CN117177766A - 疫苗平台 - Google Patents

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CN117177766A
CN117177766A CN202180073501.0A CN202180073501A CN117177766A CN 117177766 A CN117177766 A CN 117177766A CN 202180073501 A CN202180073501 A CN 202180073501A CN 117177766 A CN117177766 A CN 117177766A
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安塔尔·塔波迪
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Abstract

本发明涉及一种疫苗平台，该疫苗平台包括脂质结合氨基酸序列和寡聚化序列。特别地，脂质结合氨基酸序列和寡聚化序列来源于晶状体丝蛋白，该晶状体丝蛋白是一种没有免疫原性或免疫原性极小的蛋白质。晶状体丝蛋白具有极强的膜结合能力和寡聚性质，使晶状体丝蛋白成为用于抗原部分的理想载体。还提供了包括编码脂质结合氨基酸序列和寡聚化序列的核酸序列的免疫平台。

Description

疫苗平台
技术领域
本发明涉及一种新型疫苗平台，该新型疫苗平台包括脂质结合氨基酸序列和寡聚化序列。特别地，脂质结合氨基酸序列和寡聚化序列衍生自晶状体丝蛋白(filensin)，该晶状体丝蛋白是一种没有免疫原性或免疫原性极小的蛋白质。晶状体丝蛋白具有非常强的膜结合能力和寡聚性，使其成为抗原部分的理想载体。提供了新型免疫平台，该新型免疫平台包含编码脂质结合氨基酸序列和寡聚化序列的核酸序列。
背景技术
在病原体(pathogenic agent)以前所未有的速度传播的时代，新型疫苗平台是必不可少的。晶状体丝蛋白是在眼睛晶状体中表达的细胞骨架蛋白。作为由BFSP1、BFSP2和CRYAA构成的复合物的一部分，晶状体中间丝的正确形成需要晶状体丝蛋白(Tapodi etal.BFSP1 C-terminal domains released by post-translational processing eventscan alter significantly the calcium regulation of AQP0 waterpermeability.Experimental Eye Research 185(2019)107585)。严重急性呼吸综合征冠状病毒2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus2，SARS-CoV-2)是冠状病毒科的成员，引起冠状病毒疾病2019(COVID-19)，这是一种威胁生命的疾病。介导细胞进入和膜融合的SARS-CoV-2的突起蛋白(spike protein)是体液免疫应答的主要靶标(Watanabeet al.,Science 369,330-333(2020)17July)。
发明内容
本发明涉及一种重组多肽(免疫原性构建体)，该重组多肽包含脂质结合氨基酸序列(lipid binding amino acid sequence，LBD)、寡聚化氨基酸序列(oligomerizationamino acid sequence，OD)和免疫原性部分(immunogenic moiety，IM)，其中
(i)LBD具有低免疫原性或不具有免疫原性，并且具有至多150个氨基酸、优选至多100个氨基酸、优选至多85个氨基酸、或少于85个氨基酸的长度，
(ii)OD具有低免疫原性或不具有免疫原性，并且具有至多150个氨基酸、优选至多100个氨基酸、优选至多85个氨基酸、或少于85个氨基酸的长度，
(iii)IM具有至多50个氨基酸、至多40个氨基酸、优选至多30个氨基酸、优选至多25个氨基酸、或少于25个氨基酸的长度，或者IM是编码具有至多50个氨基酸、至多40个氨基酸、优选至多30个氨基酸、优选至多25个氨基酸、或少于25个氨基酸的长度的肽的核酸序列。
本发明还涉及经分离的核酸分子，该经分离的核酸分子包含编码重组多肽(免疫原性构建体)的核酸序列。
优选地，重组多肽(免疫原性构建体)或核酸分子用于在受试者中引起免疫应答的方法中。提供了重组多肽(免疫原性构建体)或核酸分子在制备用于在受试者中引起免疫应答的药物中的用途。
在另一方面，提供了一种用于医学的肽，该肽包含衍生自晶状体丝蛋白(BFSP1(beaded filament structural protein 1)；珠丝结构蛋白1)的脂质结合氨基酸序列(LBD，脂质结合域)或者其功能性变体或功能性片段；或由衍生自晶状体丝蛋白(BFSP1；珠丝结构蛋白1)的脂质结合氨基酸序列(LBD，脂质结合域)或者其功能性变体或功能性片段构成。
在另一方面，提供了经分离的核酸分子，该核酸分子包含以下核酸序列或由以下核酸序列构成，所述核酸序列编码衍生自晶状体丝蛋白(BFSP1)的脂质结合氨基酸序列(LBD)、或者其功能性变体或功能性片段。优选地，该核酸分子还包含编码OD的核酸序列。优选地，该核酸分子用于医学。
优选地，该核酸是DNA、cDNA或RNA，优选为包含一个或多个经修饰的核苷酸的DNA或cDNA、优选为RNA、优选为mRNA、最优选为包含一个或多个经修饰的核苷酸的RNA或mRNA。
优选地，脂质结合氨基酸序列是衍生自BFSP1的C-末端的脂质结合氨基酸序列或者其功能性变体或功能性片段。优选地，该肽包含SEQ ID NO:1(hBFSP1 G434-T460)的氨基酸序列或其功能性变体或功能性片段、优选SEQ ID NO:130的氨基酸序列或其功能性变体或功能性性片段、更优选SEQ ID NO:3(hBFSP1 G434-E463)的氨基酸序列或其功能性变体或功能性片段。在优选的实施方案中，肽由SEQ ID NO:1或其功能性变体或功能性片段构成、优选SEQ ID NO:130的氨基酸序列或其功能化变体或功能片段，更优选SEQ ID NO:3或其功能变体或功能化片段。最优选地，LBD包括或由SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其功能性变体或功能性片段构成。
优选地，功能性变体或功能性片段能够结合至脂质(例如，人工脂质体或细胞膜)。优选地，功能性变体或功能性片段具有与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:130或SEQ ID NO:3至少85％、至少90％或至少95％相同的序列。优选地，功能性变体或功能性片段具有与SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:130或SEQ IDNO:3至多15个氨基酸、至多10个氨基酸或至多5个不同的氨基酸的序列。
优选地，肽(特别是LBD)附接至寡聚化氨基酸序列(OD，寡聚化结构域)。提供了一种重组多肽，该重组多肽包含肽。优选地，重组多肽包含LBD和OD。优选地，重组多肽包含LBD和IM。优选地，重组多肽包含LBD和IM、且不包含OD。
在优选的实施方案中，寡聚化氨基酸序列是卷曲螺旋(coiled coil)结构域，例如三聚体卷曲螺旋或五聚体卷曲螺旋。
优选地，寡聚化氨基酸序列衍生自BFSP1。优选地，寡聚化氨基酸序列是衍生自BFSP1的C末端的寡聚化氨基酸序列或其功能性变体或功能性片段。在优选实施方案中，OD包括根据SEQ ID NO:2(hBFSP1 L464-P548)的序列或其功能性变体或功能性片段。在又一优选实施方案中，OD由根据SEQ ID NO:2(hBFSP1 L464-P548)的序列或其功能性变体或功能性片段构成。优选地，OD包括或由根据SEQ ID NO:123的序列或其功能性变体或功能性片段构成。优选地，OD包括或由根据SEQ ID NO:124或其功能性变体或功能性片段构成。
在另一优选实施方案中，OD是人工来源的。优选地，OD包括或由SEQ ID NO:120的氨基酸序列或其功能性变体或功能性片段构成。优选地，OD包括或由SEQ ID NO:121的氨基酸序列或其功能性变体或功能性片段构成。优选地，OD包括或由SEQ ID NO:125的氨基酸序列或其功能性变体或功能性片段构成。优选地，OD的功能性变体或功能性片段能够进行寡聚化反应(例如，形成寡聚物或聚合物)。优选地，功能性变体或功能性片段具有与SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:121-125中的任何一者至少85％、至少90％或至少95％相同的序列。优选地，功能性变体或功能性片段具有与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:121-125中任一者至多50个氨基酸、至多45个氨基酸、更优选至多30个氨基酸、更优选至多15个氨基酸、更优选至多10个氨基酸或更优选至多5个不同的氨基酸的序列。
优选地，OD包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列或其功能性变体或功能性片段、或由SEQ ID NO:122的氨基酸序列或其功能性变体或功能性片段构成。
在另一优选实施方案中，寡聚化氨基酸序列衍生自与BFSP1不同的蛋白质，优选为向受试者施用后具有较低免疫原性或没有免疫原性的蛋白。在最优选的实施方案中，寡聚化氨基酸序列衍生自COMP。优选地，寡聚化氨基酸序列包含SEQ ID NO:8中所示的序列或其功能性衍生物或功能性部分、或者SEQ ID NO:9中所示的序列或其功能性衍生物或功能性部分构成；或由SEQ ID NO:8中所示的序列或其功能性衍生物或功能性部分、或者SEQ IDNO:9中所示的序列或其功能性衍生物或功能性部分构成。优选地，功能性变体或功能性片段具有与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8-9中的任何一者至少85％、至少90％或至少95％相同的序列。优选地，功能性变体或功能性片段具有与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8-9中任一者至多50个氨基酸、至多45个氨基酸、更优选至多30个氨基酸、更优选至多15个氨基酸、更优选至多10个氨基酸或更优选至多5个不同的氨基酸的序列。
包含衍生自BFSP1的脂质结合氨基酸序列或其功能性变体或功能性片段的肽可以直接链接至OD或经由接头(L)链接至OD。优选地，接头是肽接头，优选具有至多10个、优选至多5个氨基酸的长度。最优选地，接头是GG(-甘氨酸-甘氨酸-)。
核酸分子优选包含编码接头的序列。
在某些实施方案中，(多)肽或核酸分子用于在受试者中引起免疫应答的方法中。优选地，(多)肽或核酸分子用于治疗或预防病原体感染的方法中。优选地，(多)肽或核酸分子用于治疗或预防癌症的方法中。
优选地，晶状体丝蛋白是人晶状体丝蛋白(hBFSP1)。
优选地，铰链区(接头)附接在OD的C末端氨基酸上。优选地，铰链区为最多10个、优选最多5个氨基酸长。优选地，铰链区包括甘氨酸(G)。更优选地，铰链区是GG。
优选地，OD定位在LBD的C末端。
在第三方面，生物活性剂直接或通过接头链接至肽。生物活性剂可以是脂质、糖、氨基酸分子、肽、多肽、核酸分子或药物，例如小分子药物。生物活性剂优选为免疫原性表位。生物活性剂优选抗癌剂。生物活性剂可以是癌症标记物或致癌基因。
优选地，核酸分子还包含编码生物活性剂的核酸序列。
优选地，生物活性剂是免疫原性剂(IM)，优选免疫原性氨基酸序列。优选地，IM是编码免疫原性氨基酸序列的核酸序列。在某些实施方案中，存在多于一个IM。多于一个IM可以是来自相同病原体的不同IM或来自不同病原体的不同IM。核酸序列是DNA或RNA，优选mRNA。在某些实施方案中，包含来自晶状体丝蛋白的LBD的肽与OD缀合，该OD与生物活性剂缀合、优选与IM缀合。肽可以直接或通过接头链接至OD。OD可以直接或经由接头链接至IM。
优选地，免疫原性氨基酸序列的长度为至多100个氨基酸或至多50个氨基酸、优选至多25个氨基酸、最优选5-15个氨基酸、或最优选5-25个氨基酸。
优选地，免疫原性氨基酸序列来自SARS-CoV-2，优选来自SARS-CoV-2的突起蛋白。在优选实施方案中，免疫原性氨基酸序列是S蛋白外环的C端延伸版(P807-D820，SEQ IDNO:5)或其任何功能性变体或功能性片段，或者是S蛋白外环的N端延伸版(F802-R815，SEQID NO:6或F802-K814，SEQ ID NO:11)或其任意功能性变体或功能性片段，最优选为S蛋白的外环(P807-R815，SEQ ID NO:7或P807-K814，SEQ ID NO:10)或其任何功能性变体或功能性片段。优选地，IM包含表1中列出的任何一种或多种序列或其任何功能性变体或功能性片段。优选地，IM包含至少一种来自SARS-CoV-2的TCE或其任何功能性变体或功能性片段。优选地，IM包含来自SARS-CoV-2的多于一个的氨基酸序列或核酸序列或其任何功能性变体或功能性片段。优选地，来自SARS-CoV-2的任何一个序列的功能性变体或功能性片段能够在受试者中引起免疫应答。优选地，来自SARS-CoV-2的任何一个序列的功能性变体或功能性片段具有与参考序列至多8个氨基酸、或至多5个氨基酸、或至多3个不同的氨基酸的序列。
该核酸可以包含控制序列、调节元件或非翻译区。
优选地，核酸分子包含根据SEQ ID NO:126的序列或其任何功能性变体或功能性片段。优选地，核酸分子包含根据SEQ ID NO:127的序列或其任何功能性变体或功能性片段。优选地，核酸分子包含根据SEQ ID NO 128的序列或其任何功能性变体或功能性片段。优选地，核酸分子包含根据SEQ ID NO 129的序列或其任何功能性变体或功能性片段。
在另一方面，提供了一种用于医学的重组多肽，该多肽包含脂质结合氨基酸序列(LBD)和寡聚化氨基酸序列(OD)，其中多肽链接至免疫原性部分(IM)。提供了一种核酸分子，该核酸分子包括用于重组多肽的编码序列。
提供了一种核酸分子，该核酸分子包括用于LBD和OD的编码序列。优选地，该核酸分子用于医学。优选地，核酸分子还包含用于IM的编码序列。优选地，免疫原性部分是免疫原性氨基酸序列。
LBD和OD可以通过接头(L)链接。
优选地，核酸分子还包含用于一个或多个接头的编码序列。
优选地，接头是肽接头，优选具有最多10个、优选最多5个氨基酸的长度。
任选且优选地，多肽经由接头(L')链接至免疫原性剂。
优选地，接头是肽接头，优选具有最多10个、优选最多5个氨基酸的长度。最优选地，L'是GG。
优选地，寡聚化氨基酸序列是卷曲螺旋，例如三聚体卷曲螺旋或五聚体卷曲螺旋。
优选地，脂质结合氨基酸序列和寡聚化氨基酸序列衍生自相同蛋白，优选为向受试者施用之后具有较低免疫原性或没有免疫原性的蛋白。优选地，脂质结合氨基酸序列和寡聚化氨基酸序列衍生自晶状体丝蛋白(BFSP1)，更优选衍生自人晶状体丝蛋白(hBFSP1)。
替代地，脂质结合氨基酸序列和寡聚化氨基酸序列衍生自不同的蛋白，优选为向受试者施用之后具有较低免疫原性或没有免疫原性的蛋白。
优选地，脂质结合氨基酸序列衍生自晶状体丝蛋白(BFSP1)，更优选衍生自人晶状体丝蛋白(hBFSP1)，并且寡聚化氨基酸序列衍生自另一种蛋白。
在其它优选实施方案中，LBD源自PH(Pleckstrin homology domain，普列克底物蛋白同源结构域)超家族蛋白：例如ARF(ADP核糖基化因子)、PTEN、PKC、IRS1、发动蛋白、OPA、线粒体融合蛋白(Mitofusin)、普列克底物蛋白；
C1-DAG结合超家族蛋白：例如PKC、AKAP13；
C2-超家族蛋白：例如PTEN、突触结合蛋白(Synaptotagmin)、PLC、PLA；
FYVE结构域：RhoGEF、EEA1等；PX结构域：PLD、PI3K、NOX(NADPH氧化酶)等；ENTH结构域：Epsin、CLINT1等；ANTH结构域：HIP1、HIP1R等；BAR结构域：AMPH、吞蛋白(Endophilin)等；FERM结构域：埃兹蛋白(Ezrin)、根蛋白(Radixin)等；PDZ结构域：Erbin等；Tubby结构域：TUB等。
在优选实施方案中，寡聚化氨基酸序列衍生自晶状体丝蛋白(BFSP1)，更优选来自人晶状体丝蛋白(hBFSP1)。
优选地，脂质结合氨基酸序列是衍生自BFSP1的C-末端的脂质结合氨基酸序列或其功能性变体或功能性片段。优选地，该肽包含SEQ ID NO:1(hBFSP1 G434-T460)的氨基酸序列或其功能性变体或功能性片段、优选SEQ ID NO:130的氨基酸序列或其功能性变体或功能性性片段、更优选SEQ ID NO:3(hBFSP1 G434-E463)的氨基酸序列或其功能性变体或功能性片段。在优选的实施方案中，肽由SEQ ID NO:1或其功能性变体或功能性片段、优选SEQ ID NO:130的氨基酸序列或其功能化变体或功能片段、更优选SEQ ID NO:3或其功能变体或功能化片段构成。最优选地，LBD包括或由SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其功能性变体或功能性片段构成。
