JP2023547947A

JP2023547947A - プログラム細胞死－１タンパク質に対するモノクローナル抗体および医薬におけるその使用

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Publication number: JP2023547947A
Application number: JP2023528032A
Authority: JP
Inventors: シャヒン，ウール; ベックマン，カルステン; パウルマン，クラウディア; フェラーメイアー－コップ，ジーナ; ギーゼケ，フリーデリケ; ムイク，アレクサンダー; クズマノフ，イヴァン
Original assignee: Biontech SE
Current assignee: Biontech SE
Priority date: 2020-11-11
Filing date: 2021-11-11
Publication date: 2023-11-14
Also published as: MX2023005386A; AU2021380005A1; KR20230107281A; EP4243868A1; CA3197951A1; CN116547305A; WO2022101358A1; US20230399403A1

Abstract

本開示は、ヒトＰＤ－１などの免疫チェックポイントタンパク質であるプログラム細胞死－１（ＰＤ－１）に結合する能力を有する抗体、またはそのような抗体をコードする核酸に関する。本開示はまた、前記抗体または核酸を含む組成物またはキット、および医薬の分野における、好ましくは、例えば、がんの治療のための免疫療法の分野における、これらの抗体または核酸または組成物の使用にも関する。本発明は、対象において免疫応答を誘導するための方法であって、ヒトＰＤ－１などの免疫チェックポイントタンパク質ＰＤ－１に結合する能力を有する抗体、もしくはそのような抗体をコードする核酸、または前記抗体もしくは核酸を含む組成物を対象に提供することを含む、方法にさらに関する。【選択図】なし

Description

本発明は、ヒトＰＤ－１などの免疫チェックポイントタンパク質であるプログラム細胞死－１（ＰＤ－１）に結合する能力を有する抗体、またはそのような抗体をコードする核酸に関する。本発明はまた、前記抗体または核酸を含む組成物またはキット、ならびに医薬の分野、好ましくはがんの治療のための免疫療法の分野におけるこれらの抗体もしくは核酸または組成物の使用にも関する。本発明はさらに、対象において免疫応答を誘導するための方法であって、ヒトＰＤ－１などの免疫チェックポイントタンパク質ＰＤ－１に結合する能力を有する抗体、あるいはそのような抗体をコードする核酸または前記抗体もしくは核酸を含む組成物を対象に提供することを含む、方法に関する。

免疫療法は、感染性疾患または悪性疾患を制御するために、患者において特異的免疫応答を強化または誘導することを目的とする。ますます多くなる病原体－および腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の特定は、免疫療法に対する好適な標的の広範なコレクションをもたらす。これらの抗原に由来する免疫原性ペプチド（エピトープ）を提示する細胞は、能動的または受動的免疫化戦略のいずれかにより特異的に標的化することができる。能動的免疫化は、患者において、罹患細胞を特異的に認識および死滅させることができる抗原特異的Ｔ細胞を誘導および拡大増殖させる傾向を有する。対照的に、受動的免疫化は、拡大増殖され、インビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）において遺伝子操作されていてもよいＴ細胞の養子移入に依存し得る（養子Ｔ細胞療法）。

脊椎動物では、免疫系の進化は、２種類の防御：生得免疫および養子免疫に基づく非常に効果的なネットワークをもたらした。病原体に関連する共通の分子パターンを認識する不変受容体に依存する進化的に古い生得免疫系とは対照的に、適応免疫は、Ｂ細胞（Ｂリンパ球）およびＴ細胞（Ｔリンパ球）上の高度に特異的な抗原受容体ならびにクローン選択に基づく。免疫系は、がんの発達、進行および療法の間に決定的な役割を果たす。ＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞は、腫瘍細胞を直接的に溶解させることができ、これらの細胞の高い腫瘍浸潤は、一般的に、様々な腫瘍疾患の転帰に対して好ましいとされている。ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、ＩＦＮγの分泌または抗原提示性樹状細胞（ＤＣ）の許可により、抗腫瘍免疫応答に寄与し、これが続いて、ＣＤ８^＋Ｔ細胞をプライミングおよび活性化する［Kreiter S. et al. Nature 520, 692-6 (2015)］。ＣＤ８^＋Ｔ細胞による腫瘍細胞の認識および除去は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩを介する抗原提示に依存する。抗原特異的Ｔ細胞応答は、ワクチン接種により起こすことができる。ワクチン接種は、ワクチンＲＮＡ、すなわち、免疫応答が誘導される抗原またはエピトープをコードするＲＮＡを投与することにより、達成することができる。

抗原受容体（ＴＣＲ）を介する刺激のみならず、コンジュゲートされた刺激性分子群（例えば、ＣＤ２８）を介する追加的な刺激性誘導もまた、Ｔ細胞の活性化に対して必須であり得る。がん細胞は、Ｔ細胞上のＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４または腫瘍細胞、腫瘍間質または腫瘍微小環境内の他の細胞上のＰＤ－Ｌ１などの阻害性免疫チェックポイントタンパク質のアップレギュレーションを通して免疫応答を回避および抑制することができる。ＣＴＬＡ４およびＰＤ－１は、Ｔ細胞活性化を抑制するシグナルを伝達することが知られている。モノクローナル抗体を用いてこれらのタンパク質の活性を遮断し、したがって、Ｔ細胞機能を回復させることは、がんに対するブレイクスルー療法を供給してきた。

ＰＤ－１（ＣＤ２７９としても知られる）は、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、および単球の表面上で発現される免疫調節受容体である。タンパク質ＰＤ－１は、ＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４とも称される）およびＰＤ－Ｌ２（ＣＤ２７３としても知られる）として知られる２種類の天然に存在するリガンドを有する。黒色腫、肺がん、腎臓がん、膀胱がん、食道がん、胃がんおよび他のがんをはじめとする広範囲のがんが、ＰＤ－Ｌ１を発現する。したがって、がんにおいて、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１システムは、ＰＤ－１とのＰＤ－Ｌ１の相互作用に際して、Ｔリンパ球の増殖、サイトカインの放出、および細胞傷害性を阻害し、それにより、がん細胞にＴ細胞媒介免疫応答を回避する機会を与えることができる。

ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１軸の活性を調節するために好適なモノクローナル抗体が公知である。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用は、ペムブロリズマブ（ＭＫ－３４７５、ラムブロリズマブまたはキイトルーダとも称される）により、阻害することができる。この目的のために好適な別のモノクローナル抗体は、ニボルマブ（ＯＮＯ－４５３８、ＢＭＳ－９３６５５８またはオプジーボとも称される）である。

がんに対する抗体に基づく療法は、従来の薬物と比較してより高い特異性およびより低い副作用プロファイルを有する可能性があり、したがって、従来の療法よりも有利であり得る。しかし、免疫系を活性化することにより、免疫チェックポイント阻害剤はまた、一部の患者においては自己免疫副作用を引き起こす場合がある。他の患者は、治療に対して応答できない場合がある。

さらに、抗ＰＤ－１抗体は、付随する正常な免疫の抑制を伴わずに、自己免疫疾患を軽減する潜在能力を有する。例えば、免疫毒素にカップリングされた抗ＰＤ－１結合性断片は、自己免疫性糖尿病において疾患発症を遅延させることができ、マウスでの自己免疫性脳脊髄炎モデルにおいて症状を改善する［Zhao P. et al. Nat Biomed Eng. 3(4): 292-305 (2019)］。

したがって、免疫チェックポイント阻害剤療法に関連する優れた利益にもかかわらず、これらのチェックポイントを標的とする改善された抗体の開発に対する、および特にがん免疫療法において免疫療法に関してさらなる利益を提供することに対する満たされていない必要性が未だ存在する。

本発明は、一般的に、がんまたは感染性疾患などの疾患を治療および／または予防するための治療剤として有用な抗体を提供する。治療は、免疫系の活性化および／または免疫応答の誘導を目的とする。

本発明の抗体は、免疫応答を誘導することが可能となるような、ＰＤ－１に対する、好ましくはヒトＰＤ－１に対する結合特性、およびＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を遮断する能力を示す。

本発明の抗体は、以下の特性のうちの１つまたは複数を有し得る：本発明の抗体は、（ｉ）ＰＤ－１に結合し、好ましくは特異的に結合し；（ｉｉ）免疫細胞上のＰＤ－１に対する結合特性を有することができ；（ｉｉｉ）ＰＤ－１エピトープに対する結合特性を有することができ；（ｉｖ）非ヒトＰＤ－１変異体に対する、特にマウス、ラット、ウサギおよび霊長類由来のＰＤ－１変異体に対する結合特性を有することができ；（ｖ）ＰＤ－１による阻害性シグナルの誘導を防止または低減させることができ；（ｖｉ）ＰＤ－１とのＰＤ－１のリガンド、好ましくはリガンドＰＤ－Ｌ１の相互作用／結合を阻害し、それにより、阻害性ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１軸を遮断することができ、例えば、ヒトＰＤ－１に対するヒトＰＤ－Ｌ１の結合を阻害することができ；（ｖｉｉ）ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２の免疫抑制シグナルを阻害することができ；（ｖｉｉｉ）好ましくはＴ細胞媒介免疫応答を強化または開始させることにより、好ましくはＣＤ８^＋細胞増殖を誘導することにより、免疫機能を強化または開始させることができ；（ｉｘ）がん増殖を阻害することができ；（ｘ）腫瘍細胞を枯渇させかつ／またはがん転移を抑制することができ；および／または（ｘｉ）免疫細胞を枯渇させかつ／もしくは自己免疫疾患を改善することができる。

以下において、とりわけ配列表に示される配列および配列番号に対する参照が与えられる。また、本発明をそれに限定することなく、本明細書中に記載される本発明の抗体の具体例に対する参照が与えられる：ＭＡＢ－１９－０２０２、ＭＡＢ－１９－０２０８、ＭＡＢ－１９－０２１７、ＭＡＢ－１９－０２２３、ＭＡＢ－１９－０２３３、ＭＡＢ－１９－０６０３、ＭＡＢ－１９－０６０８、ＭＡＢ－１９－０６１３、ＭＡＢ－１９－０６１８、ＭＡＢ－１９－０５８３、ＭＡＢ－１９－０５９４、およびＭＡＢ－１９－０５９８。これらの例示的（ｅｘａｍｐｌａｔｏｒｙ）であるが限定的ではない本発明の抗体は、抗体の名称を参照することにより本明細書中で指定される。

一態様では、本発明は、ＰＤ－１に結合する能力を有し、それにより、好ましくはＰＤ－１の免疫抑制シグナルを阻害する抗体に関する。

本発明の別の態様では、抗体は、活性化免疫細胞を枯渇させ、それにより、自己免疫疾患を改善する。

本発明の抗体は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５のうちのいずれか１つに記載の配列を有するかまたは含む相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。一実施形態では、重鎖可変領域のＨＣＤＲ３は、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１０のうちのいずれか１つに記載の配列を有するかまたは含む。

一実施形態では、前記抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５のうちのいずれか１つに記載の配列を有するかまたは含む相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）を含む。一実施形態では、ＨＣＤＲ２は、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９または配列番号２０のうちのいずれか１つに記載の配列を有するかまたは含む。

一実施形態では、前記抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）は、ＳＹＮ、ＲＹＹ、配列番号２１または配列番号２２に記載の配列から選択される配列を有するかまたは含む相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）を含む。一実施形態では、ＨＣＤＲ１は、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６または配列番号２７のうちのいずれか１つに記載の配列を有するかまたは含む。一実施形態では、ＨＣＤＲ１は、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１または配列番号３２のうちのいずれか１つに記載の配列を有するかまたは含む。

前記抗体の一実施形態では、抗体は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、ＨＣＤＲ１配列はＳＹＮ、配列番号２３または配列番号２８を有するかまたは含む配列から選択され、ＨＣＤＲ２配列は配列番号１１または配列番号１６を有するかまたは含む配列から選択され、ＨＣＤＲ３配列は配列番号１または配列番号６を有するかまたは含む配列から選択される。前記抗体の一実施形態では、抗体は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、ＨＣＤＲ１配列はＲＹＹ、配列番号２４または配列番号２９を有するかまたは含む配列から選択され、ＨＣＤＲ２配列は配列番号１２または配列番号１７を有するかまたは含む配列から選択され、ＨＣＤＲ３配列は配列番号２または配列番号７を有するかまたは含む配列から選択される。前記抗体の一実施形態では、抗体は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、ＨＣＤＲ１配列はＲＹＹ、配列番号２５または配列番号３０を有するかまたは含む配列から選択され、ＨＣＤＲ２配列は配列番号１３または配列番号１８を有するかまたは含む配列から選択され、ＨＣＤＲ３配列は配列番号３または配列番号８を有するかまたは含む配列から選択される。前記抗体の一実施形態では、抗体は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、ＨＣＤＲ１配列は配列番号２１、配列番号２６または配列番号３１を有するかまたは含む配列から選択され、ＨＣＤＲ２配列は配列番号１４または配列番号１９を有するかまたは含む配列から選択され、ＨＣＤＲ３配列は配列番号４または配列番号９を有するかまたは含む配列から選択される。前記抗体の一実施形態では、抗体は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、ＨＣＤＲ１配列は配列番号２２、配列番号２７または配列番号３２を有するかまたは含む配列から選択され、ＨＣＤＲ２配列は配列番号１５または配列番号２０を有するかまたは含む配列から選択され、ＨＣＤＲ３配列は配列番号５または配列番号１０を有するかまたは含む配列から選択される。

前記抗体の一実施形態では、抗体は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列は、それぞれ、ＳＹＮ、配列番号１１および配列番号１であるかまたはこれを含む。前記抗体の一実施形態では、抗体は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列は、それぞれ、ＲＹＹ、配列番号１２および配列番号２であるかまたはこれを含む。前記抗体の一実施形態では、抗体は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列は、それぞれ、ＲＹＹ、配列番号１３および配列番号３であるかまたはこれを含む。前記抗体の一実施形態では、抗体は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列は、それぞれ、配列番号２１、配列番号１４および配列番号４であるかまたはこれを含む。前記抗体の一実施形態では、抗体は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列は、それぞれ、配列番号２２、配列番号１５および配列番号５であるかまたはこれを含む。

一実施形態では、抗体は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列は、それぞれ、配列番号２３、配列番号１６および配列番号１であるかまたはこれを含む。一実施形態では、抗体は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列は、それぞれ、配列番号２４、配列番号１７および配列番号２であるかまたはこれを含む。一実施形態では、抗体は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列は、それぞれ、配列番号２５、配列番号１８および配列番号３であるかまたはこれを含む。一実施形態では、抗体は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列は、それぞれ、配列番号２６、配列番号１９および配列番号４であるかまたはこれを含む。一実施形態では、抗体は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列は、それぞれ、配列番号２７、配列番号２０および配列番号５であるかまたはこれを含む。

一実施形態では、抗体は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列は、それぞれ、配列番号２８、配列番号１１および配列番号６であるかまたはこれを含む。一実施形態では、抗体は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列は、それぞれ、配列番号２９、配列番号１２および配列番号７であるかまたはこれを含む。一実施形態では、抗体は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列は、それぞれ、配列番号３０、配列番号１３および配列番号８であるかまたはこれを含む。一実施形態では、抗体は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列は、それぞれ、配列番号３１、配列番号１４および配列番号９であるかまたはこれを含む。一実施形態では、抗体は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列は、それぞれ、配列番号３２、配列番号１５および配列番号１０であるかまたはこれを含む。

上記の態様の一実施形態および別の態様では、本発明は、ＰＤ－１に結合する能力を有し、それにより、好ましくは、ＰＤ－１の免疫抑制シグナルを阻害する抗体に関する。抗体は、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６または配列番号３７のうちのいずれか１つに記載の配列を有するかまたは含む相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。

一実施形態では、前記抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）は、ＱＡＳまたはＤＡＳから選択される配列を有するかまたは含む相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）を含む。一実施形態では、軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０または配列番号４１のうちのいずれか１つに記載の配列を有するかまたは含む相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）を含む。

一実施形態では、前記抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５または配列番号４６のうちのいずれか１つに記載の配列を有するかまたは含む相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）を含む。一実施形態では、軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０または配列番号５１のうちのいずれか１つに記載の配列を有するかまたは含む相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）を含む。

一実施形態では、抗体は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＬＣＤＲ１配列は配列番号４２または配列番号４７を有するかまたは含む配列から選択され、ＬＣＤＲ２配列はＱＡＳまたは配列番号３８を有するかまたは含む配列から選択され、ＬＣＤＲ３配列は配列番号３３を有するかまたは含む配列である。一実施形態では、抗体は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＬＣＤＲ１配列は配列番号４３または配列番号４８を有するかまたは含む配列から選択され、ＬＣＤＲ２配列はＤＡＳまたは配列番号３９を有するかまたは含む配列から選択され、ＬＣＤＲ３配列は配列番号３４を有するかまたは含む配列である。一実施形態では、抗体は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＬＣＤＲ１配列は配列番号４４または配列番号４９を有するかまたは含む配列から選択され、ＬＣＤＲ２配列はＤＡＳまたは配列番号３９を有するかまたは含む配列から選択され、ＬＣＤＲ３配列は配列番号３５を有するかまたは含む配列である。一実施形態では、抗体は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＬＣＤＲ１配列は配列番号４５または配列番号５０を有するかまたは含む配列から選択され、ＬＣＤＲ２配列はＤＡＳまたは配列番号４０を有するかまたは含む配列から選択され、ＬＣＤＲ３配列は配列番号３６を有するかまたは含む配列である。一実施形態では、抗体は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＬＣＤＲ１配列は配列番号４６または配列番号５１を有するかまたは含む配列から選択され、ＬＣＤＲ２配列はＤＡＳまたは配列番号４１を有するかまたは含む配列から選択され、ＬＣＤＲ３配列は配列番号３７を有するかまたは含む配列である。

一実施形態では、抗体は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列は、それぞれ、配列番号４２、ＱＡＳ、および配列番号３３であるかまたはこれを含む。一実施形態では、抗体は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列は、それぞれ、配列番号４３、ＤＡＳ、および配列番号３４であるかまたはこれを含む。一実施形態では、抗体は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列は、それぞれ、配列番号４４、ＤＡＳ、および配列番号３５であるかまたはこれを含む。一実施形態では、抗体は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列は、それぞれ、配列番号４５、ＤＡＳ、および配列番号３６であるかまたはこれを含む。一実施形態では、抗体は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列は、それぞれ、配列番号４６、ＤＡＳ、および配列番号３７であるかまたはこれを含む。

一実施形態では、抗体は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列は、それぞれ、配列番号４７、配列番号３８、および配列番号３３であるかまたはこれを含む。一実施形態では、抗体は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列は、それぞれ、配列番号４８、配列番号３９、および配列番号３４であるかまたはこれを含む。一実施形態では、抗体は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列は、それぞれ、配列番号４９、配列番号３９、および配列番号３５であるかまたはこれを含む。一実施形態では、抗体は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列は、それぞれ、配列番号５０、配列番号４０、および配列番号３６であるかまたはこれを含む。一実施形態では、抗体は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列は、それぞれ、配列番号５１、配列番号４１、および配列番号３７であるかまたはこれを含む。

別の態様では、本発明は、ＰＤ－１に結合する能力を有する抗体であって、本発明の上記の第１の態様の重鎖可変領域（ＶＨ）および／または本発明の上記の第２の態様の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、抗体に関する。

上記の態様の一実施形態では、抗体は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列はそれぞれ、配列ＳＹＮ、配列番号１１および配列番号１に記載の配列を含むかまたは有し、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列はそれぞれ、配列番号４２、ＱＡＳ、および配列番号３３に記載の配列を含むかまたは有する。そのような抗体の具体的であるが限定的でない例は、ＭＡＢ－１９－０２０２である。

上記の態様の一実施形態では、抗体は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列はそれぞれ、配列番号２３、配列番号１６、および配列番号１に記載の配列を含むかまたは有し、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列はそれぞれ、配列番号４７、配列番号３８、および配列番号３３に記載の配列を含むかまたは有する。そのような抗体の具体的であるが限定的でない例は、ＭＡＢ－１９－０２０２である。

上記の態様の一実施形態では、抗体は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列はそれぞれ、配列番号２８、配列番号１１、および配列番号６に記載の配列を含むかまたは有し、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列はそれぞれ、配列番号４２、ＱＡＳ、および配列番号３３に記載の配列を含むかまたは有する。そのような抗体の具体的であるが限定的でない例は、ＭＡＢ－１９－０２０２である。

上記の態様の一実施形態では、抗体は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列はそれぞれ、配列ＲＹＹ、配列番号１２および配列番号２に記載の配列を含むかまたは有し、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列はそれぞれ、配列番号４３、ＤＡＳ、および配列番号３４に記載の配列を含むかまたは有する。そのような抗体の具体的であるが限定的でない例は、ＭＡＢ－１９－０２０８である。

上記の態様の一実施形態では、抗体は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列はそれぞれ、配列番号２４、配列番号１７、および配列番号２に記載の配列を含むかまたは有し、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列はそれぞれ、配列番号４８、配列番号３９、および配列番号３４に記載の配列を含むかまたは有する。そのような抗体の具体的であるが限定的でない例は、ＭＡＢ－１９－０２０８である。

上記の態様の一実施形態では、抗体は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列はそれぞれ、配列番号２９、配列番号１２、および配列番号７に記載の配列を含むかまたは有し、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列はそれぞれ、配列番号４３、ＤＡＳ、および配列番号３４に記載の配列を含むかまたは有する。そのような抗体の具体的であるが限定的でない例は、ＭＡＢ－１９－０２０８である。

上記の態様の一実施形態では、抗体は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列はそれぞれ、配列ＲＹＹ、配列番号１３および配列番号３に記載の配列を含むかまたは有し、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列はそれぞれ、配列番号４４、ＤＡＳ、および配列番号３５に記載の配列を含むかまたは有する。そのような抗体の具体的であるが限定的でない例は、ＭＡＢ－１９－０２１７である。

上記の態様の一実施形態では、抗体は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列はそれぞれ、配列番号２５、配列番号１８、および配列番号３に記載の配列を含むかまたは有し、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列はそれぞれ、配列番号４９、配列番号３９、および配列番号３５に記載の配列を含むかまたは有する。そのような抗体の具体的であるが限定的でない例は、ＭＡＢ－１９－０２１７である。

上記の態様の一実施形態では、抗体は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列はそれぞれ、配列番号３０、配列番号１３、および配列番号８に記載の配列を含むかまたは有し、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列はそれぞれ、配列番号４４、ＤＡＳ、および配列番号３５に記載の配列を含むかまたは有する。そのような抗体の具体的であるが限定的でない例は、ＭＡＢ－１９－０２１７である。

上記の態様の一実施形態では、抗体は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列はそれぞれ、配列番号２１、配列番号１４および配列番号４に記載の配列を含むかまたは有し、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列はそれぞれ、配列番号４５、ＤＡＳ、および配列番号３６に記載の配列を含むかまたは有する。そのような抗体の具体的であるが限定的でない例は、ＭＡＢ－１９－０２２３である。

上記の態様の一実施形態では、抗体は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列はそれぞれ、配列番号２６、配列番号１９、および配列番号４に記載の配列を含むかまたは有し、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列はそれぞれ、配列番号５０、配列番号４０、および配列番号３６に記載の配列を含むかまたは有する。そのような抗体の具体的であるが限定的でない例は、ＭＡＢ－１９－０２２３である。

上記の態様の一実施形態では、抗体は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列はそれぞれ、配列番号３１、配列番号１４、および配列番号９に記載の配列を含むかまたは有し、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列はそれぞれ、配列番号４５、ＤＡＳ、および配列番号３６に記載の配列を含むかまたは有する。そのような抗体の具体的であるが限定的でない例は、ＭＡＢ－１９－０２２３である。

上記の態様の一実施形態では、抗体は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列はそれぞれ、配列番号２２、配列番号１５および配列番号５に記載の配列を含むかまたは有し、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列はそれぞれ、配列番号４６、ＤＡＳ、および配列番号３７に記載の配列を含むかまたは有する。そのような抗体の具体的であるが限定的でない例は、ＭＡＢ－１９－０２３３である。

上記の態様の一実施形態では、抗体は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列はそれぞれ、配列番号２７、配列番号２０、および配列番号５に記載の配列を含むかまたは有し、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列はそれぞれ、配列番号５１、配列番号４１、および配列番号３７に記載の配列を含むかまたは有する。そのような抗体の具体的であるが限定的でない例は、ＭＡＢ－１９－０２３３である。

上記の態様の一実施形態では、抗体は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列はそれぞれ、配列番号３２、配列番号１５、および配列番号１０に記載の配列を含むかまたは有し、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列はそれぞれ、配列番号４６、ＤＡＳ、および配列番号３７に記載の配列を含むかまたは有する。そのような抗体の具体的であるが限定的でない例は、ＭＡＢ－１９－０２３３である。

上記の態様の一実施形態では、本明細書に記載される通りの１つもしくは複数のＣＤＲ、ＣＤＲのセットまたはＣＤＲのセットの組み合わせを含む本発明の抗体は、前記ＣＤＲを、それらの介在フレームワーク領域（本明細書中でフレーミング領域またはＦＲとも称される）または前記フレームワーク領域の一部分と一緒に含む。好ましくは、一部分は、５０％が第１フレームワーク領域のＣ末端５０％および第４フレームワーク領域のＮ末端５０％である、第１および第４のフレームワーク領域のいずれかまたは両方の少なくとも約５０％を含むであろう。組換えＤＮＡ技術によりなされる本発明の抗体の構築は、免疫グロブリン重鎖、他の可変ドメイン（例えば、ダイアボディの作製において）またはタンパク質標識を含むさらなるタンパク質配列へと本発明の可変領域を連結するためのリンカーの導入を含む、クローニングまたは他の操作工程を促進するために導入されるリンカーによりコードされる可変領域に対してＮまたはＣ末端の残基の導入を生じ得る。

上記の態様の一実施形態では、抗体は、配列番号５２～配列番号５６のうちのいずれか１つに記載のＶＨ配列のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。上記の態様の一実施形態では、抗体は重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、ＶＨは、配列番号５２～配列番号５６のうちのいずれか１つに記載の配列を含む。

上記の態様の一実施形態では、抗体は、配列番号５７～配列番号６１のうちのいずれか１つに記載のＶＬ配列のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。上記の態様の一実施形態では、抗体は軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＬは、配列番号５７～配列番号６１のうちのいずれか１つに記載の配列を含む。

上記の態様の一実施形態では、抗体は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＨは配列番号５２に記載の配列を含むかまたは有し、ＶＬは配列番号５７に記載の配列を含むかまたは有する。そのような抗体の具体的であるが限定的でない例は、ＭＡＢ－１９－０２０２である。上記の態様の一実施形態では、抗体は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＨは配列番号５３に記載の配列を含むかまたは有し、ＶＬは配列番号５８に記載の配列を含むかまたは有する。そのような抗体の具体的であるが限定的でない例は、ＭＡＢ－１９－０２０８である。上記の態様の一実施形態では、抗体は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＨは配列番号５４に記載の配列を含むかまたは有し、ＶＬは配列番号５９に記載の配列を含むかまたは有する。そのような抗体の具体的であるが限定的でない例は、ＭＡＢ－１９－０２１７である。上記の態様の一実施形態では、抗体は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＨは配列番号５５に記載の配列を含むかまたは有し、ＶＬは配列番号６０に記載の配列を含むかまたは有する。そのような抗体の具体的であるが限定的でない例は、ＭＡＢ－１９－０２２３である。上記の態様の一実施形態では、抗体は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＨは配列番号５６に記載の配列を含むかまたは有し、ＶＬは配列番号６１に記載の配列を含むかまたは有する。そのような抗体の具体的であるが限定的でない例は、ＭＡＢ－１９－０２３３である。前記重鎖可変領域（ＶＨ）および前記軽鎖可変領域（ＶＬ）の変異体ならびにこれらの変異体ＶＨおよびＶＬのそれぞれの組み合わせもまた、本発明により包含される。

本発明の抗体は、限定するものではないが、ウサギ、マウス、ラット、モルモットおよびヒトを含む異なる種に由来することができる。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。一実施形態または好ましい実施形態では、本発明の抗体はモノクローナルである。本発明の抗体は、一実施形態では、１つの種、好ましくはヒト由来の抗体定常領域が別の種由来の抗原結合性部位と組み合わせられるキメラ分子を含むことができる。一実施形態では、抗体はモノクローナルキメラ抗体であり、定常領域は、好ましくはヒト免疫グロブリン定常部分、例えば、ヒトＩｇＧ１／κ定常部分である。さらに、一実施形態では、本発明の抗体は、非ヒト種由来の抗体の抗原結合性部位がヒト起源の定常領域およびフレームワーク領域と組み合わせられるヒト化分子、好ましくはモノクローナルヒト化分子を含む。一実施形態では、本明細書に記載される通りの１つもしくは複数のＣＤＲ、ＣＤＲのセットまたはＣＤＲのセットの組み合わせを含む本発明の抗体は、前記ＣＤＲをヒト抗体フレームワーク中に含む。一実施形態または好ましい実施形態では、本発明の抗体はモノクローナルヒト化抗体であり、定常領域は、好ましくはヒト免疫グロブリン定常部分、例えば、ヒトＩｇＧ１／κ定常部分である。

上記の態様の一実施形態では、抗体は、配列番号６２～配列番号６４のうちのいずれか１つに記載のＶＨ配列のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。上記の態様の一実施形態では、抗体は重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、ＶＨは、配列番号６２～配列番号６４のうちのいずれか１つに記載の配列を含む。上記の態様の一実施形態では、抗体は、配列番号６５～配列番号７０のうちのいずれか１つに記載のＶＬ配列のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。上記の態様の一実施形態では、抗体は軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＬは、配列番号６５～配列番号７０のうちのいずれか１つに記載の配列を含む。

本発明は、配列表の配列番号６２～６４に記載のこれらの好ましい重鎖可変領域および配列表の配列番号６５～７０に記載のこれらの好ましい軽鎖可変領域、またはこれらの配列のそれぞれの変異体のすべての考えられる組み合わせを包含する。

一実施形態では、抗体は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＨは配列番号６２に記載の配列を含むかまたは有し、ＶＬは配列番号６５もしくは配列番号６６もしくは配列番号６７もしくは配列番号６８に記載の配列、またはこれらの配列のそれぞれの変異体を含むかまたは有する。例えば、本発明の抗体は、配列番号６２に記載の配列、またはその変異体を含むかまたは有するＶＨ、および配列番号６５に記載の配列、またはその変異体を含むかまたは有するＶＬを含むことができる。そのような抗体の具体的であるが限定的でない例は、ＭＡＢ－１９－０６０３である。本発明の抗体の別の例は、配列番号６２に記載の配列、またはその変異体を含むかまたは有するＶＨ、および配列番号６６に記載の配列、またはその変異体を含むかまたは有するＶＬを含むことができる。そのような抗体の具体的であるが限定的でない例は、ＭＡＢ－１９－０６０８である。本発明の抗体の別の例は、配列番号６２に記載の配列、またはその変異体を含むかまたは有するＶＨ、および配列番号６７に記載の配列、またはその変異体を含むかまたは有するＶＬを含むことができる。そのような抗体の具体的であるが限定的でない例は、ＭＡＢ－１９－０６１３である。本発明の抗体の別の例は、配列番号６２に記載の配列、またはその変異体を含むかまたは有するＶＨ、および配列番号６８に記載の配列、またはその変異体を含むかまたは有するＶＬを含むことができる。そのような抗体の具体的であるが限定的でない例は、ＭＡＢ－１９－０６１８である。抗体ＭＡＢ－１９－０６０３、ＭＡＢ－１９－０６０８、ＭＡＢ－１９－０６１３およびＭＡＢ－１９－０６１８は、ＭＡＢ－１９－０２０２から誘導された。前記重鎖可変領域（ＶＨ）および前記軽鎖可変領域（ＶＬ）の変異体ならびにこれらの変異体ＶＨおよびＶＬのそれぞれの組み合わせもまた、本発明により包含される。

一実施形態では、抗体は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＨは配列番号６３に記載の配列またはその変異体を含むかまたは有し、ＶＬは配列番号６９もしくは配列番号７０に記載の配列またはそのそれぞれの変異体を含むかまたは有するか、あるいは、ＶＨは配列番号６４に記載の配列またはその変異体を含むかまたは有し、ＶＬは配列番号７０に記載の配列またはその変異体を含むかまたは有する。例えば、本発明の抗体は、配列番号６３に記載の配列またはその変異体を含むかまたは有するＶＨ、および配列番号６９に記載の配列またはその変異体を含むかまたは有するＶＬを含むことができる。そのような抗体の具体的であるが限定的でない例は、ＭＡＢ－１９－０５８３である。本発明の抗体の別の例は、配列番号６４に記載の配列またはその変異体を含むかまたは有するＶＨ、および配列番号７０に記載の配列またはその変異体を含むかまたは有するＶＬを含むことができる。そのような抗体の具体的であるが限定的でない例は、ＭＡＢ－１９－０５９４である。本発明の抗体の別の例は、配列番号６３に記載の配列またはその変異体を含むかまたは有するＶＨ、および配列番号７０に記載の配列またはその変異体を含むかまたは有するＶＬを含むことができる。そのような抗体の具体的であるが限定的でない例は、ＭＡＢ－１９－０５９８である。抗体ＭＡＢ－１９－０５８３、ＭＡＢ－１９－０５９４およびＭＡＢ－１９－０５９８は、ＭＡＢ－１９－０２３３から誘導された。前記重鎖可変領域（ＶＨ）および前記軽鎖可変領域（ＶＬ）の変異体ならびにこれらの変異体ＶＨおよびＶＬのそれぞれの組み合わせもまた、本発明により包含される。

本発明のすべての態様では、本発明の抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ４、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ抗体ならびにそれらの組み合わせを含むことができ、重鎖は異なるアイソタイプおよび／またはサブクラスのものである。様々な実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１抗体、より詳細にはＩｇＧ１、カッパまたはＩｇＧ１、ラムダアイソタイプ（すなわち、ＩｇＧ１、κ、λ）、ＩｇＧ２ａ抗体（例えば、ＩｇＧ２ａ、κ、λ）、ＩｇＧ２ｂ抗体（例えば、ＩｇＧ２ｂ、κ、λ）、ＩｇＧ３抗体（例えば、ＩｇＧ３、κ、λ）またはＩｇＧ４抗体（例えば、ＩｇＧ４、κ、λ）である。例えば、または好ましい実施形態では、本発明の抗体、好ましくはモノクローナル抗体は、好ましくはヒトＩｇＧ１／κもしくはヒトＩｇＧ１／λ定常部分を含むＩｇＧ１、κアイソタイプもしくはλアイソタイプであるか、または抗体、好ましくはモノクローナル抗体は、ＩｇＧ１、λ（ラムダ）もしくはＩｇＧ１、κ（カッパ）抗体から、好ましくはヒトＩｇＧ１、λ（ラムダ）もしくはヒトＩｇＧ１、κ（カッパ）抗体から誘導される。

本発明の一実施形態では、結合剤は、全長ＩｇＧ１抗体である。本発明の一実施形態では、結合剤は、全長ヒトＩｇＧ１抗体である。本発明の一実施形態では、結合剤は、定常領域中に１つまたは複数の突然変異を有する全長ヒトＩｇＧ１抗体である。

本発明の一実施形態では、抗体は少なくとも１つの重鎖定常領域を含み、前記定常領域のうちの少なくとも１つにおいて、ＥＵナンバリングに従うヒトＩｇＧ１重鎖中の位置Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ｄ２６５、Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｐ３２９、およびＰ３３１に対応する位置の１つまたは複数のアミノ酸は、それぞれ、Ｌ、Ｌ、Ｇ、Ｄ、Ｄ、Ｋ、Ｐ、およびＰでない。例えば、ＥＵナンバリングに従ってヒトＩｇＧ１重鎖中の２３４位に対応するアミノ酸は、Ｌではないが、好ましくはＦまたはＡから選択され、ＥＵナンバリングに従うヒトＩｇＧ１重鎖中の２３５位に対応するアミノ酸は、Ｌではないが、好ましくはＥまたはＡから選択される。本発明の一実施形態では、ＥＵナンバリングに従うヒトＩｇＧ１重鎖中の位置Ｌ２３４、Ｌ２３５、およびＤ２６５に対応する位置は、置換されている。本発明の一実施形態では、ＥＵナンバリングに従うヒトＩｇＧ１重鎖中の位置Ｌ２３４、Ｌ２３５、およびＰ３３１に対応する位置は、置換されている。本発明の一実施形態では、ＥＵナンバリングに従うヒトＩｇＧ１重鎖中の位置Ｌ２３４、Ｌ２３５、およびＰ３２９に対応する位置は、置換されている。

一実施形態では、少なくとも１つの重鎖定常領域は修飾されており、それにより、前記抗体に対するＣ１ｑの結合性は、野生型抗体と比較して低減し、好ましくは、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または１００％低減し、Ｃ１ｑ結合性は、好ましくはＥＬＩＳＡにより決定される。

上記の態様の一実施形態では、抗体は、モノクローナルキメラもしくはモノクローナルヒト化抗体またはそのような抗体の断片である。抗体は、全抗体または、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ断片または二重特異性抗体を含むその抗原結合性断片であり得る。さらに、抗原結合性断片は、（ｉ）免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチドに融合された結合ドメインポリペプチド（重鎖可変領域または軽鎖可変領域など）、（ｉｉ）ヒンジ領域に融合された免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域、および（ｉｉｉ）ＣＨ２定常領域に融合された免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域を含む結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質を含むことができる。そのような結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質は、ＵＳ２００３／０１１８５９２およびＵＳ２００３／０１３３９３９にさらに開示される。

上記の態様の一実施形態では、抗体は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆｖ断片、または単鎖（ｓｃＦｖ）抗体である。単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、好ましくは１０～約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドを用いて接続された、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質であり得る。リンカーは、柔軟性のためにグリシンリッチ、および可溶性のためにセリンまたはトレオニンリッチであり得、かつＶ_ＨのＮ末端がＶ_ＬのＣ末端と接続されるか、またはその逆であるかのいずれかであり得る。このタンパク質は、通常、定常領域の除去およびリンカーの導入にもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。

本発明の抗体は、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）媒介溶解、抗体依存性細胞性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）媒介溶解、アポトーシス（ａｐｏｔｏｓｉｓ）、同型接着および／または貪食のうちの少なくとも１つを誘導することが可能であるかまたは可能でないことができる。一実施形態では、本発明の抗体は、ＰＤ－１を発現する細胞の、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、例えば、少なくとも約２０～４０％のＣＤＣ媒介溶解、好ましくは約４０～５０％のＣＤＣ媒介溶解、およびより好ましくは５０％超のＣＤＣ媒介溶解を誘導する。一実施形態では、本発明の抗体は、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を誘導しない。代替的に、またはＣＤＣを誘導するかもしくは誘導しないことに加えて、本発明の抗体は、エフェクター細胞（例えば、単球、単核細胞、ＮＫ細胞およびＰＭＮ）の存在下で、ＰＤ－１を発現する細胞の抗体依存性細胞性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を誘導することができる。一実施形態では、本発明の抗体は、抗体依存性細胞性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を誘導しない。本発明の抗体は、アポトーシスを誘導し、細胞の同型接着を誘導し、かつ／またはマクロファージの存在下で貪食を誘導する能力を有するかまたは有しないことができる。本発明の抗体は、上記の機能的特性のうちの１つまたは複数を有することができる。好ましくは、本発明の抗体は、ＰＤ－１を発現する細胞のＣＤＣ媒介溶解およびＡＤＣＣ媒介溶解を誘導せず、かつ／またはＰＤ－１を発現する細胞のＡＤＣＣ媒介溶解を誘導しない。

上記の態様のすべての一実施形態では、抗体が結合できるＰＤ－１は、ヒトＰＤ－１である。一実施形態では、ＰＤ－１は、配列番号７１もしくは配列番号７２に記載のアミノ酸配列を有するかまたは含むか、あるいはＰＤ－１のアミノ酸配列は、配列番号７１もしくは配列番号７２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％もしくは１００％の同一性を有するか、またはその免疫原性断片である。一実施形態では、抗体は、生細胞の表面上に存在するＰＤ－１の生来型エピトープに結合する能力を有する。

上記の態様の一実施形態では、本発明の抗体は、誘導体化されるか、他の結合特異性に対して連結されるか、または共発現されることができる。別の実施形態では、本発明の抗体は、誘導体化されるか、別の機能的分子、例えば、別のペプチドもしくはタンパク質（例えば、Ｆａｂ’断片）に連結されるか、またはそれと共発現されることができる。例えば、本発明の抗体は、別の抗体（例えば、二重特異的または多重特異的抗体を作製するため）などの１つまたは複数の他の分子実体に機能的に連結されることができる（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有的会合またはそれ以外により）。

上記の態様の一実施形態では、抗体は、ＰＤ－１に結合する第１の抗原結合性領域および別の抗原に結合する少なくとも１つのさらなる抗原結合性領域を含む多重特異的抗体である。一実施形態では、抗体は、ＰＤ－１に結合する第１の抗原結合性領域および別の抗原に結合する第２の抗原結合性領域を含む二重特異的抗体である。

一実施形態では、第１および第２の結合性アームは、上記で言及される通りの全長ＩｇＧ１、λ（ラムダ）またはＩｇＧ１、κ（カッパ）抗体などの全長抗体から誘導される。一実施形態では、第１および第２の結合性アームは、モノクローナル抗体から誘導される。

例えばまたは好ましい実施形態では、第１および／または第２の結合性アームは、ＩｇＧ１、κアイソタイプまたはλアイソタイプから誘導され、好ましくはヒトＩｇＧ１／κまたはヒトＩｇＧ１／λ定常部分を含む。第１および／または第２の結合性アームは、定常領域中に１つまたは複数の突然変異を含むことができ、例えば、ＥＵナンバリングに従うヒトＩｇＧ１重鎖中の位置Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ｄ２６５、Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｐ３２９、およびＰ３３１に対応する位置における１つまたは複数のアミノ酸が、それぞれ、Ｌ、Ｌ、Ｇ、Ｄ、Ｄ、Ｋ、Ｐ、およびＰでない。

これに関して、一実施形態では、本発明は、ＰＤ－１に対する少なくとも１つの第１の結合特異性（例えば、抗ＰＤ－１抗体またはそのミメティクス）、およびそれぞれの他のチェックポイントを阻害するかまたは活性化／刺激するかのいずれかのための別の免疫チェックポイントに対する第２のまたはさらなる結合特異性を含む二重特異的または多重特異的分子を提供する。標的化することができる他のチェックポイント阻害因子としては、限定するものではないが、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＭ－３、ＫＩＲまたはＬＡＧ－３が挙げられる。第２の結合特異性により標的化することができるチェックポイント活性化因子としては、限定するものではないが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、またはＩＣＯＳが挙げられる。二重特異的もしくは多重特異的抗体または分子中の結合特異性の好ましい組み合わせとしては、例えば、抗ＰＤ１と抗ＰＤ－Ｌ１または抗ＰＤ－１と抗ＣＴＬＡ４とが挙げられる。

一実施形態では、本発明は、ＰＤ－１に対する少なくとも１つの第１の結合特異性（例えば、抗ＰＤ－１抗体またはそのミメティクス）、および代替的にまたは上記に加えて、抗血管新生活性を提供するための第２のまたはさらなる結合特異性を含む二重特異的または多重特異的分子を提供する。したがって、第２のまたはさらなる結合特異性（ｓｐｅｃｉｆｉｔｙ）は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）またはその受容体ＶＥＧＦＲ、例えば、ＶＥＧＦＲ１、２、３を標的化することが可能であり得る。代替的にまたは加えて、第２の結合特異性は、ＰＤＧＦＲ、ｃ－Ｋｉｔ、Ｒａｆおよび／またはＲＥＴを標的化することが可能であり得る。

一実施形態では、本発明は、ＰＤ－１に対する少なくとも１つの第１の結合特異性（例えば、抗ＰＤ－１抗体またはそのミメティクス）、およびがん細胞に対する本発明の抗体の特異性を可能にする、腫瘍抗原を標的化する第２のまたはさらなる結合特異性を含む二重特異的または多重特異的分子を提供する。本発明の一実施形態では、がん細胞は、黒色腫、肺がん、腎細胞癌、膀胱がん、乳がん、胃がんおよび胃食道接合部がん、膵臓腺癌、卵巣がんおよびリンパ腫からなる群から選択することができる。

一実施形態では、腫瘍抗原特異性および抗ＰＤ－１結合特異性に加えて、本発明の多重特異的抗体は、第３の結合特異性を含むことができる。一実施形態では、第３の結合特異性は、Ｆｃ受容体、例えば、ヒトＦｃ－ガンマＲＩ（ＣＤ６４）またはヒトＦｃ－アルファ受容体（ＣＤ８９）に向けられる。したがって、本発明は、ＰＤ－１に、Ｆｃ－ガンマＲ、Ｆｃ－アルファＲまたはＦｃ－イプシロンＲ発現エフェクター細胞［例えば、単球、マクロファージまたは多形核細胞（ＰＭＮ）］に、および腫瘍抗原を発現する標的がん細胞に結合することが可能な多重特異的分子を含む。

本発明の多重特異的または二重特異的抗体のＰＤ－１に結合する前記第１の抗原結合性領域は、ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２とのＰＤ－１結合性に関して競合する抗体の重鎖および軽鎖可変領域を含むことができる。多重特異的または二重特異的抗体の一実施形態では、ＰＤ－１に結合する第１の抗原結合性領域は、本明細書に記載の重鎖可変領域（ＶＨ）および／または軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。

上記の態様の一実施形態では、抗体は、配列番号７１もしくは配列番号７２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはペプチド、またはその免疫原性断片、あるいは前記タンパク質もしくはペプチド、またはその免疫原性断片を発現する核酸または宿主細胞またはウイルスを用いて動物を免疫化する工程を含む方法により取得可能である。好ましくは、そのようにして得られる抗体は、上述のタンパク質、ペプチドまたはその免疫原性断片に対して特異的である。核酸または宿主細胞またはウイルスは、本明細書に開示される通りの核酸または宿主細胞またはウイルスであり得る。

本発明はまた、上記の通りの非ヒト動物由来の単離されたＢ細胞も提供する。次いで、単離されたＢ細胞を、本発明の抗体の供給源（例えば、ハイブリドーマ）を提供するために、不死化細胞との融合により不死化することができる。そのようなハイブリドーマ（すなわち、本発明の抗体を産生する）もまた、本発明の範囲内に含められる。

したがって、さらなる態様では、本発明は、上記の態様のうちのすべての抗体を産生することが可能なハイブリドーマを提供する。本明細書で例示される通り、本発明の抗体は、抗体を発現するハイブリドーマから直接的に取得することができるか、またはクローニングおよび宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、またはリンパ球細胞）中で組換え的に発現されることができる。宿主細胞のさらなる例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの微生物および酵母などの真菌である。代替的に、本発明の抗体は、トランスジェニック非ヒト動物または植物中で組換え的に産生されることができる。本発明の好ましい抗体は、上述のハイブリドーマ、宿主細胞またはウイルスにより産生されかつそれらから取得可能なもの、ならびにそのキメラ化形態およびヒト化形態である。

さらなる態様では、本発明は、部分または薬剤にカップリングされた本発明の抗体を含むコンジュゲートを提供する。本態様の一実施形態では、部分または薬剤は、放射性同位体、酵素、色素、薬物、毒素および細胞傷害剤からなる群から選択される。色素は、例えば、蛍光色素または蛍光タグであり得る。一実施形態では、部分または薬剤は、免疫細胞活性化を達成することが可能である。例えば、部分または薬剤は、Ｔ細胞上のＣＤ２８と相互作用するＣＤ８０であり得る。

本発明の抗体は、ＰＤ－１に対する結合特異性を有する別の抗体などの１つまたは複数の他の分子実体へとカップリングまたは機能的に連結されることができる（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有的会合またはそれ以外により）。１つまたは複数の他の抗体は、好ましくは、本発明の抗体である。

したがって、さらなる態様では、本発明は、少なくとも２種類の本発明の抗体または少なくとも２種類の本発明のコンジュゲートまたは１つもしくは複数の本発明の抗体と１つもしくは複数の本発明のコンジュゲートとの混合物を含むマルチマーを提供する。一実施形態では、マルチマーは、４～８個の本発明の抗体または４～８個の本発明のコンジュゲートを含む。本発明のマルチマーの抗体またはコンジュゲートは、ペプチドにより互いに連結することができる。本発明のマルチマーは、増加した数のＰＤ－１に対する抗原結合性部位により特徴付けられる。

したがって、本発明は、そのうちのすべてがＰＤ－１発現細胞に結合し、そのような細胞へと他の分子を標的化するために使用することができる、非常に様々な抗体コンジュゲート、二重特異的および多重特異的分子、ならびに融合タンパク質を包含する。

さらなる態様では、本発明はまた、本発明の抗体またはその断片をコードする遺伝子または核酸配列を含む核酸にも関する。コードされる抗体鎖は、本明細書に記載される通りの鎖であり得る。

核酸は、ベクター、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージまたは、例えば、遺伝子操作において従来使用される別のベクター中に含めることができる。ベクターは、好適な宿主細胞中および好適な条件下でのベクターの選択を可能にするマーカー遺伝子などのさらなる遺伝子を含むことができる。さらに、ベクターは、好適な宿主におけるコード領域の適正な発現を可能にする発現制御エレメントを含むことができる。そのような制御エレメントは、当業者に公知であり、プロモーター、スプライシングカセット、および翻訳開始コドンを含むことができる。好ましくは、本発明の核酸は、真核細胞または原核細胞中での発現を可能にする上記の発現制御配列に作動可能に結合される。真核細胞または原核細胞中での発現を確実にする制御エレメントは、当業者に周知である。本発明に従う核酸分子の構築のための、上記の核酸分子を含むベクターの構築のための、適切に選択された宿主細胞へのベクターの導入のための、発現を引き起こすかまたは達成するための方法は、当技術分野で周知である。

