CN116059351A - 结合人cd40的激动性抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

公开了与人CD40结合的分离的单克隆激动性抗体和相关的基于抗体的组合物和分子。还公开了使用该抗体的治疗和诊断方法。

Description

结合人CD40的激动性抗体及其用途
本申请是中国申请号为201780024144.2、发明名称为“结合人CD40的激动性抗体及其用途”且申请日为2017年4月18日的专利申请(PCT申请号为PCT/US2017/028162)的分案申请。
相关申请
本申请要求于2016年4月18日提交的美国临时申请号62/324,170的优先权。上述申请的内容通过引用在此并入。
背景技术
T细胞和抗原呈递细胞之间的相互作用涉及促进免疫应答的多种辅助分子。一种这样的分子是CD40，它是与CD40L结合的肿瘤坏死因子受体(TNF-R)超家族的成员(RanheimEA等人，Blood.1995June 15；85(12):3556-65)。CD40是由277个氨基酸残基组成的跨膜43-48kDa糖蛋白(Braesch-Andersen等人，1989)。CD40由抗原呈递细胞(APC)表达，其天然配体(CD40L)与T细胞的结合激活APC，包括树突细胞和B细胞(Khalil和Vonderhide(2007)Update Cancer Ther,2(2):61–65)，从而增强免疫应答。CD40也在许多肿瘤细胞上表达，并且其在该环境中的连接介导直接的细胞毒性作用，例如CD40与肿瘤细胞的结合导致体外凋亡和体内肿瘤生长受损(Tai等人(2004)Cancer Res,64(8):2846–52)。
针对CD40的单克隆抗体提供多种潜在的治疗目的，包括治疗癌症。例如，已显示激动性CD40抗体替代CD4+淋巴细胞在T细胞介导免疫的小鼠模型中提供的辅助性T细胞，并且在携带肿瘤的宿主中CD40激动剂引发针对肿瘤相关抗原的有效免疫应答(Bennett等人(1998)Nature,393(6684):478–80)。此外，CD40抗体有望用于疫苗(Fransen等人(2014)Vaccine 32:1654-1660)。然而，存在与强烈调节免疫系统的药剂相关的潜在副作用(Sandin等人(2014)Cancer Immunol Res,2:80-90)。因此，需要进一步了解使CD40抗体治疗有效的特定性质和机制，以及改进的可用于治疗和/或预防疾病的抗CD40治疗性抗体。
发明内容
本发明提供了具有特定功能特性的分离的抗CD40抗体，其可以与有利和期望的治疗效果相关联。具体地，已经产生并表征了能够增加对抗原(例如在细胞上表达的抗原)的免疫应答的激动性抗CD40单克隆抗体。如本文所用，术语“抗体”是指全长抗体及其抗原结合部分。
在一个实施方式中，抗CD40抗体增强针对抗原的免疫应答，例如通过增强T细胞介导的免疫应答、B细胞活化和/或细胞因子产生。抗体可以单独施用或在组合疗法中(例如与疫苗疗法和/或化学疗法一起)施用。
在另一个实施方式中，抗CD40抗体能够增加对抗原的免疫应答，而不诱导CD40表达细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或CD40表达细胞的补体依赖性细胞毒性(CDC)。
在另一个实施方式中，抗体包含无效应恒定区。在一个实施方式中，恒定区是IgG2同种型(例如人IgG2)。
在又一个实施方式中，抗CD40抗体表现出以下特性中的一种或多种：
(a)不阻断CD40L与人CD40的结合，而不依赖于Fc受体结合；
(b)阻断CD40L与人CD40的结合，而不依赖于Fc受体结合；
(c)激活抗原呈递细胞(APC)上表达的人CD40，而不依赖于Fc受体结合；
(d)诱导肿瘤细胞的凋亡；
(e)T细胞刺激活性；
(f)增强的B细胞激活；和/或
(g)能够与CD40L协同作用。
优选地，抗体不依赖于Fc受体相互作用而起作用。优选地，抗体是IgG2同种型抗体。
在一个实施方式中，激动性抗体能够增加免疫应答而不依赖于Fc受体结合。例如，抗体可以展现出有效的激动特征而不与Fc受体例如FcγR交联。这些激动特征包括例如所测量的T细胞活性增加和/或B细胞激活增加，例如通过选自由HLA-DR V450、CD54 PE、CD86APC、CD83 BV510、CD19 V500、CD54 PE、HLA-DR V450、CD23 PerCP-Cy5.5、CD69 APC、CD86APC、CD38和CD71 PE组成的组中的细胞表面标志物的表达所测量。
在另一实施方式中，抗体阻断CD40与CD40表达细胞上的CD40L(CD154)的结合。在具体实施方式中，抗体抑制至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％,80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的可溶性CD40L与CD40表达细胞的结合。在具体实施方式中，例如通过FACS、生物层干涉测量法(BLI)或Biacore所测量，抗CD40抗体抑制至少约70％的CD40L的结合。在具体实施方式中，例如通过FACS、BLI或Biacore所测量，抗CD40抗体抑制至少约80％的CD40L的结合。
在另一实施方式中，例如通过CD95的表达增加所测量，抗体诱导细胞凋亡。还可以构建抗体以包括Fc区，其针对特定Fc受体(例如FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIB1(CD32)、FcγRIIB2(CD32)、FcγRIIIA(CD16a)、FcγRIIIB(CD16b)、FcεRI,FcεRII(CD23)、FcαRI(CD89)、Fcα/μR,和FcRn)具有特异性。
在另一实施方式中，抗体能够以10-10M或更小、优选10-11M或更小的平衡解离常数结合人CD40，和/或与食蟹猴CD40交叉反应。
本发明的特定抗CD40抗体包括抗体3C3、3G5、1B4、3B6、6H6、2E1.2、1B5-NK、3B6-NS和下述的相关实施方式。
在一个实施方式中，抗体包含选自由SEQ ID NO：9,10,23,24,37,38,51,52,65,66,65,66,79,80,93,94,107,108组成的组中的重链可变区CDR3序列，包括其保守序列修饰(例如保守氨基酸取代)。抗体可进一步包含选自由SEQ ID NO：15,16,29,30,43,44,57,58,71,72,85,86,99,100,113,114组成的组中的轻链可变区CDR3序列，包括其保守序列修饰。在另一实施方式中，重链CDR2和/或CDR1序列分别选自SEQ ID NO：7,8,21,22,35,36,49,50,63,64,77,78,91,92,105,106和SEQ ID NO：5,6,19,20,33,34,47,48,61,62,61,62,75,76,89,90,103,104，包括其保守序列修饰。在另一实施方式中，轻链CDR2和/或CDR1序列分别选自SEQ ID NO：13,14,27,28,41,42,55,56,69,70,84,85,97,98,111,112和SEQ ID NO：11,12,25,26,40,41,53,54,67,68,81,82,95,96,109,110，包括其保守序列修饰。
在另一实施方式中，抗体包含具有选自由SEQ ID NO：3,17,31,45,59,73,87,101组成的组中的氨基酸序列的重链可变区，包括其保守序列修饰。抗体可进一步包含具有选自由SEQ ID NO：4,18,32,46,60,74,88,102组成的组中的氨基酸序列的轻链可变区，包括其保守序列修饰。
在另一实施方式中，抗体包含具有以下氨基酸序列的重链和/或轻链可变区(包括其保守序列修饰)：
(a)SEQ ID NO：3和/或4；
(b)SEQ ID NO：17和/或18；
(c)SEQ ID NO：31和/或32；
(d)SEQ ID NO：45和/或46；
(e)SEQ ID NO：59和/或60；
(f)SEQ ID NO：73和/或74；
(g)SEQ ID NO：87和/或88；或
(h)SEQ ID NO：101和/或102。
包括与上述任何序列具有至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或更高序列同一性的重链和轻链可变区的抗体也包括在本发明中。本发明还包括上述值中间的范围，例如与任何上述序列具有至少80-85％、85-90％、90-95％或95-100％序列同一性的重链和轻链可变区。
在又一实施方式中，抗体结合人CD40并具有CDR序列，其来自分别具有下列中所示的氨基酸序列的重链和轻链可变区：
(a)SEQ ID NO：3和4；
(b)SEQ ID NO：17和18；
(c)SEQ ID NO：31和32；
(d)SEQ ID NO：45和46；
(e)SEQ ID NO：59和60；或
(f)SEQ ID NO：73和74；
(g)SEQ ID NO：87和88；或
(h)SEQ ID NO：101和102
(在每种情况下，在一个或多个CDR内包括一个保守序列修饰、两个保守序列修饰，或最多三个、最多四个或最多五个保守序列修饰)。
在另一实施方式中，抗体结合人CD40并具有：
(a)分别包含SEQ ID NO：5,7,9的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQID NO：11,13,15的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(b)分别包含SEQ ID NO：19,21,23的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO：25,27,29的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(c)分别包含SEQ ID NO：33,35,37的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO：39,41,43的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(d)分别包含SEQ ID NO：47,49,51的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO：53,55,57的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(e)分别包含SEQ ID NO：61,63,65的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO：67,69,71的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(f)分别包含SEQ ID NO：75,77,79的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO：81,83,85的轻链CDR1,CDR2,和CDR3序列；
(g)分别包含SEQ ID NO：89,91,93的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO：95,97,99的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；或
(h)分别包含SEQ ID NO：103,105,107的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO：109,111,113的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，(在每种情况下，在一个或多个所述CDR内任选地包括一个保守序列修饰、两个保守序列修饰，或最多三个、最多四个或最多五个保守序列修饰)。
在又一实施方式中，抗体结合人CD40并具有：
(a)分别包含SEQ ID NO：6,8,10的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQID NO：12,14,16的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(b)分别包含SEQ ID NO：20,22,24的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO：26,28,30的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(c)分别包含SEQ ID NO：34,36,38的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO：40,42,44的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(d)分别包含SEQ ID NO：48,50,52的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO：54,56,58的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(e)分别包含SEQ ID NO：62,64,66的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO：68,70,72的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；或
(f)分别包含SEQ ID NO：76,78,80的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO：82,84,86的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(g)分别包含SEQ ID NO：90,92,94的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO：96,98,100的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；或
(h)分别包含SEQ ID NO：103,105,107的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和/或分别包含SEQ ID NO：109,111,113的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，(在每种情况下，在一个或多个所述CDR内任选地包括一个保守序列修饰、两个保守序列修饰，或最多三个、最多四个或最多五个保守序列修饰)。
在另一方面，本发明提供了与上述特定抗体竞争结合CD40的抗体。在一个实施方式中，该抗体与包含重链和/或轻链可变区的抗体竞争结合CD40，所述重链和/或轻链可变区分别包含SEQ ID NO：3和4，SEQ ID NO：17和18，SEQ IDNO：31和32，SEQ ID NO：45和46，SEQ ID NO：59和60，SEQ ID NO：73和74，SEQ ID NO：87和88，SEQ ID NO：101和102中所示的氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供了与上述特定抗体结合相同表位的抗体，或与上述特定抗体所识别的CD40上的表位结合的抗体。在一个实施方式中，该抗体与包含重链和/或轻链可变区的抗体所识别的CD40上的表位结合，所述重链和/或轻链可变区分别包含SEQ IDNO：3和4，SEQ ID NO：17和18，SEQ ID NO：31和32，SEQ ID NO：45和46，SEQ ID NO：59和60，SEQ ID NO：73和74，SEQ ID NO：87和88，SEQ ID NO：101和102中所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，该抗体与抗体3C3或3G5结合相同表位。
在另一方面，本发明提供了抗体，其结合人CD40的细胞外结构域(ECD)(SEQ IDNO：133)的氨基酸残基1-5和33-36内的一个或多个残基。在一些实施方式中，抗体进一步结合选自由人CD40的ECD(SEQ ID NO：133)的氨基酸25,26,28和30组成的组中的一个或多个氨基酸。在一些实施方式中，抗体结合选自由人CD40的ECD(SEQ ID NO：133)的氨基酸5,33,34和36组成的组中的一个或多个氨基酸。在一些实施方式中，抗体结合人CD40的ECD(SEQID NO：133)的氨基酸5,33和36。在一些实施方式中，抗体结合人CD40的ECD(SEQ ID NO：133)的氨基酸5,33,34和36。
在前述任何方面，本发明提供了抗体，其中相对于与人CD40的ECD(SEQ ID NO：133)的结合，人CD40的ECD(SEQ ID NO：133)的位置5处用苏氨酸取代丙氨酸使抗体的结合减少至少30％。在一些实施方式中，相对于与人CD40的ECD(SEQ ID NO：133)的结合，人CD40的ECD的位置5处用苏氨酸取代丙氨酸使抗体的结合减少至少50％。在一些实施方式中，相对于与人CD40的ECD(SEQ ID NO：133)的结合，人CD40的ECD的位置5处用苏氨酸取代丙氨酸使抗体的结合减少至少80％。
在前述任何方面，本发明提供了展现出与CD40L的协同作用的抗体，所述CD40L可以是内源性CD40L。在一些实施方式中，当与Ramos细胞一起温育时，协同作用是增加诱导CD95的表达。在一些实施方式中，当与人B细胞一起温育时，协同作用是增加B细胞增殖。在一些实施方式中，当与树突细胞一起温育时，协同作用是增加诱导IL12p40的表达。在一些实施方式中，根据CD95的表达测量协同作用。
在另一方面，本发明提供了抗体，其结合人CD40的ECD(SEQ ID NO：133)的氨基酸残基13-15和33-36内的一个或多个残基。在一些实施方式中，抗体结合选自由人CD40的ECD(SEQ ID NO：133)的氨基酸33,34和36组成的组中的一个或多个氨基酸。
本发明的抗体可以是全长的，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD和IgE抗体或其序列变体。或者，抗体可以是片段，例如Fab、F(ab')2、Fv、单链Fv、分离的互补决定区(CDR)或两个或更多个分离的CDR的组合。抗体可以是任何已知类型或物种的抗体，包括但不限于全人抗体、人源化抗体和嵌合抗体。优选地，抗体是IgG2抗体。应当理解，可以对IgG2序列进行某些修饰，例如缺失N末端赖氨酸和/或本领域已知的各种其它突变。因此，IgG2抗体包括例如具有恒定结构域的抗体，所述恒定结构域与天然人IgG2序列具有至少90％，优选至少95％，优选至少97％，优选至少99％的序列同一性。
本发明还提供了分子缀合物，其包含与抗原(包括片段、表位和抗原决定簇)例如肿瘤抗原、自身抗原或病原体的成分连接的本发明抗体。例如，抗原可包括肿瘤抗原例如βhCG、gp100或Pmel17、CEA、gp100、TRP-2、NY-BR-1、NY-CO-58、MN(gp250)、独特型、酪氨酸酶、端粒酶、SSX2、MUC-1、MAGE-A3、和高分子量-黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)MART1、黑色素-A、NY-ESO-1、MAGE-1、MAGE-3、WT1、Her2,间皮素或高分子量-黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)。
在另一实施方式中，分子复合物进一步包括治疗剂，例如细胞毒剂、免疫抑制剂或化学治疗剂。
在另一方面，本发明提供了双特异性分子，其包含与具有不同结合特异性的第二功能部分连接的本发明抗体。例如，在一个实施方式中，第二分子可结合T细胞受体(例如CD3、CD40或CTLA-4)、NK受体(例如CD56)、B细胞受体(例如CD20)或另一肿瘤坏死因子受体(例如CD95)。
还提供了与药学上可接受的载体一起配制的包括本文所述的抗体、分子缀合物或双特异性分子的组合物。组合物可进一步包括佐剂、免疫刺激剂(例如CD40配体、FLT 3配体、细胞因子、集落刺激因子、抗CTLA-4抗体(包括不限于伊匹单抗)、抗PD1抗体(包括但不限于MPDL3280A或durvalumab)、抗41BB抗体、抗OX-40抗体、LPS(内毒素)、ssRNA、dsRNA、卡介苗(BCG)、盐酸左旋咪唑、静脉注射免疫球蛋白和Toll样受体(TLR)激动剂(例如TLR3激动剂，例如Poly IC，TLR4激动剂，TLR5激动剂，TLR7激动剂，TLR8激动剂和TLR9激动剂))，免疫抑制剂，另一种抗体或抗原，或STING激动剂。
可以包括在本发明的分子缀合物或组合物(例如在疫苗中与本发明的抗CD40抗体组合使用)中的肿瘤抗原包括存在于肿瘤细胞上(或与之相关的)并且通常不存在于正常细胞上的任何抗原或抗原决定簇，或存在于肿瘤细胞上或与肿瘤细胞相关的量大于正常(非肿瘤)细胞的抗原或抗原决定簇，或存在于肿瘤细胞上而与正常(非肿瘤)细胞不同形式的抗原或抗原决定簇。此类抗原包括肿瘤特异性抗原，包括肿瘤特异性膜抗原，肿瘤相关抗原，包括肿瘤相关膜抗原，肿瘤上的胚胎抗原，生长因子受体，生长因子配体以及与癌症相关的任何其它类型的抗原。肿瘤抗原可以是例如上皮癌抗原，(例如乳腺，胃肠，肺)，前列腺特异性癌抗原(PSA)或前列腺特异性膜抗原(PSMA)，膀胱癌抗原，肺(例如小细胞肺癌)癌抗原，结肠癌抗原，卵巢癌抗原，脑癌抗原，胃癌抗原，肾细胞癌抗原，胰腺癌抗原，肝癌抗原，食道癌抗原，头颈癌抗原，或结直肠癌抗原。例如，抗原可包括肿瘤抗原例如βhCG、gp100或Pmel17、CEA、gp100、TRP-2、NY-BR-1、NY-CO-58、MN(gp250)、独特型、酪氨酸酶、端粒酶、SSX2、MUC-1、MAGE-A3和高分子量-黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)MART1、黑色素-A、EGFRvIII、NY-ESO-1、MAGE-1、MAGE-3、WT1、Her2或间皮素。本发明使用的其它抗原(例如在疫苗中与本发明的抗CD40抗体组合使用)包括来自感染性疾病病原体的抗原，例如病毒，细菌，寄生虫和真菌，其实例在本文中公开。
还提供了编码本发明抗体的重链和/或轻链可变区的全部或部分的核酸分子，以及包含这些核酸的表达载体，和包含这些表达载体的宿主细胞。在一个实施方式中，核酸序列分别选自由SEQ ID NO：87-112组成的组，或与这些核酸序列具有例如至少约85％、90％或95％同一性的核酸序列。
本发明还提供了使用本文所述的激动性抗体增强受试者中针对抗原的免疫应答(例如T细胞介导的免疫应答和/或NK介导的应答和/或B细胞介导的免疫应答)的方法。在一个实施方式中，抗体与人CD40结合(在多种免疫细胞类型上表达)，从而触发抗原呈递细胞(APC)的细胞增殖和激活，并激活B细胞、效应子和记忆T细胞，其导致例如针对肿瘤细胞的免疫应答增强。因此，在一个实施方式中，该方法包括以有效诱导或增强针对抗原的免疫应答的量施用本发明的抗体(例如其全长抗体或其抗原结合部分)、组合物或双特异性分子。在另一实施方式中，该方法进一步包括例如与抗体、组合物或双特异性分子同时地、分开地或顺序地施用抗原。
还提供了抑制CD40表达细胞生长的方法(例如在治疗癌症中)。例如，已显示本发明的激动性抗体增加募集免疫效应细胞的细胞表面分子的表达，导致细胞死亡，例如细胞凋亡。因此，在另一个实施方式中，该方法包括以有效抑制CD40表达细胞生长的量施用本发明的抗体(例如其全长抗体或其抗原结合部分)、组合物或双特异性分子或将细胞与其接触。
进一步提供了在受试者中通过施用与抗原所连接的细胞上的受体结合的分子(例如先前描述的CD40抗体)以使抗原靶向细胞的方法，所述细胞是例如能够呈递抗原的细胞(例如外周血单核细胞(PBMC)，单核细胞(例如THP-1)，B淋巴母细胞样细胞(例如C1R.A2，1518B-LCL)和单核细胞衍生的DC。
本文所述的方法可用于治疗多种疾病，特别是癌症(例如选自由白血病，急性淋巴细胞白血病，急性髓细胞白血病，成髓细胞早幼粒细胞髓单核细胞单核细胞红白血病，慢性白血病，慢性髓细胞(粒细胞)白血病，慢性淋巴细胞白血病，套细胞淋巴瘤，原发性中枢神经系统淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，边缘区B细胞淋巴瘤，真性红细胞增多症淋巴瘤，霍奇金病，非霍奇金病，多发性骨髓瘤，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症，重链疾病，实体瘤，肉瘤，和癌，纤维肉瘤，粘液肉瘤，脂肪肉瘤，软骨肉瘤，成骨肉瘤，骨肉瘤，脊索瘤，血管肉瘤，内皮肉瘤，淋巴管肉瘤，淋巴管内皮细胞瘤，滑膜瘤，间皮瘤，尤文氏瘤，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤，结肠肉瘤，结直肠癌，胰腺癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，鳞状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳头状癌，乳头状腺癌，囊腺癌，髓样癌，支气管癌，肾细胞癌，肝细胞瘤，胆管癌，绒毛膜癌，精原细胞瘤，胚胎癌，肾母细胞瘤，宫颈癌，子宫癌，睾丸肿瘤，肺癌，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，膀胱癌，上皮癌，胶质瘤，星形细胞瘤，髓母细胞瘤，颅咽管瘤，室管膜瘤，松果体，血管母细胞瘤，听神经瘤，少突神经胶质瘤，血管瘤，黑色素瘤，神经母细胞瘤，视网膜母细胞瘤，鼻咽癌，食道癌，基底细胞癌，胆道癌，膀胱癌，骨癌，脑和中枢神经系统(CNS)癌，宫颈癌，绒毛膜癌，结肠直肠癌，结缔组织癌，消化系统癌症，子宫内膜癌，食道癌，眼癌，头颈癌，胃癌，上皮内瘤，肾癌，喉癌，肝癌，肺癌(小细胞，大细胞)，黑色素瘤，神经母细胞瘤；口腔癌(例如唇，舌，口和咽)，卵巢癌，胰腺癌，视网膜母细胞瘤，横纹肌肉瘤，直肠癌；呼吸系统癌，肉瘤，皮肤癌，胃癌，睾丸癌，甲状腺癌，子宫癌和泌尿系统癌症组成的组)。特定癌症包括选自由慢性淋巴细胞白血病，套细胞淋巴瘤，原发性中枢神经系统淋巴瘤，伯基特淋巴瘤和边缘区B细胞淋巴瘤组成的组中的CD40表达肿瘤。
在另一实施方式中，该方法可用于治疗或预防细菌、真菌、病毒或寄生虫感染。
CD40表达细胞包括表达CD40的任何和所有细胞，包括但不限于抗原呈递细胞(APC)，包括树突细胞(DC)、B细胞、巨噬细胞和单核细胞。CD40还表达在其它类型细胞上，例如上皮细胞、内皮细胞和血小板。已经在各种肿瘤细胞上证实了CD40表达，包括B细胞淋巴瘤和肾癌细胞。在具体实施方式中，CD40表达细胞包括细胞系，例如Jurkat细胞，Raji细胞，Ramos细胞和Daudi细胞。在另一实施方式中，CD40表达细胞是肿瘤细胞或癌细胞。在另一个实施方式中，CD40表达细胞包括被发现浸润肿瘤或癌细胞的B细胞，NK细胞，T细胞，也称为肿瘤浸润淋巴细胞。
在另一实施方式中，本发明提供了本文所述的抗体、组合物或双特异性分子在制备用于诱导或增强受试者中针对抗原(例如肿瘤抗原)的免疫应答的药物中的用途。在进一步的实施方式，本发明提供了本文所述的抗体或组合物在制备药物中的用途，所述药物用于(1)增加对抗原的免疫应答，(2)抑制CD40表达细胞的生长，和/或(3)将抗原靶向到APC。
本发明还提供了通过以下方法检测生物样品中CD40存在或不存在的方法：(1)使生物样品与本文所述的抗体接触(其中抗体用可检测物质标记)和(2)检测结合CD40的抗体。
本发明还提供了包含本发明的组合物(例如抗体和/或双特异性分子)的试剂盒，以及任选的使用说明书。试剂盒可以进一步含有至少一种另外的试剂，例如细胞因子或补体，或本发明的一种或多种另外的抗体。
根据所附详述和权利要求书，本发明的其它特征和优点将显而易见。
附图说明
图1提供了根据制造商的指南使用OctetTM QKe仪器(Pall ForteBio，Menlo Park，CA)通过生物层干涉测定法(BLI)测定的抗体3C3、3G5、1B4、3B6和6H6的平衡解离常数(KD)和动力学结合速率常数(kon)和解离速率常数(koff)的值。
