JP2022525103A - 前立腺癌のための治療用ｒｎａ - Google Patents

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Abstract

前立腺癌の処置のための組成物、使用、および方法が本明細書に開示される。一態様では、少なくとも１つのＲＮＡを含む組成物または医薬製剤が本明細書で開示され、ここで、少なくとも１つのＲＮＡは、以下のアミノ酸配列をコードする：（ｉ）カリクレイン２（ＫＬＫ２）、その免疫原性変異体、またはＫＬＫ２もしくはその免疫原性変異体の免疫原性断片を含むアミノ酸配列；（ｉｉ）前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、その免疫原性変異体、またはＰＳＡもしくはその免疫原性変異体の免疫原性断片を含むアミノ酸配列；（ｉｉｉ）前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、その免疫原性変異体、またはＰＡＰもしくはその免疫原性変異体の免疫原性断片を含むアミノ酸配列；（ｉｖ）ホメオボックスＢ１３（ＨＯＸＢ１３）、その免疫原性変異体、またはＨＯＸＢ１３もしくはその免疫原性変異体の免疫原性断片を含むアミノ酸配列；および（ｖ）ＮＫ３ホメオボックス１（ＮＫＸ３－１）、その免疫原性変異体、またはＮＫＸ３－１もしくはその免疫原性変異体の免疫原性断片を含むアミノ酸配列。

Description

本開示は、前立腺癌を治療するための治療用ＲＮＡの分野に関する。前立腺癌は、中年以上の男性が毎年何千人も罹患する深刻な疾患である。症例の約６０％は６５歳を超える男性で発生する。アメリカがん協会（ＡＣＳ）は、２０１９年に１７４，６５０人のアメリカ人男性が新たにこの状態と診断されると推定している。泌尿器科医療財団（Ｕｒｏｌｏｇｙ Ｃａｒｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）によれば、前立腺癌は米国における男性の癌による死亡の第２位の原因である。
前立腺癌の処置のための組成物、使用、および方法が本明細書に開示される。本明細書に開示される前立腺癌を有する患者への治療用ＲＮＡの投与は、腫瘍サイズを縮小し、進行性疾患までの時間を延長し、ならびに／または腫瘍の転移および／もしくは再発から保護し、最終的に生存期間を延長することができる。
一態様では、少なくとも１つのＲＮＡを含む組成物または医薬製剤が本明細書で提供され、ここで、少なくとも１つのＲＮＡは、以下のアミノ酸配列をコードする：
（ｉ）カリクレイン２（ＫＬＫ２）、その免疫原性変異体、またはＫＬＫ２もしくはその免疫原性変異体の免疫原性断片を含むアミノ酸配列；
（ｉｉ）前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、その免疫原性変異体、またはＰＳＡもしくはその免疫原性変異体の免疫原性断片を含むアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、その免疫原性変異体、またはＰＡＰもしくはその免疫原性変異体の免疫原性断片を含むアミノ酸配列；
（ｉｖ）ホメオボックスＢ１３（ＨＯＸＢ１３）、その免疫原性変異体、またはＨＯＸＢ１３もしくはその免疫原性変異体の免疫原性断片を含むアミノ酸配列；および
（ｖ）ＮＫ３ホメオボックス１（ＮＫＸ３－１）、その免疫原性変異体、またはＮＫＸ３－１もしくはその免疫原性変異体の免疫原性断片を含むアミノ酸配列。
一実施形態では、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、または（ｖ）のアミノ酸配列のそれぞれは、別個のＲＮＡによってコードされている。
一実施形態では、
（ｉ）（ｉ）のアミノ酸配列をコードするＲＮＡは、配列番号３もしくは４のヌクレオチド配列、または配列番号３もしくは４のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む；および／または
（ｉｉ）（ｉ）のアミノ酸配列は、配列番号１もしくは２のアミノ酸配列、または配列番号１もしくは２のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、
（ｉ）（ｉｉ）のアミノ酸配列をコードするＲＮＡは、配列番号７もしくは８のヌクレオチド配列、または配列番号７もしくは８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む；および／または
（ｉｉ）（ｉｉ）のアミノ酸配列は、配列番号５もしくは６のアミノ酸配列、または配列番号５もしくは６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、
（ｉ）（ｉｉｉ）のアミノ酸配列をコードするＲＮＡは、配列番号１１もしくは１２のヌクレオチド配列、または配列番号１１もしくは１２のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む；および／または
（ｉｉ）（ｉｉｉ）のアミノ酸配列は、配列番号９もしくは１０のアミノ酸配列、または配列番号９もしくは１０のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、
（ｉ）（ｉｖ）のアミノ酸配列をコードするＲＮＡは、配列番号１５もしくは１６のヌクレオチド配列、または配列番号１５もしくは１６のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む；および／または
（ｉｉ）（ｉｖ）のアミノ酸配列は、配列番号１３もしくは１４のアミノ酸配列、または配列番号１３もしくは１４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、
（ｉ）（ｖ）のアミノ酸配列をコードするＲＮＡは、配列番号１９もしくは２０のヌクレオチド配列、または配列番号１９もしくは２０のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む；および／または
（ｉｉ）（ｖ）のアミノ酸配列は、配列番号１７もしくは１８のアミノ酸配列、または配列番号１７もしくは１８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、または（ｖ）のアミノ酸配列の少なくとも１つは、コドン最適化された、および／またはそのＧ／Ｃ含有量が野生型コード配列と比較して増加しているコード配列によってコードされ、ここで、コドン最適化および／またはＧ／Ｃ含有量の増加は、好ましくはコードされたアミノ酸配列の配列を変化させない。一実施形態では、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、または（ｖ）のアミノ酸配列のそれぞれは、コドン最適化された、および／またはそのＧ／Ｃ含有量が野生型コード配列と比較して増加しているコード配列によってコードされ、ここで、コドン最適化および／またはＧ／Ｃ含有量の増加は、好ましくはコードされたアミノ酸配列の配列を変化させない。
一実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡは、修飾ＲＮＡ、特に安定化されたｍＲＮＡである。一実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡは、少なくとも１つのウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。一実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡは、各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。一実施形態では、各ＲＮＡは、少なくとも１つのウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。一実施形態では、各ＲＮＡは、各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。一実施形態では、修飾ヌクレオシドは、シュードウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、および５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）から独立して選択される。
一実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡは、５'キャップｍ２ ７，２'－ＯＧｐｐｓｐ（５'）Ｇを含む。一実施形態では、各ＲＮＡは、５'キャップｍ２ ７，２'－ＯＧｐｐｓｐ（５'）Ｇを含む。
一実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡは、配列番号２１のヌクレオチド配列、または配列番号２１のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む５'－ＵＴＲを含む。一実施形態では、各ＲＮＡは、配列番号２１のヌクレオチド配列、または配列番号２１のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む５'－ＵＴＲを含む。
一実施形態では、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、または（ｖ）の少なくとも１つのアミノ酸配列は、抗原プロセシングおよび／または抗原提示を増強するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、または（ｖ）の各アミノ酸配列は、抗原プロセシングおよび／または抗原提示を増強するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、抗原プロセシングおよび／または抗原提示を増強するアミノ酸配列は、ＭＨＣ分子、好ましくはＭＨＣクラスＩ分子の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに対応するアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、
（ｉ）抗原プロセシングおよび／または抗原提示を増強するアミノ酸配列をコードするＲＮＡは、配列番号２５のヌクレオチド配列、または配列番号２５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む；ならびに／または
（ｉｉ）抗原プロセシングおよび／または抗原提示を増強するアミノ酸配列は、配列番号２４のアミノ酸配列、または配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、抗原プロセシングおよび／または抗原提示を増強するアミノ酸配列は、分泌シグナルペプチドをコードするアミノ酸配列をさらに含む。
一実施形態では、
（ｉ）分泌シグナルペプチドをコードするＲＮＡは、配列番号２３のヌクレオチド配列、または配列番号２３のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む；および／または
（ｉｉ）分泌シグナルペプチドは、配列番号２２のアミノ酸配列、または配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、または（ｖ）の少なくとも１つのアミノ酸配列は、免疫寛容を破壊するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、または（ｖ）の各アミノ酸配列は、免疫寛容を破壊するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、免疫寛容を破壊するアミノ酸配列は、ヘルパーエピトープ、好ましくは破傷風トキソイド由来のヘルパーエピトープを含む。
一実施形態では、
（ｉ）免疫寛容を破壊するアミノ酸配列をコードするＲＮＡは、配列番号２７のヌクレオチド配列、または配列番号２７のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む；および／または
（ｉｉ）免疫寛容を破壊するアミノ酸配列は、配列番号２６のアミノ酸配列、または配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡは、配列番号２８のヌクレオチド配列、または配列番号２８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む３'－ＵＴＲを含む。一実施形態では、各ＲＮＡは、配列番号２８のヌクレオチド配列、または配列番号２８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む３'－ＵＴＲを含む。
一実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡは、ポリＡ配列を含む。一実施形態では、各ＲＮＡは、ポリＡ配列を含む。一実施形態では、ポリＡ配列は、少なくとも１００個のヌクレオチドを含む。一実施形態では、ポリＡ配列は、配列番号２９のヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる。
一実施形態では、ＲＮＡは、液体として製剤化されているか、固体として製剤化されているか、またはそれらの組合せである。一実施形態では、ＲＮＡは注射用に製剤化されている。一実施形態では、ＲＮＡは静脈内投与用に製剤化されている。一実施形態では、ＲＮＡは、リポプレックス粒子として製剤化されているか、または製剤化されることになっている。一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、ＲＮＡをリポソームと混合することによって得られる。
