷-5’-三磷酸(TriLink Biotechnologies)、m1ψTP，而不是UTP(Kariko et al.(2008)Mol.Ther.16(11)，1833-1840)，并通过纤维素纯化去除双链RNA(et al.(2019)Nucleicacids 15，26-35)。将RNA用帽1结构CleanCap413进行加帽，随后使用磁性颗粒纯化。将纯化的mRNA在H2O中洗脱并储存在-80℃下直至进一步使用。
实施例7：抗人PD-1 RiboMab的表达和PD-1结合
通过将mRNA脂质体转染到HEK293T/17细胞中来体外表达所产生的编码RiboMab的mRNA，并通过流式细胞术来确定含有RiboMab的上清液与表达人PD-1的K562细胞的结合(图12)。
对于RiboMab-19-0202的表达，表达了编码Mab-19-0202轻链和Mab-19-0202重链(参见SEQ ID NO：93和104)的mRNA，而对于RiboMab-19-0233的表达，表达了编码Mab-19-0233轻链和Mab-19-0233重链(参见SEQ ID NO：106和107)的mRNA。
在脂质体转染之前一天，将1.2×106个HEK293T/17细胞接种在6孔板中3mL DMEM(Life Technologies GmbH，目录号31966-021)+10％胎牛血清(FBS，Sigma，目录号F7524)中。对于脂质体转染，在无菌和无RNA酶的条件下使用400ng mRNA/μL LipofectamineMessengerMax(Thermo Fisher Scientific，目录号LMRNA015)以重链编码mRNA与轻链编码mRNA的2∶1质量比来配制3μg mRNA，并将其以每10cm2培养皿施加至约80％汇合的HEK293T/17细胞。在表达20小时之后，在无菌条件下收集上清液，并将其储存在-20℃下直至进一步使用。
将对数期生长的20×106个细胞K562细胞用于全长人PD-1的电穿孔。将250μL X-Vivo 15培养基(LONZA Technologies，目录号BE02-060F)中的细胞与10μg编码人PD-1的IVT-mRNA在4mm间隙(gap)比色皿中组合。立即将细胞用具有以下设置的BTX ECM830(BTXHarvard Apparatus)进行电穿孔：200V、3脉冲、8毫秒。随后将经电穿孔的细胞以0.5×106/mL的密度在T175瓶(Greiner Bio-One，目录号660175)中接种在RPMI(LifeTechnologies GmbH，目录号61870-010)+10％FBS中，并在37℃、5％CO2下孵育过夜。第二天，通过流式细胞术使用APC缀合的CD279(PD-1)单克隆抗体(eBioJ105，ThermoFisherScientific，目录号17-2799-42)验证PD-1表达。
通过流式细胞术分析RiboMab与表达PD-1的K562细胞的结合。将7.5×104个细胞/孔在聚苯乙烯96孔圆底板(Greiner bio-one，目录号650180)中与含RiboMab的上清液在100μL PBS/0.1％BSA/0.02％叠氮化物(FACS缓冲液)中的系列稀释液(4倍稀释步骤中范围为0.006至100％)一起在4℃下孵育1小时。在FACS缓冲液中洗涤两次之后，将细胞在50μLAlexa Fluor 488(AF488)-缀合的山羊抗人IgG F(ab’)2(在FACS缓冲液中为1∶500；Jackson ImmunoResearch Laboratories，目录号109-546-098)中在4℃下孵育30分钟。将细胞用FACS缓冲液洗涤两次，重悬在60μL FACS缓冲液中，并在BD FACSCantoTM II流式细胞仪(BD Biosciences)上进行分析。使用GraphPad Prism V9.1.0软件通过非线性回归分析结合曲线(log(激动剂)vs.响应-可变斜率(四个参数))。
图12示出了RiboMab-19-0202和RiboMab-19-0233与用全长人PD-1转染的K562细胞的剂量依赖性结合。结合曲线是高度相当的，其中EC50值的差异仅约2.5倍(RiboMab-19-0202的上清液为3.9％，以及RiboMab-19-0233的上清液为9.9％)，表明编码RiboMab的mRNA被翻译成相当量的PD-1结合抗体。

Claims (103)

1.抗体，其具有与PD-1结合之能力，其中所述抗体包含含有互补决定区3(HCDR3)的重链可变区(VH)，所述互补决定区3(HCDR3)具有或包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5中任一者中所示的序列。
2.权利要求1所述的抗体，其中所述HCDR3具有或包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10中任一者中所示的序列。
3.权利要求1或2所述的抗体，其中所述重链可变区(VH)包含互补决定区2(HCDR2)，所述互补决定区2(HCDR2)具有或包含SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：14或SEQ ID NO：15中任一者中所示的序列。
4.权利要求3所述的抗体，其中所述HCDR2具有或包含SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20中任一者中所示的序列。
5.权利要求1至4中任一项所述的抗体，其中所述重链可变区(VH)包含互补决定区1(HCDR1)，所述互补决定区1(HCDR1)具有或包含选自SYN、RYY、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22中所示的序列。
6.权利要求5所述的抗体，其中所述HCDR1具有或包含SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：27中任一者中所示的序列。
7.权利要求5所述的抗体，其中所述HCDR1具有或包含SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：32中任一者中所示的序列。
8.权利要求1至7中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)，其中：