图2是显示在ELISA中使用吸光度(OD450)得到的人CD40抗体(包括3C3、3G5、1B4、3B6和6H6)与重组纯化的人CD40包被的微量滴定板的结合随着抗体浓度变化的图。
图3是显示通过流式细胞术得到的与纯化的人PBMC(左)和食蟹猴PBMC(右)结合的平均荧光强度(MFI)随着人CD40抗体浓度(3C3、3G5、1B4、3B6和6H6)变化的图。
图4A和4B是显示通过ELISA得到的人CD40抗体对可溶性CD40配体(sCD40L)与CD40蛋白结合的作用的图。
图5是人CD40抗体(3C3、3G5、1B4、3B6和6H6)与其表面上表达人CD40的Raji细胞上的CD40结合的流式细胞术分析。
图6是人CD40抗体(3C3、3G5、1B4、3B6和6H6)与其表面上表达人CD40的Ramos细胞上的CD40结合的流式细胞术分析。
图7A和7B是显示通过人CD40抗体诱导Ramos细胞上CD95的图。
图8A和8B是显示基于所示的下列标志物CD54，HLA-DR，CD86，CD83和％CD83+细胞的表达水平变化的人CD40抗体(3C3和3G5)的树突细胞(DC)激活的图。
图9A和9B是显示通过人CD40抗体(3C3和3G5)诱导IL-12p40的图。
图10A和10B是显示基于所示的下列标志物CD54，HLA-DR，CD23，％CD23+细胞，CD69，CD86，CD38和CD71的表达水平变化的人CD40抗体(3C3和3G5)的B细胞激活的图。
图11A和11B是描绘使用表达CD40的荧光素酶报道细胞系通过人CD40抗体激活NFkB的图。
图12是显示在用CD40人抗体克隆3C3和3G5经腹膜内施用(每剂量0.3mg)治疗后，SCID小鼠肿瘤模型(Raji细胞)中肿瘤生长和存活的结果的图。
图13是显示在用CD40人抗体克隆3C3和3G5经腹膜内施用(每剂量0.3mg)治疗后，SCID小鼠肿瘤模型(Ramos细胞)中肿瘤生长和存活的结果的图。
图14A和14B是显示所示的用CD40抗体或同种型对照(IgG2)温育的标记PBMC的T细胞增殖的图。
图15是显示使用CD40抗体3C3和3G5不依赖于Fc受体相互作用与CD40结合的图。
图16是显示使用CD40抗体3C3和3G5的NFκb激活的图。
图17是显示使用CD40抗体3C3和3G5的Ramos细胞上CD95诱导的图。
图18显示了抗CD40/抗原融合APC靶向疫苗构建体的实例的示意图。
图19是显示CD40抗体3C3与可溶性CD40L对Ramon细胞中CD95表达的协同作用的图。
图20是可溶性CD40 cDNA的示意图，其编码具有N-末端人κ轻链和C-末端Flag标签的跨越氨基酸残基1-173的全长细胞外结构域(ECD)。
图21显示人CD40 ECD氨基酸序列与猴CD40 ECD氨基酸序列(上图)和小鼠CD40ECD氨基酸序列(下图)的比对。显示了产生的片段。
图22提供了显示CD40抗体3C3与具有各种点突变或其组合的人CD40ECD片段A(氨基酸残基1-5；上图)或片段D(氨基酸残基33-36；下图)结合的图。
图23A-23C是显示在指定时间点用CD40抗体3C3或3G5治疗之前和之后在猴子中测量的天冬氨酸氨基转移酶(AST；23A)、丙氨酸氨基转移酶(ALT；23B)和肌酸激酶(23C)的水平的图。
图24是显示在指定时间点用CD40抗体3C3或3G5治疗的猴子的血液中测量的IL-12水平(pg/mL)的图。
图25A-25C是显示在指定时间点用CD40抗体3C3或3G5治疗之前和之后在猴子中测量的白细胞(25A)、嗜中性粒细胞(25B)和淋巴细胞(25C)的量的图。
图26是显示用CD40抗体3C3或3G5治疗的猴子中B细胞量随时间(天)的基线百分比变化的图。
图27提供了显示经2mg(左)或0.2mg(右)CD40抗体3C3(正方形)、3G5(菱形)或盐水(圆形)后B细胞相对于基线的HLA-DR表达的图。
图28提供了显示当在抗CD40 mAb 3C3存在下培养细胞时B细胞增殖的图。
图29和30提供了显示抗CD40 mAb 3C3和CD40L的组合在B细胞中的协同作用的图。
图31提供了显示当与抗CD40 mAb 3C3一起温育时全血中细胞因子应答的表格。
具体实施方式
本发明提供了抗CD40抗体，其表现出与涉及免疫功能上调的显著治疗益处相关的特定功能特性(例如疫苗疗法中的T细胞介导的免疫应答，癌症治疗中的NK激活)，抑制细胞生长(例如在癌症治疗中)和/或由APC增强的抗原加工和呈递(例如在疫苗疗法中)。这些功能特征包括，例如，增强对抗原的免疫应答而不依赖于Fc受体结合，和/或不诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)。其它功能特征包括，例如，(1)CD40L(CD154)与CD40表达细胞的结合抑制(例如完全或部分阻断)至少50％、至少60％或至少70％，(2)阻断CD40L与人CD40的结合而不依赖于Fc受体结合，(3)诱导细胞凋亡(例如通过CD95表达的增加来测量)，(4)T细胞刺激活性增加(例如通过IL-12p40的表达增加来测量)，和/或(5)B细胞激活增加(例如通过选自由HLA-DR V450、CD54 PE、CD86 APC和CD83 BV510、CD19 V500、CD54 PE、HLA-DR V450、CD23 PerCP-Cy5.5、CD69 APC、CD86 APC、CD38 PerCP-Cy5.5和CD71 PE组成的组中的至少一种细胞表面标志物的表达增加来测量)。
为了更容易理解本发明，首先定义某些术语。在整个详述中阐述了另外的定义。
术语“CD40”(也称为“CD40分子”、“Bp50”、“CDW40”、“TNFRSF5”、“p50”、“B细胞表面抗原CD40”、“B细胞相关分子”、“CD40抗原”、“TNF受体超家族成员5”、“CD40 II型同种型”、“CD40L受体”、“神经生长因子受体相关B淋巴细胞激活分子”或“肿瘤坏死因子受体超家族成员5”)是指一种受体，它是TNF受体超家族的成员，其与配体CD40L(也称为CD154)结合。CD40介导多种免疫和炎症反应，包括T细胞依赖性免疫球蛋白类别转换和记忆B细胞发育。术语“CD40”包括由细胞天然表达的CD40的任何变体或同种型(例如以登录号P25942在
Figure BDA0003929883480000152
记录的人CD40)。因此，本发明的抗体可以与来自除人以外的物种的CD40交叉反应。或者，抗体可以对人CD40具有特异性，并且可以不与其它物种表现出任何交叉反应。CD40或其任何变体和同种型可以从天然表达它们的细胞或组织中分离，或者使用本领域熟知的技术和/或本文所述的那些重组技术产生。优选地，抗体靶向具有正常糖基化模式的hCD40。
Figure BDA0003929883480000151
(登录号P25942)报告人CD40的氨基酸序列如下(SEQ ID NO：1)：
MVRLPLQCVL WGCLLTAVHP EPPTACREKQ YLINSQCCSL CQPGQKLVSD CTEFTETECLPCGESEFLDT WNRETHCHQH KYCDPNLGLR VQQKGTSETD TICTCEEGWH CTSEACESCV LHRSCSPGFGVKQIATGVSD TICEPCPVGF FSNVSSAFEK CHPWTSCETK DLVVQQAGTN KTDVVCGPQD RLRALVVIPIIFGILFAILL VLVFIKKVAK KPTNKAPHPK QEPQEINFPD DLPGSNTAAP VQETLHGCQP VTQEDGKESRISVQERQ
术语“CD40L”(也称为“CD40配体”、“CD407L”或“CD154”)是指CD40的配体(参见例如
Figure BDA0003929883480000153
和Libby(2001)Cell Mol Life Sci,58(1):4–43)。CD40L主要在激活的T细胞上表达并且是TNF超家族分子的成员。它与抗原呈递细胞(APC)上的CD40结合(APC)，这导致取决于靶细胞类型的许多效果(Parham,Peter(2004).The Immune System(2nd ed.).Garland Science.Pp.169–173)。
Figure BDA0003929883480000161
(登录号NP_000065)报告人CD40L的氨基酸序列如下(SEQ ID NO：2)：
MIETYNQTSP RSAATGLPIS MKIFMYLLTV FLITQMIGSA LFAVYLHRRL DKIEDERNLHEDFVFMKTIQ RCNTGERSLS LLNCEEIKSQ FEGFVKDIML NKEETKKENS FEMQKGDQNP QIAAHVISEASSKTTSVLQW AEKGYYTMSN NLVTLENGKQ LTVKRQGLYY IYAQVTFCSN REASSQAPFI ASLCLKSPGRFERILLRAAN THSSAKPCGQ QSIHLGGVFE LQPGASVFVN VTDPSQVSHG TGFTSFGLLK
本文提及的术语“抗体”包括完整抗体和任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或其单链。在一个优选的实施方式中，“抗体”是指包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区可以进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，穿插有称为框架区(FR)的更保守的区域。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，其按以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。
如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”(或简称“抗体部分”)是指抗体的一个或多个片段，其保留特异性结合抗原(例如人CD40)的能力。这样的“片段”例如长度为约8个至约1500个氨基酸，合适地长度为约8个至约745个氨基酸，合适地为约8个至约300个氨基酸，例如约8个至约200个氨基酸，或长度为约10个至约50个或100个氨基酸。已经显示抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段进行。包含在抗体的术语“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)Fv片段，其由抗体单臂的VL和VH结构域组成，(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341:544-546)，其由VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)或(vii)两个或多个分离的CDR的组合，其可任选地通过合成接头连接。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，但它们可以通过合成接头使用重组方法连接，使得它们能够作为单个蛋白质链制备，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等人(1988)Science 242:423-426和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。此类单链抗体也旨在包括在抗体的术语“抗原结合部分”内。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并以与完整抗体相同的方式筛选片段的效用。抗原结合部分可以通过重组DNA技术产生，或通过完整免疫球蛋白的酶促或化学切割产生。
“双特异性”或“双功能抗体”是具有两个不同重/轻链对和两个不同结合位点的人工杂合抗体。双特异性抗体可以通过多种方法产生，包括杂交瘤的融合或Fab'片段的连接。参见例如Songsivilai&Lachmann,Clin.Exp.Immunol.79:315-321(1990)；Kostelny等人，J.Immunol.148,1547-1553(1992)。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指对特定表位显示单一结合特异性和亲和力的抗体。因此，术语“人单克隆抗体”是指展示单独结合特异性并具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和任选恒定区的抗体。在一个实施方式中，人单克隆抗体由杂交瘤产生，所述杂交瘤包括与永生化细胞融合的获自转基因非人动物(例如转基因小鼠)的B细胞，其具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组。
如本文所用，术语“重组人抗体”包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如(a)从人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体的动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤分离的抗体，(b)从转化以表达抗体的宿主细胞分离的抗体，例如来自转染瘤，(c)从重组、组合人抗体文库分离的抗体，和(d)通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其它DNA序列的任何其它方式制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体包含可变区和恒定区，其利用由种系基因编码的特定人种系免疫球蛋白序列，但包括随后的重排和例如在抗体成熟期间发生的突变。如本领域已知的(参见例如Lonberg(2005)Nature Biotech.23(9):1117-1125)，可变区含有抗原结合结构域，其由重排以形成特异性针对外来抗原的抗体的各种基因编码。除了重排之外，可以通过多个单个氨基酸改变(称为体细胞突变或超突变)进一步修饰可变区，以增加抗体对外来抗原的亲和力。恒定区将在对抗原(即同种型转换)的进一步应答中发生变化。因此，编码轻链和重链免疫球蛋白多肽以应答抗原的重排和体细胞突变的核酸分子可能与原始核酸分子不具有序列同一性，而是基本上相同或相似(即具有至少80％同一性)。
术语“人抗体”包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(如存在)的抗体。本发明的人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)(参见Lonberg,N.等人(1994)Nature 368(6474):856-859)；Lonberg,N.(1994)Handbook of ExperimentalPharmacology 113:49-101；Lonberg,N.和Huszar,D.(1995)Intern.Rev.Immunol.Vol.13:65-93,以及Harding,F.和Lonberg,N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci 764:536-546)。然而，术语“人抗体”不包括其中衍生自另一种哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列已经移植到人框架序列上的抗体(即人源化抗体)。
如本文所用，“异源抗体”是相对于产生这种抗体的转基因非人生物定义的。该术语是指具有对应于在不由转基因非人动物组成的生物中发现的并且通常来自不同于转基因非人动物的物种的氨基酸序列或编码核酸序列的抗体。
如本文所用，“分离的抗体”意指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体(例如特异性结合人CD40的分离的抗体是基本上不含特异性结合不是人CD40的抗原的抗体)。然而，特异性结合表位的分离的抗体可能与来自不同物种的其它CD40蛋白具有交叉反应性。然而，抗体优选总是与人CD40结合。另外，分离的抗体通常基本上不含其它细胞物质和/或化学品。在本发明的一个实施方式中，将具有不同CD40特异性的“分离的”抗体的组合在明确定义的组合物中组合。
术语“表位”或“抗原决定簇”是指免疫球蛋白或抗体特异性结合的抗原上的位点。表位可以由连续氨基酸形成，或者由蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而通过三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时消失。表位通常包括独特空间构象的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。用于确定哪些表位与给定抗体结合的方法(即表位作图)是本领域公知的，包括例如免疫印迹和免疫沉淀测定，其中测试来自CD40的重叠或连续肽与给定CD40抗体的反应性。确定表位空间构象的方法包括本领域技术和本文所述的技术，例如，X射线晶体学和二维核磁共振(参见例如Epitope Mapping Protocols in Methods in MolecularBiology,Vol.66,G.E.Morris,Ed.(1996))。
因此，由本发明提供结合相同表位的抗体或CD40上的表位，其包含由本文所述的特定抗体识别的表位的全部或一部分(例如相同或重叠区域或该区域之间或横跨该区域的区域)。可以使用常规技术鉴定结合相同表位的抗体，或包含特定抗体识别的表位的全部或一部分的表位。这些技术包括例如表位作图方法，例如提供表位原子分辨率的抗原：抗体复合物晶体的X射线分析。其它方法监测抗体与抗原片段或抗原的突变变异的结合，其中由于抗原序列内氨基酸残基的修饰而导致的结合丧失通常被认为是表位组分的指示。另外，还可以使用用于表位作图的计算组合方法。这些方法依赖于目的抗体从组合噬菌体展示肽文库中亲和分离特异性短肽的能力。然后将肽视为用于定义表位的引线，所述表位对应于用于筛选肽文库的抗体。对于表位作图，还开发了计算算法，其已经显示出对构象不连续表位进行作图。
还提供了与本文所述抗体竞争结合人CD40的抗体。可以使用常规技术鉴定竞争结合的抗体。这些技术包括例如免疫测定，其显示一种抗体阻断另一种抗体与靶抗原结合的能力，即竞争性结合测定。在测试中测定竞争性结合，其中受试免疫球蛋白抑制参照抗体与常见的抗原(例如CD40)的特异性结合。已知许多类型的竞争性结合测定，例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)，固相直接或间接酶免疫测定(EIA)，夹心竞争测定(参见Stahli等人，Methods in Enzymology 9:242(1983))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见Kirkland等人，J.Immunol.137:3614(1986))；固相直接标记测定，固相直接标记夹心测定(参见Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press(1988))；使用I-125标记的固相直接标记RIA(参见Morel等人，Mol.Immunol.25(1):7(1988))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung等人，Virology 176:546(1990))；和直接标记的RIA(Moldenhauer等人，Scand.J.Immunol.32:77(1990))。通常，这种测定涉及使用与固体表面或携带这些未标记的测试免疫球蛋白和标记的参照免疫球蛋白中的任一种的细胞结合的纯化抗原。通过测定在测试免疫球蛋白存在下与固体表面或细胞结合的标志物的量来测量竞争性抑制。通常，测试免疫球蛋白过量存在。通常，当竞争抗体过量存在时，它会抑制至少50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％或者更多的参考抗体与常见抗原的特异性结合。
如本文所用，术语“特异结合”、“选择结合”、“选择性结合”和“特异性结合”是指抗体与预定抗原上的表位结合。通常，当通过使用OctetTM QKe仪器的生物层干涉测定法(BLI)或通过BIACORE 2000仪器中表面等离子体共振(SPR)技术进行测定时，使用重组人CD40作为分析物并且抗体作为配体，抗体以大致小于10-7M，例如大致小于10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低的平衡解离常数(KD)结合，并且以其与预定抗原或紧密相关抗原以外的非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)结合的亲和力至少两倍的亲和力结合预定抗原。短语“识别抗原的抗体”和“对抗原特异的抗体”在本文中可与术语“与抗原特异性结合的抗体”互换使用。
此外，本发明包括与人CD40结合并且能够不依赖于Fc受体结合而增加免疫应答的抗体。例如，此类抗体展现出有效的激动特征而不与Fc受体例如FcγR交联。这些激动特征包括，例如，如通过细胞表面标志物的表达的增加而测量的T细胞活性的增加和/或B细胞激活的增加。
如本文所用，术语“KD”意指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。通常，当通过使用OctetTM QKe仪器的生物层干涉测定法(BLI)或通过BIACORE 2000仪器中表面等离子体共振(SPR)技术进行测定时，使用重组人CD40作为分析物并且抗体作为配体，本发明的人抗体以大致10-8M或更小，例如小于10-9M、10-10M、10-11M或10-12M的平衡解离常数(KD)结合CD40。
如本文所用的术语“kd”意指抗体与抗体/抗原复合物解离的解离速率常数。
如本文所用的术语“ka”意指抗体与抗原结合的结合速率常数。
如本文所用，术语“EC50”是指抗体或其抗原结合部分的浓度，其在体外或体内测定中诱导应答，其为最大应答的50％，即在最大应答和基线之间的中间。
如本文所用，“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如IgM或IgG1)。在一个实施方式中，本发明的人单克隆抗体具有IgG1同种型。在另一个实施方式中，本发明的人单克隆抗体具有IgG2同种型。
术语“与固定的CD40结合”是指本发明的人抗体与CD40结合的能力，例如，在细胞表面上表达或附着于固体支持物的CD40。
如本文所用，术语“交叉反应”是指本发明的抗体与来自不同物种的CD40结合的能力。例如，结合人CD40的本发明抗体也可以结合另一种CD40。如本文所用，通过在结合测定(例如SPR、ELISA)中检测与纯化抗原的特异性反应性或与生理CD40表达细胞结合或以其它方式功能性相互作用来测量交叉反应性。确定交叉反应性的方法包括如本文所述的标准结合测定，例如，通过使用OctetTM QKe仪器的生物层干涉测定法(BLI)或使用BiacoreTM2000SPR仪器(Biacore AB,Uppsala,Sweden)的BiacoreTM表面等离子体共振(SPR)分析或流式细胞术技术。
如本文所用，“同种型转换”是指抗体的类别或同种型从一个Ig类别变为另一个Ig类别之一的现象。
如本文所用，“非转换同种型”是指在未发生同种型转换时产生的同种型重链；编码非转换同种型的CH基因通常是紧邻功能重排的VDJ基因下游的第一个CH基因。同种型转换已分类为经典或非经典同种型转换。经典同种型转换通过重组事件发生，所述重组事件涉及转基因中的至少一个转换序列区域。非经典同种型转换可以通过例如人σμ和人∑μ之间的同源重组(δ-相关缺失)发生。可以发生替代的非经典转换机制，例如转基因和/或染色体间重组等，并实现同种型转换。
如本文所用，术语“转换序列”是指负责转换重组的那些DNA序列。“转换供体”序列，通常是μ转换区，将是在转换重组期间待缺失的构建体区的5'(即上游)。“转换受体”区域将位于待缺失的构建体区和替换恒定区(例如γ，ε等)之间。由于不存在总是发生重组的特定位点，因此通常不能从构建体预测最终基因序列。
如本文所用，“糖基化模式”定义为与蛋白质、更特别是与免疫球蛋白蛋白质共价连接的碳水化合物单元的模式。当本领域普通技术人员将异源抗体的糖基化模式识别为与非人类转基因动物的物种而不是转基因的CH基因来源的物种中的所述糖基化模式更相似的异源抗体的糖基化模式时，异源抗体的糖基化模式可以表征为基本上类似于由非人转基因动物的物种产生的抗体上天然存在的糖基化模式。
本文所用的术语“天然存在的”应用于物体是指物体可以在自然界中找到的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中的多肽或多核苷酸序列是天然存在的，所述多肽或多核苷酸序列可以从自然界中的来源分离并且在实验室中没有被人有意地修饰。
如本文所用的术语“重排”是指重链或轻链免疫球蛋白基因座的构型，其中V区段位于分别紧邻基本上编码完整VH或VL结构域的构象中的D-J或J区段。通过与种系DNA比较，可以鉴定重排的免疫球蛋白基因座；重排的基因座将具有至少一个重组的七聚体/九聚体同源元件。
本文中关于V区段使用的术语“未重排的”或“种系构型”是指其中V区段未重组以便紧邻D或J区段的构型。
如本文所用，术语“核酸分子”旨在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。
如本文所用，意指编码与CD40结合的抗体或抗体部分(例如VH、VL、CDR3)的核酸的术语“分离的核酸分子”是指其中编码抗体或抗体部分的核苷酸序列不含编码结合CD40以外的抗原的抗体或抗体部分的其它核苷酸序列的核酸分子，所述其它序列可天然地侧接人基因组DNA中的核酸。
本发明还包括SEQ ID NO：3-132中所示序列的“保守序列修饰”，即核苷酸和氨基酸序列修饰，其不消除由核苷酸序列编码的抗体或含有氨基酸序列的抗体与抗原的结合。这样的保守序列修饰包括保守核苷酸和氨基酸取代，以及核苷酸和氨基酸的添加和缺失。例如，可以通过本领域已知的标准技术将修饰引入SEQ ID NO：3-148，例如定点诱变和PCR介导的诱变。保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代的氨基酸取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸，谷氨酸)，不带电的极性侧链(例如甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，色氨酸)，非极性侧链(例如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸)，β-支链侧链(例如苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。因此，人抗CD40抗体中预测的非必需氨基酸残基优选被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替换。鉴定不消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守取代的方法是本领域众所周知的(参见例如Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:412-417(1997))。
例如，可以根据下表进行保守取代。例如，第二列中相同框中的氨基酸和优选第三列中相同行中的氨基酸可彼此取代。
Figure BDA0003929883480000231
或者，在另一个实施方式中，可以沿着抗CD40抗体编码序列的全部或部分随机引入突变，例如通过饱和诱变，并且可以针对结合活性筛选所得的修饰的抗CD40抗体。
对于核酸，术语“基本同源”表示当最佳比对和比较时，两个核酸或其指定序列是相同的，其中在至少约80％的核苷酸、通常至少约90％至95％，更优选至少约98％至99.5％的核苷酸中具有适当的核苷酸插入或缺失。或者，当片段在选择性杂交条件下与链的互补序列杂交时，存在基本同源。
两个序列之间的同一性百分比是考虑到需要引入以实现两个序列的最佳比对的缺口的数量和每个缺口的长度，两个序列共有的相同位置的数量的函数(即％同源性＝相同位置的数量/位置总数×100)。序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的确定可以使用如下面的非限制性实例中所述的数学算法完成。
