JP2024525795A - Ｃｌｄｎ６陽性癌を治療するための、ｃｌｄｎ６およびｃｄ３結合要素をコードする薬剤 - Google Patents

Ｃｌｄｎ６陽性癌を治療するための、ｃｌｄｎ６およびｃｄ３結合要素をコードする薬剤 Download PDF

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本発明は、一般に、少なくともＣＤ３およびＣＬＤＮ６への結合について二重特異性である、すなわち、少なくともＣＤ３およびＣＬＤＮ６に結合することができる結合剤に関する。具体的には、本発明は、対象の癌の治療または予防に使用し得るこれらの結合剤をコードするＲＮＡに関する。

Description

癌は世界的に２番目に多い死因であり、２０２０年には１０００万人の死亡の原因であると推定された。一般に、生殖細胞および一部のカルチノイド腫瘍などのいくつかの例外を除いて、固形腫瘍が転移すると、５年生存率が２５％を超えることはまれである。
化学療法、放射線療法、手術、および標的療法などの従来の治療法の改良ならびに免疫療法の最近の進歩により、進行性固形腫瘍を有する患者の転帰が改善されている。ここ数年で、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）および欧州医薬品庁（ＥＭＡ）は、複数の癌型、主に固形腫瘍を有する患者の治療のためのいくつかの免疫チェックポイント阻害剤を承認した。これらの承認は、癌治療の状況を劇的に変化させた。
転移癌または局所進行癌における予後不良は、さらなる治療アプローチの必要性を強調する。そのようなアプローチの１つは、有望なモダリティを有する絶えず進化している分野である標的療法のアプローチである。
ＣＬＤＮ６は、上皮細胞シートおよび内皮細胞シートにおける頂端タイトジャンクション複合体の形成に関与するテトラスパニン膜タンパク質（ＰｆａｍデータベースＩＤ：ＰＦ００８２２）のＰＭＰ－２２／ＥＭＰ／ＭＰ２０／クローディンスーパーファミリーに属し、細胞極性の維持に重要な役割を果たす（Ｋｒａｕｓｅ Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．２００８；１７７８（３）：６３１－６４５）。重要なことに、クローディンタンパク質の発現は細胞のタイトジャンクションに限定され、標準的な生理学的条件下でのイオン輸送にのみ利用可能である（Ｋｒａｕｓｅ Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．２００８；１７７８（３）：６３１－６４５）。さもなければ、ＣＬＤＮ６のインビボ機能については他にほとんど知られていない。
ＣＬＤＮ６は、そのＮ末端およびＣ末端が細胞質内に伸びる４つの膜貫通ヘリックスを有する。ＣＬＤＮ６の短いＮ末端配列の後には、大きな細胞外ループ（ＥＬ１）、短い細胞内ループ、第２の細胞外ループ（ＥＬ２）、およびＣ末端細胞質尾部が続く（Ｃｏｌｅｇｉｏ Ｏ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００２；２８３（１）：Ｃ１４２－Ｃ１４７）。
ＣＬＤＮ６のアイソフォームはこれまで同定されていない（Ｌａｌ－Ｎａｇ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．２００９；１０（８）：２３５）。クローディンファミリーメンバーのＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４およびＣＬＤＮ９は、ＣＬＤＮ６と配列相同性を共有する。ＣＬＤＮ３およびＣＬＤＮ４は、一般に、肺、肝臓、乳房、膵臓、腎臓および腸の正常な上皮細胞で発現される（Ｋｗｏｎ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．２０１３；１４（９）：１８１４８－１８１８０）。ＣＬＤＮ９発現は大部分の正常組織では存在しない；しかしながら、ヒトにおけるＣＬＤＮ９遺伝子切断と聴覚障害との関連が報告されているように（Ｓｉｎｅｎｉ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２０１９；１３８（１０）：１０７１－１０７５）、マウス内耳の蝸牛および前庭部におけるＣＬＤＮ９発現が報告されている（Ｋｉｔａｊｉｒｉ Ｓ．Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｅａｒ Ｒｅｓ．２００４；１８７（１－２）：２５－３４；Ｎａｋａｎｏ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ．２００９；５（８）：ｅ１０００６１０）。
癌胎児性タンパク質ＣＬＤＮ６は、胚性幹細胞においてほぼ排他的に発現され、次いで神経または心臓系統への分化中に急速に下方制御され、胎盤以外の正常な成体組織では発現されない（Ａｓｓｏｕ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２００７；２５（４）：９６１－９７３；Ｂｅｎ－Ｄａｖｉｄ Ｕ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１３；４：１９９２；Ｒｅｉｎｈａｒｄ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０２０；３６７（６４７６）：４４６－４５３）。ＣＬＤＮ６は、精巣癌、卵巣癌、子宮内膜癌および肺癌を含む様々なヒト癌タイプで発現される。代表的な試験は、全ての組織学的サブタイプの精巣癌の約９３％が、染色強度≧２＋によって定義される、ＣＬＤＮ６に対して非常に陽性に染色されることを示した。さらに、卵巣癌の５６％がＣＬＤＮ６に対して陽性に染色され、このうち２０～２５％が５０％を超える腫瘍細胞において高い（≧２＋）細胞膜染色を示した。原発性卵巣癌と比較して、ＣＬＤＮ６陽性試料の頻度は転移病変で有意に増加し（７２％；データは示していない）、ＣＬＤＮ６発現を疾患進行と関連付けた。子宮内膜癌の２３％および肺癌の１１％がＣＬＤＮ６に対して陽性に染色され、このうちそれぞれ１０～１５％および２～５％が≧２＋の染色強度を示した。
Ｋｒａｕｓｅ Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．２００８；１７７８（３）：６３１－６４５ Ｃｏｌｅｇｉｏ Ｏ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００２；２８３（１）：Ｃ１４２－Ｃ１４７ Ｌａｌ－Ｎａｇ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．２００９；１０（８）：２３５ Ｋｗｏｎ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．２０１３；１４（９）：１８１４８－１８１８０ Ｓｉｎｅｎｉ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２０１９；１３８（１０）：１０７１－１０７５ Ｋｉｔａｊｉｒｉ Ｓ．Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｅａｒ Ｒｅｓ．２００４；１８７（１－２）：２５－３４ Ｎａｋａｎｏ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ．２００９；５（８）：ｅ１０００６１０ Ａｓｓｏｕ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２００７；２５（４）：９６１－９７３ Ｂｅｎ－Ｄａｖｉｄ Ｕ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１３；４：１９９２ Ｒｅｉｎｈａｒｄ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０２０；３６７（６４７６）：４４６－４５３
本発明の目的は、ＣＬＤＮ６陽性癌疾患の治療のための新規な薬剤および方法を提供することであった。
いくつかの実施形態では、本発明の根底にある問題の解決策は、患者の細胞によって発現されるＲＮＡを投与して、癌細胞によって発現されるＣＬＤＮ６に特異的な２つの結合ドメインと、Ｔ細胞によって発現されるＣＤ３に特異的な結合ドメインとを含む結合剤を形成するポリペプチド鎖を発現させ、したがって癌細胞に対するＴ細胞の細胞傷害効果を標的化することを可能にするという概念に基づく。
本発明は、一般に、少なくともＣＤ３およびＣＬＤＮ６への結合について二重特異性である、すなわち、少なくともＣＤ３およびＣＬＤＮ６に結合することができる結合剤に関する。具体的には、本発明は、対象の癌の治療または予防に使用し得るこれらの結合剤をコードするＲＮＡに関する。特に、本明細書に開示される結合剤をコードするＲＮＡは、ＣＤ３およびＣＬＤＮ６を標的化するための結合剤を（適切な標的細胞によるＲＮＡの発現後に）提供するために投与され得る。
したがって、本明細書に記載の医薬組成物は、レシピエントの細胞に入るとそれぞれのコードされたポリペプチドに翻訳され得る一本鎖ＲＮＡを活性成分として含み得る。結合剤をコードする配列に加えて、ＲＮＡは、安定性および翻訳効率に関してＲＮＡの最大有効性のために最適化された１つ以上の構造要素（５’キャップ、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ、ポリ（Ａ）尾部）を含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡはこれらの要素の全てを含む。
本明細書に記載のＲＮＡをタンパク質および／または脂質、好ましくは脂質と複合体化して、投与のためのＲＮＡ粒子を生成し得る。異なるＲＮＡを一緒に複合体化してもよく、またはタンパク質および／もしくは脂質と別々に複合体化して、投与のためのＲＮＡ粒子を生成してもよい。
一態様では、本発明は、
（ｉ）ＣＤ３に特異性を有する免疫グロブリンに由来する重鎖の可変領域（ＶＨ）（ＶＨ（ＣＤ３））、ＣＬＤＮ６に特異性を有する免疫グロブリンに由来する重鎖の可変領域（ＶＨ）（ＶＨ（ＣＬＤＮ６））およびＣＬＤＮ６に特異性を有する免疫グロブリンに由来する軽鎖の可変領域（ＶＬ）（ＶＬ（ＣＬＤＮ６））を含む第１のポリペプチド鎖をコードする第１のＲＮＡ；ならびに
（ｉｉ）ＣＤ３に特異性を有する免疫グロブリンに由来する軽鎖の可変領域（ＶＬ）（ＶＬ（ＣＤ３））、ＣＬＤＮ６に特異性を有する免疫グロブリンに由来する重鎖の可変領域（ＶＨ）（ＶＨ（ＣＬＤＮ６））およびＣＬＤＮ６に特異性を有する免疫グロブリンに由来する軽鎖の可変領域（ＶＬ）（ＶＬ（ＣＬＤＮ６））を含む第２のポリペプチド鎖をコードする第２のＲＮＡ
を含む組成物または医薬製剤を提供する。
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖は第２のポリペプチド鎖と相互作用して、ＣＤ３に特異性を有する結合ドメインおよびＣＬＤＮ６に特異性を有する２つの結合ドメインを形成する。
いくつかの実施形態では、
第１のポリペプチド鎖のＶＨ（ＣＤ３）と第２のポリペプチド鎖のＶＬ（ＣＤ３）とが相互作用して、ＣＤ３に特異性を有する結合ドメインを形成し、
第１のポリペプチド鎖のＶＨ（ＣＬＤＮ６）とＶＬ（ＣＬＤＮ６）とが相互作用して、ＣＬＤＮ６に特異性を有する結合ドメインを形成し、
第２のポリペプチド鎖のＶＨ（ＣＬＤＮ６）とＶＬ（ＣＬＤＮ６）とが相互作用して、ＣＬＤＮ６に特異性を有する結合ドメインを形成する。
一態様では、本発明は、
（ｉ）可変領域ＶＨ（ＣＤ３）、可変領域ＶＨ（ＣＬＤＮ６）および可変領域ＶＬ（ＣＬＤＮ６）を含む第１のポリペプチド鎖をコードする第１のＲＮＡ；ならびに
（ｉｉ）可変領域ＶＬ（ＣＤ３）、可変領域ＶＨ（ＣＬＤＮ６）および可変領域ＶＬ（ＣＬＤＮ６）を含む第２のポリペプチド鎖をコードする第２のＲＮＡ
を含み、第１のポリペプチド鎖のＶＨ（ＣＤ３）と第２のポリペプチド鎖のＶＬ（ＣＤ３）とが相互作用して、ＣＤ３に特異性を有する結合ドメインを形成し、
第１のポリペプチド鎖のＶＨ（ＣＬＤＮ６）とＶＬ（ＣＬＤＮ６）とが相互作用して、ＣＬＤＮ６に特異性を有する結合ドメインを形成し、
第２のポリペプチド鎖のＶＨ（ＣＬＤＮ６）とＶＬ（ＣＬＤＮ６）とが相互作用して、ＣＬＤＮ６に特異性を有する結合ドメインを形成する、
組成物または医薬製剤を提供する。
いくつかの実施形態では、第１および第２のポリペプチド鎖は、免疫グロブリンまたはその機能的変異体に由来する重鎖の定常領域１（ＣＨ１）と、免疫グロブリンまたはその機能的変異体に由来する軽鎖の定常領域（ＣＬ）とを含む。
いくつかの実施形態では、免疫グロブリンはＩｇＧ１である。
いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１はヒトＩｇＧ１である。
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖上のＶＨ、ＶＬ、およびＣＨ１は、
ＶＨ（ＣＤ３）－ＣＨ１－ＶＨ（ＣＬＤＮ６）－ＶＬ（ＣＬＤＮ６）、または
ＶＨ（ＣＤ３）－ＣＨ１－ＶＬ（ＣＬＤＮ６）－ＶＨ（ＣＬＤＮ６）
の順序でＮ末端からＣ末端へと配置される。
いくつかの実施形態では、ＣＨ１は、ペプチドリンカーによってＶＨ（ＣＬＤＮ６）またはＶＬ（ＣＬＤＮ６）に接続されている。一実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＳＧＰＧＧＧＲＳ（Ｇ４Ｓ）２またはその機能的変異体を含む。
いくつかの実施形態では、第２のポリペプチド鎖上のＶＨ、ＶＬ、およびＣＬは、
ＶＬ（ＣＤ３）－ＣＬ－ＶＨ（ＣＬＤＮ６）－ＶＬ（ＣＬＤＮ６）、または
ＶＬ（ＣＤ３）－ＣＬ－ＶＬ（ＣＬＤＮ６）－ＶＨ（ＣＬＤＮ６）
の順序でＮ末端からＣ末端へと配置される。
いくつかの実施形態では、ＣＬは、ペプチドリンカーによってＶＨ（ＣＬＤＮ６）またはＶＬ（ＣＬＤＮ６）に接続されている。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＤＶＰＧＧＳまたはその機能的変異体を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＨ（ＣＬＤＮ６）およびＶＬ（ＣＬＤＮ６）は、ペプチドリンカーによって互いに接続されている。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列（Ｇ４Ｓ）ｘまたはその機能的変異体を含み、ｘは、２、３、４、５または６である。一実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列（Ｇ４Ｓ）４またはその機能的変異体を含む。
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖上のＣＨ１は、第２のポリペプチド鎖上のＣＬと相互作用する。
いくつかの実施形態では、ＶＨ（ＣＤ３）は、配列番号４のアミノ酸２７～１４５のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＨ（ＣＤ３）は、アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＲＹＴまたはその機能的変異体を含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＮＰＳＲＧＹＴまたはその機能的変異体を含むＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＡＲＹＹＤＤＨＹＳＬＤＹまたはその機能的変異体を含むＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＨ（ＣＤ３）は、アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＲＹＴまたはその機能的変異体を含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＮＰＳＲＧＹＴまたはその機能的変異体を含むＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹまたはその機能的変異体を含むＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＨ（ＣＤ３）は、配列番号４のアミノ酸２７～１４５のアミノ酸配列またはその機能的変異体を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＬ（ＣＤ３）は、配列番号６のアミノ酸２７～１３２のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＬ（ＣＤ３）は、アミノ酸配列ＳＳＶＳＹまたはその機能的変異体を含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＤＴＳまたはその機能的変異体を含むＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＱＱＷＳＳＮＰＬＴまたはその機能的変異体を含むＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＬ（ＣＤ３）は、配列番号６のアミノ酸２７～１３２のアミノ酸配列またはその機能的変異体を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＨ（ＣＬＤＮ６）は、配列番号４のアミノ酸２６７～３８３のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＨ（ＣＬＤＮ６）は、アミノ酸配列ＧＹＳＦＴＧＹＴまたはその機能的変異体を含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＮＰＹＮＧＧＴまたはその機能的変異体を含むＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＡＲＤＹＧＦＶＬＤＹまたはその機能的変異体を含むＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＨ（ＣＬＤＮ６）は、配列番号４のアミノ酸２６７～３８３のアミノ酸配列またはその機能的変異体を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＬ（ＣＬＤＮ６）は、配列番号４のアミノ酸４０４～５１０のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＬ（ＣＬＤＮ６）は、配列番号４のアミノ酸４０４～５１０のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびにＣＤＲ１に対して＋１５の位置のセリン残基（配列番号４の４４９位に対応する）を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＬ（ＣＬＤＮ６）は、配列番号４のアミノ酸４０４～５１０のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびにＣＤＲ２に対して－３の位置のセリン残基（配列番号４の４４９位に対応する）を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＬ（ＣＬＤＮ６）は、配列番号４のアミノ酸４０４～５１０のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、配列番号４のアミノ酸４０４～５１０のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、または８０％の同一性を有する配列、ならびに配列番号４の４４９位に対応する位置のセリン残基を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＬ（ＣＬＤＮ６）は、アミノ酸配列ＳＳＶＳＹまたはその機能的変異体を含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＳＴＳまたはその機能的変異体を含むＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＱＱＲＳＮＹＰＰＷＴまたはその機能的変異体を含むＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＬ（ＣＬＤＮ６）は、配列番号４のアミノ酸４０４～５１０のアミノ酸配列またはその機能的変異体を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＨ（ＣＤ３）は、配列番号４のアミノ酸２７～１４５のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＶＬ（ＣＤ３）は、配列番号６のアミノ酸２７～１３２のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＶＨ（ＣＬＤＮ６）は、配列番号４のアミノ酸２６７～３８３のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＶＬ（ＣＬＤＮ６）は、配列番号４のアミノ酸４０４～５１０のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに好ましくはＣＤＲ１に対して＋１５の位置のセリン残基（配列番号４の４４９位に対応する）および／またはＣＤＲ２に対して－３の位置のセリン残基（配列番号４の４４９位に対応する）を含む。
いくつかの実施形態では、
ＶＨ（ＣＤ３）は、配列番号４のアミノ酸２７～１４５のアミノ酸配列もしくはその機能的変異体を含み、
ＶＬ（ＣＤ３）は、配列番号６のアミノ酸２７～１３２のアミノ酸配列もしくはその機能的変異体を含み、
ＶＨ（ＣＬＤＮ６）は、配列番号４のアミノ酸２６７～３８３のアミノ酸配列もしくはその機能的変異体を含み、および／または
ＶＬ（ＣＬＤＮ６）は、配列番号４のアミノ酸４０４～５１０のアミノ酸配列もしくはその機能的変異体を含む。
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号４のアミノ酸配列またはその機能的変異体を含む。
いくつかの実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６のアミノ酸配列またはその機能的変異体を含む。
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号４のアミノ酸配列またはその機能的変異体を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６のアミノ酸配列またはその機能的変異体を含む。
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドの少なくとも１つは、コドン最適化されたコード配列および／またはそのＧ／Ｃ含有量が野生型コード配列と比較して増加しているコード配列によってコードされ、コドン最適化および／またはＧ／Ｃ含有量の増加は、好ましくはコードされたアミノ酸配列の配列を変化させない。
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドのそれぞれは、コドン最適化されたコード配列および／または野生型コード配列と比較してそのＧ／Ｃ含有量が増加しているコード配列によってコードされ、コドン最適化および／またはＧ／Ｃ含有量の増加は、好ましくはコードされたアミノ酸配列の配列を変化させない。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。そのような場合、好ましくは、ＲＮＡ中の各ウリジンまたは本質的に各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドが存在する。
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）および５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）から独立して選択される。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡは、５’キャップｍ２ ７，３’－ＯＧｐｐｐ（ｍ１ ２’－Ｏ）ＡｐＧを含む。
いくつかの実施形態では、各ＲＮＡは、５’キャップｍ２ ７，３’－ＯＧｐｐｐ（ｍ１ ２’－Ｏ）ＡｐＧを含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡは、配列番号８のヌクレオチド配列、または配列番号８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む５’ＵＴＲを含む。
いくつかの実施形態では、各ＲＮＡは、配列番号８のヌクレオチド配列、または配列番号８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む５’ＵＴＲを含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡは、配列番号９のヌクレオチド配列、または配列番号９のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む３’ＵＴＲを含む。
いくつかの実施形態では、各ＲＮＡは、配列番号９のヌクレオチド配列、または配列番号９のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む３’ＵＴＲを含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡはポリＡ配列を含む。
いくつかの実施形態では、各ＲＮＡはポリＡ配列を含む。
いくつかの実施形態では、ポリＡ配列は少なくとも１００個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ポリＡ配列は、配列番号１０のヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる。
いくつかの実施形態では、
（ｉ）第１のＲＮＡと第２のＲＮＡとは、約１．７５：１～約１．２５：１、もしくは約１．５：１～約１．２５：１、もしくは好ましくは約１．５：１の（ｗ／ｗ）比であり；ならびに／または
（ｉｉ）第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡは、各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含み；ならびに／または
（ｉｉｉ）第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡは、各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含み、修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）、および５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）から独立して選択され；ならびに／または
（ｉｖ）第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡは、５’キャップｍ２ ７，３’－ＯＧｐｐｐ（ｍ１ ２’－Ｏ）ＡｐＧを含み；ならびに／または
（ｖ）第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡは、配列番号８のヌクレオチド配列、もしくは配列番号８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む５’ＵＴＲを含み；ならびに／または
（ｖｉ）第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡは、配列番号９のヌクレオチド配列、もしくは配列番号９のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む３’ＵＴＲを含み；ならびに／または
（ｖｉｉ）第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡは、配列番号１０のヌクレオチド配列を含むポリＡ尾部を含む。
いくつかの実施形態では、
（ｉ）第１のＲＮＡと第２のＲＮＡとは、約１．７５：１～約１．２５：１、または約１．５：１～約１．２５：１、または好ましくは約１．５：１の（ｗ／ｗ）比であり；
（ｉｉ）第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡは、各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含み、修飾ヌクレオシドはＮ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）であり；
（ｉｉｉ）第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡは、５’キャップｍ２ ７，３’－ＯＧｐｐｐ（ｍ１ ２’－Ｏ）ＡｐＧを含み；
（ｉｖ）第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡは、配列番号８のヌクレオチド配列を含む５’ＵＴＲを含み；
（ｖ）第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡは、配列番号９のヌクレオチド配列を含む３’ＵＴＲを含み；ならびに
（ｖｉ）第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡは、配列番号１０のヌクレオチド配列を含むポリＡ尾部を含む。
いくつかの実施形態では、
（ｉ）第１のポリペプチド鎖は、配列番号４のアミノ酸配列、もしくは配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／または
（ｉｉ）第１のＲＮＡは、配列番号５のヌクレオチド配列、もしくは配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、
（ｉ）第２のポリペプチド鎖は、配列番号６のアミノ酸配列、もしくは配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／または
（ｉｉ）第２のＲＮＡは、配列番号７のヌクレオチド配列、もしくは配列番号７のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
一態様では、本発明は、
（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列、または配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖をコードする第１のＲＮＡ；および
（ｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列、または配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖をコードする第２のＲＮＡ
を含む組成物または医薬製剤を提供する。
全ての態様のいくつかの実施形態では、第１のＲＮＡは、配列番号５のヌクレオチド配列、または配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
全ての態様のいくつかの実施形態では、第２のＲＮＡは、配列番号７のヌクレオチド配列、または配列番号７のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
一態様では、本発明は、配列番号３５のヌクレオチド配列、もしくは配列番号３５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む第１のＲＮＡ、および／または配列番号３６のヌクレオチド配列、もしくは配列番号３６のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む第２のＲＮＡを含む組成物または医薬製剤を提供する。
一態様では、本発明は、配列番号５のヌクレオチド配列を含む第１のＲＮＡ、および配列番号７のヌクレオチド配列を含む第２のＲＮＡを含む組成物または医薬製剤であって、第１のＲＮＡと第２のＲＮＡとが約１．５：１の第１のＲＮＡ対第２のＲＮＡの（ｗ／ｗ）比で存在する、組成物または医薬製剤を提供する。
全ての態様のいくつかの実施形態では、ＲＮＡはｍＲＮＡである。
全ての態様のいくつかの実施形態では、ＲＮＡは、液体として製剤化されるか、固体として製剤化されるか、またはそれらの組合せである。
全ての態様のいくつかの実施形態では、ＲＮＡは、注射用に製剤化されているか、または製剤化されることになっている。
全ての態様のいくつかの実施形態では、ＲＮＡは、静脈内投与用に製剤化されているか、または製剤化されることになっている。
全ての態様のいくつかの実施形態では、ＲＮＡは粒子として製剤化されているか、または製剤化されることになっている。
いくつかの実施形態では、粒子は脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ粒子は、（（３－ヒドロキシプロピル）アザンジイル）ビス（ノナン－９，１－ジイル）ビス（２－ブチルオクタノエート）、２－［（ポリエチレングリコール）－２０００］－Ｎ，Ｎ－ジテトラデシルアセトアミド、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、およびコレステロールを含む。
全ての態様のいくつかの実施形態では、組成物または医薬製剤は医薬組成物である。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤をさらに含む。
全ての態様のいくつかの実施形態では、組成物または医薬製剤はキットである。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡおよび任意で粒子形成成分は、別々のバイアル内にある。
いくつかの実施形態では、組成物または医薬製剤は、癌を治療または予防するための組成物または医薬製剤の使用説明書をさらに含む。
一態様では、本発明は、医薬用途のための本明細書に記載の組成物または医薬製剤を提供する。
いくつかの実施形態では、医薬用途は、疾患または障害の治療的または予防的処置を含む。
いくつかの実施形態では、疾患または障害の治療的または予防的処置は、癌を治療または予防することを含む。
いくつかの実施形態では、疾患または障害の治療的または予防的処置は、さらなる療法を投与することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、さらなる療法は、（ｉ）腫瘍を摘出、切除、または減量する手術、（ｉｉ）放射線療法、および（ｉｉｉ）化学療法からなる群より選択される１つ以上を含む。
いくつかの実施形態では、さらなる療法は、さらなる治療薬を投与することを含む。
いくつかの実施形態では、さらなる治療薬は抗癌治療薬を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物または医薬製剤は、ヒトへの投与用である。
一態様では、本発明は、対象における癌を治療する方法であって、
（ｉ）ＣＤ３に特異性を有する免疫グロブリンに由来する重鎖の可変領域（ＶＨ）（ＶＨ（ＣＤ３））、ＣＬＤＮ６に特異性を有する免疫グロブリンに由来する重鎖の可変領域（ＶＨ）（ＶＨ（ＣＬＤＮ６））およびＣＬＤＮ６に特異性を有する免疫グロブリンに由来する軽鎖の可変領域（ＶＬ）（ＶＬ（ＣＬＤＮ６））を含む第１のポリペプチド鎖をコードする第１のＲＮＡ；ならびに
（ｉｉ）ＣＤ３に特異性を有する免疫グロブリンに由来する軽鎖の可変領域（ＶＬ）（ＶＬ（ＣＤ３））、ＣＬＤＮ６に特異性を有する免疫グロブリンに由来する重鎖の可変領域（ＶＨ）（ＶＨ（ＣＬＤＮ６））およびＣＬＤＮ６に特異性を有する免疫グロブリンに由来する軽鎖の可変領域（ＶＬ）（ＶＬ（ＣＬＤＮ６））を含む第２のポリペプチド鎖をコードする第２のＲＮＡ
を対象に投与することを含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖は第２のポリペプチド鎖と相互作用して、ＣＤ３に特異性を有する結合ドメインおよびＣＬＤＮ６に特異性を有する２つの結合ドメインを形成する。
いくつかの実施形態では、
第１のポリペプチド鎖のＶＨ（ＣＤ３）と第２のポリペプチド鎖のＶＬ（ＣＤ３）とが相互作用して、ＣＤ３に特異性を有する結合ドメインを形成し、
第１のポリペプチド鎖のＶＨ（ＣＬＤＮ６）とＶＬ（ＣＬＤＮ６）とが相互作用して、ＣＬＤＮ６に特異性を有する結合ドメインを形成し、
第２のポリペプチド鎖のＶＨ（ＣＬＤＮ６）とＶＬ（ＣＬＤＮ６）とが相互作用して、ＣＬＤＮ６に特異性を有する結合ドメインを形成する。
一態様では、本発明は、対象における癌を治療する方法であって、
（ｉ）可変領域ＶＨ（ＣＤ３）、可変領域ＶＨ（ＣＬＤＮ６）および可変領域ＶＬ（ＣＬＤＮ６）を含む第１のポリペプチド鎖をコードする第１のＲＮＡ；ならびに
（ｉｉ）可変領域ＶＬ（ＣＤ３）、可変領域ＶＨ（ＣＬＤＮ６）および可変領域ＶＬ（ＣＬＤＮ６）を含む第２のポリペプチド鎖をコードする第２のＲＮＡ
を対象に投与することを含み、第１のポリペプチド鎖のＶＨ（ＣＤ３）と第２のポリペプチド鎖のＶＬ（ＣＤ３）とが相互作用して、ＣＤ３に特異性を有する結合ドメインを形成し、
第１のポリペプチド鎖のＶＨ（ＣＬＤＮ６）とＶＬ（ＣＬＤＮ６）とが相互作用して、ＣＬＤＮ６に特異性を有する結合ドメインを形成し、
第２のポリペプチド鎖のＶＨ（ＣＬＤＮ６）とＶＬ（ＣＬＤＮ６）とが相互作用して、ＣＬＤＮ６に特異性を有する結合ドメインを形成する、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、第１および第２のポリペプチド鎖は、免疫グロブリンまたはその機能的変異体に由来する重鎖の定常領域１（ＣＨ１）と、免疫グロブリンまたはその機能的変異体に由来する軽鎖の定常領域（ＣＬ）とを含む。
いくつかの実施形態では、免疫グロブリンはＩｇＧ１である。
いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１はヒトＩｇＧ１である。
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖上のＶＨ、ＶＬ、およびＣＨ１は、
ＶＨ（ＣＤ３）－ＣＨ１－ＶＨ（ＣＬＤＮ６）－ＶＬ（ＣＬＤＮ６）、または
ＶＨ（ＣＤ３）－ＣＨ１－ＶＬ（ＣＬＤＮ６）－ＶＨ（ＣＬＤＮ６）
の順序でＮ末端からＣ末端へと配置される。
いくつかの実施形態では、ＣＨ１は、ペプチドリンカーによってＶＨ（ＣＬＤＮ６）またはＶＬ（ＣＬＤＮ６）に接続されている。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＳＧＰＧＧＧＲＳ（Ｇ４Ｓ）２またはその機能的変異体を含む。
いくつかの実施形態では、第２のポリペプチド鎖上のＶＨ、ＶＬ、およびＣＬは、
ＶＬ（ＣＤ３）－ＣＬ－ＶＨ（ＣＬＤＮ６）－ＶＬ（ＣＬＤＮ６）、または
ＶＬ（ＣＤ３）－ＣＬ－ＶＬ（ＣＬＤＮ６）－ＶＨ（ＣＬＤＮ６）
の順序でＮ末端からＣ末端へと配置される。
いくつかの実施形態では、ＣＬは、ペプチドリンカーによってＶＨ（ＣＬＤＮ６）またはＶＬ（ＣＬＤＮ６）に接続されている。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＤＶＰＧＧＳまたはその機能的変異体を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＨ（ＣＬＤＮ６）およびＶＬ（ＣＬＤＮ６）は、ペプチドリンカーによって互いに接続されている。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列（Ｇ４Ｓ）ｘまたはその機能的変異体を含み、ｘは、２、３、４、５または６である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列（Ｇ４Ｓ）４またはその機能的変異体を含む。
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖上のＣＨ１は、第２のポリペプチド鎖上のＣＬと相互作用する。
いくつかの実施形態では、ＶＨ（ＣＤ３）は、配列番号４のアミノ酸２７～１４５のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＨ（ＣＤ３）は、アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＲＹＴまたはその機能的変異体を含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＮＰＳＲＧＹＴまたはその機能的変異体を含むＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＡＲＹＹＤＤＨＹＳＬＤＹまたはその機能的変異体を含むＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＨ（ＣＤ３）は、アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＲＹＴまたはその機能的変異体を含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＮＰＳＲＧＹＴまたはその機能的変異体を含むＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹまたはその機能的変異体を含むＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＨ（ＣＤ３）は、配列番号４のアミノ酸２７～１４５のアミノ酸配列またはその機能的変異体を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＬ（ＣＤ３）は、配列番号６のアミノ酸２７～１３２のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＬ（ＣＤ３）は、アミノ酸配列ＳＳＶＳＹまたはその機能的変異体を含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＤＴＳまたはその機能的変異体を含むＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＱＱＷＳＳＮＰＬＴまたはその機能的変異体を含むＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＬ（ＣＤ３）は、配列番号６のアミノ酸２７～１３２のアミノ酸配列またはその機能的変異体を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＨ（ＣＬＤＮ６）は、配列番号４のアミノ酸２６７～３８３のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＨ（ＣＬＤＮ６）は、アミノ酸配列ＧＹＳＦＴＧＹＴまたはその機能的変異体を含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＮＰＹＮＧＧＴまたはその機能的変異体を含むＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＡＲＤＹＧＦＶＬＤＹまたはその機能的変異体を含むＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＨ（ＣＬＤＮ６）は、配列番号４のアミノ酸２６７～３８３のアミノ酸配列またはその機能的変異体を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＬ（ＣＬＤＮ６）は、配列番号４のアミノ酸４０４～５１０のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＬ（ＣＬＤＮ６）は、配列番号４のアミノ酸４０４～５１０のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびにＣＤＲ１に対して＋１５の位置のセリン残基（配列番号４の４４９位に対応する）を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＬ（ＣＬＤＮ６）は、配列番号４のアミノ酸４０４～５１０のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびにＣＤＲ２に対して－３の位置のセリン残基（配列番号４の４４９位に対応する）を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＬ（ＣＬＤＮ６）は、配列番号４のアミノ酸４０４～５１０のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、配列番号４のアミノ酸４０４～５１０のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、または８０％の同一性を有する配列、ならびに配列番号４の４４９位に対応する位置のセリン残基を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＬ（ＣＬＤＮ６）は、アミノ酸配列ＳＳＶＳＹまたはその機能的変異体を含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＳＴＳまたはその機能的変異体を含むＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＱＱＲＳＮＹＰＰＷＴまたはその機能的変異体を含むＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＬ（ＣＬＤＮ６）は、配列番号４のアミノ酸４０４～５１０のアミノ酸配列またはその機能的変異体を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＨ（ＣＤ３）は、配列番号４のアミノ酸２７～１４５のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＶＬ（ＣＤ３）は、配列番号６のアミノ酸２７～１３２のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＶＨ（ＣＬＤＮ６）は、配列番号４のアミノ酸２６７～３８３のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＶＬ（ＣＬＤＮ６）は、配列番号４のアミノ酸４０４～５１０のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに好ましくはＣＤＲ１に対して＋１５の位置のセリン残基（配列番号４の４４９位に対応する）および／またはＣＤＲ２に対して－３の位置のセリン残基（配列番号４の４４９位に対応する）を含む。
いくつかの実施形態では、
ＶＨ（ＣＤ３）は、配列番号４のアミノ酸２７～１４５のアミノ酸配列もしくはその機能的変異体を含み、
ＶＬ（ＣＤ３）は、配列番号６のアミノ酸２７～１３２のアミノ酸配列もしくはその機能的変異体を含み、
ＶＨ（ＣＬＤＮ６）は、配列番号４のアミノ酸２６７～３８３のアミノ酸配列もしくはその機能的変異体を含み、および／または
ＶＬ（ＣＬＤＮ６）は、配列番号４のアミノ酸４０４～５１０のアミノ酸配列もしくはその機能的変異体を含む。
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号４のアミノ酸配列またはその機能的変異体を含む。
いくつかの実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６のアミノ酸配列またはその機能的変異体を含む。
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号４のアミノ酸配列またはその機能的変異体を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６のアミノ酸配列またはその機能的変異体を含む。
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドの少なくとも１つは、コドン最適化されたコード配列および／またはそのＧ／Ｃ含有量が野生型コード配列と比較して増加しているコード配列によってコードされ、コドン最適化および／またはＧ／Ｃ含有量の増加は、好ましくはコードされたアミノ酸配列の配列を変化させない。
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドのそれぞれは、コドン最適化されたコード配列および／または野生型コード配列と比較してそのＧ／Ｃ含有量が増加しているコード配列によってコードされ、コドン最適化および／またはＧ／Ｃ含有量の増加は、好ましくはコードされたアミノ酸配列の配列を変化させない。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。そのような場合、好ましくは、ＲＮＡ中の各ウリジンまたは本質的に各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドが存在する。
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）および５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）から独立して選択される。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡは、５’キャップｍ２ ７，３’－ＯＧｐｐｐ（ｍ１ ２’－Ｏ）ＡｐＧを含む。
いくつかの実施形態では、各ＲＮＡは、５’キャップｍ２ ７，３’－ＯＧｐｐｐ（ｍ１ ２’－Ｏ）ＡｐＧを含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡは、配列番号８のヌクレオチド配列、または配列番号８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む５’ＵＴＲを含む。
いくつかの実施形態では、各ＲＮＡは、配列番号８のヌクレオチド配列、または配列番号８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む５’ＵＴＲを含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡは、配列番号９のヌクレオチド配列、または配列番号９のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む３’ＵＴＲを含む。
いくつかの実施形態では、各ＲＮＡは、配列番号９のヌクレオチド配列、または配列番号９のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む３’ＵＴＲを含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡはポリＡ配列を含む。
いくつかの実施形態では、各ＲＮＡはポリＡ配列を含む。
いくつかの実施形態では、ポリＡ配列は少なくとも１００個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ポリＡ配列は、配列番号１０のヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる。
いくつかの実施形態では、
（ｉ）第１のＲＮＡと第２のＲＮＡとは、約１．７５：１～約１．２５：１、もしくは約１．５：１～約１．２５：１、もしくは好ましくは約１．５：１の（ｗ／ｗ）比であり；ならびに／または
（ｉｉ）第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡは、各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含み；ならびに／または
（ｉｉｉ）第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡは、各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含み、修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）、および５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）から独立して選択され；ならびに／または
（ｉｖ）第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡは、５’キャップｍ２ ７，３’－ＯＧｐｐｐ（ｍ１ ２’－Ｏ）ＡｐＧを含み；ならびに／または
（ｖ）第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡは、配列番号８のヌクレオチド配列、もしくは配列番号８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む５’ＵＴＲを含み；ならびに／または
（ｖｉ）第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡは、配列番号９のヌクレオチド配列、もしくは配列番号９のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む３’ＵＴＲを含み；ならびに／または
（ｖｉｉ）第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡは、配列番号１０のヌクレオチド配列を含むポリＡ尾部を含む。
いくつかの実施形態では、
（ｉ）第１のＲＮＡと第２のＲＮＡとは、約１．７５：１～約１．２５：１、または約１．５：１～約１．２５：１、または好ましくは約１．５：１の（ｗ／ｗ）比であり；
（ｉｉ）第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡは、各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含み、修飾ヌクレオシドはＮ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）であり；
（ｉｉｉ）第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡは、５’キャップｍ２ ７，３’－ＯＧｐｐｐ（ｍ１ ２’－Ｏ）ＡｐＧを含み；
（ｉｖ）第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡは、配列番号８のヌクレオチド配列を含む５’ＵＴＲを含み；
（ｖ）第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡは、配列番号９のヌクレオチド配列を含む３’ＵＴＲを含み；ならびに
（ｖｉ）第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡは、配列番号１０のヌクレオチド配列を含むポリＡ尾部を含む。
いくつかの実施形態では、
（ｉ）第１のポリペプチド鎖は、配列番号４のアミノ酸配列、もしくは配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／または
（ｉｉ）第１のＲＮＡは、配列番号５のヌクレオチド配列、もしくは配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、
（ｉ）第２のポリペプチド鎖は、配列番号６のアミノ酸配列、もしくは配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／または
（ｉｉ）第２のＲＮＡは、配列番号７のヌクレオチド配列、もしくは配列番号７のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
一態様では、本発明は、対象における癌を治療する方法であって、
（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列、または配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖をコードする第１のＲＮＡ；および
（ｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列、または配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖をコードする第２のＲＮＡ