优选地，功能性变体或功能性片段能够结合至脂质(例如，人工脂质体或细胞膜)。优选地，功能性变体或功能性片段具有与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:130或SEQ ID NO:3至少85％、至少90％或至少95％相同的序列：优选地，功能性变体或功能性片段具有与SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:130或SEQ ID NO:3至多15个氨基酸、至多10个氨基酸或至多5个不同的氨基酸的序列。
优选地，寡聚化氨基酸序列是衍生自BFSP1的C末端的寡聚化氨基酸序列或其功能性变体或功能性片段。在优选实施方案中，OD包括根据SEQ ID NO:2的序列(hBFSP1 L464-P548)或其功能性变体或功能性片段。在又一优选实施方案中，OD由根据SEQ ID NO:2的序列(hBFSP1 L464-P548)或其功能性变体或功能性片段构成。
优选地，OD包括或由根据SEQ ID NO:123或SEQ ID NO:124的序列或其功能性变体或功能性片段构成。
优选地，OD是人工来源的。优选地，OD包括SEQ ID NO:120的氨基酸序列、或SEQ IDNO:121的氨基酸序列、或SEQ ID NO:125的氨基酸序列，或它们的功能性变体或功能性片段。
优选地，OD包括SEQ ID NO:122的氨基酸序列或其功能性变体或功能性片段。
在优选的实施方案中，寡聚化氨基酸序列衍生自人软骨寡聚基质蛋白(cartilageoligomeric matrix protein，COMP)，也称为血小板反应蛋白-5蛋白。优选地，寡聚化氨基酸序列衍生自COMP的卷曲螺旋区。优选地，寡聚化氨基酸序列包含或由SEQ ID NO:8中所示的序列或其功能性衍生物或功能性部分、或SEQ ID NO:9中所示的序列或其功能性衍生物或功能性部分构成。
优选地，脂质结合氨基酸序列具有小于约100个氨基酸、优选小于约50个氨基酸、优选小于约45个氨基酸、优选小于约40个氨基酸、最优选小于约35个氨基酸的长度。优选地，脂质结合氨基酸序列具有大于约5个氨基酸的长度。
优选地，寡聚化氨基酸序列衍生自BFSP1。优选地，寡聚化氨基酸序列是衍生自BFSP1的C末端的寡聚化氨基酸序列或其功能性变体或功能性片段。在优选实施方案中，OD包括根据SEQ ID NO:2的序列(hBFSP1 L464-P548)或其功能性变体或功能性片段。在又一优选实施方案中，OD由根据SEQ ID NO:2的序列(hBFSP1 L464-P548)或其功能性变体或功能性片段构成。优选地，OD包括或由根据SEQ ID NO:123的序列或其功能性变体或功能性片段构成。优选地，OD包括或由SEQ ID NO:124或其功能性变体或功能性片段构成。
在另一优选实施方案中，OD是人工来源的。优选地，OD包括或由SEQ ID NO:120的氨基酸序列或其功能性变体或功能性片段构成。优选地，OD包括或由SEQ ID NO:121的氨基酸序列或其功能性变体或功能性片段构成。优选地，OD包括或由SEQ ID NO:125的氨基酸序列、或其功能性变体或功能性片段构成。
优选地，寡聚化氨基酸序列具有约10-200个氨基酸的长度，优选10-150个氨基酸的长度。
优选地，多肽具有以下结构：LBD-OD-(L')-IM或LBD-(L)-OD-(L')-IM，其中()表示任选的元素。L和L'是接头部分，并且可以是相同的或不同的。
在第四方面，提供了一种药物组合物，该药物组合物包含脂囊泡，例如与多肽或肽结合的脂质体。
在另一方面，提供了经分离的核酸序列，所述核酸序列编码根据任何方面的多肽、肽、LBD、OD或其功能性变体或功能性片段中的任何一种。在优选实施方案中，核酸序列是RNA、例如mRNA。在其他优选实施方案中，核酸序列是DNA。核酸序列可以包含经修饰的核酸碱基。
在任一个方面中，优选地，(多)肽用于在受试者中引起免疫应答的方法中。免疫应答针对免疫原性剂。优选地，(多)肽用于使受试者免疫抵抗病原体(诸如病毒或细菌)的方法中。优选地，病原体是RNA病毒、优选冠状病毒、更优选SARS-CoV-2。受试者是动物、优选哺乳动物、更优选人。
在实施方案中，豆蔻酰基还附接至多肽或肽的N-末端。在实施方案中，豆蔻酰化以共翻译的方式发生。
优选地，免疫原性氨基酸序列的长度为至多100个氨基酸或至多50个氨基酸、优选至多25个氨基酸、最优选5-15个氨基酸、或最优选5-25个氨基酸。
优选地，免疫原性氨基酸序列来自SARS-CoV-2，优选来自SARS-CoV-2的突起蛋白。在优选实施方案中，免疫原性氨基酸序列是S蛋白外环的C端延伸版(P807-D820，SEQ IDNO:5)或其任何功能性变体或功能性片段，或S蛋白外环的N端延伸版(F802-R815，SEQ IDNO:6或F802-K814，SEQ ID NO:11)或其任意功能性变体或功能性片段，最优选为S蛋白的外环(P807-R815，SEQ ID NO:7或P807-K814，SEQ ID NO:10)或其任何功能性变体或功能性片段。优选地，IM包括表1中所列出的任何一个或多个序列。优选地，IM包含来自SARS-CoV-2的至少一种TCE。优选地，IM包含来自SARS-CoV-2的多于一个氨基酸序列或核酸序列。
该核酸可以包含控制序列、调节元件或非翻译区。
优选地，核酸分子包括根据SEQ ID NO:126的序列或其任何功能性变体或功能性片段。优选地，核酸分子包括根据SEQ ID NO:127的序列或其任何功能性变体或功能性片段。优选地，核酸分子包含根据SEQ ID NO 128的序列或其任何功能性变体或功能性片段。优选地，核酸分子包含根据SEQ ID NO 129的序列或其任何功能性变体或功能性片段。
附图说明
图1：(A)BFSP1的示意性结构：箭头表示BFSP1的两个预测LBD。(B)箭头表示源自于BFSP1的C末端的LBD。D434和D549是蛋白水解剪切位点(cleavage site)。(C)BFSP1的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。---代表BFSP1片段的LBD(lipid binding domain，脂质结合结构域)(G434-E463)。指示的天冬氨酸“D”是蛋白水解剪切位点D433和D549。....代表BFSP1的OD(oligomerization domain，寡聚化结构域)(L464-P548)。
图2：(A)用包括或不包括预测LBD的不同BFSP1片段的适当GFP缀合物转染MCF7细胞。B.用包括或不包括预测LBD的不同BFSP1片段的适当GFP缀合物转染MCF7细胞。膜用4-64膜染色剂(红色)染色。C.用包括或不包括预测LBD的不同BFSP1片段的适当GFP缀合物转染MCF7细胞。膜用/>4-64膜染色剂染色(箭头)。
图3：在MCF7细胞中重组G434-P548-GFP融合肽的过表达。G434-P549-GFP肽结合至细胞膜并形成大的细胞内膜小泡。
图4：A.BFSP1的434-548-His6标记片段的镍亲和柱纯化。空心的箭头代表单体。黑色箭头代表BFSP1的434-548-His6片段的寡聚物。(泳道1：Mw，泳道2：纯化前的细菌裂解物，泳道3-8NIC纯化的洗脱级分)。B：BFSP1的Myr-434-548-His6标记片段的镍亲和柱纯化。空心的箭头代表单体。黑色箭头代表BFSP1的Myr-434-548-His6片段的寡聚物。(泳道1：Mw，泳道2-3：纯化前的细菌裂解物，泳道4-8NIC纯化的洗脱级分)。
图5：BFSP1的434-548-His6片段是用于N-豆蔻酰基转移酶(N-myristoyltransferase，NMT)的底物。通过Tamra-Cy3荧光染料对豆蔻酸酯进行双正交标记。空心的箭头表示NMT的阳性对照底物：Myr-PfARF(恶性疟原虫的ADP核糖基化因子)。黑色实心箭头代表Myr-434-548-His6-BFSP1片段。
图6：BFSP1的434-548-His6片段的纯化。A：通过镍柱(NIC)纯化的434-548-His6的寡聚物，B：通过尺寸排阻柱(Size Exclusion Column，SEC)分离434-548-His6的寡聚物，C：包被有434-548-His6寡聚物的脂囊泡的电镜照片，D-G：434-548-His6寡聚物的SEC-级分的SDS-PAGE凝胶的考马斯染色。(第一峰：32-38，第二峰：69-85，第三峰：86-99)
图7：BFSP1的Myr-434-548-His6片段的纯化：A：通过镍柱(NIC)纯化Myr-434-548-His6的寡聚物，B：通过尺寸排阻柱(SEC)分离Myr-434-548-His6的寡聚物，C：包被有Myr-434-548-His6寡聚物的脂囊泡的电镜照片，D-H：Myr-434-548-His6寡聚物的SEC-级分的SDS-PAGE凝胶的考马斯染色。(第一峰：33-54，第二峰：71-87，第三峰：88-99)
图8：Myr-434-548-GG-免疫-表位平台的示意性结构：A：通过与新型免疫表位缀合的Myr-434-548寡聚物而稳定的脂质体的预测结构，B：豆蔻酰化融合肽单体的示意性结构。
图9：在MCF7细胞中重组G434-T460-GFP融合肽的过表达。G434-T460-GFP肽结合至细胞膜并形成大的细胞内膜小泡。
图10：TFR123的膜结合。
图11：TFR123-pET28a重组表达系统的克隆。11A：pET28a的MCS细菌表达载体。插入前用NcoI-XhoI切割载体。11B：5'-NcoI-G434-P548-3'-XhoI的PCR扩增子的示意图。(pET28a-c(+)克隆区：分别为SEQ ID No:86-88；pET28a-c(+)表达区：分别为SEQ ID No:89-91)。
图12：SARS-CoV-2突起蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:12)：----代表F802-F823保守的非糖基化序列。粗体“R”代表R815 S2'剪切位点。....代表C-末端和N-末端七核苷酸(heptad)重复序列(HRC和HRN)。
图13：SARS-CoV-2S糖蛋白的低温电镜(Cryo-EM)结构：A：S2'剪切位点的氨基酸序列的3D结构：F802-F823：FSQILPDPSKPSKRSFIEDLLF(SEQ ID NO:92)。B：S2'剪切位点外环的3D结构：P807-R815：PDPSKPSKR(SEQ ID NO:7)。
图14：A.TFR123融合肽的克隆策略。B.TFR123免疫平台，用胱天蛋白酶(半胱天冬酶，caspase)洗脱NIC。C.TFR123-免疫表位平台示意性结构：a：通过与新型免疫表位缀合的TFR123寡聚物而稳定的脂质体的预测结构，b：豆蔻酰化融合肽单体的示意性结构。D.TFR123平台和CoV-2表位的氨基酸序列(分别为SEQ ID No:93、94、95、96)。
图15：A.TFR123免疫平台，用咪唑洗脱NIC。B.TFR123-免疫表位平台的示意性结构：a：通过与新免疫表位缀合的TFR123寡聚物而稳定的脂质体的预测结构，b：豆蔻酰化融合肽单体的示意性结构。C.TFR123平台和CoV-2表位的氨基酸序列(分别为SEQ ID No:97、98、99、100)。对于与CoV-2表位缀合的TFR123免疫平台的PCR引物，参见表19。
图16：A.TFR3×3免疫平台。B.Myr-TFR-3×3-CoV-2-表位平台的示意性结构：a：通过与新免疫表位缀合的Myr-TFR-3×3寡聚物而稳定的脂质体的预测结构，b：豆蔻酰化融合肽单体的示意性结构。C.TFR3×3平台和CoV-2表位的氨基酸序列(分别为SEQ ID No:101-104)。对于与CoV-2表位缀合的TFR-3×3免疫平台的PCR引物，参见表20。
图17：A.TFR–5×5免疫平台。B.Myr-TFR-5×5-CoV-2-表位平台的示意性结构：a：通过与新免疫表位缀合的Myr-TFR-5×5寡聚物而稳定的脂质体的预测结构，b：豆蔻酰化融合肽单体的示意性结构。C.TFR5×5平台和CoV-2表位的氨基酸序列(分别为SEQ ID No:105-108)。D.对于与CoV-2表位缀合的TFR-5×5免疫平台的PCR引物，参见表21。
图18.用蛋白质印迹法(Western Blot)测试由TFR123-S2-C13疫苗产生的多克隆抗体。
(A1)用TFR123-S2-C13疫苗免疫的家兔血清检测重组的、经纯化的SARS-CoV-2-S1、SARS-CoV-2-S2和TVL(总病毒裂解物，即利姆里缓冲液(Laemmli buffer)中SARS-CoV-2感染的、灭活的Vero-6细胞裂解物)抗原蛋白。二抗：用过氧化物酶标记的抗兔IgG。(A2)：用接种了辉瑞-生物技术-COVID-19疫苗的人血清检测重组的、经纯化的SARS-CoV-2-S1、SARS-CoV-2-S2和TVL(总病毒裂解物，即利姆里缓冲液中SARS-CoV-2感染的、灭活的Vero-6细胞裂解物)抗原蛋白。二抗：用过氧化物酶标记的抗人IgG。(A3)：用从COVID-19回收的人血清检测重组的、经纯化的SARS-CoV-2-S1、SARS-CoV-2-S2和TVL(总病毒裂解物，即利姆里缓冲液中SARS-CoV-2感染的、灭活的Vero-6细胞裂解物)抗原蛋白。二抗：用过氧化物酶标记的抗人IgG。
(B)用多克隆兔抗TFR123-S2-C13抗体检测重组TFR123-S2-C13抗原，蛋白质印迹法。一抗：多克隆兔抗TFR123-S2-C13抗体：1:200。二抗：用过氧化物标记的抗兔IgG抗体。
图19：PCR扩增子的示意性结构。对于序列，参见表3。
图20：PCR扩增子的示意性结构。对于序列，参见表4。
图21：PCR扩增子的示意性结构。对于序列，参见表5。
图22：PCR扩增子的示意性结构。对于序列，参见表6。
图23：PCR扩增子的示意性结构。对于序列，参见表7。
图24：PCR扩增子的示意性结构。对于序列，参见表8。
图25：PCR扩增子的示意性结构。对于序列，参见表9。
图26：PCR扩增子的示意性结构。对于序列，参见表10。
图27：PCR扩增子的示意性结构。对于序列，参见表11。
图28：PCR扩增子的示意性结构。对于序列，参见表12。
图29：PCR扩增子的示意性结构。对于序列，参见表13。
图30：PCR扩增子的示意性结构。对于序列，参见表14。
图31：PCR扩增子的示意性结构。对于序列，参见表15。
图32：PCR扩增子的示意性结构。对于序列，参见表16。
图33：PCR扩增子的示意性结构。对于序列，参见表17。
图34：PCR扩增子的示意性结构。对于序列，参见表18。
图35：(A)在用PFA固定的MCF7细胞表面上没有疏水性修饰的TFR123聚集体的免疫荧光图像。一抗：兔抗TFR123抗体。二抗：抗兔-IgG-Alexafluor-488抗体。红色荧光(箭头)：WGA荧光脂质膜染料。固定前，TFR123和MCF7在37℃、5％ CO2气氛、DMEM介质中相互作用30分钟。(B)：在用PFA固定的MCF7细胞表面上具有疏水性修饰的TFR123聚集体的免疫荧光图像。一抗：兔抗TFR123抗体。二抗：抗兔-IgG-Alexafluor-488抗体。红色荧光(箭头)：WGA荧光脂质膜染料。固定前，TFR123和MCF7在37℃、5％CO2气氛、DMEM介质中相互作用30分钟。(C)：在37℃、5％ CO2气氛、DMEM介质中用TFR123-pEGFPN3质粒转染的MCF7细胞的“体内”共聚焦荧光显微镜图像。
图36：TFR123克隆策略。(A(SEQ ID NO:110)C-末端标记的TFR123：LBD-ODHHHHHH。(B)Myr-His-标签：在TFR123-Covid肽(SEQ ID NO 111)的N-末端上克隆“MGHHHSHHH”肽(MetGlyHisHisHisSerHisHisHis；SEQ ID NO:109)。(C)Myr-His-标签额外(Myr-His-标签extra，Myr-His-tag extra)：在TFR123-Covid肽(SEQ ID NO 112)的N-末端上克隆“MGHHHSKHHH”肽。(D(SEQ ID NO 112))链间His-标签：亲和标签中断TFR123-COVID重组肽的序列：Myr-TFR123-GGHHHHHHGG-Covid(＝Myr-LBDOD-GGHHHHHHGG-Covid)。(E(SEQ IDNO:113))Myr-TFR123-HHHHHH(A)与HHHHHHTFR123-Covid肽共组装。
图37：TFR123克隆策略。(A，SEQ ID NO:115)TFR123 Myr-His-标签的DNA序列。(B，SEQ ID NO:116)TFR123 Myr-His-标签extra的DNA序列。(C，SEQ ID NO:117)TFR123链间His-标签的DNA序列。(D，SEQ ID NO:118)HHHHHH-TFR123的DNA序列。(E，SEQ ID NO:119)TFR123-HHHHHH的DNA序列。
图38：(A)TFR123的RNA序列(SEQ ID NO:118)。(B)基于辉瑞COVID-19疫苗的WHO数据的TFR123的完整RNA序列(WHO非专有名称计划9/202011889，访问日期2021年10月22日)(SEQ ID NO 118和119)。
具体实施方式