一実施形態では、組成物または医薬製剤は医薬組成物である。一実施形態では、医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤をさらに含む。
一実施形態では、医薬製剤はキットである。一実施形態では、ＲＮＡおよび任意でリポソームは、別々のバイアル内にある。
一実施形態では、組成物または医薬製剤は、前立腺癌を処置または予防するためのＲＮＡおよび任意でリポソームの使用説明書をさらに含む。
一態様では、医薬用途のための本明細書に記載の組成物または医薬製剤が本明細書で提供される。一実施形態では、医薬用途は、疾患または障害の治療的または予防的処置を含む。一実施形態では、疾患または障害の治療的または予防的処置は、前立腺癌を処置または予防することを含む。一実施形態では、本明細書に記載の組成物または医薬製剤は、ヒトへの投与用である。
一実施形態では、疾患または障害の治療的または予防的処置は、さらなる療法を投与することをさらに含む。一実施形態では、さらなる療法は、（ｉ）腫瘍を摘出、切除、または減量する手術、（ｉｉ）放射線療法、および（ｉｉｉ）化学療法からなる群より選択される１つ以上を含む。一実施形態では、さらなる療法は、さらなる治療薬を投与することを含む。一実施形態では、さらなる治療薬は抗癌治療薬を含む。一実施形態では、さらなる治療薬はチェックポイント調節剤である。一実施形態では、チェックポイント調節剤は、抗ＰＤ１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、または抗ＰＤ１抗体と抗ＣＴＬＡ－４抗体の組合せである。
一態様では、対象に少なくとも１つのＲＮＡを投与することを含む、対象における前立腺癌を処置する方法が本明細書で提供され、ここで、少なくとも１つのＲＮＡは、以下のアミノ酸配列をコードする：
（ｉ）カリクレイン２（ＫＬＫ２）、その免疫原性変異体、またはＫＬＫ２の免疫原性断片もしくはその免疫原性変異体を含むアミノ酸配列；
（ｉｉ）前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、その免疫原性変異体、またはＰＳＡもしくはその免疫原性変異体の免疫原性断片を含むアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、その免疫原性変異体、またはＰＡＰもしくはその免疫原性変異体の免疫原性断片を含むアミノ酸配列；
（ｉｖ）ホメオボックスＢ１３（ＨＯＸＢ１３）、その免疫原性変異体、またはＨＯＸＢ１３もしくはその免疫原性変異体の免疫原性断片を含むアミノ酸配列；および
（ｖ）ＮＫ３ホメオボックス１（ＮＫＸ３－１）、その免疫原性変異体、またはＮＫＸ３－１もしくはその免疫原性変異体の免疫原性断片を含むアミノ酸配列。
一実施形態では、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、または（ｖ）のアミノ酸配列のそれぞれは、別個のＲＮＡによってコードされている。
一実施形態では、
（ｉ）（ｉ）のアミノ酸配列をコードするＲＮＡは、配列番号３もしくは４のヌクレオチド配列、または配列番号３もしくは４のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む；および／または
（ｉｉ）（ｉ）のアミノ酸配列は、配列番号１もしくは２のアミノ酸配列、または配列番号１もしくは２のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、
（ｉ）（ｉｉ）のアミノ酸配列をコードするＲＮＡは、配列番号７もしくは８のヌクレオチド配列、または配列番号７もしくは８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む；および／または
（ｉｉ）（ｉｉ）のアミノ酸配列は、配列番号５もしくは６のアミノ酸配列、または配列番号５もしくは６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、
（ｉ）（ｉｉｉ）のアミノ酸配列をコードするＲＮＡは、配列番号１１もしくは１２のヌクレオチド配列、または配列番号１１もしくは１２のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む；および／または
（ｉｉ）（ｉｉｉ）のアミノ酸配列は、配列番号９もしくは１０のアミノ酸配列、または配列番号９もしくは１０のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、
（ｉ）（ｉｖ）のアミノ酸配列をコードするＲＮＡは、配列番号１５もしくは１６のヌクレオチド配列、または配列番号１５もしくは１６のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む；および／または
（ｉｉ）（ｉｖ）のアミノ酸配列は、配列番号１３もしくは１４のアミノ酸配列、または配列番号１３もしくは１４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、
（ｉ）（ｖ）のアミノ酸配列をコードするＲＮＡは、配列番号１９もしくは２０のヌクレオチド配列、または配列番号１９もしくは２０のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む；および／または
（ｉｉ）（ｖ）のアミノ酸配列は、配列番号１７もしくは１８のアミノ酸配列、または配列番号１７もしくは１８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、または（ｖ）のアミノ酸配列の少なくとも１つは、コドン最適化された、および／またはそのＧ／Ｃ含有量が野生型コード配列と比較して増加しているコード配列によってコードされ、ここで、コドン最適化および／またはＧ／Ｃ含有量の増加は、好ましくはコードされたアミノ酸配列の配列を変化させない。一実施形態では、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、または（ｖ）のアミノ酸配列のそれぞれは、コドン最適化された、および／またはそのＧ／Ｃ含有量が野生型コード配列と比較して増加しているコード配列によってコードされ、ここで、コドン最適化および／またはＧ／Ｃ含有量の増加は、好ましくはコードされたアミノ酸配列の配列を変化させない。
一実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡは、修飾ＲＮＡ、特に安定化されたｍＲＮＡである。一実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡは、少なくとも１つのウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。一実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡは、各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。一実施形態では、各ＲＮＡは、少なくとも１つのウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。一実施形態では、各ＲＮＡは、各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。一実施形態では、修飾ヌクレオシドは、シュードウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、および５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）から独立して選択される。
一実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡは、５'キャップｍ２ ７，２'－ＯＧｐｐｓｐ（５'）Ｇを含む。一実施形態では、各ＲＮＡは、５'キャップｍ２ ７，２'－ＯＧｐｐｓｐ（５'）Ｇを含む。
一実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡは、配列番号２１のヌクレオチド配列、または配列番号２１のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む５'－ＵＴＲを含む。一実施形態では、各ＲＮＡは、配列番号２１のヌクレオチド配列、または配列番号２１のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む５'－ＵＴＲを含む。
一実施形態では、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、または（ｖ）の少なくとも１つのアミノ酸配列は、抗原プロセシングおよび／または抗原提示を増強するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、または（ｖ）の各アミノ酸配列は、抗原プロセシングおよび／または抗原提示を増強するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、抗原プロセシングおよび／または抗原提示を増強するアミノ酸配列は、ＭＨＣ分子、好ましくはＭＨＣクラスＩ分子の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに対応するアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、
（ｉ）抗原プロセシングおよび／または抗原提示を増強するアミノ酸配列をコードするＲＮＡは、配列番号２５のヌクレオチド配列、または配列番号２５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む；ならびに／または
（ｉｉ）抗原プロセシングおよび／または抗原提示を増強するアミノ酸配列は、配列番号２４のアミノ酸配列、または配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、抗原プロセシングおよび／または抗原提示を増強するアミノ酸配列は、分泌シグナルペプチドをコードするアミノ酸配列をさらに含む。
一実施形態では、
（ｉ）分泌シグナルペプチドをコードするＲＮＡは、配列番号２３のヌクレオチド配列、または配列番号２３のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む；および／または
（ｉｉ）分泌シグナルペプチドは、配列番号２２のアミノ酸配列、または配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、または（ｖ）の少なくとも１つのアミノ酸配列は、免疫寛容を破壊するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、または（ｖ）の各アミノ酸配列は、免疫寛容を破壊するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、免疫寛容を破壊するアミノ酸配列は、ヘルパーエピトープ、好ましくは破傷風トキソイド由来のヘルパーエピトープを含む。
一実施形態では、
（ｉ）免疫寛容を破壊するアミノ酸配列をコードするＲＮＡは、配列番号２７のヌクレオチド配列、または配列番号２７のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む；および／または
（ｉｉ）免疫寛容を破壊するアミノ酸配列は、配列番号２６のアミノ酸配列、または配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡは、配列番号２８のヌクレオチド配列、または配列番号２８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む３'－ＵＴＲを含む。一実施形態では、各ＲＮＡは、配列番号２８のヌクレオチド配列、または配列番号２８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む３'－ＵＴＲを含む。
一実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡは、ポリＡ配列を含む。一実施形態では、各ＲＮＡは、ポリＡ配列を含む。一実施形態では、ポリＡ配列は、少なくとも１００個のヌクレオチドを含む。一実施形態では、ポリＡ配列は、配列番号２９のヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる。
一実施形態では、ＲＮＡは注射によって投与される。一実施形態では、ＲＮＡは静脈内投与によって投与される。
一実施形態では、ＲＮＡはリポプレックス粒子として製剤化される。一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、ＲＮＡをリポソームと混合することによって得られる。
一実施形態では、対象はヒトである。
一実施形態では、本明細書に記載の方法は、さらなる療法を投与することをさらに含む。一実施形態では、さらなる療法は、（ｉ）腫瘍を摘出、切除、または減量する手術、（ｉｉ）放射線療法、および（ｉｉｉ）化学療法からなる群より選択される１つ以上を含む。一実施形態では、さらなる療法は、さらなる治療薬を投与することを含む。一実施形態では、さらなる治療薬は抗癌治療薬を含む。一実施形態では、さらなる治療薬はチェックポイント調節剤である。一実施形態では、チェックポイント調節剤は、抗ＰＤ１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、または抗ＰＤ１抗体と抗ＣＴＬＡ－４抗体の組合せである。
一態様では、本明細書に記載の方法で使用するための、本明細書に記載のＲＮＡ、例えば、
