CN117642429A - 用于治疗cldn6阳性癌症的编码cldn6和cds结合元件的试剂 - Google Patents

用于治疗cldn6阳性癌症的编码cldn6和cds结合元件的试剂 Download PDF

Info

Publication number
CN117642429A
CN117642429A CN202280046768.5A CN202280046768A CN117642429A CN 117642429 A CN117642429 A CN 117642429A CN 202280046768 A CN202280046768 A CN 202280046768A CN 117642429 A CN117642429 A CN 117642429A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
rna
amino acid
acid sequence
nucleotide sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202280046768.5A
Other languages
English (en)
Inventor
尤格·萨因
克里斯蒂安娜·斯塔德勒
克劳迪娅·林德曼
乌苏拉·埃林豪斯
哈亚特·巴赫马哈穆德
莱拉·菲舍尔
阿努哈尔·查图尔韦迪
加博尔·博罗斯
乔纳斯·莱因霍尔茨
谢尔盖·别索诺夫
卡塔林·卡里科
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biotechnology Europe Inc
Original Assignee
Biotechnology Europe Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biotechnology Europe Inc filed Critical Biotechnology Europe Inc
Publication of CN117642429A publication Critical patent/CN117642429A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/335—Modified T or U
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/50—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating RNA stability, not being an intron, e.g. poly A signal

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明总体上涉及至少对于结合CD3和CLDN6为双特异性的结合剂，即它们能够至少结合CD3和CLDN6。具体地，本发明涉及可用于对象中癌症的治疗或预防的编码这些结合剂的RNA。