本文描述的免疫平台可以用于引起对抗原部分(例如，肽)的免疫应答，当使用已知方法时，这些抗原部分被认为太短。这些抗原部分可能在病原体感染或对病原体的免疫应答中起重要作用，但由于技术困难，在目前使用的免疫技术中代表性不足。例如，在SARS-CoV-2的病毒蛋白中发现了一些CD8+T细胞表位序列(对记忆性T细胞的分化至关重要)(Ferretti,et al(2020)Unbiased Screens Show CD8(+)T Cells of COVID-19PatientsRecognize Shared Epitopes in SARS-CoV-2that Largely Reside outside the SpikeProtein.Immunity,53:(5)1095-1107e3.)，其中只有少数位于S蛋白上(Ferrettietal.Unbiased Screens Show CD8+T Cells of COVID-19Patients Recognize SharedEpitopes in SARS-CoV-2that Largely Reside outside the SpikeProtein.Immunity.2020Nov 17；53(5):1095-1107.e3.doi:10.1016/j.immuni.2020.10.006)，该CD8+T细胞表位序列是早期针对病原体开发的疫苗的主要靶点。本文描述的免疫平台为非常短的表位提供了合适的免疫表面，例如SARS-CoV-2的RBM(receptor binding motif，受体结合基序)、S1S2剪切位点或TCE-1(T-cell epitope 1，T细胞表位1)(Mahajan,S.,et al Immunodominant T-cell epitopes from the SARS-CoV-2spike antigen reveal robust pre-existing T-cell immunity in unexposedindividuals.Sci Rep 11,13164(2021).,Saini,et al SARS-CoV-2genome-wide T cellepitope mapping reveals immunodominance and substantial CD8+T cell activationin COVID-19patients.SCIENCE IMMUNOLOGY 14Apr 2021Vol 6,Issue58DOI:10.1126/sciimmunol.abf7550)。因此，短的表位可以作为有效的抗病毒工具使用，并可以实现更精确的病原体靶标。
术语“肽”是指包括由肽键共价结合的氨基酸的分子。术语“多肽”或“蛋白”指大的肽，但通常术语“肽”、“多肽”和“蛋白”是同义词，在本文中可以互换使用。术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”是以其公认的科学含义使用。
“核酸”可以是DNA或RNA，例如体外的转录RNA或合成RNA。核酸可以作为单链或双链且线性或共价环状封闭分子存在。核酸可以通过稳定化序列、封端或聚腺苷酸化进行修饰。
术语“脂质结合氨基酸序列”是指能够与磷脂(诸如，膜脂)相互作用的氨基酸序列。因此，包含脂质结合氨基酸序列的多肽和蛋白能够以不同的亲和力与蛋白相互作用。
术语“脂质结合氨基酸序列”和“脂质结合结构域”可以互换使用。同样地，术语“寡聚化氨基酸序列”和“寡聚化结构域”也可以互换使用。
“人晶状体丝蛋白”(“hBFSP1”或“BFSP1”)是指识别为UniProtKB-Q12934(BFSP1_HUMAN)的蛋白。在说明书中使用的HBFSP1的氨基酸序列是亚型1，具有标识符：Q12934-1。最初，在蛋白中预测了几个脂质结合序列。衍生自BFSP1的C末端的脂质结合结构域是指Tapodi等人识别的C-末端片段(G434-S665)中的脂质结合基序(Tapodi等人，同上)。衍生自BFSP1的C末端的脂质结合结构域是指包含SEQ ID NO 1或3的基序。
“人软骨寡聚体基质蛋白”(“COMP”)是指鉴定为UniProtKB-P49747(COMP_HUMAN)的蛋白。COMP的N-末端卷曲螺旋区在InterPro数据库中被识别为IPR039081。SEQ ID NO:8表示来自COMP的三聚体卷曲螺旋的氨基酸序列，SEQ ID NO:9表示来自COMP的五聚体卷曲螺旋。
优选地，术语“(多)肽”、“蛋白”、“氨基酸序列”、“脂质结合结构域”、“寡聚化结构域”、“核酸分子”、“核酸序列”、“免疫原性部分”包括功能性片段及其变体。
氨基酸序列的术语“功能性片段”或“功能性变体”涉及任何片段或变体，其表现出与其衍生自的氨基酸序列相同或相似的一种或多种功能性性质，即功能性等同。
本文中所使用的术语“功能性片段”或“功能性变体”特别是指变体序列，该变体序列包含与亲本序列(parent sequence)的氨基酸序列相比被一种或多种氨基酸改变的氨基酸序列，并且能够实现亲本序列的一种或多种功能，例如结合至脂质分子(即，衍生自蛋白的脂质结合氨基酸序列的“功能性片段”或“功能性变体”)、或在向受试者施用后引起免疫应答(即，衍生自病原体的免疫原性序列的“功能性片段”或“功能性变体”)。
优选地，衍生自BFSP1的脂质结合氨基酸序列的功能性片段或变体能够结合至脂质(例如，脂质体或细胞膜)，并且没有免疫原性或具有低免疫原性。优选地，衍生自BFSP1的脂质结合氨基酸序列的功能性片段或变体包含与SEQ ID NO：1或3至少85％、或至少90％、或至少95％相同的序列。
优选地，衍生自BFSP1的OD的功能性片段或变体能够寡聚化、且没有免疫原性或具有低免疫原性。优选地，衍生自BFSP1的OD的功能性片段或变体包含与SEQ ID NO：2至少85％、或至少90％、或至少95％相同的序列。
优选地，衍生自COMP的OD的功能性片段或变体能够寡聚化、且没有免疫原性或具有低免疫原性。优选地，衍生自COMP的OD的功能性片段或变体包含与SEQ ID NO：8或9至少85％、或至少90％、或至少95％相同的序列。
优选地，衍生自BFSP1或COMP的OD的功能性片段或变体是卷曲螺旋结构域，例如三聚体卷曲螺旋或五聚体卷曲螺旋。
当用于参考多肽时，术语“片段”是指与参考多肽本身相比、氨基酸残基被删除但剩余的氨基酸序列通常与参考多肽中的相应位置相同的多肽。片段通常至少有3个氨基酸长。
术语氨基酸序列或核酸序列的“功能性片段”或“功能性变体”涉及表现出与其衍生自的氨基酸序列或核酸序列相同或相似的一种或多种功能性质的任何片段或变体，即功能性等同。
本文中所使用的术语“功能性片段”或“功能性变体”特别是指变体序列，该变体序列包含与亲本序列相比被一个或多个氨基酸或核苷酸改变的氨基酸序列或核酸序列，并且能够实现亲本序列的一个或更多个功能，例如结合至脂质分子、能够引起免疫应答、或编码能够例如结合至脂质分子或引起免疫应答的氨基酸序列。
当用于参考多肽或核酸分子时，术语“片段”是指与参考多肽或核酸分子本身相比、氨基酸残基或核苷酸被删除但剩余的氨基酸序列或核酸序列通常与参考多肽中的相应位置相同的多肽或核酸分子。片段通常至少有3个氨基酸长，或者核酸分子的片段长度至少与编码3个氨基酸一样长。
术语“功能性变体”还包括保守取代的变体。术语“保守取代的变体(conservatively substituted variant)”是指包含氨基酸残基序列的肽，该氨基酸残基序列通过一个或多个保守氨基酸取代而与参考肽不同，并保持本文中所描述的参考肽的一些或全部活性。“保守氨基酸取代”是用功能性相似的残基取代氨基酸残基。保守取代的实例包括用一个疏水残基(诸如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸)取代另一个疏水残基，并且用一个亲水残基取代另一个亲水残基，诸如在精氨酸与赖氨酸之间，在谷氨酰胺与天冬酰胺之间，在苏氨酸与丝氨酸之间。术语“保守取代的变体”还包括其中残基被化学衍生的残基取代的肽，条件是所得肽保持本文中所描述的参考(多)肽的一些或全部活性。在一些实施方案中，(多)肽的功能性变体与参考肽共享至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性。在一些实施方案中，(多)肽的功能性变体与参考(多)肽共享至少85％、90％、95％或99％的序列一致性。
参考核酸的功能性变体是指编码与参考核酸相同多肽的核酸。在一些实施方案中，核酸分子的功能性变体与参考核酸分子共享至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性。在一些实施方案中，核酸分子的功能性变体与参考核酸分子共享至少85％、90％、95％或99％的序列一致性。参考核酸的功能性变体是指编码与参考核酸相同多肽的核酸。参考核酸的功能性变体可以包含经修饰的核苷酸或核苷。参考核酸分子的功能性变体可以包含经修饰的核苷酸或核苷。
核酸可以是且优选是经修饰的核酸分子。经修饰的核苷酸和核苷的制备和用途在本领域中是公知的，例如来自WO2007024708、US10232055、US4373071、US4458066、US5262530、US5700642、EP3294326、EP1685844、EP1392341、EP2763701、EP2600901、EP1934345、EP1934345、EP3319622、EP2918275、EP3337902。经修饰的核苷酸在核苷的含氮碱基中、或含氮碱基上包含一个或多个化学修饰(例如，取代)。经修饰的核苷酸可以在核苷或磷酸盐的糖部分中、或糖部分上包含化学修饰。核酸序列可以包含一个或多个经修饰的核苷酸(例如，假尿苷(pseudouridine)、N6-甲基腺苷、5-甲基胞苷、5-甲基尿苷)，优选假尿苷。
核酸序列可以编码单个多肽或多个多肽，该多个多肽以当表达为氨基酸序列时，每个序列保持其同一性(例如，串联链接)链接在一起。然后，可以将从核酸序列产生的多肽作为融合多肽产生，或者以这种方式进行工程化以产生可以通过接头序列链接的单独多肽或肽序列。
核酸序列通常可以是mRNA，其具有至少一个可以被细胞翻译的开放阅读框。翻译产物是可以用作抗原(免疫原)的肽或蛋白。在某些实施方案中，抗原是肿瘤抗原。在这些特定实施方案中，将待施用药物(疫苗)组合物的患者具有表达肿瘤抗原的肿瘤或处于形成这种肿瘤的风险中。
术语“免疫原性”是指能够在受试者中引起免疫应答(细胞或体液)的试剂。免疫原性和抗原性可以互换使用。
术语“诱导免疫应答”也包括“增强免疫应答”。
术语“TFR123”是指包含人BFSP1的LBD和任选的人BFSP1的OD的重组多肽，并且是根据本发明的免疫平台的示例性实施方案。
“免疫平台”是指能够引起针对链接至(多)肽或核酸序列的抗原试剂的免疫应答的(多)肽或核酸分子。“免疫平台”也指如本文中所描述的(多)肽或核酸分子，其适于将抗原(例如，表位)递送至施用免疫平台的受试者的细胞(例如，免疫细胞、能够呈递抗原的细胞、能够表达免疫原性氨基酸序列的细胞)。例如，包含BFSP1的G434-P548片段的多肽是免疫平台：抗原试剂(例如，来自SARS-CoV-2的表位、或SARS-CoV-2的突起蛋白、或任何其他已知的抗原部分)可以附接至多肽，并且将在施用多肽/抗原试剂缀合物的受试者中诱导对抗原试剂的免疫应答。同样地，核酸序列(诸如编码例如BFSP1的G434-P548片段的mRNA序列)是免疫平台：编码抗原试剂(例如，来自SARS-CoV-2的表位或SARS-CoV-2的突起蛋白或任何其他已知抗原部分)的核酸序列(例如，mRNA序列)可以附接至核酸序列，并且将在施用核酸序列/编码抗原试剂缀合物的核酸序列的受试者中诱导对抗原试剂的免疫应答。根据本发明的免疫平台包含衍生自BFSP1的C末端的脂质结合氨基酸序列或其功能性变体或功能性片段、或编码来自BFSP1的C末端的脂质结合氨基酸序列的核酸分子或其功能性变体或功能性片段。优选地，免疫平台包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列(hBFSP1 G434-T460)或其功能性变体或功能性片段，更优选SEQ ID NO:3(hBFSP1 G434-E463)的氨基酸序列或其功能性变体或功能性片段，或编码所述氨基酸序列的核酸分子。
在一实施方案中，肽序列由接头间隔开。如本文中使用的术语“接头”涉及添加在两个肽结构域(诸如，表位或疫苗序列)之间以连接所述肽结构域的肽。优选地，接头序列减少了两个肽结构域之间的位阻，被良好翻译，并支持或允许表位的加工。此外，接头应该没有免疫原性序列元素或只有很少的免疫原性序列元素。富含甘氨酸和/或丝氨酸的接头是优选的。各接头可以包含1、2或更多、优选至多50个氨基酸。优选短接头(例如，至多10、至多9、至多8、至多7、至多6或至多5个氨基酸长)。
TFR123是在生物脂质双层(细胞膜或脂质体)的表面形成非常稳定的蛋白聚合物的重组多肽。单体的N-末端锚定在脂质膜上，同时C-末端聚合到脂质膜上的蛋白层中。这种蛋白聚合物能够在最佳取向上非常稳定地显示任何短抗原序列(例如，9-24个氨基酸)。对兔进行无佐剂免疫导致针对重组的、经纯化的TFR123-COVID 19表位融合蛋白的抗原特异性免疫应答。
TFR123(LBD-OD)包括LBD(任选地用接头加长)和OD(任选地用接头加长)。LBD-OD重组多肽在C-末端用适当的抗原序列(优选5-25，或优选9-24个氨基酸)加长。经纯化，重组TFR123单体仅在10分钟内在真核细胞膜(MCF7)上聚合而不渗透(图10)。跨显性表达的TFR123-GFP融合蛋白位于MCF7细胞的细胞膜中，并在细胞内膜囊泡的表面形成大的寡聚体(图3)。
用于本文中所描述的肽、多肽或免疫平台中的优选LBD的氨基酸序列的实例显示在实施例章节的表22中。
用于本文中所描述的肽、多肽或免疫平台中的优选OD的氨基酸序列的实例显示在实施例章节的表23中。
疫苗组合物
免疫平台(例如，TFR123)可以结合至脂囊泡(例如，脂质体)。脂质体结合的豆蔻酰化TFR123-Cov表位(Cov表位是指衍生自SARS-CoV-2的表位)与哺乳动物细胞的孵育表明，重组多肽不穿过细胞膜，而是被视为结合至哺乳动物细胞膜的“珠”(图10)。因此，豆蔻酰化多肽使脂质体的膜稳定，即使当结合至脂质体时，多肽的膜结合特性也保持不变。
包含结合至脂质体的免疫平台的疫苗组合物是有利的，因为表位可以以非常高的密度和稳定的方式呈现。
然而，即使没有结合至脂质体，TFR123也被证明是高度功能性的(即，能够结合至膜并诱导适当和稳健的免疫反应)(图35)。
豆蔻酰化TFR123-Cov表位在哺乳动物细胞上形成了极其稳定的寡聚物层，而没有多肽的渗透。与细胞膜的结合将免疫原性表位以适当的暴露定位在细胞表面，并且可以提供针对间质蛋白酶的保护。此外，形成聚集体的未豆蔻酰化TFR123-COVID-抗原也在兔中诱导抗原选择性免疫应答。骨骼肌细胞可以结合并展示TFR123-COVID免疫原。
不希望被理论束缚，免疫平台的核心聚合物可以用作“内部佐剂”，提供增强的免疫应答。
在优选的实施方案中，疫苗组合物包含来自BFSP1的C末端的脂质结合氨基酸序列或其功能性变体或功能性片段，或编码来自BFSP1的C末端的脂质结合氨基酸序列的核酸分子或其功能性变体或功能性片段。优选地，免疫平台包括含有SEQ ID NO:1(hBFSP1 G434-T460)、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:130的氨基酸序列或其功能性变体或功能性片段、更优选SEQ ID NO:3的氨基酸序列(hBFSP1 G434-E463)或其功能性变体或功能性片段的肽，或编码所述肽和/或氨基酸序列的核酸分子。
疫苗组合物可以包含佐剂。“佐剂”是指增加对抗原的体液或细胞免疫应答的任何物质。佐剂在本领域是已知的。佐剂包括化合物的异质组，诸如油乳剂(例如弗氏佐剂(Freund's adjuvant))、矿物质化合物(诸如明矾)、细菌产物(诸如百日咳杆菌毒素(Bordetella pertussis toxin))、脂质体和免疫刺激复合物。用于佐剂的实例是单磷酰基-脂质-A、皂苷、维生素E、montanid、CpG寡核苷酸和各种油包水乳剂，它们由生物可降解的油(诸如角鲨烯)制备。
本发明的疫苗组合物还可以包括药学上可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂(参见例如Remington:The Science and practice of Pharmacy(2005)Lippincott Williams)。
药物递送系统
TFR123显示在人工脂质体表面上形成聚合物层并使它们稳定。因此，TFR123可以用于靶向药物递送构建体。例如，靶标部分(诸如特异性受体配体)附接至TFR123而不是IM，以将构建体“引导”至靶细胞。TFR123所附接的构建体例如是携带活性剂的脂质体。同样地，附接至衍生自另一种蛋白(诸如COMP)的OD的、衍生自晶状体丝蛋白的LBD可以用来代替TFR123。
提供了用于药物递送构建体的肽，该肽包含衍生自晶状体丝蛋白(BFSP1)的脂质结合氨基酸序列(LBD)或其功能性变体或功能性片段。提供了用于药物递送构建体的多肽以及寡聚化结构域，该多肽包含衍生自晶状体丝蛋白(BFSP1)的脂质结合氨基酸序列(LBD)或其功能性变体或功能性片段。在优选的实施方案中，靶标部分(targeting moiety，TM)附接至肽或多肽。在优选的实施方案中，多肽、或附接至肽的TM、或附接至多肽的TM附接至携带活性剂的脂质体或含脂质的构建体。
mRNA免疫平台