（ｉ）カリクレイン２（ＫＬＫ２）、その免疫原性変異体、またはＫＬＫ２もしくはその免疫原性変異体の免疫原性断片を含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡ；
（ｉｉ）前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、その免疫原性変異体、またはＰＳＡもしくはその免疫原性変異体の免疫原性断片を含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡ；
（ｉｉｉ）前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、その免疫原性変異体、またはＰＡＰもしくはその免疫原性変異体の免疫原性断片を含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡ；
（ｉｖ）ホメオボックスＢ１３（ＨＯＸＢ１３）、その免疫原性変異体、またはＨＯＸＢ１３もしくはその免疫原性変異体の免疫原性断片を含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡ；および／または
（ｖ）ＮＫ３ホメオボックス１（ＮＫＸ３－１）、その免疫原性変異体、またはＮＫＸ３－１もしくはその免疫原性変異体の免疫原性断片を含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡ
が、本明細書で提供される。
ＲＮＡであるＲＢＬ０３８．１、ＲＢＬ０３９．１、ＲＢＬ０４０．１、ＲＢＬ０４１．１、およびＲＢＬ０４５．１の一般的な構造。 ５'キャップ、５'および３'非翻訳領域（ＵＴＲ）、Ｎ末端およびＣ末端融合タグ（それぞれｓｅｃおよびＰ２Ｐ１６／ＭＩＴＤ）を有するコード配列ならびにポリ（Ａ）尾部を含む全てのＲＮＡワクチンの一般構造の概略図。個々の要素は、それぞれの配列の長さと比較して正確に縮尺通りに描かれているわけではないことに留意されたい。 ５'キャッピング構造β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）（ｍ２ ７，２'－ＯＧｐｐＳｐＧ）。 β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）と基本的なキャップ類似体ｍ７ＧｐｐｐＧとの相違を赤色で示す：ビルディングブロックｍ７ＧのＣ２'位の－ＯＣＨ３基、およびβホスフェートの非架橋酸素の硫黄による置換。立体形成Ｐ中心（アスタリスクで表示）の存在により、ホスホロチオエートキャップ類似体β－Ｓ－ＡＲＣＡは２つのジアステレオマーとして存在する。逆相ＨＰＬＣにおける溶出順序に基づいて、これらはＤ１およびＤ２と指定されている。 ＲＢＬ０３８．１産生のためのプラスミドｐＳＴ４－ｈＡｇ－コザック－ＫＬＫ２－ＧＳ－Ｐ２Ｐ１６－ＧＳ－ＭＩＴＤ－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０のベクターマップ。 標識された配列要素を有するインサートは、異なる色で示されている。Ｅａｍ１１０４Ｉは、線状化に使用される制限エンドヌクレアーゼの認識部位を示す。カナマイシン耐性遺伝子を黒色で示す。 ＲＢＬ０３９．１産生のためのプラスミドｐＳＴ４－ｈＡｇ－コザック－ＫＬＫ３－ＧＳ－Ｐ２Ｐ１６－ＧＳ－ＭＩＴＤ－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０のベクターマップ。 標識された配列要素を有するインサートは、異なる色で示されている。Ｅａｍ１１０４Ｉは、線状化に使用される制限エンドヌクレアーゼの認識部位を示す。カナマイシン耐性遺伝子を黒色で示す。 ＲＢＬ４０．１産生のためのプラスミドｐＳＴ４－ｈＡｇ－コザック－ＡＣＰＰ－ＧＳ－Ｐ２Ｐ１６－ＧＳ－ＭＩＴＤ－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０のベクターマップ。 標識された配列要素を有するインサートは、異なる色で示されている。Ｅａｍ１１０４Ｉは、線状化に使用される制限エンドヌクレアーゼの認識部位を示す。カナマイシン耐性遺伝子を黒色で示す。 ＲＢＬ０４１．１産生のためのプラスミドｐＳＴ４－ｈＡｇ－コザック－ｓｅｃ－ＧＳ－ＨＯＸＢ１３－ＧＳ－Ｐ２Ｐ１６－ＧＳ－ＭＩＴＤ－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０のベクターマップ。 標識された配列要素を有するインサートは、異なる色で示されている。Ｅａｍ１１０４Ｉは、線状化に使用される制限エンドヌクレアーゼの認識部位を示す。カナマイシン耐性遺伝子を黒色で示す。 ＲＢＬ０４５．１産生のためのプラスミドｐＳＴ４－ｈＡｇ－コザック－ｓｅｃ－ＧＳ－ＮＫＸ３－１－ＧＳ－Ｐ２Ｐ１６－ＧＳ－ＭＩＴＤ－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０のベクターマップ。 標識された配列要素を有するインサートは、異なる色で示されている。Ｅａｍ１１０４Ｉは、線状化に使用される制限エンドヌクレアーゼの認識部位を示す。カナマイシン耐性遺伝子を黒色で示す。 製剤開発中に試験した、選択したカチオン性脂質および共脂質の化学構造。 異なる電荷比を有するＲＮＡリポプレックスの臓器選択性。 正に帯電したｌｕｃ－ＲＮＡリポプレックスは肺において高いルシフェラーゼ発現を示し、一方、負に帯電したＲＮＡリポプレックスは脾臓においてルシフェラーゼ発現の高い選択性を示す。 ＲＮＡリポプレックスの生物学的活性は、粒径および調製に使用されるリポソームのサイズに依存する。 ２０μｇのｌｕｃ－ＲＮＡを、ＲＮＡリポプレックス（ＲＮＡ（ＬＩＰ））を再構成するために小型（１９８ｎｍ）および大型（３８１ｎｍ）のリポソームと縮合し、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）に注射した。脾臓におけるルシフェラーゼ発現を、ｌｕｃ－ＲＮＡ（ＬＩＰ）投与の６時間後に分析した（平均±ＳＤ）。 臨床製剤プロトコルに従って再構成されたＲＮＡリポプレックスの粒径。 異なる実験室において、異なるＲＮＡ構築物を用いて、異なる実験者によって再構成されたＲＮＡリポプレックスの粒径をＰＣＳ測定によって分析した。実験番号３および１０については、２つの独立した調製を実施した。 異なる電荷比を有するＲＮＡリポプレックスのサイズと多分散指数。 異なる電荷比（ＤＯＴＭＡ：ＲＮＡ）を有するＲＮＡリポプレックスについて、調製の１０分後、２時間後、および２４時間後に粒径（ｚ平均）および多分散指数を測定した。 異なる電荷比を有するＲＮＡリポプレックスのサイズと生物学的活性。 （Ａ）異なる電荷比（ＤＯＴＭＡ：ＲＮＡ）を有するＲＮＡリポプレックスについて、調製の直後（１０分）に粒径（ｚ平均）および多分散指数を測定した。（Ｂ）脾臓におけるルシフェラーゼ発現を、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝４～５）へのｌｕｃ－ＲＮＡ（ＬＩＰ）（２０μｇ ＲＮＡ）投与の６時間後に分析した。 ルシフェラーゼＲＮＡ（ＬＩＰ）のＩＶ投与後の生物発光シグナルの局在。 インビボでのｌｕｃ－ＲＮＡ（ＬＩＰ）（２０μｇ ＲＮＡ）のＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝３）への静脈内注射の６時間後（Ａ）、ならびにエクスビボでの外植した脾臓、肝臓および肺（Ｂ）の生物発光イメージング。１匹の代表的なマウスを示す。 ＲＮＡ（ＬＩＰ）は脾臓ＡＰＣによって選択的に内在化される。 ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝３）に、ローダミン標識リポソームで製剤化したＣｙ５－ＲＮＡ（４０μｇ（ＨＥＤ：９．４８ｍｇ））を静脈内注射した。脾臓の細胞集団によるＣｙ５標識ＲＮＡ（下段）またはローダミン標識リポソーム（上段）の取り込みを、リポプレックス注射の１時間後にフローサイトメトリによって評価した。代表的なドットプロットを示す。 ＡＨ５－ＲＮＡ（ＬＩＰ）による免疫化後の寛容の破壊と抗原特異的なインビボ細胞傷害性。 （Ａ）ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）を、０、３、８、および１５日目（緑色）にＡＨ５－ＲＮＡ（ＬＩＰ）（４０μｇ ＲＮＡ）で静脈内免疫した。抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を、ｇｐ７０－ＭＨＣ四量体染色（灰色）によって血液中でモニターした。線は、四量体頻度の平均値を表す。（Ｂ）ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）を、０、３、８日目にＡＨ５－ＲＮＡ（ＬＩＰ）（４０μｇ ＲＮＡ）で静脈内免疫するか、または未処置のままにした。１２日目に、ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＣＦＳＥｈｉｇｈ（ＡＨ－５ペプチドを負荷）およびＣＦＳＥｌｏｗ（Ｉｎｆ－ＨＡペプチドを負荷）脾臓細胞の混合物を投与することによって、インビボ細胞傷害性アッセイを実施した。１匹の代表的なマウスについてＡＨ５特異的溶解が示された。全てのＡＨ５－ＲＮＡ（ＬＩＰ）免疫マウスは、９０％を超える抗原特異的溶解活性を示した。 ＲＮＡ（ＬＩＰ）ワクチン接種後のＩＦＮ－αの一過性の上昇。 （Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝３）に、ＨＡ－ＲＮＡ（ＬＩＰ）（４０μｇ ＲＮＡ）、リポソーム単独または対照としてＰＢＳを注射した。ＩＦＮ－αおよびＴＮＦ－αの血清濃度を、処置の６時間後および２４時間後にＥＬＩＳＡによって評価した（平均±ＳＤ）。（Ｂ）未処置または脾臓摘出したＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝２）にＨＡ－ＲＮＡ（ＬＩＰ）（４０μｇ ＲＮＡ）を静脈内注射した。ＩＦＮ－αの血清濃度を、処置の６時間後にＥＬＩＳＡによって評価した（平均±ＳＤ）。 Ｗ＿ｐｒｏ１抗原ＲＮＡのワクチン接種は抗原特異的Ｔ細胞応答をもたらす。 静脈内ワクチン接種したＡ２／ＤＲ１マウス（ｎ＝４～５／群）の脾細胞を、示されているように対応するｍＲＮＡをエレクトロポレーションしたＢＭＤＣで２０時間再刺激した。無関係なｍＲＮＡをエレクトロポレーションしたＢＭＤＣを対照として使用した（白抜きの記号、灰色のバー）。エフェクタ機能を、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して測定した。記号は、個々の動物からの三つ組のウェルの平均値を示す。バーは、群ごとの全ての動物の中央値を示す。 高用量群の動物におけるＩＦＮ－α（黒色のバー）およびＩＬ－６（灰色のバー）の平均レベル。 エラーバーは標準偏差を示す。ＩＬ－６誘導は、５回目の投与後（２２日目）よりも１回目の投与後（１日目）の方がはるかに強かった。 ＫＬＫ２、ＫＬＫ３、ＡＣＰＰ、ＮＫＸ３－１およびＨＯＸＢ１３をコードするＲＮＡによる脾臓での抗原特異的Ｔ細胞の誘導。 ＫＬＫ２（アミノ酸１～２６１）、ＫＬＫ３（アミノ酸１～２６１）、ＡＣＰＰ（アミノ酸１～４１８）、ＨＯＸＢ１３（アミノ酸１～２８４）またはＮＫＸ３－１（アミノ酸１～２３４）をコードするリポプレックスで製剤化したＲＮＡで免疫したマウスの脾臓からのＴ細胞エフェクタのＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴ分析。最終免疫の５日後に得られた脾細胞を、それぞれのヒトタンパク質、Ｐ２／Ｐ１６／Ｐ１７ペプチドにまたがるペプチドプールまたは無関係な対照ペプチドＣＭＶ ｐｐ６５（４９５～５０４）のいずれかで再刺激した。ドットは個々の動物を表す；横棒は３匹の動物の平均±ＳＤを示す。
配列表の説明
以下の表は、本明細書で参照される特定の配列のリストを提供する。
Figure 2022525103000001
Figure 2022525103000002
Figure 2022525103000003
Figure 2022525103000004
Figure 2022525103000005
Figure 2022525103000006
Figure 2022525103000007
Figure 2022525103000008
Figure 2022525103000009
Figure 2022525103000010
本開示を以下で詳細に説明するが、この開示は本明細書に記載される特定の方法論、プロトコルおよび試薬に限定されず、これらは異なり得ることが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本開示の範囲を限定することを意図するものではなく、本開示の範囲は付属の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されるべきである。特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
好ましくは、本明細書で使用される用語は、''Ａ ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）''，Ｈ．Ｇ．Ｗ．Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｂ．Ｎａｇｅｌ，ａｎｄ Ｈ．Ｋｏｌｂｌ，Ｅｄｓ．，Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，ＣＨ－４０１０ Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，（１９９５）に記載されているように定義される。
本開示の実施は、特に指示されない限り、当技術分野の文献（例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ １９８９参照）で説明されている化学、生化学、細胞生物学、免疫学、および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を用いる。