を対象に投与することを含む方法を提供する。
全ての態様のいくつかの実施形態では、第１のＲＮＡは、配列番号５のヌクレオチド配列、または配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
全ての態様のいくつかの実施形態では、第２のＲＮＡは、配列番号７のヌクレオチド配列、または配列番号７のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
一態様では、本発明は、対象における癌を治療する方法であって、配列番号３５のヌクレオチド配列、もしくは配列番号３５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む第１のＲＮＡ、および／または配列番号３６のヌクレオチド配列、もしくは配列番号３６のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む第２のＲＮＡを対象に投与することを含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、対象における癌を治療する方法であって、配列番号５のヌクレオチド配列を含む第１のＲＮＡおよび配列番号７のヌクレオチド配列を含む第２のＲＮＡを対象に投与することを含み、第１のＲＮＡと第２のＲＮＡとが約１．５：１の第１のＲＮＡ対第２のＲＮＡの（ｗ／ｗ）比で投与される、方法を提供する。
全ての態様のいくつかの実施形態では、ＲＮＡはｍＲＮＡである。
全ての態様のいくつかの実施形態では、ＲＮＡは、液体として製剤化されるか、固体として製剤化されるか、またはそれらの組合せである。
全ての態様のいくつかの実施形態では、ＲＮＡは注射によって投与される。
全ての態様のいくつかの実施形態では、ＲＮＡは週に１回投与される。
全ての態様のいくつかの実施形態では、ＲＮＡは静脈内投与によって投与される。
全ての態様のいくつかの実施形態では、ＲＮＡは粒子として製剤化される。
いくつかの実施形態では、粒子は脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ粒子は、（（３－ヒドロキシプロピル）アザンジイル）ビス（ノナン－９，１－ジイル）ビス（２－ブチルオクタノエート）、２－［（ポリエチレングリコール）－２０００］－Ｎ，Ｎ－ジテトラデシルアセトアミド、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、およびコレステロールを含む。
全ての態様のいくつかの実施形態では、ＲＮＡは医薬組成物に製剤化される。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤をさらに含む。
全ての態様のいくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、さらなる療法を投与することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、さらなる療法は、（ｉ）腫瘍を摘出、切除、または減量する手術、（ｉｉ）放射線療法、および（ｉｉｉ）化学療法からなる群より選択される１つ以上を含む。
いくつかの実施形態では、さらなる療法は、さらなる治療薬を投与することを含む。
いくつかの実施形態では、さらなる治療薬は抗癌治療薬を含む。
全ての態様のいくつかの実施形態では、対象はヒトである。
全ての態様のいくつかの実施形態では、癌はＣＬＤＮ６陽性癌である。
一態様では、本発明は、本明細書に記載の方法で使用するための本明細書に記載の組成物または医薬製剤を提供する。
一態様では、本発明は、本明細書に記載の方法で使用するための本明細書に記載の薬剤または組成物に関する。
ＲＮＡ原薬ＢＮＴ１４２の一般構造 ５’キャップ（本明細書では「キャップ１」）、５’－ＵＴＲおよび３’－ＵＴＲを有するＲＮＡ原薬の一般構造の概略図。 ＣＨ＝定常重鎖ドメイン；ＣＬ＝定常軽鎖ドメイン；ＤＳ＝原薬；Ｌ＝リンカー；ｍ＝メッセンジャ；Ｓｅｃ＝分泌シグナルペプチド配列；ポリ（Ａ）＝ポリアデニン尾部；ＲＮＡ＝リボ核酸；ＵＴＲ＝非翻訳領域；ＶＨ＝可変重鎖ドメイン；ＶＬ＝可変軽鎖ドメイン。 ＲｉｂｏＭａｂ０２．１はヒトＣＤ３およびＣＬＤＮ６に特異的に結合し、密接に関連するＣＬＤＮ３、４および９または非ヒト霊長動物ＣＤ３へのオフターゲット結合を示さない。 ＲｉｂｏＭａｂ０２．１の標的結合を、ＡＰＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（重鎖および軽鎖［Ｈ＋Ｌ］）二次抗体を使用したフローサイトメトリ結合アッセイによって決定した。細胞を最初にシングレットについてゲーティングし、続いて生存リンパ球（ＰＢＭＣ）または生存ＨＥＫ－２９３Ｔ－１７細胞についてゲーティングした。１０μｇ／ｍＬの濃度でＨＥＫ－２９３Ｔ－１７上清中のＲｉｂｏＭａｂ０２．１を使用した。示されているように、カニクイザルまたはヒトＰＢＭＣおよびルシフェラーゼを安定に発現するＨＥＫ－２９３Ｔ－１７形質導入体（ＨＥＫ－２９３Ｔ－１７＿モック）、ＣＬＤＮ３、４、６または９は、標的細胞として機能した。垂直な点線は、染色されていない集団のピーク位置を示す。 ＡＰＣ＝アロフィコシアニン；ＣＬＤＮ＝クローディン；ＨＥＫ＝ヒト胎児腎臓；ＰＢＭＣ＝末梢血単核細胞。 マウスにおいて発現されるＲｉｂｏＭａｂ０２．１は、複数のＰＢＭＣドナーに関してインビトロで用量依存的かつ標的特異的な腫瘍細胞溶解を媒介する ８人の健常ドナー由来のヒトＰＢＭＣをルシフェラーゼ発現腫瘍細胞と共培養した。ＣＬＤＮ６陽性ＰＡ－１（Ａ）またはＯＶ－９０（Ｂ）細胞株を標的細胞として使用し、標的特異性について対照するためにＣＬＤＮ６陰性ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（Ａ、Ｂ）細胞株を使用した。２０：１のエフェクタ対標的細胞比を有する３８４ウェルプレートフォーマットでアッセイを実施した。生存腫瘍細胞の生物発光を読み出しとして測定した。腫瘍細胞死滅の具体的な溶解パーセンテージを示す。ＲｉｂｏＭａｂ０２．１含有マウス血清を段階希釈し（１０倍、１０個の点；範囲：５．０×１０－７～５００ｎｇ／ｍＬ）、共培養物に添加し、続いて（Ａ）ＰＡ－１細胞と共に２４時間または（Ｂ）ＯＶ－９０細胞と共に４８時間インキュベートした。各線は、個々のドナーのＰＢＭＣ試料による腫瘍細胞溶解を表す。エラーバーは、平均値（技術的三連）の標準偏差（ＳＤ）を示す。 ＣＤＬＮ＝クローディン；ＥＣ５０＝最大半量有効濃度、ＰＢＭＣ＝末梢血単核細胞。 ＲｉｂｏＭａｂ０２．１は用量依存性および標的依存性Ｔ細胞増殖を誘導する ３人の健常ドナー由来のＣＦＳＥ標識ヒトＰＢＭＣを、１２ウェル培養プレートフォーマットで、ＣＬＤＮ６陽性ＰＡ－１およびＯＶ－９０標的細胞、またはＣＬＤＮ６陰性であるが対照ＴＡＡ陽性ＮＵＧＣ－４ならびに標的陰性ＭＤＡ－ＭＢ－２３１対照細胞と共培養した。１０：１のエフェクタ対標的細胞比を適用した。さらに、標的細胞を含まない（－）ＰＢＭＣを別途に含めた。１００および１ｎｇ／ｍＬのＲｉｂｏＭａｂ０２．１（５つのカラムの各ブロックの１番目および２番目のカラム）または対照ＲｉｂｏＭａｂ（５つのカラムの各ブロックの３番目および４番目のカラム）含有ＨＥＫ－２９３Ｔ－１７上清を、示されているように共培養物に添加した。ＯＫＴ３抗体（抗ヒトＣＤ３；黒色の棒）は、標的非依存性ＣＤ３駆動Ｔ細胞増殖の陽性対照として機能した。７２時間のインキュベーション後、増殖中のＴ細胞のパーセンテージをフローサイトメトリによって分析した。エラーバーは、３人全てのドナーの平均値の標準偏差（ＳＤ）を示す。 ＣＦＳＥ＝カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル；ＰＢＭＣ＝末梢血単核細胞；ｗ／ｏ＝含まない。 ＲｉｂｏＭａｂ０２．１は、高濃度で低い標的非依存性効果で、用量依存的なＴ細胞活性化を媒介する ３人の健常ドナー由来のヒトＰＢＭＣ（エフェクタ細胞）を、ＣＬＤＮ６陽性ＰＡ－１細胞（標的細胞）の存在下および非存在下で、１０：１のエフェクタ対標的細胞比で培養した。ＲｉｂｏＭａｂ０２．１含有マウス血清を、アッセイに使用する前に段階希釈した（１０倍、１０個の点；範囲：４．０×１０－６～４，０００ｎｇ／ｍＬ）。４８時間の共インキュベーションの後、Ｔ細胞のフローサイトメトリ分析のために、細胞を抗ＣＤ５、抗ＣＤ６９および抗ＣＤ２５抗体で染色した。Ｌｕｃ＿ＲＮＡ－ＬＮＰ処置マウス由来の模擬血清とインキュベートした試料に対して正規化した総Ｔ細胞活性化をここに示す。活性化Ｔ細胞のパーセンテージを、各個々のドナー（左）および３人全てのドナーについて平均（右）として示す。塗りつぶされた記号は標的細胞を含む値を表し、黒色の白抜き記号は標的細胞を含まない値を表す。エラーバーは、平均（技術的三連［ドナーごと、左のパネル］または生物学的反復［ドナー全体、右のパネル］）の標準偏差（ＳＤ）を示す。 ＥＣ５０＝最大半量有効濃度；ｗ／ｏ＝含まない。 （図６）ＢＮＴ１４２処置は、腫瘍へのＴ細胞再指向によってＰＢＭＣヒト化ＮＳＧマウスにおける進行した異種移植腫瘍を排除する ＯＶ－９０細胞の進行したＳＣ腫瘍異種移植片（処置開始時の平均腫瘍体積＝１００ｍｍ３）を担持するＮＳＧマウスに、エフェクタ細胞としてヒトＰＢＭＣをＩＰ注射によって移植した。腫瘍体積をデジタルキャリパーで１週間に２回測定した。マウスを、０．１もしくは１μｇのＢＮＴ１４２、または標的と無関係なＲｉｂｏＭａｂトリボディをコードする１μｇのＲＮＡ－ＬＮＰ（標的特異性についての陰性対照）、１μｇのＬｕｃ＿ＲＮＡ－ＬＮＰ、１００μｇの組換え精製ＣＤ３ｘ（ＣＬＤＮ６）２トリボディ参照タンパク質またはビヒクル対照としてのＤＰＢＳ（生理食塩水）の５回のＩＶボーラス注射で週に１回処置した。 （図６Ａ）処置スケジュール。 指定された時点での個々のマウスの腫瘍体積。 試験開始時にそれぞれ１３～１４匹のマウスを含み、最後のデータ点で最低５匹のマウスを含む群当たりの腫瘍体積中央値の概要。垂直な点線は、試験／対照項目のＩＶ投与の時点を表す。全ての群からの４匹のマウス（０．１μｇのＢＮＴ１４２群からは５匹のマウス）を３８日目に安楽死させて、エクスビボアッセイのための試料を得た。 抗ヒトＣＤ３抗体を使用する免疫組織化学（ＩＨＣ）染色によって決定された異種移植組織１ｍｍ２当たりのＣＤ３陽性細胞の数。３回目の処置の７２時間後（３８日目）に腫瘍異種移植片を解剖した。水平な線は平均値を表す（ｎ＝４～５）。 抗ヒトＣＬＤＮ６抗体を使用したＩＨＣ染色によって決定された、それぞれの試験群および対照群からのマウスの腫瘍異種移植片におけるＣＬＤＮ６陽性細胞のパーセンテージ。腫瘍異種移植片を、試験の経過にわたって異なる時点で解剖した。水平な線は平均値を表す（ｎ＝８～１０）。 ３回目の処置の７２時間後（３８日目）に安楽死させたＢＮＴ１４２処置マウスおよび対照マウス由来のＯＶ－９０腫瘍異種移植片におけるヒトＣＤ３（上のパネル）およびＣＬＤＮ６（下のパネル）染色の代表的なＩＨＣ写真。赤褐色染色（白黒図では暗色）は陽性ＩＨＣシグナルを示し、青紫色領域は陽性染色がないことを示す（陰性ＩＨＣシグナル）。スケールバーの長さはパネルに示す通りである（ＢＮＴ１４２および参照タンパク質群：１，０００μｍ；陰性対照／Ｌｕｃ＿ＲＮＡ－ＬＮＰおよび生理食塩水群：２，０００μｍ）。 ＣＤ＝分化のクラスタ；ＣＬＤＮ＝クローディン；ｃｔｒｌ＝対照；ＩＰ＝腹腔内；ＩＶ＝静脈内；ＬＮＰ＝脂質ナノ粒子；Ｌｕｃ＝ルシフェラーゼをコードする；ｎｅｇ＝陰性；ＮＳＧ＝ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｓｃｉｄ ＩＬ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ；ＰＢＭＣ＝末梢血単核細胞；ＲＮＡ＝リボ核酸；ＳＣ＝皮下。 ＲｉｂｏＭａｂ０２．１は、用量依存的かつ標的依存的にヒトサイトカインを誘導する 特注したマルチプレックスＥＬＩＳＡキットを用いて、異なる濃度のＲｉｂｏＭａｂ０２．１によって駆動されるヒトサイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－２、ＩＬ－１０およびＩＬ－１β）産生を決定するために、Ｔ細胞活性化アッセイ（上記の図５を参照）からの細胞培養上清を使用した。各ドナーのサイトカイン濃度値（技術的三連の平均）を示す。塗りつぶされた記号は標的細胞を含む値を表し、白抜きの記号は標的細胞を含まない値を表す。 ＩＦＮ＝インターフェロン；ＩＬ＝インターロイキン；ＴＮＦ＝腫瘍壊死因子；ｗ／ｏ＝含まない。 ＢＮＴ１４２処置は、ＰＢＭＣヒト化ＮＳＧマウスにおいてヒトサイトカイン放出を誘導しない 皮下異種移植腫瘍を担持するＮＳＧ／ＰＢＭＣマウス（上記の図６を参照）由来の血清を、０．１もしくは１μｇのＢＮＴ１４２、標的特異性について対照するための標的と無関係なＲｉｂｏＭａｂトリボディをコードする１μｇのＲＮＡ－ＬＮＰ（陰性対照）、１μｇのＬｕｃ＿ＲＮＡ－ＬＮＰ対照または１００μｇのＣＤ３ｘ（ＣＬＤＮ６）２トリボディ参照タンパク質を用いた３回目の注射の６時間後および７２時間後にさらに評価した。１μｇのＢＮＴ１４２を投与したさらなる非腫瘍担持（腫瘍なし）群を含めた。（Ａ）６時間目（ｎ＝８）および７２時間目（ｎ＝４）の時点でマルチプレックスＥＬＩＳＡによって決定されたマウス血清中のヒトサイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＩＬ－２、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－１β）の濃度。データを、それぞれの時点の生理食塩水投与動物に対して正規化した。水平な線は中央値を示す。対応のない試料および対応のある試料を、それぞれマン・ホイットニーＵ検定またはウィルコクソンの符号順位検定を用いて比較した。（Ｂ）コードされた治療用抗体ＲｉｂｏＭａｂ０２．１の血清濃度。水平な線は平均値を示す。 ＊＊＊、ｐ＝０．０００２；ｃｔｒｌ＝対照；ｈ＝時間；ＩＦＮ＝インターフェロン；ＩＬ＝インターロイキン；ＬＮＰ＝脂質ナノ粒子；Ｌｕｃ＝ルシフェラーゼをコードする；ｎｅｇ．＝陰性；ｎｓ＝有意ではない；ＲＮＡ＝リボ核酸；ＴＮＦ＝腫瘍壊死因子；ｗ／ｏ＝なし。 インビボでのＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡの肝臓標的化 Ｂａｌｂ／ｃＪＲｊマウスに、ＬＮＰ製剤化ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡの単回ＩＶ注射を行った。投与の６、２４、４８、７２および１４４時間後に生物発光を観測した。（Ａ）投与の６時間後に撮影した画像を、（左）伏臥位の個々のマウスについて（ｎ＝５）ならびに（右）動物Ｎｏ．１および２の単一器官について示す。（Ｂ）ルシフェラーゼシグナル（光子／秒）の定量化を全ての分析時点について示す（ｎ＝５または３、平均）。 ＩＶ＝静脈内；ＬＮ＝リンパ節；ＬＮＰ＝脂質ナノ粒子。 ＢＮＴ１４２によってコードされたＲｉｂｏＭａｂ０２．１はインビボで効率的に発現される 雌Ｂａｌｂ／ｃＪＲｊマウス（ｎ＝３）に、マウス当たり３０μｇのＢＮＴ１４２のＩＶボーラス注射を行った。血清を投与の２時間後および６時間後に採取した。（Ａ）ＥＬＩＳＡによる血清中のＲｉｂｏＭａｂ０２．１濃度の定量化。水平な線は平均値を表す。（Ｂ）緩衝液またはスパイクインＢａｌｂ／ｃＪＲｊ血清中のＲｉｂｏＭａｂ０２．１含有血清および参照タンパク質（モノマー、ＨＭＷ）のウェスタンブロット分析を非還元条件下で分析した。合計で、血清タンパク質精製工程後にレーン当たり６０ｎｇのタンパク質を負荷した。未処置マウス由来の血清を対照として使用した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｄ抗体を使用してウェスタンブロットを行った。 Ａｂ＝抗体；ｃｔｒｌ＝対照；Ｆｄ＝検出可能な断片；ＨＭＷ＝高分子量；ＨＰＩ＝注射後の時間；ＩＤ＝識別番号；ＩｇＧ＝免疫グロブリンガンマ；ｋＤａ＝キロダルトン；ＭＷ＝分子量。 マウスへの反復ＢＮＴ１４２投与による持続可能なＲｉｂｏＭａｂ０２．１曝露および用量依存性抗薬物抗体応答 雌Ｂａｌｂ／ｃＪＲｊマウス（ｎ＝４）に、対照として１０もしくは３０μｇのＢＮＴ１４２または３０μｇのＬｕｃ＿ＲＮＡ－ＬＮＰを週に１回、水平な点線によって示されている時点での合計５回投与のためにＩＶ注射した。ベースライン（０時間目）、各ＢＮＴ１４２または生理食塩水の投与の６時間後（６、１７４、３４２、５１０および６７８時間目）ならびに２４時間前（１４４、３１２、４８０および６４８時間目）に、それぞれマウスから血液を採取した。最初のＢＮＴ１４２／生理食塩水投与の８１６時間後に最終採血を行った。血清ＲｉｂｏＭａｂ０２．１濃度をＥＬＩＳＡによって決定した。エラーバーは、平均値の標準偏差（ＳＤ）を示す。 ＬＮＰ＝脂質ナノ粒子；Ｌｕｃ＝ルシフェラーゼ；ＲＮＡ＝リボ核酸。 ＢＮＴ１４２のＩＶ注射後のカニクイザルにおけるＲｉｂｏＭａｂ０２．１曝露 ＢＮＴ１４２投与コホートおよび生理食塩水対照群はそれぞれ３匹のカニクイザルを含み、それらから血液を採取して、ＥＬＩＳＡによってＲｉｂｏＭａｂ０２．１濃度を評価するための血清を調製した。エラーバーは、平均値（技術的三連）の標準偏差（ＳＤ）を示す。 ＲｉｂｏＭａｂ０２．１は高度にモノマー性であり、マウスにおいて代替リード構造候補物ＲｉｂｏＭａｂ＿７１２／７１１ Ｃ５３Ｗよりも低いＡＤＡ応答を誘導する 雌Ｂａｌｂ／ｃＪＲｊに、ＲｉｂｏＭａｂ０２．１またはＲｉｂｏＭａｂ＿７１２／７１１またはルシフェラーゼ（対照）をコードする３０μｇのＲＮＡ－ＬＮＰをＩＶ注射した。（Ａ）注射の６時間後に血清をサンプリングした。５０ｎｇの精製タンパク質参照（モノマーおよびＨＭＷ参照）をマウス血清にスパイクした。未処置（モック）、ルシフェラーゼＲＮＡ注射（対照）またはＲｉｂｏＭａｂ ＲＮＡ注射マウスの５μＬ血清およびスパイクした参照をＭｅｌｏｎ Ｇ精製に供し、非還元条件下で、４～１５％Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎゲル上で分離した。ＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｄ抗体を用いてウェスタンブロット分析を行った。１群当たり１匹の代表的なマウスの試料を示す。（Ｂ）ＡＤＡ分析のために、示されている時点で血清をサンプリングした。血清試料を、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイによって抗ＲｉｂｏＭａｂ ＡＤＡ含有量について分析した。ＡＤＡ応答（黒色の線）を、経時的にＲｉｂｏＭａｂタンパク質濃度（灰色の点線）に対してプロットしている。ＲｉｂｏＭａｂ＿７１２／７１１ Ｃ５３Ｗ変異体（上）およびＲｉｂｏＭａｂ０２．１（下）を示す。エラーバーは、平均値の標準偏差を示す（ｎ＝４）。 Ａｂ＝抗体；ＡＤＡ＝抗薬物抗体；Ｃ５３Ｓ／Ｗ＝抗ＣＬＤＮ６ ＶＬ部分の５３位でのシステインからセリン／トリプトファンへの置換；Ｆｄ＝フラグメントディフィカルト；ＨＭＷ＝高分子量；ＩｇＧ＝免疫グロブリンＧ；ｋＤａ＝キロダルトン；ＭＷ＝分子量；ＲＵ＝相対単位。 ＲｉｂｏＭａｂ０２．１をコードする原薬中間体のＨＣ：ＬＣ重量比は、ＲｉｂｏＭａｂ０２．１の発現効率およびモノマー含有量に影響を及ぼす ＨＥＫ－２９３Ｔ－１７細胞に、それぞれＲｉｂｏＭａｂ０２．１重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）をコードする２つのＲｉｂｏＭａｂ０２．１コード原薬中間体（ＲＮＡ）の示されている重量（ｗ／ｗ）比でエレクトロポレーションした。細胞培養上清（ＳＮ）をトランスフェクションの４８時間後に回収した。（Ａ）非還元条件下でのＲｉｂｏＭａｂ０２．１含有ＳＮおよび参照タンパク質（モノマー、ＨＭＷ）のウェスタンブロット分析。トランスフェクトされていない細胞からのＳＮを陰性対照（模擬ＳＮ）として使用した。ウェスタンブロットを、検出のためにＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトカッパ軽鎖（１：５００）抗体およびＩｇＧ Ｆｄ（１：２，０００）抗体の組合せを使用して行った。（Ｂ）２つの独立した実験からの技術的二連のＳＮ試料中の平均ＲｉｂｏＭａｂ０２．１濃度をＥＬＩＳＡによって分析した。エラーバーは、平均値の標準偏差（ＳＤ）を示す。 Ａｂ＝抗体；Ｆｄ＝検出可能な断片；ＨＣ＝重鎖コードＲＮＡ；ＨＭＷ＝高分子量；ＩｇＧ＝免疫グロブリンガンマ；ｋＤａ＝キロダルトン；ＭＷ＝分子量；ＬＣ＝軽鎖コードＲＮＡ；ＬＭＷ＝低分子量；ＲＮＡ＝リボ核酸；ＳＮ＝上清。
配列の説明
以下の表は、本明細書で参照される特定の配列のリストを提供する。
Figure 2024525795000001
Figure 2024525795000002
Figure 2024525795000003
Figure 2024525795000004
Figure 2024525795000005
Figure 2024525795000006
Figure 2024525795000007
Figure 2024525795000008
本開示を以下で詳細に説明するが、この開示は本明細書に記載される特定の方法論、プロトコルおよび試薬に限定されず、これらは異なり得ることが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本開示の範囲を限定することを意図するものではなく、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されるべきである。特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
好ましくは、本明細書で使用される用語は、“Ａ ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）”，Ｈ．Ｇ．Ｗ．Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｂ．Ｎａｇｅｌ，ａｎｄ Ｈ．Ｋｏｌｂｌ，Ｅｄｓ．，Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，ＣＨ－４０１０ Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，（１９９５）に記載されているように定義される。
本開示の実施は、特に指示されない限り、当分野の文献（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ １９８９を参照）で説明されている化学、生化学、細胞生物学、免疫学、および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を用いる。
以下において、本開示の要素を説明する。これらの要素を特定の実施形態と共に列挙するが、それらは、さらなる実施形態を創出するために任意の方法および任意の数で組み合わせてもよいことが理解されるべきである。様々に説明される例および実施形態は、本開示を明示的に記載される実施形態のみに限定すると解釈されるべきではない。この説明は、明示的に記載される実施形態を任意の数の開示される要素と組み合わせた実施形態を開示し、包含すると理解されるべきである。さらに、記述される全ての要素の任意の並び替えおよび組合せは、文脈上特に指示されない限り、この説明によって開示されていると見なされるべきである。
本明細書で使用される場合、関心対象の１つ以上の値に適用される「およそ」または「約」という用語は、記載された基準値と類似の値を指す。一般に、文脈内で精通する当業者は、その文脈において「約」または「およそ」によって包含される関連する分散度を理解するであろう。例えば、いくつかの実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、言及された値の２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満内の値の範囲を包含し得る。
本開示を説明する文脈において（特に特許請求の範囲の文脈において）使用される「１つの」および「その」という用語ならびに同様の言及は、本明細書で特に指示されない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を包含すると解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、単に、その範囲内に入る各々別個の値を個別に言及することの簡略方法として機能することが意図されている。本明細書で特に指示されない限り、各個々の値は、本明細書で個別に列挙されているかのごとくに本明細書に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書で特に指示されない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提供されるありとあらゆる例または例示的言語（例えば「など」）の使用は、単に本開示をよりよく説明することを意図しており、特許請求の範囲に限定を課すものではない。本明細書中のいかなる言語も、本開示の実施に不可欠な特許請求されていない要素を指示すると解釈されるべきではない。
特に明記されない限り、「含む」という用語は、本明細書の文脈において、「含む」によって導入されたリストのメンバーに加えて、さらなるメンバーが任意に存在し得ることを示すために使用される。しかしながら、「含む」という用語は、さらなるメンバーが存在しない可能性を包含することが本開示の特定の実施形態として企図され、すなわち、この実施形態の目的のためには、「含む」は、「からなる」または「から本質的になる」の意味を有すると理解されるべきである。
本明細書の本文全体を通していくつかの資料を引用する。本明細書で引用される各資料（全ての特許、特許出願、科学出版物、製造者の仕様書、説明書などを含む）は、上記または下記のいずれでも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書のいかなる内容も、本開示がそのような開示に先行する権利を有しなかったことの承認と解釈されるべきではない。
定義
以下において、本開示の全ての態様に適用される定義を提供する。以下の用語は、特に指示されない限り、以下の意味を有する。定義されていない用語は、それらの技術分野で広く認められている意味を有する。
本明細書で使用される「低減する」、「減少させる」、「阻害する」または「損なう」などの用語は、好ましくは少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％またはさらにそれ以上のレベルの全体的な低下または全体的な低下を生じさせる能力に関する。これらの用語には、完全なまたは本質的に完全な阻害、すなわちゼロまたは本質的にゼロへの低減が含まれる。
「増加させる」、「増強する」または「超える」などの用語は、好ましくは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、またはさらにそれ以上の増加または増強に関する。
本開示によれば、「ペプチド」という用語は、オリゴペプチドおよびポリペプチドを含み、ペプチド結合によって互いに連結された約２個以上、約３個以上、約４個以上、約６個以上、約８個以上、約１０個以上、約１３個以上、約１６個以上、約２０個以上、および最大約５０個、約１００個または約１５０個までの連続するアミノ酸を含む物質を指す。「タンパク質」または「ポリペプチド」という用語は、大きなペプチド、特に少なくとも約１５０個のアミノ酸を有するペプチドを指すが、「ペプチド」、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書では通常同義語として使用される。
アミノ酸配列（ペプチドまたはタンパク質）に関して、「断片」は、アミノ酸配列の一部、すなわちＮ末端および／またはＣ末端で短縮されたアミノ酸配列である配列に関する。Ｃ末端で短縮された断片（Ｎ末端断片）は、例えば、オープンリーディングフレームの３’末端を欠くトランケートされたオープンリーディングフレームの翻訳によって得ることができる。Ｎ末端で短縮された断片（Ｃ末端断片）は、例えば、トランケートされたオープンリーディングフレームが翻訳を開始するように働く開始コドンを含む限り、オープンリーディングフレームの５’末端を欠くトランケートされたオープンリーディングフレームの翻訳によって得ることができる。アミノ酸配列の断片は、例えば、アミノ酸配列からのアミノ酸残基の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％を含む。アミノ酸配列の断片は、好ましくは、アミノ酸配列からの少なくとも６個、特に少なくとも８個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも５０個、または少なくとも１００個の連続するアミノ酸を含む。
本明細書における「変異体」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾によって親アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を意味する。親アミノ酸配列は、天然もしくは野生型（ＷＴ）アミノ酸配列であり得るか、または野生型アミノ酸配列の改変形態であり得る。好ましくは、変異体アミノ酸配列は、親アミノ酸配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾、例えば、親と比較して１～約２０個のアミノ酸修飾、好ましくは１～約１０個または１～約５個のアミノ酸修飾を有する。
本明細書における「野生型」または「ＷＴ」または「天然」とは、対立遺伝子変異を含む、自然界で見出されるアミノ酸配列を意味する。野生型アミノ酸配列、ペプチドまたはタンパク質は、意図的に改変されていないアミノ酸配列を有する。
本開示の目的のために、アミノ酸配列（ペプチド、タンパク質またはポリペプチド）の「変異体」は、アミノ酸挿入変異体、アミノ酸付加変異体、アミノ酸欠失変異体および／またはアミノ酸置換変異体を含む。「変異体」という用語は、全ての突然変異体、スプライス変異体、翻訳後修飾変異体、立体配座変異体、アイソフォーム変異体、対立遺伝子変異体、種変異体、および種ホモログ、特に天然に存在するものを含む。「変異体」という用語は、特にアミノ酸配列の断片を含む。
アミノ酸挿入変異体は、特定のアミノ酸配列中に単一または２つ以上のアミノ酸の挿入を含む。挿入を有するアミノ酸配列変異体の場合、１個以上のアミノ酸残基がアミノ酸配列の特定の部位に挿入されるが、得られた産物の適切なスクリーニングを伴うランダムな挿入も可能である。アミノ酸付加変異体は、１個以上のアミノ酸、例えば１、２、３、５、１０、２０、３０、５０個、またはそれ以上のアミノ酸のアミノ末端および／またはカルボキシ末端融合物を含む。アミノ酸欠失変異体は、配列からの１個以上のアミノ酸の除去、例えば１、２、３、５、１０、２０、３０、５０個、またはそれ以上のアミノ酸の除去を特徴とする。欠失は、タンパク質の任意の位置にあってよい。タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に欠失を含むアミノ酸欠失変異体は、Ｎ末端および／またはＣ末端切断変異体とも呼ばれる。アミノ酸置換変異体は、配列中の少なくとも１個の残基が除去され、別の残基がその位置に挿入されていることを特徴とする。相同なタンパク質もしくはペプチド間で保存されていないアミノ酸配列内の位置にある修飾、および／またはアミノ酸を類似の特性を有する他のアミノ酸で置き換えることが好ましい。いくつかの実施形態では、ペプチドおよびタンパク質変異体におけるアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち、同様に荷電したアミノ酸または非荷電アミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化は、その側鎖が関連するアミノ酸のファミリーの１つの置換を含む。天然に存在するアミノ酸は、一般に４つのファミリー：酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、および非荷電極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン）アミノ酸に分けられる。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、時に芳香族アミノ酸として一緒に分類されることがある。いくつかの実施形態では、保存的アミノ酸置換は、以下の群内の置換を含む：
グリシン、アラニン；
バリン、イソロイシン、ロイシン；
アスパラギン酸、グルタミン酸；
アスパラギン、グルタミン；
セリン、トレオニン；
リジン、アルギニン；および
フェニルアラニン、チロシン。
好ましくは、所与のアミノ酸配列と前記所与のアミノ酸配列の変異体（例えば、機能的変異体）であるアミノ酸配列との間の類似性、好ましくは同一性の程度は、少なくとも約６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。類似性または同一性の程度は、好ましくは、参照アミノ酸配列の全長の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％であるアミノ酸領域について与えられる。例えば、参照アミノ酸配列が２００個のアミノ酸からなる場合、類似性または同一性の程度は、好ましくは少なくとも約２０個、少なくとも約４０個、少なくとも約６０個、少なくとも約８０個、少なくとも約１００個、少なくとも約１２０個、少なくとも約１４０個、少なくとも約１６０個、少なくとも約１８０個、または約２００個のアミノ酸、いくつかの実施形態では連続するアミノ酸について与えられる。いくつかの実施形態では、類似性または同一性の程度は、参照アミノ酸配列の全長について与えられる。配列類似性、好ましくは配列同一性を決定するためのアラインメントは、当技術分野で公知のツールを用いて、好ましくは最良の配列アラインメントを使用して、例えばＡｌｉｇｎを使用して、標準的な設定、好ましくはＥＭＢＯＳＳ：：ニードル、マトリックス：Ｂｌｏｓｕｍ６２、ギャップオープン１０．０、ギャップ伸長０．５を使用して行うことができる。
「配列類似性」は、同一であるか、または保存的アミノ酸置換を表すアミノ酸のパーセンテージを示す。２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」は、配列間で同一であるアミノ酸のパーセンテージを示す。２つの核酸配列間の「配列同一性」は、配列間で同一であるヌクレオチドのパーセンテージを示す。
「％同一」、「同一性％」という用語または同様の用語は、特に、比較される配列間の最適なアラインメントにおいて同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸のパーセンテージを指すことが意図されている。前記パーセンテージは純粋に統計的であり、２つの配列間の差は、比較される配列の全長にわたってランダムに分布していてもよいが、必ずしもそうではない。２つの配列の比較は、通常、対応する配列の局所領域を同定するために、最適なアラインメント後に、セグメントまたは「比較ウィンドウ」に関して配列を比較することによって行われる。比較のための最適なアラインメントは、手動で、またはＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｓ Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２，４８２による局所相同性アルゴリズムを用いて、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３による局所相同性アルゴリズムを用いて、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８，２４４４の類似性検索アルゴリズムを用いて、もしくは前記アルゴリズムを使用したコンピュータプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ ＮおよびＴＦＡＳＴＡ）を援用して実施し得る。いくつかの実施形態では、２つの配列の同一性パーセントは、米国国立バイオテクノロジー情報センター（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）のウェブサイト（例えば、ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ＆ＢＬＡＳＴ＿ＳＰＥＣ＝ｂｌａｓｔ２ｓｅｑ＆ＬＩＮＫ＿ＬＯＣ＝ａｌｉｇｎ２ｓｅｑ）で入手可能なＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを使用して決定される。いくつかの実施形態では、ＮＣＢＩウェブサイトのＢＬＡＳＴＮアルゴリズムに使用されるアルゴリズムパラメータは、以下を含む：（ｉ）１０に設定された期待閾値；（ｉｉ）２８に設定されたワードサイズ；（ｉｉｉ）０に設定されたクエリ範囲内の最大一致；（ｉｖ）１、－２に設定された一致／不一致スコア；（ｖ）線形に設定されたギャップコスト；および（ｖｉ）使用されている低複雑度領域のフィルタ。いくつかの実施形態では、ＮＣＢＩウェブサイトのＢＬＡＳＴＰアルゴリズムに使用されるアルゴリズムパラメータは、以下を含む：（ｉ）１０に設定された期待閾値；（ｉｉ）３に設定されたワードサイズ；（ｉｉｉ）０に設定されたクエリ範囲内の最大一致；（ｉｖ）ＢＬＯＳＵＭ６２に設定されたマトリックス；（ｖ）存在：１１、拡張：１に設定されたギャップコスト；および（ｖｉ）条件付き組成スコアマトリックス調整。
同一性パーセントは、比較する配列が一致する同一の位置の数を決定し、この数を比較する位置の数（例えば、参照配列中の位置の数）で除して、この結果に１００を乗じることによって得られる。
いくつかの実施形態では、類似性または同一性の程度は、参照配列の全長の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％である領域について与えられる。例えば、参照核酸配列が２００個のヌクレオチドからなる場合、同一性の程度は、少なくとも約１００個、少なくとも約１２０個、少なくとも約１４０個、少なくとも約１６０個、少なくとも約１８０個、または約２００個のヌクレオチド、いくつかの実施形態では連続するヌクレオチドについて与えられる。いくつかの実施形態では、類似性または同一性の程度は、参照配列の全長について与えられる。
相同なアミノ酸配列は、本開示によれば、アミノ酸残基の少なくとも４０％、特に少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９８または少なくとも９９％の同一性を示す。
本明細書に記載のアミノ酸配列変異体は、例えば組換えＤＮＡ操作により、当業者によって容易に調製され得る。置換、付加、挿入または欠失を有するペプチドまたはタンパク質を調製するためのＤＮＡ配列の操作は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）に詳細に記載されている。さらに、本明細書に記載のペプチドおよびアミノ酸変異体は、例えば固相合成および類似の方法などによる公知のペプチド合成技術を用いて容易に調製され得る。
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列（ペプチドまたはタンパク質）の断片または変異体は、好ましくは「機能的断片」または「機能的変異体」である。アミノ酸配列の「機能的断片」または「機能的変異体」という用語は、それが由来するアミノ酸配列のものと同一または類似の１つ以上の機能特性を示す、すなわち機能的に等価である任意の断片または変異体に関する。結合剤の配列に関して、１つの特定の機能は、断片または変異体が由来するアミノ酸配列によって示される１つ以上の結合活性である。本明細書で使用される「機能的断片」または「機能的変異体」という用語は、特に、親分子または配列のアミノ酸配列と比較して１つ以上のアミノ酸によって変化しており、かつ親分子または配列の機能の１つ以上を依然として果たす、例えば標的分子に結合することができるアミノ酸配列を含む変異体分子または配列を指す。いくつかの実施形態では、親分子または配列のアミノ酸配列の改変は、分子または配列の特徴に有意に影響を及ぼさないかまたは変化させない。異なる実施形態では、機能的断片または機能的変異体の機能は、低減され得るが、依然として有意に存在し得、例えば、機能的変異体の結合は、親分子または配列の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％であり得る。しかしながら、他の実施形態では、機能的断片または機能的変異体の結合は、親分子または配列と比較して増強され得る。
指定されたアミノ酸配列（ペプチド、タンパク質またはポリペプチド）に「由来する」アミノ酸配列（ペプチド、タンパク質またはポリペプチド）は、最初のアミノ酸配列の起源を指す。好ましくは、特定のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、その特定の配列またはその断片と同一、本質的に同一または相同であるアミノ酸配列を有する。特定のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、その特定の配列の変異体またはその断片であり得る。例えば、本明細書での使用に適した配列は、天然配列の望ましい活性を保持しながら、それらが由来する天然に存在する配列または天然配列とは配列が異なるように改変され得ることが当業者に理解されるであろう。
例えば、本発明の結合剤のポリペプチド鎖のＶＨ、ＶＬ、ＣＨ１およびＣＬドメインのアミノ酸配列は、免疫グロブリンのＶＨ、ＶＬ、ＣＨ１およびＣＬドメインのアミノ酸配列に由来し得るが、それらが由来するドメインと比較して変化していてもよい。例えば、本発明によれば、免疫グロブリンに由来するＶＨまたはＶＬは、それが由来するそれぞれのＶＨもしくはＶＬのアミノ酸配列と同一であり得るアミノ酸配列を含むか、またはそれぞれの親ＶＨもしくはＶＬの配列と比較して１つ以上のアミノ酸位置が異なり得る。例えば、本発明の結合剤のＶＨドメインは、それが由来するＶＨドメインのアミノ酸配列と比較して、１つ以上のアミノ酸挿入、アミノ酸付加、アミノ酸欠失および／またはアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み得る。例えば、本発明の結合剤のＶＬドメインは、それが由来するＶＬドメインのアミノ酸配列と比較して、１つ以上のアミノ酸挿入、アミノ酸付加、アミノ酸欠失および／またはアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、親ＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列の機能的変異体であるアミノ酸配列を有するＶＨまたはＶＬは、例えば結合特異性、結合強度などの点で、親ＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列と同じまたは本質的に同じ機能を提供する。しかしながら、当業者が認識するように、いくつかの実施形態では、親分子のアミノ酸配列と比較して変化した特性を有する、例えばＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列の機能的変異体を提供することも好ましい場合がある。同じ考慮事項が、例えばＣＤＲのアミノ酸配列、ならびに他のアミノ酸配列、例えばＣＨ１および／またはＣＬドメインのアミノ酸配列にも適用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＨ１およびＣＬ配列の変異体は、相互作用する能力、例えば互いに結合する能力を有する。
本明細書で使用される場合、「説明資料」または「説明書」は、本発明の組成物および方法の有用性を伝えるために使用することができる刊行物、記録、図、または任意の他の表現媒体を含む。本発明のキットの説明資料は、例えば、本発明の組成物を含む容器に貼付されてもよく、または組成物を含む容器と共に出荷されてもよい。あるいは、説明資料と組成物が受領者によって協働して使用されることを意図して、説明資料は容器とは別に出荷されてもよい。
「単離された」は、天然状態から改変されたまたは取り出されたことを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離されて」いないが、その天然状態の共存物質から部分的または完全に分離された同じ核酸またはペプチドは「単離されて」いる。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在し得るか、または例えば宿主細胞などの非天然環境に存在し得る。
本発明の文脈における「組換え」という用語は、「遺伝子操作を介して作製された」ことを意味する。好ましくは、本発明の文脈における組換え核酸などの「組換え物」は、天然には存在しない。
本明細書で使用される「天然に存在する」という用語は、物体が自然界で見出され得るという事実を指す。例えば、生物（ウイルスを含む）中に存在し、自然界の供給源から単離することができ、実験室で人によって意図的に改変されていないペプチドまたは核酸は、天然に存在する。
本明細書で使用される「生理学的ｐＨ」は、約７．３５～約７．４５のｐＨを指し、平均は約７．４０である。
「遺伝子改変」または単に「改変」という用語は、核酸による細胞のトランスフェクションを含む。「トランスフェクション」という用語は、細胞への核酸、特にＲＮＡの導入に関する。本発明の目的のために、「トランスフェクション」という用語はまた、細胞への核酸の導入またはそのような細胞による核酸の取り込みを含み、細胞は、対象、例えば患者に存在し得る。したがって、本発明によれば、本明細書に記載の核酸のトランスフェクションのための細胞は、インビトロまたはインビボで存在することができ、例えば、細胞は患者の器官、組織および／または生物の一部を形成することができる。本発明によれば、トランスフェクションは一過性または安定であり得る。トランスフェクションのいくつかの用途では、トランスフェクトされた遺伝物質が一過性にのみ発現されれば十分である。ＲＮＡを細胞にトランスフェクトして、そのコードされたタンパク質を一過性に発現させることができる。トランスフェクションプロセスで導入された核酸は、通常、核ゲノムに組み込まれないので、外来核酸は有糸分裂によって希釈されるかまたは分解される。核酸のエピソーム増幅を可能にする細胞は、希釈率を大幅に低下させる。トランスフェクトされた核酸が実際に細胞およびその娘細胞のゲノムに残ることが望ましい場合は、安定なトランスフェクションが起こらなければならない。そのような安定なトランスフェクションは、トランスフェクションのためにウイルスベースのシステムまたはトランスポゾンベースのシステムを使用することによって達成することができる。一般に、抗原をコードする核酸は、細胞に一過性にトランスフェクトされる。ＲＮＡを細胞にトランスフェクトして、そのコードされたタンパク質を一過性に発現させることができる。
クローディン６（ＣＬＤＮ６）
クローディンは、タイトジャンクションの最も重要な成分であるタンパク質のファミリーであり、タイトジャンクションにおいて上皮細胞間の細胞間隙における分子の流れを制御する細胞間隙バリアを確立する。クローディンは、Ｎ末端およびＣ末端の両方が細胞質に位置する、膜を４回横切る膜貫通タンパク質であるＥＬ１またはＥＣＬ１と呼ばれる第１の細胞外ループは平均５３個のアミノ酸からなり、ＥＬ２またはＥＣＬ２と呼ばれる第２の細胞外ループは約２４個のアミノ酸からなる。
「クローディン６」または「ＣＬＤＮ６」という用語は、好ましくはヒトＣＬＤＮ６、特に、配列表の配列番号１もしくは配列番号２のアミノ酸配列または前記アミノ酸配列の変異体を含む、好ましくはそれからなるタンパク質に関する。ＣＬＤＮ６の第１の細胞外ループは、好ましくは配列番号１に示されるアミノ酸配列または配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸２８～８０または２９～８１、より好ましくはアミノ酸２８～７６を含む。ＣＬＤＮ６の第２の細胞外ループは、好ましくは配列番号１に示されるアミノ酸配列または配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸１３８～１６０、好ましくはアミノ酸１４１～１５９、より好ましくはアミノ酸１４５～１５７を含む。前記第１および第２の細胞外ループは、好ましくはＣＬＤＮ６の細胞外部分を形成する。
ＣＬＤＮ６は様々な起源の腫瘍で発現され、ＣＬＤＮ６を発現する唯一の成体正常組織は胎盤である。
ＣＬＤＮ６は、例えば、卵巣癌、肺癌、精巣癌、子宮内膜癌、胃癌、乳癌、肝臓癌、膵臓癌、皮膚癌、黒色腫、頭頸部癌、肉腫、胆管癌、腎細胞癌、および膀胱癌において発現することが見出されている。ＣＬＤＮ６は、卵巣癌、特に卵巣腺癌および卵巣奇形癌腫、ファロピウス管癌腹膜癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を含む肺癌、特に扁平上皮肺癌および腺癌または非扁平上皮型の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、胃癌、乳癌、肝臓癌、膵臓癌、皮膚癌、特に基底細胞癌および扁平上皮癌、悪性黒色腫、頭頸部癌、特に悪性多形性腺腫、肉腫、特に滑膜肉腫および癌肉腫、胆管癌、膀胱の癌、特に移行上皮癌および乳頭状癌、腎臓癌、特に淡明細胞型腎細胞癌および乳頭状腎細胞癌を含む腎細胞癌、結腸癌、回腸の癌を含む小腸癌、特に小腸腺癌および回腸の腺癌、精巣胎児性癌、胎盤絨毛癌、子宮頸癌、精巣癌、特に精巣セミノーマ、精巣奇形腫および精巣胎児性癌、子宮癌、奇形癌または胎児性癌など胚細胞腫瘍、特に精巣の胚細胞腫瘍、ならびにそれらの転移形態の予防および／または治療のための特に好ましい標的である。いくつかの実施形態では、ＣＬＤＮ６発現に関連する癌疾患は、卵巣癌、肺癌、転移性卵巣癌および転移性肺癌からなる群より選択される。好ましくは、卵巣癌は癌腫または腺癌である。好ましくは、肺癌は癌腫または腺癌であり、好ましくは細気管支癌腫または細気管支腺癌などの細気管支癌である。
本明細書で使用される場合、「ＣＬＤＮ６陽性癌」という用語は、好ましくは前記癌細胞の表面にＣＬＤＮ６を発現する癌細胞が関与する癌に関する。
本発明によれば、ＣＬＤＮ６は、発現レベルが胎盤細胞または胎盤組織における発現と比較して低い場合、細胞において実質的に発現されない。好ましくは、発現レベルは、胎盤細胞または胎盤組織における発現の１０％未満、好ましくは５％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％または０．０５％未満であるかまたはさらに低い。好ましくは、ＣＬＤＮ６は、発現レベルが胎盤以外の非癌性組織における発現レベルを２倍以下、好ましくは１．５倍以下だけ上回り、好ましくは前記非癌性組織における発現レベルを超えない場合、細胞において実質的に発現されない。好ましくは、ＣＬＤＮ６は、発現レベルが検出限界未満である場合、および／または発現レベルが細胞に添加されたＣＬＤＮ６特異的抗体による結合を可能にするには低すぎる場合、細胞において実質的に発現されない。
本発明によれば、ＣＬＤＮ６は、発現レベルが胎盤以外の非癌性組織における発現レベルを、好ましくは２倍超、好ましくは１０倍超、１００倍超、１，０００倍超、または１０，０００倍超上回る場合、細胞において発現される。好ましくは、ＣＬＤＮ６は、発現レベルが検出限界を超える場合、および／または発現レベルが細胞に添加されたＣＬＤＮ６特異的抗体による結合を可能にするのに十分高い場合、細胞において発現される。好ましくは、細胞において発現されるＣＬＤＮ６は、前記細胞の表面上で発現または露出される。
分化クラスタ３（ＣＤ３）
本明細書に記載の結合剤の第２の標的分子はＣＤ３（分化クラスタ３）である。
ＣＤ３複合体は、Ｔ細胞特異的抗原である。Ｔ細胞特異的抗原は、Ｔ細胞の表面上の抗原である。
ＣＤ３複合体は、多分子Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の一部として成熟ヒトＴ細胞、胸腺細胞およびナチュラルキラー細胞のサブセット上に発現される抗原を表す。Ｔ細胞共受容体はタンパク質複合体であり、４つの異なる鎖から構成される。哺乳動物では、複合体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、および２つのＣＤ３ε鎖を含む。これらの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）として公知の分子およびζ鎖と会合して、Ｔリンパ球において活性化シグナルを生成する。ＴＣＲ、ζ鎖、およびＣＤ３分子は、一緒にＴＣＲ複合体を構成する。
ヒトＣＤ３イプシロンは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００７３３に示されており、配列番号３を含む。ヒトＣＤ３ガンマは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００００７３に示されている。ヒトＣＤ３デルタは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００７３２に示されている。ＣＤ３は、ＴＣＲのシグナル伝達を担う。Ｌｉｎ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１４，２４３－２４４（２００１）に記載されているように、ＭＨＣ提示特異的抗原エピトープの結合によるＴＣＲ複合体の活性化は、Ｓｒｃファミリーキナーゼによる免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）のリン酸化をもたらし、Ｃａ２＋放出を含むＴ細胞活性化をもたらすさらなるキナーゼの動員を誘発する。例えば、固定化抗ＣＤ３抗体によるＴ細胞上のＣＤ３のクラスタリングは、Ｔ細胞受容体の係合と同様のＴ細胞活性化をもたらすが、そのクローンの典型的な特異性とは無関係である
本明細書で使用される場合、「ＣＤ３」は、ヒトＣＤ３を含み、多分子Ｔ細胞受容体複合体の一部としてヒトＴ細胞上に発現される抗原を表す。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の結合剤は、ＣＤ３のイプシロン鎖を認識し、特に、ＣＤ３イプシロンの最初の２７個のＮ末端アミノ酸またはこの２７個のアミノ酸のストレッチの機能的断片に対応するエピトープを認識する。
結合剤
本開示は、少なくともＣＤ３のエピトープおよびＣＬＤＮ６のエピトープに結合することができる二重特異性三価結合剤などの結合剤を記載する。結合剤は、少なくとも３つの結合ドメインを含み、第１の結合ドメインはＣＤ３に結合することができ、第２および第３の結合ドメインはＣＬＤＮ６に結合することができ、第２および第３の結合ドメインはＣＬＤＮ６の同じまたは異なるエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の結合剤の第２および第３の結合ドメインは、ＣＬＤＮ６の同じエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、第２および第３の結合ドメインの配列は、同一または本質的に同一である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の結合剤は組換え分子である。
「エピトープ」という用語は、結合剤によって認識されるＣＤ３および／またはＣＬＤＮ６などの分子または抗原の一部または断片を指す。例えば、エピトープは、抗体または任意の他の結合タンパク質によって認識され得る。エピトープは、抗原の連続部分または不連続部分を含み得、約５～約１００、例えば約５～約５０、より好ましくは約８～約３０、最も好ましくは約８～約２５アミノ酸長であり得、例えば、エピトープは、好ましくは９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸長であり得る。いくつかの実施形態では、エピトープは、約１０～約２５アミノ酸の長さである。「エピトープ」という用語は、構造エピトープを含む。