在优选的实施方案中，疫苗组合物包含编码LBD、任选的OD和免疫原性表位的核酸序列。mRNA疫苗的蛋白聚合物产物将在宿主细胞膜和离开宿主细胞的膜囊泡(大的外来体)上形成稳定的抗原呈递层，这导致由疫苗引起的强免疫力。
治疗的方法
提供了一种用于预防或治疗感染或癌症的方法，其中，该方法包括施用链接至本文所描述的免疫平台的、预防或治疗有效量的抗原(例如，表位)(例如，以疫苗组合物的形式)。抗原可以是编码抗原的核酸序列(例如，编码免疫原性氨基酸序列的mRNA序列)。预防或治疗可以包括多于一次地施用链接至免疫平台的抗原，例如在初级阶段和加强阶段(regime)或每年施用。特别地，提供了一种预防、改善或治疗由RNA病毒(优选冠状病毒)感染引起的疾病的方法，最优选提供了预防受试者中的COVID-19的方法，其中，向受试者施用本文中所描述的免疫平台，该免疫平台链接至来自SARS-CoV-2的表位或编码来自SARS-CoV-2的表位的核酸序列。
豆蔻酰化
如果需要，可以用几种不同的技术执行TFR123平台的豆蔻酰化(或包含衍生自晶状体丝蛋白的脂质结合氨基酸序列(LBD)、或包含LBD、OD和任选的IM或TM的重组多肽、或包含LBD和IM或TM且不包含OD的重组多肽的(多)肽的N-末端(或C-末端)豆蔻酰化)。请参见下面和实施例部分的几个实施例。
1.体外豆蔻酰化，随后洗脱包含LBD(优选OD和IM)的肽。
用His-胱天蛋白酶-3执行使用His-DVDP-LBD克隆体洗脱包含LBD(优选OD和IM)的肽，其中，DVPD胱天蛋白酶-3剪切位点邻近LBD序列。去除非剪切的His-DVPD-LBD(-OD-IM)和His-胱天蛋白酶-3。
2.MGHHHSHHH-LBD构建体：白色念珠菌N-豆蔻酰转移酶(Candida albicans N-myristyl-transferase，CaNMT)与MGHHHSHHH-LBD-(OD-IM)构建体共表达，因此在大肠杆菌细胞进行豆蔻酰化。
Myr-His-标签：“MGHHHSHHH”肽(MetGlyHisHisHisSerHisHisHis)在TFR123-COVID肽的N-末端上克隆(图36B)。这种Myr-His-标签允许甘氨酸的N-末端豆蔻酰化以及具有中断His-标签的新型TFR123-Covid重组肽的纯化。(保守的NMT位点：N豆蔻酰转移酶结合位点：GxxxSxxx.第1位甘氨酸和第5位色氨酸，x＝任何氨基酸)。
3.MGHHHSKHHH-LBD-(OD-IM)构建体或MGHHHSTHHH-LBD：豆蔻酰化的速率可以通过在第5位丝氨酸后插入K或T来增加。H可以用任何氨基酸取代。第1位是甘氨酸。
4.链间His标签：亲和标签中断TFR123-IM重组肽的序列：Myr-TFR123-GGHHHHHHGG-IM(＝Myr-LBDOD-GGHHHHHHGG-IM)。亲和标签位于TFR123与IM序列之间。侧面(flanking)的双GG-铰链提供了重组蛋白的灵活性，允许His-标签结合至镍柱上，而在N-末端的天然豆蔻酰化位点仍未修饰(图36D)。
5.Myr-His-标签extra：“MGHHHSKHHH”肽在TFR123-IM肽的N-末端上克隆(图36C)。这种Myr-His-标签extra允许更好的TFR123N-末端豆蔻酰化。
6.Myr-TFR123-HHHHHH(图36A)与HHHHHHTFR123-(IM)(图36E)的共组装：这种策略有以下几种益处：1)不需要克隆新的构建体，2)天然Myr位点代替人工位点，3)His-标签不应被中断，4)需要少量豆蔻酰化的TFR123核心肽以将未豆蔻酰化的TFR123-Covid肽结合至细胞膜或脂质体。“OD”结构域将Myr-LBD-OD-His6和His6-LBDOD-IM异构体保持在一起。
7.Myr-LBD-OD-PP-HHHHHH-PP-IM。
SARS-CoV-2表位
用于生产TFR123疫苗的SARS-CoV-2突起的表位序列列表。8个表位与SARS-CoV-2突起的受体结合结构域(Receptor Binding Domain，RBD)相关。设计了靠近TMPRSS2剪切位点的四个表位。设计了靠近弗林蛋白酶(Furin)剪切位点的三个表位。六个表位被设计为CD8+T细胞受体结合位点。(表1)
表1SARS-CoV-2表位的实例
提供了一种重组多肽，该重组多肽包含脂质结合氨基酸序列(LBD)、寡聚化氨基酸序列(OD)和任选的免疫原性部分(IM)或靶标部分(TM)，其中，
(i)LBD具有低免疫原性或不具有免疫原性，并且具有至多150个氨基酸、优选至多100个氨基酸、优选至多85个氨基酸、或少于85个氨基酸的长度，
(ii)OD具有低免疫原性或不具有免疫原性，并且具有至多150个氨基酸、优选至多100个氨基酸、优选至多85个氨基酸、或少于85个氨基酸的长度，
(iii)IM或靶标部分具有至多50个氨基酸、至多40个氨基酸、优选至多30个氨基酸、优选至多25个氨基酸、或少于25个氨基酸的长度，或者IM是编码至多50个氨基酸、至多40个氨基酸、优选至多30个氨基酸、优选至多25个氨基酸、或少于25个氨基酸长度的肽的核酸序列。
还提供了包含编码上述重组多肽的核酸序列的核酸分子。优选地，核酸分子为RNA。优选地，重组多肽或核酸分子用于在受试者中引起免疫应答的方法中。
优选地，重组多肽用于药物递送。优选地，将重组多肽附接至人工脂质体上。
提供了一种用于制备重组多肽的方法，该方法包括LBD、OD和任选的IM或TM在宿主组织中的重组表达，该宿主组织用携带LBD、OD和IM的编码序列的表达载体/转染载体进行转染，其中LBD、OD和任选的IM或TM可以在单独的表达载体/转染载体上或在相同的表达载体/转染载体上。
实施例
I.TFR123-SARS-CoV-2疫苗程序(vaccine procedure)。
a.形成源自BFSP1的脂质结合寡聚物的重组核心肽：
晶状体丝蛋白(BFSP1：珠结构蛋白1)是只在眼晶状体纤维细胞中表达的细胞骨架中间丝。在研究BFSP1的内源性蛋白水解时，发现了非常强的脂质结合结构域(LBD)。预测的BFSP1的脂质结合基序位于G434-E463氨基酸序列的位置(图1A和图1B)(衍生自BFSP1的C末端的脂质结合氨基酸序列)。脂质结合结构域(LBD)是通过在MCF7细胞系中过度表达与GFP融合的BFSP1的重组蛋白水解片段(G434-P548-GFP:LBD-OD-BFSP1)的C末端截短形式(P461-P548:OD-BFSP1)来证明的。OD：BFSP1的P461-P548片段排除了预测的LBD。与G434-P548-GFP(LBD-OD-BFSP1)相比，C末端GFP标记的P461-P548片段(OD)没有结合至细胞膜(图2A和图2B)。其他预测的LBD(482-500、598-623和642-665)的膜结合也被排除在外(图2C)。
将MCF7细胞接种在35mm玻璃底盘上。用500ng的pEGFP-N3-BFSP1片段真核表达构建体质粒瞬时转染细胞。根据制造商的建议，用GeneJuice转染试剂在OptiMEM培养基中预孵育质粒。第二天，细胞膜用4-64红色荧光膜染色剂染色。用共焦显微镜(蔡司LSM710)在37℃的5％CO2气氛中捕获生命细胞图像。
b.BFSP1的G434-P548片段(“TFR123-核心肽”)：
为了揭示为什么TFR123(别名：G434-P548肽＝LBD-OD-BFSP 1)可能成为潜在的免疫平台，有必要了解上述BFSP1片段的寡聚化和脂质结合特性。重组G434-P548-GFP肽结合至细胞膜，并且在MCF7细胞中形成大的细胞内膜囊泡(图2-3)。
将MCF7细胞接种在35mm玻璃底盘上。用500ng的pEGFP-N3-LBD-OD-BFSP1真核表达构建体质粒瞬时转染细胞。根据制造商的建议，用GeneJuice转染试剂在OptiMEM培养基中预孵育质粒。第二天，细胞膜用4-64红色荧光膜染色剂染色。用共焦显微镜(蔡司LSM710)在37℃的5％CO2气氛中捕获生命细胞图像。
G434-p548-His6的重组表达在大肠杆菌中形成大的寡聚体。
单体和寡聚物在镍亲和柱上纯化，并且在考马斯凝胶上可视化(图4A)。N-末端上的434-甘氨酸(434G)被鉴定为N-豆蔻酰转移酶(NMT)的底物。G434-P548-His6重组肽与CaNMT(白色念珠菌N-豆蔻酰转移酶)共表达导致了G434-P548-His6肽的N-末端共翻译豆蔻酰化(图5)。蛋白的翻译后和共翻译豆蔻酰化增加了蛋白-蛋白相互作用以及经修饰蛋白的膜结合。豆蔻酰化迫使大肠杆菌表达系统中Myr-434-548-His6片段寡聚化(比较图4A和4B)。通过尺寸排阻柱(SEC)分离未修饰和豆蔻酰化的434-548-His6寡聚物，得到三个不同尺寸的寡聚物的离散峰(图6B和7B)。然而，SDS-PAGE凝胶的考马斯染色证明蛋白仅存在于第2峰和第3峰(图6D-图G和图7D-图H)。
关于第一峰的保留时间(10分钟)，它表明，最大的寡聚物可能大于100000kDa，该寡聚物的片段可以使用背景染色法通过电子显微镜观察和检测。
CaNMT-pET11b和G434-P548-His6-pET28a在BL21-DE3-pLysS大肠杆菌流中的共表达。
BL21感受态大肠杆菌细胞与CaNMT-pET11b和G434-P548-His6-pET28a表达质粒共转化。pET11b编码白色念珠菌：未标签化的N-豆蔻酰转移酶(CaNMT)蛋白和氨苄青霉素抗性基因序列。然而，pET28a质粒编码用C末端多组氨酸标签标记的G434-P548片段和卡那霉素抗性基因序列标记。。在含有最终浓度为100g/ml的氨苄青霉素和最终浓度为50μg/ml的卡那霉素的LB琼脂上选择双转化的BL21细胞。为了重组表达N-末端豆蔻酰化G434-P548-His，用终浓度为500μM的豆蔻酸喂养大肠杆菌细胞。
用多组氨酸标签标记的重组蛋白的纯化。
将1升细菌培养物的丸粒在-20℃下冷冻。将每升重悬于20mL赖氨酸缓冲液(300mMNaCl，50mM Na2HPO4xNaH2PO4，0.25％Triton-X、0.25％NP40)中。将裂解的样品用超声波匀质3x2分钟，50％脉动，然后用14400xg离心。同时，用5cv的dH2O和5cv裂解缓冲液洗涤1ml捕获镍结合的琼脂糖珠。将上清液与珠在4℃下孵育过夜，轻轻摇动。然后，将悬浮液施加至重力过滤柱，分别用25毫升裂解缓冲液和50毫升洗涤缓冲液(300mM NaCl，50mMNa2HPO4xNaH2PO4)洗涤。然后，用1毫升洗脱缓冲液(300mM NaCl，50mM Na2HPO4xNaH2PO4，1M咪唑)洗脱蛋白。洗脱液储存在-20℃下。
G434-P548-His6和Myr-G434-P548-His6的SEC纯化：
从NIC(His选择镍亲和柱)洗脱的G434-P548和Myr-G434-P548的单体和大的寡聚物用日立L/7300HPLC上的SuperoseTM 6 10/300GL尺寸排阻柱(SEC)分离。用SDS-PAGE考马斯凝胶染色观察SEC-组分。
电子显微镜：TEM
将豆蔻酰化的或未豆蔻酰化的截短BFSP1尾(GGQ-548P-His6)分别稀释到组合缓冲液中、以达到100g/ml。在用1％(w/v)乙酸铀酰酯(Agar Scientific，UK)背景染色之前，将涂覆在新切割的云母上的碳膜漂浮在样品表面上，并用400目铜栅(Agar Science，UK)回收。使用100kV的加速电压，在日立H-7600透射电子显微镜(日立高科技公司，日本)中检查栅格。图像使用CCD相机(高级显微镜技术(Advanced microscopy Technology)，丹佛市，马萨诸塞州)来获取，并使用Photoshop CS(奥多比系统公司(Adobe System)，圣何塞市，加利福尼亚州)组装成拼集(montage)。
电子显微镜照片证实了荧光显微镜数据，即BFSP1的434-548-His6和Myr-434-488-His6片段都形成了锚定在脂质层中的非常强的寡聚物，并且在收获和纯化BFSP1的重组肽片段期间这些寡聚物稳定了通过超声处理产生的大膜囊泡(图6B、图6C和图7B、图7C)。第2峰和第3峰的曲线下面积由于豆蔻酰化而减少，同时第1峰的曲线下面积由于共翻译修饰而增加(比较图6B和图7B)。豆蔻酰化为Myr-434-548-His6片段在大肠杆菌表达系统中的寡聚化和膜结合性质建立了驱动力。人BFSP1-LBD-肽(G434-P548，或TFR123)的非常强的膜结合能力和寡聚化性质极大地增加了脂囊泡的稳定性。它对2％SDS莱姆利(Laemmli)样品缓冲液具有抗性：即使由于洗涤剂(2％SDS)，锚定在膜囊泡中的重组G434-P548-His6肽也不能从膜中释放，这意味着在考马斯凝胶中没有检测到显著量的重组肽，该肽代表了SEC纯化过程中收集的第一峰的级分。这种现象可能仅仅是由超声形成的人工脂囊泡表面上的非常强的重组肽层。G434-P548肽单体(TFR123＝LBD-ODBFSP1)可以用任何种类的免疫原肽序列重组延伸(图8，详细程序见III)。
LBD-OD-BFSP1肽(Myr-G434-P548＝TFR123)为疫苗接种提供了新型免疫平台，然而，仅用核心肽(人G434-548-BFSP1片段)包被的脂质体预计具有低的免疫原性效果，这可能有助于这种新型分子平台在免疫和疫苗接种技术中的安全应用(图8)。
c.LBD(脂质结合结构域)G434-E463：
G434-P548片段的N末端上的前30个氨基酸是预测并证实的BFSP 1脂质结合结构域。LBD的27个氨基酸(G434-T460)足以进行膜结合和膜囊泡形成(图9)。LBD-BFSP1(G434-E463)是TFR123平台的一部分。类似的其他几种蛋白质的LBD也可以用于免疫平台，如PH(普列克底物蛋白同源结构域)超家族蛋白：ARF(ADPribosylation factor，ADP-核糖基化因子)、PTEN、PKC、IRS1、发动蛋白、OPA、线粒体融合蛋白、普列克底物蛋白等。
C1-DAG结合超家族蛋白：PKC，AKAP 13等；C2-超家族：PTEN、突触结合蛋白、PLC、PLA等。
FYVE结构域：RhoGEF、EEA1等；PX结构域：PLD、PI3K、NOX(NADPH氧化酶)等；ENTH结构域：Epsin、CLINT1等；ANTH结构域：HIP1、HIP1R等；BAR结构域：AMPH、吞蛋白等；FERM结构域：埃兹蛋白、根蛋白等；PDZ结构域：Erbin等；Tubby结构域：TUB等。
BFSP1的LBD与上述LBD结构域家族相比具有许多优点：
-G434-E463是最短的LBD基序
-它被豆蔻酸共翻译或翻译后修饰，诱导更多的膜结合相互作用和蛋白-蛋白相互作用(寡聚化)
-它没有任何酶活性
-与内吞作用无关
-与囊泡转运无关
-脂质结合不需要像钙或镁等带正电荷的离子
-到目前为止还没有发现它是用于细胞信号激酶的因子
-与神经传递无关
-它在无血管眼晶状体中完全是组织特异性的。
G434-E463是非常独特的LBD，它似乎是最合适的脂质体结合基序，并与BFSP1的OD(寡聚化结构域：L464-P548)一起延伸，它是膜稳定化聚合物，由于组织特异性和BFSP1的原始功能，它没有可能的副作用，这保留了纤维细胞的膜结构和眼晶状体的透明度。
d.BFSP1的OD(寡聚化结构域)L464-P548:
蛋白折叠是获得蛋白适当结构和功能性的关键点。细胞骨架元素的聚合是严格调控过程，涉及多种调控因子，如相互作用蛋白、PTM(翻译后修饰)等。重组中间丝蛋白(如BFSP1、BFSP2或GFAP)在“体外”缓冲液中组装得很好(Exp Cell Res.2007June 10；313(10):2180–2188.doi:10.1016/j.yexcr.2007.04.005.)。重组的全长BFSP1(M1-S665)进入包涵体，并且该蛋白可以用8M尿素重新溶解。逐步去除去展开试剂(尿素)诱导BFSP1丝的自组装。重组OD-BFSP1(L464-P548)以及G434-P548：TFR123不进入包涵体，这些重组肽仍溶于大肠杆菌细胞。可溶性肽片段为重组LBD-OD-BFSP1:G434-P548:TFR123提供更容易和更便宜的纯化方案。
OD的C-末端截短可以降低寡聚化性质，这允许我们调控锚定在脂质体中的寡聚物肽层的强度。
II.脂质体：
a.脂质组分：
人工脂质体的复杂脂质组分模拟天然脂质双层膜。
18:1(DELTA 9-CIS)PC(DOPC)
N-棕榈酰-D-鞘磷脂
1,2-二油酰-SN-甘油-3-磷酸乙醇
胆固醇
b.用超声和挤出机生产均匀脂质体：
将纯化的脂质储存在氯仿:甲醇(2:1)溶剂中。悬浮液在惰性气体下蒸馏，然后为了除去过量的溶剂，剩余的内容物在真空下干燥长达1小时。然后，将脂质在所需的高于熔融温度的水性缓冲液中水合，随后在液氮中进行一系列重复冻融后，我们获得了多层囊泡(multilamellar vesicles，MLV)。然后，将MLV悬浮液超声处理至透明，获得小的单层囊泡(SUV，d～20-40nm)。使用聚碳酸酯过滤器(孔径：100和200nm)，通过挤压程序(LiposoFast，Avestin，Inc)对MLV系统进行过滤。经过多次过滤，我们获得了尺寸良好的圆形单层囊泡(unilamellar vesicles，LUV)。
III.克隆TFR123-SARS-CoV-2重组肽表达系统：
a.TFR123-pET28a:核心肽表达系统(G434-P548-His-pET28a)。
使用定制的DNA寡核苷酸通过PCR扩增G434-P548＝LBD-OD-BFSP1的核苷酸序列(表2)。
表2.