Description

用于治疗CLDN6阳性癌症的编码CLDN6和CDS结合元件的试剂
癌症是全球第二大死亡原因，并且在2020年估计是造成1000万人死亡的原因。一般来说，一旦实体瘤转移，除了诸如生殖细胞和一些类癌肿瘤等少数例外，5年生存率很少超过25％。
诸如化疗、放疗、手术和靶向治疗等常规疗法的改进以及免疫疗法的最新进展改善了晚期实体瘤患者的结果。在过去数年中，美国食品药品监督管理局(FDA)和欧洲药品管理局(EMA)已经批准了数种用于治疗多种癌症类型患者，主要是实体瘤的免疫检查点抑制剂。这些批准极大地改变了癌症治疗的前景。
转移或局部晚期癌症的不良预后突出了对另外的治疗方法的需求。一种这样的方法是靶向治疗，这是一个不断发展的领域，其有多种很有前途的形式。
CLDN6属于参与上皮和内皮细胞片中顶端紧密连接复合物形成的四跨膜蛋白膜蛋白的PMP-22/EMP/MP20/Claudin超家族(Pfam数据库ID：PF00822)，在维持细胞极性中具有重要作用(Krause G.et al.,Biochim Biophys Acta.2008；1778(3):631-645)。重要的是，claudin蛋白的表达仅限于细胞紧密连接，并且仅在标准生理条件下可用于离子转运(Krause G.et al.,Biochim Biophys Acta.2008；1778(3):631-645)。除此之外，对CLDN6的体内功能知之甚少。
CLDN6有四个跨膜螺旋，其N端和C端延伸到细胞质中。CLDN6的短N端序列之后是大的细胞外环(EL1)、短的细胞内环、第二个细胞外环(EL2)和C端细胞质尾部(ColegioO.R.et al.,Am J Physiol Cell Physiol.2002；283(1):C142-C147)。
到目前为止，还没有鉴定出CLDN6的同种型(Lal-Nag M.et al.,GenomeBiol.2009；10(8):235)。claudin家族成员CLDN3、CLDN4和CLDN9与CLDN6共有序列同源性。CLDN3和CLDN4通常在肺、肝、乳腺、胰腺、肾和肠的正常上皮细胞中表达(Kwon M.et al.,Int J Mol Sci.2013；14(9):18148-18180)。CLDN9的表达在绝大多数正常组织中不存在；然而，已经报道了CLDN9在小鼠内耳的耳蜗和前庭中的表达(Kitajiri S.I.et al.,HearRes.2004；187(1-2):25-34；Nakano Y.et al.,PLoS Genet.2009；5(8):e1000610)，正如人类中CLDN9基因截短和听觉损伤之间的联系一样(Sineni C.et al.,Human genetics2019；138(10):1071-1075)。
癌胚蛋白CLDN6几乎仅在胚胎干细胞中表达，然后在分化为神经或心脏谱系期间迅速下调，并且在胎盘以外的正常成年组织中不表达(Assou S.et al.,Stem Cells.2007；25(4):961-973；Ben-David U.et al.,Nat Commun.2013；4:1992；Reinhard K.et al.,Science.2020；367(6476):446-453)。CLDN6在多种人类癌症类型中表达，包括睾丸癌、卵巢癌、子宫内膜癌和肺癌。一项代表性的研究表明，在所有组织学亚型中，约93％的睾丸癌染色对CLDN6呈高度阳性，如通过染色强度≥2+定义的。此外，56％的卵巢癌对CLDN6染色呈阳性，其中在超过50％的肿瘤细胞中，20％-25％表现出高(≥2+)细胞膜染色。与原发性卵巢癌相比，在转移病灶中，CLDN6阳性样品的频率显著增加(72％；数据未显示)，CLDN6表达与疾病进展相关。23％的子宫内膜癌和11％的肺癌对CLDN6染色呈阳性，其中分别10％-15％和2％-5％表现出染色强度≥2+。
本发明的目的是提供用于治疗CLDN6阳性癌症疾病的新的试剂和方法。
在一些实施方案中，本发明根本问题的解决方案基于这样的概念，即给予由患者细胞表达的RNA以表达形成结合剂的多肽链，所述结合剂包含对癌细胞表达的CLDN6具有特异性的两个结合域和对T细胞表达的CD3具有特异性的结合域，从而使得可能将T细胞的细胞毒性作用靶向癌细胞。
发明内容
本发明总体上涉及对结合CD3和CLDN6至少具有双特异性的结合剂，即它们能够至少结合CD3和CLDN6。具体地，本发明涉及编码这些结合剂的RNA，其可用于治疗或预防对象中的癌症。特别地，可给予本文公开的编码结合剂的RNA，以提供(在由适当的靶细胞表达RNA后)用于靶向CD3和CLDN6的结合剂。
因此，本文所述的药物组合物可包含单链RNA作为活性成分，所述单链RNA可在进入受体的细胞后被翻译成相应的编码的多肽。除了编码结合剂的序列外，RNA还可以含有一种或多种结构元件，这些结构元件针对RNA在稳定性和翻译效率方面(5'帽、5'-UTR、3'-UTR、多聚(A)尾)的最大功效进行了优化。在一些实施方案中，RNA包含所有这些元件。
本文所述的RNA可以与蛋白质和/或脂质，优选脂质复合，以产生用于给药的RNA颗粒。不同的RNAs可以与蛋白质和/或脂质复合在一起或单独复合以产生用于给药的RNA颗粒。
在一方面，本发明提供了组合物或药物制剂，其包含：
(i)编码第一多肽链的第一RNA，所述第一多肽链包含来源于对CD3具有特异性的免疫球蛋白的重链的可变区(VH)(VH(CD3))、来源于对CLDN6具有特异性的免疫球蛋白的重链的可变区(VH)(VH(CLDN6))，以及来源于对CLDN6具有特异性的免疫球蛋白的轻链的可变区(VL)(VL(CLDN6))；以及
(ii)编码第二多肽链的第二RNA，所述第二多肽链包含来源于对CD3具有特异性的免疫球蛋白的轻链的可变区(VL)(VL(CD3))、来源于对CLDN6具有特异性的免疫球蛋白的重链的可变区(VH)(VH(CLDN6))，以及来源于对CLDN6具有特异性的免疫球蛋白的轻链的可变区(VL)(VL(CLDN6))。
在一些实施方案中，第一多肽链与第二多肽链相互作用以形成对CD3具有特异性的结合域和对CLDN6具有特异性的两个结合域。
在一些实施方案中：
第一多肽链的VH(CD3)与第二多肽链的VL(CD3)相互作用以形成对CD3具有特异性的结合域，
第一多肽链的VH(CLDN6)和VL(CLDN6)相互作用以形成对CLDN6具有特异性的结合域，并且
第二多肽链的VH(CLDN6)和VL(CLDN6)相互作用以形成对CLDN6具有特异性的结合域。
在一方面，本发明提供了组合物或药物制剂，其包含：
(i)编码第一多肽链的第一RNA，所述第一多肽链包含可变区VH(CD3)、可变区VH(CLDN6)和可变区VL(CLDN6)；以及
(ii)编码第二多肽链的第二RNA，所述第二多肽链包含可变区VL(CD3)、可变区VH(CLDN6)和可变区VL(CLDN6)，
其中所述第一多肽链的VH(CD3)和所述第二多肽链的VL(CD3)相互作用以形成对CD3具有特异性的结合域，
其中所述第一多肽链的VH(CLDN6)和VL(CLDN6)相互作用以形成对CLDN6具有特异性的结合域，并且
其中所述第二多肽链的VH(CLDN6)和VL(CLDN6)相互作用以形成对CLDN6具有特异性的结合域。
在一些实施方案中，第一和第二多肽链包含来源于免疫球蛋白的重链的恒定区1(CH1)或其功能变体和来源于免疫球蛋白的轻链的恒定区(CL)或其功能变体。
在一些实施方案中，免疫球蛋白是IgG1。
在一些实施方案中，IgG1是人IgG1。
在一些实施方案中，第一多肽链上的VH、VL和CH1从N端到C端按以下顺序布置：
VH(CD3)-CH1-VH(CLDN6)-VL(CLDN6)，或者
VH(CD3)-CH1-VL(CLDN6)-VH(CLDN6)。
在一些实施方案中，CH1通过肽接头与VH(CLDN6)或VL(CLDN6)连接。在一实施方案中，肽接头包含氨基酸序列SGPGGGRS(G4S)2或其功能变体。
在一些实施方案中，第二多肽链上的VH、VL和CL从N端到C端按以下顺序布置：
VL(CD3)-CL-VH(CLDN6)-VL(CLDN6)，或者
VL(CD3)-CL-VL(CLDN6)-VH(CLDN6)。
在一些实施方案中，CL通过肽接头与VH(CLDN6)或VL(CLDN6)连接。在一些实施方案中，肽接头包含氨基酸序列DVPGGS或其功能变体。
在一些实施方案中，VH(CLDN6)和VL(CLDN6)通过肽接头彼此连接。在一些实施方案中，肽接头包含氨基酸序列(G4S)x或其功能变体，其中x是2、3、4、5或6。在一实施方案中，肽接头包含氨基酸序列(G4S)4或其功能变体。
在一些实施方案中，第一多肽链上的CH1与第二多肽链上的CL相互作用。
在一些实施方案中，VH(CD3)包含SEQ ID NO:4的氨基酸27-145的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，VH(CD3)包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1包含氨基酸序列GYTFTRYT或其功能变体，所述CDR2包含氨基酸序列INPSRGYT或其功能变体，所述CDR3包含氨基酸序列ARYYDDHYSLDY或其功能变体。
在一些实施方案中，VH(CD3)包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1包含氨基酸序列GYTFTRYT或其功能变体，所述CDR2包含氨基酸序列INPSRGYT或其功能变体，所述CDR3包含氨基酸序列ARYYDDHYCLDY或其功能变体。
在一些实施方案中，VH(CD3)包含SEQ ID NO:4的氨基酸27-145的氨基酸序列或其功能变体。
在一些实施方案中，VL(CD3)包含SEQ ID NO:6的氨基酸27-132的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，VL(CD3)包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1包含氨基酸序列SSVSY或其功能变体，所述CDR2包含氨基酸序列DTS或其功能变体，所述CDR3包含氨基酸序列QQWSSNPLT或其功能变体。
在一些实施方案中，VL(CD3)包含SEQ ID NO:6的氨基酸27-132的氨基酸序列或其功能变体。
在一些实施方案中，VH(CLDN6)包含SEQ ID NO:4的氨基酸267-383的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，VH(CLDN6)包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1包含氨基酸序列GYSFTGYT或其功能变体，所述CDR2包含氨基酸序列INPYNGGT或其功能变体，所述CDR3包含氨基酸序列ARDYGFVLDY或其功能变体。
在一些实施方案中，VH(CLDN6)包含SEQ ID NO:4的氨基酸267-383的氨基酸序列或其功能变体。
在一些实施方案中，VL(CLDN6)包含SEQ ID NO:4的氨基酸404-510的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，VL(CLDN6)包含SEQ ID NO:4氨基酸404-510的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3，以及在相对于CDR1的位置+15(对应于SEQ ID NO:4的位置449)中的丝氨酸残基。
在一些实施方案中，VL(CLDN6)包含SEQ ID NO:4的氨基酸404-510的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3，以及在相对于CDR2的位置-3(对应于SEQ ID NO:4的位置449)中的丝氨酸残基。
在一些实施方案中，VL(CLDN6)包含SEQ ID NO:4的氨基酸404-510的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3、与SEQ ID NO:4的氨基酸404-510的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的序列，以及在对应于SEQ ID NO:4的位置449的位置中的丝氨酸残基。
在一些实施方案中，VL(CLDN6)包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1包含氨基酸序列SSVSY或其功能变体，所述CDR2包含氨基酸序列STS或其功能变体，并且所述CDR3包含氨基酸序列QQRSNYPPWT或其功能变体。
在一些实施方案中，VL(CLDN6)包含SEQ ID NO:4的氨基酸404-510的氨基酸序列或其功能变体。
在一些实施方案中，VH(CD3)包含SEQ ID NO:4的氨基酸27-145的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3，VL(CD3)包含SEQ ID NO:6的氨基酸27-132的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3，VH(CLDN6)包含SEQ ID NO:4的氨基酸267-383的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3，并且VL(CLDN6)包含SEQ ID NO:4的氨基酸404-510的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3，以及优选地在相对于CDR1的位置+15(对应于SEQ ID NO:4的位置449)中的丝氨酸残基和/或在相对于CDR2的位置-3(对应于SEQ ID NO:4的位置449)中的丝氨酸残基。
在一些实施方案中：
VH(CD3)包含SEQ ID NO:4的氨基酸27-145的氨基酸序列或其功能变体，
VL(CD3)包含SEQ ID NO:6的氨基酸27-132的氨基酸序列或其功能变体，
VH(CLDN6)包含SEQ ID NO:4的氨基酸267-383的氨基酸序列或其功能变体，和/或
VL(CLDN6)包含SEQ ID NO:4的氨基酸404-510的氨基酸序列或其功能变体。
在一些实施方案中，第一多肽链包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其功能变体。
在一些实施方案中，第二多肽链包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其功能变体。
在一些实施方案中，第一多肽链包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其功能变体，并且第二多肽链包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其功能变体。
在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽中的至少一种由相比野生型编码序列进行了密码子优化和/或G/C含量增加的编码序列编码，其中所述密码子优化和/或所述G/C含量增加优选地不改变所编码的氨基酸序列的序列。
在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽中的每种都由相比野生型编码序列进行了密码子优化和/或G/C含量增加的编码序列编码，其中所述密码子优化和/或所述G/C含量的增加优选地不改变所编码的氨基酸序列的序列。
在一些实施方案中，RNA包含取代尿苷的修饰的核苷。在这样的情况下，优选地存在取代RNA中的每个或基本上每个尿苷的修饰的核苷。
在一些实施方案中，修饰的核苷选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。
在一些实施方案中，至少一种RNA包含5’帽m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG。
在一些实施方案中，每种RNA包含5’帽m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG。
在一些实施方案中，至少一种RNA包含5’UTR，所述5’UTR包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列或与SEQ ID NO:8的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，每种RNA包含5’UTR，其中5’UTR包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列或与SEQ ID NO:8的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，至少一种RNA包含3’UTR，所述3’UTR包含SEQ ID NO:9的核苷酸序列或与SEQ ID NO:9的核苷酸序列的具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，每种RNA包含3’UTR，所述3’UTR包含SEQ ID NO:9的核苷酸序列或与SEQ ID NO:9的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，至少一种RNA包含多聚A序列。
在一些实施方案中，每种RNA包含多聚A序列。
在一些实施方案中，多聚A序列包含至少100个核苷酸。
在一些实施方案中，多聚A序列包含SEQ ID NO:10的核苷酸序列或由其组成。
在一些实施方案中：
(i)第一RNA和第二RNA的(w/w)比例为约1.75:1至约1.25:1，或者约1.5:1至约1.25:1，或者优选地约1.5:1；和/或
(ii)第一RNA和第二RNA包含取代每个尿苷的修饰的核苷；和/或
(iii)第一RNA和第二RNA包含取代每个尿苷的修饰的核苷，其中所述修饰的核苷独立地选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)；和/或
(iv)第一RNA和第二RNA包含5’帽m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG；和/或
(v)第一RNA和第二RNA包含5’UTR，所述RNA包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列或与SEQ ID NO:8的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或
(vi)第一RNA和第二RNA包含3’UTR，所述3’UTR包含SEQ ID NO:9的核苷酸序列或与SEQ ID NO:9的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或
(vii)第一RNA和第二RNA包含多聚A尾，所述多聚A尾包含SEQ ID NO:10的核苷酸序列。
在一些实施方案中：
(i)第一RNA和第二RNA的(w/w)比例为约1.75:1至约1.25:1，或者约1.5:1至约1.25:1，或者优选地约1.5:1；
(ii)第一RNA和第二RNA包含取代每个尿苷的修饰的核苷，其中所述修饰的核苷是N1-甲基-假尿苷(m1ψ)；
(iii)第一RNA和第二RNA包含5’帽m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG；
(iv)第一RNA和第二RNA包含5’UTR，所述5’UTR包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列；
(v)第一RNA和第二RNA包含3’UTR，所述3’UTR包含SEQ ID NO:9的核苷酸序列；并且
(vi)第一RNA和第二RNA包含多聚A尾，所述多聚A尾包含SEQ ID NO:10的核苷酸序列。
在一些实施方案中：
(i)第一多肽链包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列；和/或
(ii)第一RNA包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与SEQ ID NO:5的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中：
(i)第二多肽链包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列；和/或
(ii)第二RNA包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列或与SEQ ID NO:7的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
在一方面，本发明提供了组合物或药物制剂，其包含：
(i)编码第一多肽链的第一RNA，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4的氨基酸序列的具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列；以及
(ii)编码第二多肽链的第二RNA，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或与SEQ IDNO:6的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。
在所有方面的一些实施方案中，第一RNA包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与SEQID NO:5的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
在所有方面的一些实施方案中，第二RNA包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列或与SEQID NO:7的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
在一方面，本发明提供了组合物或药物制剂，其包含：第一RNA和/或第二RNA，所述第一RNA包含SEQ ID NO:35的核苷酸序列或与SEQ ID NO:35的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，所述第二RNA包含SEQ IDNO:36的核苷酸序列或与SEQ ID NO:36的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
在一方面，本发明提供了组合物或药物制剂，其包含：第一RNA和第二RNA，所述第一RNA包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列，所述第二RNA包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列，其中所述第一RNA和所述第二RNA以约1.5:1(w/w)比例的第一RNA与第二RNA存在。
在所有方面的一些实施方案中，RNA是mRNA。
在所有方面的一些实施方案中，RNA被配制为液体、被配制为固体或以上的组合。
在所有方面的一些实施方案中，RNA被配制或待配制用于注射。
在所有方面的一些实施方案中，RNA被配制或待配制用于静脉内给药。
在所有方面的一些实施方案中，RNA被配制或待配制为颗粒。
在一些实施方案中，颗粒是脂质纳米粒子(LNP)。
在一些实施方案中，LNP颗粒包含((3-羟丙基)氮亚烷基)双(壬烷-9,1-二基)双(2-辛酸丁酯)、2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱和胆固醇。
在所有方面的一些实施方案中，组合物或药物制剂是药物组合物。
在一些实施方案中，药物组合物还包含一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。
在所有方面的一些实施方案中，组合物或药物制剂是试剂盒。
在一些实施方案中，RNA和任选地形成颗粒的组分在单独的小瓶中。
在一些实施方案中，组合物或药物制剂还包括用于治疗或预防癌症的组合物或药物制剂的使用说明书。
在一方面，本发明提供了本文所述的用于药物用途的组合物或药物制剂。
在一些实施方案中，药物用途包括疾病或病症的治疗性或预防性治疗。
在一些实施方案中，疾病或病症的治疗性或预防性治疗包括治疗或预防癌症。
在一些实施方案中，疾病或病症的治疗性或预防性治疗还包括给予进一步的治疗。
在一些实施方案中，进一步的治疗包括选自以下中的一种或多种：(i)手术切除、切割或减积肿瘤，(ii)放射疗法，以及(iii)化学疗法。
在一些实施方案中，进一步的治疗包括给予进一步的治疗剂。
在一些实施方案中，进一步的治疗剂包括抗癌治疗剂。
在一些实施方案中，本文所述的组合物或药物制剂用于向人类给药。
在一方面，本发明提供了治疗对象中的癌症的方法，包括向所述对象给予：
(i)编码第一多肽链的第一RNA，所述第一多肽链包含来源于对CD3具有特异性的免疫球蛋白的重链的可变区(VH)(VH(CD3))、来源于对CLDN6具有特异性的免疫球蛋白的重链的可变区(VH)(VH(CLDN6))，以及来源于对CLDN6具有特异性的免疫球蛋白的轻链的可变区(VL)(VL(CLDN6))；以及
(ii)编码第二多肽链的第二RNA，所述第二多肽链包含来源于对CD3具有特异性的免疫球蛋白的轻链的可变区(VL)(VL(CD3))、来源于对CLDN6具有特异性的免疫球蛋白的重链的可变区(VH)(VH(CLDN6))，以及来源于对CLDN6具有特异性的免疫球蛋白的轻链的可变区(VL)(VL(CLDN6))。
在一些实施方案中，第一多肽链与第二多肽链相互作用以形成对CD3具有特异性的结合域和对CLDN6具有特异性的两个结合域。
在一些实施方案中：
第一多肽链的VH(CD3)和第二多肽链的VL(CD3)相互作用以形成对CD3具有特异性的结合域，
第一多肽链的VH(CLDN6)和VL(CLDN6)相互作用以形成对CLDN6具有特异性的结合域，并且
第二多肽链的VH(CLDN6)和VL(CLDN6)相互作用以形成对CLDN6具有特异性的结合域。
在一方面，本发明提供了治疗对象中的癌症的方法，包括向所述对象给予：
(i)编码第一多肽链的第一RNA，所述第一多肽链包含可变区VH(CD3)、可变区VH(CLDN6)和可变区VL(CLDN6)；以及
(ii)编码第二多肽链的第二RNA，所述第二多肽链包含可变区VL(CD3)、可变区VH(CLDN6)和可变区VL(CLDN6)，
其中所述第一多肽链的VH(CD3)与所述第二多肽链的VL(CD3)相互作用以形成对CD3具有特异性的结合域，
其中所述第一多肽链的VH(CLDN6)和VL(CLDN6)相互作用以形成对CLDN6具有特异性的结合域，并且
其中所述第二多肽链的VH(CLDN6)和VL(CLDN6)相互作用以形成对CLDN6具有特异性的结合域。
在一些实施方案中，第一和第二多肽链包含来源于免疫球蛋白的重链的恒定区1(CH1)或其功能变体和来源于免疫球蛋白的轻链的恒定区(CL)或其功能变体。
在一些实施方案中，免疫球蛋白是IgG1。
在一些实施方案中，IgG1是人IgG1。
在一些实施方案中，第一多肽链上的VH、VL和CH1从N端到C端按以下顺序布置：
VH(CD3)-CH1-VH(CLDN6)-VL(CLDN6)，或者
VH(CD3)-CH1-VL(CLDN6)-VH(CLDN6)。
在一些实施方案中，CH1通过肽接头与VH(CLDN6)或VL(CLDN6)连接。在一些实施方案中，肽接头包含氨基酸序列SGPGGGRS(G4S)2或其功能变体。
在一些实施方案中，第二多肽链上的VH、VL和CL从N端到C端按以下顺序布置：
VL(CD3)-CL-VH(CLDN6)-VL(CLDN6)，或者
VL(CD3)-CL-VL(CLDN6)-VH(CLDN6)。
在一些实施方案中，CL通过肽接头与VH(CLDN6)或VL(CLDN6)连接。在一些实施方案中，肽接头包含氨基酸序列DVPGGS或其功能变体。
在一些实施方案中，VH(CLDN6)和VL(CLDN6)通过肽接头彼此连接。在一些实施方案中，肽接头包含氨基酸序列(G4S)x或其功能变体，其中x是2、3、4、5或6。在一些实施方案中，肽接头包含氨基酸序列(G4S)4或其功能变体。
在一些实施方案中，第一多肽链上的CH1与第二多肽链上的CL相互作用。
在一些实施方案中，VH(CD3)包含SEQ ID NO:4的氨基酸27-145的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，VH(CD3)包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1包含氨基酸序列GYTFTRYT或其功能变体，所述CDR2包含氨基酸序列INPSRGYT或其功能变体，所述CDR3包含氨基酸序列ARYYDDHYSLDY或其功能变体。
在一些实施方案中，VH(CD3)包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1包含氨基酸序列GYTFTRYT或其功能变体，所述CDR2包含氨基酸序列INPSRGYT或其功能变体，所述CDR3包含氨基酸序列ARYYDDHYCLDY或其功能变体。
在一些实施方案中，VH(CD3)包含SEQ ID NO:4的氨基酸27-145的氨基酸序列或其功能变体。
在一些实施方案中，VL(CD3)包含SEQ ID NO:6的氨基酸27-132的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，VL(CD3)包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1包含氨基酸序列SSVSY或其功能变体，所述CDR2包含氨基酸序列DTS或其功能变体，所述CDR3包含氨基酸序列QQWSSNPLT或其功能变体。
在一些实施方案中，VL(CD3)包含SEQ ID NO:6的氨基酸27-132的氨基酸序列或其功能变体。
在一些实施方案中，VH(CLDN6)包含SEQ ID NO:4的氨基酸267-383的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，VH(CLDN6)包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1包含氨基酸序列GYSFTGYT或其功能变体，所述CDR2包含氨基酸序列INPYNGGT或其功能变体，所述CDR3包含氨基酸序列ARDYGFVLDY或其功能变体。
在一些实施方案中，VH(CLDN6)包含SEQ ID NO:4的氨基酸267-383的氨基酸序列或其功能变体。
在一些实施方案中，VL(CLDN6)包含SEQ ID NO:4的氨基酸404-510的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，VL(CLDN6)包含SEQ ID NO:4的氨基酸404-510的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3，以及在相对于CDR1的位置+15(对应于SEQ ID NO:4的位置449)中的丝氨酸残基。
在一些实施方案中，VL(CLDN6)包含SEQ ID NO:4的氨基酸404-510的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3，以及在相对于CDR2的位置-3(对应于SEQ ID NO:4的位置449)中的丝氨酸残基。
在一些实施方案中，VL(CLDN6)包含SEQ ID NO:4的氨基酸404-510的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3、与SEQ ID NO:4的氨基酸404-510的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的序列，以及在对应于SEQ ID NO:4的位置449的位置中的丝氨酸残基。
在一些实施方案中，VL(CLDN6)包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1包含氨基酸序列SSVSY或其功能变体，所述CDR2包含氨基酸序列STS或其功能变体，所述CDR3包含氨基酸序列QQRSNYPPWT或其功能变体。
在一些实施方案中，VL(CLDN6)包含SEQ ID NO:4的氨基酸404-510的氨基酸序列或其功能变体。
在一些实施方案中，VH(CD3)包含SEQ ID NO:4的氨基酸27-145的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3，VL(CD3)包含SEQ ID NO:6的氨基酸27-132的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3，VH(CLDN6)包含SEQ ID NO:4的氨基酸267-383的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3，并且所述VL(CLDN6)包含SEQ ID NO:4的氨基酸404-510的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3，以及优选地在相对于CDR1的位置+15(对应于SEQ ID NO:4的位置449)中的丝氨酸残基和/或在相对于CDR2的位置-3(对应于SEQ ID NO:4的位置449)中的丝氨酸残基。
在一些实施方案中：
VH(CD3)包含SEQ ID NO:4的氨基酸27-145的氨基酸序列或其功能变体，
VL(CD3)包含SEQ ID NO:6的氨基酸27-132的氨基酸序列或其功能变体，
VH(CLDN6)包含SEQ ID NO:4的氨基酸267-383的氨基酸序列或其功能变体，和/或
VL(CLDN6)包含SEQ ID NO:4的氨基酸404-510的氨基酸序列或其功能变体。
在一些实施方案中，第一多肽链包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其功能变体。
在一些实施方案中，第二多肽链包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其功能变体。
在一些实施方案中，第一多肽链包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其功能变体，并且第二多肽链包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其功能变体。
在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽中的至少一种由相比野生型编码序列进行了密码子优化和/或G/C含量增加的编码序列编码，其中所述密码子优化和/或所述G/C含量增加优选地不改变所编码的氨基酸序列的序列。
在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽中的每种都由相比野生型编码序列进行了密码子优化和/或G/C含量增加的编码序列编码，其中所述密码子优化和/或所述G/C含量增加优选地不改变所编码的氨基酸序列的序列。
在一些实施方案中，RNA包含取代尿苷的修饰的核苷。在这样的情况下，优选地存在取代RNA中的每个或基本上每个尿苷的修饰的核苷。
在一些实施方案中，修饰的核苷选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。
在一些实施方案中，至少一种RNA包含5’帽m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG。
在一些实施方案中，每种RNA都包含5’帽m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG。
在一些实施方案中，至少一种RNA包含5’UTR，所述5’UTR包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列或与SEQ ID NO:8的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，每种RNA都包含5’UTR，所述5’UTR包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列或与SEQ ID NO:8的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，至少一种RNA包含3’UTR，所述3’UTR包含SEQ ID NO:9的核苷酸序列或与SEQ ID NO:9的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，每种RNA都包含3’UTR，所述3’UTR包含SEQ ID NO:9的核苷酸序列或与SEQ ID NO:9的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，至少一种RNA包含多聚A序列。
在一些实施方案中，每种RNA都包含多聚A序列。
在一些实施方案中，多聚A序列包含至少100个核苷酸。
在一些实施方案中，多聚A序列包含SEQ ID NO:10的核苷酸序列或由其组成。
在一些实施方案中：
(i)第一RNA和第二RNA的(w/w)比例为约1.75:1至约1.25:1，或者约1.5:1至约1.25:1，或者优选地约1.5:1；和/或
(ii)第一RNA和第二RNA包含取代每个尿苷的修饰的核苷；和/或
(iii)第一RNA和第二RNA包含取代每个尿苷的修饰的核苷，其中所述修饰的核苷独立地选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)；和/或
(iv)第一RNA和第二RNA包含5’帽m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG；和/或
(v)第一RNA和第二RNA包含5’UTR，所述5’UTR包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列或与SEQ ID NO:8的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或
(vi)第一RNA和第二RNA包含3’UTR，所述3’UTR包含SEQ ID NO:9的核苷酸序列或与SEQ ID NO:9的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或
(vii)第一RNA和第二RNA包含多聚A尾，所述多聚A尾包含SEQ ID NO:10的核苷酸序列。
在一些实施方案中：
(i)第一RNA和第二RNA的(w/w)比例为约1.75:1至约1.25:1，或者约1.5:1至约1.25:1，或者优选地约1.5:1；
(ii)第一RNA和第二RNA包含取代每个尿苷的修饰的核苷，其中所述修饰的核苷是N1-甲基-假尿苷(m1ψ)；
(iii)第一RNA和第二RNA包含5’帽m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG；
(iv)第一RNA和第二RNA包含5’UTR，所述5’UTR包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列；
(v)第一RNA和第二RNA包含3’UTR，所述3’UTR包含SEQ ID NO:9的核苷酸序列；并且
(vi)第一RNA和第二RNA包含多聚A尾，所述多聚A尾包含SEQ ID NO:10的核苷酸序列。
在一些实施方案中：
(i)第一多肽链包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列；和/或
(ii)第一RNA包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与SEQ ID NO:5的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中：
(i)第二多肽链包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列；和/或
(ii)第二RNA包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列或与SEQ ID NO:7的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
在一方面，本发明提供了治疗对象中的癌症的方法，包括向所述对象给予：
(i)编码第一多肽链的第一RNA，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列；以及
(ii)编码第二多肽链的第二RNA，所述第二多肽链包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。
在所有方面的一些实施方案中，第一RNA包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与SEQID NO:5的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
在所有方面的一些实施方案中，第二RNA包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列或与SEQID NO:7的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
在一方面，本发明提供了治疗对象中的癌症的方法，包括向所述对象给予：第一RNA，其包含SEQ ID NO:35的核苷酸序列或与SEQ ID NO:35的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，以及/或者第二RNA，所述第二RNA包含SEQ ID NO:36的核苷酸序列或与SEQ ID NO:36的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
在一方面，本发明提供了治疗对象中的癌症的方法，包括向所述对象给予：包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列的第一RNA和包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列的第二RNA，其中所述第一RNA和所述第二RNA以约1.5:1(w/w)比例的第一RNA与第二RNA给药。
在所有方面的一些实施方案中，RNA是mRNA。
在所有方面的一些实施方案中，RNA被配制为液体、被配制为固体，或者以上的组合。
在所有方面的一些实施方案中，RNA通过注射给药。
在所有方面的一些实施方案中，RNA每周给药一次。
在所有方面的一些实施方案中，RNA通过静脉内给药进行给药。
在所有方面的一些实施方案中，RNA被配制为颗粒。
在一些实施方案中，颗粒是脂质纳米粒子(LNP)。
在一些实施方案中，LNP颗粒包含((3-羟丙基)氮亚烷基)双(壬烷-9,1-二基)双(2-辛酸丁酯)、2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱和胆固醇。
在所有方面的一些实施方案中，RNA在药物组合物中配制。
在一些实施方案中，药物组合物还包含一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。
在所有方面的一些实施方案中，本文所述的方法还包括给予进一步的治疗。
在一些实施方案中，进一步的治疗包括选自以下中的一种或多种：(i)手术切除、切割或减积肿瘤，(ii)放射疗法，以及(iii)化学疗法。
在一些实施方案中，进一步的治疗包括给予进一步的治疗剂。
在一些实施方案中，进一步的治疗剂包括抗癌治疗剂。
在所有方面的一些实施方案中，对象是人类。
在所有方面的一些实施方案中，癌症是CLDN6阳性癌症。
在一方面，本发明提供了用于本文所述方法中的本文所述的组合物或药物制剂。
在一方面，本发明涉及用于本文所述方法中的本文所述的试剂或组合物。
附图说明
图1：RNA药物物质BNT142的一般结构。
具有5’帽(这里为"帽1")、5'-UTRs和3'-UTRs的RNA药物物质的一般结构的示意图。
CH＝恒定重链结构域、CL＝恒定轻链结构域、DS＝药物物质；L＝接头；m＝信使；Sec＝分泌信号肽序列；多聚(A)＝多聚腺嘌呤尾；RNA＝核糖核酸；UTR＝未翻译区；VH＝可变重链结构域；VL＝可变轻链结构域。
图2：RiboMab02.1特异性结合人CD3和CLDN6，并且未表现出与密切相关的CLDN3、4和9或非人的灵长类CD3的脱靶结合。
使用APC标记的山羊抗小鼠IgG(重链和轻链[H+L])二抗，通过流式细胞术结合测定确定RiboMab02.1的靶向结合。首先对细胞进行单线态门控，然后对活淋巴细胞(PBMCs)或活HEK-293T-17细胞进行门控。使用浓度为10μg/mL的于HEK-293T-17上清液中的RiboMab02.1。如所示，稳定表达荧光素酶(HEK-293T-17_模拟)、CLDN3、4、6或9的食蟹猴或人PBMCs和HEK-293T-17转导子用作靶细胞。垂直虚线标记了未染色群体的峰值位置。
APC＝别藻蓝蛋白；CLDN＝claudin；HEK＝人胚肾；PBMC＝外周血单核细胞。
图3：小鼠中表达的RiboMab02.1介导多名PBMC供体体外的剂量依赖性和靶向特异性肿瘤细胞裂解。
将来自8名健康供体的人PBMCs与表达荧光素酶的肿瘤细胞共培养。使用CLDN6阳性的PA-1(A)或OV-90(B)细胞系作为靶细胞，并使用CLDN6阴性的MDA-MB-231(A、B)细胞系来控制靶标特异性。以384孔板形式进行测定，效应细胞与靶细胞之比为20:1。测量活的肿瘤细胞的生物发光作为读数。提供了肿瘤细胞杀伤的具体裂解百分比。将含有RiboMab02.1的小鼠血清连续稀释(10倍、10点；范围：5.0x 10-7-500ng/mL)，并加入共培养物中，然后与PA-1细胞一起孵育(A)24h或与OV-90细胞一起孵育(B)48h。每条线代表用单个供体的PBMC样品进行的肿瘤细胞裂解。误差条表示平均值的标准偏差(SD)(技术性的一式三份)。
CDLN＝claudin；EC50＝半最大效应浓度，PBMC＝外周血单核细胞。
图4：RiboMab02.1诱导剂量和靶标依赖性的T细胞增殖。
将来自三名健康供体的CFSE标记的人PBMCs与CLDN6阳性的PA-1和OV-90靶细胞一起或与CLDN6阴性但对照TAA阳性的NUGC-4以及靶标阴性的MDA-MB-231对照细胞一起，以12孔培养板形式共培养。应用效应细胞与靶细胞的比例为10:1。另外，不含(-)靶细胞的PBMCs也被单独包括。如所示，将100和1ng/mL的含有RiboMab02.1(五列的每块的第一和第二列)或对照RiboMab(五列的每块的第三和第四列)的HEK-293T-17上清液添加到共培养物中。OKT3抗体(抗人CD3；黑条)作为靶标非依赖性CD3驱动的T细胞增殖的阳性对照。孵育72h后，通过流式细胞术分析增殖的T细胞的百分比。误差条表示所有三名供体的平均值的标准偏差(SD)。
CFSE＝羧基荧光素琥珀酰亚胺酯；PBMC＝外周血单核细胞；w/o＝没有。
图5：RiboMab02.1在高浓度下介导具有低靶标非依赖性效应的剂量依赖性T细胞活化。
在存在和不存在CLDN6阳性PA-1细胞(靶细胞)的情况下，以10:1的效应细胞与靶细胞的比例培养来自三名健康供体(效应细胞)的人PBMCs。在用于测定中之前，将含有RiboMab02.1的小鼠血清连续稀释(10倍、10点；范围：4.0x 10-6-4,000ng/mL)。共孵育48h后，用抗CD5、抗CD69和抗CD25抗体对细胞进行染色，以用于T细胞的流式细胞术分析。这里显示的是标准化为与来自Luc_RNA-LNP处理的小鼠的模拟血清一起孵育的样品的总T细胞活化。每名单个供体(左图)和所有三名供体的活化T细胞百分比显示为平均值(右图)。实心符号表示有靶细胞的值，且黑色的空心符号表示无靶细胞的值。误差条表示平均值的标准偏差(SD)(技术性的一式三份[每名供体，左图]或生物学重复[供体间，右图])。
EC50＝半最大效应浓度；w/o＝没有。
图6：BNT142处理通过T细胞重定向到肿瘤消除了PBMC人源化NSG小鼠中的晚期异种移植物肿瘤。
通过IP注射，用作为效应细胞的人PBMCs移植携带OV-90细胞的晚期SC肿瘤异种移植物(处理开始时的平均肿瘤体积＝100mm3)的NSG小鼠。每周用数字卡尺测量两次肿瘤体积。每周一次用5剂IV团注注射的0.1或1μg BNT142或1μg的编码与靶标无关的RiboMab三聚体(靶标特异性的阴性对照)的RNA-LNP、1μg Luc_RNA-LNP、100μg的重组纯化的CD3 x(CLDN6)2三聚体参考蛋白或作为媒介物对照的DPBS(盐水)处理小鼠。(A)处理治疗时间表。(B)指定时间点单只小鼠的肿瘤体积。(C)每组肿瘤体积中位数概述，每组在研究开始时包括13-14只小鼠，并且在最后的数据点至少包括5只小鼠。垂直虚线表示测试/对照物品的IV给药的时间点。在第38天对来自所有组的四只小鼠(来自0.1μg BNT142组的五只小鼠)实施安乐死，以获得用于离体测定的样品。(D)通过使用抗人CD3抗体的免疫组织化学(IHC)染色测定的每mm2异种移植物组织的CD3阳性细胞的数量。在第三次处理后72h(第38天)解剖肿瘤异种移植物。水平线表示平均值(n＝4-5)。(E)通过使用抗人CLDN6抗体的IHC染色测定的来自相应测试组和对照组的小鼠的肿瘤异种移植物中CLDN6阳性细胞的百分比。在研究过程中，在不同的时间点解剖肿瘤异种移植物。水平线表示平均值(n＝8-10)。(F)来自在第三次处理后72h(第38天)实施安乐死的BNT142处理小鼠以及对照小鼠的OV-90肿瘤异种移植物中的人CD3(上图)和CLDN6(下图)染色的代表性IHC照片。红棕色染色(黑白图中为深色)表示阳性IHC信号，而蓝紫色区域表示不存在阳性染色(阴性IHC信号)。比例尺的长度如图中所示(BNT142和参考蛋白组：1,000μm；阴性对照/Luc_RNA-LNP和盐水组：2,000μm)。
CD＝分化簇；CLDN＝claudin；ctrl＝对照；IP＝腹膜内；IV＝静脉内；LNP＝脂质纳米粒子；Luc＝编码荧光素酶的；neg.＝阴性的；NSG＝NOD.Cg-Prkdscid IL2rgtm1Wjl/SzJ；PBMC＝外周血单核细胞；RNA＝核糖核酸；SC＝皮下。
图7：RiboMab02.1以剂量和靶标依赖性方式诱导人细胞因子。
利用定制的多重ELISA试剂盒，使用来自T细胞活化测定的细胞培养上清液(参见上文，图5)来测定由不同浓度的RiboMab02.1驱动的人类细胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-2、IL-10和IL-1β)的产生。显示了每名供体的细胞因子浓度值(技术性的一式三份的平均值)。实心符号表示有靶细胞的值，而空心符号表示没有靶细胞的值。
IFN＝干扰素；IL＝白细胞介素；TNF＝肿瘤坏死因子；w/o＝没有。
图8：BNT142处理未在PBMC人源化NSG小鼠中诱导人细胞因子释放。
在第三次注射0.1或1μg BNT142、1μg的编码与靶标无关的RiboMab三聚体的RNA-LNP以控制靶标特异性(阴性对照)、1μg Luc_RNA-LNP对照或100μg CD3 x(CLDN6)2三聚体参考蛋白后6和72h，进一步评估来自携带皮下异种移植物肿瘤的NSG/PBMC小鼠的血清(参见上文，图6)。包括了另一个非荷瘤(无肿瘤)组，其给予1μg BNT142。(A)通过多重ELISA，在6小时(n＝8)和72小时(n＝4)时间点测定的小鼠血清中人细胞因子(IFN-γ、IL-6、IL-2、IL-10、TNF-α和IL-1β)。将数据标准化为各个时间点的盐水给药动物。水平线表示中值。分别使用曼-惠特尼U检验或Wilcoxon符号秩检验对未配对和配对样品进行比较。(B)编码的治疗性抗体RiboMab02.1的血清浓度。水平线表示平均值。
***，p＝0.0002；ctrl＝对照；h＝小时；IFN＝干扰素；IL＝白细胞介素；LNP＝脂质纳米粒子；Luc＝编码荧光素酶的；neg.＝阴性；ns＝不显著的；RNA＝核糖核酸；TNF＝肿瘤坏死因子；w/o＝没有。
图9：LNP配制的mRNA的体内肝靶向。
Balb/cJRj小鼠接受LNP配制的萤火虫荧光素酶mRNA的单次IV注射。给药后6、24、48、72和144h监测生物发光。(A)显示了给药后6h拍摄的(左图)单只小鼠的腹侧位置(n＝5)和(右图)动物#1和2的单个器官的图像。(B)显示了所有分析时间点(n＝5或3，平均值)的荧光素酶信号的量化(光子/秒)。
IV＝静脉内；LN＝淋巴结；LNP＝脂质纳米粒子。
图10：BNT142编码的RiboMab02.1在体内有效表达。
雌性Balb/cJRj小鼠(n＝3)接受每只小鼠30μg BNT142的IV团注注射。给药后2和6h收获血清。(A)通过ELISA进行的血清中RiboMab02.1浓度的定量。水平线表示平均值。(B)在非还原条件下分析缓冲液中或加标的Balb/cJRj血清中含有RiboMab02.1的血清和参考蛋白(单体，HMW)的蛋白质印迹分析。在血清-蛋白质纯化步骤之后，每条泳道总共加载60ng蛋白质。来自未经处理的小鼠的血清作为对照。使用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗人IgG Fd抗体进行蛋白质印迹。
Ab＝抗体；ctrl＝对照；Fd＝片段可检测的；HMW＝高分子量；HPI＝注射后小时；ID＝识别号；IgG＝免疫球蛋白γ；kDa＝千道尔顿；MW＝分子量。
图11：小鼠的通过重复的BNT142给药发生的持续RiboMab02.1暴露和剂量依赖性抗药物抗体反应。
雌性Balb/cJRj小鼠(n＝4)每周一次经IV注射10或30μg BNT142或30μg作为对照的Luc_RNA-LNP，在通过水平虚线示出的时间点进行总共5次给药。分别在每次BNT142或盐水给药的基线(0h)、给药后6h(6、174、342、510和678h)和给药前24h(144、312、480和648h)，从小鼠抽取血液。在第一次BNT142/盐水给药后816h进行最后的抽血。通过ELISA测定血清RiboMab02.1浓度。误差条表示平均值的标准偏差(SD)。
LNP＝脂质纳米粒子；Luc＝荧光素酶；RNA＝核糖核酸。
图12：IV注射BNT142后食蟹猴中的RiboMab02.1暴露。
BNT142剂量队列和盐水对照组各自包括三只食蟹猴，从它们抽血以制备血清，以用于通过ELISA评估RiboMab02.1浓度。误差条表示平均值的标准偏差(SD)(技术性的一式三份)。
图13：RiboMab02.1是高度单体的，并且在小鼠中诱导的ADA反应低于替代的候选先导结构RiboMab_712/711C53W。
雌性Balb/cJRj经IV注射30μg编码RiboMab02.1或RiboMab_712/711或荧光素酶(对照)的RNA-LNP。(A)在注射后6小时对血清进行取样。在小鼠血清中加标50ng纯化的蛋白质参考物(单体和HMW参考物)。对未经处理的(模拟)、注射荧光素酶RNA的(对照)或注射RiboMab RNA的小鼠的5μL血清和加标参考物进行Melon G纯化，并在非还原条件下，在4％–15％ Criterion凝胶上进行分离。用HRP缀合的山羊抗人IgG Fd抗体进行蛋白质印迹分析。显示了每组一只代表性小鼠的样品。(B)对于ADA分析，在指示的时间点对血清进行采样。经由夹心ELISA测定分析血清样品的抗RiboMab ADA含量。针对RiboMab蛋白浓度(灰色虚线)，随时间绘制ADA反应(黑线)。显示了RiboMab_712/711C53W变体(上图)和RiboMab02.1(下图)。误差条显示了平均值的标准偏差(n＝4)。
Ab＝抗体；ADA＝抗药物抗体；C53S/W＝抗CLDN6 VL部分中的位置53处半胱氨酸到丝氨酸/色氨酸的取代；Fd＝片段困难；HMW＝高分子量；IgG＝免疫球蛋白G；kDa＝千道尔顿；MW＝分子量；RU＝相对单位。
图14：编码RiboMab02.1的药物物质中间体的HC:LC重量比影响RiboMab02.1的表达效率和单体含量。
用所示重量(w/w)比例的分别编码RiboMab02.1重链(HC)和轻链(LC)的两种编码RiboMab02.1的药物物质中间体(RNAs)对HEK-293T-17细胞进行电穿孔。转染后48h收获细胞培养上清液(SN)。(A)在非还原条件下对含有RiboMab02.1的SN和参考蛋白(单体，HMW)进行的蛋白质印迹分析。来自非转染细胞的SN用作阴性对照(模拟SN)。使用HRP缀合的山羊抗人κ轻链(1:500)和IgG Fd(1:2,000)抗体的组合进行蛋白质印迹，以进行检测。(B)通过ELISA分析来自两个独立实验的技术重复的SN样品中的平均RiboMab02.1浓度。误差条表示平均值的标准偏差(SD)。
Ab＝抗体；Fd＝可检测的片段；HC＝编码重链的RNA；HMW＝高分子量；IgG＝免疫球蛋白γ；kDa＝千道尔顿；MW＝分子量；LC＝编码轻链的RNA；LMW＝低分子量；RNA＝核糖核酸；SN＝上清液。
序列说明
下表提供了本文参考的某些序列的列表。
具体实施方式
尽管以下详细描述了本公开，但是应当理解，本公开不限于本文所述的特定方法、方案和试剂，因为这些可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不旨在限制将仅由所附权利要求限制的本公开的范围。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
优选地，本文使用的术语按"A multilingual glossary of biotechnologicalterms:(IUPAC Recommendations)",H.G.W.Leuenberger,B.Nagel和H.编辑,Helvetica Chimica Acta,CH-4010Basel,Switzerland,(1995)中描述的进行定义。
除非另有指示，否则本公开的实践将采用化学、生物化学、细胞生物学、免疫学和重组DNA技术的常规方法，这些方法在本领域的文献中进行了解释(参见例如，MolecularCloning:ALaboratory Manual,第2版,J.Sambrook et al.编辑,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor 1989)。
在下文中，将描述本公开的元素。这些元素与具体实施方案一起列出，然而，应当理解，它们可以以任何方式和任何数量组合，以产生另外的实施方案。不同描述的实例和实施方案不应被解释为将本公开仅限于明确描述的实施方案。本说明书应理解为公开并涵盖将明确描述的实施方案与任何数量的公开元素相结合的实施方案。此外，除非上下文另有指示，否则所有描述的元素的任何排列和组合都应当被认为被本说明书公开。
如本文所用，应用于一个或多个目标值的术语“近似(approximately)”或“约(about)”，是指与所述参考值相似的值。一般来说，如在上下文中熟悉的，本领域技术人员将理解上下文中“约”或“近似”所包含的相关变化程度。例如，在一些实施方案中，术语“近似”或“约”可以包括在参考值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更低内的值的范围。