「免疫グロブリン」という用語は、２対のポリペプチド鎖、１対の軽（Ｌ）低分子量鎖および１対の重（Ｈ）鎖からなり、４つ全てがジスルフィド結合によって相互接続されている、構造的に関連する糖タンパク質のクラスを指す。免疫グロブリンの構造は十分に特徴付けられている。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ ｅｄ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照。簡潔には、各重鎖は、典型的には重鎖可変領域（本明細書ではＶＨまたはＶＨと略す）および重鎖定常領域（本明細書ではＣＨまたはＣＨと略す）から構成される。重鎖定常領域は、典型的にはＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３の３つのドメインから構成される。ヒンジ領域は、重鎖のＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の領域であり、非常に柔軟である。ヒンジ領域内のジスルフィド結合は、ＩｇＧ分子内の２つの重鎖間の相互作用の一部である。各軽鎖は、典型的には軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬまたはＶＬと略す）および軽鎖定常領域（本明細書ではＣＬまたはＣＬと略す）から構成される。軽鎖定常領域は、典型的には１つのドメイン、ＣＬで構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる超可変性の領域（または配列および／もしくは構造的に定義されたループの形態が超可変であり得る超可変領域）にさらに細分され得る。各ＶＨおよびＶＬは、典型的には、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，９０１－９１７（１９８７）も参照のこと）。特に明記されない限り、または文脈と矛盾しない限り、本発明における定常領域のアミノ酸位置への言及は、ＥＵナンバリングに従う（Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９６９ Ｍａｙ；６３（１）：７８－８５；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ．１９９１ ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２）。一般に、本明細書に記載のＣＤＲはＫａｂａｔによって定義される。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンは抗体である。
本明細書全体を通して、重鎖（ＨＣ）または軽鎖（ＬＣ）への言及は、必ずしも重鎖全体（ＨＣ）または軽鎖（ＬＣ）の存在を意味するのではなく、少なくとも重鎖（ＨＣ）または軽鎖（ＬＣ）の関連するまたは特徴的な部分の存在を示すための省略表現として使用される。例えば、（Ｆａｂ）－（ｓｃＦｖ）２ベースの二重特異性抗体が２本の鎖を有し、一方が親免疫グロブリンに由来する重鎖の可変領域（ＶＨ）およびｓｃＦｖを含み、他方の鎖が親免疫グロブリンに由来する軽鎖の可変領域（ＶＬ）およびｓｃＦｖを含む場合、２本の鎖はそれぞれ重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）と呼ばれ得る。これは、実際にはどちらの鎖も重鎖または軽鎖を含まず、両方の鎖がｓｃＦｖを含む場合でも当てはまり得、両方が親重鎖および親軽鎖に由来する要素を含むことを意味する。
本発明の文脈における「抗体」（Ａｂ）という用語は、抗原に結合する、好ましくは特異的に結合する能力を有する免疫グロブリン分子、免疫グロブリン分子の断片、またはそれらのいずれかの誘導体を指す。いくつかの実施形態では、結合は、少なくとも約３０分間、少なくとも約４５分間、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約４時間、少なくとも約８時間、少なくとも約１２時間、約２４時間以上、約４８時間以上、約３、４、５、６、７日間以上など、または任意の他の関連する機能的に定義された期間（例えば抗原への抗体結合に関連する生理学的応答を誘導、促進、増強および／もしくは調節するのに十分な時間）などの、有意な期間の半減期を有する典型的な生理学的条件下で起こる。免疫グロブリン分子の重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。本明細書で使用される「抗原結合領域」、「結合領域」または「結合ドメイン」という用語は、抗原と相互作用し、典型的にはＶＨ領域とＶＬ領域の両方を含む領域またはドメインを指す。本明細書で使用される場合の抗体という用語は、単一特異性抗体だけでなく、複数、例えば２つ以上、例えば３つ以上の異なる抗原結合領域を含む多重特異性抗体も含む。抗体（Ａｂ）の定常領域は、免疫系の様々な細胞（エフェクタ細胞など）および補体活性化の古典的経路における第１成分であるＣ１ｑなどの補体系の成分を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。上記のように、本明細書で使用される抗体という用語は、特に明記されない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、抗原結合断片である、すなわち抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の断片、および抗体誘導体、すなわち抗体に由来する構築物を含む。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって実施され得ることが示されている。「抗体」という用語に包含される抗原結合断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ’もしくはＦａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片、または国際公開第２００７０５９７８２号（Ｇｅｎｍａｂ）に記載されている一価抗体；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインから本質的になるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬドメインおよびＶＨドメインから本質的になるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインから本質的になり、ドメイン抗体とも呼ばれる（Ｈｏｌｔ ｅｔ ａｌ；Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３ Ｎｏｖ；２１（１１）：４８４－９０）ｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４１，５４４－５４６（１９８９））；（ｖｉ）ラクダ科動物またはナノボディ分子（Ｒｅｖｅｔｓ ｅｔ ａｌ；Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．２００５ Ｊａｎ；５（１）：１１１－２４）ならびに（ｖｉｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え法を用いて、ＶＬ領域とＶＨ領域とが対合して一価分子を形成する単一のタンパク質鎖（一本鎖抗体または一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知であり、例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２，４２３－４２６（１９８８）およびＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５，５８７９－５８８３（１９８８）を参照）としてそれらを作製することを可能にする合成リンカーによって連結され得る。そのような一本鎖抗体は、特に明記されない限り、または文脈によって明確に指示されない限り、抗体という用語に包含される。そのような断片は一般に抗体の意味の範囲内に含まれるが、それらは、集合的におよびそれぞれ独立して本発明の固有の特徴であり、異なる生物学的特性および有用性を示す。本発明の文脈におけるこれらおよび他の有用な抗体断片、ならびにそのような断片の二重特異性フォーマットを本明細書でさらに論じる。抗体という用語は、特に明記されない限り、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、キメラ抗体およびヒト化抗体などの抗体様ポリペプチド、ならびに酵素的切断、ペプチド合成、および組換え技術などの任意の公知の技術によって提供される抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体断片（抗原結合断片）も含むことも理解されるべきである。
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」という語句は、従来の二本鎖抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）が結合して一本鎖を形成している抗体を指す。任意で、適切な折り畳みおよび活性結合部位の創出を可能にするために、リンカー（通常はペプチド）が２本の鎖の間に挿入される。
抗体は、任意のアイソタイプを有することができる。本明細書で使用される場合、「アイソタイプ」という用語は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる免疫グロブリンクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ）を指す。特定のアイソタイプ、例えばＩｇＧ１が本明細書で言及される場合、この用語は、特定のアイソタイプ配列、例えば特定のＩｇＧ１配列に限定されないが、抗体が他のアイソタイプよりもそのアイソタイプ、例えばＩｇＧ１に配列が近いことを示すために使用される。したがって、例えば本発明のＩｇＧ１抗体は、定常領域の変異を含む、天然に存在するＩｇＧ１抗体の配列変異体であり得る。
様々な実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１抗体、より具体的にはＩｇＧ１カッパもしくはＩｇＧ１ラムダアイソタイプ（すなわちＩｇＧ１κ、ＩｇＧ１λ）、ＩｇＧ２ａ抗体（例えばＩｇＧ２ａκ、ＩｇＧ２ａλ）、ＩｇＧ２ｂ抗体（例えばＩｇＧ２ｂκ、ＩｇＧ２ｂλ）、ＩｇＧ３抗体（例えばＩｇＧ３κ、ＩｇＧ３λ）またはＩｇＧ４抗体（例えばＩｇＧ４κ、ＩｇＧ４λ）である。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。したがって、「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する、単一の結合特異性を示す抗体を指す。ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合されたヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する、トランスジェニックマウスなどのトランスジェニックまたはトランスクロモソーマル非ヒト動物から得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生され得る。
本明細書で使用される「キメラ抗体」という用語は、可変領域が非ヒト種に由来し（例えばげっ歯動物に由来）、定常領域がヒトなどの異なる種に由来する抗体を指す。治療用途のためのキメラモノクローナル抗体は、抗体免疫原性を低下させるために開発されている。キメラ抗体の文脈で使用される「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の両方のＣＤＲおよびフレームワーク領域を含む領域を指す。キメラ抗体は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｈ．１５に記載されているような標準的なＤＮＡ技術を使用することによって作製され得る。キメラ抗体は、遺伝子操作された、または酵素的に操作された組換え抗体であり得る。キメラ抗体を作製することは当業者の知識の範囲内であり、したがって、本発明によるキメラ抗体の作製は、本明細書に記載される以外の方法によって行われ得る。
本明細書で使用される「ヒト化抗体」という用語は、ヒト抗体定常ドメインと、ヒト可変ドメインに対して高レベルの配列相同性を含むように改変された非ヒト可変ドメインとを含む、遺伝子操作された非ヒト抗体を指す。これは、一緒になって抗原結合部位を形成する６つの非ヒト抗体相補性決定領域（ＣＤＲ）を相同なヒトアクセプタフレームワーク領域（ＦＲ）に移植することによって達成され得る（国際公開第９２／２２６５３号および欧州特許第０６２９２４０号を参照）。親抗体の結合親和性および特異性を完全に再構成するために、親抗体（すなわち非ヒト抗体）からのフレームワーク残基のヒトフレームワーク領域への置換（復帰突然変異）が必要とされ得る。構造相同性モデリングは、抗体の結合特性に重要なフレームワーク領域内のアミノ酸残基を同定するのに役立ち得る。したがって、ヒト化抗体は、非ヒトＣＤＲ配列、主に、任意で非ヒトアミノ酸配列への１つ以上のアミノ酸復帰突然変異を含むヒトフレームワーク領域と、完全ヒト定常領域とを含み得る。任意で、必ずしも復帰突然変異ではないさらなるアミノ酸修飾を適用して、親和性および生化学的特性などの好ましい特徴を有するヒト化抗体が得られ得る。
本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を指す。ヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的突然変異誘発によって、またはインビボでの体細胞突然変異によって導入された突然変異）を含み得る。しかしながら、「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、マウスまたはラットなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体を含むことを意図しない。ヒトモノクローナル抗体は、従来のモノクローナル抗体法、例えばＫｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む、様々な技術によって作製することができる。体細胞ハイブリダイゼーション手順が原則として好ましいが、モノクローナル抗体を作製するための他の技術、例えば、Ｂリンパ球のウイルスもしくは発癌性形質転換、またはヒト抗体遺伝子のライブラリを用いるファージディスプレイ技術を使用することができる。ヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製するための適切な動物系は、マウス系である。マウスにおけるハイブリドーマ産生は非常によく確立された手順である。免疫化プロトコルおよび融合のために免疫化された脾細胞を単離するための技術は、当技術分野で公知である。融合パートナー（例えばマウス骨髄腫細胞）および融合手順も公知である。したがって、ヒトモノクローナル抗体は、例えば、マウス系またはラット系ではなくヒト免疫系の一部を担持するトランスジェニックまたはトランスクロモソーマルマウスまたはラットを使用して作製することができる。したがって、いくつかの実施形態では、ヒト抗体は、動物免疫グロブリン配列の代わりにヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列を担持する、マウスまたはラットなどのトランスジェニック動物から得られる。そのような実施形態では、抗体は、動物に導入されたヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来するが、最終的な抗体配列は、前記ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列が内因性動物抗体機構による体細胞超変異および親和性成熟によってさらに修飾された結果であり、例えばＭｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．１９９７ Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１５（２）：１４６－５６を参照。
抗体に関連して使用される場合の「完全長」という用語は、抗体が断片ではないが、自然界でそのアイソタイプについて通常見出される特定のアイソタイプのドメイン、例えばＩｇＧ１抗体のＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ヒンジ、ＶＬおよびＣＬドメインの全てを含むことを示す。
本明細書で使用される場合、文脈と矛盾しない限り、「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリンの重鎖の２つのＦｃ配列からなる抗体領域を指し、前記Ｆｃ配列は、少なくともヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む。
本明細書で使用される場合、所定の抗原またはエピトープへの結合剤、例えば抗体の結合に関連して「結合する」または「結合することができる」という用語は、典型的には、例えば、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を使用して決定した場合、抗原をリガンドとし、結合剤を分析物として使用するＢＩＡｃｏｒｅ ３０００装置での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を使用して決定した場合、または標的（ＣＬＤＮ６）発現細胞を「リガンド」として使用する水晶振動子マイクロバランスシステムを使用して決定した場合、約１０－７Ｍ以下、例えば約１０－８Ｍ以下、例えば約１０－９Ｍ以下、約１０－１０Ｍ以下、または約１０－１１Ｍもしくはさらにそれ以下のＫＤに対応する親和性での結合を指す。いくつかの実施形態では、結合剤は、所定の抗原または密接に関連する抗原以外の非特異的抗原（例えばＢＳＡ、カゼイン）への結合に対するその親和性よりも少なくとも１０倍低い、例えば少なくとも１００倍低い、例えば少なくとも１，０００倍低い、例えば少なくとも１０，０００倍低い、例えば少なくとも１００，０００倍低いＫＤに対応する親和性で所定の抗原に結合する。親和性がより低い程度量は結合剤のＫＤに依存するので、結合剤のＫＤが非常に低い（すなわち、結合剤が非常に特異的である）場合、抗原に対する親和性が非特異的抗原に対する親和性よりも低い程度は、少なくとも１０，０００倍であり得る。
本明細書で使用される「ｋｄ」（秒－１）という用語は、特定の結合剤－抗原相互作用の解離速度定数を指す。前記値は、ｋｏｆｆ値とも呼ばれる。
本明細書で使用される「ＫＤ」（Ｍ）という用語は、特定の結合剤－抗原相互作用の解離平衡定数を指す。
本発明はまた、本明細書に記載のＶＬ領域、ＶＨ領域、または１つ以上のＣＤＲの機能的変異体を含む結合剤を想定する。結合剤に関連して使用されるＶＬ、ＶＨ、またはＣＤＲの機能的変異体は、依然として、結合剤が「参照」または「親」結合剤の親和性および／または特異性／選択性の少なくともかなりの割合（少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上）を保持することを可能にし、場合によっては、そのような結合剤は、親結合剤よりも高い親和性、選択性および／または特異性に関連し得る。
そのような機能的変異体は、典型的には、親配列に対する有意な配列同一性を保持する。
例示的な変異体には、主に保存的置換によって親配列のＶＨ領域および／またはＶＬ領域および／またはＣＤＲ領域とは異なるものが含まれる；例えば、変異体における置換の最大１０個、例えば９、８、７、６、５、４、３、２または１個は保存的アミノ酸残基置換である。
ＶＬ領域もしくはＶＨ領域などの本明細書に記載の配列、またはＶＬ領域もしくはＶＨ領域などの本明細書に記載の配列とある程度の相同性もしくは同一性を有する配列の機能的変異体は、好ましくは非ＣＤＲ配列の改変または変異を含むが、ＣＤＲ配列は、好ましくは不変のままである。
本明細書に記載の重鎖可変領域配列および／または軽鎖可変領域配列の変異体を含む結合剤、例えば、本明細書に記載のＣＤＲにおける改変および／またはある程度の同一性を含む結合剤は、別の結合剤、例えば、本明細書に記載の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む結合剤と、抗原、例えばＣＤ３および／もしくはＣＬＤＮ６への結合について競合し得るか、または別の結合剤、例えば、本明細書に記載の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む結合剤の抗原に対する特異性を有し得る。
本明細書で使用される「特異性」という用語は、文脈と矛盾しない限り、以下の意味を有することが意図されている。２つの結合剤は、同じ抗原および同じエピトープに結合する場合、「同じ特異性」を有する。
「競合する」および「競合」という用語は、同じ抗原に対する第１の結合剤と第２の結合剤との間の競合を指し得る。標的抗原への結合についての抗体などの結合剤の競合を試験する方法は、当業者に周知である。そのような方法の一例は、例えばＥＬＩＳＡとしてまたはフローサイトメトリによって実施され得る、いわゆる交差競合アッセイである。あるいは、バイオレイヤー干渉法を用いて競合を決定してもよい。
標的抗原への結合について競合する結合剤は、抗原上の異なるエピトープに結合することができ、エピトープは互いに非常に近接しているので、一方のエピトープに結合する第１の結合剤は、他方のエピトープへの第２の結合剤の結合を妨げる。しかしながら、他の状況では、２つの異なる結合剤が抗原上の同じエピトープに結合することができ、競合結合アッセイにおいて結合について競合する。同じエピトープに結合するそのような結合剤は、本明細書では同じ特異性を有すると見なされる。したがって、いくつかの実施形態では、同じエピトープに結合する結合剤は、標的分子上の同じアミノ酸に結合すると見なされる。結合剤が標的抗原上の同じエピトープに結合することは、当業者に公知の標準的なアラニンスキャニング実験または抗体－抗原結晶化実験によって決定され得る。好ましくは、異なるエピトープに結合する結合剤または結合ドメインは、それらのそれぞれのエピトープへの結合について互いに競合していない。
上記のように、様々な形式の抗体が当技術分野で記載されている。本発明の結合剤は、原則として、任意のアイソタイプの抗体の配列を含むことができる。例示的なアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４である。ヒト軽鎖定常領域カッパまたはラムダのいずれかを使用し得る。いくつかの実施形態では、ＣＨ１およびＣＬなどの本明細書に記載の結合剤の配列は、ＩｇＧ１アイソタイプの抗体、例えばＩｇＧ１，κ抗体に由来する。
好ましくは、抗原結合領域またはドメインの各々は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、前記可変領域は各々、３つのＣＤＲ配列、それぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに４つのフレームワーク配列、それぞれＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４を含む。さらに、好ましくは、本明細書に記載の結合剤は、重鎖定常領域（ＣＨ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。
本発明の文脈における「結合剤」という用語は、１つ以上の所望の抗原、例えばＣＤ３およびＣＬＤＮ６に結合することができる任意の薬剤を指す。「結合剤」という用語は、抗体、抗体断片、または任意の他の結合タンパク質、またはそれらの任意の組合せを含む。いくつかの実施形態では、結合タンパク質は、ＦａｂおよびｓｃＦｖなどの抗体断片を含む。
天然に存在する抗体は、一般に単一特異性であり、すなわちそれらは単一の抗原に結合する。本発明は、Ｔ細胞などの細胞傷害性細胞（ＣＤ３受容体に係合することによって）および癌細胞などの標的細胞（ＣＬＤＮ６に係合することによって）に結合する結合剤を提供する。そのような結合剤は、少なくとも二重特異性または多重特異性、例えば三重特異性、四重特異性などである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の結合剤は、２つの異なる抗体の断片から構成される人工タンパク質である（２つの異なる抗体の前記断片は３つの結合ドメインを形成する）。
本発明によれば、二重特異性結合剤、特に二重特異性タンパク質は、２つの異なる結合特異性を有し、したがって２つのエピトープに結合し得る分子である。特に、本明細書で使用される「二重特異性結合剤」という用語は、３つの抗原結合部位、すなわち、第１のエピトープに親和性を有する第１の結合部位、ならびに第１のエピトープとは異なる第２のエピトープに結合親和性を有する第２および第３の結合部位を含む抗体由来の分子を含む。
本発明の文脈における「二重特異性」という用語は、異なるエピトープ、特に異なる抗原上の異なるエピトープ、例えばＣＤ３およびＣＬＤＮ６に結合する２つの異なる抗原結合領域を含む薬剤を指す。
「多重特異性結合剤」は、３つ以上の異なる結合特異性を有する分子である。
いくつかの実施形態では、ＣＤ３およびＣＬＤＮ６に結合する本明細書に記載の結合剤は、少なくとも三価である。本明細書で使用される場合、「原子価の」、「原子価」、「価数」、またはそれらの他の文法的変形は、結合剤中の抗原結合部位または結合ドメインの数を意味する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の結合剤は、ＣＤ３に対する少なくとも１つの抗原結合部位または結合ドメイン、およびＣＬＤＮ６に対する少なくとも２つの抗原結合部位または結合ドメインを有する。同じ抗原に結合する抗原結合部位は、同じエピトープまたは異なるエピトープを認識し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の結合剤は、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ２構築物の形式であり、すなわち、ＣＤ３に特異的なＦａｂ断片には、Ｆａｂ断片の定常領域のＣ末端にＣＬＤＮ６に特異的な２つのｓｃＦｖ断片が提供される。いくつかの実施形態では、結合剤は、好ましくはジスルフィド架橋によって一緒に結合された２つのポリペプチド鎖で構成される二量体であり、第１のポリペプチドは、ＣＨ１ポリペプチド鎖を介してさらなるＶＨドメインに連結されたｓｃＦｖを含み、第２のポリペプチドは、ＣＬポリペプチド鎖を介してさらなるＶＬドメインに連結されたｓｃＦｖを含む。ジスルフィド架橋は、好ましくは、ＣＨ１中のＣｙｓ残基とＣＬ中のＣｙｓ残基との間に形成され、その結果、第１のポリペプチドのさらなるＶＨは、抗原結合配置で第２のポリペプチドのさらなるＶＬと会合し、その結果、結合剤は全体として３つの抗原結合ドメインを含む。したがって、いくつかの実施形態では、結合剤は、ヘテロ二量体化することができ、そのときにｓｃＦｖ結合ドメインが組み込まれる（好ましくはＦｄ／ＬのＣ末端に）Ｆａｂ断片の重鎖（Ｆｄ断片）および軽鎖（Ｌ）を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖ部分のＶＨドメインとＶＬドメインはペプチドリンカーによって接続されており、および／またはＦａｂ鎖とｓｃＦｖはペプチドリンカーによって接続されている。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖ部分のＶＨドメインとＶＬドメインは、アミノ酸配列（Ｇ４Ｓ）ｘを含むペプチドリンカーによって接続されており、ｘは２、３、４、５または６である。いくつかの実施形態では、Ｆａｂ鎖とｓｃＦｖは、アミノ酸配列ＳＧＰＧ３ＲＳ（Ｇ４Ｓ）２またはＤＶＰＧ２Ｓを含むペプチドリンカーによって接続されている。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列ＳＧＰＧ３ＲＳ（Ｇ４Ｓ）２を含むリンカーは、ｓｃＦｖ結合ドメインをＦｄ断片に接続し、アミノ酸配列ＤＶＰＧ２Ｓを含むリンカーは、ｓｃＦｖ結合ドメインをＬ断片に接続する。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖ部分はＣＬＤＮ６に結合し、Ｆａｂ部分はＣＤ３に結合する。
「リンカー」という用語は、２つの異なる機能単位（例えば抗原結合部分）を結合するのに役立つ任意の手段を指す。リンカーの種類には、化学的リンカーおよびポリペプチドリンカーが含まれるが、これらに限定されない。ポリペプチドリンカーの配列は限定されない。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、好ましくは非免疫原性で、柔軟であり、例えばセリンおよびグリシン配列を含むものである。特定の構築物に依存して、リンカーは長くても短くてもよい。
いくつかの実施形態では、ＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＨ ｓｃＦｖドメインを形成するためにＶＨドメインとＶＬドメインとを接続するリンカーは、好ましくは、グリシン－セリンペプチドリンカーなどの柔軟なペプチドリンカーを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列（Ｇ４Ｓ）ｘを含み、ｘは、２、３、４、５または６である。いくつかの実施形態では、ＶＨ－ＶＬ配向でＶＨドメインおよびＶＬドメインを含むｓｃＦｖドメインの場合、リンカーはアミノ酸配列（Ｇ４Ｓ）４を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬ－ＶＨ配向でＶＨドメインおよびＶＬドメインを含むｓｃＦｖドメインの場合、リンカーはアミノ酸配列（Ｇ４Ｓ）５を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖドメインとＦｄドメインとを接続するリンカーは、好ましくはＣＨ１のＣ末端に、アミノ酸配列ＤＶＰＧ２ＳまたはＳＧＰＧ３ＲＳ（Ｇ４Ｓ）２、好ましくはＳＧＰＧ３ＲＳ（Ｇ４Ｓ）２を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖドメインとＬドメインとを接続するリンカーは、好ましくはＣＬのＣ末端に、好ましくはアミノ酸配列ＤＶＰＧ２ＳまたはＳＧＰＧ３ＲＳ（Ｇ４Ｓ）２、好ましくはＤＶＰＧ２Ｓを含む。
結合剤はまた、Ｎ末端分泌シグナルなどの分子の分泌を促進するためのアミノ酸配列、および／または分子の結合、精製もしくは検出を容易にする１つ以上のエピトープタグを含み得る。
いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載の結合剤のポリペプチド鎖の各々は、シグナルペプチドを含む。
そのようなシグナルペプチドは、典型的には約１５～３０アミノ酸の長さを示し、好ましくはポリペプチド鎖のＮ末端に位置する配列であるが、これに限定されない。本明細書で定義されるシグナルペプチドは、好ましくは、例えばＲＮＡによってコードされる１つ以上のポリペプチド鎖を、定義された細胞区画、好ましくは細胞表面、小胞体（ＥＲ）またはエンドソーム－リソソーム区画に輸送することを可能にする。
本明細書で定義されるシグナルペプチド配列には、免疫グロブリンのシグナルペプチド配列、例えば免疫グロブリン重鎖可変領域のシグナルペプチド配列または免疫グロブリン軽鎖可変領域のシグナルペプチド配列が含まれるが、これらに限定されず、免疫グロブリンはヒト免疫グロブリンであり得る。いくつかの実施形態では、シグナルペプチド配列は、ＭＨＣ分子、例えばＭＨＣクラスＩ分子のシグナルペプチド配列であり、ＭＨＣ分子はヒトＭＨＣ分子（ＨＬＡ分子）であり得る。
いくつかの実施形態では、分泌シグナルは、分泌経路の十分な通過および／または結合剤もしくはそのポリペプチド鎖の細胞外環境への分泌を可能にするシグナル配列（例えば、配列番号４のアミノ酸１～２６を含むアミノ酸配列）である。いくつかの実施形態では、分泌シグナル配列は切断可能であり、成熟結合剤から除去される。いくつかの実施形態では、分泌シグナル配列は、結合剤が産生される細胞または生物に関して選択される。
さらなる実施形態では、本明細書に記載の結合剤は、サイトカイン、免疫抑制剤、および／または免疫刺激分子などの１つ以上の治療部分に連結またはコンジュゲートされる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の結合剤は、第１の結合ドメインを含むＦａｂ抗体断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の結合剤は、第１の結合ドメインを含むＦａｂ抗体断片に共有結合的に連結された第２および第３の結合ドメインを含む２つのｓｃＦｖ抗体断片を含む。いくつかの実施形態では、結合剤は、Ｆａｂ抗体断片の各鎖のＣ末端に共有結合的に連結されたｓｃＦｖ抗体断片を含む。
本明細書に記載の結合剤のＣＨ１およびＣＬ配列は、それぞれ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含むがこれらに限定されない任意のアイソタイプのものであり得、１つ以上の突然変異または修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＨ１およびＣＬ配列のそれぞれは、ＩｇＧ１アイソタイプのものであるかまたはＩｇＧ１アイソタイプに由来し、任意で１つ以上の突然変異または修飾を有する。
本発明のいくつかの実施形態では、本明細書に記載の結合剤は、完全長抗体を含まない。本発明のいくつかの実施形態では、本明細書に記載の結合剤は、抗体のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含まない。本発明のいくつかの実施形態では、本明細書に記載の結合剤は、Ｆｃ領域を含まない。本発明のいくつかの実施形態では、本明細書に記載の結合剤は、エフェクタ機能を発揮することができるＦｃ配列を含まない。
本発明の文脈における「エフェクタ機能」という用語は、例えば、腫瘍細胞などの疾患細胞の死滅、または腫瘍の播種および転移の阻害を含む腫瘍増殖の阻害および／もしくは腫瘍発生の阻害をもたらす免疫系の成分によって媒介される任意の機能を含む。好ましくは、本発明の文脈におけるエフェクタ機能は、Ｔ細胞媒介エフェクタ機能である。そのような機能は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰまたはＣＤＣを含む。
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、細胞傷害性顆粒の内容物の放出または細胞死誘導分子の発現を特徴とする、非食作用プロセスを介した細胞傷害性エフェクタ細胞による抗体被覆標的細胞の死滅である。ＡＤＣＣは、同じく標的を溶解するが他の細胞を必要としない免疫補体系とは無関係である。ＡＤＣＣは、標的結合抗体（ＩｇＧまたはＩｇＡまたはＩｇＥクラスに属する）と、免疫グロブリン（Ｉｇ）のＦｃ領域に結合するエフェクタ細胞表面上に存在する糖タンパク質である特定のＦｃ受容体（ＦｃＲ）との相互作用によって引き起こされる。ＡＤＣＣを媒介するエフェクタ細胞には、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、マクロファージ、好中球、好酸球および樹状細胞が含まれる。ＡＤＣＣは、その有効性が多くのパラメータ（標的細胞の表面上の抗原の密度および安定性；抗体親和性およびＦｃＲ結合親和性）に依存する迅速なエフェクタ機構である。治療用抗体に最も使用されているＩｇＧサブクラスであるヒトＩｇＧ１が関与するＡＤＣＣは、そのＦｃ部分のグリコシル化プロファイルおよびＦｃγ受容体の多型に高度に依存する。
抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）は、多くの抗体療法の重要な作用機序の１つである。これは、抗体が、そのＦｃドメインを食細胞上の特異的受容体に接続し、食作用を誘発することによって、結合した標的を排除する高度に調節されたプロセスとして定義される。ＡＤＣＣとは異なり、ＡＤＣＰは、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＩａを介して、単球、マクロファージ、好中球および樹状細胞によって媒介され得、そのうちのマクロファージ上のＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）が主要な経路である。
補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）は、抗体によって誘導され得る別の細胞死滅方法である。ＩｇＭは、補体活性化のための最も有効なアイソタイプである。ＩｇＧ１およびＩｇＧ３も、両方とも古典的補体活性化経路を介してＣＤＣを誘導するのに非常に有効である。好ましくは、このカスケードにおいて、抗原抗体複合体の形成は、ＩｇＧ分子などの関与する抗体分子のＣＨ２ドメイン上にごく近接した複数のＣ１ｑ結合部位の露出をもたらす（Ｃ１ｑは補体Ｃ１の３つのサブコンポーネントの１つである）。好ましくは、これらの露出されたＣ１ｑ結合部位は、それまでの低親和性のＣ１ｑ－ＩｇＧ相互作用を高アビディティのものに変換し、一連の他の補体タンパク質が関与する事象のカスケードを誘発し、エフェクタ細胞走化性／活性化物質Ｃ３ａおよびＣ５ａのタンパク質分解性放出をもたらす。好ましくは、補体カスケードは、細胞内および細胞外への水および溶質の自由な通過を促進する細胞膜の孔を作り出す、膜侵襲複合体の形成で終了する。
いくつかの実施形態では、結合剤は、ＣＤ３に特異性を有する結合ドメインおよびＣＬＤＮ６に特異性を有する２つの結合ドメインを形成する２つのポリペプチド鎖を含む。いくつかの実施形態では、２つのポリペプチド鎖は、２つのＲＮＡ分子によってコードされる。いくつかの実施形態では、結合剤は、２つのポリペプチド鎖で構成される二量体であり、第１のポリペプチドは、免疫グロブリンの重鎖の定常領域１（ＣＨ１）を介してさらなるＶＨドメインに連結されたＣＬＤＮ６に特異的なｓｃＦｖを含み、第２のポリペプチドは、免疫グロブリンの軽鎖の定常領域（ＣＬ）を介してさらなるＶＬドメインに連結されたＣＬＤＮ６に特異的なｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、２つのポリペプチド鎖は、ジスルフィド架橋によって共に結合される。ジスルフィド架橋は、好ましくは、ＣＨ１ドメイン中のＣｙｓ残基とＣＬドメイン中のＣｙｓ残基との間に形成され、その結果、第１のポリペプチドのさらなるＶＨドメインは、ＣＤ３結合配置で第２のポリペプチドのさらなるＶＬドメインと会合し、その結果、結合剤は全体として３つの抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３に特異的な結合ドメインはＦａｂ断片に含まれ、ＣＬＤＮ６に特異的な結合ドメインはそれぞれｓｃＦｖに含まれる。いくつかの実施形態では、Ｆａｂ断片の各鎖は１つのｓｃＦｖに連結されており、ｓｃＦｖは、好ましくはＦａｂ断片のＣ末端に連結されている。本発明によれば、ｓｃＦｖ部分のＶＨドメインとＶＬドメインは、好ましくはアミノ酸配列（Ｇ４Ｓ）４を含むペプチドリンカーなどのペプチドリンカーによって接続されており、Ｆａｂ鎖とｓｃＦｖは、好ましくはアミノ酸配列ＳＧＰＧ３ＲＳ（Ｇ４Ｓ）２またはＤＶＰＧ２Ｓを含むペプチドリンカーなどのペプチドリンカーによって接続されている。
いくつかの実施形態では、結合剤は、（ｉ）ＣＤ３に特異性を有する免疫グロブリンに由来する重鎖の可変領域（ＶＨ）（ＶＨ（ＣＤ３））、ＣＬＤＮ６に特異性を有する免疫グロブリンに由来するＶＨ（ＶＨ（ＣＬＤＮ６））、およびＣＬＤＮ６に特異性を有する免疫グロブリンに由来する軽鎖の可変領域（ＶＬ）（ＶＬ（ＣＬＤＮ６））を含む第１のポリペプチド鎖；ならびに（ｉｉ）ＣＤ３に特異性を有する免疫グロブリンに由来する軽鎖の可変領域（ＶＬ）（ＶＬ（ＣＤ３））、ＣＬＤＮ６に特異性を有する免疫グロブリンに由来するＶＨ（ＶＨ（ＣＬＤＮ６））およびＣＬＤＮ６に特異性を有する免疫グロブリンに由来する軽鎖の可変領域（ＶＬ）（ＶＬ（ＣＬＤＮ６））を含む第２のポリペプチド鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、第２のポリペプチド鎖と相互作用して結合剤を形成する。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖のＶＨ（ＣＤ３）と第２のポリペプチド鎖のＶＬ（ＣＤ３）は相互作用して、ＣＤ３に特異性を有する結合ドメインを形成する。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖のＶＨ（ＣＬＤＮ６）とＶＬ（ＣＬＤＮ６）は相互作用して、ＣＬＤＮ６に特異性を有する結合ドメインを形成する。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチド鎖のＶＨ（ＣＬＤＮ６）とＶＬ（ＣＬＤＮ６）は相互作用して、ＣＬＤＮ６に特異性を有する結合ドメインを形成する。いくつかの実施形態では、第１および第２のポリペプチド鎖は、免疫グロブリンまたはその機能的変異体に由来する重鎖の定常領域１（ＣＨ１）と、免疫グロブリンまたはその機能的変異体に由来する軽鎖の定常領域（ＣＬ）とを含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンはＩｇＧ１である。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１はヒトＩｇＧ１である。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖上のＶＨ、ＶＬ、およびＣＨ１は、
ＶＨ（ＣＤ３）－ＣＨ１－ＶＨ（ＣＬＤＮ６）－ＶＬ（ＣＬＤＮ６）、または
ＶＨ（ＣＤ３）－ＣＨ１－ＶＬ（ＣＬＤＮ６）－ＶＨ（ＣＬＤＮ６）
の順序でＮ末端からＣ末端へと配置される。
いくつかの実施形態では、ＣＨ１は、ペプチドリンカーによってＶＨ（ＣＬＤＮ６）またはＶＬ（ＣＬＤＮ６）に接続されている。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＳＧＰＧＧＧＲＳ（Ｇ４Ｓ）２またはその機能的変異体を含む。
いくつかの実施形態では、第２のポリペプチド鎖上のＶＨ、ＶＬ、およびＣＬは、
ＶＬ（ＣＤ３）－ＣＬ－ＶＨ（ＣＬＤＮ６）－ＶＬ（ＣＬＤＮ６）、または
ＶＬ（ＣＤ３）－ＣＬ－ＶＬ（ＣＬＤＮ６）－ＶＨ（ＣＬＤＮ６）
の順序でＮ末端からＣ末端へと配置される。
いくつかの実施形態では、ＣＬは、ペプチドリンカーによってＶＨ（ＣＬＤＮ６）またはＶＬ（ＣＬＤＮ６）に接続されている。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＤＶＰＧＧＳまたはその機能的変異体を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＨ（ＣＬＤＮ６）およびＶＬ（ＣＬＤＮ６）は、ペプチドリンカーによって互いに接続されている。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列（Ｇ４Ｓ）ｘまたはその機能的変異体を含み、ｘは、２、３、４、５または６である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列（Ｇ４Ｓ）４またはその機能的変異体を含む。
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖上のＣＨ１は、第２のポリペプチド鎖上のＣＬと相互作用する。
いくつかの実施形態では、ＣＨ１は、配列番号４のアミノ酸１４６～２４８のアミノ酸配列またはその機能的変異体を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＬは、配列番号６のアミノ酸１３３～２３９のアミノ酸配列またはその機能的変異体を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＨ（ＣＤ３）は、配列番号４のアミノ酸２７～１４５のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３（それぞれ配列番号１８、１９および２０）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ（ＣＤ３）は、アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＲＹＴまたはその機能的変異体を含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＮＰＳＲＧＹＴまたはその機能的変異体を含むＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＡＲＹＹＤＤＨＹＳＬＤＹまたはＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹまたはその機能的変異体を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ（ＣＤ３）は、配列番号４のアミノ酸２７～１４５のアミノ酸配列またはその機能的変異体を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＬ（ＣＤ３）は、配列番号６のアミノ酸２７～１３２のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３（それぞれ配列番号２２、２３および２４）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬ（ＣＤ３）は、アミノ酸配列ＳＳＶＳＹまたはその機能的変異体を含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＤＴＳまたはその機能的変異体を含むＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＱＱＷＳＳＮＰＬＴまたはその機能的変異体を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬ（ＣＤ３）は、配列番号６のアミノ酸２７～１３２のアミノ酸配列またはその機能的変異体を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＨ（ＣＬＤＮ６）は、配列番号４のアミノ酸２６７～３８３のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３（それぞれ配列番号２５、２６および２７）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ（ＣＬＤＮ６）は、アミノ酸配列ＧＹＳＦＴＧＹＴまたはその機能的変異体を含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＮＰＹＮＧＧＴまたはその機能的変異体を含むＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＡＲＤＹＧＦＶＬＤＹまたはその機能的変異体を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ（ＣＬＤＮ６）は、配列番号４のアミノ酸２６７～３８３のアミノ酸配列またはその機能的変異体を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＬ（ＣＬＤＮ６）は、配列番号４のアミノ酸４０４～５１０のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３（それぞれ配列番号２８、２９および３０）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬ（ＣＬＤＮ６）は、アミノ酸配列ＳＳＶＳＹまたはその機能的変異体を含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＳＴＳまたはその機能的変異体を含むＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＱＱＲＳＮＹＰＰＷＴまたはその機能的変異体を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬ（ＣＬＤＮ６）は、配列番号４のアミノ酸４０４～５１０のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびにＣＤＲ１に対して＋１５の位置のセリン残基（配列番号４の４４９位に対応する）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬ（ＣＬＤＮ６）は、配列番号４のアミノ酸４０４～５１０のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびにＣＤＲ２に対して－３の位置のセリン残基（配列番号４の４４９位に対応する）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬ（ＣＬＤＮ６）は、配列番号４のアミノ酸４０４～５１０のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、配列番号４のアミノ酸４０４～５１０のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、または８０％の同一性を有する配列、ならびに配列番号４の４４９位に対応する位置のセリン残基を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬ（ＣＬＤＮ６）は、配列番号４のアミノ酸４０４～５１０のアミノ酸配列またはその機能的変異体を含む。
ＣＤＲ１に対して＋１５の位置のセリン残基とは、ＣＤＲ１の末端から数えて１５番目のアミノ酸位置がセリン残基であることを意味する。ＣＤＲ２に対して－３の位置のセリン残基とは、ＣＤＲ２の開始前の３番目のアミノ酸がセリンであることを意味する。これらは、例えば、以下（ＮからＣへ）：ＸＸＸＸＸ－Ｙ１４－ＳおよびＳ－Ｙ２－ＺＺＺによってそれぞれ表すことができ、ＸはＣＤＲ１アミノ酸を表し、ＹはＣＤＲ間の介在アミノ酸を表し、Ｓはセリン残基を表し、ＺはＣＤＲ２アミノ酸を表す。
いくつかの実施形態では、ＶＨ（ＣＤ３）は、配列番号４のアミノ酸２７～１４５のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＶＬ（ＣＤ３）は、配列番号６のアミノ酸２７～１３２のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＶＨ（ＣＬＤＮ６）は、配列番号４のアミノ酸２６７～３８３のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＶＬ（ＣＬＤＮ６）は、配列番号４のアミノ酸４０４～５１０のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、好ましくはＶＬ（ＣＬＤＮ６）は、ＣＤＲ１に対して＋１５の位置のセリン残基（配列番号４の４４９位に対応する）および／またはＣＤＲ２に対して－３の位置のセリン残基（配列番号４の４４９位に対応する）を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＨ（ＣＤ３）は、配列番号４のアミノ酸２７～１４５のアミノ酸配列もしくはその機能的変異体を含み、ＶＬ（ＣＤ３）は、配列番号６のアミノ酸２７～１３２のアミノ酸配列もしくはその機能的変異体を含み、ＶＨ（ＣＬＤＮ６）は、配列番号４のアミノ酸２６７～３８３のアミノ酸配列もしくはその機能的変異体を含み、および／またはＶＬ（ＣＬＤＮ６）は、配列番号４のアミノ酸４０４～５１０のアミノ酸配列もしくはその機能的変異体を含む。
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号４のアミノ酸２７～５１０のアミノ酸配列、配列番号４のアミノ酸２７～５１０のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号４のアミノ酸２７～５１０のアミノ酸配列もしくは配列番号４のアミノ酸２７～５１０のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列の機能的断片を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号４のアミノ酸２７～５１０のアミノ酸配列を含む。
これらおよび他の実施形態では、第１のポリペプチド鎖をコードするＲＮＡは、配列番号５のヌクレオチド１３２～１５８３のヌクレオチド配列、配列番号５のヌクレオチド１３２～１５８３のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列、または配列番号５のヌクレオチド１３２～１５８３のヌクレオチド配列もしくは配列番号５のヌクレオチド１３２～１５８３のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列の機能的断片を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖をコードするＲＮＡは、配列番号５のヌクレオチド１３２～１５８３のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６のアミノ酸２７～４８９のアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸２７～４８９のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号６のアミノ酸２７～４８９のアミノ酸配列もしくは配列番号６のアミノ酸２７～４８９のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列の機能的断片を含む。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６のアミノ酸２７～４８９のアミノ酸配列を含む。
これらおよび他の実施形態では、第２のポリペプチド鎖をコードするＲＮＡは、配列番号７のヌクレオチド１３２～１５２０のヌクレオチド配列、配列番号７のヌクレオチド１３２～１５２０のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列、または配列番号７のヌクレオチド１３２～１５２０のヌクレオチド配列もしくは配列番号７のヌクレオチド１３２～１５２０のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列の機能的断片を含む。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチド鎖をコードするＲＮＡは、配列番号７のヌクレオチド１３２～１５２０のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、（ｉ）第１のポリペプチド鎖は、配列番号４のアミノ酸２７～５１０のアミノ酸配列、配列番号４のアミノ酸２７～５１０のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号４のアミノ酸２７～５１０のアミノ酸配列もしくは配列番号４のアミノ酸２７～５１０のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列の機能的断片を含み、および（ｉｉ）第２のポリペプチド鎖は、配列番号６のアミノ酸２７～４８９のアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸２７～４８９のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号６のアミノ酸２７～４８９のアミノ酸配列もしくは配列番号６のアミノ酸２７～４８９のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列の機能的断片を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号４のアミノ酸２７～５１０のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６のアミノ酸２７～４８９のアミノ酸配列を含む。