两个核苷酸序列之间的同一性百分比可以使用GCG软件包中的GAP程序(可从http://www.gcg.com获得)，使用NWSgapdna.CMP矩阵和40、50、60、70或80的缺口权重和1、2、3、4、5或6的长度权重来确定。两个核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分比也可以使用E.Meyers和W.Miller(CABIOS，4：11-17(1989))的算法使用PAM120权重残基表、缺口长度罚分为12、缺口罚分为4确定，该算法已并入ALIGN程序(版本2.0)。另外，可以使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))算法使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵、16、14、12、10、8、6或4的缺口权重、1、2、3、4、5或6的长度权重确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比，该算法已结合到GCG软件包中的GAP程序中(可在http://www.gcg.com获得)。
本发明的核酸和蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”以对公共数据库进行检索，以例如鉴定相关序列。可以使用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)进行这样的检索。可以用NBLAST程序、得分＝100、字长＝2进行BLAST核苷酸检索，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序、得分＝50、字长＝3进行BLAST蛋白质检索，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的加缺口的比对，可以如Altschul等人，(1997)Nucleic AcidsRes.25(17):3389-3402中所述使用Gapped BLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各个程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。
核酸可以存在于完整细胞中、细胞裂解物中，或为部分纯化或基本上纯的形式。当通过标准技术(包括碱/SDS处理，CsCl条带化，柱层析，琼脂糖凝胶电泳和本领域熟知的其它凝胶电泳)从其它细胞组分或其它污染物(例如其它细胞核酸或蛋白质)中纯化时，核酸被“分离”或“基本上纯化”。参见F.Ausubel,等人，ed.Current Protocols in MolecularBiology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York(1987)。
根据提供基因序列的标准技术，可以突变本发明的核酸组合物，尽管其通常为来自cDNA、基因组或其混合物的天然序列(除了修饰的限制性位点等)的形式。对于编码序列，这些突变可以根据需要影响氨基酸序列。具体而言，考虑了与天然V序列、D序列、J序列、恒定序列、转换序列和本文所述的其它此类序列基本上同源或衍生的DNA序列(其中“衍生的”表示序列与另一序列相同或从另一序列修饰而来)。
当核酸与另一核酸序列处于功能关系时，它是“可操作地连接的”。例如，如果启动子或增强子影响序列的转录，则启动子或增强子与编码序列可操作地连接。关于转录调节序列，可操作地连接是指连接的DNA序列是连续的，并且在必要时连接两个蛋白质编码区，它们是连续的并且在阅读框中。对于转换序列，可操作地连接表示序列能够影响转换重组。
如本文所用，术语“载体”意指能够转运已与其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指环状双链DNA环，其中可以连接另外的DNA区段。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体通常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明旨在包括其它形式的表达载体，例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，它们具有相同的功能。
如本文所用，术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)意指其中已引入重组表达载体的细胞。应当理解，这些术语不仅意指特定的主题细胞，而且意指这种细胞的后代。因为某些修饰可能由于突变或环境影响而在后代中发生，所以这些后代事实上可能与亲本细胞不同，但仍包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。
如本文所用，术语“抗原”是指任何天然或合成的免疫原性物质，例如蛋白质、肽或半抗原。适用于本发明的抗原(例如在与本发明的抗CD40抗体组合的疫苗中)包括例如感染性疾病抗原和肿瘤抗原(针对其的保护性或治疗性免疫应答是期望的)，例如由肿瘤细胞或病原生物或传染病抗原表达的抗原。例如，合适的抗原包括用于预防或治疗癌症的肿瘤相关抗原。肿瘤相关抗原的实例包括但不限于包含βhCG、gp100或Pmel17、HER2/neu、WT1、间皮素、CEA、gp100、MART1、TRP-2、黑色素-A、NY-ESO-1、NY-BR-1、NY-CO-58、MN(gp250)、独特型、MAGE-1、MAGE-3、MAGE-A3、酪氨酸酶、端粒酶、SSX2和MUC-1抗原和生殖细胞衍生的肿瘤抗原的全部或部分序列。肿瘤相关抗原还包括血型抗原，例如Lea、Leb、LeX、LeY、H-2、B-1、B-2抗原。或者，可以在本发明的抗原-抗体构建体中包括多于一种抗原。例如，MAGE抗原可以与其它抗原如黑色素A、酪氨酸酶和gp100以及佐剂如GM-CSF或IL-12组合，并与抗APC抗体连接。
其它合适的抗原包括用于预防或治疗病毒疾病的病毒抗原。病毒抗原的实例包括但不限于HIV-1gag、HIV-1env、HIV-1nef、HBV(表面或核心抗原)、HPV、FAS、HSV-1、HSV-2、p17、ORF2和ORF3抗原。细菌抗原的实例包括但不限于弓形虫(Toxoplasma gondii)或梅毒螺旋体(Treponema pallidum)。本发明的抗体-细菌抗原缀合物可用于治疗或预防各种细菌性疾病，例如炭疽，肉毒杆菌，破伤风，衣原体，霍乱，白喉，莱姆病，梅毒和结核病。在下面公开来自传染病病原体的其它合适的抗原，例如病毒，细菌，寄生虫和真菌。
前述抗原的序列是本领域众所周知的。例如，MAGE-3cDNA序列的实例提供于US 6,235,525(Ludwig Institute for Cancer Research)中；NY-ESO-1核酸和蛋白质序列的实例提供于US 5,804,381和US 6,069,233(Ludwig Institute for Cancer Research)中；黑色素-A核酸和蛋白质序列的实例提供于US 5,620,886和US 5,854,203(Ludwig Institutefor Cancer Research)中；NY-BR-1核酸和蛋白质序列的实例提供于US 6,774,226和US 6,911,529(Ludwig Institute for Cancer Research)中，NY-CO-58核酸和蛋白质序列的实例提供于WO 02090986(Ludwig Institute for Cancer Research)中；HER-2/neu蛋白的氨基酸序列的实例可从
Figure BDA0003929883480000261
登录号AAA58637获得；人癌胚抗原样1(CEA-1)的核苷酸序列(mRNA)可从
Figure BDA0003929883480000262
登录号NM_020219获得。
可用于本发明的组合物和方法的HPV抗原可包括例如HPV-16抗原，HPV-18抗原，HPV-31抗原，HPV-33抗原和/或HPV-35抗原；并且合适地是HPV-16抗原和/或HPV-18抗原。HPV-16的基因组描述于Virology，145：181-185(1985)中，编码HPV-18的DNA序列描述于美国专利号5,840,306中，其公开内容通过引用整体并入本文。HPV-16抗原(例如HPV-16的E1和/或E2蛋白的血清反应区域)描述于美国专利号6,531,127且HPV-18抗原(例如HPV-18的L1和/或L2蛋白的血清反应区域)描述于美国专利号5,840,306中，其公开内容通过引用并入本文。类似地，HBV的完整基因组可从GENBANK登录号NC_003977获得，其公开内容并入本文。HCV的基因组描述于欧洲专利申请号318 216中，其公开内容并入本文。通过引用并入本文的PCT/US90/01348公开了HCV基因组的克隆的序列信息，HCV病毒蛋白的氨基酸序列以及制备和使用这种组合物用于HCV疫苗的方法，所述HCV疫苗包含HCV蛋白和由其衍生的肽。
可以用本领域众所周知的各种方式鉴定蛋白质的抗原肽(即含有T细胞表位的抗原肽)。例如，可以通过使用基于网络的预测算法(BIMAS和SYFPEITHI)分析蛋白质的序列来预测T细胞表位，以产生与10000个充分表征的以前由CTL定义的MHC结合肽的内部数据库匹配的潜在MHC I类和II结合肽。基于对给定MHC分子的高亲和力，可以对高评分肽进行分级和选择为“感兴趣的”。
鉴定含有T细胞表位的抗原肽的另一种方法是将蛋白质分成所需长度的非重叠肽或所需长度的重叠肽，这些肽可通过蛋白质的重组、合成或在某些有限的情况下化学切割产生并测试免疫原性，例如引发T细胞应答(即增殖或淋巴因子分泌)。
为了如通过T细胞生物学技术所确定的通过例如精细作图技术确定蛋白质的精确T细胞表位，可以通过在肽的氨基或羧基末端添加或者缺失氨基酸残基来修饰具有T细胞刺激活性并因此包含至少一个T细胞表位的肽并测试以确定T细胞对该修饰肽的反应性的变化。如果发现天然蛋白质序列中具有重叠区域的两种或更多种肽具有如通过T细胞生物学技术所确定的人T细胞刺激活性，可以产生包含全部或部分此类肽的另外的肽和可以通过类似的方法测试这些另外的肽。按照该技术，选择肽并重组或合成产生。基于各种因素选择肽，包括T细胞对肽的应答强度(例如刺激指数)。然后可以检查这些所选肽的物理和化学性质(例如溶解度、稳定性)以确定肽是否适合用于治疗组合物或肽是否需要修饰。
术语“抗原呈递细胞”或“APC”是在其表面上展示与MHC复合的外来抗原的细胞。T细胞使用T细胞受体(TCR)识别该复合物。APC的实例包括但不限于树突细胞(DC)，外周血单核细胞(PBMC)，单核细胞(例如THP-1)，B淋巴母细胞样细胞(例如C1R.A2、1518B-LCL)和单核细胞衍生的树突细胞(DC)。一些APC通过吞噬作用或受体介导的内吞作用使抗原内化。APC受体的实例包括但不限于C型凝集素，例如人树突细胞和上皮细胞205受体(DEC-205)，和人巨噬细胞甘露糖受体。
术语“抗原呈递”是指APC捕获抗原并使其能够被T细胞识别的过程，例如，作为MHC-I和/或MHC-II缀合物的组分。
“MHC分子”包括两种类型的分子，MHC I类和MHC II类。MHC I类分子将抗原呈递给特异性CD8+T细胞，MHC II类分子将抗原呈递给特异性CD4+T细胞。外源性递送至APC的抗原主要用于与MHC II类结合。相反，内源性递送至APC的抗原主要用于与MHC I类结合。
如本文所用，术语“免疫刺激剂”包括但不限于能够刺激APC例如DC和巨噬细胞的化合物。例如，用于本发明的合适的免疫刺激剂能够刺激APC，从而加速APC的成熟过程，增加APC的增殖，和/或募集或释放共刺激分子(例如CD80，CD86，ICAM-1，MHC分子和CCR7)和上调促炎细胞因子(例如IL-1β，IL-6，IL-12，IL-15和IFN-γ)。合适的免疫刺激剂也能够增加T细胞增殖。这些免疫刺激剂包括但不限于CD27配体；FLT 3配体；细胞因子，如IFN-α，IFN-β，IFN-γ和IL-2；集落刺激因子，如G-CSF(粒细胞集落刺激因子)和GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)；抗CTLA-4抗体，抗PD1抗体，抗41BB抗体或抗OX-40抗体；LPS(内毒素)；单链RNA；双链RNA；卡介苗(BCG)；左旋咪唑盐酸盐；和静脉注射免疫球蛋白。在一个实施方式中，免疫刺激剂可以是Toll样受体(TLR)激动剂。例如，免疫刺激剂可以是TLR3激动剂，例如双链肌苷：胞嘧啶多核苷酸(例如来自Hemispherx Bipharma，PA，US的作为AmpligenTM的Poly I:C或来自Oncovir的Poly IC:LC)或Poly A:U；TLR4激动剂，例如单磷酰脂质A(MPL)或RC-529(例如可从GSK，UK获得)；TLR5激动剂，如鞭毛蛋白；TLR7或TLR8激动剂，例如咪唑喹啉TLR7或TLR8激动剂，例如咪喹莫特(例如AldaraTM)或瑞喹莫特和相关的咪唑喹啉剂(例如可从3M Corporation获得)；或TLR9激动剂，例如具有未甲基化的CpG基序的脱氧核苷酸(所谓的“CpG”，例如可从Coley Pharmaceutical获得)。优选的免疫刺激剂是TLR3激动剂，优选Poly I:C。这些免疫刺激剂可以与本发明的抗体和构建体同时地、分开地或顺序地施用，也可以与抗体和构建体物理连接。
如本文所用，术语“连接”是指两个或更多个分子的缔合。连接可以是共价的或非共价的。连接也可以是遗传的(即重组融合的)。这种连接可以使用多种本领域公认的技术实现，例如化学缀合和重组蛋白质生产。
如本文所用，术语抗原“交叉呈递”是指外源蛋白抗原通过APC上的MHC I类和II类分子呈递给T细胞。
如本文所用，术语“T细胞介导的应答”是指由T细胞包括效应T细胞(例如CD8+细胞)和辅助T细胞(例如CD4+细胞)介导的任何应答。T细胞介导的应答包括例如T细胞的细胞毒性和增殖。
如本文所用，术语“细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答”是指由细胞毒性T细胞诱导的免疫应答。CTL应答主要由CD8+T细胞介导。
如本文所用，术语“抑制”或“阻断”(例如意指CD40L与细胞上CD40的结合的抑制/阻断)可互换使用，并包括部分和完全抑制/阻断。CD40L的抑制/阻断优选降低或改变当CD40L结合发生而没有抑制或阻断时发生的正常活性水平或正常活性类型。与不与抗CD40抗体接触的CD40L相比，抑制和阻断还意图包括与抗CD40抗体接触时CD40L的结合亲和力的任何可测量的降低，例如抑制至少约10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的CD40L的结合。在具体实施方式中，例如通过BLI或SPR(Biacore)测定所测量，抗CD40抗体抑制至少约70％的CD40L的结合。在另一实施方式中，抗CD40抗体抑制至少约80％的CD40L的结合。
如本文所用，术语“抑制生长”(例如意指细胞)旨在包括细胞生长的任何可测量的减少，例如抑制至少约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，99％或100％的细胞生长。
术语“诱导免疫应答”、“增加免疫应答”和“增强免疫应答”可互换使用，并且指免疫应答(即被动或适应性)对特定抗原的刺激。
关于诱导CDC或ADCC使用的术语“诱导”和“增加”是指刺激特定的直接细胞杀伤机制。例如，在一个实施方式中，抗体以10μg/ml的浓度通过CD40表达细胞的CDC诱导至少约20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％或60％的裂解。在优选实施方式中，抗体以10μg/ml的浓度通过CD40表达细胞的CDC诱导至少约40％的裂解。在另一实施方式中，抗体以10μg/ml的浓度通过CD40表达细胞的ADCC诱导至少约20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％或85％的裂解。在一个实施方式中，抗体以10μg/ml的浓度通过CD40表达细胞的ADCC诱导至少约40％的裂解。
本文所用的术语“治疗”是指本文所述的治疗或预防措施。“治疗”方法对需要这种治疗的受试者例如需要针对特定抗原的增强的免疫应答的受试者或最终可能获得这种疾病的受试者施用本发明的人抗体，以预防、治愈、延迟、减轻或改善疾病或复发性疾病的一种或多种症状，或以延长受试者的超过在没有这种治疗的情况下存活。
术语“有效剂量”定义为足以达到或至少部分达到所需效果的量。术语“治疗有效剂量”定义为足以在已经患有该疾病的患者中治愈或至少部分地阻止疾病及其并发症的量。对此用途有效的量取决于所治疗疾病的严重程度和患者自身免疫系统的一般状态。
如本文所用，术语“协同”意指当组合使用时两种药物的施用产生比通过添加两种组分的单独效果所预期的更大的效果，例如比添加两种成分的单独效果所预期的大于两倍、大于三倍、大于五倍或十倍以上的效果。例如，可以使用基于Chou和Talalay的中值效应模型的商业软件包Calcusyn分析药物相互作用(Chou,T.C.&Talalay,P.(1984)Adv.EnzymeRegul.22,27-55.Quantatative analysis of dose-effect relationships:thecombined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors)。组合指数(C.I.)为1表示加性药物相互作用，而C.I.大于1是拮抗性的，而得分低于1是协同的。CI值定义如下：1.45-1.2是中度拮抗性的，1.2-1.1是轻微拮抗性的，1.1-0.9是加性的，0.9-0.85是轻微协同的，0.85-0.7是中度协同的，而0.7-0.3是协同的。
术语“患者”包括接受预防性或治疗性治疗的人和其它哺乳动物受试者。
如本文所用，术语“受试者”包括任何人或非人动物。例如，本发明的方法和组合物可用于治疗患有免疫疾病的受试者。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类动物，绵羊，狗，牛，鸡，两栖动物，爬行动物等。
在以下小节中更详细地描述了本发明的各个方面。
I.产生针对CD40的抗体
本发明的抗CD40抗体可使用多种已知技术产生，例如Kohler和Milstein,Nature256:495(1975)描述的标准体细胞杂交技术。尽管可以使用体细胞杂交方法，但原则上也可以使用其它生产单克隆抗体的技术，例如B淋巴细胞的病毒或致癌转化，使用人抗体基因文库的噬菌体展示技术。
在具体(示例性)实施方式中，用合适的抗原免疫小鼠(例如
Figure BDA0003929883480000311
转基因小鼠的H2L2株)或其它合适的宿主动物，以引发产生或能够产生将特异性结合用于免疫的抗原的抗体的淋巴细胞。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。然后可以使用合适的融合剂(例如聚乙二醇)将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞(Goding,MonoclonalAntibodies:Principles and Practice,pp.59-103(Academic Press,1986))。测定杂交瘤细胞在其中生长的培养基以产生针对抗原的单克隆抗体。在鉴定产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可通过有限稀释程序将克隆进行亚克隆并通过标准方法进行培养(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103(Academic Press,1986))。用于此目的的合适培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可以在体内作为动物的腹水肿瘤生长。亚克隆分泌的单克隆抗体可通过常规免疫球蛋白纯化方法从培养基、腹水或血清中分离，例如蛋白A-Sepharose，羟基磷灰石层析，凝胶电泳，透析或亲和层析。
在另一实施方式中，使用携带部分人免疫系统而不是小鼠系统的转基因或转染色体小鼠产生针对CD40的抗体。在一个实施方式中，本发明使用转基因小鼠，在本文中称为“HuMAb小鼠”，其含有编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因迷你基因座，以及使内源μ和κ链基因座失活的靶向突变(Lonberg,N.等人(1994)Nature 368(6474):856-859)。因此，小鼠展现出小鼠IgM或κ表达下降，并且响应于免疫，所引入的人重链和轻链转基因经历类转换和体细胞突变，以生成高亲和力人IgGκ单克隆抗体(Lonberg,N.等人(1994)，同上；综述于Lonberg,N.(1994)Handbook of ExperimentalPharmacology 113:49-101；Lonberg,N.和Huszar,D.(1995)Intern.Rev.Immunol.Vol.13:65-93,和Harding,F.和Lonberg,N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci764:536-546)。HuMAn小鼠的制备详见下文第II节和在Taylor,L.等人(1992)Nucleic Acids Research 20:6287-6295；Chen,J.等人(1993)International Immunology 5:647-656；Tuaillon等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA90:3720-3724；Choi等人(1993)Nature Genetics 4:117-123；Chen,J.等人(1993)EMBO J.12:821-830；Tuaillon等人(1994)J.Immunol.152:2912-2920；Lonberg等人，(1994)Nature 368(6474):856-859；Lonberg,N.(1994)Handbook ofExperimental Pharmacology 113:49-101；Taylor,L.等人(1994)InternationalImmunology 6:579-591；Lonberg,N.和Huszar,D.(1995)Intern.Rev.Immunol.Vol.13:65-93；Harding,F.和Lonberg,N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci 764:536-546；Fishwild,D.等人(1996)Nature Biotechnology 14:845-851中。进一步参见均为Lonberg和Kay和GenPharmInternational的美国专利号5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；和5,770,429；Surani等人的美国专利号5,545,807；公开于1998年6月11日的国际公开号WO 98/24884；公开于1994年11月10日的WO94/25585；公开于1993年6月24日的WO 93/1227；公开于1992年12月23日的WO 92/22645；公开于1992年3月19日的WO 92/03918。
在另一实施方式中，可以从使用以下文献中描述的技术产生的抗体噬菌体文库中分离结合人CD40的抗体，例如，McCafferty等人，Nature,348:552-554(1990)，Clackson等人，Nature,352:624-628(1991)、Marks等人，J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)和Hoet等人(2005)Nature Biotechnology 23,344-348；Ladner等人的美国专利号5,223,409；5,403,484；和5,571,698；Dower等人的美国专利号5,427,908和5,580,717；McCafferty等人的美国专利号5,969,108和6,172,197；和Griffiths等人的美国专利号5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915和6,593,081。另外，也可使用通过链改组产生高亲和力(nM范围)人抗体(Marks等人，Bio/Technology,10:779-783(1992))，以及组合感染和体内重组作为构建大噬菌体文库(Waterhouse等人，Nuc.Acids.Res.,21:2265-2266(1993))的策略。
在具体实施方式中，使用Hoet等人同上所述的噬菌体展示技术产生结合人CD40的抗体。该技术涉及产生人Fab文库，其具有从人供体分离的免疫球蛋白序列的独特组合，并且在重链CDR中产生合成多样性。然后筛选文库中与人CD40结合的Fab。
用于产生能产生本发明抗体的杂交瘤的优选动物系统是鼠系统。小鼠中杂交瘤的产生是本领域众所周知的，包括免疫方案和分离和融合免疫脾细胞的技术。
产生CD40单克隆抗体的转染瘤的产生
本发明的抗体也可以在宿主细胞转染瘤中产生，例如，使用本领域众所周知的重组DNA技术和基因转染方法的组合(Morrison,S.(1985)Science229:1202)。
例如，在一个实施方式中，可以将目的基因(例如人抗体基因)连接到表达载体中，例如真核表达质粒，例如WO 87/04462，WO 89/01036和EP 338 841中公开的GS基因表达系统或本领域众所周知的其它表达系统。具有克隆抗体基因的纯化质粒可以引入真核宿主细胞如CHO-细胞或NSO-细胞，或者可选地引入其它真核细胞如植物来源的细胞、真菌或酵母细胞。用于引入这些基因的方法可以是本领域描述的方法，例如电穿孔、脂质体、脂质体转染或其它。在宿主细胞中引入这些抗体基因后，可以鉴定和选择表达抗体的细胞。这些细胞代表转染瘤，然后能够放大它们的表达水平并扩大规模以产生抗体。可以从这些培养物上清液和/或细胞中分离和纯化重组抗体。
或者，这些克隆的抗体基因可以在其它表达系统例如大肠杆菌中或在完整生物中表达，或者可以合成表达。
使用部分抗体序列表达完整抗体
抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。因此，CDR内的氨基酸序列在个体抗体之间比CDR之外的序列更加多样化。因为CDR序列负责大多数抗体-抗原相互作用，所以可以通过构建表达载体来表达模拟特定天然存在抗体的性质的重组抗体，所述表达载体包括来自特异性天然存在的抗体的CDR序列，所述抗体移植到具有不同性质的来自不同抗体的框架序列上(参见例如Riechmann,L.等人，1998,Nature332:323-327；Jones,P.等人，1986,Nature 321:522-525；和Queen,C.等人，1989,Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.86:10029-10033)。此类框架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库获得。这些种系序列将不同于成熟抗体基因序列，因为它们不包括完全组装的可变基因，其在B细胞成熟期间通过V(D)J连接形成。种系基因序列也将与高亲和力次级库抗体的序列在可变区上个体均匀地不同。例如，体细胞突变在框架区的氨基末端部分相对不常见。例如，体细胞突变在框架区1的氨基末端部分和框架区4的羧基末端部分中相对不常见。此外，许多体细胞突变不会显著改变抗体的结合特性。由于这个原因，没有必要获得特定抗体的完整DNA序列以重建具有与原始抗体相似的结合特性的完整重组抗体(参见于1999年3月12日递交的PCT/US99/05535)。跨越CDR区的部分重链和轻链序列通常足以用于此目的。该部分序列用于确定哪个种系变量和连接基因区段对重组抗体可变基因有贡献。然后使用种系序列填充可变区的缺失部分。重链和轻链前导序列在蛋白质成熟过程中被切割，并且对最终抗体的性质没有贡献。为了添加缺失的序列，可以通过连接或PCR扩增将克隆的cDNA序列与合成的寡核苷酸组合。或者，整个可变区可以合成为一组短的、重叠的寡核苷酸，并通过PCR扩增组合以产生完全合成的可变区克隆。该方法具有某些优点，例如消除或包含或特定限制性位点，或特定密码子的优化。