在描述本公开的上下文中(特别是在权利要求的上下文中)使用的术语“一个(a)”和“一种(an)”和“所述(the)”以及类似引用应被解释为涵盖单数和复数，除非本文另有指示或与上下文明显矛盾。本文对值范围的叙述仅旨在作为单独引用落入该范围内的每个单独值的简写方法。除非本文中另有指示，否则每个单独的值都被并入说明书中，就好像它在本文中被单独叙述一样。本文描述的所有方法都可以以任何合适的顺序执行，除非本文另有指示或在其他情况下与上下文明显矛盾。本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“如”)的使用仅旨在更好地说明本公开，并且不对权利要求的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应被解释为指示对本公开的实践至关重要的任何未要求保护的元素。
除非另有明确规定，否则术语“包含(comprising)”在本文件的上下文中用于指示除通过“包含(comprising)”所引入的列表成员外，还可以任选地存在其他成员。然而，作为本公开的具体实施方案，预期了术语“包含(comprising)”包括不存在其他成员的可能性，即，就为了本实施方案的目的，“包含(comprising)”应被理解为具有“由…组成(consisting of)”或“基本上由组成(consisting essentially of)”的含义。
本说明书全文引用了多份文件。本文引用的每一份文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指导等)，无论是同上文还是同下文，均在此通过引用整体并入本文。本文中的任何内容均不得被解释为承认本公开无权先于此类公开。
定义
在下文中，将提供适用于本公开的所有方面的定义。除非另有指示，否则以下术语具有以下含义。任何未定义的术语都有其领域认可的含义。
本文所用的术语如“减少”、“降低”、“抑制”或“损害”涉及水平的总体减少或导致水平总体减少的能力，优选为至少5％、至少10％、至少20％、至少50％、至少75％或甚至更多。这些术语包括完全或基本上完全的抑制，即减少到零或基本上减少到零。
诸如“增加”、“增强”或“超过”之类的术语优选地涉及至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少80％、至少100％、至少200％、至少500％或甚至更多的增加或增强。
根据公开内容，术语“肽”包括寡肽和多肽，并且是指包含经由肽键彼此连接的约两个或更多个、约3个或更多个、约4个或更多个、约6个或更多个、约8个或更多个、约10个或更多个、约13个或更多个、约16个或更多个、约20个或更多个，以及多达约50个、约100个或约150个连续氨基酸的物质。术语“蛋白质”或“多肽”是指大的肽，特别是具有至少约150个氨基酸的肽，但术语“肽”、“蛋白质”和“多肽”在本文中通常用作同义词。
关于氨基酸序列(肽或蛋白质)，“片段”涉及氨基酸序列的一部分，即表示在N端和/或C端缩短的氨基酸序列的序列。可例如通过翻译缺少开放阅读框的3'端的截短的开放阅读框来获得在C端缩短的片段(N端片段)。可以例如通过翻译缺少开放阅读框的5'端的截短的开放阅读框来获得在N端缩短的片段(C端片段)，只要截短的开放阅读框包括用于开始翻译的起始密码子即可。氨基酸序列的片段包含例如来自氨基酸序列的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的氨基酸残基。氨基酸序列的片段优选包含来自氨基酸序列的至少6个，特别是至少8个、至少12个、至少15个、至少20个、至少30个、至少50个或至少100个连续氨基酸。
本文通过“变体”意指由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本氨基酸序列的氨基酸序列。亲本氨基酸序列可以是天然存在的或野生型(WT)氨基酸序列，或者可以是野生型氨基酸序列的修饰形式。优选地，变体氨基酸序列与亲本氨基酸序列相比具有至少一个氨基酸修饰，例如，与亲本相比具有1至约20个氨基酸修饰，并且优选地1至约10个或1至约5个氨基酸修饰。
本文通过“野生型”或“WT”或“天然的”意指在天然下发现的氨基酸序列，包括等位基因变异。野生型氨基酸序列、肽或蛋白质具有未被有意修饰的氨基酸序列。
为了本公开的目的，氨基酸序列(肽、蛋白质或多肽)的“变体”包括氨基酸插入变体、氨基酸添加变体、氨基酸缺失变体和/或氨基酸取代变体。术语“变体”包括所有突变体、剪接变体、翻译后修饰的变体、构象、同种型、等位基因变体、物种变体和物种同源物，特别是那些天然存在的变体。术语“变体”特别包括氨基酸序列的片段。
氨基酸插入变体包括在特定氨基酸序列中插入单个或两个或更多个氨基酸。在具有插入的氨基酸序列变体的情况下，将一个或多个氨基酸残基插入到氨基酸序列中的特定位点中，尽管随机插入并适当筛选所得产物也是可能的。氨基酸添加变体包括一个或多个氨基酸，如1、2、3、5、10、20、30、50个或更多个氨基酸的氨基和/或羧基端融合。氨基酸缺失变体的特征在于从序列中去除一个或多个氨基酸，如去除1、2、3、5、10、20、30、50个或更多个氨基酸。缺失可以在蛋白质的任何位置中。在蛋白质的N端和/或C端包括缺失的氨基酸缺失变体也称为N端和/或C端截短变体。氨基酸取代变体的特征在于序列中的至少一个残基被去除，并且另一个残基被插入其位置中。优选在同源蛋白质或肽之间不保守的氨基酸序列中的位置进行修饰和/或用具有类似特性的其他氨基酸取代氨基酸。在一些实施方案中，肽和蛋白质变体中的氨基酸变化是保守的氨基酸变化，即类似带电或不带电的氨基酸的取代。保守的氨基酸变化涉及取代在其侧链中相关的氨基酸家族中的一个。天然存在的氨基酸通常分为四个家族：酸性(天冬氨酸、谷氨酸)、碱性(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)和不带电荷的极性(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)的氨基酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被一起分类为芳香族氨基酸。在一些实施方案中，保守氨基酸取代包括以下组内的取代：
甘氨酸、丙氨酸；
缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；
天冬氨酸、谷氨酸；
天冬酰胺、谷氨酰胺；
丝氨酸、苏氨酸；
赖氨酸、精氨酸；以及
苯丙氨酸、酪氨酸。
优选地，给定氨基酸序列和作为所述给定氨基酸序列的变体(例如，功能变体)的氨基酸序列之间的相似性程度，优选地同一性程度将至少为约60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。优选地，给出作为参考氨基酸序列的整个长度的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的氨基酸区域的相似性或同一性程度。例如，如果参考氨基酸序列由200个氨基酸组成，则优选地给出至少约20个、至少约40个、至少约60个、至少约80个、至少约100个、至少约120个、至少约140个、至少约160个、至少约180个或约200个氨基酸，在一些实施方案中，连续的氨基酸的相似性或同一性程度。在一些实施方案中，给出参考氨基酸序列的整个长度的相似性或同一性程度。用于确定序列相似性，优选地序列同一性的比对可以用领域已知的工具进行，优选使用最佳序列比对，例如使用Align，使用标准设置，优选地EMBOSS::needle，Matrix:Blosum62，空位开放10.0，空位延伸0.5。
“序列相似性”表示相同的或代表保守氨基酸取代的氨基酸的百分比。两个氨基酸序列之间的“序列同一性”表示序列之间相同的氨基酸的百分比。两个核酸序列之间的“序列同一性”表示序列之间相同核苷酸的百分比。
术语“％相同的”、“％同一性”或类似术语旨在特别指在待比较序列之间的最佳比对中相同的核苷酸或氨基酸的百分比。所述百分比是纯统计上的，并且两个序列之间的差异可以是但不一定是在要比较的序列的整个长度上随机分布的。通常通过在最佳比对后将序列相对于片段或“比较窗”进行比较来进行两个序列的比较，以识别相应序列的局部区域。用于比较的最佳比对可以手动进行，或者借助Smith和Waterman,1981,AdsApp.Math.2,482的局部同源性算法、借助Neddleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48,443的局部同源性算法、借助Pearson和Lipman,1988,Proc.Natl Acad.Sci.USA 88,2444的相似性搜索算法，或者借助使用所述算法的计算机程序(Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA，Genetics Computer Group,575ScienceDrive,Madison,Wis.)进行。在一些实施方案中，使用BLASTN或BLASTP算法来确定两个序列的同一性百分比，如在美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站(例如，在blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PAGE_TYPE＝BlastSearch&BLAST_SPEC＝blast2seq&LINK_LOC＝align2seq)上可获得的。在一些实施方案中，NCBI网站上用于BLASTN算法的算法参数包括：(i)预期阈值设置为10；(ii)字大小设置为28；(iii)查询范围中的最大匹配设置为0；(iv)匹配/错配分数设置为1、-2；(v)空位成本设置为线性；以及(vi)使用低复杂性区域的过滤器。在一些实施方案中，NCBI网站上用于BLASTP算法的算法参数包括：(i)预期阈值设置为10；(ii)字大小设置为3；(iii)查询范围中的最大匹配设置为0；(iv)矩阵设置为BLOSUM62；(v)空位成本设置为存在：11延伸：1；以及(vi)条件组成得分矩阵调整。
通过确定待比较序列对应的相同位置的数量，将该数量除以所比较的位置的数量(例如，参考序列中的位置数量)，并将该结果乘以100，可以获得百分比同一性。
在一些实施方案中，给出作为参考序列的整个长度的至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的区域的相似性或同一性的程度。例如，如果参考核酸序列由200个核苷酸组成，则给出至少约100个、至少约120个、至少约140个、至少约160个、至少约180个或约200个核苷酸，在一些实施方案中，连续的核苷酸的同一性的程度。在一些实施方案中，给出参考序列的整个长度的相似性或同一性的程度。
同源性氨基酸序列根据本公开表现出至少40％，特别是至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，并且优选地至少95％、至少98或至少99％的氨基酸残基同一性。
技术人员可以容易地制备本文所述的氨基酸序列变体，例如通过重组DNA操作。例如，在Sambrook et al.(1989)中详细描述了用于制备具有取代、添加、插入或缺失的肽或蛋白质的DNA序列的操作。此外，本文所述的肽和氨基酸变体可以借助已知肽合成技术容易地制备，例如通过固相合成和类似方法。
在一些实施方案中，氨基酸序列(肽或蛋白质)的片段或变体优选为“功能性片段”或“功能性变体”。术语氨基酸序列的“功能性片段”或“功能性变体”涉及表现出与其所来源的氨基酸序列的那些相同或相似的一种或多种功能特性的任何片段或变体，即其是功能上等同的。关于结合剂的序列，一种特定的功能是片段或变体所来源的氨基酸序列所显示处的一种或多种结合活性。如本文所使用的术语“功能性片段”或“功能性变体”特别是指变体分子或序列，其包含与亲本分子或序列的氨基酸序列相比被一个或多个氨基酸改变，并且仍然能够实现亲本分子或序列的一种或多种功能，例如与靶分子结合的氨基酸序列。在一些实施方案中，亲本分子或序列的氨基酸序列中的修饰不会显著影响或改变分子或序列的特征。在不同的实施方案中，功能片段或功能变体的功能可能被降低但仍然显著存在，例如，功能变体的结合可以是亲本分子或序列的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。然而，在其他实施方案中，与亲本分子或序列相比，功能片段或功能变体的结合可能增强。
"来源于"指定的氨基酸序列(肽、蛋白质或多肽)的氨基酸序列(肽、蛋白质或多肽)是指第一氨基酸序列的来源。优选地，来源于特定氨基酸序列的氨基酸序列具有与该特定序列或其片段相同、基本上相同或同源的氨基酸序列。来源于特定氨基酸序列的氨基酸序列可以是该特定序列或其片段的变体。例如，本领域普通技术人员将理解，适合于本文使用的序列可以被改变，使得它们在序列上与它们所来源的天然存在或天然序列不同，同时保持天然序列的所需活性。
例如，本发明的结合剂的多肽链的VH、VL、CH1和CL结构域的氨基酸序列可以来源于免疫球蛋白的VH、VL、CH1和CL结构域的氨基酸序列，但相比它们所来源的结构域可能发生改变。例如，根据本发明，来源于免疫球蛋白的VH或VL包含可能与其所来源的分别的VH或VL的氨基酸序列相同的氨基酸序列，或者其相比分别的亲本VH或VL的序列可以在一种或多种氨基酸位置中不同。例如，本发明的结合剂的VH结构域可包含氨基酸序列，该氨基酸序列与其来源的VH结构域的氨基酸序列相比，包含一个或多个氨基酸插入、氨基酸添加、氨基酸缺失和/或氨基酸取代。例如，本发明的结合剂的VL结构域可以包含氨基酸序列，该氨基酸序列与其来源的VL结构域的氨基酸序列相比，包含一个或多个氨基酸插入、氨基酸添加、氨基酸缺失和/或氨基酸取代。优选地，具有作为亲本VH或VL的氨基酸序列的功能变体的氨基酸序列的VH或VH提供与亲本VH或VL的氨基酸序列相同或基本上相同的功能，例如，在结合特异性、结合强度等方面。然而，如本领域普通技术人员所知，在一些实施方案中，还可以优选提供例如VH或VL的氨基酸序列的功能变体，其与亲本分子的氨基酸序列相比具有改变的特征。同样的考虑适用于例如CDRs的氨基酸序列和其他氨基酸序列，例如CH1和/或CL结构域的那些。在一些实施方案中，本文所述的CH1和CL序列的变体具有相互作用的能力，例如彼此结合的能力。
如本文所用，“指导性材料”或“指导”包括出版物、记录、图表或任何其他表达媒介，其可用于传达本发明的组合物和方法的有用性。本发明试剂盒的指导性材料可以例如固定在含有本发明组合物的容器上，或者与含有组合物的容器一起运输。可选地，指导性材料可以与容器分开运输，目的是让接受者配合使用指导性材料和组合物。
“分离的”意指从天然状态改变或移除。例如，活动物中天然存在的核酸或肽不是“分离的”，但与其天然状态的共存物质部分或完全分离的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以实质上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境中，诸如例如宿主细胞中。
术语“重组”在本发明的上下文中意指“通过遗传改造制造”。优选地，在本发明的上下文中，诸如重组核酸的“重组物体”不是天然发生的。
本文所用的术语“天然存在的”是指可以在天然下发现物体的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中，并且可以从天然来源中分离，并且没有在实验室中被人类有意修饰的肽或核酸是天然存在的。
本文所用的“生理pH”是指约7.35至约7.45的pH，平均值约为7.40。
术语“基因修饰”或简称“修饰”包括用核酸转染细胞。术语“转染”涉及将核酸，特别是RNA引入细胞中。为了本发明的目的，术语“转染”还包括将核酸引入细胞中或由这样的细胞摄取核酸，其中所述细胞可以存在于对象，例如患者中。因此，根据本发明，本文所述的用于转染核酸的细胞可以存在于体外或体内，例如该细胞可以形成患者的器官、组织和/或生物体的一部分。根据本发明，转染可以是短暂的或稳定的。对于转染的一些应用，如果转染的遗传物质仅瞬时表达，则其是足够的。RNA可以被转染到细胞中以瞬时表达其编码的蛋白质。由于转染过程中引入的核酸通常不会整合到核基因组中，因此外来核酸会通过有丝分裂被稀释或降解。允许附加型核酸扩增的细胞大大降低了稀释率。如果希望转染的核酸实际上保留在细胞及其子细胞的基因组中，则必须进行稳定的转染。这种稳定的转染可以通过使用基于病毒的系统或基于转座子的系统进行转染来实现。通常，编码结合剂的核酸被瞬时转染到细胞中。RNA可以被转染到细胞中以瞬时表达其编码的蛋白质。
Claudin 6(CLDN6)
Claudins是一个蛋白质家族，其是紧密连接的最重要组分，其中它们建立控制上皮细胞之间细胞间隙中的分子流动的细胞旁屏障。Claudins是跨越膜4次的跨膜蛋白，其中N端和C端都位于细胞质中。称为EL1或ECL1的第一个细胞外环平均由53个氨基酸组成，并且称为EL2或ECL2的第二个细胞外环由约24个氨基酸组成。
术语"claudin 6"或"CLDN6"优选地涉及人CLDN6，并且特别地，涉及这样的蛋白质，其包含序列表的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体，优选地由序列表的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体组成。CLDN6的第一细胞外环优选地包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列或SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的氨基酸28-80或29-81，更优选地氨基酸28-76。CLDN6的第二细胞外环优选地包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列或SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的氨基酸138-160，优选地氨基酸141-159，更优选地氨基酸145-157。所述第一和第二细胞外环优选地形成CLDN6的细胞外部分。
CLDN6在各种来源的肿瘤中表达，唯一表达CLDN6的成人正常组织是胎盘。
已经发现，CLDN6在例如卵巢癌、肺癌、睾丸癌、子宫内膜癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、黑色素瘤、头颈癌、肉瘤、胆管癌、肾细胞癌和尿膀胱癌中表达。CLDN6是预防和/或治疗卵巢癌的特别优选的靶标，特别是卵巢腺癌和卵巢畸胎癌、输卵管癌症腹膜癌、肺癌，包括小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，特别是鳞状细胞肺癌和腺癌或非鳞状类型的非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌，特别是基底细胞癌和鳞状细胞癌、恶性黑色素瘤、头颈癌，特别是恶性多形性腺瘤、肉瘤，特别是滑膜肉瘤和癌肉瘤、胆管癌、尿膀胱癌，特别是移行细胞癌和乳头状癌、肾癌，特别是肾细胞癌，包括透明细胞肾细胞癌和肾乳头状细胞癌、结肠癌、小肠癌，包括回肠癌，特别是小肠腺癌和回肠腺癌、睾丸胚胎癌、胎盘绒毛膜癌、子宫颈癌、睾丸癌，特别是睾丸精原细胞瘤、睾丸畸胎瘤和胚胎睾丸癌、子宫癌、生殖细胞肿瘤如畸胎癌或胚胎癌，特别是睾丸的生殖细胞肿瘤，以及以上的转移形式。在一些实施方案中，与CLDN6表达相关的癌症疾病选自卵巢癌、肺癌、转移性卵巢癌和转移性肺癌。优选地，卵巢癌是癌症或腺癌。优选地，肺癌是癌症或腺癌，并且优选地是细支气管癌，如细支气管癌或细支气管腺癌。
如本文所用，术语“CLDN6阳性癌症”涉及癌症，其涉及表达CLDN6的癌细胞，优选在所述癌细胞的表面上表达。
根据本发明，如果表达水平相比胎盘细胞或胎盘组织中的表达更低，则CLDN6在细胞中不实质性地表达。优选地，表达水平小于胎盘细胞或胎盘组织中表达的10％，优选地小于5％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％或0.05％，或者甚至更低。优选地，如果表达水平超过胎盘以外的非癌组织中的表达水平的不多于2倍，优选1.5倍，并且优选地不超过所述非癌组织中的表达水平，则CLDN6在细胞中不实质性地表达。优选地，如果表达水平低于检测限和/或如果表达水平太低而不允许被添加到细胞中的CLDN6特异性抗体结合，则CLDN6在细胞中不实质性地表达。
根据本发明，如果表达水平超过胎盘以外的非癌组织中的表达水平，优选超过2倍，优选地10倍、100倍、1,000倍或10,000倍，则CLDN6在细胞中表达。优选地，如果表达水平高于检测限和/或如果表达水平足够高以允许被添加到细胞中的CLDN6特异性抗体结合，则CLDN6在细胞中表达。优选地，在细胞中表达的CLDN6在所述细胞的表面上表达或暴露。
分化簇3(CD3)
本文所述的结合剂的第二靶标分子是CD3(分化簇3)。
CD3复合物是一种T细胞特异性抗原。T细胞特异性抗原是T细胞表面上的抗原。
CD3复合物表示在成熟人T细胞、胸腺细胞和自然杀伤细胞亚集上表达的抗原，作为多分子T细胞受体(TCR)复合物的一部分。T细胞共受体是一种蛋白质复合物，并且由四条不同的链组成。在哺乳动物中，该复合物包含CD3γ链、CD3δ链和两条CD3ε链。这些链与称为T细胞受体(TCR)的分子和ζ链结合，以在T淋巴细胞中产生激活信号。TCR、ζ-链和CD3分子一起组成TCR复合物。
人CD3ε在GenBank登录号NM_000733中指出，并且包含SEQ ID NO:3。人CD3γ在GenBank登录号NM_000073中指出。人CD3δ在GenBank登录号NM_000732中指出。CD3负责TCR的信号转导。如Lin和Weiss,Journal of Cell Science 114,243-244(2001)中所描述的，通过结合MHC呈递的特异性抗原表位来激活TCR复合物导致免疫受体酪氨酸基激活基序(ITAMs)被Src家族激酶磷酸化，触发其他激酶的募集，其导致T细胞激活，包括Ca2+释放。CD3在T细胞上的聚集，例如通过固定化的抗CD3抗体，导致T细胞活化，类似于T细胞受体的接合，但独立于其克隆的典型特异性。
如本文所用，“CD3”包括人CD3，并且表示作为多分子T细胞受体复合物的一部分在人T细胞上表达的抗原。
在一些实施方案中，本文所述的结合剂识别CD3的ε链，特别地，其识别对应于CD3ε的前27个N端氨基酸或该27个氨基酸延伸的功能片段的表位。
结合剂
本公开描述了能够至少结合CD3的表位和CLDN6的表位的结合剂，如双特异性的三价结合剂。结合剂包含至少三个结合域，其中第一结合域能够结合CD3，并且第二结合域和第三结合域能够结合CLDN6，并且其中第二结合域和第三结合域结合CLDN6的相同或不同表位。在一些实施方案中，本文所述的结合剂的第二结合域和第三结合域结合CLDN6的相同表位。在一些实施方案中，第二结合域和第三结合域的序列是相同的或基本上相同的。
在一些实施方案中，本文所述的结合剂是重组分子。
术语“表位”是指被结合剂识别的分子或抗原如CD3和/或CLDN6的部分或片段。例如，表位可以被抗体或任何其他结合蛋白识别。表位可以包括抗原的连续或不连续部分，并且长度可以在约5个和约100个氨基酸之间，如在约5个和约50个氨基酸之间，更优选在约8个和约30个氨基酸之间，最优选在约8个和约25个氨基酸之间，例如，表位长度可以优选地为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。在一些实施方案中，表位的长度在约10个和约25个氨基酸之间。术语“表位”包括结构表位。
术语“免疫球蛋白”是指一类结构相关的糖蛋白，由两对多肽链、一对轻(L)低分子量链和一对重(H)链组成，所有四条链通过二硫键相互连接。免疫球蛋白的结构已经得到了很好的表征。参见例如Fundamental Immunology第7章(Paul,W.,编辑,第2版Raven Press,N.Y.(1989))。简言之，每条重链通常由重链可变区(本文缩写为VH或VH)和重链恒定区(本文简写为CH或CH)组成。重链恒定区通常由三个结构域组成，即CH1、CH2和CH3。铰链区是重链的CH1和CH2结构域之间的区域，并且是高度柔性的。铰链区中的二硫键是IgG分子中两条重链之间相互作用的一部分。每条轻链通常由轻链可变区(本文缩写为VL或VL)和轻链恒定区(本文简写为CL或CL)组成。轻链恒定区通常由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分为高变区(或在序列和/或结构定义的环的形式上可以是高变的高变区)，也称为互补决定区(CDRs)，中间插入了更保守的区域，称为框架区(FRs)。每个VH和VL通常由三个CDRs和四个FRs组成，从氨基端到羧基端按以下顺序布置：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(也参见Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196,901917(1987))。除非另有说明或与上下文相矛盾，本发明中恒定区中氨基酸位置的参考是根据EU编号的(Edelman et al.,Proc NatlAcad Sci U S A.1969年5月；63(1):78-85；Kabat et al.,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版.1991NIH出版编号91-3242)。通常，本文所述的CDRs是Kabat定义的。在一些实施方案中，免疫球蛋白是抗体。
在整个文件中，提及重链(HC)或轻链(LC)并不一定意味着存在整个重链(HC)或轻链(LC)，但用作缩写以指示存在至少相关的或区分性的重链(HC)或轻链(LC)部分。例如，如果基于(Fab)-(scFv)2的双特异性抗体具有两条链，并且一条链包含来源于亲本免疫球蛋白以及scFv的重链(VH)的可变区，并且另一条链包含来源于亲本免疫球蛋白以及scFv的轻链(VL)的可变区，则这两条链可以分别称为重链(HC)和轻链(LC)。即使两条链实际上都不包含重链或轻链，并且两条链都包含scFv，也可能是这种情况，这意味着它们都包含来源于亲本重链和亲本轻链的要素。
在本发明的上下文中，术语“抗体”(Ab)是指免疫球蛋白分子、免疫球蛋白蛋白分子的片段或以上任一的衍生物，其具有结合，优选地特异性结合抗原的能力。在一些实施方案中，结合在具有显著时间段的半衰期的典型生理条件下发生，如至少约30分钟、至少约45分钟、至少约1小时、至少约2小时、至少约4小时、至少约8小时、至少约12小时、约24小时或更长时间、约48小时或更长时间，约3、4、5、6、7天或更多天等，或者任何其他相关的功能定义的时间段(如足以诱导、促进、增强和/或调节与抗体结合抗原相关的生理反应的时间)。免疫球蛋白分子的重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。如本文所用的，术语“抗原结合区”、“结合区”或“结合域”是指与抗原相互作用的区域或结构域，并且通常包括VH区和VL区。当在本文中使用时，术语抗体不仅包括单特异性抗体，还包括多特异性抗体，其包括多个，如两个或更多个，例如，三个或更多个不同的抗原结合区。抗体(Abs)的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(如效应细胞)和补体系统的组分，如C1q，其是补体激活的经典途径中的第一个组分。如上文指出的，除非另有说明或上下文明确矛盾，否则本文所用的术语抗体包括作为抗原结合片段的抗体片段，即保留特异性结合抗原的能力，以及抗体衍生物，即来源于抗体的构建体。已经表明抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来执行。术语“抗体”内包含的抗原结合片段的实例包括：(i)Fab’或Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段，或者WO2007059782(Genmab)中描述的单价抗体；(ii)F(ab')2片段，即包含通过铰链区的二硫键桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)基本上由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)基本上由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward et al.,Nature 341,544-546(1989))，其基本上由VH结构域组成，并且也称为结构域抗体(Holt et al；TrendsBiotechnol.2003年11月；21(11):484-90)；(vi)camelid或纳米抗体分子(Revets et al；Expert Opin Biol Ther.2005年1月；5(1):111-24)，以及(vii)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH是由单独的基因编码的，但它们可以使用重组方法通过合成接头连接，该合成接头使它们能够被制成单个蛋白链，其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链抗体或单链Fv(scFv)，参见例如Bird et al.,Science 242,423426(1988)和Huston et al.,PNAS USA 85,5879 5883(1988))。除非上下文另有说明或明确指出，否则这些单链抗体包含在术语抗体中。尽管这些片段通常包括在抗体的含义内，但它们共同且各自独立地是本发明的独特特征，表现出不同的生物特性和效用。本文进一步讨论了本发明的上下文中的这些和其他有用的抗体片段，以及这些片段的双特异性形式。还应当理解，除非另有规定，否则术语抗体还包括多克隆抗体、单克隆抗体(mAbs)、抗体样多肽，如嵌合抗体和人源化抗体，以及保留通过任何已知技术如酶切割、肽合成和重组技术提供的特异性结合抗原的能力的抗体片段(抗原结合片段)。
短语“单链Fv”或“scFv”是指这样的抗体，其中传统的双链抗体的重链和轻链(VH和VL)的可变结构域已连接形成一条链。任选地，在两条链之间插入接头(通常是肽)，以允许适当折叠和产生活性结合位点。
抗体可以具有任何同种型。如本文所用，术语“同种型”是指由重链恒定区基因编码的免疫球蛋白类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM)。当本文提及特定同种型，例如IgG1时，该术语不限于具体的同种型序列，例如特定的IgG1序列，而是用于指示相比其他同种型，抗体在序列上更接近该同种型，例如IgG1。因此，例如本发明的IgG1抗体可以是天然存在的IgG1抗体的序列变体，包括恒定区中的变异。
在不同的实施方案中，抗体是IgG1抗体，更特别地是IgG1、κ或IgG1、λ同种型(即IgG1、κ、λ)、IgG2a抗体(例如，IgG2a、κ、λ)、IgG2b抗体(例如，IgG2b、κ、λ)、IgG3抗体(例如，IgG3、κ、λ)或IgG4抗体(例如，IgG4、κ、λ)。
本文中使用的术语“单克隆抗体”是指单分子组合物的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物显示出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。因此，术语“人单克隆抗体”是指表现出单一结合特异性的抗体，其具有来源于人类生殖系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。人单克隆抗体可由杂交瘤产生，所述杂交瘤包括从具有包含融合到永生化细胞的人重链转基因和轻链转基因的基因组的转基因的或转染色体的非人动物，如转基因小鼠获得的B细胞。
本文所用的术语“嵌合抗体”是指其中可变区来源于非人类物种(例如来源于啮齿动物)，且恒定区来源于不同物种如人类的抗体。开发用于治疗应用的嵌合单克隆抗体是为了降低抗体免疫原性。在嵌合抗体的上下文中使用的术语“可变区”或“可变结构域”是指包含免疫球蛋白的重链和轻链的CDRs和框架区的区域。可以通过使用标准DNA技术来产生嵌合抗体，如Sambrook et al.,1989,Molecular Cloning:A laboratory Manual,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,第15章中所述的。嵌合抗体可以是遗传或酶改造的重组抗体。产生嵌合抗体在技术人员的知识范围内，并因此，可以通过本文所述以外的其他方法进行根据本发明的嵌合抗体的产生。
本文所用的术语“人源化的抗体”是指遗传改造的非人类抗体，其包含人类抗体恒定结构域和经修饰以包含与人类可变结构域具有高水平序列同源性的非人类可变结构域。这可以通过将共同形成抗原结合位点的六个非人类抗体互补决定区(CDRs)移植到同源的人类受体框架区(FR)上来实现(参见WO92/22653和EP0629240)。为了完全重建亲本抗体的结合亲和力和特异性，可能需要将来自亲本抗体(即非人类抗体)的框架残基取代到人类框架域(回复突变)中。结构同源性建模可能有助于鉴定对抗体的结合特性重要的框架区中的氨基酸残基。因此，人源化抗体可以包含非人类CDR序列，主要是任选地包含非人类氨基酸序列的一个或多个氨基酸回复突变的人框架区和完整的人恒定区。任选地，可以应用不一定是回复突变的另外的氨基酸修饰来获得具有优选特征如亲和力和生物化学特性的人源化抗体。
本文使用的术语“人类抗体”是指具有来源于人类生殖系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人类抗体可以包括不由人类生殖系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性突变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，本文所用的术语“人类抗体”并不旨在包括这样的抗体，其中来源于另一哺乳动物物种如小鼠或大鼠的生殖系的CDR序列已被移植到人类框架序列中。人单克隆抗体可以通过多种技术产生，包括常规的单克隆抗体方法，例如Kohler和Milstein,Nature 256:495(1975)的标准体细胞杂交技术。尽管体细胞杂交程序是优选的，但原则上也可以采用其他生产单克隆抗体的技术，例如B淋巴细胞的病毒或致癌转化或使用人抗体基因文库的噬菌体展示技术。用于制备分泌人单克隆抗体的杂交瘤的合适的动物系统是鼠系统。在小鼠中产生杂交瘤是一种非常成熟的程序。用于分离免疫的脾细胞以用于融合的免疫方案和技术是本领域已知的。融合伴侣(例如，鼠骨髓瘤细胞)和融合程序也是已知的。因此，可以例如使用携带人免疫系统的一部分而不是小鼠或大鼠系统的转基因或转染色体小鼠或大鼠来产生人单克隆抗体。因此，在一些实施方案中，从携带人生殖系免疫球蛋白序列而不是动物免疫球蛋白序列的转基因动物如小鼠或大鼠获得人类抗体。在这样的实施方案中，抗体来源于引入动物中的人生殖系免疫球蛋白序列，但最终抗体序列是所述人生殖系免疫球蛋白序列通过内源性动物抗体机制被体细胞超突变和亲和力成熟进一步修饰的结果，参见例如，Mendez etal.1997Nat Genet.15(2):146-56。
当用于抗体的上下文中时，术语“全长”表示抗体不是片段，而是包含天然下通常发现的该同种型的特定同种型的所有结构域，例如IgG1抗体的VH、CH1、CH2、CH3、铰链、VL和CL结构域。
当在本文中使用时，除非与上下文矛盾，否则术语“Fc区”是指由免疫球蛋白重链的两个Fc序列组成的抗体区，其中所述Fc序列至少包括铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
如本文所使用的，在结合剂，例如抗体与预定抗原或表位结合的上下文中，术语“结合”或"能够结合”通常是指以对应于约10-7M或更小，如约10-8M或更小，如约10-9M或更小、约10-10M或更小，或者约10-11M或甚至更小的KD的亲和力结合，例如，当使用生物层干涉测量法(BLI)测定时、当在BIAcore 3000仪器中，使用抗原作为配体并使用结合剂作为分析物，使用表面等离子共振(SPR)技术测定时，或者当使用表达靶标(CLDN6)的细胞作为“配体”，使用石英晶体微天平系统测定时。在一些实施方案中，结合剂以对应于比其与除预定抗原或密切相关抗原之外的非特异性抗原(例如，BSA、酪蛋白)的结合亲和力低至少10倍，如低至少100倍，例如低至少1,000倍，如低至少10,000倍，例如低至少100,000倍的KD的亲和力结合预定的抗原。亲和力低出的量取决于结合剂的KD，使得当结合剂的KD非常低(即结合剂是高度特异性的)时，则抗原的亲和力低于对非特异性抗原的亲和力的程度可以是至少10,000倍。
本文中使用的术语“kd”(sec-1)是指特定结合剂-抗原相互作用的解离速率常数。所述值也被称为koff值。
本文中使用的术语"KD"(M)是指特定结合剂-抗原相互作用的解离平衡常数。
本发明还预期了包含本文所述的VL区、VH区或一种或多种CDRs的功能变体的结合剂。在结合剂的上下文中使用的VL、VH或CDR的功能变体仍然允许结合剂保留“参考”或“亲本”结合剂的亲和力和/或特异性/选择性的至少实质性的部分(至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多)，并且在一些情况下，这种结合剂可以以比亲本结合剂更大的亲和力、选择性和/或特异性结合。
这样的功能变体通常保留与亲本序列显著的序列同一性。
示例性变体包括主要通过保守取代与亲本序列的VH和/或VL和/或者CDR区不同的那些变体；例如，变体中多达10个，如9、8、7、6、5、4、3、2个或1个取代是保守的氨基酸残基取代。
本文所述序列的功能变体如VL区或VH区，或者与本文所述的序列具有某一程度的同源性或同一性的序列如VL区或VH区，优选地包含非CDR序列中的修饰或变异，而CDR序列优选地保持不变。
包含本文所述的重链和/或轻链可变区序列的变体的结合剂，例如，包含本文所述的CDRs中的修饰和/或某一程度的同一性的结合剂，可以与另一结合剂，例如包含本文所述重链和轻链可变区的结合剂竞争结合抗原，例如CD3和/或CLDN6，或者可以对另一种结合剂，例如包含本文所述的重链和轻链可变区的结合剂的抗原具有特异性。
除非与上下文相矛盾，否则本文中使用的术语“特异性”旨在具有以下含义。如果两种结合剂与相同的抗原和相同的表位结合，则它们具有“相同的特异性”。
术语“竞争(competes)”和“竞争(competition)”可指第一结合剂和第二结合剂对同一抗原的竞争。对本领域技术人员公知的是如何测试结合剂如抗体与靶抗原结合的竞争。这种方法的一个实例是所谓的交叉竞争测定，其可以例如作为ELISA或通过流式细胞术进行。可选地，可以使用生物层干涉测量法来确定竞争。
竞争与靶抗原结合的结合剂可以结合抗原上的不同表位，其中所述表位彼此非常接近，以至于与一个表位结合的第一结合剂阻止第二结合剂与另一表位结合。然而，在其他情况下，两种不同的结合剂可以结合抗原上的相同表位，并将在竞争结合测定中竞争结合。这种与相同表位结合的结合剂在本文中被认为具有相同的特异性。因此，在一些实施方案中，与相同表位结合的结合剂被认为与靶分子上的相同氨基酸结合。可以通过本领域技术人员已知的标准丙氨酸扫描实验或抗体-抗原结晶实验来确定结合剂与靶抗原上的相同表位结合。优选地，与不同表位结合的结合剂或结合域不相互竞争结合其各自的表位。
如上文所述，本领域已经描述了各种形式的抗体。本发明的结合剂原则上可以包含任何同种型的抗体序列。示例性的同种型是IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。可以使用人轻链恒定区κ或λ中的任一种。在一些实施方案中，本文所述的结合剂如CH1和CL的序列来源于IgG1同种型的抗体，例如IgG1、κ抗体。
优选地，每个抗原结合区或结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，并且其中所述可变区各自包含三个CDR序列，分别为CDR1、CDR2和CDR3，以及四个框架序列，分别为FR1、FR2、FR3和FR4。此外，优选地，本文所述的结合剂包含重链恒定区(CH)和轻链恒定区(CL)。
在本发明的上下文中，术语“结合剂”是指能够与一种或多种期望的抗原，例如CD3和CLDN6结合的任何试剂。术语“结合剂”包括抗体、抗体片段或任何其他结合蛋白，或者以上的任意组合。在一些实施方案中，结合蛋白包含抗体片段，如Fab和scFv。
天然存在的抗体通常是单特异性的，即它们与单一抗原结合。本发明提供了结合细胞毒性细胞如T细胞(通过接合CD3受体)和靶细胞如癌细胞(通过接合CLDN6)的结合剂。这种结合剂至少是双特异性的或多特异性的，如三特异性的、四特异性的等。在一些实施方案中，本文所述的结合剂是由两种不同抗体的片段组成的人工蛋白质(两种不同抗体的所述片段形成三个结合域)。
根据本发明，双特异性的结合剂，特别是双特异性的蛋白质，是具有两种不同结合特异性的分子，并因此可以与两种表位结合。特别地，本文所用的术语“双特异性的结合剂”包括抗体来源的分子，其包含三个抗原结合位点，第一结合位点对第一表位具有亲和力，并且第二结合位点和第三结合位点对与第一表位不同的第二表位具有结合亲和力。
在本发明的上下文中，术语“双特异性的”是指包含与不同表位，特别是不同抗原上的不同表位，例如CD3和CLDN6结合的两个不同抗原结合区的试剂。
“多特异性结合剂”是具有超过两种不同结合特异性的分子。
在一些实施方案中，本文所述的结合CD3和CLDN6的结合剂至少是三价的。如本文所用，“价的(valent)”、“价(valence)”、“价(valencies)”或其其他语法变体意指结合剂中抗原结合位点或结合域的数量。在一些实施方案中，本文所述的结合剂具有至少一个CD3的抗原结合位点或结合域和至少两个CLDN6的抗原结合位点或结合域。与相同抗原结合的抗原结合位点可以识别相同的表位或不同的表位。
在一些实施方案中，本文所述的结合剂是Fab-scFv2构建体的形式，即在Fab片段的恒定区的C端提供对CD3具有特异性的Fab片段，其具有对CLDN6具有特异性的两个scFv片段。在一些实施方案中，结合剂是由优选地通过二硫键桥结合在一起的两条多肽链组成的二聚体，其中第一多肽包含通过CH1多肽链连接到另外的VH结构域的scFv，并且第二多肽包含通过CL多肽链连接到另外的VL结构域上的scFv。二硫键桥优选地在CH1中的Cys残基和CL中的Cys残基之间形成，使得第一多肽的另外的VH与第二多肽的另外的VL以抗原结合构型结合，使得结合剂整体包括三个抗原结合域。因此，在一些实施方案中，结合剂包含Fab片段的重链(Fd片段)和轻链(L)，所述Fab片段能够异二聚化并且在其上掺入scFv结合域(优选地在Fd/L的C端)。在一些实施方案中，scFv部分中的VH和VL结构域通过肽接头和/或Fab链连接，并且scFv通过肽接头连接。在一些实施方案中，scFv部分中的VH和VL结构域通过包含氨基酸序列(G4S)x的肽接头连接，其中x是2、3、4、5或6。在一些实施方案中，Fab链和scFv通过包含氨基酸序列SGPG3RS(G4S)2或DVPG2S的肽接头连接。在一些实施方案中，包含氨基酸序列SGPG3RS(G4S)2的接头将scFv结合域连接到Fd片段，并且包含氨基酸序列DVPG2S的接头将scFv结合域连接到L片段。在一些实施方案中，scFv部分与CLDN6结合，并且Fab部分与CD3结合。
术语“接头”是指用于连接两个不同功能单元(例如抗原结合部分)的任何方式。接头的类型包括但不限于化学接头和多肽接头。多肽接头的序列不受限制。在一些实施方案中，多肽接头优选是非免疫原性和柔性的，如包含丝氨酸和甘氨酸序列的那些。取决于特定的构建体，接头可以是长的或短的。
在一些实施方案中，连接VH和VL结构域以形成VH-VL或VL-VH scFv结构域的接头优选包括柔性肽接头，如甘氨酸-丝氨酸肽接头。在一些实施方案中，接头包含氨基酸序列(G4S)x，其中x是2、3、4、5或6。在一些实施方案中，在VH-VL取向上包含VH和VL结构域的scFv结构域的情况下，接头包含氨基酸序列(G4S)4。在一些实施方案中，在VL-VH取向上包含VH和VL结构域的scFv结构域的情况下，接头包含氨基酸序列(G4S)5。
在一些实施方案中，优选在CH1的C端连接scFv结构域和Fd结构域的接头包含氨基酸序列DVPG2S或SGPG3RS(G4S)2，优选SGPG3RS(G4S)2。在一些实施方案中，优选在CL的C端连接scFv结构域和L结构域的接头优选包含氨基酸序列DVPG2S或SGPG3RS(G4S)2，优选DVPG2S。
结合剂还可以包含用于促进分子分泌的氨基酸序列，如N端分泌信号，以及/或者促进分子的结合、纯化或检测的一种或多种表位标签。
根据一些实施方案，本文所述的结合剂的每条多肽链都包含信号肽。
这样的信号肽是序列，其通常表现出约15-30个氨基酸的长度，并且优选位于多肽链的N端，但不限于此。本文定义的信号肽优选地允许多肽链，例如，如由RNA编码的，运输到定义的细胞隔室中，优选细胞表面、内质网(ER)或内体-溶酶体隔室。
如本文定义的信号肽序列包括但不限于免疫球蛋白的信号肽序列，例如，免疫球蛋白重链可变区的信号肽序列或免疫球蛋白轻链可变区的信号肽序列，其中所述免疫球蛋白可以是人免疫球蛋白。在一些实施方案中，信号肽序列是MHC分子，例如MHC I类分子的信号肽序列，其中所述MHC分子可以是人MHC分子(HLA分子)。
在一些实施方案中，分泌信号是允许充分通过分泌途径和/或将结合剂或其多肽链分泌到细胞外环境中的信号序列(例如，包含SEQ ID NO:4的氨基酸1-26的氨基酸序列)。在一些实施方案中，分泌信号序列是可切割的并且被从成熟结合剂中去除。在一些实施方案中，相对于其中产生结合剂的细胞或生物体来选择分泌信号序列。
在其他实施方案中，本文所述的结合剂连接或缀合到一种或多种治疗部分，如细胞因子、免疫抑制剂和/或免疫刺激分子。
在一些实施方案中，本文所述的结合剂包含Fab抗体片段，其包含第一结合域。在一些实施方案中，本文所述的结合剂包含两个scFv抗体片段，其包含共价连接到包含第一结合域的Fab抗体片段的第二和第三结合域。在一些实施方案中，结合剂包含共价连接到Fab抗体片段的每条链的C端的scFv抗体片段。
本文所述的结合剂的CH1和CL序列可以各自为任何同种型，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，并且可以包含一个或多个突变或修饰。在一些实施方案中，CH1和CL序列中的每一个都是IgG1同种型或自其衍生，任选地具有一个或多个突变或修饰。
在本发明的一些实施方案中，本文所述的结合剂不包含全长抗体。在本发明的一些实施方案中，本文所述的结合剂不包含抗体的CH2和CH3结构域。在本发明的一些实施方案中，本文所述的结合剂不包含Fc区。在本发明的一些实施方案中，本文所述的结合剂不包含能够发挥效应子功能的Fc序列。
在本发明的上下文中，术语“效应子功能”包括由免疫系统的组分介导的任何功能，其导致例如杀死患病细胞如肿瘤细胞，或者抑制肿瘤生长和/或抑制肿瘤发展，包括抑制肿瘤扩散和转移。优选地，在本发明的上下文中，效应子功能是T细胞介导的效应子功能。这样的功能包括ADCC、ADCP或CDC。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是细胞毒性效应细胞通过非吞噬细胞过程杀死抗体包被的靶细胞，其特征是释放细胞毒性颗粒的内容物或表达细胞死亡诱导分子。ADCC独立于免疫补体系统，该系统也裂解靶标，但不需要任何其他细胞。ADCC是通过靶标结合抗体(属于IgG或IgA或IgE类)与某些Fc受体(FcRs)，即存在于效应细胞表面上的与免疫球蛋白(Ig)的Fc区结合的糖蛋白的相互作用而触发的。介导ADCC的效应细胞包括自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和树突状细胞。ADCC是一种快速效应机制，其功效取决于许多参数(靶细胞表面上的抗原的密度和稳定性；抗体亲和力和FcR结合亲和力)。涉及人IgG1的ADCC是治疗性抗体最常用的IgG亚类，高度依赖于其Fc部分的糖基化特征和Fcγ受体的多态性。
抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)是许多抗体疗法的至关重要的作用机制之一。它被定义为一个高度调节的过程，通过这个过程，抗体经由将其Fc结构域连接到吞噬细胞上的特定受体，并引发吞噬作用，来清除结合的靶标。与ADCC不同，ADCP可由单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞通过FcγRIIa、FcγRI和FcγRIIIa来介导，其中巨噬细胞上的FcγRIIa(CD32a)代表主要的途径。
补体依赖性细胞毒性(CDC)是另一种可以由抗体介导的细胞杀伤方法。IgM是用于补体激活的最有效的同种型。IgG1和IgG3也都非常有效地经由经典的补体激活途径介导CDC。优选地，在该级联反应中，抗原-抗体复合物的形成导致在参与的抗体分子如IgG分子的CH2结构域上紧密相邻的多个C1q结合位点的揭开(C1q是补体C1的三个子组分之一)。优选地，这些揭开的C1q结合位点将先前低亲和力的C1q-IgG相互作用转化为高亲和力的相互作用，这触发涉及一系列其他补体蛋白的一连串事件，并导致效应细胞趋化/活化剂C3a和C5a的蛋白水解释放。优选地，补体级联以膜攻击复合物的形成结束，其在细胞膜中产生促进水和溶质自由进出细胞的孔。
在一些实施方案中，结合剂包含形成对CD3具有特异性的结合域和对CLDN6具有特异性的两个结合域的两条多肽链。在一些实施方案中，两条多肽链由两种RNA分子编码。在一些实施方案中，结合剂是由两条多肽链组成的二聚体，其中第一多肽包含对通过免疫球蛋白的重链的恒定区1(CH1)连接到另外的VH结构域的CLDN6具有特异性的scFv，并且第二多肽包含对通过免疫球蛋白的轻链的恒定区(CL)连接到另外的VL结构域的CLDN6具有特异性的scFv。在一些实施方案中，两条多肽链通过二硫键桥结合在一起。二硫键桥优选在CH1结构域中的Cys残基和CL结构域的Cys残余基之间形成，使得第一多肽的另外的VH结构域与第二多肽的另外的VL结构域以CD3结合构型结合，使得结合剂整体包括三个抗原结合域。在一些实施方案中，对CD3具有特异性的结合域由Fab片段组成，并且对CLDN6具有特异性的结合域各自均由scFv组成。在一些实施方案中，Fab片段的每条链连接到一个scFv，并且scFvs优选在Fab片段的C端连接。根据本发明，scFv部分中的VH和VL结构域优选通过肽接头连接，如包含氨基酸序列(G4S)4的肽接头，并且Fab链和scFv优选通过肽接头，如包含氨基酸序列SGPG3RS(G4S)2或DVPG2S的肽接头连接。
在一些实施方案中，结合剂包含：(i)第一多肽链，其包含来源于对CD3具有特异性的免疫球蛋白的重链的可变区(VH)(VH(CD3))、来源于对CLDN6具有特异性的免疫球蛋白的VH(VH(CLDN6))，以及来源于对CLDN6具有特异性的免疫球蛋白的轻链的可变区(VL)(VL(CLDN6))；以及(ii)第二多肽链，其包含来源于对CD3具有特异性的免疫球蛋白的轻链的可变区(VL)(VL(CD3))、来源于对CLDN6具有特异性的免疫球蛋白的VH(VH(CLDN6))，以及来源于对CLDN6具有特异性的免疫球蛋白的轻链的可变区(VL)(VL(CLDN6))。在一些实施方案中，第一多肽链与第二多肽链相互作用以形成结合剂。在一些实施方案中，第一多肽链的VH(CD3)和第二多肽链的VL(CD3)相互作用，以形成对CD3具有特异性的结合域。在一些实施方案中，第一多肽链的VH(CLDN6)和VL(CLDN6)相互作用，以形成对CLDN6具有特异性的结合域。在一些实施方案中，第二多肽链的VH(CLDN6)和VL(CLDN6)相互作用，以形成对CLDN6具有特异性的结合域。在一些实施方案中，第一和第二多肽链包含来源于免疫球蛋白的重链的恒定区1(CH1)或其功能变体和来源于免疫球蛋白的轻链的恒定区(CL)或其功能变体。在一些实施方案中，免疫球蛋白是IgG1。在一些实施方案中，IgG1是人IgG1。在一些实施方案中，第一多肽链上的VH、VL和CH1从N端到C端按以下顺序布置：
VH(CD3)-CH1-VH(CLDN6)-VL(CLDN6)，或者
VH(CD3)-CH1-VL(CLDN6)-VH(CLDN6)。
在一些实施方案中，CH1通过肽接头与VH(CLDN6)或VL(CLDN6)连接。在一些实施方案中，肽接头包含氨基酸序列SGPGGGRS(G4S)2或其功能变体。
在一些实施方案中，第二多肽链上的VH、VL和CL从N端到C端按以下顺序布置：
VL(CD3)-CL-VH(CLDN6)-VL(CLDN6)，或者
VL(CD3)-CL-VL(CLDN6)-VH(CLDN6)。
在一些实施方案中，CL通过肽接头与VH(CLDN6)或VL(CLDN6)连接。在一些实施方案中，肽接头包含氨基酸序列DVPGGS或其功能变体。
在一些实施方案中，VH(CLDN6)和VL(CLDN6)通过肽接头彼此连接。在一些实施方案中，肽接头包含氨基酸序列(G4S)x或其功能变体，其中x是2、3、4、5或6。在一些实施方案中，肽接头包含氨基酸序列(G4S)4或其功能变体。
在一些实施方案中，第一多肽链上的CH1与第二多肽链上的CL相互作用。
在一些实施方案中，CH1包含SEQ ID NO:4的氨基酸146-248的氨基酸序列或其功能变体。
在一些实施方案中，CL包含SEQ ID NO:6的氨基酸133-239的氨基酸序列或其功能变体。
在一些实施方案中，VH(CD3)包含SEQ ID NO:4的氨基酸27-145的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3(分别为SEQ ID NO:18、19和20)。在一些实施方案中，VH(CD3)包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1包含氨基酸序列GYTFTRYT或其功能变体，所述CDR2包含氨基酸序列INPSRGYT或其功能变体，所述CDR3包含氨基酸序列ARYYDDHYSLDY或ARYYDDHYCLDY或者其功能变体。在一些实施方案中，VH(CD3)包含SEQ ID NO:4的氨基酸27-145的氨基酸序列或其功能变体。
在一些实施方案中，VL(CD3)包含SEQ ID NO:6的氨基酸27-132的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3(分别为SEQ ID NO:22、23和24)。在一些实施方案中，VL(CD3)包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1包含氨基酸序列SSVSY或其功能变体，所述CDR2包含氨基酸序列DTS或其功能变体，所述CDR3包含氨基酸序列QQWSSNPLT或其功能变体。在一些实施方案中，VL(CD3)包含SEQ ID NO:6的氨基酸27-132的氨基酸序列或其功能变体。
在一些实施方案中，VH(CLDN6)包含SEQ ID NO:4的氨基酸267-383的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3(分别为SEQ ID NO:25、26和27)。在一些实施方案中，VH(CLDN6)包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1包含氨基酸序列GYSFTGYT或其功能变体，所述CDR2包含氨基酸序列INPYNGGT或其功能变体，所述CDR3包含氨基酸序列ARDYGFVLDY或其功能变体。在一些实施方案中，VH(CLDN6)包含SEQ ID NO:4的氨基酸267-383的氨基酸序列或其功能变体。
在一些实施方案中，VL(CLDN6)包含SEQ ID NO:4的氨基酸404-510的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3(分别为SEQ ID NO:28、29和30)。在一些实施方案中，VL(CLDN6)包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1包含氨基酸序列SSVSY或其功能变体，所述CDR2包含氨基酸序列STS或其功能变体，所述CDR3包含氨基酸序列QQRSNYPPWT或其功能变体。在一些实施方案中，VL(CLDN6)包含SEQ ID NO:4的氨基酸404-510的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3，以及在相对于CDR1的位置+15中的丝氨酸残基(对应于SEQ ID NO:4的位置449)。在一些实施方案中，VL(CLDN6)包含SEQ ID NO:4的氨基酸404-510的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3，以及在相对于CDR2的位置-3中的丝氨酸残基(对应于SEQ ID NO:4的位置449)。在一些实施方案中，VL(CLDN6)包含SEQ ID NO:4的氨基酸404-510的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3、与SEQ ID NO:4的氨基酸404-510的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的序列，以及在对应于SEQ ID NO:4的位置449的位置中的丝氨酸残基。在一些实施方案中，VL(CLDN6)包含SEQ ID NO:4的氨基酸404-510的氨基酸序列或其功能变体。
在相对于CDR1的位置+15中的丝氨酸残基意指在CDR1结束之后的第15个氨基酸位置是丝氨酸残基。在相对于CDR2的位置-3中的丝氨酸残基意指在CDR2开始之前的第三个氨基酸是丝氨酸。这些可以例如分别通过下式表示(N到C)：XXXXX–Y14–S和S–Y2–ZZZ，其中X代表CDR1氨基酸，Y代表介于CDRs之间的氨基酸，S代表丝氨酸残基，并且Z代表CDR2氨基酸。
在一些实施方案中，VH(CD3)包含SEQ ID NO:4的氨基酸27-145的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3，VL(CD3)包含SEQ ID NO:6的氨基酸27-132的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3，VH(CLDN6)包含SEQ ID NO:4的氨基酸267-383的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3，并且VL(CLDN6)包含SEQ ID NO:4的氨基酸404-510的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3，并且优选地VL(CLDN6)包含在相对于CDR1的位置+15(对应于SEQ ID NO:4的位置449)中的丝氨酸残基和/或在相对于CDR2的位置-3(对应于SEQ ID NO:4的位置449)中的丝氨酸残基。
在一些实施方案中，VH(CD3)包含SEQ ID NO:4的氨基酸27-145的氨基酸序列或其功能变体，VL(CD3)包含SEQ ID NO:6的氨基酸27-132的氨基酸序列或其功能变体，VH(CLDN6)包含SEQ ID NO:4的氨基酸267-383的氨基酸序列或其功能变体，和/或VL(CLDN6)包含SEQ ID NO:4的氨基酸404-510的氨基酸序列或其功能变体。
在一些实施方案中，第一多肽链包含SEQ ID NO:4的氨基酸27-510的氨基酸序列、与SEQ ID NO:4的氨基酸27-510的氨基酸序列或SEQ ID NO:4的氨基酸27-510的氨基酸序列的功能片段具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:4的氨基酸27-510的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一多肽链包含SEQ IDNO:4的氨基酸27-510的氨基酸序列。