(i)所述HCDR1序列选自具有或包含SYN、SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：28的序列，所述HCDR2序列选自具有或包含SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：16的序列，并且所述HCDR3序列选自具有或包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：6的序列；
(ii)所述HCDR1序列选自具有或包含RYY、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：29的序列，所述HCDR2序列选自具有或包含SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：17的序列，并且所述HCDR3序列选自具有或包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：7的序列；
(iii)所述HCDR1序列选自具有或包含RYY、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：30的序列，所述HCDR2序列选自具有或包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：18的序列，并且所述HCDR3序列选自具有或包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：8的序列；
(iv)所述HCDR1序列选自具有或包含SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：31的序列，所述HCDR2序列选自具有或包含SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：19的序列，并且所述HCDR3序列选自具有或包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：9的序列；
(v)所述HCDR1序列选自具有或包含SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：32的序列，所述HCDR2序列选自具有或包含SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：20的序列，并且所述HCDR3序列选自具有或包含SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：10的序列。
9.权利要求1至8中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)，其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3序列：
(i)分别是或包含SYN、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：1；
(ii)分别是或包含RYY、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：2；
(iii)分别是或包含RYY、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：3；
(iv)分别是或包含SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：4；或者
(v)分别是或包含SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：5。
10.权利要求1至8中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)，其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3序列：
(i)分别是或包含SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：1；
(ii)分别是或包含SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：2；
(iii)分别是或包含SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：3；
(iv)分别是或包含SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：4；或者
(v)分别是或包含SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：5。
11.权利要求1至8中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)，其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3序列：
(i)分别是或包含SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：6；
(ii)分别是或包含SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：7；
(iii)分别是或包含SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：8；
(iv)分别是或包含SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：9；或者
(v)分别是或包含SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：10。
12.抗体，其具有与PD-1结合之能力，其中所述抗体包含含有互补决定区3(LCDR3)的轻链可变区(VL)，所述互补决定区3(LCDR3)具有或包含SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ IDNO：35、SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：37中任一者中所示的序列。
13.权利要求12所述的抗体，其中所述轻链可变区(VL)包含互补决定区2(LCDR2)，所述互补决定区2(LCDR2)具有或包含选自QAS或DAS的序列。