以下において、本開示の要素を説明する。これらの要素を具体的な実施形態と共に列挙するが、それらは、さらなる実施形態を創出するために任意の方法および任意の数で組み合わせてもよいことが理解されるべきである。様々に説明される例および実施形態は、本開示を明確に記述される実施形態のみに限定すると解釈されるべきではない。この説明は、明確に記述される実施形態を任意の数の開示される要素と組み合わせた実施形態を開示し、包含すると理解されるべきである。さらに、記述される全ての要素の任意の並び替えおよび組合せは、文脈上特に指示されない限り、この説明によって開示されていると見なされるべきである。
「約」という用語は、およそ、または、ほぼを意味し、本明細書に記載の数値または範囲の文脈において、一実施形態では、列挙または特許請求される数値または範囲の±２０％、±１０％、±５％、または±３％を意味する。
本開示を説明する文脈において（特に特許請求の範囲の文脈において）使用される「１つの」および「その」という用語ならびに同様の言及は、本明細書で特に指示されない限り、または文脈上明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を包含すると解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、単に、その範囲内に属する各々別々の値を個々に言及することの簡略方法として機能することが意図されている。本明細書で特に指示されない限り、個々の値は、本明細書で個別に列挙されているかのごとくに本明細書に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書で特に指示されない限り、または文脈上明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提供されるありとあらゆる例または例示的言語（例えば「など」）の使用は、単に本開示をより良く説明することを意図しており、特許請求の範囲に限定を課すものではない。本明細書中のいかなる言語も、本開示の実施に必須の特許請求されていない要素を指示すると解釈されるべきではない。
特に明記されない限り、「含む」という用語は、「含む」によって導入されたリストのメンバーに加えて、さらなるメンバーが任意に存在し得ることを示すために本文書の文脈で使用される。しかし、「含む」という用語は、さらなるメンバーが存在しない可能性を包含することが本開示の特定の実施形態として企図され、すなわちこの実施形態の目的のためには、「含む」は「からなる」の意味を有すると理解されるべきである。
本明細書の本文全体を通していくつかの資料を引用する。本明細書で引用される各資料（全ての特許、特許出願、科学出版物、製造者の仕様書、指示書等を含む）は、上記または下記のいずれでも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書のいかなる内容も、本開示がそのような開示に先行する権利を有さなかったことの承認と解釈されるべきではない。
定義
以下において、本開示の全ての態様に適用される定義を提供する。以下の用語は、特に指示されない限り、以下の意味を有する。未定義の用語は、それらの技術分野で広く認められている意味を有する。
本明細書で使用される「低減する」または「阻害する」などの用語は、例えば約５％以上、約１０％以上、約２０％以上、約５０％以上、または約７５％以上のレベルの全体的な減少を生じさせる能力を意味する。「阻害する」という用語または同様の語句には、完全なまたは本質的に完全な阻害、すなわち、ゼロまたは本質的にゼロへの低減が含まれる。
一実施形態における「増加」または「増強」などの用語は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約１００％の増加または増強に関する。
本明細書で使用される「生理学的ｐＨ」は、約７．５のｐＨを指す。
「イオン強度」という用語は、特定の溶液中の異なる種類のイオン種の数とそれらのそれぞれの電荷との間の数学的関係を指す。したがって、イオン強度Ｉは、式：
Figure 2022525103000011
 によって数学的に表され、式中、ｃは特定のイオン種のモル濃度、ｚはその電荷の絶対値である。合計Σは、溶液中の全ての異なる種類のイオン（ｉ）に適用される。
本開示によれば、一実施形態における「イオン強度」という用語は、一価イオンの存在に関する。二価イオン、特に二価カチオンの存在に関して、キレート剤の存在により、それらの濃度または有効濃度（遊離イオンの存在）は、一実施形態では、ＲＮＡの分解を防ぐのに十分に低い。一実施形態では、二価イオンの濃度または有効濃度は、ＲＮＡヌクレオチド間のホスホジエステル結合の加水分解のための触媒レベルよりも低い。一実施形態では、遊離二価イオンの濃度は２０μＭ以下である。一実施形態では、遊離二価イオンは存在しないか、または本質的に存在しない。
「凍結」という用語は、通常は熱の除去による、液体の固化に関する。
「凍結乾燥する」または「凍結乾燥」という用語は、物質を凍結し、次に周囲の圧力を下げて、物質中の凍結媒体を固相から気相に直接昇華させることによる物質の凍結乾燥を指す。
「噴霧乾燥」という用語は、容器（噴霧乾燥機）内で（加熱された）気体を霧化（噴霧）された流体と混合することによって物質を噴霧乾燥することを指し、そこで形成された液滴からの溶媒が蒸発し、乾燥粉末をもたらす。
「凍結保護剤」という用語は、凍結段階中に活性成分を保護するために製剤に添加される物質に関する。
「凍結乾燥保護剤」という用語は、乾燥段階中に活性成分を保護するために製剤に添加される物質に関する。
「再構成する」という用語は、乾燥した製品に水などの溶媒を添加して、それを元の液体状態などの液体状態に戻すことに関する。
本開示の文脈における「組換え」という用語は、「遺伝子操作を介して作製された」ことを意味する。一実施形態では、本開示の文脈における「組換え物体」は、天然には存在しない。
本明細書で使用される「天然に存在する」という用語は、物体が自然界で見出され得るという事実を指す。例えば、生物（ウイルスを含む）中に存在し、自然界の供給源から単離することができ、実験室で人間によって意図的に改変されていないペプチドまたは核酸は、天然に存在する。「自然界で見出される」という用語は、「自然界に存在する」ことを意味し、公知の物体ならびに自然からまだ発見および／または単離されていないが、天然源から将来発見および／または単離される可能性がある物体を含む。
本開示の文脈において、「粒子」という用語は、分子または分子複合体によって形成される構造化された実体に関する。一実施形態では、「粒子」という用語は、マイクロサイズまたはナノサイズのコンパクトな構造体などの、マイクロサイズまたはナノサイズの構造体に関する。
本開示の文脈において、「ＲＮＡリポプレックス粒子」という用語は、脂質、特にカチオン性脂質、およびＲＮＡを含む粒子に関する。正に帯電したリポソームと負に帯電したＲＮＡの間の静電相互作用は、ＲＮＡリポプレックス粒子の複合体化と自発的形成をもたらす。正に帯電したリポソームは、一般に、ＤＯＴＭＡなどのカチオン性脂質とＤＯＰＥなどのさらなる脂質を使用して合成し得る。一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子はナノ粒子である。
本開示で使用される場合、「ナノ粒子」は、ＲＮＡおよび少なくとも１つのカチオン性脂質を含み、静脈内投与に適した平均直径を有する粒子を指す。
「平均直径」という用語は、いわゆるキュムラントアルゴリズムを使用したデータ分析を伴う動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される粒子の平均流体力学的直径を指し、結果として、長さの次元を有するいわゆるＺ平均、および無次元である多分散指数（ＰＩ）を提供する（Ｋｏｐｐｅｌ，Ｄ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．５７，１９７２，ｐｐ ４８１４－４８２０，ＩＳＯ １３３２１）。ここで、粒子についての「平均直径」、「直径」または「サイズ」は、このＺ平均の値と同義で使用される。
「多分散指数」という用語は、本明細書では、粒子、例えばナノ粒子の集合体のサイズ分布の尺度として使用される。多分散指数は、いわゆるキュムラント解析による動的光散乱測定に基づいて計算される。
「エタノール注入技術」という用語は、脂質を含むエタノール溶液が針を通して水溶液に迅速に注入されるプロセスを指す。この作用は、溶液全体に脂質を分散させ、脂質構造形成、例えばリポソーム形成などの脂質小胞形成を促進する。一般に、本明細書に記載のＲＮＡリポプレックス粒子は、コロイド状リポソーム分散液にＲＮＡを添加することによって得ることができる。エタノール注入技術を使用して、そのようなコロイド状リポソーム分散液は、一実施形態では、以下のように形成される：ＤＯＴＭＡのようなカチオン性脂質およびさらなる脂質などの脂質を含むエタノール溶液を、撹拌しながら水溶液に注入する。一実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡリポプレックス粒子は、押出工程なしで得ることができる。
「押し出す」または「押出」という用語は、固定された断面プロフィールを有する粒子の作製を指す。特に、この用語は粒子の小型化を指し、それによって粒子は定義された細孔を有するフィルタを強制的に通過する。
前立腺は、男性の下腹部に見られる小さな腺である。これは膀胱の下に位置し、尿道を取り囲んでいる。前立腺は、ホルモンのテストステロンによって調節され、精液（ｓｅｍｅｎ）としても知られる精液（ｓｅｍｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ）を産生する。精液は、射精中に尿道から出る精子を含む物質である。
本明細書で使用される場合、「前立腺癌」は、前立腺における癌である。腫瘍と呼ばれる細胞の異常な悪性増殖が前立腺で形成される場合、それは前立腺癌と呼ばれる。ほとんどの前立腺癌は進行が遅い；しかし、一部は比較的急速に成長する。癌細胞は、前立腺から身体の他の領域、特に骨およびリンパ節に広がり得る。最初は症状を引き起こさないことがある。後の段階では、排尿困難、血尿、または骨盤、背中もしくは排尿時の痛みにつながる可能性がある。症例の約９９％は５０歳以上の男性で発生する。多くの場合、積極的監視または注意深い経過観察で管理される。他の治療は、手術、放射線療法、ホルモン療法または化学療法の組合せを含み得る。前立腺の内部でのみ発生する場合は、治癒する可能性がある。疾患が骨に広がっている人では、とりわけ、鎮痛薬、ビスホスホネートおよび標的療法が有用であり得る。転帰は、人の年齢および他の健康上の問題、ならびに癌がどの程度侵攻性で広範囲であるかに依存する。世界的には、癌は２番目に頻度の高いタイプのがんであり、男性の癌関連死の第５位の主要原因である。
本明細書で使用される「同時投与された」または「同時投与」などの用語は、単一の製剤の一部として、または同じもしくは異なる経路によって投与される複数の製剤として、２つ以上の薬剤を同時に（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｌｙ）、同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、または本質的に同時に投与することを指す。本明細書で使用される「本質的に同時に」は、互いに約１分、５分、１０分、１５分、３０分、１時間、２時間、または６時間以内を意味する。
本開示は、所与の核酸配列またはアミノ酸配列（参照配列）に対してそれぞれある程度の同一性を有する核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。
２つの核酸配列間の「配列同一性」は、これらの配列間で同一であるヌクレオチドの割合を示す。２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」は、これらの配列間で同一であるアミノ酸のパーセンテージを示す。
「％同一」、「同一性％」という用語または同様の用語は、特に、比較される配列間の最適なアラインメントにおいて同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸のパーセンテージを指すことを意図している。前記パーセンテージは純粋に統計的であり、２つの配列間の差は、比較される配列の全長にわたってランダムに分布していてもよいが、必ずしもそうではない。２つの配列の比較は、通常、対応する配列の局所領域を同定するために、最適なアラインメント後に、セグメントまたは「比較ウィンドウ」に関して配列を比較することによって実施される。比較のための最適なアラインメントは、手操作によって、またはＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｓ Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２，４８２による局所相同性アルゴリズムを用いて、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３による局所相同性アルゴリズムを用いて、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８，２４４４の類似性検索アルゴリズムを用いて、もしくは前記アルゴリズムを使用したコンピュータプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ ＮおよびＴＦＡＳＴＡ）を援用して実施し得る。いくつかの実施形態では、２つの配列の同一性パーセントは、米国国立バイオテクノロジー情報センター（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）のウェブサイト（例えば、ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ＆ＢＬＡＳＴ＿ＳＰＥＣ＝ｂｌａｓｔ２ｓｅｑ＆ＬＩＮＫ＿ＬＯＣ＝ａｌｉｇｎ２ｓｅｑ）で利用可能なＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを使用して決定される。いくつかの実施形態では、ＮＣＢＩウェブサイトのＢＬＡＳＴＮアルゴリズムに使用されるアルゴリズムパラメータは、以下を含む：（ｉ）１０に設定された期待閾値；（ｉｉ）２８に設定されたワードサイズ；（ｉｉｉ）０に設定されたクエリ範囲内の最大一致；（ｉｖ）１、－２に設定された一致／不一致スコア；（ｖ）線形に設定されたギャップコスト；および（ｖｉ）使用されている低複雑度領域のフィルタ。いくつかの実施形態では、ＮＣＢＩウェブサイトのＢＬＡＳＴＰアルゴリズムに使用されるアルゴリズムパラメータは、以下を含む：（ｉ）１０に設定された期待閾値；（ｉｉ）３に設定されたワードサイズ；（ｉｉｉ）０に設定されたクエリ範囲内の最大一致；（ｉｖ）ＢＬＯＳＵＭ６２に設定されたマトリックス；（ｖ）存在：１１、拡張：１に設定されたギャップコスト；および（ｖｉ）条件付き組成スコアマトリックス調整。