在这些和其他的实施方案中，编码第一多肽链的RNA包含SEQ ID NO:5的核苷酸132-1583的核苷酸序列、与SEQ ID NO:5的核苷酸132-1583的核苷酸序列或SEQ ID NO:5的核苷酸132-1583的核苷酸序列的功能片段具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:5的核苷酸132-1583的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码第一多肽链的RNA包含SEQ ID NO:5的核苷酸132-1583的核苷酸序列。
在一些实施方案中，第二多肽链包含SEQ ID NO:6的氨基酸27-489的氨基酸序列、与SEQ ID NO:6的氨基酸27-489的氨基酸序列或SEQ ID NO:6的氨基酸27-489的氨基酸序列的功能片段具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:6的氨基酸27-489的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二多肽链包含SEQ IDNO:6的氨基酸27-489的氨基酸序列。
在这些和其他的实施方案中，编码第二多肽链的RNA包含SEQ ID NO:7的核苷酸132-1520的核苷酸序列、与SEQ ID NO:7的核苷酸132-1520的核苷酸序列或SEQ ID NO:7的核苷酸132-1520的核苷酸序列的功能片段具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:7的核苷酸132-1520的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码第二多肽链的RNA包含SEQ ID NO:7的核苷酸132-1520的核苷酸序列。
在一些实施方案中，(i)第一多肽链包含SEQ ID NO:4的氨基酸27-510的氨基酸序列、与SEQ ID NO:4的氨基酸27-510的氨基酸序列或SEQ ID NO:4的氨基酸27-510的氨基酸序列的功能片段具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:4的氨基酸27-510的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，并且(ii)第二多肽链包含SEQ ID NO:6的氨基酸27-489的氨基酸序列、与SEQ ID NO:6的氨基酸27-489的氨基酸序列或SEQ ID NO:6的氨基酸27-489的氨基酸序列的功能片段具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:6的氨基酸27-489的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一多肽链包含SEQ ID NO:4的氨基酸27-510的氨基酸序列，并且第二多肽链包含SEQ IDNO:6的氨基酸27-489的氨基酸序列。
在这些和其他的实施方案中，(i)编码第一多肽链的RNA包含SEQ ID NO:5的核苷酸132-1583的核苷酸序列、与SEQ ID NO:5的核苷酸132-1583的核苷酸序列或SEQ ID NO:5的核苷酸132-1583的核苷酸序列的功能片段具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:5的核苷酸132-1583的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，并且(ii)编码第二多肽链的RNA包含SEQ ID NO:7的核苷酸132-1520的核苷酸序列、与SEQ ID NO:7的核苷酸132-1520的核苷酸序列或SEQ ID NO:7的核苷酸132-1520的核苷酸序列的功能片段具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，或者与SEQ IDNO:7的核苷酸132-1520的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码第一多肽链的RNA包含SEQ ID NO:5的核苷酸132-1583的核苷酸序列，并且编码第二多肽链的RNA包含SEQ ID NO:7的核苷酸132-1520的核苷酸序列。
根据一些实施方案，信号肽直接或通过接头融合至本文所述的多肽链。因此，在一些实施方案中，信号肽融合至上述氨基酸序列。
在一些实施方案中，信号序列包含SEQ ID NO:4的氨基酸1-26的氨基酸序列、与SEQ ID NO:4的氨基酸1-26的氨基酸序列或SEQ ID NO:4的氨基酸1-26的氨基酸序列的功能片段具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:4的氨基酸1-26的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，信号序列包含SEQ ID NO:4的氨基酸1-26的氨基酸序列。
在这些和其他的实施方案中，编码信号序列的RNA(i)包含SEQ ID NO:5的核苷酸54-131的核苷酸序列、与SEQ ID NO:5的核苷酸54-131的核苷酸序列或SEQ ID NO:5的核苷酸54-131的核苷酸序列的功能片段具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:5的核苷酸54-131的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码信号序列的RNA包含SEQ ID NO:5的核苷酸54-131的核苷酸序列。
在一些实施方案中，第一多肽链包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列、与SEQ ID NO:4的氨基酸序列或SEQ ID NO:4的氨基酸序列的功能片段具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一多肽链包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在这些和其他的实施方案中，编码第一多肽链的RNA包含SEQ ID NO:5的核苷酸54-1583的核苷酸序列、与SEQ ID NO:5的核苷酸54-1583的核苷酸序列或SEQ ID NO:5的核苷酸54-1583的核苷酸序列的功能片段具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:5的核苷酸54-1583的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码第一多肽链的RNA包含SEQ ID NO:5的核苷酸54-1583的核苷酸序列。
在其他实施方案中，编码第一多肽链的RNA包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列、与SEQID NO:5的核苷酸序列或SEQ ID NO:5的核苷酸序列的功能片段具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:5的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码第一多肽链的RNA包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列。
在一些实施方案中，第二多肽链包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列、与SEQ ID NO:6的氨基酸序列或SEQ ID NO:6的氨基酸序列的功能片段具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二多肽链包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
在这些和其他的实施方案中，编码第二多肽链的RNA包含SEQ ID NO:7的核苷酸54-1520的核苷酸序列、与SEQ ID NO:7的核苷酸54-1520的核苷酸序列或SEQ ID NO:7的核苷酸54-1520的核苷酸序列的功能片段具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:7的核苷酸54-1520的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码第二多肽链的RNA包含SEQ ID NO:7的核苷酸54-1520的核苷酸序列。
在其他实施方案中，编码第二多肽链的RNA包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列、与SEQID NO:7的核苷酸序列或SEQ ID NO:7的核苷酸序列的功能片段具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:7的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码第二多肽链的RNA包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列。
在一些实施方案中，(i)第一多肽链包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列、与SEQ IDNO:4的氨基酸序列或SEQ ID NO:4的氨基酸序列的功能片段具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，并且(ii)第二多肽链包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列、与SEQ ID NO:6的氨基酸序列或SEQ ID NO:6的氨基酸序列的功能片段具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一多肽链包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，并且第二多肽链包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
在这些和其他的实施方案中，(i)编码第一多肽链的RNA包含SEQ ID NO:5的核苷酸54-1583的核苷酸序列、与SEQ ID NO:5的核苷酸54-1583的核苷酸序列或SEQ ID NO:5的核苷酸54-1583的核苷酸序列的功能片段具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:5的核苷酸54-1583的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，并且(ii)编码第二多肽链的RNA包含SEQ ID NO:7的核苷酸54-1520的核苷酸序列、与SEQ ID NO:7的核苷酸54-1520的核苷酸序列或SEQ ID NO:7的核苷酸54-1520的核苷酸序列的功能片段具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:7的核苷酸54-1520的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码第一多肽链的RNA包含SEQ ID NO:5的核苷酸54-1583的核苷酸序列，并且编码第二多肽链的RNA包含SEQ ID NO:7的核苷酸54-1520的核苷酸序列。
在其他实施方案中，(i)编码第一多肽链的RNA包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列、与SEQ ID NO:5的核苷酸序列或SEQ ID NO:5的核苷酸序列的功能片段具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:5的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，并且(ii)编码第二多肽链的RNA包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列、与SEQ ID NO:7的核苷酸序列或SEQID NO:7的核苷酸序列的功能片段具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:7的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码第一多肽链的RNA包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列，并且编码第二多肽链的RNA包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列。
在一些实施方案中，结合剂结合CLDN6的胞外结构域。在一些实施方案中，结合剂结合活细胞表面上存在的CLDN6的天然表位。在一些实施方案中，结合剂结合CLDN6的第一胞外环。
本文所述的结合剂对CLDN6是特异性的，即其具有结合CLDN6的能力，即结合存在于CLDN6中的表位，优选地位于CLDN6的胞外结构域内的表位，特别是第一胞外环，优选CLDN6的氨基酸位置28-76或29-81，或者第二胞外环，优选CLDN6的氨基酸位置141-159的能力。在一些实施方案中，具有与CLDN6结合的能力的试剂与不存在于CLDN9上的CLDN6上的表位结合。在一些实施方案中，具有与CLDN6结合的能力的试剂与不存在于CLDN4和/或CLDN3上的CLDN6上的表位结合。在一些实施方案中，具有与CLDN6结合的能力的试剂与不存在于除CLDN6以外的claudin蛋白上的CLDN6上的表位结合。
在一些实施方案中，具有结合CLDN6的能力的试剂优选结合CLDN6但不结合CLDN9，并且优选地不结合CLDN4和/或CLDN3。在一些实施方案中，具有结合CLDN6的能力的试剂结合在细胞表面上表达的CLDN6。在一些实施方案中，具有与CLDN6结合能力的试剂与存在于活细胞表面上的CLDN6的天然表位结合。
术语“在细胞表面上表达”或“与细胞表面相关”意指诸如抗原的分子与细胞质膜相关并位于细胞质膜处，其中分子的至少一部分面向所述细胞的细胞外空间，并且可以从所述细胞外部接近，例如通过位于细胞外部的抗体接近。在该上下文中，一部分优选为至少4个，优选为至少8个，优选为至少12个，更优选为至少20个氨基酸。这种关联可以是直接的或间接的。例如，该结合可以是通过一个或多个跨膜结构域、一个或多个脂质锚定物，或者通过与任何其他蛋白质、脂质、糖或可以在细胞质膜的外小叶上发现的其他结构的相互作用。例如，与细胞表面相关的分子可以是具有细胞外部分的跨膜蛋白，或者可以是通过与作为跨膜蛋白的另一蛋白相互作用而与细胞表面相关联的蛋白。
“细胞表面”或“细胞的表面”是根据其在本领域的通常含义使用的，并因此包括可被蛋白质和其他分子接近而结合的细胞外部。如果抗原位于所述细胞的表面并且可被例如添加到细胞中的抗原特异性抗体接近而结合，则抗原在细胞的表面上表达。
在本发明的上下文中，术语“细胞外部分”或“外结构域”是指分子如蛋白质的一部分，其面向细胞的细胞外空间，并且优选地可从所述细胞的外部接近，例如通过位于细胞外部的结合分子如抗体。优选地，该术语是指一个或多个细胞外环或结构域或以上的片段。
核酸
本文中使用的术语“多核苷酸”或“核酸”旨在包括DNA和RNA，如基因组DNA、cDNA、mRNA、重组产生和化学合成的分子。核酸可以是单链的或双链的。RNA包括体外转录的RNA(IVT RNA)或合成的RNA。根据本发明，多核苷酸优选是分离的。
核酸可以包含在载体中。本文所用的术语“载体”包括技术人员已知的任何载体，包括质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体如λ噬菌体、病毒载体如逆转录病毒、腺病毒或杆状病毒载体或人工染色体载体如细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)或P1人工染色体(PAC)。所述载体包括表达以及克隆载体。表达载体包含质粒以及病毒载体，并且通常含有用于在特定宿主生物体(例如细菌、酵母、植物、昆虫或哺乳动物)中或在体外表达系统中表达可操作连接的编码序列所需的期望的编码序列和适当的DNA序列。克隆载体通常用于改造和扩增某一期望的DNA片段，并且可能缺乏用于表达期望DNA片段所需的功能序列。
在本发明所有方面的一些实施方案中，本文所述的编码结合剂，例如双特异性或多特异性结合剂的RNA在被治疗对象的细胞(例如，肝细胞)中表达，以提供结合剂。
本文所述的核酸可以是重组和/或分离的分子。
在本公开中，术语“RNA”涉及包括核糖核苷酸残基的核酸分子。在优选实施方案中，RNA包含全部或大部分的核糖核苷酸残基。如本文所用，“核糖核苷酸”是指在β-D-呋喃核糖基的2'位置处具有羟基的核苷酸。RNA包括但不限于双链RNA、单链RNA、分离的RNA如部分纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA，以及通过添加、缺失、取代和/或改变一个或多个核苷酸而不同于天然存在的RNA的修饰的RNA。这种改变可能是指将非核苷酸物质添加到内部RNA核苷酸或RNA的末端。本文还预期了RNA中的核苷酸可以是非标准核苷酸，如化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。对于本公开，这些改变的RNAs被认为是天然存在的RNA的类似物。
在本公开的一些实施方案中，RNA是信使RNA(mRNA)，其涉及编码肽或蛋白质的RNA转录物。如本领域中所确立的，mRNA通常包含5'未翻译区(5'-UTR)、肽编码区和3'未翻译区(3'-UTR)。在一些实施方案中，RNA通过体外转录或化学合成产生。在一些实施方案中，通过体外转录，使用DNA模板产生mRNA，其中DNA是指含有脱氧核糖核苷酸的核酸。
在本公开的一些实施方案中，RNA是“复制子RNA”或简单地“复制子”，特别是“自复制RNA”或“自扩增RNA”。在一项特别优选的实施方案中，复制子或自复制RNA来源于或包含来源于ssRNA病毒，特别是正链ssRNA病毒如α病毒的元件。α病毒是正链RNA病毒的典型代表。α病毒在受感染细胞的细胞质中复制(关于α病毒生命周期的综述参见Joséet al.,Future Microbiol.,2009,第4卷,第837–856页)。许多α病毒的总基因组长度通常在11,000和12,000个核苷酸之间的范围内，并且基因组RNA通常具有5’帽和3’多聚(A)尾。α病毒的基因组编码非结构蛋白(参与病毒RNA的转录、修饰和复制以及蛋白质修饰)和结构蛋白(形成病毒颗粒)。基因组中通常存在两个开放阅读框(ORFs)。四种非结构蛋白(nsP1–nsP4)通常由第一ORF一起编码，该第一ORF起始于基因组的5′端附近，而α病毒结构蛋白由第二ORF一起编码，该第二ORF被发现于第一ORF的下游，并在基因组的3′端附近延伸。通常，第一ORF大于第二ORF，比例大约为2:1。在被α病毒感染的细胞中，只有编码非结构蛋白的核酸序列从基因组RNA中翻译，而编码结构蛋白的遗传信息可从亚基因组转录物中翻译，亚基因组转录物是一种类似于真核信使RNA的RNA分子(mRNA；Gould et al.,2010,Antiviral Res.,第87卷第111–124页)。感染后，即在病毒生命周期的早期阶段，(+)链基因组RNA直接像信使RNA一样起作用，以用于翻译编码非结构多聚蛋白(nsP1234)的开放阅读框。已经提出了用于将外来遗传信息递送到靶细胞或靶生物体中的α病毒来源的载体。在简单的方法中，编码α病毒结构蛋白的开放阅读框被编码目标蛋白质的开放阅读框取代。基于α病毒的反式复制(trans-replication)系统依赖于两个单独的核酸分子上的α病毒核苷酸序列元件：一个核酸分子编码病毒复制酶，并且另一个核酸分子能够被所述复制酶以反式复制(因此被称为反式复制系统)。反式复制需要在给定的宿主细胞中存在这两种核酸分子。能够被复制酶反式复制的核酸分子必须包含某些α病毒序列元件，以允许α病毒复制酶识别和合成RNA。
在一些实施方案中，本文所述的RNA可以具有修饰的核苷。在一些实施方案中，RNA包含取代至少一个(例如，每个)尿苷的修饰的核苷。
本文使用的术语“尿嘧啶”描述了可以存在于RNA的核酸中的核碱基之一。尿嘧啶的结构是：
本文中使用的术语“尿苷”描述了可以存在于RNA中的核苷之一。尿苷的结构是：
UTP(尿苷5’-三磷酸酯)具有以下结构：
假-UTP(假尿苷5’-三磷酸酯)具有以下结构：
“假尿苷”是修饰的核苷的一个实例，它是尿苷的异构体，其中尿嘧啶经由碳-碳键而不是氮-碳糖苷键附接到戊糖环上。
另一示例性的修饰的核苷是N1-甲基-假尿苷(m1Ψ)，其具有以下结构：
N1-甲基-假-UTP具有以下结构：
另一示例性的修饰的核苷是5-甲基-尿苷(m5U)，其具有以下结构：
在一些实施方案中，本文所述的RNA中的一个或多个尿苷被修饰的核苷取代。在一些实施方案中，修饰的核苷是修饰的尿苷。
在一些实施方案中，RNA包含取代至少一个尿苷的修饰的核苷。在一些实施方案中，RNA包含取代每个尿苷的修饰的核苷。
在一些实施方案中，修饰的核苷独立地选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方案中，修饰的核苷包括假尿苷(ψ)。在一些实施方案中，修饰的核苷包括N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在一些实施方案中，修饰的核苷包括5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方案中，RNA可以包含多于一种类型的修饰的核苷，并且所述修饰的核苷独立地选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方案中，修饰的核苷包括假尿苷(ψ)和N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在一些实施方案中，修饰的核苷包括假尿苷(ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方案中，修饰的核苷包括N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方案中，修饰的核苷包括假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。
在一些实施方案中，RNA中取代一个或多个，例如全部尿苷的修饰的核苷可以是以下中的任何一种或多种：3-甲基-尿苷(m3U)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-氮杂-尿苷、6-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-尿苷(s2U)、4-硫代-尿苷(s4U)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基-尿苷(ho5U)、5-氨基烯丙基-尿苷、5-卤代-尿苷(例如，5-碘代-尿苷或5-溴代-尿苷)、尿苷5-氧乙酸(cmo5U)、尿苷5-氧乙酸甲酯(mcmo5U)、5-羧甲基-尿苷(cm5U)、1-羧甲基-假尿苷、5-羧基羟基甲基-尿苷(chm5U)、5-羧基羟基甲基-尿苷甲酯(mchm5U)、5-甲氧基羰基甲基-尿苷(mcm5U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代-尿苷(mcm5s2U)、5-氨基甲基-2-硫代-尿苷(nm5s2U)、5-甲基氨基甲基-尿苷(mnm5U)、1-乙基-假尿苷、5-甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(mnm5s2U)、5-甲基氨基甲基-2-硒基-尿苷(mnm5se2U)、5-氨基甲酰基甲基-尿苷(ncm5U)、5-羧甲基氨基甲基-尿苷(cmnm5U)、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(cmnm5s2U)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-尿苷(τm5U)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷(τm5s2U)、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷)、5-甲基-2-硫代-尿苷(m5s2U)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷(D)、二氢假尿苷、5,6-二氢尿苷、5-甲基-二氢尿苷(m5D)、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷(acp3U)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基氨基甲基)尿苷(inm5U)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫代-尿苷(inm5s2U)、α-硫代-尿苷、2′-O-甲基-尿苷(Um)、5,2′-O-二甲基-尿苷(m5Um)、2′-O-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫代-2′-O-甲基-尿苷(s2Um)、5-甲氧基羰基甲基-2′-O-甲基-尿苷(mcm5Um)、5-氨基甲酰基甲基-2′-O-甲基-尿苷(ncm5Um)、5-羧甲基氨基甲基-2′-O-甲基-尿苷(cmnm5Um)、3,2′-O-二甲基-尿苷(m3Um)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2′-O-甲基-尿苷(inm5Um)、1-硫代-尿苷、二脱氧胸苷、2′-F-阿糖尿苷、2′-F-尿苷,2′-OH-阿糖尿苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷、5-[3-(1-E-丙烯基氨基)尿苷，或者本领域已知的任何其他修饰的尿苷。
在一些实施方案中，RNA包含其他修饰的核苷或包含其他修饰的核苷，例如，修饰的胞苷。例如，在一些实施方案中，在RNA中，5-甲基胞苷被胞苷部分或完全地取代，优选完全取代。在一些实施方案中，RNA包含5-甲基胞苷和选自以下中的一种或多种：假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方案中，RNA包含5-甲基胞苷和N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在一些实施方案中，RNA包含取代每个胞苷的5-甲基胞苷和取代每个尿苷的N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。
在一些实施方案中，根据本公开的RNA包含5’帽。在一些实施方案中，本公开的RNA不具有未加帽的5'-三磷酸酯。在一些实施方案中，RNA可以被5'-帽类似物修饰。术语"5’帽"是指在mRNA分子的5'端上发现的结构，并且通常由经由5'-至5'-三磷酸酯链接连接到mRNA的鸟苷核苷酸组成。在一些实施方案中，该鸟苷在7-位置处被甲基化。提供具有5’帽或5’帽类似物的RNA可以通过体外转录来实现，其中5’帽被共转录表达到RNA链中，或者可以使用加帽酶在转录后附接到RNA上。
在一些实施方案中，RNA的组成部分帽是m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG(有时也称为m2 7,3` OG(5’)ppp(5’)m2’-OApG)，其具有以下结构：
以下是示例性的Cap1 RNA，其包含RNA和m2 7,3`OG(5’)ppp(5’)m2’-OApG：
以下是另一示例性的Cap1 RNA(无帽类似物)：
在一些实施方案中，在一些实施方案中，使用具有以下结构的帽类似物抗反向帽(ARCA帽(m2 7,3`OG(5’)ppp(5’)G))，用"Cap0"结构修饰RNA：
以下是示例性的Cap0 RNA，其包含RNA和m2 7,3`OG(5’)ppp(5’)G：
在一些实施方案中，使用具有以下结构的帽类似物β-S-ARCA(m2 7,2`OG(5’)ppSp(5’)G)生成"Cap0"结构：
以下是示例性的Cap0 RNA，其包含β-S-ARCA(m2 7,2`OG(5’)ppSp(5’)G)和RNA：
β-S-ARCA的“D1”非对映异构体或"β-S-ARCA(D1)"是β-S-ARCA的非对映异构体，其与β-S-ARCA的D2非对映异构体(β-S-ARCA(D2))相比，其首先在HPLC柱上洗脱，并因此表现出更短的保留时间(参见WO 2011/015347，通过引用并入本文中)。
特别优选的帽是m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG。在一些实施方案中，本文所述的RNA序列(例如，SEQ ID NO:5和/或7)被用m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG加帽。在一些实施方案中，帽的ApG对应于本文所述的RNA序列的两个5'核苷酸。
在一些实施方案中，根据本公开的RNA包含5'-UTR和/或3'-UTR。术语“未翻译区”或“UTR”涉及DNA分子中被转录但未翻译成氨基酸序列的区域，或者涉及RNA分子如mRNA分子中的相应区域。未翻译区(UTR)可以存在于开放阅读框的5'(上游)(5'-UTR)和/或开放阅读框的3'(下游)(3'-UTR。5'-UTR(如果存在)位于蛋白质编码区的起始密码子上游的5'端。5'-UTR位于5’帽的下游(如果存在)，例如直接与5’帽相邻。3'-UTR(如果存在)位于蛋白质编码区的终止密码子下游的3'端，但术语"3'-UTR"优选不包括多聚(A)序列。因此，3'-UTR在多聚(A)序列的上游(如果存在)，例如直接与多聚(A)序列相邻。
在一些实施方案中，RNA包含5'-UTR，其包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列或与SEQID NO:8的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，RNA包含3'-UTR，其包含SEQ ID NO:9的核苷酸序列或与SEQID NO:9的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
特别优选的5'-UTR包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列。特别优选的3'-UTR包含SEQID NO:9的核苷酸序列。
在一些实施方案中，根据本公开的RNA包含3'-多聚(A)序列。
如本文所用，术语"多聚(A)序列"或"多聚A尾"是指腺苷酸残基的不间断或间断序列，其通常位于RNA分子的3'端。多聚(A)序列是本领域技术人员已知的，并且可以遵循本文所述RNAs中的3’-UTR。不间断的多聚(A)序列的特征在于连续的腺苷酸残基。在天然下，不间断的多聚(A)序列是典型的。本文公开的RNAs可以具有在转录后通过模板非依赖性RNA聚合酶附接到RNA的游离3'端的多聚(A)序列，或者由DNA编码并由模板依赖性RNA聚合酶转录的多聚(A)序列。
已经证明，约120个A核苷酸的多聚(A)序列对转染的真核细胞中的RNA水平以及从多聚(A)序列上游(5’)存在的开放阅读框翻译的蛋白质水平具有有益影响(Holtkamp etal.,2006,Blood,第108卷,第4009-4017页)。
多聚(A)序列可以具有任何长度。在一些实施方案中，多聚(A)序列包含至少20个、至少30个、至少40个、至少80个或至少100个，并且至多500个、至多400个、至多300个、至多200个或至多150个A核苷酸，并且特别地，约120个A核苷酸、基本上由至少20个、至少30个、至少40个、至少80个或至少100个，并且至多500个、至多400个、至多300个、至多200个或至多150个A核苷酸，并且特别地，约120个A核苷酸组成，或者由至少20个、至少30个、至少40个、至少80个或至少100个，并且至多500个、至多400个、至多300个、至多200个或至多150个A核苷酸，并且特别地，约120个A核苷酸组成。在该上下文中，"基本上由…组成"意指多聚(A)序列中的大多数核苷酸，通常为多聚(A)序列中按核苷酸数量的至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％是A核苷酸，但允许保留核苷酸除A核苷酸以外的核苷酸，如U核苷酸(尿苷酸)、G核苷酸(鸟苷酸)或C核苷酸(胞苷酸)。在该上下文中，"由…组成"意指多聚(A)序列中的所有核苷酸，即多聚(A)序列中按核苷酸数量的100％是A核苷酸。术语"A核苷酸"或"A"是指腺苷酸。
在一些实施方案中，基于在与编码链互补的链中包含重复dT核苷酸(脱氧胸苷酸)的DNA模板，在RNA转录期间，例如在制备体外转录的RNA期间，附接上多聚(A)序列。编码多聚(A)序列的DNA序列(编码链)被称为多聚(A)盒。
在一些实施方案中，存在于DNA的编码链中的多聚(A)盒基本上由dA核苷酸组成，但被四种核苷酸(dA、dC、dG和dT)的随机序列中断。这种随机序列的长度可以是5-50个、10-30个或10-20个核苷酸。在WO 2016/005324A1中公开了这样的盒，其在此通过引用并入本文中。WO 2016/005324A1中公开的任何多聚(A)盒都可以用于本发明。还包括多聚(A)盒，其基本上由dA核苷酸组成，但被具有四种核苷酸(dA、dC、dG、dT)的相等分布并具有例如5-50个核苷酸长度的随机序列中断，其在DNA水平上显示质粒DNA在大肠杆菌(E.coli)中的恒定增殖，并且在RNA水平上，仍然与关于支持RNA稳定性和翻译效率的有益特性相关。因此，在一些实施方案中，本文所述的RNA分子中包含的多聚(A)序列基本上由A核苷酸组成，但被四种核苷酸(A、C、G、U)的随机序列中断。这种随机序列的长度可以是5-50个、10-30个或10-20个核苷酸。
在一些实施方案中，多聚(A)序列在其3'端侧翼没有除A核苷酸以外的核苷酸，即所述多聚(A)序列在其3'端未被除A以外的核苷酸掩蔽或者其后不是除A以外的核苷酸。
在一些实施方案中，多聚(A)序列可以包含至少20个、至少30个、至少40个、至少80个或至少100个，且至多500个、至多400个、至多300个、至多200个或至多150个核苷酸。在一些实施方案中，多聚(A)序列基本上可以由至少20个、至少30个、至少40个、至少80个或至少100个，且至多500个、至多400个、至多300个、至多200个或至多150个核苷酸组成。在一些实施方案中，多聚(A)序列可以由至少20个、至少30个、至少40个、至少80个或至少100个，且至多500个、至多400个、至多300个、至多200个或至多150个核苷酸组成。在一些实施方案中，多聚(A)序列包含至少100个核苷酸。在一些实施方案中，多聚(A)序列包含约150个核苷酸。在一些实施方案中，多聚(A)序列包含约120个核苷酸。
在一些实施方案中，RNA包含多聚(A)序列，其包含SEQ ID NO:10的核苷酸序列或与SEQ ID NO:10的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
特别优选的多聚(A)序列包含SEQ ID NO:10的核苷酸序列。
根据本公开，结合剂优选作为单链的、5’加帽的mRNA给药，所述mRNA在进入被给予所述RNA的对象的细胞后被翻译成相应的蛋白质。优选地，RNA包含结构元件，所述结构元件针对RNA关于稳定性和翻译效率的最大功效进行了优化(5’帽、5'-UTR、3'-UTR、多聚(A)序列)。
在一些实施方案中，m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG被用作RNA的5'端的特异性加帽结构。在一些实施方案中，5'-UTR序列来源于人类α-珠蛋白mRNA，并且任选地具有优化的‘Kozak序列’以提高翻译效率。在一些实施方案中，来源于“分裂氨基端增强子(amino terminalenhancer of split)”(AES)mRNA(称为F)和线粒体编码的12S核糖体RNA(称为I)的两个序列元件(FI元件)的组合被置于编码序列和多聚(A)序列之间，以确保较高的最大蛋白质水平和延长的mRNA持久性。这些是通过赋予RNA稳定性和增加总蛋白表达的序列的离体选择过程来鉴定的(参见WO 2017/060314，通过引用并入本文中)。在一些实施方案中，使用了多聚(A)序列，其长度测量为110个核苷酸，由30个腺苷残基的延伸组成，后面是10个核苷酸的接头序列和另外70个腺苷残基。该多聚(A)序列被设计为增强RNA稳定性和翻译效率。
在本发明的所有方面的一些实施方案中，编码结合剂的RNA在被处理以提供结合剂的对象的细胞，例如肝细胞中表达。在本发明的所有方面的一些实施方案中，RNA在对象的细胞中瞬时表达。在本发明的所有方面的一些实施方案中，RNA是体外转录的RNA。在本发明的所有方面的一些实施方案中，结合剂的表达在细胞外空间中，即结合剂被分泌。在本发明的所有方面的一些实施方案中，结合剂的表达在血流中。
在本公开的上下文中，术语“转录”涉及一种过程，其中DNA序列中的遗传密码被转录成RNA。随后，RNA可以被翻译成肽或蛋白质。
根据本发明，术语“转录”包括“体外转录”，其中术语“体外转录”涉及这样的过程，其中在无细胞系统中，优选使用合适的细胞提取物，体外合成RNA，特别是mRNA。优选地，将克隆载体应用于转录物的产生。这些克隆载体通常被指定为转录载体，并且根据本发明包含在术语“载体”中。根据本发明，本发明中使用的RNA优选为体外转录的RNA(IVT-RNA)，并且可以通过合适的DNA模板的体外转录获得。用于控制转录的启动子可以是任何RNA聚合酶的任何启动子。RNA聚合酶的特定实例是T7、T3和SP6 RNA聚合酶。优选地，根据本发明的体外转录由T7或SP6启动子控制。可以通过克隆核酸，特别是cDNA，并将其引入合适的载体中以用于体外转录，来获得用于体外转录的DNA模板。可以通过RNA的逆转录获得cDNA。
关于RNA，术语“表达”或“翻译”涉及细胞核糖体中的过程，通过该过程，mRNA的链引导氨基酸序列的组装以制造肽或蛋白质。
在一些实施方案中，在给予(例如，经静脉内给予)本文所述的RNA，例如，配制为RNA脂质颗粒的RNA后，将至少一部分RNA递送至靶细胞(例如，肝细胞)。在一些实施方案中，将至少一部分RNA递送至靶细胞的胞质溶胶。在一些实施方案中，RNA被靶细胞翻译以产生其所编码的肽或蛋白质。因此，本公开还涉及用于将RNA递送至对象中的靶细胞的方法，该方法包括将本文所述的RNA颗粒给予对象。在一些实施方案中，将RNA递送至靶细胞的胞质溶胶。在一些实施方案中，靶细胞翻译RNA以产生由RNA编码的肽或蛋白质。
“编码”是指多核苷酸如基因、cDNA或mRNA中的具体核苷酸序列的固有特性，以在具有定义的核苷酸(即rRNA、tRNA和mRNA)序列或定义的氨基酸序列以及由此产生的生物特性的生物过程中，用作其他聚合物和大分子合成的模板。因此，如果对应于该基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因编码该蛋白质。其核苷酸序列与mRNA序列相同且通常在序列表中提供的编码链和用作基因或cDNA转录模板的非编码链都可以被称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其他产物。
在一些实施方案中，根据本发明给予的编码结合剂的RNA是非免疫原性的。
本文所用的术语“非免疫原性RNA”是指在给药时不会诱导免疫系统的反应的RNA，例如对哺乳动物的反应，或者诱导的反应比不同之处仅在于它没有经过使非免疫原性RNA为非免疫原性的修饰和处理的相同RNA诱导的反应弱，即比标准RNA(stdRNA)诱导的反应弱。在一优选的实施方案中，通过将抑制RNA介导的先天免疫受体活化的修饰的核苷掺入RNA中并去除双链RNA(dsRNA)，使本文中也称为修饰的RNA(modRNA)的非免疫原性RNA为非免疫原性的。
为了通过掺入修饰的核苷使非免疫原性RNA为非免疫原性的，可以使用任何修饰的核苷，只要其降低或抑制RNA的免疫原性即可。特别优选的是抑制RNA介导的先天免疫受体活化的修饰的核苷。在一些实施方案中，修饰的核苷包括用包含修饰的核碱基的核苷取代一个或多个尿苷。在一些实施方案中，修饰的核碱基是修饰的尿嘧啶。在一些实施方案中，包含修饰的核碱基的核苷选自：3-甲基-尿苷(m3U)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-氮杂-尿苷、6-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-尿苷(s2U)、4-硫代-尿苷(s4U)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基-尿苷(ho5U)、5-氨基烯丙基-尿苷、5-卤代-尿苷(例如，5-碘代-尿苷或5-溴代-尿苷)、尿苷5-氧乙酸(cmo5U)、尿苷5-氧乙酸甲酯(mcmo5U)、5-羧甲基-尿苷(cm5U)、1-羧甲基-假尿苷、5-羧基羟基甲基-尿苷(chm5U)、5-羧基羟基甲基-尿苷甲酯(mchm5U)、5-甲氧基羰基甲基-尿苷(mcm5U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代-尿苷(mcm5s2U)、5-氨基甲基-2-硫代-尿苷(nm5s2U)、5-甲基氨基甲基-尿苷(mnm5U)、1-乙基-假尿苷、5-甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(mnm5s2U)、5-甲基氨基甲基-2-硒基-尿苷(mnm5se2U)、5-氨基甲酰基甲基-尿苷(ncm5U)、5-羧甲基氨基甲基-尿苷(cmnm5U)、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(cmnm5s2U)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-尿苷(τm5U)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷(τm5s2U)、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷)、5-甲基-2-硫代-尿苷(m5s2U)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷(D)、二氢假尿苷、5,6-二氢尿苷、5-甲基-二氢尿苷(m5D)、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷(acp3U)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基氨基甲基)尿苷(inm5U)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫代-尿苷(inm5s2U)、α-硫代-尿苷、2′-O-甲基-尿苷(Um)、5,2′-O-二甲基-尿苷(m5Um)、2′-O-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫代-2′-O-甲基-尿苷(s2Um)、5-甲氧基羰基甲基-2′-O-甲基-尿苷(mcm5Um)、5-氨基甲酰基甲基-2′-O-甲基-尿苷(ncm5Um)、5-羧甲基氨基甲基-2′-O-甲基-尿苷(cmnm5Um)、3,2′-O-二甲基-尿苷(m3Um)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2′-O-甲基-尿苷(inm5Um)、1-硫代-尿苷、二脱氧胸苷、2′-F-阿糖尿苷、2′-F-尿苷、2′-OH-阿糖尿苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷和5-[3-(1-E-丙烯基氨基)尿苷。在一项特别优选的实施方案中，包含修饰的核碱基的核苷是假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5U)，特别是N1-甲基-假尿苷。
在一些实施方案中，用包含修饰的核碱基的核苷取代一个或多个尿苷包括取代至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少75％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的尿苷。
在通过体外转录(IVT)，例如使用T7 RNA聚合酶合成mRNA期间，由于酶的非常规活性，产生了大量的异常产物，包括双链RNA(dsRNA)。dsRNA诱导炎性细胞因子并激活效应酶，导致蛋白质合成的抑制。可以例如通过离子对反相HPLC，使用无孔或多孔的C-18聚苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)基质，从诸如IVT RNA的RNA中去除dsRNA。可选地，可以采用基于酶的方法，其使用特异性水解dsRNA但非ssRNA的大肠杆菌RNA酶III，从而从IVT RNA制剂中清除dsRNA污染物。此外，可以通过使用纤维素物质将dsRNA与ssRNA分离。在一些实施方案中，将RNA制剂与纤维素物质接触，并且在允许dsRNA与纤维素物质结合且不允许ssRNA与纤维素物质结合的条件下，将ssRNA与纤维素物质分离。
如本文所使用的术语“去除(remove)”或“去除(removal)”是指第一物质群体，如非免疫原性RNA与临近的第二物质群体如dsRNA分离的特征，其中第一物质群体不一定不含第二物质，并且第二物质群体不一定不含第一物质。然而，与第一和第二物质的未分离的混合物相比，以去除第二物质群体为特征的第一物质群体具有可测量的更低含量的第二物质。
在一些实施方案中，从非免疫原性RNA中去除dsRNA包括去除dsRNA，使得非免疫源性RNA组合物中小于10％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％、小于0.5％、小于0.3％、小于0.1％或小于0.01％的RNA是dsRNA。在一些实施方案中，非免疫原性RNA不含或基本上不含dsRNA。在一些实施方案中，非免疫原性RNA组合物包括单链核苷修饰的RNA的纯化制剂。例如，在一些实施方案中，单链核苷修饰的RNA的纯化制剂基本上不含双链RNA(dsRNA)。在一些实施方案中，相对于左右其他的核酸分子(DNA、dsRNA等)，纯化制剂是至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少99.9％单链核苷修饰的RNA。
在一些实施方案中，非免疫原性RNA在细胞中比具有相同序列的标准RNA更有效地翻译。在一些实施方案中，翻译相对于其未修饰的对应物增强了2倍。在一些实施方案中，翻译增强了3倍。在一些实施方案中，翻译增强了4倍。在一些实施方案中，翻译增强了5倍。在一些实施例中，翻译增强了6倍。在一些实施方案中，翻译增强了7倍。在一些实施方案中，翻译增强了8倍。在一些实施方案中，翻译增强了9倍。在一些实施方案中，翻译增强了10倍。在一些实施方案中，翻译增强了15倍。在一些实施方案中，翻译增强了20倍。在一些实施方案中，翻译增强了50倍。在一些实施方案中，翻译增强了100倍。在一些实施方案中，翻译增强了200倍。在一些实施方案中，翻译增强了500倍。在一些实施方案中，翻译增强了1,000倍。在一些实施方案中，翻译增强了2,000倍。在一些实施方案中，因子为10-1,000倍。在一些实施方案中，因子为10-100倍。在一些实施方案中，因子为10-200倍。在一些实施方案中，因子为10-300倍。在一些实施方案中，因子为10-500倍。在一些实施方案中，因子为20-1,000倍。在一些实施方案中，因子为30-1,000倍。在一些实施方案中，因子为50-1,000倍。在一些实施方案中，因子为100-1,000倍。在一些实施方案中，因子为200-1,000倍。在一些实施方案中，翻译增强了任何其他显著的量或量的范围。
在一些实施方案中，非免疫原性RNA表现出比具有相同序列的标准RNA显著更低的先天免疫原性。在一些实施方案中，非免疫原性RNA表现出比其未修饰的对应物低2倍的先天免疫应答。在一些实施方案中，先天免疫原性降低了3倍。在一些实施方案中，先天免疫原性降低了4倍。在一些实施方案中，先天免疫原性降低了5倍。在一些实施方案中，先天免疫原性降低了6倍。在一些实施方案中，先天免疫原性降低了7倍。在一些实施方案中，先天免疫原性降低了8倍。在一些实施方案中，先天免疫原性降低了9倍。在一些实施方案中，先天免疫原性降低了10倍。在一些实施方案中，先天免疫原性降低了15倍。在一些实施方案中，先天免疫原性降低了20倍。在一些实施方案中，先天免疫原性降低了50倍。在一些实施方案中，先天免疫原性降低了100倍。在一些实施方案中，先天免疫原性降低了200倍。在一些实施方案中，先天免疫原性降低了500倍。在一些实施方案中，先天免疫原性降低了1,000倍。在一些实施方案中，先天免疫原性降低了2,000倍。
术语“表现出显著更低的先天免疫原性”是指先天免疫原性的可检测的降低。在一些实施方案中，该术语是指减少，使得可以在不触发可检测的先天免疫应答的情况下给予有效量的非免疫原性RNA。在一些实施方案中，该术语是指减少，使得非免疫原性RNA可被重复给药，而不会引发足以可检测地减少由非免疫原性RNA编码的蛋白质的产生的先天免疫应答。在一些实施方案中，这种减少使得非免疫原性RNA可被重复给药，而不会引发足以消除由非免疫原性RNA编码的蛋白质的可检测的产生的先天免疫应答。
“免疫原性”是诸如RNA等外来物质在人类或其他动物体内引发免疫应答的能力。先天免疫系统是免疫系统的相对非特异性的和即时性的组分。它是脊椎动物免疫系统以及适应性免疫系统的两个主要组分之一。
如本文所用，“内源性”是指来自生物体、细胞、组织或系统或在其内部产生的任何物质。
如本文所用，术语“外源性”是指从生物体、细胞、组织或系统引入或在其外部产生的任何物质。
本文中使用的术语“表达”定义为特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
如本文所用，术语“链接的(linked)”、“融合的(fused)”或“融合(fusion)”可互换使用。这些术语是指将两个或更多个元件或组分或结构域连接在一起。
密码子优化/G/C含量的增加
在一些实施方案中，本文所述的结合剂的氨基酸序列由相比野生型编码序列进行了密码子优化和/或G/C含量增加的编码序列编码。这还包括实施方案，其中编码序列的一个或多个序列区域相比野生型编码序列相应的序列区域进行了密码子优化和/或G/C含量增加。在一些实施方案中，密码子优化和/或G/C含量的增加优选地不改变编码的氨基酸序列的序列。
术语“密码子优化”是指在不优选地改变核酸分子编码的氨基酸序列的情况下，改变核酸分子的编码区中的密码子，以反映宿主生物体的典型密码子使用。在本发明的上下文中，编码区优选是密码子优化的，以用于使用本文所述的RNA分子在待治疗的对象中进行最佳的表达。密码子优化基于这样的发现，即翻译效率也由细胞中tRNAs出现的不同频率决定。因此，可以对RNA序列进行修饰，从而插入可实现tRNAs的频繁出现的密码子来代替“稀有密码子”。
在本发明的一些实施方案中，与野生型RNA的相应编码序列的G/C含量相比，本文所述的RNA的编码区的鸟苷/胞嘧啶(G/C)含量增加，其中与由野生型RNA编码的氨基酸序列相比，由RNA编码的氨基酸序列优选地不被修饰。RNA序列的这种修饰是基于这样的事实，即要翻译的任何RNA区域的序列对于该mRNA的有效翻译都是重要的。具有增加的G(鸟苷)/C(胞嘧啶)含量的序列比具有增加的A(腺苷)/U(尿嘧啶)含量的序列更稳定。关于几个密码子编码一个和相同的氨基酸的事实(所谓的遗传密码的简并性)，可以确定对稳定性最有利的密码子(所谓的替代密码子使用)。取决于RNA编码的氨基酸，与其野生型序列相比，RNA序列有多种修饰的可能性。特别地，可以通过用编码相同的氨基酸但不含有A和/或U或含有较低含量的A和/或U核苷酸的其他密码子取代这些密码子来修饰含有A和/或U核苷酸的密码子。
在各种实施方案中，与野生型RNA的编码区的G/C含量相比，本文所述的RNA的编码区的G/C含量增加了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少55％或甚至更多。
包含颗粒的核酸
本文所述的核酸，如编码结合剂的RNA，可以配制为颗粒给药。
在本公开的上下文中，术语“颗粒”涉及由分子或分子复合物形成的结构化实体。
在一些实施方案中，本文所述的颗粒是纳米粒子。术语“纳米粒子”涉及纳米尺寸的颗粒，其中颗粒的所有三个外部尺寸都为纳米级，即至少为约1nm且低于约1,000nm。优选地，颗粒的大小是其直径。
在一些实施方案中，核酸颗粒包含超过一种类型的核酸分子，其中所述核酸分子的分子参数可以彼此相似或不同，类似于关于摩尔质量或基本结构元素，如分子结构、加帽、编码区或其他特征，
在包含RNA，例如第一RNA和第二RNA的颗粒制剂中，每种RNA物质可能被单独配制为单独的颗粒制剂。在该情况下，每种单独的颗粒制剂将包含一种RNA物质。单独的颗粒制剂可以作为单独的实体存在，例如在单独的容器中。可通过将每种RNA物质(通常每种都以包含RNA的溶液的形式)与颗粒形成剂一起单独提供，从而允许颗粒的形成，来获得这样的制剂。相应的颗粒将仅包含在形成颗粒(单独的颗粒制剂)时提供的具体RNA物质。在一些实施方案中，组合物如药物组合物包含多于一种单独的颗粒制剂。相应的药物组合物被称为混合颗粒制剂。可通过单独形成单一颗粒制剂，然后进行单一颗粒制剂的混合步骤，而得根据本发明的混合颗粒制剂。通过混合步骤，可获得包括含RNA颗粒的混合群体的制剂。单一颗粒群体可以一起在一个容器中，该容器包括单一颗粒制剂的混合群体。可选地，可能将药物组合物的所有RNA物质配制在一起，作为组合的颗粒制剂。可通过提供所有RNA物质以及颗粒形成剂的组合制剂(通常是组合溶液)，从而允许形成颗粒，而获得这样的制剂。与混合颗粒制剂相反，组合的颗粒制剂通常包括包含多于一种RNA物质的颗粒。在组合的颗粒组合物中，不同的RNA物质通常一起存在于单一颗粒中。
“核酸颗粒”可用于将核酸递送到目标靶位点(例如，细胞、组织、器官等)。核酸颗粒可以由核酸和至少一种颗粒形成组分形成，例如，至少一种阳离子或阳离子可离子化的脂质或脂质样物质、至少一种阳离子聚合物如鱼精蛋白，或者以上的混合物。带正电的分子如聚合物和脂质与带负电的核酸之间的静电相互作用参与颗粒的形成。这导致核酸颗粒的络合和自发形成。不期望受到任何理论的束缚，据信阳离子或阳离子可离子化的脂质或脂质样物质和/或阳离子聚合物与核酸组合在一起，以形成聚集体，并且这种聚集体导致胶体稳定的颗粒。核酸颗粒包括基于脂质纳米粒子(LNP)和基于脂质复合物(lipoplex)(LPX)的制剂。
本文使用的术语“胶体”涉及一种均匀的混合物，其中分散的颗粒不会沉降。混合物中的不溶性颗粒是微观的，颗粒尺寸在1-1,000纳米之间。该混合物可被称为胶体或胶体悬浮液。有时，术语“胶体”仅指混合物中的颗粒，而不是整个悬浮液。
在一些实施方案中，本文所述的颗粒还包含除阳离子或阳离子可离子化的脂质或脂质样物质以外的至少一种脂质或脂质样物质、除阳离子聚合物以外的至少另一种聚合物，或者以上的混合物。
在一些实施方案中，本文所述的核酸颗粒可具有约30nm至约1,000nm、约50nm至约800nm、约70nm至约600nm、约90nm至约400nm或约100nm至约300nm范围的平均直径。
术语“平均直径”是指颗粒的平均流体动力学直径，如通过动态激光光散射(DLS)，利用数据分析，使用提供长度的维度作为结果，即所谓的Z平均值的所谓的累积量算法以及无量纲的多分散指数(PI)所测量的(Koppel,D.,J.Chem.Phys.57,1972,第4814-4820页,ISO13321)。这里，颗粒的“平均直径”、“直径”或“大小”与Z平均值的该值同义。
本文所述的核酸颗粒可表现出小于约0.5、小于约0.4、小于约0.3或约0.2或更小的多分散指数。通过实例的方式，核酸颗粒可以表现出在约0.1至约0.3或约0.2至约0.3范围内的多分散指数。
“多分散指数”优选地是基于动态光散射测量，通过在“平均直径”的定义中提到的所谓累积量分析来计算的。在某些先决条件下，它可以作为纳米粒子集合的尺寸分布的度量。
N/P比率给出了脂质中的氮基团与核酸，例如RNA中的磷酸基团的数量的比率。它与电荷比有关，因为氮原子(取决于pH)通常带正电，并且磷酸基团带负电。存在电荷平衡的N/P比率取决于pH。脂质制剂经常以大于4至多达12的N/P比率形成，因为带正电荷的纳米粒子被认为有利于转染。在这种情况下，RNA被认为与纳米粒子完全结合。
先前已经描述了不同类型的含核酸颗粒适合于以颗粒形式递送核酸(例如Kaczmarek,J.C.et al.,2017,Genome Medicine 9,60)。对于非病毒核酸递送媒介物，核酸的纳米粒子包封在物理上保护核酸不被降解，并且取决于具体的化学性质，可以帮助细胞摄取和内体逃逸。
本公开描述了颗粒，其包含核酸、至少一种阳离子或阳离子可离子化的脂质或脂质样物质，以及/或者至少一种与核酸结合以形成核酸颗粒和包含这些颗粒的组合物的阳离子聚合物。核酸颗粒可以包含通过与颗粒的非共价相互作用以不同形式络合的核酸。本文所述的颗粒不是病毒颗粒，特别是感染性病毒颗粒，即它们不能病毒性感染细胞。
合适的阳离子或阳离子可离子化的脂质或脂质样物质和阳离子聚合物是形成核酸颗粒的那些，并且包括在术语“颗粒形成组分”或“颗粒形成剂”中。术语“颗粒形成组分”或“颗粒形成剂”涉及与核酸结合以形成核酸颗粒的任何组分。这样的组分包括可以是核酸颗粒的一部分的任何组分。
阳离子聚合物
鉴于其高度的化学柔性，聚合物是基于纳米粒子的递送的常用物质。通常，阳离子聚合物用于将带负电的核酸静电凝聚成纳米粒子。这些带正电荷的基团通常由胺组成，这些胺在5.5至7.5的pH范围下改变其质子化状态，被认为会导致离子失衡，这导致内体破裂。聚合物如聚L-赖氨酸、聚酰胺胺、鱼精蛋白和聚乙烯亚胺，以及天然存在的聚合物如壳聚糖，都已应用于核酸递送，并适合作为本文的阳离子聚合物。另外，一些研究人员已经合成了专门用于核酸递送的聚合物。尤其是聚(β-氨基酯)，由于其易于合成和生物降解性，已在核酸递送中得到广泛应用。这样的合成聚合物也适合作为本文中的阳离子聚合物。
本文所用的“聚合物”以其普通含义给出，即包含一个或多个通过共价键连接的重复单元(单体)的分子结构。重复单元可以全部相同，或者在一些情况下，聚合物内可以存在多于一种类型的重复单元。在一些情况下，聚合物是生物来源的，即生物聚合物如蛋白质。在一些情况下，另外的部分也可以存在于聚合物，例如靶向部分，如本文所述的那些中。
如果聚合物内存在多于一种类型的重复单元，则称该聚合物为“共聚物”。应理解，本文所用的聚合物可以是共聚物。形成共聚物的重复单元可以以任何形式布置。例如，重复单元可以以随机顺序、交替顺序布置，或者作为“嵌段”共聚物布置，即包含一个或多个区域，每个区域包含第一重复单元(例如，第一嵌段)，以及一个或多个区域，每个区域包含第二重复单元(例如，第二嵌段)等。嵌段共聚物可以具有两个(二嵌段共聚物)、三个(三嵌段共聚物)，或者更多数量的不同嵌段。