これらおよび他の実施形態では、（ｉ）第１のポリペプチド鎖をコードするＲＮＡは、配列番号５のヌクレオチド１３２～１５８３のヌクレオチド配列、配列番号５のヌクレオチド１３２～１５８３のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列、または配列番号５のヌクレオチド１３２～１５８３のヌクレオチド配列もしくは配列番号５のヌクレオチド１３２～１５８３のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列の機能的断片を含み、および（ｉｉ）第２のポリペプチド鎖をコードするＲＮＡは、配列番号７のヌクレオチド１３２～１５２０のヌクレオチド配列、配列番号７のヌクレオチド１３２～１５２０のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列、または配列番号７のヌクレオチド１３２～１５２０のヌクレオチド配列もしくは配列番号７のヌクレオチド１３２～１５２０のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列の機能的断片を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖をコードするＲＮＡは、配列番号５のヌクレオチド１３２～１５８３のヌクレオチド配列を含み、第２のポリペプチド鎖をコードするＲＮＡは、配列番号７のヌクレオチド１３２～１５２０のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態によれば、シグナルペプチドは、直接またはリンカーを介して、本明細書に記載のポリペプチド鎖に融合される。したがって、いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、上記のアミノ酸配列に融合される。
いくつかの実施形態では、シグナル配列は、配列番号４のアミノ酸１～２６のアミノ酸配列、配列番号４のアミノ酸１～２６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号４のアミノ酸１～２６のアミノ酸配列もしくは配列番号４のアミノ酸１～２６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列の機能的断片を含む。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、配列番号４のアミノ酸１～２６のアミノ酸配列を含む。
これらおよび他の実施形態では、シグナル配列（ｉ）をコードするＲＮＡは、配列番号５のヌクレオチド５４～１３１のヌクレオチド配列、配列番号５のヌクレオチド５４～１３１のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列、または配列番号５のヌクレオチド５４～１３１のヌクレオチド配列もしくは配列番号５のヌクレオチド５４～１３１のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列の機能的断片を含む。いくつかの実施形態では、シグナル配列をコードするＲＮＡは、配列番号５のヌクレオチド５４～１３１のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号４のアミノ酸配列、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号４のアミノ酸配列もしくは配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列の機能的断片を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号４のアミノ酸配列を含む。
これらおよび他の実施形態では、第１のポリペプチド鎖をコードするＲＮＡは、配列番号５のヌクレオチド５４～１５８３のヌクレオチド配列、配列番号５のヌクレオチド５４～１５８３のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列、または配列番号５のヌクレオチド５４～１５８３のヌクレオチド配列もしくは配列番号５のヌクレオチド５４～１５８３のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列の機能的断片を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖をコードするＲＮＡは、配列番号５のヌクレオチド５４～１５８３のヌクレオチド配列を含む。
さらなる実施形態では、第１のポリペプチド鎖をコードするＲＮＡは、配列番号５のヌクレオチド配列、配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列、または配列番号５のヌクレオチド配列もしくは配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列の機能的断片を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖をコードするＲＮＡは、配列番号５のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６のアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号６のアミノ酸配列もしくは配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列の機能的断片を含む。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６のアミノ酸配列を含む。
これらおよび他の実施形態では、第２のポリペプチド鎖をコードするＲＮＡは、配列番号７のヌクレオチド５４～１５２０のヌクレオチド配列、配列番号７のヌクレオチド５４～１５２０のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列、または配列番号７のヌクレオチド５４～１５２０のヌクレオチド配列もしくは配列番号７のヌクレオチド５４～１５２０のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列の機能的断片を含む。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチド鎖をコードするＲＮＡは、配列番号７のヌクレオチド５４～１５２０のヌクレオチド配列を含む。
さらなる実施形態では、第２のポリペプチド鎖をコードするＲＮＡは、配列番号７のヌクレオチド配列、配列番号７のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列、または配列番号７のヌクレオチド配列もしくは配列番号７のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列の機能的断片を含む。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチド鎖をコードするＲＮＡは、配列番号７のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、（ｉ）第１のポリペプチド鎖は、配列番号４のアミノ酸配列、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号４のアミノ酸配列もしくは配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列の機能的断片を含み、および（ｉｉ）第２のポリペプチド鎖は、配列番号６のアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号６のアミノ酸配列もしくは配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列の機能的断片を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖は配列番号４のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は配列番号６のアミノ酸配列を含む。
これらおよび他の実施形態では、（ｉ）第１のポリペプチド鎖をコードするＲＮＡは、配列番号５のヌクレオチド５４～１５８３のヌクレオチド配列、配列番号５のヌクレオチド５４～１５８３のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列、または配列番号５のヌクレオチド５４～１５８３のヌクレオチド配列もしくは配列番号５のヌクレオチド５４～１５８３のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列の機能的断片を含み、および（ｉｉ）第２のポリペプチド鎖をコードするＲＮＡは、配列番号７のヌクレオチド５４～１５２０のヌクレオチド配列、配列番号７のヌクレオチド５４～１５２０のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列、または配列番号７のヌクレオチド５４～１５２０のヌクレオチド配列もしくは配列番号７のヌクレオチド５４～１５２０のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列の機能的断片を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖をコードするＲＮＡは、配列番号５のヌクレオチド５４～１５８３のヌクレオチド配列を含み、第２のポリペプチド鎖をコードするＲＮＡは、配列番号７のヌクレオチド５４～１５２０のヌクレオチド配列を含む。
さらなる実施形態では、（ｉ）第１のポリペプチド鎖をコードするＲＮＡは、配列番号５のヌクレオチド配列、配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列、または配列番号５のヌクレオチド配列もしくは配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列の機能的断片を含み、および（ｉｉ）第２のポリペプチド鎖をコードするＲＮＡは、配列番号７のヌクレオチド配列、配列番号７のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列、または配列番号７のヌクレオチド配列もしくは配列番号７のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列の機能的断片を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖をコードするＲＮＡは配列番号５のヌクレオチド配列を含み、第２のポリペプチド鎖をコードするＲＮＡは配列番号７のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、結合剤は、ＣＬＤＮ６の細胞外ドメインに結合する。いくつかの実施形態では、結合剤は、生細胞の表面に存在するＣＬＤＮ６の天然エピトープに結合する。いくつかの実施形態では、結合剤は、ＣＬＤＮ６の第１の細胞外ループに結合する。
本明細書に記載の結合剤は、ＣＬＤＮ６に特異的である、すなわち、ＣＬＤＮ６に結合する能力、すなわち、ＣＬＤＮ６に存在するエピトープ、好ましくはＣＬＤＮ６の細胞外ドメイン、特に第１の細胞外ループ、好ましくはＣＬＤＮ６のアミノ酸位置２８～７６もしくは２９～８１、または第２の細胞外ループ、好ましくはＣＬＤＮ６のアミノ酸位置１４１～１５９内に位置するエピトープに結合する能力を有する。いくつかの実施形態では、ＣＬＤＮ６に結合する能力を有する薬剤は、ＣＬＤＮ９上には存在しないＣＬＤＮ６上のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、ＣＬＤＮ６に結合する能力を有する薬剤は、ＣＬＤＮ４および／またはＣＬＤＮ３上には存在しないＣＬＤＮ６上のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、ＣＬＤＮ６に結合する能力を有する薬剤は、ＣＬＤＮ６以外のクローディンタンパク質上には存在しないＣＬＤＮ６上のエピトープに結合する。
いくつかの実施形態では、ＣＬＤＮ６に結合する能力を有する薬剤は、好ましくはＣＬＤＮ６に結合するがＣＬＤＮ９には結合せず、好ましくはＣＬＤＮ４および／またはＣＬＤＮ３には結合しない。いくつかの実施形態では、ＣＬＤＮ６に結合する能力を有する薬剤は、細胞表面に発現されたＣＬＤＮ６に結合する。いくつかの実施形態では、ＣＬＤＮ６に結合する能力を有する薬剤は、生細胞の表面に存在するＣＬＤＮ６の天然エピトープに結合する。
「細胞表面に発現された」または「細胞表面と会合した」という用語は、抗原などの分子が細胞の原形質膜と会合して位置し、分子の少なくとも一部が前記細胞の細胞外空間に面しており、例えば細胞の外側に位置する抗体によって前記細胞の外側からアクセス可能であることを意味する。これに関連して、一部とは、好ましくは少なくとも４個、好ましくは少なくとも８個、好ましくは少なくとも１２個、より好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸である。会合は、直接的であっても間接的であってもよい。例えば、会合は、１つ以上の膜貫通ドメイン、１つ以上の脂質アンカーによるものであってもよく、または他の任意のタンパク質、脂質、サッカリド、もしくは細胞の原形質膜の外葉に見出され得る他の構造との相互作用によるものであってもよい。例えば、細胞の表面と会合する分子は、細胞外部分を有する膜貫通タンパク質であってもよく、または膜貫通タンパク質である別のタンパク質と相互作用することによって細胞の表面と会合するタンパク質であってもよい。
「細胞表面」または「細胞の表面」は、当技術分野におけるその通常の意味に従って使用され、したがって、タンパク質および他の分子による結合にアクセス可能な細胞の外側を含む。抗原は、細胞の表面に位置し、例えば細胞に添加された抗原特異的抗体による結合にアクセス可能である場合、前記細胞の表面に発現される。
本発明の文脈における「細胞外部分」または「エキソドメイン」という用語は、細胞の細胞外空間に面しており、好ましくは、例えば細胞の外側に位置する抗体などの分子に結合することによって、前記細胞の外側からアクセス可能であるタンパク質などの分子の一部を指す。好ましくは、この用語は、１つ以上の細胞外ループもしくはドメインまたはその断片を指す。
核酸
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、組換え生産された分子および化学合成された分子などのＤＮＡおよびＲＮＡを含むことが意図されている。核酸は、一本鎖または二本鎖であり得る。ＲＮＡは、インビトロ転写されたＲＮＡ（ＩＶＴ ＲＮＡ）または合成ＲＮＡを含む。本発明によれば、ポリヌクレオチドは、好ましくは単離されている。
核酸は、ベクターに含まれ得る。本明細書で使用される「ベクター」という用語は、プラスミドベクター、コスミドベクター、ラムダファージなどのファージベクター、レトロウイルス、アデノウイルスもしくはバキュロウイルスベクターなどのウイルスベクター、または細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）もしくはＰ１人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体ベクターを含む、当業者に公知の任意のベクターを含む。前記ベクターは、発現ベクターおよびクローニングベクターを含む。発現ベクターは、プラスミドおよびウイルスベクターを含み、一般に、所望のコード配列および特定の宿主生物（例えば、細菌、酵母、植物、昆虫もしくは哺乳動物）またはインビトロ発現系における作動可能に連結されたコード配列の発現に必要な適切なＤＮＡ配列を含む。クローニングベクターは、一般に、特定の所望のＤＮＡ断片を操作および増幅するために使用され、所望のＤＮＡ断片の発現に必要な機能的配列を欠いていてもよい。
本発明の全ての態様のいくつかの実施形態では、本明細書に記載の結合剤、例えば二重特異性または多重特異性結合剤をコードするＲＮＡは、処置された対象の細胞（例えば肝細胞）で発現されて結合剤を提供する。
本明細書に記載の核酸は、組換えおよび／または単離された分子であり得る。
本開示では、「ＲＮＡ」という用語は、リボヌクレオチド残基を含む核酸分子に関する。好ましい実施形態では、ＲＮＡは、リボヌクレオチド残基の全部または大部分を含む。本明細書で使用される場合、「リボヌクレオチド」は、β－Ｄ－リボフラノシル基の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを指す。ＲＮＡは、限定されないが、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的に精製されたＲＮＡなどの単離されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え生産されたＲＮＡ、ならびに１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または改変によって天然に存在するＲＮＡとは異なる修飾ＲＮＡを包含する。そのような改変は、内部ＲＮＡヌクレオチドへの、またはＲＮＡの末端（一方もしくは両方）への非ヌクレオチド物質の付加を指し得る。本明細書では、ＲＮＡ中のヌクレオチドが、化学合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドなどの非標準ヌクレオチドであり得ることも企図される。本開示では、これらの改変されたＲＮＡは、天然に存在するＲＮＡの類似体と見なされる。
本開示のいくつかの実施形態では、ＲＮＡは、ペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ転写物に関連するメッセンジャＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。当技術分野で確立されているように、ｍＲＮＡは、一般に、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）、ペプチドコード領域および３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、インビトロ転写または化学合成によって生成される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型を使用するインビトロ転写によって生成され、ここで、ＤＮＡは、デオキシリボヌクレオチドを含む核酸を指す。
本開示のいくつかの実施形態では、ＲＮＡは、「レプリコンＲＮＡ」または単に「レプリコン」、特に「自己複製ＲＮＡ」または「自己増幅ＲＮＡ」である。特に好ましい一実施形態では、レプリコンまたは自己複製ＲＮＡは、ｓｓＲＮＡウイルス、特にアルファウイルスなどのプラス鎖ｓｓＲＮＡウイルスに由来するか、またはそれに由来する要素を含む。アルファウイルスは、プラス鎖ＲＮＡウイルスの典型的な代表例である。アルファウイルスは、感染細胞の細胞質で複製する（アルファウイルスの生活環の総説については、Ｊｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００９，ｖｏｌ．４，ｐｐ．８３７－８５６を参照）。多くのアルファウイルスの全ゲノム長は、典型的には１１，０００～１２，０００ヌクレオチドの範囲であり、ゲノムＲＮＡは、典型的には５’キャップおよび３’ポリ（Ａ）尾部を有する。アルファウイルスのゲノムは、非構造タンパク質（ウイルスＲＮＡの転写、修飾および複製ならびにタンパク質修飾に関与する）および構造タンパク質（ウイルス粒子を形成する）をコードする。典型的には、ゲノム中に２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在する。４つの非構造タンパク質（ｎｓＰ１～ｎｓＰ４）は、典型的には、ゲノムの５’末端付近から始まる第１のＯＲＦによって一緒にコードされ、一方アルファウイルスの構造タンパク質は、第１のＯＲＦの下流に見出され、ゲノムの３’末端付近に延びる第２のＯＲＦによって一緒にコードされる。典型的には、第１のＯＲＦは第２のＯＲＦよりも大きく、比率はおよそ２：１である。アルファウイルスに感染した細胞では、非構造タンパク質をコードする核酸配列のみがゲノムＲＮＡから翻訳され、一方構造タンパク質をコードする遺伝情報は、真核生物のメッセンジャＲＮＡ（ｍＲＮＡ；Ｇｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．８７，ｐｐ．１１１－１２４）に類似したＲＮＡ分子であるサブゲノム転写物から翻訳可能である。感染後、すなわちウイルス生活環の初期段階に、（＋）鎖ゲノムＲＮＡは、非構造ポリタンパク質（ｎｓＰ１２３４）をコードするオープンリーディングフレームの翻訳のためにメッセンジャＲＮＡのように直接作用する。アルファウイルス由来のベクターは、外来遺伝情報を標的細胞または標的生物に送達するために提案されている。単純なアプローチでは、アルファウイルス構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを、目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームによって置き換える。アルファウイルスに基づくトランス複製系は、２つの別個の核酸分子上のアルファウイルスヌクレオチド配列要素に依存する：一方の核酸分子はウイルスレプリカーゼをコードし、他方の核酸分子はトランスで前記レプリカーゼによって複製されることができる（したがってトランス複製系という名称）。トランス複製は、所与の宿主細胞中にこれらの核酸分子の両方が存在することを必要とする。トランスでレプリカーゼによって複製され得る核酸分子は、アルファウイルスレプリカーゼによる認識およびＲＮＡ合成を可能にするために特定のアルファウイルス配列要素を含まなければならない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡは修飾ヌクレオシドを有し得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、少なくとも１つの（例えば全ての）ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。
本明細書で使用される「ウラシル」という用語は、ＲＮＡの核酸中に存在し得る核酸塩基の１つを表す。ウラシルの構造は：
Figure 2024525795000009
 である。
本明細書で使用される「ウリジン」という用語は、ＲＮＡ中に存在し得るヌクレオシドの１つを表す。ウリジンの構造は：
Figure 2024525795000010
 である。
ＵＴＰ（ウリジン５’－三リン酸）は、以下の構造：
Figure 2024525795000011
 を有する。
プソイドＵＴＰ（プソイドウリジン５’－三リン酸）は、以下の構造：
Figure 2024525795000012
 を有する。
「プソイドウリジン」は、ウリジンの異性体である修飾ヌクレオシドの一例であり、ウラシルは、窒素－炭素グリコシド結合の代わりに炭素－炭素結合を介してペントース環に結合している。
別の例示的な修飾ヌクレオシドはＮ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１Ψ）であり、これは、構造：
Figure 2024525795000013
 を有する。
Ｎ１－メチルプソイドＵＴＰは、以下の構造：
Figure 2024525795000014
 を有する。
別の例示的な修飾ヌクレオシドは５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）であり、これは、構造：
Figure 2024525795000015
 を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡ中の１つ以上のウリジンは、修飾ヌクレオシドで置き換えられる。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは修飾ウリジンである。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、少なくとも１つのウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）および５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）から独立して選択される。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドはプソイドウリジン（ψ）を含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドはＮ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）を含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、２種類以上の修飾ヌクレオシドを含んでもよく、修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）および５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）から独立して選択される。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）およびＮ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）を含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）および５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）を含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、Ｎ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）および５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）を含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）および５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ中の１つ以上、例えば全てのウリジンを置換する修飾ヌクレオシドは、３－メチルウリジン（ｍ３Ｕ）、５－メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－アザウリジン、６－アザウリジン、２－チオ－５－アザウリジン、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、４－チオウリジン（ｓ４Ｕ）、４－チオプソイドウリジン、２－チオプソイドウリジン、５－ヒドロキシウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５－アミノアリルウリジン、５－ハロウリジン（例えば５－ヨードウリジンもしくは５－ブロモウリジン）、ウリジン５－オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５－カルボキシメチルウリジン（ｃｍ５Ｕ）、１－カルボキシメチルプソイドウリジン、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－ウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５－アミノメチル－２－チオウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－メチルアミノメチルウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、１－エチルプソイドウリジン、５－メチルアミノメチル－２－チオウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－メチルアミノメチル－２－セレノウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５－カルバモイルメチル－ウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－プロピニルウリジン、１－プロピニルプソイドウリジン、５－タウリノメチルウリジン（τｍ５Ｕ）、１－タウリノメチルプソイドウリジン、５－タウリノメチル－２－チオウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１－タウリノメチル－４－チオプソイドウリジン）、５－メチル－２－チオウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、１－メチル－４－チオプソイドウリジン（ｍ１ｓ４Ψ）、４－チオ－１－メチルプソイドウリジン、３－メチルプソイドウリジン（ｍ３Ψ）、２－チオ－１－メチルプソイドウリジン、１－メチル－１－デアザプソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザプソイドウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロプソイドウリジン、５，６－ジヒドロウリジン、５－メチルジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２－チオジヒドロウリジン、２－チオジヒドロプソイドウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオウリジン、４－メトキシプソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオプソイドウリジン、Ｎ１－メチルプソイドウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）プソイドウリジン（ａｃｐ３Ψ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２－チオウリジン（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、α－チオウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジン（Ｕｍ）、５，２’－Ｏ－ジメチルウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２’－Ｏ－メチルプソイドウリジン（Ψｍ）、２－チオ－２’－Ｏ－メチルウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２’－Ｏ－ジメチルウリジン（ｍ３Ｕｍ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２’－Ｏ－メチルウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１－チオウリジン、デオキシチミジン、２’－Ｆ－アラウリジン、２’－Ｆ－ウリジン、２’－ＯＨ－アラウリジン、５－（２－カルボメトキシビニル）ウリジン、５－［３－（１－Ｅ－プロペニルアミノ）ウリジン、または当技術分野で公知の任意の他の修飾ウリジンのいずれか１つ以上であり得る。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、他の修飾ヌクレオシドを含むか、またはさらなる修飾ヌクレオシド、例えば修飾シチジンを含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＲＮＡにおいて、シチジンを５－メチルシチジンで部分的または完全に、好ましくは完全に置換する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、５－メチルシチジンと、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）および５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）から選択される１つ以上とを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、５－メチルシチジンおよびＮ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、各シチジンの代わりに５－メチルシチジンを含み、各ウリジンの代わりにＮ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）を含む。
いくつかの実施形態では、本開示によるＲＮＡは５’キャップを含む。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡは、キャップされていない５’－三リン酸を有さない。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、５’キャップ類似体によって修飾され得る。「５’キャップ」という用語は、ｍＲＮＡ分子の５’末端に見出される構造を指し、一般に、５’－５’三リン酸結合を介してｍＲＮＡに接続されたグアノシンヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、このグアノシンは７位でメチル化されている。ＲＮＡに５’キャップまたは５’キャップ類似体を提供することは、５’キャップがＲＮＡ鎖に共転写的に発現されるインビトロ転写によって達成され得るか、またはキャッピング酵素を使用して転写後にＲＮＡに結合され得る。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡのためのビルディングブロックキャップは、ｍ２ ７，３’－ＯＧｐｐｐ（ｍ１ ２’－Ｏ）ＡｐＧ（時にｍ２ ７，３’ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ｍ２’－ＯＡｐＧとも呼ばれる）であり、これは、以下の構造：
Figure 2024525795000016
 を有する。
以下は、ＲＮＡおよびｍ２ ７，３’ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ｍ２’－ＯＡｐＧを含む例示的なキャップ１ ＲＮＡである：
Figure 2024525795000017
以下は、別の例示的なキャップ１ ＲＮＡ（キャップ類似体なし）である：
Figure 2024525795000018
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、いくつかの実施形態では、構造：
Figure 2024525795000019
 を有するキャップ類似体アンチリバースキャップ（ＡＲＣＡキャップ（ｍ２ ７，３｀ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ））を使用して、「キャップ０」構造で修飾される。
以下は、ＲＮＡおよびｍ２ ７，３’ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇを含む例示的なキャップ０ ＲＮＡである：
Figure 2024525795000020
いくつかの実施形態では、「キャップ０」構造は、構造：
Figure 2024525795000021
 を有するキャップ類似体ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ（ｍ２ ７，２’ＯＧ（５’）ｐｐＳｐ（５’）Ｇ）を使用して生成される。
以下は、ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ（ｍ２ ７，２’ＯＧ（５’）ｐｐＳｐ（５’）Ｇ）およびＲＮＡを含む例示的なキャップ０ ＲＮＡである：
Figure 2024525795000022
ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡの「Ｄ１」ジアステレオマーまたは「ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）」は、ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡのＤ２ジアステレオマー（ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ２））と比較してＨＰＬＣカラムで最初に溶出し、したがってより短い保持時間を示すベータ－Ｓ－ＡＲＣＡのジアステレオマーである（参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１１／０１５３４７号を参照）。
特に好ましいキャップは、ｍ２ ７，３’－ＯＧｐｐｐ（ｍ１ ２’－Ｏ）ＡｐＧである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡ配列（例えば配列番号５および／または７）は、ｍ２ ７，３’－ＯＧｐｐｐ（ｍ１ ２’－Ｏ）ＡｐＧでキャップされる。いくつかの実施形態では、キャップのＡｐＧは、本明細書に記載のＲＮＡ配列の２つの５’ヌクレオチドに対応する。
いくつかの実施形態では、本開示によるＲＮＡは、５’－ＵＴＲおよび／または３’－ＵＴＲを含む。「非翻訳領域」または「ＵＴＲ」という用語は、転写されるがアミノ酸配列に翻訳されないＤＮＡ分子内の領域、またはｍＲＮＡ分子などのＲＮＡ分子内の対応する領域に関する。非翻訳領域（ＵＴＲ）は、オープンリーディングフレームの５’側（上流）（５’－ＵＴＲ）および／またはオープンリーディングフレームの３’側（下流）（３’－ＵＴＲ）に存在し得る。５’－ＵＴＲは、存在する場合、タンパク質コード領域の開始コドンの上流の５’末端に位置する。５’－ＵＴＲは５’キャップ（存在する場合）の下流にあり、例えば５’キャップに直接隣接している。３’－ＵＴＲは、存在する場合、タンパク質コード領域の終止コドンの下流の３’末端に位置するが、「３’－ＵＴＲ」という用語は、好ましくはポリ（Ａ）配列を含まない。したがって、３’－ＵＴＲはポリ（Ａ）配列（存在する場合）の上流にあり、例えばポリ（Ａ）配列に直接隣接している。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、配列番号８のヌクレオチド配列、または配列番号８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む５’－ＵＴＲを含む。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、配列番号９のヌクレオチド配列、または配列番号９のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む３’－ＵＴＲを含む。
特に好ましい５’－ＵＴＲは、配列番号８のヌクレオチド配列を含む。特に好ましい３’－ＵＴＲは、配列番号９のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示によるＲＮＡは、３’－ポリ（Ａ）配列を含む。
本発明で使用される場合、「ポリ（Ａ）配列」または「ポリＡ尾部」という用語は、典型的にはＲＮＡ分子の３’末端に位置するアデニル酸残基の連続的または断続的な配列を指す。ポリ（Ａ）配列は当業者に公知であり、本明細書に記載のＲＮＡの３’ＵＴＲに後続し得る。連続的なポリ（Ａ）配列は、連続するアデニル酸残基を特徴とする。自然界では、連続的なポリ（Ａ）配列が典型的である。本明細書に開示されるＲＮＡは、転写後に鋳型非依存性ＲＮＡポリメラーゼによってＲＮＡの遊離３’末端に結合されたポリ（Ａ）配列、またはＤＮＡによってコードされ、鋳型依存性ＲＮＡポリメラーゼによって転写されたポリ（Ａ）配列を有し得る。
約１２０個のＡヌクレオチドのポリ（Ａ）配列は、トランスフェクトされた真核細胞におけるＲＮＡのレベル、およびポリ（Ａ）配列の上流（５’側）に存在するオープンリーディングフレームから翻訳されるタンパク質のレベルに有益な影響を及ぼすことが実証されている（Ｈｏｌｔｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．１０８，ｐｐ．４００９－４０１７）。
ポリ（Ａ）配列は任意の長さであり得る。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも８０個、または少なくとも１００個、および最大５００個、最大４００個、最大３００個、最大２００個、または最大１５０個までのＡヌクレオチド、特に約１２０個のＡヌクレオチドを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。これに関連して、「から本質的になる」は、ポリ（Ａ）配列中のほとんどのヌクレオチド、典型的にはポリ（Ａ）配列中のヌクレオチドの数の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％がＡヌクレオチドであるが、残りのヌクレオチドが、Ｕヌクレオチド（ウリジル酸）、Ｇヌクレオチド（グアニル酸）、またはＣヌクレオチド（シチジル酸）などのＡヌクレオチド以外のヌクレオチドであることを許容することを意味する。これに関連して、「からなる」は、ポリ（Ａ）配列中の全てのヌクレオチド、すなわちポリ（Ａ）配列中のヌクレオチドの数の１００％がＡヌクレオチドであることを意味する。「Ａヌクレオチド」または「Ａ」という用語は、アデニル酸を指す。
いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、コード鎖に相補的な鎖中に反復ｄＴヌクレオチド（デオキシチミジル酸）を含むＤＮＡ鋳型に基づいて、ＲＮＡ転写中、例えばインビトロ転写ＲＮＡの調製中に結合される。ポリ（Ａ）配列をコードするＤＮＡ配列（コード鎖）は、ポリ（Ａ）カセットと呼ばれる。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡのコード鎖に存在するポリ（Ａ）カセットは、本質的にｄＡヌクレオチドからなるが、４つのヌクレオチド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、およびｄＴ）のランダムな配列によって中断されている。そのようなランダムな配列は、５～５０、１０～３０、または１０～２０ヌクレオチド長であり得る。そのようなカセットは、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１６／００５３２４ Ａ１号に開示されている。国際公開第２０１６／００５３２４ Ａ１号に開示されている任意のポリ（Ａ）カセットを本発明で使用し得る。本質的にｄＡヌクレオチドからなるが、４つのヌクレオチド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴ）が均等に分布し、例えば５～５０ヌクレオチドの長さを有するランダムな配列によって中断されているポリ（Ａ）カセットは、ＤＮＡレベルでは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるプラスミドＤＮＡの持続的な増殖を示し、ＲＮＡレベルでは、ＲＮＡの安定性および翻訳効率を支持することに関して有益な特性と依然として関連している。その結果として、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡ分子に含まれるポリ（Ａ）配列は、本質的にＡヌクレオチドからなるが、４つのヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）のランダムな配列によって中断されている。そのようなランダムな配列は、５～５０、１０～３０、または１０～２０ヌクレオチド長であり得る。
いくつかの実施形態では、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドは、その３’末端でポリ（Ａ）配列に隣接していない、すなわち、ポリ（Ａ）配列は、Ａ以外のヌクレオチドによってその３’末端でマスクされていないか、または後続されていない。
いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも８０個、または少なくとも１００個、および最大５００個、最大４００個、最大３００個、最大２００個、または最大１５０個までのヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、本質的に、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも８０個、または少なくとも１００個、および最大５００個、最大４００個、最大３００個、最大２００個、または最大１５０個までのヌクレオチドからなり得る。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも８０個、または少なくとも１００個、および最大５００個、最大４００個、最大３００個、最大２００個、または最大１５０個までのヌクレオチドからなり得る。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）配列は少なくとも１００個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）配列は約１５０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）配列は約１２０個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、配列番号１０のヌクレオチド配列、または配列番号１０のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリ（Ａ）配列を含む。
特に好ましいポリ（Ａ）配列は、配列番号１０のヌクレオチド配列を含む。
本開示によれば、結合剤は、好ましくは、ＲＮＡを投与されている対象の細胞に入るとそれぞれのタンパク質に翻訳される一本鎖５’キャップｍＲＮＡとして投与される。好ましくは、ＲＮＡは、安定性および翻訳効率に関するＲＮＡの最大の有効性のために最適化された構造要素（５’キャップ、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ、ポリ（Ａ）配列）を含む。
いくつかの実施形態では、ｍ２ ７，３’－ＯＧｐｐｐ（ｍ１ ２’－Ｏ）ＡｐＧをＲＮＡの５’－末端の特異的キャッピング構造として利用する。いくつかの実施形態では、５’－ＵＴＲ配列は、ヒトαグロビンｍＲＮＡに由来し、任意で、翻訳効率を高めるために最適化された「コザック配列」を有する。いくつかの実施形態では、「スプリットのアミノ末端エンハンサ」（ＡＥＳ）ｍＲＮＡ（Ｆと呼ばれる）およびミトコンドリアコード１２ＳリボソームＲＮＡ（Ｉと呼ばれる）に由来する２つの配列要素（ＦＩ要素）の組合せをコード配列とポリ（Ａ）配列との間に配置して、より高い最大タンパク質レベルおよびｍＲＮＡの長期持続性を確実にする。これらは、ＲＮＡの安定性を付与し、総タンパク質発現を増強する配列のエクスビボ選択プロセスによって同定された（参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１７／０６０３１４号を参照）。いくつかの実施形態では、３０個のアデノシン残基のストレッチと、それに続く１０個のヌクレオチドリンカー配列および別の７０個のアデノシン残基からなる、１１０ヌクレオチド長と測定されるポリ（Ａ）配列が使用される。このポリ（Ａ）配列は、ＲＮＡの安定性および翻訳効率を高めるように設計された。
本発明の全ての態様のいくつかの実施形態では、結合剤をコードするＲＮＡは、処置された対象の細胞、例えば肝細胞で発現されて結合剤を提供する。本発明の全ての態様のいくつかの実施形態では、ＲＮＡは、対象の細胞で一過性に発現される。本発明の全ての態様のいくつかの実施形態では、ＲＮＡはインビトロ転写ＲＮＡである。本発明の全ての態様のいくつかの実施形態では、結合剤の発現は細胞外空間内である、すなわち、結合剤は分泌される。本発明の全ての態様のいくつかの実施形態では、結合剤の発現は血流中である。
本開示の文脈において、「転写」という用語は、ＤＮＡ配列中の遺伝暗号がＲＮＡに転写されるプロセスに関する。その後、ＲＮＡはペプチドまたはタンパク質に翻訳され得る。
本発明によれば、「転写」という用語は「インビトロ転写」を含み、「インビトロ転写」という用語は、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡが、好ましくは適切な細胞抽出物を使用して、無細胞系においてインビトロで合成されるプロセスに関する。好ましくは、クローニングベクターが転写物の生成に適用される。これらのクローニングベクターは、一般に転写ベクターと呼ばれ、本発明によれば「ベクター」という用語に包含される。本発明によれば、本発明で使用されるＲＮＡは、好ましくはインビトロ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ－ＲＮＡ）であり、適切なＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって得られ得る。転写を制御するためのプロモータは、任意のＲＮＡポリメラーゼのための任意のプロモータであり得る。ＲＮＡポリメラーゼの特定の例は、Ｔ７、Ｔ３、およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼである。好ましくは、本発明によるインビトロ転写は、Ｔ７またはＳＰ６プロモータによって制御される。インビトロ転写のためのＤＮＡ鋳型は、核酸、特にｃＤＮＡをクローニングし、それをインビトロ転写のための適切なベクターに導入することによって得られ得る。ｃＤＮＡは、ＲＮＡの逆転写によって得られ得る。
ＲＮＡに関して、「発現」または「翻訳」という用語は、ｍＲＮＡの鎖がペプチドまたはタンパク質を作製するようにアミノ酸の配列のアセンブリを指示する、細胞のリボソームにおけるプロセスに関する。
いくつかの実施形態では、例えばＲＮＡ脂質粒子として製剤化された本明細書に記載のＲＮＡの投与（例えば静脈内投与）後、ＲＮＡの少なくとも一部が標的細胞（例えば肝細胞）に送達される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡの少なくとも一部が標的細胞のサイトゾルに送達される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、標的細胞によって翻訳されて、それがコードするペプチドまたはタンパク質を産生する。したがって、本開示はまた、本明細書に記載のＲＮＡ粒子を対象に投与することを含む、対象の標的細胞にＲＮＡを送達するための方法に関する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、標的細胞のサイトゾルに送達される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、標的細胞によって翻訳されて、ＲＮＡによってコードされたペプチドまたはタンパク質を産生する。
「コードする」は、定義されたヌクレオチドの配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）または定義されたアミノ酸の配列のいずれかを有する、生物学的プロセスにおける他のポリマーおよび高分子の合成のための鋳型として働く、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中の特定のヌクレオチド配列の固有の特性、およびそれから生じる生物学的特性を指す。したがって、ある遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が細胞または他の生物系においてタンパク質を産生する場合、その遺伝子はタンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常は配列表に提供されるコード鎖と、遺伝子またはｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される非コード鎖の両方が、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物をコードすると呼ばれ得る。
いくつかの実施形態では、本発明に従って投与される結合剤をコードするＲＮＡは、非免疫原性である。
本明細書で使用される「非免疫原性ＲＮＡ」という用語は、例えば哺乳動物への投与時に免疫系による応答を誘導しないか、または非免疫原性ＲＮＡを非免疫原性にする修飾および処理に供されていないという点においてのみ異なる同じＲＮＡによって誘導されるよりも弱い応答を誘導する、すなわち標準ＲＮＡ（ｓｔｄＲＮＡ）によって誘導されるよりも弱い応答を誘導するＲＮＡを指す。好ましい一実施形態では、本明細書において修飾ＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）とも呼ばれる非免疫原性ＲＮＡは、自然免疫受容体のＲＮＡ媒介活性化を抑制する修飾ヌクレオシドをＲＮＡに組み込み、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を除去することによって非免疫原性にされる。
修飾ヌクレオシドの組み込みによって非免疫原性ＲＮＡを非免疫原性にするために、ＲＮＡの免疫原性を低下させるまたは抑制する限り、任意の修飾ヌクレオシドを使用し得る。自然免疫受容体のＲＮＡ媒介活性化を抑制する修飾ヌクレオシドが特に好ましい。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドによる１つ以上のウリジンの置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は修飾ウラシルである。いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドは、３－メチル－ウリジン（ｍ３Ｕ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－アザ－ウリジン、６－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ウリジン（ｓ２Ｕ）、４－チオ－ウリジン（ｓ４Ｕ）、４－チオ－プソイドウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、５－ヒドロキシ－ウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５－アミノアリル－ウリジン、５－ハロ－ウリジン（例えば５－ヨード－ウリジンまたは５－ブロモ－ウリジン）、ウリジン５－オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５－カルボキシメチル－ウリジン（ｃｍ５Ｕ）、１－カルボキシメチル－プソイドウリジン、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－ウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオ－ウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５－アミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－メチルアミノメチル－ウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、１－エチル－プソイドウリジン、５－メチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－メチルアミノメチル－２－セレノ－ウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５－カルバモイルメチル－ウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－プソイドウリジン、５－タウリノメチル－ウリジン（τｍ５Ｕ）、１－タウリノメチル－プソイドウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１－タウリノメチル－４－チオ－プソイドウリジン、５－メチル－２－チオ－ウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、１－メチル－４－チオ－プソイドウリジン（ｍ１ｓ４Ψ）、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、３－メチル－プソイドウリジン（ｍ３Ψ）、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロプソイドウリジン、５，６－ジヒドロウリジン、５－メチル－ジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－メトキシ－ウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン、Ｎ１－メチル－プソイドウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）プソイドウリジン（ａｃｐ３Ψ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２－チオ－ウリジン（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、α－チオ－ウリジン、２’－Ｏ－メチル－ウリジン（Ｕｍ）、５，２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２’－Ｏ－メチル－プソイドウリジン（Ψｍ）、２－チオ－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン（ｍ３Ｕｍ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１－チオ－ウリジン、デオキシチミジン、２’－Ｆ－アラ－ウリジン、２’－Ｆ－ウリジン、２’－ＯＨ－アラ－ウリジン、５－（２－カルボメトキシビニル）ウリジン、および５－［３－（１－Ｅ－プロペニルアミノ）ウリジンからなる群より選択される。特に好ましい一実施形態では、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）または５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、特にＮ１－メチルプソイドウリジンである。