14.权利要求12所述的抗体，其中所述轻链可变区(VL)包含互补决定区2(LCDR2)，所述互补决定区2(LCDR2)具有或包含SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40或SEQ IDNO：41中任一者中所示的序列。
15.权利要求12至14中任一项所述的抗体，其中所述轻链可变区(VL)包含互补决定区1(LCDR1)，所述互补决定区1(LCDR1)具有或包含SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：46中任一者中所示的序列。
16.权利要求12至14中任一项所述的抗体，其中所述轻链可变区(VL)包含互补决定区1(LCDR1)，所述互补决定区1(LCDR1)具有或包含SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：51中任一者中所示的序列。
17.权利要求12至16中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中：
(i)所述LCDR1序列选自具有或包含SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：47的序列，所述LCDR2序列选自具有或包含QAS或SEQ ID NO：38的序列，并且所述LCDR3序列是具有或包含SEQ IDNO：33的序列；
(ii)所述LCDR1序列选自具有或包含SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：48的序列，所述LCDR2序列选自具有或包含DAS或SEQ ID NO：39的序列，并且所述LCDR3序列是具有或包含SEQ IDNO：34的序列；
(iii)所述LCDR1序列选自具有或包含SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：49的序列，所述LCDR2序列选自具有或包含DAS或SEQ ID NO：39的序列，并且所述LCDR3序列是具有或包含SEQ ID NO：35的序列；
(iv)所述LCDR1序列选自具有或包含SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：50的序列，所述LCDR2序列选自具有或包含DAS或SEQ ID NO：40的序列，并且所述LCDR3序列是具有或包含SEQ IDNO：36的序列；
(v)所述LCDR1序列选自具有或包含SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：51的序列，所述LCDR2序列选自具有或包含DAS或SEQ ID NO：41的序列，并且所述LCDR3序列是具有或包含SEQ IDNO：37的序列。
18.权利要求12至17中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中所述LCDR1、LCDR2和LCDR3序列：
(i)分别是或包含SEQ ID NO：42、QAS和SEQ ID NO：33；
(ii)分别是或包含SEQ ID NO：43、DAS和SEQ ID NO：34；
(iii)分别是或包含SEQ ID NO：44、DAS和SEQ ID NO：35；
(iv)分别是或包含SEQ ID NO：45、DAS和SEQ ID NO：36；或者(v)分别是或包含SEQ IDNO：46、DAS和SEQ ID NO：37。
19.权利要求12至17中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中所述LCDR1、LCDR2和LCDR3序列：
(i)分别是或包含SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：33；
(ii)分别是或包含SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：34；
(iii)分别是或包含SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：35；
(iv)分别是或包含SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：36；或者
(v)分别是或包含SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：37。
20.抗体，其具有与PD-1结合之能力，其中所述抗体包含权利要求1至11中任一项所述的重链可变区(VH)和/或权利要求12至19中任一项所述的轻链可变区(VL)。
21.权利要求1至20中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)以及含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别包含或具有SYN、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：1中所示的序列，并且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：42、QAS和SEQ ID NO：33中所示的序列。
22.权利要求1至20中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)以及含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：1中所示的序列，并且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：47、SEQ IDNO：38和SEQ ID NO：33中所示的序列。
23.权利要求1至20中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)以及含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：6中所示的序列，并且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：42、QAS和SEQID NO：33中所示的序列。