一実施形態では、核酸はＲＮＡである。

一実施形態では、核酸は、核酸に対して安定化作用を有する少なくとも１つの薬剤と会合する。安定化作用は、ＲＮＡ分解からの保護を含むことができる。本発明の一実施形態では、少なくとも１つの薬剤は、前記ＲＮＡと複合体を形成し、かつ／または前記ＲＮＡを封入する。一実施形態では、少なくとも１つの薬剤は、ＲＮＡ複合体化脂質、ＲＮＡ複合体化ポリマーおよびＲＮＡ複合体化ペプチドまたはタンパク質からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤を含む。例えば、少なくとも１つの薬剤は、ポリエチレンイミン、プロタミン、ポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｌ－アルギニンおよびヒストンからなる群のうちの少なくとも１つから選択される。

さらなる態様では、本発明は、本発明の核酸を含むベクターを提供する。一実施形態では、ベクターは、多層ベシクル、単層ベシクル、またはそれらの混合物である。一実施形態では、ベクターは、リポソーム、好ましくはカチオン性リポソームである。リポソームは、ホスファチジルコリンなどのリン脂質および／またはコレステロールなどのステロールを含むことができる。一実施形態では、リポソームは、約５０ｎｍ～約２００ｎｍの範囲の粒径を有する。一実施形態では、本明細書に記載される通りのベクターは、部位特異的標的化のためのリガンドをさらに含む。前記リガンドは、例えば、抗体である。一実施形態では、リガンド、例えば、抗体は、がん細胞、特に本明細書に記載される通りのがん細胞に結合することが可能である。一実施形態では、ベクターは、腫瘍細胞においてＲＮＡを放出し、かつ／または腫瘍細胞に侵入する。一実施形態では、リガンド、例えば、抗体は、腫瘍細胞などの罹患細胞の表面に会合するタンパク質に結合する。例えば、リガンドまたは抗体は、疾患関連抗原の細胞外部分に結合することができる。

本発明のさらなる態様は、本発明の核酸を含むかまたは本発明のベクターを含む宿主細胞に関する。宿主細胞は、原核および／または真核宿主細胞であり得る。これらの宿主細胞へと、外来性核酸および／またはベクターを導入することができる。一実施形態では、宿主細胞は、真核宿主細胞、好ましくは哺乳動物宿主細胞である。一実施形態では、哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞、ＣＨＯ細胞株の誘導体、例えば、ＣＨＯ－Ｋ１およびＣＨＯｐｒｏ－３、またはリンパ球細胞である。一実施形態では、哺乳動物宿主細胞は、マウス骨髄腫細胞、例えば、ＮＳ０およびＳｐ２／０、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎臓）細胞もしくはその誘導体、例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｔ／１７および／またはＨＥＫ２９３Ｆ、ＣＯＳおよびＶｅｒｏ細胞（両方ともアフリカミドリザル腎臓）、および／またはＨｅＬａ（ヒト子宮頸がん）細胞から選択される。一実施形態では、哺乳動物宿主細胞は、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔおよび／またはＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞から選択される。宿主細胞のさらなる例は、大腸菌などの微生物および酵母、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）およびアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主などの糸状菌などの真菌である。

さらなる態様では、本発明は、本発明の核酸を含むかまたは本発明のベクターを含むウイルスを提供する。

さらなる態様では、本発明は、活性剤および薬学的に許容される担体を含む組成物、好ましくは医薬組成物であって、活性剤が：
（ｉ）本発明の抗体；
（ｉｉ）本発明のコンジュゲート；
（ｉｉｉ）本発明のマルチマー；
（ｉｖ）本発明の核酸；
（ｖ）本発明のベクター；
（ｖｉ）本発明の宿主細胞；および／または
（ｖｉｉ）本発明のウイルス
から選択される少なくとも１つである、医薬組成物を提供する。

一実施形態では、医薬組成物は、非経口投与のために、好ましくは、心血管投与、特に、静脈内または動脈内投与のために製剤化される。

本発明のさらなる態様は、疾患の予防的および／または治療的処置における使用のための本発明の医薬組成物に関する。医学的使用の一実施形態では、疾患は、がん成長および／またはがん転移である。医学的使用の一実施形態では、疾患は、ＰＤ－Ｌ１を発現することにより特徴付けられ、かつ／またはその表面とのＰＤ－Ｌ１の会合により特徴付けられる、罹患細胞またはがん細胞を含むことにより特徴付けられる。医学的使用の一実施形態では、医薬組成物は、がんを予防または治療する方法での使用のためのものである。医学的使用の一実施形態では、がんは、黒色腫、肺がん、腎細胞がん、膀胱がん、乳がん、胃がんおよび胃食道接合部がん、膵臓腺癌、卵巣がん、腎臓腫瘍、膠芽腫およびリンパ腫からなる群から選択され、好ましくは、ホジキンリンパ腫である。

医学的使用の一実施形態では、医薬組成物は、標的器官または組織に特異的に送達され、その中で蓄積することが予定され、かつ／またはその中に留まる。医学的使用の一実施形態では、標的器官または組織は、がん組織、特に、本明細書に特定される通りのがん組織である。例えば、罹患器官または組織は、疾患関連抗原を発現し、かつ／またはその表面との疾患関連抗原の会合により特徴付けられる細胞により特徴付けることができる。疾患関連抗原は、腫瘍関連抗原であり得る。疾患関連抗原は、腫瘍細胞などの罹患細胞の表面と会合することができる。医学的使用の一実施形態では、ベクターまたはウイルスは、標的器官もしくは組織において核酸を放出し、かつ／または標的器官もしくは組織において細胞に侵入する。医学的使用の一実施形態では、抗体は、標的器官または組織の細胞において発現される予定である。

医学的使用の一実施形態では、治療は、単剤療法または併用療法である。好ましくは、組み合わせ治療は、化学療法、分子標的療法、放射線療法、および免疫療法の他の形態からなる群から選択される少なくとも１つの治療である。免疫療法の他の形態は、他のチェックポイント阻害因子を標的化し、それにより、それぞれの他のチェックポイントを阻害（アンタゴニスト）するかまたは活性化／刺激（アゴニスト）するかのいずれかであり得る。標的化することができる他のチェックポイント阻害因子としては、限定するものではないが、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＭ－３、ＫＩＲまたはＬＡＧ－３が挙げられ、第２の結合特異性により標的化することができるチェックポイント活性化因子としては、限定するものではないが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、またはＩＣＯＳが挙げられる。例えば、結合特異性の好ましい組み合わせとしては、抗ＰＤ１と抗ＰＤ－Ｌ１とを、または抗ＰＤ－１と抗ＣＴＬＡ４とが挙げられる。代替的にまたは加えて、免疫療法は、抗血管新生活性を提供することができる。例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）またはその受容体ＶＥＧＦＲ（例えば、ＶＥＧＦＲ１、２、３）を標的化することによる。代替的にまたは加えて、ＰＤＧＦＲ、ｃ－Ｋｉｔ、Ｒａｆおよび／またはＲＥＴを標的化することが可能であり得る。

本発明の抗体はまた、１つまたは複数のワクチンと組み合わせて使用することもでき、ワクチンは、腫瘍細胞などの罹患細胞により発現される抗原に対して免疫系を刺激するためのものである。例えば、抗原は、本明細書に特定される通りの腫瘍抗原のうちの１つまたは複数であり得る。ワクチン接種は、ワクチンＲＮＡ、すなわち、それに対して免疫応答が誘導される抗原またはエピトープをコードするＲＮＡを投与することにより達成できる。代替的に、抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質を、投与することができる。

したがって、本発明はまた、（ｉ）対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドもしくはタンパク質、またはペプチドもしくはタンパク質をコードするポリヌクレオチド；ならびに（ｉｉ）本発明の抗体、本発明のコンジュゲート、本発明のマルチマー、本発明の核酸、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、および／または本発明のウイルスから選択される少なくとも１つを含む組成物、好ましくは医薬組成物も提供する。

一実施形態では、組成物は、対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドもしくはタンパク質をコードするＲＮＡを含む。

医学的使用の一実施形態では、対象はヒトである。

さらなる態様では、本発明は、少なくとも１つの活性剤を対象に投与することを含む、対象において疾患を治療または予防する方法であって、活性剤が：
（ｉ）本発明の抗体；
（ｉｉ）本発明のコンジュゲート；
（ｉｉｉ）本発明のマルチマー；
（ｉｖ）本発明の核酸；
（ｖ）本発明のベクター；
（ｖｉ）本発明の宿主細胞；および／または
（ｖｉｉ）本発明のウイルス
から選択される少なくとも１つである、方法を提供する。

方法の一実施形態では、本発明の医薬組成物が、対象に投与される。方法の一実施形態では、対象は、ＰＤ－Ｌ１を発現し、かつ／またはその表面とのＰＤ－Ｌ１の会合により特徴付けられる細胞により特徴付けられる罹患器官または組織を有する。方法の一実施形態では、疾患は、がん成長および／またはがん転移である。方法の一実施形態では、方法は、がんおよび／またはがん転移を有するかまたはそれを発症するリスクを有する対象におけるがん成長および／またはがん転移を治療または予防するためのものである。方法の一実施形態では、有効量の活性剤が提供される。好ましくは、抗体は、１つまたは複数の用量において、０．１～２０ｍｇ／ｋｇの範囲、より好ましくは０．３～１０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で提供される。前記用量は、例えば、１～４週間毎、より好ましくは２～３週間毎、例えば、２または３週間毎（ｖｅｒｙ）に提供することができる。

方法の一実施形態では、がんは、黒色腫、肺がん、腎細胞癌、膀胱がん、乳がん、胃がんおよび胃食道接合部がん、膵臓腺がん、卵巣がん、腎臓腫瘍、膠芽腫およびリンパ腫からなる群から選択され、好ましくは、ホジキンリンパ腫である。

方法の一実施形態では、活性剤または医薬組成物は心血管系へと投与され、好ましくは、活性剤または医薬組成物は、末梢静脈への投与などの、静脈内または動脈内投与により投与される。方法の一実施形態では、活性剤または医薬組成物は、標的器官もしくは組織へと特異的に送達され、その中で蓄積し、かつ／またはその中に留まる。方法の一実施形態では、標的器官または組織は、がん組織、特に、本明細書に特定される通りのがん組織である。例えば、罹患器官または組織は、疾患関連抗原を発現し、かつ／またはその表面との疾患関連抗原の会合により特徴付けられる細胞により特徴付けることができる。疾患関連抗原は、腫瘍関連抗原であり得る。疾患関連抗原は、腫瘍細胞などの罹患細胞の表面と会合することができる。方法の一実施形態では、ベクター、宿主細胞またはウイルスは、標的器官もしくは組織において核酸を放出し、かつ／または標的器官もしくは組織において細胞に侵入し、好ましくは、抗体が標的器官または組織の細胞において発現される。

方法の一実施形態では、治療は、単剤療法または併用療法である。好ましくは、組み合わせ治療は、化学療法、分子標的療法、放射線療法、および免疫療法の他の形態からなる群から選択される少なくとも１つの治療である。免疫療法の他の形態は、ワクチン接種、例えば、ＲＮＡワクチン接種を含み、かつ／または他のチェックポイント阻害因子を標的化し、それにより、それぞれの他のチェックポイントを阻害（アンタゴニスト）するかもしくは活性化／刺激（アゴニスト）するかのいずれかであり得る。標的化することができる他のチェックポイント阻害因子としては、限定するものではないが、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＭ－３、ＫＩＲまたはＬＡＧ－３が挙げられる。第２の結合特異性により標的化することができるチェックポイント活性化因子としては、限定するものではないが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、またはＩＣＯＳが挙げられる。例えば、結合特異性の好ましい組み合わせとしては、抗ＰＤ１と抗ＰＤ－Ｌ１とを、または抗ＰＤ－１と抗ＣＴＬＡ４とが挙げられる。代替的にまたは加えて、免疫療法は、抗血管新生活性を提供することができる。例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）またはその受容体ＶＥＧＦＲ（例えば、ＶＥＧＦＲ１、２、３）を標的化することによる。代替的にまたは加えて、ＰＤＧＦＲ、ｃ－Ｋｉｔ、Ｒａｆおよび／またはＲＥＴを標的化することが可能であり得る。

方法の好ましい実施形態では、治療は併用療法であり、治療は、
（ｉ）対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドもしくはタンパク質、またはペプチドもしくはタンパク質をコードするポリヌクレオチド；ならびに
（ｉｉ）本発明の抗体、本発明のコンジュゲート、本発明のマルチマー、本発明の核酸、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、および／または本発明のウイルスから選択される少なくとも１つ
を対象に投与することを含む。

一実施形態では、対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドもしくはタンパク質、またはペプチドもしくはタンパク質をコードするポリヌクレオチドならびに（ｉｉ）において明記される通りの少なくとも１つの活性化合物は、逐次的に投与される。一実施形態では、（ｉｉ）において明記される通りの少なくとも１つの活性化合物は、対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドもしくはタンパク質、またはペプチドもしくはタンパク質をコードするポリヌクレオチドの投与後に投与される。一実施形態では、（ｉｉ）において明記される通りの少なくとも１つの活性化合物は、対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドもしくはタンパク質、またはペプチドもしくはタンパク質をコードするポリヌクレオチドの投与後６時間以降、１２時間以降または２４時間以降に投与される。一実施形態では、（ｉｉ）において明記される通りの少なくとも１つの活性化合物は、対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドもしくはタンパク質、またはペプチドもしくはタンパク質をコードするポリヌクレオチドの投与後１２時間～４８時間の間に投与される。

一実施形態では、本発明の方法は、対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドもしくはタンパク質をコードするＲＮＡを対象に投与することを含む。

方法の一実施形態では、対象はヒトである。

さらなる態様では、本発明は、サンプル中のＰＤ－１の定性的または定量的検出のためのキットであって、本発明の抗体または本発明のコンジュゲートまたは本発明のマルチマーを含む、キットを提供する。

またさらなる態様では、本発明は、サンプル中に発現されるＰＤ－１の存在または量を決定する方法における、本発明の抗体または本発明のコンジュゲートまたは本発明のマルチマーまたは本発明のキットの使用であって、方法が以下：
（ｉ）サンプルを抗体またはコンジュゲートまたはマルチマーと接触させる工程、および
（ｉｉ）抗体またはコンジュゲートまたはマルチマーとＰＤ－１との間の複合体の形成を検出し、かつ／または複合体の量を決定する工程
を含む、使用を提供する。

一実施形態では、キットまたは方法は、ＰＤ－１の定量的および／または定性的評価、例えば、絶対的および／または相対的測定を可能にする。

本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。

図１は、組換えヒトＰＤ－１細胞外ドメインに対するキメラ抗ＰＤ－１抗体ＭＡＢ－１９－０２０２、ＭＡＢ－１９－０２０８、ＭＡＢ－１９－０２１７、ＭＡＢ－１９－０２２３、およびＭＡＢ－１９－０２３３の結合性を示す。結合能は、ＥＬＩＳＡにより決定した。キメラ抗ＰＤ－１抗体は、０．０６ｎｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬの範囲の連続希釈において試験した。参照抗体として、抗ｈＰＤ－１－Ｎｉ－ｈＩｇＧ４（ニボルマブの可変領域を特徴とする）および抗ｈＰＤ１－Ｐｅｍ－ｈＩｇＧ４（ペムブロリズマブの可変領域を特徴とする）を使用した。データは、４パラメーターロジスティックモデルを用いてフィッティングした。図２は、ＨＥＫ－２９３－ｈＰＤ－１に対するキメラ抗ＰＤ－１抗体ＭＡＢ－１９－０２０２、ＭＡＢ－１９－０２０８、ＭＡＢ－１９－０２１７、ＭＡＢ－１９－０２２３、およびＭＡＢ－１９－０２３３の結合性を示す。結合性は、ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔＣＸ５ハイコンテントイメージャーデバイスを使用して評価した。キメラ抗ＰＤ－１抗体は、０．０７ｎｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬの範囲の連続希釈において試験した。参照抗体として、抗ｈＰＤ－１－Ｎｉ－ｈＩｇＧ４（ニボルマブの可変領域を特徴とする）および抗ｈＰＤ１－Ｐｅｍ－ｈＩｇＧ４（ペムブロリズマブの可変領域を特徴とする）を使用した。ＲＦＵは、相対蛍光単位である。データは、４パラメーターロジスティックモデルを用いてフィッティングした。図３は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断バイオアッセイを使用して評価した、キメラ抗ＰＤ－１抗体ＭＡＢ－１９－０２０２、ＭＡＢ－１９－０２０８、ＭＡＢ－１９－０２１７、ＭＡＢ－１９－０２２３、およびＭＡＢ－１９－０２３３によるＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用の遮断を示す。キメラ抗ＰＤ－１抗体は、９ｎｇ／ｍＬ～６．６７μｇ／ｍＬの範囲の連続希釈において試験した。参照抗体として、抗ｈＰＤ－１－Ｎｉ－ｈＩｇＧ４（ニボルマブの可変領域を特徴とする）および抗ｈＰＤ１－Ｐｅｍ－ｈＩｇＧ４（ペムブロリズマブの可変領域を特徴とする）を使用した。ＲＬＵは相対光単位である。データは、４パラメーターロジスティックモデルを用いてフィッティングした。図４は、活性ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１軸を用いる抗原特異的Ｔ細胞アッセイにより測定した、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１媒介Ｔ細胞阻害の解放を示す。クローディン６特異的ＴＣＲ－およびＰＤ－１インビトロ翻訳（ＩＶＴ）－ＲＮＡをエレクトロポレーションされたＣＦＳＥ標識Ｔ細胞を、キメラ抗ＰＤ１抗体ＭＡＢ－１９－０２０２、ＭＡＢ－１９－０２０８、ＭＡＢ－１９－０２１７、ＭＡＢ－１９－０２２３、およびＭＡＢ－１９－０２３３の０．６ｎｇ／ｍＬ～０．６μｇ／ｍＬの範囲の連続希釈の存在下で、自家クローディン６－ＩＶＴ－ＲＮＡをエレクトロポレーションされた未熟樹状細胞と共に５日間インキュベートした。ＣＤ８^＋Ｔ細胞増殖は、フローサイトメトリーにより測定した。示されるデータは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して算出される通りの拡大増殖指数である。エラーバー（ＳＤ）は、実験内の変動を示す（２連、１名のドナー由来の細胞を使用）。参照抗体として、ペムブロリズマブ（ＭＳＤ、ＰＺＮ１０７４９８９７）を使用した。データは、４パラメーターロジスティックモデルを用いてフィッティングした。図５は、ＥＬＩＳＡにより決定された、組換えヒトＰＤ－１細胞外ドメインに対するヒト化抗ＰＤ－１抗体ＭＡＢ－１９－０６０３、ＭＡＢ－１９－０６０８、ＭＡＢ－１９－０６１３、およびＭＡＢ－１９－０６１８ならびに親キメラ抗ＰＤ－１ＭＡＢ－１９－０２０２の結合性を示す。キメラ抗ＰＤ－１抗体は、０．１５ｎｇ／ｍＬ～２．５μｇ／ｍＬの範囲の連続希釈において試験した。参照抗体として、抗ｈＰＤ－１－Ｎｉ－ｈＩｇＧ４（ニボルマブの可変領域を特徴とする）および抗ｈＰＤ１－Ｐｅｍ－ｈＩｇＧ４（ペムブロリズマブの可変領域を特徴とする）を使用した。データは、４パラメーターロジスティックモデルを用いてフィッティングした。図６は、ＥＬＩＳＡにより決定された、組換えヒトＰＤ－１細胞外ドメインに対するヒト化抗ＰＤ－１抗体ＭＡＢ－１９－０５８３、ＭＡＢ－１９－０５９４、およびＭＡＢ－１９－０５９８ならびに親キメラ抗ＰＤ－１ＭＡＢ－１９－０２３３の結合性を示す。キメラ抗ＰＤ－１抗体は、０．１５ｎｇ／ｍＬ～２．５μｇ／ｍＬの範囲の連続希釈において試験した。参照抗体として、抗ｈＰＤ－１－Ｎｉ－ｈＩｇＧ４（ニボルマブの可変領域を特徴とする）および抗ｈＰＤ１－Ｐｅｍ－ｈＩｇＧ４（ペムブロリズマブの可変領域を特徴とする）を使用した。データは、４パラメーターロジスティックモデルを用いてフィッティングした。図７は、ＨＥＫ－２９３－ｈＰＤ－１に対するヒト化抗ＰＤ－１抗体ＭＡＢ－１９－０６０３、ＭＡＢ－１９－０６０８、ＭＡＢ－１９－０６１３、およびＭＡＢ－１９－０６１８ならびに親キメラ抗ＰＤ－１ＭＡＢ－１９－０２０２の結合性を示す。結合性は、ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔＣＸ５ハイコンテントイメージャーデバイスを使用して評価した。キメラ抗ＰＤ－１抗体は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬの範囲の連続希釈において試験した。参照抗体として、抗ｈＰＤ－１－Ｎｉ－ｈＩｇＧ４（ニボルマブの可変領域を特徴とする）および抗ｈＰＤ１－Ｐｅｍ－ｈＩｇＧ４（ペムブロリズマブの可変領域を特徴とする）を使用した。ＲＦＵは、相対蛍光単位である。データは、４パラメーターロジスティックモデルを用いてフィッティングした。図８は、ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔＣＸ５ハイコンテントイメージャーデバイスを使用して評価した、ＨＥＫ－２９３－ｈＰＤ－１に対するヒト化抗ＰＤ－１抗体ＭＡＢ－１９－０５８３、ＭＡＢ－１９－０５９４、およびＭＡＢ－１９－０５９８ならびに親キメラ抗ＰＤ－１ＭＡＢ－１９－０２３３の結合性を示す。キメラ抗ＰＤ－１抗体は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬの範囲の連続希釈において試験した。参照抗体として、抗ｈＰＤ－１－Ｎｉ－ｈＩｇＧ４（ニボルマブの可変領域を特徴とする）および抗ｈＰＤ１－Ｐｅｍ－ｈＩｇＧ４（ペムブロリズマブの可変領域を特徴とする）を使用した。ＲＦＵは、相対蛍光単位である。データは、４パラメーターロジスティックモデルを用いてフィッティングした。図９は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断バイオアッセイを用いて評価した、ヒト化抗ＰＤ－１抗体ＭＡＢ－１９－０６０３、ＭＡＢ－１９－０６０８、ＭＡＢ－１９－０６１３、およびＭＡＢ－１９－０６１８ならびに親キメラ抗ＰＤ－１ＭＡＢ－１９－０２０２によるＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用の遮断を示す。キメラ抗ＰＤ－１抗体は、９ｎｇ／ｍＬ～６．６７μｇ／ｍＬの範囲の連続希釈において試験した。参照抗体として、抗ｈＰＤ－１－Ｎｉ－ｈＩｇＧ４（ニボルマブの可変領域を特徴とする）および抗ｈＰＤ１－Ｐｅｍ－ｈＩｇＧ４（ペムブロリズマブの可変領域を特徴とする）を使用した。ＲＬＵは、相対光単位である。データは、４パラメーターロジスティックモデルを用いてフィッティングした。図１０は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断バイオアッセイを使用して評価した、ヒト化抗ＰＤ－１抗体ＭＡＢ－１９－０５８３、ＭＡＢ－１９－０５９４、およびＭＡＢ－１９－０５９８ならびに親キメラ抗ＰＤ－１ＭＡＢ－１９－０２３３によるＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用の遮断を示す。キメラ抗ＰＤ－１抗体は、９ｎｇ／ｍＬ～６．６７μｇ／ｍＬの範囲の連続希釈において試験した。参照抗体として、抗ｈＰＤ－１－Ｎｉ－ｈＩｇＧ４（ニボルマブの可変領域を特徴とする）および抗ｈＰＤ１－Ｐｅｍ－ｈＩｇＧ４（ペムブロリズマブの可変領域を特徴とする）を使用した。ＲＬＵは、相対光単位である。データは、４パラメーターロジスティックモデルを用いてフィッティングした。図１１は、活性ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１軸を用いる抗原特異的Ｔ細胞アッセイにより測定した、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１媒介Ｔ細胞阻害の解放を示す。クローディン６特異的ＴＣＲ－およびＰＤ－１インビトロ翻訳（ＩＶＴ）－ＲＮＡをエレクトロポレーションされたＣＦＳＥ標識Ｔ細胞を、ヒト化抗ＰＤ－１抗体ＭＡＢ－１９－０６０３、ＭＡＢ－１９－０６０８、ＭＡＢ－１９－０６１３、およびＭＡＢ－１９－０６１８ならびに親キメラ抗ＰＤ－１ＭＡＢ－１９－０２０２の０．６ｎｇ／ｍＬ～０．６μｇ／ｍＬの範囲の連続希釈の存在下で、自家クローディン６－ＩＶＴ－ＲＮＡをエレクトロポレーションされた未熟樹状細胞と共に５日間インキュベートした。ＣＤ８^＋Ｔ細胞増殖は、フローサイトメトリーにより測定した。示されるデータは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して算出される通りの拡大増殖指数である。エラーバー（ＳＤ）は、実験内の変動を示す（２連、１名のドナー由来の細胞を使用）。参照抗体として、ペムブロリズマブ（ＭＳＤ、ＰＺＮ１０７４９８９７）を使用した。データは、４パラメーターロジスティックモデルを用いてフィッティングした。図１２は、Ｋ５６２細胞へとトランスフェクションされた全長ヒトＰＤ－１に対するインビトロ発現された抗ＰＤ－１ＲｉｂｏＭａｂ－１９－０２０２およびＲｉｂｏＭａｂ－１９－０２３３の結合性を示す。接着性ＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞を、３μｇＲｉｂｏＭａｂコードｍＲＮＡ（重鎖と軽鎖との２：１比、１μＬリポフェクタミンＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ当たりに複合体化された４００ｎｇｍＲＮＡ）を用いてリポフェクションし、２０時間のインキュベーション後、上清を回収した。Ｋ５６２細胞を、全長ヒトＰＤ－１をコードする１μｇｍＲＮＡを用いてエレクトロポレーションし、０．００６％～１００％の範囲のＲｉｂｏＭａｂ含有上清の連続希釈を用いて、エレクトロポレーションの２０時間後に処理した。ＲｉｂｏＭａｂの結合性を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８コンジュゲート化ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ特異的（Ｆａｂ’）_２断片を使用するフローサイトメトリーにより検出した。データは、ｎ＝３技術的反復の幾何平均蛍光強度（ｇＭＦＩ）ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８±標準偏差（ＳＤ）として表す。

本発明が以下で詳細に説明されるが、本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコールおよび試薬に限定されず、なぜならこれらは変わり得るからであることが理解されるべきである。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明する目的のみのためのものであり、本発明の範囲を限定することは意図されないことも理解されるべきであり、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるであろう。別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。

以下において、本発明の要素が説明されるであろう。これらの要素は、具体的な実施形態を用いて列記されるが、しかしながら、それらがいずれかの様式およびいずれかの数において組み合わせられて、追加の実施形態をつくり出すことができることが理解されるべきである。様々に説明される実施例および好ましい実施形態は、明示的に記載される実施形態のみへと本発明を限定するものと解釈されるべきではない。本説明は、明示的に記載される実施形態をいずれかの数の開示されかつ／または好ましい要素と組み合わせる実施形態をサポートおよび包含するものと理解されるべきである。さらに、本出願中のすべての記載される要素のいかなる再配列および組み合わせが、文脈がそうでないことを示さない限り、本出願の説明により開示されると見なされるべきである。

好ましくは、本明細書で使用される用語は、"A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Koelbl, Eds., (1995) Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerlandに記載される通りに定義される。

本発明の実務は、別途示されない限り、当該分野の文献中に説明される、生化学、細胞生物学、免疫学、および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を用いるであろう（例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989を参照されたい）。

本明細書およびそれに続く特許請求の範囲全体を通して、文脈がそうでないことを要求しない限り、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）および「含むこと」（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）などの変形は、記載されるメンバー、整数もしくは工程またはメンバー、整数もしくは工程の群の包含を暗示するが、いずれかの他のメンバー、整数もしくは工程またはメンバー、整数もしくは工程の群の除外を暗示しないことが理解されるであろうが、しかし、一部の実施形態では、そのような他のメンバー、整数もしくは工程またはメンバー、整数もしくは工程の群が除外される場合があり、すなわち、主題が、記載されるメンバー、整数もしくは工程またはメンバー、整数もしくは工程の群の包含にある。用語「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」ならびに本発明を説明する文脈中で使用される類似の参照（特に、特許請求の範囲の文脈において）は、本明細書中で別途示されるかまたは文脈により明らかに矛盾しない限り、単数形および複数形の両方を網羅するものと理解されるべきである。本明細書の値の範囲の記述は、範囲内に入る各々の別個の値を個別に参照する省略された方法として機能することが単に意図される。本明細書で別途示されない限り、各々の個別の値が、本明細書で個別に列挙されているかの如く、本明細書中に組み入れられる。

本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書で別途示されるかまたは文脈により明らかに矛盾しない限り、いずれかの好適な順序で行うことができる。本明細書に提供されるいずれかおよびすべての例、または例示的表現［例えば、「など（ｓｕｃｈａｓ）」］の使用は、本発明をよりよく例示することが単に意図され、別途特許請求される本発明の範囲に対する限定を提示しない。本明細書中のいかなる表現も、本発明の実務に対して必須のいずれかの特許請求されない要素を示すものとして解釈されるべきではない。

いくつかの文書が、本明細書のテキスト全体を通して引用される。本明細書で引用される文書のそれぞれ（すべての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の仕様、説明書等を含む）は、上記または下記にかかわらず、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書のいずれも、本発明が先行発明に基づいてそのような開示に先行する権利を有しないことの了解として解釈されるべきではない。

「低減すること」または「阻害すること」などの用語は、好ましくは５％以上、１０％以上、２０％以上、より好ましくは５０％以上、最も好ましくは７５％以上のレベルにおける全体的な減少を引き起こす能力に関する。用語「阻害する」または類似の語句は、完全または本質的に完全な阻害、すなわち、ゼロまでまたは本質的にゼロまでの低減を含む。

「増加させること」、「強化すること」、「促進すること」または「延長すること」などの用語は、好ましくは、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも１００％、好ましくは少なくとも２００％および特に少なくとも３００％までの増加、強化、促進または延長に関する。これらの用語はまた、ゼロまたは測定不可能もしくは検出不可能なレベルから、ゼロ超のレベルまたは測定可能もしくは検出可能なレベルへの増加、強化、促進または延長にも関する場合がある。

用語「ＰＤ－１」は、プログラム細胞死－１に関し、細胞により天然に発現されるかまたはＰＤ－１遺伝子を用いてトランスフェクションされた細胞により発現される、ＰＤ－１のいずれかの変異体、コンホメーション、アイソフォームおよび種ホモログを含む。好ましくは、「ＰＤ－１」は、ヒトＰＤ－１、特に、配列表の配列番号７１に記載のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００５００９．２）を有するタンパク質または配列表の配列番号７３に記載の核酸配列（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００５０１８．２）により好ましくはコードされるタンパク質に関する。

用語「ＰＤ－１」は、細胞により天然に発現されるかまたはＰＤ－１遺伝子を用いてトランスフェクションされた細胞中／細胞上に発現される、ヒトＰＤ－１の翻訳後修飾された変異体、アイソフォームおよび種ホモログを含む。

用語「ＰＤ－１変異体」は、（ｉ）ＰＤ－１スプライシング変異体、（ｉｉ）特に異なるＮ－グリコシル化状態を有する変異体を含む、ＰＤ－１翻訳後修飾変異体、（ｉｉｉ）ＰＤ－１コンホメーション変異体を包含するであろう。そのような変異体は、ＰＤ－１の可溶性形態を含むことができる。

ＰＤ－１は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属するＩ型膜タンパク質である［The EMBO Journal (1992), vol.11, issue 11, p.3887-3895］。ヒトＰＤ－１タンパク質は、配列表の配列番号７１に記載の配列の２４～１７０位のアミノ酸から構成される細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン（配列番号７１に記載の配列の１７１～１９１位のアミノ酸）および細胞質ドメイン（配列番号７１に記載の配列の１９２～２８８位のアミノ酸）を含む。用語「ＰＤ－１断片」は、本明細書で使用される場合、ＰＤ－１タンパク質のいずれかの断片、好ましくは免疫原性断片を包含するであろう。この用語はまた、例えば、全長タンパク質の上述のドメインまたはこれらのドメインのいずれかの断片、特に免疫原性断片も包含する。ヒトＰＤ－１タンパク質の好ましい細胞外ドメインのアミノ酸配列は、配列表の配列番号７２に示される。

本発明の文脈における用語「細胞外部分」または「細胞外ドメイン」とは、好ましくは、細胞の細胞外空間に面し、かつ、例えば、細胞の外側に位置する抗体などの結合性分子により、好ましくは前記細胞の外側からアクセス可能である、タンパク質などの分子の一部分を意味する。好ましくは、この用語は、１つもしくは複数の細胞外ループまたはドメインまたはその断片を意味する。

用語「抗体」とは、ジスルフィド結合により相互に接続された少なくとも２本の重鎖（Ｈ）および２本の軽鎖（Ｌ）を含む糖タンパク質、またはその抗原結合性部分を意味する。用語「抗体」はまた、抗体の、特に、本明細書に記載される抗体のすべての組換え形態、例えば、原核または真核細胞中で発現される抗体、非グリコシル化抗体、ならびに以下に記載される通りのいずれかの抗原結合性抗体断片および誘導体も含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略される）および重鎖定常領域から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書でＶＬと略される）および軽鎖定常領域から構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される比較的保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域へとさらに細分割することができる。各ＶＨおよびＶＬは、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置される、３個のＣＤＲおよび４個のＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織または因子に対する免疫グロブリンの結合性を媒介することができる。

用語「ヒト化抗体」とは、非ヒト種由来の免疫グロブリンから実質的に誘導される抗原結合性部位を有する分子を意味し、分子の残余の免疫グロブリン構造は、ヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づく。抗原結合性部位は、定常ドメイン上に融合された完全な可変ドメインを含むか、または可変ドメイン中の適切なフレームワーク領域上に移植された相補性決定領域（ＣＤＲ）のみを含むかのいずれかであり得る。抗原結合性部位は、野生型であるかまたは１つもしくは複数のアミノ酸置換により改変され、例えば、ヒト免疫グロブリンにより近接して似せるために改変されていることができる。ヒト化抗体の一部の形態は、すべてのＣＤＲ配列を保存する（例えば、マウス抗体由来の６個のＣＤＲすべてを含むヒト化マウス抗体）。他の形態は、元の抗体に対して変化している１つまたは複数のＣＤＲを有する。

用語「キメラ抗体」とは、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列のそれぞれのうちの１つの部分が、特定の種に由来するかまたは特定のクラスに属する抗体中の対応する配列に対して相同であり、鎖の残余のセグメントが別の抗体中の対応する配列に相同である抗体を意味する。典型的には、軽鎖および重鎖の両方の可変領域が哺乳動物の１つの種に由来する抗体の可変領域を模倣し、定常部分が別の種に由来する抗体の配列に対して相同である。そのようなキメラ形態の１つの明らかな利点は、可変領域が、例えば、ヒト細胞調製物に由来する定常領域と組み合わせて、非ヒト宿主生物由来の容易に入手可能なＢ細胞またはハイブリドーマを使用して、現在既知の供給源から好都合に誘導することができることである。可変領域は調製の容易さの利点を有し、特異性は供給源により影響を受けない一方で、ヒトである定常領域は、非ヒト供給源由来の定常領域が起こすよりも、抗体が注入される場合にヒト対象からの免疫応答を起こしにくい。しかしながら、定義は、この特定の例に限定されない。

抗体の用語「抗原結合性部分」（または単に「結合性部分」）とは、本明細書で使用される場合、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたは複数の断片を意味する。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片により果たされ得ることが示されてきている。抗体の用語「抗原結合性部分」の中に包含される結合性断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨドメインからなる一価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）_２断片、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋により連結された２個のＦａｂ断片を含む二価断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片［Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546］；（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、および（ｖｉｉ）合成リンカーにより連結されていてもよい２つ以上の単離されたＣＤＲの組み合わせが挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは別個の遺伝子によりコードされるが、それらは、組換え法を使用して、ＶＬおよびＶＨ領域が対形成して一価分子［単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Bird et al. (1988) Science 242: 423-426；およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883を参照されたい］を形成する単一タンパク質鎖となることを可能にする合成リンカーにより連結することができる。そのような単鎖抗体はまた、抗体の用語「抗原結合性部分」の中に包含されることも意図される。さらなる例は、（ｉ）免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチドに融合された結合ドメインポリペプチド、（ｉｉ）ヒンジ領域に融合された免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域、および（ｉｉｉ）ＣＨ２定常領域に融合された免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域を含む結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質である。結合ドメインポリペプチドは、重鎖可変領域または軽鎖可変領域であり得る。結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質は、ＵＳ２００３／０１１８５９２およびＵＳ２００３／０１３３９３９にさらに開示される。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の技術を使用して取得され、断片は、無傷の抗体と同じ様式で有用性に関してスクリーニングされる。

用語「エピトープ」とは、抗体に結合することが可能なタンパク質決定基を意味し、本明細書の用語「結合性」は、好ましくは、特異的結合性に関する。エピトープは、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、通常は特異的な三次元的構造特徴および特異的な電荷特徴を有する。コンホメーションエピトープおよび非コンホメーションエピトープは、前者に対する結合性が変性性溶媒の存在下では失われるが後者では失われないことにより区別される。用語「エピトープ」とは、好ましくは、分子中の抗原性決定基、すなわち、免疫系により認識される抗原などの分子の一部分または断片を意味する。例えば、エピトープは、Ｔ細胞、Ｂ細胞または抗体により認識され得る。抗原のエピトープは、抗原の連続的または非連続的な一部分を含むことができ、約５～約５０、より好ましくは約８～約３０、最も好ましくは約１０～約２５などの約５～約１００アミノ酸長であり得、例えば、エピトープは、好ましくは、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸長であり得る。一実施形態では、エピトープは、約１０～約２５アミノ酸長である。用語「エピトープ」は、Ｂ細胞エピトープおよびＴ細胞エピトープを含む。

用語「Ｔ細胞エピトープ」とは、ＭＨＣ分子の文脈において提示される場合に、Ｔ細胞により認識されるタンパク質の一部分または断片を意味する。用語「主要組織適合性複合体」および略語「ＭＨＣ」は、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ分子を含み、すべての脊椎動物において存在する遺伝子の複合体に関する。ＭＨＣタンパク質または分子は、免疫反応中のリンパ球と抗原提示細胞または罹患細胞との間のシグナル伝達に対して重要であり、ＭＨＣタンパク質または分子は、ペプチドエピトープに結合し、Ｔ細胞上のＴ細胞受容体による認識のためにそれらを提示する。ＭＨＣによりコードされるタンパク質は、細胞の表面上に発現され、自己抗原（細胞自体に由来するペプチド断片）および非自己抗原（例えば、侵入微生物の断片）の両方をＴ細胞に対して提示する。クラスＩＭＨＣ／ペプチド複合体の場合、結合性ペプチドは、典型的には約８～約１０アミノ酸長であるが、より長いかまたはより短いペプチドが有効である場合がある。クラスＩＩＭＨＣ／ペプチド複合体の場合、結合性ペプチドは、典型的には約１０～約２５アミノ酸長であり、特に約１３～約１８アミノ酸長であるが、より長いかまたはより短いペプチドが有効である場合がある。

用語「二重特異的分子」は、２種類の異なる結合特異性を有するいずれかの薬剤、例えば、タンパク質、ペプチド、またはタンパク質もしくはペプチド複合体を含むことが意図される。例えば、分子は、（ａ）細胞表面抗原、および（ｂ）エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体に結合するか、またはこれらと相互作用することができる。用語「多重特異的分子」または「ヘテロ特異的分子」は、３種類以上の異なる結合特異性を有するいずれかの薬剤、例えば、タンパク質、ペプチド、またはタンパク質もしくはペプチド複合体を含むことが意図される。例えば、分子は、（ａ）細胞表面抗原、（ｂ）エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体、および（ｃ）少なくとも１つの他の構成要素に結合するか、またはこれらと相互作用することができる。したがって、本発明は、ＰＤ－１、およびエフェクター細胞上のＦｃ受容体などの他の標的に向けられる、二重特異的、三重特異的、四重特異的、および他の多重特異的分子を含むが、これらに限定されない。用語「二重特異的抗体」はまた、ダイアボディも含む。ダイアボディは、ＶＨおよびＶＬドメインが単一ポリペプチド鎖上に発現されるが、同じ鎖上の２つのドメイン間での対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用し、それにより、ドメインが別の鎖の相補的ドメインと対形成するように仕向け、かつ２つの抗原結合性部分をつくり出す、二価二重特異的抗体である［例えば、Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448；Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2: 1121-1123を参照されたい］。

本発明はまた、本明細書に記載される抗体の誘導体も含む。用語「抗体誘導体」とは、抗体のいずれかの修飾形態、例えば、抗体と別の薬剤または抗体とのコンジュゲートを意味する。本明細書で使用される場合、抗体が動物を免疫化することによる系かまたは免疫グロブリン遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることによる系から得られる場合、抗体は、特定の生殖系列配列「から誘導」され、選択された抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列において少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。典型的には、特定の生殖系列配列から誘導される抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列との、１０アミノ酸以下の差異、より好ましくは５アミノ酸以下、またはさらにより好ましくは４、３、２、または１アミノ酸以下の差異を示すであろう。

本明細書で使用される場合、用語「ヘテロ抗体」とは、そのうちの少なくとも２つが異なる特異性を有する、一緒に連結された２つ以上の抗体、その誘導体、または抗原結合性領域を意味する。これらの異なる特異性は、エフェクター細胞上のＦｃ受容体に対する結合特異性、および標的細胞、例えば、腫瘍細胞上の抗原またはエピトープに対する結合特異性を含む。

本明細書に記載される抗体は、ヒト抗体であり得る。用語「ヒト抗体」は、本明細書で使用される場合、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列から誘導された可変領域および定常領域を有する抗体を含むことが意図される。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基［例えば、インビトロでランダムもしくは部位特異的突然変異誘発により、またはインビボ（ｉｎｖｉｖｏ）で体細胞突然変異により導入される突然変異］を含むことができる。

用語「モノクローナル抗体」とは、本明細書で使用される場合、単一分子組成の抗体分子の調製物を意味する。モノクローナル抗体は、特定のエピトープに対する単一結合特異性および親和性を示す。一実施形態では、モノクローナル抗体は、不死化細胞に融合された、非ヒト動物、例えば、マウスから取得されるＢ細胞を含むハイブリドーマにより産生される。

用語「組換え抗体」は、本明細書で使用される場合、（ａ）免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックもしくはトランスクロモソーマルである動物（例えば、マウス）またはそれから調製されたハイブリドーマから単離された抗体、（ｂ）抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から、例えば、トランスフェクトーマから単離された抗体、（ｃ）組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離された抗体、および（ｄ）他のＤＮＡ配列への免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを含むいずれかの他の手段により調製、発現、作製または単離された抗体などの、組換え手段により調製、発現、作製または単離されるすべての抗体を含む。

用語「トランスフェクトーマ」は、本明細書で使用される場合、抗体を発現する組換え真核宿主細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、ＮＳ／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ／１７植物細胞、または酵母細胞を含む真菌を含む。

本明細書で使用される場合、「異種抗体」は、そのような抗体を産生するトランスジェニック生物に関連して定義される。この用語は、トランスジェニック生物からならない生物中で見出され、一般的にトランスジェニック生物以外の種から誘導されるものに対応するアミノ酸配列またはコード核酸配列を有する抗体を意味する。

本明細書で使用される場合、「ヘテロハイブリッド抗体」とは、異なる生物的起源の軽鎖および重鎖を有する抗体を意味する。例えば、ネズミ軽鎖と会合したヒト重鎖を有する抗体は、ヘテロハイブリッド抗体である。

本明細書に記載される抗体は、好ましくは、単離される。「単離された抗体」は、本明細書で使用される場合、異なる抗原性特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を意味することが意図される（例えば、ＰＤ－１に特異的に結合する単離された抗体は、ＰＤ－１以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。ヒトＰＤ－１のエピトープ、アイソフォームまたは変異体に特異的に結合する単離された抗体は、しかしながら、例えば、他の種由来の他の関連する抗原（例えば、ＰＤ－１種ホモログ）に対する交差反応性を有する場合がある。さらに、単離された抗体は、他の細胞性物質および／または化学物質を実質的に含まないことができる。本発明の一実施形態では、「単離された」モノクローナル抗体の組み合わせは、異なる特異性を有し、明確に規定された組成において組み合わせられている抗体に関する。

本明細書で使用される場合、「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）を意味する。

本明細書で使用される場合、「アイソタイプスイッチング」とは、それにより抗体のクラスまたはアイソタイプが、あるＩｇクラスから他のＩｇクラスのものへと変化する現象を意味する。

本発明に従えば、用語「結合性」は、好ましくは、「特異的結合性」に関する。本明細書で使用される場合、「特異的結合性」とは、所定の抗原に結合する抗体を意味する。典型的には、抗体は、約１×１０^－７Ｍ以下のＫＤに対応する親和性を有して結合し、所定の抗原または近縁の抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）に対する結合性に関するその親和性よりも少なくとも２桁、好ましくは少なくとも３桁、より好ましくは少なくとも４桁低いＫＤに対応する親和性を有して所定の抗原に結合する。用語「ＫＤ」（Ｍ）は、本明細書で使用される場合、特定の抗体－抗原相互作用の解離平衡定数を意味することが意図される。

本明細書で使用される場合、対象に適用される場合の用語「天然に存在する」とは、対象が天然に見出され得る事実を意味する。例えば、天然での供給源から単離することができ、実験室で人により意図的に改変されていない生物（ウイルスを含む）中に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。

用語「再編成された」とは、本明細書で使用される場合、それぞれ、完全なＶＨまたはＶＬドメインを本質的にコードするコンホメーションにおいてＶセグメントがＤ－ＪまたはＪセグメントに直ちに隣接して位置する、重鎖または軽鎖免疫グロブリン遺伝子座の構成を意味する。再編成された免疫グロブリン（抗体）遺伝子の遺伝子座は、生殖系列ＤＮＡに対する比較により特定することができ；再編成された遺伝子座は、少なくとも１つの組み換えられたヘプタマー／ノナマー相同性エレメントを有するであろう。

Ｖセグメントを参照して本明細書で使用される場合の用語「非再編成」または「生殖系列構成」とは、Ｖセグメントが組み換えられておらず、それによりＤまたはＪセグメントに直ちに隣接している構成を意味する。

Ｉ．抗体作用のメカニズム
下記は、本発明の抗体の治療効力の基礎になるメカニズムに関する考察を提供するが、いかようにも本発明を限定するものと見なされるべきではない。

本明細書に記載される抗体は、好ましくは、免疫チェックポイントＰＤ－１と相互作用する。ＰＤ－１に対する結合性により、そのリガンド（ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２）とのＰＤ－１の相互作用が阻害される。ＰＤ－Ｌ１は、例えば、腫瘍細胞および腫瘍微小環境の抗原提示細胞上に発現される。ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用は、免疫応答、好ましくはＴ細胞媒介免疫応答の消失をもたらし、したがって、本明細書に記載される通りの抗体を用いてＰＤ－１を遮断することにより、免疫応答のそのような消失は妨げられるかもしくは少なくとも低減するか、または言い換えれば免疫応答が誘導される。

ＰＤ－１およびそのリガンドは、免疫応答の防止または低減において互いに相互作用するが、この作用を達成するために、ＰＤ－１遮断は、リガンド遮断よりも有利である可能性がある。これは、ＰＤ－Ｌ２を発現する罹患細胞とＰＤ－１を発現するリンパ球との間の阻害性シグナル伝達が免疫系による免疫応答の阻害を助ける場合があるので、例えば、ＰＤ－Ｌ１の遮断は、それでも低減された免疫応答をもたらし得るからである。

免疫系は、２種類の別個の様式：生得免疫および適応免疫を介して、罹患細胞を認識および破壊する能力を有する。生得成分は、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、および顆粒球からなる。これらの細胞は、細胞の形質転換に関与する分子パターンを特定し、様々なサイトカインおよび炎症性メディエーターを放出する。生得応答は、適応免疫応答において存在する特徴である外来性抗原に対するメモリー能力を欠いている。この免疫系の後者の成分はまた、リンパ球上の受容体の存在により付与される、外来性抗原に対する特異性も特徴とする。抗原提示細胞（ＡＰＣ）もまた、適応応答において役割を果たし、ＡＰＣは、外来性抗原を飲み込み、主要組織適合性複合体の文脈において、リンパ球に対してそれらを提示する。ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子の文脈において抗原を認識する受容体を保有し、これにより、ＣＤ４^＋Ｔ細胞がサイトカインを放出し、ＣＤ８^＋リンパ球（ＣＴＬ）またはＢ細胞をさらに活性化することを可能にする。ＣＴＬは、細胞媒介免疫の一部分であり、アポトーシスまたはパーフォリン媒介細胞溶解を介して、ＭＨＣクラスＩ分子の文脈において提示される抗原の認識後に、細胞を除去することが可能である。Ｔ細胞媒介免疫が抗腫瘍応答において重要な役割を果たすことは、広く認められている。Ｂ細胞は、免疫グロブリンの放出に関与し、したがって、体液性免疫系の一部分である。

用語「免疫応答」とは、抗原または抗原を発現する細胞などの標的に対する一体化した身体応答を意味し、好ましくは、細胞性免疫応答または細胞性および体液性免疫応答を意味する。免疫応答は、保護的／予防的（ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ／ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）かつ／または治療的であり得る。