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドによる１つ以上のウリジンの置換は、ウリジンの少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の置換を含む。
例えばＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用したインビトロ転写（ＩＶＴ）によるｍＲＮＡの合成中に、酵素の通常とは異なる活性のために、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含む有意な量の異常な産物が産生される。ｄｓＲＮＡは炎症性サイトカインを誘導し、エフェクタ酵素を活性化してタンパク質合成の阻害をもたらす。ｄｓＲＮＡは、例えば、非多孔質または多孔質Ｃ－１８ポリスチレン－ジビニルベンゼン（ＰＳ－ＤＶＢ）マトリックスを使用するイオン対逆相ＨＰＬＣによって、ＩＶＴ ＲＮＡなどのＲＮＡから除去することができる。あるいは、ｓｓＲＮＡではなくｄｓＲＮＡを特異的に加水分解し、それによってＩＶＴ ＲＮＡ調製物からｄｓＲＮＡ夾雑物を除去する大腸菌ＲＮａｓｅＩＩＩを用いた酵素ベースの方法を使用することができる。さらに、セルロース材料を使用することによってｄｓＲＮＡをｓｓＲＮＡから分離することができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ調製物をセルロース材料と接触させ、ｄｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にし、かつｓｓＲＮＡのセルロース材料への結合を許容しない条件下で、ｓｓＲＮＡをセルロース材料から分離する。
「除去する」または「除去」は、この用語が本明細書で使用される場合、ｄｓＲＮＡなどの第２の物質の集団の近傍から分離されている、非免疫原性ＲＮＡなどの第１の物質の集団の特徴を指し、ここで、第１の物質の集団は必ずしも第２の物質を欠くわけではなく、第２の物質の集団は必ずしも第１の物質を欠くわけではない。しかしながら、第２の物質の集団の除去を特徴とする第１の物質の集団は、第１の物質と第２の物質との分離されていない混合物と比較して、第２の物質の含有量が測定可能に低い。
いくつかの実施形態では、非免疫原性ＲＮＡからのｄｓＲＮＡの除去は、非免疫原性ＲＮＡ組成物中のＲＮＡの１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．３％未満、０．１％未満、または０．０１％未満がｄｓＲＮＡであるようなｄｓＲＮＡの除去を含む。いくつかの実施形態では、非免疫原性ＲＮＡは、ｄｓＲＮＡを含まないか、または本質的に含まない。いくつかの実施形態では、非免疫原性ＲＮＡ組成物は、一本鎖ヌクレオシド修飾ＲＮＡの精製調製物を含む。例えば、いくつかの実施形態では、一本鎖ヌクレオシド修飾ＲＮＡの精製調製物は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、精製調製物は、他の全ての核酸分子（ＤＮＡ、ｄｓＲＮＡなど）と比較して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも９９．９％の一本鎖ヌクレオシド修飾ＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、非免疫原性ＲＮＡは、同じ配列を有する標準ＲＮＡよりも効率的に細胞内で翻訳される。いくつかの実施形態では、翻訳は、その非修飾対応物と比較して２倍増強される。いくつかの実施形態では、翻訳は３倍増強される。いくつかの実施形態では、翻訳は４倍増強される。いくつかの実施形態では、翻訳は５倍増強される。いくつかの実施形態では、翻訳は６倍増強される。いくつかの実施形態では、翻訳は７倍増強される。いくつかの実施形態では、翻訳は８倍増強される。いくつかの実施形態では、翻訳は９倍増強される。いくつかの実施形態では、翻訳は１０倍増強される。いくつかの実施形態では、翻訳は１５倍増強される。いくつかの実施形態では、翻訳は２０倍増強される。いくつかの実施形態では、翻訳は５０倍増強される。いくつかの実施形態では、翻訳は１００倍増強される。いくつかの実施形態では、翻訳は２００倍増強される。いくつかの実施形態では、翻訳は５００倍増強される。いくつかの実施形態では、翻訳は１，０００倍増強される。いくつかの実施形態では、翻訳は２，０００倍増強される。いくつかの実施形態では、倍数は１０～１，０００倍である。いくつかの実施形態では、倍数は１０～１００倍である。いくつかの実施形態では、倍数は１０～２００倍である。いくつかの実施形態では、倍数は１０～３００倍である。いくつかの実施形態では、倍数は１０～５００倍である。いくつかの実施形態では、倍数は２０～１，０００倍である。いくつかの実施形態では、倍数は３０～１，０００倍である。いくつかの実施形態では、倍数は５０～１，０００倍である。いくつかの実施形態では、倍数は１００～１，０００倍である。いくつかの実施形態では、倍数は２００～１，０００倍である。いくつかの実施形態では、翻訳は、任意の他の有意な量または量の範囲だけ増強される。
いくつかの実施形態では、非免疫原性ＲＮＡは、同じ配列を有する標準ＲＮＡよりも有意に低い自然免疫原性を示す。いくつかの実施形態では、非免疫原性ＲＮＡは、その非修飾対応物よりも２倍低い自然免疫応答を示す。いくつかの実施形態では、自然免疫原性は３倍低下する。いくつかの実施形態では、自然免疫原性は４倍低下する。いくつかの実施形態では、自然免疫原性は５倍低下する。いくつかの実施形態では、自然免疫原性は６倍低下する。いくつかの実施形態では、自然免疫原性は７倍低下する。いくつかの実施形態では、自然免疫原性は８倍低下する。いくつかの実施形態では、自然免疫原性は９倍低下する。いくつかの実施形態では、自然免疫原性は１０倍低下する。いくつかの実施形態では、自然免疫原性は１５倍低下する。いくつかの実施形態では、自然免疫原性は２０倍低下する。いくつかの実施形態では、自然免疫原性は５０倍低下する。いくつかの実施形態では、自然免疫原性は１００倍低下する。いくつかの実施形態では、自然免疫原性は２００倍低下する。いくつかの実施形態では、自然免疫原性は５００倍低下する。いくつかの実施形態では、自然免疫原性は１，０００倍低下する。いくつかの実施形態では、自然免疫原性は２，０００倍低下する。
「有意に低い自然免疫原性を示す」という用語は、自然免疫原性の検出可能な低下を指す。いくつかの実施形態では、この用語は、検出可能な自然免疫応答を誘発することなく有効量の非免疫原性ＲＮＡを投与することができるような低下を指す。いくつかの実施形態では、この用語は、非免疫原性ＲＮＡによってコードされるタンパク質の産生を検出可能に減少させるのに十分な自然免疫応答を誘発することなく非免疫原性ＲＮＡを繰り返し投与することができるような低下を指す。いくつかの実施形態では、低下は、非免疫原性ＲＮＡによってコードされるタンパク質の検出可能な産生を排除するのに十分な自然免疫応答を誘発することなく非免疫原性ＲＮＡを繰り返し投与することができるようなものである。
「免疫原性」は、ＲＮＡなどの異物がヒトまたは他の動物の体内で免疫応答を引き起こす能力である。自然免疫系は、比較的非特異的で即時的な免疫系の成分である。これは、適応免疫系と共に、脊椎動物免疫系の２つの主要成分のうちの１つである。
本明細書で使用される場合、「内因性」は、生物、細胞、組織または系からの、またはそれらの内部で産生される任意の物質を指す。
本明細書で使用される場合、「外因性」という用語は、生物、細胞、組織または系から導入されるか、またはそれらの外部で産生される任意の物質を指す。
本明細書で使用される「発現」という用語は、特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳として定義される。
本明細書で使用される場合、「連結された」、「融合された」、または「融合」という用語は、互換的に使用される。これらの用語は、２つ以上の要素または成分またはドメインの結合を指す。
コドン最適化／Ｇ／Ｃ含有量の増加
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の結合剤のアミノ酸配列は、コドン最適化されたコード配列および／またはそのＧ／Ｃ含有量が野生型コード配列と比較して増加しているコード配列によってコードされる。これはまた、コード配列の１つ以上の配列領域がコドン最適化されており、および／または野生型コード配列の対応する配列領域と比較してＧ／Ｃ含有量が増加している実施形態を含む。いくつかの実施形態では、コドン最適化および／またはＧ／Ｃ含有量の増加は、好ましくはコードされるアミノ酸配列の配列を変化させない。
「コドン最適化された」という用語は、好ましくは核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を改変することなく、宿主生物の典型的なコドン使用頻度を反映するための核酸分子のコード領域中のコドンの改変を指す。本発明の文脈内で、コード領域は、好ましくは、本明細書に記載のＲＮＡ分子を使用して治療される対象における最適な発現のためにコドン最適化される。コドン最適化は、翻訳効率が、細胞におけるｔＲＮＡの出現の異なる頻度によっても決定されるという所見に基づく。したがって、ＲＮＡの配列は、頻繁に生じるｔＲＮＡが利用可能であるコドンが「コドン」の代わりに挿入されるように改変され得る。希少
本発明のいくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡのコード領域のグアノシン／シトシン（Ｇ／Ｃ）含有量は、野生型ＲＮＡの対応するコード配列のＧ／Ｃ含有量と比較して増加しており、ＲＮＡによってコードされるアミノ酸配列は、好ましくは野生型ＲＮＡによってコードされるアミノ酸配列と比較して改変されていない。ＲＮＡ配列のこの改変は、翻訳される任意のＲＮＡ領域の配列がそのｍＲＮＡの効率的な翻訳のために重要であるという事実に基づく。Ｇ（グアノシン）／Ｃ（シトシン）含有量が増加した配列は、Ａ（アデノシン）／Ｕ（ウラシル）含有量が増加した配列よりも安定である。いくつかのコドンが全く同じアミノ酸をコードする（いわゆる遺伝暗号の縮重）という事実に関して、安定性のために最も好ましいコドンを決定することができる（いわゆる代替コドン使用頻度）。ＲＮＡによってコードされるアミノ酸に応じて、その野生型配列と比較して、ＲＮＡ配列の修飾には様々な可能性がある。特に、Ａおよび／またはＵヌクレオチドを含むコドンは、これらのコドンを、同じアミノ酸をコードするがＡおよび／もしくはＵを含まないかまたはより低い含有量のＡおよび／もしくはＵヌクレオチドを含む他のコドンで置換することによって改変することができる。
様々な実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡのコード領域のＧ／Ｃ含有量は、野生型ＲＮＡのコード領域のＧ／Ｃ含有量と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、またはさらにそれ以上増加している。
核酸含有粒子
結合剤をコードするＲＮＡなどの本明細書に記載の核酸は、粒子として製剤化されて投与され得る。
本開示の文脈において、「粒子」という用語は、分子または分子複合体によって形成される構造化された実体に関する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の粒子はナノ粒子である。「ナノ粒子」という用語は、粒子の３つの外形寸法全てがナノスケール、すなわち、少なくとも約１ｎｍおよび約１，０００ｎｍ未満であるナノサイズ粒子に関する。好ましくは、粒子のサイズはその直径である。
いくつかの実施形態では、核酸粒子は２種類以上の核酸分子を含み、核酸分子の分子パラメータは、モル質量または基本的な構造要素、例えば分子構造、キャッピング、コード領域もしくは他の特徴に関するように、互いに類似し得るかまたは異なり得る。
ＲＮＡ、例えば第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡを含む粒子製剤では、各ＲＮＡ種を個々の粒子製剤として別々に製剤化することが可能である。その場合、個々の粒子製剤はそれぞれ１つのＲＮＡ種を含む。個々の粒子製剤は、別個の実体として、例えば別個の容器中に存在し得る。そのような製剤は、粒子形成剤と一緒に各ＲＮＡ種を別々に（典型的にはそれぞれＲＮＡ含有溶液の形態で）提供し、それにより粒子の形成を可能にすることによって得ることができる。それぞれの粒子は、粒子が形成されるときに提供される特定のＲＮＡ種のみを含む（個々の粒子製剤）。いくつかの実施形態では、医薬組成物などの組成物は、複数の個々の粒子製剤を含む。それぞれの医薬組成物は、混合粒子製剤と呼ばれる。本発明による混合粒子製剤は、個々の粒子製剤を別々に形成し、続いて個々の粒子製剤を混合する工程によって得ることができる。混合する工程により、ＲＮＡ含有粒子の混合集団を含む製剤を得ることができる。個々の粒子集団は、個々の粒子製剤の混合集団を含む１つの容器に一緒に存在し得る。あるいは、医薬組成物の全てのＲＮＡ種を組み合わせた粒子製剤として一緒に製剤化することが可能である。そのような製剤は、粒子形成剤と共に全てのＲＮＡ種の組合せ製剤（典型的には組合せ溶液）を提供し、それにより粒子の形成を可能にすることによって得ることができる。混合粒子製剤とは対照的に、組合せ粒子製剤は、典型的には複数のＲＮＡ種を含む粒子を含む。組合せ粒子組成物では、異なるＲＮＡ種が、典型的には単一の粒子中に一緒に存在する。
「核酸粒子」を使用して、目的の標的部位（例えば細胞、組織、器官など）に核酸を送達することができる。核酸粒子は、核酸および少なくとも１つの粒子形成成分、例えば、少なくとも１つのカチオン性もしくはカチオンにイオン化可能な脂質もしくは脂質様物質、プロタミンなどの少なくとも１つのカチオン性ポリマー、またはそれらの混合物から形成され得る。ポリマーおよび脂質などの正に帯電した分子と負に帯電した核酸との間の静電相互作用は、粒子形成に関与する。これは、核酸粒子の複合体化および自発的形成をもたらす。いかなる理論にも拘束されることを意図するものではないが、カチオン性もしくはカチオンにイオン化可能な脂質もしくは脂質様物質および／またはカチオン性ポリマーは、核酸と一緒になって凝集体を形成し、この凝集はコロイド的に安定な粒子をもたらすと考えられる。核酸粒子には、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）ベースおよびリポプレックス（ＬＰＸ）ベースの製剤が含まれる。
本明細書で使用される「コロイド」という用語は、分散した粒子が沈降しない均一な混合物の一種に関する。混合物中の不溶性粒子は微視的であり、粒径は１～１，０００ナノメートルである。混合物は、コロイドまたはコロイド懸濁液と呼ばれ得る。「コロイド」という用語は、混合物中の粒子のみを指し、懸濁液全体を指すのではない場合がある。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の粒子は、カチオン性もしくはカチオンにイオン化可能な脂質もしくは脂質様物質以外の少なくとも１つの脂質もしくは脂質様物質、カチオン性ポリマー以外の少なくとも１つのポリマー、またはそれらの混合物をさらに含む。
本明細書に記載の核酸粒子は、いくつかの実施形態では、約３０ｎｍ～約１，０００ｎｍ、約５０ｎｍ～約８００ｎｍ、約７０ｎｍ～約６００ｎｍ、約９０ｎｍ～約４００ｎｍ、または約１００ｎｍ～約３００ｎｍの範囲の平均直径を有し得る。
「平均直径」という用語は、長さの次元を有するいわゆるＺ平均、および無次元である多分散指数（ＰＩ）を結果として提供する、いわゆるキュムラントアルゴリズムを使用したデータ分析を伴う動的レーザ光散乱（ＤＬＳ）によって測定される粒子の平均流体力学的直径を指す（Ｋｏｐｐｅｌ，Ｄ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．５７，１９７２，ｐｐ ４８１４－４８２０，ＩＳＯ １３３２１）。ここで、粒子の「平均直径」、「直径」または「サイズ」は、このＺ平均の値と同義で使用される。
本明細書に記載の核酸粒子は、約０．５未満、約０．４未満、約０．３未満、または約０．２以下の多分散指数を示し得る。例として、核酸粒子は、約０．１～約０．３または約０．２～約０．３の範囲の多分散指数を示し得る。
「多分散指数」は、好ましくは、「平均直径」の定義で言及されているように、いわゆるキュムラント解析による動的光散乱測定に基づいて計算される。特定の前提条件下では、これは、ナノ粒子の集合体のサイズ分布の尺度と見なすことができる。
Ｎ／Ｐ比は、脂質中の窒素基対核酸、例えばＲＮＡ中のリン酸基の数の比を与える。窒素原子（ｐＨに依存する）は通常正に帯電し、リン酸基は負に帯電するので、これは電荷比と相関する。電荷平衡が存在する場合、Ｎ／Ｐ比はｐＨに依存する。正に帯電したナノ粒子はトランスフェクションに有利であると考えられているので、脂質製剤は、４より大きく１２までのＮ／Ｐ比で形成されることが多い。その場合、ＲＮＡはナノ粒子に完全に結合していると見なされる。
様々な種類の核酸含有粒子が微粒子形態の核酸の送達に適することが以前に記載されている（例えばＫａｃｚｍａｒｅｋ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９，６０）。非ウイルス核酸送達ビヒクルの場合、核酸のナノ粒子封入は、核酸を分解から物理的に保護し、特定の化学的性質に応じて、細胞取り込みおよびエンドソーム脱出を助けることができる。
本開示は、核酸、少なくとも１つのカチオン性もしくはカチオンにイオン化可能な脂質もしくは脂質様物質、および／または核酸と会合して核酸粒子を形成する少なくとも１つのカチオン性ポリマーを含む粒子、ならびにそのような粒子を含む組成物を記載する。核酸粒子は、非共有結合相互作用によって様々な形態で粒子に複合体化される核酸を含み得る。本明細書に記載の粒子は、ウイルス粒子、特に感染性ウイルス粒子ではない、すなわち、それらは細胞にウイルス感染することができない。
適切なカチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質およびカチオン性ポリマーは、核酸粒子を形成するものであり、「粒子形成成分」または「粒子形成剤」という用語に含まれる。「粒子形成成分」または「粒子形成剤」という用語は、核酸と会合して核酸粒子を形成する任意の成分に関する。そのような成分には、核酸粒子の一部であり得る任意の成分が含まれる。
カチオン性ポリマー
ポリマーは、それらの高度な化学的柔軟性を考慮して、ナノ粒子ベースの送達のために一般的に使用される材料である。典型的には、カチオン性ポリマーは、負に帯電した核酸をナノ粒子に静電的に凝縮するために使用される。これらの正に帯電した基は、多くの場合、５．５～７．５のｐＨ範囲でプロトン化の状態を変化させるアミンからなり、エンドソーム破裂をもたらすイオンの不均衡につながると考えられる。ポリ－Ｌ－リジン、ポリアミドアミン、プロタミンおよびポリエチレンイミンなどのポリマー、ならびにキトサンなどの天然に存在するポリマーは全て核酸送達に適用されており、本明細書におけるカチオン性ポリマーとして適している。さらに、一部の研究者は、特に核酸送達のためのポリマーを合成した。ポリ（β－アミノエステル）は、特に、その合成の容易さと生分解性のために核酸送達において広く使用されている。そのような合成ポリマーは、本明細書におけるカチオン性ポリマーとしても適している。
本明細書で使用される「ポリマー」は、その通常の意味、すなわち、共有結合によって連結された１つ以上の繰り返し単位（モノマー）を含む分子構造体という意味を与えられる。繰り返し単位は、全て同一であってもよく、または場合によっては、ポリマー内に２種類以上の繰り返し単位が存在してもよい。場合によっては、ポリマーは生物学的に誘導される、すなわちタンパク質などの生体高分子である。場合によっては、さらなる部分、例えば本明細書に記載されるような標的化部分もポリマー中に存在し得る。
２種類以上の繰り返し単位がポリマー内に存在する場合、そのポリマーは「コポリマー」であると言われる。本明細書で使用されるポリマーはコポリマーであり得ることが理解されるべきである。コポリマーを形成する繰り返し単位は、任意の方法で配置され得る。例えば、繰り返し単位は、ランダムな順序で、交互の順序で、または「ブロック」コポリマーとして、すなわちそれぞれが第１の繰り返し単位（例えば第１のブロック）を含む１つ以上の領域、およびそれぞれが第２の繰り返し単位（例えば第２のブロック）を含む１つ以上の領域、等を含むように配置され得る。ブロックコポリマーは、２つ（ジブロックコポリマー）、３つ（トリブロックコポリマー）、またはそれ以上の数の異なるブロックを有することができる。
いくつかの実施形態では、ポリマーは生体適合性である。生体適合性ポリマーは、典型的には中程度の濃度で有意な細胞死をもたらさないポリマーである。いくつかの実施形態では、生体適合性ポリマーは生分解性であり、すなわち、ポリマーは、体内などの生理学的環境内で、化学的および／または生物学的に分解することができる。
いくつかの実施形態では、ポリマーは、プロタミンまたはポリアルキレンイミン、特にプロタミンであり得る。
「プロタミン」という用語は、アルギニンに富み、（魚のような）様々な動物の精子細胞中で体細胞ヒストンの代わりに特にＤＮＡと会合して見出される、比較的低分子量の様々な強塩基性タンパク質のいずれかを指す。特に、「プロタミン」という用語は、強塩基性で、水に可溶性であり、熱によって凝固せず、加水分解時に主にアルギニンを生成する、魚の精子中に見出されるタンパク質を指す。精製形態では、それらは、インスリンの長時間作用型製剤において、ヘパリンの抗凝固作用を中和するために使用される。
本開示によれば、本明細書で使用される「プロタミン」という用語は、天然源または生物源から得られるまたはそれに由来する任意のプロタミンアミノ酸配列およびその断片、および前記アミノ酸配列またはその断片の多量体形態、ならびに人工の、特定の目的のために特別に設計された、天然源または生物源から単離することができない（合成された）ポリペプチドを含むことが意図されている。
いくつかの実施形態では、ポリアルキレンイミンは、ポリエチレンイミンおよび／またはポリプロピレンイミン、好ましくはポリエチレンイミンを含む。好ましいポリアルキレンイミンはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。ＰＥＩの平均分子量は、好ましくは０．７５×１０２～１０７Ｄａ、好ましくは１，０００～１０５Ｄａ、より好ましくは１０，０００～４０，０００Ｄａ、より好ましくは１５，０００～３０，０００Ｄａ、さらにより好ましくは２０，０００～２５，０００Ｄａである。
本開示によれば、直鎖状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などの直鎖状ポリアルキレンイミンが好ましい。
本明細書での使用が企図されるカチオン性ポリマー（ポリカチオン性ポリマーを含む）には、核酸に静電的に結合することができる任意のカチオン性ポリマーが含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書での使用が企図されるカチオン性ポリマーは、例えば核酸と複合体を形成することによって、または核酸が封入もしくはカプセル化されている小胞を形成することによって、核酸が会合することができる任意のカチオン性ポリマーを含む。
本明細書に記載の粒子はまた、カチオン性ポリマー以外のポリマー、すなわち非カチオン性ポリマーおよび／またはアニオン性ポリマーを含み得る。集合的に、アニオン性および中性ポリマーは、本明細書では非カチオン性ポリマーと呼ばれる。
脂質および脂質様物質
「脂質」および「脂質様物質」という用語は、本明細書では、１つ以上の疎水性部分または基、および任意で１つ以上の親水性部分または基も含む分子として広く定義される。疎水性部分および親水性部分を含む分子はまた、しばしば両親媒性物質として示される。脂質は、通常、水に難溶性である。水性環境では、両親媒性の性質は、分子が組織化された構造体と様々な相とに自己集合することを可能にする。それらの相の１つは、それらが水性環境で小胞、多層／単層リポソーム、または膜中に存在する場合、脂質二重層からなる。疎水性は、長鎖飽和および不飽和脂肪族炭化水素基、ならびに１つ以上の芳香族、脂環式、または複素環式基で置換されたそのような基を含むがこれらに限定されない無極性基を含むことによって付与され得る。親水性基は、極性基および／または荷電基を含み得、炭水化物、リン酸基、カルボン酸基、硫酸基、アミノ基、スルフヒドリル基、ニトロ基、ヒドロキシル基、および他の同様の基を含む。
本明細書で使用される場合、「両親媒性」という用語は、極性部分と非極性部分の両方を有する分子を指す。多くの場合、両親媒性化合物は、長い疎水性尾部に結合した極性頭部を有する。いくつかの実施形態では、極性部分は水に可溶性であるが、非極性部分は水に不溶性である。さらに、極性部分は、形式正電荷または形式負電荷のいずれを有していてもよい。あるいは、極性部分は、形式正電荷と形式負電荷の両方を有してもよく、双性イオンまたは内部塩であってもよい。本開示の目的のために、両親媒性化合物は、１つ以上の天然または非天然脂質および脂質様化合物であり得るが、これらに限定されない。
「脂質様物質」、「脂質様化合物」または「脂質様分子」という用語は、構造的および／または機能的に脂質に関連するが、厳密な意味で脂質とは見なされ得ない物質、特に両親媒性物質に関する。例えば、この用語は、水性環境で小胞、多層／単層リポソーム、または膜中に存在する場合に両親媒性層を形成することができる化合物を含み、界面活性剤、または親水性部分と疎水性部分の両方を有する合成化合物を含む。一般的に言えば、この用語は、脂質の構造と類似していても類似していなくてもよい、異なる構造組織を有する親水性部分と疎水性部分とを含む分子を指す。細胞膜への自発的な組み込みが可能な脂質様化合物の例としては、合成機能－スペーサ－脂質構築物（ＦＳＬ）、合成機能－スペーサ－ステロール構築物（ＦＳＳ）、および人工両親媒性分子などの機能性脂質構築物が挙げられる。脂質は一般に円筒形である。２つのアルキル鎖が占める面積は、極性頭部基が占める面積と同様である。脂質はモノマーとしての溶解度が低く、水不溶性の平面二重層に凝集する傾向がある。従来の界面活性剤モノマーは、一般に円錐形である。親水性頭部基は、直鎖アルキル鎖よりも多くの分子空間を占める傾向がある。界面活性剤は、水溶性の球状または楕円状ミセルに凝集する傾向がある。脂質はまた、界面活性剤と同じ一般構造－極性親水性頭部基および非極性疎水性尾部－を有するが、脂質は、モノマーの形状、溶液中で形成される凝集体の種類、および凝集に必要な濃度範囲において界面活性剤とは異なる。本明細書で使用される場合、「脂質」という用語は、本明細書で特に指示されない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、脂質および脂質様物質の両方を包含すると解釈されるべきである。
両親媒性層に含まれ得る両親媒性化合物の具体的な例としては、リン脂質、アミノ脂質およびスフィンゴ脂質が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、両親媒性化合物は脂質である。「脂質」という用語は、水に不溶性であるが、多くの有機溶媒に可溶性であることを特徴とする有機化合物の群を指す。一般に、脂質は、８つのカテゴリ：脂肪酸、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、サッカロ脂質、ポリケチド（ケトアシルサブユニットの縮合に由来する）、ステロール脂質およびプレノール脂質（イソプレンサブユニットの縮合に由来する）に分けられ得る。「脂質」という用語は時に脂肪の同義語として使用されるが、脂肪はトリグリセリドと呼ばれる脂質のサブグループである。脂質はまた、脂肪酸およびその誘導体（トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、およびリン脂質を含む）などの分子、ならびにコレステロールなどのステロール含有代謝物を包含する。
脂肪酸、または脂肪酸残基は、末端がカルボン酸基である炭化水素鎖からなる多様な分子の群である；この配置は、分子に、極性の親水性末端と水に不溶性の非極性の疎水性末端とを付与する。典型的には４～２４炭素長である炭素鎖は、飽和であっても不飽和であってもよく、酸素、ハロゲン、窒素、および硫黄を含む官能基に結合していてもよい。脂肪酸が二重結合を含む場合、シスまたはトランス幾何異性のいずれかの可能性があり、これは分子の立体配置に有意に影響を及ぼす。シス二重結合は脂肪酸鎖を屈曲させ、これは、鎖中のより多くの二重結合と組み合わされる影響である。脂肪酸カテゴリにおける他の主要な脂質クラスは、脂肪酸エステルおよび脂肪酸アミドである。
グリセロ脂質は、一置換、二置換、および三置換グリセロールから構成され、最もよく知られているのは、トリグリセリドと呼ばれるグリセロールの脂肪酸トリエステルである。「トリアシルグリセロール」という語は、「トリグリセリド」と同義に使用されることがある。これらの化合物では、グリセロールの３つのヒドロキシル基はそれぞれ、典型的には異なる脂肪酸によってエステル化されている。グリセロ脂質のさらなるサブクラスは、グリコシド結合を介してグリセロールに結合した１つ以上の糖残基の存在を特徴とするグリコシルグリセロールによって代表される。
グリセロリン脂質は、エステル結合によって２つの脂肪酸由来の「尾部」に、およびリン酸エステル結合によって１つの「頭部」基に結合したグリセロールコアを含む両親媒性分子（疎水性領域と親水性領域の両方を含む）である。通常リン脂質と呼ばれる（スフィンゴミエリンもリン脂質として分類されるが）グリセロリン脂質の例は、ホスファチジルコリン（ＰＣ、ＧＰＣｈｏまたはレシチンとしても公知）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥまたはＧＰＥｔｎ）およびホスファチジルセリン（ＰＳまたはＧＰＳｅｒ）である。
スフィンゴ脂質は、スフィンゴイド塩基骨格という共通の構造的特徴を共有する化合物の複雑なファミリーである。哺乳動物における主要なスフィンゴイド塩基は、一般にスフィンゴシンと呼ばれる。セラミド（Ｎ－アシル－スフィンゴイド塩基）は、アミド結合脂肪酸を有するスフィンゴイド塩基誘導体の主要なサブクラスである。脂肪酸は、典型的には、１６～２６個の炭素原子の鎖長を有する飽和または一不飽和である。哺乳動物の主要なスフィンゴリン脂質はスフィンゴミエリン（セラミドホスホコリン）であるが、昆虫は主にセラミドホスホエタノールアミンを含有し、真菌はフィトセラミドホスホイノシトールおよびマンノース含有頭部基を有する。スフィンゴ糖脂質は、グリコシド結合を介してスフィンゴイド塩基に結合した１つ以上の糖残基から構成される分子の多様なファミリーである。これらの例は、セレブロシドおよびガングリオシドなどの単純なおよび複雑なスフィンゴ糖脂質である。
コレステロールおよびその誘導体、またはトコフェロールおよびその誘導体などのステロール脂質は、グリセロリン脂質およびスフィンゴミエリンと共に膜脂質の重要な成分である。
サッカロ脂質は、脂肪酸が糖骨格に直接連結され、膜二重層と適合性である構造を形成する化合物を表す。サッカロ脂質では、単糖が、グリセロ脂質およびグリセロリン脂質に存在するグリセロール骨格の代わりになる。最もよく知られているサッカロ脂質は、グラム陰性菌のリポ多糖のリピドＡ成分のアシル化グルコサミン前駆体である。典型的なリピドＡ分子は、７本もの脂肪アシル鎖で誘導体化されている、グルコサミンの二糖である。大腸菌での増殖に必要な最小限のリポ多糖は、２つの３－デオキシ－Ｄ－マンノ－オクツロソン酸（Ｋｄｏ）残基でグリコシル化されたグルコサミンのヘキサアシル化二糖である、Ｋｄｏ２－リピドＡである。
ポリケチドは、古典的な酵素、ならびに脂肪酸シンターゼと機構的特徴を共有する反復およびマルチモジュール酵素によるアセチルおよびプロピオニルサブユニットの重合によって合成される。それらは、動物、植物、細菌、真菌および海洋源からの多数の二次代謝物および天然産物を含み、大きな構造的多様性を有する。多くのポリケチドは、その骨格がグリコシル化、メチル化、ヒドロキシル化、酸化、または他のプロセスによってさらに修飾されることが多い環状分子である。
本開示によれば、脂質および脂質様物質は、カチオン性、アニオン性または中性であり得る。中性脂質または脂質様物質は、選択されたｐＨで非荷電または中性の双性イオン形態で存在する。
カチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質
本明細書に記載の核酸粒子は、粒子形成剤として少なくとも１つのカチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質を含み得る。本明細書での使用が企図されるカチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質は、核酸に静電的に結合することができる任意のカチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質を含む。いくつかの実施形態では、本明細書での使用が企図されるカチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質は、例えば核酸と複合体を形成することによって、または核酸が封入もしくはカプセル化されている小胞を形成することによって、核酸と会合することができる。
本明細書で使用される場合、「カチオン性脂質」または「カチオン性脂質様物質」は、正味の正電荷を有する脂質または脂質様物質を指す。カチオン性脂質または脂質様物質は、静電相互作用によって負に帯電した核酸に結合する。一般に、カチオン性脂質は、ステロール、アシル鎖、ジアシルまたはそれ以上のアシル鎖などの親油性部分を有し、脂質の頭部基は、典型的には正電荷を担持する。
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質または脂質様物質は、特定のｐＨ、特に酸性ｐＨでのみ正味の正電荷を有するが、好ましくは正味の正電荷を有さず、好ましくは電荷を有さず、すなわち、生理学的ｐＨなどの異なる、好ましくはより高いｐＨでは中性である。このイオン化可能な挙動は、生理学的ｐＨでカチオン性のままである粒子と比較して、エンドソーム脱出を助け、毒性を低減することによって有効性を高めると考えられる。
本開示の目的のために、そのような「カチオンにイオン化可能な」脂質または脂質様物質は、状況と矛盾しない限り、「カチオン性脂質または脂質様物質」という用語に含まれる。
いくつかの実施形態では、カチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質は、正に帯電しているかまたはプロトン化することができる少なくとも１つの窒素原子（Ｎ）を含む頭部基を含む。
カチオン性脂質の例としては、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ジオレイルオキシプロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、３－（Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）；１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）；１，２－ジアシルオキシ－３－ジメチルアンモニウムプロパン；１，２－ジアルキルオキシ－３－ジメチルアンモニウムプロパン；ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２－ジステアリルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、２，３－ジ（テトラデコキシ）プロピル－（２－ヒドロキシエチル）ジメチルアザニウム（ＤＭＲＩＥ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＭＥＰＣ）、ｌ，２－ジミリストイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、１，２－ジオレイルオキシプロピル－３－ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）、および２，３－ジオレオイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－ｌ－プロパナミウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、３－ジメチルアミノ－２－（コレスト－５－エン－３－ベータ－オキシブタン－４－オキシ）－１－（シス、シス－９，１２－オクタデカジエンオキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、２－［５’－（コレスト－５－エン－３－ベータ－オキシ）－３’－オキサペントキシ）－３－ジメチル－１－（シス、シス－９’，１２’－オクタデカジエンオキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３，４－ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）、１，２－Ｎ，Ｎ’－ジオレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＯｃａｒｂＤＡＰ）、２，３－ジリノレオイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロピルアミン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－Ｎ，Ｎ’－ジリノレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ）、１，２－ジリノレオイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＣＤＡＰ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＸＴＣ２－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル－４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（テトラデシルオキシ）－１－プロパナミニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、（±）－Ｎ－（３－アミノプロピル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（シス－９－テトラデセニルオキシ）－１－プロパナミニウムブロミド（ＧＡＰ－ＤＭＯＲＩＥ）、（±）－Ｎ－（３－アミノプロピル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（ドデシルオキシ）－１－プロパナミニウムブロミド（ＧＡＰ－ＤＬＲＩＥ）、（±）－Ｎ－（３－アミノプロピル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（テトラデシルオキシ）－１－プロパナミニウムブロミド（ＧＡＰ－ＤＭＲＩＥ）、Ｎ－（２－アミノエチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（テトラデシルオキシ）－１－プロパナミニウムブロミド（βＡＥ－ＤＭＲＩＥ）、Ｎ－（４－カルボキシベンジル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（オレオイルオキシ）プロパン－１－アミニウム（ＤＯＢＡＱ）、２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジミリストイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＤＡＰ）、１，２－ジパルミトイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＤＡＰ）、Ｎ１－［２－（（１Ｓ）－１－［（３－アミノプロピル）アミノ］－４－［ジ（３－アミノ－プロピル）アミノ］ブチルカルボキサミド）エチル］－３，４－ジ［オレイルオキシ］－ベンズアミド（ＭＶＬ５）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）、２，３－ビス（ドデシルオキシ）－Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－１－アモニウムブロミド（ＤＬＲＩＥ）、Ｎ－（２－アミノエチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（テトラデシルオキシ）プロパン－１－アミニウムブロミド（ＤＭＯＲＩＥ）、ジ（（Ｚ）－ノン－２－エン－１－イル）８，８’－（（（（２（ジメチルアミノ）エチル）チオ）カルボニル）アザンジイル）ジオクタノエート（ＡＴＸ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（ドデシルオキシ）プロパン－１－アミン（ＤＬＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（テトラデシルオキシ）プロパン－１－アミン（ＤＭＤＭＡ）、ジ（（Ｚ）－ノン－２－エン－１－イル）－９－（（４－（ジメチルアミノブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）、Ｎ－ドデシル－３－（（２－ドデシルカルバモイル－エチル）－｛２－［（２－ドデシルカルバモイル－エチル）－２－｛（２－ドデシルカルバモイル－エチル）－［２－（２－ドデシルカルバモイル－エチルアミノ）エチル］－アミノ｝－エチルアミノ）プロピオンアミド（リピドイド９８Ｎ１２－５）、１－［２－［ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ］エチル－［２－［４－［２－［ビス（２ヒドロキシドデシル）アミノ］エチル］ピペラジン－１－イル］エチル］アミノ］ドデカン－２－オール（リピドイドＣ１２－２００）が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約１０モル％～約１００モル％、約２０モル％～約１００モル％、約３０モル％～約１００モル％、約４０モル％～約１００モル％、または約５０モル％～約１００モル％を構成し得る。
さらなる脂質または脂質様物質
本明細書に記載の粒子はまた、カチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質以外の脂質または脂質様物質、すなわち非カチオン性脂質または脂質様物質（非カチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質を含む）を含み得る。集合的に、アニオン性および中性脂質または脂質様物質は、本明細書では非カチオン性脂質または脂質様物質と呼ばれる。イオン化可能／カチオン性脂質または脂質様物質に加えて、コレステロールおよび脂質などの他の疎水性部分の添加によって核酸粒子の製剤を最適化することにより、粒子の安定性および核酸送達の有効性を高め得る。
核酸粒子の全体的な電荷に影響を及ぼしても及ぼさなくてもよいさらなる脂質または脂質様物質を組み込み得る。いくつかの実施形態では、さらなる脂質または脂質様物質は、非カチオン性脂質または脂質様物質である。非カチオン性脂質は、例えば、１つ以上のアニオン性脂質および／または中性脂質を含み得る。本明細書で使用される場合、「アニオン性脂質」は、選択されたｐＨで負に帯電している任意の脂質を指す。本明細書で使用される場合、「中性脂質」は、選択されたｐＨで非荷電または中性の双性イオン形態で存在するいくつかの脂質種のいずれかを指す。好ましい実施形態では、さらなる脂質は、以下の中性脂質成分、例えば中性脂質成分：（１）リン脂質；（２）コレステロールもしくはその誘導体；または（３）リン脂質とコレステロールもしくはその誘導体との混合物の１つを含む。コレステロール誘導体の例としては、コレスタノール、コレスタノン、コレステノン、コプロスタノール、コレステリル－２’－ヒドロキシエチルエーテル、コレステリル－４’－ヒドロキシブチルエーテル、トコフェロールおよびそれらの誘導体、ならびにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
使用することができる特定のリン脂質としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリンまたはスフィンゴミエリンが挙げられるが、これらに限定されない。そのようなリン脂質としては、特に、ジアシルホスファチジルコリン、例えばジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジペンタデカノイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジアラキドイルホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）、ジベヘノイルホスファチジルコリン（ＤＢＰＣ）、ジトリコサノイルホスファチジルコリン（ＤＴＰＣ）、ジリグノセロイルファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ジエーテルＰＣ）、１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ）およびホスファチジルエタノールアミン、特にジアシルホスファチジルエタノールアミン、例えばジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジパルミトイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジラウロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、ジフィタノイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）、およびさらに様々な疎水性鎖を有するホスファチジルエタノールアミン脂質が挙げられる。
特定の好ましい実施形態では、さらなる脂質は、ＤＳＰＣ、またはＤＳＰＣとコレステロールである。
いくつかの実施形態では、核酸粒子は、カチオン性脂質とさらなる脂質の両方を含む。
理論に拘束されることを望むものではないが、少なくとも１つのさらなる脂質の量と比較した少なくとも１つのカチオン性脂質の量は、電荷、粒径、安定性、組織選択性、および核酸の生物活性などの重要な核酸粒子特性に影響を及ぼし得る。したがって、いくつかの実施形態では、少なくとも１つのカチオン性脂質対少なくとも１つのさらなる脂質のモル比は、約１０：０～約１：９、約４：１～約１：２、または約３：１～約１：１である。
いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質、特に中性脂質（例えば１つ以上のリン脂質および／またはコレステロール）は、粒子中に存在する総脂質の約０モル％～約９０モル％、約０モル％～約８０モル％、約０モル％～約７０モル％、約０モル％～約６０モル％、または約０モル％～約５０モル％を構成し得る。
ポリマーコンジュゲート脂質
いくつかの実施形態では、粒子は、少なくとも１つのポリマーコンジュゲート脂質を含み得る。ポリマーコンジュゲート脂質は、典型的には、脂質部分と、それにコンジュゲートされたポリマー部分とを含む分子である。いくつかの実施形態では、ポリマーコンジュゲート脂質は、本明細書ではペグ化脂質またはＰＥＧ脂質とも呼ばれる、ＰＥＧコンジュゲート脂質である。
いくつかの実施形態では、ポリマーコンジュゲート脂質は、疎水性脂質層を遮蔽する保護親水性層を形成することによって脂質粒子を立体的に安定化するように設計される。いくつかの実施形態では、ポリマーコンジュゲート脂質は、そのような脂質粒子がインビボで投与される場合、血清タンパク質とのその会合および／または結果として生じる細網内皮系による取り込みを減少させることができる。
様々なＰＥＧコンジュゲート脂質が当技術分野で公知であり、ペグ化ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＡＧ）、例えば１－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、ペグ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）、ＰＥＧコハク酸ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＡＧ）、例えば４－Ｏ－（２’，３’－ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル－１－Ｏ－（ω－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオエート（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ）、ペグ化セラミド（ＰＥＧ－ｃｅｒ）、またはＰＥＧジアルコキシプロピルカルバメート、例えばω－メトキシ（ポリエトキシ）エチル－Ｎ－（２，３－ジ（テトラデカノキシ）プロピル）カルバメートもしくは２，３－ジ（テトラデカノキシ）プロピル－Ｎ－（ωメトキシ（ポリエトキシ）エチル）カルバメートなどが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、粒子は、その各々の内容全体が本明細書に記載の目的のために参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１７／０７５５３１号および国際公開第２０１８／０８１４８０号に記載されているような１つ以上のＰＥＧコンジュゲート脂質またはペグ化脂質を含み得る。
リポプレックス粒子
本開示のいくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡは、ＲＮＡリポプレックス粒子中に存在し得る。
リポプレックス（ＬＰＸ）は、一般に、予め形成されたカチオン性脂質リポソームをアニオン性ＲＮＡと混合することによって形成される静電複合体である。形成されたリポプレックスは、リポソーム構造からコンパクトなＲＮＡ－リポプレックスへの変換に起因して生じる分子の異なる内部配置を有する。これらの製剤は、一般に、核酸の封入が不十分であり、核酸の捕捉が不完全であることを特徴とする。
リポソームは、水性コアを取り囲む単層または多層リン脂質二重層を含む球状小胞である。それらは、極性頭部（親水性）基および非極性尾部（疎水性）基を有する材料から調製される。これらの基間の相互作用は、小胞の形成を誘導する。核酸の送達のために設計されたリポソームを製剤化するのに使用されるカチオン性脂質は、本質的に両親媒性であり、グリセロールを介して炭化水素鎖またはコレステロール誘導体に連結された正電荷（カチオン性）アミン頭部基からなる。
正に帯電したリポソームは、一般に、ＤＯＴＭＡなどのカチオン性脂質、およびＤＯＰＥなどのさらなる脂質を使用して合成され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子はナノ粒子である。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、カチオン性脂質とさらなる脂質の両方を含む。例示的な実施形態では、カチオン性脂質はＤＯＴＭＡであり、さらなる脂質はＤＯＰＥである。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのカチオン性脂質対少なくとも１つのさらなる脂質のモル比は、約１０：０～約１：９、約４：１～約１：２、または約３：１～約１：１である。特定の実施形態では、モル比は、約３：１、約２．７５：１、約２．５：１、約２．２５：１、約２：１、約１．７５：１、約１．５：１、約１．２５：１、または約１：１であり得る。例示的な実施形態では、少なくとも１つのカチオン性脂質対少なくとも１つのさらなる脂質のモル比は、約２：１である。
本明細書に記載のＲＮＡリポプレックス粒子は、いくつかの実施形態では、約２００ｎｍ～約１０００ｎｍ、約２００ｎｍ～約８００ｎｍ、約２５０ｎｍ～約７００ｎｍ、約４００ｎｍ～約６００ｎｍ、約３００ｎｍ～約５００ｎｍ、または約３５０ｎｍ～約４００ｎｍの範囲の平均直径を有する。特定の実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約２００ｎｍ、約２２５ｎｍ、約２５０ｎｍ、約２７５ｎｍ、約３００ｎｍ、約３２５ｎｍ、約３５０ｎｍ、約３７５ｎｍ、約４００ｎｍ、約４２５ｎｍ、約４５０ｎｍ、約４７５ｎｍ、約５００ｎｍ、約５２５ｎｍ、約５５０ｎｍ、約５７５ｎｍ、約６００ｎｍ、約６２５ｎｍ、約６５０ｎｍ、約７００ｎｍ、約７２５ｎｍ、約７５０ｎｍ、約７７５ｎｍ、約８００ｎｍ、約８２５ｎｍ、約８５０ｎｍ、約８７５ｎｍ、約９００ｎｍ、約９２５ｎｍ、約９５０ｎｍ、約９７５ｎｍ、または約１０００ｎｍの平均直径を有する。一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約２５０ｎｍ～約７００ｎｍの範囲の平均直径を有する。別の実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約３００ｎｍ～約５００ｎｍの範囲の平均直径を有する。例示的な実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約４００ｎｍの平均直径を有する。
ＲＮＡリポプレックス粒子は、脂質のエタノール溶液を水または適切な水相に注入することによって得られ得るリポソームを使用して調製され得る。いくつかの実施形態では、水相は酸性ｐＨを有する。いくつかの実施形態では、水相は、例えば約５ｍＭの量の酢酸を含む。リポソームは、リポソームをＲＮＡと混合することによってＲＮＡリポプレックス粒子を調製するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、リポソームおよびＲＮＡリポプレックス粒子は、少なくとも１つのカチオン性脂質および少なくとも１つのさらなる脂質を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのカチオン性脂質は、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）および／または１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのさらなる脂質は、１，２－ジ－（９Ｚ－オクタデセノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）および／または１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのカチオン性脂質は、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）を含み、少なくとも１つのさらなる脂質は、１，２－ジ－（９Ｚ－オクタデセノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む。いくつかの実施形態では、リポソームおよびＲＮＡリポプレックス粒子は、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）および１，２－ジ－（９Ｚ－オクタデセノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む。