24.权利要求1至20中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)以及含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别包含或具有RYY、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：2中所示的序列，并且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：43、DAS和SEQ ID NO：34中所示的序列。
25.权利要求1至20中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)以及含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：2中所示的序列，并且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：48、SEQ IDNO：39和SEQ ID NO：34中所示的序列。
26.权利要求1至20中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)以及含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：7中所示的序列，并且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：43、DAS和SEQID NO：34中所示的序列。
27.权利要求1至20中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)以及含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别包含或具有RYY、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：3中所示的序列，并且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：44、DAS和SEQ ID NO：35中所示的序列。
28.权利要求1至20中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)以及含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：3中所示的序列，并且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：49、SEQ IDNO：39和SEQ ID NO：35中所示的序列。
29.权利要求1至20中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)以及含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：8中所示的序列，并且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：44、DAS和SEQID NO：35中所示的序列。
30.权利要求1至20中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)以及含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：4中所示的序列，并且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：45、DAS和SEQID NO：36中所示的序列。
31.权利要求1至20中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)以及含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：4中所示的序列，并且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：50、SEQ IDNO：40和SEQ ID NO：36中所示的序列。
32.权利要求1至20中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)以及含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：9中所示的序列，并且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：45、DAS和SEQID NO：36中所示的序列。
33.权利要求1至20中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)以及含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：5中所示的序列，并且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：46、DAS和SEQID NO：37中所示的序列。
34.权利要求1至20中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)以及含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：5中所示的序列，并且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：51、SEQ IDNO：41和SEQ ID NO：37中所示的序列。
35.权利要求1至20中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)以及含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：10中所示的序列，并且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别包含或具有SEQ ID NO：46、DAS和SEQID NO：37中所示的序列。
36.权利要求1至35中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含与SEQ ID NO：52至SEQ ID NO：56中任一者中所示VH序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
37.权利要求1至36中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含重链可变区(VH)，其中所述VH包含SEQ ID NO：52至SEQ ID NO：56中任一者中所示的序列。