「免疫応答を誘導すること」とは、誘導前に免疫応答が見られなかったことを意味することができるが、誘導前に一定レベルの免疫応答があり、かつ誘導後には前記免疫応答が強化されることも意味することができる。したがって、「免疫応答を誘導すること」はまた、「免疫応答を強化すること」も含む。好ましくは、対象において免疫応答を誘導した後、前記対象は、がん疾患などの疾患の発症から保護されるか、または疾患状態が、免疫応答を誘導することにより改善される。この場合に免疫応答を誘導することとは、対象の疾患状態が改善されること、対象が転移を発症しないこと、またはがん疾患を発症するリスクを有する対象ががん疾患を発症しないことを意味することができる。

用語「細胞性免疫応答」および「細胞性応答」または類似の用語は、細胞に向けられた免疫応答を意味する。生得細胞性免疫応答は、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、および顆粒球により駆動される。適応細胞性免疫応答は、「ヘルパー」または「キラー」のいずれかとして作用するＴ細胞またはＴリンパ球を含むＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩの文脈における抗原の提示により特徴付けられる。ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４^＋Ｔ細胞とも称される）は、免疫応答を調節することにより中心的な役割を果たし、キラー細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、細胞溶解性Ｔ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞またはＣＴＬとも称される）は、がん細胞などの罹患細胞を死滅させ、さらなる罹患細胞の産生を妨げる。好ましい実施形態では、本発明は、１つまたは複数の腫瘍抗原を発現し、好ましくはＭＨＣクラスＩ上にそのような腫瘍抗原を提示する腫瘍細胞に対する抗腫瘍ＣＴＬ応答の刺激を含む。

本発明に従う「腫瘍抗原」は、標的であり、かつ／または抗体もしくはＴリンパ球（Ｔ細胞）を用いる特異的反応などの免疫応答を誘導する、いずれかの物質、好ましくはペプチドまたはタンパク質を網羅する。好ましくは、抗原は、Ｔ細胞エピトープなどの少なくとも１種のエピトープを含む。腫瘍抗原またはそのＴ細胞エピトープは、好ましくは、細胞により、好ましくは、罹患細胞、特に、がん細胞を含む抗原提示細胞により、ＭＨＣ分子の文脈において提示され、これが、抗原（抗原を発現する細胞を含む）に対する免疫応答をもたらす。

本発明の抗体は、ＰＤ－１に対するそれらの結合特性および好ましくはＰＤ－１の免疫抑制シグナルを阻害するそれらの能力により特徴付けられる。発明の概要および添付の特許請求の範囲に詳述される通り、本発明の抗体は、本明細書に記載の配列を有するかもしくは含む相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含むことにより、かつ／または本明細書に記載の配列を有するかもしくは含む相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むことにより、特徴付けられる。好ましい実施形態では、ＶＨおよびＶＬのそれぞれの相補性決定領域１および２が、さらに特定される。

用語「重鎖可変領域」（「ＶＨ」とも称される）および「軽鎖可変領域」（「ＶＬ」とも称される）は、それらの最も一般的な意味において本明細書で使用され、フレームワーク領域（ＦＲ）とも称される他の領域が散在する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むことができるいずれかの配列を含む。フレームワーク領域（ｒｅａｇｉｏｎｓ）は、とりわけ、ＣＤＲ同士を引き離し、それにより、特に、ＶＨおよびＶＬのフォールディングおよびそれらの対形成後に、抗原結合性部位を形成することができる。好ましくは、各ＶＨおよびＶＬは、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置される、３個のＣＤＲおよび４個のＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。つまり、用語「重鎖可変領域」および「軽鎖可変領域」は、生来型抗体においてまたは本明細書で例示される通りのＶＨおよびＶＬ配列（配列表の配列番号５２～７０）において見出すことができるような配列に限定されると解釈されるべきではない。これらの用語は、ＣＤＲを含みかつ適切に配置することが可能ないずれかの配列、例えば、生来型抗体のＶＬおよびＶＨ領域から誘導されるかまたは配列表の配列番号５２～７０に記載の配列から誘導される配列を含む。特に、フレームワーク領域の配列は、それぞれ、ＶＨおよびＶＬの特性（ｃｈａｒａｃｔｉｓｔｉｃｓ）を失うことなく、改変することができる（アミノ酸置換に関する変異体および配列長に関する変異体、すなわち、挿入または欠失変異体の両方を含む）ことが、当業者には明らかであろう。好ましい実施形態では、いかなる改変も、フレームワーク領域に限定される。しかし、当業者はまた、ＣＤＲ、超可変領域および可変領域もまた、ＰＤ－１に結合する能力を失うことなく、改変できるという事実にも十分に気づくであろう。例えば、ＣＤＲ領域は、本明細書に特定される領域に対して同一または高度に相同であるかのいずれかであろう。「高度に相同」により、１～５箇所、好ましくは１～４箇所、１～３箇所または１もしくは２箇所などの置換をＣＤＲ中に行うことができることが考慮される。加えて、超可変領域および可変領域は、本明細書で具体的に開示される領域との実質的な相同性を示すように、改変することができる。

本明細書に特定される通りのＣＤＲは、２種類の異なるＣＤＲ特定法を使用することにより特定することができる。本明細書で使用される第１のナンバリングスキームは、Ｋａｂａｔに従い（Wu and Kabat, 1970；Kabat et al., 1991）、第２のスキームは、ＩＭＧＴナンバリングである（Lefranc, 1997；Lefranc et al., 2005）。第３のアプローチでは、両方の特定スキームの交差部分が使用されてきた。

本発明のモノクローナルキメラ抗体（ＭＡＢ－１９－０２０２、ＭＡＢ－１９－０２０８、ＭＡＢ－１９－０２１７、ＭＡＢ－１９－０２２３およびＭＡＢ－１９－０２３３）およびモノクローナルヒト化抗体の具体例を参照して、それぞれの配列は、実施例の表１、２、４および５に示される。本発明の例示的なヒト化抗体ＭＡＢ－１９－０６０３、ＭＡＢ－１９－０６０８、ＭＡＢ－１９－０６１３およびＭＡＢ－１９－０６１８は、ＭＡＢ－１９－０２０２のヒト化変異体であり、本発明の例示的なヒト化抗体ＭＡＢ－１９－０５８３、ＭＡＢ－１９－０５９４およびＭＡＢ－１９－０５９８は、ＭＡＢ－１９－０２３３のヒト化変異体である。

本発明の抗体は、原則としては、いかなるアイソタイプの抗体でもあり得る。アイソタイプの選択は、典型的には、所望のＦｃ媒介エフェクター機能、例えば、ＡＤＣＣもしくはＣＤＣ誘導、またはＦｃ媒介エフェクター機能を欠く抗体（「不活性」抗体）に対する要求により導かれるであろう。例示的なアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４である。ヒト軽鎖定常領域カッパまたはラムダのいずれかを使用することができる。本発明の抗体のエフェクター機能は、様々な治療的使用のために、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体へのアイソタイプスイッチングにより変化させることができる。一実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、低減または消耗したエフェクター機能を有する。一実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ＡＤＣＣもしくはＣＤＣまたはその両方を媒介しない。一実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、低減または消耗したエフェクター機能を有するＩｇＧ１アイソタイプの定常領域を有する。低減または消耗したエフェクター機能は、例えば、通常はＰＤ－１を発現するＴ細胞に対する潜在的な毒性を回避することを助けることができる。

本発明に従う抗体は、Ｆｃ領域における改変を含むことができる。抗体がそのような改変を含む場合、抗体は、不活性または非活性化抗体になる場合がある。用語「不活性性」、「不活性」または「非活性化」とは、本明細書で使用される場合、少なくとも、いずれかのＦｃ－ガンマ受容体に結合すること、ＦｃＲのＦｃ媒介架橋結合を誘導すること、もしくは個別の抗体の２つのＦｃ領域を介する標的抗原のＦｃＲ媒介架橋結合を誘導することができないか、またはＣ１ｑに結合することができないＦｃ領域を意味する。

いくつかの変異体を、治療的抗体開発のために、Ｆｃ－ガンマ受容体およびＣ１ｑとの相互作用に関して不活性な抗体のＦｃ領域を作製するために構築することができる。例えば、ＩｇＧ１アイソタイプ抗体における、改変することができるアミノ酸位置の例としては、位置Ｌ２３４、Ｌ２３５およびＰ３３１が挙げられる。Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓなどのそれらの組み合わせは、ヒトＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ１６およびＣ１ｑに対する結合性における重度の減少を引き起こすことができる［Xu et al., 2000, Cell Immunol. 200(1):16-26；Oganesyan et al., 2008, Acta Cryst. (D64):700-4］。また、Ｌ２３４ＦおよびＬ２３５Ｅアミノ酸置換は、Ｆｃ－ガンマ受容体とＣ１ｑとの相互作用が消失したＦｃ領域を生じ得る［Canfield et al., 1991, J. Exp. Med. (173):1483-91；Duncan et al., 1988, Nature (332):738-40］。Ｄ２６５Ａアミノ酸置換は、すべてのＦｃｙ受容体に対する結合性を減少させ、ＡＤＣＣを防止することができる［Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. (276):6591-604］。Ｃ１ｑに対する結合性は、位置Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｐ３２９、およびＰ３３１を突然変異させることにより、消失させることができる。Ｄ２７０ＡまたはＫ３２２ＡまたはＰ３２９ＡまたはＰ３３１Ａのいずれかへとこれらの位置を突然変異させることは、ＣＤＣ活性が欠損した抗体を生じ得る（Idusogie EE, et al., 2000, J Immunol. 164: 4178-84）。代替的に、ヒトＩｇＧ２およびＩｇＧ４サブクラスは、Ｃ１ｑおよびＦｃγ受容体とのそれらの相互作用が天然に障害されていると考えられるが、Ｆｃ－ガンマ受容体との相互作用が報告された（Parren et al., 1992, J. Clin Invest. 90:1537-1546；Bruhns et al., 2009, Blood 113: 3716-3725）。これらの残余の相互作用を消失させる突然変異を、両方のアイソタイプにおいて起こすことができ、これはＦｃＲ結合性に関連する望ましくない副作用の低減をもたらす。ＩｇＧ２に関して、これらとしてはＬ２３４ＡおよびＧ２３７Ａが挙げられ、ＩｇＧ４に関して、Ｌ２３５Ｅが挙げられる。別の好適な不活性突然変異はＰ３２９Ｇである。一実施形態では、Ｌ２３４、Ｌ２３５およびＰ３２９不活性突然変異の組み合わせ、例えば、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇの組み合わせを使用することができる。

本発明の抗体は、例えば、腫瘍抗原を標的化する他の抗体を用い、それにより、これらの腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導することにより、あるいは他のチェックポイント阻害因子もしくは活性化因子または血管新生阻害因子を用いることにより、腫瘍を攻撃する従来の化学療法剤または他の免疫療法と共に、相乗的に使用することができる。

抗体依存性細胞媒介細胞傷害性はまた、本明細書で「ＡＤＣＣ」とも称される。ＡＤＣＣは、好ましくは、標的細胞が抗体によりマークされることを必要とする、本明細書に記載される通りのエフェクター細胞、特にリンパ球の細胞殺傷能を説明する。

ＡＤＣＣは、好ましくは、抗体が腫瘍細胞上の抗原に結合し、抗体Ｆｃドメインが免疫エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に嵌合した場合に起こる。Ｆｃ受容体のいくつかのファミリーが特定されており、特異的細胞集団は、規定されたＦｃ受容体を特徴的に発現する。ＡＤＣＣは、抗原提示および腫瘍標的化Ｔ細胞応答をもたらす、様々な程度の即時的な腫瘍破壊を直接的に誘導するメカニズムとして見ることができる。好ましくは、ＡＤＣＣのインビボ誘導は、腫瘍標的化Ｔ細胞応答および宿主由来抗体応答につながるであろう。

補体依存性細胞傷害性はまた、本明細書で「ＣＤＣ」とも称される、ＣＤＣは、抗体により仕向けることができる別の細胞殺傷法である。ＩｇＭが、補体活性化に関して最も効果的なアイソタイプである。ＩｇＧ１およびＩｇＧ３の両方もまた、古典的補体活性化経路を介してＣＤＣを仕向けることにおいて非常に効果的である。好ましくは、このカスケードにおいては、抗原－抗体複合体の形成は、ＩｇＧ分子などの参加する抗体分子のＣ_Ｈ２ドメインに非常に接近して複数のＣ１ｑ結合性部位の覆いを外す（Ｃ１ｑは補体Ｃ１の３つの下位成分のうちの１つである）。好ましくは、これらの覆いを外されたＣ１ｑ結合性部位は、以前には低親和性であったＣ１ｑ－ＩｇＧ相互作用を高アビディティのものへと変換し、それが一連の他の補体タンパク質を含む事象のカスケードを惹起し、かつエフェクター細胞走化性／活性化剤Ｃ３ａおよびＣ５ａのタンパク質溶解性放出をもたらす。好ましくは、補体カスケードは、細胞膜において孔を生成する膜侵襲複合体の形成で終わり、これが細胞の内側および外側への水および溶質の自由通過を促進する。

ＩＩ．抗体の製造
本発明の抗体は、従来のモノクローナル抗体方法論、例えば、Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975)の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む、様々な技術により製造することができる。体細胞ハイブリダイゼーション手順が好ましいが、原則として、モノクローナル抗体を製造するための他の技術、例えば、Ｂリンパ球のウイルスもしくは発がん性形質転換または抗体遺伝子のライブラリーを使用するファージディスプレイ技術を用いることができる。

モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製するための好ましい動物系は、ネズミ系である。マウスにおけるハイブリドーマ作製は、よく確立された手順である。免疫化プロトコールおよび融合のための免疫化された脾細胞の単離に関する技術は、当技術分野で公知である。融合パートナー（例えば、ネズミ骨髄腫細胞）および融合手順もまた公知である。

モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製するための他の好ましい動物系は、ラットおよびウサギ系である［例えば、Spieker-Polet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:9348 (1995)に記載され、Rossi et al., Am. J. Clin. Pathol. 124: 295 (2005)もまた参照されたい］。

さらに別の好ましい実施形態では、ＰＤ－１に対するヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒト免疫系の一部分を担持するトランスジェニックまたはトランスクロモソーマルマウスを使用して生成することができる。これらのトランスジェニックまたはトランスクロモソーマルマウスとしては、それぞれ、ＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスとして知られるマウスが挙げられ、本明細書で集合的に「トランスジェニックマウス」と称される。そのようなトランスジェニックマウスにおけるヒト抗体の製造は、ＷＯ２００４／０３５６０７においてＣＤ２０に関して詳細に記載される通りに行うことができる。

モノクローナル抗体を生成するためのさらに別の戦略は、規定された戦略の抗体を産生するリンパ球から抗体をコードする遺伝子を直接的に単離することであり、例えば、Babcock et al., 1996; A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single, isolated lymphocytes producing antibodies of defined strategyを参照されたい。組換え抗体遺伝子操作の詳細に関して、Welschof and Kraus, Recombinant antibodes for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8およびBenny K.C. Lo Antibody Engineering ISBN 1-58829-092-1もまた参照されたい。

免疫化
ＰＤ－１に対する抗体を生成するために、動物、例えば、ウサギまたはマウスを、記載される通りの、ＰＤ－１配列から誘導された担体コンジュゲート化ペプチド、組換え的に発現されたＰＤ－１抗原もしくはその断片の富化された調製物および／またはＰＤ－１を発現する細胞を用いて免疫化することができる。代替的に、ウサギまたはマウスを、全長ヒトＰＤ－１またはその断片をコードするＤＮＡを用いて免疫化することができる。ＰＤ－１抗原の精製または富化された調製物を使用する免疫化が抗体を生じない場合、ウサギまたはマウスは、免疫応答を促進するために、ＰＤ－１を発現する細胞、例えば、細胞株を用いて免疫化することもできる。

免疫応答は、尾静脈または眼窩後方採血により取得される血漿および血清サンプルを用いて、免疫化プロトコールの経過にわたってモニタリングすることができる。十分な力価の抗ＰＤ－１免疫グロブリンを有するウサギまたはマウスを、融合のために使用することができる。ウサギまたはマウスに、ＰＤ－１発現細胞を腹腔内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｙ）または静脈内に追加免疫し、その３日間後に屠殺し、脾臓を取り出して、特異的抗体を分泌するハイブリドーマの割合を増加させることができる。

モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製
ＰＤ－１に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製するために、免疫化された動物、例えば、ウサギまたはマウス由来の脾細胞およびリンパ節細胞を単離し、マウスまたはウサギ骨髄腫細胞株などの適切な不死化細胞株へと融合させることができる。次いで、得られたハイブリドーマを、抗原特異的抗体の産生に関してスクリーニングすることができる。次いで、個別のウェルを、抗体を分泌するハイブリドーマに関してＥＬＩＳＡによりスクリーニングすることができる。ＰＤ－１発現細胞を使用する免疫蛍光およびＦＡＣＳ分析により、ＰＤ－１に対する特異性を有する抗体を特定することができる。抗体を分泌するハイブリドーマを再プレーティングし、再度スクリーニングすることができ、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体に関してまだ陽性である場合、限界希釈によりサブクローニングすることができる。次いで、安定なサブクローンをインビトロで培養し、特性決定のための組織培養培地中で抗体を生成させることができる。

モノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの作製
本発明の抗体はまた、例えば、当技術分野で周知の通りの組換えＤＮＡ技術および遺伝子トランスフェクション法の組み合わせを使用して、宿主細胞トランスフェクトーマにおいて製造することができる［Morrison, S. (1985) Science 229: 1202］。

例えば、一実施形態では、目的の遺伝子、例えば、抗体遺伝子を、ＷＯ８７／０４４６２、ＷＯ８９／０１０３６およびＥＰ３３８８４１に開示されるＧＳ遺伝子発現系または当技術分野で周知の他の発現系を用いるなどして、真核細胞発現プラスミドなどの発現ベクターへとライゲーションすることができる。クローニングされた抗体遺伝子を含む精製プラスミドを、真核宿主細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、ＮＳ／０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ／１７もしくはＨＥＫ２９３細胞または代替的に植物由来細胞、真菌もしくは酵母細胞などの他の真核細胞中に導入することができる。これらの遺伝子を導入するために使用される方法は、エレクトロポレーション、リポフェクチン、リポフェクタミンその他などの当技術分野で記載される方法であり得る。宿主細胞におけるこれらの抗体遺伝子の導入後、抗体を発現する細胞を、特定および選択することができる。これらの細胞はトランスフェクトーマを代表し、次いで、それらの発現レベルに関して増幅し、抗体を産生させるために大規模化することができる。組換え抗体は、これらの培養上清および／または細胞から単離および精製することができる。

代替的に、クローニングされた抗体遺伝子を、微生物、例えば、大腸菌などの原核細胞を含む他の発現系において発現させることができる。さらに、抗体は、ヒツジおよびウサギ由来の乳もしくは雌鶏由来の卵におけるなどのトランスジェニック非ヒト動物において、またはトランスジェニック植物において、製造することができ；例えば、Verma, R., et al. (1998) J. Immunol. Meth. 216: 165-181；Pollock, et al. (1999) J. Immunol. Meth. 231: 147-157；およびFischer, R., et al. (1999) Biol. Chem. 380: 825-839を参照されたい。

本発明の抗体はまた、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術を使用して、ＲＮＡウイルスなどの遺伝子改変されたウイルスにおいて製造することもできる。抗体またはその断片を発現するウイルス粒子をレスキューするために使用することができる組換えウイルスゲノムは、例えば、「リバースジェネティクス」と称される方法により取得することができる。

無傷抗体を発現するための部分的抗体配列の使用（すなわち、ヒト化およびキメラ化）
ａ）キメラ化
ネズミまたはウサギモノクローナル抗体は、ヒトにおける治療用抗体として使用することができるが、これらの抗体は、反復して適用される場合にヒトにおいて高度に免疫原性であり得るので、このことは、治療効果の低減をもたらす場合がある。主な免疫原性は、重鎖定常領域により媒介される。ヒトにおけるネズミまたはウサギ抗体の免疫原性は、それぞれの抗体がキメラ化またはヒト化される場合、低減または完全に回避することができる。キメラ抗体は、その異なる部分が異なる動物種から誘導される抗体であり、例えば、ネズミまたはウサギ抗体から誘導される可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するものである。抗体のキメラ化は、ネズミまたはウサギ抗体重鎖および軽鎖の可変領域を、ヒト重鎖および軽鎖の定常領域と連結することにより達成される（例えば、Kraus et al., in Methods in Molecular Biology series, Recombinant antibodies for cancer therapy, ISBN-0-89603-918-8により記載される通り）。好ましい実施形態では、キメラ抗体は、ヒトカッパ軽鎖定常領域をネズミまたはウサギ軽鎖可変領域へと連結することにより作製される。また好ましい実施形態では、キメラ抗体は、ヒトラムダ軽鎖定常領域をネズミまたはウサギ軽鎖可変領域へと連結することにより作製することができる。キメラ抗体の作製のための好ましい重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４である。キメラ抗体の作製のための他の好ましい重鎖定常領域は、ＩｇＧ２、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＭである。

ｂ）ヒト化
抗体は、６個の重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）に位置するアミノ酸残基を主に介して、標的抗原と相互作用する。この理由のために、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲの外側の配列よりも、個々の抗体間で多様である。ＣＤＲ配列が大部分の抗体－抗原相互作用を担うので、異なる特性を有する異なる抗体由来のフレームワーク配列上へと移植された特異的な天然に存在する抗体由来のＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、特異的な天然に存在する抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である［例えば、Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332: 323-327；Jones, P. et al. (1986) Nature 321: 522-525；およびQueen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86: 10029-10033を参照されたい］。そのようなフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公共のＤＮＡデータベースから取得することができる。これらの生殖系列配列は、Ｂ細胞成熟の間のＶ（Ｄ）Ｊ連結により形成される完全に組み立てられた可変遺伝子を含まないので、成熟抗体遺伝子配列とは異なるであろう。生殖系列遺伝子配列はまた、可変領域にわたって均一に個体レベルにある（ａｔｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｅｖｅｎｌｙａｃｒｏｓｓ）高親和性の二次的レパートリー抗体の配列とも異なる。例えば、体細胞突然変異は、フレームワーク領域１のアミノ末端部分およびフレームワーク領域４のカルボキシ末端部分においては比較的頻度が低い。さらに、多数の体細胞突然変異が、抗体の結合特性を顕著に変化させない。この理由のために、元の抗体のものと類似する結合特性を有する無傷の組換え抗体を再作製するために、特定の抗体のＤＮＡ配列全体を取得する必要はない（ＷＯ９９／４５９６２を参照されたい）。ＣＤＲ領域にわたる部分的な重鎖および軽鎖配列が、典型的には、この目的のために十分である。部分配列は、どの生殖系列可変セグメントおよび連結遺伝子セグメントが組換えられた抗体可変遺伝子に寄与したかを決定するために使用される。次いで、生殖系列配列を使用して、可変領域の欠失部分を埋める。重鎖および軽鎖リーダー配列は、タンパク質成熟の間に切断され、最終的な抗体の特性に寄与しない。欠失した配列を付加するために、クローニングしたｃＤＮＡ配列を、ライゲーションまたはＰＣＲ増幅により合成オリゴヌクレオチドと組み合わせることができる。代替的に、可変領域全体を、短い重複オリゴヌクレオチドのセットとして合成し、ＰＣＲ増幅により組み合わせて、完全に合成の可変領域クローンを作製することができる。このプロセスは、特定の制限部位の除去もしくは包含、または特定のコドンの最適化などの一定の利点を有する。

ハイブリドーマ由来の重鎖および軽鎖転写産物のヌクレオチド配列は、天然配列と同一のアミノ酸コード能を有する合成Ｖ配列を作製するために、合成オリゴヌクレオチドの重複セットを設計するために使用される。合成重鎖およびκ鎖配列は、３種類の様式で天然配列とは異なり得る：オリゴヌクレオチド合成およびＰＣＲ増幅を促進するために反復ヌクレオチド塩基の鎖が中断され；最適な翻訳開始部位が、Ｋｏｚａｋの法則に従って組み込まれ（Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266: 19867-19870）；ＨｉｎｄＩＩＩ部位が翻訳開始部位の上流で遺伝子操作される。

重鎖および軽鎖可変領域の両方に関して、最適化されたコード鎖配列および対応する非コード鎖配列は、対応する非コードオリゴヌクレオチドの概ね中間点において、３０～５０ヌクレオチドへと分割される。したがって、各鎖に関して、オリゴヌクレオチドは、１５０～４００ヌクレオチドのセグメントにわたる重複する二本鎖セットへと組み立てることができる。次いで、１５０～４００ヌクレオチドのＰＣＲ増幅産物を産生するための鋳型として、プールが使用される。典型的には、単一可変領域オリゴヌクレオチドセットは、２つの重複するＰＣＲ産物を生成するために別個に増幅される２つのプールへと分割されるであろう。次いで、これらの重複産物は、ＰＣＲ増幅により合わせられて、完全な可変領域が形成される。発現ベクターコンストラクトへと容易にクローニングすることができる断片を生成するために、ＰＣＲ増幅において重鎖および軽鎖定常領域の重複断片を含むことも望ましい場合がある。

次いで、再構築されたキメラ化またはヒト化重鎖および軽鎖可変領域を、クローニングされたプロモーター配列、リーダー配列、翻訳開始配列、定常領域配列、３’非翻訳配列、ポリアデニル化配列、および転写終結配列と合わせて、発現ベクターコンストラクトを形成させる。重鎖および軽鎖発現コンストラクトは、単一のベクターへと合わせられるか、共トランスフェクションされるか、連続的にトランスフェクションされるか、または宿主細胞へと別個にトランスフェクションされることができ、続いて、宿主細胞が融合されて、両方の鎖を発現する宿主細胞を形成する。ヒトＩｇＧκのための発現ベクターの構築における使用のためのプラスミドは、当業者に対して利用可能である。ＰＣＲ増幅されたＶ重鎖およびＶカッパ軽鎖ｃＤＮＡ配列を使用して完全な重鎖および軽鎖ミニ遺伝子を再構築することができるように、プラスミドを構築することができる。これらのプラスミドを、完全ヒト、またはキメラＩｇＧ１、カッパまたはＩｇＧ４、カッパ抗体を発現させるために使用することができる。類似のプラスミドを、他の重鎖アイソタイプの発現のために、またはラムダ軽鎖を含む抗体の発現のために、構築することができる。

したがって、本発明に従えば、本発明の抗ＰＤ－１抗体の構造的特徴を使用して、ＰＤ－１に対する結合性などの本発明の抗体の少なくとも１つの機能的特性を保持する、構造的に関連したヒト化抗ＰＤ－１抗体を作製することができる。より具体的には、本明細書に開示される通りの１つまたは複数のＣＤＲ領域を、既知のヒトフレームワーク領域およびＣＤＲと組換え的に合わせて、本発明の追加的な組換え的に遺伝子操作されたヒト化抗ＰＤ－１抗体を作製することができる。

ＩＩＩ．抗体の特性決定
抗原発現細胞に対する結合性
ＰＤ－１に結合しかつ／またはＰＤ－１／リガンド相互作用を遮断する抗体の能力は、実施例に示されるものなどの、標準的な結合性アッセイ、レポーター遺伝子遮断アッセイ、Ｔ細胞増殖アッセイ等を使用して決定することができる。

抗体の結合性の特性決定
抗ＰＤ－１抗体を精製するために、選択されたハイブリドーマを、モノクローナル抗体精製のために、２リットルスピナーフラスコ中で成長させることができる。代替的に、抗ＰＤ－１抗体を、透析に基づくバイオリアクター中で製造することができる。上清をろ過し、必要な場合、濃縮し、その後、プロテインＧ－セファロースまたはプロテインＡ－セファロースを用いるアフィニティークロマトグラフィーを行うことができる。溶出されたＩｇＧを、純度を確認するために、ゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィーによりチェックすることができる。バッファー溶液を、ＰＢＳへと交換することができ、かつ濃度を、１．４３吸光係数を使用するＯＤ２８０により決定することができる。モノクローナル抗体をアリコートに分け、－８０℃で保存することができる。選択された抗ＰＤ－１モノクローナル抗体が固有のエピトープに結合するかを決定するために、部位特異的または複数部位特異的突然変異誘発を使用することができる。

ＰＤ－１結合特異性の決定
ＰＤ－１に対する抗ＰＤ－１抗体の結合潜在能力は、ＥＬＩＳＡ技術により決定（ｄｅｒｍｉｎｅｄ）することができる。例えば、ＰＤ－１／Ｆｃキメラを、マイクロタイタープレート上にコーティングすることができる。ブロッキング後、試験される抗ＰＤ－１抗体を添加し、インキュベートすることができる。次いで、洗浄手順を行った後、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼにカップリングされた抗ヒトＩｇＧを、検出のために添加することができる。

細胞表面発現されたＰＤ－１に対する抗ＰＤ－１抗体の結合能は、ＰＤ－１を異所的に発現するＨＥＫ－２９３細胞を使用して分析することができる。抗ＰＤ－１抗体を、様々な濃度でこれらの細胞へと添加し、インキュベートすることができる。続いて、蛍光タグにコンジュゲート化された抗Ｉｇ抗体を添加することができ、次いで、細胞に関連する免疫蛍光シグナルを記録することができる。

遮断能の決定（Ｄｅｔｅｒｍｉｎｇ）
ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を遮断する抗ＰＤ－１抗体の潜在能力は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断バイオアッセイを使用して分析することができる。ＰＤ－Ｌ１発現細胞を、様々な濃度での、試験される抗体と共にインキュベートすることができる。ＰＤ－１発現エフェクター細胞を添加し、そのようにして得られた混合物をインキュベートした後、例えば、ルシフェラーゼアッセイ試薬を添加することができ、発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｅ）を測定することができる。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断バイオアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｊ１２１５０）または同等のキットを、製造業者により記載される通りに使用することができる。

活性ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１軸を用いる抗原特異的アッセイにおいてＴ細胞増殖を誘導する抗ＰＤ１抗体の能力を特性決定するために、腫瘍抗原を発現する樹状細胞（ＤＣ）を行うことができる。そのようなアッセイは、以下の実施例５において、非限定的な様式で詳述される。

フローサイトメトリー分析および免疫蛍光顕微鏡観察
免疫化された動物の血清中の抗ＰＤ－１抗体の存在およびＰＤ－１を発現する生細胞に対するモノクローナル抗体の結合性を実証するために、フローサイトメトリーまたは免疫蛍光顕微鏡観察分析を、当業者に周知の様式で使用することができる。

エピトープマッピング
本発明の抗体により認識されるエピトープのマッピングは、"Epitope Mapping Protocols", Methods in Molecular Biology by Glenn E. Morris ISBN-089603-375-9および,,Epitope Mapping: A Practical Approach", Practical Approach Series, 248 by Olwyn M. R. Westwood, Frank C. Hayに詳細に記載される通りに行うことができる。

ＩＶ．ＰＤ－１に結合する二重特異的／多重特異的抗体
本発明のさらに別の実施形態では、ＰＤ－１に対する抗体を、誘導体化するかまたは別の機能的分子、例えば、別のペプチドもしくはタンパク質（例えば、Ｆａｂ’断片）に連結して、複数の結合部位または標的エピトープに結合する二重特異的または多重特異的分子を作製することができる。例えば、本発明の抗体は、別の抗体、ペプチドまたは結合性ミメティクスなどの１つまたは複数の他の結合性分子へと機能的に連結することができる（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有的会合またはそれ以外により）。

したがって、本発明は、ＰＤ－１に対する少なくとも１つの第１の結合特異性および第２の標的エピトープに対する（またはさらなる標的エピトープに対する）第２の結合特異性（またはさらなる結合特異性）を含む二重特異的および多重特異的分子を含む。

第２の結合特異性は、別の免疫チェックポイントに向けられ、それにより、それぞれのチェックポイントを阻害するかまたは活性化／刺激するかのいずれかであり得る。標的化することができる他のチェックポイント阻害因子としては、限定するものではないが、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＭ－３、ＫＩＲまたはＬＡＧ－３が挙げられる。第２の結合特異性により標的化することができるチェックポイント活性化因子としては、限定するものではないが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、またはＩＣＯＳが挙げられる。したがって、本発明は、少なくとも１つの他のチェックポイントに結合し、かつそれぞれの結合性によりＰＤ－１を阻害することの両方が可能である二重特異的および多重特異的分子を含む。第２の結合特異性は、アンタゴニスト性であり得、例えば、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＴＩＭ－３、抗ＫＩＲもしくは抗ＬＡＧ－３であり得、またはアゴニスト性であり得、例えば、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ４０、抗ＣＤ１２２、抗ＣＤ１３７、抗ＯＸ４０、抗ＧＩＴＲ、もしくは抗ＩＣＯＳであり得る。ＰＤ－１および追加的に少なくとも１つの他の免疫チェックポイントに結合することが可能な多重特異的分子もまた、本発明により包含される。結合特異性の好ましい組み合わせとしては、抗ＰＤ１と抗ＰＤ－Ｌ１とが、または抗ＰＤ－１と抗ＣＴＬＡ４とが挙げられる。

例えば、ＣＤ２８は、Ｔ細胞の活性化に対して必要であり得る刺激性誘発を提供する。同じことが、例えば、ＣＤ１３７に言える。ＣＤ１３７（４－１ＢＢ、ＴＮＦＲＳＦ９）は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーである。ＣＤ１３７は、ＣＤ８^＋およびＣＤ４^＋Ｔ細胞、調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）およびＮＫＴ細胞、Ｂ細胞ならびに好中球に対する共刺激分子である。Ｔ細胞上では、ＣＤ１３７は構成的には発現されないが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）活性化に際して誘導される。その天然のリガンド４－１ＢＢＬまたはアゴニスト抗体を介する刺激は、アダプターとしてＴＮＦＲ関連因子（ＴＲＡＦ）－２およびＴＲＡＦ－１を使用するシグナル伝達をもたらす。ＣＤ１３７による早期シグナル伝達は、Ｋ－６３ポリユビキチン化反応を含み、これは最終的には核因子（ＮＦ）－κＢおよび分裂促進因子活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼ経路の活性化を生じる。シグナル伝達は、増加したＴ細胞共刺激、増殖、サイトカイン産生、成熟および延長したＣＤ８^＋Ｔ細胞生存につながる。ＣＤ１３７に対するアゴニスト性抗体は、様々な前臨床モデルにおいてＴ細胞による抗腫瘍制御を促進することが示されてきた［Murillo et al. 2008 Clin. Cancer Res. 14(21): 6895-6906］。ＣＤ１３７を刺激する抗体は、Ｔ細胞の生存および増殖を誘導し、それにより、抗腫瘍免疫応答を強化することができる。ＣＤ１３７を刺激する抗体は、先行技術において開示されており、ヒトＩｇＧ４抗体であるウレルマブ（ＷＯ２００５／０３５５８４）およびヒトＩｇＧ２抗体であるウトミルマブ（Fisher et al. 2012 Cancer Immunol. Immunother. 61: 1721-1733）を含む。

代替的に、第２の結合特異性は、抗血管新生活性を提供することができる。したがって、第２の結合特異性は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）またはその受容体ＶＥＧＦＲ（例えば、ＶＥＧＦＲ１、２、３）を標的化することが可能であり得る。代替的にまたは加えて、第２の結合特異性は、ＰＤＧＦＲ、ｃ－Ｋｉｔ、Ｒａｆおよび／またはＲＥＴを標的化することが可能であり得る。

本発明の二重特異的または多重特異的分子の第２のまたはさらなる結合特異性は、腫瘍抗原を標的とすることができ、かつ腫瘍抗原に結合することが可能であることもまた、本発明により包含される。腫瘍抗原は、表面抗原またはＭＨＣの文脈において提示される抗原であり得る。結合特異性は、例えば、Ｂ細胞受容体（抗体）またはＴ細胞受容体に基づくことができるであろう。

用語「腫瘍抗原」とは、本明細書で使用される場合、細胞質、細胞表面および細胞核から誘導することができるがん細胞の構成要素を意味する。特に、この用語は、細胞内でまたは腫瘍細胞上の表面抗原として産生されるそれらの抗原を意味する。腫瘍抗原は、典型的には、がん細胞により優勢的に発現され（例えば、非がん細胞におけるよりもがん細胞において高レベルで発現される）、一部の場合には、がん細胞だけにより発現される。腫瘍抗原の例としては、限定するものではないが、ｐ５３、ＡＲＴ－４、ＢＡＧＥ、ベータ－カテニン／ｍ、Ｂｃｒ－ａｂＬＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ－１、ＣＡＳＰ－８、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＥＡ、クローディンファミリーの細胞表面タンパク質、例えば、クローディン（ＣＬＡＵＤＩΝ）－６、クローディン－１８．２およびクローディン－１２、ｃ－ＭＹＣ、ＣＴ、Ｃｙｐ－Ｂ、ＤＡＭ、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ、ＧｎＴ－Ｖ、Ｇａｐ１００、ＨＡＧＥ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＨＰＶ－Ｅ７、ＨＰＶ－Ｅ６、ＨＡＳＴ－２、ｈＴＥＲＴ（またはｈＴＲＴ）、ＬＡＧＥ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ＭＡＧＥ－Ａ、好ましくはＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ５、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ７、ＭＡＧＥ－Ａ８、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１１、またはＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥ－Ｂ、ＭＡＧＥ－Ｃ、ＭＡＲＴ－１／Ｍｅｌａｎ－Ａ、ＭＣ１Ｒ、ミオシン／ｍ、ＭＵＣ１、ＭＵＭ－１、ＭＵＭ－２、ＭＵＭ－３、ＮＡ８８－Ａ、ＮＦ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＮＹ－ＢＲ－１、ｐｌ９０マイナーＢＣＲ－ａｂＬ、Ｐｍｌ／ＲＡＲａ、ＰＲＡＭＥ、プロテイナーゼ３、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＲＡＧＥ、ＲＵ１またはＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ－１またはＳＡＲＴ－３、ＳＣＧＢ３Ａ２、ＳＣＰ１、ＳＣＰ２、ＳＣＰ３、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＴＰＩ／ｍ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＴＲＰ－２／ＩＮＴ２、ＴＰＴＥ、ＷＴ、およびＷＴ－１が挙げられる。

一実施形態では、標的とされる第２の抗原は、ＮＹ－ＥＳＯ－１（ＵｎｉＰｒｏｔＰ７８３５８）、チロシナーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔＰ１４６７９）、ＭＡＧＥ－Ａ３（ＵｎｉＰｒｏｔＰ４３３５７）、ＴＰＴＥ（ＵｎｉＰｒｏｔＰ５６１８０）、ＫＬＫ２（ＵｎｉＰｒｏｔＰ２０１５１）、ＰＳＡ（ＫＬＫ３）（ＵｎｉＰｒｏｔＰ０７２８８）、ＰＡＰ（ＡＣＰＰ、ＵｎｉＰｒｏｔＰ１５３０９）、ＨＯＸＢ１３（ＵｎｉＰｒｏｔＱ９２８２６）、ＮＫＸ３－１（ＵｎｉＰｒｏｔＱ９９８０１）、ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７（ＵｎｉＰｒｏｔＰ０３１２６／Ｐ０３１２９）；ＨＰＶ１８Ｅ６／Ｅ７（ＵｎｉＰｒｏｔＰ０６４６３／Ｐ０６７８８）；ＨＰＶ３１Ｅ６／Ｅ７（ＵｎｉＰｒｏｔＰ１７３８６／Ｐ１７３８７）；ＨＰＶ３３Ｅ６／Ｅ７（ＵｎｉＰｒｏｔＰ０６４２７／Ｐ０６４２９）；ＨＰＶ４５Ｅ６／Ｅ７（ＵｎｉＰｒｏｔＰ２１７３５／Ｐ２１７３６）；ＨＰＶ５８Ｅ６／Ｅ７（ＵｎｉＰｒｏｔＰ２６５５５／Ｐ２６５５７）、ＰＲＡＭＥ（ＵｎｉＰｒｏｔＰ７８３９５）、ＡＣＴＬ８（ＵｎｉＰｒｏｔＱ９Ｈ５６８）、ＣＸｏｒｆ６１（ＫＫＬＣ１、ＵｎｉＰｒｏｔＱ５Ｈ９４３）、ＭＡＧＥ－Ａ９Ｂ（ＵｎｉＰｒｏｔＰ４３３６２）、ＣＬＤＮ６（ＵｎｉＰｒｏｔＰ５６７４７）、ＰＬＡＣ１（ＵｎｉＰｒｏｔＱ９ＨＢＪ０）、およびｐ５３（ＵｎｉＰｒｏｔＰ０４６３７）からなる群から選択される。

これらの抗原を含む治療方法は、がんの治療を目的とすることができ、がん細胞は、それぞれの抗原の発現により特徴付けられる。本明細書に記載される抗原、特に、ＮＹ－ＥＳＯ－１、チロシナーゼ、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＴＰＴＥ、ＫＬＫ２、ＰＳＡ（ＫＬＫ３）、ＰＡＰ（ＡＣＰＰ）、ＨＯＸＢ１３、ＮＫＸ３－１、ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７；ＨＰＶ１８Ｅ６／Ｅ７；ＨＰＶ３１Ｅ６／Ｅ７；ＨＰＶ３３Ｅ６／Ｅ７；ＨＰＶ４５Ｅ６／Ｅ７；ＨＰＶ５８Ｅ６／Ｅ７、ＰＲＡＭＥ、ＡＣＴＬ８、ＣＸｏｒｆ６１（ＫＫＬＣ１）、ＭＡＧＥ－Ａ９Ｂ、ＣＬＤＮ６、ＰＬＡＣ１、およびｐ５３を組み合わせて使用することも可能である。そのような抗原の組み合わせを含む治療方法は、がんの治療を目的とすることができ、がん細胞は、抗原のそれぞれの組み合わせのうちの２種類以上の抗原の発現により特徴付けられるか、または治療される特定のがんを有する患者の大きな割合のがん細胞（例えば、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれ以上でさえ）が、組み合わせのそれぞれの抗原のうちの１つまたは複数を発現する。そのような組み合わせは、少なくとも２種類、少なくとも３種類、少なくとも４種類、少なくとも５種類、または少なくとも６種類の抗原の組み合わせを含むことができる。したがって、組み合わせは、３、４、５、６、７、または８種類の抗原を含むことができる。

皮膚黒色腫の治療に関して、さらなる結合特異性（ｓｐｅｃｉｔｉｔｙ）（単数／複数）は、以下の抗原のうちの１種類を少なくとも標的化することができる：ＮＹ－ＥＳＯ－１、チロシナーゼ、ＭＡＧＥ－Ａ３、および／またはＴＰＴＥ。

前立腺がんの治療に関して、さらなる結合特異性（単数／複数）は、以下の抗原のうちの１種類を少なくとも標的化することができる：ＫＬＫ２、ＰＳＡ（ＫＬＫ３）、ＰＡＰ（ＡＣＰＰ）、ＨＯＸＢ１３、および／またはＮＫＸ３－１。

乳がんの治療に関して、さらなる結合特異性（単数／複数）は、以下の抗原のうちの１種類を少なくとも標的化することができる：ＰＲＡＭＥ、ＡＣＴＬ８、ＣＸｏｒｆ６１（ＫＫＬＣ１）、ＭＡＧＥＡ３、ＭＡＧＥ－Ａ９Ｂ、ＣＬＤＮ６、ＮＹ－ＥＳＯ－１、および／またはＰＬＡＣ１。

卵巣がんの治療に関して、さらなる結合特異性（単数／複数）は、以下の抗原のうちの１種類を少なくとも標的化することができる：ＣＬＤＮ６、ｐ５３、および／またはＰＲＡＭＥ。

本発明の二重特異的および多重特異的分子は、腫瘍抗原特異性および抗ＰＤ－１結合特異性に加えて、第３の結合特異性をさらに含むことができる。一実施形態では、第３の結合特異性は、Ｆｃ受容体、例えば、ヒトＦｃ－ガンマＲＩ（ＣＤ６４）またはヒトＦｃ－アルファ受容体（ＣＤ８９）に向けられる。したがって、本発明は、ＰＤ－１に、Ｆｃ－γＲ、Ｆｃ－アルファＲまたはＦｃ－イプシロンＲ発現エフェクター細胞［例えば、単球、マクロファージまたは多形核細胞（ＰＭＮ）］に、および腫瘍抗原を発現する標的がん細胞に結合することが可能である多重特異的分子を含む。これらの多重特異的分子は、腫瘍抗原発現細胞の貪食、抗体依存性細胞性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、サイトカイン放出、またはスーパーオキシドアニオンの生成などのＦｃ受容体媒介エフェクター細胞活性を引き起こすことができる（ｍａｙｍａｙｔｒｉｇｇｅｒ）。

別の実施形態では、第３の結合特異性は、抗増強因子（ＥＦ）部分、例えば、細胞傷害活性に関与する表面タンパク質に結合し、それにより、標的細胞に対する免疫応答を増大させる分子である。「抗増強因子部分」は、所与の分子、例えば、抗原または受容体に結合し、それにより、Ｆｃ受容体または標的細胞抗原に対する結合性決定基の作用の強化をもたらす、抗体、機能的抗体断片またはリガンドであり得る。「抗増強因子部分」は、Ｆｃ受容体または標的細胞抗原に結合することができる。代替的に、抗増強因子部分は、第１および第２の結合特異性が結合する実体とは異なる実体に結合することができる。例えば、抗増強因子部分は、細胞傷害性Ｔ細胞に結合することができる（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＩＣＡＭ－１または標的細胞に対する免疫応答の増加をもたらす他の免疫細胞を介して）。

一実施形態では、本発明の二重特異的および多重特異的分子は、結合特異性として、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、または単鎖Ｆｖを含む、少なくとも１つの抗体を含む。抗体はまた、軽鎖もしくは重鎖二量体、またはＬａｄｎｅｒら、ＵＳ４，９４６，７７８に記載される通りのＦｖまたは単鎖コンストラクトなどのいずれかのその最小断片でもあり得る。抗体はまた、ＵＳ２００３／０１１８５９２およびＵＳ２００３／０１３３９３９に開示される通りの結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質でもあり得る。

本明細書で使用される場合、用語「エフェクター細胞」とは、免疫応答の認知相および活性化相ではなく、免疫応答のエフェクター相に関与する免疫細胞を意味する。例示的な免疫細胞としては、骨髄またはリンパ起源の細胞、例えば、リンパ球［例えば、Ｂ細胞および細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を含むＴ細胞、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、単球、好酸球、好中球、多形核細胞、顆粒球、マスト細胞、および好塩基球］が挙げられる。一部のエフェクター細胞は、特異的Ｆｃ受容体を発現し、特異的免疫機能を行う。好ましい実施形態では、エフェクター細胞は、抗体依存性細胞性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を誘導することが可能であり、例えば、ＡＤＣＣを誘導することが可能な好中球である。例えば、ＦｃＲを発現するナチュラルキラー細胞、単球、マクロファージは、標的細胞の特異的殺傷および免疫系の他の成分に対する抗原の提示、または抗原を提示する細胞への結合に関与する。他の実施形態では、エフェクター細胞は、標的抗原、標的細胞、または微生物を貪食することができる。エフェクター細胞上の特定のＦｃＲの発現は、サイトカインなどの体液性因子により調節され得る。例えば、Ｆｃ－ガンマＲＩの発現は、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）によりアップレギュレーションされることが見出されている。この強化された発現は、標的に対するＦｃ－ガンマＲＩ担持細胞の細胞傷害活性を増加させる。エフェクター細胞は、標的抗原または標的細胞を貪食するかまたは溶解させることができる。

「標的細胞」は、本発明の抗体により標的化され得る、対象（例えば、ヒトまたは動物）内のいずれかの望ましくない細胞を意味するであろう。好ましい実施形態では、標的細胞は腫瘍細胞である。

本発明の二重特異的および多重特異的分子は、化学的技術［例えば、D. M. Kranz et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5807を参照されたい］、「ポリドーマ」（ｐｏｌｙｄｏｍａ）技術（ＲｅａｄｉｎｇのＵＳ４，４７４，８９３を参照されたい）、または組換えＤＮＡ技術を使用して作製することができる。

特に、本発明の二重特異的および多重特異的分子は、当技術分野で公知の方法を使用して、構成要素結合特異性、例えば、抗ＣＴＬＡ４および抗ＰＤ－１結合特異性をコンジュゲート化することにより、調製することができる。例えば、二重特異的および多重特異的分子の各結合特異性を、別個に作製し、次いで、互いにコンジュゲートすることができる。結合特異性がタンパク質またはペプチドである場合、様々なカップリング剤または架橋剤を、共有的コンジュゲートのために使用することができる。架橋剤の例としては、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ－フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、およびスルホスクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（スルホ－ＳＭＣＣ）が挙げられる［例えば、Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160: 1686；Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 8648を参照されたい］。他の方法としては、Ｐａｕｌｕｓ［Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78,118-132］；Ｂｒｅｎｎａｎら［Science (1985) 229: 81-83］、およびＧｌｅｎｎｉｅら［J. Immunol. (1987) 139: 2367-2375］により記載されるものが挙げられる。好ましいコンジュゲート化剤（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇａｇｅｎｔ）は、両方ともＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）から入手可能である、ＳＡＴＡおよびスルホ－ＳＭＣＣである。

結合特異性が抗体である場合、これらを、２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合を介してコンジュゲートすることができる。特に好ましい実施形態では、ヒンジ領域は、コンジュゲートに先立って、奇数、好ましくは１つのスルフヒドリル残基を含むように改変することができる。

代替的に、両方の結合特異性は、同じベクター中にコードされ、同じ宿主細胞中で発現および組み立てられることができる。この方法は、二重特異的および多重特異的分子がｍＡｂ×ｍＡｂ、ｍＡｂ×Ｆａｂ、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）_２またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合、特に有用である。本発明の二重特異的および多重特異的分子、例えば、二重特異的分子は、単鎖分子、例えば、単鎖二重特異的抗体、１つの単鎖抗体および結合性決定基を含む単鎖二重特異的分子、または２つの結合性決定基を含む単鎖二重特異的分子であり得る。二重特異的および多重特異的分子はまた、単鎖分子でもあり得るか、または少なくとも２つの単鎖分子を含むことができる。二重特異的および多重特異的分子を調製するための方法は、例えば、ＵＳ５，２６０，２０３；ＵＳ５，４５５，０３０；ＵＳ４，８８１，１７５；ＵＳ５，１３２，４０５；ＵＳ５，０９１，５１３；ＵＳ５，４７６，７８６；ＵＳ５，０１３，６５３；ＵＳ５，２５８，４９８；およびＵＳ５，４８２，８５８に記載される。したがって、本発明は、すべてのこれらの抗体形式を包含する。