在一些实施方案中，聚合物是生物相容的。生物相容性聚合物是在中等浓度下通常不会导致显著细胞死亡的聚合物。在一些实施方案中，生物相容性聚合物是可生物降解的，即该聚合物能够在生理环境内，如在体内进行化学和/或生物降解。
在一些实施方案中，聚合物可以是鱼精蛋白或聚亚烷基亚胺，特别是鱼精蛋白。
术语“鱼精蛋白”是指具有相对较低的分子量的各种强碱性蛋白质中的任一种，其富含精氨酸，且尤其是与取代各种动物(如鱼类)的精子细胞中的体细胞组蛋白的DNA相关。特别地，术语“鱼精蛋白”是指在鱼类精子中发现的蛋白质，这些蛋白质是强碱性的，可溶于水中，不受热凝结，且水解后主要产生精氨酸。在纯化形式中，它们用于长效胰岛素制剂中，并中和肝素的抗凝作用。
根据本公开，本文中使用的术语“鱼精蛋白”意指包括从天然或生物来源获得或衍生的任何鱼精蛋白氨基酸序列，包括其片段和所述氨基酸序列或其片段的多聚体形式，以及人工的和专为特定目的设计的并且不能从天然或生物学来源分离的(合成的)多肽。
在一些实施方案中，聚亚烷基亚胺包括聚乙烯亚胺和/或聚丙烯亚胺，优选聚乙烯亚胺。优选的聚亚烷基亚胺是聚乙烯亚胺(PEI)。PEI的平均分子量优选为0.75·102-107Da，优选地1,000-105Da，更优选地10,000-40,000Da，更优选地15,000-30,000Da，甚至更优选地20,000-25,000Da。
根据本公开优选的是线性聚亚烷基亚胺，如线性聚乙烯亚胺(PEI)。
本文中预期使用的阳离子聚合物(包括聚阳离子聚合物)包括能够静电结合核酸的任何阳离子聚合物。在一些实施方案中，本文中预期使用的阳离子聚合物包括核酸可与之结合的任何阳离子聚合物，例如通过与核酸形成复合物或形成封闭或包封核酸的囊泡。
本文所述的颗粒还可以包括除阳离子聚合物以外的聚合物，即非阳离子聚合物和/或阴离子聚合物。阴离子和中性聚合物在本文中统称为非阳离子聚合物。
脂质和脂质样物质
术语“脂质”和“脂质样物质”在本文中被广泛地定义为包含一个或多个疏水性部分或基团以及任选地还包含一个或多个亲水性部分或基团的分子。包含疏水性部分和亲水性部分的分子也经常被表示为两亲化合物。脂质通常不易溶于水中。在水性环境中，两亲性质允许分子自组装成有组织的结构和不同的相。那些相中的一种由脂质双层组成，因为它们存在于水性环境中的囊泡、多层/单层脂质体或膜中。可以通过包含非极性基团来赋予疏水性，所述非极性基团包括但不限于：长链饱和及不饱和脂族烃基以及被一个或多个芳族、脂环族或杂环基团取代的这类基团。亲水性基团可包括极性和/或带电荷的基团，并且包括碳水化合物、磷酸盐、羧酸、硫酸盐、氨基、巯基、硝基、羟基和其他类似基团。
如本文所用，术语“两亲性的”是指具有极性部分和非极性部分的分子。通常，两亲性化合物具有一个附接到疏水性长尾上的极性头。在一些实施方案中，极性部分可溶于水中，而非极性部分不溶于水。另外，极性部分可以具有正式的正电荷或者正式的负电荷。可选地，极性部分可以具有正式的正电荷和负电荷，并且是两性离子或内盐。出于本公开的目的，两亲性化合物可以是但不限于一种或多种天然或非天然的脂质和脂质样化合物。
术语“脂质样物质”、“脂质样化合物”或“脂质样分子”涉及在结构和/或功能上与脂质相关，但在严格意义上可能不被视为脂质的物质，特别是两亲性物质。例如，该术语包括能够形成两亲性层的化合物，因为它们存在于水性环境中的囊泡、多层/单层脂质体或膜中，并且包括表面活性剂或具有亲水性和疏水性部分的合成化合物。一般来说，该术语是指分子，其包含具有可能与脂质的结构组织相似或可能不相似的不同结构组织的亲水性和疏水性部分。能够自发整合到细胞膜中的脂质样化合物的实例包括功能性脂质构建体，如合成的功能-间隔子-脂质构建体(FSL)、合成的功能-间隔子-甾醇构建体(FSS)以及人工两亲性分子。脂类通常是圆柱形的。两条烷基链所占据的面积与极性头基团所占据的面积相似。脂质作为单体具有低溶解度，并且往往聚集成不溶于水的平面双层。传统的表面活性剂单体通常是锥形的。亲水性头基团往往比线性烷基链占据更多的分子空间。表面活性剂往往聚集成水溶性的球形或椭圆形胶束。虽然脂质也具有与表面活性剂相同的一般结构——极性亲水性头基和非极性疏水性尾——但脂质与表面活性素的不同之处在于单体的形状、溶液中形成的聚集体的类型以及聚集所需的浓度范围。如本文所用，术语“脂质”应被解释为涵盖脂质和脂质样物质，除非本文另有指示或与上下文明显矛盾。
可包括在两亲性层中的两亲性化合物的具体实例包括但不限于磷脂、氨基脂质和鞘脂。
在一些实施方案中，两亲性化合物是脂质。术语“脂质”是指一组有机化合物，其特征是不溶于水，但可溶于许多有机溶剂。一般来说，脂质可分为八类：脂肪酸、甘油脂质、甘油磷脂、鞘脂、糖脂、聚酮(来源于酮酰基亚基的缩合)、甾醇脂质和异戊烯醇脂质(来源于异戊二烯亚基的缩合)。尽管术语“脂质”有时被用作脂肪的同义词，但脂肪是称为甘油三酯的脂质的亚组。脂质还包括诸如脂肪酸及其衍生物(包括三甘油酯、二甘油酯、单甘油酯和磷脂)等分子，以及诸如胆固醇等包含甾醇的代谢物。
脂肪酸或脂肪酸残基是由以羧酸基团终止的烃链组成的不同的分子组；这种布置赋予分子一个极性的亲水端和一个不溶于水的非极性的疏水端。碳链长度通常在4-24个碳之间，可以是饱和的或不饱和的，并且可以附接到含有氧、卤素、氮和硫的官能团上。如果脂肪酸含有双键，则存在顺式或反式几何异构的可能性，这会显著影响分子的构型。顺式双键导致脂肪酸链弯曲，这种影响与链中更多的双键复合。脂肪酸类别中的其他主要脂质分类是脂肪酯和脂肪酰胺。
甘油脂质由单取代、二取代和三取代的甘油组成，最著名的是甘油的脂肪酸三酯，称为甘油三酯。词语“三酰甘油”有时与“甘油三酯”同义性地使用。在这些化合物中，甘油的三个羟基各自被酯化，通常被不同的脂肪酸酯化。甘油脂质的另外的亚类以糖基甘油为代表，其特征在于存在经由糖苷链接附接到甘油上的一个或多个糖残基。
甘油磷脂是两亲性分子(包含疏水性和亲水性区域)，其含有通过酯链接连接到两个脂肪酸衍生的“尾”和通过磷酸酯链接连接到一个“头”基的甘油核心。甘油磷脂，通常称为磷脂(尽管鞘磷脂也被归类为磷脂)的实例是磷脂酰胆碱(也称为PC、GPCho或卵磷脂)、磷脂酰乙醇胺(PE或GPEtn)和磷脂酰丝氨酸(PS或GPSer)。
鞘脂是一个复杂的化合物家族，其具有一个共同的结构特征，即鞘氨醇碱基主链。哺乳动物的主要鞘氨醇碱基通常被称为鞘氨醇。神经酰胺(N-酰基-鞘氨醇碱基)是具有酰胺连接的脂肪酸的鞘氨醇碱基衍生物的一个主要亚类。脂肪酸通常是饱和的或单不饱和的，链长度为16-26个碳原子。哺乳动物的主要磷酸鞘脂是鞘磷脂(神经酰胺磷酸胆碱)，而昆虫主要含有神经酰胺磷酸乙酰胺，并且真菌具有植物神经酰胺磷酸肌醇和含有甘露糖的头基。鞘糖脂是一个不同的分子家族，由一个或多个糖残基组成，经由糖苷键连接到鞘氨醇碱基上。这些的实例是简单和复杂的鞘糖脂，如脑苷脂和神经节苷脂。
甾醇脂质，如胆固醇及其衍生物，或者生育酚及其衍生物，与甘油磷脂和鞘磷脂一起，是膜脂质的重要组分。
糖脂描述了这样的化合物，其中脂肪酸直接连接到糖主链上，形成与膜双层相容的结构。在糖脂中，单糖取代了甘油脂质和甘油磷脂中存在的甘油主链。最熟悉的糖脂是革兰氏阴性菌中脂多糖的脂质A组分的酰化葡糖胺前体。典型的脂质A分子是葡糖胺的二糖，其衍生有多达七个脂肪酰基链。在大肠杆菌中生长所需的最小脂多糖是Kdo2-脂质A，这是一种葡糖胺的六酰化二糖，其用两个3-脱氧-D-甘露醇-辛酮糖酸(Kdo)残基进行糖基化。
聚酮是通过与脂肪酸合成酶共有机制特征的经典酶以及迭代酶和多模块酶聚合乙酰基和丙酰基亚基而合成的。它们包括来自动物、植物、细菌、真菌和海洋来源的大量次生代谢物和天然产物，并且具有很大的结构多样性。许多聚酮是环状分子，其主链通常通过糖基化、甲基化、羟基化、氧化或其他过程进一步修饰。
根据本公开，脂质和脂质样物质可以是阳离子的、阴离子的或中性的。中性脂质或脂质样物质在选定的pH下以不带电的或中性的两性离子形式存在。
阳离子或阳离子可离子化的脂质或脂质样物质
本文所述的核酸颗粒可包含至少一种阳离子或阳离子可离子化的脂质或脂质样物质作为颗粒形成剂。本文中预期使用的阳离子或阳离子可离子化的脂质或脂质样物质包括能够静电结合核酸的任何阳离子或阳离子可离子化的脂质或脂质样物质。在一些实施方案中，本文中预期使用的阳离子或阳离子可离子化的脂质或脂质样物质可以与核酸结合，例如通过与核酸形成复合物或者形成封闭或包封核酸的囊泡。
如本文所用，“阳离子脂质”或“阳离子脂质样物质”是指具有净正电荷的脂质或脂质样物质。阳离子脂质或脂质样物质通过静电相互作用结合带负电的核酸。通常，阳离子脂质具有亲脂性部分，如甾醇、酰基链、二酰基或更多的酰基链，并且脂质的头基通常携带正电荷。
在一些实施方案中，阳离子脂质或脂质样物质仅在某些pH，特别是酸性pH下具有净正电荷，而其优选在不同的，优选更高的pH，如生理pH下不具有净正电荷，优选不具有电荷，即其为中性的。与在生理pH下保持阳离子的颗粒相比，这种可离子化的行为被认为通过帮助内体逃逸和降低毒性来增强功效。
为了本公开的目的，除非与环境相矛盾，否则这种“阳离子可离子化的”的脂质或脂质样物质包括在术语“阳离子脂质或脂质样物质”中。
在一些实施方案中，阳离子或阳离子可离子化的脂质或脂质样物质包含头基，其包括至少一个带正电荷的或能够被质子化的氮原子(N)。
阳离子脂质的实例包括但不限于：1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)；N,N-二甲基-2,3-二油氧基丙基胺(DODMA)、1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)、3-(N—(N′,N′-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基)胆固醇(DC-Chol)、二甲基双十八烷基铵(DDAB)；1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)；1,2-二酰基氧-3-二甲基铵丙烷；1,2-二烷基氧-3-二甲基铵丙烷；二十八烷基二甲基氯化铵(DODAC)、1,2-二硬脂酰基氧-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DSDMA)、2,3-二(十四烷氧基)丙基-(2-羟基乙基)-二甲基氮鎓(DMRIE)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DMEPC)、l,2-二肉豆蔻酰-3-三甲基铵丙烷(DMTAP)、1,2-二油烯基氧丙基-3-二甲基-羟基乙基溴化铵(DORIE)，以及2,3-二油酰基氧-N-[2(精胺甲酰胺)乙基]-N,N-二甲基-l-丙铵三氟乙酸盐(DOSPA)、1,2-二亚油烯基氧-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚油烯基氧-N,N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)、二十八烷基酰胺甘氨酰精胺(DOGS)、3-二甲基氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧代丁-4-氧)-1-(顺,顺-9,12-十八碳二烯氧)丙烷(CLinDMA)、2-[5′-(胆甾-5-烯-3-β-氧)-3′-噁戊氧)-3-二甲基-1-(顺,顺-9′,12′-十八碳二烯氧)丙烷(CpLinDMA)、N,N-二甲基-3,4-二油烯基氧苄基胺(DMOBA)、1,2-N,N′-二油烯基氨基甲酰-3-二甲基氨基丙烷(DOcarbDAP)、2,3-二亚油酰基氧-N,N-二甲基丙基胺(DLinDAP)、1,2-N,N′-二亚油酰基氨基甲酰-3-二甲基氨基丙烷(DLincarbDAP)、1,2-二二亚油酰基氨基甲酰-3-二甲基氨基丙烷(DLinCDAP)、2,2-二亚油酰基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二噁戊烷(DLin-K-DMA)、2,2-二亚油酰基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二噁戊烷(DLin-K-XTC2-DMA)、2,2-二亚油酰基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二噁戊烷(DLin-KC2-DMA)、三十七-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸盐(DLin-MC3-DMA)、N-(2-羟基乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷基氧)-1-丙基溴化铵(DMRIE)、(±)-N-(3-氨基丙基)-N,N-二甲基-2,3-双(顺-9-十四烯氧)-1-丙基溴化铵(GAP-DMORIE)、(±)-N-(3-氨基丙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十二烷基氧)-1-丙基溴化铵(GAP-DLRIE)、(±)-N-(3-氨基丙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷基氧)-1-丙基溴化铵(GAP-DMRIE)、N-(2-氨基乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷基氧)-1-丙基溴化铵(βAE-DMRIE)、N-(4-羧基苄基)-N,N-二甲基-2,3-双(油酰基氧)丙-1-胺鎓(DOBAQ)、2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧]辛基}氧)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基氧]丙-1-胺(辛基-CLinDMA)、1,2-二肉豆蔻酰基-3-二甲基铵-丙烷(DMDAP)、1,2-二棕榈酰基-3-二甲基铵-丙烷(DPDAP)、N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基-丙基)氨基]丁基甲酰氨)乙基]-3,4-二[油烯基氧]-苯甲酰胺(MVL5)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DOEPC)、2,3-双(十二烷基氧)-N-(2-羟基乙基)-N,N-二甲基丙-1-溴化铵(DLRIE)、N-(2-氨基乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷基氧)丙-1-溴化铵(DMORIE)、二((Z)-壬-2-烯-1-基)8,8'-((((2(二甲基氨基)乙基)硫代)羰基)氮亚烷基)二辛酸酯(ATX)、N,N-二甲基-2,3-双(十二烷基氧)丙-1-胺(DLDMA)、N,N-二甲基-2,3-双(十四烷基氧)丙-1-胺(DMDMA)、二((Z)-壬-2-烯-1-基)-9-((4-(二甲基氨基丁酰基)氧)十七烷二酸酯(L319)、N-十二烷基-3-((2-十二烷基氨基甲酰基-乙基)-{2-[(2-十二烷基氨基甲酰基-乙基)-2-{(2-十二烷基氨基甲酰基-乙基)-[2-(2-十二烷基氨基甲酰基-乙基氨基)-乙基]-氨基}-乙基氨基)丙酰胺(lipidoid 98N12-5)、1-[2-[双(2-羟基十二烷基)氨基]乙基-[2-[4-[2-[双(2羟基十二烷基)氨基]乙基]哌嗪-1-基]乙基]氨基]十二-2-醇(lipidoidC12-200)。
在一些实施方案中，阳离子脂质可包含颗粒中存在的总脂质的约10mol％至约100mol％、约20mol％至约100mol％、约30mol％至约100mol％、约40mol％至约100mol％，或者约50mol％至约100mol％。
另外的脂质或脂质样物质
本文所述的颗粒还可以包含除阳离子或阳离子可离子化的脂质或脂质样物质以外的脂质或脂质样物质，即非阳离子脂质或脂质样物质(包括非阳离子可离子化的脂质或脂质样物质)。阴离子和中性脂质或脂质样物质在本文中统称为非阳离子脂质或脂质样物质。除了可离子化/阳离子脂质或脂质样物质外，还通过添加其他疏水性部分如胆固醇和脂质来优化核酸颗粒的配方，可以增强颗粒稳定性和核酸递送的效力。
可以掺入另外的脂质或脂质样物质，其可以影响或可以不影响核酸颗粒的总电荷。在一些实施方案中，另外的脂质或脂质样物质是非阳离子脂质或脂质样物质。非阳离子脂质可以包含例如一种或多种阴离子脂质和/或中性脂质。如本文所用，“阴离子脂质”是指在选定pH下带负电的任何脂质。如本文所使用，“中性脂质”是指在选定pH下以不带电或中性两性离子形式存在的多种脂质物质中的任何一种。在优选的实施方案中，另外的脂质包含以下中性脂质组分之一，例如中性脂质组份：(1)磷脂，(2)胆固醇或其衍生物；或者(3)磷脂和胆固醇或其衍生物的混合物。胆固醇衍生物的实例包括但不限于胆甾烷醇、胆甾酮、胆甾烯酮、粪甾醇、胆甾醇基-2'-羟乙基醚、胆甾醇基-4'-羟基丁基醚、生育酚和以上的衍生物，以及以上的混合物。
可使用的具体磷脂包括但不限于：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸或鞘磷脂。这样的磷脂特别包括二酰基磷脂酰胆碱，如二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、双十五酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、双二十酰磷脂酰胆碱(DAPC)、双二十二酰磷脂酰胆碱(DBPC)、双二十三酰磷脂酰胆碱(DTPC)、双二十四酰磷脂酰胆碱(DLPC)、棕榈酰油酰基-磷脂酰胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0Diether PC)、1-油酰基-2-胆固醇半琥珀酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)和磷脂酰乙醇胺，特别是二酰基磷脂酰乙醇胺，如二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二月桂酰基-磷脂酰乙醇胺(DLPE)、二植烷酰基-磷脂酰乙醇胺(DPyPE)，以及具有不同疏水性链的其他磷脂酰乙醇胺脂质。
在某些优选的实施方案中，另外的脂质是DSPC或DSPC和胆固醇。
在一些实施方案中，核酸颗粒包括阳离子脂质和另外的脂质。
不希望受到理论的束缚，与至少一种另外的脂质的量相比，至少一种阳离子脂质的量可能影响重要的核酸颗粒特征，如核酸的电荷、颗粒大小、稳定性、组织选择性和生物活性。因此，在一些实施方案中，至少一种阳离子脂质与至少一种另外的脂质的摩尔比为约10:0至约1:9、约4:1至约1:2，或者约3:1至约1:1。
在一些实施方案中，非阳离子脂质，特别是中性脂质(例如，一种或多种磷脂和/或胆固醇)可包含颗粒中存在的总脂质的约0mol％至约90mol％、约0mol％至约80mol％、约0mol％至约70mol％、约0mol％至约60mol％或约0mol％至约50mol％。
聚合物缀合的脂质
在一些实施方案中，颗粒可以包括至少一种聚合物缀合的脂质。聚合物缀合的脂质通常是包含脂质部分和与其缀合的聚合物部分的分子。在一些实施方案中，聚合物缀合的脂质是PEG缀合的脂质，在本文中也称为聚乙二醇化的脂质或PEG-脂质。
在一些实施方案中，聚合物缀合的脂质被设计为通过形成屏蔽疏水性脂质层的保护性亲水层来在空间上稳定脂质颗粒。在一些实施方案中，当这种脂质颗粒在体内给药时，聚合物缀合的脂质可以减少其与血清蛋白的结合和/或产生的网状内皮系统的摄取。
各种PEG缀合的脂质是本领域已知的，并且包括但不限于聚乙二醇化的二酰基甘油(PEG-DAG)如1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG)、聚乙二醇化的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、PEG琥珀酸酯二酰甘油(PEG-S-DAG)如4-O-(2',3'-二(十四烷基氧)丙基-1-O-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG)、聚乙二醇化的神经酰胺(PEG-cer)或PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯如ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基-N-(2,3-二(十四烷氧)丙基)氨基甲酸酯或2,3-二(ω甲氧基(聚乙氧基)乙基)氨基甲酸酯等。
在一些实施方案中，颗粒可包含如WO 2017/075531和WO 2018/081480中所述的一种或多种PEG缀合的脂质或聚乙二醇化的脂质，为了本文所述的目的，其中每项的全部内容均通过引用并入本文中。
脂质复合物颗粒
在本公开的一些实施方案中，本文所述的RNA可以存在于RNA脂质复合物颗粒中。
脂质复合物(LPX)是静电复合物，其通常通过将预先形成的阳离子脂质体与阴离子RNA混合而形成。形成的脂质复合物具有不同的分子内部布置，这些布置是由于从脂质体结构转化为紧凑的RNA–脂质复合物而产生的。这些制剂的特征通常在于其对核酸的不良包封和核酸的不完全包裹。
脂质体是包含单层或多层磷脂双层的球形囊泡，其封闭水性核心。它们由具有极性头(亲水性的)基和非极性尾(疏水性的)基的物质制备。这些基团之间的相互作用诱导囊泡的形成。用于配制设计用于递送核酸的脂质体的阳离子脂质本质上是两亲性的，并且由经由甘油连接到烃链或胆固醇衍生物的带正电荷(阳离子)的胺头基组成。
通常可以使用阳离子脂质如DOTMA和另外的脂质如DOPE合成带正电荷的脂质体。在一些实施方案中，RNA脂质复合物颗粒是纳米粒子。
在一些实施方案中，RNA脂质复合物颗粒包括阳离子脂质和另外的脂质。在示例性的实施方案中，阳离子脂质是DOTMA，并且另外的脂质是DOPE。
在一些实施方案中，至少一种阳离子脂质与至少一种另外的脂质的摩尔比为约10:0至约1:9、约4:1至约1:2或约3:1至约1:1。在具体的实施方案中，摩尔比可以为约3:1、约2.75:1、约2.5:1、约2.25:1、约2:1、约1.75:1、约1.5:1、约1.25:1或约1:1。在示例性的实施方案中，至少一种阳离子脂质与至少一种另外的脂质的摩尔比为约2:1。
在一些实施方案中，本文所述的RNA脂质复合物颗粒具有的平均直径范围为约200nm至约1000nm、约200nm至约800nm、约250至约700nm、约400至约600nm、约300nm至约500nm或约350nm至约400nm。在具体的实施方案中，RNA脂质复合物颗粒具有的平均直径为约200nm、约225nm、约250nm、约275nm、约300nm、约325nm、约350nm、约375nm、约400nm、约425nm、约450nm、约475nm、约500nm、约525nm、约550nm、约575nm、约600nm、约625nm、约650nm、约700nm、约725nm、约750nm、约775nm、约800nm、约825nm、约850nm、约875nm、约900nm、约925nm、约950nm、约975nm或约1000nm。在实施方案中，RNA脂质复合物颗粒具有的平均直径范围为约250nm至约700nm。在另一实施方案中，RNA脂质复合物颗粒具有的平均直径范围为约300nm至约500nm。在示例性的实施方案中，RNA脂质复合物颗粒具有约400nm的平均直径。
可以使用脂质体来制备RNA脂质复合物颗粒，所述脂质体可以通过将于乙醇中的脂质溶液注射到水或合适的水相中而获得。在一些实施方案中，水相具有酸性pH。在一些实施方案中，水相包含乙酸，例如约5mM的量。脂质体可用于通过将脂质体与RNA混合来制备RNA脂质复合物颗粒。
在一些实施方案中，脂质体和RNA脂质复合物颗粒包含至少一种阳离子脂质和至少一种另外的脂质。在一些实施方案中，至少一种阳离子脂质包括1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)和/或1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)。在一些实施方案中，至少一种另外的脂质包括1,2-二-(9Z-十八烯酰)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、胆固醇(Chol)和/或1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)。在一些实施方案中，至少一种阳离子脂质包括1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)，并且至少一种另外的脂质包括1,2-二-(9Z-十八烯酰)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。在一些实施方案中，脂质体和RNA脂质复合物颗粒包含1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)和1,2-二-(9Z-十八烯酰)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。
脂质纳米粒子(LNP)
在一些实施方案中，本文所述的RNA以脂质纳米粒子(LNP)的形式存在。LNP可以包括能够形成颗粒的任何脂质，一种或多种核酸分子附接到所述颗粒上，或者一种或多个核苷酸分子包封在所述颗粒中。
LNP通常包括四种组分：可离子化的阳离子脂质、中性脂质如磷脂、类固醇如胆固醇和聚合物缀合的脂质如PEG脂质。可以通过在水性缓冲液中将溶解在乙醇中的脂质与核酸混合来制备LNP。
在一些实施方案中，在本文所述的RNALNP中，mRNA被占据LNP的中心核心的可离子化的脂质结合。PEG脂质与磷脂一起形成LNP的表面。在一些实施方案中，表面包括双层。在一些实施方案中，带电和不带电形式的胆固醇和可离子化的脂质可以分布在整个LNP中。
在一些实施方案中，LNP包含一种或多种阳离子脂质以及一种或多种稳定性脂质。稳定性脂质包括中性脂质和聚乙二醇化的脂质。
在一些实施方案中，LNP包含阳离子脂质、中性脂质、类固醇、聚合物缀合的脂质；以及包封在脂质纳米粒子中的或与脂质纳米粒子结合的RNA。
在一些实施方案中，LNP包含40-55mol％、40-50mol％、41-50mol％、42-50mol％、43-50mol％、44-50mol％、45-50mol％、46-50mol％、46-49mol％或约47或48mol％的阳离子脂质。在一些实施方案中，LNP包含约46.0、46.1、46.2、46.3、46.4、46.5、46.6、46.7、46.8、46.9、47.0、47.1、47.2、47.3、47.4、47.5、47.6、47.7、47.8、47.9、48.0、48.1、48.2、48.3、48.4、48.5、48.6、48.7、48.8、48.9或49mol％的阳离子脂质。
在一些实施方案中，中性脂质以5-15mol％、7-13mol％或9-11mol％的浓度存在。在一些实施方案中，中性脂质以约10mol％的浓度存在。
在一些实施方案中，类固醇以30-50mol％、35-45mol％或38-43mol％范围的浓度存在。在一些实施方案中，类固醇以约41mol％的浓度存在。
在一些实施方案中，LNP包含1-10mol％、1-5mol％或1-2.5mol％的聚合物缀合的脂质。在一些实施方案中，聚合物缀合的脂质以约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0mol％的浓度存在。
在一些实施方案中，LNP包含45-50mol％的阳离子脂质；5-15mol％的中性脂质；35-45mol％的类固醇；1-5mol％的聚合物缀合的脂质；以及包封在脂质纳米粒子内或与脂质纳米粒子结合的RNA。
在一些实施方案中，mol％是基于脂质纳米粒子中存在的脂质的总mol来确定的。在一些实施方案中，基于脂质纳米粒子中存在的阳离子脂质、中性脂质、类固醇和聚合物缀合的脂质的总mol来确定mol％。
在一些实施方案中，中性脂质选自：DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE、DOPG、DPPG、POPE、DPPE、DMPE、DSPE和SM。在一些实施方案中，中性脂质选自：DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE和SM。在一些实施方案中，中性脂质是DSPC。
在一些实施方案中，类固醇是胆固醇。
在一些实施方案中，聚合物缀合的脂质是聚乙二醇化的脂质。在一些实施方案中，聚乙二醇化的脂质具有以下结构：
或其药学上可接受的盐、互变异构体或立体异构体，其中：
R12和R13各自独立地为直链或支链的饱和或不饱和烷基链，其包含10-30个碳原子，其中所述烷基链任选地被一个或多个酯键中断；并且w具有的均值范围为30-60。在一些实施方案中，R12和R13各自独立地为直链的饱和烷基链，其包含12-16个碳原子。在一些实施方案中，w具有的均值范围为40-55。在一些实施方案中，均值w为约45。在一些实施方案中，R12和R13各自独立地为直链的饱和烷基链，其包含约14个碳原子，并且w具有约45的均值。
在一些实施方案中，聚乙二醇化的脂质是或包含2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺。
在一些实施方案中，LNPs的阳离子脂质组分具有式(III)的结构：
或其药学上可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中：
L1或L2之一为–O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-or-NRaC(＝O)O-，并且L1或L2中的另一个为–O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O或直接的键；
G1和G2各自独立地为未取代的C1-C12亚烷基或C1-C12亚烯基；
G3为C1-C24亚烷基、C1-C24亚烯基、C3-C8环亚烷基、C3-C8环亚烯基；
Ra为H或C1-C12烷基；
R1和R2各自独立地为C6-C24烷基或C6-C24烯基；
R3为H、OR5、CN、-C(＝O)OR4、-OC(＝O)R4或–NR5C(＝O)R4；
R4为C1-C12烷基；
R5为H或C1-C6烷基；并且
x为0、1或2。
在式(III)的一些前述实施方案中，脂质具有以下结构(IIIA)或(IIIB)中的一种：
其中：
A是3-8元的环烷基或环亚烷基环；
R6在每次出现时都独立地为H、OH或C1-C24烷基；
n是范围为1-15的整数。
在式(III)的一些前述实施方案中，脂质具有结构(IIIA)，并且在其它实施方案中，脂质具有结构(IIIB)。
在式(III)的其它实施方案中，脂质具有以下结构(IIIC)或(IIID)中的一种：
其中y和z各自独立地是范围为1-12的整数。
在式(III)的任何前述实施方案中，L1或L2之一为-O(C＝O)-。例如，在一些实施方案中，L1和L2中的每个都是-O(C＝O)-。在任何前述的一些不同实施方案中，L1和L2各自独立地为-(C＝O)O-或-O(C＝O)-。例如，在一些实施方案中，L1和L2中的每个都是-(C＝O)O-。
在式(III)的一些不同的实施方案中，脂质具有以下结构(IIIE)或(IIIF)中的一种：
在式(III)的一些前述实施方案中，脂质具有以下结构(IIIG)、(IIIH)、(IIII)或(IIIJ)中的一种：
在式(III)的一些前述实施方案中，n是范围为2-12，例如2-8或2-4的整数。例如，在一些实施方案中，n是3、4、5或6。在一些实施方案中，n是3。在一些实施方案中，n是4。在一些实施方案中，n是5。在一些实施方案中，n是6。
在式(III)的一些其他的前述实施方案中，y和z各自独立地是范围为2-10的整数。例如，在一些实施方案中，y和z各自独立地是范围为4-9或4-6的整数。
在式(III)的一些前述实施方案中，R6是H。在其他的前述实施方案中，R6是C1-C24烷基。在其他实施方中，R6是OH。
在式(III)的一些实施方案中，G3未被取代。在其他实施方中，G3被取代。在各种不同的实施方案中，G3是线性C1-C24亚烷基或线性C1-C24亚烯基。
在式(III)的一些其他的前述实施方案中，R1或R2或二者都是C6-C24烯基。例如，在一些实施方案中，R1和R2各自独立地具有以下结构：
其中：
R7a和R7b在每次出现时都独立地为H或C1-C12烷基；并且a是2-12的整数，其中R7a、R7b和a各自的选择使得R1和R2各自独立地包含6-20个碳原子。例如，在一些实施方案中，a是范围为5-9或8-12的整数。
在式(III)的一些前述实施方案中，R7a的至少一次出现是H。例如，在一些实施方案中，R7a在每次出现时都是H。在前述的其他不同的实施方案中，R7b的至少一次出现是C1-C8烷基。例如，在一些实施方案中，C1-C8烷基是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基或正辛基。
在式(III)的不同实施方案中，R1或R2或二者具有以下结构中的一种：
在式(III)的一些前述实施方案中，R3是OH、CN、-C(＝O)OR4、-OC(＝O)R4或–NHC(＝O)R4。在一些实施方案中，R4是甲基或乙基。
在各种不同的实施方案中，式(III)的阳离子脂质具有下表中所示的结构之一。
式(III)的代表性化合物。
各种脂质(包括例如，阳离子脂质、中性脂质和聚合物缀合的脂质)是本领域已知的，并且在本文中可用于形成脂质纳米粒子，例如，靶向特定细胞类型(例如，肝细胞)的脂质纳米粒子。在一些实施方案中，本文所述的药物组合物中包括的阳离子脂质可以是((3-羟丙基)氮亚烷基)双(壬烷-9,1-二基)双(2-辛酸丁酯)或其衍生物。在一些实施方案中，本文所述的药物组合物中包括的中性脂质可以是或包含磷脂或其衍生物(例如，1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPSC))和/或胆固醇。在一些实施方案中，本文所述的药物组合物中包括的聚合物缀合的脂质可以是PEG缀合的脂质(例如，2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺或其衍生物)。
在一些实施方案中，LNP包含式(III)的脂质、RNA、中性脂质、类固醇和聚乙二醇化的脂质。在一些实施方案中，式(III)的脂质是化合物III-45。在一些实施方案中，中性脂质是DSPC。在一些实施方案中，类固醇是胆固醇。在一些实施方案中，聚乙二醇化的脂质是ALC-0159。
ALC-0159：
在一些实施方案中，阳离子脂质以约45摩尔％至约50摩尔％的量存在于LNP中。在一些实施方案中，中性脂质以约5摩尔％至约15摩尔％的量存在于LNP中。在一些实施方案中，类固醇以约35摩尔％至约45摩尔％的量存在于LNP中。在一些实施方案中，聚乙二醇化的脂质以约1摩尔％至约5摩尔％的量存在于LNP中。
在一些实施方案中，LNP包含约45摩尔％至约50摩尔％的量的化合物III-45、约5摩尔％至约15摩尔％的量的DSPC、约35摩尔％至约45摩尔％的量的胆固醇和约1摩尔％至约5摩尔％的量的ALC-0159。
在一些实施方案中，LNP包含约47摩尔％或48摩尔％的量的化合物III-45、约10摩尔％的量的DSPC、约41摩尔％的量的胆固醇和约1.6摩尔％或1.7摩尔％的量的ALC-0159。
N/P值优选地至少为约4。在一些实施方案中，N/P值范围为4-20、4-12、4-10、4-8或5-7。在一些实施方案中，N/P值为约6。
给予的RNAs的实施方案
在一些实施方案中，本文所述的组合物或药物制剂包含编码第一多肽链的RNA和编码第二多肽链的RNA，所述第一和第二多肽链彼此相互作用以形成本文所述的结合剂。同样，本文所述的方法包括给予这样的RNA。在一些实施方案中，RNA是体外转录的RNA。
在一些实施方案中，RNA是核苷修饰的mRNA(modRNA)。在一些实施方案中，核苷修饰的信使RNA(modRNA)药物物质的有效成分是在进入细胞，例如干细胞后翻译的单链mRNA。在一些实施方案中，modRNA包含针对RNA的最大功效进行了优化的常见结构元件(5’帽、5'-UTR、3'-UTR、多聚(A)尾)。在一些实施方案中，modRNA包含1-甲基-假尿苷，而非尿苷。在一些实施方案中，5’帽结构是m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG。在一些实施方案中，5'-UTR和3'-UTR分别包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列和SEQ ID NO:9的核苷酸序列。在一些实施方案中，多聚(A)尾包含SEQ ID NO:10的序列。在一些实施方案中，对modRNA应用另外的纯化步骤，以减少在体外转录反应期间产生的dsRNA污染物。
下面描述第一RNA和第二RNA的一些实施方案。在描述其元素时，使用的某些术语具有以下含义：
5’UTR：具有优化的‘Kozak序列’以增加翻译效率的人α-珠蛋白mRNA的5'-UTR序列。
sec：sec对应于分泌信号肽(sec)，其引导新生多肽链易位到内质网中。
3’UTR：3'-UTR是来源于“分裂的氨基端增强子”(AES)mRNA(称为F)和线粒体编码的12S核糖体RNA(称为I)的两个序列元件的组合。这些是通过赋予RNA稳定性和增加总蛋白表达的序列的离体选择过程来鉴定的。
多聚A：多聚(A)尾，其测量为110个核苷酸长度，由30个腺苷残基、随后的10个核苷酸接头序列和设计为增强树突细胞中的RNA稳定性和翻译效率的另外70个腺苷残基的延伸组成。
VH(aCD3)：对CD3具有特异性的免疫球蛋白的重链可变区。
VL(aCD3)：对CD3具有特异性的免疫球蛋白的轻链可变区。
CH1：免疫球蛋白重链的恒定区1。
CL：免疫球蛋白轻链的恒定区。
VH(aCLDN6)：对CLDN6具有特异性的免疫球蛋白的重链可变区。
VL(aCLDN6)：对CLDN6具有特异性的免疫球蛋白的轻链可变区。
RBP022.1(SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5)-"第一RNA"的实施方案
CAP1(m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG)-5’UTR-sec-VH(aCD3)-CH1-VH(aCLDN6)-VL(aCLDN6)-3UTR-多聚A
RBP021.1(SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:7)-"第二RNA"的实施方案
CAP1(m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG)-5’UTR-sec-VL(aCD3)-CL-VH(aCLDN6)-VL(aCLDN6)-3’UTR-多聚A
RBP022.1和RBP021.1的核苷酸序列
核苷酸序列显示为具有单独的序列元件，如粗体字母所示的。另外，翻译的蛋白的序列以斜体字母显示在编码核苷酸序列下方(*＝终止密码子)。
RBP022.1
RBP021.1
在一些实施方案中，本文所述的第一RNA包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的第二RNA包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列。
本文所述的RNA优选地配制在脂质纳米粒子(LNP)中。在一些实施方案中，LNP包含阳离子脂质、中性脂质、类固醇、聚合物缀合的脂质；以及RNA。在一些实施方案中，阳离子脂质是ALC-0366，中性脂质是DSPC，类固醇是胆固醇，并且聚合物缀合的脂质是ALC-0159。优选的给药模式是静脉内给药。
在一些实施方案中，药物产品包含以下所示的组分
在一些实施方案中，药物产品包含以下所示的组分，优选地以以下所示的比例或浓度包含：
ALC-0366，((3-羟丙基)氮亚烷基)双(壬烷-9,1-二基)双(2-辛酸丁酯)；
ALC-0159,2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺；
DSPC＝1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；DS＝药物物质；Ph.Eur.＝欧洲药典；q.s.＝适量(尽可能足够)；USP-NF＝美国药典和国家处方集。
在一些实施方案中，mRNA与总脂质(N/P)的比率在6.0和6.5之间，如约6.0或约6.3。
药物组合物
本文所述的试剂可以在药物组合物或药物中给药，并且可以以任何合适的药物组合物的形式给药。
在一些实施方案中，在药物组合物包含如本文所述的第一RNA和第二RNA的情况下，这样的第一RNA和第二RNA可以以约3:1至约1:3的摩尔比存在，或者在一些实施方案中，以约2:1至约1:2的摩尔比存在，或者在一些实施方案中，以约1.5:1至约1:1.5的摩尔比存在。在一些实施方案中，这样的第一RNA和第二RNA可以以约3:1至约1:1的摩尔比存在，或者在一些实施方案中，以约2:1至约1:1的摩尔比存在，或者在一些实施方案中，以约1.5:1的摩尔比存在。
在一些实施方案中，在药物组合物包含如本文所述的第一RNA和第二RNA的情况下，这样的第一RNA和第二RNA可以以约3:1至约1:3的重量(w/w)比存在，或者在一些实施方案中，以约2:1至约1:2的(w/w)比例存在，或者在一些实施方案中，以约1.5:1至约1:1.5的(w/w)比例存在。在一些实施方案中，这样的第一RNA和第二RNA可以以约3:1至约1:1的(w/w)比例存在，或者在一些实施方案中，以约2:1至约1:1的(w/w)比例存在，或者在一些实施方案中，以约1.75:1至约1.25:1的(w/w)比例存在，或者在一些实施方案中，以约1.75:1至约1.5:1的(w/w)比例存在，或者在一些实施方案中，以约1.5:1至约1.25:1的(w/w)比例存在，或者在一些优选的实施方案中，以约1.5:1的(w/w)比例存在。
在一些实施方案中，本文所述的药物组合物是用于治疗对象中的癌症的组合物。
在本发明的所有方面的一些实施方案中，本文所述的组分如编码结合剂的RNA可以在药物组合物中给药，所述药物组合物可以包含药学上可接受的载体，并且可以任选地包含一种或多种佐剂、稳定剂等。在一些实施方案中，药物组合物用于治疗性或预防性治疗，例如，用于治疗或预防癌症。
术语“药物组合物”涉及包含治疗有效试剂的制剂，优选与药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂一起。所述药物组合物可用于通过向对象给予所述药物组合物来治疗、预防或降低疾病或病症的严重性。药物组合物也是本领域已知的药物制剂。
根据本公开的药物组合物通常以“药学上有效的量”和“药学上可接受的制剂”应用。
术语“药学上可接受的”是指与药物组合物的活性成分的作用不相互作用的物质的无毒性。
术语“药学上有效的量”或“治疗上有效的量”是指单独或与其他剂量一起实现期望反应或期望效果的量。在治疗特定疾病的情况下，期望的反应优选涉及抑制疾病的过程。这包括减缓疾病的进展，且特别是中断或逆转疾病的进展。在疾病治疗中所期望的反应也可以是延迟所述疾病或所述病况的发作或预防其发作。本文所述组合物的有效量将取决于待治疗的病况、疾病的严重程度、患者的个体参数，包括年龄、生理条件、大小和体重、治疗的持续时间、伴随治疗的类型(如果存在)、给药的具体途径和类似因素。因此，本文所述组合物的给药剂量可以取决于各种这样的参数。在初始剂量下患者中的反应不充分的情况下，可以使用更高的剂量(或通过不同的、更局部的给药途径实现的有效地更高的剂量)。
在一些实施方案中，本文所述的药物组合物的每一剂量或累积剂量可包含编码靶向CLDN6的结合剂的RNA，其量为0.05μg/kg或更多，例如，其量为0.05μg/kg-5mg/kg，或者0.05μg/kg-500μg/kg，或者0.5μg/kg-500μg/kg，或者1μg/kg-50μg/kg，或者5μg/kg-150μg/kg，或者15μg/kg-150μg/kg，其中kg是指待治疗的对象的kg体重。如技术人员将清楚的，由于本文公开的结合剂包含两种多肽，每种多肽由单独的RNA编码，所指示的量与编码第一和第二多肽链的RNA的累积量有关。优选地，每一剂量或累积剂量包含编码第一和第二多肽链的RNA的混合物，其总量为5μg/kg-150μg/kg，或者15μg/kg-150μg/kg。
在一些实施方案中，给予本文所述的药物组合物以递送本文所述的编码针对CLDN6的结合剂的RNA(例如，mRNA)，以实现约0.05ng/mL或更高的结合剂水平(例如，血浆水平和/或组织水平)。
在一些实施方案中，给药可以仅涉及单一剂量。在一些实施方案中，给药可以涉及应用固定数量的剂量。在一些实施方案中，给药可以涉及间歇性剂量(例如，在时间上分开的多剂剂量)和/或周期性(例如，由共同的时间段分开的单独剂量)剂量。在一些实施方案中，给药可以涉及连续剂量(例如，灌注)，至少持续一段选定的时间。
在一些实施方案中，本文所述的药物组合物在至少一个或多个(包括例如，至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少其个、至少八个或更多个)剂量周期中被给予患有CLDN6阳性癌症，例如，CLDN6阳性实体瘤的对象。在一些实施方案中，每个剂量周期可以是三周的剂量周期。在一些实施方案中，本文所述的药物组合物以每个剂量周期至少一剂剂量给药。在一些实施方案中，剂量周期涉及给予设定数量和/或模式的剂量；在一些实施方案中，剂量周期涉及给予设定的累积剂量，例如，在特定的时间段内，并且任选地经由多剂剂量，其可以例如以设定的间隔和/或根据设定的模式给药。
本领域技术人员知道剂量周期中通常给予的癌症治疗剂。在一些实施方案中，本文所述的药物组合物在一个或多个剂量周期中给药。
在一些实施方案中，一个剂量周期是至少3天或更多天(包括例如，至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天、至少21天、至少22天、至少23天、至少24天、至少25天、至少26天、至少27天、至少28天、至少29天、至少30天。
在一些实施方案中，一个给药周期可以涉及多剂剂量，例如，根据一种模式，诸如例如，一剂剂量可以在一个周期内每天给药，或者一剂剂量可以在一个周期内每2天、每3天、每4天、每5天、每6天、每7天给药。
在一些实施方案中，可以给予多个周期。例如，在一些实施方案中，可以给予至少2个周期(包括例如，至少3个周期、至少4个周期、至少5个周期、至少6个周期、至少7个周期、至少8个周期、至少9个周期、至少10个周期或更多个周期)。在一些实施方案中，可以给予至少3-8个剂量周期。
在一些实施方案中，周期之间可能有“休息期”；在一些实施方案中，周期之间可能不存在休息期。在一些实施方案中，周期之间有时可能存在休息期，并且有时可能不存在休息期。
本公开的药物组合物可以包含盐、缓冲剂、防腐剂，以及任选地其他治疗剂。在一些实施方案中，本公开的药物组合物包含一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。
用于本公开的药物组合物的合适的防腐剂包括但不限于苯扎氯铵、氯丁醇、对羟基苯甲酸酯和硫柳汞。
本文使用的术语“赋形剂”是指可能存在于本公开的药物组合物中但不是活性成分的物质。赋形剂的实例包括但不限于载体、粘合剂、稀释剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂、调味剂或着色剂。
术语“稀释剂”涉及稀释剂和/或冲淡剂。此外，术语“稀释剂”包括流体、液体或固体悬浮液和/或混合介质中的任何一种或多种。合适的稀释剂的实例包括乙醇、甘油和水。
术语“载体”是指可以是天然的、合成的、有机的、无机的组分，其中活性组分被组合以促进、增强或实现药物组合物的给药。本文所用的载体可以是一种或多种适用于向对象给药的相容的固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。合适的载体包括但不限于无菌水、林格氏液、乳酸林格氏液、无菌氯化钠溶液、等渗盐水、聚亚烷基二醇、氢化萘，以及特别地生物相容性丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物。在一些实施方案中，本公开的药物组合物包括等渗盐水。
用于治疗用途的药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂在药学领域中是众所周知的，并且例如在Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.(A.RGennaro编辑.1985)中进行了描述。
可以关于预期的给药途径和标准药物实践选择药物载体、赋形剂或稀释剂。
在一些实施方案中，本文所述的药物组合物还可以包含一种或多种添加剂，例如，在一些实施方案中，可以增强这样的组合物在某些条件下的稳定性的添加剂。例如，在一些实施方案中，药物组合物还可以包含冷冻保护剂(例如，蔗糖)和/或水性缓冲溶液，其在一些实施方案中可以包括一种或多种盐(例如，钠盐)。
在一些实施方案中，本文所述的药物组合物可以经静脉内、动脉内、皮下、皮内或肌内给药。在一些实施方案中，药物组合物被配制用于局部给药或全身给药。全身给药可以包括肠内给药，其设计通过胃肠道吸收，或者肠胃外给药。如本文所用，“肠胃外给药”是指通过胃肠道以外的任何方式给药，如通过静脉内注射。在一些实施方案中，药物组合物被配制用于全身给药，例如用于静脉内给药。
本文使用的术语“共同给药”意指借以将不同的化合物或组合物给药给同一患者的过程。不同的化合物或组合物可以同时、基本上同时或按顺序给药。
本文所述试剂和治疗的效应
本文所述的治疗可在靶细胞上产生免疫效应器功能，例如T细胞介导的效应器功能，这可导致靶细胞的杀伤。在一些实施方案中，在本发明的上下文中的效应器功能包括细胞毒性CD4+和/或CD8+淋巴细胞(CTLs)的激活和靶细胞，即以抗原，即CLDN6的表达为特征的细胞的清除，例如，经由细胞凋亡或穿孔素介导的细胞凋亡和细胞裂解、细胞因子如IFN-γ和TNF-α的产生，以及表达抗原的靶细胞的特异性细胞毒性。
激活后，细胞毒性淋巴细胞可以触发靶细胞的破坏。例如，细胞毒性T细胞可以通过以下方式中的一种或两种触发靶细胞的破坏。首先，激活后，T细胞释放细胞毒素，如穿孔素、颗粒酶和颗粒溶素。穿孔素和颗粒溶素在靶细胞中产生孔，并且颗粒酶进入细胞并在细胞质中触发胱天蛋白酶级联反应，其诱导细胞的凋亡(程序性细胞死亡)。其次，可以经由T细胞和靶细胞之间的Fas-Fas配体相互作用来诱导凋亡。
在一些实施方案中，本文所述的包含对癌细胞表达的CLDN6具有特异性的两个结合域和对T细胞表达的CD3具有特异性的结合域的结合剂靶向表达CD3的T细胞对表达CLDN6的癌细胞的细胞毒性效应。在一些实施方案中，结合剂与T细胞上的CD3的结合导致T细胞的增殖和/或活化。在一些实施方案中，T细胞释放细胞毒性因子，例如穿孔素和颗粒酶，并启动癌症细胞的细胞溶解和凋亡。在一些实施方案中，结合剂诱导T细胞介导的针对表达CLDN6的癌细胞的细胞毒性。在一些实施方案中，结合剂引发如本文所述的免疫效应器功能。在一些实施方案中，所述免疫效应器功能针对在其表面上携带肿瘤相关抗原CLDN6的细胞。
在一些实施方案中，癌细胞来自选自以下的癌症：尿道膀胱癌、卵巢癌，特别是卵巢腺癌和卵巢畸胎癌、肺癌，包括小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，特别是鳞状细胞肺癌和腺癌或非鳞状型的非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌，特别是基底细胞癌和鳞状细胞癌、恶性黑色素瘤、头颈癌，特别是恶性多形性腺瘤、肉瘤，特别是滑膜肉瘤和癌肉瘤、胆管癌、尿道膀胱癌，特别是移行细胞癌和乳头状癌、肾癌，特别是肾细胞癌，包括透明细胞肾细胞癌和乳头状肾细胞癌、结肠癌、小肠癌，包括回肠癌，特别是小肠腺癌和回肠腺癌、睾丸胚胎性癌、胎盘绒毛膜癌、子宫颈癌、睾丸癌，特别是睾丸精原细胞瘤、睾丸畸胎瘤和胚胎睾丸癌、子宫癌、生殖细胞肿瘤如畸胎癌或胚胎癌，特别是睾丸的生殖细胞肿瘤，以及以上的转移形式。
如本文所用，“免疫反应”是指对抗原或表达抗原的细胞的综合身体反应，并且是指细胞免疫反应和/或体液免疫反应。免疫系统分为脊椎动物的第一线先天免疫系统和获得性或适应性免疫系统，每个系统都含有体液和细胞成分。
“细胞介导的免疫”、“细胞免疫”、“细胞免疫应答”或类似术语意指包括针对以抗原表达为特征，特别是以具有I类或II类MHC的抗原的呈递为特征的细胞的细胞反应。细胞反应涉及免疫效应细胞，特别是被称为T细胞或T淋巴细胞的细胞，它们充当“助手”或“杀手”。辅助T细胞(也称为CD4+T细胞)通过调节免疫反应发挥中心作用，并且杀伤细胞(也称为细胞毒性T细胞、溶细胞性T细胞)杀伤患病细胞，如病毒感染的细胞，防止产生更多患病细胞。
在本发明的上下文中，术语“免疫效应细胞”或“免疫反应细胞”涉及在免疫反应期间发挥效应器功能的细胞。例如，免疫效应细胞包括T细胞(细胞毒性T细胞、辅助T细胞、肿瘤浸润性T细胞)、B细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突细胞。优选地，在本发明的上下文中，“免疫效应细胞”是T细胞，优选CD4+和/或CD8+T细胞，最优选CD8+T细胞。根据本发明，术语“免疫效应细胞”还包括可以在适当刺激下成熟为免疫细胞(如T细胞，特别是T辅助细胞或溶细胞性T细胞)的细胞。免疫效应细胞包括CD34+造血干细胞、未成熟和成熟的T细胞以及未成熟和成熟的B细胞。当暴露于抗原时，T细胞前体分化为溶细胞性T细胞，类似于免疫系统的克隆选择。
术语“T细胞”和“T淋巴细胞”在本文中可互换使用，并且包括但不限于T辅助细胞(CD4+T细胞)和包含溶细胞性T细胞的细胞毒性T细胞(CTLs)。
T细胞属于一组被称为淋巴细胞的白细胞，并且在细胞介导的免疫中起着中心作用。它们可以通过其细胞表面上存在的称为T细胞受体(TCR)的特殊受体而与其他淋巴细胞类型，如B细胞和自然杀伤细胞区分开来。胸腺是负责T细胞成熟的主要器官。已经发现了几种不同的T细胞亚群，每种亚群都有不同的功能。
T辅助细胞在免疫过程中辅助其他白细胞，包括B细胞成熟为浆细胞和细胞毒性T细胞和巨噬细胞的激活等功能。这些细胞也被称为CD4+T细胞，因为它们在其表面表达CD4糖蛋白。当辅助T细胞通过在抗原呈递细胞(APCs)的表面上表达的MHC II类分子呈递肽抗原时，辅助T细胞被激活。一旦被激活，它们就会迅速分裂，并分泌称为细胞因子的小蛋白质，其调节或协助活跃的免疫反应。
细胞毒性T细胞破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且也与移植排斥反应有关。这些细胞也被称为CD8+T细胞，因为它们在其表面上表达CD8糖蛋白。这些细胞通过与存在于身体几乎每个细胞表面的MHC I类相关抗原结合来识别其靶标。
大多数T细胞具有作为几种蛋白质的复合物存在的T细胞受体(TCR)。T细胞的TCR能够与和主要组织相容性复合体(MHC)分子结合并呈现在靶细胞表面上的免疫原性肽(表位)相互作用。TCR的特异性结合触发T细胞内的信号级联，导致增殖和分化为成熟的效应T细胞。实际的T细胞受体由两条单独的肽链组成，这两条肽链从独立的T细胞受体α和β(TCRα和TCRβ)基因产生，并且称为α-TCR和β-TCR链。γδT细胞(γΔT细胞)代表T细胞的一个小子集，其表面上具有不同的T细胞受体(TCR)。然而，在γδT细胞中，TCR由一条γ链和一条δ链组成。这组T细胞(占总T细胞的2％)远不如αβT细胞常见。
“体液免疫”或“体液免疫反应”是由在细胞外液中发现的大分子，如分泌的抗体、补体蛋白和某些抗菌肽介导的免疫方面。它与细胞介导的免疫形成对比。其涉及抗体的方面通常被称为抗体介导的免疫。
术语“巨噬细胞”是指由单核细胞分化产生的吞噬细胞的亚群。被炎症、免疫细胞因子或微生物产物激活的巨噬细胞通过水解和氧化攻击非特异性地吞噬并杀死巨噬细胞内的外来病原体，导致病原体降解。来自降解的蛋白质的肽展示在巨噬细胞表面上，在那里它们可以被T细胞识别，并且它们可以直接与B细胞表面上的抗体相互作用，导致T和B细胞活化并进一步刺激免疫反应。巨噬细胞属于抗原呈递细胞的类别。在一些实施方案中，巨噬细胞是脾巨噬细胞。
术语“树突细胞”(DC)是指属于抗原呈递细胞类别的吞噬细胞的另一种亚型。在一些实施方案中，树突细胞来源于造血骨髓祖细胞。这些祖细胞最初转化为未成熟的树突细胞。这些未成熟细胞的特征在于高吞噬活性和低T细胞活化潜能。未成熟的树突细胞不断地针对诸如病毒和细菌等病原体对周围环境进行采样。一旦它们与可呈递的抗原接触，它们就会被激活为成熟的树突细胞，并开始迁移到脾脏或淋巴结。未成熟的树突细胞吞噬病原体并将其蛋白质降解成小块，并且在成熟后，使用MHC分子将那些片段呈递在其细胞表面处。同时，它们上调在T细胞活化中充当共受体的细胞表面受体，如CD80、CD86和CD40，大大增强了它们活化T细胞的能力。它们还上调CCR7，CCR7是一种趋化受体，其诱导树突细胞通过血流到达脾脏或通过淋巴系统到达淋巴结。在这里，它们充当抗原呈递细胞，并通过向辅助T细胞和杀伤T细胞以及B细胞呈递抗原以及非抗原特异性的共刺激信号来激活辅助T细胞和杀伤T细胞以及B细胞。因此，树突细胞可以主动诱导T细胞或B细胞相关的免疫反应。在一些实施方案中，树突细胞是脾树突细胞。
术语“抗原呈递细胞”(APC)是能够在其细胞表面上(或在其表面处)展示、获得和/或呈递至少一种抗原或抗原片段的多种细胞中的细胞。抗原呈递细胞可分为专业抗原呈递细胞和非专业抗原呈递细胞。
术语“专业抗原呈递细胞”涉及组成性表达与幼稚T细胞相互作用所需的主要组织相容性复合体II类(MHC II类)分子的抗原呈递细胞。如果T细胞与抗原呈递细胞膜上的MHCII类分子复合物相互作用，则抗原呈递细胞产生共刺激分子，诱导T细胞的活化。专业抗原呈递细胞包括树突细胞和巨噬细胞。
术语“非专业抗原呈递细胞”涉及抗原呈递细胞，其不组成性表达MHC II类分子，但在某些细胞因子如干扰素γ的刺激下表达。示例性的非专业抗原呈递细胞包括成纤维细胞、胸腺上皮细胞、甲状腺上皮细胞、神经胶质细胞、胰腺β细胞或血管内皮细胞。
“抗原加工”是指将抗原降解为加工产物，其为所述抗原的片段(例如，将蛋白质降解为肽)，以及这些片段中的一个或多个与MHC分子的结合(例如，经由结合)，以被细胞如抗原呈递细胞呈递给特异性T细胞。
本文所用的“激活”或“刺激”是指已被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的免疫效应细胞如T细胞的状态。激活也可能与信号传导通路的启动、诱导的细胞因子产生和可检测的效应器功能有关。术语“激活的免疫效应细胞”是指正在进行细胞分裂的免疫效应细胞等。
术语“引发”是指这样的过程，其中免疫效应细胞如T细胞首次与其特异性抗原接触并导致分化为效应细胞如效应T细胞。
术语“克隆扩增”或“扩增”是指这样的过程，其中特定实体倍增。在本公开的上下文中，该术语优选用于免疫应答的上下文，其中免疫效应细胞被刺激、增殖，并且特异性免疫效应细胞扩增。优选地，克隆扩增导致免疫效应细胞的分化。
治疗
本发明提供了本文所述的用于治疗或预防对象中的疾病或病症，特别是与CLDN6表达相关的疾病，如CLDN6阳性癌症的方法和试剂。本文所述的方法可包括给予有效量的组合物，其包含编码本文所述的结合剂的RNA。
术语“与表达相关的疾病”在其指的是抗原时，是指涉及抗原的任何疾病，例如以抗原存在为特征的疾病。抗原可以是疾病相关的抗原，如肿瘤相关的抗原，例如CLDN6。在一些实施方案中，与抗原表达相关的疾病是涉及优选在细胞表面上表达抗原的细胞的疾病。
本发明的治疗性化合物或组合物可以预防性地(即以预防疾病或病症)或治疗性地(即以治疗疾病或病症)给予患有疾病或病症，或者有(或易感)发展疾病或病症的风险的对象。这类对象可以使用标准临床方法进行鉴定。在本发明的上下文中，预防性给药发生在疾病的明显临床症状显现之前，从而预防疾病或病症，或者在其他情况下延迟其进展。在医学领域的上下文中，术语“预防”包括任何减轻疾病死亡率或发病率负担的活动。预防可以一级、二级和三级预防水平出现。虽然一级预防避免了疾病的发展，但二级和三级预防水平包括旨在预防疾病进展和症状出现，以及通过恢复功能和减少与疾病相关的并发症来减少已经确立的疾病的负面影响的活动。