同一性パーセントは、比較する配列が一致する同一の位置の数を決定し、この数を比較する位置の数（例えば、参照配列中の位置の数）で除して、この結果に１００を乗じることによって得られる。
いくつかの実施形態では、同一性の程度は、参照配列の全長の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％である領域について与えられる。例えば、参照核酸配列が２００ヌクレオチドからなる場合、同一性の程度は、いくつかの実施形態では連続ヌクレオチド中の少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約１８０、または約２００ヌクレオチドについて与えられる。いくつかの実施形態では、同一性の程度は、参照配列の全長について与えられる。
それぞれ所与の核酸配列またはアミノ酸配列に対して特定の程度の同一性を有する核酸配列またはアミノ酸配列は、前記所与の配列の少なくとも１つの機能的特性を有し得、例えば、場合によっては、前記所与の配列と機能的に等価である。１つの重要な特性には、特に対象に投与した場合の免疫原性が含まれる。いくつかの実施形態では、所与の核酸配列またはアミノ酸配列に対して特定の程度の同一性を有する核酸配列またはアミノ酸配列は、所与の配列と機能的に等価である。
ＲＮＡ
本開示では、「ＲＮＡ」という用語は、リボヌクレオチド残基を含む核酸分子に関する。好ましい実施形態では、ＲＮＡは、リボヌクレオチド残基の全てまたは大部分を含む。本明細書で使用される場合、「リボヌクレオチド」は、β－Ｄ－リボフラノシル基の２'位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを指す。ＲＮＡは、限定されることなく、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的に精製されたＲＮＡなどの単離されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え産生されたＲＮＡ、ならびに１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または改変によって天然に存在するＲＮＡとは異なる修飾ＲＮＡを包含する。そのような改変は、内部ＲＮＡヌクレオチドまたはＲＮＡの末端（一方もしくは両方）への非ヌクレオチド物質の付加を指し得る。本明細書ではまた、ＲＮＡ中のヌクレオチドは、化学的に合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドなどの非標準ヌクレオチドであり得ることが企図される。本開示では、これらの改変されたＲＮＡは、天然に存在するＲＮＡの類似体と見なされる。
本開示の特定の実施形態では、ＲＮＡは、ペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ転写物に関連するメッセンジャＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。当技術分野で確立されているように、ｍＲＮＡは一般に、５'非翻訳領域（５'－ＵＴＲ）、ペプチドコード領域および３'非翻訳領域（３'－ＵＴＲ）を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、インビトロ転写または化学合成によって生成される。一実施形態では、ｍＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型を使用するインビトロ転写によって生成され、ここで、ＤＮＡは、デオキシリボヌクレオチドを含む核酸を指す。
一実施形態では、ＲＮＡはインビトロ転写されたＲＮＡ（ＩＶＴ－ＲＮＡ）であり、適切なＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって得られ得る。転写を制御するためのプロモータは、任意のＲＮＡポリメラーゼのための任意のプロモータであり得る。インビトロ転写のためのＤＮＡ鋳型は、核酸、特にｃＤＮＡをクローニングし、それをインビトロ転写のための適切なベクターに導入することによって得られ得る。ｃＤＮＡは、ＲＮＡの逆転写によって得られ得る。
一実施形態では、ＲＮＡは、修飾されたヌクレオシドを有し得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、少なくとも１つの（例えば全ての）ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。
本明細書で使用される「ウラシル」という用語は、ＲＮＡの核酸中に存在し得る核酸塩基の１つを表す。ウラシルの構造は：
Figure 2022525103000012
 である。
本明細書で使用される「ウリジン」という用語は、ＲＮＡ中に存在し得るヌクレオシドの１つを表す。ウリジンの構造は：
Figure 2022525103000013
 である。
ＵＴＰ（ウリジン５'－三リン酸）は、以下の構造：
Figure 2022525103000014
 を有する。
シュードＵＴＰ（シュードウリジン５'－三リン酸）は、以下の構造：
Figure 2022525103000015
 を有する。
「シュードウリジン」は、ウリジンの異性体である修飾ヌクレオシドの一例であり、ウラシルは、窒素－炭素グリコシド結合の代わりに炭素－炭素結合を介してペントース環に結合している。
別の例示的な修飾ヌクレオシドはＮ１－メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）であり、これは、構造：
Figure 2022525103000016
 を有する。
Ｎ１－メチルシュードＵＴＰは、以下の構造：
Figure 2022525103000017
 を有する。
別の例示的な修飾ヌクレオシドは５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）であり、これは、構造：
Figure 2022525103000018
 を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡ中の１つ以上のウリジンは、修飾ヌクレオシドで置き換えられる。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは修飾ウリジンである。
いくつかの実施形態では、ウリジンを置換する修飾ウリジンは、シュードウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、または５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）である。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ中の１つ以上のウリジンを置換する修飾ヌクレオシドは、３－メチルウリジン（ｍ３Ｕ）、５－メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－アザウリジン、６－アザウリジン、２－チオ－５－アザウリジン、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、４－チオウリジン（ｓ４Ｕ）、４－チオシュードウリジン、２－チオシュードウリジン、５－ヒドロキシウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５－アミノアリルウリジン、５－ハロウリジン（例えば、５－ヨードウリジンまたは５－ブロモウリジン）、ウリジン５－オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５－カルボキシメチルウリジン（ｃｍ５Ｕ）、１－カルボキシメチルシュードウリジン、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－ウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５－アミノメチル－２－チオウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－メチルアミノメチルウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、１－エチルシュードウリジン、５－メチルアミノメチル－２－チオウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－メチルアミノメチル－２－セレノウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５－カルバモイルメチル－ウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－プロピニルウリジン、１－プロピニルシュードウリジン、５－タウリノメチルウリジン（τｍ５Ｕ）、１－タウリノメチルシュードウリジン、５－タウリノメチル－２－チオウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１－タウリノメチル－４－チオシュードウリジン）、５－メチル－２－チオウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、１－メチル－４－チオシュードウリジン（ｍ１ｓ４Ψ）、４－チオ－１－メチルシュードウリジン、３－メチルシュードウリジン（ｍ３Ψ）、２－チオ－１－メチルシュードウリジン、１－メチル－１－デアザシュードウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザシュードウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロシュードウリジン、５，６－ジヒドロウリジン、５－メチルジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２－チオジヒドロウリジン、２－チオジヒドロシュードウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオウリジン、４－メトキシシュードウリジン、４－メトキシ－２－チオシュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）シュードウリジン（ａｃｐ３Ψ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２－チオウリジン（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、α－チオウリジン、２'－Ｏ－メチルウリジン（Ｕｍ）、５，２'－Ｏ－ジメチルウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２'－Ｏ－メチルシュードウリジン（Ψｍ）、２－チオ－２'－Ｏ－メチルウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５－メトキシカルボニルメチル－２'－Ｏ－メチルウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５－カルバモイルメチル－２'－Ｏ－メチルウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２'－Ｏ－メチルウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２'－Ｏ－ジメチルウリジン（ｍ３Ｕｍ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２'－Ｏ－メチルウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１－チオウリジン、デオキシチミジン、２'－Ｆ－アラウリジン、２'－Ｆ－ウリジン、２'－ＯＨ－アラウリジン、５－（２－カルボメトキシビニル）ウリジン、５－［３－（１－Ｅ－プロペニルアミノ）ウリジン、または当技術分野で公知の任意の他の修飾ウリジンのいずれか１つ以上であり得る。