それらの特異的標的に対する二重特異的および多重特異的分子の結合性は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ（例えば、増殖阻害）、またはウエスタンブロットアッセイにより、確認することができる。これらのアッセイの各々は、一般的に、目的の複合体に対して特異的な標識試薬（例えば、抗体）を用いることにより、特定の目的のタンパク質－抗体複合体の存在を検出する。例えば、ＦｃＲ－抗体複合体は、例えば、抗体－ＦｃＲ複合体を認識し、かつこれに特異的に結合する酵素連結型抗体または抗体断片を使用して検出することができる。代替的に、複合体は、様々な他の免疫アッセイのうちのいずれかを使用して検出することができる。例えば、抗体は、放射活性標識して、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）において使用することができる（例えば、Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986を参照されたい）。放射活性同位体は、γ－カウンターもしくはシンチレーションカウンターの使用などの手段により、またはオートラジオグラフィーにより、検出することができる。

Ｖ．免疫コンジュゲート
別の態様では、本発明は、部分または薬剤にコンジュゲートされた抗ＰＤ－１抗体を特徴とする。そのようなコンジュゲートは、本明細書では「免疫コンジュゲート」とも称される。

部分または薬剤は、抗体に結合した酵素であり得る。そのような抗体は、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）もしくは多元酵素免疫アッセイ技術（ＥＭＩＴ）などの酵素免疫アッセイ、またはウエスタンブロットのために使用することができる。

代替的にまたは加えて、放射性核種（放射性同位体）を、部分または薬剤として抗体に結合させることができる。そのようなコンジュゲートは、療法において使用することができ、また診断目的［放射免疫アッセイ、陽電子放射断層撮影（「イムノＰＥＴ」）］においても使用することができる。放射性核種は、錯化剤を介して抗体にコンジュゲートすることができる。本発明の抗体はまた、がんなどの障害を治療するための細胞傷害性放射性医薬品を生成するために、放射性同位体、例えば、ヨウ素－１３１、イットリウム－９０またはインジウム－１１１にコンジュゲートすることもできる。本発明に従う抗体は、抗体が放射性同位体にコンジュゲートされることを可能にするリンカー－キレーター、例えば、チウキセタンに結合することができる。

代替的にまたは加えて、部分または薬剤は、タグ、例えば、蛍光標識または蛍光プローブとしても知られる蛍光タグであり得る。臭化エチジウム、フルオレセインおよび緑色蛍光タンパク質が、一般的なタグである。

治療的部分または治療剤を含むコンジュゲートもまた、本発明により包含される。治療的部分または治療剤は、ＣＤ２８に結合してＴ細胞応答における共刺激シグナルを生じるサイトカインまたはＣＤ８０であり得る。治療的部分または治療剤はまた、細胞毒素または薬物（例えば、免疫抑制剤）でもあり得る。１つまたは複数の細胞毒素を含む免疫コンジュゲートは、「免疫毒素」と称される。細胞毒素または細胞傷害剤は、細胞に対して有害であり、かつ特に、細胞を殺傷するいずれかの薬剤を含む。例としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシンならびにそれらのアナログまたは相同物が挙げられる。

本発明の免疫コンジュゲートを形成するための好適な治療剤としては、限定するものではないが、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、５－フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤［例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル（ｔｈｉｏｅｐａｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびｃｉｓ－ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン］、アントラサイクリン［例えば、ダウノルビシン（旧ダウノマイシン）およびドキソルビシン］、抗生物質［例えば、ダクチノマイシン（旧アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ）］、および抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられる。好ましい実施形態では、治療剤は、細胞傷害剤または放射毒性剤である。別の実施形態では、治療剤は、免疫抑制剤である。さらに別の実施形態では、治療剤は、ＧＭ－ＣＳＦである。好ましい実施形態では、治療剤は、ドキソルビシン、シスプラチン、ブレオマイシン、スルフェート、カルムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミドまたはリシンＡである。

本発明の抗体コンジュゲートは、所与の生物学的応答を変化させるために使用することができ、薬物部分は、古典的な化学的治療剤に限定されると解釈されるべきではない。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を保有するタンパク質またはポリペプチドであり得る。そのようなタンパク質としては、例えば、酵素的に活性な毒素、もしくはその活性断片、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス属（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素、またはジフテリア毒素；タンパク質、例えば、腫瘍壊死因子またはインターフェロン－γ；または生物学的応答修飾因子、例えば、リンホカイン、インターロイキン－１（「ＩＬ－１」）、インターロイキン－２（「ＩＬ－２」）、インターロイキン－６（「ＩＬ－６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ－ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ－ＣＳＦ」）、または他の増殖因子などが挙げられる。

抗体にそのような治療的部分をコンジュゲート化するための技術は周知であり、例えば、Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds. ), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)；Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)；Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pincheraet al. (eds. ), pp. 475-506 (1985)；"Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985)、およびThorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982)を参照されたい。コンジュゲートの部分、例えば、治療的部分、または薬剤は、リンカー配列により抗体にコンジュゲートすることができる。好適なリンカー配列は、当業者に公知である。

ＶＩ．抗体をコードする核酸
さらなる態様では、本発明はまた、本明細書に記載される通りの抗体またはその一部分、例えば、抗体鎖をコードする遺伝子または核酸配列を含む核酸または核酸分子にも関する。

用語「核酸分子」または「核酸」は、本明細書で使用される場合、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）分子を含むことが意図される。核酸は、本発明に従えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、組換え的に生成された分子および化学合成された分子を含む。本発明に従えば、核酸は、一本鎖または二本鎖および直鎖状または共有的に環状に閉じた分子として存在することができる。例えば、核酸は、二本鎖ＤＮＡである。

本発明に従って記載される核酸は、好ましくは、単離されている。用語「単離された核酸」とは、本発明に従えば、核酸が、（ｉ）例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、インビトロで増幅されたか、（ｉｉ）クローニングにより組換え的に生成されたか、（ｉｉｉ）例えば、切断およびゲル電気泳動分画により、精製されたか、または（ｉｖ）例えば、化学合成により、合成されたことを意味する。単離された核酸は、組換えＤＮＡ技術による操作に対して利用可能である核酸である。

核酸は、本発明に従えば、単独でまたは同種もしくは異種であり得る他の核酸と組み合わせて存在することができる。好ましい実施形態では、核酸は、前記核酸に関して同種または異種であり得る発現制御配列に機能的に連結される。用語「同種」とは、核酸が天然にも発現制御配列に機能的に連結されることを意味し、かつ用語「異種」とは、核酸が天然には発現制御配列に機能的に連結されないことを意味する。

ＲＮＡおよび／またはタンパク質もしくはペプチドを発現する核酸などの核酸と発現制御配列とは、前記核酸の発現または転写が前記発現制御配列の制御下または影響下にあるように互いに共有的に連結されている場合、互いに「機能的に」連結されている。核酸が機能的タンパク質へと翻訳される対象であり、したがってコード配列に機能的に連結された発現制御配列を伴う場合、前記発現制御配列の誘導は、コード配列中のフレームシフトを引き起こすことなく、または所望のタンパク質もしくはペプチドへと翻訳されることが可能でない前記コード配列を伴わずに、前記核酸の転写をもたらす。

用語「発現制御配列」は、本発明に従えば、プロモーター、リボソーム結合性部位、エンハンサーおよび遺伝子の転写またはｍＲＮＡの翻訳を調節する他の制御エレメントを含む。本発明の特定の実施形態では、発現制御配列は、調節することができる。発現制御配列の正確な構造は、種または細胞タイプに応じて変化し得るが、一般的に、それぞれ、転写および翻訳の開始に関与する、５’－非転写配列ならびに５’－および３’－非翻訳配列（５’－ＵＴＲ；３’－ＵＴＲ）、例えば、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などを含む。より具体的には、５’－非転写発現制御配列は、機能的に連結された核酸の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。発現制御配列はまた、エンハンサー配列または上流活性化因子配列も含むことができる。

本発明に従えば、用語「プロモーター」または「プロモーター領域」は、発現される核酸配列に対して上流（５’）に位置し、ＲＮＡポリメラーゼに対する認識および結合性部位を提供することにより配列の発現を制御する核酸配列に関する。「プロモーター領域」は、遺伝子の転写の調節に関与するさらなる因子に対する認識および結合性部位をさらに含むことができる。プロモーターは、原核細胞または真核細胞遺伝子の転写を制御することができる。さらに、プロモーターは、「誘導性」であり得、かつ誘導剤に応答して転写を開始させることができるか、または転写が誘導剤により制御されない場合、「構成的」であり得る。誘導性プロモーターの制御下にある遺伝子は、誘導剤が存在しない場合には発現されないかまたはわずかにしか発現されない。誘導剤の存在下では、遺伝子はスイッチが入れられるか、または転写のレベルが増加する。これは、一般的に、特異的転写因子の結合により媒介される。

本発明に従って好ましいプロモーターとしては、１つまたは複数の一部分または複数の部分が、例えば、ヒトＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ）などの他の細胞性タンパク質の遺伝子のプロモーターの一部分または複数の部分に融合され、かつ追加的なイントロンを含むかまたは含まない、ＳＰ６、Ｔ３およびＴ７ポリメラーゼに対するプロモーター、ヒトＵ６ＲＮＡプロモーター、ＣＭＶプロモーター、およびそれらの人工ハイブリッドプロモーター（例えば、ＣＭＶ）が挙げられる。

本発明に従えば、用語「発現」は、その最も一般的な意味において使用され、ＲＮＡまたはＲＮＡおよびタンパク質／ペプチドの産生を含む。この用語はまた、核酸の部分的発現も含む。さらに、発現は、一時的または安定的に行われることができる。

好ましい実施形態では、核酸分子は、本発明に従えば、適切な場合には核酸の発現を制御するプロモーターを伴って、ベクター中に存在する。用語「ベクター」は、その最も一般的な意味において本明細書で使用され、前記核酸が、例えば、原核細胞および／または真核細胞へと導入され、適切な場合、ゲノムへとインテグレートされることを可能にする、核酸に対するいずれかの中間媒体を含む。この種類のベクターは、好ましくは、細胞中で複製および／または発現される。ベクターは、プラスミド、ファージミド、バクテリオファージまたはウイルスゲノムを含むが、リポソームも含む。用語「プラスミド」は、本明細書で使用される場合、一般的に、染色体ＤＮＡとは独立して複製することができる染色体外遺伝物質のコンストラクト、通常は環状ＤＮＡ二重鎖に関する。

組換え技術を使用するクローニングまたは発現のためのベクターは、当技術分野で公知であり、例えば、プラスミドに基づく発現ベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたはバキュロウイルスベクターを含む。ベクターの例は、ｐＧＥＸ、ｐＥＴ、ｐＬｅｘＡ、ｐＢＩ、ｐＶＩＴＲＯ、ｐＶＩＶＯ、およびｐＳＴ、例えば、ｐＳＴ４を含む。

ベクターは、ＩＶＴベクターであり得る。ＩＶＴベクターは、インビトロ転写のための鋳型として標準化された様式で使用することができる。そのようなＩＶＴベクターは、以下の構造を有することができる：ＲＮＡ転写を可能にする５’ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、それに続く、３’および／または５’非翻訳領域（ＵＴＲ）のいずれかが隣接する目的の遺伝子、ならびにＡヌクレオチドを含有する３’ポリアデニルカセット。そのようなベクターは、加えて、コードされるタンパク質の分泌のためのシグナルペプチドをコードする核酸配列を含んでもよい。インビトロ転写に先立って、環状プラスミドは、ＩＩ型制限酵素（認識配列が切断部位に対応する）により、ポリアデニルカセットの下流で直線化することができる。したがって、ポリアデニルカセットは、転写産物中の後方のポリ（Ａ）配列に対応する。一実施形態では、ベクターは、好ましくは、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲおよび３’ポリアデニルカセットを含む、ｐＳＴ４に基づくＩＶＴベクターである。ＩＶＴベクターは、シグナルペプチドをコードするカセットをさらに含んでもよい。

５’－ＵＴＲ配列として、翻訳効率を増加させるために、「Ｋｏｚａｋ配列」または最適化「Ｋｏｚａｋ配列」を含んでもよいヒトアルファ－グロビンｍＲＮＡの５’－ＵＴＲ配列を使用することができる。５’－ＵＴＲ配列は、ヒト（Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ）ヘモグロビンサブユニットアルファ１の配列であり得る。５’－ＵＴＲ配列の好適な配列は、配列表の配列番号９４および９５（「Ｋｏｚａｋ配列」）に例示される。代替的に、５’－ＵＴＲは、配列表の配列番号９４および９５に描写される通りの配列の変異体であり得る。

３’－ＵＴＲ配列として、ヒトベータ－グロビンｍＲＮＡの２つの反復される３’－ＵＴＲを使用することができ、ｍＲＮＡのより高い最大タンパク質レベルおよび延長した持続性を確実にするために、コード配列とポリ（Ａ）尾部との間に配置されてもよい。代替的に、３’－ＵＴＲは、「スプリットのアミノ末端エンハンサー」（ＡＥＳ）ｍＲＮＡ（Ｆと称される）およびミトコンドリアにコードされる１２ＳリボソームＲＮＡ（Ｉと称される）から誘導される２つの配列エレメントの組み合わせ（ＦＩエレメント）であり得る。これらは、ＲＮＡ安定性を付与し、総タンパク質発現を増強する配列に対するエクスビボ（ｅｘｖｉｖｏ）選択プロセスにより特定された（参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１７／０６０３１４を参照されたい）。３’－ＵＴＲ配列の好適な配列は、配列表の配列番号１０１および１０２に例示され、「ＦＩ」エレメントを形成させる（ｆｒｏｍ）ために使用することができる。代替的に、３’－ＵＴＲは、配列表の配列番号１０１および１０２に描写される通りの配列の変異体であり得る。

一実施形態では、ＩＶＴ核酸ベクターは、ポリ（Ａ）尾部、好ましくは本明細書でさらに特定される通りのポリ（Ａ）尾部をさらにコードされ／含むことができる。例えば、３０個のアデノシン残基の伸長部それに続く１０ヌクレオチドリンカー配列（ランダムヌクレオチドの）およびさらなる７０個のアデノシン残基からなる１１０ヌクレオチド長であるポリ（Ａ）尾部を使用することができる。このポリ（Ａ）尾部配列は、樹状細胞におけるＲＮＡ安定性および翻訳効率を強化するために設計された（参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１６／００５３２４Ａ１を参照されたい）。

一実施形態では、ベクターは、タンパク質の分泌のためのシグナルペプチドをコードする核酸配列を含むことができる。分泌シグナルペプチドは、ヒトＭＨＣクラスＩ複合体分泌シグナルペプチド、例えば、ｈｕｓｅｃ－ＨＬＡＩ－Ｃｗ（ｏｐｔ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＦ９６５０５．１）であり得る。

上述のエレメントは、以下の配列においてベクター中に位置することができる：
（ｉ）５’－ＵＴＲ－「Ｋｏｚａｃ配列」－抗体もしくは抗体鎖もしくはその断片をコードする核酸配列－３’－ＵＴＲ－ポリ（Ａ）尾部；または
（ｉｉ）５’－ＵＴＲ－「Ｋｏｚａｃ配列」－分泌シグナルペプチド－抗体もしくは抗体鎖もしくはその断片をコードする核酸配列－３’－ＵＴＲ－ポリ（Ａ）尾部。

抗体の発現のためのベクターのタイプは、抗体重鎖および軽鎖が異なるベクター中に存在するベクタータイプまたは重鎖および軽鎖が同じベクター中に存在するベクタータイプのいずれかであり得る。

一実施形態では、核酸によりコードされる抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、好ましくはＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ抗体からなる群から選択される抗体であり得る。一実施形態では、抗体は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆｖ断片、または単鎖（ｓｃＦｖ）抗体である。例えば、抗体または抗体鎖をコードする核酸配列は、本明細書に記載される通りの抗体、例えば、ＭＡＢ－１９－０２０２、ＭＡＢ－１９－０２０８、ＭＡＢ－１９－０２１７、ＭＡＢ－１９－０２２３、ＭＡＢ－１９－０２３３、ＭＡＢ－１９－０６０３、ＭＡＢ－１９－０６０８、ＭＡＢ－１９－０６１３、ＭＡＢ－１９－０６１８、ＭＡＢ－１９－０５８３、ＭＡＢ－１９－０５９４、ＭＡＢ－１９－０５９８、またはこれらの抗体のうちの１つの重鎖もしくは軽鎖をコードする核酸配列を含むことができる。一実施形態では、核酸は、本明細書に記載される通りの抗体鎖をコードする核酸配列を含む。

抗体鎖は、好ましくはそれぞれ本明細書に記載される通りの重鎖（Ｈ鎖）または軽鎖（Ｌ鎖）であり得る。一実施形態では、Ｈ鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域を含み、重鎖定常領域は、重鎖ＣＨ_１定常領域または重鎖ＣＨ_１定常領域、重鎖ＣＨ_２定常領域および重鎖ＣＨ_３定常領域の組み合わせを含むことができる。一実施形態では、ＣＨ_１定常ドメインおよびＣＨ_２定常ドメインは、ＣＨ_１定常ドメインとＣＨ_２定常ドメインとの間に位置するヒンジ領域により接続されることができる。

一実施形態では、Ｌ鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域を含み、軽鎖定常領域は、ＣＬカッパ定常ドメインまたはＣＬラムダ定常ドメインであり得る。

一実施形態では、抗体または抗体鎖をコードする核酸は、本明細書に例示される（ｅｘｅｍｐｌｉｅｄ）通りのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列（配列表の配列番号１～３２、ＳＹＮ、ＲＹＹ）のうちの少なくとも１つを含む重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸配列を含む。すなわち、核酸は、本明細書に例示される通りのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２またはＨＣＤＲ３配列をコードする核酸配列を含むことができるか、または核酸（ｎｕｃｌｅｉｃａｉｄ）は、本明細書に規定される通りのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列の組み合わせのうちのいずれかを含む重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸配列を含むことができる。個々のＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３配列の好ましい組み合わせは、それぞれのアミノ酸配列に関して上記で特定される通りである。この教示は、結果的に、核酸配列に適用される。

一実施形態では、核酸は、本明細書に例示される通りのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列（配列表の配列番号３３～５１、ＱＡＳ、ＤＡＳ）のうちの少なくとも１つを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸配列を含む。すなわち、核酸は、本明細書に例示される通りのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２またはＬＣＤＲ３配列をコードする核酸配列を含むことができるか、または核酸は、本明細書に規定される通りのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列の組み合わせのうちのいずれかを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸配列を含むことができる。個々のＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３配列の好ましい組み合わせは、それぞれのアミノ酸配列に関して上記で特定される通りである。この教示は、結果的に、核酸配列に適用される。

一実施形態では、核酸は、本明細書に例示される通りのＶＨおよびＶＬ配列（配列表の配列番号５２～７０）をコードする核酸配列を含む。

一実施形態では、核酸は、配列表の配列番号７４～９２に描写される通りの核酸配列を含む。

一実施形態では、ＰＤ－１に結合する抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および／または軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸配列を含む、核酸、例えばＲＮＡもしくはＲＮＡに基づくベクター、またはインビトロ転写に対して好適なベクターが提供され、核酸は、配列表の配列番号７４～９２に描写される通りの核酸配列のうちの１つに対して少なくとも７０％の同一性を有し、配列表の配列番号１～３２および配列番号３３～５１に描写される通りのそれぞれＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに／またはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、変異体核酸配列は、配列番号７４～配列番号９２に記載の核酸配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％の同一性を有する。一実施形態では、ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログは、同一性の程度を決定するために同一であると見なされる。例えば、ウリジン（Ｕ）およびシュードウリジン、例えば、ｍ１ψは、同一性の程度を決定するために同一であると見なされる。

一実施形態では、変異体核酸配列は、本明細書に特定される通りのそれぞれのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列のうちの１つまたは複数を含む／コードする。すなわち、重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする変異体核酸配列は、本明細書に特定される通りのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３アミノ酸配列のうちの１つまたは複数を含む／コードすることができ、ＣＤＲ配列の具体的な組み合わせに関して、本明細書のそれぞれの開示が参照される。例えば、変異体核酸配列は、本明細書に特定される通りのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む／コードすることができる。

軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする変異体核酸配列は、本明細書に特定される通りのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３アミノ酸配列のうちの１つまたは複数を含む／コードすることができ、ＣＤＲ配列の具体的な組み合わせに関して、本明細書のそれぞれの開示が参照される。例えば、変異体核酸配列は、本明細書に特定される通りのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む／コードすることができる。

変異体核酸配列は、それぞれ、親配列の重鎖可変領域（ＶＨ）または軽鎖可変領域（ＶＬ）により提供される同じ結合特異性および／または機能性を提供することが可能な重鎖可変領域（ＶＨ）または軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードすることができる。

一実施形態では、ＰＤ－１に結合する抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸であって、重鎖可変領域（ＶＨ）は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有し、ＶＨをコードする核酸配列は、配列番号７４に対して少なくとも７０％の同一性を有し、コードされるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３アミノ酸配列は、
（ｉ）それぞれ、ＳＹＮ、配列番号１１および配列番号１；
（ｉｉ）それぞれ、配列番号２３、配列番号１６および配列番号１；または
（ｉｉｉ）それぞれ、配列番号２８、配列番号１１および配列番号６
から選択される、核酸が提供される。

一実施形態では、ＰＤ－１に結合する抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸であって、軽鎖可変領域（ＶＬ）は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有し、ＶＬをコードする核酸配列は、配列番号７９に対して少なくとも７０％の同一性を有し、コードされるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３アミノ酸配列は、
（ｉ）それぞれ、配列番号４２、ＱＡＳ、および配列番号３３；または
（ｉｉ）それぞれ、配列番号４７、配列番号３８、および配列番号３３
から選択される、核酸が提供される。

一実施形態では、上記ＶＨ変異体は、配列番号７４に記載の核酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％の同一性を有する。一実施形態では、上記ＶＬ変異体は、配列番号７９に記載の核酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％の同一性を有する。

一実施形態では、ＰＤ－１に結合する抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸であって、重鎖可変領域（ＶＨ）は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有し、ＶＨをコードする核酸配列は、配列番号７５に対して少なくとも７０％の同一性を有し、コードされるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３アミノ酸配列は、
（ｉ）それぞれ、ＲＹＹ、配列番号１２および配列番号２；
（ｉｉ）それぞれ、配列番号２４、配列番号１７および配列番号２；または
（ｉｉｉ）それぞれ、配列番号２９、配列番号１２および配列番号７
から選択される、核酸が提供される。

一実施形態では、ＰＤ－１に結合する抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸であって、軽鎖可変領域（ＶＬ）は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有し、ＶＬをコードする核酸配列は、配列番号８０に対して少なくとも７０％の同一性を有し、コードされるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３アミノ酸配列は、
（ｉ）それぞれ、配列番号４３、ＤＡＳ、および配列番号３４；または
（ｉｉ）それぞれ、配列番号４８、配列番号３９、および配列番号３４
から選択される、核酸が提供される。

一実施形態では、上記ＶＨ変異体は、配列番号７５に記載の核酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％の同一性を有する。一実施形態では、上記ＶＬ変異体は、配列番号８０に記載の核酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％の同一性を有する。

一実施形態では、ＰＤ－１に結合する抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸であって、重鎖可変領域（ＶＨ）は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有し、ＶＨをコードする核酸配列は、配列番号７６に対して少なくとも７０％の同一性を有し、コードされるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３アミノ酸配列は、
（ｉ）それぞれ、ＲＹＹ、配列番号１３および配列番号３；
（ｉｉ）それぞれ、配列番号２５、配列番号１８および配列番号３；または
（ｉｉｉ）それぞれ、配列番号３０、配列番号１３および配列番号８
から選択される、核酸が提供される。

一実施形態では、ＰＤ－１に結合する抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸であって、軽鎖可変領域（ＶＬ）は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有し、ＶＬをコードする核酸配列は、配列番号８１に対して少なくとも７０％の同一性を有し、コードされるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３アミノ酸配列は、
（ｉ）それぞれ、配列番号４４、ＤＡＳ、および配列番号３５；または
（ｉｉ）それぞれ、配列番号４９、配列番号３９、および配列番号３５
から選択される、核酸が提供される。

一実施形態では、上記ＶＨ変異体は、配列番号７６に記載の核酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％の同一性を有する。一実施形態では、上記ＶＬ変異体は、配列番号８１に記載の核酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％の同一性を有する。

一実施形態では、ＰＤ－１に結合する抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸であって、重鎖可変領域（ＶＨ）は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有し、ＶＨをコードする核酸配列は、配列番号７７に対して少なくとも７０％の同一性を有し、コードされるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３アミノ酸配列は、
（ｉ）それぞれ、配列番号２１、配列番号１４および配列番号４；
（ｉｉ）それぞれ、配列番号２６、配列番号１９および配列番号４；または
（ｉｉｉ）それぞれ、配列番号３１、配列番号１４および配列番号９
から選択される、核酸が提供される。

一実施形態では、ＰＤ－１に結合する抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸であって、軽鎖可変領域（ＶＬ）は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有し、ＶＬをコードする核酸配列は、配列番号８２に対して少なくとも７０％の同一性を有し、コードされるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３アミノ酸配列は、
（ｉ）それぞれ、配列番号４５、ＤＡＳ、および配列番号３６；または
（ｉｉ）それぞれ、配列番号５０、配列番号４０、および配列番号３６
から選択される、核酸が提供される。

一実施形態では、上記ＶＨ変異体は、配列番号７７に記載の核酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％の同一性を有する。一実施形態では、上記ＶＬ変異体は、配列番号８２に記載の核酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％の同一性を有する。

一実施形態では、ＰＤ－１に結合する抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸であって、重鎖可変領域（ＶＨ）は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有し、ＶＨをコードする核酸配列は、配列番号７８に対して少なくとも７０％の同一性を有し、コードされるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３アミノ酸配列は、
（ｉ）それぞれ、配列番号２２、配列番号１５および配列番号５；
（ｉｉ）それぞれ、配列番号２７、配列番号２０および配列番号５；または
（ｉｉｉ）それぞれ、配列番号３２、配列番号１５および配列番号１０
から選択される、核酸が提供される。

一実施形態では、ＰＤ－１に結合する抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸であって、軽鎖可変領域（ＶＬ）は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有し、ＶＬをコードする核酸配列は、配列番号８３に対して少なくとも７０％の同一性を有し、コードされるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３アミノ酸配列は、
（ｉ）それぞれ、配列番号４６、ＤＡＳ、および配列番号３７；または
（ｉｉ）それぞれ、配列番号５１、配列番号４１、および配列番号３７
から選択される、核酸が提供される。

一実施形態では、上記ＶＨ変異体は、配列番号７８に記載の核酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％の同一性を有する。一実施形態では、上記ＶＬ変異体は、配列番号８３に記載の核酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％の同一性を有する。

一実施形態では、核酸は、以下に示され、配列表の配列番号７４に描写される通りの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸配列を含むか、またはその断片である。一実施形態では、重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号７４に描写される配列の変異体である。

上記の核酸配列および対応するアミノ酸配列において、Ｋａｂａｔナンバリングに従う相補性決定領域（ＣＤＲ）は波線により示され、下線のヌクレオチドまたはアミノ酸は、ＩＭＧＴナンバリングに従うＣＤＲを示す。太字はＫａｂａｔおよびＩＭＧＴナンバリングの交差部分を示す。

一実施形態では、核酸は、以下に示され、配列表の配列番号７５に描写される通りの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸配列を含むか、またはその断片である。一実施形態では、重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号７５に描写される配列の変異体である。

一実施形態では、核酸は、以下に示され、配列表の配列番号７６に描写される通りの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸配列を含むか、またはその断片である。一実施形態では、重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号７６に描写される配列の変異体である。

一実施形態では、核酸は、以下に示され、配列表の配列番号７７に描写される通りの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸配列を含むか、またはその断片である。一実施形態では、重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号７７に描写される配列の変異体である。

一実施形態では、核酸は、以下に示され、配列表の配列番号７８に描写される通りの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸配列を含むか、またはその断片である。一実施形態では、重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号７８に描写される配列の変異体である。

一実施形態では、核酸は、以下に示され、配列表の配列番号８４に描写される通りの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸配列を含むか、またはその断片である。一実施形態では、重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号８４に描写される配列の変異体である。

一実施形態では、核酸は、以下に示され、配列表の配列番号８５に描写される通りの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸配列を含むか、またはその断片である。一実施形態では、重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号８５に描写される配列の変異体である。

一実施形態では、核酸は、以下に示され、配列表の配列番号８６に描写される通りの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸配列を含むか、またはその断片である。一実施形態では、重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号８６に描写される配列の変異体である。

一実施形態では、核酸は、以下に示され、配列表の配列番号７９に描写される通りの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸配列を含むか、またはその断片である。一実施形態では、軽鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号７９に描写される配列の変異体である。

一実施形態では、核酸は、以下に示され、配列表の配列番号８０に描写される通りの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸配列を含むか、またはその断片である。一実施形態では、軽鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号８０に描写される配列の変異体である。

一実施形態では、核酸は、以下に示され、配列表の配列番号８１に描写される通りの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸配列を含むか、またはその断片である。一実施形態では、軽鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号８１に描写される配列の変異体である。

一実施形態では、核酸は、以下に示され、配列表の配列番号８２に描写される通りの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸配列を含むか、またはその断片である。一実施形態では、軽鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号８２に描写される配列の変異体である。

一実施形態では、核酸は、以下に示され、配列表の配列番号８３に描写される通りの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸配列を含むか、またはその断片である。一実施形態では、軽鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号８３に描写される配列の変異体である。

一実施形態では、核酸は、以下に示され、配列表の配列番号８７に描写される通りの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸配列を含むか、またはその断片である。一実施形態では、軽鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号８７に描写される配列の変異体である。

一実施形態では、核酸は、以下に示され、配列表の配列番号８８に描写される通りの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸配列を含むか、またはその断片である。一実施形態では、軽鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号８８に描写される配列の変異体である。

一実施形態では、核酸は、以下に示され、配列表の配列番号８９に描写される通りの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸配列を含むか、またはその断片である。一実施形態では、軽鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号８９に描写される配列の変異体である。

一実施形態では、核酸は、以下に示され、配列表の配列番号９０に描写される通りの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸配列を含むか、またはその断片である。一実施形態では、軽鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号９０に描写される配列の変異体である。

一実施形態では、核酸は、以下に示され、配列表の配列番号９１に描写される通りの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸配列を含むか、またはその断片である。一実施形態では、軽鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号９１に描写される配列の変異体である。

一実施形態では、核酸は、以下に示され、配列表の配列番号９２に描写される通りの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸配列を含むか、またはその断片である。一実施形態では、軽鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号９２に描写される配列の変異体である。

具体的な核酸およびアミノ酸配列に関して本明細書に与えられる教示、例えば、配列表に示されるものは、前記具体的配列に対して機能的に等価である配列を生じる前記具体的配列の改変、例えば、具体的アミノ酸配列のものと同一または類似の特性を示すアミノ酸配列および具体的核酸配列によりコードされるアミノ酸配列のものと同一または類似の特性を示すアミノ酸配列をコードする核酸配列にも関するように解釈されるべきである。１つの重要な特性は、その標的に対する抗体の結合性を保持することまたは抗体の所望のエフェクター機能を持続させることである。好ましくは、具体的配列に関して改変された配列は、抗体中の具体的配列を置き換える場合、ＰＤ－１に対する前記抗体の結合性および好ましくは本明細書に記載される通りの前記抗体の機能、例えば、ＰＤ－１を発現する細胞上のＰＤ－１の免疫抑制、ＣＤＣ媒介溶解またはＡＤＣＣ媒介溶解の阻害を保持する。

例えば、本明細書に記載される通りの核酸およびアミノ酸配列の変異体は、以下の特性のうちの少なくとも１つを提供する抗体または抗原結合性断片をコードまたは提供する：
（ｉ）ＰＤ－１、例えば、ヒトＰＤ－１に結合し、好ましくは特異的に結合することが可能であること；
（ｉｉ）そのリガンドに対するＰＤ－１の結合性を遮断することが可能であること；
（ｉｉｉ）好ましくは診断的および／または治療的使用を提供するために十分である親和性を伴って、親抗体が結合するのと同じ抗原に結合することが可能であること；および／または
（ｉｖ）低減または消耗したエフェクター機能を提供することが可能であること。

特に、ＣＤＲ、超可変領域および可変領域の配列を、ＰＤ－１に結合する能力を失うことなく改変できることが、当業者により理解されるであろう。例えば、ＣＤＲ領域は、本明細書に特定される領域に対して同一であるかまたは高度に相同であるかのいずれかであろう。「高度に相同」により、１～５箇所、好ましくは１～４箇所、１～３箇所または１もしくは２箇所などの置換をＣＤＲ中に行うことができることが企図される。加えて、超可変領域および可変領域は、本明細書で具体的に開示される領域との実質的な相同性を示すように、改変することができる。

本明細書に記載される核酸はまた、特定の宿主細胞または生物におけるコドン使用頻度を最適化する目的のために改変された核酸も含むことが理解されるべきである。生物間でのコドン使用頻度における差異は、異種遺伝子発現に関する様々な問題を引き起こし得る。元の配列の１つまたは複数のヌクレオチドを変更することによるコドン最適化は、前記核酸がその中で発現される対象である同種または異種宿主における、核酸の発現の最適化、特に、翻訳効率の最適化をもたらし得る。例えば、ヒトから誘導されかつ抗体の定常領域および／またはフレームワーク領域をコードする核酸が本発明に従って使用される予定である場合、例えば、キメラまたはヒト化抗体を調製するために、特に、本明細書に記載される通りの他の生物から誘導される核酸などの異種核酸に融合されていてもよい前記核酸が、マウスまたはハムスターなどのヒトとは異なる生物由来の細胞において発現される予定である場合、コドン使用頻度の最適化の目的のために前記核酸を改変することが好ましい場合がある。例えば、ヒト軽鎖および重鎖定常領域をコードする核酸配列は、最適化されたコドン使用頻度を生じるがアミノ酸配列の変化を生じない、１つまたは複数の、好ましくは、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０箇所および好ましくは最大１０、１５、２０、２５、３０、５０、７０もしくは１００箇所またはそれ以上のヌクレオチド置換を含むために改変することができる。

本発明に従う「核酸」は、ＲＮＡ、より好ましくはインビトロ転写ＲＮＡ（ＩＶＴＲＮＡ）または合成ＲＮＡであり得る。核酸は、特に、ＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写により調製することができるＲＮＡの形態での、細胞への導入、すなわち、トランスフェクションのために用いることができる。ＲＮＡはさらに、配列の安定化、キャッピング、およびポリアデニル化により適用前に修飾することができる。

用語「遺伝物質」は、単離された核酸、ＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれか、二重らせんの一片、染色体の一片、または生物もしくは細胞のゲノム全体、特にそのエクソームもしくはトランスクリプトームを含む。

用語「突然変異」とは、参照と比較した核酸配列の変化または差異（ヌクレオチド置換、付加または欠失）を意味する。「体細胞突然変異」は、生殖細胞（精子および卵子）を除く身体の細胞のうちのいずれかにおいて起こることができ、したがって、子孫へと伝わらない。これらの変化は、（常にではないが）がんまたは他の疾患を引き起こす場合がある。好ましくは、突然変異は、非同義突然変異である。用語「非同義突然変異」とは、翻訳産物におけるアミノ酸置換などのアミノ酸変化をもたらす突然変異、好ましくはヌクレオチド置換を意味する。

本発明に従えば、用語「突然変異」は、点突然変異、インデル、融合、クロモスリプシスおよびＲＮＡ編集を含む。

本発明に従えば、用語「インデル」は、共局在する挿入および欠失ならびにヌクレオチドにおける正味の増加または喪失をもたらす突然変異として定義される、特殊な突然変異クラスを説明する。ゲノムのコード領域において、インデルの長さが３の倍数でない限り、インデルは、フレームシフト突然変異を生じる。インデルは、点突然変異と対比することができ；インデルが配列からヌクレオチドを挿入および欠失させ、点突然変異はヌクレオチドのうちの１つを置き換える置換の一形態である。

本発明に従えば、用語「クロモスリプシス」とは、単一の破壊的事象を介して、ゲノムの特異的領域が粉砕され、次に一緒につなぎ合わせられる遺伝学的現象を意味する。

本発明に従えば、用語「ＲＮＡ編集」（ＲＮＡｅｄｉｔｏｒＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇ）とは、ＲＮＡ分子の情報内容が、塩基構成における化学的変化を介して変更される分子的プロセスを意味する。ＲＮＡ編集は、シチジン（Ｃ）からウリジン（Ｕ）およびアデノシン（Ａ）からイノシン（Ｉ）脱アミノ化などのヌクレオシド改変、ならびに非鋳型ヌクレオチド付加および挿入を含む。ｍＲＮＡにおけるＲＮＡ編集は、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を効果的に変化させ、ゲノムＤＮＡ配列により予測されるものとは異なるようにさせる。

本発明に従えば、「参照」は、腫瘍試料から取得される結果を関連付けおよび比較するために使用することができる。典型的には、「参照」は、患者または１つもしくは複数の異なる個体、好ましくは健康個体、特に同じ種の個体のいずれかから取得される、１つまたは複数の正常試料、特に、がん疾患に罹患していない試料に基づいて取得することができる。「参照」は、十分に多数の正常試料を試験することにより、実験的に決定することができる。

本発明の文脈において、用語「ＲＮＡ」は、リボヌクレオチド残基を含み、好ましくは完全にまたは実質的にリボヌクレオチド残基から構成される分子に関する。「リボヌクレオチド」は、β－Ｄ－リボフラノシル基の２’位にヒドロキシル基を含むヌクレオチドに関する。用語「ＲＮＡ」は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、単離されたＲＮＡ、例えば、部分的または完全に精製されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、および組換え的に生成されたＲＮＡ、例えば、１つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または変更により天然に存在するＲＮＡとは異なる改変型ＲＮＡを含む。そのような変更は、ＲＮＡの末端へのまたは内部的などの、例えば、ＲＮＡの１つまたは複数のヌクレオチドでの、非ヌクレオチド物質の付加を含むことができる。ＲＮＡ分子中のヌクレオチドはまた、非標準ヌクレオチド、例えば、天然に存在しないヌクレオチドまたは化学合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドも含むことができる。これらの変更されたＲＮＡは、アナログまたは天然に存在するＲＮＡのアナログ（１つまたは複数）と称される場合がある。

本発明に従えば、用語「ＲＮＡ」は、「ｍＲＮＡ」を含み、好ましくはこれに関する。用語「ｍＲＮＡ」とは、「メッセンジャーＲＮＡ」を意味し、ＤＮＡ鋳型を使用することにより生成され、かつペプチドまたはポリペプチドをコードする「転写産物」に関する。転写を制御するためのプロモーターは、いずれかのＲＮＡポリメラーゼに対するいずれかのプロモーターであり得る。インビトロ転写のためのＤＮＡ鋳型は、核酸、特にｃＤＮＡのクローニングおよびインビトロ転写のための適切なベクターへの導入により、取得することができる。ｃＤＮＡは、ＲＮＡの逆転写により取得することができる。典型的には、ｍＲＮＡは、５’－ＵＴＲ、タンパク質コード領域、および３’－ＵＴＲを含む。ｍＲＮＡは、細胞中およびインビトロにおいて限定された半減期のみを保有する。本発明の文脈において、ｍＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写により生成することができる。インビトロ転写方法論は、当業者に公知である。例えば、様々な市販のインビトロ転写キットがある。

本発明に従えば、ＲＮＡの安定性および翻訳効率は、必要な場合に変化させることができる。増大した安定性および改善した翻訳効率を有するＲＮＡ分子は、例えば、ＲＮＡにコードされる本発明の抗体に対して有利であり得る。例えば、ＲＮＡの安定化作用および／または翻訳効率を増加させる作用を有する１つまたは複数の改変により、ＲＮＡを安定化し、その翻訳を増加させることができる。そのような改変は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＥＰ２００６／００９４４８に記載される。本発明に従って使用されるＲＮＡの発現を増加させるために、好ましくは、発現されるペプチドまたはタンパク質の配列を変化させることなく、コード領域、すなわち、発現されるペプチドまたはタンパク質をコードする配列内で改変し、それにより、ｍＲＮＡ安定性を増加させるためにＧＣ含量を増加させ、かつコドン最適化を行って、結果として、細胞における翻訳を強化することができる。

本発明において使用されるＲＮＡの文脈における用語「改変」は、前記ＲＮＡ中に天然に存在しないＲＮＡのいずれかの改変を含む。

本発明の一実施形態では、本発明に従って使用されるＲＮＡは、未キャッピング５’－三リン酸を有しない。そのような未キャッピング５’－三リン酸の除去は、ホスファターゼを用いてＲＮＡを処理することにより達成することができる。

本発明に従うＲＮＡは、その安定性を増加させかつ／または細胞傷害性を減少させるために、修飾型リボヌクレオチドを有することができる。例えば、一実施形態では、本発明に従って使用されるＲＮＡにおいて、５－メチルシチジンが、シチジンを部分的または完全に、好ましくは完全に置換する。代替的または追加的に、一実施形態では、本発明に従って使用されるＲＮＡにおいて、シュードウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、または５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）が、ウリジンを部分的または完全に、好ましくは完全に置換する。

用語「ウリジン」は、本明細書で使用される場合、ＲＮＡ中に生じ得るヌクレオシドのうちの１つを記載する。ウリジンの構造は：

である。

ＵＴＰ（ウリジン５’－三リン酸）は、以下の構造：

を有する。

シュードＵＴＰ（シュードウリジン５’－三リン酸）は、以下の構造：

を有する。

「シュードウリジン」は、ウリジンの異性体である修飾型ヌクレオシドの一例であり、ウラシルが、窒素－炭素グリコシド結合ではなく炭素－炭素結合を介してペントース環に連結される。

別の例示的な修飾型ヌクレオシドは、以下の構造：

を有するＮ１－メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）である。

Ｎ１－メチルシュード－ＵＴＰは、以下の構造：

を有する。

別の例示的な修飾型ヌクレオシドは、以下の構造：

を有する５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）である。

一部の実施形態では、本明細書に記載されるＲＮＡ中の１つまたは複数のウリジンは、修飾型ヌクレオシドにより置き換えられる。一部の実施形態では、修飾型ヌクレオシドは、修飾型ウリジンである。

一部の実施形態では、ウリジンを置き換える修飾型ウリジンは、シュードウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、または５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）である。

一部の実施形態では、ＲＮＡ中の１つまたは複数のウリジンを置き換える修飾型ヌクレオシドは、３－メチルウリジン（ｍ^３Ｕ）、５－メトキシウリジン（ｍｏ^５Ｕ）、５－アザウリジン、６－アザウリジン、２－チオ－５－アザウリジン、２－チオ－ウリジン（ｓ２Ｕ）、４－チオウリジン（ｓ^４Ｕ）、４－チオシュードウリジン、２－チオシュードウリジン、５－ヒドロキシウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５－アミノアリルウリジン、５－ハロウリジン（例えば、５－ヨードウリジンまたは５－ブロモウリジン）、ウリジン５－オキシ酢酸（ｃｍｏ^５Ｕ）、ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ^５Ｕ）、５－カルボキシメチルウリジン（ｃｍ^５Ｕ）、１－カルボキシメチルシュードウリジン、５－カルボキシヒドロキシメチルウリジン（ｃｈｍ^５Ｕ）、５－カルボキシヒドロキシメチルウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ^５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチルウリジン（ｍｃｍ^５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン（ｍｃｍ^５ｓ^２Ｕ）、５－アミノメチル－２－チオウリジン（ｎｍ^５ｓ^２Ｕ）、５－メチルアミノメチルウリジン（ｍｎｍ^５Ｕ）、１－エチルシュードウリジン、５－メチルアミノメチル－２－チオウリジン（ｍｎｍ^５ｓ^２Ｕ）、５－メチルアミノメチル－２－セレノウリジン（ｍｎｍ^５ｓｅ^２Ｕ）、５－カルバモイルメチル－ウリジン（ｎｃｍ^５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチルウリジン（ｃｍｎｍ^５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン（ｃｍｎｍ^５ｓ^２Ｕ）、５－プロピニルウリジン、１－プロピニルシュードウリジン、５－タウリノメチルウリジン（τｍ^５Ｕ）、１－タウリノメチルシュードウリジン、５－タウリノメチル－２－チオウリジン（τｍ^５ｓ^２Ｕ）、１－タウリノメチル－４－チオシュードウリジン）、５－メチル－２－チオウリジン（ｍ^５ｓ^２Ｕ）、１－メチル－４－チオシュードウリジン（ｍ^１ｓ^４ψ）、４－チオ－１－メチルシュードウリジン、３－メチルシュードウリジン（ｍ^３ψ）、２－チオ－１－メチルシュードウリジン、１－メチル－１－デアザシュードウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザシュードウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロシュードウリジン、５，６－ジヒドロウリジン、５－メチル－ジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオウリジン、４－メトキシシュードウリジン、４－メトキシ－２－チオシュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ^３Ｕ）、１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）シュードウリジン（ａｃｐ^３ψ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ^５Ｕ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２－チオ－ウリジン（ｉｎｍ^５ｓ^２Ｕ）、α－チオウリジン、２’－Ｏ－メチル－ウリジン（Ｕｍ）、５，２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン（ｍ^５Ｕｍ）、２’－Ｏ－メチルシュードウリジン（ψｍ）、２－チオ－２’－Ｏ－メチルウリジン（ｓ^２Ｕｍ）、５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン（ｍｃｍ^５Ｕｍ）、５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｎｃｍ^５Ｕｍ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン（ｃｍｎｍ^５Ｕｍ）、３，２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン（ｍ^３Ｕｍ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２’－Ｏ－メチルウリジン（ｉｎｍ^５Ｕｍ）、１－チオウリジン、デオキシチミジン、２’－Ｆ－ａｒａ－ウリジン、２’－Ｆ－ウリジン、２’－ＯＨ－ａｒａ－ウリジン、５－（２－カルボメトキシビニル）ウリジン、５－［３－（１－Ｅ－プロペニルアミノ）ウリジン、または当技術分野で公知のいずれかの他の修飾型ウリジンのうちのいずれか１つまたは複数であり得る。

一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡは、少なくとも１つのウリジンの代わりに修飾型ヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡは、各ウリジンの代わりに修飾型ヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、各ＲＮＡは、少なくとも１つのウリジンの代わりに修飾型ヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、各ＲＮＡは、各ウリジンの代わりに修飾型ヌクレオシドを含む。

一部の実施形態では、修飾型ヌクレオシドは、シュードウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルシュードウリジン（ｍ^１ψ）、および５－メチルウリジン（ｍ^５Ｕ）から独立して選択される。一部の実施形態では、修飾型ヌクレオシドは、シュードウリジン（ψ）を含む。一部の実施形態では、修飾型ヌクレオシドは、Ｎ１－メチルシュードウリジン（ｍ^１ψ）を含む。一部の実施形態では、修飾型ヌクレオシドは、５－メチルウリジン（ｍ^５Ｕ）を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡは、修飾型ヌクレオシドのうちの２種類以上のタイプを含むことができ、修飾型ヌクレオシドは、シュードウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルシュードウリジン（ｍ^１ψ）、および５－メチルウリジン（ｍ^５Ｕ）から独立して選択される。一部の実施形態では、修飾型ヌクレオシドは、シュードウリジン（ψ）およびＮ１－メチルシュードウリジン（ｍ^１ψ）を含む。一部の実施形態では、修飾型ヌクレオシドは、シュードウリジン（ψ）および５－メチルウリジン（ｍ^５Ｕ）を含む。一部の実施形態では、修飾型ヌクレオシドは、Ｎ１－メチルシュードウリジン（ｍ^１ψ）、および５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）を含む。一部の実施形態では、修飾型ヌクレオシドは、シュードウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルシュードウリジン（ｍ^１ψ）、および５－メチルウリジン（ｍ^５Ｕ）を含む。

一実施形態では、ＲＮＡは、他の修飾型ヌクレオシドを含むか、またはさらなる修飾型ヌクレオシド、例えば、修飾型シチジンを含む。例えば、一実施形態では、ＲＮＡにおいて、５－メチルシチジンが、シチジンを部分的または完全に、好ましくは完全に置換する。一実施形態では、ＲＮＡは、５－メチルシチジンならびにシュードウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルシュードウリジン（ｍ^１ψ）、および５－メチルウリジン（ｍ^５Ｕ）から選択される１つまたは複数を含む。一実施形態では、ＲＮＡは、５－メチルシチジンおよびＮ１－メチルシュードウリジン（ｍ^１ψ）を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡは、各シチジンの代わりに５－メチルシチジンおよび各ウリジンの代わりにＮ１－メチルシュードウリジン（ｍ^１ψ）を含む。

一実施形態では、用語「修飾」は、５’－キャップまたは５’－キャップアナログを含むＲＮＡを提供することに関する。用語「５’－キャップ」とは、ｍＲＮＡ分子の５’末端上に見出されるキャップ構造を意味し、一般的に、稀な５’－５’三リン酸連結を介してｍＲＮＡに接続されたグアノシンヌクレオチドからなる。一実施形態では、このグアノシンは、７位でメチル化される。用語「従来の５’－キャップ」とは、天然に存在するＲＮＡ５’－キャップ、好ましくは７－メチルグアノシンキャップ（ｍ^７Ｇ）を意味する。本発明の文脈において、用語「５’－キャップ」は、ＲＮＡキャップ構造に似通った５’－キャップアナログを含み、好ましくはインビボおよび／または細胞中でそれに連結される場合、ＲＮＡを安定化しかつ／またはＲＮＡの翻訳を強化する能力を保有するために修飾される。