在一些实施方案中，本发明的试剂或组合物的给药可以通过单次给药进行或通过多次给药来加强。
术语“疾病”是指影响个体身体的异常状况。疾病通常被解释为与特定症状和体征相关的医疗状况。疾病可能是由起源于外部来源的因素引起的，如传染性疾病，或者其可能是由内部功能障碍引起的，如自身免疫性疾病。在人类中，“疾病”通常被更广泛地用于指给受影响的个体造成疼痛、功能障碍、痛苦、社会问题或死亡，或者与个体接触的那些的类似问题的任何状况。在该更广泛的意义上，它有时包括损伤、残疾、障碍、综合征、感染、孤立症状、异常行为以及结构和功能的非典型变化，而在其他情况下以及出于其他目的，这些可能被认为是可区分的类别。疾病通常不仅在身体上，而且在情感上影响个体，因为感染许多疾病和携带许多疾病生活可能改变一个人对生活的看法和一个人的个性。
如本文所用，术语“疾病”包括癌症，特别是本文所述的癌症的那些形式。本文中对癌症或特定形式的癌症的任何引用也包括其癌症转移。在一些实施方案中，根据本申请的待治疗的疾病与表达CLDN6的细胞相关。
根据本发明，“与表达CLDN6的细胞相关的疾病”或类似表达意指CLDN6在患病组织或器官的细胞中表达。在一些实施方案中，与健康组织或器官中的状态相比，患病组织或器官的细胞中CLDN6的表达增加。增加是指增加至少10％，特别是至少20％、至少50％、至少100％、至少200％、至少500％、至少1,000％、至少10,000％或甚至更多。在一些实施方案中，仅在患病组织中发现表达，而在健康组织中的表达被抑制。根据本发明，与表达CLDN6的细胞相关的疾病包括癌症疾病。此外，根据本发明，癌症疾病优选地是其中癌症细胞表达CLDN6的那些。
如本文所用，“癌症疾病”或“癌症”包括以异常调节的细胞生长、增殖、分化、粘附和/或迁移为特征的疾病。通过“癌细胞”意指异常细胞，其通过快速、不受控制的细胞增殖而生长，并在启动新生长的刺激停止后继续生长。优选地，“癌症疾病”的特征在于表达CLDN6的细胞，并且癌细胞表达CLDN6。表达CLDN6的细胞优选为癌细胞，优选本文所述的癌症。
根据本发明的术语“癌症”包括白血病、精原细胞瘤、黑色素瘤、畸胎瘤、淋巴瘤、神经母细胞瘤、胶质瘤、直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肾上腺癌、甲状腺癌、血液癌症、皮肤癌、脑癌、子宫颈癌、肠道癌症、肝癌、结肠癌、胃癌、肠癌、头颈癌、胃肠道癌、淋巴结癌、食管癌、结直肠癌、胰腺癌、耳鼻喉(ENT)癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、卵巢癌和肺癌，以及以上的转移。其实例为肺癌、乳癌、前列腺癌、结肠癌、肾细胞癌、宫颈癌，或者上述癌症类型或肿瘤的转移。根据本发明的术语癌症还包括癌症转移。
根据本发明，“癌”是来源于上皮细胞的恶性肿瘤。该组代表了最常见的癌症，包括常见形式的乳腺癌、前列腺癌、肺癌和结肠癌。
“腺癌”是起源于腺组织中的癌症。这种组织也是被称为上皮组织的较大组织类别的一部分。上皮组织包括皮肤、腺体和排列在身体空腔和器官中的各种其他组织。上皮在胚胎学上来源于外胚层、内胚层和中胚层。要被归类为腺癌，这些细胞不一定需要是腺体的一部分，只要它们具有分泌特性。这种形式的癌症可以发生在一些高等哺乳动物，包括人类中。高分化的腺癌往往与它们所来源的腺组织相似，而低分化的腺癌可能不相似。通过对来自活组织检查的细胞进行染色，病理学家将确定肿瘤是腺癌还是一些其他类型的癌症。腺癌可发生在身体的许多组织中，这是由于体内腺体的普遍性。虽然每种腺体可能不会分泌相同的物质，但只要细胞具有外分泌功能，它就被认为是腺性的，并因此其恶性形式被称为腺癌。恶性腺癌侵袭其他组织，并通常在给予足够时间进行转移的情况下转移。卵巢腺癌是最常见的卵巢癌类型。它包括浆液性和粘液性腺癌、透明细胞腺癌和子宫内膜样腺癌。
通过“转移”，意指癌细胞从其原来的位点扩散到身体的另一部位。转移的形成是一个非常复杂的过程，并且取决于恶性细胞从原发性肿瘤中分离、细胞外基质的入侵、内皮基底膜的渗透以进入体腔和血管，然后在通过血液转运后渗透靶器官。最后，新肿瘤在靶位点处的生长取决于血管生成。即使在原发性肿瘤被移除后，肿瘤转移也经常发生，因为肿瘤细胞或组分可能会保留并发展出转移潜力。在一些实施方案中，根据本发明的术语“转移”涉及“远处转移”，其涉及远离原发性肿瘤和区域淋巴结系统的转移。在一些实施方案中，根据本发明的术语“转移”涉及淋巴结转移。使用本发明的治疗可治疗的一种特定形式的转移是起源于作为原发性位点的胃癌的转移。在优选实施方案中，这种胃癌转移是Krukenberg瘤、腹膜转移和/或淋巴结转移。
如本文所用，术语“不可切除的肿瘤”通常是指以一种或多种特征为特征的肿瘤，根据合理的医学判断，这些特征被认为表明肿瘤不能安全地(例如，在不对对象造成过度伤害的情况下)通过手术移除，以及/或者与之相关的合格的医学专业人员已经确定肿瘤移除对对象的风险大于与这种移除相关的益处。在一些实施方案中，不可切除的肿瘤是指这样的肿瘤，其涉及和/或已经生长到必要器官或组织(包括可能无法重建的血管)中，以及/或者在其他情况下，其处于不能在没有对一个或多个其他关键或必要器官和/或组织(包括血管)造成损害的不合理风险的情况下，容易地通过手术接近的位置中。在一些实施方案中，肿瘤的“不可切除性”是指实现边缘阴性(R0)切除的可能性。在胰腺癌的上下文中，主要血管被肿瘤包裹，如肠系膜上动脉(SMA)或腹腔轴、门静脉闭塞以及腹腔或主动脉旁淋巴结病的存在，通常被认为是排除R0手术的发现。本领域技术人员将理解决定肿瘤是否不可切除的参数。
“靶细胞”应意指任何非期望的细胞，如癌细胞。在优选的实施方案中，靶细胞表达CLDN6。
在一些实施方案中，CLDN6阳性癌症包括CLDN6阳性的晚期实体瘤。在一些实施方案中，CLDN6阳性癌症选自：晚期/转移性CLDN6阳性卵巢癌、非鳞状型的非小细胞肺癌(NSCLC)、子宫内膜癌和睾丸癌，特别是对其而言没有可能赋予临床益处的可用标准治疗。在一些实施方案中，CLDN6阳性癌症包括其他方面未特指的(NOS)肿瘤，包括罕见肿瘤和未知原发性癌症。这样的癌症可以测试CLDN6的表达。
在一些实施方案中，CLDN6阳性癌症选自：尿道膀胱癌、卵巢癌，特别是卵巢腺癌和卵巢畸胎癌、肺癌，包括小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，特别是鳞状细胞肺癌和腺癌或非鳞状型的非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌，特别是基底细胞癌和鳞状细胞癌、恶性黑色素瘤、头颈癌，特别是恶性多形性腺瘤、肉瘤，特别是滑膜肉瘤和癌肉瘤、胆管癌、尿道膀胱癌，特别是移行细胞癌和乳头状癌、肾癌，特别是肾细胞癌，包括透明细胞肾细胞癌和乳头状肾细胞癌、结肠癌、小肠癌，包括回肠癌，特别是小肠腺癌和回肠腺癌、睾丸胚胎性癌、胎盘绒毛膜癌、子宫颈癌、睾丸癌，特别是睾丸精原细胞瘤、睾丸畸胎瘤和胚胎睾丸癌、子宫癌、生殖细胞肿瘤如畸胎癌或胚胎癌，特别是睾丸的生殖细胞肿瘤，以及以上的转移形式。
在本上下文中，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”或“治疗干预(therapeutic intervention)”涉及为了对抗诸如疾病或病症等状况的目的而对对象进行管理和护理。该术语旨在包括对象所患的给定病况的治疗的完整谱系，如给予治疗有效的化合物以减轻症状或并发症，以延缓疾病、病症或病况的进展、以减轻或缓和症状和并发症，以及/或者以治愈或消除疾病、病症或病况以及预防该病况，其中预防应被理解为为了对抗疾病、病况或病症的目的而对个体进行管理和护理，并且包括给予活性化合物以防止症状或并发症的发作。
术语“治疗性治疗”涉及改善个体的健康状态和/或延长(增加)个体的寿命的任何治疗。所述治疗可以消除个体中的疾病，阻止或减缓个体中疾病的发展，抑制或减缓个体中疾病的发展，降低个体中症状的频率或严重程度，以及/或者减少当前患有或先前患有疾病的个体中的复发。
术语“预防性的治疗(prophylactic treatment)”或“防止性的治疗(preventivetreatment)”涉及旨在防止疾病在个体中发生的任何治疗。术语“预防性的治疗”或“防止性的治疗”在本文中可互换使用。
术语“个体”和“对象”在本文中可互换使用。它们指的是人类或其他哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物)，其可能患有或易患疾病或病症，但可能患有或可能不患有该疾病或病症。在许多实施方案中，个体是人类。除非另有说明，否则术语“个体”和“对象”并不表示特定的年龄，并因此包括成年、老年、儿童和新生儿。在本公开的实施方案中，“个体”或“对象”是“患者”。
术语“患者”意指接受治疗的个体或对象，特别是患病的个体或对象。
本文引用的文件和研究的引用并不旨在承认上述任何内容与现有技术有关。关于这些文件内容的所有声明都基于申请人可获得的信息，并且不构成对这些文件内容正确性的任何承认。
提供以下描述是为了使本领域的普通技术人员能够制作和使用各种实施方案。对具体装置、技术和应用的描述仅作为实例提供。对本文所描述的实例的各种修改对于本领域的普通技术人员来说将是容易显而易见的，并且在不脱离各种实施方案的精神和范围的情况下，本文所定义的一般原理可以应用于其他实例和应用。因此，各种实施方案不旨在局限于本文所述和所示的实例，而是应符合与权利要求一致的范围。
实施例
实施例1：BNT142的物理、化学和药物特性。
药物物质
BNT142药物物质是一种RNA混合物，其编码针对CLDN6和CD3的抗原结合片段基于(Fab)-(scFv)2的双特异性抗体–或三聚体–的重链(HC)和轻链(LC)，下文中称为RiboMab02.1。RiboMab02.1识别CLDN6和CD3epsilon(ε)链的构象表位。药物物质的活性成分是两种单链的、5’加帽的和N1-甲基假尿苷修饰的RNAs的混合物，它们被翻译成各自的蛋白质亚基，并在靶细胞中形成完整的双特异性抗体。图1显示了编码蛋白质的RNAs的一般结构的示意图，其由用作体外RNA转录模板的线性化质粒脱氧核糖核酸(DNA)的相应核苷酸序列决定。除了编码HC和LC的序列外，每种RNA都含有共同的结构元件，这些元件在稳定性和翻译效率方面针对最大功效进行了优化(5’帽、5'-未翻译区[UTR]、3'-UTR和多聚[A]尾)。
药物产品
药物产品的描述
药物产品是用于IV给药的于水性缓冲液中的无菌RNA-LNP分散物。药物产品生产涉及将RNA封装在由专门的脂质组分组成的纳米级脂质颗粒中。一旦在LNP中配制，RNA药物物质就受到保护，免于在血清中降解。LNP制剂使RNA能够从内体室逃逸到细胞胞质溶胶中，在那里它可被翻译成功能蛋白。BNT142药物产品的组成在表2中给出。
表2：BNT142药物产品的组成
ALC-0366，((3-羟丙基)氮亚烷基)双(壬烷-9,1-二基)双(2-辛酸丁酯)；
ALC-0159，2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺；
DSPC＝1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；DS＝药物物质；Ph.Eur.＝欧洲药典；q.s.＝适量(尽可能足够)；USP-NF＝美国药典和国家处方集。
药物产品的pH和渗透压范围通常分别为pH 6.9-7.9和425-625mOsmol/kg。通过动态光散射(DLS)测量的LNP粒径范围为约50-100nm，多分散指数小于或等于0.2。已选择药物产品的粒径，以优化其到达靶组织的能力、其药物负载能力和产品安全性。
在被靶细胞摄取后，编码重链和轻链的RNAs被翻译成各自的蛋白质、折叠并组装，形成完整的双特异性抗体，其随后被分泌。该抗体可通过将细胞毒性T细胞募集到肿瘤细胞上，系统性地用于在表达CLDN6的肿瘤细胞上特异性地作用，并诱导靶标依赖性的多克隆T细胞活化和肿瘤细胞裂解。
BNT142药物产品作为冷冻浓缩的悬浮液提供，以用于在含有1mg/mL配制为RNA-LNP的RNA(包括重量比为1.5:1的第一和第二RNA)的一次性使用的玻璃小瓶中注射。解冻后，将药物产品在可商购获得的等渗NaCl溶液(0.9％)中稀释，并用直列式过滤器过滤。通过IV给药向患者给予IMP。
实施例2：非临床研究
BNT142非临床包装包括初级PD研究，建立概念验证并评估RiboMab02.1的作用模式，以及次级PD研究，预测脱靶特征分析并研究RiboMab02.1的非特异性T细胞激活和细胞因子释放。此外，在GLP顺从性研究中研究了RiboMab02.1的CLDN6结合部分的组织交叉反应性。尽管BNT142在技术上不落入其范围内，但遵循了国际协调委员会(ICH)指南S6、S7A/B和S9，以及FDA关于结合CD3的T细胞接合物的建议。
在评估药物产品(RNA-LNP)的安全性方面时，也考虑了上述指南。这里，一种平台方法已被用于安全药理学和(免疫)毒性研究中。如先前证明的，RNA平台和所用LNPs的固有安全性在很大程度上与RNA序列或长度无关，而是取决于RNA和/或LNP的剂量和类型。出于之一原因，作为RNA-LNP平台研究，进行了单剂量和GLP顺从性重复剂量毒性研究，包括安全药理学读数。除了在这些体内研究中包括免疫毒理学读数外，也在体外解决了药物产品介导的免疫毒性。
PK研究解决产品的不同方面。首先，对编码的RiboMab02.1在不同物种中的PK调整进行了表征，阐明了BNT142的剂量暴露。其次，使用替代RNA解决了LNP的平台特性如生物分布和蛋白质表达。另外，在来自一项研究的大鼠血浆、尿液、粪便和肝脏样本中，对ALC-0366和ALC-0159的代谢进行了体外评估，并且对于ALC-0159，还进行了体内评估，其还表征了这种脂质的血浆和肝脏PK特征。
2.1非临床药理学
主要药效学
主要PD研究是那些体外和体内研究，其研究诸如BNT142药物物质翻译成蛋白质的效应以及编码的双特异性蛋白质RiboMab02.1相对于其治疗靶标人CD3和CLDN6的期望作用模式。
RiboMab02.1特异性结合人CD3和癌胚抗原CLDN6
为了确定RiboMab02.1对CLDN6和人CD3的靶标特异性，使用含有在用BNT142转染的HEK-293T-17生产细胞中表达的RiboMab02.1的细胞培养上清液进行流式细胞术结合测定。人外周血单核细胞(PBMCs)用作RiboMab02.1 CD3结合臂的靶细胞，而食蟹猴来源的PBMCs用作物种对照。使用用CLDN6转导以用于稳定蛋白表达的HEK-293T-17细胞作为两个RiboMab02.1 CLDN6结合臂的靶细胞。为了评估RiboMab02.1与密切相关的claudinsCLDN3、CLDN4和CLDN9的交叉反应性，测试了RiboMab02.1与HEK-293T-17稳定转导子的结合，每种转导子异源表达一种CLDN分子。RiboMab02.1特异性结合CLDN6，并且不结合CLDN3、CLDN4或CLDN9。同样，RiboMab02.1只识别人CD3，但不识别猿CD3(图2)。
体内产生的RiboMab02.1介导剂量依赖性的靶标特异性的肿瘤细胞裂解
通过分析T细胞介导的细胞毒性测定中的细胞毒性潜力，离体评估了在BNT142给药的Balb/cJRj小鼠中产生的RiboMab02.1的生物活性。使用表达荧光素酶的细胞系进行基于生物发光的细胞毒性测定。CLDN6阳性人卵巢癌细胞系PA-1和OV-90用于确定靶标依赖性的裂解效率，而靶标阴性的人乳腺癌细胞系MDA-MB-231用作阴性对照以确认靶标特异性的裂解。使用来自八名不同健康供体的人PBMCs作为效应细胞，以反映人类T细胞反应的供体依赖性异质性。根据靶标阳性细胞系的倍增时间，将含有PA-1的测定物孵育24h，并将OV-90孵育48h。相应地孵育对照物。在Balb/cJRj小鼠中产生的RiboMab02.1有效地介导靶标特异性和剂量依赖性的细胞毒性，对于PA-1，EC50值在0.004-0.200ng/mL(0.04-2.00pM)的范围内，并且对于OV-90细胞，在0.07-2.07ng/mL(0.7-20.7pM)的范围内(分别为图3的A和B)，具体取决于供体PBMCs的活性。
利用CLDN6阴性的MDA-MB-231细胞系，含有RiboMab02.1的小鼠血清没有诱导靶标非依赖性的(非特异性的)裂解(图3)。
体外表达的RiboMab02.1导致剂量依赖性的和靶标特异性的T细胞增殖
用BNT142或对照编码RiboMab的RNA转染HEK-293T-17生产细胞。使用含有RiboMab02.1或对照RiboMab(对不相关的TAA具有特异性)的上清液作为测试物品。将两种浓度(100或1ng/mL)的含RiboMab的上清液加入羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记的人PBMCs和靶标阳性或阴性细胞的共培养物中。PA-1或OV-90作为CLDN6阳性细胞，并且MDA-MB-231作为靶标阴性细胞。CLDN6阴性的NUGC-4细胞(表达不相关的TAA)以及不存在任何靶标细胞的PBMCs被包括作为进一步的特异性对照。在该测定中比较了来自三名健康供体的PBMCs。孵育72h后，通过流式细胞术分析T细胞以确定靶标依赖性增殖。在PA-1细胞存在下，100ng/mL和1ng/mL RiboMab02.1分别诱导了约58±2％和44±7％的T细胞增殖，而利用OV-90细胞，诱导了24±3％和2±3％的T细胞增殖(图4)。相反，在与NUGC-4或MDA-MB-231细胞共培养的PBMCs中，以及在不存在任何靶细胞的情况下，均未观察到RiboMab02-1驱动的T细胞增殖(图4)。用作T细胞活化的阳性对照的人CD3特异性抗体OKT3在存在和不存在靶细胞的情况下导致强活化。
RiboMab02.1仅在远高于EC50的剂量下引发靶标非依赖性的T细胞活化
为了确定RiboMab02.1的靶标特异性生物活性的范围，使用作为主要作用模式的T细胞活化作为读数。从给予BNT142或编码荧光素酶的RNA-LNP(Luc_RNA-LNP；模拟)的小鼠获得含有RiboMab02.1的以及模拟血清样品。使用来自三名健康供体的人PBMCs作为效应细胞。血清样品从4000ng/mL开始进行连续稀释(10倍、10点)，并以10:1的效应细胞与靶细胞比例添加到单独培养或与CLDN6阳性PA-1靶细胞一起培养的PBMCs中。孵育48h后，通过流式细胞术分别分析T细胞的早期和晚期活化标志物CD69和CD25的表面表达。在来自任何高达40ng/mL RiboMab02.1的供体的PBMCs中都未观察到脱靶T细胞活化。400和4000ng/mL的两种最高RiboMab02.1浓度分别导致2％-6％和6％-19％的脱靶T细胞活化(高于背景水平)(图5，左图)。在靶细胞存在下，所有三名供体的平均EC50值(图5，右图)被确定为0.026ng/mL(0.3pM)。OKT3阳性对照在有和没有靶细胞的情况下导致>50％的T细胞活化(数据未显示)。CD69对T细胞的上调作用高于CD25；CD25阳性细胞几乎完全是CD69双阳性的，指向早期激活状态(数据未显示)。
总之，RiboMab02.1介导T细胞的靶标依赖性激活，其浓度高达超过EC50值的>1,500倍。
静脉内给予的BNT142通过将T细胞重新定向到肿瘤而在小鼠中介导异种移植物肿瘤清除
为了确定BNT142在体内的抗肿瘤功效，使用CLDN6阳性的人卵巢癌(OV-90)异种移植物小鼠模型。简言之，将免疫缺陷的雄性和雌性NOD.Cg-PrkdscidIL2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠经皮下(SC)接种人OV-90卵巢癌细胞。用来自健康供体的人PBMCs经腹膜内(IP)移植具有已建立的肿瘤(平均大小≥30mm3)的小鼠(得到的小鼠模型注释为NSG/PBMC)。七天后，开始包括每周5次的单次IV团注BNT142或对照物品的治疗方案。BNT142的给药剂量为每只小鼠0.1或1μg(～0.004和0.04mg/kg)。作为靶标特异性对照，应用1μg编码不相关的结合TAA xCD3的三聚体蛋白的对照RNA-LNP。单独的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS，盐水)和1μgLuc_RNA-LNP作为阴性对照，并且重组纯化的CD3 x(CLDN6)2三聚体参考蛋白(每只动物100μg，～4mg/kg)作为阳性对照(图6的A)。
利用1μg BNT142，在第二次处理后肿瘤体积开始缩小，并且利用0.1μg BNT142或100μg的参考蛋白，在第三次处理后肿瘤体积开始缩小。直到实验结束，一直保持稳定下降(图6的B、图6的C)。一般来说，阴性对照中没有一个表现出肿瘤体积减少。
在第三次注射后72h，对每组4只小鼠(仅对于0.1μg BNT142组为5只小鼠)实施安乐死，以评估异种移植物肿瘤中的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。平均而言，在用0.1和1μgBNT142处理的小鼠中，每mm2异种移植物肿瘤组织中分别观察到1,310和1,797个TIL(图6的D和图6的F)。参考蛋白处理导致每mm2肿瘤组织平均1,542个TIL，而阴性对照组则表现出每mm2组织139-410个TIL。在OV-90接种后第38天的不同时间点，分析了数只小鼠的肿瘤组织中CLDN6阳性细胞的百分比。在来自用1μg BNT142处理的小鼠的肿瘤异种移植物中发现了最低百分比的CLDN6阳性细胞(指示肿瘤细胞杀伤/清除增加)，其次是参考蛋白和0.1μgBNT142处理(图6的E和图6的F)。
总之，与阴性对照组相反，BNT142和参考蛋白处理组中的小鼠在异种移植物肿瘤中显示出显著的肿瘤减少，同时伴有更高的T细胞浸润和更低的CLDN6阳性。
次要药效学
次要PD研究被定义为那些研究编码的与其治疗靶点CLDN6无关的双特异性蛋白RiboMab02.1的作用模式和效应的体外和体内研究。RiboMab02.1体外诱导人促炎性细胞因子的靶标依赖性释放
分析了从T细胞活化测定获得的细胞培养上清液，以研究RiboMab02.1依赖性诱导靶中和脱靶细胞因子释放。使用定制的多重ELISA试剂盒测量人促炎性细胞因子IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10和TNF-α的水平。RiboMab02.1在靶细胞存在下，以剂量和供体依赖性的方式诱导所有细胞因子的释放。除了在一名供体和在最高浓度的RiboMab02.1下观察到IL-6的低诱导外，在没有CLDN6阳性PA-1靶细胞的情况下没有观察到细胞因子诱导(图7)。阳性对照OKT3在靶细胞存在和不存在的情况下诱导细胞因子释放，而模拟血清(来自Luc_RNA-LNP给药的小鼠)没有诱导任何细胞因子产生(数据未显示)。
向PBMC人源化的小鼠体内给予BNT142不会诱导人促炎性细胞因子释放
测量了在第三次BNT142给药6和72h后获得的携带OV-90人异种移植物肿瘤的NSG/PBMC小鼠的血清样品中的人促炎性细胞因子IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10和TNF-α(参见上文)。用1μg BNT142处理另一组无肿瘤的NSG/PBMC小鼠。在评估的任何时间点，在BNT142处理组或对照组中均未观察到细胞因子诱导(图8的A)，而参考蛋白组中的小鼠在6小时时间点显示出所有六种细胞因子的短暂但显著的升高。将数据标准化为在各个时间点获得的盐水对照组的值。活性药物RiboMab02.1(由1μg BNT142编码)以及参考蛋白的系统可用性是相当的(图8的B)。
GLP顺从性组织交叉反应性研究
为了研究RiboMab02.1的潜在非特异性结合，根据GLP，使用三种浓度(10、5、1μg/mL)的亲本嵌合IgG抗体IMAB206-C46S(其共有相同的抗CLDN6 CDRs)进行了全人类组织交叉反应性(TCR)研究。表3中总结了分析的成人正常人体组织(FDA1997)和发现。
表3：来自GLP顺从性TCR研究的结果
简言之，在所有测试组织中，仅在1/3的供体中，在所有应用的三种浓度的测试物品下，肾上腺的内分泌细胞和胎盘中的绒毛的染色呈阳性。未能检测到膜染色，并且所有观察到的结合都是细胞质性质的。只有细胞质结合是可能的，因为细胞隔室已经通过切片过程被人工暴露，从而允许测试物品接近。这种情况不会在体内发生，并因此，细胞质结合不被认为是相关的。未观察到其他交叉反应性或非特异性结合。
脱靶结合测定(非GLP)
用三聚体参考蛋白(与RiboMab02.1的序列相同)进行细胞微阵列筛选，以研究RiboMab02.1的潜在非特异性靶标。针对固定的单独地过表达6,239种不同的全长人质膜蛋白和细胞表面拴系的人分泌蛋白，包括371种异二聚体的人HEK293细胞筛选三聚体的结合。
当与CD3δ或CD3γ和CLDN6一起表达为异二聚体时，三聚体参考蛋白显示出与其主要靶标CD3ε的特异性相互作用。尽管如此，还是观察到了与CLDN9的另外的弱脱靶相互作用。未观察到其他结合。
安全药理学
ICH指南S7A指出，在人体暴露之前，应对任何药物产品进行一组核心安全药理学研究。作为在小鼠中进行的GLP顺从性重复剂量毒性研究的一部分，评估了高达～5mg/kgRNA-LNP对中枢神经系统(CNS)和呼吸系统的潜在影响。另外，在食蟹猴中的一项非GLP研究中，评估了高达0.15mg/kg BNT142对心血管安全终点(血压、心率和心电图参数)的影响。在小鼠研究中，包括用空LNP处理的对照臂。
呼吸安全性
对在Balb/c小鼠中进行的GLP顺从性的重复剂量毒性研究中包括的卫星动物评估了RNA-LNP的呼吸安全性。每周给予四次注射，并在给药前以及第二次和第四次注射后4和24h进行全身体积描记术。
小鼠被分为四组，每组包含四只雄性和四只雌性。第1组和第2组为对照组，并接受盐水(第1组)和不含RNA但脂质含量与～5mg/kg组(第2组)相当的空LNPs。治疗组接受RNA-LNP，剂量～1.5mg/kg(第3组)和～5mg/kg(第4组)。体积描记术揭示没有与测试物品相关的影响。
CNS安全性
在顺从GLP的Balb/c小鼠中，研究了RNA-LNP在两种剂量水平(～1.5mg/kg和～5mg/kg)下诱导的神经、行为和自主神经效应。
对在呼吸安全性研究中使用的相同动物(相同的RNA-LNP剂量组和对照组)进行本研究。在第一次给药前和第一次给药后48h以及第四次给药前和第四次给药之后48h检查RNA-LNP对40个神经药理学参数的影响。
在雄性动物中的第一次～5mg/kg给药之后，注意到与测试物品相关的后肢握力的短暂下降(～-37％)。在同一组的雌性动物中也观察到了这种影响(～-4％)。这种下降是可逆的，因为在第四次给药之前或之后，没有观察到与测试物品相关的后肢握力的差异。在所有测试时间点都没有观察到前肢握力的变化，并且没有检测到肌肉或坐骨神经的宏观或微观变化，这表明后肢握力的短暂下降不是由肌肉或神经损伤引起的。未观察到其他与测试物品相关的影响。
心血管安全性
BNT142给药的潜在心血管影响的研究已包括在食蟹猴的非GLP PK和耐受性研究中。
在这项研究中，食蟹猴被分为四组，每组包含三只雌性动物。第1组接受盐水，而第2、3和4组分别给予一次剂量为0.015、0.05和0.15mg/kg的BNT142。在治疗开始前以及动物给药后6h和24h进行血压测量。在测试物品处理的动物中，外周动脉收缩压和舒张压以及产生的平均血压均在正常生理限度内。另外，从给药前开始至给药后至少20h，记录心电图(ECG)。在该时间间隔内，心率和ECG的定量和定性参数不受BNT142给药的影响。
非临床药理学-结论
在主要和次要体外以及体内PD研究中，BNT142编码的RiboMab02.1表现出剂量和靶标依赖性的作用模式。高于EC50(26pg/mL)>1,500倍浓度的RiboMab02.1的体外非特异性T细胞活化的起始表明有一个广阔的治疗窗。
首先在GLP顺从性组织交叉反应性研究(使用具有相同抗CLDN6CDRs的替代IgG)中测试了RiboMab02.1的安全性，该研究的结果是未鉴定到非特异性结合。在随后的使用RiboMab02.1参考蛋白的细胞微阵列研究中，仅观察到与CLDN6密切相关的CLDN9的弱脱靶结合。由于除了内耳中的紧密连接处的表达外，绝大多数正常组织中没有CLDN9的表达，预计不会出现不希望的脱靶效应。
总之，RiboMab02.1靶向除CLDN6和CD3以外的靶标的结合被认为是不可能的。
安全药理学评估揭示对心血管参数(食蟹猴)或呼吸参数(小鼠)没有影响。在小鼠中第一次给予～5mg/kg RNA-LNP后48h，观察到后肢握力暂时下降。这种效应是短暂的，并且在随后的三次RNA-LNP给药后没有检测到。在组织的病理检查期间没有发现神经或肌肉异常，表明这些效应与神经毒性不同。
总之，这些数据表明，BNT142编码的RiboMab02.1在体内和体外的非临床模型中是靶标限制的和有生物活性的。在高达～5mg/kg RNA-LNP的剂量下，未观察到测试物品介导的对小鼠生理功能的影响，所述剂量涵盖了高达0.15mg/kg及以上剂量的预期临床剂量范围。
2.2非临床药代动力学研究
BNT142的PK可以分为两部分。首先，在IV注射后，RNA-LNP被系统性地分布，并将RNA货物递送到预期的靶器官，即肝脏。其次，LNP转染的肝细胞翻译RNA并将编码的蛋白质RiboMab02.1分泌到系统循环中。
为了评估第一部分，分析了放射性标记的LNP在小鼠中的不同器官中的生物分布。为了评估第二部分，利用在LNP中配制的编码萤火虫荧光素酶的修饰RNA来评估肝脏靶向和体内翻译RNA的动力学。此外，已在小鼠和食蟹猴(NHP模型)中对单次IV给药后分泌的RiboMab02.1的体内PK特征进行了表征。
在体内和体外评估LNP中PEG脂质赋形剂(ALC-0159)的PK特征和ALC-0159的代谢评估。在体内，ALC-0159从血浆快速分布到肝脏，而ALC-0159的代谢在体外和体内似乎缓慢发生。ALC-0159分别通过酯和酰胺官能团的水解代谢进行代谢，并且在所有评估的测试物种(小鼠、大鼠、猴、人)中都观察到这种水解代谢。虽然在尿液中没有可检测到的脂质排泄，但ALC-0159在粪便中排泄的剂量百分比不变，为～50％。使用体外代谢研究来评估氨基脂质ALC-0366的稳定性。ALC-0366在所有物种的肝微粒体、S9级分中稳定超过120min，并且在肝细胞中稳定超过240min。
分布
使用RNA-LNP研究LNP在体内的生物分布，该RNA-LNP具有与BNT142相同的LNP配方，但具有不同的RNA。向小鼠经IV给予放射性标记的RNA-LNP。经由液体闪烁光谱法对LNP在小鼠组织中的分布进行定量。经由生物发光成像研究LNP的器官靶向和随后的编码荧光素酶的mRNA的表达。
放射性标记的LNP的分布
在单次IV团注1mg/kg(基于RNA含量)后，在CD-1小鼠(n＝4/性别/时间点)中研究LNP的组织分布特征。对于本研究，用不可交换的、不可代谢的脂质标记物[3H]-胆固醇十六烷基醚([3H]-CHE)标记含有RNA的LNP，以监测脂质颗粒的分布。对小鼠实施安乐死，并在给药后0.083(5min)、0.25、0.5、1、2、4、8和24h收集血液、血浆和组织。通过标准液体闪烁计数测定所有样品中的放射性，并将所得值用于计算各种组织中的总脂质当量(脂质eq)浓度和注射剂量的百分比。
LNP在小鼠中的血液和血浆中表现出双相动力学，血液/血浆浓度最初快速下降，随后是缓慢清除期。在雄性和雌性小鼠中观察到相似的血液/血浆浓度-时间特征。LNP在组织中的分布通常较快，在大多数组织中，在注射后4h之前出现峰值水平或达到平稳期。肝脏是主要的分布器官，在注射后4h，对于雄性和雌性小鼠，平均浓度分别为282和355μg脂质eq/g组织，这约为注射剂量的70％-74％。到给药后4h，LNP也分布到脾脏中，在给药后4h产生61.7-77.1μg脂质eq/g组织(注射剂量的0.84％-1.15％)的水平。在其他组织中观察到最小的分布或没有分布。进行本研究是为了确定LNPs分布的主要器官，并且未考虑给予的LNP的总质量平衡。
总之，LNP快速且主要分布至肝脏。
体内翻译的RNA的肝脏靶向和动力学
利用用LNPs配制的修饰的编码萤火虫荧光素酶的mRNA评估蛋白质表达的生物分布，以评估肝脏靶向性和体内翻译的mRNA的动力学。IV给药后，荧光素酶蛋白显示出时间依赖性翻译，其中高生物发光信号主要位于肝脏中(图9)。作为第二分布器官，脾脏显示的生物发光信号比肝脏低10倍。在心脏、肺、肾脏和淋巴结中检测到轻微的发光信号。
脂质赋形剂的药代动力学(ALC-0159)
BNT142在纳米粒子中含有PEG脂质赋形剂ALC-0159。在以1.96mg ALC-0159/kg，向Wistar Han大鼠给予单次IV剂量的在具有相似脂质组成(不同的氨基脂质)的LNP中配制的编码荧光素酶的RNA后，ALC-0159的血浆浓度迅速下降，初始t1/2值为1.72h。然后以72.7h的终末清除t1/2从血浆中清除ALC-0159。分配到肝脏的脂质剂量的估计百分比为～20％。
RiboMab02.1体内药代动力学
在小鼠中给予BNT142后，RiboMab02.1被有效翻译、组装和分泌
以下研究证实了体内摄取BNT142后RiboMab02.1的翻译、组装和分泌(Balb/cJRj小鼠)。在单次IV给予30μg BNT142后2和6h，收获含有分泌的RiboMab02.1的血清。通过ELISA(图10的A)和蛋白质印迹(图10的B)分析了血清，证实在体内产生了完全组装的和结构稳定的(单体)RiboMab02.1。
小鼠中BNT142的重复剂量PK研究
在Balb/cJRj小鼠中进行了重复剂量PK研究，以评估通过每周给予BNT142，RiboMab02.1的系统水平是否可维持。处理组以每周的间隔接受5次IV团注10或30μgBNT142(分别约为0.4和1.2mg/kg)或30μg Luc_RNA-LNP。从在每次BNT142给药后6h(tmax)和给药前24h(最后可检测浓度[C谷])从动物抽取的血液制备血清样品。时间点分别对应于第一次BNT142或Luc-RNA-LNP对照注射后的6、174、342、510和678h(Cmax)或144、312、480和648h(C谷)。在第一次注射后816h(34天)抽取最后一次血样。如通过ELISA测定的，在最后一次注射10μg和30μg BNT142后6h，分别达到高达7.4μg/mL和46μg/mL的RiboMab02.1峰值水平(Cmax)。抗体浓度在每次注射后7天内迅速下降，C谷值比Cmax值低约130倍。重要的是，在随后注射的任一BNT142剂量之间，均未观察到RiboMab02.1翻译的损失(图11)。
食蟹猴中BNT142的单一剂量PK研究
对雌性食蟹猴进行单剂量PK研究，每组三只动物。处理组接受单次覆盖预期临床剂量范围(0.150、0.05和0.015mg/kg)的IV团注剂量的BNT142，或者作为对照的盐水。通过ELISA分析在不同时间点(注射后0、1、3、6、12、24、48、72、168和336h)采集的血清样品中RiboMab02.1的浓度，以评估剂量暴露。在所有组中，在BNT142给药后6h(中值tmax)均达到RiboMab02.1峰值浓度(Cmax)(平均值[中值tmax]：0.015mg/kg组＝7.3ng/mL；0.050mg/kg组＝27.5ng/mL；0.150mg/kg组＝155.0ng/mL)。在0.015mg/kg组中，从BNT142给药后3h和多达72h，并且在0.15mg/kg以及0.05mg/kg组中，高达168h(7天)，可检测到RiboMab02.1水平(图12和表4)。RiboMab02.1的有效半衰期确定为在27和37小时之间。然而，由于ELISA定量方法的定量下限(LLOQ)为0.1ng/mL，两个较低剂量组中的RiboMab02.1半衰期测定受到限制。在盐水对照样品中或在BNT142给药后336h(14天)未检测到信号(检测可能受到LLOQ的限制)。表4中总结了单只动物的PK参数和平均值/中值。
总之，所有三种BNT142剂量在食蟹猴中产生的滴度均在生物活性RiboMab02.1的治疗范围内，中值Cmax在注射后6h。观察到RiboMab02.1浓度的个体间变异性，在Cmax时，分别为最低剂量组中的2-7倍差异，中等剂量组中的1-2倍差异，以及最高剂量组中的2倍差异。
表4：单次静脉内团注给予BNT142后食蟹猴血清中RiboMab02.1的PK参数
a.使用MRT0-inf(药物平均滞留时间-无穷)来计算有效t1/2。
b.tmax和tlast的中值。
Cmax＝最大观察浓度；C谷＝最后可检测浓度；h＝小时；n＝数量；N/A＝不适用；NC＝不可计算；NR＝未报导(决定系数小于0.8)；SD＝标准偏差；t＝时间；t1/2＝半衰期；t最后＝最后可测量浓度的时间；tmax＝观察到最大浓度的时间。
代谢和分泌
RNA，包括N1-甲基假尿苷修饰的mRNA，对细胞RNA酶的降解敏感，并经历核酸代谢。核苷酸代谢在细胞内持续发生，核苷被降解和排泄或循环用于核苷酸合成。
在LNP配方中用作赋形剂的四种脂质中，有两种是天然存在的(胆固醇和DSPC)，并且将像其内源性等同物一样代谢和排泄。对非天然脂质(ALC-0366和ALC-0159)的代谢和排泄进行了体外研究，并且在ALC-0159的情况下，也进行了体内研究。
在小鼠、大鼠、猴和人肝微粒体、S9级分和肝细胞中评估了ALC-0366(氨基脂质)的体外代谢稳定性。在所有物种和测试系统中，ALC-0366在肝微粒体(剩余ALC-0366>89％)和S9级分(剩余ALC-0366>88％)中稳定超过120min，并且在肝细胞(剩余ALC-0366>94％)中稳定超过240min。
使用均来自小鼠、大鼠、猴和人的血液、肝S9级分和肝细胞体外检查ALC-0159的代谢，并在来自PK研究的大鼠血浆、尿液、粪便和肝脏中进行离体检查。这些研究确定，ALC-0159通过酰胺键水解代谢相对较慢，产生N,N-双十四烷基胺。在所评估的物种中观察到了这种水解代谢。
在大鼠PK研究中，IV给予RNA-LNP后，尿液中没有可检测到的ALC-0159的排泄。然而，～50％的ALC-0159在粪便中被不变地清除。非临床药代动力学和代谢-概述和结论
BNT142的PK可以分成两部分：
·BNT142的PK：IV注射后，RNA-LNPs在4h内全身分布，并将
RNA货物递送到期望的靶器官，即肝脏。
·BNT142编码的双特异性的抗体RiboMab02.1的PK：递送到肝细胞中后，RNA被翻译，并且编码的RiboMab02.1蛋白被释放到循环中。
为了研究第一部分，在具有包含放射性标记脂质的LNP的小鼠中进行了生物分布研究。LNP的分布通常较快，在注射后4h之前，在大多数组织中达到峰值水平。肝脏是主要的分布器官，其次是脾，其中只有一部分LNP分布，并且观察到很少或没有分布到其他组织。在小鼠中给予LNP配制的编码荧光素酶(Luc)的RNA后，通过体内成像显示肝脏中的靶向RNA翻译。在注射后长达144h，在肝脏中观察到Luc翻译(生物发光)，而脾显示出低十倍的信号强度。
在大鼠IV PK研究中，在这项2周的研究期间，血浆中PEG脂质(ALC-0159)的浓度下降了约8,000倍。ALC-0159在血浆中的表观终末t1/2为72.7h，并且它可能代表来自最初吸收LNPs的组织的脂质重新分布回到血浆中，以进行清除，在粪便中大多数没有变化。在体外，ALC-0159通过酰胺功能的水解代谢缓慢代谢，而非天然氨基脂质(ALC-0366)的体外代谢研究表明了在所有物种和测试系统中的稳定性。
经由小鼠中的重复剂量研究和NHP中的单剂量研究，通过定量血清中翻译的RiboMab02.1的来确定BNT142编码的双特异性抗体RiboMab02.1的PK参数。
在每周给予BNT142的小鼠中可检测到剂量依赖性RiboMab02.1血清浓度。在30μg(～1.2mg/kg)剂量队列中，在第5次给药后达到46μg/mL的Cmax，证实RiboMab02.1暴露恢复。
在NHPs中的单次给药PK研究中，RiboMab02.1显示出剂量依赖性表达，在给予0.15mg/kg BNT142(测试的最高剂量)后，中值tmax在给药后6h(如在小鼠中观察到的)，并且平均Cmax为155ng/mL。直到给药后7天研究结束时，在NHPs中都可检测到RiboMab02.1。
总之，小鼠和NHPs中的PK数据证明了RiboMab02.1的BNT142剂量依赖性的但非与剂量成比例的暴露。给药后6h达到峰值RiboMab02.1浓度，此后下降。由于RiboMab02.1的非临床有效半衰期为27-37h，预计在约五个半衰期(～135-185h或6-8天)内出现抗体从人体的完全清除。因此，每周给药将支持维持RiboMab02.1血浆水平，该水平赋予在整个q1w临床治疗间隔内的生物活性。
2.3毒理学
评估RNA-LNP介导的效应的非临床(免疫)毒理学项目使用了平台方法，包括使用人类细胞和血液成分的体外研究，以及在小鼠和食蟹猴中的体内研究。
在小鼠中的非GLP单剂量毒性研究中，可耐受高达4mg/kg RNA-LNP的剂量。
发现包括临床观察(竖毛和脱水)、最小体重减轻和延迟体重增加、肝脏转氨酶小幅增加、脾重量增加和肝脏中最小至轻度的混合白细胞浸润，与最小肝损伤和轻度炎症反应一致。所有影响在28天内都是可逆的。
在重复剂量毒性研究中，小鼠中可耐受高达～5mg/kg的RNA-LNP剂量。研究中的发现包括食物消耗量小幅减少、白细胞总数暂时减少，以及碱性磷酸酶和肝酶暂时升高。此外，除了5mg/kg剂量下肝脏中的可逆微观变化外，还注意到肾脏和肝脏重量的增加，以及脾中的髓外造血和动脉周围淋巴鞘的淋巴增生，这也与脾重量的增加有关。这些变化在2周的恢复期后得到改善，并且在大多数情况下完全逆转。
在测试单一剂量的高达0.15mg/kg BNT142的NHPs中的非GLP PK/耐受性研究中，未观察到任何参数的变化。
在免疫毒性评估中，～1.5mg/kg和～5mg/kg RNA-LNP在小鼠中给药后6h诱导细胞因子(IFN-α、IFN-γ、IL-6和TNF-α)的短暂升高，其在重复给药后不太明显。在单次给予高达0.15mg/kg后，在食蟹猴中未在体内观察到BNT142诱导的细胞因子升高。在使用人全血的体外研究中，浓度≥4μg/mL(≥0.32mg/kg的人等效剂量)的BNT142诱导IFN-γ、IL-1β-、IL-2、IL-6、IL-8和TNF-α的分泌。在高达40μg/mL(3.2mg/kg的人等效剂量)的浓度下，在体外未观察到补体系统的RNA-LNP激活。
用于RiboMab02.1的安全性研究的相关物种的选择
根据ICH S6(R1)，相关物种是其中测试物质具有药理学活性的物种。RiboMab02.1双特异性抗体的药理学活性需要CD3受体在相应物种的T细胞上的结合和肿瘤靶标表位(CLDN6)的表达。然而，RiboMab02.1的抗CD3部分对除人类灵长类以外的任何其他物种的CD3都没有交叉反应。
由于没有合适的测试物种来充分捕捉RiboMab02.1的安全性特征，因此没有在动物中对该抗体进行安全性研究。相反，使用CLDN6亲本抗体IMAB206-C46S或与RiboMab02.1相同的重组参考蛋白进行上述的体外安全性研究。
RNA-LNP药物产品的非临床安全性评估
在一些RNA-LNP安全性研究中，使用了与BNT142具有相同LNP脂质组成但具有不同RNA的药物产品。由于RNA序列或长度的差异预计不会在很大程度上影响RNA-LNP介导的安全性特征，因此该结果被认为代表了RNA-LNP介导的BNT142毒性。这种平台毒性评估方法先前已被接受。
单剂量毒性
在雄性和雌性CD-1小鼠中进行了非GLP单剂量毒性研究。该研究表征了1-4mg/kg剂量的RNA-LNPs的潜在毒性，通过比较RNA-LNP与相应对照品(即空的LNP)的毒性来确定LNP介导的毒性，并评估了RNA-LNP在4周观察期(第29天终止)后的可逆性、进展和/或潜在延迟效应。
小鼠在第1天接受单次IV剂量的RNA-LNP或对照品(盐水或空的LNP)。在第3天(主要的动物)或第29天(恢复的动物)对动物实施安乐死。研究终点包括死亡率、临床观察、体重变化、临床病理学、尸检观察、器官重量和组织病理学(肝、脾和胃)。
在雄性和雌性CD-1小鼠中耐受高达4mg/kg RNA-LNP的单一剂量。发现包括临床观察(竖毛和脱水)、最小体重减轻和延迟的体重增加。在第3天，可检测到肝脏转氨酶(丙氨酸转氨酶[ALT]和/或天冬氨酸转氨酶[AST])的小幅增加、脾重量增加、接受4mg/kg的单只雌性中的肝脏苍白和肝脏中最小的混合白细胞浸润，与最小的肝损伤和轻度炎症反应一致。性别之间的发现没有差异。所有影响在第29天显示出完全或部分恢复的证据，肝脏中的混合白细胞浸润证明了这一点，表明轻度炎症反应正在消退。
重复剂量毒性
在雄性和雌性Balb/cJRj小鼠中进行了一项GLP顺从性平台重复剂量毒性研究，评估LNP和RNA介导的毒性。该研究定征了每周四次的～1.5和～5mg/kg的RNA-LNP剂量的潜在毒性，通过比较RNA-LNP与相应对照品(即空的LNP)的毒性来确定LNP介导的毒性，并评估了2周观察期后RNA-LNP的可逆性、进展和/或潜在的延迟效应。测试的RNA-LNP剂量(高达～5mg/kg)超过预期的临床剂量(0.00005mg/kg-0.15mg/kg)30-30000x。在GLP顺从性小鼠毒性研究中，基于可以IV递送的最大可行体积和浓度，最高剂量(100μg/只动物相当于～5mg/kg)被认为是最大可行剂量。
小鼠中对每周四次IV注射的RNA-LNP的处理的耐受剂量为30和100μg/只动物(分别为～1.5和～5mg/kg)。在高剂量组中，动物表现出食物消耗量的暂时减少(雄性中的-8.2％或者雌性中的-13.6％)。然而，这些食物消耗的变化并没有导致体重的伴随下降。在处理或恢复期期间未观察到死亡。
对于主要的研究动物，在第三次给药后24h(测试第16天)评估血液学参数，并且对于恢复动物，在最后一次处理后一周(测试第30天)进行评估。在测试第16天，用30μg(～1.5mg/kg)或100μg(～5mg/kg)RNA-LNP处理导致总白细胞减少(分别为雄性中的-59％或-62％和雌性中的-67％或-74％)。这主要是由于淋巴细胞显著减少(分别为雄性中的-67％或-72％和雌性中的-74％或-79％)。
对于用空的LNPs处理的动物，也注意到白细胞(雄性中的-24.1％和雌性中的-37.4％和淋巴细胞(雄性中的-37.2％和雌性中的-48.7％)的绝对数量的下降。对于恢复期动物，发现血液学参数中没有与测试物品相关的差异，表明所有变化都是可逆的。
在最后一次给药后24h(测试第23天)和恢复期结束时(测试第37天)，评估临床化学。在测试第23天，在用30μg(～1.5mg/kg)处理的雌性小鼠中观察到肝脏酶ALT(+51％)、AST(+45％)和乳酸脱氢酶(LDH)(+69％)的完全可逆的升高。没有注意到该剂量组的生化参数的其他与测试物品相关的差异。在高剂量(100μg、～5mg/kg的RNA-LNP)中，在处理的雌性中观察到肝脏酶(ALT、AST)和LDH升高(分别为+8,170％、+4,992％和+2,787％)。在用空的LNPs处理的雌性中，还注意到肝脏酶活性(ALT、AST)和LDH的增加(+274％、+44％和+40％)。另外，对于碱性磷酸酶(ALP)，观察到在该组的两种性别中都有增加(雄性+39％，雌性+93％)。在整个恢复期内，该水平出现下降，但在研究结束时仍高于实验室正常水平(雄性+19％，雌性+21％)。
另外，在测试第23天，雄性(+31％)和雌性(+36％)的球蛋白浓度增加。因此，注意到雄性(-15％)和雌性(-21％)的白蛋白/球蛋白比率下降。这些变化在恢复期结束时已经消退。
在测试第23天，即第四次给药后约24h，解剖主要的研究动物。在测试第37天，对所有恢复的动物进行尸检。在主要研究结束时，来自两个剂量组的一些雌性动物的脾脏增大。这种影响与脾脏重量增加有关(雄性中为+68％，且雌性中为+99％)。另外，尸检揭示一只雌性的肝脏苍白，且另一只雌性的肝脏部分苍白，表面光滑，二者均给予100μg。在两种性别的该高剂量组中，也注意到肝脏(雄性中的+17％和雌性中的+34％)和肾重量(雄性中的+15％和雌性中的+18％)的增加。在恢复期间，对脾和肝脏重量的影响没有得到完全补偿，但所有其他影响都已消退。
在主要研究结束时，仅在雌性的肝脏中发现组织病理学变化(细胞质改变、单核炎症细胞浸润、多核巨细胞和坏死)。在恢复期后，除一只雌性外，所有动物中的这些发现都是完全可逆的。在低剂量组和高剂量组中，都观察到雌性脾脏中完全可逆的组织病理学发现，其包括髓外造血、充血、色素沉积和动脉周围淋巴鞘的淋巴增生。在任何时间点都没有在雄性动物中进行组织病理学观察。
食蟹猴中BNT142的单剂量药代动力学和耐受性研究
本研究的目的是获得食蟹猴单剂量IV给药后BNT142的PK和耐受性信息。
通过IV团注注射单次给予的BNT142在猴中以高达0.15mg/kg的剂量被耐受。没有与BNT142给药相关的过早死亡、体重、体温、血压、眼科、听力检查、心血管评估、临床病理学参数(血液学、凝血、临床化学和尿液分析)或细胞因子的临床观察或变化。
免疫毒性研究
在两项独立研究(如下所述)中评估了免疫毒理学参数，并作为小鼠中GLP顺从性重复剂量毒性研究和NHPs中单剂量PK研究的一部分。在小鼠中，在第一次给药后6、24和48h(测试第1、2和3天)以及第三次给药后6、24、48h(测试第15、16和17天)进行细胞因子分析。在测试第1天和测试第15天，在两个剂量组(～1.5mg/kg和～5mg/kg)中的雄性和雌性动物给药后6h，IFN-α、IFN-γ、IL-6和TNF-α瞬时升高。在重复给药(测试第15天)后，升高程度较小。到给药后24h，IL-6和TNF-α的水平完全下降，而到给药后48h，IFN-α和IFN-γ的水平恢复到基线。在任何一组中均未观察到IL-1β、IL-2、IL-10或IL-12p70的升高。在NHPs中，在高达0.15mg/kg的剂量后6、24或48h，在任何测试的细胞因子中都没有观察到与测试物品相关的细胞因子升高。未观察到指示全身免疫毒性的临床体征。
人血清的体外补体激活
通过孵育RNA-LNP浓度为0.04-40μg/mL(代表～0.003至～3.2mg/kg的剂量)的正常人血清，评估了药物产品在体外激活人补体的潜力，所述浓度涵盖预期的临床暴露。用RNA-LNP孵育后未观察到补体激活。BNT142的全血细胞因子释放
在将BNT142与全血一起孵育后，评估了促炎性细胞因子(IFN-α、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12p70、IP-10和TNF-α)的分泌。测试的稀释范围(0.0625-64μg/ml)代表并超过了预期的药物产品浓度(相当于0.005-5.12mg/kg的剂量)。在高达2μg/mL(0.16mg/kg的人等效剂量)的浓度下，未检测到与测试物品相关的细胞因子分泌。除此之外，BNT142在≥4μg/mL(≥0.32mg/kg的人等效剂量)的浓度下诱导IL-1β、IL-6、IL-8分泌，并且在≥32μg/mL(≥2.56mg/kg的人等效剂量)的浓度下诱导IFN-γ、IL-2、TNF-α分泌。
毒理学-结论
BNT142的毒理学评估分为两部分–一部分评估编码的抗体RiboMab02.1的体外安全性，原因是缺乏该化合物具有活性的药理学相关物种。相反，在数项体内和体外研究中测试了RNA-LNP，其中一些使用了具有相同类型的修饰的mRNA但具有不同序列(例如，编码荧光素酶)的替代物。这种方法在其他情形下已被证明是可靠的。
RNA-LNP的安全性已在小鼠和猴中的三项体内毒性/耐受性研究中进行了评估。在预期的BNT142的临床剂量上限范围(0.015-0.15mg/kg)内，在NHP耐受性研究中未观察到与RNA-LNP相关的效应，而在小鼠中单次或多次较高剂量的RNA-LNP(1至～5mg/kg)会对临床病理学参数、器官重量和组织病理学变化造成影响，主要是以剂量依赖性的方式。这些效应通常只在雌性动物中出现或更为明显。
在两种性别中，在重复给予～1.5或～5mg/kg RNA-LNP后，淋巴细胞计数(以及因此的白细胞计数)降低，并且球蛋白浓度增加。单一剂量的2mg/kg(雌性)和4mg/kg(两种性别)诱导最小的ALT和AST升高，在接受多剂量的～1.5mg/kg或～5mg/kg RNA-LNP的雌性中，在重复给药后，ALT和AST升高更明显，并且与LDH升高一起被观察到。因此，这些效应与肝脏组织病理学的最小轻度(单剂量)或最小显著(重复剂量)变化(细胞质改变、单核炎症细胞浸润、多核巨细胞和坏死)有关。在重复给予～1.5mg/kg或～5mg/kg RNA-LNP的雌性的脾脏中，也看到了显微改变，如充血、髓外造血(hematopoesis)、动脉鞘周围淋巴增生或色素沉积。尽管在雄性和雌性动物中观察到肝脏、脾和肾的重量增加，但没有进行其他组织病理学观察。除了在恢复结束时显示出改善的在两个剂量组中仍略有升高的ALP水平，以及接受更高剂量(作为单剂量的～4mg/kg或作为四次连续剂量的～5mg/kg)治疗的雌性中的一些病理变化外，大多数所述效应在2-3周内是完全可逆的。
RNA-LNP的体外免疫毒理学评估表明，在高达～3.2mg/kg的人等效剂量下，人补体没有激活，但在0.3mg/kg或更高的人等效剂量下，释放药物产品浓度依赖性的细胞因子。支持这些发现的是，在GLP毒性研究中，在向小鼠给予～1.5或～5mg/kg RNA-LNP后，见到可逆的细胞因子升高，尽管在重复给药后，细胞因子升高的程度较低。在NHP耐受性研究中，在单次给予临床剂量上限范围为0.015-0.15mg/kg的BNT142后，未见到细胞因子升高。
总之，基于上文讨论的非临床毒理学结果，0.00005mg/kg(0.05μg/kg)的首次人体剂量被认为是合理安全的，同时预计会在人体内产生药理学相关的RiboMab02.1暴露。
实施例3：体内表达的RiboMab02.1是高度单体的，并且在小鼠中诱导的ADA反应低于替代的候选引导结构RiboMab_712/711C53W。
亲本抗CLDN6 VL中的游离半胱氨酸(根据IMGT编号，在位置53(C53)处的VL(CLDN6))已被取代为RiboMab02.1中的丝氨酸(C53S)(SEQ ID NOs:4和6，分别由SEQ IDNOs:5和7的mRNA序列编码)，或者取代为RiboMab_712/711中的色氨酸(C53W)(SEQ ID NOs:31和33，分别由SEQ ID NOs:32和34的mRNA序列编码)。亲本抗CLDN6 VL的位置53对应于序列SEQ ID NO:4和31中的位置449，以及序列SEQ ID NO:6和33中的位置428。它还对应于相对于VL(CLDN6)的CDR1的位置+15和/或相对于VL(CLDN6)的CDR2的位置-3。
针对蛋白质聚集和RiboMab特异性抗药物抗体(ADA)的诱导，在小鼠中比较了两种编码CD3 x(CLDN6)2的前导结构变体。
四只雌性Balb/cJRj小鼠接受了每只小鼠30μg RNA-LNP(～1.4mg/kg)的IV单一剂量。在给药前和给药后6、24、48、96、168、216、265和528小时(0.25-22天)对血清取样。
在非还原条件下，通过蛋白质印迹分析对注射后6小时获得的血清样品进行分析(图13的A；来自每组的小鼠#4的代表性蛋白质印迹图像)。使用了等体积的Melon G纯化的血清。相对于其表达水平，携带C53W取代的RiboMab_712/711导致产生比C53S变体(RiboMab02.1)更高量的HMW物质。RiboMab02.1的HMW在体内几乎无法检测到。这是一个重要的区别，因为药物HMW的形成通常与免疫原性的增加有关。
使用来自Gyros Protein Technologies AB的Gyros xPandTMXPA1025ELISA设备，测定小鼠血清中的抗RiboMab02.1和抗RiboMab_712/711药物抗体(ADA)。在GyrolabBioaffy 200 CD上进行三明治免疫测定。
使用100μg/mL生物素化的药物抗体捕获抗RiboMab ADA。用25nM Alexa Fluor647缀合的AffiniPure山羊抗小鼠IgG、Fc片段特异性的抗体检测血清ADA水平。使用200-3W-002-A方法生成数据，并使用Gyrolab Evaluator软件分析结果。
根据浮动分割点(floating cut-point)确定阳性ADA反应。因此，使用阴性血清(出血前)的反应和以下公式来计算分割点：
归一化因子(NF)+平均阴性对照(NC)。
NF＝X*阴性样品的SD；X＝1.645；SD＝阴性血清(出血前)的标准偏差；NC＝3个阴性对照(合并的阴性血清)。
数据(图13的B)表明，与RiboMab_712/711相比，RiboMab02.1在小鼠中的免疫原性潜力较低，这与RiboMab02.1的较高单体含量一致(图13的A)。较低的免疫原性不能用表达水平的差异来解释，因为免疫原性与表达水平并不密切相关。
总之，与RiboMab_712/711的两个序列中的色氨酸取代相比，两个RiboMab02.1序列中的游离半胱氨酸C53被丝氨酸取代导致HMW形成和ADA诱导的水平较低。
实施例4：1.5:1的HC:LC重量比的编码RiboMab02.1的药物物质中间体导致高度单体的RiboMab02.1的有效表达。
通过电穿孔，以1:1、1.25:1、1.5:1、1.75:1、2:1、2.25:1、2.5:1和2.75:1(总RNA浓度：100μg/mL RNA；总体积：250μL)的HC:LC重量比的编码HC和LC的药物物质中间体(RNAs)转染HEK-293T-17生产细胞。本实施例中使用的编码HC和LC的药物物质中间体(RNAs)(分别为SEQ ID NO:5和7)编码RiboMab02.1的两种多肽SEQ ID NOs:4和6。这两种多肽在这里被称为HC和LC，因为它们分别包含来源于靶向CD3的亲本抗体的重链和轻链的可变区。RiboMab02.1的多肽均不包含抗体的全重链或轻链。
转染后48h，对细胞培养上清液(SN)样品进行蛋白质印迹(WB)和ELISA分析(图14)。
对于WB分析(图14的A)，对SN样品进行热处理以进行蛋白质变性，然后在非还原条件下进行SDS-PAGE。使用参考三聚体蛋白的两种制剂作为阳性对照：一种含有0.23％的高分子量(HMW；单体参考)物质，且另一种含有96.5％ HMW(HMW参考)物质。然后将通过SDS-PAGE分离的蛋白带印迹到硝化纤维素膜上，并与分别靶向κ轻链或IgG Fd区的两种HRP缀合的山羊抗人检测抗体的组合一起孵育。在此之后，用化学发光试剂显影印迹膜并暴露4秒。随后通过软件对图像进行分析，以定量单个带的信号强度和百分比比例(表5)。在所有测试的SN样品中，以低分子量(LMW)物质为特征的游离LC形式始终较低。单体含量总体较高(>90％)，并且HMW物质–主要是200kDa的HC二聚体–在测试的HC:LC RNA比例中在2.4％-9.1％之间变化。
对于通过夹心免疫测定法进行的RiboMab02.1定量，使用Gyros xPandTMXPA1025ELISA设备，分别使用生物素化的或AlexaFlour647缀合的山羊抗小鼠IgG抗体进行捕获和检测，分析了来自两项独立实验的技术重复的SN样品。在Gyrolab Bioaffy 20HC CD中进行测定。利用Gyrolab huIgG–高滴度方法v2生成数据，并使用Gyrolab Evaluator软件评估结果。，
结果(图14的B)显示编码HC的RNA含量与通过ELISA检测到的单体RiboMab的量呈负相关。因此，1.25:1和1.5:1的HC:LC RNA比例在SN中产生最高的RiboMab浓度(～3.5μg/mL)，并且以剂量依赖性的方式，2.75:1的HC:LC比例产生最低量的RiboMab02.1(～2.0μg/mL)。选择1.5:1的HC:LC RNA比例用于编码RiboMab02.1的药物物质和药物产品的下游开发(表5)，因为它显示出对HMW含量最有利的RiboMab02.1产率。
表5：转染各种编码RiboMab02.1的药物物质中间体比例后的RiboMab2.1浓度和单体含量。
选择用于进一步开发的HC:LC RNA比例以粗体文本显示。LC＝轻链；LMW＝低分子量；HC＝重链；HMW＝高分子量；SD＝标准偏差。