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡは、少なくとも１つのウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡは、各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、各ＲＮＡは、少なくとも１つのウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、各ＲＮＡは、各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、シュードウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）および５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）から独立して選択される。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、シュードウリジン（ψ）を含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、Ｎ１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）を含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡは、２種類以上の修飾ヌクレオシドを含んでいてもよく、修飾ヌクレオシドは、シュードウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、および５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）から独立して選択される。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、シュードウリジン（ψ）およびＮ１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）を含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、シュードウリジン（ψ）および５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）を含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、Ｎ１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）および５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）を含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、シュードウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）および５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）を含む。
いくつかの実施形態では、本開示によるＲＮＡは５'キャップを含む。一実施形態では、本開示のＲＮＡは、キャップされていない５'－三リン酸を有さない。一実施形態では、ＲＮＡは５'キャップ類似体によって修飾されていてもよい。「５'キャップ」という用語は、ｍＲＮＡ分子の５'末端に見出される構造を指し、一般に、５'－５'三リン酸結合によってｍＲＮＡに連結されたグアノシンヌクレオチドからなる。一実施形態では、このグアノシンは７位でメチル化されている。ＲＮＡに５'キャップまたは５'キャップ類似体を提供することは、５'キャップがＲＮＡ鎖に共転写的に発現されるインビトロ転写によって達成され得るか、またはキャッピング酵素を使用して転写後にＲＮＡに結合され得る。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡのためのビルディングブロックキャップは、ｍ２ ７，３'－ＯＧｐｐｐ（ｍ１ ２'－Ｏ）ＡｐＧ（時にｍ２ ７，３'ＯＧ（５'）ｐｐｐ（５'）ｍ２'－ＯＡｐＧとも称される）であり、これは、以下の構造：
Figure 2022525103000019
 を有する。
以下は、ＲＮＡおよびｍ２ ７，３'ＯＧ（５'）ｐｐｐ（５'）ｍ２'－ＯＡｐＧを含む例示的なキャップ１ ＲＮＡである：
Figure 2022525103000020
 。
以下は、別の例示的なキャップ１ ＲＮＡ（キャップ類似体なし）である：
Figure 2022525103000021
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、一実施形態では構造：
Figure 2022525103000022
 を有するキャップ類似体の抗逆方向キャップ（ＡＲＣＡキャップ（ｍ２ ７，３'ＯＧ（５'）ｐｐｐ（５'）Ｇ））を使用して、「キャップ０」構造で修飾される。
以下は、ＲＮＡおよびｍ２ ７，３'ＯＧ（５'）ｐｐｐ（５'）Ｇを含む例示的なキャップ０ ＲＮＡである：
Figure 2022525103000023
いくつかの実施形態では、「キャップ０」構造は、構造：
Figure 2022525103000024
 を有するキャップ類似体β－Ｓ－ＡＲＣＡ（ｍ２ ７，２'ＯＧ（５'）ｐｐＳｐ（５'）Ｇ）を使用して生成される。
以下は、β－Ｓ－ＡＲＣＡ（ｍ２ ７，２'ＯＧ（５'）ｐｐＳｐ（５'）Ｇ）およびＲＮＡを含む例示的なキャップ０ ＲＮＡである
Figure 2022525103000025
 。
特に好ましいキャップは、５'キャップｍ２ ７，２'ＯＧ（５'）ｐｐＳｐ（５'）Ｇを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される少なくとも１つのＲＮＡは、５'キャップｍ２ ７，２'ＯＧ（５'）ｐｐＳｐ（５'）Ｇを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される各ＲＮＡは、５'キャップｍ２ ７，２'ＯＧ（５'）ｐｐＳｐ（５'）Ｇを含む。
いくつかの実施形態では、本開示によるＲＮＡは、５'－ＵＴＲおよび／または３'－ＵＴＲを含む。「非翻訳領域」または「ＵＴＲ」という用語は、転写されるがアミノ酸配列に翻訳されないＤＮＡ分子内の領域、またはｍＲＮＡ分子などのＲＮＡ分子内の対応する領域に関する。非翻訳領域（ＵＴＲ）は、オープンリーディングフレームの５'側（上流）（５'－ＵＴＲ）および／またはオープンリーディングフレームの３'側（下流）（３'－ＵＴＲ）に存在し得る。５'－ＵＴＲは、存在する場合、タンパク質コード領域の開始コドンの上流の５'末端に位置する。５'－ＵＴＲは５'キャップ（存在する場合）の下流にあり、例えば、５'キャップに直接隣接している。３'－ＵＴＲは、存在する場合、タンパク質コード領域の終止コドンの下流の３'末端に位置するが、「３'－ＵＴＲ」という用語は、好ましくはポリＡ配列を含まない。したがって、３'－ＵＴＲはポリＡ配列（存在する場合）の上流にあり、例えば、ポリＡ配列に直接隣接している。
特に好ましい５'－ＵＴＲは、配列番号２１のヌクレオチド配列を含む。特に好ましい３'－ＵＴＲは、配列番号２８のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡは、配列番号２１のヌクレオチド配列、または配列番号２１のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む５'－ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、各ＲＮＡは、配列番号２１のヌクレオチド配列、または配列番号２１のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む５'－ＵＴＲを含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡは、配列番号２８のヌクレオチド配列、または配列番号２８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む３'－ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、各ＲＮＡは、配列番号２８のヌクレオチド配列、または配列番号２８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む３'－ＵＴＲを含む。
本発明で使用される場合、「ポリＡ尾部」または「ポリＡ配列」という用語は、典型的にはＲＮＡ分子の３'末端に位置するアデニル酸残基の連続的または断続的な配列を指す。ポリＡ尾部またはポリＡ配列は当業者に公知であり、本明細書に記載のＲＮＡの３'－ＵＴＲの後に続き得る。連続的なポリＡ尾部は、連続するアデニル酸残基を特徴とする。自然界では、連続的なポリＡ尾部が典型的である。本明細書に開示されるＲＮＡは、転写後に鋳型非依存性ＲＮＡポリメラーゼによってＲＮＡの遊離３'末端に結合したポリＡ尾部、またはＤＮＡによってコードされ、鋳型依存性ＲＮＡポリメラーゼによって転写されたポリＡ尾部を有し得る。
約１２０個のＡヌクレオチドの３'ポリＡ尾部は、トランスフェクトされた真核細胞中のＲＮＡのレベル、およびポリＡ尾部の上流（５'側）に存在するオープンリーディングフレームから翻訳されるタンパク質のレベルに有益な影響を及ぼすことが実証されている（Ｈｏｌｔｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．１０８，ｐｐ．４００９－４０１７）。
ポリＡ尾部は、任意の長さであってよい。いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも８０個、または少なくとも１００個、および最大５００個、最大４００個、最大３００個、最大２００個、または最大１５０個までのＡヌクレオチド、特に約１２０個のＡヌクレオチドを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。この文脈において、「本質的に～からなる」は、ポリＡ尾部のほとんどのヌクレオチド、典型的にはポリＡ尾部のヌクレオチド数の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％がＡヌクレオチドであることを意味するが、残りのヌクレオチドが、Ｕヌクレオチド（ウリジル酸）、Ｇヌクレオチド（グアニル酸）、Ｃヌクレオチド（シチジル酸）などのＡヌクレオチド以外のヌクレオチドであることを許容する。この文脈において、「からなる」は、ポリＡ尾部の全てのヌクレオチド、すなわちポリＡ尾部のヌクレオチド数の１００％がＡヌクレオチドであることを意味する。「Ａヌクレオチド」または「Ａ」という用語は、アデニル酸を指す。
いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は、コード鎖に相補的な鎖内に反復ｄＴヌクレオチド（デオキシチミジル酸）を含むＤＮＡ鋳型に基づいて、ＲＮＡ転写中、例えば、インビトロ転写ＲＮＡの調製中に結合される。ポリＡ尾部（コード鎖）をコードするＤＮＡ配列は、ポリ（Ａ）カセットと称される。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡのコード鎖に存在するポリ（Ａ）カセットは、本質的にｄＡヌクレオチドからなるが、４つのヌクレオチド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、およびｄＴ）のランダム配列によって中断されている。そのようなランダム配列は、５～５０、１０～３０、または１０～２０ヌクレオチドの長さであり得る。そのようなカセットは、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１６／００５３２４ Ａ１号に開示されている。国際公開第２０１６／００５３２４ Ａ１号に開示されている任意のポリ（Ａ）カセットを本発明で使用し得る。本質的にｄＡヌクレオチドからなるが、４つのヌクレオチド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴ）が均等に分布し、例えば５～５０ヌクレオチドの長さを有するランダム配列によって中断されているポリ（Ａ）カセットは、ＤＮＡレベルでは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてプラスミドＤＮＡの持続的な増殖を示し、ＲＮＡレベルでは、ＲＮＡの安定性と翻訳効率を支持することに関する有益な特性とまだ関連している。その結果として、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡ分子に含まれるポリＡ尾部は、本質的にＡヌクレオチドからなるが、４つのヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）のランダム配列によって中断されている。そのようなランダム配列は、５～５０、１０～３０、または１０～２０ヌクレオチドの長さであり得る。
いくつかの実施形態では、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドは、その３'末端でポリＡ尾部に隣接しておらず、すなわち、ポリＡ尾部はマスクされていないか、またはその３'末端でＡ以外のヌクレオチドが後続していない。
いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は配列番号２９の配列を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡはポリＡ尾部を含む。いくつかの実施形態では、各ＲＮＡはポリＡ尾部を含む。いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも８０個または少なくとも１００個、および最大５００個、最大４００個、最大３００個、最大２００個、または最大１５０個までのヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は、本質的に、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも８０個、または少なくとも１００個、および最大５００個、最大４００個、最大３００個、最大２００個、または最大１５０個までのヌクレオチドからなり得る。いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも８０個、または少なくとも１００個、および最大５００個、最大４００個、最大３００個、最大２００個、または最大１５０個までのヌクレオチドからなり得る。いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は、配列番号２９に示されるポリＡ尾部を含み得る。いくつかの態様では、ポリＡ尾部は少なくとも１００個のヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、ポリＡ尾部は約１５０個のヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、ポリＡ尾部は約１２０個のヌクレオチドを含む。
本開示の文脈において、「転写」という用語は、ＤＮＡ配列中の遺伝暗号がＲＮＡに転写される過程に関する。その後、ＲＮＡはペプチドまたはタンパク質に翻訳され得る。
ＲＮＡに関して、「発現」または「翻訳」という用語は、ｍＲＮＡの鎖が、ペプチドまたはタンパク質を作製するようにアミノ酸の配列の構築を指示する、細胞のリボソームにおける過程に関する。
一実施形態では、例えばＲＮＡリポプレックス粒子として製剤化された、本明細書に記載のＲＮＡの投与後、ＲＮＡの少なくとも一部が標的細胞に送達される。一実施形態では、ＲＮＡの少なくとも一部が標的細胞のサイトゾルに送達される。一実施形態では、ＲＮＡは、標的細胞によって翻訳されて、それがコードするペプチドまたはタンパク質を産生する。一実施形態では、標的細胞は脾臓細胞である。一実施形態では、標的細胞は、脾臓におけるプロフェッショナル抗原提示細胞などの抗原提示細胞である。一実施形態では、標的細胞は、樹状細胞またはマクロファージである。本明細書に記載のＲＮＡリポプレックス粒子は、そのような標的細胞にＲＮＡを送達するために使用され得る。したがって、本開示はまた、本明細書に記載のＲＮＡリポプレックス粒子を対象に投与することを含む、対象の標的細胞にＲＮＡを送達するための方法に関する。一実施形態では、ＲＮＡは、標的細胞のサイトゾルに送達される。一実施形態では、ＲＮＡは、標的細胞によって翻訳されて、ＲＮＡによってコードされるペプチドまたはタンパク質を産生する。
本開示によれば、「ＲＮＡがコードする」という用語は、ＲＮＡが、標的組織の細胞内などの適切な環境に存在する場合、翻訳過程の間にそれがコードするペプチドまたはタンパク質を産生するようにアミノ酸の構築を指示できることを意味する。一実施形態では、ＲＮＡは、ペプチドまたはタンパク質の翻訳を可能にする細胞翻訳機構と相互作用することができる。細胞は、コードされたペプチドもしくはタンパク質を細胞内で（例えば、細胞質内および／もしくは核内で）産生し得るか、コードされたペプチドもしくはタンパク質を分泌し得るか、またはそれを表面上で産生し得る。
本開示によれば、「ペプチド」という用語は、オリゴペプチドおよびポリペプチドを含み、約２個以上、約３個以上、約４個以上、約６個以上、約８個以上、約１０個以上、約１３個以上、約１６個以上、約２０個以上、および最大約５０個、約１００個または約１５０個までの、ペプチド結合によって互いに連結された連続するアミノ酸を含む物質を指す。「タンパク質」という用語は、大きなペプチド、特に少なくとも約１５１個のアミノ酸を有するペプチドを指すが、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書では通常同義語として使用される。
「抗原」という用語は、免疫応答を生じさせることができるエピトープを含む薬剤に関する。「抗原」という用語には、特にタンパク質およびペプチドが含まれる。一実施形態では、抗原は、樹状細胞またはマクロファージのような抗原提示細胞などの免疫系の細胞によって提示される。抗原またはＴ細胞エピトープなどのそのプロセシング産物は、一実施形態では、Ｔ細胞もしくはＢ細胞受容体によって、または抗体などの免疫グロブリン分子によって結合される。したがって、抗原またはそのプロセシング産物は、抗体またはＴリンパ球（Ｔ細胞）と特異的に反応し得る。一実施形態では、抗原は、腫瘍抗原などの疾患関連抗原であり、エピトープはそのような抗原に由来する。
「疾患関連抗原」という用語は、疾患に関連する任意の抗原を指すためにその最も広い意味で使用される。疾患関連抗原は、宿主の免疫系を刺激して疾患に対する細胞性抗原特異的免疫応答および／または体液性抗体応答を生じさせるエピトープを含む分子である。したがって、疾患関連抗原またはそのエピトープは、治療目的に使用され得る。疾患関連抗原は、癌、典型的には腫瘍に関連し得る。
「腫瘍抗原」という用語は、細胞質、細胞表面および細胞核に由来し得る癌細胞の構成要素を指す。特に、この用語は、細胞内でまたは腫瘍細胞上の表面抗原として産生される抗原を指す。
「エピトープ」という用語は、免疫系によって認識される抗原などの分子の一部または断片を指す。例えば、エピトープは、Ｔ細胞、Ｂ細胞または抗体によって認識され得る。抗原のエピトープは、抗原の連続部分または不連続部分を含み得、約５～約１００アミノ酸の長さであり得る。一実施形態では、エピトープは、約１０～約２５アミノ酸の長さである。「エピトープ」という用語は、Ｔ細胞エピトープを含む。
「Ｔ細胞エピトープ」という用語は、ＭＨＣ分子に関連して提示された場合にＴ細胞によって認識されるタンパク質の一部または断片を指す。「主要組織適合遺伝子複合体」という用語および「ＭＨＣ」という略語は、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ分子を含み、全ての脊椎動物に存在する遺伝子の複合体に関する。ＭＨＣタンパク質または分子は、免疫反応におけるリンパ球と抗原提示細胞または疾患細胞との間のシグナル伝達に重要であり、ＭＨＣタンパク質または分子はペプチドエピトープに結合し、Ｔ細胞上のＴ細胞受容体による認識のためにそれらを提示する。ＭＨＣによってコードされるタンパク質は、細胞の表面に発現され、自己抗原（細胞自体からのペプチド断片）および非自己抗原（例えば、侵入微生物の断片）の両方をＴ細胞に表示する。クラスＩ ＭＨＣ／ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは、典型的には約８～約１０アミノ酸長であるが、より長いまたはより短いペプチドも有効であり得る。クラスＩＩ ＭＨＣ／ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは、典型的には約１０～約２５アミノ酸長であり、特に約１３～約１８アミノ酸長であるが、より長いおよびより短いペプチドも有効であり得る。
本開示の特定の実施形態では、ＲＮＡは少なくとも１つのエピトープをコードする。特定の実施形態では、エピトープは、本明細書に記載されるような腫瘍抗原に由来する。
投与されたＲＮＡ
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、カリクレイン２（ＫＬＫ２）タンパク質をコードするＲＮＡ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）タンパク質をコードするＲＮＡ、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）タンパク質をコードするＲＮＡ、ホメオボックスＢ１３（ＨＯＸＢ１３）タンパク質をコードするＲＮＡ、およびＮＫ３ホメオボックス１（ＮＫＸ３－１）タンパク質をコードするＲＮＡを含む。同様に、本明細書に記載の方法は、カリクレイン２（ＫＬＫ２）タンパク質をコードするＲＮＡ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）タンパク質をコードするＲＮＡ、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）タンパク質をコードするＲＮＡ、ホメオボックスＢ１３（ＨＯＸＢ１３）タンパク質をコードするＲＮＡ、およびＮＫ３ホメオボックス１（ＮＫＸ３－１）タンパク質をコードするＲＮＡの投与を含む。
カリクレイン２（ＫＬＫ２）タンパク質は、ＫＬＫ２、その免疫原性変異体、またはＫＬＫ２もしくはその免疫原性変異体の免疫原性断片を含むアミノ酸配列を含み、配列番号１もしくは２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、または配列番号１もしくは２のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。ＫＬＫ２タンパク質をコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号３もしくは４のヌクレオチド配列、または配列番号３もしくは４のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る；および／または（ｉｉ）配列番号１もしくは２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、または配列番号１もしくは２のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。
前立腺特異抗原（ＰＳＡ）タンパク質は、ＰＳＡを含むアミノ酸配列、その免疫原性変異体、またはＰＳＡもしくはその免疫原性変異体の免疫原性断片を含み、配列番号５もしくは６のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、または配列番号５もしくは６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。ＰＳＡタンパク質をコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号７もしくは８のヌクレオチド配列、または配列番号７もしくは８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る；および／または（ｉｉ）配列番号５もしくは６のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、または配列番号５もしくは６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。
前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）タンパク質は、ＰＡＰ、その免疫原性変異体、またはＰＡＰもしくはその免疫原性変異体の免疫原性断片を含むアミノ酸配列を含み、配列番号９もしくは１０のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、または配列番号９もしくは１０のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。ＰＡＰタンパク質をコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号１１もしくは１２のヌクレオチド配列、または配列番号１１もしくは１２のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る；および／または（ｉｉ）配列番号９もしくは１０のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、または配列番号９もしくは１０のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。
ホメオボックスＢ１３（ＨＯＸＢ１３）タンパク質は、ＨＯＸＢ１３、その免疫原性変異体、またはＨＯＸＢ１３もしくはその免疫原性変異体の免疫原性断片を含むアミノ酸配列を含み、配列番号１３もしくは１４のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、または配列番号１３もしくは１４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。ＨＯＸＢ１３タンパク質をコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号１５もしくは１６のヌクレオチド配列、または配列番号１５もしくは１６のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る；および／または（ｉｉ）配列番号１３もしくは１４のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、または配列番号１３もしくは１４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。
ＮＫ３ホメオボックス１（ＮＫＸ３－１）タンパク質は、ＮＫＸ３－１、その免疫原性変異体、またはＮＫＸ３－１もしくはその免疫原性変異体の免疫原性断片を含むアミノ酸配列を含み、配列番号１７もしくは１８のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、または配列番号１７もしくは１８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。ＮＫＸ３－１タンパク質をコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号１９もしくは２０のヌクレオチド配列、または配列番号１９もしくは２０のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る；および／または（ｉｉ）配列番号１７もしくは１８のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、または配列番号１７もしくは１８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。