正向引物引入了5'NcoI限制性核酸内切酶位点，然而反向引物排除了内源性“终止”密码子，并在PCR扩增子上引入了3'XhoI位点。在PCR反应过程中，全长BFSP1-pET23a的图像克隆用于模板DNA。将PCR扩增子插入pGEMT-easy克隆载体(Promega)。使用T7和Sp6引物进行DNA测序，确定扩增子的正确核苷酸序列。用NcoI-XhoI酶消化经确认的TFR123-pGEMTeasy克隆体。345bp的DNA插入物在1.5％丙烯酰胺凝胶上运行，并且用来自凯杰(Qiagen)的QIA快速凝胶提取试剂盒纯化。目的载体(pET28a)用相同的NcoI-XhoI限制性内切酶双重消化。将5'-NcoI-G434-P548-XhoI-3'DNA插入物连接至用NcoI-XhoI消化的pET28a载体中(图11)。限制性内切酶和T4-DNA连接酶来自Neb(新英格兰生物实验室)。将TFR123-pET28a转化到DH5-α和BL21-DE3-pLysS感受态大肠杆菌流中。
b.TFR123-SARS-CoV-2最佳候选表位序列：
SARS-CoV-2疫苗最大的挑战是识别病毒的最有用的免疫原表位序列。SARS-CoV-2的突起蛋白似乎是最明显的抗原。使用突起蛋白进行疫苗接种有许多策略和挑战。
关于突起蛋白有三个显著的问题。
Nr.1:突起是高度糖基化蛋白(见Watanabe等人，Science 369,330 333(2020)17July)。翻译后修饰排除了在细菌中突起蛋白的成本有效和高产重组表达。然而，糖基化可能是可变的，稍微改变了突起的3D结构。这降低了可能疫苗的可重复免疫原效应。突起蛋白的真核表达(例如，在HEK293细胞中)是昂贵的，并且可变糖基化的问题仍然存在。
Nr.2:突起的外段：也包含受体结合结构域(RBD)的S1蛋白不像S2蛋白和跨膜结构域(TM)那样具有保守的氨基酸序列。这意味着S1蛋白的进化变异可能会降低可能疫苗的可重复免疫原效应。
Nr.3:未修饰(无糖基化)的保守氨基酸序列位于突起的隐藏区域，这对于疫苗接种是无用的，因为这些氨基酸结构在突起表面没有很好地显示。
对突起蛋白氨基酸序列的研究表明了非常有希望的序列：F802-F823(PBM：蛋白酶结合基序)，其包含S2'蛋白水解剪切点(图13)。F802-F823氨基酸序列没有天冬酰胺(“N”)，这排除了N-糖基化。这是非常重要的，因为突起蛋白的N-糖基化是在天冬酰胺残基上进行的(Watanabe等，Science 369,330 333 17July 2020)。三聚体突起的每个单体显示22个N-糖基化位点(参见Watanabe等，Science 369,330 333 17July 2020)。糖基化似乎是病毒内化进入肺细胞中是必不可少的，因为突起糖基化的破坏会损害病毒的进入(GeneticEngineering and Biotechnology News.Retrieved 2020-05-18)。肺细胞ACE2受体的配体结合功能性与识别蛋白的碳水化合物修饰的凝集素受体非常相似，这表明聚糖-蛋白相互作用在病毒进入过程中的重要性。然而，蛋白酶的底物结合更倾向于未修饰的氨基酸序列。蛋白酶需要清楚地进入底物的剪切位点。事实上，糖基化可以掩盖这种进入。另一方面，底物的蛋白酶结合位点必须显示得很好，否则不会发生蛋白水解剪切。突起蛋白的S2'剪切位点可能是培育(raise)SARS-CoV-2疫苗的极好的合适表位，因为它非常好地显示在突起蛋白的外段，而且它没有糖基化(图13)。
TFR123免疫平台能够在非常高的浓度下显示极短的肽表位。直径为200纳米并包被有Myr-G434-P548-SARS-CoV-2-S2'-剪切位点的脂质体可能是非常稳定的且具有免疫原性。TFR123-SARS-CoV-2-S2'-剪切位点可能成为一种非常有前途的新型COVID 19疫苗。
免疫原表位序列的最佳大小含有7-14个氨基酸，这小到对TFR123免疫平台的寡聚化和脂质结合没有影响。为此，设计了完整的克隆家族(参见以下：III.b.)。
将TFR123融合肽亚克隆到pET28a表达载体。多组氨酸标签和胱天蛋白酶-3剪切位点设计在TFR123融合肽的N-末端，因为它将通过镍亲和柱(来自西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)的His-选择亲和凝胶)纯化，而未标签化重组融合肽将通过重组活化的胱天蛋白酶-3(赛默飞世尔(ThermoFisher)))从镍柱(NIC)洗脱。融合肽的体外豆蔻酰化是通过白色念珠菌重组N-豆蔻酰转移酶(CaNMT)和活化的豆蔻酸(Myr-S-CoA)实现的。豆蔻酰化融合肽通过HPLC-SEC(尺寸排阻柱)分离。
TFR123融合肽的克隆策略：(图16)。
i.TFR123核心：
已经存在的G434-P548-His6-pET28a表达克隆必须被N-末端组氨酸标签和胱天蛋白酶剪切位点重组地修饰。这些可以通过PCR或通过与原始G434-P548编码基因序列杂交和融合的预先设计的寡核苷酸来执行。我们实现了两种克隆策略。PCR引物序列参见表3。对于PCR扩增子的示意性结构参见图19。
表3.用于TFR123核心构建体的PCR引物：正向引物将NcoI位点和多组氨酸标签编码序列引入到G434-P548编码序列的5'末端。反向引物在原始核心肽编码序列的3'末端引入“TAA”终止密码子和XhoI位点。这种克隆的意义是去除C-末端His-标签并引入N-末端His-标签和胱天蛋白酶剪切位点。
杂交策略的序列参见表4。对于PCR扩增子的示意性结构参见图20。
表4.TFR123核心的核苷酸序列(His6-Casp3-G434-P548-pET28a)：该表包含相互杂交的核苷酸序列(正义(Sense)-1至反义(Antisense)1、或正义-2至反义-2)。杂交双链DNA具有彼此相容的末端、以及与用NcoI-SacI消化的目的载体G434-P548-pET28a相容的末端。
ii.TFR123-C8-N1(TFR123-P807-R815)
最佳候选序列是S蛋白的外环(P807-R815)(图15C，表19)。为了设计TFR123-P807-R815克隆体，已经存在的TFR123核心(在III.b.i中设计)必须用SARS-CoV-2S蛋白的P807-R815氨基酸编码序列通过C-末端延伸进行修饰。这些可以通过PCR或通过与III.b.i.中设计的TFR123核心编码基因序列杂交和融合的预先设计的寡核苷酸来执行。我们实现了两种克隆策略。对于PCR引物序列，参见表5。对于PCR扩增子的示意性结构，参见图21。
表5.TFR123-P807-R815构建体(C8-N1)的PCR引物：正向引物将NcoI位点和多组氨酸标签编码序列引入到G434-P548编码序列的5'端上。反向引物将S蛋白的S2'剪切位点(P807-R815)的外环、“TAA”终止密码子和XhoI位点引入到原始核心肽编码序列的3'端。
对于杂交策略的序列，参见表6。(注释：称为“GGQ-LBD-C8-N6-CoV2-正义1”和“GGQ-LBD-C8-N6-CoV2-反义1”的引物用于TFR123-P807-D820和TFR123-P807-R815构建体)。对于PCR扩增子的示意性结构，参见图22。
表6.TFR123-P807-R815-pET28a构建体(C8-N1)的核苷酸序列：该表包含相互杂交的核苷酸序列(正义-1至反义1、或正义-2至反义-2)。具有相容性的杂交双链DNA彼此终止(-T和A悬垂)以及终止至用MfeIXhoI设计的目的载体TFR123-pET28a。
iii.TFR123-C8-N6(TFR123-P807-D820)
第二好的表位序列是S蛋白外环的C末端延伸版。为了设计和创建TFR123-P807-D820克隆体，实现与前一克隆体：TFR123-P807-R815情况相同的程序。对于PCR引物序列，参见表7。对于PCR扩增子的示意性结构，参见图23。
表7.TFR123-P807-D820构建体的PCR引物(C8-N6)：正向引物将NcoI位点和多组氨酸标签编码序列引入到G434-P548编码序列的5'端上。反向引物将S蛋白S2'剪切位点(P807-D820)外环的C-末端延伸、“TAA”终止密码子和XhoI位点引入到原始核心肽编码序列的3'端。
对于杂交策略的序列，参见表8。
(对于表8的注释：称为“GGQ-LBD-C8-N6-CoV2-正义1”和“GGQLBD-C8-N6-CoV2-反义1”的引物用于TFR123-P807-D820和TFR123-P707-R815构建体)。对于PCR扩增子的示意性结构，参见图24。
表8.TFR123-P807-R820-pET28a构建体的核苷酸序列(C8-N6)：该表包含相互杂交的核苷酸序列(正义-1至反义1、或正义-2至反义-2)。具有相容性的杂交双链DNA彼此终止(-T和A悬垂)以及终止至用MfeIXhoI设计的目的载体TFR123-pET28a。
iv.TFR123-C13(TFR123-F802-R815)
第三最好的候选表位是S蛋白外环的N-末端延伸。对于TFR123F-802-R815克隆体的设计和创建，按照之前在III.b.ii中描述的相同方案进行。对于PCR引物序列，参见表9。对于PCR扩增子的示意性结构，参见图25。
表9.TFR123-P802-R815构建体的PCR引物(C13)：正向引物将NcoI位点和多组氨酸标签编码序列引入到G434-P548编码序列的5'端上。反向引物将S蛋白S2'剪切位点(P802-R815)外环的N-末端延伸、“TAA”终止密码子和XhoI位点引入到原始核心肽编码序列的3'端。
对于杂交策略的序列，参见表10。对于PCR扩增子的示意性结构，参见图26。
表10.TFR123-P802-R815-pET28a构建体的核苷酸序列(C13)：该表包含相互杂交的核苷酸序列(正义-1至反义1、或正义-2至反义-2)。具有相容性的杂交双链DNA彼此终止(-T和A悬垂)以及终止至用MfeIXhoI设计的目的载体TFR123-pET28a。
此外，我们发现F802-K814可能是很好的表位。因此，C13可以指F802-R815和F802-K814两者。F802-K814是优选序列(SEQ ID NO:11)。
c.对照表位序列以确认SARS CoV-2的最佳候选表位
i.TFR 123-FP(融合肽：S816-F823:SFIEDLLF)延伸至N12。融合肽(FD)仅包含8个氨基酸(S816-F823)。SARS-CoV-2的S蛋白的3D结构分析表明，这种序列位于突起蛋白封闭位置的隐藏区。尽管FP在S2'剪切(突起的开放位置)后会很好地显示，但它似乎不是用于疫苗接种的最佳表位序列。尽管FP的位置劣势，但它能够证明我们的假设，为什么S2'剪切位点的外环可能是用于疫苗接种的最佳候选表位。对于免疫学研究，为TFR123平台(TFR123-R815-V826)设计了延伸的FP序列。对于克隆体，实现了与先前TFR123克隆体相同的程序。对于PCR引物序列，参见表11。对于PCR扩增子的示意性结构，参见图27。
表11.TFR123-R815-V826构建体的PCR引物(N12)：正向引物将NcoI位点和多组氨酸标签编码序列引入到G434-P548编码序列的5'端上。反向引物将S蛋白S2'剪切位点(R815-V826)外环的N-末端延伸、“TAA”终止密码子和XhoI位点引入到原始核心肽编码序列的3'端。
对于杂交策略的序列，参见表12。对于PCR扩增子的示意性结构，参见图28。
表12.该表包含相互杂交的核苷酸序列(正义-1至反义1、或正义-2至反义-2)。具有相容性的杂交双链DNA彼此终止(-T和A悬垂)以及终止至用MfeIXhoI设计的目的载体TFR123-pET28a。
ii.TFR123-HRN(N-末端七肽重复：HR1)K921-I934。HRN(替代名称：HR1)具有非常稳定的卷曲螺旋结构。乍一看，这似乎是理想的表位。此外，封闭的糖基化位点距离很远(N801和N1074)。然而，卷曲螺旋结构组装得非常紧密，相互掩盖。事实上，HR1并不是最佳的表位，但它可以成为合适的对照序列。对于克隆体，实现了与先前TFR123克隆体相同的程序。对于PCR引物序列，参见表13。对于PCR扩增子的示意性结构，参见图29。
表13.TFR123-K921-I934构建体的PCR引物(HR1)：正向引物将NcoI位点和多组氨酸标签编码序列引入到G434-P548编码序列的5'端上。反向引物将S蛋白S2'剪切位点(K921-I934)外环的N-末端延伸、“TAA”终止密码子和XhoI位点引入到原始核心肽编码序列的3'端。
对于杂交策略的序列，参见表14。对于PCR扩增子的示意性结构，参见图30。
表14.TFR123-K921-I934-pET28a构建体的核苷酸序列(HR1)：该表包含相互杂交的核苷酸序列(正义-1至反义1、或正义-2至反义-2)。具有相容性的杂交双链DNA彼此终止(-T和A悬垂)以及终止至用MfeIXhoI设计的目的载体TFR123-pET28a。
iii.TFR123-HRC(C-末端七肽重复：HR2)A1174-N1187。HRC(或者：HR2)是用于疫苗接种的次优序列，因为它的侧缘具有糖基化位点(N1173和N1194)，并且它离TM(跨膜基序)非常接近。对于克隆体，实现了与先前TFR123克隆体相同的程序。对于PCR引物序列，参见表15。对于PCR扩增子的示意性结构，参见图31。
表15.TFR123-A1174-N1187构建体的PCR引物(HR2)：正向引物将NcoI位点和多组氨酸标签编码序列引入到G434-P548编码序列的5'端上。反向引物将S蛋白S2'剪切位点(A1174-N1187)外环的N-末端延伸、“TAA”终止密码子和XhoI位点引入到原始核心肽编码序列的3'端。
对于杂交策略的序列，参见表16。对于PCR扩增子的示意性结构，参见图32。
表16.TFR123-A1174-N1187-pET28a构建体的核苷酸序列(HR2)：该表包含相互杂交的核苷酸序列(正义-1至反义1、或正义-2至反义-2)。具有相容性的杂交双链DNA彼此终止(-T和A悬垂)以及终止至用MfeIXhoI设计的目的载体TFR123-pET28a。
iv.FR123-RBM(受体结合基序：A475-C488)。RBM是S蛋白的RBD(受体结合结构域：N331-P527)的配体相互作用部分。这似乎是非常有希望的表位，因为RBM抗原免疫产生的中和抗体可以阻止病毒的对接和进入。另一方面，RBM在S蛋白结构中的位置位于RBD(受体结合结构域)的凹槽中。这意味着RBM没有很好显示突起蛋白序列。出于这个原因，RBM将被用作对照序列，以证明我们的最佳候选表位。对于克隆体，实现了与先前TFR123克隆体相同的程序。对于PCR引物序列，参见表17。对于PCR扩增子的示意性结构，参见图33。
表17.TFR123-A475-C488构建体(RBM)的PCR引物：正向引物将NcoI位点和多组氨酸标签编码序列引入到G434-P548编码序列的5'端上。反向引物将S蛋白S2'剪切位点(A475-C488)外环的N-末端延伸、“TAA”终止密码子和XhoI位点引入到原始核心肽编码序列的3'端。
对于杂交策略的序列，参见表18。对于PCR扩增子的示意性结构，参见图34。
表18.TFR123-A475-C488-pET28a构建体的核苷酸序列(RBM)：该表包含相互杂交的核苷酸序列(正义-1至反义1、或正义-2至反义-2)。具有相容性的杂交双链DNA彼此终止(-T和A悬垂)以及终止至用MfeIXhoI设计的目的载体TFR123-pET28a。
IV.FR123-SARS-CoV-2单体的纯化：
每个DNA载体构建体已经转化到大肠杆菌BL21蛋白表达菌株中。通过标准热休克方案进行转化。将100mg载体插入构建体在冰上导入至100ml感受态大肠杆菌BL21菌株悬浮液，并在冰上孵育10分钟。将试管放在42℃的水浴中正好1分钟，然后在冰上孵育5分钟。向悬浮液中加入350SOC培养基，并在摇瓶中以140rpm在37℃下孵育90分钟。将5ml和100ml的孵育悬浮液铺在含有20μl卡那霉素(50mg/ml)的20μlLB琼脂平板上。从含有10μl卡那霉素的10ml的LB培养基中从生长的单菌落开始10ml培养，在37℃下以140rpm孵育过夜。将100ml培养物加入到1000ml含有1ml卡那霉素的新鲜LB中，分离到两个500毫升玻璃容器中。培养物孵育4小时，直到溶液达到OD 600，然后向系统中加入1mM的IPTG(异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷，异丙基β-D-硫代半乳糖苷)以诱导所需的蛋白表达。再孵育另外4小时后，细菌悬浮液在4℃下以8000rpm离心15分钟，并将丸粒在-20℃下冷冻。用20ml裂解缓冲液(300mMNaCl；50mM NaH2PO4:Na2HPO4 1:1；10mM咪唑；0.5％Triton X，0.5％Nonident NP-40；蛋白酶抑制剂混合物pH＝8)将丸粒在冰上解冻。通过在冰上以50％的脉冲率进行5x1分钟的超声波处理使细胞裂解，然后在4℃下以8000rpm离心15分钟。将上清液与镍亲和层析珠一起孵育过夜，同时轻轻摇动。将悬浮液转移到色谱柱，并且静置直至珠完全下降。在干净的试管中收集流出物后，并且珠用3×10mL过量的裂解缓冲液清洗，然后用3×10mL清洗缓冲液(300mM NaCl，50mM NaH2PO4:Na2HPO4 1:1，蛋白酶抑制剂混合物pH＝8.0)清洗。将表达的蛋白质通过收集在单独的微量离心管中的10x1ml的洗脱缓冲液(300mM NaCl，50mMNaH2PO4:Na2HPO4 1:1，1M咪唑)洗脱。在此过程中，我们从方括号中所示的步骤中收集了SDS-PAGE样本。使用密度测定法通过BSA稀释系列鉴定洗脱蛋白的浓度。将重组肽用重折叠缓冲液(refolding buffer)(20mM Tris pH＝7.5，150mM NaCl，10％甘油，3M尿素)透析。重组肽用0.22μm MILLEX GP膜无菌过滤。
V.TFR123-SARS-CoV-2单体的组装。
脂质体和经纯化的TFR123-SARS-CoV-2肽以1：1重量比：0.5mg脂质体与0.5mg重组肽在重折叠缓冲液(20mM Tris pH＝7.5，150mM NaCl，10％甘油，3M尿素)中混合。寡聚物的组装将通过逐步去除尿素来诱导。脂质体-肽混合物将在含有2M尿素、然后是1.5M尿素、1M尿素、0.5M尿素和无尿素的重折叠缓冲液中透析。
VI.兔的免疫接种：
对于免疫接种，我们使用3个月大的兔。兔接受0.5mg抗原的免疫注射，延伸至1.2毫升。联合注射用400μl的CFL延伸。每只兔在颈部区域接受4×300ml的皮下注射。在初始步骤之后，动物在两周后接受0.的加强注射，再过一周另外接受0.25mg的注射。兔将在两周后放血。血液将被离心，并且兔血清将被储存在冰上并通过血清学调查进行分析(参见下文VIII)。
VII.兔的免疫应答的定量：
a.促炎细胞因子的测定：为了定量用适当抗原注射的兔的免疫应答，我们打算通过验证的炎症ELISA试剂盒测量促炎细胞因子(TNF-α、IL2、IL6等)的变化。用TFR123核心肽注射的兔来预期非常低的免疫应答。然而，TFR123-CoV-2-表位延伸免疫原(III.B.ii-iv和III.c.i-iv)可能会产生明显的免疫应答。
b.在每次加强免疫后检测血清的免疫球蛋白滴度：
稀释血清的IgM和IgG滴度将通过ELISA进行测定。
VIII.兔血清敏感性的血清学研究
a.固定化重组全长突起蛋白的ELISA法。为了研究和测定兔血清的敏感性，我们打算测试一系列稀释的兔血清。将重组的、经纯化的全长突起蛋白固定在ELISA平板上，并与一系列稀释的兔血清(1:1、1:2、1:4、1:8、1:16和1:32)一起孵育。
b.固定化重组肽的ELISA法用于免疫：将用于免疫的合适抗原(TFR123-SARS-CoV-2)固定在ELISA平板上。将进行与上述(VIII.a)相同的实验。c.免疫兔血清对SARS-CoV-2感染的HEK 293人胚胎肾细胞的免疫细胞化学研究。
感染的HEK293细胞将用4％PFA固定，用洋地黄皂苷渗透，并在10％驴血清中封闭。一抗将是免疫兔的血清。二抗将是抗兔-AlexaFluor-488荧光抗体。荧光照片将由共焦显微镜拍摄。
IX.对取自用SARS-CoV-2感染且无症状或已痊愈的个体的人血清的敏感性进行血清学研究
为了证明我们概念，SARS-CoV-2突起的蛋白酶结合基序的外环(PBM＝TFR123-P807-R815)是用于疫苗接种的潜在最佳表位序列，我们打算检测取自用SARS-CoV-2病毒感染的个体的人血清。将用于免疫的合适抗原(TFR123-SARS-CoV-2)固定在ELISA平板上，并与一系列稀释的人血清(1:1、1:2、1:4、1:8、1:16和1:32)孵育。
X.TFR123-CoV-2疫苗在仓鼠体内的有效性研究
a.对照TFR123核心和TFR123-CoV-2疫苗在仓鼠中的免疫应答研究：为了定量用适当抗原注射的仓鼠的免疫应答，我们打算通过验证的炎症ELISA试剂盒测量促炎细胞因子(TNF-α、IL2、IL6等)的变化。每次加强免疫后检测血清免疫球蛋白滴度：稀释血清的IgM和IgG滴度将通过ELISA进行测定。
b.用SARS-CoV-2感染的仓鼠中病毒拷贝数的定量。
c.用TFR123-CoV2注射后用SARS-CoV2感染的仓鼠中病毒拷贝数的定量。
具有TFR123-S2-C13的兔的免疫结果
来自接种TFR123-S2-C13的兔的抗SARS-CoV-2抗体显示出与来自SARS-CoV-2感染恢复期的人的抗SARS-CoV-2抗体或来自接种复必泰(Comirnaty)疫苗的人的抗SARS-CoV-2抗体的重组突起蛋白和总病毒裂解物相似的免疫阳性反应。
为了显示TFR123-S2-C13诱导的免疫应答的特异性，我们使用了用第三次接种TFR123-S2-C13疫苗后的第二周(即，第一次注射后的六周)抽取的免疫兔的血液样本。作为阳性对照，使用了接种用复必泰疫苗的受试者的血清样品(第二次注射后四周)。经纯化的重组SARS-CoV-2-S1、SARS-CoV-2-S2和TVL(总病毒裂解物，即来自用SARS-CoV-2转染的Vero-6细胞的灭活裂解物)用作抗原。来自接种复必泰疫苗的受试者的血清样本对SARS-CoV-2-S1和SARS-CoV-2-S2给出了免疫阳性信号(图18)。兔抗TFR123-S2-C13抗体与重组SARS-CoV-2-S2和内源性SARS-CoV-2-S2蛋白的蛋白水解片段发生免疫阳性反应(图18)。来自SARS-CoV-2感染恢复期的人的血清样品的抗体显示对SARS-CoV-2-S1和SARS-CoV-2-S2以及内源性SARS-CoV-2突起蛋白的蛋白水解片段的免疫阳性(图18)。因此，由TFR123-S2-C13疫苗产生的多克隆抗体对SARS-CoV-2具有特异性和敏感性。
表格
表19.用于与CoV-2表位缀合的TFR123免疫平台的PCR引物
表20.用于与CoV-2表位缀合的TFR-3×3免疫平台的PCR引物
表21.用于与CoV-2表位缀合的TFR-5×5免疫平台的PCR引物
/>
表22.LBD变体的氨基酸序列的实例
表23.OD变体的氨基酸序列的实例
/>
兔的免疫
成立了以下小组：
1.接受Myr-GHHHSHHH-LBD-OD的兔
2.接受Myr-GHHHSHHH-LBD-OD-S2-C13的兔
3.接受Myr-GHHHSHHH-LBD-OD-RBM-C14的兔
4.接受Myr-GHHHSHHH-LBD-OD-RBD-C14的兔
5.接受Myr-GHHHSHHH-LBD-OD-RBD-N14的兔
6.接受Myr-GHHHSHHH-LBD-OD-S1S2-C14的兔
7.接受以下联合疫苗的兔：Myr-LBD-OD-HHHHHH；GHHHSHHH-LBD-OD-S2-C13；GHHHSHHH-LBD-OD-RBM-C14；GHHHSHHH-LBD-OD-RBD-C14；GHHHSHHH-LBD-OD-RBD-N14；GHHHSHHH-LBD-OD-S1S2-C14
通过ELISA和蛋白质印迹检测特异性抗突起-IgG抗体。
序列表
<110> 佩奇大学
<120> 新型疫苗平台
<130> P133312
<150> HUP2000351
<151> 2020-10-26
<160> 130
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 27
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Gly Gly Gln Ile Ser Lys Gly Phe Gly Lys Leu Tyr Arg Lys Val Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Arg Ser Pro Lys Glu Pro Glu Thr
20 25
<210> 2
<211> 85
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Leu Tyr Thr Lys Glu Arg His Val Leu Val Thr Gly Asp Ala Asn Tyr
1 5 10 15
Val Asp Pro Arg Phe Tyr Val Ser Ser Ile Thr Ala Lys Gly Gly Val
20 25 30
Ala Val Ser Val Ala Glu Asp Ser Val Leu Tyr Asp Gly Gln Val Glu
35 40 45
Pro Ser Pro Glu Ser Pro Lys Pro Pro Leu Glu Asn Gly Gln Val Gly
50 55 60
Leu Gln Glu Lys Glu Asp Gly Gln Pro Ile Asp Gln Gln Pro Ile Asp
65 70 75 80
Lys Glu Ile Glu Pro
85
<210> 3
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Gly Gly Gln Ile Ser Lys Gly Phe Gly Lys Leu Tyr Arg Lys Val Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Arg Ser Pro Lys Glu Pro Glu Thr Pro Thr Glu
20 25 30
<210> 4
<211> 665
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Met Tyr Arg Arg Ser Tyr Val Phe Gln Thr Arg Lys Glu Gln Tyr Glu
1 5 10 15
His Ala Asp Glu Ala Ser Arg Ala Ala Glu Pro Glu Arg Pro Ala Asp
20 25 30
Glu Gly Trp Ala Gly Ala Thr Ser Leu Ala Ala Leu Gln Gly Leu Gly
35 40 45
Glu Arg Val Ala Ala His Val Gln Arg Ala Arg Ala Leu Glu Gln Arg
50 55 60
His Ala Gly Leu Arg Arg Gln Leu Asp Ala Phe Gln Arg Leu Gly Glu
65 70 75 80
Leu Ala Gly Pro Glu Asp Ala Leu Ala Arg Gln Val Glu Ser Asn Arg
85 90 95
Gln Arg Val Arg Asp Leu Glu Ala Glu Arg Ala Arg Leu Glu Arg Gln
100 105 110
Gly Thr Glu Ala Gln Arg Ala Leu Asp Glu Phe Arg Ser Lys Tyr Glu
115 120 125
Asn Glu Cys Glu Cys Gln Leu Leu Leu Lys Glu Met Leu Glu Arg Leu
130 135 140
Asn Lys Glu Ala Asp Glu Ala Leu Leu His Asn Leu Arg Leu Gln Leu
145 150 155 160
Glu Ala Gln Phe Leu Gln Asp Asp Ile Ser Ala Ala Lys Asp Arg His
165 170 175
Lys Lys Asn Leu Leu Glu Val Gln Thr Tyr Ile Ser Ile Leu Gln Gln
180 185 190
Ile Ile His Thr Thr Pro Pro Ala Ser Ile Val Thr Ser Gly Met Arg
195 200 205
Glu Glu Lys Leu Leu Thr Glu Arg Glu Val Ala Ala Leu Arg Ser Gln
210 215 220
Leu Glu Glu Gly Arg Glu Val Leu Ser His Leu Gln Ala Gln Arg Val
225 230 235 240
Glu Leu Gln Ala Gln Thr Thr Thr Leu Glu Gln Ala Ile Lys Ser Ala
245 250 255
His Glu Cys Tyr Asp Asp Glu Ile Gln Leu Tyr Asn Glu Gln Ile Glu
260 265 270
Thr Leu Arg Lys Glu Ile Glu Glu Thr Glu Arg Val Leu Glu Lys Ser
275 280 285
Ser Tyr Asp Cys Arg Gln Leu Ala Val Ala Gln Gln Thr Leu Lys Asn
290 295 300
Glu Leu Asp Arg Tyr His Arg Ile Ile Glu Ile Glu Gly Asn Arg Leu
305 310 315 320
Thr Ser Ala Phe Ile Glu Thr Pro Ile Pro Leu Phe Thr Gln Ser His
325 330 335
Gly Val Ser Leu Ser Thr Gly Ser Gly Gly Lys Asp Leu Thr Arg Ala
340 345 350
Leu Gln Asp Ile Thr Ala Ala Lys Pro Arg Gln Lys Ala Leu Pro Lys
355 360 365