38.权利要求12至37中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含与SEQ ID NO：57至SEQ ID NO：61中任一者中所示VL序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
39.权利要求12至38中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含轻链可变区(VL)，其中所述VL包含SEQ ID NO：57至SEQ ID NO：61中任一者中所示的序列。
40.权利要求1至39中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含或具有SEQ ID NO：52中所示的序列并且所述VL包含或具有SEQID NO：57中所示的序列。
41.权利要求1至39中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含或具有SEQ ID NO：53中所示的序列并且所述VL包含或具有SEQID NO：58中所示的序列。
42.权利要求1至39中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含或具有SEQ ID NO：54中所示的序列并且所述VL包含或具有SEQID NO：59中所示的序列。
43.权利要求1至39中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含或具有SEQ ID NO：55中所示的序列并且所述VL包含或具有SEQID NO：60中所示的序列。
44.权利要求1至39中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含或具有SEQ ID NO：56中所示的序列并且所述VL包含或具有SEQID NO：61中所示的序列。
45.权利要求1至35中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含与SEQ ID NO：62至SEQ ID NO：64中任一者中所示VH序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
46.权利要求45所述的抗体，其中所述抗体包含重链可变区(VH)，其中所述VH包含SEQID NO：62至SEQ ID NO：64中任一者中所示的序列。
47.权利要求12至35中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含与SEQ ID NO：65至SEQ ID NO：70中任一者中所示VL序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
48.权利要求47所述的抗体，其中所述抗体包含轻链可变区(VL)，其中所述VL包含SEQID NO：65至SEQ ID NO：70中任一者中所示的序列。
49.权利要求1至35中任一项或权利要求45至48中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含或具有SEQ ID NO：62中所示的序列，并且所述VL包含或具有SEQ ID NO：65或SEQ ID NO：66或SEQ ID NO：67或SEQ ID NO：68中所示的序列。
50.权利要求1至35中任一项或权利要求45至48中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含或具有SEQ ID NO：63中所示的序列，并且所述VL包含或具有SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：70中所示的序列，或者其中所述VH包含或具有SEQ ID NO：64中所示的序列，并且所述VL包含或具有SEQ ID NO：70中所示的序列。
51.权利要求1至50中任一项所述的抗体，其中所述抗体选自IgG1、IgG2，优选IgG2a和IgG2b、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、分泌型IgA、IgD和IgE抗体。
52.权利要求1至51中任一项所述的抗体，其是单克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体、或者这样的抗体的片段。
53.权利要求1至52中任一项所述的抗体，其中所述抗体是Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段或单链(scFv)抗体。
54.权利要求1至53中任一项所述的抗体，其中PD-1是人PD-1。
55.权利要求54所述的抗体，其中所述PD-1具有或包含SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：72中所示的氨基酸序列，或者PD-1具有与SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：72中所示氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，或者是其免疫原性片段。
56.权利要求1至55中任一项所述的抗体，其与活细胞表面上存在的PD-1的天然表位结合。
57.权利要求1至56中任一项所述的抗体，其中所述抗体是多特异性抗体，其包含与PD-1结合的第一抗原结合区和至少一个与另一抗原结合的另外的抗原结合区。
58.权利要求57所述的抗体，其中所述抗体是双特异性抗体，其包含与PD-1结合的第一抗原结合区和与另一抗原结合的第二抗原结合区。
59.权利要求57或58所述的抗体，其中所述与PD-1结合的第一抗原结合区包含权利要求1至50中任一项中所示的重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)。
60.权利要求1至59中任一项所述的抗体，其可通过包括以下步骤的方法获得：用具有SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：72中所示的氨基酸序列的蛋白质或肽、或者其免疫原性片段、或者表达所述蛋白质或肽或者其免疫原性片段的核酸或宿主细胞或病毒对动物进行免疫接种。
61.杂交瘤，其能够产生权利要求1至60中任一项所述的抗体。