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の形態で存在する。ＬＮＰは、１つ以上の核酸分子が結合している、または１つ以上の核酸分子が封入されている粒子を形成することができる任意の脂質を含み得る。
ＬＮＰは、典型的には、４つの成分：イオン化可能なカチオン性脂質、リン脂質などの中性脂質、コレステロールなどのステロイド、およびＰＥＧ脂質などのポリマーコンジュゲート脂質を含む。ＬＮＰは、エタノールに溶解した脂質を水性緩衝液中で核酸と混合することによって調製され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡ ＬＮＰにおいて、ｍＲＮＡは、ＬＮＰの中心コアを占めるイオン化可能な脂質によって結合される。ＰＥＧ脂質は、リン脂質と共にＬＮＰの表面を形成する。いくつかの実施形態では、表面は二重層を含む。いくつかの実施形態では、荷電形態および非荷電形態のコレステロールおよびイオン化可能な脂質は、ＬＮＰ全体に分布し得る。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、１つ以上のカチオン性脂質および１つ以上の安定化脂質を含む。安定化脂質は、中性脂質およびペグ化脂質を含む。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質、中性脂質、ステロイド、ポリマーコンジュゲート脂質、および脂質ナノ粒子内に封入された、または脂質ナノ粒子と会合したＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、４０～５５モル％、４０～５０モル％、４１～５０モル％、４２～５０モル％、４３～５０モル％、４４～５０モル％、４５～５０モル％、４６～５０モル％、４６～４９モル％、または約４７もしくは４８モル％のカチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約４６．０、４６．１、４６．２、４６．３、４６．４、４６．５、４６．６、４６．７、４６．８、４６．９、４７．０、４７．１、４７．２、４７．３、４７．４、４７．５、４７．６、４７．７、４７．８、４７．９、４８．０、４８．１、４８．２、４８．３、４８．４、４８．５、４８．６、４８．７、４８．８、４８．９、または４９モル％のカチオン性脂質を含む。
いくつかの実施形態では、中性脂質は、５～１５モル％、７～１３モル％、または９～１１モル％の範囲の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、中性脂質は、約１０モル％の濃度で存在する。
いくつかの実施形態では、ステロイドは、３０～５０モル％、３５～４５モル％または３８～４３モル％の範囲の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、ステロイドは、約４１モル％の濃度で存在する。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、１～１０モル％、１～５モル％、または１～２．５モル％のポリマーコンジュゲート脂質を含む。いくつかの実施形態では、ポリマーコンジュゲート脂質は、約１．５、１．６、１．７、１．８、１．９または２．０モル％の濃度で存在する。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、４５～５０モル％のカチオン性脂質；５～１５モル％の中性脂質；３５～４５モル％のステロイド；１～５モル％のポリマーコンジュゲート脂質；および脂質ナノ粒子内に封入された、または脂質ナノ粒子と会合したＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、モルパーセントは、脂質ナノ粒子中に存在する脂質の総モルに基づいて決定される。いくつかの実施形態では、モルパーセントは、脂質ナノ粒子中に存在するカチオン性脂質、中性脂質、ステロイドおよびポリマーコンジュゲート脂質の総モルに基づいて決定される。
いくつかの実施形態では、中性脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＤＯＰＧ、ＤＰＰＧ、ＰＯＰＥ、ＤＰＰＥ、ＤＭＰＥ、ＤＳＰＥ、およびＳＭからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、中性脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥおよびＳＭからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、中性脂質はＤＳＰＣである。
いくつかの実施形態では、ステロイドはコレステロールである。
いくつかの実施形態では、ポリマーコンジュゲート脂質はペグ化脂質である。いくつかの実施形態では、ペグ化脂質は、以下の構造：
Figure 2024525795000023
 またはその薬学的に許容される塩、互変異性体もしくは立体異性体を有し、ここで、
Ｒ１２およびＲ１３は、それぞれ独立して、１０～３０個の炭素原子を含む直鎖または分岐の飽和または不飽和アルキル鎖であり、アルキル鎖は、１つ以上のエステル結合によって中断されていてもよく、ｗは、３０～６０の範囲の平均値を有する。いくつかの実施形態では、Ｒ１２およびＲ１３は、それぞれ独立して、１２～１６個の炭素原子を含む直鎖の飽和アルキル鎖である。いくつかの実施形態では、ｗは、４０～５５の範囲の平均値を有する。いくつかの実施形態では、平均ｗは約４５である。いくつかの実施形態では、Ｒ１２およびＲ１３は、それぞれ独立して、約１４個の炭素原子を含む直鎖の飽和アルキル鎖であり、ｗは約４５の平均値を有する。
いくつかの実施形態では、ペグ化脂質は、２－［（ポリエチレングリコール）－２０００］－Ｎ，Ｎ－ジテトラデシルアセトアミドであるか、またはそれを含む。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰのカチオン性脂質成分は、式（ＩＩＩ）：
Figure 2024525795000024
 の構造、またはその薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体を有し、ここで、
Ｌ１またはＬ２の一方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ－、ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－または－ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ－であり、Ｌ１またはＬ２の他方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ－、ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－または－ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ－または直接結合であり；
Ｇ１またはＧ２は、それぞれ独立して、置換されていないＣ１－Ｃ１２アルキレンまたはＣ１－Ｃ１２アルケニレンであり；
Ｇ３は、Ｃ１－Ｃ２４アルキレン、Ｃ１－Ｃ２４アルケニレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルケニレンであり；
Ｒａは、ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｃ６－Ｃ２４アルキルまたはＣ６－Ｃ２４アルケニルであり；
Ｒ３は、Ｈ、ＯＲ５、ＣＮ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ４、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ４または－ＮＲ５Ｃ（＝Ｏ）Ｒ４であり；
Ｒ４はＣ１－Ｃ１２アルキルであり；
Ｒ５は、ＨまたはＣ１－Ｃ６アルキルであり；ならびに
ｘは、０、１または２である。
式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、脂質は、以下の構造（ＩＩＩＡ）または（ＩＩＩＢ）：
Figure 2024525795000025
 または
Figure 2024525795000026
 の１つを有し、ここで、
Ａは、３～８員のシクロアルキルまたはシクロアルキレン環であり；
Ｒ６は、各存在において、独立してＨ、ＯＨまたはＣ１－Ｃ２４アルキルであり；
ｎは、１～１５の範囲の整数である。
式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、脂質は構造（ＩＩＩＡ）を有し、他の実施形態では、脂質は構造（ＩＩＩＢ）を有する。
式（ＩＩＩ）の他の実施形態では、脂質は、以下の構造（ＩＩＩＣ）または（ＩＩＩＤ）：
Figure 2024525795000027
 または
Figure 2024525795000028
 の１つを有し、ここで、ｙおよびｚは、それぞれ独立して、１～１２の範囲の整数である。
式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいずれかでは、Ｌ１またはＬ２の一方は－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。例えば、いくつかの実施形態では、Ｌ１およびＬ２の各々は－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。前述のいずれかのいくつかの異なる実施形態では、Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－または－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。例えば、いくつかの実施形態では、Ｌ１およびＬ２の各々は－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である。
式（ＩＩＩ）のいくつかの異なる実施形態では、脂質は、以下の構造（ＩＩＩＥ）または（ＩＩＩＦ）：
Figure 2024525795000029
 または
Figure 2024525795000030
 の１つを有する。
式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、脂質は、以下の構造（ＩＩＩＧ）、（ＩＩＩＨ）、（ＩＩＩＩ）、または（ＩＩＩＪ）：
Figure 2024525795000031
Figure 2024525795000032
Figure 2024525795000033
 または
Figure 2024525795000034
 のうちの１つを有する。
式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、ｎは、２～１２、例えば２～８または２～４の範囲の整数である。例えば、いくつかの実施形態では、ｎは、３、４、５または６である。いくつかの実施形態では、ｎは３である。いくつかの実施形態では、ｎは４である。いくつかの実施形態では、ｎは５である。いくつかの実施形態では、ｎは６である。
式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかの他の実施形態では、ｙおよびｚは、それぞれ独立して、２～１０の範囲の整数である。例えば、いくつかの実施形態では、ｙおよびｚは、それぞれ独立して、４～９または４～６の範囲の整数である。
式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、Ｒ６はＨである。前述の実施形態の他の実施形態では、Ｒ６はＣ１－Ｃ２４アルキルである。他の実施形態では、Ｒ６はＯＨである。
式（ＩＩＩ）のいくつかの実施形態では、Ｇ３は非置換である。他の実施形態では、Ｇ３は置換されている。様々な異なる実施形態では、Ｇ３は、直鎖Ｃ１－Ｃ２４アルキレンまたは直鎖Ｃ１－Ｃ２４アルケニレンである。
式（ＩＩＩ）のいくつかの他の前述の実施形態では、Ｒ１もしくはＲ２、またはその両方がＣ６－Ｃ２４アルケニルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、以下の構造：
Figure 2024525795000035
 を有し、ここで、
Ｒ７ａおよびＲ７ｂは、各存在において、独立してＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり；ならびに
ａは２～１２の整数であり、
ここで、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂおよびａはそれぞれ、Ｒ１およびＲ２がそれぞれ独立して６～２０個の炭素原子を含むように選択される。例えば、いくつかの実施形態では、ａは、５～９または８～１２の範囲の整数である。
式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、Ｒ７ａの少なくとも１つの存在はＨである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ７ａは、各存在においてＨである。前述の実施形態の他の異なる実施形態では、Ｒ７ｂの少なくとも１つの存在はＣ１－Ｃ８アルキルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｃ１－Ｃ８アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ヘキシルまたはｎ－オクチルである。
式（ＩＩＩ）の異なる実施形態では、Ｒ１もしくはＲ２、またはその両方が、以下の構造：
Figure 2024525795000036
 の１つを有する。
式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、Ｒ３は、ＯＨ、ＣＮ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ４、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ４または－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ４である。いくつかの実施形態では、Ｒ４は、メチルまたはエチルである。
様々な異なる実施形態では、式（ＩＩＩ）のカチオン性脂質は、以下の表に示される構造の１つを有する。
式（ＩＩＩ）の代表的な化合物。
Figure 2024525795000037
Figure 2024525795000038
Figure 2024525795000039
Figure 2024525795000040
Figure 2024525795000041
Figure 2024525795000042
Figure 2024525795000043
Figure 2024525795000044
様々な脂質（例えば、カチオン性脂質、中性脂質およびポリマーコンジュゲート脂質を含む）が当技術分野で公知であり、本明細書では、脂質ナノ粒子、例えば特定の細胞型（例えば肝細胞）を標的とする脂質ナノ粒子を形成するために使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物に含まれるカチオン性脂質は、（（３－ヒドロキシプロピル）アザンジイル）ビス（ノナン－９，１－ジイル）ビス（２－ブチルオクタノエート）またはその誘導体であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物に含まれる中性脂質は、リン脂質またはその誘導体（例えば、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＳＣ））および／またはコレステロールであり得るか、またはそれを含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物に含まれるポリマーコンジュゲート脂質は、ＰＥＧコンジュゲート脂質（例えば、２－［（ポリエチレングリコール）－２０００］－Ｎ，Ｎ－ジテトラデシルアセトアミドまたはその誘導体）であり得る。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、式（ＩＩＩ）の脂質、ＲＮＡ、中性脂質、ステロイドおよびペグ化脂質を含む。いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）の脂質は化合物ＩＩＩ－４５である。いくつかの実施形態では、中性脂質はＤＳＰＣである。いくつかの実施形態では、ステロイドはコレステロールである。いくつかの実施形態では、ペグ化脂質はＡＬＣ－０１５９である。
ＡＬＣ－０１５９：
Figure 2024525795000045
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、ＬＮＰ中に約４５～約５０モル％の量で存在する。いくつかの実施形態では、中性脂質は、ＬＮＰ中に約５～約１５モル％の量で存在する。いくつかの実施形態では、ステロイドは、ＬＮＰ中に約３５～約４５モルパーセントの量で存在する。いくつかの実施形態では、ペグ化脂質は、ＬＮＰ中に約１～約５モル％の量で存在する。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約４５～約５０モル％の量の化合物ＩＩＩ－４５、約５～約１５モル％の量のＤＳＰＣ、約３５～約４５モル％の量のコレステロール、および約１～約５モル％の量のＡＬＣ－０１５９を含む。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約４７または４８モル％の量の化合物ＩＩＩ－４５、約１０モル％の量のＤＳＰＣ、約４１モル％の量のコレステロール、および約１．６または１．７モル％の量のＡＬＣ－０１５９を含む。
Ｎ／Ｐ値は、好ましくは少なくとも約４である。いくつかの実施形態では、Ｎ／Ｐ値は、４～２０、４～１２、４～１０、４～８、または５～７の範囲である。いくつかの実施形態では、Ｎ／Ｐ値は約６である。
投与されるＲＮＡの実施形態
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物または医療用調製物は、第１のポリペプチド鎖をコードするＲＮＡおよび第２のポリペプチド鎖をコードするＲＮＡを含み、前記第１および第２のポリペプチド鎖は、互いに相互作用して本明細書に記載の結合剤を形成する。同様に、本明細書に記載の方法は、そのようなＲＮＡの投与を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡはインビトロ転写ＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡはヌクレオシド修飾ｍＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、ヌクレオシド修飾メッセンジャＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）原薬の活性成分は、細胞、例えば肝細胞に入ると翻訳される一本鎖ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｍｏｄＲＮＡは、ＲＮＡの最大有効性のために最適化された共通の構造要素（５’キャップ、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ、ポリ（Ａ）尾部）を含む。いくつかの実施形態では、ｍｏｄＲＮＡは、ウリジンの代わりに１－メチルプソイドウリジンを含む。いくつかの実施形態では、５’キャップ構造は、ｍ２ ７，３’－ＯＧｐｐｐ（ｍ１ ２’－Ｏ）ＡｐＧである。いくつかの実施形態では、５’－ＵＴＲおよび３’－ＵＴＲは、それぞれ、配列番号８のヌクレオチド配列および配列番号９のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）尾部は配列番号１０の配列を含む。いくつかの実施形態では、インビトロ転写反応中に生成されたｄｓＲＮＡ夾雑物を減少させるために、さらなる精製工程をｍｏｄＲＮＡに適用する。
第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡのいくつかの実施形態を以下に記載する。その要素を説明するときに使用される特定の用語は、以下の意味を有する：
５’ＵＴＲ：翻訳効率を高めるための最適化された「コザック配列」を有するヒトαグロビンｍＲＮＡの５’－ＵＴＲ配列。
ｓｅｃ：ｓｅｃは、新生ポリペプチド鎖の小胞体への移行を誘導する、分泌シグナルペプチド（ｓｅｃ）に対応する。
３’ＵＴＲ：３’－ＵＴＲは、「スプリットのアミノ末端エンハンサ」（ＡＥＳ）ｍＲＮＡ（Ｆと呼ばれる）およびミトコンドリアコード１２ＳリボソームＲＮＡ（Ｉと呼ばれる）に由来する２つの配列要素の組合せである。これらは、ＲＮＡの安定性を付与し、総タンパク質発現を増強する配列のエクスビボ選択プロセスによって同定された。
ポリＡ：３０個のアデノシン残基のストレッチ、それに続く１０個のヌクレオチドのリンカー配列、ならびに樹状細胞におけるＲＮＡの安定性および翻訳効率を高めるように設計された別の７０個のアデノシン残基からなる、１１０ヌクレオチド長と測定されるポリ（Ａ）尾部。
ＶＨ（ａＣＤ３）：ＣＤ３に特異性を有する免疫グロブリンの重鎖の可変領域
ＶＬ（ａＣＤ３）：ＣＤ３に特異性を有する免疫グロブリンの軽鎖の可変領域
ＣＨ１：免疫グロブリンの重鎖の定常領域１
ＣＬ：免疫グロブリンの軽鎖の定常領域
ＶＨ（ａＣＬＤＮ６）：ＣＬＤＮ６に特異性を有する免疫グロブリンの重鎖の可変領域
ＶＬ（ａＣＬＤＮ６）：ＣＬＤＮ６に特異性を有する免疫グロブリンの軽鎖の可変領域
ＲＢＰ０２２．１（配列番号４；配列番号５）－「第１のＲＮＡ」の実施形態
キャップ１（ｍ２ ７，３’－ＯＧｐｐｐ（ｍ１ ２’－Ｏ）ＡｐＧ）－５’ＵＴＲ－ｓｅｃ－ＶＨ（ａＣＤ３）－ＣＨ１－ＶＨ（ａＣＬＤＮ６）－ＶＬ（ａＣＬＤＮ６）－３ＵＴＲ－ポリＡ
ＲＢＰ０２１．１（配列番号６；配列番号７）－「第２のＲＮＡ」の実施形態
キャップ１（ｍ２ ７，３’－ＯＧｐｐｐ（ｍ１ ２’－Ｏ）ＡｐＧ）－５’ＵＴＲ－ｓｅｃ－ＶＬ（ａＣＤ３）－ＣＬ－ＶＨ（ａＣＬＤＮ６）－ＶＬ（ａＣＬＤＮ６）－３’ＵＴＲ－ポリＡ
ＲＢＰ０２２．１およびＲＢＰ０２１．１のヌクレオチド配列
ヌクレオチド配列は、太字で表示される個々の配列要素で示されている。さらに、翻訳されたタンパク質の配列は、コードヌクレオチド配列の下にイタリック体で示されている（＊＝終止コドン）。
Figure 2024525795000046
Figure 2024525795000047
Figure 2024525795000048
Figure 2024525795000049
Figure 2024525795000050
Figure 2024525795000051
Figure 2024525795000052
Figure 2024525795000053
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の第１のＲＮＡは、配列番号５のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の第２のＲＮＡは、配列番号７のヌクレオチド配列を含む。
本明細書に記載のＲＮＡは、好ましくは脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に製剤化される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質、中性脂質、ステロイド、ポリマーコンジュゲート脂質、およびＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質はＡＬＣ－０３６６であり、中性脂質はＤＳＰＣであり、ステロイドはコレステロールであり、ポリマーコンジュゲート脂質はＡＬＣ－０１５９である。好ましい投与方法は静脈内投与である。
いくつかの実施形態では、製剤は、以下に示す成分を含む：
Figure 2024525795000054
いくつかの実施形態では、製剤は、以下に示す成分を、好ましくは以下に示す割合または濃度で含む：
Figure 2024525795000055
ＡＬＣ－０３６６、（（３－ヒドロキシプロピル）アザンジイル）ビス（ノナン－９，１－ジイル）ビス（２－ブチルオクタノエート）；
ＡＬＣ－０１５９、２－［（ポリエチレングリコール）－２０００］－Ｎ，Ｎ－ジテトラデシルアセトアミド；
ＤＳＰＣ＝１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン；ＤＳ＝原薬；Ｐｈ．Ｅｕｒ．＝ヨーロッパ薬局方；ｑ．ｓ．＝必要量（十分であり得る量）；ＵＳＰ－ＮＦ＝米国薬局方および国民医薬品集
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ対総脂質の比（Ｎ／Ｐ）は、６．０～６．５、例えば約６．０または約６．３である。
医薬組成物
本明細書に記載の薬剤は、医薬組成物または医薬品で投与されてもよく、任意の適切な医薬組成物の形態で投与されてもよい。
医薬組成物が本明細書に記載の第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡを含むいくつかの実施形態では、そのような第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡは、約３：１～約１：３のモル比で、またはいくつかの実施形態では約２：１～約１：２のモル比で、またはいくつかの実施形態では約１．５：１～約１：１．５のモル比で存在し得る。いくつかの実施形態では、そのような第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡは、約３：１～約１：１のモル比で、またはいくつかの実施形態では約２：１～約１：１のモル比で、またはいくつかの実施形態では約１．５：１のモル比で存在し得る。
医薬組成物が本明細書に記載の第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡを含むいくつかの実施形態では、そのような第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡは、約３：１～約１：３の重量（ｗ／ｗ）比で、またはいくつかの実施形態では約２：１～約１：２の（ｗ／ｗ）比で、またはいくつかの実施形態では約１．５：１～約１：１．５の（ｗ／ｗ）比で存在し得る。いくつかの実施形態では、そのような第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡは、約３：１～約１：１の（ｗ／ｗ）比で、またはいくつかの実施形態では約２：１～約１：１の（ｗ／ｗ）比で、またはいくつかの実施形態では約１．７５：１～約１．２５：１の（ｗ／ｗ）比で、またはいくつかの実施形態では約１．７５：１～約１．５：１の（ｗ／ｗ）比で、またはいくつかの実施形態では約１．５：１～約１．２５：１の（ｗ／ｗ）比で、またはいくつかの好ましい実施形態では約１．５：１の（ｗ／ｗ）比で存在し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、対象における癌を治療するための組成物である。
本発明の全ての態様のいくつかの実施形態では、結合剤をコードするＲＮＡなどの本明細書に記載の成分は、薬学的に許容される担体を含み得、任意で１つ以上のアジュバント、安定剤などを含み得る医薬組成物で投与され得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、治療的または予防的処置のため、例えば癌を治療または予防にするのに使用するためのものである。
「医薬組成物」という用語は、治療上有効な薬剤を、好ましくは薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤と共に含む製剤に関する。上記医薬組成物は、前記医薬組成物を対象に投与することによって疾患または障害を治療する、予防する、またはその重症度を低下させるのに有用である。医薬組成物は、当技術分野では医薬製剤としても公知である。
本開示による医薬組成物は、一般に、「薬学的有効量」および「薬学的に許容される調製物」で適用される。
「薬学的に許容される」という用語は、医薬組成物の活性成分の作用と相互作用しない物質の非毒性を指す。
「薬学的有効量」または「治療有効量」という用語は、単独でまたはさらなる用量と共に所望の反応または所望の効果を達成する量を指す。特定の疾患の治療の場合、所望の反応は、好ましくは疾患の経過の阻害に関する。これは、疾患の進行を遅らせること、特に疾患の進行を中断するまたは逆転させることを含む。疾患の治療における所望の反応はまた、前記疾患または前記状態の発症の遅延または発症の予防であり得る。本明細書に記載の組成物の有効量は、治療される状態、疾患の重症度、年齢、生理学的状態、サイズおよび体重を含む患者の個々のパラメータ、治療の期間、付随する治療の種類（存在する場合）、特定の投与経路ならびに同様の因子に依存する。したがって、本明細書に記載の組成物の投与される用量は、そのような様々なパラメータに依存し得る。患者の反応が初期用量では不十分である場合、より高い用量（または異なる、より局所的な投与経路によって達成される効果的により高い用量）を使用し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物の各用量または累積用量は、ＣＬＤＮ６標的化結合剤をコードするＲＮＡを０．０５μｇ／ｋｇ以上の量、例えば０．０５μｇ／ｋｇ～５ｍｇ／ｋｇ、または０．０５μｇ／ｋｇ～５００μｇ／ｋｇ、または０．５μｇ／ｋｇ～５００μｇ／ｋｇ、または１μｇ／ｋｇ～５０μｇ／ｋｇ、または５μｇ／ｋｇ～１５０μｇ／ｋｇ、または１５μｇ／ｋｇ～１５０μｇ／ｋｇの範囲内の量で含み得、ここで、ｋｇは治療される対象の体重ｋｇを指す。当業者には明らかなように、本明細書に開示される結合剤は、それぞれが別個のＲＮＡによってコードされる２つのポリペプチドを含むので、示される量は、第１および第２のポリペプチド鎖をコードするＲＮＡの累積量に関する。好ましくは、各用量または累積用量は、５μｇ／ｋｇ～１５０μｇ／ｋｇ、または１５μｇ／ｋｇ～１５０μｇ／ｋｇの総量で第１および第２のポリペプチド鎖をコードするＲＮＡの混合物を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、ＣＬＤＮ６に対する結合剤をコードする本明細書に記載のＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）を送達して、約０．０５ｎｇ／ｍＬ以上の結合剤のレベル（例えば血漿レベルおよび／または組織レベル）を達成するために投与される。
いくつかの実施形態では、投与は単回用量のみを含み得る。いくつかの実施形態では、投与は、固定数の用量の適用を含み得る。いくつかの実施形態では、投与は、間欠的（例えば、時間的に分離された複数の用量）および／または周期的（例えば、共通の期間によって分離された個々の用量）投与である投与を含み得る。いくつかの実施形態では、投与は、少なくとも選択された期間の連続投与（例えば灌流）を含み得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、ＣＬＤＮ６陽性癌、例えばＣＬＤＮ６陽性固形腫瘍に罹患している対象に、少なくとも１回以上（例えば、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、またはそれ以上を含む）の投与サイクルで投与される。いくつかの実施形態では、各投与サイクルは、３週間の投与サイクルであり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、投与サイクル当たり少なくとも１回の投与で投与される。いくつかの実施形態では、投与サイクルは、投与の設定された数および／またはパターンの投与を含む；いくつかの実施形態では、投与サイクルは、例えば特定の期間にわたって、ならびに任意で、例えば設定された間隔（１つ以上）でおよび／または設定されたパターンに従って投与され得る複数回投与を介して、設定された累積用量を投与することを含む。
当業者は、癌治療薬がしばしば投与サイクルで投与されることを認識している。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、１回以上の投与サイクルで投与される。
いくつかの実施形態では、１回の投与サイクルは、少なくとも３日間以上（例えば、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、少なくとも２０日間、少なくとも２１日間、少なくとも２２日間、少なくとも２３日間、少なくとも２４日間、少なくとも２５日間、少なくとも２６日間、少なくとも２７日間、少なくとも２８日間、少なくとも２９日間、少なくとも３０日間を含む）である。
いくつかの実施形態では、１回の投与サイクルは、例えば、用量がサイクル内で毎日投与され得る、または用量がサイクル内で２日ごと、３日ごと、４日ごと、５日ごと、６日ごと、７日ごとに投与され得るなどのパターンに従った、複数回投与を含み得る。
いくつかの実施形態では、複数サイクルが投与され得る。例えば、いくつかの実施形態では、少なくとも２サイクル（例えば、少なくとも３サイクル、少なくとも４サイクル、少なくとも５サイクル、少なくとも６サイクル、少なくとも７サイクル、少なくとも８サイクル、少なくとも９サイクル、少なくとも１０サイクル、またはそれ以上を含む）を投与することができる。いくつかの実施形態では、少なくとも３～８回の投与サイクルが投与され得る。
いくつかの実施形態では、サイクル間に「休薬期間」が存在し得る；いくつかの実施形態では、サイクル間に休薬期間が存在しなくてもよい。いくつかの実施形態では、サイクル間に休薬期間が存在する場合もあり、休薬期間が存在しない場合もある。
本開示の医薬組成物は、塩、緩衝剤、防腐剤および任意で他の治療薬を含有し得る。いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤を含む。
本開示の医薬組成物で使用するための適切な防腐剤には、限定されないが、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサールが含まれる。
本明細書で使用される「賦形剤」という用語は、本開示の医薬組成物中に存在し得るが、活性成分ではない物質を指す。賦形剤の例としては、限定されないが、担体、結合剤、希釈剤、潤滑剤、増粘剤、界面活性剤、防腐剤、安定剤、乳化剤、緩衝剤、香味剤または着色剤が挙げられる。
「希釈剤」という用語は、希釈するおよび／または希薄にする薬剤に関する。さらに、「希釈剤」という用語は、流体、液体または固体の懸濁液および／または混合媒体のいずれか１つ以上を含む。適切な希釈剤の例としては、エタノール、グリセロールおよび水が挙げられる。
「担体」という用語は、医薬組成物の投与を容易にする、増強するまたは可能にするために活性成分が組み合わされる、天然、合成、有機、無機であり得る成分を指す。本明細書で使用される担体は、対象への投与に適した１つ以上の適合性の固体もしくは液体充填剤、希釈剤または封入物質であり得る。適切な担体としては、限定されないが、滅菌水、リンゲル、乳酸リンゲル、滅菌塩化ナトリウム溶液、等張食塩水、ポリアルキレングリコール、水素化ナフタレンおよび、特に、生体適合性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマーまたはポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンコポリマーが挙げられる。いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は等張食塩水を含む。
治療的使用のための薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤は、製薬分野で周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄｉｔ．１９８５）に記載されている。
医薬担体、賦形剤または希釈剤は、意図される投与経路および標準的な製薬慣行に関して選択することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、例えば、いくつかの実施形態では、特定の条件下でそのような組成物の安定性を高め得る１つ以上の添加剤をさらに含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、医薬組成物は、いくつかの実施形態では１つ以上の塩（例えばナトリウム塩）を含み得る凍結保護剤（例えばスクロース）および／または水性緩衝液をさらに含み得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、静脈内、動脈内、皮下、皮内または筋肉内に投与され得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、局所投与または全身投与用に製剤化される。全身投与は、消化管を介した吸収を含む経腸投与、または非経口投与を含み得る。本明細書で使用される場合、「非経口投与」は、静脈内注射などによる、消化管を介する以外の任意の方法での投与を指す。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、全身投与用、例えば静脈内投与用に製剤化される。
本明細書で使用される「同時投与」という用語は、異なる化合物または組成物が同じ患者に投与されるプロセスを意味する。異なる化合物または組成物は、同時に、本質的に同時に、または連続的に投与され得る。
本明細書に記載の薬剤および治療の効果
本明細書に記載の治療は、標的細胞上に免疫エフェクタ機能、例えばＴ細胞媒介エフェクタ機能をもたらし得、これは標的細胞の死滅をもたらし得る。いくつかの実施形態では、本発明の文脈におけるエフェクタ機能は、細胞傷害性ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋リンパ球（ＣＴＬ）の活性化、ならびに標的細胞、すなわち、例えばアポトーシスまたはパーフォリン媒介アポトーシスおよび細胞溶解を介した抗原、すなわちＣＬＤＮ６の発現を特徴とする細胞の排除、ＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αなどのサイトカインの産生、ならびに抗原発現標的細胞の特異的細胞傷害を含む。
活性化されると、細胞傷害性リンパ球は標的細胞の破壊を引き起こし得る。例えば、細胞傷害性Ｔ細胞は、以下の手段のいずれかまたは両方によって標的細胞の破壊を引き起こし得る。まず、活性化すると、Ｔ細胞は、パーフォリン、グランザイム、およびグラニュライシンなどの細胞毒を放出する。パーフォリンおよびグラニュライシンは標的細胞に細孔を作り、グランザイムは細胞に進入し、細胞のアポトーシス（プログラム細胞死）を誘導する細胞質のカスパーゼカスケードを引き起こす。第２に、アポトーシスは、Ｔ細胞と標的細胞との間のＦａｓ－Ｆａｓリガンド相互作用を介して誘導され得る。
いくつかの実施形態では、癌細胞によって発現されるＣＬＤＮ６に特異的な２つの結合ドメインおよびＴ細胞によって発現されるＣＤ３に特異的な結合ドメインを含む本明細書に記載の結合剤は、ＣＤ３を発現するＴ細胞の細胞傷害効果を、ＣＬＤＮ６を発現する癌細胞に標的化する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞上のＣＤ３への結合剤の結合は、Ｔ細胞の増殖および／または活性化をもたらす。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、細胞傷害性因子、例えばパーフォリンおよびグランザイムを放出し、癌細胞の細胞溶解およびアポトーシスを開始させる。いくつかの実施形態では、結合剤は、ＣＬＤＮ６を発現する癌細胞に対するＴ細胞媒介性細胞傷害を誘導する。いくつかの実施形態では、結合剤は、本明細書に記載の免疫エフェクタ機能を誘発する。いくつかの実施形態では、前記免疫エフェクタ機能は、その表面に腫瘍関連抗原ＣＬＤＮ６を担持する細胞に向けられる。
いくつかの実施形態では、癌細胞（１つ以上）は、膀胱癌、卵巣癌、特に卵巣腺癌および卵巣奇形癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を含む肺癌、特に扁平上皮肺癌および腺癌または非扁平上皮型の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、胃癌、乳癌、肝臓癌、膵臓癌、皮膚癌、特に基底細胞癌および扁平上皮癌、悪性黒色腫、頭頸部癌、特に悪性多形腺腫、肉腫、特に滑膜肉腫および癌肉腫、胆管癌、膀胱癌、特に移行上皮癌および乳頭癌、腎臓癌、特に腎明細胞癌および乳頭状腎細胞癌を含む腎細胞癌、結腸癌、回腸の癌を含む小腸癌、特に小腸腺癌および回腸の腺癌、精巣胎児性癌、胎盤絨毛癌、子宮頸癌、精巣癌、特に精巣セミノーマ、精巣奇形腫および胎児性精巣癌、子宮癌、奇形癌または胎児性癌などの胚細胞腫瘍、特に精巣の胚細胞腫瘍、ならびにその転移形態からなる群より選択される癌に由来する。
本明細書で使用される場合、「免疫応答」は、抗原または抗原を発現する細胞に対する統合された身体応答を指し、細胞性免疫応答および／または体液性免疫応答を指す。免疫系は、最も重要な自然免疫系と、それぞれが体液性成分および細胞性成分を含む脊椎動物の獲得免疫系または適応免疫系とに分けられる。
「細胞媒介性免疫」、「細胞性免疫」、「細胞性免疫応答」、または同様の用語は、抗原の発現を特徴とする、特にクラスＩまたはクラスＩＩ ＭＨＣによる抗原の提示を特徴とする細胞に対する細胞応答を含むことが意図されている。細胞応答は、免疫エフェクタ細胞、特に「ヘルパー」または「キラー」のいずれかとして働くＴ細胞またはＴリンパ球と呼ばれる細胞に関する。ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞とも呼ばれる）は、免疫応答を調節することによって中心的な役割を果たし、キラー細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、細胞溶解性Ｔ細胞とも呼ばれる）は、ウイルス感染細胞などの疾患細胞を死滅させ、さらなる疾患細胞の産生を防止する。
本発明の文脈における「免疫エフェクタ細胞」または「免疫反応性細胞」という用語は、免疫反応中にエフェクタ機能を発揮する細胞に関する。例えば、免疫エフェクタ細胞は、Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、腫瘍浸潤Ｔ細胞）、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、マクロファージ、および樹状細胞を含む。好ましくは、本発明の文脈において、「免疫エフェクタ細胞」は、Ｔ細胞、好ましくはＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞、最も好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞である。本発明によれば、「免疫エフェクタ細胞」という用語はまた、適切な刺激で免疫細胞（Ｔ細胞、特にＴヘルパー細胞、または細胞溶解性Ｔ細胞など）に成熟することができる細胞を含む。免疫エフェクタ細胞は、ＣＤ３４＋造血幹細胞、未成熟および成熟Ｔ細胞ならびに未成熟および成熟Ｂ細胞を含む。Ｔ細胞前駆体の細胞溶解性Ｔ細胞への分化は、抗原に曝露された場合、免疫系のクローン選択に類似する。
「Ｔ細胞」および「Ｔリンパ球」という用語は、本明細書では互換的に使用され、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）および細胞溶解性Ｔ細胞を含む細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を含むが、これらに限定されない。
Ｔ細胞は、リンパ球として公知の白血球の群に属し、細胞性免疫において中心的な役割を果たす。これらは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と呼ばれるこれらの細胞表面上の特別な受容体の存在によって、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞などの他のリンパ球型と区別することができる。胸腺は、Ｔ細胞の成熟に関与する主要な器官である。Ｔ細胞のいくつかの異なるサブセットが発見されており、それぞれが異なる機能を有する。
Ｔヘルパー細胞は、数ある機能の中でも特に、Ｂ細胞の形質細胞への成熟ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む免疫学的プロセスにおいて他の白血球を補助する。これらの細胞は、その表面にＣＤ４糖タンパク質を発現するので、ＣＤ４＋Ｔ細胞としても公知である。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原と共に提示された場合に活性化される。活性化されると、これらは速やかに分裂し、能動免疫応答を調節または補助するサイトカインと呼ばれる小さなタンパク質を分泌する。
細胞傷害性Ｔ細胞は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、移植拒絶反応にも関与する。これらの細胞は、その表面にＣＤ８糖タンパク質を発現するので、ＣＤ８＋Ｔ細胞としても公知である。これらの細胞は、身体のほぼあらゆる細胞の表面に存在する、ＭＨＣクラスＩに関連する抗原に結合することによってそれらの標的を認識する。
Ｔ細胞の大部分は、いくつかのタンパク質の複合体として存在するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有する。Ｔ細胞のＴＣＲは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合し、標的細胞の表面に提示される免疫原性ペプチド（エピトープ）と相互作用することができる。ＴＣＲの特異的結合は、Ｔ細胞内のシグナルカスケードを誘発し、増殖および成熟エフェクタＴ細胞への分化をもたらす。実際のＴ細胞受容体は、独立したＴ細胞受容体アルファおよびベータ（ＴＣＲαおよびＴＣＲβ）遺伝子から産生され、α－ＴＣＲ鎖およびβ－ＴＣＲ鎖と呼ばれる２つの別個のペプチド鎖から構成される。γδ Ｔ細胞（ガンマデルタＴ細胞）は、その表面に異なるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞の小さなサブセットである。しかし、γδ Ｔ細胞では、ＴＣＲは１本のγ鎖と１本のδ鎖で構成される。このＴ細胞の群は、αβ Ｔ細胞よりもはるかにまれである（全Ｔ細胞の２％）。
「体液性免疫」または「体液性免疫応答」は、分泌抗体、補体タンパク質、および特定の抗菌ペプチドなどの細胞外液に見出される高分子によって媒介される免疫の態様である。これは、細胞媒介性免疫とは対照的である。抗体が関与するその態様は、しばしば抗体媒介性免疫と呼ばれる。
「マクロファージ」という用語は、単球の分化によって産生される食細胞のサブグループを指す。炎症、免疫サイトカインまたは微生物産物によって活性化されるマクロファージは、マクロファージ内の外来病原体を、病原体の分解をもたらす加水分解および酸化攻撃によって非特異的に貪食し、死滅させる。分解されたタンパク質由来のペプチドは、マクロファージ細胞表面に提示され、そこでＴ細胞によって認識され得、Ｂ細胞表面の抗体と直接相互作用して、Ｔ細胞およびＢ細胞の活性化ならびに免疫応答のさらなる刺激をもたらすことができる。マクロファージは抗原提示細胞のクラスに属する。いくつかの実施形態では、マクロファージは脾臓マクロファージである。
「樹状細胞」（ＤＣ）という用語は、抗原提示細胞のクラスに属する食細胞の別のサブタイプを指す。いくつかの実施形態では、樹状細胞は、造血骨髄前駆細胞に由来する。これらの前駆細胞は、最初に未成熟な樹状細胞に変わる。これらの未成熟細胞は、高い食作用活性と低いＴ細胞活性化能とを特徴とする。未成熟な樹状細胞は、ウイルスおよび細菌などの病原体について周囲環境を絶えずサンプリングする。それらは、提示可能な抗原と接触すると、活性化されて成熟樹状細胞となり、脾臓またはリンパ節に移動し始める。未成熟樹状細胞は病原体を貪食し、それらのタンパク質を小さな断片に分解し、成熟すると、ＭＨＣ分子を使用してそれらの細胞表面にそれらの断片を提示する。同時に、それらは、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ４０などのＴ細胞活性化における共受容体として機能する細胞表面受容体を上方制御し、Ｔ細胞を活性化するそれらの能力を大幅に増強する。それらはまた、樹状細胞が血流を通って脾臓に、またはリンパ系を通ってリンパ節に移動するように誘導する走化性受容体であるＣＣＲ７を上方制御する。ここで、それらは抗原提示細胞として働き、非抗原特異的共刺激シグナルと共に抗原を提示することによってヘルパーＴ細胞およびキラーＴ細胞ならびにＢ細胞を活性化する。したがって、樹状細胞は、Ｔ細胞またはＢ細胞に関連する免疫応答を能動的に誘導することができる。いくつかの実施形態では、樹状細胞は脾臓樹状細胞である。
「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）という用語は、少なくとも１つの抗原または抗原断片をその細胞表面上に（またはその細胞表面で）表示、獲得、および／または提示することができる様々な細胞の１つである。抗原提示細胞は、プロフェッショナル抗原提示細胞と非プロフェッショナル抗原提示細胞とに区別することができる。
「プロフェッショナル抗原提示細胞」という用語は、ナイーブＴ細胞との相互作用に必要な主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ（ＭＨＣクラスＩＩ）分子を構成的に発現する抗原提示細胞に関する。Ｔ細胞が抗原提示細胞の膜上のＭＨＣクラスＩＩ分子複合体と相互作用する場合、抗原提示細胞は、Ｔ細胞の活性化を誘導する共刺激分子を産生する。プロフェッショナル抗原提示細胞は、樹状細胞およびマクロファージを含む。
「非プロフェッショナル抗原提示細胞」という用語は、ＭＨＣクラスＩＩ分子を構成的に発現しないが、インターフェロンガンマなどの特定のサイトカインによる刺激を受けると発現する抗原提示細胞に関する。例示的な非プロフェッショナル抗原提示細胞としては、線維芽細胞、胸腺上皮細胞、甲状腺上皮細胞、グリア細胞、膵臓ベータ細胞または血管内皮細胞が挙げられる。
「抗原プロセシング」は、抗原の、前記抗原の断片であるプロセシング産物への分解（例えばタンパク質のペプチドへの分解）、および抗原提示細胞などの細胞による特異的Ｔ細胞への提示のためのＭＨＣ分子とこれらの断片の１つ以上との会合（例えば結合による）を指す。
本明細書で使用される「活性化」または「刺激」は、検出可能な細胞増殖を誘導するのに十分に刺激されたＴ細胞などの免疫エフェクタ細胞の状態を指す。活性化はまた、シグナル伝達経路の開始、サイトカイン産生の誘導、および検出可能なエフェクタ機能に関連し得る。「活性化免疫エフェクタ細胞」という用語は、とりわけ、細胞分裂を受けている免疫エフェクタ細胞を指す。
「プライミング」という用語は、Ｔ細胞などの免疫エフェクタ細胞がその特異的抗原と最初に接触し、エフェクタＴ細胞などのエフェクタ細胞への分化を引き起こすプロセスを指す。
「クローン拡大」または「拡大」という用語は、特定の実体が増加するプロセスを指す。本開示の文脈において、この用語は、好ましくは、免疫エフェクタ細胞が刺激され、増殖し、特定の免疫エフェクタ細胞が増幅される免疫学的応答に関連して使用される。好ましくは、クローン拡大は免疫エフェクタ細胞の分化をもたらす。
治療
本発明は、対象において、本明細書に記載の疾患または障害、特にＣＬＤＮ６陽性癌などのＣＬＤＮ６の発現に関連する疾患を治療または予防するための方法および薬剤を提供する。本明細書に記載の方法は、本明細書に記載の結合剤をコードするＲＮＡを含む有効量の組成物を投与することを含み得る。
抗原に言及する場合の「発現に関連する疾患」という用語は、抗原に関係する任意の疾患、例えば抗原の存在を特徴とする疾患を指す。抗原は、腫瘍関連抗原、例えばＣＬＤＮ６などの疾患関連抗原であり得る。いくつかの実施形態では、抗原の発現に関連する疾患は、好ましくは細胞表面に抗原を発現する細胞が関与する疾患である。
本発明の治療化合物または治療組成物は、疾患もしくは障害に罹患しているか、または疾患もしくは障害を発症するリスクがある（もしくは発症しやすい）対象に、予防的に（すなわち、疾患または障害を予防するために）または治療的に（すなわち、疾患または障害を治療するために）投与され得る。そのような対象は、標準的な臨床方法を用いて同定され得る。本発明の文脈において、予防的投与は、疾患または障害が予防されるか、あるいはその進行が遅延されるように、疾患の明白な臨床症状の発現の前に行われる。医学の分野の文脈において、「予防する」という用語は、疾患による死亡または罹患の負担を軽減する任意の活性を包含する。予防は、一次、二次および三次予防レベルで行うことができる。一次予防は疾患の発症を回避するが、二次および三次レベルの予防は、機能を回復させ、疾患関連合併症を減少させることによって、疾患の進行および症状の出現を予防すること、ならびに既に確立された疾患の悪影響を減少させることを目的とした活動を包含する。
いくつかの実施形態では、本発明の薬剤または組成物の投与は、単回投与によって実施され得るか、または複数回投与によってブーストされ得る。
「疾患」という用語は、個体の身体に影響を及ぼす異常な状態を指す。疾患はしばしば、特定の症状および徴候に関連する医学的状態として解釈される。疾患は、感染症などの外部源に由来する因子によって引き起こされ得るか、または自己免疫疾患などの内部機能不全によって引き起こされ得る。ヒトでは、「疾患」はしばしば、罹患した個体に疼痛、機能不全、窮迫、社会的問題、もしくは死亡を引き起こす、または個体と接触するものに対して同様の問題を引き起こす状態を指すためにより広く使用される。このより広い意味では、疾患は時に、損傷、身体障害、障害、症候群、感染、孤立した症状、逸脱した挙動、ならびに構造および機能の非定型の変化を含む場合があるが、他の状況および他の目的では、これらは区別可能なカテゴリと見なされ得る。多くの疾患を患い、それらと共に生活することは、人生観および人格を変える可能性があるため、疾患は通常、身体的だけでなく感情的にも個体に影響を及ぼす。
本明細書で使用される場合、「疾患」という用語は、癌、特に本明細書に記載の癌の形態を含む。本明細書における癌または癌の特定の形態への言及は、その癌転移も含む。いくつかの実施形態では、本出願に従って治療される疾患は、ＣＬＤＮ６を発現する細胞に関連する。
「ＣＬＤＮ６を発現する細胞に関連する疾患」または同様の表現は、本発明によれば、ＣＬＤＮ６が疾患組織または器官の細胞で発現されることを意味する。いくつかの実施形態では、疾患組織または器官の細胞におけるＣＬＤＮ６の発現は、健康な組織または器官における状態と比較して増加している。増加は、少なくとも１０％、特に少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、少なくとも１，０００％、少なくとも１０，０００％またはさらにそれ以上の増加を指す。いくつかの実施形態では、発現は罹患組織でのみ見出され、健常組織での発現は抑制されている。本発明によれば、ＣＬＤＮ６を発現する細胞に関連する疾患には、癌疾患が含まれる。さらに、本発明によれば、癌疾患は、好ましくは、癌細胞がＣＬＤＮ６を発現するものである。