５’－キャップまたは５’－キャップアナログを有するＲＮＡを提供することは、前記５’－キャップまたは５’－キャップアナログの存在下でのＤＮＡ鋳型のインビトロ転写により達成することができ、前記５’－キャップは、生成されるＲＮＡ鎖へと共転写的に組み込まれるか、またはＲＮＡを、例えば、インビトロ転写により生成することができ、５’－キャップを、キャッピング酵素、例えば、ワクシニアウイルスのキャッピング酵素を使用して転写後にＲＮＡに結合することができる。

一部の実施形態では、ＲＮＡに対する構成要素キャップは、以下の構造：

を有するｍ_２ ^{７，３’－Ｏ}Ｇｐｐｐ（ｍ_１ ^２’－Ｏ）ＡｐＧ［ｍ_２ ^{７，３’Ｏ}Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ｍ^２’－ＯＡｐＧとも称されることもある］である。

以下は、ＲＮＡおよびｍ_２ ^{７，３’Ｏ}Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ｍ^２’－ＯＡｐＧを含む例示的なＣａｐ１ＲＮＡである：

以下は、別の例示的なＣａｐ１ＲＮＡ（キャップなしアナログ）である：

一部の実施形態では、ＲＮＡは、一実施形態では、以下の構造：

を有するキャップアナログ抗リバースキャップ［ＡＲＣＡキャップ（ｍ_２ ^{７，３’Ｏ}Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ）］を使用して、「Ｃａｐ０」構造を有して修飾することができる

以下は、ＲＮＡおよびｍ_２ ^{７，３’Ｏ}Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇを含む例示的なＣａｐ０ＲＮＡである：

一部の実施形態では、「Ｃａｐ０」構造は、以下の構造：

を有するキャップアナログベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ［ｍ_２ ^{７，２’Ｏ}Ｇ（５’）ｐｐＳｐ（５’）Ｇ］を使用して生成される。

以下は、ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ［ｍ_２ ^{７，２’Ｏ}Ｇ（５’）ｐｐＳｐ（５’）Ｇ］およびＲＮＡを含む例示的なＣａｐ０ＲＮＡである：

特に好ましいキャップは、５’－キャップｍ_２ ^{７，２’Ｏ}Ｇ（５’）ｐｐＳｐ（５’）Ｇを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される少なくとも１つのＲＮＡは、５’－キャップｍ_２ ^{７，２’Ｏ}Ｇ（５’）ｐｐＳｐ（５’）Ｇを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される各ＲＮＡは、５’－キャップｍ_２ ^{７，２’Ｏ}Ｇ（５’）ｐｐＳｐ（５’）Ｇを含む。

一部の実施形態では、本開示に従うＲＮＡは、５’－ＵＴＲおよび／または３’－ＵＴＲを含む。

ＲＮＡは、さらなる改変を含むことができる。例えば、本発明において使用されるＲＮＡのさらなる改変は、天然に存在するポリ（Ａ）尾部の伸長もしくは切断または前記ＲＮＡのコード領域に関連しないＵＴＲの導入などの５’－または３’－非翻訳領域（ＵＴＲ）の変化、例えば、既存の３’－ＵＴＲのグロビン遺伝子、例えば、アルファ２－グロビン、アルファ１－グロビン、ベータ－グロビン、好ましくはベータ－グロビン、より好ましくはヒトベータ－グロビンから誘導される３’－ＵＴＲの１つもしくは複数、好ましくは２コピーとの交換またはそれらの挿入であり得る。

用語「非翻訳領域」または「ＵＴＲ」は、転写されるがアミノ酸配列へと翻訳されないＤＮＡ分子中の領域、またはｍＲＮＡ分子などのＲＮＡ分子中の対応する領域に関する。非翻訳領域（ＵＴＲ）は、オープンリーディングフレームの５’（上流）（５’－ＵＴＲ）および／またはオープンリーディングフレームの３’（下流）（３’－ＵＴＲ）に存在することができる。存在する場合、５’－ＵＴＲは、タンパク質コード領域の開始コドンの上流で５’末端に位置する。５’－ＵＴＲは、５’－キャップ（存在する場合）の下流であり、例えば、５’－キャップに直接的に隣接する。存在する場合、３’－ＵＴＲは、タンパク質コード領域の終止コドンの下流で３’末端に位置するが、用語「３’－ＵＴＲ」は、好ましくはポリＡ配列を含まない。したがって、３’－ＵＴＲは、ポリＡ配列（存在する場合）の上流であり、例えば、ポリＡ配列に直接的に隣接する。好ましい５’－ＵＴＲおよび３’－ＵＴＲ配列エレメントの例は、本明細書に詳細に記載され、配列表の配列番号９４、９５、１０１および１０２により例示され、かつ本開示中で参照される。

非遮蔽ポリＡ配列を有するＲＮＡは、遮蔽ポリＡ配列を有するＲＮＡよりも効率的に翻訳される。用語「ポリ（Ａ）尾部」または「ポリＡ配列」は、典型的にはＲＮＡ分子の３’末端に位置するアデニル（Ａ）残基の中断されないかまたは中断される配列に関し、「非遮蔽ポリＡ配列」とは、ＲＮＡ分子の３’末端のポリＡ配列がポリＡ配列のＡによって終結し、ポリＡ配列の３’末端、すなわち、下流に位置するＡ以外のヌクレオチドがその後に続かないことを意味する。中断されないポリＡ尾部は、連続的なアデニレート残基により特徴付けられる。天然では、中断されないポリＡ尾部が典型的である。本明細書に開示されるＲＮＡは、転写後に鋳型非依存的ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡの遊離３’末端へと結合されるポリＡ尾部またはＤＮＡによりコードされ、かつ鋳型依存的ＲＮＡポリメラーゼにより転写されるポリＡ尾部を有することができる。さらに、約１２０塩基対の長いポリＡ配列は、最適な転写産物安定性およびＲＮＡの翻訳効率をもたらす。

したがって、本発明に従って使用されるＲＮＡの安定性および／または発現を増加させるために、ＲＮＡは、好ましくは１０～５００、より好ましくは３０～３００、さらにより好ましくは６５～２００、特に１００～１５０アデノシン残基の長さを有するポリＡ配列が同時に存在するように改変することができる。特に好ましい実施形態では、ポリＡ配列は、約１２０アデノシン残基の長さを有する。本発明に従って使用されるＲＮＡの安定性および／または発現をさらに増加させるために、ポリＡ配列は非遮蔽であり得る。

一部の実施形態では、ポリＡ尾部は、コード鎖に相補的な鎖中の反復ｄＴヌクレオチド（デオキシチミジレート）を含むＤＮＡ鋳型に基づいて、ＲＮＡ転写中、例えば、インビトロ転写されたＲＮＡの調製中に連結される。ポリＡ尾部をコードするＤＮＡ配列（コード鎖）は、ポリ（Ａ）カセットと称される。

一部の実施形態では、ＤＮＡのコード鎖中に存在するポリ（Ａ）カセットは、本質的にｄＡヌクレオチドからなるが、４種類のヌクレオチド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、およびｄＴ）のランダム配列により中断される。そのようなランダム配列は、５～５０、１０～３０、または１０～２０ヌクレオチド長であり得る。そのようなカセットは、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６／００５３２４Ａ１に開示される。ＷＯ２０１６／００５３２４Ａ１に開示されるいずれかのポリ（Ａ）カセットを、本発明において使用することができる。本質的にｄＡヌクレオチドからなるが、４種類のヌクレオチド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴ）の均等な分布を有し、例えば、５～５０ヌクレオチドの長さを有するランダム配列により中断されるポリ（Ａ）カセットは、ＤＮＡレベルで、大腸菌においてプラスミドＤＮＡの一定の増殖を示し、ＲＮＡレベルでは、ＲＮＡ安定性を支持することに関して有益な特性を未だ伴い、翻訳効率がもたらされる。結果として、一部の実施形態では、本明細書に記載されるＲＮＡ分子に含まれるポリＡ尾部は、本質的にＡヌクレオチドからなるが、４種類のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）のランダム配列により中断される。そのようなランダム配列は、５～５０、１０～３０、または１０～２０ヌクレオチド長であり得る。一実施形態では、ポリ（Ａ）カセットは、３０個のアデニンヌクレオチド、リンカー（Ｌ）およびさらに７０個のアデニンヌクレオチドを含むかまたはからなり、本明細書で「Ａ３０ＬＡ７０」ポリ（Ａ）尾部とも称される（配列表の配列番号１０３に例示される通り）。

抗ＰＤ－１抗体の重鎖を生成するためのＲＮＡは、以下の構造を有することができる：
（ｉ）５’－キャップ－５’－ＵＴＲ－「Ｋｏｚａｃ配列」－重鎖可変領域をコードする核酸配列－重鎖定常領域をコードする核酸配列－３’－ＵＴＲ－ポリ（Ａ）尾部；または
（ｉｉ）５’－キャップ－５’－ＵＴＲ－「Ｋｏｚａｃ配列」－分泌シグナルペプチド－重鎖可変領域をコードする核酸配列－重鎖定常領域をコードする核酸配列－３’－ＵＴＲ－ポリ（Ａ）尾部。

抗ＰＤ－１抗体の軽鎖を生成するためのＲＮＡは、以下の構造を有することができる：
（ｉ）５’－キャップ－５’－ＵＴＲ－「Ｋｏｚａｃ配列」－軽鎖可変領域をコードする核酸配列－軽鎖定常領域をコードする核酸配列－３’－ＵＴＲ－ポリ（Ａ）尾部；または
（ｉｉ）５’－キャップ－５’－ＵＴＲ－「Ｋｏｚａｃ配列」－分泌シグナルペプチド－軽鎖可変領域をコードする核酸配列－軽鎖定常領域をコードする核酸配列－３’－ＵＴＲ－ポリ（Ａ）尾部。

個別のエレメントの好ましい実施形態は、本明細書で上記において記載される通りである。例えば、３’－ＵＴＲはＦＩエレメントであり得、ポリ（Ａ）尾部はＡ３０ＬＡ７０エレメントであり得る。

この文脈において、「本質的に～からなる」とは、ポリＡ尾部中の大多数のヌクレオチド、典型的にはポリＡ尾部中のヌクレオチドの個数基準で少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％がＡヌクレオチドであることを意味するが、残余のヌクレオチドがＵヌクレオチド（ウリジレート）、Ｇヌクレオチド（グアニレート）、またはＣヌクレオチド（シチジレート）などのＡヌクレオチド以外のヌクレオチドであることを許容する。この文脈において、「からなる」とは、ポリＡ尾部中のすべてのヌクレオチド、すなわち、ポリＡ尾部中のヌクレオチドの個数基準で１００％がＡヌクレオチドであることを意味する。用語「Ａヌクレオチド」または「Ａ」とは、アデニレートを意味する。

一部の実施形態では、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドはその３’末端でポリＡ尾部に隣接せず、すなわち、ポリＡ尾部は遮蔽されていないか、またはＡ以外のヌクレオチドがその３’末端で後に続かない。

一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡは、ポリＡ尾部を含む。一部の実施形態では、各ＲＮＡは、ポリＡ尾部を含む。一部の実施形態では、ポリＡ尾部は、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも８０、または少なくとも１００および最大５００、最大４００、最大３００、最大２００、または最大１５０ヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、ポリＡ尾部は、本質的に少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも８０、または少なくとも１００および最大５００、最大４００、最大３００、最大２００、または最大１５０ヌクレオチドからなることができる。一部の実施形態では、ポリＡ尾部は、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも８０、または少なくとも１００および最大５００、最大４００、最大３００、最大２００、または最大１５０ヌクレオチドからなることができる。一部の実施形態では、ポリＡ尾部は、少なくとも１００ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリＡ尾部は、約１５０ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリＡ尾部は、約１２０ヌクレオチドを含む。

加えて、ＲＮＡ分子の３’－非翻訳領域への３’－非翻訳領域（ＵＴＲ）の組み込みは、翻訳効率の強化をもたらし得る。そのような３’－非翻訳領域のうちの２つ以上を組み込むことにより、相乗作用を達成することができる。３’－非翻訳領域は、それらが導入されるＲＮＡに対して自家または異種であり得る。１つの特定の実施形態では、３’－非翻訳領域は、ヒトβ－グロビン遺伝子から誘導される。

上記の改変の組み合わせ、すなわち、ポリＡ配列の組み込み、ポリＡ配列の非遮蔽化および１つまたは複数の３’－非翻訳領域の組み込みは、ＲＮＡの安定性および翻訳効率の増加に対して、相乗的な影響を有する。

ＲＮＡの用語「安定性」は、ＲＮＡの「半減期」に関する。「半減期」は、分子の活性、量、または数の半分が消失するために必要とされる期間に関する。本発明の文脈において、ＲＮＡの半減期は、前記ＲＮＡの安定性に対する指標である。ＲＮＡの半減期は、ＲＮＡの「発現の持続時間」に影響を及ぼし得る。長い半減期を有するＲＮＡが長期間にわたって発現されるであろうことを予期することができる。

当然、本発明に従って、ＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を減少させることが望ましい場合、ＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を増加させる上記の通りのエレメントの機能に干渉するように、ＲＮＡを改変することが可能である。

用語「発現」は、その最も一般的な意味で本発明に従って使用され、例えば、転写および／または翻訳による、ＲＮＡおよび／またはペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質の生成を含む。ＲＮＡに関して、用語「発現」または「翻訳」は、特に、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の生成に関する。この用語は、核酸の部分的な発現も含む。さらに、発現は、一時的または安定的であり得る。本発明に従えば、ＰＤ－１抗体に対して特異的に結合する抗体を使用する技術などのタンパク質検出のための従来的な技術により、抗体を細胞またはその溶解物中で検出できる場合、抗体は細胞中で発現されている。

本発明の文脈において、用語「転写」は、ＤＮＡ配列中の遺伝的コードがＲＮＡへと転写されるプロセスに関する。その後、ＲＮＡはタンパク質へと翻訳される場合がある。本発明に従えば、用語「転写」は、「インビトロ転写」を含み、用語「インビトロ転写」は、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡが、好ましくは適切な細胞抽出物を使用して、無細胞システムにおいてインビトロ合成されるプロセスに関する。好ましくは、クローニングベクターが、転写産物の生成のために適用される。これらのクローニングベクターは、一般的に、転写ベクターと表され、本発明に従えば、用語「ベクター」により包含される。本発明に従えば、本発明において使用されるＲＮＡは、好ましくはインビトロ転写されたＲＮＡ（ＩＶＴ－ＲＮＡ）であり、適切なＤＮＡ鋳型のインビトロ転写により取得することができる。転写を制御するためのプロモーターは、いずれかのＲＮＡポリメラーゼに対するいずれかのプロモーターであり得る。ＲＮＡポリメラーゼの特定の例は、Ｔ７、Ｔ３、およびＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼである。好ましくは、本発明に従うインビトロ転写は、Ｔ７またはＳＰ６プロモーターにより制御される。インビトロ転写のためのＤＮＡ鋳型は、核酸、特にｃＤＮＡのクローニング、およびインビトロ転写のための適切なベクターへとそれを導入することにより、取得することができる。ｃＤＮＡは、ＲＮＡの逆転写により取得することができる。

用語「翻訳」は、本発明に従えば、メッセンジャーＲＮＡの鎖がアミノ酸の配列のアセンブリーへと向かい、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を生じる、細胞のリボソーム中のプロセスに関する。

本発明に従えば、核酸と機能的に連結されていることができる発現制御配列または調節配列は、核酸に関して同種または異種であり得る。コード配列および調節配列は、コード配列の転写または翻訳が調節配列の制御下または影響下にあるように共有的に一緒に結合されている場合、「機能的に」一緒に連結されている。調節配列とコード配列との機能的連結を伴って、コード配列が機能的タンパク質へと翻訳される予定である場合、調節配列の誘導は、コード配列のリーディングフレームシフトまたは所望のタンパク質もしくはペプチドへとコード配列が翻訳できないことを引き起こすことなく、コード配列の転写をもたらす。

用語「発現制御配列」または「調節配列」は、本発明に従えば、プロモーター、リボソーム結合性配列および核酸の転写または誘導されるＲＮＡの翻訳を制御する他の制御エレメントを含む。本発明のある特定の実施形態では、調節配列は、制御され得る。調節配列の正確な構造は、種または細胞タイプに応じて変化し得るが、一般的に、転写または翻訳の開始に関与する、５’－非転写配列ならびに５’－および３’－非翻訳配列、例えば、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などを含む。特に、５’－非転写調節配列は、機能的に結合された遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。調節配列はまた、エンハンサー配列または上流活性化因子配列も含むことができる。

好ましくは、本発明に従えば、細胞において発現される対象のＲＮＡが、前記細胞へと導入される。本発明に従う方法の一実施形態では、細胞へと導入されるＲＮＡは、適切なＤＮＡ鋳型のインビトロ転写により取得することができる。

本発明に従えば、「発現することが可能なＲＮＡ」および「コードするＲＮＡ」などの用語は、本明細書で相互に交換可能に使用され、特定のペプチドまたはポリペプチドに関して、適切な環境中、好ましくは細胞内に存在する場合、ＲＮＡが、発現されて前記ペプチドまたはポリペプチドを産生することができることを意味する。好ましくは、本発明に従うＲＮＡは、細胞の翻訳機構と相互作用して、発現することが可能なペプチドまたはポリペプチドをもたらすことができる。

「移入すること」、「導入すること」または「トランスフェクションすること」などの用語は、本明細書で相互に交換可能に使用され、細胞への核酸、特に外来性または異種核酸、特にＲＮＡの導入に関する。本発明に従えば、細胞は、器官、組織および／または生物の一部分を形成することができる。本発明に従えば、核酸の投与は、裸の核酸としてまたは投与試薬と組み合わせるかのいずれかで達成される。好ましくは、核酸の投与は、裸の核酸の形態でのものである。好ましくは、ＲＮＡは、ＲＮアーゼ阻害剤などの安定化物質と組み合わせて投与される。本発明はまた、長期間にわたって持続する発現を可能にするための、細胞への核酸の繰り返される導入も想定する。

細胞は、例えば、ＲＮＡとの複合体を形成するかまたはその中にＲＮＡが取り囲まれるかもしくは封入されるベシクルを形成し、裸のＲＮＡと比較してＲＮＡの安定性の増大をもたらすことにより、核酸、例えば、ＲＮＡがそれに伴ういずれかの担体と共にトランスフェクションされ得る。本発明に従って有用な担体としては、例えば、脂質含有担体、例えば、カチオン性脂質、リポソーム、特にカチオン性リポソーム、およびミセル、およびナノ粒子、例えば、リポプレックス粒子が挙げられる。カチオン性脂質は、負に荷電した核酸と複合体を形成することができる。いずれかのカチオン性脂質を、本発明に従って使用することができる。

トランスフェクションすることができる細胞はまた、組換えになるであろう宿主細胞も含む。用語「組換え宿主細胞」は、本明細書で使用される場合、組換え発現ベクターが導入されている細胞を意味することが意図される。そのような用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫も指すことが意図されることを理解されたい。ある特定の改変が突然変異または環境的影響のいずれかに起因して後続の世代において起こり得るので、そのような子孫は、実際には、親細胞とは同一でない場合があるが、それでも本明細書で使用する場合の用語「組換え宿主細胞」の範囲内に含められる。宿主細胞および組換え宿主細胞としては、例えば、トランスフェクトーマ、例えば、ＣＨＯ細胞、ＮＳ／０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞、およびリンパ球細胞が挙げられる。

本明細書に規定される通りの抗体を産生するために使用される宿主細胞は、市販（ｃｏｍｍｅｒｉａｌｙａｖａｉｌａｂｌｅ）であり、当業者に周知の様々な培地中で培養することができる。これらの培地のうちのいずれかには、必要な場合、ホルモンおよび／または他の増殖因子を添加することができる。

本開示のある特定の実施形態では、本明細書に記載されるＲＮＡは、ＲＮＡリポプレックス粒子中に存在することができる。本明細書に記載されるＲＮＡリポプレックス粒子およびＲＮＡリポプレックス粒子を含む組成物は、非経口投与後の、特に静脈内投与後の、標的組織へのＲＮＡのデリバリーのために有用である。ＲＮＡリポプレックス粒子は、水または好適な水相へとエタノール中の脂質の溶液を注入することにより取得することができるリポソームを使用して調製することができる。一実施形態では、水相は、酸性ｐＨを有する。一実施形態では、水相は、例えば、約５ｍＭの量で、酢酸を含む。一実施形態では、リポソームおよびＲＮＡリポプレックス粒子は、少なくとも１種のカチオン性脂質および少なくとも１種の追加の脂質を含む。一実施形態では、少なくとも１種のカチオン性脂質は、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）および／または１，２－ジオレイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）を含む。一実施形態では、少なくとも１種の追加の脂質は、１，２－ジ－（９Ｚ－オクタデセノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）および／または１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）を含む。一実施形態では、少なくとも１種のカチオン性脂質は１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）を含み、少なくとも１種の追加の脂質は１，２－ジ－（９Ｚ－オクタデセノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む。一実施形態では、リポソームおよびＲＮＡリポプレックス粒子は、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）および１，２－ジ－（９Ｚ－オクタデセノニル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む。リポソームは、リポソームをＲＮＡと混合することにより、ＲＮＡリポプレックス粒子を調製するために使用することができる。

ＲＮＡリポプレックス粒子は、一実施形態では、約２００ｎｍ～約１０００ｎｍ、約２００ｎｍ～約８００ｎｍ、約２５０～約７００ｎｍ、約４００～約６００ｎｍ、約３００ｎｍ～約５００ｎｍまたは約３５０ｎｍ～約４００ｎｍの範囲である平均直径を有することができる。１つの実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約２５０ｎｍ～約７００ｎｍの範囲である平均直径を有する。別の実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約３００ｎｍ～約５００ｎｍの範囲である平均直径を有する。例示的な実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約４００ｎｍの平均直径を有する。

ＲＮＡリポプレックス粒子は、約０．５未満、約０．４未満、または約０．３未満の多分散性指数を示すことができる。例として、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約０．１～約０．３の範囲の多分散性指数を示すことができる。

脂質溶液、リポソームおよびＲＮＡリポプレックス粒子は、カチオン性脂質を含むことができる。本明細書で使用される場合、「カチオン性脂質」とは、正味の正電荷を有する脂質を意味する。カチオン性脂質は、脂質マトリックスに対する静電相互作用により、負に荷電したＲＮＡに結合する。一般的に、カチオン性脂質は、ステロール、アシル鎖またはジアシル鎖などの脂溶性部分を保有し、脂質の頭部基は、典型的には正電荷を担持する。カチオン性脂質の例としては、限定するものではないが、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）；１，２－ジオレイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＤＡＰ）；１，２－ジアシルオキシ－３－ジメチルアンモニウムプロパン；１，２－ジアルキルオキシ－３－ジメチルアンモニウムプロパン；ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、２，３－ジ（テトラデコキシ）プロピル－（２－ヒドロキシエチル）－ジメチルアザニウム（ＤＭＲＩＥ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＭＥＰＣ）、ｌ，２－ジミリストイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、１，２－ジオレイルオキシプロピル－３－ジメチル－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）、および２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－ｌ－プロパナミウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）が挙げられる。ＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＤＡＣ、およびＤＯＳＰＡが好ましい。具体的な実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＯＴＭＡおよび／またはＤＯＴＡＰである。

追加の脂質を、ＲＮＡリポプレックス粒子の全体的な正－負電荷比率および物理的安定性を調整するために組み込むことができる。ある特定の実施形態では、追加の脂質は、中性脂質である。本明細書で使用される場合、「中性脂質」とは、ゼロの正味電荷を有する脂質を意味する。中性脂質の例としては、限定するものではないが、１，２－ジ－（９Ｚ－オクタデセノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン（ｓｐｈｉｎｇｏｅｍｙｅｌｉｎ）、セファリン、コレステロール、およびセレブロシドが挙げられる。具体的な実施形態では、追加の脂質は、ＤＯＰＥ、コレステロールおよび／またはＤＯＰＣである。

ある特定の実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、カチオン性脂質および追加の脂質の両方を含む。例示的な実施形態では、カチオン性脂質はＤＯＴＭＡであり、追加の脂質はＤＯＰＥである。理論に拘泥することを望まないが、少なくとも１種の追加の脂質の量と比較した少なくとも１種のカチオン性脂質の量は、電荷、粒径、安定性、組織選択性、およびＲＮＡの生体活性などの重要なＲＮＡリポプレックス粒子特性に影響を及ぼし得る。したがって、一部の実施形態では、少なくとも１種のカチオン性脂質と少なくとも１種の追加の脂質とのモル比は、約１０：０～約１：９、約４：１～約１：２、または約３：１～約１：１である。具体的な実施形態では、モル比は、約３：１、約２．７５：１、約２．５：１、約２．２５：１、約２：１、約１．７５：１、約１．５：１、約１．２５：１、または約１：１であり得る。例示的な実施形態では、少なくとも１種のカチオン性脂質と少なくとも１種の追加の脂質とのモル比は、約２：１である。

ＲＮＡリポプレックス粒子の電荷は、少なくとも１種のカチオン性脂質中に存在する電荷とＲＮＡ中に存在する電荷との合計である。電荷比は、少なくとも１種のカチオン性脂質中に存在する正電荷とＲＮＡ中に存在する負電荷との比率である。少なくとも１種のカチオン性脂質中に存在する正電荷とＲＮＡ中に存在する負電荷との電荷比は、以下の方程式により算出される：電荷比＝［（カチオン性脂質濃度（ｍｏｌ））×（カチオン性脂質中の正電荷の総数）］／［（ＲＮＡ濃度（ｍｏｌ））×（ＲＮＡ中の負電荷の総数）］。ＲＮＡの濃度および少なくとも１種のカチオン性脂質の量は、当業者により従来の方法を使用して決定することができる。一実施形態では、生理的ｐＨにおいて、ＲＮＡリポプレックス粒子中の正電荷と負電荷との電荷比は、約１．６：２～約１：２、または約１．６：２～約１．１：２である。具体的な実施形態では、生理的ｐＨにおけるＲＮＡリポプレックス粒子中の正電荷と負電荷との電荷比は、約１．６：２．０、約１．５：２．０、約１．４：２．０、約１．３：２．０、約１．２：２．０、約１．１：２．０、または約１：２．０である。

ＲＮＡリポプレックス粒子は、例えば、エタノール注入技術を使用することにより、例えば、ＲＮＡをリポソームまたは少なくとも１種のカチオン性脂質と混合することにより、取得することができる。取得される組成物は、本発明に従えば、塩化ナトリウムなどの塩を含むことができる。理論に拘泥することを望まないが、塩化ナトリウムは、少なくとも１種のカチオン性脂質との混合に先立って、ＲＮＡを予め調整するためのイオン浸透圧剤として機能する。ある特定の実施形態は、本開示中の塩化ナトリウムに対する代替的な有機または無機塩を企図する。代替的な塩としては、限定するものではないが、塩化カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一カリウム、酢酸カリウム、炭酸水素カリウム、硫酸カリウム、酢酸カリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一ナトリウム、酢酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、硫酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化リチウム、塩化マグネシウム、リン酸マグネシウム、塩化カルシウム、およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のナトリウム塩が挙げられる。

一般的に、ＲＮＡリポプレックス粒子を含む組成物は、好ましくは０ｍＭ～約５００ｍＭ、約５ｍＭ～約４００ｍＭ、または約１０ｍＭ～約３００ｍＭの範囲である濃度で塩化ナトリウムを含むことができる。一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子を含む組成物は、そのような塩化ナトリウム濃度に対応するイオン強度を含む。

用語「イオン強度」とは、特定の溶液中の異なる種類のイオン種の数とそれらのそれぞれの電荷との間の数学的関係を意味する。したがって、イオン強度Ｉは、以下の式：

［式中、ｃは特定のイオン種の濃度であり、ｚはその電荷の絶対値である］により数学的に表される。合計Σは、溶液中のすべての異なる種類のイオン（ｉ）にわたって取得される。

本開示に従えば、用語「イオン強度」は、一実施形態では、一価イオンの存在に関する。二価イオンの存在に関して、特定の二価カチオンにおいては、それらの濃度またはキレート剤の存在に起因する有効濃度（遊離イオンの存在）は、一実施形態では、ＲＮＡの分解を妨げるように、十分に低い。一実施形態では、二価イオンの濃度または有効濃度は、ＲＮＡヌクレオチド間のホスホジエステル結合の加水分解に対する触媒的レベル未満である。一実施形態では、遊離二価イオンの濃度は、２０μＭ以下である。一実施形態では、遊離二価イオンはないか、または本質的にない。

これらの組成物は、代替的にまたは加えて、生成物品質の実質的な喪失および特に凍結、凍結乾燥、噴霧乾燥または保存、例えば、凍結、凍結乾燥もしくは噴霧乾燥組成物の保存中のＲＮＡ活性の実質的な喪失を回避するために、安定化剤を含むことができる。凍結乾燥または噴霧乾燥組成物は、使用前に再構成することができる。１つの実施形態では、安定化剤は、炭水化物である。用語「炭水化物」とは、本明細書で使用される場合、単糖、二糖、三糖、オリゴ糖、および多糖を意味し、かつこれらを包含する。本開示の実施形態では、安定化剤は、マンノース、グルコース、スクロースまたはトレハロースである。本発明に従えば、ＲＮＡリポプレックス粒子組成物は、組成物の安定性に対して、特にＲＮＡリポプレックス粒子の安定性およびＲＮＡの安定性に対して好適な安定化剤濃度を有することができる。

用語「凍結すること」は、通常は熱の除去を伴う、液体の固化に関する。

用語「凍結乾燥すること」または「凍結乾燥」とは、物質を凍結させ、続いて周囲圧を低減させて、物質中の凍結媒体が固相から気相へと直接的に昇華することを可能にすることによる、物質の凍結－乾燥を意味する。

用語「噴霧乾燥」とは、（加熱）気体を容器（噴霧乾燥器）内で霧化（噴霧）される流体と混合し、形成された液滴からの溶媒が蒸発し、乾燥粉末を生じることにより、物質を噴霧乾燥することを意味する。

用語「再構成する」は、その元の液体状態などの液体状態へと乾燥生成物を戻すために、乾燥生成物に水などの溶媒を添加することに関する。

本発明に従えば、ＲＮＡリポプレックス粒子組成物は、ＲＮＡリポプレックス粒子の安定性に対して、および特にＲＮＡの安定性に対して好適なｐＨを有し得る。一実施形態では、本明細書に記載されるＲＮＡリポプレックス粒子組成物は、約５．５～約７．５のｐＨを有する。

本発明に従えば、組成物は、少なくとも１種の緩衝剤を含むことができる。理論に拘泥することを望まないが、緩衝剤の使用は、組成物の製造、保存および使用中の組成物のｐＨを維持する。本発明のある特定の実施形態では、緩衝剤は、炭酸水素ナトリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、［トリス（ヒドロキシメチル）メチル－アミノ］プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、２－（ビス（２－ヒドロキシエチル）アミノ）酢酸（ビシン）、２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－１，３－ジオール（トリス）、Ｎ－（２－ヒドロキシ－１，１－ビス（ヒドロキシ－メチル）エチル）グリシン（トリシン）、３－［［１，３－ジヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－２－イル］アミノ］－２－ヒドロキシプロパン－１－スルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２－［［１，３－ジヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－２－イル］アミノ］エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、１，４－ピペラジンジエタンスルホン酸（ＰＩＰＥＳ）、ジメチルアルシン酸、２－ホルホリン－４－イルエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３－モルホリノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）であり得る。他の好適な緩衝剤は、塩形態の酢酸、塩形態のクエン酸、塩形態のホウ酸および塩形態のリン酸であり得る。一実施形態では、緩衝剤はＨＥＰＥＳである。一実施形態では、緩衝剤は、約２．５ｍＭ～約１５ｍＭの濃度を有する。

本発明のある特定の実施形態では、キレート剤の使用を企図する。キレート剤とは、金属イオンとの少なくとも２つの配位共有結合を形成し、それにより安定な水溶性錯体を生成することが可能である化合物を意味する。理論に拘泥することを望まないが、キレート剤は、そうでなければ加速されたＲＮＡ分解を誘導し得る遊離二価イオンの濃度を低減させる。好適なキレート剤の例としては、限定するものではないが、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ＥＤＴＡの塩、デスフェリオキサミン（ｄｅｓｆｅｒｒｉｏｘａｍｉｎｅ）Ｂ、デフェロキサミン（ｄｅｆｅｒｏｘａｍｉｎｅ）、ジチオカルブナトリウム、ペニシラミン、ペンテト酸カルシウム、ペンテト酸のナトリウム塩、サクシマー、トリエンチン、ニトリロ三酢酸、ｔｒａｎｓ－ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＤＣＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ビス（アミノエチル）グリコールエーテル－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸、イミノ二酢酸、クエン酸、酒石酸、フマル酸、またはその塩が挙げられる。ある特定の実施形態では、キレート剤はＥＤＴＡまたはＥＤＴＡの塩である。例示的な実施形態では、キレート剤は、ＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物である。一部の実施形態では、ＥＤＴＡは、約０．０５ｍＭ～約５ｍＭの濃度である。

ＲＮＡリポプレックス粒子を含む組成物は、液体または固体中にあり得る。固体の非限定的な例としては、凍結形態または凍結乾燥形態が挙げられる。好ましい実施形態では、組成物は液体である。

リポプレックス粒子として提供される場合、抗体をコードするＲＮＡは、約４：１～約１６：１、約６：１～約１４：１、約８：１～約１２：１、または約１０：１の比率で、免疫学的寛容を破壊するアミノ酸配列をコードするＲＮＡと共に、リポプレックス粒子などの粒子として共製剤化される。

本開示の文脈において、用語「粒子」は、分子または分子複合体により形成される構造化された実体に関する。一実施形態では、用語「粒子」は、マイクロ－またはナノサイズのコンパクトな構造などのマイクロまたはナノサイズ構造に関する。

本開示の文脈において、用語「ＲＮＡリポプレックス粒子」は、脂質、特にカチオン性脂質およびＲＮＡを含有する粒子に関する。正に荷電したリポソームと負に荷電したＲＮＡとの間の静電相互作用は、複合体化およびＲＮＡリポプレックス粒子の自発的形成をもたらす。正に荷電したリポソームは、一般的に、ＤＯＴＭＡなどのカチオン性脂質、およびＤＯＰＥなどの追加の脂質を使用して合成することができる。一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、ナノ粒子である。

本開示中で使用する場合、「ナノ粒子」とは、ＲＮＡおよび少なくとも１種のカチオン性脂質を含み、静脈内投与に対して好適な平均直径を有する粒子を意味する。

用語「平均直径」とは、長さの次元を伴ういわゆるＺａｖｅｒａｇｅ、および無次元である多分散性指数（ＰＩ）を結果として提供する、いわゆるキュムラントアルゴリズムを使用するデータ解析を伴う、動的光散乱（ＤＬＳ）により測定される通りの粒子の平均流体力学直径を意味する（Koppel, D., J. Chem. Phys. 57, 1972, pp 4814-4820, ISO 13321）。ここで、粒子に関する「平均直径」、「直径」または「サイズ」は、Ｚａｖｅｒａｇｅのこの値と同義的に使用される。

用語「多分散性指数」は、粒子、例えば、ナノ粒子の集合体のサイズ分布の尺度として、本明細書で使用される。多分散性指数は、いわゆるキュムラント解析による動的光散乱測定に基づいて算出される。

用語「エタノール注入技術」とは、脂質を含むエタノール溶液が、針を通して水溶液へと迅速に注入されるプロセスを意味する。この動作は、脂質を溶液全体に分散させ、脂質構造体形成、例えば、リポソーム形成などの脂質ベシクル形成を促進する。一般的に、本明細書に記載されるＲＮＡリポプレックス粒子は、ＲＮＡをコロイド状リポソーム分散物へと添加することにより取得可能である。エタノール注入技術を使用して、そのようなコロイド状リポソーム分散物は、一実施形態では、以下の通りに形成される：脂質、例えば、ＤＯＴＭＡなどのカチオン性脂質および追加の脂質を含むエタノール溶液を、攪拌下で水溶液へと注入する。一実施形態では、本明細書に記載されるＲＮＡリポプレックス粒子は、押し出しの工程を伴わずに取得可能である。

用語「押し出すこと」または「押し出し」とは、固定された断面プロファイルを有する粒子の作製を意味する。特に、この用語は、それにより粒子が所定の孔を有するフィルターを通して押し出される、粒子の小型化を意味する。

例えば、本発明に従う脂質含有担体、例えば、カチオン性脂質、リポソーム、特にカチオン性リポソーム、およびミセル、およびナノ粒子、例えば、リポプレックス粒子を含む担体を使用することにより核酸を提供／投与することの代わりに、目的の核酸は、組換え宿主細胞、好ましくは上記で特定される通りのもの、または抗体もしくは抗体から誘導される抗体断片をコードする組換えウイルスを使用することによっても、提供／投与することができる。

これらのウイルスは、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスであり得る。数種類のウイルスベクターが、悪性疾患の免疫療法を強化するためのそれらの潜在能力に関して、有望な結果を示してきた。複製能を有するウイルスおよび複製能を有しないウイルスを使用することができ、後者の群が好ましい。ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ワクシニア、レオウイルス、およびニューカッスル病ウイルスが、本発明に従って有用な好ましいウイルスの例である。一実施形態では、ウイルスまたはウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルスおよび弱毒化ポックスウイルスを含むポックスウイルス、セムリキ森林ウイルス、レオウイルス、レトロウイルス、ニューカッスル病ウイルス、シンドビスウイルスおよびＴｙウイルス様粒子からなる群から選択される。アデノウイルスおよびレトロウイルスが特に好ましい。レトロウイルスは、典型的には、複製欠損である（すなわち、感染性粒子を生成することが不可能である）。

インビトロまたはインビボで細胞へと核酸を導入する方法は、核酸リン酸カルシウム沈殿物のトランスフェクション、ＤＥＡＥを伴う核酸のトランスフェクション、目的の核酸を担持する上記のウイルスを用いるトランスフェクションまたは感染、リポソーム媒介トランスフェクションなどを含む。特定の実施形態では、特定の細胞へと核酸を仕向けることが好ましい。そのような実施形態では、細胞へと核酸を投与するために使用される担体（例えば、レトロウイルスまたはリポソーム）は、結合した標的制御分子を有することができる。例えば、標的細胞上の表面膜タンパク質または標的細胞上の受容体に対するリガンドに対して特異的な抗体などの分子を、核酸担体に組み込むか、または核酸担体に結合することができる。好ましい抗体は、腫瘍抗原に選択的に結合する抗体を含む。リポソームを介した核酸の投与が望ましい場合、標的制御および／または取り込みを可能にするために、エンドサイトーシスに関連する表面膜タンパク質に結合するタンパク質を、リポソーム製剤中に組み込むことができる。そのようなタンパク質は、特定の細胞タイプに対して特異的なカプシドタンパク質またはその断片、内在化するタンパク質に対する抗体、細胞内部位へと向かうタンパク質などを含む。

好ましくは、ペプチドまたはポリペプチドをコードするＲＮＡの、細胞への、特にインビボにおいて存在する細胞への導入は、細胞中での前記ペプチドまたはポリペプチドの発現をもたらす。特定の実施形態では、特定の細胞への核酸の標的化が好ましい。そのような実施形態では、細胞への核酸の投与に対して適用される担体（例えば、レトロウイルスまたはリポソーム）は、標的化分子を示す。例えば、標的細胞上の表面膜タンパク質または標的細胞上の受容体に対するリガンドに対して特異的な抗体などの分子を、核酸担体へと組み込むことができるか、またはこれらに結合させることができる。核酸がリポソームにより投与される場合、エンドサイトーシスに関連する表面膜タンパク質に結合するタンパク質を、標的化および／または取り込みを可能にするために、リポソーム製剤へと組み込むことができる。そのようなタンパク質は、特定の細胞タイプに対して特異的なカプシドタンパク質またはその断片、内在化されるタンパク質に対する抗体、細胞内局在を標的とするタンパク質などを包含する。

本明細書で別途示されるかまたは文脈により明らかに矛盾しない限り、本明細書の項目ＶＩの下での抗体をコードする核酸に関して提供される教示は、抗原のエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードする核酸／ポリヌクレオチドに対して相応に適用可能である。抗原提示細胞においてＲＮＡを発現させるために有益に使用することができる脾臓標的化ＲＮＡリポプレックス粒子は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３／１４３６８３に記載される。

本明細書に提供される通りの、抗ＰＤ－１抗体を生成するための核酸またはベクター（ＲＮＡまたはＲＮＡに基づくベクターなど）は、インビトロ転写方法により生成することができる。

そのような方法は、標準的なクローニング技術を使用してＩＶＴベクター（例えば、ｐＳＴ４ベクター）へと、適宜（ｏｔｉｏｎａｌｌｙ）免疫グロブリン定常部分のＮ末端に、上記で規定される通りの重鎖可変領域（ＶＨ）または軽鎖可変領域（ＶＬ）のＤＮＡ配列（例えば、配列表の配列番号７４～９２）を挿入する工程を含む。ベクターは、本明細書に規定される通りの５’－ＵＴＲ、本明細書に規定される通りの３’－ＵＴＲ、例えば、ＦＩエレメント、上記で本明細書に規定される通りのポリ（Ａ）尾部、例えば、３０個のアデニンヌクレオチド、リンカー（Ｌ）およびさらなる配列から構成されるポリ（Ａ）尾部（Ａ３０ＬＡ７０）を含むことができる。加えて、ＩＶＴベクターは、分泌シグナルペプチド、例えば、本明細書に規定される通りの分泌シグナルペプチドをコードする（ｅｎｃｏｓｄｉｎｇｆｏｒ）核酸配列を含んでもよい。

インビトロ転写のための鋳型を生成するために、プラスミドＤＮＡを、例えば、制限エンドヌクレアーゼを使用して、ポリ（Ａ）尾部コード領域の下流で直線化し、それにより、例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを使用することにより、ｍＲＮＡを転写するために鋳型を生成することができる。

インビトロ転写の間、ＲＮＡは、免疫原性を最小化するために改変することができ、ＲＮＡは、その５’末端でキャッピングすることができる。

そのように取得される、キャッピングされていてもよいＲＮＡが、宿主細胞、例えば、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞またはその誘導体、例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｔ／１７および／またはＨＥＫ２９３Ｆ、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞および／またはＨｅＬａ細胞をトランスフェクションするために使用される。一実施形態では、哺乳動物宿主細胞は、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔおよび／またはＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞から選択される。トランスフェクションのために、例えば、上記で本明細書に記載される通りのリポソームを使用することができる。

トランスフェクションされた細胞が、抗体もしくは抗体鎖またはその断片を発現させるために使用される。抗ＰＤ－１抗体のＨ鎖およびＬ鎖の両方を発現するために、宿主細胞は、抗ＰＤ－１抗体のＨ鎖およびＬ鎖をそれぞれコードする両方のタイプのＲＮＡ、すなわち、個別のＲＮＡを用いて、好ましくはトランスフェクションされる。

抗ＰＤ－１抗体は、細胞内的に、細胞周囲腔中に産生され得るか、または培地へと直接的に分泌され得る。抗体は細胞内的に産生される場合、細胞をその後に溶解させることができ、細胞片は、例えば、遠心分離または限外ろ過により、除去されるべきである。当業者は、細胞内的に産生された抗体を単離するための好適な方法に精通している。細胞周囲腔へと分泌される抗体を単離するための方法について、同じことが言える。例えば、分泌（ｓｅｃｒｅｔｏｔｙ）シグナルペプチドを使用することにより、抗体が培地中へと分泌される場合、そのような発現系由来の上清を、例えば、市販のタンパク質濃縮フィルターを使用することにより、最初に濃縮することができる。プロテアーゼ阻害剤、例えば、ＰＭＳＦを、タンパク質分解を阻害するための上述の工程のうちのいずれかに含めることができ、抗生物質を、汚染物質の成長を予防するために含めることができる。トランスフェクションされた宿主細胞から調製される抗ＰＤ－１抗体は、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動、フローサイトメトリーおよび／または透析などのクロマトグラフィーを使用することにより、精製することができる。

ＶＩＩ．医薬組成物
別の態様では、本発明は、コンジュゲートおよび／もしくはマルチマーを含む本発明の１つの抗体または抗体の組み合わせを含むか、かつ／あるいは前記核酸を含む宿主細胞もしくはベクターを含む本発明の抗体をコードする核酸配列を含む１つの核酸または核酸の組み合わせを含む組成物、例えば、医薬組成物を提供する。医薬組成物は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995に開示されるものなどの従来の技術に従って、薬学的に許容される担体または希釈剤ならびにいずれかの他の公知のアジュバントおよび賦形剤と共に、製剤化することができる。一実施形態では、組成物は、複数（例えば、２つ以上）の単離された抗体の組み合わせを含む。別の実施形態では、組成物は、複数（例えば、２つ以上）の核酸、ベクターまたは宿主細胞の組み合わせを含む。

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合するいずれかおよびすべての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗微生物剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを含む。好ましくは、担体は、心血管（例えば、静脈内または動脈内）、筋内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与（例えば、注入または輸液による）に対して好適である。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち、抗体、二重特異的および多重特異的分子、核酸、ベクターは、酸および化合物を不活性化する可能性がある他の天然条件の作用から化合物を保護するための材料中にコーティングされ得る。

「薬学的に許容される物質」とは、本化合物の所望の生物学的活性を保持し、いかなる望ましくない毒物学的作用も付与しない物質を意味する［例えば、Berge, S. M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66: 1-19を参照されたい］。

担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、生理食塩水および水性バッファー溶液、植物油、例えば、オリーブ油、および注入可能有機エステル、例えば、オレイン酸エチルならびにそれらの好適な混合物を含む溶媒または分散媒であり得る。適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用により、分散液の場合には必要とされる粒径の維持により、および界面活性剤の使用により、維持することができる。

本発明の担体または組成物はまた、薬学的に許容される塩を含むこともできる。含めることができる薬学的に許容される塩の例としては、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、無毒無機酸、例えば、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リンなどから、ならびに無毒有機酸、例えば、脂肪族モノカルボン酸およびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などから誘導されるものが挙げられる。塩基付加塩としては、アルカリ土類金属、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどから、ならびに無毒有機アミン、例えば、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ－メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどから誘導されるものが挙げられる。

本発明の組成物はまた、抗酸化剤を含むこともできる。薬学的に許容される抗酸化剤の例としては：（１）水溶性抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；（２）油溶性抗酸化剤、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ－トコフェロールなど；および（３）金属キレート剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが挙げられる。

本発明の組成物はまた、保存剤、湿潤化剤、乳化剤および分散化剤などのアジュバントを含有することもできる。微生物の存在の防止を、滅菌プロセス、ならびに様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの包含の両方により、確実にすることができる。等張化剤、例えば、糖、多価アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物中に含めることが望ましい場合もある。加えて、注入可能な医薬剤形の延長された吸収を、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンの包含によりもたらすことができる。

薬学的に許容される担体としては、無菌水溶液または分散液および無菌注入可能溶液または分散液の即時調製のための無菌粉末が挙げられる。薬学的に活性な物質に対するそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で公知である。いずれかの従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合性である場合を除いて、本発明の医薬組成物中でのその使用が企図される。補助的な活性化合物もまた、組成物中へと組み込むことができる。

医薬組成物は、典型的には、製造および保存の条件下で無菌かつ安定でなければならない。組成物は、液剤、マイクロエマルジョン剤、リポソーム、または高薬物濃度に対して好適な他の規則的構造として、製剤化することができる。

本発明の組成物は、当技術分野で公知の様々な方法により投与することができる。当業者により理解されるであろう通り、投与の経路および／または様式は、所望の結果に応じて変わるであろう。活性化合物は、迅速放出から化合物を保護するであろう担体、例えば、インプラント、経皮パッチ剤、および微小封入デリバリーシステムを含む徐放製剤を用いて調製することができる。生分解性生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸を使用することができる。そのような製剤の調製のための方法は、当業者に一般的に公知である。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照されたい。

ある特定の投与経路により本発明の化合物（例えば、抗体または核酸またはベクターまたは核酸もしくはベクターの組み合わせ）を投与するために、その不活性化を防止するための物質を用いて化合物をコーティングするか、またはそれと共に化合物を同時投与する必要がある場合がある。例えば、化合物は、適切な担体、例えば、リポソーム、または希釈剤中で対象へと投与することができる。薬学的に許容される希釈剤としては、生理食塩水および水性バッファー溶液が挙げられる。リポソームとしては、水中油中水ＣＧＦエマルジョンおよび従来のリポソームが挙げられる［Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7: 27］。

無菌注入可能溶液は、上記で列挙された成分のうちの１つまたは組み合わせを含む適切な溶媒中に必要量の活性化合物を組み込み、必要な場合、その後に滅菌精密ろ過することにより、調製することができる。

一般的に、分散物は、基本的な分散媒および上記で列挙された必要とされる他の成分を含有する無菌ベシクルへと、活性化合物を組み込むことにより調製される。無菌注入可能溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、その以前に滅菌ろ過された溶液から有効成分プラスいずれかの追加の所望の成分の粉末を生じる、真空乾燥および凍結－乾燥（凍結乾燥）である。

投与量レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療的応答）を提供するために調整される。例えば、単回ボーラスを投与することができるか、数回に分けられた用量を、経時的に投与することができるか、または用量を、治療状況の要求により示される通りに、比例的に低減もしくは増加させることができる。投与の容易さおよび投与量の均一性のために、単位投与剤形中に非経口組成物を製剤化することが、特に有利である。本明細書で使用される場合、単位投与剤形とは、治療される対象に対する単位的投与量として好適である物理的に分離した単位を意味し；各単位は、必要な薬学的担体と協働して所望の治療効果を生じるために算出された活性化合物の所定の量を含有する。本発明の単位投与剤形に対する仕様は、（ａ）活性化合物の固有の特性および達成される予定の特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体における感受性の治療に対するそのような活性化合物の配合の分野に内在する制限により指定され、かつ直接的にそれらに依存する。