来自杂交瘤的重链和轻链转录物的核苷酸序列用于设计重叠的合成寡核苷酸组，以产生具有与天然序列相同的氨基酸编码能力的合成V序列。合成的重链和κ链序列可以通过三种方式与天然序列不同：中断重复核苷酸碱基串以促进寡核苷酸合成和PCR扩增；根据Kozak的规则引入最佳翻译起始位点(Kozak,1991,J.Biol.Chem.266:19867-19870)；以及在翻译起始位点的上游设计HindIII位点。
对于重链和轻链可变区，优化的编码和相应的非编码链序列被分解成大约相应的非编码寡核苷酸的中点的30-50个核苷酸。因此，对于每条链，寡核苷酸可以组装成重叠的双链组，其跨越150-400个核苷酸的区段。然后将库用作模板以产生150-400个核苷酸的PCR扩增产物。通常，将单个可变区寡核苷酸组分解成两个库，其分别扩增以产生两个重叠的PCR产物。然后通过PCR扩增组合这些重叠产物以形成完整的可变区。还可能需要在PCR扩增中包括重链或轻链恒定区的重叠片段(包括κ轻链的BbsI位点，或者如果是γ重链，则为AgeI位点)以产生易于克隆到表达载体构建体中的片段。
然后将重构的重链和轻链可变区与克隆的启动子，前导序列，翻译起始，前导序列，恒定区，3'非翻译，多腺苷酸化和转录终止序列组合以形成表达载体构建体。重链和轻链表达构建体可以组合成单一载体，共转染，顺序转染或分开转染到宿主细胞中，然后融合宿主细胞以形成表达两条链的宿主细胞。
构建用于构建表达载体的质粒，使得PCR扩增的V重链和Vκ轻链cDNA序列可用于重建完整的重链和轻链小基因。这些质粒可用于表达完全人IgG1κ或IgG4κ抗体。本发明的完全人和嵌合抗体还包括IgG2，IgG3，IgE，IgA，IgM和IgD抗体。可以构建类似的质粒用于表达其它重链同种型，或用于表达包含λ轻链的抗体。
因此，在本发明的另一方面，本发明的抗CD40抗体的结构特征用于产生结构上相关的抗CD40抗体，其保留本发明抗体的至少一种功能特性，例如，
(a)诱导或增强对抗原的免疫应答，而不依赖于Fc受体结合；
(b)诱导或增强对抗原的免疫应答，而不诱导CD40表达细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)；
(c)诱导或增强对抗原的免疫应答，而不诱导CD40表达细胞的补体依赖性细胞毒性(CDC)；和/或
(d)能够与CD40L协同作用；和/或
其它特征可包括，例如：
(d)没有抑制或没有阻断CD40L的结合；
(e)抑制或阻断CD40L的结合；
(f)抑制或阻断CD40L与人CD40的结合，而不依赖于Fc受体结合；
(g)诱导或增强肿瘤细胞的细胞凋亡；
(h)诱导或增强细胞的T细胞刺激活性(例如增加IL-12p40的表达所测量的)；和/或
(i)诱导或增强B细胞激活(例如增加选自由HLA-DR V450、CD54 PE、CD86 APC和CD83 BV510、CD19 V500、CD54 PE、HLA-DR V450、CD23PerCP-Cy5.5、CD69 APC、CD86 APC、CD38 PerCP-Cy5.5和CD71 PE组成的组中的至少一种细胞表面标志物的表达所测量的)。
在一个实施方式中，本发明的抗体的一个或多个CDR区可以与已知的框架区和CDR重组组合，以产生本发明的另外的重组改造的抗CD40抗体。重链和轻链可变框架区可以衍生自相同或不同的抗体序列。抗体序列可以是天然存在的抗体的序列，或者可以是几种抗体的共有序列。参见Kettleborough等人，Protein Engineering 4:773(1991)；Kolbinger等人，Protein Engineering 6:971(1993)和Carter等人，WO 92/22653。
因此，在另一实施方式中，本发明提供了用于制备抗CD40抗体的方法，其包括：制备抗体，所述抗体包括(1)重链框架区和重链CDR，其中重链CDR中的至少一个包括选自SEQID NO：5,6,7,8,9,10,19,20,21,22,23,24,33,34,35,36,37,38,47,48,49,51,52,61,62,63,64,65,66,75,76,77,78,79,80,89,90,91,92,93,94,103,104,105,106,107,108中所示的CDR的氨基酸序列；和(2)轻链框架区和轻链CDR，其中轻链CDR中的至少一个包括选自SEQID NO：11,12,13,14,15,16,25,26,27,28,29,30,39,40,41,42,43,44,53,54,55,56,57,58,67,68,69,70,71,72,81,82,83,84,85,86,95,96,97,98,99,100,109,110,111,112,113,114中所示的CDR的氨基酸序列；其中抗体保留结合CD40的能力。抗体结合CD40的能力可以使用标准结合测定来确定，例如实施例中所述的那些(例如ELISA或FLISA)。
本领域众所周知，抗体重链和轻链CDR3结构域在抗体对抗原的结合特异性/亲和力中起特别重要的作用(参见Hall等人，J.Imunol.,149:1605-1612(1992)；Polymenis等人，J.Immunol.,152:5318-5329(1994)；Jahn等人，Immunobiol.,193:400-419(1995)；Klimka等人，Brit.J.Cancer,83:252-260(2000)；Beiboer等人，J.Mol.Biol,296:833-849(2000)；Rader等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:8910-8915(1998)；Barbas等人，J.Am.Chem.Soc.,116:2161-2162(1994)；Ditzel等人，J.Immunol.,157:739-749(1996))。因此，如上所述制备的本发明的重组抗体优选包含抗体3C3、3G5、1B4、3B6、6H6、2E1.2、1B5-NK和3B6-NS的重链和/或轻链CDR3。抗体进一步可包含抗体3C3、3G5、1B4、3B6、6H6、2E1.2、1B5-NK和3B6-NS的CDR2。抗体进一步可包含抗体3C3、3G5、1B4、3B6、6H6、2E1.2、1B5-NK和3B6-NS的CDR1。抗体可进一步包含CDR的任何组合。
因此，在另一实施方式中，本发明进一步提供了抗CD40抗体，其包含：(1)重链框架区、重链CDR1区、重链CDR2区和重链CDR3区，其中重链CDR3区选自3C3、3G5、1B4、3B6、6H6、2E1.2、1B5-NK或3B6-NS的CDR3；和(2)轻链框架区、轻链CDR1区、轻链CDR2区和轻链CDR3区，其中轻链CDR3区选自3C3、3G5、1B4、3B6、6H6、2E1.2、1B5-NK或3B6-NS的CDR3，其中抗体结合CD40。抗体可进一步包括3C3、3G5、1B4、3B6、6H6、2E1.2、1B5-NK或3B6-NS的重链CDR2和/或轻链CDR2。抗体可进一步包含3C3、3G5、1B4、3B6、6H6、2E1.2、1B5-NK或3B6-NS的重链CDR1和/或轻链CDR1。
产生具有修饰序列的抗体
在另一实施方式中，修饰本发明的抗CD40抗体的可变区序列或其部分以产生结构上相关的抗CD40抗体，其保持结合(即与未修饰的抗体相同的表位结合)并因此在功能上等同。用于鉴定可以在不去除抗原结合的情况下改变的残基的方法是本领域众所周知的(参见例如Marks等人(Biotechnology(1992)10(7):779-83(monoclonal antibodiesdiversification by shuffling light chain variable regions,then heavy chainvariable regions with fixed CDR3 sequence changes)；Jespers等人(1994)Biotechnology 12(9):899-903(selection of human antibodies from phage displayrepertoires to a single epitope of an antigen)；Sharon等人(1986)PNAS USA 83(8):2628-31(site-directed mutagenesis of an invariant amino acid residue atthe variable-diversity segments junction of an antibody)；Casson等人(1995)J.Immunol.155(12):5647-54(evolution of loss and change of specificityresulting from random mutagenesis of an antibody heavy chain variableregion)。
因此，在本发明的一个方面，上述改造的抗体的CDR1、2和/或3区域可以包含与本文公开的抗体3C3、3G5、1B4、3B6、6H6、2E1.2、1B5-NK或3B6-NS的氨基酸序列完全相同的氨基酸序列。然而，在本发明的其它方面，抗体包含来自3C3、3G5、1B4、3B6、6H6、2E1.2、1B5-NK或3B6-NS的确切CDR序列的衍生物，但仍保留有效结合CD40的能力。此类序列修饰可包括一个或多个氨基酸添加、缺失或取代，例如，如上所述的保守序列修饰。序列修饰还可以基于上文针对抗体3C3、3G5、1B4、3B6、6H6、2E1.2、1B5-NK或3B6-NS的特定CDR1、CDR2和CDR3序列描述的共有序列。
因此，在另一个实施方式中，改造的抗体可以由一个或多个CDR组成，所述CDR例如与抗体3C3、3G5、1B4、3B6、6H6、2E1.2、1B5-NK或3B6-NS的一个或多个CDR具有90％、95％、98％或99.5％的同一性。上述值中间的范围，例如与一种或多种上述序列具有90-95％、95-98％或98-100％相同同一性的CDR也包括在本发明的范围内。
在另一实施方式中，可以改变CDR的一个或多个残基以修饰结合以实现更有利的结合速率的结合、更有利的解离速率的结合或两者，从而实现理想化的结合常数。使用该策略，可以实现具有例如1010M-1或更高的超高结合亲和力的抗体。本领域熟知的亲和力成熟技术和本文所述的那些可用于改变CDR区，然后筛选所得结合分子以获得所需的结合变化。因此，随着CDR的改变，可以监测结合亲和力以及免疫原性的变化并对其进行评分，从而实现针对最佳组合结合和低免疫原性而优化的抗体。
除了CDR内的修饰之外或代替修饰，还可以在抗体的重链和/或轻链可变区的一个或多个框架区FR1、FR2、FR3和FR4内进行修饰，只要这些修饰不消除抗体的结合亲和力。例如，本发明抗体的重链和/或轻链可变区的框架区中的一个或多个非种系氨基酸残基被种系氨基酸残基取代，即在重链或轻链可变区的人种系序列中与其具有显著的序列同一性的相应氨基酸残基。例如，可以将抗体链与种系抗体链进行比对，其与抗体框架序列和种系链框架之间不匹配的氨基酸残基可以用种系序列中的相应残基取代。当抗体可变框架区和等同的人种系序列可变框架区之间的氨基酸不同时，如果合理地预期氨基酸属于以下类别的一个氨基酸，则抗体框架氨基酸通常应当被等同的人种系序列氨基酸取代：
(1)直接非共价结合抗原的氨基酸残基，
(2)与CDR区相邻的氨基酸残基，
(3)以其它方式与CDR区相互作用的氨基酸残基(例如通过计算机模拟确定在CDR区的约
Figure BDA0003929883480000391
之内)，或
(4)参与VL-VH界面的氨基酸残基。
“直接非共价结合抗原”的残基包括框架区中位置上的氨基酸，其具有根据已建立的化学力例如通过氢键、范德华力、疏水相互作用等等直接与抗原上的氨基酸相互作用的可能性。因此，在一个实施方式中，本发明抗体框架区的氨基酸残基被相应的种系氨基酸残基取代，该氨基酸残基直接非共价结合抗原。
“与CDR区域相邻”的残基包括在与抗体的一级序列中的一个或多个CDR紧邻的位置上的氨基酸残基，例如，在与入Kabat定义的CDR、或者如Chothia所定义的CDR(参见例如Chothia and Lesk J.Mol.Biol.196:901(1987))紧邻的位置。因此，在一个实施方式中，本发明抗体框架区内的氨基酸残基被相应的种系氨基酸残基取代，该氨基酸残基与CDR区域相邻。
“以其它方式与CDR区域相互作用”的残基包括通过二级结构分析确定的足以影响CDR区的空间方向的残基。这些氨基酸通常具有在CDR中的一些原子的约3埃单位
Figure BDA0003929883480000392
内的侧链原子，并且必须含有可以根据已建立的化学力(例如上面列出的那些)与CDR原子相互作用的原子。因此，在一个实施方式中，本发明抗体框架区内的氨基酸残基被相应的种系氨基酸残基取代，该氨基酸残基以其它方式与CDR区域相互作用。
已知框架中几个位置的氨基酸对于确定许多抗体中的CDR确认(例如能够与CDR相互作用)是重要的(Chothia and Lesk,同上,Chothia等人，同上和Tramontano等人，J.Mol.Biol.215:175(1990)，所有这些文献都通过引用并入本文)。这些作者通过分析几种已知抗体的结构鉴定了对CDR构象重要的保守框架残基。基于CDR的构象，分析的抗体落入有限数量的结构或“规范”类别中。规范类别成员中的保守框架残基称为“规范”残基。典型残基包括轻链的残基2、25、29、30、33、48、64、71、90、94和95以及重链的残基24、26、29、34、54、55、71和94。可以根据Martin and Thorton(1996)J.Mol.Biol.263:800的方法鉴定另外的残基(例如CDR结构-决定残基)。值得注意的是，已知轻链的位置2、48、64和71以及重链的位置26-30、71和94(根据Kabat编号)的氨基酸能够与许多抗体中的CDR相互作用。轻链中位置35和重链中位置93和103的氨基酸也可能与CDR相互作用。可以根据Foote and Winter(1992)J.Mol.Biol.224:487的方法鉴定可影响CDR构象的另外的残基。此类残基被称为“游标”残基，并且是框架区域中与CDR紧密相邻(即在CDR之下形成“平台”)的那些残基。
“参与VL-VH界面”或“包装残基”的残基包括如Novotny and Haber,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:4592-66(1985)或Chothia等人，同上所定义的VL和VH之间界面处的那些残基。
偶尔，关于特定氨基酸是否属于上述类别中的一个或多个，存在一些模糊性。在这种情况下，产生了替代变体抗体，其中一种具有该特定的取代，另一种则不具有该特定的取代。如此产生的替代变体抗体可以在本文所述的任何测定中测试所需活性，并选择优选的抗体。
框架区内的其它替代候选物是在该位置对抗体不常见或“罕见”的氨基酸。这些氨基酸可以用来自人种系序列的等同位置或更典型的抗体的等同位置的氨基酸取代。例如，当抗体的框架区中的氨基酸对于该位置是罕见的并且种系序列中的相应氨基酸对于免疫球蛋白序列中的该位置是共同的时候；或者当抗体中的氨基酸对于该位置是罕见的并且种系序列中相应的氨基酸相对于其它序列也是罕见的时候，取代可能是期望的。考虑了通过用种系序列中的恰好对于抗体是典型的氨基酸替换不常见的氨基酸，可以使抗体免疫原性降低。例如在未配对的半胱氨酸残基或推定的N-连接糖基化位点的情况下，取代可能是期望的。
如本文所用的术语“罕见”表示在该位置处出现的氨基酸小于约20％、优选小于约10％、更优选小于约5％、甚至更优选小于约3％、甚至更优选小于约2％、甚至更优选小于约1％的序列的代表性样品中的序列，并且如本文所用的术语“常见”表示出现的氨基酸超过约25％但通常超过约50％的代表性样品中的序列。例如，所有轻链和重链可变区序列分别被分组为序列的“亚组”，其彼此特别同源并且在某些关键位置具有相同的氨基酸(Kabat等人，同上)。当确定抗体序列中的氨基酸在序列中是“罕见”还是“常见”时，通常优选仅考虑与抗体序列在同一亚组中的那些序列。
通常，抗体的框架区通常基本上相同，并且更通常地，与它们来源的人种系序列的框架区相同。当然，框架区中的许多氨基酸对抗体的特异性或亲和力几乎没有或没有直接贡献。因此，可以忍受框架残基的许多个体保守取代而不明显改变所得免疫球蛋白的特异性或亲和力。因此，在一个实施方式中，抗体的可变框架区与人种系可变框架区序列或此类序列的共有序列具有至少85％的序列同一性。在另一实施方式中，抗体的可变框架区与人种系可变框架区序列或此类序列的共有序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
除了简单地结合CD40之外，可以选择抗体以保留本发明抗体的其它功能特性，例如：
(a)诱导或增强对抗原的免疫应答，而不依赖于Fc受体结合；
(b)诱导或增强对抗原的免疫应答，而不诱导CD40表达细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)；
(c)诱导或增强对抗原的免疫应答，而不诱导CD40表达细胞的补体依赖性细胞毒性(CDC)；和/或
(d)能够与CD40L协同作用。
其它特征可包括，例如：
(e)不阻断CD40L与人CD40的结合，而不依赖于Fc受体结合；
(f)阻断CD40L与人CD40的结合，而不依赖于Fc受体结合；
(g)激活APC上表达的人CD40，而不依赖于Fc受体结合；
(h)诱导肿瘤细胞的凋亡；
(i)T细胞刺激活性；和/或
(j)增强的B细胞激活。
CD40单克隆抗体的表征
可以使用多种已知技术表征本发明的单克隆抗体与CD40的结合。通常，最初通过ELISA表征抗体。简而言之，可以用PBS中的纯化CD40包被微量滴定板，然后用无关蛋白例如用PBS稀释的牛血清白蛋白(BSA)封闭。将来自CD40免疫小鼠的血浆稀释液加入每个孔中，并在37℃温育1-2小时。用PBS/吐温20 洗涤平板，然后与缀合碱性磷酸酶的山羊抗人IgGFc特异性多克隆试剂在37℃温育1小时。洗涤后，用ABTS底物使平板显影，并在OD405进行分析。优选地，显示出最高效价的小鼠将用于融合。
如上所述的ELISA测定可用于筛选抗体，并因此筛选产生与CD40免疫原显示出阳性反应性的抗体的杂交瘤。然后可以亚克隆并进一步表征与CD40结合，优选以高亲和力结合的杂交瘤。然后可以选择来自每个杂交瘤的一个克隆，其保留亲本细胞的反应性(通过ELISA)，以制备细胞库，并用于抗体纯化。
为了纯化抗CD40抗体，可以在滚瓶、2升旋转瓶或其它培养系统中培养选择的杂交瘤。可以过滤和浓缩上清液，然后用蛋白质A-Sepharose(Pharmacia，Piscataway，NJ)进行亲和层析，以纯化蛋白质。在缓冲液交换成PBS后，可以通过OD280使用1.43消光系数或优选通过比浊法分析来确定浓度。可以通过凝胶电泳和抗原特异性方法确认(check)IgG。
为了确定所选择的抗CD40单克隆抗体是否与独特表位结合，可以使用市售试剂(Pierce，Rockford，IL)将每种抗体生物素化。可以用链霉抗生物素蛋白标记的探针检测生物素化的MAb结合。为了确定纯化抗体的同种型，可以使用本领域认可的技术进行同种型ELISA。例如，可以在4℃用10μg/ml的抗Ig过夜包被微量滴定板的孔。用5％BSA封闭后，使板与10μg/ml单克隆抗体或纯化的同种型对照在环境温度反应2小时。然后可以使孔与IgG1或其它同种型特异性缀合的探针反应。如上所述使平板显影和分析平板。
为了测试单克隆抗体与表达CD40的活细胞的结合，可以使用流式细胞术。简言之，将表达膜结合的CD40(在标准生长条件下生长)的细胞系和/或人PBMC与各种浓度溶于含有0.1％BSA的PBS中的单克隆抗体在4℃混合1小时。洗涤后，在与一抗染色相同的条件下使细胞与荧光素标记的抗IgG抗体反应。可以通过FACScan仪器使用光和侧向散射特性分析样品以在单个细胞上进行门控并确定标记抗体的结合。可以使用荧光显微术的替代测定(除了或代替)流式细胞术测定。可以如上所述精确染色细胞并通过荧光显微镜检查。该方法允许单个细胞的可视化，但是根据抗原的密度可能具有降低的灵敏度。
可通过蛋白质印迹进一步测试抗CD40 IgG与CD40抗原的反应性。简而言之，可以制备来自CD40表达细胞的细胞提取物，并进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，将分离的抗原转移到硝酸纤维素膜上，用20％小鼠血清封闭，并用待测试的单克隆抗体探测。可以使用抗IgG碱性磷酸酶检测IgG结合，并用BCIP/NBT底物片剂(Sigma Chem.Co.,St.Louis，MO)显色。
用于分析各种抗CD40抗体的结合亲和力、交叉反应性和结合动力学的方法包括本领域已知的标准测定法，例如实施例中所述的使用BiacoreTM 2000SPR仪器的BiacoreTM表面等离子体共振(SPR)分析(Biacore AB,Uppsala,Sweden)，或使用OctetTM QKe仪器的生物层干涉测量法(BLI)。
本文也提供了与抗CD40抗体3C3、3G5、1B4、3B6、6H6、2E1.2,1B5-NK和3B6-NS结合相同表位的激动性抗CD40抗体(通过给定的表位作图技术测定)。例如，如实施例17中所述，本发明的抗体(例如抗体3C3)与人CD40的细胞外结构域(ECD)(SEQ ID NO：133)的氨基酸残基1-5和33-36内的一个或多个残基，例如人CD40的ECD(SEQ ID NO：133)的氨基酸5、33、34和/或36结合。还显示抗体3C3进一步结合人CD40的ECD(SEQ ID NO：133)的一个或多个氨基酸26、28和/或30，例如人CD40的ECD(SEQ ID NO：133)的氨基酸5、33、34和36或人CD40的ECD(SEQ ID NO：133)的氨基酸5、33和36。
本发明的其它抗体(例如抗体3G5)与人CD40的ECD(SEQ ID NO：133)的氨基酸残基13-15和33-36内的一个或多个残基，例如人CD40的ECD(SEQ ID NO：133)的氨基酸33、34和36结合。
与本文所述的人CD40上的表位(例如与示例性抗体相同的表位)结合的抗体表现出治疗上有利的特性。例如，如实施例16和20中所证明，抗体3C3表现出与可溶性CD40配体(sCD40L)的协同拮抗效应，例如通过当与Ramos细胞一起温育时CD95表达诱导的增加、当与人B细胞一起温育时B细胞增殖的增加，和/或当与树突细胞一起温育时IL12p40表达的诱导增加来测量。
因此，与3C3结合相同表位的抗体具有与其它治疗剂(包括与人CD40的配体结合位点结合的那些)协同作用的能力。代表性协同作用包括例如与涉及免疫功能上调的显著治疗益处相关的特定功能特性(例如，如疫苗疗法中的T细胞介导的免疫应答，癌症治疗中的NK激活)，抑制细胞生长(例如，在癌症治疗中)和/或由APC增强的抗原加工和呈递(例如，在疫苗疗法中)。
如本文所述，用于确定与本文所述抗体结合“CD40上的相同表位”的抗体的技术包括例如表位作图方法，例如提供表位的原子分辨率的抗原:抗体复合物晶体的X射线分析。其它方法监测抗体与抗原片段或抗原的突变变异的结合，其中由于抗原序列内氨基酸残基的修饰而导致的结合丧失通常被认为是表位组分的指示。另外，还可以使用用于表位作图的计算组合方法。方法还可以依赖于目的抗体从组合噬菌体展示肽文库中亲和分离特异性短肽(天然三维形式或变性形式)的能力。然后将肽视为用于定义对应于抗体的表位的引线，所述抗体用于筛选肽文库。对于表位作图，还开发了计算算法，其已经显示出对构象不连续表位进行作图。
II.分子缀合物/免疫毒素
本发明提供多种治疗性分子缀合物(例如疫苗缀合物)，其包括与抗体连接的抗原，例如肿瘤或病毒抗原，所述抗体结合APC上的受体，例如结合CD40的抗体。这允许将抗原靶向APC，例如CD40表达细胞(例如树突细胞、B细胞和巨噬细胞)，以增强加工、呈递和最终增强针对抗原的免疫应答。图18中显示了这种缀合物的示意图，其中，例如，抗原与基本上完整的抗CD40抗体的每条重链的CH3结构域遗传融合。然而，应当理解，抗原可以替代地与这种抗体或其片段的其它部分连接，并且也可以使用其它形式的缀合，例如如下面进一步讨论的化学缀合。
适用于本发明的分子缀合物的抗原包括例如感染性疾病抗原和肿瘤抗原(针对其的保护性或治疗性免疫应答是期望的)，例如由肿瘤细胞或病原生物或传染病抗原表达的抗原。例如，合适的抗原包括用于预防或治疗癌症的肿瘤相关抗原。肿瘤相关抗原的实例包括但不限于包含以下序列的全部或部分的序列：βhCG、gp100或Pmel17、HER2/neu、WT1、间皮素、CEA、gp100、MART1、TRP-2、黑色素-A、NY-ESO-1、NY-BR-1、NY-CO-58、MN(gp250)、独特型,MAGE-1、MAGE-3、MAGE-A3、酪氨酸酶、端粒酶、SSX2和MUC-1抗原和生殖细胞衍生的肿瘤抗原。肿瘤相关抗原还包括血型抗原，例如Lea、Leb、LeX、LeY、H-2、B-1、B-2抗原。或者，可以在本发明的抗原-抗体构建体中包括一种以上的抗原。例如，MAGE抗原可以与其它抗原如黑色素A、酪氨酸酶和gp100以及佐剂如GM-CSF或IL-12组合，并与抗APC抗体连接。
其它合适的抗原包括用于预防或治疗病毒疾病的病毒抗原。病毒抗原的实例包括但不限于HIV-1gag、HIV-1env、HIV-1nef、HBV(表面或核心抗原)、HPV、FAS、HSV-1、HSV-2、p17、ORF2和ORF3抗原。细菌抗原的实例包括但不限于弓形虫(Toxoplasma gondii)或梅毒螺旋体(Treponema pallidum)。本发明的抗体-细菌抗原缀合物可用于治疗或预防各种细菌性疾病，例如炭疽，肉毒杆菌，破伤风，衣原体，霍乱，白喉，莱姆病，梅毒和结核病。
上述抗原的序列是本领域众所周知的。例如，MAGE-3cDNA序列的实例提供于US 6,235,525(Ludwig Institute for Cancer Research)中；NY-ESO-1核酸和蛋白质序列的实例提供于US 5,804,381和US 6,069,233(Ludwig Institute for Cancer Research)中；黑色素-A核酸和蛋白质序列的实例提供于US 5,620,886和US 5,854,203(Ludwig Institutefor Cancer Research)中；NY-BR-1核酸和蛋白质序列的实例提供于US 6,774,226和US 6,911,529(Ludwig Institute for Cancer Research)中，NY-CO-58核酸和蛋白质序列的实例提供于WO 02090986(Ludwig Institute for Cancer Research)中；HER-2/neu蛋白的氨基酸序列的实例可从
Figure BDA0003929883480000451
登录号AAA58637获得；人癌胚抗原样1(CEA-1)的核苷酸序列(mRNA)可从
Figure BDA0003929883480000452
登录号NM_020219获得。
在一个实施方式中，抗原是HPV抗原，例如HPV-16抗原，HPV-18抗原，HPV-31抗原，HPV-33抗原和/或HPV-35抗原。HPV-16的基因组描述于Virology,145:181-185(1985)中，编码HPV-18的DNA序列描述于美国专利号5,840,306中，其公开内容通过引用整体并入本文。HPV-16抗原(例如HPV-16的E1和/或E2蛋白的血清反应区域)描述于美国专利号6,531,127和HPV-18抗原(例如HPV-18的L1和/或L2蛋白的血清反应区域)描述于美国专利号5,840,306中，其公开内容通过引用并入本文。类似地，HBV的完整基因组可从GENBANK登录号NC_003977获得，其公开内容并入本文。HCV的基因组描述于欧洲专利申请号318 216中，其公开内容并入本文。通过引用并入本文的PCT/US90/01348公开了HCV基因组的克隆的序列信息，HCV病毒蛋白的氨基酸序列以及制备和使用这种组合物用于HCV疫苗的方法，所述HCV疫苗包含HCV蛋白和由其衍生的肽。