Asn Val Pro Arg Arg Lys Glu Ile Ile Thr Lys Asp Lys Thr Asn Gly
370 375 380
Ala Leu Glu Asp Ala Pro Leu Lys Gly Leu Glu Asp Thr Lys Leu Val
385 390 395 400
Gln Val Val Leu Lys Glu Glu Ser Glu Ser Lys Phe Glu Ser Glu Ser
405 410 415
Lys Glu Val Ser Pro Leu Thr Gln Glu Gly Ala Pro Glu Asp Val Pro
420 425 430
Asp Gly Gly Gln Ile Ser Lys Gly Phe Gly Lys Leu Tyr Arg Lys Val
435 440 445
Lys Glu Lys Val Arg Ser Pro Lys Glu Pro Glu Thr Pro Thr Glu Leu
450 455 460
Tyr Thr Lys Glu Arg His Val Leu Val Thr Gly Asp Ala Asn Tyr Val
465 470 475 480
Asp Pro Arg Phe Tyr Val Ser Ser Ile Thr Ala Lys Gly Gly Val Ala
485 490 495
Val Ser Val Ala Glu Asp Ser Val Leu Tyr Asp Gly Gln Val Glu Pro
500 505 510
Ser Pro Glu Ser Pro Lys Pro Pro Leu Glu Asn Gly Gln Val Gly Leu
515 520 525
Gln Glu Lys Glu Asp Gly Gln Pro Ile Asp Gln Gln Pro Ile Asp Lys
530 535 540
Glu Ile Glu Pro Asp Gly Ala Glu Leu Glu Gly Pro Glu Glu Lys Arg
545 550 555 560
Glu Gly Glu Glu Arg Asp Glu Glu Ser Arg Arg Pro Cys Ala Met Val
565 570 575
Thr Pro Gly Ala Glu Glu Pro Ser Ile Pro Glu Pro Pro Lys Pro Ala
580 585 590
Ala Asp Gln Asp Gly Ala Glu Val Leu Gly Thr Arg Ser Arg Ser Leu
595 600 605
Pro Glu Lys Gly Pro Pro Lys Ala Leu Ala Tyr Lys Thr Val Glu Val
610 615 620
Val Glu Ser Ile Glu Lys Ile Ser Thr Glu Ser Ile Gln Thr Tyr Glu
625 630 635 640
Glu Thr Ala Val Ile Val Glu Thr Met Ile Gly Lys Thr Lys Ser Asp
645 650 655
Lys Lys Lys Ser Gly Glu Lys Ser Ser
660 665
<210> 5
<211> 15
<212> PRT
<213> SARS冠状病毒2
<220>
<223> C8N6
<400> 5
Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp
1 5 10 15
<210> 6
<211> 14
<212> PRT
<213> SARS冠状病毒2
<220>
<223> S2C14
<400> 6
Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg
1 5 10
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> SARS冠状病毒2
<220>
<223> C8N1
<400> 7
Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg
1 5 10
<210> 8
<211> 26
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> COMP OD 1
<400> 8
Arg Leu Leu Ala Arg Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Leu Glu Glu Leu
1 5 10 15
Glu Arg Arg Leu Glu Glu Leu Glu Arg Ala
20 25
<210> 9
<211> 36
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> COMP OD 2
<400> 9
Asp Glu Met Leu Arg Glu Leu Gln Glu Thr Asn Ala Ala Leu Gln Asp
1 5 10 15
Val Arg Glu Leu Leu Arg Gln Gln Val Arg Gln Ile Thr Phe Leu Arg
20 25 30
Ala Leu Leu Met
35
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> SARS冠状病毒2
<400> 10
Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys
1 5
<210> 11
<211> 13
<212> PRT
<213> SARS冠状病毒2
<400> 11
Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys
1 5 10
<210> 12
<211> 1273
<212> PRT
<213> SARS冠状病毒2
<400> 12
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805 810 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915 920 925
Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
930 935 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
995 1000 1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu
1010 1015 1020
Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val
1025 1030 1035 1040
Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala
1045 1050 1055
Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu
1060 1065 1070
Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His
1075 1080 1085
Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val
1090 1095 1100
Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr
1105 1110 1115 1120
Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr
1125 1130 1135
Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu
1140 1145 1150
Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp
1155 1160 1165
Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp
1170 1175 1180
Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu
1185 1190 1195 1200
Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile
1205 1210 1215
Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile
1220 1225 1230
Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
1235 1240 1245
Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val
1250 1255 1260
Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1265 1270
<210> 13
<211> 14
<212> PRT
<213> SARS冠状病毒2
<220>
<223> S1S2C14
<400> 13
Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg
1 5 10
<210> 14
<211> 24
<212> PRT
<213> SARS冠状病毒2
<220>
<223> S1S2C24
<400> 14
Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser Tyr Gln Thr Gln
1 5 10 15
Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg
20
<210> 15
<211> 14
<212> PRT
<213> SARS冠状病毒2
<220>
<223> RBD-N14
<400> 15
Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln
1 5 10
<210> 16
<211> 14
<212> PRT
<213> SARS冠状病毒2
<220>
<223> RBM-C14
<400> 16
Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys
1 5 10
<210> 17
<211> 14
<212> PRT
<213> SARS冠状病毒2
<220>
<223> RBD-C14
<400> 17
Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly
1 5 10
<210> 18
<211> 24
<212> PRT
<213> SARS冠状病毒2
<220>
<223> RBM-24
<400> 18
Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly
1 5 10 15
Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln
20
<210> 19
<211> 24
<212> PRT
<213> SARS冠状病毒2
<220>
<223> RBD-24
<400> 19
Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly
1 5 10 15
Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
20
<210> 20
<211> 24
<212> PRT
<213> SARS冠状病毒2
<220>
<223> S2-24
<400> 20
Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro
1 5 10 15
Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg
20
<210> 21
<211> 14
<212> PRT
<213> SARS冠状病毒2
<220>
<223> NUL-14
<400> 21
Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe
1 5 10
<210> 22
<211> 24
<212> PRT
<213> SARS冠状病毒2
<220>
<223> NUL-24
<400> 22
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
1 5 10 15
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe
20
<210> 23
<211> 14
<212> PRT
<213> SARS冠状病毒2
<220>
<223> TCE1-C14
<400> 23
Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu
1 5 10
<210> 24
<211> 14
<212> PRT
<213> SARS冠状病毒2
<220>
<223> TCE2-C14
<400> 24
Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys
1 5 10
<210> 25
<211> 14
<212> PRT
<213> SARS冠状病毒2
<220>
<223> TCE3-C14
<400> 25
Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile
1 5 10
<210> 26
<211> 24
<212> PRT
<213> SARS冠状病毒2
<220>
<223> TCE1-24
<400> 26
Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr
1 5 10 15
Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu
20
<210> 27
<211> 24
<212> PRT
<213> SARS冠状病毒2
<220>
<223> TCE2-24
<400> 27
Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys
1 5 10 15
Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys
20
<210> 28
<211> 24
<212> PRT
<213> SARS冠状病毒2
<220>
<223> TCE3-24
<400> 28
Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln
1 5 10 15
Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile
20
<210> 29
<211> 70
<212> PRT
<213> SARS冠状病毒2
<220>
<223> RBM-70
<400> 29
Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile
20 25 30
Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu
35 40 45
Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr
50 55 60
Asn Gly Val Gly Tyr Gln
65 70
<210> 30
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 30
ccatgggcca ccaccacagc caccaccacg gagggcagat aagcaaaggc 50
<210> 31
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 31
ctcgagttat ggctcaatct ccttgtctat agg 33
<210> 32
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 32
ctcgagttac ctcttgcttg gttttgatgg atctggccct cctggctcaa tctccttgtc 60
tatag 65
<210> 33
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 33
ctcgagttaa tcttcaataa atgacctctt gcttggtttt gatggatctg gccctcctgg 60
ctcaatctcc ttgtctatag 80
<210> 34
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 34
ctcgagttac ttgcttggtt ttgatggatc tggtaatatt tgtgaaaacc ctcctggctc 60
aatctccttg tctatag 77
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 35
gagctcagtg ggggtctcag g 21
<210> 36
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 36
ctcgagttaa gcacgctcga gttcttccag acg 33
<210> 37
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 37
gagctcggtg gtcgtctgct agctcgtctg gaag 34
<210> 38
<211> 66
<212> DNA
<213> A人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 38
ctcgagttac ctcttgcttg gttttgatgg atctggccct ccagcacgct cgagttcttc 60
cagacg 66
<210> 39
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 39
ctcgagttaa tcttcaataa atgacctctt gcttggtttt gatggatctg gccctccagc 60
acgctcgagt tcttccagac g 81
<210> 40
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 40
ctcgagttac ttgcttggtt ttgatggatc tggtaatatt tgtgaaaacc ctccagcacg 60
ctcgagttct tccagacg 78
<210> 41
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 41
ctcgagttac atcagcagag cgcgcagaaa g 31
<210> 42
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 42
gagctcggag gggatgaaat gttgcgtgaa ttac 34
<210> 43
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 43
ctcgagttac ctcttgcttg gttttgatgg atctggccct cccatcagca gagcgcgcag 60
aaag 64
<210> 44
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 44
ctcgagttaa tcttcaataa atgacctctt gcttggtttt gatggatctg gccctcccat 60
cagcagagcg cgcagaaag 79
<210> 45
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 45
ctcgagttac ttgcttggtt ttgatggatc tggtaatatt tgtgaaaacc ctcctggctc 60
aatctccttg tctatag 77
<210> 46
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 46
ccatgggcca ccaccaccac caccacgatg tgccagatgg agggcagata agcaaaggc 59
<210> 47
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 47
ctcgagttat ggctcaatct ccttgtctat agg 33
<210> 48
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 48
ctcgagttac actttgttga aaagtagatc ttcaataaat gacctccctc ctggctcaat 60
ctccttgtct ataggctgct g 81
<210> 49
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 49
ctcgagttaa attttgccaa tagcactatt aaattggttg gcaatcaatt tccctcctgg 60
ctcaatctcc ttgtctatag gctgctg 87
<210> 50
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 50
ctcgagttaa ttgaggcggt caatttcttt ttgaatgttt acaactgaag cattccctcc 60
tggctcaatc tccttgtcta taggctgctg 90
<210> 51
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 51
ctcgagttaa caattaaaac cttcaacacc attacaaggt gtgctaccgg cccctcctgg 60
ctcaatctcc ttgtctatag gctgctg 87
<210> 52
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 52
ccatgggagg gcagataagc aaaggc 26
<210> 53
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 53
ctcgagtggc tcaatctcct tgtctatagg 30
<210> 54
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 54
catgggccac caccaccacc accacgatgt gccagatgga gggcagataa gcaaaggctt 60
tgggaaacta 70
<210> 55
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 55
agtttcccaa agcctttgct tatctgccct ccatctggca catcgtggtg gtggtggtgg 60
tggcc 65
<210> 56
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 56
tacaggaagg tcaaggagaa agtgagaagc cccaaagagc ctgagacccc cactgagct 59
<210> 57
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 57
cagtgggggt ctcaggctct ttggggcttc tcactttctc cttgaccttc ctgtat 56
<210> 58
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 58
aattgaccag cagcctatag acaaggagat tgagccagga gggcca 46
<210> 59
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 59
ggccctcctg gctcaatctc cttgtctata ggctgctggt c 41
<210> 60
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 60
gatccatcaa aaccaagcaa gaggtaac 28
<210> 61
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 61
tcgagttacc tcttgcttgg ttttgatgga tct 33
<210> 62
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 62
gatccatcaa aaccaagcaa gaggtcattt attgaagatt aac 43
<210> 63
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 63
tcgagttaat cttcaataaa tgacctcttg cttggttttg atggatct 48
<210> 64
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 64
aattgaccag cagcctatag acaaggagat tgagccagga gggttttca 49
<210> 65
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 65
gaaaaccctc ctggctcaat ctccttgtct ataggctgct ggtc 44
<210> 66
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 66
caaatattac cagatccatc aaaaccaagc aagaggtaac 40
<210> 67
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 67
tcgagttacc tcttgcttgg ttttgatgga tctggtaata tttgt 45
<210> 68
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 68
aattgaccag cagcctatag acaaggagat tgagccagga ggga 44
<210> 69
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 69
ccctcctggc tcaatctcct tgtctatagg ctgctggtc 39
<210> 70
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 70
ggtcatttat tgaagatcta cttttcaaca aagtgtaac 39
<210> 71
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 71
tcgagttaca ctttgttgaa aagtagatct tcaataaatg acct 44
<210> 72
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 72
aattgaccag cagcctatag acaaggagat tgagccagga gggcca 46
<210> 73
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 73
ggccctcctg gctcaatctc cttgtctata ggctgctggt c 41
<210> 74
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 74
gatccatcaa aaccaagcaa gaggtaac 28
<210> 75
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 75
tcgagttacc tcttgcttgg ttttgatgga tct 33
<210> 76
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 76
aattgaccag cagcctatag acaaggagat tgagccagga gggaatgct 49
<210> 77
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 77
gcattccctc ctggctcaat ctccttgtct ataggctgct ggtc 44
<210> 78
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 78