本発明の医薬製剤としては、経口、鼻内、局所（頬内および舌下を含む）、直腸、膣内および／または非経口投与に対して好適なものが挙げられる。製剤は、単位投与剤形において便利に提示することができ、薬学の分野で公知のいずれかの方法により調製することができる。単一投与剤形を生成するための有効成分の量は、治療される対象、および特定の投与様式に応じて変わるであろう。単一投与剤形を生成するための有効成分の量は、一般的に、治療効果を生じる組成物の量であろう。

本発明の組成物の局所または経皮投与のための剤形としては、散剤、スプレー剤、軟膏剤、パスタ剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、液剤、パッチ剤および吸入剤が挙げられる。活性化合物は、無菌条件下で、薬学的に許容される担体、および必要であり得るいずれかの保存料または他のアジュバントもしくは賦形剤と混合することができる。

語句「非経口投与」および「非経口的に投与される」とは、本明細書で使用される場合、通常は注入による、腸内投与および局所投与以外の投与様式を意味し、限定するものではないが、静脈内、筋内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注入および輸液が挙げられる。

一実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、タンパク質として投与されるべきであり、抗体は、本明細書に記載される通りの、ハイブリドーマ、トランスフェクトーマから、またはインビトロ転写により取得されていてもよい。一実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、本明細書に記載される通りの１つもしくは複数の核酸または１つもしくは複数のベクターとして、例えば、抗体または抗体の鎖またはそのような抗体もしくは鎖の断片をコードするＲＮＡまたはＲＮＡを含むリポソームまたは１つもしくは複数のＲＮＡとして、投与されるべきである。

一実施形態では、本発明の抗体は、皮下注入により、結晶形態で投与され、Yang et al. (2003) PNAS, 100 (12): 6934-6939を参照されたい。

本発明の化合物がヒトおよび動物へと医薬品として投与される場合、本発明の化合物は、単独で、または例えば、約０．０１パーセント～約９９パーセント、好ましくは約０．１パーセント～約９０パーセント、最も好ましくは約１パーセント～約５０パーセントの有効成分を、薬学的に許容される担体、好ましくは上記で特定される通りの薬学的に許容される担体と組み合わせて含む医薬組成物として、与えることができる。加えて、アジュバントおよび／または賦形剤、例えば、抗酸化剤または保存剤を、さらに含めることができる。

選択される投与経路にかかわらず、好適な水和形態で使用することができる本発明の化合物、および／または本発明の医薬組成物は、当業者に公知の従来の方法により、薬学的に許容される剤形へと製剤化される。

医薬組成物は、当技術分野で公知の医療デバイスを用いて投与することができる。例えば、好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、無針皮下注入デバイス、例えば、ＵＳ５，３９９，１６３；ＵＳ５，３８３，８５１；ＵＳ５，３１２，３３５；ＵＳ５，０６４，４１３；ＵＳ４，９４１，８８０；ＵＳ４，７９０，８２４；またはＵＳ４，５９６，５５６に開示されるデバイスを用いて、投与することができる。本発明において有用な周知のインプラントおよびモジュールの例としては、制御された速度で医薬を分配するためのインプラント可能な微量注入ポンプを開示するＵＳ４，４８７，６０３；皮膚を介して医薬を投与するための治療用デバイスを開示するＵＳ４，４８６，１９４；精密な輸液速度で医薬を送達するための医薬輸液ポンプを開示するＵＳ４，４４７，２３３；連続的薬物デリバリーのための可変流インプラント可能輸液装置を開示するＵＳ４，４４７，２２４；マルチチャンバー区画を有する浸透圧薬物デリバリーシステムを開示するＵＳ４，４３９，１９６；および浸透圧薬物デリバリーシステムを開示するＵＳ４，４７５，１９６に開示されるものが挙げられる。

多数の他のそのようなインプラント、デリバリーシステム、およびモジュールが当業者に公知である。ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、インビボでの適正な分布を確実にするために製剤化することができる。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、多数の高度に親水性の化合物を排除する。本発明の治療的化合物がＢＢＢを横断することを確実にするために（望ましい場合）、化合物を、例えば、リポソーム中に製剤化することができる。リポソームを製造する方法に関して、例えば、ＵＳ４，５２２，８１１；ＵＳ５，３７４，５４８；およびＵＳ５，３９９，３３１を参照されたい。リポソームは、特異的細胞または器官へと選択的に輸送され、したがって、標的化された薬物デリバリーを強化する１つまたは複数の部分を含むことができる［例えば、V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29: 685を参照されたい］。例示的な標的化部分としては、葉酸塩またはビオチン（例えば、ＬｏｗらのＵＳ５，４１６，０１６）；マンノシド［Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038］；抗体［P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357: 140；M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180］；および界面活性剤タンパク質Ａ受容体［Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134］が挙げられる。

本発明の一実施形態では、本発明の治療的化合物は、リポソーム中に製剤化される。より好ましい実施形態では、リポソームは、標的化部分を含む。最も好ましい実施形態では、リポソーム中の治療的化合物は、所望の領域、例えば、腫瘍の部位に対して近位の部位へと、ボーラス注入により送達される。組成物は、容易な注射針通過性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度まで流動性でなければならない。組成物は、製造および保存の条件下で安定でなければならず、かつ細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。

さらなる実施形態では、本発明の抗体は、胎盤を通過するそれらの輸送を防止または低減するために製剤化することができる。これは、当技術分野で公知の方法により、例えば、抗体のＰＥＧ化により、またはＦ（ａｂ）２’断片の使用により、行うことができる。Cunningham-Rundles C, Zhuo Z, Griffith B, Keenan J. (1992), "Biological activities of polyethylene-glycol immunoglobulin conjugates. Resistance to enzymatic degradation." J. Immunol. Methods, 152: 177-190；およびLandor M. (1995)の, "Maternal-fetal transfer of immunoglobulins", Ann. Allergy Asthma Immunol. 74: 279-283をさらに参照することができる。

組成物は、無菌であり、かつ組成物がシリンジにより送達可能である程度まで流動性でなければならない。水に加えて、担体は、等張性緩衝生理食塩溶水、エタノール、ポリオール［例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｅｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）など］、およびそれらの好適な混合物であり得る。適正な流動性は、レシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合には必要とされる粒径の維持により、および界面活性剤の使用により、維持することができる。多くの場合に、等張化剤、例えば、糖、ポリオール、例えば、マンニトールまたはソルビトール、および塩化ナトリウムを組成物中に含めることが好ましい。注入可能組成物の長期的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを組成物中に含めることにより、もたらすことができる。

上記の通り、活性化合物が好適に保護される場合、化合物は、例えば、不活性希釈剤または吸収可能な可食性担体と共に、経口投与することができる。

ＶＩＩＩ．本発明の使用および方法
本発明の抗体、コンジュゲート、マルチマー、核酸、ベクター、宿主細胞およびウイルスは、ＰＤ－１またはそのリガンド（ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２）を発現する細胞を含む疾患の治療を含む多数の治療的有用性を有する。

したがって、さらなる態様では、本発明は、本発明の抗体、コンジュゲート、マルチマー、核酸、ベクター、宿主細胞、ウイルスまたは組成物の医学的使用に関連する。これに関して、本発明は、疾患の治療における使用のための、例えば、腫瘍／がん治療における使用のための、抗体、コンジュゲート、マルチマー、核酸、ベクター、宿主細胞、ウイルスまたは組成物、好ましくは医薬組成物を提供する。表現「疾患の治療における使用のための、例えば、腫瘍／がん治療における使用のための」は、「医薬としての、特にがんの治療方法における使用のための」；またはヒト（またはより一般的にはそれを必要とする対象）における前記治療方法における使用のための医薬製剤の調製における前記生成物の使用と置き換え可能にも本明細書で使用される。

以下では、本発明の好ましい使用および方法を説明する場合、本発明の抗体が参照される。しかし、本明細書で別途示されるかまたは文脈により明らかに矛盾しない限り、この教示は、抗体を含むかまたはそれをコードする他の活性剤、すなわち、本発明のコンジュゲート、マルチマー、核酸、ベクター、宿主細胞、ウイルスまたは組成物に対しても適用可能であることが理解されるべきである。

例えば、抗体または核酸は、本明細書に記載されるものなどの様々な疾患を治療または予防するために、例えば、インビトロもしくはエクスビボでの培養中の細胞へと、または、例えば、インビボでの対象、好ましくは、ヒト対象へと投与することができる。

本明細書で使用される場合、用語「対象」は、ＰＤ－１に対する抗体に対して応答するヒトおよび非ヒト動物を含むことが意図される。用語「非ヒト動物」としては、すべての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類等が挙げられる。好ましい対象としては、罹患細胞を殺傷することにより正されるかまたは改善することができる障害を有するヒト患者が挙げられる。

本発明に従えば、用語「疾患」とは、がんもしくは腫瘍、特に、本明細書に記載される腫瘍もしくはがんの形態、または自己免疫疾患を含む、いずれかの病理学的状態を意味する。

「腫瘍」または「がん」により、迅速な制御されない細胞増殖により成長し、新規成長の停止を引き起こす刺激の後に成長し続ける、細胞または組織の異常群が意味される。腫瘍は、正常組織に伴う構造的組織化および機能的協調の部分的または完全な欠如を示し、通常は、良性または悪性のいずれかであり得る区別できる組織塊を形成する。本開示に従うこれらの用語は、転移も含む。本発明の目的のために、用語「がん」および「がん疾患」は、用語「腫瘍」および「腫瘍疾患」と相互に交換可能に使用される。

「転移」により、その元の部位からの身体の別の部分へのがん細胞の拡散が意味される。転移の形成は、非常に複雑なプロセスであり、原発腫瘍からの悪性細胞の分離、細胞外マトリックスの侵入、身体腔および血管に侵入するための内皮基底膜の浸透、および、続いて、血液による輸送後の、標的器官への浸潤に依存する。最後に、標的部位での新規腫瘍の成長は、血管新生に依存する。腫瘍細胞または構成要素が残りかつ転移能力を発達させ得るので、腫瘍転移は、多くの場合、原発腫瘍の除去後でさえ起こる。一実施形態では、本発明に従う用語「転移」は、原発腫瘍および所属リンパ節系から離れた転移に関する「遠隔転移」に関する。

用語「疾患の治療」は、疾患またはその症状の治癒、持続期間の短縮、改善、予防、進行もしくは悪化の減速または阻害、あるいは発症の予防または遅延を含む。

本発明に従えば、サンプルは、本発明に従って有用ないずれかのサンプル、特に、体液をはじめとする組織サンプル、および／または細胞サンプルなどの生物学的サンプルであり得、パンチ生検をはじめとする組織生検により、および血液、気管支吸引物、喀痰、尿、糞便または他の体液の採取によるなどの、従来の様式で取得することができる。本発明に従えば、用語「生物学的サンプル」はまた、生物学的サンプルの画分も含む。

本明細書で議論される治療および使用における治療効果は、好ましくは、例えば、ＰＤ－１を発現する細胞に対するＰＤ－１の免疫抑制シグナルを阻害することにより、好ましくは、抗体とＰＤ－１との複合体を形成することにより、および／または免疫応答、より好ましくはＴ細胞媒介免疫応答を誘導することにより、細胞の殺傷を媒介する本発明の抗体の機能的特性を介して達成される。

一実施形態では、抗ＰＤ－１抗体はタンパク質として投与され、抗体は、本明細書に記載される通り、ハイブリドーマ、トランスフェクトーマから、またはインビトロ転写により取得されていることができる。一実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、本明細書に規定される通りの１つもしくは複数の核酸としてまたは１つもしくは複数のベクターとして、例えば、抗体もしくは抗体の鎖またはそのような抗体もしくは鎖の断片をコードするＲＮＡまたはＲＮＡを含むリポソームまたは１つもしくは複数のＲＮＡとして、投与される。

本発明の抗体は、インビトロにおける治療的または診断的使用に関連するそれらの結合活性に関して、最初に試験することができる。例えば、抗体は、本明細書に記載される通りの結合性アッセイ、レポーター遺伝子遮断アッセイ、および／またはＴ細胞増殖アッセイを使用して試験することができる。

本発明の抗体は、以下の生物学的活性のうちの１つまたは複数をインビボまたはインビトロにおいて誘起するために使用することができる：ＰＤ－１に結合すること、好ましくは特異的に結合すること；がん細胞上または正常細胞上のいずれかのＰＤ－１に対する結合特性を有すること；ＰＤ－１エピトープに対する結合特性を有すること；非ヒトＰＤ－１変異体、特にマウス、ラット、ウサギおよび霊長類由来のＰＤ－１変異体に対する結合特性を有すること；ＰＤ－１による阻害性シグナルの誘導を防止または低減すること；ＰＤ－１とのＰＤ－１のリガンドの、好ましくはリガンドＰＤ－Ｌ１の相互作用／結合性を阻害すること、例えば、ヒトＰＤ－１に対するヒトＰＤ－Ｌ１の結合性を阻害すること；ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２の免疫抑制シグナルを阻害すること；好ましくはＴ細胞媒介免疫応答を強化または開始することにより、免疫機能（このメカニズムを介する）を強化または開始すること；がん増殖を阻害すること；ならびに／または腫瘍細胞を枯渇させる、および／またはがん転移を抑制すること。

抗体はまた、貪食もしくはＡＤＣＣを媒介し、補体の存在下でＣＤＣを媒介し、かつ／または罹患細胞のアポトーシスを媒介することができる。

一実施形態では、本発明の抗体は、腫瘍疾患を有する対象を治療するために使用することができる。これらの腫瘍は、固形腫瘍および／または血液学的悪性腫瘍を含む。治療および／または予防することができる腫瘍疾患の例は、限定するものではないが、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、および白血病を含む、すべてのがんおよび腫瘍実体を包含する。より詳細には、そのようながんの例としては、骨がん、血液がん、肺がん、肝臓がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部または頚部のがん、皮膚または眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん、結腸がん、乳がん、前立腺がん、子宮がん、性生殖器官の癌、ホジキン病（ホジキンリンパ腫）、食道のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟組織肉腫、膀胱のがん、腎臓のがん、腎細胞癌、腎盂のがん、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、神経外胚葉がん、脊髄軸腫瘍、神経膠腫、髄膜腫、および下垂体腺腫が挙げられる。これらのがんは、早期、中間期または進行期、例えば、転移であり得る。一実施形態では、治療されるがんは、進行期にある。

ＰＤ－１経路遮断療法に対して特に感受性であるがんの例としては、限定するものではないが、転移性黒色腫を含む黒色腫、ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、例えば、進行型ＮＳＣＬＣ、および小細胞肺がんを含む肺がん、腎細胞癌、膀胱がん、進行型トリプルネガティブ乳がんを含む乳がん、胃がんおよび胃食道接合部がん、膵臓腺癌、および卵巣がんが挙げられる。

インビボおよびインビトロにおける本発明の組成物の好適な投与経路は、当技術分野で周知であり、当業者により選択され得る。本発明の組成物は、全身的または局所的に投与することができる。例えば、組成物は、経口的または非経口的に投与（ａｄｍｉｓｔｅｒｅｄ）することができる。これに関して、上記のそれぞれの開示もまた参照される。

がん治療における組み合わせ戦略が、単剤療法アプローチの影響よりも顕著に強い場合がある、結果として生じる相乗効果に起因して望ましい場合がある。したがって、本発明の抗体または医薬組成物を、併用療法において、すなわち、他の薬剤と組み合わせて投与することもできることもまた、本発明により包含される。

本発明の抗ＰＤ－１抗体は、１つまたは他の複数の治療剤、例えば、細胞傷害剤、放射毒性剤、抗血管新生剤またはおよび本発明の抗体に対する免疫応答の誘導を低減するための免疫抑制剤と共に同時投与することができる。抗体を薬剤に連結する（免疫複合体として）ことができるか、または薬剤とは別個に投与することができる。後者（別個の投与）の場合、抗体を、薬剤の前、その後もしくはそれと同時に投与することができるか、または他の公知の療法、例えば、抗がん療法、例えば、放射線と同時投与することができる。そのような治療剤としては、とりわけ、上記に列挙されるものなどの抗新生物剤が挙げられる。化学療法剤との本発明の抗ＰＤ－１抗体の同時投与は、腫瘍細胞に対する細胞傷害作用を生じる異なるメカニズムを介して作動する２種類の抗がん剤を提供する。そのような同時投与は、薬物に対する耐性の発達または抗体と非反応性にするであろう腫瘍細胞の抗原性における変化に起因する問題を解決し得る。

本発明の抗体または組成物は、化学療法と併せて使用することができる。化学療法のための治療剤としては、限定するものではないが、１つまたは複数の化学療法剤、例えば、タキソール誘導体、タキソテール、ゲムシタビン、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、５－フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤［例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびｃｉｓ－ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン］、アントラサイクリン［例えば、ダウノルビシン（旧ダウノマイシン）およびドキソルビシン（アドリアマイシン）］、抗生物質［例えば、ダクチノマイシン（旧アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ）］、および抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられる。好ましい実施形態では、治療剤は、細胞傷害剤または放射毒性剤である。別の実施形態では、治療剤は、免疫抑制剤である。さらに別の実施形態では、治療剤は、ＧＭ－ＣＳＦである。好ましい実施形態では、治療剤は、ドキソルビシン、シスプラチン（プラチノール）、ブレオマイシン、スルフェート、カルムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミド（サイトキサン、プロシトックス、ネオサール）またはリシンＡである。

別の実施形態では、本発明の抗体は、好ましくは、ＰＤ－１経路遮断に対して特に（ｐａｒｔｉｃｕｌａｒｙ）感受性であるがん、例えば、転移性黒色腫を含む黒色腫、ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、例えば、進行型ＮＳＣＬＣ、および小細胞肺がんを含む肺がん、腎細胞がん、膀胱がん、進行型トリプルネガティブ乳がんを含む進行型トリプルネガティブ乳がん、胃がんおよび胃食道接合部がん、膵臓腺癌、または卵巣がんに罹患した患者において治療有効性を示す化学療法剤と組み合わせて投与することができる。

一実施形態では、本発明の抗体または医薬組成物は、免疫療法剤と共に投与することができる。本明細書で使用される場合、「免疫療法剤」は、特異的免疫応答および／または免疫エフェクター機能の活性化に関与し得るいずれかの薬剤に関する。本開示は、免疫療法剤としての抗体の使用を企図する。理論に拘泥することを望まないが、抗体は、アポトーシスの誘導、シグナル伝達経路の成分の遮断または腫瘍細胞の増殖の阻害を含む様々なメカニズムを介してがん細胞に対する治療効果を達成することが可能である。ある特定の実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を介して細胞死を誘導するか、または補体タンパク質に結合して補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）として知られる直接的細胞毒性をもたらすことができる。本開示と組み合わせて使用することができる抗がん抗体および潜在的な抗体標的（括弧内）としては、以下のものが挙げられる：アバゴボマブ（ＣＡ－１２５）、アブシキシマブ（ＣＤ４１）、アデカツムマブ（ＥｐＣＡＭ）、アフツズマブ（ＣＤ２０）、アラシズマブペゴール（ＶＥＧＦＲ２）、アルツモマブペンテテート（ＣＥＡ）、アマツキシマブ（ＭＯＲＡｂ－００９）、アナツモマブ・マフェナトクス（ＴＡＧ－７２）、アポリズマブ（ＨＬＡ－ＤＲ）、アルシツモマブ（ＣＥＡ）、アテゾリズマブ（ＰＤ－Ｌ１）、バビツキシマブ（ホスファチジルセリン）、ベクツモマブ（ＣＤ２２）、ベリムマブ（ＢＡＦＦ）、ベバシズマブ（ＶＥＧＦ－Ａ）、ビバツズマブ・メルタンシン（ＣＤ４４ｖ６）、ブリナツモマブ（ＣＤ１９）、ブレンツキシマブ・ベドチン（ＣＤ３０ＴＮＦＲＳＦ８）、カンツズマブ・メルタンシン（ムチンＣａｎＡｇ）、カンツズマブ・ラブタンシン（ＭＵＣ１）、カプロマブペンデチド（前立腺癌細胞）、カルルマブ（ＣＮＴ０８８８）、カツマキソマブ（ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３）、セツキシマブ（ＥＧＦＲ）、シタツズマブ・ボガトクス（ＥｐＣＡＭ）、シクスツムマブ（ＩＧＦ－１受容体）、クラウジキシマブ（クローディン）、クリバツズマブ・テトラキセタン（ＭＵＣ１）、コナツムマブ（ＴＲＡＩＬ－Ｒ２）、ダセツズマブ（ＣＤ４０）、ダロツズマブ（インスリン様増殖因子Ｉ受容体）、デノスマブ（ＲＡＮＫＬ）、デツモマブ（Ｂリンパ腫細胞）、ドロジツマブ（ＤＲ５）、エクロメキシマブ（ＧＤ３ガングリオシド）、エドレコロマブ（ＥｐＣＡＭ）、エロツズマブ（ＳＬＡＭＦ７）、エナバツズマブ（ＰＤＬ１９２）、エンシツキシマブ（ＮＰＣ－１Ｃ）、エプラツズマブ（ＣＤ２２）、エルツマキソマブ（ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＣＤ３）、エタラシズマブ（インテグリンαｖβ３）、ファルレツズマブ（葉酸受容体１）、ＦＢＴＡ０５（ＣＤ２０）、フィクラツズマブ（ＳＣＨ９００１０５）、フィギツムマブ（ＩＧＦ－１受容体）、フランボツマブ（糖タンパク質７５）、フレソリムマブ（ＴＧＦ－β）、ガリキシマブ（ＣＤ８０）、ガニツマブ（ＩＧＦ－Ｉ）、ゲムツズマブ・オゾガマイシン（ＣＤ３３）、ゲボキズマブ（ＩＬＩβ）、ジレンツキシマブ［炭酸脱水酵素９（ＣＡ－ＩＸ）］、グレムバツムマブ・ベドチン（ＧＰＮＭＢ）、イブリツモマブ・チウキセタン（ＣＤ２０）、イクルクマブ（ＶＥＧＦＲ－１）、イゴボマブ（Ｉｇｏｖｏｍａ）（ＣＡ－１２５）、インダツキシマブ・ラブタンシン（ＳＤＣ１）、インテツムマブ（ＣＤ５１）、イノツズマブ・オゾガマイシン（ＣＤ２２）、イピリムマブ（ＣＤ１５２）、イラツムマブ（ＣＤ３０）、ラベツズマブ（ＣＥＡ）、レキサツムマブ（ＴＲＡＩＬ－Ｒ２）、リビビルマブ（Ｂ型肝炎表面抗原）、リンツズマブ（ＣＤ３３）、ロルボツズマブ・メルタンシン（ＣＤ５６）、ルカツムマブ（ＣＤ４０）、ルミリキシマブ（ＣＤ２３）、マパツムマブ（ＴＲＡＩＬ－Ｒ１）、マツズマブ（ＥＧＦＲ）、メポリズマブ（ＩＬ５）、ミラツズマブ（ＣＤ７４）、ミツモマブ（ＧＤ３ガングリオシド）、モガムリズマブ（ＣＣＲ４）、モキセツモマブ・パスドトクス（ＣＤ２２）、ナコロマブ・タフェナトクス（Ｃ２４２抗原）、ナプツモマブ・エスタフェナトクス（５Ｔ４）、ナルナツマブ（Ｎａｍａｔｕｍａｂ）（ＲＯＮ）、ネシツムマブ（ＥＧＦＲ）、ニモツズマブ（ＥＧＦＲ）、ニボルマブ（ＩｇＧ４）、オファツムマブ（ＣＤ２０）、オララツマブ（ＰＤＧＦ－Ｒａ）、オナルツズマブ（ヒト散乱因子受容体キナーゼ）、オポルツズマブ・モナトクス（ＥｐＣＡＭ）、オレゴボマブ（ＣＡ－１２５）、オキセルマブ（ＯＸ－４０）、パニツムマブ（ＥＧＦＲ）、パトリツマブ（ＨＥＲ３）、ペムツモマブ（Ｐｅｍｔｕｍｏｍａ）（ＭＵＣ１）、ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａ）（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ピンツモマブ（腺癌抗原）、プリツムマブ（ビメンチン）、ラコツモマブ（Ｎ－グリコリルノイラミン酸）、ラドレツマブ（フィブロネクチンエクストラドメインＢ）、ラフィビルマブ（狂犬病ウイルス糖タンパク質）、ラムシルマブ（ＶＥＧＦＲ２）、リロツムマブ（ＨＧＦ）、リツキシマブ（ＣＤ２０）、ロバツムマブ（ＩＧＦ－１受容体）、サマリズマブ（ＣＤ２００）、シブロツズマブ（ＦＡＰ）、シルツキシマブ（ＩＬ６）、タバルマブ（ＢＡＦＦ）、タカツズマブ・テトラキセタン（アルファ－フェトプロテイン）、タプリツモマブ・パプトクス（ＣＤ１９）、テナツモマブ（テネイシンＣ）、テプロツムマブ（ＣＤ２２１）、チシリムマブ（ＣＴＬＡ４）、チガツズマブ（ＴＲＡＩＬ－Ｒ２）、ＴＮＸ－６５０（ＩＬ１３）、トシツモマブ（ＣＤ２０）、トラスツズマブ（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ＴＲＢＳ０７（ＧＤ２）、トレメリムマブ（ＣＴＬＡ４）、ツコツズマブ・セルモロイキン（ＥｐＣＡＭ）、ウブリツキシマブ（ＭＳ４Ａ１）、ウレルマブ（４－１ＢＢ）、ボロシキシマブ（インテグリンα５β１）、ボツムマブ（腫瘍抗原ＣＴＡＡ１６．８８）、ザルツムマブ（ＥＧＦＲ）、およびザノリムマブ（ＣＤ４）。

例えば、本発明に従えば、本発明の抗体を投与されている対象は、別の免疫チェックポイントを標的化する１つまたは複数の抗体を用いて、追加的に治療される。抗原提示細胞とＴリンパ球との間の阻害性相互作用を妨害することにより腫瘍防御を活性化する免疫チェックポイント阻害剤としては、限定するものではないが、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＣＴＬＡ４、抗ＴＩＭ－３、抗ＫＩＲおよび／または抗ＬＡＧ－３が挙げられる。活性化チェックポイント、例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、またはＩＣＯＳを刺激する免疫療法剤、すなわち、例えば、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ４０、抗ＣＤ１２２、抗ＣＤ１３７、抗ＯＸ４０、抗ＧＩＴＲ、および／または抗ＩＣＯＳもまた包含される。特に好ましい併用療法としては、限定するものではないが、それにより両方の成分を標的化することによって効率およびＰＤ１経路の遮断を増加させる抗ＰＤ１と抗ＰＤ－Ｌ１との組み合わせ、またはＰＤ１経路（ｐａｔｗａｙ）およびＣＴＬＡ４経路の両方の遮断を妨げるための抗ＰＤ－１と抗ＣＴＬＡ４との組み合わせが挙げられる。

本発明の別の特定の実施形態では、抗体を投与されている対象は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）またはその受容体ＶＥＧＦＲを標的とする抗体、および血管新生を阻害する１つまたは複数の化合物を含む抗血管新生剤を用いて、追加的に治療される。これらの薬物を用いる事前治療または並行適用（ａｐｐｌｉｃａｔｉｔｉｏｎ）は、大型腫瘍での抗体の浸透を改善し得る。

例えば、抗血管新生剤は、ＶＥＧＦを標的とし得る。好適な（ｓｕｉｔｂａｌｅ）ＶＥＧＦ阻害剤は、ベバシズマブである。他の例としては、限定するものではないが、ＶＥＧＦＲ１、２、３、ＰＤＧＦＲ、ｃ－Ｋｉｔ、Ｒａｆおよび／またはＲＥＴを阻害するマルチキナーゼ阻害剤（例えば、スニチニブ、ソラフェニブ、パゾパニブ）が挙げられる。

本発明の別の特定の実施形態では、抗体を投与されている対象は、ＥＧＦＲ受容体に結合するモノクローナル抗体およびＥＧＦＲ受容体により開始されるシグナル伝達を阻害する化合物を含む、増殖因子受容体シグナル伝達を阻害する化合物を用いて、追加的に治療される。

別の実施形態では、そのような治療剤は、低用量シクロホスファミド、および／または抗ＩＬ２もしくは抗ＩＬ２受容体抗体などの調節Ｔ細胞の枯渇または機能的不活性化をもたらす薬剤を含む。

さらに別の実施形態では、本発明の抗体は、抗ＣＤ２５抗体、抗ＥＰＣＡＭ抗体、および抗ＣＤ４０抗体から選択される１つまたは複数の抗体と組み合わせて投与することができる。

なおさらなる実施形態では、本発明の抗体は、補体活性化を強化するために、抗Ｃ３ｂ（ｉ）抗体と組み合わせて投与することができる。

別の実施形態では、本発明の抗体は、ワクチン接種療法と組み合わせて、すなわち、対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含む少なくとも１種のペプチドもしくはタンパク質、またはペプチドもしくはタンパク質をコードする少なくとも１種のポリヌクレオチド／核酸と組み合わせて投与することができる。

用語「抗原」は、それに対して免疫応答または抗体などの免疫エフェクター分子が向けられ、かつ／または向けられるべきであるエピトープを含む物質に関する。用語「抗原」は、特に、タンパク質およびペプチドを含む。一実施形態では、抗原は、腫瘍抗原などの疾患関連抗原である。

用語「疾患関連抗原」は、好ましくは宿主の免疫系を刺激して疾患に対する細胞性抗原特異的免疫応答および／または体液性抗体応答を生じさせるであろうエピトープを含有する、疾患に関連するいずれかの抗原を意味するために、その最も広い意味で用いられる。疾患関連抗原、そのエピトープ、または疾患関連抗原もしくはエピトープを標的化して免疫応答を誘導するペプチドもしくはタンパク質などの物質は、したがって、治療的目的のために、特にワクチン接種のために使用することができる。疾患関連抗原は、微生物による感染に関連し、典型的には微生物抗原であるか、またはがん、典型的には腫瘍に関連することができる。

一実施形態では、それに対して免疫応答が向けられるべきである抗原（すなわち、疾患関連抗原）は、好ましくは本明細書に特定される通りの腫瘍抗原である。より好ましくは、少なくとも１種の腫瘍抗原は、ＮＹ－ＥＳＯ－１（ＵｎｉＰｒｏｔＰ７８３５８）、チロシナーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔＰ１４６７９）、ＭＡＧＥ－Ａ３（ＵｎｉＰｒｏｔＰ４３３５７）、ＴＰＴＥ（ＵｎｉＰｒｏｔＰ５６１８０）、ＫＬＫ２（ＵｎｉＰｒｏｔＰ２０１５１）、ＰＳＡ（ＫＬＫ３）（ＵｎｉＰｒｏｔＰ０７２８８）、ＰＡＰ（ＡＣＰＰ、ＵｎｉＰｒｏｔＰ１５３０９）、ＨＯＸＢ１３（ＵｎｉＰｒｏｔＱ９２８２６）、ＮＫＸ３－１（ＵｎｉＰｒｏｔＱ９９８０１）、ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７（ＵｎｉＰｒｏｔＰ０３１２６／Ｐ０３１２９）；ＨＰＶ１８Ｅ６／Ｅ７（ＵｎｉＰｒｏｔＰ０６４６３／Ｐ０６７８８）；ＨＰＶ３１Ｅ６／Ｅ７（ＵｎｉＰｒｏｔＰ１７３８６／Ｐ１７３８７）；ＨＰＶ３３Ｅ６／Ｅ７（ＵｎｉＰｒｏｔＰ０６４２７／Ｐ０６４２９）；ＨＰＶ４５Ｅ６／Ｅ７（ＵｎｉＰｒｏｔＰ２１７３５／Ｐ２１７３６）；ＨＰＶ５８Ｅ６／Ｅ７（ＵｎｉＰｒｏｔＰ２６５５５／Ｐ２６５５７）、ＰＲＡＭＥ（ＵｎｉＰｒｏｔＰ７８３９５）、ＡＣＴＬ８（ＵｎｉＰｒｏｔＱ９Ｈ５６８）、ＣＸｏｒｆ６１（ＫＫＬＣ１、ＵｎｉＰｒｏｔＱ５Ｈ９４３）、ＭＡＧＥ－Ａ９Ｂ（ＵｎｉＰｒｏｔＰ４３３６２）、ＣＬＤＮ６（ＵｎｉＰｒｏｔＰ５６７４７）、ＰＬＡＣ１（ＵｎｉＰｒｏｔＱ９ＨＢＪ０）、およびｐ５３（ＵｎｉＰｒｏｔＰ０４６３７）からなる群から選択される。ワクチン接種のために使用されるペプチドまたはタンパク質（すなわち、ワクチン抗原）は、前記抗原またはそのエピトープを含むことができる。一実施形態では、ワクチン抗原は、ワクチン抗原をコードするＲＮＡの形態で投与される。これらの抗原を含む治療方法は、がんの治療を目的とすることができ、がん細胞は、それぞれの抗原の発現により特徴付けられる。本明細書に記載される抗原、特に、ＮＹ－ＥＳＯ－１、チロシナーゼ、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＴＰＴＥ、ＫＬＫ２、ＰＳＡ（ＫＬＫ３）、ＰＡＰ（ＡＣＰＰ）、ＨＯＸＢ１３、ＮＫＸ３－１、ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７；ＨＰＶ１８Ｅ６／Ｅ７；ＨＰＶ３１Ｅ６／Ｅ７；ＨＰＶ３３Ｅ６／Ｅ７；ＨＰＶ４５Ｅ６／Ｅ７；ＨＰＶ５８Ｅ６／Ｅ７、ＰＲＡＭＥ、ＡＣＴＬ８、ＣＸｏｒｆ６１（ＫＫＬＣ１）、ＭＡＧＥ－Ａ９Ｂ、ＣＬＤＮ６、ＰＬＡＣ１、およびｐ５３を組み合わせて使用することもまた可能である。そのような抗原の組み合わせを含む治療方法は、がんの治療を目的とすることができ、がん細胞は、抗原のそれぞれの組み合わせのうちの２種類以上の抗原の発現により特徴付けられるか、または治療される特定のがんを有する患者の大きな割合のがん細胞（例えば、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれ以上でさえ）が、組み合わせのそれぞれの抗原のうちの１つもしくは複数を発現する。そのような組み合わせは、少なくとも２種類、少なくとも３種類、少なくとも４種類、少なくとも５種類、または少なくとも６種類の抗原の組み合わせを含むことができる。したがって、組み合わせは、３、４、５、６、７、または８種類の抗原を含むことができる。この場合、組み合わせの各抗原は、前記抗原もしくはそのエピトープを含むペプチドもしくはタンパク質（すなわち、ワクチン抗原）、またはペプチドもしくはタンパク質をコードするＲＮＡを投与することにより、対処される。１つの特に好ましい実施形態では、組み合わせの各抗原は、抗原を含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡを投与することにより標的とされる。したがって、ワクチン接種は、異なるＲＮＡ分子の投与を包含することができ、前記異なるＲＮＡ分子の各々は、抗原の組み合わせの抗原を含むペプチドまたはタンパク質をコードする。組み合わせの異なるワクチン抗原または異なるワクチン抗原をコードするＲＮＡは、混合物中で、連続的に、またはその組み合わせで投与することができる。

一実施形態では、抗原組み合わせは、ＮＹ－ＥＳＯ－１、チロシナーゼ、ＭＡＧＥ－Ａ３、およびＴＰＴＥを含み、好ましくはこれらからなる。この組み合わせは、皮膚黒色腫の治療のために使用することができる。

一実施形態では、抗原組み合わせは、ＫＬＫ２、ＰＳＡ（ＫＬＫ３）、ＰＡＰ（ＡＣＰＰ）、ＨＯＸＢ１３、およびＮＫＸ３－１を含み、好ましくはこれらからなる。この組み合わせは、前立腺がんの治療のために使用することができる。

一実施形態では、抗原組み合わせは、ＰＲＡＭＥ、ＡＣＴＬ８、ＣＸｏｒｆ６１（ＫＫＬＣ１）、ＭＡＧＥＡ３、ＭＡＧＥ－Ａ９Ｂ、ＣＬＤＮ６、ＮＹ－ＥＳＯ－１、およびＰＬＡＣ１を含み、好ましくはこれらからなる。この組み合わせは、トリプルネガティブ乳がん、特にエストロゲン受容体陰性＆プロゲステロン（ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎ）受容体陰性＆ＨＥＲ２陰性乳がんなどの乳がんの治療のために使用することができる。

一実施形態では、抗原組み合わせは、ＣＬＤＮ６、ｐ５３、およびＰＲＡＭＥを含み、好ましくはこれらからなる。この組み合わせは、上皮性卵巣がんなどの卵巣がんの治療のために使用することができる。

本明細書に記載されるワクチンは、がんなどの疾患において発現される１つまたは複数の抗原を標的とする１つまたは複数のＲＮＡからなることができる。有効成分は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）への侵入時にそれぞれのタンパク質へと翻訳される一本鎖ｍＲＮＡであり得る。抗原配列をコードする野生型またはコドン最適化型配列に加えて、ＲＮＡは、安定性および翻訳効率に関してＲＮＡの最大効力に対して最適化された１つまたは複数の構造エレメントを含むことができる［５’キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、ポリ（Ａ）尾部］。一実施形態では、ＲＮＡは、これらのエレメントのうちのすべてを含む。一実施形態では、ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）を、ＲＮＡ原薬の５’末端での特異的キャッピング構造として利用することができる。５’ＵＴＲ配列として、翻訳効率を増加させるための最適化された「Ｋｏｚａｋ配列」を伴っていてもよい、ヒトアルファ－グロビンｍＲＮＡの５’ＵＴＲ配列を使用することができる。３’ＵＴＲ配列として、より高い最大タンパク質レベルおよびｍＲＮＡの延長した持続性を確実にするために、コード配列とポリ（Ａ）尾部との間に配置されたヒトベータ－グロビンｍＲＮＡの２つの反復される３’ＵＴＲを使用することができる。代替的に、３’ＵＴＲは、「スプリットのアミノ末端エンハンサー」（ＡＥＳ）ｍＲＮＡ（Ｆと称される）およびミトコンドリアにコードされる１２ＳリボソームＲＮＡ（Ｉと称される）から誘導される２つの配列エレメントの組み合わせ（ＦＩエレメント）であり得る。これらは、ＲＮＡ安定性を付与し、かつ総タンパク質発現を増強する配列に対するエクスビボ選択プロセスにより特定された（参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／０６０３１４を参照されたい）。さらに、３０個のアデノシン残基の伸長部およびそれに続く１０ヌクレオチドリンカー配列（ランダムヌクレオチドの）およびさらなる７０個のアデノシン残基からなる１１０ヌクレオチド長であるポリ（Ａ）尾部を使用することができる。このポリ（Ａ）尾部配列は、樹状細胞におけるＲＮＡ安定性および翻訳効率を強化するために設計された。

さらに、ｓｅｃ（分泌シグナルペプチド）および／またはＭＩＴＤ（ＭＨＣクラスＩ輸送ドメイン）を、それぞれのエレメントがそれぞれＮまたはＣ末端タグとして翻訳されるように、抗原コード領域に融合することができる。ヒトＭＨＣクラスＩ複合体をコードする配列から誘導される融合タンパク質タグ（ＨＬＡ－Ｂ５１、ハロタイプＡ２、Ｂ２７／Ｂ５１、Ｃｗ２／Ｃｗ３）は、抗原プロセシングおよび提示を改善することが示されている。ｓｅｃは、小胞体（ｅｎｄｏｐｌａｓｍａｔｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）への新生ポリペプチド鎖の移動を導く分泌シグナルペプチドをコードする７８ｂｐ断片に対応することができる。ＭＩＴＤは、ＭＨＣクラスＩ輸送ドメインとも称される、ＭＨＣクラスＩ分子の膜貫通および細胞質ドメインに対応することができる。それ自体の分泌シグナルペプチドおよび膜貫通ドメインを有するＣＬＤＮ６などの抗原は、融合タグの付加の必要がない場合がある。融合タンパク質に対して一般的に使用される主にアミノ酸グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）からなる短いリンカーペプチドをコードする配列を、ＧＳ／リンカーとして使用することができる。

抗原は、免疫学的寛容を破壊するために、ヘルパーエピトープと組み合わせて投与することができる。ヘルパーエピトープは、破傷風トキソイド由来、例えば、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｔｅｔａｎｉ）の破傷風トキソイド（ＴＴ）から誘導されるＰ２Ｐ１６アミノ酸配列であり得る。これらの配列は、プライミング中に腫瘍非特異的Ｔ細胞ヘルプを提供することにより、自己抗原に対する免疫応答の効率的な誘導のために、自己寛容メカニズムを克服することを助ける場合がある。破傷風トキソイド重鎖は、ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子に無差別に結合し、ほとんどすべての破傷風ワクチン接種された個体においてＣＤ４^＋メモリーＴ細胞を誘導することができるエピトープを含む。加えて、ＴＴヘルパーエピトープと腫瘍関連抗原との組み合わせは、プライミング中にＣＤ４^＋媒介Ｔ細胞ヘルプを提供することにより、腫瘍関連抗原単独の適用と比較して、免疫刺激を改善することが知られている。ＣＤ８^＋Ｔ細胞を刺激するリスクを低減するために、無差別に結合するヘルパーエピトープを含むことが知られる２種類のペプチド配列、例えば、Ｐ２およびＰ１６を、可能な限りのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子に対する結合性を確実にするために使用することができる。

一実施形態では、ワクチン抗原は、免疫学的寛容を破壊するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、免疫学的寛容を破壊するアミノ酸配列は、ヘルパーエピトープ、好ましくは破傷風トキソイド由来ヘルパーエピトープを含む。免疫学的寛容を破壊するアミノ酸配列を、直接的にまたはリンカーにより分離されるかのいずれかで、ワクチン配列、例えば、抗原配列のＣ末端に融合することができる。免疫学的寛容を破壊するアミノ酸配列を、ワクチン配列およびＭＩＴＤに連結してもよい。ワクチン抗原がワクチン抗原をコードするＲＮＡの形態で投与される場合、免疫学的寛容を破壊するアミノ酸配列は、ＲＮＡにコードされることができる。一実施形態では、抗原標的化ＲＮＡは、得られた免疫応答を強化するために、ヘルパーエピトープをコードするＲＮＡと一緒に適用することができる。ヘルパーエピトープをコードするこのＲＮＡは、抗原コードＲＮＡに関して上記で記載される、安定性および翻訳効率に関してＲＮＡの最大効力に対して最適化された構造エレメントを含むことができる［５’キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、ポリ（Ａ）尾部］。さらに、抗原コードＲＮＡに関して上記で記載される通り、ｓｅｃ（分泌シグナルペプチド）および／またはＭＩＴＤ（ＭＨＣクラスＩ輸送ドメイン）を、それぞれのエレメントがそれぞれＮまたはＣ末端タグとして翻訳されるように、ヘルパーエピトープコード領域に融合することができる。一実施形態では、ＲＮＡは、得られた免疫応答を強化するために、破傷風トキソイド（ＴＴ）由来ヘルパーエピトープＰ２およびＰ１６（Ｐ２Ｐ１６）をコードする追加のＲＮＡと共に同時投与される。

ワクチンＲＮＡは、静脈内（ｉ．ｖ．）投与のための血清安定性ＲＮＡリポプレックス［ＲＮＡ_{（ＬＩＰ）}］を生成するために、リポソームと複合体化することができる。異なるＲＮＡの組み合わせを使用する場合、ＲＮＡは、静脈内（ｉ．ｖ．）投与のための血清安定性ＲＮＡリポプレックス［ＲＮＡ_{（ＬＩＰ）}］を生成するために、リポソームと別個に複合体化することができる。ＲＮＡ_{（ＬＩＰ）}は、リンパ器官中の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を標的とし、これが免疫系の効率的な刺激をもたらす。

一実施形態では、ワクチンＲＮＡは、免疫学的寛容を破壊するアミノ酸配列をコードするＲＮＡと共に、リポプレックス粒子として共製剤化される。

本明細書で使用される場合、「腫瘍抗原」または「がん抗原」は、（ｉ）腫瘍特異的抗原、（ｉｉ）腫瘍関連抗原、（ｉｉｉ）腫瘍上の胎児性抗原、（ｉｖ）腫瘍特異的膜抗原、（ｖ）腫瘍関連膜抗原、（ｖｉ）増殖因子受容体、および（ｘｉ）がんに関連するいずれかの他のタイプの抗原または物質を含む。

いずれかの腫瘍抗原（好ましくは腫瘍細胞により発現される）を、本明細書に開示されるワクチン接種により標的化することができる。一実施形態では、腫瘍抗原は腫瘍細胞により提示され、したがって、Ｔ細胞により標的化され得る。本明細書に開示される通りのワクチン接種は、好ましくは、ＭＨＣ提示された腫瘍抗原に対して特異的なＴ細胞を活性化する。腫瘍抗原は、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）であり得る。ＴＳＡは、腫瘍細胞に固有であり、身体中の他の細胞には存在しない。ＴＡＡは、腫瘍細胞に固有でなく、むしろ、抗原に対する免疫学的寛容の状態を誘導することができない条件下で正常細胞上に発現される。腫瘍上での抗原の発現は、免疫系が抗原に対して応答することを可能にする条件下で起こり得る。ＴＡＡは、免疫系が未熟かつ応答できない胎児成育期に正常細胞上で発現される抗原であり得るか、または正常細胞上では極めて低レベルで通常存在するが、腫瘍細胞上でははるかに高いレベルで発現する抗原であり得る。

ペプチドおよびタンパク質抗原は、例えば、少なくとも５アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも１５アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも２５アミノ酸、少なくとも３０アミノ酸、少なくとも３５アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも４５アミノ酸、または少なくとも５０アミノ酸長を含む、２～１００アミノ酸であり得る。一部の実施形態では、ペプチドは、５０アミノ酸超であり得る。一部の実施形態では、ペプチドは、１００アミノ酸超であり得る。

ペプチドまたはタンパク質抗原は、免疫系が抗体および標的抗原、例えば、疾患関連抗原に対するＴ細胞応答を発達させる能力を誘導または増加させることができる、いずれかのペプチドまたはタンパク質であり得る。

さらに別の実施形態では、本発明の抗体は、放射線療法および／または自家末梢幹細胞もしくは骨髄移植と併せて投与することができる。

本発明の組成物と少なくとも１種の抗炎症剤または少なくとも１種の免疫抑制剤とを含む併用療法もまた、本発明により包含される。一実施形態では、そのような治療剤としては、１つまたは複数の抗炎症剤、例えば、ステロイド薬またはＮＳＡＩＤ（非ステロイド性抗炎症薬）が挙げられる。好ましい薬剤としては、例えば、アスピリンおよび他のサリシレート、Ｃｏｘ－２阻害剤、例えば、ロフェコキシブ（Ｖｉｏｘｘ）およびセレコキシブ（ＣＥＬＥＢＲＥＸ）、ＮＳＡＩＤ、例えば、イブプロフェン（Ｍｏｔｒｉｎ、Ａｄｖｉｌ）、フェノプロフェン（Ｎａｌｆｏｎ）、ナプロキセン（Ｎａｐｒｏｓｙｎ）、スリンダク（Ｃｌｉｎｏｒｉｌ）、ジクロフェナク（Ｖｏｌｔａｒｅｎ）、ピロキシカム（Ｆｅｌｄｅｎｅ）、ケトプロフェン（Ｏｒｕｄｉｓ）、ジフルニサル（Ｄｏｌｏｂｉｄ）、ナブメトン（Ｒｅｌａｆｅｎ）、エトドラク（Ｌｏｄｉｎｅ）、オキサプロジン（Ｄａｙｐｒｏ）、およびインドメタシン（Ｉｎｄｏｃｉｎ）が挙げられる。本発明に従う併用療法はまた、（ｉ）本発明の抗体と、（ｉｉ）上記で特定される通りのワクチン接種治療／療法、および（ｉｉｉ）少なくとも１種の抗炎症剤または少なくとも１種の免疫抑制剤との組み合わせも含むことができる。

本発明の二重特異的および多重特異的分子を、別の免疫チェックポイントと相互作用させるために使用することができる。それにより、それぞれの他のチェックポイントを阻害または活性化／刺激するかのいずれかである。標的化することができる他のチェックポイント阻害因子としては、限定するものではないが、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＭ－３、ＫＩＲまたはＬＡＧ－３が挙げられ、第２の結合特異性により標的化することができるチェックポイント活性化因子としては、限定するものではないが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、またはＩＣＯＳが挙げられる。結合特異性の好ましい組み合わせとしては、抗ＰＤ１と抗ＰＤ－Ｌ１とを、または抗ＰＤ－１と抗ＣＴＬＡ４とが挙げられる。

代替的にまたは加えて、本発明の二重特異的または多重特異的分子は、例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）またはその受容体ＶＥＧＦＲ（例えば、ＶＥＧＦＲ１、２、３）を標的化することにより、抗血管新生活性を提供するために使用することができる。第２の結合特異性はまた、ＰＤＧＦＲ、ｃ－Ｋｉｔ、Ｒａｆおよび／またはＲＥＴを標的化することが可能でもあり得る。

代替的にまたは加えて、本発明の二重特異的または多重特異的分子は、がん細胞に対する本発明の抗体の特異性を可能にする、腫瘍抗原、好ましくは、上記で特定される通りの腫瘍抗原を標的化するために使用することができる。

好ましくは（Ｐｒｅｆｅｒａｂｙｌ）、腫瘍抗原特異性および抗ＰＤ－１結合特異性に加えて、本発明の多重特異的抗体はまた、細胞表面上の受容体をキャップ化および除去することによるなど、エフェクター細胞上のＦｃ－ガンマＲまたはＦｃ－アルファＲレベルを変化させるためにも使用することができる。抗Ｆｃ受容体の混合物もまた、この目的のために使用することができる。