Claims (126)

1.组合物或药物制剂，其包含：
(i)编码第一多肽链的第一RNA，所述第一多肽链包含来源于对CD3具有特异性的免疫球蛋白重链的可变区(VH)(VH(CD3))、来源于对CLDN6具有特异性的免疫球蛋白的重链的可变区(VH)(VH(CLDN6))，以及来源于对CLDN6具有特异性的免疫球蛋白的轻链的可变区(VL)(VL(CLDN6))；以及
(ii)编码第二多肽链的第二RNA，所述第二多肽链包含来源于对CD3具有特异性的免疫球蛋白的轻链的可变区(VL)(VL(CD3))、来源于对CLDN6具有特异性的免疫球蛋白的重链的可变区(VH)(VH(CLDN6))，以及来源于对CLDN6具有特异性的免疫球蛋白的轻链的可变区(VL)(VL(CLDN6))。
2.如权利要求1所述的组合物或药物制剂，其中所述第一多肽链与所述第二多肽链相互作用以形成对CD3具有特异性的结合域和对CLDN6具有特异性的两个结合域。
3.如权利要求1或2所述的组合物或药物制剂，其中，
所述第一多肽链的VH(CD3)和所述第二多肽链的VL(CD3)相互作用以形成对CD3具有特异性的结合域，
所述第一多肽链的VH(CLDN6)和VL(CLDN6)相互作用以形成对CLDN6具有特异性的结合域，并且
所述第二多肽链的VH(CLDN6)和VL(CLDN6)相互作用以形成对CLDN6具有特异性的结合域。
4.如权利要求1-3中任一项所述的组合物或药物制剂，其中所述第一多肽链和第二多肽链包含来源于免疫球蛋白的重链的恒定区1(CH1)或其功能变体和来源于免疫球蛋白的轻链的恒定区(CL)或其功能变体。
5.如权利要求1-4中任一项所述的组合物或药物制剂，其中所述免疫球蛋白是IgG1。
6.如权利要求5所述的组合物或药物制剂，其中所述IgG1是人IgG1。
7.如权利要求4-6中任一项所述的组合物或药物制剂，其中所述第一多肽链上的VH、VL和CH1从N端到C端按以下顺序布置：
VH(CD3)-CH1-VH(CLDN6)-VL(CLDN6)，或者
VH(CD3)-CH1-VL(CLDN6)-VH(CLDN6)。
8.如权利要求4-7中任一项所述的组合物或药物制剂，其中所述CH1通过肽接头与所述VH(CLDN6)或VL(CLDN6)连接。
9.如权利要求8所述的组合物或药物制剂，其中所述肽接头包含氨基酸序列SGPGGGRS(G4S)2或其功能变体。
10.如权利要求4-9中任一项所述的组合物或药物制剂，其中所述第二多肽链上的VH、VL和CL从N端到C端按以下顺序布置：
VL(CD3)-CL-VH(CLDN6)-VL(CLDN6)，或者
VL(CD3)-CL-VL(CLDN6)-VH(CLDN6)。
11.如权利要求4-10中任一项所述的组合物或药物制剂，其中所述CL通过肽接头与所述VH(CLDN6)或VL(CLDN6)连接。
12.如权利要求11所述的组合物或药物制剂，其中所述肽接头包含氨基酸序列DVPGGS或其功能变体。
13.如权利要求1-12中任一项所述的组合物或药物制剂，其中所述VH(CLDN6)和所述VL(CLDN6)通过肽接头彼此连接。
14.如权利要求13所述的组合物或药物制剂，其中所述肽接头包含氨基酸序列(G4S)x或其功能变体，其中x是2、3、4、5或6。
15.如权利要求14所述的组合物或药物制剂，其中所述肽接头包含氨基酸序列(G4S)4或其功能变体。
16.如权利要求4-15中任一项所述的组合物或药物制剂，其中所述第一多肽链上的CH1与所述第二多肽链上的CL相互作用。
17.如权利要求1-16中任一项所述的组合物或药物制剂，其中所述VH(CD3)包含SEQ IDNO:4的氨基酸27-145的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
18.如权利要求1-17中任一项所述的组合物或药物制剂，其中所述VL(CD3)包含SEQ IDNO:6的氨基酸27-132的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
19.如权利要求1-18中任一项所述的组合物或药物制剂，其中所述VH(CLDN6)包含SEQID NO:4的氨基酸267-383的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
20.如权利要求1-19中任一项所述的组合物或药物制剂，其中所述VL(CLDN6)包含SEQID NO:4的氨基酸404-510的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3，以及优选地在相对于CDR1的位置+15中的丝氨酸残基和/或在相对于CDR2的位置-3中的丝氨酸残基。
21.如权利要求1-20中任一项所述的组合物或药物制剂，其中所述VH(CD3)包含SEQ IDNO:4的氨基酸27-145的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3，所述VL(CD3)包含SEQ ID NO:6的氨基酸27-132的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3，所述VH(CLDN6)包含SEQ ID NO:4的氨基酸267-383的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3，并且所述VL(CLDN6)包含SEQ ID NO:4的氨基酸404-510的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3，并且优选地所述VL(CLDN6)包含在相对于CDR1的位置+15中的丝氨酸残基和/或在相对于CDR2的位置-3中的丝氨酸残基。
22.如权利要求1-21中任一项所述的组合物或药物制剂，其中，
所述VH(CD3)包含SEQ ID NO:4的氨基酸27-145的氨基酸序列或其功能变体，
所述VL(CD3)包含SEQ ID NO:6的氨基酸27-132的氨基酸序列或其功能变体，
所述VH(CLDN6)包含SEQ ID NO:4的氨基酸267-383的氨基酸序列或其功能变体，和/或
所述VL(CLDN6)包含SEQ ID NO:4的氨基酸404-510的氨基酸序列或其功能变体。
23.如权利要求1-22中任一项所述的组合物或药物制剂，其中所述第一多肽链包含SEQID NO:4的氨基酸序列或其功能变体。
24.如权利要求1-23中任一项所述的组合物或药物制剂，其中所述第二多肽链包含SEQID NO:6的氨基酸序列或其功能变体。
25.如权利要求1-24中任一项所述的组合物或药物制剂，其中所述第一多肽链包含SEQID NO:4的氨基酸序列或其功能变体，并且所述第二多肽链包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其功能变体。
26.如权利要求1-25中任一项所述的组合物或药物制剂，其中所述第一多肽和所述第二多肽中的至少一种由相比野生型编码序列进行了密码子优化和/或G/C含量增加的编码序列编码，其中所述密码子优化和/或所述G/C含量增加优选地不改变所编码的氨基酸序列的序列。
27.如权利要求1-26中任一项所述的组合物或药物制剂，其中所述第一多肽和所述第二多肽中的每种都由相比野生型编码序列进行了密码子优化和/或G/C含量增加的编码序列编码，其中所述密码子优化和/或所述G/C含量增加优选地不改变所编码的氨基酸序列的序列。
28.如权利要求1-27中任一项所述的组合物或药物制剂，其中所述RNA包含取代尿苷的修饰的核苷。
29.如权利要求28所述的组合物或药物制剂，其中所述修饰的核苷选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。
30.如权利要求1-29中任一项所述的组合物或药物制剂，其中至少一种RNA包含5’帽m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG。
31.如权利要求1-30中任一项所述的组合物或药物制剂，其中每种RNA都包含所述5’帽m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG。
32.如权利要求1-31中任一项所述的组合物或药物制剂，其中至少一种RNA包含5’UTR，所述5’UTR包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列或与SEQ ID NO:8的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
33.如权利要求1-32中任一项所述的组合物或药物制剂，其中每种RNA都包含5’UTR，所述5’UTR包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列或与SEQ ID NO:8的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
34.如权利要求1-33中任一项所述的组合物或药物制剂，其中至少一种RNA包含3’UTR，所述3’UTR包含SEQ ID NO:9的核苷酸序列或与SEQ ID NO:9的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
35.如权利要求1-34中任一项所述的组合物或药物制剂，其中每种RNA都包含3’UTR，所述3’UTR包含SEQ ID NO:9的核苷酸序列或与SEQ ID NO:9的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
36.如权利要求1-35中任一项所述的组合物或药物制剂，其中至少一种RNA包含多聚A序列。
37.如权利要求1-36中任一项所述的组合物或药物制剂，其中每种RNA都包含多聚A序列。
38.如权利要求36或37所述的组合物或药物制剂，其中所述多聚A序列包含至少100个核苷酸。
39.如权利要求36-38中任一项所述的组合物或药物制剂，其中所述多聚A序列包含SEQID NO:10的核苷酸序列或由其组成。
40.如权利要求1-39中任一项所述的组合物或药物制剂，其中
(i)所述第一RNA和所述第二RNA的(w/w)比例为约1.75:1至约1.25:1，或者约1.5:1至约1.25:1，或者优选地约1.5:1；和/或
(ii)所述第一RNA和所述第二RNA包含取代每个尿苷的修饰的核苷；和/或
(iii)所述第一RNA和所述第二RNA包含取代每个尿苷的修饰的核苷，其中所述修饰的核苷独立地选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)；和/或
(iv)所述第一RNA和所述第二RNA包含5’帽m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG；和/或
(v)所述第一RNA和所述第二RNA包含5’UTR，所述5’UTR包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列或与SEQ ID NO:8的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或
(vi)所述第一RNA和所述第二RNA包含3’UTR，所述3’UTR包含SEQ ID NO:9的核苷酸序列或与SEQ ID NO:9的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或
(vii)所述第一RNA和所述第二RNA包含多聚A尾，所述多聚A尾包含SEQ ID NO:10的核苷酸序列。
41.如权利要求1-40中任一项所述的组合物或药物制剂，其中，
(i)所述第一多肽链包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列；和/或
(ii)所述第一RNA包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与SEQ ID NO:5的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
42.如权利要求1-41中任一项所述的组合物或药物制剂，其中，
(i)所述第二多肽链包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列；和/或
(ii)所述第二RNA包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列或与SEQ ID NO:7的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
43.组合物或药物制剂，其包含：
(i)编码第一多肽链的第一RNA，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列；和
(ii)编码第二多肽链的第二RNA，所述第二多肽链包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。
44.如权利要求1-43中任一项所述的组合物或药物制剂，其中所述第一RNA包含SEQ IDNO:5的核苷酸序列或与SEQ ID NO:5的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
45.如权利要求1-44中任一项所述的组合物或药物制剂，其中所述第二RNA包含SEQ IDNO:7的核苷酸序列或与SEQ ID NO:7的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
46.如权利要求1-45中任一项所述的组合物或药物制剂，其中所述RNA是mRNA。
47.如权利要求1-46中任一项所述的组合物或药物制剂，其中所述RNA被配制为液体、被配制为固体，或者以上的组合。
48.如权利要求1-47中任一项所述的组合物或药物制剂，其中所述RNA被配制或待配制用于注射。
49.如权利要求1-48中任一项所述的组合物或药物制剂，其中所述RNA被配制或待配制用于静脉内给药。
50.如权利要求1-49中任一项所述的组合物或药物制剂，其中所述RNA被配制或待配制为颗粒。
51.如权利要求50所述的组合物或药物制剂，其中所述颗粒是脂质纳米粒子(LNP)。
52.如权利要求51所述的组合物或药物制剂，其中所述LNP颗粒包括((3-羟丙基)氮亚烷基)双(壬烷-9,1-二基)双(2-辛酸丁酯)、2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱和胆固醇。
53.如权利要求1-52中任一项所述的组合物或药物制剂，其为药物组合物，其中所述药物组合物优选地包含0.05μg/kg或更高，或者0.05μg/kg-5mg/kg，或者0.05μg/kg-500μg/kg，或者0.5μg/kg-500μg/kg，或者1μg/kg-50μg/kg，或者5μg/kg-150μg/kg，或者15μg/kg-150μg/kg剂量的编码所述第一多肽和第二多肽的RNA，其中kg是指待治疗对象的kg体重。
54.如权利要求53所述的组合物或药物制剂，其中所述药物组合物还包含一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。
55.如权利要求1-52中任一项所述的组合物或药物制剂，其中所述药物制剂是试剂盒。
56.如权利要求55所述的组合物或药物制剂，其中所述RNA和任选地形成颗粒的组分在单独的小瓶中。
57.如权利要求55或56所述的组合物或药物制剂，其还包括用于治疗或预防癌症的组合物或药物制剂的使用说明书。
58.如权利要求1-57中任一项所述的用于药物用途的组合物或药物制剂。
59.如权利要求58所述的组合物或药物制剂，其中所述药物用途包括疾病或病症的治疗性或预防性治疗。
60.如权利要求59所述的组合物或药物制剂，其中疾病或病症的治疗性或预防性治疗包括治疗或预防癌症。
61.如权利要求59-60中任一项所述的组合物或药物制剂，其中疾病或病症的治疗性或预防性治疗还包括给予进一步的治疗。
62.如权利要求62所述的组合物或药物制剂，其中所述进一步的治疗包括选自以下中的一种或多种：(i)手术切除、切割或减积肿瘤，(ii)放射疗法，以及(iii)化学疗法。
63.如权利要求62所述的组合物或药物制剂，其中所述进一步的治疗包括给予进一步的治疗剂。
64.如权利要求63所述的组合物或药物制剂，其中所述进一步的治疗剂包括抗癌治疗剂。
65.如权利要求1-64中任一项所述的组合物或药物制剂，其被用于向人类给药。
66.治疗对象中的癌症的方法，其包括向所述对象给予：
(i)编码第一多肽链的第一RNA，所述第一多肽链包含来源于对CD3具有特异性的免疫球蛋白的重链的可变区(VH)(VH(CD3))、来源于对CLDN6具有特异性的免疫球蛋白的重链的可变区(VH)(VH(CLDN6))，以及来源于对CLDN6具有特异性的免疫球蛋白的轻链的可变区(VL)(VL(CLDN6))；以及
(ii)编码第二多肽链的第二RNA，所述第二多肽链包含来源于对CD3具有特异性的免疫球蛋白的轻链的可变区(VL)(VL(CD3))、来源于对CLDN6具有特异性的免疫球蛋白的重链的可变区(VH)(VH(CLDN6))，以及来源于对CLDN6具有特异性的免疫球蛋白的轻链的可变区(VL)(VL(CLDN6))。
67.如权利要求66所述的方法，其中所述第一多肽链与所述第二多肽链相互作用以形成对CD3具有特异性的结合域和对CLDN6具有特异性的两个结合域。
68.如权利要求66或67所述的方法，其中
所述第一多肽链的VH(CD3)与所述第二多肽链的VL(CD3)相互作用以形成对CD3具有特异性的结合域，
所述第一多肽链的VH(CLDN6)和VL(CLDN6)相互作用以形成对CLDN6具有特异性的结合域，并且
所述第二多肽链的VH(CLDN6)和VL(CLDN6)相互作用以形成对CLDN6具有特异性的结合域。
69.如权利要求66-68中任一项所述的方法，其中所述第一和所述第二多肽链包含来源于免疫球蛋白的重链的恒定区1(CH1)或其功能变体和来源于免疫球蛋白的轻链的恒定区(CL)或其功能变体。
70.如权利要求66-69中任一项所述的方法，其中所述免疫球蛋白是IgG1。
71.如权利要求70所述的方法，其中所述IgG1是人IgG1。
72.如权利要求69-71中任一项所述的方法，其中所述第一多肽链上的VH、VL和CH1从N端到C端按以下顺序布置：
VH(CD3)-CH1-VH(CLDN6)-VL(CLDN6)，或
VH(CD3)-CH1-VL(CLDN6)-VH(CLDN6)。
73.如权利要求69-72中任一项所述的方法，其中所述CH1通过肽接头与所述VH(CLDN6)或VL(CLDN6)连接。
74.如权利要求73所述的方法，其中所述肽接头包含SGPGGGRS(G4S)2的氨基酸序列或其功能变体。
75.如权利要求69-74中任一项所述的方法，其中所述第二多肽链上的VH、VL和CL从N端到C端按以下顺序布置：
VL(CD3)-CL-VH(CLDN6)-VL(CLDN6)，或者
VL(CD3)-CL-VL(CLDN6)-VH(CLDN6)。
76.如权利要求69-75中任一项所述的方法，其中所述CL通过肽接头与所述VH(CLDN6)或VL(CLDN6)连接。
77.如权利要求76所述的方法，其中所述肽接头包含DVPGGS的氨基酸序列或其功能变体。
78.如权利要求66-77中任一项所述的方法，其中所述VH(CLDN6)和所述VL(CLDN6)通过肽接头彼此连接。
79.如权利要求78所述的方法，其中所述肽接头包含(G4S)x的氨基酸序列或其功能变体，其中x是2、3、4、5或6。
80.如权利要求79所述的方法，其中所述肽接头包含(G4S)4的氨基酸序列或其功能变体。
81.如权利要求69-80中任一项所述的方法，其中所述第一多肽链上的CH1与所述第二多肽链上的CL相互作用。
82.如权利要求66-81中任一项所述的方法，其中所述VH(CD3)包含SEQ ID NO:4的氨基酸27-145的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
83.如权利要求66-82中任一项所述的方法，其中所述VL(CD3)包含SEQ ID NO:6的氨基酸27-132的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
84.如权利要求66-83中任一项所述的方法，其中所述VH(CLDN6)包含SEQ ID NO:4的氨基酸267-383的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
85.如权利要求66-84中任一项所述的方法，其中所述VL(CLDN6)包含SEQ ID NO:4的氨基酸404-510的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3，以及优选地在相对于CDR1的位置+15中的丝氨酸残基和/或在相对于CDR2的位置-3中的丝氨酸残基。
86.如权利要求66-85中任一项所述的方法，其中所述VH(CD3)包含SEQ ID NO:4的氨基酸27-145的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3，所述VL(CD3)包含SEQ ID NO:6的氨基酸27-132的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3，所述VH(CLDN6)包含SEQ ID NO:4的氨基酸267-383的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3，并且所述VL(CLDN6)包含SEQ ID NO:4的氨基酸404-510的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3，并且优选地所述VL(CLDN6)包含在相对于CDR1的位置+15中的丝氨酸残基和/或在相对于CDR2的位置-3中的丝氨酸残基。
87.如权利要求66-86中任一项所述的方法，其中
所述VH(CD3)包含SEQ ID NO:4的氨基酸27-145的氨基酸序列或其功能变体，
所述VL(CD3)包含SEQ ID NO:6的氨基酸27-132的氨基酸序列或其功能变体，
所述VH(CLDN6)包含SEQ ID NO:4的氨基酸267-383的氨基酸序列或其功能变体，和/或
所述VL(CLDN6)包含SEQ ID NO:4的氨基酸404-510的氨基酸序列或其功能变体。
88.如权利要求66-87中任一项所述的方法，其中所述第一多肽链包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其功能变体。
89.如权利要求66-88中任一项所述的方法，其中所述第二多肽链包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其功能变体。
90.如权利要求66-89中任一项所述的方法，其中所述第一多肽链包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其功能变体，并且所述第二多肽链包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其功能变体。
91.如权利要求66-90中任一项所述的方法，其中所述第一多肽和所述第二多肽中的至少一种由相比野生型编码序列进行了密码子优化和/或G/C含量增加的编码序列编码，其中所述密码子优化和/或所述G/C含量增加优选地不改变所编码的氨基酸序列的序列。
92.如权利要求66-91中任一项所述的方法，其中所述第一多肽和所述第二多肽中的每种都由相比野生型编码序列进行了密码子优化和/或G/C含量增加的编码序列编码，其中所述密码子优化和/或所述G/C含量增加优选地不改变所编码的氨基酸序列的序列。
93.如权利要求66-92中任一项所述的方法，其中所述RNA包含取代尿苷的修饰的核苷。
94.如权利要求93所述的方法，其中所述修饰的核苷选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。
95.如权利要求66-94中任一项所述的方法，其中至少一种RNA包含5’帽m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG。
96.如权利要求66-95中任一项所述的方法，其中每种RNA都包含5’帽m2 7,3’-OGppp(m1 2 ’-O)ApG。
97.如权利要求66-96中任一项所述的方法，其中至少一种RNA包含5’UTR，所述5’UTR包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列或与SEQ ID NO:8的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
98.如权利要求66-97中任一项所述的方法，其中每种RNA都包含5’UTR，所述5’UTR包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列或与SEQ ID NO:8的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
99.如权利要求66-98中任一项所述的方法，其中至少一种RNA包含3’UTR，所述3’UTR包含SEQ ID NO:9的核苷酸序列或与SEQ ID NO:9的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
100.如权利要求66-99中任一项所述的方法，其中每种RNA都包含3’UTR，所述3’UTR包含SEQ ID NO:9的核苷酸序列或与SEQ ID NO:9的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
101.如权利要求66-100中任一项所述的方法，其中至少一种RNA包含多聚A序列。
102.如权利要求66-101中任一项所述的方法，其中每种RNA都包含多聚A序列。
103.如权利要求101或102所述的方法，其中所述多聚A序列包含至少100个核苷酸。
104.如权利要求101-103中任一项所述的方法，其中所述多聚A序列包含SEQ ID NO:10的核苷酸序列或由其组成。
105.如权利要求66-104中任一项所述的方法，其中
(i)所述第一RNA和所述第二RNA的(w/w)比例为约1.75:1至约1.25:1，或者约1.5:1至约1.25:1，或者优选地约1.5:1；和/或
(ii)所述第一RNA和所述第二RNA包含取代每个尿苷的修饰的核苷；和/或
(iii)所述第一RNA和所述第二RNA包含取代每个尿苷的修饰的核苷，其中所述修饰的核苷独立地选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)；和/或
(iv)所述第一RNA和所述第二RNA包含5’帽m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG；和/或
(v)所述第一RNA和所述第二RNA包含5’UTR，所述5’UTR包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列或与SEQ ID NO:8的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或
(vi)所述第一RNA和所述第二RNA包含3’UTR，所述3’UTR包含SEQ ID NO:9的核苷酸序列或与SEQ ID NO:9的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或
(vii)所述第一RNA和所述第二RNA包含多聚A尾，所述多聚A尾包含SEQ ID NO:10的核苷酸序列。
106.如权利要求66-105中任一项所述的方法，其中
(i)所述第一多肽链包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列；和/或
(ii)所述第一RNA包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与SEQ ID NO:5的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
107.如权利要求66-106中任一项所述的方法，其中
(i)所述第二多肽链包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列；和/或
(ii)所述第二RNA包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列或与SEQ ID NO:7的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
108.治疗对象中的癌症的方法，包括向所述对象给予：
(i)编码第一多肽链的第一RNA，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列；以及
(ii)编码第二多肽链的第二RNA，所述第二多肽链包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。
109.如权利要求66-108中任一项所述的方法，其中所述第一RNA包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与SEQ ID NO:5的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
110.如权利要求66-109中任一项所述的方法，其中所述第二RNA包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列或与SEQ ID NO:7的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
111.如权利要求66-110中任一项所述的方法，其中所述RNA是mRNA。
112.如权利要求66-111中任一项所述的方法，其中所述RNA被配制为液体、被配制为固体，或者以上的组合。
113.如权利要求66-112中任一项所述的方法，其中所述RNA通过注射给药，优选地每周一次，
114.如权利要求66-113中任一项所述的方法，其中所述RNA通过静脉内给药进行给药。
115.如权利要求66-114中任一项所述的方法，其中所述RNA被配制为颗粒。
116.如权利要求115所述的方法，其中所述颗粒是脂质纳米粒子(LNP)。
117.如权利要求116所述的方法，其中所述LNP颗粒包含((3-羟丙基)氮亚烷基)双(壬烷-9,1-二基)双(2-辛酸丁酯)、2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱和胆固醇。
118.如权利要求66-117中任一项所述的方法，其中所述RNA在药物组合物中进行配制，其中所述药物组合物优选地包含0.05μg/kg或更高，或者0.05μg/kg-5mg/kg，或者0.05μg/kg-500μg/kg，或者0.5μg/kg-500μg/kg，或者1μg/kg-50μg/kg，或者5μg/kg-150μg/kg，或者15μg/kg-150μg/kg剂量的编码所述第一和第二多肽的RNA，其中kg是指待治疗对象的kg体重。
119.如权利要求118所述的方法，其中所述药物组合物还包含一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。
120.如权利要求66-119中任一项所述的方法，其还包括给予进一步的治疗。
121.如权利要求120所述的方法，其中所述进一步的治疗包括选自以下中的一种或多种：(i)手术切除、切割或减积肿瘤，(ii)放射疗法，以及(iii)化学疗法。
122.如权利要求121所述的方法，其中所述进一步的治疗包括给予进一步的治疗剂。
123.如权利要求122所述的方法，其中所述进一步的治疗剂包括抗癌治疗剂。
124.如权利要求66-123中任一项所述的方法，其中所述对象是人类。
125.如权利要求66-124中任一项所述的方法，其中所述癌症是CLDN6阳性癌症。
126.用于权利要求66-125中任一项所述的方法中的权利要求1-65中任一项所述的组合物或药物制剂。
CN202280046768.5A 2021-07-15 2022-07-13 用于治疗cldn6阳性癌症的编码cldn6和cds结合元件的试剂 Pending CN117642429A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EPPCT/EP2021/069869 2021-07-15
EP2021069869 2021-07-15
PCT/EP2022/069659 WO2023285560A1 (en) 2021-07-15 2022-07-13 Agents encoding cldn6 and cd3 binding elements for treating cldn6-positive cancers