62.缀合物，其包含与部分或试剂偶联的权利要求1至60中任一项所述的抗体。
63.权利要求62所述的缀合物，其中所述部分或试剂选自放射性同位素、酶、染料、药物、毒素和细胞毒性剂。
64.多聚体，其包含至少两个权利要求1至60中任一项所述的抗体、或者至少两个权利要求62或63所述的缀合物、或者一个或更多个权利要求1至60中任一项所述的抗体与一个或更多个权利要求62或63所述的缀合物的混合物。
65.权利要求64所述的多聚体，其包含4至8个权利要求1至60中任一项所述的抗体或者权利要求62或63所述的缀合物。
66.核酸，其包含编码权利要求1至60中任一项所述的抗体或其片段的核酸序列。
67.权利要求66所述的核酸，其中所述核酸是RNA。
68.载体，其包含权利要求66或67所述的核酸。
69.权利要求68所述的载体，其中所述载体是多层囊泡、单层囊泡或其混合物。
70.权利要求68或69所述的载体，其中所述载体是脂质体。
71.权利要求70所述的载体，其中所述脂质体是阳离子脂质体。
72.权利要求70或71所述的载体，其中所述脂质体的粒径在约50nm至约200nm的范围内。
73.宿主细胞，其包含权利要求66或67所述的核酸或者包含权利要求68至72中任一项所述的载体。
74.病毒，其包含权利要求66或67所述的核酸或者包含权利要求68至72中任一项所述的载体。
75.药物组合物，其包含活性剂和可药用载体，其中所述活性剂是选自以下中的至少一种：
(i)权利要求1至60中任一项所述的抗体；
(ii)权利要求62或63所述的缀合物；
(iii)权利要求64或65所述的多聚体；
(iv)权利要求66或67所述的核酸；
(v)权利要求68至72中任一项所述的载体；
(vi)权利要求73所述的宿主细胞；和/或
(vii)权利要求74所述的病毒。
76.权利要求75所述的药物组合物，其被配制成用于肠胃外施用。
77.权利要求76所述的药物组合物，其被配制成用于心血管施用，特别是静脉内或动脉内施用。
78.权利要求75至77中任一项所述的药物组合物，其用于疾病的预防性和/或治疗性治疗。
79.权利要求78所述的药物组合物，其中所述疾病是癌症生长和/或癌症转移。
80.权利要求78或79所述的药物组合物，其中所述疾病的特征在于包含病变细胞或癌细胞，所述病变细胞或癌细胞的特征在于表达PD-L1和/或特征在于PD-L1与其表面缔合。
81.权利要求75至80中任一项所述的药物组合物，其用于预防或治疗癌症的方法。
82.权利要求79至81中任一项所述的药物组合物，其中所述癌症选自黑素瘤、肺癌、肾细胞癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌和胃食管连接部癌、胰腺腺癌、卵巢癌和淋巴瘤。
83.权利要求75至82中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物将被特异性地递送至靶器官或组织、积累在靶器官或组织中和/或保留在靶器官或组织中。
84.权利要求75至83中任一项所述的药物组合物，其中所述载体或所述病毒在所述靶器官或组织处释放所述核酸，和/或者进入所述靶器官或组织处的细胞。
85.权利要求75至84中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体将在所述靶器官或组织的细胞中表达。
86.权利要求75至85中任一项所述的药物组合物，其中所述治疗是单一治疗或组合治疗。
87.权利要求86所述的药物组合物，其中所述组合治疗是选自化学治疗、分子靶向治疗、放射治疗和其他形式的免疫治疗中的至少一种治疗。
88.权利要求75至87中任一项所述的药物组合物，其中所述对象是人。
89.在对象中治疗或预防疾病的方法，其包括向对象施用至少一种活性剂，其中所述活性剂是选自以下中的至少一种：
(i)权利要求1至60中任一项所述的抗体；
(ii)权利要求62或63所述的缀合物；
(iii)权利要求64或65所述的多聚体；
(iv)权利要求66或67所述的核酸；
(v)权利要求68至72中任一项所述的载体；
(vi)权利要求73所述的宿主细胞；和/或
(vii)权利要求74所述的病毒。
90.权利要求89所述的方法，其中将权利要求75至77中任一项所述的药物组合物施用于所述对象。
91.权利要求89或90所述的方法，其中所述对象具有病变器官或组织，所述病变器官或组织的特征在于细胞表达PD-L1和/或特征在于PD-L1与其表面缔合。
92.权利要求89至91中任一项所述的方法，其中所述疾病是癌症生长和/或癌症转移。
93.权利要求92所述的方法，其中所述癌症选自黑素瘤、肺癌、肾细胞癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌和胃食管连接部癌、胰腺腺癌、卵巢癌和淋巴瘤。
94.权利要求89至93中任一项所述的方法，其中将所述活性剂或所述药物组合物施用到心血管系统中。
95.权利要求94所述的方法，其中所述活性剂或所述药物组合物通过静脉内或动脉内施用例如施用到外周静脉中来施用。
96.权利要求89至95中任一项所述的方法，其中所述活性剂或所述药物组合物特异性地递送至靶器官或组织、积累在靶器官或组织中和/或保留在靶器官或组织中。
97.权利要求89至96中任一项所述的方法，其中所述载体、所述宿主细胞或所述病毒在所述靶器官或组织处释放所述核酸，和/或者进入所述靶器官或组织处的细胞。
98.权利要求97所述的方法，其中所述抗体在所述靶器官或组织的细胞中表达。
99.权利要求89至98中任一项所述的方法，其中所述治疗是单一治疗或组合治疗。
100.权利要求99所述的方法，其中所述组合治疗是选自化学治疗、分子靶向治疗、放射治疗和其他形式的免疫治疗中的至少一种治疗。
101.权利要求89至100中任一项所述的方法，其中所述对象是人。
102.用于定性或定量检测样品中PD-1的试剂盒，其中所述试剂盒包含权利要求1至60中任一项所述的抗体或者权利要求62或63所述的缀合物或者权利要求64或65所述的多聚体。
103.权利要求1至60中任一项所述的抗体或者权利要求62或63所述的缀合物或者权利要求64或65所述的多聚体或者权利要求102所述的试剂盒在确定样品中表达的PD-1的存在或量的方法中的用途，所述方法包括以下步骤：
(i)使样品与所述抗体或所述缀合物或所述多聚体接触，以及
(ii)检测所述抗体或所述缀合物或所述多聚体与PD-1之间复合物的形成和/或者确定所述复合物的量。
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