本発明の使用および方法に関して、医薬組成物、好ましくは上記の通りの医薬組成物中に含めることができる有効成分の実際の投与量レベルは、患者に対して毒性であることなく、特定の患者、組成物、および投与様式に対する所望の治療的応答を達成するために有効である有効成分の量を取得するように、変化させることができる。選択される投与量レベルは、用いられる本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、用いられる特定の化合物の排出速度、治療の持続期間、用いられる特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または物質、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全身健康状態および既往歴、ならびに医学分野で周知の同様の因子を含む様々な薬物動態因子に依存するであろう。

当技術分野で通常の技能を有する医師または獣医師は、必要な医薬組成物の有効量を容易に決定および処方することができる。例えば、医師または獣医師は、所望の治療効果を達成するために必要なレベルよりも低いレベルで、医薬組成物中で用いられる本発明の化合物の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させることができるであろう。一般的に、本発明の組成物の好適な一日用量は、治療効果を生成するために有効である最低用量である化合物の量であろう。そのような有効用量は、一般的に、上記の因子に依存するであろう。投与が、静脈内、筋内、腹腔内、または皮下であり、好ましくは標的の部位に対して近位に投与されることが好ましい。望ましい場合、治療組成物の有効な一日用量は、適宜単位投与剤形において、一日全体を通して適切な間隔で別個に投与される２、３、４、５、６またはそれ以上の部分用量として投与することができる。本発明の化合物が単独で投与されることが可能であるが、化合物を医薬組成物（製剤）として投与することが好ましい。

一実施形態では、本発明の抗体は、毒性副作用を低減するために、輸液により、好ましくは長時間、例えば、２４時間超にわたるゆっくりとした持続点滴により、投与することができる。投与はまた、２～２４時間、例えば、２～１２時間の期間にわたる持続点滴によっても行うことができる。そのようなレジメンは、必要に応じて、例えば、６ヵ月間または１２ヵ月間後に、１回または複数回繰り返すことができる。投与量は、抗ＰＤ－１抗体を標的とする抗イディオタイプ抗体を使用することにより、生物学的サンプル中での投与時の循環抗ＰＤ－１抗体の量を測定することにより、決定または調整することができる。

さらに別の実施形態では、抗体は、維持療法により、例えば、６ヵ月間以上の期間にわたって週１回など、投与することができる。

腫瘍療法に対する「治療有効投与量」は、完全または部分的のいずれかであり得る目的の腫瘍応答により測定することができる。完全奏効（ＣＲ）は、疾患の臨床的、放射線学的または他の証拠がないこととして定義される。部分奏効（ＰＲ）は、５０％超の総計腫瘍サイズの低減をもたらす。中央値無増悪期間は、目的の腫瘍応答の持続期間を特性決定する尺度である。

腫瘍療法に対する「治療有効投与量」はまた、疾患の進行を安定化するその能力によっても測定することができる。化合物ががんを阻害する能力は、ヒト腫瘍における効力を予測する動物モデル系において評価することができる。代替的に、組成物のこの特性は、熟練した実施者に公知のインビトロアッセイにより、細胞成長またはアポトーシスを阻害する化合物の能力を調べることにより、評価することができる。治療的化合物の治療有効量は、腫瘍サイズを減少させるか、またはそうでなければ、対象における症状を改善することができる。当業者は、対象のサイズ、対象の症状の重症度、および特定の組成物または選択される投与経路などの因子に基づいて、そのような量を決定することができるであろう。

したがって、さらなる態様では、本発明は、本発明の抗体、コンジュゲート、マルチマー、核酸、ベクター、宿主細胞、ウイルスまたは組成物の医学的使用に関連する。これに関して、本発明は、疾患の治療における使用のための、例えば、腫瘍／がん治療における使用のための、抗体、コンジュゲート、マルチマー、核酸、ベクター、宿主細胞、ウイルスまたは組成物、好ましくは医薬組成物を提供する。表現「疾患の治療における使用のための、例えば、腫瘍／がん治療における使用のための」は、「医薬としての、特にがんの治療方法における使用のための」；またはヒト（またはより一般的にはそれを必要とする対象）における前記治療方法における使用のための医薬製剤の調製における前記生成物の使用と置き換え可能にも本明細書で用いられる。

腫瘍／がん治療における本発明の抗体、コンジュゲート、マルチマー、核酸、ベクター、宿主細胞、ウイルスまたは組成物の使用に対する代替として、本発明の抗体、コンジュゲート、マルチマー、核酸、ベクター、宿主細胞、ウイルスまたは組成物は、その治療に対して免疫応答の誘導が必要とされる他の疾患の治療において使用することができる。したがって、本発明の抗体、コンジュゲート、マルチマー、核酸、ベクター、宿主細胞、ウイルスまたは組成物は、感染治療に対して有効であり得る。感染治療としては、例えば、ヒト肝炎ウイルス（Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ａ型肝炎、またはＥ型肝炎）、ヒトレトロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ１、ＨＩＶ２）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ１、ＨＴＬＶ２）、またはヒトリンパ球向性ウイルス（ｈｕｍａｎｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃｃｅｌｌｔｙｐｅｖｉｒｕｓ）、単純ヘルペスウイルス１型または２型、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒトヘルペスウイルス６型を含むヒトヘルペスウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、日本脳炎ウイルス、ムンプスウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルス、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）を発生させるウイルス、エボラウイルス、西ナイルウイルスによる感染、または人工的に改変されたこれらのウイルスのものが挙げられる。

腫瘍／がん治療における本発明の抗体、コンジュゲート、マルチマー、核酸、ベクター、宿主細胞、ウイルスまたは組成物の使用に対するなおさらなる代替として、本発明の抗体、コンジュゲート、マルチマー、核酸、ベクター、宿主細胞、ウイルスまたは組成物は、その治療に対して活性化型免疫細胞の枯渇が必要とされる他の疾患の治療において使用することができる。したがって、本発明の抗体、コンジュゲート、マルチマー、核酸、ベクター、宿主細胞、ウイルスまたは組成物は、自己免疫疾患の治療に対して有効であり得る。自己免疫疾患としては、例えば、セリアック病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、関節リウマチおよび全身性エリテマトーデスが挙げられ得る。

文脈がそうでないことを示さない限り、がんの治療に関連して上記で開示される本発明の使用および方法の好ましい実施形態に関する開示は、感染疾患または自己免疫疾患の治療に対しても当てはまる。

本発明の抗体、コンジュゲートまたはマルチマー、および使用説明書を含むキットもまた、本発明の範囲内である。キットは、本発明の抗ＰＤ－１抗体を標的とする抗体、酵素基質または他の基質、呈色を得るための酵素などの１つまたは複数の追加の試薬をさらに含むことができる。本発明のキットは、サンプル中のＰＤ－１の定性的または定量的検出のために使用することができる。

特定の実施形態では、本発明は、サンプル中のＰＤ－１抗原の存在を検出するか、またはＰＤ－１抗原の量を測定するための方法であって、抗体またはその一部分とＰＤ－１との間の複合体の形成を可能にする条件下で、好ましくは本明細書に開示される通りの抗体であるＰＤ－１に特異的に結合する抗体と、サンプル、および対照サンプルを接触させることを含む、方法を提供する。次いで、複合体の形成を検出し、対照サンプルと比較したサンプル間での複合体形成の差異が、サンプル中のＰＤ－１抗原の存在を示すものである。

さらに別の実施形態では、本発明は、インビボまたはインビトロにおいてＰＤ－１発現細胞の存在を検出するかまたはその量を定量するための方法を提供する。方法は、（ｉ）検出可能マーカーにコンジュゲートされた本発明の抗体を対象に投与すること；（ｉｉ）ＰＤ－１発現細胞を含有する領域を特定するために、前記検出可能マーカーを検出するための手段へと対象を曝露することを含む。

上記の通りの方法は、特に、ＰＤ－１関連疾患および／またはＰＤ－１関連疾患の局在を診断するために、有用である。好ましくは、対照サンプル中のＰＤ－１の量よりも高いサンプル中のＰＤ－１の量は、サンプルが由来する対象、特にヒトにおけるＰＤ－１関連疾患の存在を示すものである。

さらに別の実施形態では、本発明のコンジュゲートは、化合物（例えば、治療剤、標識など）を、そのような化合物を抗体へと連結することにより、それらの表面上に発現されたＰＤ－１を有する細胞へと標的化するために用いることができる。したがって、本発明はまた、ＰＤ－１を発現する細胞をエクスビボまたはインビトロで局在化するための方法も提供する。

本明細書のタンパク質またはペプチド、構造および機能を説明する場合、アミノ酸が参照される。本明細書では、アミノ酸残基は、以下の略語を使用することにより表現される。また、別途明示的に示されない限り、ペプチドおよびタンパク質のアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端（左側末端から右側末端へと）特定され、Ｎ末端が最初の残基として特定される。アミノ酸は、以下の通り、それらの３文字略語、１文字略語、またはフルネームにより指定される。Ａｌａ：Ａ：アラニン；Ａｓｐ：Ｄ：アスパラギン酸；Ｇｌｕ：Ｅ：グルタミン酸；Ｐｈｅ：Ｆ：フェニルアラニン；Ｇｌｙ：Ｇ：グリシン；Ｈｉｓ：Ｈ：ヒスチジン；Ｉｌｅ：Ｉ：イソロイシン；Ｌｙｓ：Ｋ：リジン；Ｌｅｕ：Ｌ：ロイシン；Ｍｅｔ：Ｍ：メチオニン；Ａｓｎ：Ｎ：アスパラギン；Ｐｒｏ：Ｐ：プロリン；Ｇｌｎ：Ｑ：グルタミン；Ａｒｇ：Ｒ：アルギニン；Ｓｅｒ：Ｓ：セリン；Ｔｈｒ：Ｔ：トレオニン；Ｖａｌ：Ｖ：バリン；Ｔｒｐ：Ｗ：トリプトファン；Ｔｙｒ：Ｙ：チロシン；Ｃｙｓ：Ｃ：システイン。

具体的なアミノ酸配列、例えば、配列表において示されるものに関して本明細書で与えられる教示は、前記具体的配列に機能的に同等である配列を生じる前記具体的配列の変異体、例えば、具体的アミノ酸配列のものと同一または類似の特性を示すアミノ酸配列にも関するように解釈されるべきである。

本発明に従う用語「変異体」とは、特に、突然変異体、スプライシング変異体、コンホメーション、アイソフォーム、対立遺伝子変異体、種変異体および種ホモログ、特に天然に存在するものを意味する。対立遺伝子変異体は、その重要性が多くの場合に不明である、遺伝子の正常配列中の変化に関する。完全な遺伝子配列決定は、多くの場合、所与の遺伝子に対して多数の対立遺伝子変異体を特定する。種ホモログは、所与の核酸またはアミノ酸配列のものとは異なる起源種を有する核酸またはアミノ酸配列である。用語「変異体」は、いずれかの翻訳後修飾変異体およびコンホメーション変異体を包含するであろう。

本発明の目的のために、アミノ酸配列の「変異体」は、アミノ酸挿入変異体、アミノ酸付加変異体、アミノ酸欠失変異体および／またはアミノ酸置換変異体を含む。

好ましくは、所与のアミノ酸配列と前記所与のアミノ酸配列の変異体であるアミノ酸配列との間の類似性、好ましくは同一性の程度は、少なくとも約６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％であろう。類似性または同一性の程度は、好ましくは、参照アミノ酸配列の全長の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％であるアミノ酸領域に対して与えられる。例えば、参照アミノ酸配列が２００アミノ酸からなる場合、類似性または同一性の程度は、好ましくは、少なくとも約２０、少なくとも約４０、少なくとも約６０、少なくとも約８０、少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約１８０、または約２００アミノ酸、好ましくは連続的アミノ酸に対して与えられる。好ましい実施形態では、類似性または同一性の程度は、参照アミノ酸配列の全長に対して与えられる。配列類似性、好ましくは配列同一性を決定するためのアライメントは、当技術分野で公知のツール、好ましくは最良配列アライメントを使用して、例えば、標準的設定、好ましくはＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ、マトリックス：Ｂｌｏｓｕｍ６２、ギャップオープン１０．０、ギャップ伸長０．５を使用するＡｌｉｇｎを使用して、行うことができる。

「配列類似性」は、同一であるかまたは保存的アミノ酸置換を表すかのいずれかであるアミノ酸のパーセンテージを示す。２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」は、配列間で同一であるアミノ酸のパーセンテージを示す。

用語「パーセント同一性」は、最良アライメント後に取得された、比較される２つの配列間で同一であるアミノ酸残基のパーセンテージを意味することが意図され、このパーセンテージは純粋に統計学的であり、２つの配列間の差異は、ランダムかつそれらの全長にわたって分布する。２つのアミノ酸配列間の配列比較は、それらを最適にアライメントした後、これらの配列を比較することにより従来的に行われ、前記比較は、配列類似性の局所領域を特定および比較するために、セグメント毎または「比較ウインドウ」毎に行われる。比較のための配列の最適アライメントは、手動の他に、Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482の局所相同性アルゴリズムによるか、Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443の局所相同性アルゴリズムによるか、Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444の類似性検索法によるか、またはこれらのアルゴリズムを使用するコンピュータプログラム（ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓソフトウェアパッケージ、ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ、５７５ＳｃｉｅｎｃｅＤｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＴＦＡＳＴＡ）を使用して、生成することができる。

パーセント同一性は、比較対象である２つの配列間の同一の位置の個数を決定し、この数を比較される位置の個数により除算し、結果を１００により乗算し、それによりこれら２つの配列間のパーセンテージ同一性を取得することにより算出される。

核酸分子に関して、用語「変異体」は、縮重核酸配列を含み、本発明に従う縮重核酸は、遺伝子コードの縮重に起因してコドン配列において参照核酸とは異なる核酸である。

さらに、本発明に従う所与の核酸配列の「変異体」は、単一または複数、例えば、少なくとも２箇所、少なくとも４箇所、もしくは少なくとも６箇所、好ましくは最大３箇所、最大４箇所、最大５箇所、最大６箇所、最大１０箇所、最大１５箇所、もしくは最大２０箇所のヌクレオチド置換、欠失および／または付加を含む核酸配列を含む。

好ましくは、所与の核酸配列と前記所与の核酸配列の変異体である核酸配列との同一性の程度は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％または最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％であろう。同一性の程度は、好ましくは、少なくとも約３０、少なくとも約５０、少なくとも約７０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１５０、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、少なくとも約３００、または少なくとも約４００ヌクレオチドの領域に対して与えられる。好ましい実施形態では、同一性の程度は、参照核酸配列の全長に対して与えられる。

２つの核酸配列間の「配列同一性」は、配列間で同一であるヌクレオチドのパーセンテージを示す。

用語「パーセンテージ同一性」は、最良アライメント後に取得される、比較される２つの配列間で同一であるヌクレオチドのパーセンテージを意味することが意図され、このパーセンテージは純粋に統計学的であり、２つの配列間の差異は、ランダムかつそれらの全長にわたって分布する。２つのヌクレオチド配列間の配列比較は、それらを最適にアライメントした後、これらの配列を比較することにより従来的に行われ、前記比較は、配列類似性の局所領域を特定および比較するために、セグメント毎または「比較ウインドウ」毎に行われる。比較のための配列の最適アライメントは、手動の他に、Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482の局所相同性アルゴリズムによるか、Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443の局所相同性アルゴリズムによるか、Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444の類似性検索法によるか、またはこれらのアルゴリズムを用いるコンピュータプログラム（ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓソフトウェアパッケージ、ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ、５７５ＳｃｉｅｎｃｅＤｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＴＦＡＳＴＡ）を用いて、生成することができる。

パーセンテージ同一性は、比較対象である２つの配列間の同一の位置の個数を決定し、この数を比較される位置の個数により除算し、かつ結果を１００により乗算し、それによりこれら２つの配列間のパーセンテージ同一性を取得することにより算出される。

用語「部分（ｐａｒｔ）」、「断片」および「一部分（ｐｏｒｔｉｏｎ）」は、本明細書で相互に交換可能に使用され、構造の連続的または不連続的な破片を意味する。アミノ酸配列またはタンパク質または核酸配列などの特定の構造に関して、用語その「部分」、「断片」および「一部分」は、前記構造の連続的または不連続的な破片を示すことができる。好ましくは、アミノ酸配列または核酸配列などの構造の「部分」、「断片」および「一部分」は、好ましくは、全体構造またはアミノ酸配列または核酸配列の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％を含み、好ましくはこれからなる。構造の一部分、部分または断片は、好ましくは、前記構造の１つまたは複数の機能的特性を含む。例えば、エピトープ、ペプチドまたはタンパク質の一部分、部分または断片は、好ましくは、それが由来するエピトープ、ペプチドまたはタンパク質に対して免疫学的に均等である。一部分、部分または断片が不連続的な破片である場合、前記不連続的な破片は、好ましくは、構造の２、３、４、５、６、７、８個またはそれ以上の部分から構成され、各部分は、構造の連続的なエレメントである。例えば、アミノ酸配列の不連続的な破片は、２、３、４、５、６、７、８個またはそれ以上、好ましくは４個以下の前記アミノ酸配列の部分から構成され得、各部分は、好ましくは、アミノ酸配列の少なくとも５個の連続するアミノ酸、少なくとも１０個の連続するアミノ酸、好ましくは少なくとも２０個の連続するアミノ酸、好ましくは少なくとも３０個の連続するアミノ酸を含む。

本発明は、以下の図面および実施例により詳細に説明され、図面および実施例は、例示目的のみのために使用され、本発明の範囲を限定すると解釈されない。説明および実施例により、同様に本発明に含められるさらなる実施形態が、当業者に利用可能である。

配列
本開示内で、以下の配列および配列番号が参照される：
配列番号１ＨＣＤＲ３（ＭＡＢ－１９－０２０２）ＫａｂａｔおよびＩＭＧＴの交差部分（＝Ｋａｂａｔ）
配列番号２ＨＣＤＲ３（ＭＡＢ－１９－０２０８）ＫａｂａｔおよびＩＭＧＴの交差部分（＝Ｋａｂａｔ）
配列番号３ＨＣＤＲ３（ＭＡＢ－１９－０２１７）ＫａｂａｔおよびＩＭＧＴの交差部分（＝Ｋａｂａｔ）
配列番号４ＨＣＤＲ３（ＭＡＢ－１９－０２２３）ＫａｂａｔおよびＩＭＧＴの交差部分（＝Ｋａｂａｔ）
配列番号５ＨＣＤＲ３（ＭＡＢ－１９－０２３３）ＫａｂａｔおよびＩＭＧＴの交差部分（＝Ｋａｂａｔ）

配列番号６ＨＣＤＲ３（ＭＡＢ－１９－０２０２）ＩＭＧＴ
配列番号７ＨＣＤＲ３（ＭＡＢ－１９－０２０８）ＩＭＧＴ
配列番号８ＨＣＤＲ３（ＭＡＢ－１９－０２１７）ＩＭＧＴ
配列番号９ＨＣＤＲ３（ＭＡＢ－１９－０２２３）ＩＭＧＴ
配列番号１０ＨＣＤＲ３（ＭＡＢ－１９－０２３３）ＩＭＧＴ

配列番号１１ＨＣＤＲ２（ＭＡＢ－１９－０２０２）ＫａｂａｔおよびＩＭＧＴの交差部分（＝ＩＭＧＴ）
配列番号１２ＨＣＤＲ２（ＭＡＢ－１９－０２０８）ＫａｂａｔおよびＩＭＧＴの交差部分（＝ＩＭＧＴ）
配列番号１３ＨＣＤＲ２（ＭＡＢ－１９－０２１７）ＫａｂａｔおよびＩＭＧＴの交差部分（＝ＩＭＧＴ）
配列番号１４ＨＣＤＲ２（ＭＡＢ－１９－０２２３）ＫａｂａｔおよびＩＭＧＴの交差部分（＝ＩＭＧＴ）
配列番号１５ＨＣＤＲ２（ＭＡＢ－１９－０２３３）ＫａｂａｔおよびＩＭＧＴの交差部分（＝ＩＭＧＴ）

配列番号１６ＨＣＤＲ２（ＭＡＢ－１９－０２０２）Ｋａｂａｔ
配列番号１７ＨＣＤＲ２（ＭＡＢ－１９－０２０８）Ｋａｂａｔ
配列番号１８ＨＣＤＲ２（ＭＡＢ－１９－０２１７）Ｋａｂａｔ
配列番号１９ＨＣＤＲ２（ＭＡＢ－１９－０２２３）Ｋａｂａｔ
配列番号２０ＨＣＤＲ２（ＭＡＢ－１９－０２３３）Ｋａｂａｔ

ＳＹＮＨＣＤＲ１（ＭＡＢ－１９－０２０２）ＫａｂａｔおよびＩＭＧＴの交差部分
ＲＹＹＨＣＤＲ１（ＭＡＢ－１９－０２０８）ＫａｂａｔおよびＩＭＧＴの交差部分
ＲＹＹＨＣＤＲ１（ＭＡＢ－１９－０２１７）ＫａｂａｔおよびＩＭＧＴの交差部分
配列番号２１ＨＣＤＲ１（ＭＡＢ－１９－０２２３）ＫａｂａｔおよびＩＭＧＴの交差部分
配列番号２２ＨＣＤＲ１（ＭＡＢ－１９－０２３３）ＫａｂａｔおよびＩＭＧＴの交差部分

配列番号２３ＨＣＤＲ１（ＭＡＢ－１９－０２０２）Ｋａｂａｔ
配列番号２４ＨＣＤＲ１（ＭＡＢ－１９－０２０８）Ｋａｂａｔ
配列番号２５ＨＣＤＲ１（ＭＡＢ－１９－０２１７）Ｋａｂａｔ
配列番号２６ＨＣＤＲ１（ＭＡＢ－１９－０２２３）Ｋａｂａｔ
配列番号２７ＨＣＤＲ１（ＭＡＢ－１９－０２３３）Ｋａｂａｔ

配列番号２８ＨＣＤＲ１（ＭＡＢ－１９－０２０２）ＩＭＧＴ
配列番号２９ＨＣＤＲ１（ＭＡＢ－１９－０２０８）ＩＭＧＴ
配列番号３０ＨＣＤＲ１（ＭＡＢ－１９－０２１７）ＩＭＧＴ
配列番号３１ＨＣＤＲ１（ＭＡＢ－１９－０２２３）ＩＭＧＴ
配列番号３２ＨＣＤＲ１（ＭＡＢ－１９－０２３３）ＩＭＧＴ

配列番号３３ＬＣＤＲ３（ＭＡＢ－１９－０２０２）交差部分＝Ｋａｂａｔ＝ＩＭＧＴ
配列番号３４ＬＣＤＲ３（ＭＡＢ－１９－０２０８）交差部分＝Ｋａｂａｔ＝ＩＭＧＴ
配列番号３５ＬＣＤＲ３（ＭＡＢ－１９－０２１７）交差部分＝Ｋａｂａｔ＝ＩＭＧＴ
配列番号３６ＬＣＤＲ３（ＭＡＢ－１９－０２２３）交差部分＝Ｋａｂａｔ＝ＩＭＧＴ
配列番号３７ＬＣＤＲ３（ＭＡＢ－１９－０２３３）交差部分＝Ｋａｂａｔ＝ＩＭＧＴ

ＱＡＳＬＣＤＲ２（ＭＡＢ－１９－０２０２）ＫａｂａｔおよびＩＭＧＴの交差部分（＝ＩＭＧＴ）
ＤＡＳＬＣＤＲ２（ＭＡＢ－１９－０２０８）ＫａｂａｔおよびＩＭＧＴの交差部分（＝ＩＭＧＴ）
ＤＡＳＬＣＤＲ２（ＭＡＢ－１９－０２１７）ＫａｂａｔおよびＩＭＧＴの交差部分（＝ＩＭＧＴ）
ＤＡＳＬＣＤＲ２（ＭＡＢ－１９－０２２３）ＫａｂａｔおよびＩＭＧＴの交差部分（＝ＩＭＧＴ）
ＤＡＳＬＣＤＲ２（ＭＡＢ－１９－０２３３）ＫａｂａｔおよびＩＭＧＴの交差部分（＝ＩＭＧＴ）

配列番号３８ＬＣＤＲ２（ＭＡＢ－１９－０２０２）Ｋａｂａｔ
配列番号３９ＬＣＤＲ２（ＭＡＢ－１９－０２０８）Ｋａｂａｔ
配列番号３９ＬＣＤＲ２（ＭＡＢ－１９－０２１７）Ｋａｂａｔ
配列番号４０ＬＣＤＲ２（ＭＡＢ－１９－０２２３）Ｋａｂａｔ
配列番号４１ＬＣＤＲ２（ＭＡＢ－１９－０２３３）Ｋａｂａｔ

配列番号４２ＬＣＤＲ１（ＭＡＢ－１９－０２０２）ＫａｂａｔおよびＩＭＧＴの交差部分（＝ＩＭＧＴ）
配列番号４３ＬＣＤＲ１（ＭＡＢ－１９－０２０８）ＫａｂａｔおよびＩＭＧＴの交差部分（＝ＩＭＧＴ）
配列番号４４ＬＣＤＲ１（ＭＡＢ－１９－０２１７）ＫａｂａｔおよびＩＭＧＴの交差部分（＝ＩＭＧＴ）
配列番号４５ＬＣＤＲ１（ＭＡＢ－１９－０２２３）ＫａｂａｔおよびＩＭＧＴの交差部分（＝ＩＭＧＴ）
配列番号４６ＬＣＤＲ１（ＭＡＢ－１９－０２３３）ＫａｂａｔおよびＩＭＧＴの交差部分（＝ＩＭＧＴ）

配列番号４７ＬＣＤＲ１（ＭＡＢ－１９－０２０２）Ｋａｂａｔ
配列番号４８ＬＣＤＲ１（ＭＡＢ－１９－０２０８）Ｋａｂａｔ
配列番号４９ＬＣＤＲ１（ＭＡＢ－１９－０２１７）Ｋａｂａｔ
配列番号５０ＬＣＤＲ１（ＭＡＢ－１９－０２２３）Ｋａｂａｔ
配列番号５１ＬＣＤＲ１（ＭＡＢ－１９－０２３３）Ｋａｂａｔ

配列番号５２ＶＨ（ＭＡＢ－１９－０２０２）
配列番号５３ＶＨ（ＭＡＢ－１９－０２０８）
配列番号５４ＶＨ（ＭＡＢ－１９－０２１７）
配列番号５５ＶＨ（ＭＡＢ－１９－０２２３）
配列番号５６ＶＨ（ＭＡＢ－１９－０２３３）

配列番号５７ＶＬ（ＭＡＢ－１９－０２０２）
配列番号５８ＶＬ（ＭＡＢ－１９－０２０８）
配列番号５９ＶＬ（ＭＡＢ－１９－０２１７）
配列番号６０ＶＬ（ＭＡＢ－１９－０２２３）
配列番号６１ＶＬ（ＭＡＢ－１９－０２３３）

配列番号６２Ｈ５（ＭＡＢ－１９－０２０２由来）
配列番号６３Ｈ５（ＭＡＢ－１９－０２３３由来）
配列番号６４Ｈ１（ＭＡＢ－１９－０２３３由来）

配列番号６５Ｌ１（ＭＡＢ－１９－０２０２由来）
配列番号６６Ｌ２（ＭＡＢ－１９－０２０２由来）
配列番号６７Ｌ３（ＭＡＢ－１９－０２０２由来）
配列番号６８Ｌ４（ＭＡＢ－１９－０２０２由来）

配列番号６９Ｌ１（ＭＡＢ－１９－０２３３由来）
配列番号７０Ｌ４（ＭＡＢ－１９－０２３３由来）

配列番号７１ヒトＰＤ－１完全
配列番号７２ヒトＰＤ－１細胞外ドメイン
配列番号７３核酸ヒトＰＤ－１

配列番号７４核酸ＶＨ（ＭＡＢ－１９－０２０２）
配列番号７５核酸ＶＨ（ＭＡＢ－１９－０２０８）
配列番号７６核酸ＶＨ（ＭＡＢ－１９－０２１７）
配列番号７７核酸ＶＨ（ＭＡＢ－１９－０２２３）
配列番号７８核酸ＶＨ（ＭＡＢ－１９－０２３３）

配列番号７９核酸ＶＬ（ＭＡＢ－１９－０２０２）
配列番号８０核酸ＶＬ（ＭＡＢ－１９－０２０８）
配列番号８１核酸ＶＬ（ＭＡＢ－１９－０２１７）
配列番号８２核酸ＶＬ（ＭＡＢ－１９－０２２３）
配列番号８３核酸ＶＬ（ＭＡＢ－１９－０２３３）

配列番号８４核酸Ｈ５（ＭＡＢ－１９－０２０２由来）
配列番号８５核酸Ｈ５（ＭＡＢ－１９－０２３３由来）
配列番号８６核酸Ｈ１（ＭＡＢ－１９－０２３３由来）

配列番号８７核酸Ｌ１（ＭＡＢ－１９－０２０２由来）
配列番号８８核酸Ｌ２（ＭＡＢ－１９－０２０２由来）
配列番号８９核酸Ｌ３（ＭＡＢ－１９－０２０２由来）
配列番号９０核酸Ｌ４（ＭＡＢ－１９－０２０２由来）

配列番号９１核酸Ｌ１（ＭＡＢ－１９－０２３３由来）
配列番号９２核酸Ｌ４（ＭＡＢ－１９－０２３３由来）

配列番号９３ｐＳＴ４－ｈＡｇ－ｈｕｓｅｃ（ｏｐｔ）－抗ＰＤ１－０２０２－ＨＣ－ｈＩｇＧ１－ＬＡＬＡ－ＰＧ－ＦＩ－Ａ３０ＬＡ７０（ＨＣ；ＲｉｂｏＭａｂ－１９－０２０２）

配列番号９４５’－ＵＴＲ
配列番号９５Ｋｏｚａｃ配列
配列番号９６シグナルペプチド配列
配列番号９７定常ドメインＣＨ_１
配列番号９８ヒンジ領域
配列番号９９定常ドメインＣＨ_２
配列番号１００定常ドメインＣＨ_３
配列番号１０１Ｆエレメント
配列番号１０２Ｉエレメント
配列番号１０３ポリ（Ａ）尾部（Ａ３０ＬＡ７０）

配列番号１０４ｐＳＴ４－ｈＡｇ－ｈｕｓｅｃ（ｏｐｔ）－抗ＰＤ１－０２０２－ＬＣ－ｈＩｇＧ１－ＦＩ－Ａ３０ＬＡ７０
（ＬＣ；ＲｉｂｏＭａｂ－１９－０２０２）
配列番号１０５定常ドメインＣＬカッパ

配列番号１０６ｐＳＴ４－ｈＡｇ－ｈｕｓｅｃ（ｏｐｔ）－抗ＰＤ１－０２３３－ＨＣ－ｈＩｇＧ１－ＬＡＬＡ－ＰＧ－ＦＩ－Ａ３０ＬＡ７０（ＨＣ；ＲｉｂｏＭａｂ－１９－０２３３）
配列番号１０７ｐＳＴ４－ｈＡｇ－ｈｕｓｅｃ（ｏｐｔ）－抗ＰＤ１－０２３３－ＬＣ－ｈＩｇＧ１－ＦＩ－Ａ３０ＬＡ７０
（ＬＣ；ＲｉｂｏＭａｂ－１９－０２３３）

本明細書で使用される技術および方法は、本明細書に記載されるか、またはそれ自体公知であり、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.に記載される通りの様式で行われる。キットおよび試薬の使用を含むすべての方法は、具体的に示されない限り、製造業者の情報に従って行われる。
［実施例１］

抗ヒトＰＤ－１抗体の生成
３頭のニュージーランドホワイトウサギに、組換えヒトＨｉｓタグ付きＰＤ－１タンパク質（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号８９８６－ＰＤ）を用いて免疫化した。血液由来の単一Ｂ細胞をソーティングし、実施例２～４に記載される通り、ヒトＰＤ－１酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、細胞性ヒトＰＤ－１結合性アッセイにより、およびヒトＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断バイオアッセイにより、ＰＤ－１特異的抗体の産生について上清をスクリーニングした。スクリーニング陽性のＢ細胞から、ＲＮＡを抽出し、配列決定を行った。重鎖および軽鎖の可変領域を遺伝子合成し、Ｆｃｇ受容体との相互作用を最小化するための突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）を含むヒト免疫グロブリン定常部分（ＩｇＧ１／κ）のＮ末端でｐＣＥＰ４発現ベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｖ０４４５０）中にクローニングした。キメラＰＤ－１抗体の可変領域配列は、以下の表に示される。表１は重鎖の可変領域を示し、表２は軽鎖の可変領域を示す。両方の場合に、Ｋａｂａｔナンバリングに従うフレーミング領域（ＦＲ）ならびに相補性決定領域（ＣＤＲ）が定義される。下線のアミノ酸は、ＩＭＧＴナンバリングに従うＣＤＲを示す。太字は、ＫａｂａｔおよびＩＭＧＴナンバリングの交差部分を示す。

２９３－ｆｒｅｅトランスフェクション試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ／Ｍｅｒｃｋ）を使用するＨＥＫ２９３－ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ細胞一時的トランスフェクションを、ＴｅｃａｎＦｒｅｅｄｏｍＥｖｏデバイスにより実行した。キメラ抗体を、プレートオートサンプラーを伴うＤｉｏｎｅｘＵｌｔｉｍａｔｅ３０００ＨＰＬＣ上でのアフィニティークロマトグラフィーを使用して、細胞上清から精製した。産生されたキメラ抗体を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して、細胞培養上清から精製した。抗体を、１００ｍＭグリシンｐＨ２．５を用いて溶出し、１ＭＴｒｉｓｐＨ９を用いて中和して、最終ｐＨ６～７の間を達成した。精製された抗体を、さらなる分析、特に、実施例２～５に記載される通りのヒトＰＤ－１ＥＬＩＳＡ、細胞性ヒトＰＤ－１結合性アッセイ、ヒトＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断バイオアッセイ、およびＴ細胞増殖アッセイによる再試験のために使用した。２種類のキメラウサギ抗体ＭＡＢ－１９－０２０２およびＭＡＢ－１９－０２３３を、最良性能クローンとして特定し、その後にヒト化した。ヒト化抗体配列は、ＦｕｓｉｏｎＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｂｅｌｆａｓｔ、Ｉｒｅｌａｎｄ）において生成した。組換えヒト化配列の抗体ＩＤへのヒト化軽鎖および重鎖の割り当ては、表３に列記される。ヒト化軽鎖および重鎖の可変領域配列は、表４および表５に示される。表４は重鎖の可変領域を示し、表５は軽鎖の可変領域を示す。両方の場合に、Ｋａｂａｔナンバリングに従うフレーミング領域（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）が定義される。下線のアミノ酸は、ＩＭＧＴナンバリングに従うＣＤＲを示す。

組換えヒト化ｈＩｇＧ１－ＬＡＬＡ抗体をクローニングし、上記の通りに生成させ、実施例２～５に記載される通りのヒトＰＤ－１ＥＬＩＳＡ、細胞性ヒトＰＤ－１結合性アッセイ、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断バイオアッセイ、およびＴ細胞増殖アッセイにより同様に分析した。
［実施例２］

ヒトＰＤ－１ＥＬＩＳＡ
組換えヒトＰＤ－１細胞外ドメインに対するキメラおよびヒト化抗ＰＤ－１抗体の結合効力を、ＥＬＩＳＡにより決定した。組換えヒトＰＤ－１ヒトＦＣキメラ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）を、室温で６０分間、ＰＢＳ（Ｖｅｎｄｏｒ）中の０．６２５μｇ／ｍＬの濃度で、３８４ウェルＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）平底プレート（Ｎｕｎｃ）上にコーティングした。コーティングされたプレートを、ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳ－Ｔ）を用いて３回洗浄し、ＰＢＳ、２％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎとの室温で６０分間のインキュベーションによりブロッキングし、ＰＢＳ－Ｔを用いてさらに３回洗浄した。抗ＰＤ－１抗体を、１，０００～０．０６ｎｇ／ｍＬまたは２，５００～０．１５ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度でＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（ＥＬＩＳＡバッファー）中に添加し、プレートを室温で６０分間インキュベートした。参照抗体として、抗ｈＰＤ－１－Ｎｉ－ｈＩｇＧ４（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ；カタログ番号ｈｐｄ１ｎｉ－ｍａｂ１１４；ニボルマブの可変領域を特徴とする）および抗ｈＰＤ１－Ｐｅｍ－ｈＩｇＧ４（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ；カタログ番号ｈｐｄ１ｐｅ－ｍａｂ１４；ペムブロリズマブの可変領域を特徴とする）を使用した。ＰＢＳ－Ｔを用いる３回の洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼにカップリングしたヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ’）_２断片（ＡｂＤＳｅｒｏｔｅｃ；カタログ番号ＳＴＡＲ１２６Ｐ）を、１：５，０００の希釈でＥＬＩＳＡバッファー中に添加した。プレートを室温で６０分間インキュベートし、ＰＢＳ－Ｔを用いて６回洗浄し、続いて、ＴＭＢ溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加した。１０分間後、ＨＣｌを添加し、４５０ｎｍおよび６２０ｎｍの波長での吸光度を、ＴｅｃａｎＩｎｆｉｎｉｔｅＭ１０００リーダーを使用して記録した。データを、４パラメーターロジスティックモデルを用いてフィッティングし、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ８．４．３（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ、米国）を使用してＥＣ５０値を算出した。

ヒトＰＤ－１に対するキメラ抗ＰＤ－１抗体ＭＡＢ－１９－０２０２、ＭＡＢ－１９－０２０８、ＭＡＢ－１９－０２１７、ＭＡＢ－１９－０２２３、およびＭＡＢ－１９－０２３３の結合曲線は、図１に示される通り、参照抗体抗ｈＰＤ－１－Ｎｉ－ｈＩｇＧ４および抗ｈＰＤ１－Ｐｅｍ－ｈＩｇＧ４と同等であった。ＥＣ５０値の解析は、抗体ＭＡＢ－１９－０２０２、ＭＡＢ－１９－０２０８、ＭＡＢ－１９－０２２３、およびＭＡＢ－１９－０２３３のより低いＥＣ５０値を明らかにした（表６）。キメラ抗体ＭＡＢ－１９－０２０２およびＭＡＢ－１９－０２３３のヒト化後、ヒト化変異体および親キメラ抗体を用いてアッセイを繰り返した（図５および図６）。２種類のキメラおよびヒト化抗ｈＰＤ－１抗体のＥＣ５０値は、すべて、２種類の参照抗体のＥＣ５０値よりも低かった（表７）。
［実施例３］

ＨＥＫ－２９３－ｈＰＤ－１細胞結合性
細胞表面発現ｈＰＤ－１に対するキメラおよびヒト化抗ＰＤ－１抗体の結合性を、全長ヒトＰＤ１を異所的に発現するＨＥＫ－２９３細胞（ＢＰＳＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号６０６８０）を使用して分析した。細胞培養物を、１０％ＦＣＳ、１×ＭＥＭＮＥＡＡ、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび１００μｇ／ｍＬハイグロマイシンＢを含有するＭＥＭ中で成長させた。抗体結合性を試験するために細胞をプレートする場合には、ハイグロマイシンＢは省略した。２０μＬ培地中の１，０００個の細胞を、透明底部を有する黒色３８４ウェル細胞培養処理プレート中に、１ウェル当たりに播種し、３７℃および５％ＣＯ_２で２時間インキュベートした。抗ＰＤ－１抗体を、１，０００～０．０６ｎｇ／ｍＬまたは６２０～０．４５ｎｇ／ｍＬの範囲の最終濃度まで、５μＬ培地中に添加した。参照抗体として、抗ｈＰＤ－１－Ｎｉ－ｈＩｇＧ４および抗ｈＰＤ１－Ｐｅｍ－ｈＩｇＧ４を使用した。３７℃および５％ＣＯ_２での１８時間のインキュベーション後、２５μＬＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（細胞洗浄バッファー）を用いてプレートを１回洗浄し、Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ－４８８コンジュゲート化ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ’）_２断片（Ｖｅｎｄｏｒ）を、２０μＬ培地中に０．８μｇ／ｍＬの濃度で添加した。プレートを、暗所にて３７℃および５％ＣＯ_２で４時間インキュベートし、２５μＬ細胞洗浄バッファーを用いて１回洗浄し、５μｇ／ｍＬＨｏｅｃｈｓｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する２０μＬ培地と共に１０分間インキュベートした。細胞関連免疫蛍光シグナルを、ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔＣＸ５ハイコンテントイメージャーデバイス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して記録した。データを、４パラメーターロジスティックモデルを用いてフィッティングし、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ８．４．３を使用してＥＣ５０値を算出した。

ヒトＰＤ－１に対するキメラ抗ＰＤ－１抗体ＭＡＢ－１９－０２０２、ＭＡＢ－１９－０２０８、ＭＡＢ－１９－０２１７、ＭＡＢ－１９－０２２３、およびＭＡＢ－１９－０２３３の細胞結合性に関する結合曲線は、図２に示される通り、参照抗体抗ｈＰＤ－１－Ｎｉ－ｈＩｇＧ４および抗ｈＰＤ１－Ｐｅｍ－ｈＩｇＧ４と同等であった。ＥＣ５０値の解析は、抗体ＭＡＢ－１９－０２１７、およびＭＡＢ－１９－０２２３のより低いＥＣ５０値を明らかにした（表６）。ＭＡＢ－１９－０２０２に対するＥＣ５０値は、不完全なフィッティングに起因して算出できなかった（ｎ．ａ．不適用）。キメラ抗体ＭＡＢ－１９－０２０２およびＭＡＢ－１９－０２３３のヒト化後、ヒト化変異体および親キメラ抗体を用いてアッセイを繰り返した（図７および図８）。２種類のキメラおよびヒト化抗ｈＰＤ－１抗体（ＭＡＢ－１９－０５９４を除く）のＥＣ５０値は、すべて、この実験において２種類の参照抗体よりも低かった（表７）。
［実施例４］

ヒトＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断バイオアッセイ
ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を遮断するキメラおよびヒト化抗ＰＤ－１抗体の効力を、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断バイオアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ；カタログ番号Ｊ１２５０）を製造業者の説明書に従って使用して分析した。簡潔には、５００μＬのＰＤ－Ｌ１発現人工ＡＰＣａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞懸濁物を、１４．５ｍＬ細胞回復培地［９０％Ｈａｍ’ｓＦ－１２（Ｐｒｏｍｅｇａ；カタログ番号Ｊ１２３Ａ）＋１０％胎児ウシ血清（Ｐｒｏｍｅｇａ；カタログ番号Ｊ１２１Ａ）］に添加し、２５μＬ細胞懸濁物を、平底３８４ウェルアッセイプレートのウェル当たりに播種した。３７℃および５％ＣＯ_２での一晩のインキュベーション後、培地を除去し、抗体を、４０，０００～１８ｎｇ／ｍＬまたは２０，０００～９ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度で１０μＬＨＡＭ’ｓＦ－１２、１％ＦＢＳに添加した。参照抗体として、抗ｈＰＤ－１－Ｎｉ－ｈＩｇＧ４および抗ｈＰＤ１－Ｐｅｍ－ｈＩｇＧ４を使用した。ＰＤ－１発現エフェクター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ；カタログ番号Ｊ１１５Ａ）を解凍し、ＨＡＭ’ｓＦ－１２、１％ＦＢＳ中に再懸濁した。１０μＬエフェクター細胞懸濁物を各ウェルに添加し、プレートを、３７℃および５％ＣＯ_２で６時間インキュベートした。プレートを室温で１０分間平衡化し、２０μＬＢｉｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ試薬を各ウェルに添加した。室温での１５分間のインキュベーション後、発光を、ＴｅｃａｎＩｎｆｉｎｉｔｅＭ１０００リーダーを使用して測定した。データを、４パラメーターロジスティックモデルを用いてフィッティングし、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ８．４．３を使用してＥＣ５０値を算出した。

キメラ抗ＰＤ－１抗体ＭＡＢ－１９－０２０２、ＭＡＢ－１９－０２０８、ＭＡＢ－１９－０２１７、ＭＡＢ－１９－０２２３、およびＭＡＢ－１９－０２３３のＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１遮断活性は、図３に示される通り、参照抗体抗ｈＰＤ－１－Ｎｉ－ｈＩｇＧ４および抗ｈＰＤ１－Ｐｅｍ－ｈＩｇＧ４と同等であった。これはまた、ＩＣ５０値にも反映された（表６）。ＭＡＢ－１９－０２０２およびＭＡＢ－１９－０２３３は、２種類の参照抗体よりも明らかに良好な性能を示し、２種類の参照抗体と比較してより低いＩＣ５０値を生じた。

キメラ抗体ＭＡＢ－１９－０２０２およびＭＡＢ－１９－０２３３のヒト化後、ヒト化変異体および親キメラ抗体を用いてアッセイを繰り返した（図９および図１０）。ここでも、ＭＡＢ－１９－０２０２および誘導されたヒト化抗体は、２種類の参照抗体よりも高い性能を示した（図９および表２）。ＭＡＢ－１９－０２３３および誘導されたヒト化抗体は、参照抗体と同等の性能を示した（図１０および表７）。
［実施例５］

初代細胞に基づく設定における抗ヒトＰＤ－１抗体の機能的活性を測定するための活性ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１軸を用いる抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞増殖アッセイ
活性ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１軸を用いる抗原特異的アッセイにおけるキメラおよびヒト化抗ＰＤ１抗体によるＴ細胞増殖の誘導を測定するために、樹状細胞（ＤＣ）を、クローディン－６抗原を発現させるために、クローディン－６インビトロ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ－ＲＮＡ）を用いてトランスフェクションした。Ｔ細胞を、ＰＤ－１ＩＶＴ－ＲＮＡを用いて、およびクローディン－６特異的ＨＬＡ－Ａ２拘束Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を用いてトランスフェクションした。このＴＣＲは、ＤＣ上のＨＬＡ－Ａ２において提示されるクローディン－６由来エピトープを認識することができる。抗ＰＤ１抗体は、単球由来ＤＣ上に内因性に発現されるＰＤ－Ｌ１とＴ細胞上のＰＤ－１との間の阻害性ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を遮断し、強化されたＴ細胞増殖をもたらすことができる。

ＨＬＡ－Ａ２^＋末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、健康ドナーから取得した（Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎｓｚｅｎｔｒａｌｅ、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＨｏｓｐｉｔａｌ、Ｍａｉｎｚ、ドイツ）。単球を、製造業者の説明書に従って、抗ＣＤ１４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ；カタログ番号１３０－０５０－２０１）を使用する磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）技術により、ＰＢＭＣから単離した。末梢血リンパ球（ＰＢＬ、ＣＤ１４陰性画分）を、将来のＴ細胞単離のために凍結させた。未熟ＤＣ（ｉＤＣ）への分化のために、１×１０^６個の単球／ｍＬを、５％ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｅＧｍｂＨ、カタログ番号Ｈ４５２２－１００ＭＬ）、ピルビン酸ナトリウム（ＬｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＧｍｂＨ、カタログ番号１１３６０－０３９）、非必須アミノ酸（ＬｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＧｍｂＨ、カタログ番号１１１４０－０３５）、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン・ストレプトマイシン（ＬｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＧｍｂＨ、カタログ番号１５１４０－１２２）、１，０００ＩＵ／ｍＬ顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０－０９３－８６８）および１，０００ＩＵ／ｍＬインターロイキン－４（ＩＬ－４；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０－０９３－９２４）を含有するＲＰＭＩＧｌｕｔａＭＡＸ（ＬｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＧｍｂＨ、カタログ番号６１８７０－０４４）中で５日間培養した。これらの５日の間に１回、培地の半分を、新鮮培地を用いて置き換えた。ｉＤＣを、非接着細胞を収集することにより回収し、接着細胞を、２ｍＭＥＤＴＡを含有するＰＢＳと共に３７℃で１０分間インキュベートすることにより剥がした。洗浄後、ｉＤＣを、将来の抗原特異的Ｔ細胞アッセイのために、１０％ｖ／ｖＤＭＳＯ（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍＧｍｂＨ、カタログ番号Ａ３６７２，００５０）＋５０％ｖ／ｖヒトＡＢ血清を含有するＲＰＭＩＧｌｕｔａＭＡＸ中で凍結させた。

抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞増殖アッセイの開始の１日前に、同じドナー由来の凍結ＰＢＬおよびｉＤＣを解凍した。ＣＤ８^＋Ｔ細胞を、製造業者の説明書に従って、抗ＣＤ８マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０－０４５－２０１）を使用するＭＡＣＳ技術により、ＰＢＬから単離した。約１０～１５×１０^６個のＣＤ８^＋Ｔ細胞を、ＢＴＸＥＣＭ（登録商標）８３０エレクトロポレーションシステムデバイス（ＢＴＸ；５００Ｖ、１×３ｍｓパルス）を使用して、４ｍｍエレクトロポレーションキュベット（ＶＷＲＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＧｍｂＨ、カタログ番号７３２－００２３）において、２５０μＬＸ－Ｖｉｖｏ１５（ＢｉｏｚｙｍＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＧｍｂＨ、カタログ番号８８１０２６）中の１０μｇのアルファ鎖をコードするインビトロ転写（ＩＶＴ）ＲＮＡ＋１０μｇのクローディン－６特異的ネズミＴＣＲ（ＨＬＡ－Ａ２拘束；ＷＯ２０１５／１５０３２７Ａ１に記載される）のベータ鎖をコードするＩＶＴ－ＲＮＡ＋１０μｇのＰＤ－１をコードするＩＶＴ－ＲＮＡを用いてエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション直後、細胞を、５％ヒトＡＢ血清を補充した新鮮ＩＭＤＭ培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＧｍｂＨ、カタログ番号１２４４０－０６１）へと移し、３７℃、５％ＣＯ_２で少なくとも１時間休ませた。Ｔ細胞を、製造業者の説明書に従って、ＰＢＳ中の１．６μＭカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｃ３４５６４）を使用して標識し、５％ヒトＡＢ血清を補充したＩＭＤＭ培地中で一晩インキュベートした。