本明細書で使用される場合、「癌疾患」または「癌」は、異常に制御された細胞成長、増殖、分化、接着、および／または遊走を特徴とする疾患を含む。「腫瘍細胞」とは、急速で制御されない細胞増殖によって成長し、新たな成長を開始させた刺激が停止した後も成長し続ける異常細胞を意味する。好ましくは、「癌疾患」は、ＣＬＤＮ６を発現する細胞を特徴とし、癌細胞はＣＬＤＮ６を発現する。ＣＬＤＮ６を発現する細胞は、好ましくは癌細胞、好ましくは本明細書に記載の癌の癌細胞である。
本発明による「癌」という用語には、白血病、セミノーマ、黒色腫、奇形腫、リンパ腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、副腎癌、甲状腺癌、血液癌、皮膚癌、脳の癌、子宮頸癌、腸癌、肝臓癌、結腸癌、胃癌、腸癌、頭頸部癌、消化器癌、リンパ節癌、食道癌、結腸直腸癌、膵臓癌、鼻咽喉（ＥＮＴ）癌、乳癌、前立腺癌、子宮癌、卵巣癌および肺癌、ならびにそれらの転移が含まれる。それらの例は、肺癌腫、乳房癌腫、前立腺癌腫、結腸癌腫、腎細胞癌腫、子宮頸癌腫、または上記の癌型もしくは腫瘍の転移である。本発明による癌という用語は、癌転移も含む。
本発明によれば、「癌腫」は、上皮細胞に由来する悪性腫瘍である。この群は、乳癌、前立腺癌、肺癌および結腸癌の一般的な形態を含む、最も一般的な癌である。
「腺癌」は、腺組織に由来する癌である。この組織はまた、上皮組織として知られるより大きな組織カテゴリの一部である。上皮組織には、皮膚、腺、ならびに体腔および身体の器官の内側を覆う様々な他の組織が含まれる。上皮は、発生学的には外胚葉、内胚葉および中胚葉に由来する。腺癌として分類されるために、細胞は、分泌特性を有する限り、必ずしも腺の一部である必要はない。この形態の癌腫は、ヒトを含む一部の高等哺乳動物で発生し得る。十分に分化した腺癌は、それらが由来する腺組織に類似する傾向があるが、十分に分化していないものはその傾向がない場合もある。生検から細胞を染色することによって、病理学者は、腫瘍が腺癌であるかまたは何らかの他の種類の癌であるかを決定する。腺癌は、体内の腺の遍在性のために、身体の多くの組織で発生し得る。各腺は同じ物質を分泌していない可能性があるが、細胞への外分泌機能がある限り、腺と見なされ、したがってその悪性形態は腺癌と命名される。悪性腺癌は他の組織に浸潤し、転移するのに十分な時間があれば転移することが多い。卵巣腺癌は、最も一般的な種類の卵巣癌である。これには、漿液性および粘液性腺癌、明細胞腺癌ならびに類内膜腺癌が含まれる。
「転移」とは、癌細胞がその元の部位から身体の別の部分に広がることを意味する。転移の形成は非常に複雑な過程であり、原発性腫瘍からの悪性細胞の分離、細胞外マトリックスの侵襲、体腔および血管に入るための内皮基底膜の貫通、次いで血液によって輸送された後、標的器官の浸潤に依存する。最後に、標的部位における新しい腫瘍の成長は血管新生に依存する。腫瘍転移は、腫瘍細胞または成分が残存し、転移能を発現し得るので、原発性腫瘍の除去後でさえもしばしば起こる。いくつかの実施形態では、本発明による「転移」という用語は、原発性腫瘍および所属リンパ節系から離れた転移に関する「遠隔転移」に関する。いくつかの実施形態では、本発明による「転移」という用語は、リンパ節転移に関する。本発明の治療を用いて治療可能な転移の１つの特定の形態は、原発部位として胃癌に由来する転移である。好ましい実施形態では、そのような胃癌転移は、クルーケンベルグ腫瘍、腹膜転移および／またはリンパ節転移である。
本明細書で使用される場合、「切除不能腫瘍」という用語は、典型的には、健全な医学的判断に従って、腫瘍が手術によって安全に（例えば、対象に過度の害を与えることなく）除去することができないことを示すと考えられる１つ以上の特徴によって特徴付けられる腫瘍、および／または適格な医療専門家が、腫瘍除去の対象に対するリスクがそのような除去に関連する利益を上回ると判断した腫瘍を指す。いくつかの実施形態では、切除不能腫瘍は、必須の器官もしくは組織（再建可能でない可能性がある血管を含む）に関与し、かつ／もしくはその中に成長した腫瘍、ならびに／または１つ以上の他の重要なもしくは必須の器官および／もしくは組織（血管を含む）に対する損傷の不当な危険性を伴わずに外科的に容易にアクセスすることができない場所にある腫瘍を指す。いくつかの実施形態では、腫瘍の「切除不能性」は、マージン陰性（Ｒ０）切除を達成する可能性を指す。膵臓癌に関連して、上腸間膜動脈（ＳＭＡ）または腹腔動脈などの腫瘍による大血管のエンケースメント、門脈閉塞、および腹腔または傍大動脈リンパ節症の存在が、一般に、Ｒ０手術を不可能にする所見として認められている。当業者は、腫瘍が切除不能であるか否かを決定するパラメータを理解するであろう。
「標的細胞」とは、癌細胞などの望ましくない細胞を意味する。好ましい実施形態では、標的細胞はＣＬＤＮ６を発現する。
いくつかの実施形態では、ＣＬＤＮ６陽性癌は、ＣＬＤＮ６陽性の進行性固形腫瘍を含む。いくつかの実施形態では、ＣＬＤＮ６陽性癌は、特に臨床的利益を与える可能性が高い利用可能な標準治療がない、進行性／転移性ＣＬＤＮ６陽性卵巣癌、非扁平上皮型の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、子宮内膜癌および精巣癌からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、ＣＬＤＮ６陽性癌は、まれな腫瘍および未知の原発性の癌を含む、特定不能（ＮＯＳ）腫瘍を含む。そのような癌は、ＣＬＤＮ６発現について試験することができる。
いくつかの実施形態では、ＣＬＤＮ６陽性癌は、膀胱癌、卵巣癌、特に卵巣腺癌および卵巣奇形癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を含む肺癌、特に扁平上皮肺癌および腺癌または非扁平上皮型の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、胃癌、乳癌、肝臓癌、膵臓癌、皮膚癌、特に基底細胞癌および扁平上皮癌、悪性黒色腫、頭頸部癌、特に悪性多形腺腫、肉腫、特に滑膜肉腫および癌肉腫、胆管癌、膀胱癌、特に移行上皮癌および乳頭癌、腎臓癌、特に腎明細胞癌および乳頭状腎細胞癌を含む腎細胞癌、結腸癌、回腸の癌を含む小腸癌、特に小腸腺癌および回腸の腺癌、精巣胎児性癌、胎盤絨毛癌、子宮頸癌、精巣癌、特に精巣セミノーマ、精巣奇形腫および胎児性精巣癌、子宮癌、奇形癌または胎児性癌などの胚細胞腫瘍、特に精巣の胚細胞腫瘍、ならびにその転移形態からなる群より選択される。
本文脈において、「治療」、「治療する」または「治療介入」という用語は、疾患または障害などの状態と闘うことを目的とした対象の管理およびケアに関する。この用語は、症状もしくは合併症を緩和するため、疾患、障害もしくは状態の進行を遅らせるため、症状および合併症を緩和もしくは軽減するため、ならびに／または疾患、障害もしくは状態を治癒もしくは排除するため、ならびに状態を予防するための治療上有効な化合物の投与などの、対象が罹患している所与の状態に対するあらゆる範囲の治療を含むことが意図されており、予防は、疾患、状態または障害と闘うことを目的とした個体の管理およびケアとして理解されるべきであり、症状または合併症の発症を防止するための活性化合物の投与を含む。
「治療的処置」という用語は、個体の健康状態を改善する、および／または寿命を延長する（増加させる）任意の治療に関する。前記治療は、個体における疾患を排除し得る、個体における疾患の発症を停止もしくは遅延させ得る、個体における疾患の発症を阻害もしくは遅延させ得る、個体における症状の頻度もしくは重症度を低下させ得る、および／または現在疾患を有しているかもしくは以前に有していたことがある個体における再発を減少させ得る。
「予防的処置」または「予防処置」という用語は、個体において疾患が発生するのを防ぐことを意図した任意の治療に関する。「予防的処置」または「予防処置」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
「個体」および「対象」という用語は、本明細書では互換的に使用される。これらは、疾患または障害に罹患し得るかまたは罹患しやすいが、疾患または障害を有していても有していなくてもよいヒトまたは別の哺乳動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマもしくは霊長動物）を指す。多くの実施形態では、個体はヒトである。特に明記されない限り、「個体」および「対象」という用語は特定の年齢を示すものではなく、したがって成人、高齢者、小児、および新生児を包含する。本開示の実施形態では、「個体」または「対象」は「患者」である。
「患者」という用語は、治療のための個体または対象、特に疾患個体または対象を意味する。
本明細書で参照される文書および試験の引用は、前述のいずれかが関連する先行技術であることの承認として意図されていない。これらの文書の内容に関する全ての記述は、出願人が入手可能な情報に基づいており、これらの文書の内容の正確さに関するいかなる承認も構成しない。
以下の説明は、当業者が様々な実施形態を作成および使用することを可能にするために提示される。特定の装置、技術および用途の説明は、例としてのみ提供される。本明細書に記載される例に対する様々な変更は、当業者には容易に明らかであり、本明細書で定義される一般的な原理は、様々な実施形態の精神および範囲から逸脱することなく他の例および用途に適用され得る。したがって、様々な実施形態は、本明細書に記載され、示される例に限定されることを意図するものではなく、特許請求の範囲と一致する範囲を与えられるべきである。
実施例１：ＢＮＴ１４２の物理的、化学的および薬学的特性。
原薬
ＢＮＴ１４２原薬は、ＣＬＤＮ６およびＣＤ３に対する抗原結合断片（Ｆａｂ）－（ｓｃＦｖ）２ベースの二重特異性抗体－またはトリボディ－の重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）をコードするＲＮＡ混合物であり、以下、ＲｉｂｏＭａｂ０２．１と称する。ＲｉｂｏＭａｂ０２．１は、ＣＬＤＮ６およびＣＤ３イプシロン（ε）鎖の立体構造エピトープを認識する。原薬の活性成分は、それぞれのタンパク質サブユニットに翻訳され、標的細胞において完全二重特異性抗体を形成する２つの一本鎖の５’キャップおよびＮ１－メチルプソイドウリジン修飾ＲＮＡの混合物である。図１は、インビトロＲＮＡ転写のための鋳型として使用される線状化プラスミドデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のそれぞれのヌクレオチド配列によって決定される、タンパク質コードＲＮＡの一般構造の概略図を示す。ＨＣおよびＬＣをコードする配列に加えて、各ＲＮＡは、安定性および翻訳効率に関して最大有効性のために最適化された共通の構造要素（５’キャップ、５’－非翻訳領域［ＵＴＲ］、３’－ＵＴＲ、およびポリ［Ａ］尾部）を含む。
製剤
製剤の説明
製剤は、ＩＶ投与用の水性緩衝液中の滅菌ＲＮＡ－ＬＮＰ分散液である。製剤の製造は、特殊な脂質成分で構成されるナノスケール脂質粒子へのＲＮＡの封入を含む。ＬＮＰに製剤化されると、ＲＮＡ原薬は血清中での分解から保護される。ＬＮＰ製剤は、エンドソーム区画から細胞サイトゾルへのＲＮＡの脱出を可能にし、そこでＲＮＡは機能性タンパク質への翻訳に利用可能となる。ＢＮＴ１４２製剤の組成を表２に示す。
Figure 2024525795000056
ＡＬＣ－０３６６、（（３－ヒドロキシプロピル）アザンジイル）ビス（ノナン－９，１－ジイル）ビス（２－ブチルオクタノエート）；
ＡＬＣ－０１５９、２－［（ポリエチレングリコール）－２０００］－Ｎ，Ｎ－ジテトラデシルアセトアミド；
ＤＳＰＣ＝１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン；ＤＳ＝原薬；Ｐｈ．Ｅｕｒ．＝ヨーロッパ薬局方；ｑ．ｓ．＝必要量（十分であり得る量）；ＵＳＰ－ＮＦ＝米国薬局方および国民医薬品集
製剤のｐＨおよび重量オスモル濃度は、典型的には、それぞれｐＨ６．９～７．９および４２５～６２５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの範囲である。動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定されるＬＮＰ粒径は、約５０～１００ｎｍの範囲であり、多分散指数は０．２以下である。製剤の粒径は、標的組織に到達するその能力、その薬物負荷能力、および製品安全性を最適化するように選択されている。
標的細胞によって取り込まれると、重鎖および軽鎖をコードするＲＮＡは、それぞれのタンパク質に翻訳され、折り畳まれ、組み立てられて完全二重特異性抗体を形成し、その後分泌される。抗体は、細胞傷害性Ｔ細胞を腫瘍細胞に動員することによってＣＬＤＮ６を発現する腫瘍細胞に特異的に作用し、標的依存性ポリクローナルＴ細胞活性化および腫瘍細胞溶解を誘導するために全身的に利用可能である。
ＢＮＴ１４２製剤は、ＲＮＡ－ＬＮＰとして製剤化された１ｍｇ／ｍＬのＲＮＡ（第１のＲＮＡと第２のＲＮＡの両方を１．５：１の重量比で含む）を含有する単回使用ガラスバイアル中の注射用凍結濃縮懸濁液として提供される。解凍後、製剤を市販の等張ＮａＣｌ溶液（０．９％）で希釈し、インラインフィルタで濾過する。ＩＭＰは、ＩＶ投与によって患者に投与される。
実施例２：非臨床試験
ＢＮＴ１４２非臨床パッケージは、ＲｉｂｏＭａｂ０２．１の概念実証を確立し、作用機構を評価する一次ＰＤ試験、ならびにオフターゲットプロファイリングを予測し、ＲｉｂｏＭａｂ０２．１による非特異的Ｔ細胞活性化およびサイトカイン放出を調べる二次ＰＤ試験を含む。さらに、ＲｉｂｏＭａｂ０２．１のＣＬＤＮ６結合部分の組織交差反応性をＧＬＰ準拠試験で検討した。ＢＮＴ１４２は技術的にはその範囲内にないが、医薬品規制調和国際会議（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｆｏｒ Ｈａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎ）（ＩＣＨ）ガイドラインＳ６、Ｓ７Ａ／ＢおよびＳ９、ならびにＣＤ３結合Ｔ細胞エンゲージャに関するＦＤＡ勧告に従った。
製剤（ＲＮＡ－ＬＮＰ）の安全面を評価する場合に、上記のガイドラインも考慮した。ここで、安全性薬理学および（免疫）毒性試験ではプラットフォームアプローチを使用している。以前に実証されたように、ＲＮＡプラットフォームおよび使用されるＬＮＰに固有の安全面は、ＲＮＡの配列または長さとはほとんど無関係であり、むしろＲＮＡおよび／またはＬＮＰの用量および種類に依存する。このため、ＲＮＡ－ＬＮＰプラットフォーム試験として、安全性薬理の読み出しを含む単回投与およびＧＬＰ準拠反復投与毒性試験を実施した。これらのインビボ試験に免疫毒性の読み出しを含めることに加えて、製剤媒介免疫毒性もインビトロで対処した。
ＰＫ試験は、製品の異なる面に対処する。第１に、コードされたＲｉｂｏＭａｂ０２．１のＰＫプロファイルを異なる種において特徴付け、ＢＮＴ１４２の用量曝露を解明した。第２に、代用ＲＮＡを使用して、ＬＮＰの生体内分布およびタンパク質発現などのプラットフォーム特性に対処した。さらに、ＡＬＣ－０３６６およびＡＬＣ－０１５９の代謝を、この脂質の血漿および肝臓ＰＫプロファイルも特徴付ける試験からのラット血漿、尿、糞便および肝臓試料においてインビトロで評価し、ＡＬＣ－０１５９についてはインビボでも評価した。
２．１ 非臨床薬理学
一次薬力学
一次ＰＤ試験は、ＢＮＴ１４２原薬のタンパク質への翻訳およびその治療標的であるヒトＣＤ３およびＣＬＤＮ６に関連するコードされた二重特異性タンパク質ＲｉｂｏＭａｂ０２．１の所望の作用機構などの効果を調べるインビトロおよびインビボ試験である。
ＲｉｂｏＭａｂ０２．１はヒトＣＤ３および癌胎児抗原ＣＬＤＮ６に特異的に結合する
ＣＬＤＮ６およびヒトＣＤ３に対するＲｉｂｏＭａｂ０２．１の標的特異性を決定するために、ＢＮＴ１４２でトランスフェクションされたＨＥＫ－２９３Ｔ－１７産生細胞において発現されるＲｉｂｏＭａｂ０２．１を含有する細胞培養上清を使用して、フローサイトメトリ結合アッセイを行った。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＲｉｂｏＭａｂ０２．１ ＣＤ３結合アームの標的細胞として使用し、カニクイザル由来ＰＢＭＣを種対照として使用した。安定なタンパク質発現のためにＣＬＤＮ６を形質導入したＨＥＫ－２９３Ｔ－１７細胞を、２つのＲｉｂｏＭａｂ０２．１ ＣＬＤＮ６結合アームの標的細胞として使用した。密接に関連するクローディンＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４およびＣＬＤＮ９に対するＲｉｂｏＭａｂ０２．１の交差反応性を評価するために、それぞれがＣＬＤＮ分子の１つを異種発現するＨＥＫ－２９３Ｔ－１７安定形質導入体へのＲｉｂｏＭａｂ０２．１の結合を試験した。ＲｉｂｏＭａｂ０２．１はＣＬＤＮ６に特異的に結合し、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４またはＣＬＤＮ９には結合しなかった。同様に、ヒトＣＤ３のみがＲｉｂｏＭａｂ０２．１によって認識され、サルＣＤ３は認識されなかった（図２）。
インビボ産生ＲｉｂｏＭａｂ０２．１は用量依存的かつ標的特異的な腫瘍細胞溶解を媒介する
ＢＮＴ１４２を投与したＢａｌｂ／ｃＪＲｊマウスにおいて産生されたＲｉｂｏＭａｂ０２．１の生物活性を、Ｔ細胞媒介細胞傷害性アッセイにおいて細胞傷害能を分析することによってエクスビボで評価した。ルシフェラーゼ発現細胞株を使用して、生物発光に基づく細胞傷害性アッセイを行った。ＣＬＤＮ６陽性ヒト卵巣癌細胞株ＰＡ－１およびＯＶ－９０は、標的依存性溶解効率を決定するのに役立ち、一方、標的陰性ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１を陰性対照として使用して、標的特異的溶解を確認した。ヒトＴ細胞応答のドナー依存性の不均一性を反映するために、８人の異なる健常ドナー由来のヒトＰＢＭＣをエフェクタ細胞として使用した。標的陽性細胞株の倍加時間に従って、ＰＡ－１含有アッセイを２４時間、ＯＶ－９０含有アッセイを４８時間インキュベートした。それに応じて対照をインキュベートした。Ｂａｌｂ／ｃＪＲｊマウスにおいて産生されたＲｉｂｏＭａｂ０２．１は、標的特異的かつ用量依存的な細胞傷害性を効率的に媒介し、ＥＣ５０値は、ドナーＰＢＭＣの活性に依存して、ＰＡ－１細胞については０．００４～０．２００ｎｇ／ｍＬ（０．０４～２．００ｐＭ）、ＯＶ－９０細胞については０．０７～２．０７ｎｇ／ｍＬ（０．７～２０．７ｐＭ）（それぞれ図３ＡおよびＢ）の範囲であった。
ＲｉｂｏＭａｂ０２．１含有マウス血清は、ＣＬＤＮ６陰性ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株で標的非依存性（非特異的）溶解を誘導しなかった（図３）。
インビトロ発現ＲｉｂｏＭａｂ０２．１は用量依存的かつ標的特異的なＴ細胞増殖をもたらす
ＨＥＫ－２９３Ｔ－１７産生細胞をＢＮＴ１４２または対照ＲｉｂｏＭａｂコードＲＮＡでトランスフェクトした。ＲｉｂｏＭａｂ０２．１または対照ＲｉｂｏＭａｂ（無関係なＴＡＡに特異的）を含有する上清を被験物質として使用した。２つの濃度（１００または１ｎｇ／ｍＬ）のＲｉｂｏＭａｂ含有上清を、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）標識ヒトＰＢＭＣと標的陽性または陰性細胞との共培養物に添加した。ＰＡ－１またはＯＶ－９０をＣＬＤＮ６陽性細胞として使用し、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１を標的陰性細胞として使用した。ＣＬＤＮ６陰性ＮＵＧＣ－４細胞（無関係なＴＡＡを発現する）および標的細胞の非存在下のＰＢＭＣをさらなる特異性対照として含めた。３人の健常ドナー由来のＰＢＭＣをこのアッセイで比較した。７２時間のインキュベーション後、Ｔ細胞をフローサイトメトリによって分析して、標的依存性増殖を判定した。ＰＡ－１細胞の存在下では、およそ５８±２％および４４±７％のＴ細胞増殖が、それぞれ１００ｎｇ／ｍＬおよび１ｎｇ／ｍＬのＲｉｂｏＭａｂ０２．１によって誘導され、ＯＶ－９０細胞では、２４±３％および２±３％のＴ細胞増殖が誘導された（図４）。対照的に、ＲｉｂｏＭａｂ０２．１によって駆動されるＴ細胞増殖は、ＮＵＧＣ－４細胞またはＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞と共培養したＰＢＭＣにおいても、標的細胞の非存在下においても見られなかった（図４）。Ｔ細胞活性化の陽性対照として使用したヒトＣＤ３特異的抗体ＯＫＴ３は、標的細胞の存在下および非存在下で強力な活性化をもたらした。
ＲｉｂｏＭａｂ０２．１は、ＥＣ５０をはるかに上回る用量でのみ標的非依存性Ｔ細胞活性化を誘発する
ＲｉｂｏＭａｂ０２．１の標的特異的生物活性の範囲を決定するために、主要な作用機構としてのＴ細胞活性化を読み出しとして使用した。ＲｉｂｏＭａｂ０２．１含有試料および模擬血清試料を、ＢＮＴ１４２またはルシフェラーゼをコードするＲＮＡ－ＬＮＰ（Ｌｕｃ＿ＲＮＡ－ＬＮＰ；模擬）のいずれかを投与されたマウスから得た。３人の健常ドナー由来のヒトＰＢＭＣをエフェクタ細胞として使用した。血清試料を、４，０００ｎｇ／ｍＬで開始して段階希釈し（１０倍、１０個の点）、単独でまたはＣＬＤＮ６陽性ＰＡ－１標的細胞と一緒に１０：１のエフェクタ対標的細胞比で培養したＰＢＭＣに添加した。４８時間のインキュベーション後、Ｔ細胞を、それぞれ初期活性化マーカＣＤ６９および後期活性化マーカＣＤ２５の表面発現についてフローサイトメトリによって分析した。４０ｎｇ／ｍＬ ＲｉｂｏＭａｂ０２．１まで、ドナーのいずれからのＰＢＭＣにおいてもオフターゲットＴ細胞活性化は見られなかった。４００および４，０００ｎｇ／ｍＬの２つの最も高いＲｉｂｏＭａｂ０２．１濃度は、それぞれ２～６％および６～１９％のオフターゲットＴ細胞活性化（バックグラウンドレベルを超える）をもたらした（図５、左）。３人のドナー全ての平均ＥＣ５０値（図５、右）は、標的細胞の存在下で０．０２６ｎｇ／ｍＬ（０．３ｐＭ）と決定された。ＯＫＴ３陽性対照は、標的細胞ありおよび標的細胞なしで＞５０％のＴ細胞活性化をもたらした（データは示していない）。Ｔ細胞上のＣＤ６９の上方制御はＣＤ２５の上方制御よりも高かった；ＣＤ２５陽性細胞は、ほとんど排他的にＣＤ６９二重陽性であり、初期活性化状態を指し示した（データは示していない）。
結論として、ＲｉｂｏＭａｂ０２．１は、ＥＣ５０値の１，５００倍を超える濃度までＴ細胞の標的依存性活性化を媒介する。
静脈内投与されたＢＮＴ１４２は、腫瘍へのＴ細胞の再指向によってマウスにおける異種移植腫瘍排除を媒介する
インビボでのＢＮＴ１４２の抗腫瘍効果を決定するために、ＣＬＤＮ６陽性ヒト卵巣癌（ＯＶ－９０）異種移植マウスモデルを使用した。手短に述べると、免疫不全の雄および雌のＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｓｃｉｄ ＩＬ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスに、ヒトＯＶ－９０卵巣癌細胞を皮下（ＳＣ）接種した。確立された腫瘍（平均サイズ≧３０ｍｍ３）を有するマウスに、健常ドナー由来のヒトＰＢＭＣを腹腔内（ＩＰ）に移植した（得られたマウスモデルをＮＳＧ／ＰＢＭＣと注釈付けた）。７日後、ＢＮＴ１４２または対照項目の５回の毎週の単回ＩＶボーラス注射を含む処置レジメンを開始した。ＢＮＴ１４２を、マウス１匹当たり０．１または１μｇ（約０．００４および０．０４ｍｇ／ｋｇ）の用量で投与した。標的特異性対照として、無関係なＴＡＡ×ＣＤ３結合トリボディタンパク質をコードする１μｇの対照ＲＮＡ－ＬＮＰを適用した。ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ、生理食塩水）単独および１μｇのＬｕｃ＿ＲＮＡ－ＬＮＰを陰性対照として使用し、組換え精製ＣＤ３ｘ（ＣＬＤＮ６）２トリボディ参照タンパク質（１００μｇ／動物、約４ｍｇ／ｋｇ）を陽性対照として使用した（図６Ａ）。
腫瘍体積は、２回目の処置後に１μｇのＢＮＴ１４２で縮小し始め、３回目の処置後に０．１μｇのＢＮＴ１４２または１００μｇの参照タンパク質で縮小し始めた。実験終了まで、着実な低下が維持された（図６Ｂ、Ｃ）。陰性対照のいずれも、概して、腫瘍体積の減少を示さなかった。
群当たり４匹のマウス（０．１μｇのＢＮＴ１４２群についてのみ５匹のマウス）を３回目の注射の７２時間後に安楽死させて、異種移植腫瘍における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を評価した。平均して、０．１および１μｇのＢＮＴ１４２で処置されたマウスにおいて、それぞれ１，３１０および１，７９７ＴＩＬ／ｍｍ２の異種移植腫瘍組織が認められた（図６ＤおよびＦ）。参照タンパク質処置は、平均１，５４２ＴＩＬ／ｍｍ２の腫瘍組織をもたらしたが、陰性対照群は、１３９～４１０ＴＩＬ／ｍｍ２の腫瘍組織を示した。腫瘍組織中のＣＬＤＮ６陽性細胞の割合を、ＯＶ－９０接種後３８日目以後の異なる時点で数匹のマウスについて分析した。ＣＬＤＮ６陽性細胞の最も低いパーセンテージ（腫瘍細胞死滅／排除の増加を示す）は、１μｇのＢＮＴ１４２、続いて参照タンパク質および０．１μｇのＢＮＴ１４２で処置したマウス由来の腫瘍異種移植片において見出された（図６ＥおよびＦ）。
まとめると、ＢＮＴ１４２処置群および参照タンパク質処置群のマウスは、陰性対照群とは対照的に、異種移植腫瘍におけるより高いＴ細胞浸潤およびより低いＣＬＤＮ６陽性と同時に、有意な腫瘍減少を示した。
副次的薬力学
二次ＰＤ試験は、その治療標的ＣＬＤＮ６に関連しないコードされた二重特異性タンパク質ＲｉｂｏＭａｂ０２．１の作用機構および効果を調べるインビトロおよびインビボ試験として定義される。
ＲｉｂｏＭａｂ０２．１は、インビトロでヒト炎症促進性サイトカインの標的依存的放出を誘導する
オンターゲットサイトカイン放出およびオフターゲットサイトカイン放出のＲｉｂｏＭａｂ０２．１依存的誘導を調べるために、Ｔ細胞活性化アッセイから得られた細胞培養上清を分析した。ヒト炎症促進性サイトカインのＩＦＮ－γ、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０およびＴＮＦ－αのレベルを、特注のマルチプレックスＥＬＩＳＡキットを使用して測定した。ＲｉｂｏＭａｂ０２．１は、標的細胞の存在下で用量依存的およびドナー依存的に全てのサイトカインの放出を誘導した。１人のドナーおよび最高濃度のＲｉｂｏＭａｂ０２．１で見られたＩＬ－６の低い誘導を除いて、ＣＬＤＮ６陽性ＰＡ－１標的細胞の非存在下ではサイトカイン誘導は観察されなかった（図７）。陽性対照ＯＫＴ３は、標的細胞の存在下および非存在下でサイトカイン放出を誘導したが、模擬血清（Ｌｕｃ＿ＲＮＡ－ＬＮＰ投与マウス由来）はサイトカイン産生を誘導しなかった（データは示していない）。
ＰＢＭＣヒト化マウスへのＢＮＴ１４２のインビボ投与はヒト炎症促進性サイトカイン放出を誘導しない
ヒト炎症促進性サイトカインＩＦＮ－γ、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０およびＴＮＦ－αを、３回目のＢＮＴ１４２投与の６時間後および７２時間後に得られたＯＶ－９０ヒト異種移植腫瘍担持ＮＳＧ／ＰＢＭＣマウスの血清試料において測定した（上記参照）。腫瘍を有さないＮＳＧ／ＰＢＭＣマウスのさらなる群を１μｇのＢＮＴ１４２で処置した。サイトカイン誘導は、評価したいずれの時点でもＢＮＴ１４２処置群または対照群では見られなかったが（図８Ａ）、参照タンパク質群のマウスは、６時間の時点で６つ全てのサイトカインの一過性であるが有意な上昇を示した。データを、それぞれの時点で生理食塩水対照群で得られた値に対して正規化した。活性薬物ＲｉｂｏＭａｂ０２．１（１μｇのＢＮＴ１４２によってコードされる）および参照タンパク質の全身アベイラビリティは同等であった（図８Ｂ）。
ＧＬＰ準拠組織交差反応性試験
ＲｉｂｏＭａｂ０２．１の潜在的な非特異的結合を調べるために、３つの濃度（１０、５、１μｇ／ｍＬ）で親キメラＩｇＧ抗体ＩＭＡＢ２０６－Ｃ４６Ｓ（同一の抗ＣＬＤＮ６ ＣＤＲを共有する）を使用した完全ヒト組織交差反応性（ＴＣＲ）試験をＧＬＰに従って行った。分析した成人正常ヒト組織（ＦＤＡ １９９７）および所見を表３に要約する。
Figure 2024525795000057
簡単に述べると、全ての試験された組織のうちで、副腎および胎盤の絨毛の内分泌細胞のみが、適用された被験物質の３つ全ての濃度で１／３のドナーにおいて陽性に染色された。膜染色は検出できず、観察された結合は全て細胞質性であった。細胞質結合は、細胞区画が切片化プロセスによって人工的に露出され、被験物質のアクセスを可能にしていることによってのみ可能である。この状況はインビボでは起こらず、したがって細胞質結合は関連性があるとは考えられない。他の交差反応性または非特異的結合は観察されなかった。
オフターゲット結合アッセイ（非ＧＬＰ）
ＲｉｂｏＭａｂ０２．１の潜在的な非特異的標的を調べるために、トリボディ参照タンパク質（ＲｉｂｏＭａｂ０２．１と同一配列）を用いた細胞マイクロアレイスクリーニングを行った。３７１個のヘテロ二量体を含む、６，２３９個の異なる全長ヒト原形質膜タンパク質および細胞表面係留ヒト分泌タンパク質を個別に過剰発現する、固定されたヒトＨＥＫ２９３細胞に対する結合について、トリボディをスクリーニングした。
トリボディ参照タンパク質は、ＣＤ３δまたはＣＤ３γのいずれかとＣＬＤＮ６とのヘテロ二量体として発現された場合、その一次標的ＣＤ３εとの特異的相互作用を示した。これにもかかわらず、ＣＬＤＮ９とのさらなる弱いオフターゲット相互作用が観察された。他の結合は観察されなかった。
安全性薬理学
ＩＣＨガイドラインＳ７Ａは、安全性薬理試験のコアバッテリーがヒト曝露前に医薬品に対して実施されるべきであることを示している。中枢神経系（ＣＮＳ）および呼吸器系に対する最大約５ｍｇ／ｋｇのＲＮＡ－ＬＮＰの潜在的な影響を、マウスで実施されたＧＬＰ準拠反復投与毒性試験の一部として評価した。さらに、心血管安全性エンドポイント（血圧、心拍数および心電図パラメータ）に対する最大０．１５ｍｇ／ｋｇのＢＮＴ１４２の影響を、カニクイザルにおける非ＧＬＰ試験で評価した。マウス試験では、空のＬＮＰで処置した対照アームを含めた。
呼吸器安全性
ＲＮＡ－ＬＮＰの呼吸器安全性を、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて実施されたＧＬＰ準拠反復投与毒性試験に含まれるサテライト動物で評価した。４回の毎週の注射を投与し、２回目および４回目の注射の４時間後および２４時間後に全身プレチスモグラフィを実施した。
マウスを、それぞれ４匹の雄および４匹の雌を含む４つの群に割り当てた。第１群および第２群は対照群であり、生理食塩水（第１群）およびＲＮＡを含まないが約５ｍｇ／ｋｇ群と同等の脂質含有量を有する空のＬＮＰ（第２群）を投与した。処置群には、約１．５ｍｇ／ｋｇ（第３群）および約５ｍｇ／ｋｇ（第４群）の用量のＲＮＡ－ＬＮＰを投与した。プレチスモグラフィは、被験物質に関連する効果を明らかにしなかった。
ＣＮＳ安全性
ＲＮＡ－ＬＮＰによって誘導される神経学的影響、行動的影響および自律神経系への影響を、ＧＬＰに従ってＢａｌｂ／ｃマウスにおいて２つの用量レベル（約１．５ｍｇ／ｋｇおよび約５ｍｇ／ｋｇ）で検討した。
この試験は、呼吸器安全性試験で使用したのと同じ動物（同じＲＮＡ－ＬＮＰ用量群および対照群）で実施した。４０個の神経薬理学的パラメータに対するＲＮＡ－ＬＮＰの影響を、最初の投与の前および４８時間後、ならびに４回目の投与の前および４８時間後に検査した。
雄動物において、約５ｍｇ／ｋｇの最初の投与後に後肢握力の被験物質関連の一過性の低下が認められた（約－３７％）。この作用は、同じ群の雌動物でも見られた（約－４％）。４回目の投与の前後で後肢握力に被験物質に関連する差が観察されなかったため、低下は可逆的であった。試験した全ての時点で前肢握力の変化は見られず、筋肉または坐骨神経の肉眼的または顕微鏡的変化は検出されず、後肢握力の一過性の低下が筋肉または神経損傷によって引き起こされたのではないことを示した。他の被験物質関連の影響は観察されなかった。
心血管安全性
ＢＮＴ１４２投与の潜在的な心血管作用の調査は、カニクイザルにおける非ＧＬＰ ＰＫ試験および忍容性試験に含まれている。
この試験では、カニクイザルを、それぞれ３匹の雌動物を含む４つの群に割り当てた。第１群には生理食塩水を投与し、第２、第３および第４群にはそれぞれ０．０１５、０．０５および０．１５ｍｇ／ｋｇの用量のＢＮＴ１４２を１回投与した。血圧測定を、処置の開始前ならびに動物への投与の６時間後および２４時間後に実施した。末梢動脈収縮期および拡張期血圧ならびに結果として得られた平均血圧は、被験物質処置動物において正常な生理学的限界内であった。さらに、投与前に開始して投与後少なくとも２０時間まで、心電図（ＥＣＧ）を記録した。この期間には、心拍数ならびにＥＣＧの定量的および定性的パラメータは、ＢＮＴ１４２の投与によって影響されなかった。
非臨床薬理学－結論
一次および二次インビトロならびにインビボＰＤ試験において、ＢＮＴ１４２によってコードされるＲｉｂｏＭａｂ０２．１は、用量依存的および標的依存的な作用機構を示した。ＥＣ５０（２６ｐｇ／ｍＬ）の１，５００倍を超えるＲｉｂｏＭａｂ０２．１濃度によるインビトロでの非特異的Ｔ細胞活性化の開始は、広い治療域を指し示している。
ＲｉｂｏＭａｂ０２．１の安全性を、非特異的結合の同定をもたらさなかったＧＬＰ準拠組織交差反応性試験（同一の抗ＣＬＤＮ６ ＣＤＲを有する代用ＩｇＧを使用）において最初に試験した。ＲｉｂｏＭａｂ０２．１参照タンパク質を使用したその後の細胞マイクロアレイ試験では、ＣＬＤＮ６に密接に関連するＣＬＤＮ９に対してのみ弱いオフターゲット結合が観察された。内耳のタイトジャンクションでの発現を除いて、大部分の正常組織からのＣＬＤＮ９発現は存在しないので、望ましくないオフターゲット効果は予想されない。
まとめると、ＲｉｂｏＭａｂ０２．１がＣＬＤＮ６およびＣＤ３以外の標的に結合する可能性は低いと考えられる。
安全性薬理評価は、心血管パラメータ（カニクイザル）または呼吸器パラメータ（マウス）に影響を及ぼさないことを明らかにした。マウスにおける約５ｍｇ／ｋｇのＲＮＡ－ＬＮＰの最初の投与の４８時間後に、後肢握力の一時的な低下が観察された。この作用は一過性であり、その後の３回のＲＮＡ－ＬＮＰ投与後には検出されなかった。組織の病理学的検査中に神経学的異常または筋肉の異常は見出されず、これらの作用が神経毒性とは異なることを示唆した。
まとめると、これらのデータは、ＢＮＴ１４２によってコードされるＲｉｂｏＭａｂ０２．１が、インビボおよびインビトロの両方で非臨床モデルにおいて標的限定性であり、生物学的に活性であることを示唆している。最大０．１５ｍｇ／ｋｇおよびそれを超える用量の予想される臨床用量範囲をカバーする、最大約５ｍｇ／ｋｇのＲＮＡ－ＬＮＰの用量で、マウスの生理学的機能に対する被験物質媒介作用は観察されていない。
２．２ 非臨床薬物動態試験
ＢＮＴ１４２のＰＫは２つの部分に分けることができる。最初に、ＩＶ注射後、ＲＮＡ－ＬＮＰは全身に分布し、ＲＮＡカーゴを意図される標的器官である肝臓に送達する。第２に、ＬＮＰによってトランスフェクトされた肝細胞は、ＲＮＡを翻訳し、コードされたタンパク質ＲｉｂｏＭａｂ０２．１を全身循環に分泌する。
第１の部分を評価するために、マウスの異なる器官における放射性標識されたＬＮＰの生体内分布を分析した。第２の部分の評価のために、ＬＮＰに製剤化されたホタルルシフェラーゼをコードする修飾ＲＮＡを利用して、インビボで翻訳されたＲＮＡの肝臓標的化および動態を評価した。さらに、単回ＩＶ投与後のマウスおよびカニクイザル（ＮＨＰモデル）において、分泌されたＲｉｂｏＭａｂ０２．１のインビボＰＫプロファイルを特徴付けた。
ＬＮＰにおけるＰＥＧ脂質賦形剤（ＡＬＣ－０１５９）のＰＫプロファイリングおよびＡＬＣ－０１５９の代謝の評価を、インビボおよびインビトロで評価した。インビボでは、ＡＬＣ－０１５９は血漿から肝臓に速やかに分布するが、ＡＬＣ－０１５９の代謝はインビトロおよびインビボでゆっくり起こるようである。ＡＬＣ－０１５９は、それぞれエステル官能基およびアミド官能基の加水分解代謝によって代謝され、この加水分解代謝は、評価した全ての試験種（マウス、ラット、サル、ヒト）にわたって観察される。尿中に検出可能な脂質の排泄はなかったが、糞便中に未変化で排泄された用量の割合は、ＡＬＣ－０１５９について約５０％であった。アミノ脂質ＡＬＣ－０３６６の安定性を、インビトロ代謝試験を使用して評価した。ＡＬＣ－０３６６は、全ての種において、肝ミクロソーム、Ｓ９画分では１２０分、肝細胞では２４０分にわたって安定であった。
分布
インビボでのＬＮＰの生体内分布を、ＢＮＴ１４２と同じＬＮＰ製剤を有するが異なるＲＮＡを含むＲＮＡ－ＬＮＰを使用して検討した。放射性標識ＲＮＡ－ＬＮＰをマウスにＩＶ投与した。マウス組織におけるＬＮＰ分布を、液体シンチレーション分光法によって定量化した。ＬＮＰの器官標的化およびその後のルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡの発現を、生物発光イメージングによって検討した。
放射性標識ＬＮＰの分布
ＬＮＰの組織分布プロファイルを、１ｍｇ／ｋｇ（ＲＮＡ含有量に基づく）の単回ＩＶボーラス注射後のＣＤ－１マウス（ｎ＝４／性／時点）において調べた。この試験のために、ＲＮＡ含有ＬＮＰを、交換不可能な非代謝性脂質マーカである［３Ｈ］－コレステリルヘキサデシルエーテル（［３Ｈ］－ＣＨＥ）で標識して、脂質粒子の分布を観測した。マウスを安楽死させ、血液、血漿および組織を投与の０．０８３時間後（５分後）、０．２５時間後、０．５時間後、１時間後、２時間後、４時間後、８時間後および２４時間後に回収した。全ての試料の放射能を標準的な液体シンチレーションカウントによって決定し、得られた値を使用して、様々な組織における総脂質当量（ｌｉｐｉｄｅｑ）濃度および注射用量のパーセンテージを計算した。
ＬＮＰは、マウスの血液および血漿中で、血液／血漿濃度の急速な初期低下とそれに続くゆっくりした排出期という二相性動態を示した。同様の血液／血漿濃度－時間プロファイルが雄マウスおよび雌マウスで観察された。組織へのＬＮＰの分布は一般に迅速であり、ピークレベルが注射後４時間より早くほとんどの組織で起こるか、またはプラトーが達成された。肝臓が主要な分布器官であり、注射の４時間後の雄マウスおよび雌マウスについて平均濃度はそれぞれ２８２および３５５μｇ ｌｉｐｉｄｅｑ／ｇ組織であり、これは注射用量の約７０％～７４％であった。ＬＮＰはまた、投与の４時間後までに脾臓にも分布し、投与の４時間後に６１．７～７７．１μｇ ｌｉｐｉｄｅｑ／ｇ組織（注射用量の０．８４％～１．１５％）のレベルをもたらした。他の組織では、最小限の分布が観察されたか、または分布が観察されなかった。この試験は、ＬＮＰ分布の主要器官を同定するために実施され、投与されたＬＮＰの総質量バランスを考慮しなかった。
要約すると、ＬＮＰは、急速に主として肝臓に分布する。
インビボで翻訳されたＲＮＡの肝臓標的化および動態
インビボ翻訳されたｍＲＮＡの肝臓標的化および動態を評価するために、ＬＮＰと共に製剤化されたホタルルシフェラーゼをコードする修飾ｍＲＮＡを用いてタンパク質発現の生体内分布を評価した。ＩＶ投与後、ルシフェラーゼタンパク質は、主に肝臓に位置する高い生物発光シグナルを有する時間依存的翻訳を示した（図９）。二次分布器官として、脾臓は、肝臓と比較して１０倍低い生物発光シグナルを示した。わずかなルミネセンスシグナルが心臓、肺、腎臓およびリンパ節で検出された。
脂質賦形剤（ＡＬＣ－０１５９）の薬物動態
ＢＮＴ１４２は、ナノ粒子中にＰＥＧ脂質賦形剤ＡＬＣ－０１５９を含有する。１．９６ｍｇのＡＬＣ－０１５９／ｋｇの同様の脂質組成（異なるアミノ脂質）を有するＬＮＰに製剤化されたルシフェラーゼをコードするＲＮＡのＷｉｓｔａｒ Ｈａｎラットへの単回ＩＶ投与後、ＡＬＣ－０１５９の血漿濃度は急速に低下し、初期ｔ１／２値は１．７２時間であった。次いで、ＡＬＣ－０１５９は、７２．７時間の最終排出ｔ１／２で血漿から除去された。肝臓に分布する脂質用量の推定パーセントは約２０％であった。
ＲｉｂｏＭａｂ０２．１のインビボ薬物動態
ＲｉｂｏＭａｂ０２．１は、マウスにおけるＢＮＴ１４２の投与後に効率的に翻訳され、構築され、分泌される
以下の試験は、インビボ（Ｂａｌｂ／ｃＪＲｊマウス）でのＢＮＴ１４２の取り込み後のＲｉｂｏＭａｂ０２．１の翻訳、構築および分泌を確認する。分泌されたＲｉｂｏＭａｂ０２．１を含有する血清を、３０μｇのＢＮＴ１４２の単回ＩＶ投与の２時間後および６時間後に採取した。血清をＥＬＩＳＡ（図１０Ａ）およびウェスタンブロット（図１０Ｂ）によって分析し、完全に構築された構造的に安定な（単量体）ＲｉｂｏＭａｂ０２．１のインビボでの生成を確認した。
マウスにおけるＢＮＴ１４２の反復投与ＰＫ試験
ＢＮＴ１４２の毎週の投与によってＲｉｂｏＭａｂ０２．１の全身レベルが持続可能であるかどうかを評価するために、Ｂａｌｂ／ｃＪＲｊマウスにおいて反復投与ＰＫ試験を行った。処置群は、毎週の間隔で１０もしくは３０μｇのＢＮＴ１４２（それぞれ約０．４および１．２ｍｇ／ｋｇ）または３０μｇのＬｕｃ＿ＲＮＡ－ＬＮＰの５回のＩＶボーラス注射を受けた。各ＢＮＴ１４２投与の６時間後（ｔｍａｘ）および２４時間前（最後の検出可能濃度［Ｃｔｒｏｕｇｈ］）に動物から採取した血液から血清試料を調製した。時点は、それぞれ最初のＢＮＴ１４２またはＬｕｃ－ＲＮＡ－ＬＮＰ対照注射の６、１７４、３４２、５１０および６７８時間後（Ｃｍａｘ）または１４４、３１２、４８０および６４８時間後（Ｃｔｒｏｕｇｈ）に対応する。最後の血液試料を最初の注射の８１６時間後（３４日後）に採取した。ＥＬＩＳＡによって決定した場合、それぞれ１０μｇおよび３０μｇのＢＮＴ１４２による最後の注射の６時間後に、最大７．４μｇ／ｍＬおよび４６μｇ／ｍＬのＲｉｂｏＭａｂ０２．１ピークレベル（Ｃｍａｘ）に到達した。抗体濃度は各注射の７日以内に急速に低下し、Ｃｔｒｏｕｇｈ値はＣｍａｘ値よりも約１３０倍低かった。重要なことに、いずれかのＢＮＴ１４２用量のその後の注射の間に、ＲｉｂｏＭａｂ０２．１翻訳の喪失は観察されなかった（図１１）。
カニクイザルにおけるＢＮＴ１４２の単回投与ＰＫ試験
単回投与ＰＫ試験を、１群当たり３匹の動物を用いて雌カニクイザルで実施した。処置群は、予想される臨床用量範囲（０．１５０、０．０５および０．０１５ｍｇ／ｋｇ）をカバーするＢＮＴ１４２または対照としての生理食塩水の単回ＩＶボーラス投与を受けた。用量曝露を評価するために、異なる時点（注射の０、１、３、６、１２、２４、４８、７２、１６８および３３６時間後）で採取した血清試料において、ＲｉｂｏＭａｂ０２．１の濃度をＥＬＩＳＡによって分析した。ＲｉｂｏＭａｂ０２．１ピーク濃度（Ｃｍａｘ）は、全ての群においてＢＮＴ１４２投与の６時間後（ｔｍａｘの中央値）に達成された（平均値［ｔｍａｘの中央値］：０．０１５ｍｇ／ｋｇ群＝７．３ｎｇ／ｍＬ；０．０５０ｍｇ／ｋｇ群＝２７．５ｎｇ／ｍＬ；０．１５０ｍｇ／ｋｇ群＝１５５．０ｎｇ／ｍＬ）。ＲｉｂｏＭａｂ０２．１レベルは、０．０１５ｍｇ／ｋｇ群ではＢＮＴ１４２投与の３時間後から最大７２時間後まで、０．１５ｍｇ／ｋｇおよび０．０５ｍｇ／ｋｇ群では最大１６８時間（７日間）まで検出可能であった（図１２および表４）。ＲｉｂｏＭａｂ０２．１の有効半減期は、２７～３７時間であると決定された。しかしながら、２つのより低い用量群におけるＲｉｂｏＭａｂ０２．１半減期の決定は、ＥＬＩＳＡ定量化法の０．１ｎｇ／ｍＬの定量化下限（ＬＬＯＱ）のために制限された。生理食塩水対照試料中またはＢＮＴ１４２投与の３３６時間（１４日間）後では、シグナルは検出されなかった（検出はＬＬＯＱによって潜在的に制限された）。個々の動物のＰＫパラメータおよび平均値／中央値を表４に要約する。
要約すると、３つのＢＮＴ１４２用量は全て、カニクイザルにおいて生物学的に活性なＲｉｂｏＭａｂ０２．１の治療範囲内の力価をもたらし、Ｃｍａｘの中央値は注射の６時間後であった。ＲｉｂｏＭａｂ０２．１濃度の個体間変動が観察され、Ｃｍａｘにおいて、それぞれ最低用量群で２～７倍、中間用量群で１～２倍および最高用量群で２倍の差が認められた。
Figure 2024525795000058
ａ．ＭＲＴ０～ｉｎｆ（薬物平均滞留時間０～無限大）を使用して、有効ｔ１／２を計算した。
ｂ．ｔｍａｘおよびｔｌａｓｔの中央値。
Ｃｍａｘ＝最大観察濃度；Ｃｔｒｏｕｇｈ＝最後の検出可能な濃度；ｈ＝時間；ｎ＝数；Ｎ／Ａ＝該当せず；ＮＣ＝算出不能；ＮＲ＝報告なし（決定係数が０．８未満であった）；ＳＤ＝標準偏差；ｔ＝時間；ｔ１／２＝半減期；ｔｌａｓｔ＝最後の測定可能な濃度の時間；ｔｍａｘ＝観察された最大濃度までの時間。
代謝および排泄
Ｎ１－メチルプソイドウリジン修飾ｍＲＮＡを含むＲＮＡは、細胞ＲＮａｓｅによる分解に感受性であり、核酸代謝に供される。ヌクレオチド代謝は細胞内で連続的に起こり、ヌクレオシドは分解され、排泄されるかまたはヌクレオチド合成のために再利用される。
ＬＮＰ製剤中の賦形剤として使用される４つの脂質のうちで、２つは天然に存在し（コレステロールおよびＤＳＰＣ）、それらの内因性対応物と同様に代謝および排泄される。非天然脂質（ＡＬＣ－０３６６およびＡＬＣ－０１５９）の代謝および排泄をインビトロで検討し、ＡＬＣ－０１５９の場合はインビボでも検討した。
マウス、ラット、サル、およびヒトの肝ミクロソーム、Ｓ９画分、および肝細胞において、ＡＬＣ－０３６６（アミノ脂質）のインビトロ代謝安定性を評価した。ＡＬＣ－０３６６は、全ての種および試験系において、肝ミクロソーム（残存ＡＬＣ－０３６６＞８９％）およびＳ９画分（残存ＡＬＣ－０３６６＞８８％）では１２０分間にわたって安定であり、肝細胞（残存ＡＬＣ－０３６６＞９４％）では２４０分間にわたって安定であった。
ＡＬＣ－０１５９の代謝を、全てマウス、ラット、サルおよびヒト由来の血液、肝臓Ｓ９画分および肝細胞を使用してインビトロで、ならびにＰＫ試験からのラット血漿、尿、糞便および肝臓においてエクスビボで調べた。これらの試験は、ＡＬＣ－０１５９がアミド結合加水分解によって比較的ゆっくりと代謝され、Ｎ，Ｎ－ジテトラデシルアミンを生じることを決定した。この加水分解代謝は、評価した種全体で観察された。
ラットＰＫ試験では、ＲＮＡ－ＬＮＰのＩＶ投与後、尿中にＡＬＣ－０１５９の検出可能な排泄はなかった。しかし、約５０％のＡＬＣ－０１５９が糞便中に未変化で排泄された。
非臨床薬物動態および代謝－要約および結論
ＢＮＴ１４２のＰＫは、２つの部分に分けることができる。
・ＢＮＴ１４２のＰＫ：ＩＶ注射後、ＲＮＡ－ＬＮＰは４時間以内に全身に分布し、ＲＮＡカーゴを意図される標的器官である肝臓に送達する。
・ＢＮＴ１４２にコードされた二重特異性抗体ＲｉｂｏＭａｂ０２．１のＰＫ：肝細胞への送達後、ＲＮＡが翻訳され、コードされたＲｉｂｏＭａｂ０２．１タンパク質が循環中に放出される。
最初の部分を調べるために、放射性標識脂質を含有するＬＮＰを用いてマウスにおいて生体内分布試験を実施した。ＬＮＰの分布は一般に急速であり、ピークレベルは、注射後４時間より早くほとんどの組織で達成された。肝臓が主要な分布器官であり、ＬＮＰのごく一部が分布した脾臓がこれに続き、他の組織への分布は最小限であるか、または全く観察されなかった。肝臓における標的化ＲＮＡ翻訳は、マウスにおけるＬＮＰ製剤化ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）コードＲＮＡの投与後のインビボイメージングによって示された。注射後１４４時間まで肝臓でＬｕｃ翻訳（生物発光）が観察されたが、脾臓は１０倍低いシグナル強度を示した。
ラットＩＶ ＰＫ試験では、この２週間の試験中、ＰＥＧ脂質（ＡＬＣ－０１５９）の濃度は血漿中で約８，０００倍低下した。血漿中の見かけの終末相ｔ１／２は、ＡＬＣ－０１５９については７２．７時間であり、これは、最初にＬＮＰを血漿に取り込んで排出した組織からの脂質の再分布を表している可能性が高く、糞便中ではほとんど未変化であった。インビトロでは、ＡＬＣ－０１５９はアミド官能基の加水分解代謝によってゆっくり代謝されたが、非天然アミノ脂質（ＡＬＣ－０３６６）のインビトロ代謝試験は、全ての種および試験系において安定性を示した。
ＢＮＴ１４２にコードされた二重特異性抗体ＲｉｂｏＭａｂ０２．１のＰＫパラメータを、血清中の翻訳されたＲｉｂｏＭａｂ０２．１の定量化を介して、マウスにおける反復投与試験およびＮＨＰにおける単回投与試験によって決定した。
用量依存性ＲｉｂｏＭａｂ０２．１血清濃度は、ＢＮＴ１４２を毎週投与したマウスにおいて検出可能であった。３０μｇ（約１．２ｍｇ／ｋｇ）用量コホートにおける５回目の投与後に４６μｇ／ｍＬのＣｍａｘに達し、ＲｉｂｏＭａｂ０２．１曝露回復が確認された。
ＮＨＰにおける単回投与ＰＫ試験において、ＲｉｂｏＭａｂ０２．１は用量依存的発現を示し、投与の６時間後にｔｍａｘ中央値（マウスにおいて観察された）および０．１５ｍｇ／ｋｇのＢＮＴ１４２（試験した最高用量）による投与後に１５５ｎｇ／ｍＬの平均Ｃｍａｘを示した。ＲｉｂｏＭａｂ０２．１は、投与７日後の試験終了までＮＨＰにおいて検出可能であった。
要約すると、マウスおよびＮＨＰにおけるＰＫデータは、ＲｉｂｏＭａｂ０２．１のＢＮＴ１４２用量比例的ではなく、ＢＮＴ１４２用量依存的曝露を示した。ピークＲｉｂｏＭａｂ０２．１濃度は投与の６時間後に達成され、その後低下した。ＲｉｂｏＭａｂ０２．１の非臨床有効半減期は２７～３７時間であるので、ヒト身体からの抗体の完全なクリアランスは、およそ５半減期（約１３５～１８５時間または６～８日間）で起こると予想される。したがって、毎週の投与は、週１回の臨床治療間隔全体にわたって生物学的活性を付与するＲｉｂｏＭａｂ０２．１血漿レベルの維持を支援する。
２．３ 毒性学
ＲＮＡ－ＬＮＰ媒介作用を評価する非臨床（免疫）毒性プログラムは、ヒト細胞および血液成分を使用するインビトロ試験、ならびにマウスおよびカニクイザルにおけるインビボ試験を含むプラットフォームアプローチを使用した。
マウスにおける非ＧＬＰ単回投与毒性試験では、４ｍｇ／ｋｇまでのＲＮＡ－ＬＮＰの用量が忍容された。
所見には、最小限の肝損傷および軽度の炎症反応と一致して、臨床所見（立毛および脱水）、最小体重減少および体重増加遅延、肝臓トランスアミナーゼのわずかな上昇、脾臓重量の増加および肝臓への最小から軽度の混合白血球浸潤が含まれた。全ての作用は２８日以内に可逆的であった。
反復投与毒性試験では、最大約５ｍｇ／ｋｇのＲＮＡ－ＬＮＰ用量がマウスにおいて忍容された。試験の所見には、摂餌量のわずかな減少、全白血球の一過性減少、ならびに一過性のアルカリホスファターゼおよび肝酵素の上昇が含まれた。さらに、５ｍｇ／ｋｇの用量での肝臓における可逆的な顕微鏡的変化、ならびに脾臓における髄外造血および動脈周囲リンパ鞘のリンパ過形成に加えて、腎臓および肝臓重量の増加が認められ、これは脾臓重量の増加にも関連していた。これらの変化は改善し、ほとんどの場合、２週間の回復期間後に完全に回復した。
最大０．１５ｍｇ／ｋｇのＢＮＴ１４２の単回投与を試験するＮＨＰにおける非ＧＬＰ ＰＫ／忍容性試験では、いずれのパラメータにも変化は観察されなかった。
免疫毒性評価では、約１．５ｍｇ／ｋｇおよび約５ｍｇ／ｋｇのＲＮＡ－ＬＮＰは、マウスにおいて投与の６時間後にサイトカイン（ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６およびＴＮＦ－α）の一過性上昇を誘導し、これは反復投与後にはあまり顕著ではなかった。最大０．１５ｍｇ／ｋｇの単回投与後、カニクイザルにおいてインビボでＢＮＴ１４２誘導サイトカイン上昇は観察されなかった。ヒト全血を使用したインビトロ試験では、≧４μｇ／ｍＬ（≧０．３２ｍｇ／ｋｇのヒト等価用量）の濃度のＢＮＴ１４２は、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１β－、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８およびＴＮＦ－αの分泌を誘導した。補体系のＲＮＡ－ＬＮＰ活性化は、４０μｇ／ｍＬ（３．２ｍｇ／ｋｇのヒト等価用量）までの濃度についてはインビトロで観察されなかった。
ＲｉｂｏＭａｂ０２．１の安全性試験のための関連種の選択
ＩＣＨ Ｓ６（Ｒ１）によれば、関連種は、被験物質が薬理学的に活性である種である。ＲｉｂｏＭａｂ０２．１二重特異性抗体の薬理学的活性は、それぞれの種のＴ細胞上のＣＤ３受容体の結合および腫瘍標的エピトープ（ＣＬＤＮ６）の発現を必要とする。しかしながら、ＲｉｂｏＭａｂ０２．１の抗ＣＤ３部分は、ヒト霊長動物以外の他の種のＣＤ３に対して交差反応性ではない。
ＲｉｂｏＭａｂ０２．１の安全性プロファイルを十分に捕捉するのに適した試験種がないので、抗体について動物における安全性試験は行わなかった。代わりに、ＣＬＤＮ６親抗体ＩＭＡＢ２０６－Ｃ４６ＳまたはＲｉｂｏＭａｂ０２．１と同一の組換え参照タンパク質のいずれかを使用して、上記のインビトロ安全性試験を行った。
ＲＮＡ－ＬＮＰ製剤の非臨床安全性評価
ＲＮＡ－ＬＮＰ安全性試験のいくつかでは、ＢＮＴ１４２と同一のＬＮＰ脂質組成を有するが異なるＲＮＡを含む製剤を使用した。ＲＮＡの配列または長さの違いは、ＲＮＡ－ＬＮＰ媒介の安全性プロファイルに大きな影響を及ぼすとは予想されないので、結果は、ＢＮＴ１４２のＲＮＡ－ＬＮＰ媒介毒性を代表すると考えられる。このプラットフォーム毒性評価アプローチは、以前に受け入れられている。
単回投与毒性
非ＧＬＰ単回用量毒性試験を雄および雌のＣＤ－１マウスにおいて実施した。この試験は、１～４ｍｇ／ｋｇの用量のＲＮＡ－ＬＮＰの潜在的な毒性を特徴付け、ＲＮＡ－ＬＮＰの毒性をそれぞれの対照物質（すなわち空のＬＮＰ）と比較することによってＬＮＰ媒介毒性を同定し、４週間の観察期間（２９日目に終了）後のＲＮＡ－ＬＮＰの可逆性、進行および／または潜在的な遅延効果を評価した。
マウスは、１日目にＲＮＡ－ＬＮＰまたは対照物質（生理食塩水または空のＬＮＰ）の単回ＩＶ投与を受けた。動物を３日目（主動物）または２９日目（回復動物）に安楽死させた。試験エンドポイントには、死亡率、臨床所見、体重変化、臨床病理学、剖検所見、臓器重量および組織病理学（肝臓、脾臓および胃）が含まれた。
最大４ｍｇ／ｋｇのＲＮＡ－ＬＮＰの単回投与が、雄および雌のＣＤ－１マウスにおいて忍容された。所見には、臨床所見（立毛および脱水）、最小体重減少および体重増加遅延が含まれた。３日目に、最小の肝損傷および軽度の炎症反応と一致して、肝臓トランスアミナーゼ（アラニントランスアミナーゼ［ＡＬＴ］および／またはアスパラギン酸トランスアミナーゼ［ＡＳＴ］）のわずかな上昇、脾臓重量の増加、４ｍｇ／ｋｇを投与された１匹の雌における肝臓の蒼白化、ならびに肝臓への最小限の混合白血球浸潤が検出可能であった。性別による所見の差はなかった。全ての作用は、２９日目に完全または部分的な回復の証拠を示し、肝臓への混合白血球浸潤によって実証され、軽度の炎症反応の持続的な消散を示した。
反復投与毒性
ＬＮＰおよびＲＮＡ媒介毒性を評価するＧＬＰ準拠プラットフォーム反復投与毒性試験を、雄および雌のＢａｌｂ／ｃＪＲｊマウスにおいて実施した。この試験は、約１．５および約５ｍｇ／ｋｇの４回の毎週のＲＮＡ－ＬＮＰ投与の潜在的な毒性を特徴付け、ＲＮＡ－ＬＮＰの毒性をそれぞれの対照物質（すなわち空のＬＮＰ）と比較することによってＬＮＰ媒介毒性を同定し、２週間の観察期間後のＲＮＡ－ＬＮＰの可逆性、進行および／または潜在的な遅延効果を評価した。試験したＲＮＡ－ＬＮＰ用量（最大約５ｍｇ／ｋｇ）は、予想臨床用量（０．００００５ｍｇ／ｋｇ～０．１５ｍｇ／ｋｇ）を３０倍～３０，０００倍上回る。ＧＬＰ準拠マウス毒性試験では、最高用量（約５ｍｇ／ｋｇに相当する１００μｇ／動物）を、ＩＶ送達され得る最大実現可能体積および濃度に基づく最大実現可能用量と見なした。
ＲＮＡ－ＬＮＰの４回の毎週のＩＶ注射による処置は、マウスにおいて３０および１００μｇ／動物（それぞれ約１．５および約５ｍｇ／ｋｇ）の用量で忍容された。高用量群では、動物は一過性の摂餌量減少を示した（雄では－８．２％、雌では－１３．６％）。しかしながら、摂餌量のこれらの変化は、付随する体重減少をもたらさなかった。処置期間中または回復期間中に死亡は観察されなかった。
血液学的パラメータを、主試験動物については３回目の投与の２４時間後（試験１６日目）、回復動物については最後の処置の１週間後（試験３０日目）に評価した。３０μｇ（約１．５ｍｇ／ｋｇ）または１００μｇ（約５ｍｇ／ｋｇ）のＲＮＡ－ＬＮＰによる処置は、試験１６日目に全白血球の減少をもたらした（雄ではそれぞれ－５９％または－６２％、雌ではそれぞれ－６７％または－７４％）。これは主にリンパ球の有意な減少によるものであった（雄ではそれぞれ－６７％または－７２％、雌ではそれぞれ－７４％または－７９％）。
空のＬＮＰで処置した動物についても、白血球（雄では－２４．１％、雌では－３７．４％）およびリンパ球（雄では－３７．２％、雌では－４８．７％）の絶対数の減少が認められた。回復動物では、血液学的パラメータの被験物質に関連する差は見出されず、全ての変化が可逆的であったことを示した。