可以用本领域众所周知的各种方式鉴定蛋白质的抗原肽(即含有T细胞表位的抗原肽)。例如，可以通过使用基于网络的预测算法(BIMAS和SYFPEITHI)分析蛋白质的序列来预测T细胞表位，以产生与10000个充分表征的以前由CTL定义的MHC结合肽的内部数据库匹配的潜在MHC I类和II结合肽。基于对给定MHC分子的高亲和力，可以对高评分肽进行分级和选择为“感兴趣的”。
鉴定含有T细胞表位的抗原肽的另一种方法涉及将蛋白质分成所需长度的非重叠肽或所需长度的重叠肽，这些肽可通过蛋白质的重组、合成或在某些有限的情况下化学切割产生并测试免疫原性，例如引发T细胞应答(即增殖或淋巴因子分泌)。
为了如通过T细胞生物学技术所确定的通过例如精细作图技术确定蛋白质的精确T细胞表位，可以通过在肽的氨基或羧基末端添加或者缺失氨基酸残基来修饰具有T细胞刺激活性并因此包含至少一个T细胞表位的肽并测试以确定T细胞对该修饰肽的反应性的变化。如果发现天然蛋白质序列中具有重叠区域的两种或更多种肽具有如通过T细胞生物学技术所确定的人T细胞刺激活性，可以产生包含全部或部分此类肽的另外的肽和可以通过类似的方法测试这些另外的肽。按照该技术，选择肽并重组或合成产生。基于各种因素选择肽，包括T细胞对肽的应答强度(例如刺激指数)。然后可以检查这些所选肽的物理和化学性质(例如溶解度、稳定性)以确定肽是否适合用于治疗组合物或肽是否需要修饰。
另外，疫苗缀合物可包括一种或多种免疫刺激剂，其也增强针对抗原的免疫应答。可以通过遗传或化学方法制备本发明的抗体-抗原疫苗缀合物。在任一种情况下，缀合物的抗体部分可以由完整抗体或抗体的一部分例如Fab片段或单链Fv组成。另外，缀合物中可包含一种以上的抗原和/或免疫刺激剂。
可以使用各种熟知且容易获得的交联剂制备化学构建的抗体-抗原缀合物。这些交联剂可以是同功能或异功能化合物，如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)，磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(sulfo-SMCC)，5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)，其与抗树突抗体和选定抗原上的不同反应性氨基酸或碳水化合物侧链形成共价连接。其它偶联剂和交联剂也可用于产生共价键，例如蛋白A、碳二亚胺和邻苯二甲酰亚胺(oPDM)；(参见例如Karpovsky等人(1984)J.Exp.Med.160:1686；Liu,MA等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:8648)。其它方法包括由Paulus(Behring Ins.Mitt.(1985)No.78,118-132)；Brennan等人(Science(1985)229:81-83)、和Glennie等人(J.Immunol.(1987)139:2367-2375)描述的方法。优选的缀合剂是SATA和磺基-SMCC，两者均可从PierceChemical Co.(Rockford,IL)获得。也可以使用上述相同的连接方法将免疫刺激剂与本发明的分子缀合物化学连接。
在另一实施方式中，本发明的抗体连接至治疗部分，例如细胞毒素、药物或放射性同位素。当与细胞毒素缀合时，这些抗体缀合物被称为“免疫毒素”。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害的(例如杀死)的任何药剂。实例包括紫杉醇，细胞松弛素B，短杆菌肽D，溴化乙锭，依米嗪，丝裂霉素，依托泊苷，替尼泊苷，长春新碱，长春花碱，秋水仙素，阿霉素，道诺霉素，二羟基蒽醌二酮，米托蒽醌，光神霉素，放线菌素D，1-脱氢睾酮，糖皮质激素，普鲁卡因，丁卡因，利多卡因，普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同系物。治疗剂包括但不限于抗代谢物(例如甲氨蝶呤，6-巯基嘌呤，6-硫鸟嘌呤，阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶达卡巴嗪)，烷化剂(例如二氯甲基二乙胺，苯丁酸氮芥，美法仑，卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)，环磷酰胺，白消安，二溴甘露醇，链脲佐菌素，丝裂霉素C和顺-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)，蒽环霉素(例如道诺霉素(以前称为阿霉素)和多柔比星)，抗生素(例如更生霉素(以前称为放线菌素)，博来霉素，光神霉素和安曲霉素(AMC))和抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春花碱)。本发明的抗体可与放射性同位素(例如放射性碘)缀合，以产生细胞毒性放射性药物，用于治疗树突相关疾病，例如自身免疫疾病或炎性疾病，或移植物抗宿主病。
本发明的抗体缀合物可用于修饰给定的生物应答，并且药物部分不应解释为限于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有所需生物活性的蛋白质或多肽。这些蛋白质可包括例如酶活性毒素或其活性片段，例如相思豆毒素，蓖麻毒素A，假单胞菌外毒素或白喉毒素；诸如肿瘤坏死因子或干扰素γ的蛋白质；或者，生物应答调节剂，例如淋巴因子，白细胞介素-1(“IL-1”)，白细胞介素-2(“IL-2”)，白细胞介素-6(“IL-6”)，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)，粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其它生长因子。
用于将此类治疗部分缀合至抗体的技术是众所周知的，参见例如Arnon等人，"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy",于Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等人(编辑)，pp.243-56(AlanR.Liss,Inc.1985)；Hellstrom等人，"Antibodies For Drug Delivery",于ControlledDrug Delivery(2nd Ed.)、Robinson等人(编辑)，pp.623-53(Marcel Dekker,Inc.1987)；Thorpe,"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:AReview",于Monoclonal Antibodies'84:Biological And Clinical Applications,Pinchera等人(编辑)，pp.475-506(1985)；"Analysis,Results,And Future Prospective Of TheTherapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy",于MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin等人(编辑)，pp.303-16(Academic Press 1985)，和Thorpe等人，"The Preparation And Cytotoxic PropertiesOf Antibody-Toxin Conjugates",Immunol.Rev.,62:119-58(1982)。
III.组合物
在另一实施方式中，本发明提供了一种组合物，例如含有与载体(例如药学上可接受的载体)一起配制的本发明的单克隆抗体中的一种或组合的组合物。还提供了含有包含本发明抗体的双特异性分子的组合物。在一个实施方式中，组合物包括本发明的多种(例如两种或更多种)分离的抗体的组合。优选地，组合物的每种抗体结合CD40的不同的预先选择的表位。
本发明的药物组合物还可以联合治疗施用，即与其它药剂联合施用。例如，组合疗法可包括本发明的组合物，其具有至少一种或多种另外的治疗剂，例如抗炎剂，DMARD(改善疾病的抗风湿药)，免疫抑制剂和化学治疗剂。本发明的药物组合物还可以与放射疗法联合施用。本发明还包括与其它抗体的共同施用。
如本文所用，术语“载体”和“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂，分散介质，包衣，抗细菌剂和抗真菌剂，等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，载体适用于静脉内，肌肉内，皮下，肠胃外，脊柱或表皮施用(例如通过注射或输注)。取决于施用途径，活性化合物即抗体，双特异性和多特异性分子，可以包被在材料中以保护化合物免受酸和其它可能使化合物失活的天然条件的作用。
可与本发明的抗体和构建体一起使用的佐剂的实例包括：弗氏不完全佐剂和完全佐剂(Difco Laboratories,Detroit,Mich.)；Merck Adjuvant 65(Merck and Company,Inc.,Rahway,N.J.)；AS-2(SmithKline Beecham,Philadelphia,Pa.)；铝盐如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝；钙、铁或锌的盐；酰化酪氨酸的不溶性悬浮液；酰化糖；阳离子或阴离子衍生的多糖；聚磷腈；可生物降解的微球；细胞因子，如GM-CSF，白细胞介素-2，白细胞介素-7，白细胞介素-12等因子；3D-MPL；CpG寡核苷酸；和单磷酰脂质A，例如3-脱氧酰化的单磷酰脂质A。
MPL佐剂可从Corixa Corporation(Seattle,Wash；参见例如美国专利号4,436,727；4,877,611；4,866,034和4,912,094)。含有CpG的寡核苷酸(其中CpG二核苷酸未甲基化)是众所周知的，并且描述于例如WO 96/02555,WO 99/33488和美国专利号6,008,200和5,856,462中。例如还由Sato等人，Science 273:352,1996描述了免疫刺激DNA序列。
其它替代佐剂包括例如皂苷，如Quil A或其衍生物，包括QS21和QS7(AquilaBiopharmaceuticals Inc.,Framingham,Mass.)；七叶素；毛地黄；或满天星(Gypsophila)或藜(Chenopodium quinoa)皂苷；Montanide ISA 720(Seppic，France)；SAF(Chiron,California,United States)；ISCOMS(CSL)，MF-59(Chiron)；SBAS系列佐剂(例如SBAS-2或SBAS-4，可从SmithKline Beecham,Rixensart,Belgium获得)；Detox(EnhanzynTM)(Corixa,Hamilton,Mont.)；RC-529(Corixa,Hamilton,Mont.)和其它氨基烷基氨基葡萄糖苷4-磷酸酯(AGP)；聚氧乙烯醚佐剂，如WO 99/52549A1中所述的那些；合成的咪唑喹啉如咪喹莫特[S-26308，R-837]，(Harrison,等人，Vaccine 19:1820-1826,2001；和瑞喹莫特[S-28463，R-848](Vasilakos,等人，Cellular immunology 204:64-74,2000；羰基化合物和胺的席夫碱，其在抗原呈递细胞和T细胞表面上组成型表达，例如妥卡雷琐(Rhodes,J.等人，Nature377:71-75,1995)；细胞因子，趋化因子和共刺激分子作为蛋白质或肽，包括例如促炎细胞因子，如干扰素，GM-CSF，IL-1α，IL-1β，TGF-α和TGF-β，Th1诱导剂如干扰素γ，IL-2，IL-12，IL-15，IL-18和IL-21，Th2诱导剂如IL-4，IL-5，IL-6，IL-10和IL-13等趋化因子和共刺激基因，如MCP-1，MIP-1α，MIP-1β，RANTES，TCA-3，CD80，CD86和CD70；靶向配体的免疫刺激剂如CTLA-4和L-选择素，细胞凋亡刺激蛋白质和肽如Fas；合成脂质基佐剂例如vaxfectin，(Reyes等人，Vaccine 19:3778-3786,2001)角鲨烯，α-生育酚，聚山梨醇酯80，DOPC和胆固醇；内毒素，[LPS]，(Beutler,B.,Current Opinion in Microbiology 3:23-30,2000)；触发Toll受体产生Th1诱导细胞因子的配体，如合成的分枝杆菌脂蛋白，分枝杆菌蛋白p19，肽聚糖，磷壁酸和脂质A；和CT(霍乱毒素，亚单位A和B)和LT(来自大肠杆菌的热不稳定肠毒素，亚单位A和B)，热休克蛋白家族(HSP)和LLO(李斯特菌溶血素O；WO 01/72329)。这些和各种其它Toll样受体(TLR)激动剂描述于例如Kanzler等人,Nature Medicine,May 2007,Vol13,No 5中。与本发明的抗CD40抗体组合使用的优选免疫刺激剂是TLR3激动剂，例如PolyIC。
“药学上可接受的盐”是指保留母体化合物的所需生物活性并且不会产生任何不期望的毒理学作用的盐(参见例如Berge,S.M.,等人(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。这些盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括衍生自无毒无机酸，例如盐酸，硝酸，磷酸，硫酸，氢溴酸，氢碘酸，磷等，以及衍生自无毒有机酸，例如脂族单羧酸和二羧酸，苯基取代的链烷酸，羟基链烷酸，芳香酸，脂族和芳族磺酸等的那些。碱加成盐包括衍生自碱土金属，例如钠，钾，镁，钙等，以及衍生自无毒有机胺，例如N,N'-二苄基乙二胺，N-甲基葡糖胺，氯普鲁卡因，胆碱，二乙醇胺，乙二胺，普鲁卡因等的那些。
可通过本领域已知的各种方法施用本发明的组合物。如本领域技术人员所理解的那样，施用途径和/或方式将根据所需结果而变化。活性化合物可以用载体制备，所述载体将保护化合物免于快速释放，例如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯，聚酐，聚乙醇酸，胶原，聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类制剂的许多方法是专利化的或本领域技术人员通常已知的。参见例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。
为了通过某些施用途径施用本发明化合物，可能需要用材料包被化合物或与化合物共同施用以防止其失活。例如，化合物可以在合适的载体例如脂质体或稀释剂中施用于受试者。可接受的稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。脂质体包括水包油包水CGF乳剂以及常规脂质体(Strejan等人(1984)J.Neuroimmunol.7:27)。
载体包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。这些介质和药剂用于药物活性物质的用途是本领域已知的。除非任何常规介质或药剂与活性化合物不相容，否则考虑将其用于本发明的药物组合物中。补充的活性化合物也可以并入组合物中。
治疗组合物通常必须在制造和储存条件下是无菌和稳定的。该组合物可以配制成溶液、微乳液、脂质体或适于高药物浓度的其它有序结构。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水，乙醇，多元醇(例如甘油，丙二醇和液体聚乙二醇等)，以及它们的合适混合物。例如，通过使用诸如卵磷脂的包衣、通过在分散的情况下保持所需的粒径和通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。
无菌可注射溶液可以通过将所需量的活性化合物与上面列举的成分中的一种或组合(如果需要)一起掺入适当的溶剂中，然后进行灭菌微滤来制备。通常，通过将活性化合物掺入无菌载体中来制备分散体，所述无菌载体含有基础分散介质和来自上面所列那些的所需其它成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其产生活性成分的粉末加上来自其先前无菌过滤的溶液的任何其它所需成分。
调整剂量方案以提供最佳的所需应答(例如治疗应答)。例如，可以施用单次推注，可以随时间施用几个单独剂量，或者可以根据治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。例如，本发明的抗体可以每周一次或两次通过皮下或肌内注射施用，或者每月一次或两次通过皮下或肌内注射施用。
以剂量单位形式配制肠胃外组合物以便于施用和剂量均匀是特别有利的。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为待治疗受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位含有经计算可与所需的药物载体一起产生所需的治疗效果的预定量的活性化合物。本发明的剂量单位形式的规格由以下决定并且直接取决于：(a)活性化合物的独特特征和要实现的特定治疗效果，以及(b)复合这种用于治疗个体敏感性的活性化合物的技术中固有的局限性。
药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸，盐酸半胱氨酸，硫酸氢钠，偏亚硫酸氢钠和亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯，丁基化羟基苯甲醚(BHA)，丁基化羟基甲苯(BHT)，卵磷脂，没食子酸丙酯和α-生育酚等；(3)金属螯合剂，如柠檬酸，乙二胺四乙酸(EDTA)，山梨糖醇，酒石酸和磷酸等。
对于治疗组合物，本发明的制剂包括适合口服、鼻腔、局部(包括口腔和舌下)、直肠、阴道和/或肠胃外施用的那些。制剂可以方便地以单位剂型存在，并且可以通过药学领域已知的任何方法制备。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据所治疗的受试者和具体的施用方式而变化。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常是产生治疗效果的组合物的量。通常，在百分之一百中，该量的范围为约0.001％至约90％的活性成分，优选约0.005％至约70％，最优选约0.01％至约30％。
适用于阴道施用的本发明制剂还包括含有本领域已知的适当载体的子宫托、卫生棉、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾制剂。用于局部或透皮施用本发明组合物的剂型包括粉末、喷雾剂、软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、溶液、贴剂和吸入剂。活性化合物可以在无菌条件下与药学上可接受的载体混合，并与可能需要的任何防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。
本文所用的短语“肠胃外施用”和“以肠胃外施用”是指除肠内和局部施用以外的施用方式，通常通过注射，包括但不限于静脉内，肌肉内，动脉内，鞘内，囊内，眶内，心内，皮内，腹膜内，经气管，皮下，角质层下，关节内，包膜下，蛛网膜下，脊柱内，硬膜外和胸骨内注射和输注。
可用于本发明药物组合物中的合适的水性和非水性载体的实例包括水，乙醇，多元醇(例如甘油，丙二醇和聚乙二醇等)及其合适的混合物，植物油如橄榄油和可注射的有机酯如油酸乙酯。例如，通过使用诸如卵磷脂的包衣材料、通过在分散的情况下保持所需的粒径和通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。
这些组合物还可含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过上文的灭菌程序和通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等，可以确保防止微生物的存在。还可能需要在组合物中包含等渗剂，例如糖、氯化钠等。此外，可以通过包含延迟吸收的试剂如单硬脂酸铝和明胶来延长可注射药物形式的吸收。
当本发明化合物作为药物施用于人和动物时，它们可以单独施用或作为含有例如0.001至90％(更优选0.005至70％，例如0.01至30％)活性成分与药学上可接受的载体组合的药物组合物施用。
无论选择何种施用途径，可以通过本领域技术人员已知的常规方法将本发明化合物(可以以合适的水合形式使用)和/或本发明的药物组合物配制成药学上可接受的剂型。
可以改变本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以便获得有效实现特定患者、组合物和施用方式的所需治疗应答的活性成分的量，而对患者没有毒性。所选的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所用本发明特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性，使用的具体化合物的施用途径、施用时间、排泄速率，治疗的持续时间，与所用特定组合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料，所治疗患者的年龄、性别、体重、病况、一般健康状况和既往病史，以及像医学领域众所周知的因素。具有本领域普通技能的医生或兽医可以容易地确定和开出所需药物组合物的有效量。例如，医生或兽医可以以低于实现所需治疗效果所需的水平开始药物组合物中使用的本发明化合物的剂量，并逐渐增加剂量直至达到所需效果。通常，本发明组合物的合适日剂量是化合物的量，其是有效产生治疗效果的最低剂量。这种有效剂量通常取决于上述因素。优选施用是静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下施用，优选在靶位点附近施用。如果需要，治疗组合物的有效日剂量可以作为两个、三个、四个、五个、六个或更多个亚剂量施用，所述亚剂量在一天中以适当的间隔分开施用，任选地，以单位剂型施用。虽然本发明化合物可以单独施用，但优选将该化合物作为药物制剂(组合物)施用。
治疗组合物可以与本领域已知的医疗装置一起施用。例如，在一个优选的实施方式中，本发明的治疗组合物可以与无针皮下注射装置一起施用，例如美国专利号5,399,163,5,383,851,5,312,335,5,064,413,4,941,880,4,790,824,或4,596,556中公开的装置。可用于本发明的众所周知的植入物和模块的实例包括：美国专利号4,487,603，其公开了一种用于以受控速率分配药物的可植入微输液泵；美国专利号4,486,194，其公开了一种通过皮肤施用药物的治疗装置；美国专利号4,447,233，其公开了一种用于以精确输注速率输送药物的药物输注泵；美国专利号4,447,224，其公开了一种用于连续药物输送的可变流量可植入输注装置；美国专利号4,439,196，其公开了一种具有多室隔室的渗透药物递送系统；和美国专利号4,475,196，其公开了渗透性药物递送系统。许多其它这样的植入物、递送系统和模块是本领域技术人员已知的。
在某些实施方式中，能够配制本发明的抗体以确保恰当的体内分布。例如，血脑屏障(BBB)排除了许多高亲水性化合物。为了确保本发明的治疗化合物穿过BBB(如果需要)，可以将它们配制在例如脂质体中。对于制备脂质体的方法，参见例如美国专利4,522,811；5,374,548和5,399,331。脂质体可包含一个或多个选择性转运到特定细胞或器官中的部分，从而增强靶向药物递送(参见例如V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685)。示例性的靶向部分包括叶酸或生物素(参见例如Low等人的美国专利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038)；抗体(P.G.Bloeman等人(1995)FEBS Lett.357:140；M.Owais等人(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39:180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等人(1995)Am.J.Physiol.1233:134)，其不同种类可包含本发明的制剂，以及本发明分子的组分；p120(Schreier等人(1994)J.Biol.Chem.269:9090)；还参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346:123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4:273。在本发明的一个实施方式中，将本发明的治疗化合物配制在脂质体中；在更优选的实施方式中，脂质体包括靶向部分。在最优选的实施方式中，脂质体中的治疗化合物通过团注递送到接近肿瘤或感染的部位。组合物必须是流动的，以至于易于注射。它必须在制造和储存条件下稳定，并且必须防止微生物如细菌和真菌的污染作用。
可以在预测人肿瘤功效的动物模型系统中评估化合物抑制癌症的能力。或者，组合物的这种性质可以通过检查化合物抑制的能力来评估，这种抑制在体外通过本领域技术人员已知的测定进行。治疗有效量的治疗化合物可以减小肿瘤大小，或以其它方式改善受试者的症状。本领域普通技术人员将能够基于诸如受试者的大小、受试者症状的严重性和所选择的特定组合物或施用途径等因素来确定这样的量。
组合物必须是无菌的和流动的，达到组合物可通过注射器递送的程度。除水之外，载体可以是等渗缓冲盐水溶液，乙醇，多元醇(例如甘油，丙二醇和液体聚乙二醇等)，以及它们的合适混合物。例如，通过使用诸如卵磷脂的包衣、通过在分散的情况下保持所需的粒径和通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、或山梨糖醇和氯化钠。通过在组合物中包括长期吸收的试剂，例如单硬脂酸铝或明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。
当适当保护活性化合物时，如上所述，化合物可以口服施用，例如，用惰性稀释剂或可吸收的食用载体。
IV.本发明的用途和方法
本发明的抗体、分子缀合物、双特异性分子和组合物可用于治疗和/或预防(例如免疫)多种疾病和病症。
主要的疾病指征之一是癌症。癌症的类型包括但不限于白血病，急性淋巴细胞白血病，急性髓细胞白血病，成髓细胞早幼粒细胞髓单核细胞单核细胞红白血病，慢性白血病，慢性髓细胞(粒细胞)白血病，慢性淋巴细胞白血病，套细胞淋巴瘤，原发性中枢神经系统淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，边缘区B细胞淋巴瘤，真性红细胞增多症淋巴瘤，霍奇金病，非霍奇金病，多发性骨髓瘤，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症，重链疾病，实体瘤，肉瘤，和癌，纤维肉瘤，粘液肉瘤，脂肪肉瘤，软骨肉瘤，成骨肉瘤，骨肉瘤，脊索瘤，血管肉瘤，内皮肉瘤，淋巴管肉瘤，淋巴管内皮细胞瘤，滑膜瘤，间皮瘤，尤文氏瘤，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤，结肠肉瘤，结直肠癌，胰腺癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，鳞状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳头状癌，乳头状腺癌，囊腺癌，髓样癌，支气管癌，肾细胞癌，肝细胞瘤，胆管癌，绒毛膜癌，精原细胞瘤，胚胎癌，肾母细胞瘤，宫颈癌，子宫癌，睾丸肿瘤，肺癌，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，膀胱癌，上皮癌，胶质瘤，星形细胞瘤，髓母细胞瘤，颅咽管瘤，室管膜瘤，松果体，血管母细胞瘤，听神经瘤，少突神经胶质瘤，血管瘤，黑色素瘤，神经母细胞瘤，视网膜母细胞瘤，鼻咽癌，食道癌，基底细胞癌，胆道癌，膀胱癌，骨癌，脑和中枢神经系统(CNS)癌，宫颈癌，绒毛膜癌，结肠直肠癌，结缔组织癌，消化系统癌症，子宫内膜癌，食道癌，眼癌，头颈癌，胃癌，上皮内瘤，肾癌，喉癌，肝癌，肺癌(小细胞，大细胞)，黑色素瘤，神经母细胞瘤；口腔癌(例如唇，舌，口和咽)，卵巢癌，胰腺癌，视网膜母细胞瘤，横纹肌肉瘤，直肠癌；呼吸系统癌，肉瘤，皮肤癌，胃癌，睾丸癌，甲状腺癌，子宫癌和泌尿系统癌症。具体癌症包括选自由慢性淋巴细胞白血病，套细胞淋巴瘤，原发性中枢神经系统淋巴瘤，伯基特淋巴瘤和边缘区B细胞淋巴瘤组成的组中的CD40表达肿瘤。