最大５×１０^６個の解凍ｉＤＣを、上記の通りのエレクトロポレーションシステムを使用して（３００Ｖ、１×１２ｍｓパルス）、２５０μＬＸ－Ｖｉｖｏ１５培地中の全長クローディン－６をコードする３μｇＩＶＴ－ＲＮＡを用いてエレクトロポレーションし、５％ヒトＡＢ血清を補充したＩＭＤＭ培地中で一晩インキュベートした。

次の日、細胞を回収した。ＤＣ上のクローディン－６およびＰＤ－Ｌ１ならびにＴ細胞上のＴＣＲおよびＰＤ－１の細胞表面発現を、フローサイトメトリーにより調べた。ＤＣを、Ａｌｅｘａ６４７コンジュゲート化ＣＬＤＮ６特異的抗体（市販でない；社内生成）および抗ヒトＣＤ２７４抗体（ＰＤ－Ｌ１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｅｓ、カタログ番号１２－５９８３）を用いて染色し、Ｔ細胞を、抗マウスＴＣＲβ鎖抗体（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎＧｍｂＨ、カタログ番号５５３１７４）および抗ヒトＣＤ２７９抗体（ＰＤ－１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｅｓ、カタログ番号１７－２７９９）を用いて染色した。５，０００個のエレクトロポレーションされたＤＣを、９６ウェル丸底プレート中の５％ヒトＡＢ血清を補充したＩＭＤＭＧｌｕｔａＭＡＸ中で、キメラおよびヒト化抗ｈＰＤ－１抗体ならびに参照抗体ペムブロリズマブ（ＭＳＤ；ＰＺＮ１０７４９８９７、ＰｈｏｅｎｉｘＡｐｏｔｈｅｋｅＭａｉｎｚから購入）の存在下において、５０，０００個のエレクトロポレーションされたＣＦＳＥ標識Ｔ細胞と共にインキュベートした。Ｔ細胞増殖を、フローサイトメトリーの５日後に測定した。ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）またはＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａ（商標）フローサイトメーター（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でデータを取得した。データを、ＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェアＶ１０．３を使用して解析した。ＣＦＳＥ希釈に基づく増殖解析を、ＦｌｏｗＪｏからの増殖モデリングツールを使用して行い、生成ピークを自動的にフィッティングし、拡大増殖指数値を算出した。データを、４パラメーターロジスティックモデルを用いてフィッティングし、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ８．４．３を使用してＥＣ５０値を算出した。

ＭＡＢ－１９－０２０２から誘導されたすべてのキメラ抗体およびヒト化抗ｈＰＤ－１抗体を、このＴ細胞増殖アッセイにより、０．２ｎｇ／ｍＬから０．６μｇ／ｍＬの範囲の濃度において試験した。これらのうちのすべてが、阻害性ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１軸を遮断することができ、かつＣＤ８^＋Ｔ細胞の強い増殖を誘導した。このことは、拡大増殖指数における増加により反映された。フィッティングされた用量応答曲線は、図４および図１１に示される通り、ペムブロリズマブに対する、すべての試験されたキメラおよびヒト化抗体により誘導される増殖の同等な増加を明らかにした。

表

［実施例６］

インビトロ転写による抗ヒトＰＤ－１ＲｉｂｏＭａｂの生成
インビトロ転写されたメッセンジャーＲＮＡ（ＩＶＴ－ｍＲＮＡ）を介した抗ＰＤ－１ＲｉｂｏＭａｂの生成のために、本発明者らは、標準的なクローニング技術を使用して、ヒト免疫グロブリン定常部分（突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇを有するＩｇＧ１κ）のＮ末端において、ＭＡＢ－１９－０２０２－ＬＣ（配列番号７９）、ＭＡＢ－１９－０２３３－ＬＣ（配列番号８３）、ＭＡＢ－１９－０２０２－ＨＣ（配列番号７４）およびＭＡＢ－１９－０２３３－ＨＣ（配列番号７８）のＤＮＡ配列を、ＩＶＴ－ｍＲＮＡ鋳型ベクターｐＳＴ４－ｈＡｇ－ＭＣＳ－ＦＩ－Ａ３０ＬＡ７０（ＢｉｏＮＴｅｃｈＳＥ）へと挿入した。このベクターは、他の場所に記載される通りのヒトアルファ－グロビン（ｈＡｇ）５’非翻訳領域（ＵＴＲ）リーダー配列および特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７３８１４に記載される通りの３’ＦＩエレメントを含む。ポリ（Ａ）尾部は、３０個のアデニンヌクレオチド、リンカー（Ｌ）およびさらなる７０個のアデニンヌクレオチドからなる（Ａ３０ＬＡ７０、ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０６５３５７）。以下のコンストラクトを、抗ＰＤ－１ＲｉｂｏＭａｂの形成のためにクローニングした：

ＲｉｂｏＭａｂ－１９－０２０２：
重鎖：以下に示され、配列表の配列番号９３に描写される通りの核酸配列を有するｐＳＴ４－ｈＡｇ－ｈｕｓｅｃ（ｏｐｔ）－抗ＰＤ１－０２０２－ＨＣ－ｈＩｇＧ１－ＬＡＬＡ－ＰＧ－ＦＩ－Ａ３０ＬＡ７０：
ATTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCGCCACCATGAGAGTGATGGCCCCCAGAACCCTGATCCTGCTGCTGTCTGGCGCCCTGGCCCTGACAGAGACATGGGCCGGAAGCCAGAGCGTGGAAGAATCTGGCGGCAGACTGGTCACACCTGGCACACCTCTGACACTGACCTGTACCGTGTCCGGCTTCAGCCTGTACAGCTACAACATGGGCTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAGGGACTCGAGTACATCGGCATCATCAGCGGCGGCACAATCGGCCACTATGCCTCTTGGGCCAAGGGCAGATTCACCATCAGCAAGACCAGCAGCACCACCGTGGACCTGAAGATGACCAGCCTGACCACCGAGGACACCGCCACCTACTTTTGCGCCAGAGCCTTCTACGACGACTACGACTACAACGTGTGGGGCCCAGGCACACTCGTGACAGTCTCCTCTGCCTCTACAAAGGGCCCTAGCGTGTTCCCTCTGGCTCCTAGCAGCAAGTCTACAAGCGGAGGAACAGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGATTACTTTCCCGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAATTCTGGCGCTCTGACAAGCGGCGTGCACACCTTTCCAGCTGTGCTGCAAAGCAGCGGCCTGTACTCTCTGAGCAGCGTGGTCACAGTGCCAAGCTCTAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAATGTGAACCACAAGCCTAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGTCCTCCATGTCCTGCTCCAGAAGCTGCTGGCGGCCCTTCCGTGTTTCTGTTCCCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGATCCCGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAACAGTACAACAGCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGGGCGCTCCCATCGAGAAAACCATCTCTAAGGCCAAGGGACAGCCCCGCGAACCTCAGGTTTACACACTGCCTCCAAGCCGGGAAGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTCGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACAACCCCTCCTGTGCTGGACTCCGATGGCTCATTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACAGTGGACAAGTCCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGTCTCCTGGATGATGACTCGAGCTGGTACTGCATGCACGCAATGCTAGCTGCCCCTTTCCCGTCCTGGGTACCCCGAGTCTCCCCCGACCTCGGGTCCCAGGTATGCTCCCACCTCCACCTGCCCCACTCACCACCTCTGCTAGTTCCAGACACCTCCCAAGCACGCAGCAATGCAGCTCAAAACGCTTAGCCTAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGTGATTAACCTTTAGCAATAAACGAAAGTTTAACTAAGCTATACTAACCCCAGGGTTGGTCAATTTCGTGCCAGCCACACCGAGACCTGGTCCAGAGTCGCTAGCCGCGTCGCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCATATGACTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA（配列番号９３）

配列表の配列番号９３に描写される通りの配列内には、以下のエレメントが含められる：
以下に示され、配列表の配列番号９４に描写される通りの核酸配列を有する５’－ＵＴＲ（「ｈＡｇ」）。
ATTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCC（配列番号９４）

以下に示され、配列表の配列番号９５に描写される通りの核酸配列を有する「Ｋｏｚａｃ配列」。
GCCACC（配列番号９５）

以下に示され、配列表の配列番号９６に描写される通りの核酸配列を有する分泌シグナルペプチド配列［「ｈｕｓｅｃ（ｏｐｔ）」）。
ATGAGAGTGATGGCCCCCAGAACCCTGATCCTGCTGCTGTCTGGCGCCCTGGCCCTGACAGAGACATGGGCCGGAAGC（配列番号９６）

配列表の配列番号７４に描写される通りの核酸配列を有する重鎖可変ドメイン（「抗ＰＤ１－０２０２－ＨＣ」）。

以下に示され、配列表の配列番号９７に描写される通りの核酸配列を有する定常ドメインＣＨ_１。
GCCTCTACAAAGGGCCCTAGCGTGTTCCCTCTGGCTCCTAGCAGCAAGTCTACAAGCGGAGGAACAGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGATTACTTTCCCGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAATTCTGGCGCTCTGACAAGCGGCGTGCACACCTTTCCAGCTGTGCTGCAAAGCAGCGGCCTGTACTCTCTGAGCAGCGTGGTCACAGTGCCAAGCTCTAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAATGTGAACCACAAGCCTAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTG（配列番号９７）

以下に示され、配列表の配列番号９８に描写される通りの核酸配列を有するヒンジ領域。
GAACCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGTCCTCCATGTCCT（配列番号９８）

以下に示され、配列表の配列番号９９に描写される通りの核酸配列を有する定常ドメインＣＨ_２。
GCTCCAGAAGCTGCTGGCGGCCCTTCCGTGTTTCTGTTCCCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGATCCCGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAACAGTACAACAGCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGGGCGCTCCCATCGAGAAAACCATCTCTAAGGCCAAG（配列番号９９）

以下に示され、配列表の配列番号１００に描写される通りの核酸配列を有する定常ドメインＣＨ_３。
GGACAGCCCCGCGAACCTCAGGTTTACACACTGCCTCCAAGCCGGGAAGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTCGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACAACCCCTCCTGTGCTGGACTCCGATGGCTCATTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACAGTGGACAAGTCCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGTCTCCTGGA（配列番号１００）

以下に示され、配列表の配列番号１０１に描写される通りの核酸配列を有する「Ｆエレメント」。
CTGGTACTGCATGCACGCAATGCTAGCTGCCCCTTTCCCGTCCTGGGTACCCCGAGTCTCCCCCGACCTCGGGTCCCAGGTATGCTCCCACCTCCACCTGCCCCACTCACCACCTCTGCTAGTTCCAGACACCTCC（配列番号１０１）

以下に示され、配列表の配列番号１０２に描写される通りの核酸配列を有する「Ｉエレメント」。
CAAGCACGCAGCAATGCAGCTCAAAACGCTTAGCCTAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGTGATTAACCTTTAGCAATAAACGAAAGTTTAACTAAGCTATACTAACCCCAGGGTTGGTCAATTTCGTGCCAGCCACACC（配列番号１０２）

以下に示され、配列表の配列番号１０３に描写される通りの核酸配列を有するポリ（Ａ）尾部（「Ａ３０ＬＡ７０」）。
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCATATGACTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA（配列番号１０３）

軽鎖：以下に示され、配列表の配列番号１０４に描写される通りの核酸配列を有するｐＳＴ４－ｈＡｇ－ｈｕｓｅｃ（ｏｐｔ）－抗ＰＤ１－０２０２－ＬＣ－ｈＩｇＧ１－ＦＩ－Ａ３０ＬＡ７０：
ATTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCGCCACCATGAGAGTGATGGCCCCCAGAACCCTGATCCTGCTGCTGTCTGGCGCCCTGGCCCTGACAGAGACATGGGCCGGAAGCGCTGCTGTGCTGACCCAGACACCTTCTCCAGTGTCTGCCGCCGTTGGCGGCACAGTGACAATCAGCTGTCAGAGCAGCCAGAGCGTGTACGGCAACAACCAGCTGTCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTGATCTACCAGGCCAGCAAGCTGGAAACAGGCGTGCCCAGCAGATTCAAAGGCAGCGGCTCTGGCACCCAGTTCACCCTGACAATCTCCGACCTGGAAAGCGACGATGCCGCCACCTACTATTGTGCCGGCGGATACAGCAGCAGCTCCGACACAACATTTGGCGGCGGAACAGAGGTGGTGGTCAAGCGTACGGTGGCCGCTCCTAGCGTGTTCATCTTCCCACCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTCTGGCACAGCCAGCGTTGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCAGAGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAATAGCCAAGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCTACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACACTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAAGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCACCAGGGCCTTTCTAGCCCTGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAATGTTGATGACTCGAGCTGGTACTGCATGCACGCAATGCTAGCTGCCCCTTTCCCGTCCTGGGTACCCCGAGTCTCCCCCGACCTCGGGTCCCAGGTATGCTCCCACCTCCACCTGCCCCACTCACCACCTCTGCTAGTTCCAGACACCTCCCAAGCACGCAGCAATGCAGCTCAAAACGCTTAGCCTAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGTGATTAACCTTTAGCAATAAACGAAAGTTTAACTAAGCTATACTAACCCCAGGGTTGGTCAATTTCGTGCCAGCCACACCGAGACCTGGTCCAGAGTCGCTAGCCGCGTCGCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCATATGACTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA（配列番号１０４）

この配列内では、エレメントは以下の通りである：配列表の配列番号９４および９５に描写される通りの「Ｋｏｚａｃ配列」を含む５’－ＵＴＲ、配列表の配列番号９６に描写される通りの分泌シグナルペプチド配列［「ｈｕｓｅｃ（ｏｐｔ）」］、配列表の配列番号７９に描写される通りの核酸配列を有する軽鎖可変ドメイン（「抗ＰＤ１－０２０２－ＬＣ」）、以下に示され、配列表の配列番号１０５に描写される通りの核酸配列を有する定常ドメイン（ＣＬカッパ）、配列表の配列番号１０１に描写される通りの「Ｆエレメント」、配列表の配列番号１０２に描写される通りの「Ｉエレメント」、ならびに配列表の配列番号１０３に描写される通りのポリ（Ａ）尾部（「Ａ３０ＬＡ７０」）。
CGTACGGTGGCCGCTCCTAGCGTGTTCATCTTCCCACCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTCTGGCACAGCCAGCGTTGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCAGAGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAATAGCCAAGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCTACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACACTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAAGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCACCAGGGCCTTTCTAGCCCTGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAATGT（配列番号１０５）

ＲｉｂｏＭａｂ－１９－０２３３：
重鎖：以下に示され、配列表の配列番号１０６に描写される通りの核酸配列を有するｐＳＴ４－ｈＡｇ－ｈｕｓｅｃ（ｏｐｔ）－抗ＰＤ１－０２３３－ＨＣ－ｈＩｇＧ１－ＬＡＬＡ－ＰＧ－ＦＩ－Ａ３０ＬＡ７０：
ATTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCGCCACCATGAGAGTGATGGCCCCCAGAACCCTGATCCTGCTGCTGTCTGGCGCCCTGGCCCTGACAGAGACATGGGCCGGAAGCCAGAGCCTGGAAGAATCTGGCGGCGATCTTGTGAAACCTGGCGCCTCTCTGACCCTGACATGTAAAGCCAGCGGCATCGACTTCAGCAGCGTGTACTACATGTGTTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAAGGCCTGGAATGGATCGCCTGTATCTACGTGGGCAGCAGCGGCGTGTCCTACTATGCCACATGGGCCAAGGGCAGATTCACCATCAGCAAGACCAGCAGCACCACCGTGACACTGCAGATGACATCTCTGACAGCCGCCGACACCGCCACCTACTTTTGTGCCAGAGCCGGATATGTGGGCGCCGTGTATGTGACACTGACCAGACTGGATCTGTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACAGTCTCCTCTGCCTCTACAAAGGGCCCTAGCGTGTTCCCTCTGGCTCCTAGCAGCAAGTCTACAAGCGGAGGAACAGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGATTACTTTCCCGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAATTCTGGCGCTCTGACAAGCGGCGTGCACACCTTTCCAGCTGTGCTGCAAAGCAGCGGCCTGTACTCTCTGAGCAGCGTGGTCACAGTGCCAAGCTCTAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAATGTGAACCACAAGCCTAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGTCCTCCATGTCCTGCTCCAGAAGCTGCTGGCGGCCCTTCCGTGTTTCTGTTCCCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGATCCCGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAACAGTACAACAGCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGGGCGCTCCCATCGAGAAAACCATCTCTAAGGCCAAGGGACAGCCCCGCGAACCTCAGGTTTACACACTGCCTCCAAGCCGGGAAGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTCGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACAACCCCTCCTGTGCTGGACTCCGATGGCTCATTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACAGTGGACAAGTCCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGTCTCCTGGATGATGACTCGAGCTGGTACTGCATGCACGCAATGCTAGCTGCCCCTTTCCCGTCCTGGGTACCCCGAGTCTCCCCCGACCTCGGGTCCCAGGTATGCTCCCACCTCCACCTGCCCCACTCACCACCTCTGCTAGTTCCAGACACCTCCCAAGCACGCAGCAATGCAGCTCAAAACGCTTAGCCTAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGTGATTAACCTTTAGCAATAAACGAAAGTTTAACTAAGCTATACTAACCCCAGGGTTGGTCAATTTCGTGCCAGCCACACCGAGACCTGGTCCAGAGTCGCTAGCCGCGTCGCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCATATGACTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA（配列番号１０６）

軽鎖：以下に示され、配列表の配列番号１０７に描写される通りの核酸配列を有するｐＳＴ４－ｈＡｇ－ｈｕｓｅｃ（ｏｐｔ）－抗ＰＤ１－０２３３－ＬＣ－ｈＩｇＧ１－ＦＩ－Ａ３０ＬＡ７０：
ATTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCGCCACCATGAGAGTGATGGCCCCCAGAACCCTGATCCTGCTGCTGTCTGGCGCCCTGGCCCTGACAGAGACATGGGCCGGAAGCGCTGCTGTGCTGACCCAGACACCTTCTCCAGTGTCTGCCGCCGTTGGCGGCACAGTGACAATCAGCTGTCAGAGCAGCCAGAGCATCTACACCAACAACGACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTGATCTACGATGCCAGCAAGCTGGCCTCTGGCGTGCCAAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCCAGTTCACCCTGACAATTAGCGGCGTGCAGTCCGATGATGCCGCCACCTATTATTGCCTCGGCGGCTACGATGACGACGCCGACAATGCTTTTGGCGGCGGAACAGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGTGGCCGCTCCTAGCGTGTTCATCTTCCCACCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTCTGGCACAGCCAGCGTTGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCAGAGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAATAGCCAAGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCTACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACACTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAAGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCACCAGGGCCTTTCTAGCCCTGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAATGTTGATGACTCGAGCTGGTACTGCATGCACGCAATGCTAGCTGCCCCTTTCCCGTCCTGGGTACCCCGAGTCTCCCCCGACCTCGGGTCCCAGGTATGCTCCCACCTCCACCTGCCCCACTCACCACCTCTGCTAGTTCCAGACACCTCCCAAGCACGCAGCAATGCAGCTCAAAACGCTTAGCCTAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGTGATTAACCTTTAGCAATAAACGAAAGTTTAACTAAGCTATACTAACCCCAGGGTTGGTCAATTTCGTGCCAGCCACACCGAGACCTGGTCCAGAGTCGCTAGCCGCGTCGCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCATATGACTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA（配列番号１０７）

インビトロ転写のための鋳型を生成するために、プラスミドＤＮＡを、クラスＩＩ制限エンドヌクレアーゼを使用してポリ（Ａ）尾部コード領域の下流で直線化し、それにより、ポリ（Ａ）尾部の後ろに追加のヌクレオチドを含まないｍＲＮＡを転写するための鋳型を生成した［Holtkamp et al. (2006) Blood 108 (13), 4009-4017］。直線化した鋳型ＤＮＡを精製し、本質的に以前に記載された通りにＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いるインビトロ転写に供した［Grudzien-Nogalska et al. (2013) Methods Mol Biol. 969:55-72］。免疫原性を最小化するために、Ｎ１－メチルシュードウリジン－５’－三リン酸（ＴｒｉＬｉｎｋＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｍ^１ΨＴＰを、ＵＴＰの代わりに組み込み［Kariko et al. (2008) Mol. Ther. 16 (11), 1833-1840］、二本鎖ＲＮＡをセルロース精製により除去した［Baiersdoerfer et al. (2019) Nucleic acids 15, 26-35］。ＲＮＡを、ＣｌｅａｎＣａｐ４１３、Ｃａｐ１構造を用いてキャッピングし、続いて、磁性粒子を用いて精製した。精製されたｍＲＮＡを、Ｈ_２Ｏに溶出し、さらなる使用まで－８０℃で保存した。
［実施例７］

抗ヒトＰＤ－１ＲｉｂｏＭａｂの発現およびＰＤ－１結合性
生成されたＲｉｂｏＭａｂコードｍＲＮＡを、ＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞へのｍＲＮＡのリポフェクションによりインビトロ発現させ、ヒトＰＤ－１発現Ｋ５６２細胞に対するＲｉｂｏＭａｂ含有上清の結合性を、フローサイトメトリーにより決定した（図１２）。

ＲｉｂｏＭａｂ－１９－０２０２の発現のために、Ｍａｂ－１９－０２０２軽鎖およびＭａｂ－１９－０２０２重鎖（配列番号９３および１０４を参照されたい）をコードするｍＲＮＡを発現させ、一方、ＲｉｂｏＭａｂ－１９－０２３３の発現のために、Ｍａｂ－１９－０２３３軽鎖およびＭａｂ－１９－０２３３重鎖（配列番号１０６および１０７を参照されたい）をコードするｍＲＮＡを発現させた。

リポフェクションの１日前に、１．２×１０^６個ＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞を、６ウェルプレートにおいて３ｍＬＤＭＥＭ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＧｍｂＨ、カタログ番号３１９６６－０２１）＋１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｆ７５２４）中に播種した。リポフェクションのために、３μｇｍＲＮＡを、１μＬのリポフェクタミンＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＬＭＲＮＡ０１５）当たり４００ｎｇｍＲＮＡを使用して、２：１質量比の重鎖および軽鎖コードｍＲＮＡにおいて、無菌かつＲＮアーゼ不含条件下で製剤化し、約８０％コンフルエンスでのＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞の１０ｃｍ^２培養ディッシュ当たりに適用した。２０時間の発現後、上清を無菌条件下で回収し、さらなる使用まで－２０℃で保存した。

対数期で成長する２０×１０^６個細胞のＫ５６２細胞を、全長ヒトＰＤ－１のエレクトロポレーションのために使用した。２５０μＬＸ－Ｖｉｖｏ１５培地（ＬＯＮＺＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＢＥ０２－０６０Ｆ）中の細胞を、４ｍｍギャップキュベット中で１０μｇのヒトＰＤ－１コードＩＶＴ－ｍＲＮＡと合わせた。細胞を、以下の設定によってＢＴＸＥＣＭ８３０（ＢＴＸＨａｒｖａｒｄＡｐｐａｒａｔｕｓ）を用いて直ちにエレクトロポレーションした：２００Ｖ、３パルス、８ｍｓ。エレクトロポレーションされた細胞を、その後、Ｔ１７５フラスコ（Ｃｅｌｌｓｔａｒ（登録商標）、ＧｒｅｉｎｅｒＢｉｏ－Ｏｎｅ、カタログ番号６６０１７５）において、０．５×１０^６／ｍＬの密度でＲＰＭＩ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＧｍｂＨ、カタログ番号６１８７０－０１０）＋１０％ＦＢＳ中に播種し、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。次の日、ＰＤ－１発現を、ＡＰＣコンジュゲート化ＣＤ２７９（ＰＤ－１）モノクローナル抗体（ｅＢｉｏＪ１０５、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１７－２７９９－４２）を使用するフローサイトメトリーにより確認した。

ＰＤ－１を発現するＫ５６２細胞へのＲｉｂｏＭａｂの結合性を、フローサイトメトリーにより分析した。７．５×１０^４個細胞／ウェルを、１００μＬＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ／０．０２％アジド（ＦＡＣＳバッファー）中のＲｉｂｏＭａｂ含有上清の連続希釈物（４倍希釈工程における０．００６～１００％範囲）と共に、ポリスチレン９６ウェル丸底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒｂｉｏ－ｏｎｅ、カタログ番号６５０１８０）において、４℃で１時間インキュベートした。ＦＡＣＳバッファー中で２回洗浄した後、細胞を、５０μＬのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（ＡＦ４８８）コンジュゲート化ヤギ抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ’）_２（ＦＡＣＳバッファー中１：５００；ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号１０９－５４６－０９８）中で、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を、ＦＡＣＳバッファーを用いて２回洗浄し、６０μＬＦＡＣＳバッファー中に再懸濁し、ＢＤＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩフローサイトメーター（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で分析した。結合曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍＶ９．１．０ソフトウェアを使用して、非線形回帰［ｌｏｇ（アゴニスト）ｖｓ．応答－可変勾配（４パラメーター）］により解析した。

図１２は、全長ヒトＰＤ－１を用いてトランスフェクションされたＫ５６２細胞に対するＲｉｂｏＭａｂ－１９－０２０２およびＲｉｂｏＭａｂ－１９－０２３３の用量依存的結合性を示す。結合曲線は、ＥＣ５０値における約２．５倍の差異（３．９％：ＲｉｂｏＭａｂ－１９－０２０２に対する上清および９．９％：ＲｉｂｏＭａｂ－１９－０２３３に対する上清）のみを伴って、非常に同等であり、このことは、ＲｉｂｏＭａｂをコードするｍＲＮＡが、同等な量のＰＤ－１結合性抗体へと翻訳されることを示した。

Claims

ＰＤ－１に結合する能力を有する抗体であって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５のうちのいずれか１つに記載の配列を有するかまたは含む相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、抗体。
ＨＣＤＲ３が、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１０のうちのいずれか１つに記載の配列を有するかまたは含む、請求項１に記載の抗体。
重鎖可変領域（ＶＨ）が、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５のうちのいずれか１つに記載の配列を有するかまたは含む相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）を含む、請求項１または２に記載の抗体。
ＨＣＤＲ２が、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９または配列番号２０のうちのいずれか１つに記載の配列を有するかまたは含む、請求項３に記載の抗体。
重鎖可変領域（ＶＨ）が、ＳＹＮ、ＲＹＹ、配列番号２１または配列番号２２に記載の配列から選択される配列を有するかまたは含む相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体。
ＨＣＤＲ１が、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６または配列番号２７のうちのいずれか１つに記載の配列を有するかまたは含む、請求項５に記載の抗体。
ＨＣＤＲ１が、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１または配列番号３２のうちのいずれか１つに記載の配列を有するかまたは含む、請求項５に記載の抗体。
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、
（ｉ）ＨＣＤＲ１配列が、ＳＹＮ、配列番号２３または配列番号２８を有するかまたは含む配列から選択され、ＨＣＤＲ２配列が、配列番号１１または配列番号１６を有するかまたは含む配列から選択され、ＨＣＤＲ３配列が、配列番号１または配列番号６を有するかまたは含む配列から選択され；
（ｉｉ）ＨＣＤＲ１配列が、ＲＹＹ、配列番号２４または配列番号２９を有するかまたは含む配列から選択され、ＨＣＤＲ２配列が、配列番号１２または配列番号１７を有するかまたは含む配列から選択され、ＨＣＤＲ３配列が、配列番号２または配列番号７を有するかまたは含む配列から選択され；
（ｉｉｉ）ＨＣＤＲ１配列が、ＲＹＹ、配列番号２５または配列番号３０を有するかまたは含む配列から選択され、ＨＣＤＲ２配列が、配列番号１３または配列番号１８を有するかまたは含む配列から選択され、ＨＣＤＲ３配列が、配列番号３または配列番号８を有するかまたは含む配列から選択され；
（ｉｖ）ＨＣＤＲ１配列が、配列番号２１、配列番号２６または配列番号３１を有するかまたは含む配列から選択され、ＨＣＤＲ２配列が、配列番号１４または配列番号１９を有するかまたは含む配列から選択され、ＨＣＤＲ３配列が、配列番号４または配列番号９を有するかまたは含む配列から選択され；
（ｖ）ＨＣＤＲ１配列が、配列番号２２、配列番号２７または配列番号３２を有するかまたは含む配列から選択され、ＨＣＤＲ２配列が、配列番号１５または配列番号２０を有するかまたは含む配列から選択され、ＨＣＤＲ３配列が、配列番号５または配列番号１０を有するかまたは含む配列から選択される、
請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体。
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列が、
（ｉ）それぞれ、ＳＹＮ、配列番号１１および配列番号１；
（ｉｉ）それぞれ、ＲＹＹ、配列番号１２および配列番号２；
（ｉｉｉ）それぞれ、ＲＹＹ、配列番号１３および配列番号３；
（ｉｖ）それぞれ、配列番号２１、配列番号１４および配列番号４；または
（ｖ）それぞれ、配列番号２２、配列番号１５および配列番号５
であるかまたはこれを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の抗体。
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列が、
（ｉ）それぞれ、配列番号２３、配列番号１６および配列番号１；
（ｉｉ）それぞれ、配列番号２４、配列番号１７および配列番号２；
（ｉｉｉ）それぞれ、配列番号２５、配列番号１８および配列番号３；
（ｉｖ）それぞれ、配列番号２６、配列番号１９および配列番号４；または
（ｖ）それぞれ、配列番号２７、配列番号２０および配列番号５
であるかまたはこれを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の抗体。
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列が、
（ｉ）それぞれ、配列番号２８、配列番号１１および配列番号６；
（ｉｉ）それぞれ、配列番号２９、配列番号１２および配列番号７；
（ｉｉｉ）それぞれ、配列番号３０、配列番号１３および配列番号８；
（ｉｖ）それぞれ、配列番号３１、配列番号１４および配列番号９；または
（ｖ）それぞれ、配列番号３２、配列番号１５および配列番号１０
であるかまたはこれを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の抗体。
ＰＤ－１に結合する能力を有する抗体であって、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６または配列番号３７のうちのいずれか１つに記載の配列を有するかまたは含む相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、抗体。
軽鎖可変領域（ＶＬ）が、ＱＡＳまたはＤＡＳから選択される配列を有するかまたは含む相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）を含む、請求項１２に記載の抗体。
軽鎖可変領域（ＶＬ）が、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０または配列番号４１のうちのいずれか１つに記載の配列を有するかまたは含む相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）を含む、請求項１２に記載の抗体。
軽鎖可変領域（ＶＬ）が、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５または配列番号４６のうちのいずれか１つに記載の配列を有するかまたは含む相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）を含む、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の抗体。
軽鎖可変領域（ＶＬ）が、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０または配列番号５１のうちのいずれか１つに記載の配列を有するかまたは含む相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）を含む、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の抗体。
ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、
（ｉ）ＬＣＤＲ１配列が、配列番号４２または配列番号４７を有するかまたは含む配列から選択され、ＬＣＤＲ２配列が、ＱＡＳまたは配列番号３８を有するかまたは含む配列から選択され、ＬＣＤＲ３配列が、配列番号３３を有するかまたは含む配列であり；
（ｉｉ）ＬＣＤＲ１配列が、配列番号４３または配列番号４８を有するかまたは含む配列から選択され、ＬＣＤＲ２配列が、ＤＡＳまたは配列番号３９を有するかまたは含む配列から選択され、ＬＣＤＲ３配列が、配列番号３４を有するかまたは含む配列であり；
（ｉｉｉ）ＬＣＤＲ１配列が、配列番号４４または配列番号４９を有するかまたは含む配列から選択され、ＬＣＤＲ２配列が、ＤＡＳまたは配列番号３９を有するかまたは含む配列から選択され、ＬＣＤＲ３配列が、配列番号３５を有するかまたは含む配列であり；
（ｉｖ）ＬＣＤＲ１配列が、配列番号４５または配列番号５０を有するかまたは含む配列から選択され、ＬＣＤＲ２配列が、ＤＡＳまたは配列番号４０を有するかまたは含む配列から選択され、ＬＣＤＲ３配列が、配列番号３６を有するかまたは含む配列であり；
（ｖ）ＬＣＤＲ１配列が、配列番号４６または配列番号５１を有するかまたは含む配列から選択され、ＬＣＤＲ２配列が、ＤＡＳまたは配列番号４１を有するかまたは含む配列から選択され、ＬＣＤＲ３配列が、配列番号３７を有するかまたは含む配列である、
請求項１２から１６のいずれか一項に記載の抗体。
ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列が、
（ｉ）それぞれ、配列番号４２、ＱＡＳ、および配列番号３３；
（ｉｉ）それぞれ、配列番号４３、ＤＡＳ、および配列番号３４；
（ｉｉｉ）それぞれ、配列番号４４、ＤＡＳ、および配列番号３５；
（ｉｖ）それぞれ、配列番号４５、ＤＡＳ、および配列番号３６；または
（ｖ）それぞれ、配列番号４６、ＤＡＳ、および配列番号３７
であるかまたはこれを含む、請求項１２から１７のいずれか一項に記載の抗体。
ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列が、
（ｉ）それぞれ、配列番号４７、配列番号３８、および配列番号３３；
（ｉｉ）それぞれ、配列番号４８、配列番号３９、および配列番号３４；
（ｉｉｉ）それぞれ、配列番号４９、配列番号３９、および配列番号３５；
（ｉｖ）それぞれ、配列番号５０、配列番号４０、および配列番号３６；または
（ｖ）それぞれ、配列番号５１、配列番号４１、および配列番号３７
であるかまたはこれを含む、請求項１２から１７のいずれか一項に記載の抗体。
ＰＤ－１に結合する能力を有する抗体であって、請求項１から１１のいずれか一項に記載の重鎖可変領域（ＶＨ）および／または請求項１２から１９のいずれか一項に記載の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、抗体。
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列が、それぞれ、配列ＳＹＮ、配列番号１１および配列番号１に記載の配列を含むかまたは有し、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列が、それぞれ、配列番号４２、ＱＡＳ、および配列番号３３に記載の配列を含むかまたは有する、請求項１から２０のいずれか一項に記載の抗体。
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列が、それぞれ、配列番号２３、配列番号１６、および配列番号１に記載の配列を含むかまたは有し、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列が、それぞれ、配列番号４７、配列番号３８、および配列番号３３に記載の配列を含むかまたは有する、請求項１から２０のいずれか一項に記載の抗体。
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列が、それぞれ、配列番号２８、配列番号１１、および配列番号６に記載の配列を含むかまたは有し、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列が、それぞれ、配列番号４２、ＱＡＳ、および配列番号３３に記載の配列を含むかまたは有する、請求項１から２０のいずれか一項に記載の抗体。
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列が、それぞれ、配列ＲＹＹ、配列番号１２および配列番号２に記載の配列を含むかまたは有し、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列が、それぞれ、配列番号４３、ＤＡＳ、および配列番号３４に記載の配列を含むかまたは有する、請求項１から２０のいずれか一項に記載の抗体。
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列が、それぞれ、配列番号２４、配列番号１７および配列番号２に記載の配列を含むかまたは有し、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列が、それぞれ、配列番号４８、配列番号３９、および配列番号３４に記載の配列を含むかまたは有する、請求項１から２０のいずれか一項に記載の抗体。
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列が、それぞれ、配列番号２９、配列番号１２および配列番号７に記載の配列を含むかまたは有し、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列が、それぞれ、配列番号４３、ＤＡＳ、および配列番号３４に記載の配列を含むかまたは有する、請求項１から２０のいずれか一項に記載の抗体。
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列が、それぞれ、配列ＲＹＹ、配列番号１３および配列番号３に記載の配列を含むかまたは有し、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列が、それぞれ、配列番号４４、ＤＡＳ、および配列番号３５に記載の配列を含むかまたは有する、請求項１から２０のいずれか一項に記載の抗体。
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列が、それぞれ、配列番号２５、配列番号１８、および配列番号３に記載の配列を含むかまたは有し、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列が、それぞれ、配列番号４９、配列番号３９、および配列番号３５に記載の配列を含むかまたは有する、請求項１から２０のいずれか一項に記載の抗体。
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列が、それぞれ、配列番号３０、配列番号１３および配列番号８に記載の配列を含むかまたは有し、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列が、それぞれ、配列番号４４、ＤＡＳ、および配列番号３５に記載の配列を含むかまたは有する、請求項１から２０のいずれか一項に記載の抗体。
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列が、それぞれ、配列番号２１、配列番号１４および配列番号４に記載の配列を含むかまたは有し、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列が、それぞれ、配列番号４５、ＤＡＳ、および配列番号３６に記載の配列を含むかまたは有する、請求項１から２０のいずれか一項に記載の抗体。
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列が、それぞれ、配列番号２６、配列番号１９および配列番号４に記載の配列を含むかまたは有し、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列が、それぞれ、配列番号５０、配列番号４０、および配列番号３６に記載の配列を含むかまたは有する、請求項１から２０のいずれか一項に記載の抗体。
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列が、それぞれ、配列番号３１、配列番号１４、および配列番号９に記載の配列を含むかまたは有し、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列が、それぞれ、配列番号４５、ＤＡＳ、および配列番号３６に記載の配列を含むかまたは有する、請求項１から２０のいずれか一項に記載の抗体。
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列が、それぞれ、配列番号２２、配列番号１５および配列番号５に記載の配列を含むかまたは有し、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列が、それぞれ、配列番号４６、ＤＡＳ、および配列番号３７に記載の配列を含むかまたは有する、請求項１から２０のいずれか一項に記載の抗体。
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列が、それぞれ、配列番号２７、配列番号２０および配列番号５に記載の配列を含むかまたは有し、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列が、それぞれ、配列番号５１、配列番号４１、および配列番号３７に記載の配列を含むかまたは有する、請求項１から２０のいずれか一項に記載の抗体。
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列が、それぞれ、配列番号３２、配列番号１５、および配列番号１０に記載の配列を含むかまたは有し、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列が、それぞれ、配列番号４６、ＤＡＳ、および配列番号３７に記載の配列を含むかまたは有する、請求項１から２０のいずれか一項に記載の抗体。
配列番号５２から配列番号５６のうちのいずれか１つに記載の重鎖可変領域（ＶＨ）配列のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列を含むＶＨを含む、請求項１から３５のいずれか一項に記載の抗体。
配列番号５２から配列番号５６のうちのいずれか１つに記載の配列を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、請求項１から３６のいずれか一項に記載の抗体。
配列番号５７から配列番号６１のうちのいずれか１つに記載の軽鎖可変領域（ＶＬ）配列のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列を含むＶＬを含む、請求項１２から３７のいずれか一項に記載の抗体。
配列番号５７から配列番号６１のうちのいずれか１つに記載の配列を含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項１２から３８のいずれか一項に記載の抗体。
重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＨが配列番号５２に記載の配列を含むかまたは有し、ＶＬが配列番号５７に記載の配列を含むかまたは有する、請求項１から３９のいずれか一項に記載の抗体。
重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＨが配列番号５３に記載の配列を含むかまたは有し、ＶＬが配列番号５８に記載の配列を含むかまたは有する、請求項１から３９のいずれか一項に記載の抗体。
重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＨが配列番号５４に記載の配列を含むかまたは有し、ＶＬが配列番号５９に記載の配列を含むかまたは有する、請求項１から３９のいずれか一項に記載の抗体。
重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＨが配列番号５５に記載の配列を含むかまたは有し、ＶＬが配列番号６０に記載の配列を含むかまたは有する、請求項１から３９のいずれか一項に記載の抗体。
重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＨが配列番号５６に記載の配列を含むかまたは有し、ＶＬが配列番号６１に記載の配列を含むかまたは有する、請求項１から３９のいずれか一項に記載の抗体。
配列番号６２から配列番号６４のうちのいずれか１つに記載の重鎖可変領域（ＶＨ）配列のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列を含むＶＨを含む、請求項１から３５のいずれか一項に記載の抗体。
配列番号６２から配列番号６４のうちのいずれか１つに記載の配列を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、請求項４５に記載の抗体。
配列番号６５から配列番号７０のうちのいずれか１つに記載の軽鎖可変領域（ＶＬ）配列のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列を含むＶＬを含む、請求項１２から３５のいずれか一項に記載の抗体。
配列番号６５から配列番号７０のうちのいずれか１つに記載の配列を含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項４７に記載の抗体。
重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＨが配列番号６２に記載の配列を含むかまたは有し、ＶＬが配列番号６５または配列番号６６または配列番号６７または配列番号６８に記載の配列を含むかまたは有する、請求項１から３５のいずれか一項または請求項４５から４８のいずれか一項に記載の抗体。
重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＨが配列番号６３に記載の配列を含むかもしくは有し、ＶＬが配列番号６９もしくは配列番号７０に記載の配列を含むかもしくは有するか、またはＶＨが配列番号６４に記載の配列を含むかもしくは有し、ＶＬが配列番号７０に記載の配列を含むかもしくは有する、請求項１から３５のいずれか一項または請求項４５から４８のいずれか一項に記載の抗体。
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、好ましくはＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ抗体からなる群から選択される、請求項１から５０のいずれか一項に記載の抗体。
モノクローナル、キメラもしくはヒト化抗体またはそのような抗体の断片である、請求項１から５１のいずれか一項に記載の抗体。
Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆｖ断片、または単鎖（ｓｃＦｖ）抗体である、請求項１から５２のいずれか一項に記載の抗体。
ＰＤ－１がヒトＰＤ－１である、請求項１から５３のいずれか一項に記載の抗体。
ＰＤ－１が、配列番号７１もしくは配列番号７２に記載のアミノ酸配列を有するかもしくは含むか、あるいはＰＤ－１のアミノ酸配列が、配列番号７１もしくは配列番号７２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、もしくは１００％の同一性を有するか、またはその免疫原性断片である、請求項５４に記載の抗体。
生細胞の表面上に存在するＰＤ－１の生来型エピトープに結合する、請求項１から５５のいずれか一項に記載の抗体。
ＰＤ－１に結合する第１の抗原結合性領域および別の抗原に結合する少なくとも１つのさらなる抗原結合性領域を含む多重特異的抗体である、請求項１から５６のいずれか一項に記載の抗体。
ＰＤ－１に結合する第１の抗原結合性領域および別の抗原に結合する第２の抗原結合性領域を含む二重特異的抗体である、請求項５７に記載の抗体。
ＰＤ－１に結合する第１の抗原結合性領域が、請求項１から５０のいずれか一項に記載の重鎖可変領域（ＶＨ）および／または軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項５７または５８に記載の抗体。
配列番号７１もしくは配列番号７２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはペプチド、またはその免疫原性断片、あるいは前記タンパク質もしくはペプチド、またはその免疫原性断片を発現する核酸または宿主細胞またはウイルスを用いて動物を免疫化する工程を含む方法により取得可能である、請求項１から５９のいずれか一項に記載の抗体。
請求項１から６０のいずれか一項に記載の抗体を産生することが可能なハイブリドーマ。
部分または薬剤にカップリングされた請求項１から６０のいずれか一項に記載の抗体を含むコンジュゲート。
部分または薬剤が、放射性同位体、酵素、色素、薬物、毒素および細胞傷害剤からなる群から選択される、請求項６２に記載のコンジュゲート。
請求項１から６０のいずれか一項に記載の少なくとも２つの抗体または請求項６２もしくは６３に記載の少なくとも２つのコンジュゲートまたは請求項１から６０のいずれか一項に記載の１つもしくは複数の抗体と請求項６２もしくは６３に記載の１つもしくは複数のコンジュゲートとの混合物を含むマルチマー。
４～８個の請求項１から６０のいずれか一項に記載の抗体または請求項６２もしくは６３に記載のコンジュゲートを含む、請求項６４に記載のマルチマー。
請求項１から６０のいずれか一項に記載の抗体またはその断片をコードする核酸配列を含む核酸。
ＲＮＡである、請求項６６に記載の核酸。
請求項６６または６７に記載の核酸を含むベクター。
多層ベシクル、単層ベシクル、またはそれらの混合物である、請求項６８に記載のベクター。
リポソームである、請求項６８または６９に記載のベクター。
リポソームがカチオン性リポソームである、請求項７０に記載のベクター。
リポソームが、約５０ｎｍ～約２００ｎｍの範囲の粒径を有する、請求項７０または７１に記載のベクター。
請求項６６もしくは６７に記載の核酸を含むか、または請求項６８から７２のいずれか一項に記載のベクターを含む宿主細胞。
請求項６６もしくは６７に記載の核酸を含むか、または請求項６８から７２のいずれか一項に記載のベクターを含むウイルス。
活性剤および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であって、活性剤が、
（ｉ）請求項１から６０のいずれか一項に記載の抗体；
（ｉｉ）請求項６２または６３に記載のコンジュゲート；
（ｉｉｉ）請求項６４または６５に記載のマルチマー；
（ｉｖ）請求項６６または６７に記載の核酸；
（ｖ）請求項６８から７２のいずれか一項に記載のベクター；
（ｖｉ）請求項７３に記載の宿主細胞；および／または
（ｖｉｉ）請求項７４に記載のウイルス
から選択される少なくとも１つである、医薬組成物。
非経口投与のために製剤化される、請求項７５に記載の医薬組成物。
心血管投与、特に、静脈内または動脈内投与のために製剤化される、請求項７６に記載の医薬組成物。
疾患の予防的および／または治療的処置における使用のための、請求項７５から７７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
疾患ががん成長および／またはがん転移である、請求項７８に記載の医薬組成物。
疾患が、ＰＤ－Ｌ１を発現することにより特徴付けられ、かつ／もしくはそれらの表面とのＰＤ－Ｌ１の会合により特徴付けられる罹患細胞またはがん細胞を含むことにより特徴付けられる、請求項７８または７９に記載の医薬組成物。
がんを予防または治療する方法における使用のための、請求項７５から８０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
がんが、黒色腫、肺がん、腎細胞癌、膀胱がん、乳がん、胃がんおよび胃食道接合部がん、膵臓腺癌、卵巣がんおよびリンパ腫からなる群から選択される、請求項７９から８１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
標的器官もしくは組織に特異的に送達され、その中で蓄積することが予定され、かつ／またはその中に留まる、請求項７５から８２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
ベクターもしくはウイルスが標的器官もしくは組織において核酸を放出し、かつ／または標的器官もしくは組織において細胞に侵入する、請求項７５から８３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
抗体が、標的器官または組織の細胞において発現される予定である、請求項７５から８４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
治療が単剤療法または併用療法である、請求項７５から８５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
組み合わせ治療が、化学療法、分子標的療法、放射線療法、および免疫療法の他の形態からなる群から選択される少なくとも１つの治療である、請求項８６に記載の医薬組成物。
対象がヒトである、請求項７５から８７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
少なくとも１つの活性剤を対象に投与することを含む、対象において疾患を治療または予防する方法であって、活性剤が、
（ｉ）請求項１から６０のいずれか一項に記載の抗体；
（ｉｉ）請求項６２または６３に記載のコンジュゲート；
（ｉｉｉ）請求項６４または６５に記載のマルチマー；
（ｉｖ）請求項６６または６７に記載の核酸；
（ｖ）請求項６８から７２のいずれか一項に記載のベクター；
（ｖｉ）請求項７３に記載の宿主細胞；および／または
（ｖｉｉ）請求項７４に記載のウイルス
から選択される少なくとも１つである、方法。
請求項７５から７７のいずれか一項に記載の医薬組成物が対象に投与される、請求項８９に記載の方法。
対象が、ＰＤ－Ｌ１を発現し、かつ／もしくはそれらの表面とのＰＤ－Ｌ１の会合により特徴付けられる細胞により特徴付けられる罹患器官または組織を有する、請求項８９または９０に記載の方法。
疾患ががん成長および／またはがん転移である、請求項８９から９１のいずれか一項に記載の方法。
がんが、黒色腫、肺がん、腎細胞癌、膀胱がん、乳がん、胃がんおよび胃食道接合部がん、膵臓腺癌、卵巣がんおよびリンパ腫からなる群から選択される、請求項９２に記載の方法。
活性剤または医薬組成物が心血管系へと投与される、請求項８９から９３のいずれか一項に記載の方法。
活性剤または医薬組成物が、末梢静脈への投与などの静脈内または動脈内投与により投与される、請求項９４に記載の方法。
活性剤または医薬組成物が、標的器官もしくは組織に特異的に送達され、その中で蓄積し、かつ／またはその中に留まる、請求項８９から９５のいずれか一項に記載の方法。
ベクター、宿主細胞またはウイルスが、標的器官もしくは組織において核酸を放出し、かつ／または標的器官もしくは組織において細胞に侵入する、請求項８９から９６のいずれか一項に記載の方法。
抗体が、標的器官または組織の細胞において発現される、請求項９７に記載の方法。
治療が単剤療法または併用療法である、請求項８９から９８のいずれか一項に記載の方法。
組み合わせ治療が、化学療法、分子標的療法、放射線療法、および免疫療法の他の形態からなる群から選択される少なくとも１つの治療である、請求項９９に記載の方法。
対象がヒトである、請求項８９から１００のいずれか一項に記載の方法。
サンプル中のＰＤ－１の定性的または定量的検出のためのキットであって、請求項１から６０のいずれか一項に記載の抗体または請求項６２もしくは６３に記載のコンジュゲートまたは請求項６４もしくは６５に記載のマルチマーを含む、キット。
サンプル中で発現されるＰＤ－１の存在または量を決定する方法における、請求項１から６０のいずれか一項に記載の抗体のまたは請求項６２もしくは６３に記載のコンジュゲートのまたは請求項６４もしくは６５に記載のマルチマーのまたは請求項１０２に記載のキットの使用であって、方法が以下：
（ｉ）サンプルを抗体またはコンジュゲートまたはマルチマーと接触させる工程、および
（ｉｉ）抗体またはコンジュゲートまたはマルチマーとＰＤ－１との間での複合体の形成を検出しかつ／またはその量を決定する工程
を含む、使用。