tcagttgtaa acattcaaaa agaaattgac cgcctcaatt aac 43
<210> 79
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 79
tcgagttaat tgaggcggtc aatttctttt tgaatgttta caactgaa 48
<210> 80
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 80
aattgaccag cagcctatag acaaggagat tgagccagga ggggccgg 48
<210> 81
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 81
accggcccct cctggctcaa tctccttgtc tataggctgc tggtc 45
<210> 82
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 82
tagcacacct tgtaatggtg ttgaaggttt taattgttaa c 41
<210> 83
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 83
tcgagttaac aattaaaacc ttcaacacca ttacaaggtg tgct 44
<210> 84
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pET-28a-c(+) 克隆区
<400> 84
agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa 60
ttcccctcta gaaataattt tgtttaactt taagaaggag atataccatg ggcagcagcc 120
atcatcatca tcacagcagc ggcctggtgc cgcgcggcag ccatatggct agcatgactg 180
gtggacagca aatgggtcgc ggatccgaat tcgagctccg tcgacaagct tgcggccgca 240
ctcgagcacc accaccacca ccactgagat ccggctgcta acaaagcccg aaaggaagct 300
gagttggctg ctgccaccgc tgagcaataa ctagcataac cccttggggc ctctaaacgg 360
gtcttgaggg gttttttg 378
<210> 85
<211> 472
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pET-28b(+) 克隆区
<400> 85
agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa 60
ttcccctcta gaaataattt tgtttaactt taagaaggag atataccatg ggcagcagcc 120
atcatcatca tcacagcagc ggcctggtgc cgcgcggcag ccatatggct agcatgactg 180
gtggacagca aatgggtcgc ggatccgaat tcgagctccg tcgacaagct tgcggccgca 240
ctcgagcacc accaccacca ccactgagat ccggctgcta acaaagcccg gtcgggatcc 300
gaattcgagc tccgtcgaca agcttgcggc cgcactcgag caccaccacc accaccactg 360
agatccggct gctaacaaag cccgaaagga agctgagttg gctgctgcca ccgctgagca 420
ataactagca taaccccttg gggcctctaa acgggtcttg aggggttttt tg 472
<210> 86
<211> 471
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pET-28c(+) 克隆区
<400> 86
agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa 60
ttcccctcta gaaataattt tgtttaactt taagaaggag atataccatg ggcagcagcc 120
atcatcatca tcacagcagc ggcctggtgc cgcgcggcag ccatatggct agcatgactg 180
gtggacagca aatgggtcgc ggatccgaat tcgagctccg tcgacaagct tgcggccgca 240
ctcgagcacc accaccacca ccactgagat ccggctgcta acaaagcccg gtcggatccg 300
aattcgagct ccgtcgacaa gcttgcggcc gcactcgagc accaccacca ccaccactga 360
gatccggctg ctaacaaagc ccgaaaggaa gctgagttgg ctgctgccac cgctgagcaa 420
taactagcat aaccccttgg ggcctctaaa cgggtcttga ggggtttttt g 471
<210> 87
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pET-28a(+) 表达区
<400> 87
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg
20 25 30
Gly Ser Glu Phe Glu Leu Arg Arg Gln Ala Cys Gly Arg Thr Arg Ala
35 40 45
Pro Pro Pro Pro Pro Leu Arg Ser Gly Cys
50 55
<210> 88
<211> 52
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pET-28b(+) 表达区
<400> 88
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Gly Arg Asp
20 25 30
Pro Asn Ser Ser Ser Val Asp Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu His His
35 40 45
His His His His
50
<210> 89
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pET-28c(+) 表达区
<400> 89
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Gly Arg Ile
20 25 30
Arg Ile Arg Ala Pro Ser Thr Ser Leu Arg Pro His Ser Ser Thr Thr
35 40 45
Thr Thr Thr Thr Glu Ile Arg Leu Leu Thr Lys Pro
50 55 60
<210> 90
<211> 22
<212> PRT
<213> SARS冠状病毒2
<400> 90
Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser Phe
1 5 10 15
Ile Glu Asp Leu Leu Phe
20
<210> 91
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> His-标签+胱天蛋白酶位点+TFR123平台且无表位
<400> 91
Met Gly His His His His His His Asp Val Pro Asp Gly Gly Gln Ile
1 5 10 15
Ser Lys Gly Phe Gly Lys Leu Tyr Arg Lys Val Lys Glu Lys Val Arg
20 25 30
Ser Pro Lys Glu Pro Glu Thr Pro Thr Glu Leu Tyr Thr Lys Glu Arg
35 40 45
His Val Leu Val Thr Gly Asp Ala Asn Tyr Val Asp Pro Arg Phe Tyr
50 55 60
Val Ser Ser Ile Thr Ala Lys Gly Gly Val Ala Val Ser Val Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ser Val Leu Tyr Asp Gly Gln Val Glu Pro Ser Pro Glu Ser Pro
85 90 95
Lys Pro Pro Leu Glu Asn Gly Gln Val Gly Leu Gln Glu Lys Glu Asp
100 105 110
Gly Gln Pro Ile Asp Gln Gln Pro Ile Asp Lys Glu Ile Glu Pro
115 120 125
<210> 92
<211> 138
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> His-标签+胱天蛋白酶位点+TFR123平台和C8N1
<400> 92
Met Gly His His His His His His Asp Val Pro Asp Gly Gly Gln Ile
1 5 10 15
Ser Lys Gly Phe Gly Lys Leu Tyr Arg Lys Val Lys Glu Lys Val Arg
20 25 30
Ser Pro Lys Glu Pro Glu Thr Pro Thr Glu Leu Tyr Thr Lys Glu Arg
35 40 45
His Val Leu Val Thr Gly Asp Ala Asn Tyr Val Asp Pro Arg Phe Tyr
50 55 60
Val Ser Ser Ile Thr Ala Lys Gly Gly Val Ala Val Ser Val Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ser Val Leu Tyr Asp Gly Gln Val Glu Pro Ser Pro Glu Ser Pro
85 90 95
Lys Pro Pro Leu Glu Asn Gly Gln Val Gly Leu Gln Glu Lys Glu Asp
100 105 110
Gly Gln Pro Ile Asp Gln Gln Pro Ile Asp Lys Glu Ile Glu Pro Gly
115 120 125
Gly Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg
130 135
<210> 93
<211> 143
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> His-标签+胱天蛋白酶位点+TFR123平台和C8N6
<400> 93
Met Gly His His His His His His Asp Val Pro Asp Gly Gly Gln Ile
1 5 10 15
Ser Lys Gly Phe Gly Lys Leu Tyr Arg Lys Val Lys Glu Lys Val Arg
20 25 30
Ser Pro Lys Glu Pro Glu Thr Pro Thr Glu Leu Tyr Thr Lys Glu Arg
35 40 45
His Val Leu Val Thr Gly Asp Ala Asn Tyr Val Asp Pro Arg Phe Tyr
50 55 60
Val Ser Ser Ile Thr Ala Lys Gly Gly Val Ala Val Ser Val Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ser Val Leu Tyr Asp Gly Gln Val Glu Pro Ser Pro Glu Ser Pro
85 90 95
Lys Pro Pro Leu Glu Asn Gly Gln Val Gly Leu Gln Glu Lys Glu Asp
100 105 110
Gly Gln Pro Ile Asp Gln Gln Pro Ile Asp Lys Glu Ile Glu Pro Gly
115 120 125
Gly Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp
130 135 140
<210> 94
<211> 142
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> His-标签+胱天蛋白酶位点+TFR123平台和C13
<400> 94
Met Gly His His His His His His Asp Val Pro Asp Gly Gly Gln Ile
1 5 10 15
Ser Lys Gly Phe Gly Lys Leu Tyr Arg Lys Val Lys Glu Lys Val Arg
20 25 30
Ser Pro Lys Glu Pro Glu Thr Pro Thr Glu Leu Tyr Thr Lys Glu Arg
35 40 45
His Val Leu Val Thr Gly Asp Ala Asn Tyr Val Asp Pro Arg Phe Tyr
50 55 60
Val Ser Ser Ile Thr Ala Lys Gly Gly Val Ala Val Ser Val Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ser Val Leu Tyr Asp Gly Gln Val Glu Pro Ser Pro Glu Ser Pro
85 90 95
Lys Pro Pro Leu Glu Asn Gly Gln Val Gly Leu Gln Glu Lys Glu Asp
100 105 110
Gly Gln Pro Ile Asp Gln Gln Pro Ile Asp Lys Glu Ile Glu Pro Gly
115 120 125
Gly Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys
130 135 140
<210> 95
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Myr-His-标签+TFR123+接头 无表位
<400> 95
Met Gly His His His Ser His His His Gly Gly Gln Ile Ser Lys Gly
1 5 10 15
Phe Gly Lys Leu Tyr Arg Lys Val Lys Glu Lys Val Arg Ser Pro Lys
20 25 30
Glu Pro Glu Thr Pro Thr Glu Leu Tyr Thr Lys Glu Arg His Val Leu
35 40 45
Val Thr Gly Asp Ala Asn Tyr Val Asp Pro Arg Phe Tyr Val Ser Ser
50 55 60
Ile Thr Ala Lys Gly Gly Val Ala Val Ser Val Ala Glu Asp Ser Val
65 70 75 80
Leu Tyr Asp Gly Gln Val Glu Pro Ser Pro Glu Ser Pro Lys Pro Pro
85 90 95
Leu Glu Asn Gly Gln Val Gly Leu Gln Glu Lys Glu Asp Gly Gln Pro
100 105 110
Ile Asp Gln Gln Pro Ile Asp Lys Glu Ile Glu Pro
115 120
<210> 96
<211> 135
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Myr-His-标签+FR123+接头 + SARS-CoV-2 C8N1 表位
<400> 96
Met Gly His His His Ser His His His Gly Gly Gln Ile Ser Lys Gly
1 5 10 15
Phe Gly Lys Leu Tyr Arg Lys Val Lys Glu Lys Val Arg Ser Pro Lys
20 25 30
Glu Pro Glu Thr Pro Thr Glu Leu Tyr Thr Lys Glu Arg His Val Leu
35 40 45
Val Thr Gly Asp Ala Asn Tyr Val Asp Pro Arg Phe Tyr Val Ser Ser
50 55 60
Ile Thr Ala Lys Gly Gly Val Ala Val Ser Val Ala Glu Asp Ser Val
65 70 75 80
Leu Tyr Asp Gly Gln Val Glu Pro Ser Pro Glu Ser Pro Lys Pro Pro
85 90 95
Leu Glu Asn Gly Gln Val Gly Leu Gln Glu Lys Glu Asp Gly Gln Pro
100 105 110
Ile Asp Gln Gln Pro Ile Asp Lys Glu Ile Glu Pro Gly Gly Pro Asp
115 120 125
Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg
130 135
<210> 97
<211> 140
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Myr-His-标签+TFR123+接头+ SARS-CoV-2 C8N6 表位
<400> 97
Met Gly His His His Ser His His His Gly Gly Gln Ile Ser Lys Gly
1 5 10 15
Phe Gly Lys Leu Tyr Arg Lys Val Lys Glu Lys Val Arg Ser Pro Lys
20 25 30
Glu Pro Glu Thr Pro Thr Glu Leu Tyr Thr Lys Glu Arg His Val Leu
35 40 45
Val Thr Gly Asp Ala Asn Tyr Val Asp Pro Arg Phe Tyr Val Ser Ser
50 55 60
Ile Thr Ala Lys Gly Gly Val Ala Val Ser Val Ala Glu Asp Ser Val
65 70 75 80
Leu Tyr Asp Gly Gln Val Glu Pro Ser Pro Glu Ser Pro Lys Pro Pro
85 90 95
Leu Glu Asn Gly Gln Val Gly Leu Gln Glu Lys Glu Asp Gly Gln Pro
100 105 110
Ile Asp Gln Gln Pro Ile Asp Lys Glu Ile Glu Pro Gly Gly Pro Asp
115 120 125
Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp
130 135 140
<210> 98
<211> 139
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Myr-His-标签+TFR123+接头+ SARS-CoV-2 C13 表位
<400> 98
Met Gly His His His Ser His His His Gly Gly Gln Ile Ser Lys Gly
1 5 10 15
Phe Gly Lys Leu Tyr Arg Lys Val Lys Glu Lys Val Arg Ser Pro Lys
20 25 30
Glu Pro Glu Thr Pro Thr Glu Leu Tyr Thr Lys Glu Arg His Val Leu
35 40 45
Val Thr Gly Asp Ala Asn Tyr Val Asp Pro Arg Phe Tyr Val Ser Ser
50 55 60
Ile Thr Ala Lys Gly Gly Val Ala Val Ser Val Ala Glu Asp Ser Val
65 70 75 80
Leu Tyr Asp Gly Gln Val Glu Pro Ser Pro Glu Ser Pro Lys Pro Pro
85 90 95
Leu Glu Asn Gly Gln Val Gly Leu Gln Glu Lys Glu Asp Gly Gln Pro
100 105 110
Ile Asp Gln Gln Pro Ile Asp Lys Glu Ile Glu Pro Gly Gly Phe Ser
115 120 125
Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys
130 135
<210> 99
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Myr-His-标签+TFR3x3平台且无表位
<400> 99
Met Gly His His His Ser His His His Gly Gly Gln Ile Ser Lys Gly
1 5 10 15
Phe Gly Lys Leu Tyr Arg Lys Val Lys Glu Lys Val Arg Ser Pro Lys
20 25 30
Glu Pro Glu Thr Pro Thr Glu Leu Gly Gly Arg Leu Leu Ala Arg Leu
35 40 45
Glu Glu Leu Glu Arg Arg Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Leu Glu Glu
50 55 60
Leu Glu Arg Ala
65
<210> 100
<211> 79
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Myr-His-标签+TFR3x3平台和C8N1
<400> 100
Met Gly His His His Ser His His His Gly Gly Gln Ile Ser Lys Gly
1 5 10 15
Phe Gly Lys Leu Tyr Arg Lys Val Lys Glu Lys Val Arg Ser Pro Lys
20 25 30
Glu Pro Glu Thr Pro Thr Glu Leu Gly Gly Arg Leu Leu Ala Arg Leu
35 40 45
Glu Glu Leu Glu Arg Arg Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Leu Glu Glu
50 55 60
Leu Glu Arg Ala Gly Gly Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg
65 70 75
<210> 101
<211> 84
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Myr-His-标签+TFR3x3平台和C8N6
<400> 101
Met Gly His His His Ser His His His Gly Gly Gln Ile Ser Lys Gly
1 5 10 15
Phe Gly Lys Leu Tyr Arg Lys Val Lys Glu Lys Val Arg Ser Pro Lys
20 25 30
Glu Pro Glu Thr Pro Thr Glu Leu Gly Gly Arg Leu Leu Ala Arg Leu
35 40 45
Glu Glu Leu Glu Arg Arg Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Leu Glu Glu
50 55 60
Leu Glu Arg Ala Gly Gly Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
65 70 75 80
Phe Ile Glu Asp
<210> 102
<211> 83
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Myr-His-标签+TFR3x3平台和C13
<400> 102
Met Gly His His His Ser His His His Gly Gly Gln Ile Ser Lys Gly
1 5 10 15
Phe Gly Lys Leu Tyr Arg Lys Val Lys Glu Lys Val Arg Ser Pro Lys
20 25 30
Glu Pro Glu Thr Pro Thr Glu Leu Gly Gly Arg Leu Leu Ala Arg Leu
35 40 45
Glu Glu Leu Glu Arg Arg Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Leu Glu Glu
50 55 60
Leu Glu Arg Ala Gly Gly Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys
65 70 75 80
Pro Ser Lys
<210> 103
<211> 78
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Myr-His-标签+TFR5x5平台且无表位
<400> 103
Met Gly His His His Ser His His His Gly Gly Gln Ile Ser Lys Gly
1 5 10 15
Phe Gly Lys Leu Tyr Arg Lys Val Lys Glu Lys Val Arg Ser Pro Lys
20 25 30
Glu Pro Glu Thr Pro Thr Glu Leu Gly Gly Asp Glu Met Leu Arg Glu
35 40 45
Leu Gln Glu Thr Asn Ala Ala Leu Gln Asp Val Arg Glu Leu Leu Arg
50 55 60
Gln Gln Val Arg Gln Ile Thr Phe Leu Arg Ala Leu Leu Met
65 70 75
<210> 104
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Myr-His-标签+TFR5x5平台和C8N1
<400> 104
Met Gly His His His Ser His His His Gly Gly Gln Ile Ser Lys Gly
1 5 10 15
Phe Gly Lys Leu Tyr Arg Lys Val Lys Glu Lys Val Arg Ser Pro Lys
20 25 30
Glu Pro Glu Thr Pro Thr Glu Leu Gly Gly Asp Glu Met Leu Arg Glu
35 40 45
Leu Gln Glu Thr Asn Ala Ala Leu Gln Asp Val Arg Glu Leu Leu Arg
50 55 60
Gln Gln Val Arg Gln Ile Thr Phe Leu Arg Ala Leu Leu Met Gly Gly
65 70 75 80
Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg
85
<210> 105
<211> 94
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Myr-His-标签+TFR5x5平台和C8N6
<400> 105
Met Gly His His His Ser His His His Gly Gly Gln Ile Ser Lys Gly
1 5 10 15
Phe Gly Lys Leu Tyr Arg Lys Val Lys Glu Lys Val Arg Ser Pro Lys
20 25 30
Glu Pro Glu Thr Pro Thr Glu Leu Gly Gly Asp Glu Met Leu Arg Glu
35 40 45
Leu Gln Glu Thr Asn Ala Ala Leu Gln Asp Val Arg Glu Leu Leu Arg
50 55 60
Gln Gln Val Arg Gln Ile Thr Phe Leu Arg Ala Leu Leu Met Gly Gly
65 70 75 80
Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp
85 90
<210> 106
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Myr-His-标签+TFR5x5平台和C13
<400> 106