臨床化学を、最後の投与の２４時間後（試験２３日目）および回復期間の終了時（試験３７日目）に評価した。試験２３日目に３０μｇ（約１．５ｍｇ／ｋｇ）で処置した雌マウスにおいて、肝酵素ＡＬＴ（＋５１％）、ＡＳＴ（＋４５％）および乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）（＋６９％）の完全に可逆的な上昇が観察された。生化学的パラメータについての他の被験物質関連の差は、この用量群では認められなかった。高用量（１００μｇ、約５ｍｇ／ｋｇのＲＮＡ－ＬＮＰ）では、処置した雌において肝酵素（ＡＬＴ、ＡＳＴ）およびＬＤＨの上昇が観察された（それぞれ＋８，１７０％、＋４，９９２％および＋２，７８７％）。空のＬＮＰで処置した雌でも、肝酵素活性（ＡＬＴ、ＡＳＴ）およびＬＤＨの上昇が認められた（＋２７４％、＋４４％および＋４０％）。さらに、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）については、この群の両性（雄＋３９％、雌＋９３％）で上昇が観察された。レベルは回復期間を通して低下したが、試験終了時に依然として実験室正常値を超えて上昇していた（雄＋１９％、雌＋２１％）。
さらに、試験２３日目に、グロブリン濃度が雄（＋３１％）および雌（＋３６％）について上昇した。したがって、アルブミン／グロブリン比の減少が雄（－１５％）および雌（－２１％）について認められた。これらの変化は、回復期間の終了時にはおさまっていた。
４回目の投与からおよそ２４時間後の試験２３日目に、主試験動物を解剖した。全ての回復動物の剖検を試験３７日目に実施した。主試験の終了時に、両用量群の一部の雌動物において脾臓が拡大していた。この作用は、脾臓重量の増加に関連していた（雄では＋６８％、雌では＋９９％）。さらに、剖検により、どちらも１００μｇを投与された、１匹の雌については肝臓の蒼白化、別の１匹の雌については平滑な表面を有する部分的な肝臓の蒼白化が明らかになった。この高用量群では、両性において、肝臓重量（雄では＋１７％、雌では＋３４％）および腎臓重量（雄では＋１５％、雌では＋１８％）の増加も認められた。回復中、脾臓および肝臓の重量に対する影響は完全には補償されなかったが、他の全ての影響はおさまっていた。
組織病理学的変化は、主試験の終了時に雌の肝臓においてのみ見出された（細胞質変化、単核炎症細胞浸潤物、多核巨細胞および壊死）。これらの所見は、回復期間後、１匹を除く全ての雌において完全に可逆的であった。雌の脾臓における完全に可逆的な病理組織学的所見は、低用量群および高用量群の両方で観察され、これらは髄外造血、うっ血、色素沈着および動脈周囲リンパ鞘のリンパ過形成を含んでいた。いずれの時点でも、雄動物では組織病理学的観察は行わなかった。
カニクイザルにおけるＢＮＴ１４２の単回投与薬物動態および忍容性試験
この試験の目的は、カニクイザルへの単回用量ＩＶ投与後のＢＮＴ１４２のＰＫおよび忍容性の情報を得ることであった。
ＩＶボーラス注射によるＢＮＴ１４２の単回投与は、サルにおいて最大０．１５ｍｇ／ｋｇの用量で忍容された。早期死亡、臨床所見または体重、体温、血圧、眼科学、聴覚検査、心血管評価、臨床病理パラメータ（血液学、凝固、臨床化学および尿検査）もしくはＢＮＴ１４２の投与に関連するサイトカインの変化はなかった。
免疫毒性試験
免疫毒性学的パラメータを、２つの独立した試験（以下に記載）において、ならびにマウスにおけるＧＬＰ準拠反復投与毒性試験およびＮＨＰにおける単回投与ＰＫ試験の一部として評価した。マウスでは、最初の投与の６、２４および４８時間後（試験１、２および３日目）ならびに３回目の投与の６、２４および４８時間後（試験１５、１６および１７日目）にサイトカイン分析を実施した。ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６およびＴＮＦ－αは、試験１日目および試験１５日目に両方の用量群（約１．５ｍｇ／ｋｇおよび約５ｍｇ／ｋｇ）の雄および雌動物において、投与後６時間で一過性に上昇した。反復投与後（試験１５日目）、上昇の程度はより小さかった。ＩＬ－６およびＴＮＦ－αのレベルは投与後２４時間までに完全に低下したが、ＩＦＮ－αおよびＩＦＮ－γのレベルは投与後４８時間までにベースラインに戻った。ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－１０またはＩＬ－１２ｐ７０の上昇は、いずれの群においても観察されなかった。ＮＨＰでは、試験したサイトカインのいずれにおいても、０．１５ｍｇ／ｋｇまでの投与の６、２４または４８時間後に被験物質関連のサイトカインの上昇は観察されなかった。全身免疫毒性を示す臨床徴候は観察されなかった。
ヒト血清のインビトロ補体活性化
インビトロでヒト補体を活性化する製剤の可能性を、予想される臨床曝露をカバーする０．０４～４０μｇ／ｍＬ（約０．００３～約３．２ｍｇ／ｋｇの用量を代表する）のＲＮＡ－ＬＮＰ濃度での正常ヒト血清とのインキュベーションによって評価した。ＲＮＡ－ＬＮＰとのインキュベーション後、補体活性化は観察されなかった。
ＢＮＴ１４２による全血サイトカイン放出
炎症促進性サイトカイン（ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＰ－１０およびＴＮＦ－α）の分泌を、ＢＮＴ１４２の全血とのインキュベーション後に評価した。試験した希釈範囲（０．０６２５～６４μｇ／ｍｌ）は、製剤の予想される濃度（０．００５～５．１２ｍｇ／ｋｇの用量に相当）を代表し、それを上回る。被験物質関連のサイトカイン分泌は、２μｇ／ｍＬ（０．１６ｍｇ／ｋｇのヒト等価用量）の濃度まで検出できなかった。それを超えると、ＢＮＴ１４２は、≧４μｇ／ｍＬ（≧０．３２ｍｇ／ｋｇのヒト等価用量）の濃度でＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－８の分泌を誘導し、≧３２μｇ／ｍＬ（≧２．５６ｍｇ／ｋｇのヒト等価用量）の濃度でＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－αの分泌を誘導した。
毒性学－結論
ＢＮＴ１４２の毒性評価を２つの部分に分けた－一方の部分は、この化合物が活性であろう薬理学的に関連する種がないため、コードされた抗体ＲｉｂｏＭａｂ０２．１の安全性をインビトロで評価した。その代わりに、ＲＮＡ－ＬＮＰをいくつかのインビボおよびインビトロ試験で試験し、それらのいくつかは、同一の種類の修飾ｍＲＮＡを有するが異なる配列を有する（例えばルシフェラーゼをコードする）代用物を使用した。このアプローチは、他の場合に信頼できることが証明されている。
ＲＮＡ－ＬＮＰの安全性は、マウスおよびサルにおける３つのインビボ毒性／忍容性試験で評価されている。予想される上限臨床用量範囲のＢＮＴ１４２（０．０１５～０．１５ｍｇ／ｋｇ）では、ＮＨＰ忍容性試験においてＲＮＡ－ＬＮＰ関連作用は観察されなかったが、マウスにおけるより高い単回または複数回用量のＲＮＡ－ＬＮＰ（１～５ｍｇ／ｋｇ）は、主に用量依存的に、臨床病理パラメータ、臓器重量および組織病理学的変化に対する影響をもたらした。これらの作用は、しばしば雌動物においてのみ存在するか、またはより顕著であった。
両性において、約１．５または約５ｍｇ／ｋｇのＲＮＡ－ＬＮＰの反復投与後、リンパ球数（したがって白血球数）が減少し、グロブリン濃度が上昇した。２ｍｇ／ｋｇ（雌）および４ｍｇ／ｋｇ（両性）の単回投与は、最小のＡＬＴおよびＡＳＴ上昇を誘導し、これらは、約１．５ｍｇ／ｋｇまたは約５ｍｇ／ｋｇのＲＮＡ－ＬＮＰのいずれかの複数回投与を受けた雌において反復投与後により顕著であり、ＬＤＨ上昇と共に観察された。したがって、これらの作用は、肝臓組織病理学における最小から軽度（単回投与）または最小から顕著（反復投与）の変化（細胞質変化、単核炎症細胞浸潤物、多核巨細胞および壊死）に関連していた。約１．５ｍｇ／ｋｇまたは約５ｍｇ／ｋｇのＲＮＡ－ＬＮＰを繰り返し投与された雌の脾臓において、うっ血、髄外造血、動脈周囲鞘のリンパ過形成または色素沈着などの顕微鏡的変化も見られた。肝臓、脾臓および腎臓の重量増加が雄および雌動物で観察されたが、他の組織病理学的観察は行わなかった。記載された作用の大部分は、両用量群で依然としてわずかに上昇したＡＬＰレベル、およびより高い用量（単回投与として約４ｍｇ／ｋｇまたは４回の連続投与として約５ｍｇ／ｋｇ）で処置した雌におけるいくつかの病理学的変化を除いて、２～３週間以内に完全に可逆的であり、回復の終了時までに改善を示した。
インビトロでのＲＮＡ－ＬＮＰの免疫毒性学的評価は、約３．２ｍｇ／ｋｇのヒト等価用量までヒト補体の活性化を示さなかったが、０．３ｍｇ／ｋｇ以上のヒト等価用量では製剤濃度依存的サイトカイン放出を示した。これらの所見を裏付けて、ＧＬＰ毒性試験においてマウスに約１．５または約５ｍｇ／ｋｇのＲＮＡ－ＬＮＰを投与した後に可逆的なサイトカイン上昇が見られたが、サイトカイン上昇の程度は反復投与後により低かった。ＮＨＰ忍容性試験では、０．０１５～０．１５ｍｇ／ｋｇのＢＮＴ１４２という上限臨床用量範囲の単回投与後にサイトカイン上昇は見られなかった。
要約すると、上記で論じた非臨床毒性結果に基づいて、０．００００５ｍｇ／ｋｇ（０．０５μｇ／ｋｇ）のヒト初回用量は合理的に安全であると考えられるが、ヒトにおいてＲｉｂｏＭａｂ０２．１の薬理学的に関連する曝露をもたらすと予想される。
実施例３：インビボ発現されたＲｉｂｏＭａｂ０２．１は高度にモノマー性であり、マウスにおいて代替リード構造候補物ＲｉｂｏＭａｂ＿７１２／７１１ Ｃ５３Ｗよりも低いＡＤＡ応答を誘導する
親抗ＣＬＤＮ６ ＶＬ（ＩＭＧＴナンバリングによる５３位（Ｃ５３）のＶＬ（ＣＬＤＮ６））中の遊離システインは、ＲｉｂｏＭａｂ０２．１ではセリンに（Ｃ５３Ｓ）（それぞれ、配列番号５および７のｍＲＮＡ配列によってコードされる配列番号４および６）、またはＲｉｂｏＭａｂ＿７１２／７１１ではトリプトファンに（Ｃ５３Ｗ）（それぞれ、配列番号３２および３４のｍＲＮＡ配列によってコードされる配列番号３１および３３）置換されている。親抗ＣＬＤＮ６ ＶＬの５３位は、配列番号４および３１の配列における４４９位に対応し、配列番号６および３３の配列における４２８位に対応する。これはまた、ＶＬ（ＣＬＤＮ６）のＣＤＲ１に対して＋１５の位置および／またはＶＬ（ＣＬＤＮ６）のＣＤＲ２に対して－３の位置に対応する。
リード構造変異体をコードする両方のＣＤ３ｘ（ＣＬＤＮ６）２を、タンパク質凝集およびＲｉｂｏＭａｂ特異的抗薬物抗体（ＡＤＡ）の誘導に関してマウスにおいて比較した。
４匹の雌Ｂａｌｂ／ｃＪＲｊマウスに、マウス当たり３０μｇのＲＮＡ－ＬＮＰ（約１．４ｍｇ／ｋｇ）のＩＶ単回用量を投与した。血清を、投与前ならびに投与後６、２４、４８、９６、１６８、２１６、２６５および５２８時間（０．２５～２２日間）にサンプリングした。
注射の６時間後に得られた血清試料を、非還元条件下でのウェスタンブロット分析によって分析した（図１３Ａ；各群のマウス＃４の代表的なウェスタンブロット画像）。等体積のＭｅｌｏｎ Ｇ精製血清を使用した。Ｃ５３Ｗ置換を有するＲｉｂｏＭａｂ＿７１２／７１１は、それらの発現レベルと比較して、Ｃ５３Ｓ変異体（ＲｉｂｏＭａｂ０２．１）よりも高い量のＨＭＷ種の産生をもたらした。ＲｉｂｏＭａｂ０２．１のＨＭＷは、インビボではほとんど検出できなかった。薬物ＨＭＷ形成はしばしば免疫原性の増加と相関するので、これは重要な違いである。
マウス血清中の抗ＲｉｂｏＭａｂ０２．１および抗ＲｉｂｏＭａｂ＿７１２／７１１薬物抗体（ＡＤＡ）を、Ｇｙｒｏｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＡＢ製のＧｙｒｏｓ ｘＰａｎｄ（商標）ＸＰＡ１０２５ ＥＬＩＳＡ装置を使用して決定した。サンドイッチイムノアッセイを、Ｇｙｒｏｌａｂ Ｂｉｏａｆｆｙ ２００ ＣＤで処理した。
抗ＲｉｂｏＭａｂ ＡＤＡを、１００μｇ／ｍＬのビオチン化薬物抗体を使用して捕捉した。血清ＡＤＡレベルを、Ｆｃ断片特異的抗体である２５ｎＭのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧを用いて検出した。２００－３Ｗ－００２－Ａ法を用いてデータを生成し、Ｇｙｒｏｌａｂ Ｅｖａｌｕａｔｏｒソフトウェアを用いて結果を分析した。
陽性ＡＤＡ応答を浮動小数点に従って決定した。したがって、陰性血清（採血前）の応答および式、正規化係数（ＮＦ）＋平均陰性対照（ＮＣ）を使用してカットポイントを計算した。
ＮＦ＝陰性試料のＸ＊ＳＤ；Ｘ＝１．６４５；ＳＤ＝陰性血清（採血前）の標準偏差；ＮＣ＝３つの陰性対照（プール陰性血清）。
データ（図１３Ｂ）は、ＲｉｂｏＭａｂ０２．１のより高い単量体含有量（図１３Ａ）と一致して、ＲｉｂｏＭａｂ＿７１２／７１１と比較してマウスにおけるＲｉｂｏＭａｂ０２．１のより低い免疫原性能を示す。免疫原性は発現レベルと密接には相関しないので、より低い免疫原性は発現レベルの差によって説明することができない。
結論として、両方のＲｉｂｏＭａｂ０２．１配列におけるようなセリンによる遊離システインＣ５３の置換は、ＲｉｂｏＭａｂ＿７１２／７１１の両方の配列におけるようなトリプトファンへの置換と比較して、より低いレベルのＨＭＷ形成およびＡＤＡ誘導をもたらした。
実施例４：ＲｉｂｏＭａｂ０２．１をコードする原薬中間体の１．５：１のＨＣ：ＬＣ重量比は、高度にモノマー性のＲｉｂｏＭａｂ０２．１の効率的な発現をもたらす
ＨＥＫ－２９３Ｔ－１７産生細胞を、１：１、１．２５：１、１．５：１、１．７５：１、２：１、２．２５：１、２．５：１および２．７５：１のＨＣ：ＬＣ重量比でＨＣおよびＬＣをコードする原薬中間体（ＲＮＡ）を用いたエレクトロポレーションによってトランスフェクトした（総ＲＮＡ濃度：１００μｇ／ｍＬ ＲＮＡ；総体積：２５０μＬ）。この実施例で使用されるＨＣおよびＬＣをコードする原薬中間体（ＲＮＡ）（それぞれ配列番号５および７）は、配列番号４および６のＲｉｂｏＭａｂ０２．１の２つのポリペプチドをコードする。２つのポリペプチドは、それぞれ、ＣＤ３を標的とする親抗体の重鎖および軽鎖に由来する可変領域を含むので、本明細書ではＨＣおよびＬＣと呼ばれる。ＲｉｂｏＭａｂ０２．１のポリペプチドはどちらも、抗体の完全な重鎖または軽鎖を含まない。
細胞培養上清（ＳＮ）試料をトランスフェクションの４８時間後にウェスタンブロット（ＷＢ）およびＥＬＩＳＡ分析に供した（図１４）。
ＷＢ分析（図１４Ａ）のために、ＳＮ試料をタンパク質変性のために熱処理し、続いて非還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。参照トリボディタンパク質の２つの調製物を陽性対照として使用した：一方は０．２３％の高分子量（ＨＭＷ；モノマー参照）種を含有し、他方は９６．５％のＨＭＷ（ＨＭＷ参照）種を含有した。次いで、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離されたタンパク質バンドをニトロセルロース膜にブロットし、それぞれカッパ軽鎖またはＩｇＧ Ｆｄ領域を標的とする２つのＨＲＰ結合ヤギ抗ヒト検出抗体の組合せとインキュベートした。この後、ブロットした膜を化学発光試薬で発色させ、４秒間曝露した。その後、画像をソフトウェアによって分析して、個々のバンドのシグナル強度およびパーセンテージ割合を定量化した（表５）。低分子量（ＬＭＷ）種を特徴とする遊離ＬＣ形態は、試験した全てのＳＮ試料で一貫して低かった。モノマー含有量は全体的に高く（＞９０％）、ＨＭＷ種－主に２００ｋＤａのＨＣ二量体－は、試験したＨＣ：ＬＣ ＲＮＡ比にわたって２．４％～９．１％で変化した。
サンドイッチイムノアッセイによるＲｉｂｏＭａｂ０２．１定量化のために、２つの独立した実験からの技術的二連のＳＮ試料を、捕捉および検出のためにそれぞれビオチン化またはＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ６４７結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を使用するＧｙｒｏｓ ｘＰａｎｄ（商標）ＸＰＡ１０２５ ＥＬＩＳＡ装置を用いて分析した。アッセイは、Ｇｙｒｏｌａｂ Ｂｉｏａｆｆｙ ２０ ＨＣ ＣＤで実施した。Ｇｙｒｏｌａｂ ｈｕＩｇＧ－Ｈｉｇｈ Ｔｉｔｅｒ法ｖ２を用いてデータを生成し、Ｇｙｒｏｌａｂ Ｅｖａｌｕａｔｏｒソフトウェアを使用して結果を評価した。
結果（図１４Ｂ）は、ＨＣをコードするＲＮＡの含有量がＥＬＩＳＡによって検出された単量体ＲｉｂｏＭａｂの量と逆相関したことを示す。したがって、１．２５：１および１．５：１のＨＣ：ＬＣ ＲＮＡ比は、ＳＮにおいて最も高いＲｉｂｏＭａｂ濃度（約３．５μｇ／ｍＬ）をもたらし、２．７５：１のＨＣ：ＬＣ比は、用量依存的に、最も低い量のＲｉｂｏＭａｂ０２．１（約２．０μｇ／ｍＬ）をもたらした。１．５：１のＨＣ：ＬＣ ＲＮＡ比は最も好ましいＲｉｂｏＭａｂ０２．１収量対ＨＭＷ含有量を示したので、ＲｉｂｏＭａｂ０２．１をコードする原薬および製剤の下流開発のためにこれを選択した（表５）。
Figure 2024525795000059
さらなる開発のために選択したＨＣ：ＬＣ ＲＮＡ比を太字で示す。ＬＣ＝軽鎖；ＬＭＷ＝低分子量；ＨＣ＝重鎖；ＨＭＷ＝高分子量；ＳＤ＝標準偏差

Claims (126)

  1. （ｉ）ＣＤ３に特異性を有する免疫グロブリンに由来する重鎖の可変領域（ＶＨ）（ＶＨ（ＣＤ３））、ＣＬＤＮ６に特異性を有する免疫グロブリンに由来する重鎖の可変領域（ＶＨ）（ＶＨ（ＣＬＤＮ６））およびＣＬＤＮ６に特異性を有する免疫グロブリンに由来する軽鎖の可変領域（ＶＬ）（ＶＬ（ＣＬＤＮ６））を含む第１のポリペプチド鎖をコードする第１のＲＮＡ；ならびに
    （ｉｉ）ＣＤ３に特異性を有する免疫グロブリンに由来する軽鎖の可変領域（ＶＬ）（ＶＬ（ＣＤ３））、ＣＬＤＮ６に特異性を有する免疫グロブリンに由来する重鎖の可変領域（ＶＨ）（ＶＨ（ＣＬＤＮ６））およびＣＬＤＮ６に特異性を有する免疫グロブリンに由来する軽鎖の可変領域（ＶＬ）（ＶＬ（ＣＬＤＮ６））を含む第２のポリペプチド鎖をコードする第２のＲＮＡ
    を含む組成物または医薬製剤。
  2. 前記第１のポリペプチド鎖が前記第２のポリペプチド鎖と相互作用して、ＣＤ３に特異性を有する結合ドメインおよびＣＬＤＮ６に特異性を有する２つの結合ドメインを形成する、請求項１に記載の組成物または医薬製剤。
  3. 前記第１のポリペプチド鎖のＶＨ（ＣＤ３）と前記第２のポリペプチド鎖のＶＬ（ＣＤ３）とが相互作用して、ＣＤ３に特異性を有する結合ドメインを形成し、
    前記第１のポリペプチド鎖のＶＨ（ＣＬＤＮ６）とＶＬ（ＣＬＤＮ６）とが相互作用して、ＣＬＤＮ６に特異性を有する結合ドメインを形成し、および
    前記第２のポリペプチド鎖のＶＨ（ＣＬＤＮ６）とＶＬ（ＣＬＤＮ６）とが相互作用して、ＣＬＤＮ６に特異性を有する結合ドメインを形成する、
    請求項１または２に記載の組成物または医薬製剤。
  4. 前記第１および第２のポリペプチド鎖が、免疫グロブリンまたはその機能的変異体に由来する重鎖の定常領域１（ＣＨ１）と、免疫グロブリンまたはその機能的変異体に由来する軽鎖の定常領域（ＣＬ）とを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  5. 前記免疫グロブリンがＩｇＧ１である、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  6. 前記ＩｇＧ１がヒトＩｇＧ１である、請求項５に記載の組成物または医薬製剤。
  7. 前記第１のポリペプチド鎖上のＶＨ、ＶＬ、およびＣＨ１が、
    ＶＨ（ＣＤ３）－ＣＨ１－ＶＨ（ＣＬＤＮ６）－ＶＬ（ＣＬＤＮ６）、または
    ＶＨ（ＣＤ３）－ＣＨ１－ＶＬ（ＣＬＤＮ６）－ＶＨ（ＣＬＤＮ６）
    の順序でＮ末端からＣ末端へと配置されている、請求項４～６のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  8. 前記ＣＨ１が、ペプチドリンカーによって前記ＶＨ（ＣＬＤＮ６）またはＶＬ（ＣＬＤＮ６）に接続されている、請求項４～７のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  9. 前記ペプチドリンカーが、アミノ酸配列ＳＧＰＧＧＧＲＳ（Ｇ４Ｓ）２またはその機能的変異体を含む、請求項８に記載の組成物または医薬製剤。
  10. 前記第２のポリペプチド鎖上のＶＨ、ＶＬ、およびＣＬが、
    ＶＬ（ＣＤ３）－ＣＬ－ＶＨ（ＣＬＤＮ６）－ＶＬ（ＣＬＤＮ６）、または
    ＶＬ（ＣＤ３）－ＣＬ－ＶＬ（ＣＬＤＮ６）－ＶＨ（ＣＬＤＮ６）
    の順序でＮ末端からＣ末端へと配置されている、請求項４～９のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  11. 前記ＣＬがペプチドリンカーによって前記ＶＨ（ＣＬＤＮ６）またはＶＬ（ＣＬＤＮ６）に接続されている、請求項４～１０のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  12. 前記ペプチドリンカーが、アミノ酸配列ＤＶＰＧＧＳまたはその機能的変異体を含む、請求項１１に記載の組成物または医薬製剤。
  13. 前記ＶＨ（ＣＬＤＮ６）および前記ＶＬ（ＣＬＤＮ６）がペプチドリンカーによって互いに接続されている、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  14. 前記ペプチドリンカーが、アミノ酸配列（Ｇ４Ｓ）ｘまたはその機能的変異体を含み、ｘが２、３、４、５または６である、請求項１３に記載の組成物または医薬製剤。
  15. 前記ペプチドリンカーが、アミノ酸配列（Ｇ４Ｓ）４またはその機能的変異体を含む、請求項１４に記載の組成物または医薬製剤。
  16. 前記第１のポリペプチド鎖上のＣＨ１が前記第２のポリペプチド鎖上のＣＬと相互作用する、請求項４～１５のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  17. 前記ＶＨ（ＣＤ３）が、配列番号４のアミノ酸２７～１４５のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  18. 前記ＶＬ（ＣＤ３）が、配列番号６のアミノ酸２７～１３２のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  19. 前記ＶＨ（ＣＬＤＮ６）が、配列番号４のアミノ酸２６７～３８３のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  20. 前記ＶＬ（ＣＬＤＮ６）が、配列番号４のアミノ酸４０４～５１０のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに好ましくはＣＤＲ１に対して＋１５の位置のセリン残基および／またはＣＤＲ２に対して－３の位置のセリン残基を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  21. 前記ＶＨ（ＣＤ３）が、配列番号４のアミノ酸２７～１４５のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、前記ＶＬ（ＣＤ３）が、配列番号６のアミノ酸２７～１３２のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、前記ＶＨ（ＣＬＤＮ６）が、配列番号４のアミノ酸２６７～３８３のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、前記ＶＬ（ＣＬＤＮ６）が、配列番号４のアミノ酸４０４～５１０のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ならびに好ましくは前記ＶＬ（ＣＬＤＮ６）が、ＣＤＲ１に対して＋１５の位置のセリン残基および／またはＣＤＲ２に対して－３の位置のセリン残基を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  22. 前記ＶＨ（ＣＤ３）が、配列番号４のアミノ酸２７～１４５のアミノ酸配列もしくはその機能的変異体を含み、
    前記ＶＬ（ＣＤ３）が、配列番号６のアミノ酸２７～１３２のアミノ酸配列もしくはその機能的変異体を含み、
    前記ＶＨ（ＣＬＤＮ６）が、配列番号４のアミノ酸２６７～３８３のアミノ酸配列もしくはその機能的変異体を含み、および／または
    前記ＶＬ（ＣＬＤＮ６）が、配列番号４のアミノ酸４０４～５１０のアミノ酸配列もしくはその機能的変異体を含む、
    請求項１～２１のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  23. 前記第１のポリペプチド鎖が、配列番号４のアミノ酸配列またはその機能的変異体を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  24. 前記第２のポリペプチド鎖が、配列番号６のアミノ酸配列またはその機能的変異体を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  25. 前記第１のポリペプチド鎖が、配列番号４のアミノ酸配列またはその機能的変異体を含み、前記第２のポリペプチド鎖が、配列番号６のアミノ酸配列またはその機能的変異体を含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  26. 前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドの少なくとも１つが、コドン最適化されたコード配列、および／またはそのＧ／Ｃ含有量が野生型コード配列と比較して増加しているコード配列によってコードされ、前記コドン最適化および／または前記Ｇ／Ｃ含有量の増加が、好ましくは前記コードされたアミノ酸配列の配列を変化させない、請求項１～２５のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  27. 前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドのそれぞれが、コドン最適化されたコード配列、および／またはそのＧ／Ｃ含有量が野生型コード配列と比較して増加しているコード配列によってコードされ、前記コドン最適化および／または前記Ｇ／Ｃ含有量の増加が、好ましくは前記コードされたアミノ酸配列の配列を変化させない、請求項１～２６のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  28. 前記ＲＮＡがウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  29. 前記修飾ヌクレオシドが、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）および５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）から選択される、請求項２８に記載の組成物または医薬製剤。
  30. 少なくとも１つのＲＮＡが５’キャップｍ２ ７，３’－ＯＧｐｐｐ（ｍ１ ２’－Ｏ）ＡｐＧを含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  31. 各ＲＮＡが５’キャップｍ２ ７，３’－ＯＧｐｐｐ（ｍ１ ２’－Ｏ）ＡｐＧを含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  32. 少なくとも１つのＲＮＡが、配列番号８のヌクレオチド配列、または配列番号８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む５’ＵＴＲを含む、請求項１～３１のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  33. 各ＲＮＡが、配列番号８のヌクレオチド配列、または配列番号８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む５’ＵＴＲを含む、請求項１～３２のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  34. 少なくとも１つのＲＮＡが、配列番号９のヌクレオチド配列、または配列番号９のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む３’ＵＴＲを含む、請求項１～３３のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  35. 各ＲＮＡが、配列番号９のヌクレオチド配列、または配列番号９のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む３’ＵＴＲを含む、請求項１～３４のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  36. 少なくとも１つのＲＮＡがポリＡ配列を含む、請求項１～３５のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  37. 各ＲＮＡがポリＡ配列を含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  38. 前記ポリＡ配列が少なくとも１００個のヌクレオチドを含む、請求項３６または３７に記載の組成物または医薬製剤。
  39. 前記ポリＡ配列が、配列番号１０のヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる、請求項３６～３８のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  40. （ｉ）前記第１のＲＮＡと前記第２のＲＮＡとが、約１．７５：１～約１．２５：１、もしくは約１．５：１～約１．２５：１、もしくは好ましくは約１．５：１の（ｗ／ｗ）比であり；ならびに／または
    （ｉｉ）前記第１のＲＮＡおよび前記第２のＲＮＡが、各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含み；ならびに／または
    （ｉｉｉ）前記第１のＲＮＡおよび前記第２のＲＮＡが、各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含み、前記修飾ヌクレオシドが、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）、および５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）から独立して選択され；ならびに／または
    （ｉｖ）前記第１のＲＮＡおよび前記第２のＲＮＡが、５’キャップｍ２ ７，３’－ＯＧｐｐｐ（ｍ１ ２’－Ｏ）ＡｐＧを含み；ならびに／または
    （ｖ）前記第１のＲＮＡおよび前記第２のＲＮＡが、配列番号８のヌクレオチド配列、もしくは配列番号８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む５’ＵＴＲを含み；ならびに／または
    （ｖｉ）前記第１のＲＮＡおよび前記第２のＲＮＡが、配列番号９のヌクレオチド配列、もしくは配列番号９のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む３’ＵＴＲを含み；ならびに／または
    （ｖｉｉ）前記第１のＲＮＡおよび前記第２のＲＮＡが、配列番号１０のヌクレオチド配列を含むポリＡ尾部を含む、
    請求項１～３９のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  41. （ｉ）前記第１のポリペプチド鎖が、配列番号４のアミノ酸配列、もしくは配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；および／または
    （ｉｉ）前記第１のＲＮＡが、配列番号５のヌクレオチド配列、もしくは配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、
    請求項１～４０のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  42. （ｉ）前記第２のポリペプチド鎖が、配列番号６のアミノ酸配列、もしくは配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；および／または
    （ｉｉ）前記第２のＲＮＡが、配列番号７のヌクレオチド配列、もしくは配列番号７のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、
    請求項１～４１のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  43. （ｉ）配列番号４のアミノ酸配列、または配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖をコードする第１のＲＮＡ；および
    （ｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列、または配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖をコードする第２のＲＮＡ
    を含む組成物または医薬製剤。
  44. 前記第１のＲＮＡが、配列番号５のヌクレオチド配列、または配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１～４３のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  45. 前記第２のＲＮＡが、配列番号７のヌクレオチド配列、または配列番号７のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１～４４のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  46. 前記ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項１～４５のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  47. 前記ＲＮＡが、液体として製剤化されるか、固体として製剤化されるか、またはそれらの組合せである、請求項１～４６のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  48. 前記ＲＮＡが注射用に製剤化されているか、または製剤化されることになっている、請求項１～４７のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  49. 前記ＲＮＡが静脈内投与用に製剤化されているか、または製剤化されることになっている、請求項１～４８のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  50. 前記ＲＮＡが粒子として製剤化されているか、または製剤化されることになっている、請求項１～４９のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  51. 前記粒子が脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である、請求項５０に記載の組成物または医薬製剤。
  52. 前記ＬＮＰ粒子が、（（３－ヒドロキシプロピル）アザンジイル）ビス（ノナン－９，１－ジイル）ビス（２－ブチルオクタノエート）、２－［（ポリエチレングリコール）－２０００］－Ｎ，Ｎ－ジテトラデシルアセトアミド、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、およびコレステロールを含む、請求項５１に記載の組成物または医薬製剤。
  53. 前記第１および第２のポリペプチドをコードする、好ましくは０．０５μｇ／ｋｇ以上、または０．０５μｇ／ｋｇ～５ｍｇ／ｋｇ、または０．０５μｇ／ｋｇ～５００μｇ／ｋｇ、または０．５μｇ／ｋｇ～５００μｇ／ｋｇ、または１μｇ／ｋｇ～５０μｇ／ｋｇ、または５μｇ／ｋｇ～１５０μｇ／ｋｇ、または１５μｇ／ｋｇ～１５０μｇ／ｋｇの用量のＲＮＡを含み、ｋｇが治療される対象の体重ｋｇを指す、医薬組成物である、請求項１～５２のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  54. 前記医薬組成物が、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤をさらに含む、請求項５３に記載の組成物または医薬製剤。
  55. 前記医薬製剤がキットである、請求項１～５２のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  56. 前記ＲＮＡおよび任意で前記粒子形成成分が別々のバイアル内にある、請求項５５に記載の組成物または医薬製剤。
  57. 癌を治療または予防するための組成物または医薬製剤の使用説明書をさらに含む、請求項５５または５６に記載の組成物または医薬製剤。
  58. 医薬用途のための、請求項１～５７のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  59. 前記医薬用途が、疾患または障害の治療的または予防的処置を含む、請求項５８に記載の組成物または医薬製剤。
  60. 疾患または障害の前記治療的または予防的処置が、癌を治療または予防することを含む、請求項５９に記載の組成物または医薬製剤。
  61. 疾患または障害の前記治療的または予防的処置が、さらなる療法を投与することをさらに含む、請求項５９または６０のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  62. 前記さらなる療法が、（ｉ）腫瘍を摘出、切除、または減量する手術、（ｉｉ）放射線療法、および（ｉｉｉ）化学療法からなる群より選択される１つ以上を含む、請求項６２に記載の組成物または医薬製剤。
  63. 前記さらなる療法が、さらなる治療薬を投与することを含む、請求項６２に記載の組成物または医薬製剤。
  64. 前記さらなる治療薬が抗癌治療薬を含む、請求項６３に記載の組成物または医薬製剤。
  65. ヒトへの投与用である、請求項１～６４のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  66. 対象における癌を治療する方法であって、
    （ｉ）ＣＤ３に特異性を有する免疫グロブリンに由来する重鎖の可変領域（ＶＨ）（ＶＨ（ＣＤ３））、ＣＬＤＮ６に特異性を有する免疫グロブリンに由来する重鎖の可変領域（ＶＨ）（ＶＨ（ＣＬＤＮ６））およびＣＬＤＮ６に特異性を有する免疫グロブリンに由来する軽鎖の可変領域（ＶＬ）（ＶＬ（ＣＬＤＮ６））を含む第１のポリペプチド鎖をコードする第１のＲＮＡ；ならびに
    （ｉｉ）ＣＤ３に特異性を有する免疫グロブリンに由来する軽鎖の可変領域（ＶＬ）（ＶＬ（ＣＤ３））、ＣＬＤＮ６に特異性を有する免疫グロブリンに由来する重鎖の可変領域（ＶＨ）（ＶＨ（ＣＬＤＮ６））およびＣＬＤＮ６に特異性を有する免疫グロブリンに由来する軽鎖の可変領域（ＶＬ）（ＶＬ（ＣＬＤＮ６））を含む第２のポリペプチド鎖をコードする第２のＲＮＡ
    を前記対象に投与することを含む、方法。
  67. 前記第１のポリペプチド鎖が前記第２のポリペプチド鎖と相互作用して、ＣＤ３に特異性を有する結合ドメインおよびＣＬＤＮ６に特異性を有する２つの結合ドメインを形成する、請求項６６に記載の方法。
  68. 前記第１のポリペプチド鎖のＶＨ（ＣＤ３）と前記第２のポリペプチド鎖のＶＬ（ＣＤ３）とが相互作用して、ＣＤ３に特異性を有する結合ドメインを形成し、
    前記第１のポリペプチド鎖のＶＨ（ＣＬＤＮ６）とＶＬ（ＣＬＤＮ６）とが相互作用して、ＣＬＤＮ６に特異性を有する結合ドメインを形成し、
    前記第２のポリペプチド鎖のＶＨ（ＣＬＤＮ６）とＶＬ（ＣＬＤＮ６）とが相互作用して、ＣＬＤＮ６に特異性を有する結合ドメインを形成する、
    請求項６６または６７に記載の方法。
  69. 前記第１および第２のポリペプチド鎖が、免疫グロブリンまたはその機能的変異体に由来する重鎖の定常領域１（ＣＨ１）と、免疫グロブリンまたはその機能的変異体に由来する軽鎖の定常領域（ＣＬ）とを含む、請求項６６～６８のいずれか一項に記載の方法。
  70. 前記免疫グロブリンがＩｇＧ１である、請求項６６～６９のいずれか一項に記載の方法。
  71. 前記ＩｇＧ１がヒトＩｇＧ１である、請求項７０に記載の方法。
  72. 前記第１のポリペプチド鎖上のＶＨ、ＶＬ、およびＣＨ１が、
    ＶＨ（ＣＤ３）－ＣＨ１－ＶＨ（ＣＬＤＮ６）－ＶＬ（ＣＬＤＮ６）、または
    ＶＨ（ＣＤ３）－ＣＨ１－ＶＬ（ＣＬＤＮ６）－ＶＨ（ＣＬＤＮ６）
    の順序でＮ末端からＣ末端へと配置されている、請求項６９～７１のいずれか一項に記載の方法。
  73. 前記ＣＨ１が、ペプチドリンカーによって前記ＶＨ（ＣＬＤＮ６）またはＶＬ（ＣＬＤＮ６）に接続されている、請求項６９～７２のいずれか一項に記載の方法。
  74. 前記ペプチドリンカーが、アミノ酸配列ＳＧＰＧＧＧＲＳ（Ｇ４Ｓ）２またはその機能的変異体を含む、請求項７３に記載の方法。
  75. 前記第２のポリペプチド鎖上のＶＨ、ＶＬ、およびＣＬが、
    ＶＬ（ＣＤ３）－ＣＬ－ＶＨ（ＣＬＤＮ６）－ＶＬ（ＣＬＤＮ６）、または
    ＶＬ（ＣＤ３）－ＣＬ－ＶＬ（ＣＬＤＮ６）－ＶＨ（ＣＬＤＮ６）
    の順序でＮ末端からＣ末端へと配置されている、請求項６９～７４のいずれか一項に記載の方法。
  76. 前記ＣＬが、ペプチドリンカーによって前記ＶＨ（ＣＬＤＮ６）またはＶＬ（ＣＬＤＮ６）に接続されている、請求項６９～７５のいずれか一項に記載の方法。
  77. 前記ペプチドリンカーが、アミノ酸配列ＤＶＰＧＧＳまたはその機能的変異体を含む、請求項７６に記載の方法。
  78. 前記ＶＨ（ＣＬＤＮ６）および前記ＶＬ（ＣＬＤＮ６）がペプチドリンカーによって互いに接続されている、請求項６６～７７のいずれか一項に記載の方法。
  79. 前記ペプチドリンカーが、アミノ酸配列（Ｇ４Ｓ）ｘまたはその機能的変異体を含み、ｘが２、３、４、５または６である、請求項７８に記載の方法。
  80. 前記ペプチドリンカーが、アミノ酸配列（Ｇ４Ｓ）４またはその機能的変異体を含む、請求項７９に記載の方法。
  81. 前記第１のポリペプチド鎖上のＣＨ１が前記第２のポリペプチド鎖上のＣＬと相互作用する、請求項６９～８０のいずれか一項に記載の方法。
  82. 前記ＶＨ（ＣＤ３）が、配列番号４のアミノ酸２７～１４５のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、請求項６６～８１のいずれか一項に記載の方法。
  83. 前記ＶＬ（ＣＤ３）が、配列番号６のアミノ酸２７～１３２のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、請求項６６～８２のいずれか一項に記載の方法。
  84. 前記ＶＨ（ＣＬＤＮ６）が、配列番号４のアミノ酸２６７～３８３のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、請求項６６～８３のいずれか一項に記載の方法。
  85. 前記ＶＬ（ＣＬＤＮ６）が、配列番号４のアミノ酸４０４～５１０のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに好ましくはＣＤＲ１に対して＋１５の位置のセリン残基および／またはＣＤＲ２に対して－３の位置のセリン残基を含む、請求項６６～８４のいずれか一項に記載の方法。
  86. 前記ＶＨ（ＣＤ３）が、配列番号４のアミノ酸２７～１４５のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、前記ＶＬ（ＣＤ３）が、配列番号６のアミノ酸２７～１３２のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、前記ＶＨ（ＣＬＤＮ６）が、配列番号４のアミノ酸２６７～３８３のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、前記ＶＬ（ＣＬＤＮ６）が、配列番号４のアミノ酸４０４～５１０のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ならびに好ましくは前記ＶＬ（ＣＬＤＮ６）が、ＣＤＲ１に対して＋１５の位置のセリン残基および／またはＣＤＲ２に対して－３の位置のセリン残基を含む、請求項６６～８５のいずれか一項に記載の方法。
  87. 前記ＶＨ（ＣＤ３）が、配列番号４のアミノ酸２７～１４５のアミノ酸配列もしくはその機能的変異体を含み、
    前記ＶＬ（ＣＤ３）が、配列番号６のアミノ酸２７～１３２のアミノ酸配列もしくはその機能的変異体を含み、
    前記ＶＨ（ＣＬＤＮ６）が、配列番号４のアミノ酸２６７～３８３のアミノ酸配列もしくはその機能的変異体を含み、および／または
    前記ＶＬ（ＣＬＤＮ６）が、配列番号４のアミノ酸４０４～５１０のアミノ酸配列もしくはその機能的変異体を含む、
    請求項６６～８６のいずれか一項に記載の方法。
  88. 前記第１のポリペプチド鎖が、配列番号４のアミノ酸配列またはその機能的変異体を含む、請求項６６～８７のいずれか一項に記載の方法。
  89. 前記第２のポリペプチド鎖が、配列番号６のアミノ酸配列またはその機能的変異体を含む、請求項６６～８８のいずれか一項に記載の方法。
  90. 前記第１のポリペプチド鎖が配列番号４のアミノ酸配列またはその機能的変異体を含み、前記第２のポリペプチド鎖が配列番号６のアミノ酸配列またはその機能的変異体を含む、請求項６６～８９のいずれか一項に記載の方法。
  91. 前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドの少なくとも１つが、コドン最適化されたコード配列、および／またはそのＧ／Ｃ含有量が野生型コード配列と比較して増加しているコード配列によってコードされ、前記コドン最適化および／または前記Ｇ／Ｃ含有量の増加が、好ましくは前記コードされたアミノ酸配列の配列を変化させない、請求項６６～９０のいずれか一項に記載の方法。
  92. 前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドのそれぞれが、コドン最適化されたコード配列、および／またはそのＧ／Ｃ含有量が野生型コード配列と比較して増加しているコード配列によってコードされ、前記コドン最適化および／または前記Ｇ／Ｃ含有量の増加が、好ましくは前記コードされたアミノ酸配列の配列を変化させない、請求項６６～９１のいずれか一項に記載の方法。
  93. 前記ＲＮＡがウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む、請求項６６～９２のいずれか一項に記載の方法。
  94. 前記修飾ヌクレオシドが、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）、および５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）から選択される、請求項９３に記載の方法。
  95. 少なくとも１つのＲＮＡが５’キャップｍ２ ７，３’－ＯＧｐｐｐ（ｍ１ ２’－Ｏ）ＡｐＧを含む、請求項６６～９４のいずれか一項に記載の方法。
  96. 各ＲＮＡが５’キャップｍ２ ７，３’－ＯＧｐｐｐ（ｍ１ ２’－Ｏ）ＡｐＧを含む、請求項６６～９５のいずれか一項に記載の方法。
  97. 少なくとも１つのＲＮＡが、配列番号８のヌクレオチド配列、または配列番号８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む５’ＵＴＲを含む、請求項６６～９６のいずれか一項に記載の方法。
  98. 各ＲＮＡが、配列番号８のヌクレオチド配列、または配列番号８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む５’ＵＴＲを含む、請求項６６～９７のいずれか一項に記載の方法。
  99. 少なくとも１つのＲＮＡが、配列番号９のヌクレオチド配列、または配列番号９のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む３’ＵＴＲを含む、請求項６６～９８のいずれか一項に記載の方法。
  100. 各ＲＮＡが、配列番号９のヌクレオチド配列、または配列番号９のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む３’ＵＴＲを含む、請求項６６～９９のいずれか一項に記載の方法。
  101. 少なくとも１つのＲＮＡがポリＡ配列を含む、請求項６６～１００のいずれか一項に記載の方法。
  102. 各ＲＮＡがポリＡ配列を含む、請求項６６～１０１のいずれか一項に記載の方法。
  103. 前記ポリＡ配列が少なくとも１００個のヌクレオチドを含む、請求項１０１または１０２に記載の方法。
  104. 前記ポリＡ配列が、配列番号１０のヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる、請求項１０１～１０３のいずれか一項に記載の方法。
  105. （ｉ）前記第１のＲＮＡと前記第２のＲＮＡとが、約１．７５：１～約１．２５：１、もしくは約１．５：１～約１．２５：１、もしくは好ましくは約１．５：１の（ｗ／ｗ）比であり；ならびに／または
    （ｉｉ）前記第１のＲＮＡおよび前記第２のＲＮＡが、各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含み；ならびに／または
    （ｉｉｉ）前記第１のＲＮＡおよび前記第２のＲＮＡが、各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含み、前記修飾ヌクレオシドが、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）、および５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）から独立して選択され；ならびに／または
    （ｉｖ）前記第１のＲＮＡおよび前記第２のＲＮＡが、５’キャップｍ２ ７，３’－ＯＧｐｐｐ（ｍ１ ２’－Ｏ）ＡｐＧを含み；ならびに／または
    （ｖ）前記第１のＲＮＡおよび前記第２のＲＮＡが、配列番号８のヌクレオチド配列、もしくは配列番号８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む５’ＵＴＲを含み；ならびに／または
    （ｖｉ）前記第１のＲＮＡおよび前記第２のＲＮＡが、配列番号９のヌクレオチド配列、もしくは配列番号９のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む３’ＵＴＲを含み；ならびに／または
    （ｖｉｉ）前記第１のＲＮＡおよび前記第２のＲＮＡが、配列番号１０のヌクレオチド配列を含むポリＡ尾部を含む、
    請求項６６～１０４のいずれか一項に記載の方法。
  106. （ｉ）前記第１のポリペプチド鎖が、配列番号４のアミノ酸配列、もしくは配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；および／または
    （ｉｉ）前記第１のＲＮＡが、配列番号５のヌクレオチド配列、もしくは配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、
    請求項６６～１０５のいずれか一項に記載の方法。
  107. （ｉ）前記第２のポリペプチド鎖が、配列番号６のアミノ酸配列、もしくは配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；および／または
    （ｉｉ）前記第２のＲＮＡが、配列番号７のヌクレオチド配列、もしくは配列番号７のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、
    請求項６６～１０６のいずれか一項に記載の方法。
  108. 対象における癌を治療する方法であって、
    （ｉ）配列番号４のアミノ酸配列、または配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖をコードする第１のＲＮＡ；および
    （ｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列、または配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖をコードする第２のＲＮＡ
    を前記対象に投与することを含む、方法。
  109. 前記第１のＲＮＡが、配列番号５のヌクレオチド配列、または配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項６６～１０８のいずれか一項に記載の方法。
  110. 前記第２のＲＮＡが、配列番号７のヌクレオチド配列、または配列番号７のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項６６～１０９のいずれか一項に記載の方法。
  111. 前記ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項６６～１１０のいずれか一項に記載の方法。
  112. 前記ＲＮＡが、液体として製剤化されるか、固体として製剤化されるか、またはそれらの組合せである、請求項６６～１１１のいずれか一項に記載の方法。
  113. 前記ＲＮＡが注射によって、好ましくは週に１回投与される、請求項６６～１１２のいずれか一項に記載の方法。
  114. 前記ＲＮＡが静脈内投与によって投与される、請求項６６～１１３のいずれか一項に記載の方法。
  115. 前記ＲＮＡが粒子として製剤化される、請求項６６～１１４のいずれか一項に記載の方法。
  116. 前記粒子が脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である、請求項１１５に記載の方法。
  117. 前記ＬＮＰ粒子が、（（３－ヒドロキシプロピル）アザンジイル）ビス（ノナン－９，１－ジイル）ビス（２－ブチルオクタノエート）、２－［（ポリエチレングリコール）－２０００］－Ｎ，Ｎ－ジテトラデシルアセトアミド、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、およびコレステロールを含む、請求項１１６に記載の方法。
  118. 前記ＲＮＡが医薬組成物に製剤化され、前記医薬組成物が、前記第１および第２のポリペプチドをコードする、好ましくは０．０５μｇ／ｋｇ以上、または０．０５μｇ／ｋｇ～５ｍｇ／ｋｇ、または０．０５μｇ／ｋｇ～５００μｇ／ｋｇ、または０．５μｇ／ｋｇ～５００μｇ／ｋｇ、または１μｇ／ｋｇ～５０μｇ／ｋｇ、または５μｇ／ｋｇ～１５０μｇ／ｋｇ、または１５μｇ／ｋｇ～１５０μｇ／ｋｇの用量のＲＮＡを含み、ｋｇが治療される対象の体重ｋｇを指す、請求項６６～１１７のいずれか一項に記載の方法。
  119. 前記医薬組成物が、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤をさらに含む、請求項１１８に記載の方法。
  120. さらなる療法を投与することをさらに含む、請求項６６～１１９のいずれか一項に記載の方法。
  121. 前記さらなる療法が、（ｉ）腫瘍を摘出、切除、または減量する手術、（ｉｉ）放射線療法、および（ｉｉｉ）化学療法からなる群より選択される１つ以上を含む、請求項１２０に記載の方法。
  122. 前記さらなる療法が、さらなる治療薬を投与することを含む、請求項１２１に記載の方法。
  123. 前記さらなる治療薬が抗癌治療薬を含む、請求項１２２に記載の方法。
  124. 前記対象がヒトである、請求項６６～１２３のいずれか一項に記載の方法。
  125. 前記癌がＣＬＤＮ６陽性癌である、請求項６６～１２４のいずれか一項に記載の方法。
  126. 請求項６６～１２５のいずれか一項に記載の方法において使用するための、請求項１～６５のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
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