本发明的抗体和缀合物也可用于治疗细菌、真菌、病毒和寄生虫感染性疾病。
当用于治疗时，本发明的抗体可以单独或与其它疗法如免疫刺激剂、疫苗、化学疗法或放射疗法直接(即体内)施用于受试者。在所有情况下，抗体、缀合物、双特异性抗体、组合物和免疫刺激剂以及其它疗法以有效量施用以发挥其所需的治疗效果。术语“有效量”是指实现所需生物效应所必需或足够的量。例如，有效量可以是消除肿瘤、癌症或细菌、病毒或真菌感染所必需的量。任何特定应用的有效量可以根据诸如所治疗的疾病或病况，所施用的特定抗体，受试者的大小或疾病或病症的严重性等因素而变化。本领域普通技术人员可凭经验确定特定分子的有效量，而无需过多的实验。
优选的施用途径包括例如注射(例如皮下，静脉内，肠胃外，腹膜内，鞘内)。注射可以是团注或连续输注。其它施用途径包括口服施用。
在另一个实施方式中，抗体与疫苗抗原组合施用，以增强针对疫苗抗原的免疫应答，例如肿瘤抗原(从而增强针对肿瘤的免疫应答)或来自传染性疾病病原体的抗原(从而增强针对传染病病原体的免疫应答)。疫苗抗原可以是能够引发针对肿瘤或针对传染病病原体(例如病毒、细菌、寄生虫或真菌)的免疫应答的任何抗原或抗原组合物。它也可以是例如新抗原，例如来自患者肿瘤测序的新抗原。抗原或抗原可以是例如肽/蛋白质、多糖和/或脂质，或者可以作为编码可以在体内表达的肽或蛋白质抗原的核酸(例如DNA)施用。一种或多种抗原衍生自肿瘤，例如本文先前公开的各种肿瘤抗原。或者，一种或多种抗原可以衍生自病原体，例如病毒、细菌、寄生虫和/或真菌，例如本文先前公开的各种病原体抗原。合适的病原体抗原的其它实例包括但不限于以下：
病毒抗原或抗原决定簇可以衍生自例如：巨细胞病毒(尤其是人，如gB或其衍生物)；EB病毒(如gp350)；黄病毒(例如黄热病毒，登革热病毒，蜱媒脑炎病毒，日本脑炎病毒)；肝炎病毒如乙型肝炎病毒(例如乙型肝炎表面抗原，如EP-A-414 374、EP-A-0304 578和EP-A-198474中描述的PreS1、PreS2和S抗原)，甲型肝炎病毒，丙型肝炎病毒和戊型肝炎病毒；HIV-1，(如tat、nef、gpl20或gp160)；人疱疹病毒，如gD或其衍生物或立即早期蛋白质，如来自HSV1或HSV2的ICP27；人乳头瘤病毒(例如HPV6、11、16、18)；流感病毒(全活或灭活病毒，裂解流感病毒，在卵或MDCK细胞中生长，或Vero细胞或全流感病毒体(如Gluck,Vaccine,1992,10,915-920所述)或其纯化或重组蛋白，如NP、NA、HA或M蛋白)；麻疹病毒；腮腺炎病毒；副流感病毒；狂犬病毒；呼吸道合胞病毒(如F和G蛋白)；轮状病毒(包括减毒活病毒)；天花病毒；水痘带状疱疹病毒(如gpI、II和IE63)；和负责宫颈癌的HPV病毒(例如早期蛋白质E6或E7与蛋白质D载体融合形成来自HPV 16的蛋白质D-E6或E7融合体，或其组合；或E6或E7与L2的组合(参见例如WO 96/26277)。
细菌抗原或抗原决定簇可以衍生自例如：芽孢杆菌属的某些种，包括炭疽芽孢杆菌(例如肉毒杆菌毒素)；博德特氏菌属的某些种，包括百日咳博德特氏菌(例如百日咳杆菌毒素，百日咳毒素，丝状血凝素，腺苷酸环化酶，菌毛)；疏螺旋体属的某些种，包括B.burgdorferi(例如OspA，OspC，DbpA，DbpB)，B.garinii(例如OspA，OspC，DbpA，DbpB)，B.afzelii(例如OspA，OspC，DbpA，DbpB)，B.andersonii(例如OspA，OspC，DbpA，DbpB)，B.hermsii；弯曲杆菌属的某些种，包括空肠弯曲杆菌(例如毒素，粘附素和侵袭素)和C.coli；衣原体属的某些种，包括沙眼衣原体(例如MOMP，肝素结合蛋白)，肺炎衣原体(例如MOMP，肝素结合蛋白)，鹦鹉热衣原体；梭菌属的某些种，包括破伤风梭菌(如破伤风毒素)，肉毒杆菌(例如肉毒杆菌毒素)，艰难梭菌(例如梭菌毒素A或B)；棒状杆菌属的某些种，包括白喉杆菌(例如白喉毒素)；Ehrlichia属，包括马链球菌和人粒细胞埃里希体病的药剂；Rickettsia属，包括R.rickettsii；肠球菌属的某些种，包括粪肠球菌，屎肠球菌；埃希氏菌属的某些种，包括肠毒性大肠杆菌(例如定植因子，热不稳定毒素或其衍生物，或热稳定毒素)，肠致病性大肠杆菌，肠致病性大肠杆菌(例如志贺毒素样毒素)；嗜血杆菌属的某些种，包括B型流感嗜血杆菌(例如PRP)，非典型的流感嗜血杆菌，例如OMP26，高分子量粘附素，P5，P6，蛋白D和脂蛋白D，以及菌毛和菌毛衍生肽(参见和例如US 5,843,464)；幽门螺杆菌属的某些种，包括幽门螺杆菌(例如脲酶，过氧化氢酶，空泡毒素)；假单胞菌属的某些种，包括铜绿假单胞菌；军团菌属的某些种，包括嗜肺军团菌；钩端螺旋体属的某些种，包括问号钩端螺旋体；李斯特菌属的某些种，包括单核细胞增生李斯特菌；莫拉氏菌属的某些种，包括粘膜炎莫拉氏菌，也称为Branhamella catarrhalis(例如高分子量和低分子量粘附素和侵袭素)；Morexella Catarrhalis(包括其外膜囊泡和OMP106(参见例如WO97/41731))；分枝杆菌属的某些种，包括结核分枝杆菌(例如ESAT6，抗原85A、-B或-C)，牛分枝杆菌，麻风分枝杆菌，鸟分枝杆菌，副结核分枝杆菌，耻垢分枝杆菌；奈瑟菌属的某些种，包括淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟球菌(例如荚膜多糖及其结合物，转铁蛋白结合蛋白，乳铁蛋白结合蛋白，PilC，粘附素)；肠炎奈瑟球菌B(包括其外膜囊泡和NspA(参见例如WO 96/29412)；沙门氏菌属的某些种，包括伤寒沙门氏菌，副伤寒沙门氏菌，猪霍乱沙门氏菌，肠炎沙门氏菌；志贺氏菌属的某些种，包括S.sonnei,S.dysenteriae,S.flexnerii；葡萄球菌属的某些种，包括金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌；链球菌属的某些种，包括肺炎链球菌(例如荚膜多糖及其缀合物，PsaA，PspA，链球菌溶血素，胆碱结合蛋白)和蛋白质抗原肺炎球菌溶血素(BiochemBiophys Acta,1989,67,1007；Rubins等人，Microbial Pathogenesis,25,337-342)，及其突变体解毒衍生物(参见例如WO 90/06951；WO 99/03884)；密螺旋体属的某些种，包括T.pallidum(例如外膜蛋白)，T.denticola,T.hyodysenteriae；弧菌属的某些种，包括霍乱弧菌(例如霍乱毒素)；和耶尔森菌属的某些种，包括Y.enterocolitica(例如Yop蛋白)，鼠疫耶尔森氏菌,假结核耶尔森氏菌。
寄生虫/真菌抗原或抗原决定簇可以衍生自例如：巴贝虫属的某些种，包括B.microti；念珠菌属的某些种，包括C.albicans；隐球菌属的某些种，包括C.neoformans；内阿米巴属的某些种，包括E.histolytica；贾第虫属的某些种，包括；G.lamblia；Leshmania属,包括L.major；Plasmodium.faciparum(MSP1,AMA1,MSP3,EBA,GLURP,RAP1,RAP2,Sequestrin,PfEMP1,Pf332,LSA1,LSA3,STARP,SALSA,PfEXPl,Pfs25,Pfs28,PFS27/25,Pfsl6,Pfs48/45,Pfs230和它们在疟原虫属的某些种中的类似物)；肺囊虫属的某些种，包括P.carinii；血吸虫属的某些种，包括S.mansoni；毛滴虫属的某些种，包括T.vaginalis；弓形虫属的某些种，包括T.gondii(例如SAG2,SAG3,Tg34)；Trypanosoma属，包括T.cruzi。
应理解，根据本发明的这个方面，抗原和抗原决定簇可以以许多不同的形式使用。例如，抗原或抗原决定簇可以作为分离的蛋白质或肽(例如在所谓的“亚单位疫苗”中)存在，或者例如作为细胞相关的或病毒相关的抗原或抗原决定簇存在(例如在活或杀死的病原体菌株中)。活病原体优选以已知方式减毒。或者，可以通过使用编码抗原或抗原决定簇的多核苷酸(如所谓的“DNA疫苗接种”)在受试者中原位产生抗原或抗原决定簇，尽管可以理解可以使用的多核苷酸，能够用这种方法使用的多核苷酸不限于DNA，也可包括如上所述的RNA和修饰的多核苷酸。
当用于治疗时，本发明的分子缀合物(即疫苗结合物)可以单独或与免疫刺激剂一起直接(即体内)给予受试者。在一个方面，免疫刺激剂与缀合物连接。或者，可以通过首先使缀合物(例如通过培养或温育)与APC(例如树突细胞)接触，然后将细胞施用于受试者(即离体)，间接地将缀合物施用于受试者。缀合物与APC的接触和递送使得它们在施用前由APC加工和呈递，也称为抗原或细胞“加载”。将抗原加载到APC的技术是本领域公知的，包括例如Gunzer and Grabbe,Crit Rev Immunol 21(1-3):133-45(2001)和Steinman,ExpHematol24(8):859-62(1996)。
在所有情况下，疫苗缀合物和免疫刺激剂以有效量施用以发挥其所需的治疗效果。
本发明的抗体、分子缀合物、双特异性分子和组合物也可与佐剂和其它治疗剂共同施用。应当理解，本文所用的术语“共同施用”包括本发明的抗体和缀合物与佐剂和其它试剂同时地、分开地或顺序地施用中的任一种或全部，包括作为给药方案的一部分施用。通常将抗体单独或与这些试剂组合配制在载体中。这种载体的实例包括溶液、溶剂、分散介质、延迟剂、乳液等。这些介质用于药物活性物质的用途是本领域已知的。适用于分子的任何其它常规载体都属于本发明的范围。
适用于与本发明的抗体和缀合物共同施用的化学治疗剂包括例如紫杉醇，细胞松弛素B，短杆菌肽D，溴化乙锭，依米嗪，丝裂霉素，依托泊苷，替尼泊苷，长春新碱，长春花碱，秋水仙素，阿霉素，道诺霉素，二羟基蒽醌二酮，米托蒽醌，光神霉素，放线菌素D，1-脱氢睾酮，糖皮质激素，普鲁卡因，丁卡因，利多卡因，普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同系物。进一步治疗剂包括例如抗代谢物(例如甲氨蝶呤，6-巯基嘌呤，6-硫鸟嘌呤，阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶达卡巴嗪)，烷化剂(例如二氯甲基二乙胺，苯丁酸氮芥，美法仑，卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)，环磷酰胺，白消安，二溴甘露醇，链脲佐菌素，丝裂霉素C和顺-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)，蒽环霉素(例如道诺霉素(以前称为阿霉素)和多柔比星)，抗生素(例如更生霉素(以前称为放线菌素)，博来霉素，光神霉素和蒽霉素(AMC))和抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春花碱)和替莫唑胺。
消除或抑制免疫抑制活性的药剂，例如免疫细胞(例如调节性T细胞、NKT细胞、巨噬细胞、髓样抑制细胞、未成熟或抑制性树突细胞)或由肿瘤或肿瘤的局部微环境的宿主细胞产生的抑制因子(例如TGFβ，吲哚胺2,3双加氧酶-IDO)也可以与本发明的抗体和缀合物一起施用。这些试剂包括抗体和小分子药物，例如IDO抑制剂，例如1甲基色氨酸或衍生物。
用于与本发明的抗体、缀合物和双特异性物质共同施用以诱导或增强免疫应答的合适药剂包括，例如，佐剂和/或免疫刺激剂，其非限制性实例已在上文中公开。优选的免疫刺激剂是TLR3激动剂，例如Poly IC。
V.联合疗法
本文所述的抗CD40抗体也可用于联合疗法，例如用于治疗癌症。因此，本文提供了联合疗法的方法，其中抗CD40抗体与一种或多种其它药剂共同施用，例如有效刺激免疫应答从而进一步增强、刺激或上调受试者的免疫应答的小分子药物、抗体或其抗原结合部分和/或蛋白质配体。此外，如本文实施例中所示，施用激动剂抗CD40抗体和可溶性CD40配体在诱导T细胞受体介导的信号中具有协同作用，例如，如肿瘤细胞中CD95表达的增加所示。
例如，例如本文所述的抗CD40抗体可以与免疫细胞(例如T细胞)上的(i)刺激性(例如共刺激性)分子(例如受体或配体)的激动剂和/或(ii)抑制信号或分子(例如受体或配体)的拮抗剂组合，两者都导致放大免疫应答，例如抗原特异性T细胞应答。在某些方面，免疫-肿瘤学药剂是参与固有免疫的细胞例如NK细胞的(i)刺激(包括共刺激)分子(例如受体或配体)的激动剂或(ii)抑制(包括共抑制)分子(例如受体或配体)的拮抗剂，并且其中免疫-肿瘤学药剂增强固有免疫。此类免疫-肿瘤学药剂通常称为免疫检查点调节剂，例如免疫检查点抑制剂或免疫检查点刺激剂。
在一个实施方式中，抗CD40抗体与靶向刺激或抑制分子的药剂一起施用，所述刺激或抑制分子是免疫球蛋白超家族(IgSF)的成员。例如，可以与靶向IgSF家族成员的药剂一起向受试者施用例如本文所述的抗CD40抗体以增加免疫应答。例如，抗CD40抗体可以与靶向(或特异性结合)B7家族膜结合配体成员一起施用，所述B7家族膜结合配体成员包括B7-1,B7-2,B7-H1(PD-L1)、B7-DC(PD-L2)、B7-H2(ICOS-L)、B7-H3,B7-H4,B7-H5(VISTA)和B7-H6或特异性结合B7家族成员的共刺激或共抑制受体。
抗CD40抗体还可以与靶向TNF和TNFR分子家族成员(配体或受体)的药剂一起施用，例如CD40和CD40L(例如人CD40和人CD40L)、OX-40,OX-40L,CD70,CD27L,CD30,CD30L,4-1BBL,CD137,TRAIL/Apo2-L,TRAILR1/DR4,TRAILR2/DR5,TRAILR3,TRAILR4,OPG,RANK,RANKL,TWEAKR/Fn14,TWEAK,BAFFR,EDAR,XEDAR,TACI,APRIL,BCMA,LTβR,LIGHT,DcR3,HVEM,VEGI/TL1A,TRAMP/DR3,EDA1,EDA2,TNFR1,淋巴毒素α/TNFβ,TNFR2,TNFα,LTβR,淋巴毒素α1β2,FAS,FASL,RELT,DR6,TROY和NGFR(参见例如Tansey(2009)Drug DiscoveryToday 00:1)。
可以通过本文所述的抗CD40抗体(例如3C3和3G5)和抑制T细胞激活的蛋白质(例如免疫检查点抑制剂)的拮抗剂(抑制剂或阻断剂)中的一种或多种，例如如上所述的CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2和LAG-3，以及任何下列蛋白质：TIM-3、半乳凝素9、CEACAM-1、BTLA、CD69、半乳凝素-1、TIGIT、CD113、GPR56、VISTA、B7-H3、B7-H4、2B4、CD48、GARP、PD1H、LAIR1、TIM-1和TIM-4，和/或刺激T细胞激活的蛋白质的激动剂中的一种或多种，例如B7-1、B7-2、CD28、4-1BB(CD137)、4-1BBL、ICOS、ICOS-L、OX40、OX40L、CD70、CD27、CD40、DR3和CD28H组合来刺激T细胞应答。
调节上述蛋白质之一并且可以与激动剂抗CD40抗体(例如本文所述的那些)组合用于治疗癌症的示例性药剂包括：YervoyTM(伊匹单抗)或曲美木单抗(针对CTLA-4)、加利昔单抗(针对B7.1)、BMS-936558/纳武单抗(针对PD-1)、MK-3475/派姆单抗(针对PD-1)、AMP224(针对B7DC)、BMS-936559(针对B7-H1)、MPDL3280A/阿特珠单抗(针对B7-H1)、MEDI-570(针对ICOS)、AMG557(针对B7H2)、MGA271(针对B7H3)、IMP321(针对LAG-3)、BMS-663513(针对CD137)、PF-05082566(针对CD137)、CDX-1127(针对CD27)、抗OX40(ProvidenceHealth Services)、huMAbOX40L(针对OX40L)、阿塞西普(针对TACI)、CP-870893(针对CD40)、鲁卡木单抗(针对CD40)、达西珠单抗(针对CD40)、莫罗单抗-CD3(针对CD3)、伊匹单抗(针对CTLA-4)。
可以与激动剂抗CD40抗体组合用于治疗癌症的其它分子包括NK细胞上的抑制性受体的拮抗剂或NK细胞上的激活受体的激动剂。例如，抗CD40激动剂抗体可与KIR拮抗剂(例如利鲁单抗)组合。
T细胞激活也受可溶性细胞因子的调节，并且抗CD40抗体可以施用于例如患有癌症受试者，具有抑制T细胞激活的细胞因子的拮抗剂或刺激T细胞激活的细胞因子的激动剂。
在另一个实施方式中，抗CD40抗体可以与(i)抑制T细胞激活的IgSF家族或B7家族或TNF家族的蛋白质的拮抗剂(或抑制剂或阻断剂)或抑制T细胞激活的细胞因子的拮抗剂(例如IL-6，IL-10，TGF-β，VEGF；“免疫抑制细胞因子”)和/或(ii)刺激T细胞激活的IgSF家族、B7家族或TNF家族细胞因子的刺激性受体的激动剂组合使用，用于刺激免疫应答，例如用于治疗增殖性疾病，例如癌症。
用于组合疗法的其它药剂包括抑制或消耗巨噬细胞或单核细胞的药剂，包括但不限于CSF-1R拮抗剂，例如CSF-1R拮抗剂抗体，包括RG7155(WO11/70024,WO11/107553,WO11/131407,WO13/87699,WO13/119716,WO13/132044)或FPA-008(WO11/140249；WO13169264；WO14/036357)。
抗CD40抗体也可以与抑制TGF-β信号传导的药剂一起施用。
可以与抗CD40抗体组合的其它药剂包括增强肿瘤抗原呈递的药剂，例如树突细胞疫苗，分泌GM-CSF的细胞疫苗，CpG寡核苷酸和咪喹莫特，或增强肿瘤细胞免疫原性的疗法(例如蒽环类药物)。
可以与抗CD40抗体组合的其它疗法包括消耗或阻断Treg细胞的疗法，例如特异性结合CD25的药剂。
可以与抗CD40抗体组合的另一种疗法是抑制代谢酶的疗法，例如吲哚胺二恶英酶(IDO)，二恶英酶，精氨酸酶或一氧化氮合成酶。
可与抗CD40抗体一起使用的另一类药剂包括抑制腺苷形成或抑制腺苷A2A受体的药剂。
可以与抗CD40抗体组合用于治疗癌症的其它疗法包括逆转/预防T细胞无反应性或衰竭的疗法以及在肿瘤部位引发固有免疫激活和/或炎症的疗法。
抗CD40抗体可以与一种以上的免疫-肿瘤学药剂组合，并且可以例如与靶向免疫途径的多种元件的组合方法组合，例如以下的一种或多种：增强肿瘤抗原呈递的疗法(例如树突细胞疫苗，分泌GM-CSF的细胞疫苗，CpG寡核苷酸，咪喹莫特)；抑制负免疫调节的疗法，例如通过抑制CTLA-4和/或PD1/PD-L1/PD-L2途径和/或消耗或阻断Treg或其它免疫抑制细胞；刺激阳性免疫调节的疗法，例如用刺激CD-137、OX-40和/或GITR途径和/或刺激T细胞效应子功能的激动剂；全身性增加抗肿瘤T细胞频率的疗法；消耗或抑制Treg例如肿瘤中的Treg的疗法，例如使用CD25的拮抗剂(例如达珠单抗)或通过离体抗CD25珠消耗；影响肿瘤抑制性骨髓细胞功能的疗法；增强肿瘤细胞免疫原性的疗法(如蒽环类药物)；过继性T细胞或NK细胞转移，包括遗传修饰的细胞，例如由嵌合抗原受体修饰的细胞(CAR-T疗法)；抑制代谢酶如吲哚胺二恶英酶(IDO)、二恶英酶、精氨酸酶或一氧化氮合成酶的疗法；可逆转/阻止T细胞无反应性或衰竭的疗法；在肿瘤部位引发固有免疫激活和/或炎症的疗法；施用免疫刺激细胞因子；或阻断免疫抑制细胞因子。
本文所述的激动剂抗CD40抗体可与一种或多种结合阳性共刺激受体的激动剂，通过抑制性受体减弱信号传导的阻断剂，拮抗剂和一种或多种全身性增加抗肿瘤T细胞的频率的药剂，克服肿瘤微环境中不同免疫抑制途径的药剂(例如，阻断抑制受体参与(例如PD-L1/PD-1相互作用)，消耗或抑制Treg(例如使用抗CD25单克隆抗体(例如达克珠单抗)或通过离体抗CD25珠消耗)，抑制代谢酶如IDO，或逆转/阻止T细胞无反应性或衰竭)和在肿瘤部位触发固有免疫激活和/或炎症的药剂一起使用。
本文提供了用于刺激受试者中的免疫应答的方法，包括向受试者施用激动剂抗CD40分子(例如抗体)和一种或多种另外的免疫刺激性抗体，例如抗PD-1拮抗剂，例如拮抗剂抗体，抗PD-L1拮抗剂，例如拮抗剂抗体，拮抗剂抗CTLA-4拮抗剂，例如拮抗剂抗体和/或抗LAG3拮抗剂，例如拮抗剂抗体，使得免疫应答在受试者中被刺激，例如抑制肿瘤生长或刺激抗病毒反应。在一个实施方式中，另外的免疫刺激性抗体(例如拮抗剂抗PD-1，拮抗剂抗PD-L1，拮抗剂抗CTLA-4和/或拮抗剂抗LAG3抗体)是人抗体。
本文还提供了治疗过度增殖性疾病(例如癌症)的方法，包括向受试者施用激动剂抗CD40抗体和拮抗剂PD-1抗体。在一个实施方式中，受试者是人。在另一个实施方式中，抗PD-1抗体是人序列单克隆抗体，抗CD40抗体是人序列单克隆抗体，例如包含本文所述的3C3和3G5的CDR或可变区的抗体或本文描述的另一种激动剂抗CD40抗体。
适用于本文所述方法的PD-1拮抗剂包括但不限于配体、抗体(例如单克隆抗体和双特异性抗体)和多价剂。在一个实施方式中，PD-1拮抗剂是融合蛋白，例如Fc融合蛋白，例如AMP-244。在一个实施方式中，PD-1拮抗剂是抗PD-1或抗PD-L1抗体。
示例性的抗PD-1抗体是WO 2006/121168中所述的纳武单抗(BMS-936558)或包含抗体17D8、2D3、4H1、5C4、7D3、5F4和4A11之一的CDR或可变区的抗体。在某些实施方式中，抗PD1抗体是WO2012/145493中所述的MK-3475(Lambrolizumab)；和WO 2012/145493中所述的AMP-514。进一步已知的PD-1抗体和其它PD-1抑制剂包括WO 2009/014708,WO 03/099196,WO 2009/114335,WO 2011/066389,WO 2011/161699,WO 2012/145493,美国专利号7,635,757和8,217,149,和美国专利公开号2009/0317368中所述的那些。还可以使用WO2013/173223中所公开的任何抗PD-1抗体。作为与这些抗体之一竞争结合和/或与PD-1上的相同表位结合的抗PD-1抗体也可以用于组合治疗。靶向PD-1受体的另一种方法是由与IgG1的Fc部分融合的PD-L2细胞外结构域(B7-DC)组成的重组蛋白，称为AMP-224。
本文提供了治疗过度增殖性疾病(例如癌症)的方法，包括向受试者施用激动剂抗CD40抗体和拮抗剂PD-L1抗体。在一个实施方式中，受试者是人。在另一个实施方式中，抗PD-L1抗体是人序列单克隆抗体，抗CD40抗体是人序列单克隆抗体，例如包含本文所述的3C3和3G5的CDR或可变区的抗体或本文描述的另一种激动剂抗CD40抗体。
在一个实施方式中，抗PD-L1抗体是BMS-936559(在WO 2007/005874和美国专利号7,943,743中称为12A4)，或包含3G10,12A4,10A5,5F8,10H10,1B12,7H1,11E6,12B7和13G4的CDR或可变区的抗体(其描述于PCT公开WO07/005874和美国专利号7,943,743中)。在某些实施方式中，抗PD-L1抗体是MEDI4736(也称为抗B7-H1)、MPDL3280A(也称为RG7446)、MSB0010718C(WO2013/79174)或rHigM12B7。还可以使用WO2013/173223,WO2011/066389,WO2012/145493,美国专利号7,635,757和8,217,149和美国公开号2009/145493中所公开的任何抗PD-L1抗体。与任何这些抗体的表位竞争和/或结合相同表位的抗PD-L1抗体也可以用于组合治疗。
本文提供了治疗过度增殖性疾病(例如癌症)的方法，包括向受试者施用本文所述的抗CD40抗体和CTLA-4拮抗剂抗体。在一个实施方式中，受试者是人。在另一实施方式中，抗CTLA-4抗体是选自由以下组成的组中的抗体：YervoyTM(PCT公开WO 01/14424中所述的伊匹单抗或抗体10D1)，曲美木单抗(以前称为ticilimumab,CP-675,206)，以下任何出版物中所述的单克隆或抗CTLA-4抗体：WO 98/42752；WO 00/37504；U.S.专利号6,207,156；Hurwitz等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(17):10067-10071；Camacho等人(2004)J.Clin.Oncology 22(145)：摘要号2505(抗体CP-675206)；和Mokyr等人(1998)CancerRes.58:5301-5304。还可以使用WO2013/173223中所公开的任何抗CTLA-4抗体。
本文提供了治疗过度增殖性疾病(例如癌症)的方法，包括向受试者施用抗CD40抗体和抗LAG-3抗体。在一个实施方式中，受试者是人。在另一个实施方式中，抗PD-L1抗体是人序列单克隆抗体，抗CD40抗体是人序列单克隆抗体，例如包含本文所述的3C3或3G5的CDR或可变区的抗体或本文所述的另一种激动剂抗CD40抗体。抗LAG3抗体的实例包括包含在美国专利公开号US2011/0150892、WO10/19570和WO2014/008218中所述的抗体25F7、26H10、25E3、8B7、11F2或17E5的CDR或可变区的抗体。在一个实施方式中，抗LAG-3抗体是BMS-986016。可以使用的其它本领域公认的抗LAG-3抗体包括描述于S2011/007023、WO08/132601和WO09/44273中的IMP731和IMP-321。与任何这些抗体的表位竞争和/或结合相同表位的抗LAG-3抗体也可以用于组合治疗。
施用本文所述的抗CD40抗体和针对一种或多种第二靶抗原(例如LAG-3和/或CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1)的拮抗剂(例如拮抗剂抗体)可增强对患者的癌细胞的免疫应答。可以使用本公开的抗体抑制其生长的癌症包括通常对免疫疗法有应答的癌症和通常对免疫疗法无应答的癌症。用本公开的组合疗法治疗的癌症的代表性实例包括本文列出的那些癌症。
在某些实施方式中，本文所讨论的治疗抗体的组合可以在药学上可接受的载体中作为单一组合物同时施用，或者与药学上可接受的载体中的每种抗体的作为单独组合物同时施用。在另一实施方式中，治疗抗体的组合可以顺序施用。例如，可以依次施用抗CTLA-4抗体和抗CD40抗体，例如首先施用抗CTLA-4抗体，然后施用抗CD40抗体，或者首先施用抗CD40抗体，然后施用抗CTLA-4抗体。另外或备选地，可以依次施用抗PD-1抗体和抗CD40抗体，例如首先施用抗PD-1抗体，然后施用抗CD40抗体，或者首先施用抗CD40抗体，然后施用抗PD-1抗体。另外或备选地，可以依次施用抗PD-L1抗体和抗CD40抗体，例如首先施用抗PD-L1抗体，然后施用抗CD40抗体，或者首先施用抗CD40抗体，然后施用抗PD-L1抗体。另外或备选地，可以依次施用抗LAG-3抗体和抗CD40抗体，例如首先施用抗LAG-3抗体，然后施用抗CD40抗体，或者首先施用抗CD40抗体，然后施用抗LAG-3抗体。
此外，如果顺序施用多于一个剂量的组合疗法，则顺序施用的顺序可以在每个施用时间点反转或保持相同的顺序，顺序施用可以与同时施用或其任何组合进行组合。例如，可以同时进行抗CTLA-4抗体和抗CD40抗体的组合的第一施用，可以顺序进行首先抗CTLA-4抗体、然后抗CD40抗体的第二施用，并且可以顺序进行首先抗CD40抗体、然后抗CTLA-4抗体的第三施用，等等。另外或备选地，可以同时进行抗PD-1抗体和抗CD40抗体的组合的第一施用，可以顺序进行首先抗PD-1抗体、然后抗CD40抗体的第二施用，并且可以顺序进行首先抗CD40抗体、然后抗PD-1抗体的第三施用，等等。另外或备选地，可以同时进行抗PD-L1抗体和抗CD40抗体的组合的第一施用，可以顺序进行首先抗PD-L1抗体、然后抗CD40抗体的第二施用，并且可以顺序进行首先抗CD40抗体、然后抗PD-L1抗体的第三施用，等等。另外或备选地，可以同时进行抗LAG-3抗体和抗CD40抗体的组合的第一施用，可以顺序进行首先抗LAG-3抗体、然后抗CD40抗体的第二施用，并且可以顺序进行首先抗CD40抗体、然后抗LAG-3抗体的第三施用，等等。另一代表性给药方案可以涉及顺序进行首先抗CD40、然后抗CTLA-4抗体(和/或抗PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体和/或抗LAG-3抗体)的第一施用，并且可以同时进行后续施用。