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117642429A true CN117642429A (zh) 2024-03-01

Family

ID=82781147

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202280046768.5A Pending CN117642429A (zh) 2021-07-15 2022-07-13 用于治疗cldn6阳性癌症的编码cldn6和cds结合元件的试剂

Country Status (11)

Country Link
EP (1) EP4370551A1 (zh)
JP (1) JP2024525795A (zh)
KR (1) KR20240035794A (zh)
CN (1) CN117642429A (zh)
AR (1) AR126464A1 (zh)
AU (1) AU2022311053A1 (zh)
CA (1) CA3226700A1 (zh)
IL (1) IL309495A (zh)
MX (1) MX2024000678A (zh)
TW (1) TW202327647A (zh)
WO (1) WO2023285560A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024086575A1 (en) 2022-10-17 2024-04-25 BioNTech SE Combination vaccines against coronavirus infection, influenza infection, and/or rsv infection

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992022653A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
GB9203459D0 (en) 1992-02-19 1992-04-08 Scotgen Ltd Antibodies with germ-line variable regions
WO2007059782A1 (en) 2005-11-28 2007-05-31 Genmab A/S Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof
EP2281579A1 (en) 2009-08-05 2011-02-09 BioNTech AG Vaccine composition comprising 5'-Cap modified RNA
CA2890438C (en) * 2012-11-13 2022-10-18 Biontech Ag Agents for treatment of claudin expressing cancer diseases
BR122020024124B1 (pt) * 2012-11-13 2024-01-30 Biontech Ag Agentes para tratamento de doenças cancerosas expressando claudina
WO2016005004A1 (en) 2014-07-11 2016-01-14 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Stabilization of poly(a) sequence encoding dna sequences
WO2017059902A1 (en) 2015-10-07 2017-04-13 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh 3' utr sequences for stabilization of rna
CA3003055C (en) 2015-10-28 2023-08-01 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
WO2018081480A1 (en) 2016-10-26 2018-05-03 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations
WO2018054484A1 (en) * 2016-09-23 2018-03-29 Biontech Ag Bispecific trivalent antibodies binding to claudin 6 or claudin18.2 and cd3 for treatment of claudin expressing cancer diseases
CA3134056A1 (en) * 2019-03-20 2020-09-24 The Regents Of The University Of California Claudin-6 bispecific antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
JP2024525795A (ja) 2024-07-12
CA3226700A1 (en) 2023-01-19
MX2024000678A (es) 2024-02-07
AU2022311053A9 (en) 2024-01-04
IL309495A (en) 2024-02-01
TW202327647A (zh) 2023-07-16
AU2022311053A1 (en) 2023-12-14
KR20240035794A (ko) 2024-03-18
AR126464A1 (es) 2023-10-11
WO2023285560A1 (en) 2023-01-19
EP4370551A1 (en) 2024-05-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2021202453B2 (en) Methods and compositions for delivering mrna coded antibodies
JP7514206B2 (ja) コロナウイルスワクチン
JP2016533174A (ja) ペプチドキメラ抗原受容体ｔ細胞スイッチおよびその使用
US20240043527A1 (en) Rna compositions targeting claudin-18.2
KR20190125398A (ko) 글리칸-상호작용 화합물 및 사용 방법
US20240009238A1 (en) Agents and methods for targeted delivery to cells
CN117642429A (zh) 用于治疗cldn6阳性癌症的编码cldn6和cds结合元件的试剂
KR20230065256A (ko) 코로나바이러스 s 단백질용 결합제
CN115666638A (zh) 涉及用于抗原疫苗接种的非免疫原性rna的治疗
TW202245808A (zh) 用於治療癌症之治療性ｒｎａ
KR20240024806A (ko) 면역 작동자 세포의 활성화 및 표적화를 위한 물질 및 방법
WO2024074634A1 (en) Rna compositions targeting claudin-18.2
WO2024074211A1 (en) Rna compositions targeting claudin-18.2
AU2023216437A1 (en) Agents and methods for targeted delivery of nucleic acids to cells
AU2023232105A1 (en) Epo receptor agonists and antagonists
WO2022218957A1 (en) Polymersomes comprising a soluble encapsulated polynucleotide and an ionizable lipid as well as methods of making and uses thereof
CN118176209A (zh) 涉及用于抗原疫苗接种的非免疫原性rna和pd-1轴结合拮抗剂的治疗

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40106183

Country of ref document: HK