Met Gly His His His Ser His His His Gly Gly Gln Ile Ser Lys Gly
1 5 10 15
Phe Gly Lys Leu Tyr Arg Lys Val Lys Glu Lys Val Arg Ser Pro Lys
20 25 30
Glu Pro Glu Thr Pro Thr Glu Leu Gly Gly Asp Glu Met Leu Arg Glu
35 40 45
Leu Gln Glu Thr Asn Ala Ala Leu Gln Asp Val Arg Glu Leu Leu Arg
50 55 60
Gln Gln Val Arg Gln Ile Thr Phe Leu Arg Ala Leu Leu Met Gly Gly
65 70 75 80
Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys
85 90
<210> 107
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mye-His标签
<400> 107
Met Gly His His His Ser His His His
1 5
<210> 108
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TFR123平台变体A
<400> 108
Gly Gly Gln Ile Ser Lys Gly Phe Gly Lys Leu Tyr Arg Lys Val Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Arg Ser Pro Lys Glu Pro Glu Thr Pro Thr Glu Leu Tyr
20 25 30
Thr Lys Glu Arg His Val Leu Val Thr Gly Asp Ala Asn Tyr Val Asp
35 40 45
Pro Arg Phe Tyr Val Ser Ser Ile Thr Ala Lys Gly Gly Val Ala Val
50 55 60
Ser Val Ala Glu Asp Ser Val Leu Tyr Asp Gly Gln Val Glu Pro Ser
65 70 75 80
Pro Glu Ser Pro Lys Pro Pro Leu Glu Asn Gly Gln Val Gly Leu Gln
85 90 95
Glu Lys Glu Asp Gly Gln Pro Ile Asp Gln Gln Pro Ile Asp Lys Glu
100 105 110
Ile Glu Pro Leu Glu His His His His His His
115 120
<210> 109
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TFR123变体B
<400> 109
Gly His His His Ser His His His Gly Gly Gln Ile Ser Lys Gly Phe
1 5 10 15
Gly Lys Leu Tyr Arg Lys Val Lys Glu Lys Val Arg Ser Pro Lys Glu
20 25 30
Pro Glu Thr Pro Thr Glu Leu Tyr Thr Lys Glu Arg His Val Leu Val
35 40 45
Thr Gly Asp Ala Asn Tyr Val Asp Pro Arg Phe Tyr Val Ser Ser Ile
50 55 60
Thr Ala Lys Gly Gly Val Ala Val Ser Val Ala Glu Asp Ser Val Leu
65 70 75 80
Tyr Asp Gly Gln Val Glu Pro Ser Pro Glu Ser Pro Lys Pro Pro Leu
85 90 95
Glu Asn Gly Gln Val Gly Leu Gln Glu Lys Glu Asp Gly Gln Pro Ile
100 105 110
Asp Gln Gln Pro Ile Asp Lys Glu Ile Glu Pro Gly Gly
115 120 125
<210> 110
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TFR123变体C
<400> 110
Gly His His His Ser Lys His His His Gly Gly Gln Ile Ser Lys Gly
1 5 10 15
Phe Gly Lys Leu Tyr Arg Lys Val Lys Glu Lys Val Arg Ser Pro Lys
20 25 30
Glu Pro Glu Thr Pro Thr Glu Leu Tyr Thr Lys Glu Arg His Val Leu
35 40 45
Val Thr Gly Asp Ala Asn Tyr Val Asp Pro Arg Phe Tyr Val Ser Ser
50 55 60
Ile Thr Ala Lys Gly Gly Val Ala Val Ser Val Ala Glu Asp Ser Val
65 70 75 80
Leu Tyr Asp Gly Gln Val Glu Pro Ser Pro Glu Ser Pro Lys Pro Pro
85 90 95
Leu Glu Asn Gly Gln Val Gly Leu Gln Glu Lys Glu Asp Gly Gln Pro
100 105 110
Ile Asp Gln Gln Pro Ile Asp Lys Glu Ile Glu Pro Gly Gly
115 120 125
<210> 111
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TFR123变体D
<400> 111
Gly Gly Gln Ile Ser Lys Gly Phe Gly Lys Leu Tyr Arg Lys Val Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Arg Ser Pro Lys Glu Pro Glu Thr Pro Thr Glu Leu Tyr
20 25 30
Thr Lys Glu Arg His Val Leu Val Thr Gly Asp Ala Asn Tyr Val Asp
35 40 45
Pro Arg Phe Tyr Val Ser Ser Ile Thr Ala Lys Gly Gly Val Ala Val
50 55 60
Ser Val Ala Glu Asp Ser Val Leu Tyr Asp Gly Gln Val Glu Pro Ser
65 70 75 80
Pro Glu Ser Pro Lys Pro Pro Leu Glu Asn Gly Gln Val Gly Leu Gln
85 90 95
Glu Lys Glu Asp Gly Gln Pro Ile Asp Gln Gln Pro Ile Asp Lys Glu
100 105 110
Ile Glu Pro Gly Gly His His His His His His Gly Gly
115 120 125
<210> 112
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TFR123变体F
<400> 112
Gly His His His Ser His His His Gly Gly Gln Ile Ser Lys Gly Phe
1 5 10 15
Gly Lys Leu Tyr Arg Lys Val Lys Glu Lys Val Arg Ser Pro Lys Glu
20 25 30
Pro Glu Thr Pro Thr Glu Leu Tyr Thr Lys Glu Arg His Val Leu Val
35 40 45
Thr Gly Asp Ala Asn Tyr Val Asp Pro Arg Phe Tyr Val Ser Ser Ile
50 55 60
Thr Ala Lys Gly Gly Val Ala Val Ser Val Ala Glu Asp Ser Val Leu
65 70 75 80
Tyr Asp Gly Gln Val Glu Pro Ser Pro Glu Ser Pro Lys Pro Pro Leu
85 90 95
Glu Asn Gly Gln Val Gly Leu Gln Glu Lys Glu Asp Gly Gln Pro Ile
100 105 110
Asp Gln Gln Pro Ile Asp Lys Glu Ile Glu Pro Gly Gly
115 120 125
<210> 113
<211> 380
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TFR123 -Myr-His-标签的DNA序列
<400> 113
ccatgggcca ccaccacagc caccaccacg gagggcagat aagcaaaggc tttgggaaac 60
tatacaggaa ggtcaaggag aaagtgagaa gccccaaaga gcctgagacc cccactgagc 120
tctacaccaa agagcggcac gtgctggtca caggggatgc caattacgtg gaccctagat 180
tctatgtctc ctccatcaca gctaaaggtg gggtggctgt ttctgttgcg gaagactctg 240
tgctttatga cggccaggtg gagccctctc ctgagtcacc caagccccct ttagagaatg 300
ggcaggtggg tctgcaggag aaagaagatg gacaaccaat tgaccagcag cctatagaca 360
aggagattga gccaggaggg 380
<210> 114
<211> 383
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TFR123 Myr-His-标签-额外的DNA序列
<400> 114
ccatgggcca ccaccacagc aaacaccacc acggagggca gataagcaaa ggctttggga 60
aactatacag gaaggtcaag gagaaagtga gaagccccaa agagcctgag acccccactg 120
agctctacac caaagagcgg cacgtgctgg tcacagggga tgccaattac gtggacccta 180
gattctatgt ctcctccatc acagctaaag gtggggtggc tgtttctgtt gcggaagact 240
ctgtgcttta tgacggccag gtggagccct ctcctgagtc acccaagccc cctttagaga 300
atgggcaggt gggtctgcag gagaaagaag atggacaacc aattgaccag cagcctatag 360
acaaggagat tgagccagga ggg 383
<210> 115
<211> 374
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TFR123链间His-标签的DNA序列
<400> 115
ccatgggagg gcagataagc aaaggctttg ggaaactata caggaaggtc aaggagaaag 60
tgagaagccc caaagagcct gagaccccca ctgagctcta caccaaagag cggcacgtgc 120
tggtcacagg ggatgccaat tacgtggacc ctagattcta tgtctcctcc atcacagcta 180
aaggtggggt ggctgtttct gttgcggaag actctgtgct ttatgacggc caggtggagc 240
cctctcctga gtcacccaag ccccctttag agaatgggca ggtgggtctg caggagaaag 300
aagatggaca accaattgac cagcagccta tagacaagga gattgagcca ggagggcacc 360
accaccacca ccac 374
<210> 116
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HHHHHH-TFR123的DNA序列
<400> 116
ccatggtcac caccaccacc accacgaggg cagataagca aaggctttgg gaaactatac 60
aggaaggtca aggagaaagt gagaagcccc aaagagcctg agacccccac tgagctctac 120
accaaagagc ggcacgtgct ggtcacaggg gatgccaatt acgtggaccc tagattctat 180
gtctcctcca tcacagctaa aggtggggtg gctgtttctg ttgcggaaga ctctgtgctt 240
tatgacggcc aggtggagcc ctctcctgag tcacccaagc cccctttaga gaatgggcag 300
gtgggtctgc aggagaaaga agatggacaa ccaattgacc agcagcctat agacaaggag 360
attgagccat aactcgag 378
<210> 117
<211> 376
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TFR123-HHHHHH的DNA序列
<400> 117
ccatggaggg cagataagca aaggctttgg gaaactatac aggaaggtca aggagaaagt 60
gagaagcccc aaagagcctg agacccccac tgagctctac accaaagagc ggcacgtgct 120
ggtcacaggg gatgccaatt acgtggaccc tagattctat gtctcctcca tcacagctaa 180
aggtggggtg gctgtttctg ttgcggaaga ctctgtgctt tatgacggcc aggtggagcc 240
ctctcctgag tcacccaagc cccctttaga gaatgggcag gtgggtctgc aggagaaaga 300
agatggacaa ccaattgacc agcagcctat agacaaggag attgagccac tcgagcacca 360
ccaccaccac cactga 376
<210> 118
<211> 353
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TFR123的RNA序列
<220>
<221> misc_feature
<222> 120
<223> /note="n为1-甲基-3'-假尿苷基"
<400> 118
anggagggca ganaagcaaa ggcnnnggga aacnanacag gaaggncaag gagaaagnga 60
gaagccccaa agagccngag acccccacng agcncnacac caaagagcgg cacgngcngg 120
ncacagggga ngccaannac gnggacccna ganncnangn cnccnccanc acagcnaaag 180
gnggggnggc ngnnncngnn gcggaagacn cngngcnnna ngacggccag gnggagcccn 240
cnccngagnc acccaagccc ccnnnagaga angggcaggn gggncngcag gagaaagaag 300
anggacaacc aanngaccag cagccnanag acaaggagan ngagccagga ggg 353
<210> 119
<211> 409
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UTR和多(A)尾至TFR123 RNA
<220>
<221> misc_feature
<222> 121
<223> /note="n为1-甲基-3'-假尿苷基"
<400> 119
tgatgacncg agcnggnacn gcangcacgc aangcnagcn gccccnnncc cgnccngggn 60
accccgagnc ncccccgacc ncgggnccca ggnangcncc caccnccacc ngccccacnc 120
accaccncng cnagnnccag acaccnccca agcacgcagc aangcagcnc aaaacgcnna 180
gccnagccac acccccacgg gaaacagcag ngannaaccn nnagcaanaa acgaaagnnn 240
aacnaagcna nacnacccca gggnnggnca annncgngcc agccacaccc nggagcnagc 300
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gcanangacn aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 409
<210> 120
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 三聚体OD
<400> 120
Arg Leu Leu Ala Arg Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Leu Glu Glu Leu
1 5 10 15
Glu Arg Arg Leu Glu Glu Leu Glu Arg Ala
20 25
<210> 121
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 三聚体OD 2
<400> 121
Arg Leu Leu Ala Arg Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Leu Glu Glu Leu
1 5 10 15
Glu Arg Arg Leu Glu Glu Leu Glu Ala Arg
20 25
<210> 122
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 五聚体OD
<400> 122
Asp Glu Met Leu Arg Glu Leu Gln Glu Thr Asn Ala Ala Leu Gln Asp
1 5 10 15
Val Arg Glu Leu Leu Arg Gln Gln Val Arg Gln Ile Thr Phe Leu Arg
20 25 30
Ala Leu Leu Met
35
<210> 123
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 来自晶状体丝蛋白的短OD
<400> 123
Leu Tyr Thr Lys Glu Arg His Val Leu Val Thr Gly Asp Ala Asn Tyr
1 5 10 15
Val Asp Pro Arg Phe Tyr Val Ser Ser Ile Thr Ala Lys Gly
20 25 30
<210> 124
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 来自晶状体丝蛋白的OD32
<400> 124
Leu Tyr Thr Lys Glu Arg His Val Leu Val Thr Gly Asp Ala Asn Tyr
1 5 10 15
Val Asp Pro Arg Phe Tyr Val Ser Ser Ile Thr Ala Lys Gly Gly Val
20 25 30
<210> 125
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 短三聚体OD
<400> 125
Leu Leu Ala Arg Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Leu Glu Glu Leu Glu
1 5 10 15
Arg Arg Leu Glu Glu Leu Glu
20
<210> 126
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TFR123的DNA序列
<400> 126
ggagggcaga taagcaaagg ctttgggaaa ctatacagga aggtcaagga gaaagtgaga 60
agccccaaag agcctgagac ccccactgag ctctacacca aagagcggca cgtgctggtc 120
acaggggatg ccaattacgt ggaccctaga ttctatgtct cctccatcac agctaaaggt 180
ggggtggctg tttctgttgc ggaagactct gtgctttatg acggccaggt ggagccctct 240
cctgagtcac ccaagccccc tttagagaat gggcaggtgg gtctgcagga gaaagaagat 300
ggacaaccaa ttgaccagca gcctatagac aaggagattg agcca 345
<210> 127
<211> 108
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 五聚体OD的DNA序列
<400> 127
gatgaaatgt tgcgtgaatt acaggaaacc aacgctgctc tgcaagacgt tcgtgaactg 60
ctgcgtcaac aggttcgtca gatcaccttt ctgcgcgctc tgctgatg 108
<210> 128
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 三聚体OD的DNA序列
<400> 128
cgtctgctag ctcgtctgga agaactggaa agacgtctgg aagaactgga acgtcgtctg 60
gaagaactcg ag 72
<210> 129
<211> 133
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 长三聚体OD的DNA序列
<400> 129
cgtctgctag ctcgtctgga agaactggaa agacgtctgg aagaactgga acgtcgtctg 60
gaagaactcg agcgtgctat caacaccgtc gacctggaac tggctgctct gcgtcgtcgt 120
ctggaagaac tgg 133
<210> 130
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hBFSP1 LBD 额外
<400> 130
Gly Gly Gln Ile Ser Lys Gly Phe Gly Lys Leu Tyr Arg Lys Val Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Arg Ser Pro Lys Glu Pro Glu Thr Pro Thr Glu Leu
20 25 30

Claims (26)

1.一种用于医学的肽，所述肽包括能够结合至脂质的、衍生自晶状体丝蛋白(BFSP1)的脂质结合氨基酸序列(LBD)或者其功能性变体或功能性片段。
2.根据权利要求1所述的所使用的肽，其中，所述LBD包括选自能够结合至脂质的、根据SEQ ID NO:1、3和130的序列的氨基酸序列及其功能性变体和功能性片段，优选地，其中所述功能性变体或功能性片段具有分别与SEQ ID NO:1、3或130至多10个、优选至多8个、更优选至多5个不同的氨基酸。
3.根据权利要求1或2所述的所使用的肽，其中，所述LBD包括能够结合至脂质的、根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列或者其功能性变体或功能性片段，优选地，其中所述功能性变体或功能性片段具有与SEQ ID NO:3至多10个、优选至多8个、优选至多7个、优选至多6个、更优选至多5个、更优选至多4个、更优选至多3个不同的氨基酸。
4.一种用于医学的重组多肽，其中，所述多肽包括根据权利要求1或2中所限定的肽。
5.根据权利要求4所述的所使用的重组多肽，所述重组多肽还包括寡聚化氨基酸序列(OD)。
6.根据权利要求5所述的所使用的重组多肽，其中，所述OD是卷曲螺旋，优选三聚体卷曲螺旋。
7.根据权利要求5所述的所使用的重组多肽，其中，所述OD衍生自所述BFSP1。
8.根据权利要求6所述的所使用的重组多肽，其中，所述OD包括能够寡聚化的、根据SEQID NO:2、SEQ ID NO:123-124的序列中的任何一个及其功能性变体及功能性片段，优选地，其中所述功能性变体或功能性片段具有分别与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:123或SEQ ID NO:124至少85％、优选至少90％和更优选至少95％相同的序列。
9.根据权利要求8所述的所使用的重组多肽，其中，所述OD包括能够寡聚化的、根据SEQID NO:2的序列或者其功能性变体或功能性片段，优选地，其中所述功能性变体或者功能性片段具有与SEQ ID NO:2至少85％、优选至少90％、更优选至少95％相同的序列。
10.根据权利要求4或5所述的所使用的重组多肽，其中，所述OD包括选自能够寡聚化的、根据SEQ ID NO:120-122和125的序列的序列及其功能性变体和功能性片段，优选地，其中所述功能性变体或功能性片段具有分别与SEQ ID NO:120、SEQ ID NO-121、SEQ ID NO:122或SEQ ID NO:125至少85％、优选至少90％和更优选至少95％相同的序列。
11.根据权利要求10所述的所使用的重组多肽，其中，所述OD包括能够寡聚化的、根据SEQ ID NO:120的序列或者其功能性变体或功能性片段，优选地，其中所述功能性变体或功能性片段具有与SEQ ID NO:120至少85％、优选至少90％、更优选至少95％相同的序列。
12.根据权利要求3-11中任一项所述的所使用的重组多肽，所述重组多肽包括免疫原性试剂(IM)，优选免疫原性氨基酸序列。
13.根据权利要求12所述的所使用的重组多肽，其中，所述免疫原性氨基酸序列的长度为2-50个氨基酸，优选3-40个氨基酸、更优选5-25个氨基酸。
14.根据权利要求11或12所述的所使用的重组多肽，其中，所述IM衍生自SARS-CoV-2，优选衍生自SARS-CoV-2的突起蛋白。
15.根据权利要求14所述的所使用的重组多肽，其中，所述IM的氨基酸序列选自能够在受试者中引起免疫应答的SEQ ID NO:5-7和10-29以及其功能性变体或功能性片段，优选地，其中所述功能性变体或功能性片段具有分别与SEQ ID NO:5、6、7、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29至多5个、优选至多4个、更优选至多3个、更优选至个不同的氨基酸的序列。
16.一种用于医学的经分离的核酸分子，所述经分离的核酸分子包括能够结合至脂质的、编码衍生自晶状体丝蛋白(BFSP 1)的脂质结合氨基酸序列(LBD)或者其功能性变体或功能性片段的核酸序列。
17.根据权利要求16所述的经分离的核酸分子，其中，所述核酸是DNA或RNA，优选包括一个或多个经修饰的核苷酸的DNA、优选RNA、优选mRNA、最优选包括一个或多个经修饰的核苷酸的RNA或mRNA。
18.根据权利要求16或17所述的经分离的核酸分子，其中，所述LBD是根据权利要求1-3中任一项所限定的LBD。
19.根据权利要求16-18中任一项所述的经分离的核酸分子，所述经分离的核酸分子还包括编码根据权利要求5-11中任一项所限定的寡聚化氨基酸序列(OD)的核酸序列。
20.根据权利要求16-19中任一项所述的经分离的核酸分子，所述经分离的核酸分子还包括编码根据权利要求12-15中任一项所限定的免疫原性部分(IM)的核酸序列。
21.一种药物组合物，所述药物组合物包括根据前述权利要求中任一项所限定的肽、多肽或核酸分子，还包括至少一种药学上可接受的载体。
22.根据权利要求1-3中任一项所述的所使用的肽、根据权利要求4-15中任一项所述的所使用的重组多肽、根据权利权利要求16-20中任一项所述的经分离的核酸分子、或根据权利要求21所述的药物组合物用于在受试者中引起免疫应答。
23.根据权利要求1-3中任一项所述的所使用的肽、根据权利要求4-15中任一项所述的所使用的重组多肽、根据权利权利要求16-20中任一项所述的经分离的核酸分子、或根据权利要求21所述的药物组合物用于预防或治疗受试者中由病原体引发的感染。
24.一种药物递送构建体，所述药物递送构建体包括根据权利要求1-13中任一项所限定的肽或多肽。
25.根据权利要求24所述的药物递送构建体，所述药物递送构建体还包括靶标部分。
26.根据权利要求24或25所述的药物递送构建体，其中，所述肽或多肽附接至脂质体。
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