在一个实施方式中，具有可受益于免疫系统刺激的疾病例如癌症或传染病的受试者，通过向受试者施用抗CD40抗体和免疫肿瘤剂来治疗，其中免疫-肿瘤学药剂是CD137(4-1BB)激动剂，例如激动性CD137抗体。合适的CD137抗体包括例如urelumab或PF-05082566(WO12/32433)。
在一个实施方式中，具有可受益于免疫系统刺激的疾病例如癌症或传染病的受试者，通过向受试者施用抗CD40抗体和免疫肿瘤剂来治疗，其中免疫-肿瘤学药剂是OX40激动剂，例如激动性OX40抗体。合适的OX40抗体包括例如MEDI-6383、MEDI-6469或MOXR0916(RG7888；WO06/029879)。
在一个实施方式中，具有可受益于免疫系统刺激的疾病例如癌症或传染病的受试者，通过向受试者施用抗CD40抗体和免疫肿瘤剂来治疗，其中免疫-肿瘤学药剂是第二CD40激动剂，例如另一种激动性CD40抗体。
在一个实施方式中，具有可受益于免疫系统刺激的疾病例如癌症或传染病的受试者，通过向受试者施用抗CD40抗体和免疫肿瘤剂来治疗，其中免疫-肿瘤学药剂是CD27激动剂，例如激动性CD27抗体。合适的CD27抗体包括例如varlilumab(CDX-1127)。
在一个实施方式中，具有可受益于免疫系统刺激的疾病例如癌症或传染病的受试者，通过向受试者施用抗CD40抗体和免疫肿瘤剂来治疗，其中免疫-肿瘤学药剂是MGA271(针对B7H3)(WO11/109400)。
在一个实施方式中，具有可受益于免疫系统刺激的疾病例如癌症或传染病的受试者，通过向受试者施用抗CD40抗体和免疫肿瘤剂来治疗，其中免疫-肿瘤学药剂是KIR拮抗剂，例如lirilumab。
在一个实施方式中，具有可受益于免疫系统刺激的疾病例如癌症或传染病的受试者，通过向受试者施用抗CD40抗体和免疫肿瘤剂来治疗，其中免疫-肿瘤学药剂是IDO拮抗剂。合适的IDO拮抗剂包括例如INCB-024360(WO2006/122150,WO07/75598,WO08/36653,WO08/36642)、indoximod,NLG-919(WO09/73620,WO09/1156652,WO11/56652,WO12/142237)或F001287。
在一个实施方式中，具有可受益于免疫系统刺激的疾病例如癌症或传染病的受试者，通过向受试者施用抗CD40抗体和免疫肿瘤剂来治疗，其中免疫-肿瘤学药剂是Toll样受体激动剂，例如TLR2/4激动剂(例如卡介苗)；TLR7激动剂(例如Hiltonol或咪喹莫特)；TLR7/8激动剂(例如瑞喹莫特)；或TLR9激动剂(例如CpG7909)。
在一个实施方式中，具有可受益于免疫系统刺激的疾病例如癌症或传染病的受试者，通过向受试者施用抗CD40抗体和免疫肿瘤剂来治疗，其中免疫-肿瘤学药剂是TGF-β抑制剂，例如GC1008、LY2157299、TEW7197或IMC-TR1。
在一方面，顺序施用抗CD40抗体，然后施用第二药剂例如免疫-肿瘤学药剂。在一方面，同时施用抗CD40抗体与第二药剂例如免疫-肿瘤学药剂。在又一方面，施用第二药剂之后顺序施用抗CD40抗体。两种药剂的施用可以在例如相隔30分钟，60分钟，90分钟，120分钟，3小时，6小时，12小时，24小时，36小时，48小时，3天，5天，7天或一周或多周的时间开始，或者可以在已经施用第一药剂后例如30分钟，60分钟，90分钟，120分钟，3小时，6小时，12小时，24小时，36小时，48小时，3天，5天，7天或一周或多周开始施用第二药剂。
在某些方面，抗CD40抗体和第二药剂例如免疫-肿瘤学药剂同时施用于患者，例如同时输注给患者，例如在30或60分钟的时间段内。或者，抗CD40抗体可以与第二药剂例如免疫-肿瘤学药剂共同配制。
任选地，抗CD40作为唯一的免疫治疗剂，或抗CD40抗体与一种或多种另外的免疫治疗抗体(例如抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1和/或抗LAG-3抗体)的组合可以进一步与免疫原性剂组合，所述免疫原性剂例如癌细胞，纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白，肽和碳水化合物分子)，细胞和用编码免疫刺激细胞因子的基因转染的细胞(He等人(2004)J.Immunol.173:4919-28)。可以使用的肿瘤疫苗的非限制性实例包括黑素瘤抗原的肽，例如gp100，MAGE抗原，Trp-2，MART1和/或酪氨酸酶的肽，或转染以表达细胞因子GM-CSF的肿瘤细胞(下面进一步讨论)。还可以进一步将抗CD40抗体和一种或多种另外的抗体(例如抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1和/或抗LAG-3抗体)与标准癌症治疗组合。例如，可以进一步将抗CD40抗体和一种或多种另外的抗体(例如抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1和/或抗LAG-3抗体)与化学治疗方案有效组合。在这些情况下，可以减少用本公开的组合施用的其它化学治疗剂的剂量(Mokyr等人(1998)Cancer Research 58:5301-5304)。这种组合的实例是抗CD40激动剂抗体(有或没有和另外的抗体，例如抗CTLA-4抗体和/或抗PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体和/或抗LAG-3抗体)与达卡巴嗪组合用于治疗黑素瘤。另一实例是抗CD40抗体(有或没有和抗CTLA-4抗体和/或抗PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体和/或LAG-3抗体)与白细胞介素-2(IL-2)组合用于治疗黑素瘤。抗CD40抗体和抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1和/或抗LAG-3抗体与化学疗法联合使用的科学依据是细胞死亡(这是大多数化学治疗化合物的细胞毒性作用的结果)应该导致抗原呈递途径中肿瘤抗原水平的增加。可能导致与抗CD40抗体(有或没有抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1和/或抗LAG-3抗体)协同作用的其它组合疗法包括放射、手术或激素剥夺。这些方案中的每一种产生宿主中肿瘤抗原的来源。血管生成抑制剂还可以与组合的抗CD40抗体和抗CTLA-4抗体和/或抗PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体和/或抗LAG-3抗体组合。抑制血管生成导致肿瘤细胞死亡，其可以是进入宿主抗原呈递途径的肿瘤抗原的来源。
抗CD40激动剂抗体作为唯一的免疫治疗剂，或CD40激动剂和CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1和/或LAG-3阻断抗体的组合也可以与将表达Fcα或Fcγ受体的效应细胞靶向肿瘤细胞的双特异性抗体组合使用(参见例如美国专利号5,922,845和5,837,243)。双特异性抗体可以用于靶向两种单独抗原。通过使用组合的抗CD40抗体和抗CTLA-4抗体和/或抗PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体和/或抗LAG-3抗体，可以增强这些应答的T细胞臂。
在另一个实例中，抗CD40激动剂抗体作为唯一的免疫治疗剂或抗CD40抗体和另外的免疫刺激剂的组合，例如抗CTLA-4抗体和/或抗PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体和/或LAG-3药剂例如抗体，可以与抗肿瘤抗体一起使用，所述抗肿瘤抗体例如
Figure BDA0003929883480000701
(rituximab)、
Figure BDA0003929883480000702
(trastuzumab)、
Figure BDA0003929883480000703
(tositumomab)、
Figure BDA0003929883480000704
(ibritumomab)、
Figure BDA0003929883480000705
(alemtuzumab)、
Figure BDA0003929883480000706
(eprtuzumab)、
Figure BDA0003929883480000707
(bevacizumab)、和
Figure BDA0003929883480000708
(erlotinib)等等。举例而言并且不希望受理论束缚，用抗癌抗体或与毒素缀合的抗癌抗体的治疗可导致癌细胞死亡(例如肿瘤细胞)，其将增强由免疫刺激剂例如CD40、CTLA-4、PD-1、PD-L1或LAG-3药剂例如抗体介导的免疫应答。在示例性实施方式中，过度增殖性疾病(例如癌症肿瘤)的治疗可以包括抗癌剂例如抗体，与抗CD40和任选的另外的免疫刺激剂例如抗CTLA-4和/或抗CDLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1和/或抗LAG-3剂例如抗体组合，同时或顺序或其任何组合，其可增强宿主的抗肿瘤免疫应答。
肿瘤通过各种机制逃避宿主免疫监视。许多这些机制可以通过蛋白质的失活来克服，所述蛋白质由肿瘤表达并且是免疫抑制的。这些其中包括TGF-β(Kehrl等人(1986)J.Exp.Med.163:1037-1050)，IL-10(Howard&O'Garra(1992)Immunology Today 13:198-200)，和Fas配体(Hahne等人(1996)Science274:1363-1365)。针对这些实体中每一种的抗体可以进一步与抗CD40抗体以及有或没有另外的免疫刺激剂例如抗CTLA-4和/或抗CDLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1和/或抗LAG-3剂例如抗体组合，以抵消免疫抑制剂的作用，并有利于宿主的抗肿瘤免疫应答。
能够用于激活宿主免疫应答的其它药剂(例如抗体)可以在有或没有另外的免疫刺激剂例如抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1和/或抗LAG-3抗体的情况下进一步与抗CD40抗体组合使用。这些包括树突细胞表面上的分子，其激活DC功能和抗原呈递。抗CD40抗体(Ridge等人，同上)可以与抗CD40抗体和任选的另外的免疫刺激剂例如抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1和/或抗LAG-3剂例如抗体结合使用。T细胞共刺激分子的其它活化抗体(Weinberg等人，同上，Melero等人，同上，Hutloff等人，同上)也可提供增加的T细胞激活水平。
如上所述，骨髓移植目前用于治疗多种造血来源的肿瘤。单独或与抗CTLA-4抗体和/或抗PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体和/或抗LAG-3抗体组合的抗CD40免疫疗法可用于增加供体移植肿瘤特异性T细胞的有效性。
几种实验性治疗方案涉及抗原特异性T细胞的离体激活和扩增以及这些细胞过继转移到受体中以产生抗肿瘤的抗原特异性T细胞(Greenberg&Riddell,同上)。这些方法也能够用于激活针对感染原例如CMV的T细胞应答。在抗CD40的存在下、在有或没有另外的免疫刺激疗法例如抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1和/或抗LAG-3抗体的情况下，可以预期离体激活增加过继转移的T细胞的频率和活性。
本文提供了用免疫刺激剂改变与过度增殖性疾病(例如癌症)的治疗相关的不良事件的方法，包括在有或没有有抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1和/或抗LAG-3剂例如抗体的情况下，对受试者施用抗CD40抗体。例如，本文描述的方法提供了通过向患者施用不可吸收的类固醇来降低免疫刺激性治疗性抗体诱导的结肠炎或腹泻的发生率的方法。如本文所用，“不可吸收的类固醇”是糖皮质激素，其表现出广泛的首过代谢，使得在肝脏代谢后，类固醇的生物利用度低，即小于约20％。在本文所述的一个实施方式中，不可吸收的类固醇是布地奈德。布地奈德是局部作用的糖皮质激素，其在口服施用后主要通过肝脏充分代谢。ENTOCORT
Figure BDA0003929883480000712
(Astra-Zeneca)是一种pH值和时间依赖性的布地奈德口服制剂，用于优化向回肠和整个结肠的药物输送。ENTOCORT 
Figure BDA0003929883480000713
在美国被批准用于治疗涉及回肠和/或升结肠的轻度至中度克罗恩病。治疗克罗恩病的ENTOCORT
Figure BDA0003929883480000714
的常用口服剂量是6至9mg/天。ENTOCORT
Figure BDA0003929883480000715
在肠内释放，然后在肠粘膜中被吸收并保留在肠粘膜中。一旦它通过肠粘膜靶组织，ENTOCORT
Figure BDA0003929883480000716
被肝脏中的细胞色素P450系统充分代谢，代谢产物具有可忽略的糖皮质激素活性。因此，生物利用度低(约10％)。布地奈德的低生物利用度导致与其它糖皮质激素相比具有不太充分的首过代谢的治疗比率。与全身作用的皮质类固醇相比，布地奈德导致较少的副作用，包括较少的下丘脑-垂体抑制。但是，
Figure BDA0003929883480000711
的长期施用可导致全身性糖皮质激素效应，例如高钙血症和肾上腺抑制。参见PDR 58thed.2004；608-610。
在又进一步的实施方式中，在有或没有免疫刺激性治疗抗体抗CD40和任选地抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或PD-L1和/或抗LAG-3抗体的情况下，与不可吸收的类固醇结合的抗CD40抗体可以进一步与水杨酸盐组合。水杨酸盐包括5-ASA剂，例如：柳氮磺胺吡啶(
Figure BDA0003929883480000721
Pharmacia&UpJohn)；奥沙拉秦(
Figure BDA0003929883480000722
Pharmacia&UpJohn)；巴柳氮(
Figure BDA0003929883480000723
Salix Pharmaceuticals,Inc.)；和美沙拉嗪(
Figure BDA0003929883480000724
Procter&Gamble Pharmaceuticals；
Figure BDA0003929883480000725
Shire US；
Figure BDA0003929883480000726
AxcanScandipharm,Inc.；
Figure BDA0003929883480000727
Solvay)。
根据本文所述的方法，水杨酸盐在有或没有抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1和/或LAG-3抗体的情况下与抗CD40和不可吸收的类固醇组合施用，用于降低免疫刺激抗体诱导的结肠炎的发病率。因此，例如，用于降低由本文所述的免疫刺激性抗体诱导的结肠炎发病率的方法包括同时或顺序施用水杨酸盐和不可吸收的类固醇(例如在不可吸收的类固醇后6小时施用水杨酸盐)，或任何其组合。此外，水杨酸盐和不可吸收的类固醇可以通过相同的途径(例如两者都是口服施用)或通过不同的途径施用(例如水杨酸盐口服施用，不可吸收的类固醇直肠施用)，这可以与用于施用抗CD40和抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1和/或抗LAG-3抗体的途径不同。
本文所述的抗CD40抗体和组合抗体疗法还可以与其它众所周知的疗法联合使用，所述疗法因其对抗所治疗适应症(例如癌症)的特定用途而被选择。本文所述的抗CD40抗体的组合可以与已知的药学上可接受的药剂顺序使用。
例如，本文所述的抗CD40抗体和组合抗体疗法可以与另外的治疗组合(例如，同时或分开)组合使用，例如照射，化疗(例如，使用喜树碱(CPT-11)，5-氟尿嘧啶)(5-FU)，顺铂，多柔比星，伊立替康，紫杉醇，吉西他滨，顺铂，紫杉醇，卡铂-紫杉醇(Taxol)，多柔比星，5-fu或喜树碱+apo2l/TRAIL(6X组合)，一种或多种蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米或MG132)，一种或多种Bcl-2抑制剂(例如BH3I-2'(bcl-xl抑制剂)，吲哚胺双加氧酶-1抑制剂(例如INCB24360，indoximod，NLG-919或F001287)，AT-101(R-(-)-棉酚衍生物)，ABT-263(小分子)，GX-15-070(obatoclax)，或MCL-1(髓样白血病细胞分化蛋白-1)拮抗剂)，iAP(细胞凋亡蛋白抑制剂)拮抗剂(例如smac7，smac4，小分子模拟物，合成smac肽(参见Fulda等人，NatMed 2002；8:808-15)，ISIS23722(LY2181308)，或AEG-35156(GEM-640))，HDAC(组蛋白脱乙酰酶)抑制剂，抗CD20抗体(例如利妥昔单抗)，血管生成抑制剂(例如贝伐单抗)，靶向VEGF和VEGFR的抗血管生成剂(例如Avastin)，合成三萜类(参见Hyer等人，Cancer Research2005；65:4799-808)，c-FLIP(细胞FLICE抑制蛋白)调节剂(例如PPARγ(过氧化物酶体增殖物激活受体γ)的天然和合成配体，5809354或5569100)，激酶抑制剂(如索拉非尼)，曲妥珠单抗，西妥昔单抗，替西罗莫司，mTOR抑制剂如雷帕霉素和替西罗莫司，硼替佐米，JAK2抑制剂，HSP90抑制剂，PI3K-AKT抑制剂，来那度胺，GSK3β抑制剂，IAP抑制剂和/或基因毒性药物。
本文所述的抗CD40抗体和组合抗体疗法可进一步与一种或多种抗增殖细胞毒性剂组合使用。可用作抗增殖细胞毒性剂的化合物类别包括但不限于以下：
烷化剂(包括但不限于氮芥，乙烯亚胺衍生物，烷基磺酸盐，亚硝基脲和三氮烯)：乌拉莫司汀，盐酸氮芥，环磷酰胺(CYTOXANTM)异环磷酰胺，美法仑，苯丁酸氮芥，派铂溴烷，三亚乙基三聚氰胺，三乙烯硫代磷胺，白消安，卡莫司汀，洛莫司汀，链脲佐菌素，达卡巴嗪和替莫唑胺。
抗代谢物(包括但不限于叶酸拮抗剂，嘧啶类似物，嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂)：甲氨蝶呤，5-氟尿嘧啶，氟尿苷，阿糖胞苷，6-巯基嘌呤，6-硫鸟嘌呤，氟达拉滨磷酸盐，喷司他丁和吉西他滨。
用于与激动剂抗CD40抗体组合的合适的抗增殖剂不限于紫杉烷，紫杉醇(可以商品名TAXOLTM获得紫杉醇)，多西紫杉醇，盘皮海绵内酯(DDM)，dictyostatin(DCT)，Peloruside A，埃博霉素，埃博霉素A，埃博霉素B，埃博霉素C，埃博霉素D，埃博霉素E，埃博霉素F，呋喃埃博霉素D，脱氧埃博霉素B1，[17]-脱氢脱氧埃博霉素B，[18]脱氢脱氧埃博霉素B，C12,13-环丙基-埃博霉素A，C6-C8桥联埃博霉素A，反式-9,10-脱氢埃博霉素D，顺式-9,10-脱氢埃博霉素D，16-脱甲基埃博霉素B，埃博霉素B10，discoderomolide，patupilone(EPO-906)，KOS-862，KOS-1584，ZK-EPO，ABJ-789，XAA296A(Discodermolide)，TZT-1027(soblidotin)，ILX-651(tasidotin盐酸盐)，Halichondrin B，艾日布林甲磺酸酯(E-7389)，Hemiasterlin(HTI-286)，E-7974，Cyrptophycins，LY-355703，美登木素生物碱免疫缀合物(DM-1)，MKC-1，ABT-751，T1-38067，T-900607，SB-715992(伊斯平斯)，SB-743921，MK-0731，STA-5312，eleutherobin，17β-乙酰氧基-2-乙氧基-6-氧代-B-高雌-1,3,5(10)-三烯-3-醇，cyclostreptin，isolaulimalide，laulimalide，4-表-7-脱氢-14,16-二甲基-(+)盘皮海绵内酯和cryptothilone 1，以及本领域已知的其它微管稳定剂。
在需要与本文所述的抗CD40抗体一起或在用本文所述的抗CD40抗体治疗之前使异常增殖细胞静止的情况下，激素和类固醇(包括合成类似物)，例如17α-乙炔雌二醇，乙菧酚，睾酮，泼尼松，氟甲睾酮，屈他雄酮丙酸酯，Testolactone，醋酸甲地孕酮，甲泼尼龙，甲基睾酮，泼尼松龙，去炎松，三对甲氧苯氯乙烯，羟孕酮，氨鲁米特，雌莫司汀，醋酸甲羟孕酮，亮丙瑞林，氟他胺，托瑞米芬，ZOLADEXTM，也可以施用于患者。当使用本文所述的方法或组合物时，也可以根据需要施用在临床环境中用于调节肿瘤生长或转移的其它药剂，例如抗模拟剂。
用于安全有效地施用化学治疗剂的方法是本领域技术人员已知的。另外，它们的施用在标准文献中描述。例如，许多化学治疗剂的施用描述于Physicians'Desk Reference(PDR)，例如1996年版(Medical Economics Company,Montvale,N.J.07645-1742,USA)；其公开内容在此通过引用并入本文。
可根据本领域熟知的治疗方案施用化学治疗剂和/或放射疗法。对于本领域技术人员显而易见的是，化学治疗剂和/或放射疗法的施用可以根据所治疗的疾病和化学治疗剂和/或放射疗法对那种疾病的已知作用而变化。而且，根据熟练临床医生的知识，考虑到所施用的治疗剂对患者的观察效果，并且鉴于观察到的疾病对于给药的治疗剂的应答，可以改变治疗方案(例如剂量和施用时间)。
VI.结果
如本文实施例中所示，与单独用抗体或与在不存在抗体疗法的情况下用一种或多种另外的治疗剂治疗相比，抗CD40抗体与一种或多种另外的治疗剂(例如可溶性CD40配体或另一种抗体，例如抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体和/或抗LAG-3抗体)的共同施用提供了改善的功效。优选地，抗CD40抗体与一种或多种另外的治疗剂的组合表现出治疗协同作用。
“治疗协同作用”是指这样一种现象，即用治疗剂组合治疗的患者在表现出治疗上优于其最佳剂量下使用的组合的每个单独成分所获得的结果的结果(T.H.Corbett等人，1982,Cancer Treatment Reports,66,1187)。在这种情况下，治疗上优异的结果是这样的结果，其中患者或a)当接受等于或大于组合的个体成分各自作为单一疗法以组合中相同剂量施用的治疗益处的治疗益处，表现出较少的不良事件发生率，或b)当接受大于当每种成分在组合中以相同剂量施用时作为单独组分施用时组合中每种个体成分的治疗益处的治疗益处时，不显示剂量限制性毒性。在异种移植模型中，以其最大耐受剂量使用的组合，其中每种成分将以通常不超过其个体最大耐受剂量的剂量存在，在例如通过施用当成分单独施用时，该组合大于最佳成分的肿瘤生长减少的值的组合实现肿瘤生长减少时表现出治疗协同作用。
因此，与用抗CD40抗体的单一疗法或在不存在抗体疗法的情况下用另外的治疗剂治疗相比，这些组合的成分在组合中对抑制肿瘤生长具有加和或超加和效应。“加和”是指比单一疗法与每个单独成分达到的最佳单独结果程度更大的结果(例如，肿瘤有丝分裂指数或肿瘤生长的减少程度或肿瘤缩小程度或无症状或症状-减轻时间的频率和/或持续时间)，而“超加和”用于表示超出这些单独结果总和的结果。在一个实施方式中，加和效应测量为缩短或终止肿瘤生长。加和效应还可以测量为例如肿瘤尺寸的减小，肿瘤有丝分裂指数的降低，转移性病灶的数量随时间的减少，总体应答率的增加，或中位数或总体存活的增加。在另一实施方式中，加和效应测量为当与Ramos细胞一起温育时，增加CD95表达的诱导，当与人B细胞温育时增加B细胞增殖，和/或当与树突细胞温育时增加IL12p40表达的诱导增加。
可以定量治疗性治疗的有效性的量度的一个非限制性实例是通过计算log10细胞杀伤，其根据以下等式确定：
log10细胞杀伤＝T C(天)/3.32×Td
其中T C表示细胞生长的延迟，即治疗组(T)的肿瘤和对照组(C)的肿瘤达到预定值(例如1g或10mL)的平均时间(天)，并且Td表示在对照动物中肿瘤体积加倍所需的时间。当应用该测量时，如果log10细胞杀伤大于或等于0.7，则认为产品是有活性的，并且如果log10细胞杀伤大于2.8，则认为产品非常有活性。使用该测量，当log10细胞杀伤大于当最佳成分单独施用时最佳成分log10细胞杀伤的值时，以其自身最大耐受剂量使用的组合(其中每种成分以通常小于或等于其最大耐受剂量的剂量存在)，表现出治疗协同作用。在示例性情况下，组合的log10细胞杀伤超过组合的最佳成分的log10细胞杀伤值至少0.1log细胞杀伤，至少0.5log细胞杀伤，或至少1.0log细胞杀伤。
通过以下实施例进一步说明本发明，这些实施例不应解释为进一步的限制。在本申请中引用的序列表、附图和所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容通过引用明确地并入本文。
实施例
实施例1
产生CD40特异性人单克隆抗体
通过用可溶性人CD40抗原免疫
Figure BDA0003929883480000761
转基因小鼠的H2L2株产生人抗CD40单克隆抗体。
Figure BDA0003929883480000762
转基因小鼠已经敲除了内源性小鼠重链(HC)和κ轻链(κ链)DNA序列并且具有稳定地并入小鼠基因组中的人可变(V)区和大鼠恒定(C)区的序列。
抗原和免疫：抗原是包含与抗体Fc结构域融合的CD40细胞外结构域的可溶性融合蛋白(R&D Systems)，或重组人CD40-msG2a嵌合蛋白(内部制备)。将抗原与完全弗氏佐剂(Sigma)佐剂混合用于第一次免疫。此后，将抗原与不完全弗氏(Sigma)混合。在MPL加TDM佐剂系统(Sigma)中用可溶性CD40蛋白免疫另外的小鼠。将溶于PBS中的5-25微克可溶性重组CD40抗原或在PBS中的转染用于人CD40表面表达的5×106个NSO细胞与佐剂1:1混合。每14天向小鼠注射200微升制备的抗原进入腹膜腔。在融合前三至四天，对产生抗CD40效价的动物静脉内注射5-10微克可溶性重组CD40抗原。收获小鼠脾脏，并将分离的脾细胞用于杂交瘤制备。
杂交瘤制备：将P3x63Ag8.653鼠骨髓瘤细胞系(ATCC CRL 1580)用于融合。含有10％FBS的RPMI 1640(Invitrogen)用于培养骨髓瘤细胞。杂交瘤生长培养基中添加了另外的培养基补充剂，其中包括：至多10％的杂交瘤增强补充剂(Sigma)，10％FBS(Sigma)，L-谷氨酰胺(Gibco)，0.1％庆大霉素(Gibco)，2-巯基乙醇(Gibco)，具有HAT(Sigma)；1.0×104M次黄嘌呤，4.0×10-7M氨基蝶呤，1.6×10-5M胸苷培养基。
将脾细胞与P3x63Ag8.653骨髓瘤细胞以6:1的比例混合，并通过离心沉淀。在小心混合下滴加聚乙二醇以促进融合。使杂交瘤生长一至两周直至可见集落形成。收获上清液并使用人可溶性CD40融合蛋白和大鼠Fc特异性检测通过ELISA初步筛选大鼠IgG。然后通过流式细胞术测定IgG阳性上清液的CD40特异性。还筛选了杂交瘤与食蟹猴CD40的交叉反应性，并且所有都是结合阳性的。
扩增杂交瘤细胞并冷冻细胞沉淀用于RNA分离和测序。使用来自相应杂交瘤的RNA鉴定人mAb的VH和VL编码区。将RNA逆转录为cDNA，通过PCR扩增V编码区并对PCR产物进行测序，插入人IgG2载体中，瞬时表达和通过蛋白A柱层析纯化，这导致分离出许多特别感兴趣的抗体，其被命名为3C3、3G5、1B4、3B6、6H6、6H6、2E1.2、1B5-NK(在后者的情况下，在重链的FR3上进行N75K修饰后)和3B6-NS(在N63S修饰轻链FR3上的抗体3B6以去除N-连接的糖基化位点之后)。
表1、2和3总结了人mAb的VH和VL区的种系信息和氨基酸序列(在氨基酸序列的情况下，互补决定区(CDR)加下划线)。相应的核酸序列在这些实施例的末尾标题为“序列表概述”的序列表中提供。
表1-种系数据
Figure BDA0003929883480000771
Figure BDA0003929883480000781
表2-CDR序列
Figure BDA0003929883480000782
Figure BDA0003929883480000791
表3-全长可变区序列
Figure BDA0003929883480000792
Figure BDA0003929883480000801
Figure BDA0003929883480000811
抗体3C3的重链和轻链的完整氨基酸序列如下：
轻链序列(去除了前导序列)
Figure BDA0003929883480000812
重链序列(去除了前导序列)
Figure BDA0003929883480000813
在每种情况下，可变序列以斜体显示，恒定结构域以粗体显示。恒定结构域序列是已从中除去C-末端赖氨酸的IgG2序列。
将相同的恒定结构域序列用于具有如上所列的各自可变序列的其它抗体。
实施例2
通过生物层干涉法(BLI)测定人mAb的亲和力和速率常数
根据制造商的指导，使用OctetTM QKe仪器(Pall ForteBio,Menlo Park,CA)通过生物层干涉测量法(BLI)检查各种人抗CD40抗体的结合亲和力和结合动力学。
在抗人Fc捕获(AHC)生物传感器(Fortebio产品号18-5060)上捕获来自实施例1的纯化抗体。每种抗体在稀释缓冲液(10mMPO4+150mM NaCl+1mg/mL BSA+0.5％Tween 20，pH7.2)中制备至0.5μg/mL，并在25℃和1000rpm平板摇动速度下加载到新鲜水合的AHC生物传感器上35-50秒，以实现靶应答为0.2nm。捕获低水平的配体以限制分析物的质量传递对动力学参数的任何影响。对于一次测定，八个生物传感器装载有相同的抗体。
通过将六个装载抗体的生物传感器暴露于分析物：可溶性人CD40-MsIgG2a(Celldex，通过SDS-PAGE测定为60kD)以测定结合。使用稀释缓冲液中的分析物的2倍系列稀释液在25℃和1000rpm平板摇动速度下测定亲和力测量值。将分析物孔中的载有抗体的生物传感器结合进行1200秒，然后将生物传感器移至稀释缓冲液孔中2.5小时(9000秒)以进行解离测量。
在每种情况下通过将两个剩余的生物传感器与捕获的抗体保持在稀释缓冲液孔中进行相应的对照以进行结合和解离步骤。对照生物传感器的数据用于减去背景并解释生物传感器漂移和抗体与生物传感器的解离。
在每种情况下使用Fortebio的数据分析软件版本8.2.0.7(Pall ForteBio,MenloPark,CA)以从稀释缓冲液中与捕获的抗体结合的分析物的浓度系列得到动力学参数。根据制造商的指南，使用数据分析软件将结合和解离曲线拟合至1:1结合模型。
确定的亲和力和动力学参数(减去背景)显示在图1中，其中kon＝结合速率常数，kdis＝解离速率常数，KD＝解离平衡结合常数，由比率kdis/kon确定。
实施例3
确定CD40的人mAb结合特征的测定
用溶于PBS中的重组人CD40-Fc包被微量滴定板，然后用溶于PBS中的5％牛血清白蛋白封闭。加入各种浓度的来自实施例1的蛋白A纯化的人mAb和同种型对照，并在37℃温育。用PBS/Tween洗涤平板，然后在37℃与缀合至辣根过氧化物酶的山羊抗人IgG F(ab’)2特异性多克隆试剂一起温育。洗涤后，将板用HRP底物显色，并使用微量滴定板读数器在OD450-650下分析。代表性结合曲线如图2所示。
为了确定食蟹猴是测试抗CD40 mAb的相关模型，将纯化的食蟹猴PBMC或人PBMC与不同浓度的抗人CD40 mAb在室温下在平板振荡器上温育20分钟。然后用含有0.1％BSA和0.05％NaN3(PBA)的PBS洗涤细胞两次。在室温下在平板振荡器上加入山羊抗人IgG Fc-PE抗体20分钟。通过随后用缀合了别藻蓝蛋白(APC)的CD20抗体染色鉴定B细胞。通过流式细胞术分析细胞，结合曲线显示在图3中，其表明与来自食蟹猴和人的CD40相似的结合。
实施例4
通过ELISA阻断sCD40L结合
通过ELISA测量来自实施例1的人mAb对可溶性CD40配体(sCD40L)与CD40蛋白结合的影响。用来自R&D Systems的2μg/ml可溶性重组人CD40/Fc嵌合体包被微量滴定板，然后用5％PBA封闭。将抗CD40抗体([终末]＝100μg/mL)加入板中，然后加入来自Immunex的可溶性人重组CD40L-生物素([终浓度]＝0.5μg/mL)。用链霉抗生物素蛋白-HRP和底物SuperBlue TMB检测CD40捕获的rCD40L。结果显示在图4A和B中，并带有所示的对照。
实施例5
与CD40细胞结合
通过流式细胞术研究抗CD40人mAb与在其表面上表达人CD40的人细胞上的CD40结合的能力如下：
测试来自实施例1的抗体与在其表面上表达人CD40的人细胞系的结合。将蛋白A纯化的人mAb 3C3、3G5、1B4、3B6和6H6与表达人CD40的Raji和Ramos细胞在室温下在平板振荡器上温育。20分钟后，用含有0.1％BSA和0.05％NaN3的PBS(PBA)洗涤细胞，通过将细胞与PE标记的山羊抗人IgG Fc特异性探针一起温育来检测结合的抗体。用PBA从细胞中洗去过量的探针，并根据制造商的说明，使用FACSCanto IITM仪器(BD Biosciences,NJ,USA)通过分析确定细胞相关荧光。
如图5(与Raji细胞结合)和图6(与Ramos细胞结合)所示，随着抗体浓度的变化，人mAb表现出与表达人CD40的细胞的高水平结合。
实施例6
Ramos细胞上的CD95诱导
将Ramos细胞在37℃、6％CO2下与2ug/mL来自实施例1的人抗CD40 mAb一起温育过夜。然后第二天，用PBA将它们洗涤一次，并在室温下用缀合了PE的抗CD95抗体(BectonDickinson)摇动染色20分钟。洗去过量的标记抗体，并在FACSCanto IITM仪器(BDBiosciences,NJ,USA)上读取样品。如图7A和B所示(其中阴影图表示未处理/对照细胞，黑线表示用所示抗体处理的细胞)，3C3和1B5-NK抗体显示CD95的增加，而其它抗体3G5、1B4、3B6、6H6、2E1.2和3B6-NS能够诱导表面表达的CD95表达的强烈增加。
实施例7
树突细胞激活
树突细胞如下衍生自人单核细胞：
将PMBC加入到T175cm2瓶中，使单核细胞在37℃、6％CO2下粘附约2小时。取出细胞并将单核细胞在含有10％ FBS、10ng/mL IL-4(R&D Systems)和100ng/mL GM-CSF(R&DSystems)的RPMI中培养7天。收获细胞并通过CD11c的表达证实是树突细胞(未显示)。
然后将细胞在来自实施例1的10ug/mL 3C3和3G5人抗CD40抗体和适当对照的存在下于37℃、6％CO2温育。72小时后，收获细胞，收集上清液并储存用于细胞因子分析。细胞用以下标记的抗体在室温下摇动染色20分钟：HLA-DR V450、CD54 PE、CD86 APC和CD83 BV510(均来自BD)。然后将细胞洗涤两次并在FACSCanto IITM仪器(BD Biosciences,NJ,USA)上分析。图8A显示当与指定的抗体或对照温育时这些标记中的每一种的表达水平。
通过ELISA(R&D Systems)在来自这些72小时培养物的上清液中评估IL-12p40的诱导。图9A显示相对于如所示的对照，用3C3和3G5抗CD40抗体产生IL-12p40的增加。
在进一步的实验中，将细胞在来自实施例1的10、1和0.1ug/mL 3C3和3G5人抗CD40抗体和适当对照的存在下于37℃、6％CO2温育。48小时后，收获细胞，收集上清液并储存用于细胞因子分析。将细胞用CD54标记的抗体(BD)在室温下摇动染色20分钟。然后将细胞洗涤两次并在FACSCanto IITM仪器(BD Biosciences,NJ,USA)上分析。图8B显示当与指定的抗体或对照温育时CD54的表达水平。
通过ELISA(R&D Systems)在来自这些48小时培养物的上清液中评估IL-12p40的诱导。图9B显示相对于如所示的对照，用3C3和3G5抗CD40抗体产生的IL-12p40增加。
实施例8
B细胞激活
将全血与来自实施例1的10ug/mL 3C3和3G5抗CD40抗体在37℃、6％CO2温育过夜。第二天，使用以下标记的抗体染色B细胞和激活标志物：CD54PE、HLA-DR V450、CD23 PerCP-Cy5.5、CD69 APC、CD86 APC、CD38PerCP-Cy5.5和CD71 PE。将细胞在室温下摇动染色20分钟，然后将细胞洗涤两次并在FACSCanto IITM仪器(BD Biosciences,NJ,USA)上分析。图10A显示了相对于所示对照的这些标志物中每一种的表达水平的变化。
在进一步的实验中，将全血与来自实施例1的10、1和10ug/mL 3C3和3G5抗CD40抗体在37℃、6％CO2温育过夜。第二天，使用以下标记的抗体染色B细胞和激活标志物：CD19V500,HLA-DR V450,CD86 APC(均来自BD)。将细胞在室温下摇动染色20分钟，然后将细胞洗涤两次并在FACSCanto IITM仪器(BD Biosciences,NJ,USA)上分析。图10B显示了相对于所示对照的这些标志物中每一种的表达水平的变化。
实施例9
NFκB激活
将表达CD40的荧光素酶报告细胞系在37℃、6％CO2与各种浓度的来自实施例1的人抗CD40抗体一起温育6小时。根据制造商的指导，用Promega的荧光素酶测定系统检测荧光素酶表达。图11A和11B显示，随着抗体浓度的变化，由3C3、3G5、1B4、3B6、6H6、2E1.2、1B5-NK和3B6-NS抗体诱导的高水平NFkB激活。
实施例10
Raji异种移植SCID小鼠模型中的肿瘤杀伤
将CB.17SCID小鼠(购自Taconic Biosciences,Inc.)保持在无病原体的小鼠设施中。将淋巴瘤Raji细胞(1×106)皮下注射到SCID小鼠中，每组5只小鼠。在第1、5和11天，通过腹膜内施用、每剂量0.3mg，用CD40人mAb克隆3C3和3G5处理这些小鼠。用卡尺每周测量2次肿瘤生长。肿瘤生长和存活分析的结果显示在图12中，从中可以看出，在肿瘤攻击的小鼠中，相对于盐水处理的对照，用抗CD40抗体处理抑制肿瘤的生长并显著延长存活。
实施例11
Ramos异种移植SCID小鼠模型中的肿瘤杀伤
将CB.17SCID小鼠(购自Taconic Biosciences,Inc.)保持在无病原体的小鼠设施中。将人淋巴瘤Ramos细胞(1×106)在第0天皮下注射到SCID小鼠中，每组5只小鼠。在第1、5和11天，通过腹膜内施用、每剂量0.3mg，用抗CD40人mAb 3C3或3G5处理这些小鼠。用卡尺每周测量2次肿瘤生长。
结果如图13所示，表明与盐水处理的对照相比，抗CD40 mAb显著抑制肿瘤体积的生长，导致肿瘤攻击小鼠的100％(3G5)或80％(3C3)的存活。
实施例12
T细胞增殖
从血沉棕黄层预制物中分离的人外周血单核细胞(PBMC)在室温下用0.5uM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记，同时旋转5分钟。将CFSE标记的PBMC(1.5×106)分配到干涂有浓度为0.2ug/mL的抗CD3抗体(OKT3)的孔中。
将CD40抗体(3G5、3C3、1412)或同种型对照(IgG2)以可溶形式分配到孔中，终浓度为10ug/mL。将板在37℃(5％CO2)温育。在第6天，收获细胞并用抗CD3-APC或同种型对照染色，并通过流式细胞术分析。代表性的图显示在图14A中，从中可以看出抗体显著增强T细胞增殖，如CD3+门中CFSE染色强度降低所证明的。重复实验的结果显示在图14B中，其显示相对于同种型对照，用抗CD40抗体分裂细胞的增加。
实施例13
与CD40结合而不依赖于Fc受体相互作用
用溶于PBS中的重组人CD40-Fc包被微量滴定板，然后用溶于PBS中的5％牛血清白蛋白封闭。加入各种浓度的来自实施例1的蛋白A纯化的人mAb(如图所示，整个IgG和F(ab’)2片段)，并在37℃温育。用PBS/Tween洗涤平板，然后在37℃与缀合至辣根过氧化物酶的山羊抗人IgG F(ab’)2特异性多克隆试剂一起温育。洗涤后，将板用HRP底物显色，并使用微量滴定板读数器在OD450-650下分析。结果显示于图15中。每种抗体的IgG2和F(ab)’2形式显示出与CD40-Fc结合的类似浓度依赖性。
实施例14
CD40激活而不依赖于Fc受体相互作用
将来自上述实施例9的表达CD40的荧光素酶报告细胞系在37℃、6％CO2与各种浓度的人抗CD40抗体(如图所示，整个IgG和F(ab’)2片段)一起温育6小时。根据制造商的指导，用Promega的荧光素酶测定系统检测荧光素酶表达。结果显示于图16中。这些结果表明CD3介导3C3和3G5激活报告细胞系不需要与Fc受体结合，因为具有Fc结构域的完整抗体及其缺乏Fc结构域的相应F(ab)'2形式都能够激活报告细胞系的NFkB。
实施例15
CD95诱导而不依赖于Fc受体相互作用
将Ramos细胞在37℃、6％CO2下与各种浓度的人抗CD40 mAb(如图所示，整个IgG和F(ab’)2片段)一起温育过夜。第二天，用PBA将它们洗涤一次，并在室温下用缀合了PE的抗CD95抗体(Becton Dickinson)摇动染色20分钟。洗去过量的标记抗体，并在FACSCanto IITM仪器(BD Biosciences,NJ,USA)上读取样品。结果显示于图17中。这些数据表明3G5不需要Fc受体相互作用来诱导CD40+人淋巴母细胞系Ramos上CD95的表达。
实施例16
与sCD40L协同作用
将Ramos细胞与抗体3C3加或减0.1mg/ml可溶性CD40配体一起温育过夜。然后用抗CD95-PE抗体染色细胞并通过流式细胞术分析。结果显示在图19中，表明抗CD40抗体3C3与sCD40L协同作用。因此，抗体3C3(和与3C3结合相同表位的抗CD40抗体)与可溶性CD40配体(sCD40L)表现出协同的激动性效应，因此具有与其它治疗剂包括那些与人CD40的配体结合位点结合的治疗剂协同作用的能力。代表性协同作用包括例如与涉及免疫功能上调的显著治疗益处相关的特定功能特性(例如疫苗疗法中的T细胞介导的免疫应答，癌症治疗中的NK激活)，抑制细胞生长(例如在癌症治疗中)和/或由APC增强的抗原加工和呈递(例如在疫苗疗法中)。
实施例17
抗CD40人抗体3C3和3G5以及sCD40的表位作图
i)可溶性CD40的截短和突变片段(sCD40)。
通过GenScript合成编码跨越氨基酸残基1-173的全长细胞外结构域(ECD)(SEQID NO：133)以及编码氨基酸1-94、36-130和84-173的三个较小片段的可溶性CD40(sCD40)cDNA，并将其框内插入具有N-末端人κ轻链和C-末端Flag标签的哺乳动物表达载体中。通过瞬时转染到ExpiCHO-S细胞(SAFC)中表达所得的κ-sCD40-Flag融合蛋白。由于CD40抗体3C3识别人和猴而不是小鼠CD40，因此基于人和小鼠序列之间的差异设计了一系列突变的sCD40aa1-94cDNA，如图20和21中的比对所示。通过GenScript合成和克隆突变体。将所有这些截短或突变的片段克隆到相同的载体中，并用与前述相同的细胞系表达。
ii)通过ELISA测定结合
通过ELISA测试3C3与一系列sCD40片段的结合。将1g/ml纯化的κ-sCD40-Flag融合蛋白或含有sCD40融合蛋白的CHO细胞上清液捕获到微量滴定板上，所述微量滴定板用PBS中的5μg/ml小鼠抗Flag抗体(Sigma)预包被并用PBS中含5％牛血清白蛋白。在与CD40抗体温育后，用PBS/Tween洗涤微量培养板，并与缀合至辣根过氧化物酶的山羊抗人IgG Fc多克隆试剂一起温育。洗涤后，将板用HRP底物显色，并使用微量滴定板读数器在OD 450-650下分析。用平行进行用山羊抗人IgG Fab2-HRP测量κ链结合的ELISA，以验证来自不同转染的sCD40融合蛋白表达。
用约1ug/ml全长sCD40和3个截短片段的ELISA分析确定sCD40 N-末端残基1-94是必需的并且足以结合3C3，因为编码氨基酸残基1-94的片段以及整个ECD也与3C3结合，但编码该序列的氨基酸残基36-130或84-173的片段完全不结合(参见表4)。
表4平均OD
Figure BDA0003929883480000891
基于这些结果，3C3的关键识别位点在氨基酸1-35内。
为了进一步鉴定3C3结合位点构象组织的关键区域和氨基酸残基，通过ELISA检测约2ug/ml的13个突变的sCD40(氨基酸残基1-94)片段(4个区域性多重突变和9个单突变)(参见显示来自单独实验的结果的表5和6，和图22)。
表5平均OD
Figure BDA0003929883480000892
Figure BDA0003929883480000901
表6OD
Figure BDA0003929883480000902
Figure BDA0003929883480000911
残基1-5的多个突变几乎完全消除了3C3。残基1-4的点突变不会降低与3C3的结合。残基5的点突变显著降低了结合，但没有达到多个突变蛋白的程度。
残基13-15的多个突变不会降低3C3的结合。残基25、26、28和30的多个突变导致3C3的轻微减少。在这些区域未测试点突变。
残基33-36的多个突变几乎完全消除了3C3结合。残基35的点突变对结合没有影响。残基33、34和36的点突变降低了3C3结合，但没有达到多个突变蛋白的程度。测试另一种CD40抗体3G5与所有片段和突变体的结合，并显示与3C3不同(表6)。残基1-5的多个突变不会降低结合，而残基33-36的突变消除了结合。与3C3不同，残基33的点突变完全消除了结合，34的突变显著降低了结合。
实施例18
生物学和毒性谱
在幼稚食蟹猴中进行非GLP试点研究。本研究旨在提供3C3的生物学和毒性谱的初步数据。还评估了另一种抗CD40抗体(3G5)。在第1天(0.2mg/kg或媒介物)通过静脉注射在大隐静脉中施用测试制品，并且在第29天(2mg/kg或媒介物)再次施用。在第1天和第29天，动物还接受了皮下(1mg)注射匙孔血蓝蛋白(KLH)。对潜在测试物品相关效应的评估基于临床体征，体温，临床病理学参数(血液学，凝血，临床化学和尿分析)，抗药物抗体，细胞因子，T细胞依赖性抗体应答分析(TDAR)，流式细胞术和毒代动力学参数。在测试物品施用之前记录体重一次，之后每周记录体重。这设计为没有计划尸检的生存研究。
在该研究中给予3C3或3G5在食蟹猴中具有良好的耐受性，而没有任何毒性参数明显超出对照水平。值得注意的是给予3C3的猴子中天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和肌酸激酶的最小升高(图23A-23C)。在给药抗CD40的动物中均观察到IL-12(图24)白细胞(图25A)、中性粒细胞(图25B)和淋巴细胞(图25C)的药理学降低，最明显的是B细胞的短暂降低(图26和27)。总之，3C3和3G5在此条件下显示出极小的毒性证据。
实施例19
B细胞增殖而不依赖于Fc相互作用
通过使用CD19珠的磁性选择从外周血单核细胞分离人B细胞。在室温下用0.5uM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记细胞，同时旋转5分钟。标记的细胞在抗CD40 mAb 3C3或同种型对照(整个IgG和F(ab’)2片段两者)存在下培养6天。然后收获细胞并通过流式细胞术分析增殖。结果显示在图28中，表明CD40介导的3C3增殖不需要与Fc受体结合，因为具有Fc结构域的完整抗体及其缺乏Fc结构域的相应F(ab)’2形式都能够诱导B细胞增殖。
实施例20
与人B细胞中的CD40L协同作用
如实施例19分离并标记人B细胞。在存在或不存在0.1ug/mL可溶性CD40L(Immunex)的情况下，将抗CD40 mAb 3C3或0.1ug/mL的同种型对照与细胞一起温育6天。图29显示单独使用3C3或与CD40L结合的同种型对照抗体未观察到显著增殖，但是当CD40L与培养物中的3C3组合时诱导增殖。
制备树突细胞，并如实施例7中那样在加入或不加入0.1ug/mL可溶性CD40L的情况下用0.5ug/mL 3C3培养。通过ELISA(R&D Systems)测量IL-12p40的产生。图30显示相对于单独的3C3或具有CD40L的同种型对照的低水平生产，3C3和CD40L的组合诱导更高水平的IL-12p40。
实施例21
全血细胞因子反应
将全血与10ug/mL同种型对照或3C3或LPS一起温育过夜作为阳性对照。第二天，收集血浆并通过ELISA(R&D Systems)测量细胞因子。结果显示在图31中，表明没有显著的炎性细胞因子产生。
等同内容
本领域技术人员将认识到或者能够使用不超过常规的实验确定本文所述的本发明具体实施方式的许多等同物。这些等同物旨在由所附权利要求书涵盖。
序列表概述
Figure BDA0003929883480000941
Figure BDA0003929883480000951
Figure BDA0003929883480000961
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Figure BDA0003929883480001041
Figure BDA0003929883480001051

Claims (21)

1.一种抑制表达CD40的癌细胞生长的体外方法，其包括以有效抑制CD40表达细胞生长的量将所述细胞与结合人CD40的抗体或其抗原结合片段接触，其中所述抗体包含：
(a)SEQ ID NO:19所示的重链CDR1氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO:21所示的重链CDR2氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO:23所示的重链CDR3氨基酸序列；
(d)SEQ ID NO:25所示的轻链CDR1氨基酸序列；
(e)SEQ ID NO:27所示的轻链CDR2氨基酸序列；和
(f)SEQ ID NO:29所示的轻链CDR3氨基酸序列。
2.结合人CD40的抗体或其抗原结合片段在制备诱导或增强受试者中针对抗原的免疫应答的药物中的用途，其中，所述免疫应答由活化的T细胞介导，并且其中所述抗体包含：
(a)SEQ ID NO:19所示的重链CDR1氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO:21所示的重链CDR2氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO:23所示的重链CDR3氨基酸序列；
(d)SEQ ID NO:25所示的轻链CDR1氨基酸序列；
(e)SEQ ID NO:27所示的轻链CDR2氨基酸序列；和
(f)SEQ ID NO:29所示的轻链CDR3氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述药物还包括所述抗原。
4.结合人CD40的抗体或其抗原结合片段在制备治疗由活化的T细胞或NK细胞介导的癌症的药物中的用途，其中所述抗体包含：
(a)SEQ ID NO:19所示的重链CDR1氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO:21所示的重链CDR2氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO:23所示的重链CDR3氨基酸序列；
(d)SEQ ID NO:25所示的轻链CDR1氨基酸序列；
(e)SEQ ID NO:27所示的轻链CDR2氨基酸序列；和
(f)SEQ ID NO:29所示的轻链CDR3氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的用途，其中，所述癌症是慢性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和边缘区B细胞淋巴瘤。
6.根据权利要求2至5中任一项所述的用途，其中所述药物还包括一种或多种另外的治疗剂。
7.根据权利要求6所述的用途，其中，所述一种或多种另外的治疗剂是抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体和/或抗CTLA-4抗体。
8.根据权利要求2至7中任一项所述的用途，所述抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链可变区，所述重链和轻链可变区具有与以下至少95％相同的氨基酸序列：
SEQ ID NO：17和18。
9.根据权利要求2至8中任一项所述的用途，所述抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链可变区，所述重链和轻链可变区具有与以下至少98％相同的氨基酸序列：
SEQ ID NO：17和18。
10.根据权利要求2至9中任一项所述的用途，所述抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链可变区，其中，所述重链和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：17和18所示。
11.根据权利要求2至10中任一项所述的用途，所述抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，其中，所述重链和轻链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：135和136所示。
12.根据权利要求2至10中任一项所述的用途，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含人恒定区。
13.根据权利要求2至10中任一项所述的用途，其中，所述抗体或其抗原结合片段是人抗体。
14.根据权利要求2至13中任一项所述的用途，其中，所述抗原结合片段为Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv或scFv。
15.根据权利要求2至14中任一项所述的用途，其中，所述抗体或其抗原结合片段与抗原连接以形成分子缀合物。
16.根据权利要求2至14中任一项所述的用途，其中，所述抗体或其抗原结合片段与第二分子连接，所述第二分子具有不同于所述抗体或其抗原结合片段的结合特异性以双特异性分子。
17.根据权利要求16所述的用途，其中，所述第二分子结合CTLA-4、PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3、半乳凝素9、CEACAM-1、BTLA、CD69、半乳凝素1、TIGIT、CD113、GPR56、VISTA、B7-H3、B7-H4、2B4、CD48、GARP、PD1H、LAIR1、TIM-1、TIM-4、B7-1、B7-2、CD28、4-1BB(CD137)、4-1BBL、ICOS、ICOS-L、OX40、OX40L、CD70、CD27、DR3或CD28H。
18.根据权利要求2至17中任一项所述的用途，其中，所述抗体或其抗原结合片段，分子缀合物，双特异性分子为组合物的形式并且还包含载体。
19.根据权利要求18所述的用途，其中，所述组合物还包含佐剂。
20.根据权利要求18或19所述的组合物，其中，所述组合物还包含一种或多种其它抗体。
21.根据权利要求20所述的用途，其中，所述一种或多种其它抗体结合CTLA-4、PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3、半乳凝素9、CEACAM-1、BTLA、CD69、半乳凝素1、TIGIT、CD113、GPR56、VISTA、B7-H3、B7-H4、2B4、CD48、GARP、PD1H、LAIR1、TIM-1、TIM-4、B7-1、B7-2、CD28、4-1BB(CD137)、4-1BBL、ICOS、ICOS-L、OX40、OX40L、CD70、CD27、DR3或CD28H。
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