本明細書における「変異体」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾によって親アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を意味する。親アミノ酸配列は、天然もしくは野生型（ＷＴ）アミノ酸配列であり得るか、または野生型アミノ酸配列の改変バージョンであり得る。好ましくは、変異体アミノ酸配列は、親アミノ酸配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾、例えば、親と比較して１～約２０のアミノ酸修飾、好ましくは１～約１０または１～約５のアミノ酸修飾を有する。
本明細書における「野生型」または「ＷＴ」または「天然」とは、対立遺伝子変異を含む、自然界に見出されるアミノ酸配列を意味する。野生型アミノ酸配列、ペプチドまたはタンパク質は、意図的に修飾されていないアミノ酸配列を有する。
本開示の目的のために、アミノ酸配列（ペプチド、タンパク質またはポリペプチド）の「変異体」は、アミノ酸挿入変異体、アミノ酸付加変異体、アミノ酸欠失変異体および／またはアミノ酸置換変異体を含む。「変異体」という用語は、全ての突然変異体、スプライス変異体、翻訳後修飾変異体、立体配座変異体、アイソフォーム変異体、対立遺伝子変異体、種変異体、および種ホモログ、特に天然に存在するものを含む。
アミノ酸挿入変異体は、特定のアミノ酸配列中に１個または２個以上のアミノ酸の挿入を含む。挿入を有するアミノ酸配列変異体の場合、１個以上のアミノ酸残基がアミノ酸配列の特定の部位に挿入されるが、結果として生じる産物の適切なスクリーニングを伴うランダム挿入も可能である。アミノ酸付加変異体は、１個以上のアミノ酸、例えば１、２、３、５、１０、２０、３０、５０個、またはそれ以上のアミノ酸のアミノ末端および／またはカルボキシ末端融合を含む。アミノ酸欠失変異体は、配列からの１個以上のアミノ酸の除去、例えば１、２、３、５、１０、２０、３０、５０個、またはそれ以上のアミノ酸の除去を特徴とする。欠失は、タンパク質の任意の位置にあってよい。タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に欠失を含むアミノ酸欠失変異体は、Ｎ末端および／またはＣ末端切断変異体とも呼ばれる。アミノ酸置換変異体は、配列内の少なくとも１個の残基が除去され、別の残基がその位置に挿入されていることを特徴とする。相同なタンパク質もしくはペプチド間で保存されていないアミノ酸配列の位置にある修飾、および／またはアミノ酸を類似の性質を有する他のアミノ酸で置換することが好ましい。好ましくは、ペプチドおよびタンパク質変異体におけるアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち、同様に荷電したアミノ酸または非荷電アミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化には、その側鎖が関連するアミノ酸のファミリーの１つの置換が含まれる。天然に存在するアミノ酸は、一般に、酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、および非荷電極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン）アミノ酸の４つのファミリーに分けられる。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、時に芳香族アミノ酸として一緒に分類されることがある。一実施形態では、保存的アミノ酸置換には、以下の群内の置換が含まれる：
グリシン、アラニン；
バリン、イソロイシン、ロイシン；
アスパラギン酸、グルタミン酸；
アスパラギン、グルタミン；
セリン、トレオニン；
リジン、アルギニン；および
フェニルアラニン、チロシン。
好ましくは、所与のアミノ酸配列と前記所与のアミノ酸配列の変異体であるアミノ酸配列との間の類似性、好ましくは同一性の程度は、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。類似性または同一性の程度は、好ましくは、参照アミノ酸配列の全長の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％であるアミノ酸領域に対して与えられる。例えば、参照アミノ酸配列が２００個のアミノ酸からなる場合、類似性または同一性の程度は、好ましくは、少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約１８０、または約２００個のアミノ酸、好ましくは連続するアミノ酸に対して与えられる。好ましい実施形態では、類似性または同一性の程度は、参照アミノ酸配列の全長に対して与えられる。
「配列類似性」は、同一であるか、または保存的アミノ酸置換を表すアミノ酸のパーセンテージを示す。２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」は、これらの配列間で同一であるアミノ酸のパーセンテージを示す。
指定されたアミノ酸配列（ペプチド、タンパク質またはポリペプチド）に「由来する」アミノ酸配列（ペプチド、タンパク質またはポリペプチド）は、最初のアミノ酸配列の起源を指す。好ましくは、特定のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、その特定の配列またはその断片と同一、本質的に同一、または相同であるアミノ酸配列を有する。特定のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、その特定の配列の変異体またはその断片であり得る。
本明細書に記載のペプチド抗原およびタンパク質抗原（ＫＬＫ２タンパク質、ＰＳＡタンパク質、ＰＡＰタンパク質、ＨＯＸＢ１３タンパク質、およびＮＫＸ３－１タンパク質）は、抗原、すなわちワクチン抗原をコードするＲＮＡの投与によって対象に提供された場合、好ましくは対象においてＴ細胞の刺激、プライミングおよび／または拡大をもたらす。前記刺激された、プライミングされたおよび／または拡大されたＴ細胞は、好ましくは標的抗原、特に疾患細胞、組織および／または器官によって発現される標的抗原、すなわち疾患関連抗原に対して向けられる。したがって、ワクチン抗原は、疾患関連抗原、またはその断片もしくは変異体を含み得る。一実施形態では、そのような断片または変異体は、疾患関連抗原と免疫学的に等価である。本開示の文脈において、「抗原の断片」または「抗原の変異体」という用語は、Ｔ細胞の刺激、プライミングおよび／または拡大をもたらす薬剤を意味し、刺激、プライミングおよび／または拡大されたＴ細胞は、特に疾患細胞、組織および／または器官の表面に発現された場合、疾患関連抗原を標的とする。したがって、本開示に従って投与されるワクチン抗原は、疾患関連抗原に対応し得るかもしくはそれを含み得る、疾患関連抗原の断片に対応し得るかもしくはそれを含み得る、または疾患関連抗原もしくはその断片に相同である抗原に対応し得るかもしくはそれを含み得る。本開示に従って投与されるワクチン抗原が、疾患関連抗原の断片または疾患関連抗原の断片に相同であるアミノ酸配列を含む場合、前記断片またはアミノ酸配列は、疾患関連抗原のエピトープ、または疾患関連抗原のエピトープに相同である配列を含み得、ここで、Ｔ細胞は前記エピトープに結合する。したがって、本開示によれば、抗原は、疾患関連抗原の免疫原性断片、または疾患関連抗原の免疫原性断片に相同であるアミノ酸配列を含み得る。本開示による「抗原の免疫原性断片」は、好ましくは、Ｔ細胞を刺激、プライミングおよび／または拡大することができる抗原の断片に関する。ワクチン抗原は（疾患関連抗原と同様に）、Ｔ細胞による結合のための関連エピトープを提供することが好ましい。ワクチン抗原が（疾患関連抗原と同様に）、Ｔ細胞による結合のための関連エピトープを提供するために、抗原提示細胞などの細胞の表面に発現されることも好ましい。本発明によるワクチン抗原は、組換え抗原であり得る。
「免疫学的に等価」という用語は、免疫学的に等価なアミノ酸配列などの免疫学的に等価な分子が、同じもしくは本質的に同じ免疫学的特性を示し、および／または、例えば免疫学的効果の種類に関して、同じもしくは本質的に同じ免疫学的効果を発揮することを意味する。本開示の文脈において、「免疫学的に等価」という用語は、好ましくは、抗原または抗原変異体の免疫学的効果または特性に関して使用される。例えば、アミノ酸配列が、参照アミノ酸配列に結合するＴ細胞または参照アミノ酸配列を発現する細胞に曝露されたときに、参照アミノ酸配列と反応する特異性を有する免疫反応、特にＴ細胞の刺激、プライミングおよび／または拡大を誘導する場合、前記アミノ酸配列は参照アミノ酸配列と免疫学的に等価である。したがって、抗原と免疫学的に等価である分子は、Ｔ細胞の刺激、プライミングおよび／または拡大に関して、Ｔ細胞が標的とする抗原と同じもしくは本質的に同じ特性を示し、および／または同じもしくは本質的に同じ効果を発揮する。
本明細書で使用される「活性化」または「刺激」は、検出可能な細胞増殖を誘導するのに十分に刺激されたＴ細胞の状態を指す。活性化はまた、誘導されたサイトカイン産生、および検出可能なエフェクタ機能に関連し得る。「活性化Ｔ細胞」という用語は、とりわけ、細胞分裂を行っているＴ細胞を指す。
「プライミング」という用語は、Ｔ細胞がその特異的抗原と最初に接触し、エフェクタＴ細胞への分化を引き起こす過程を指す。
「クローン拡大」または「拡大」という用語は、特定の実体が増加する過程を指す。本開示の文脈において、この用語は、好ましくは、リンパ球が抗原によって刺激され、増殖し、前記抗原を認識する特定のリンパ球が増幅される免疫学的応答の文脈で使用される。好ましくは、クローン拡大はリンパ球の分化をもたらす。
リポプレックス粒子
本開示の特定の実施形態では、本明細書に記載されるＲＮＡは、ＲＮＡリポプレックス粒子中に存在し得る。本明細書に記載のＲＮＡリポプレックス粒子およびＲＮＡリポプレックス粒子を含む組成物は、非経口投与後、特に静脈内投与後の標的組織へのＲＮＡの送達に有用である。ＲＮＡリポプレックス粒子は、脂質のエタノール溶液を水または適切な水相に注入することによって得られ得るリポソームを使用して調製され得る。一実施形態では、水相は酸性ｐＨを有する。一実施形態では、水相は、例えば約５ｍＭの量の酢酸を含む。一実施形態では、リポソームおよびＲＮＡリポプレックス粒子は、少なくとも１つのカチオン性脂質および少なくとも１つのさらなる脂質を含む。一実施形態では、少なくとも１つのカチオン性脂質は、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）および／または１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）を含む。一実施形態では、少なくとも１つのさらなる脂質は、１，２－ジ－（９Ｚ－オクタデセノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）および／または１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）を含む。一実施形態では、少なくとも１つのカチオン性脂質は、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）を含み、少なくとも１つのさらなる脂質は、１，２－ジ－（９Ｚ－オクタデセノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む。一実施形態では、リポソームおよびＲＮＡリポプレックス粒子は、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）および１，２－ジ－（９Ｚ－オクタデセノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む。リポソームは、リポソームをＲＮＡと混合することによってＲＮＡリポプレックス粒子を調製するために使用され得る。
脾臓を標的とするＲＮＡリポプレックス粒子は、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１３／１４３６８３号に記載されている。正味の負電荷を有するＲＮＡリポプレックス粒子は、脾臓組織または脾臓細胞、例えば抗原提示細胞、特に樹状細胞を選択的に標的とするために使用し得ることが見出された。したがって、ＲＮＡリポプレックス粒子の投与後、脾臓におけるＲＮＡ蓄積および／またはＲＮＡ発現が起こる。したがって、本開示のＲＮＡリポプレックス粒子は、脾臓においてＲＮＡを発現させるために使用され得る。一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子の投与後、肺および／または肝臓におけるＲＮＡ蓄積および／またはＲＮＡ発現は、全く起こらないかまたは本質的に起こらない。一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子の投与後、脾臓内のプロフェッショナル抗原提示細胞などの抗原提示細胞におけるＲＮＡ蓄積および／またはＲＮＡ発現が起こる。したがって、本開示のＲＮＡリポプレックス粒子は、そのような抗原提示細胞においてＲＮＡを発現させるために使用され得る。一実施形態では、抗原提示細胞は、樹状細胞および／またはマクロファージである。
ＲＮＡリポプレックス粒径
本明細書に記載のＲＮＡリポプレックス粒子は、一実施形態では、約２００ｎｍ～約１０００ｎｍ、約２００ｎｍ～約８００ｎｍ、約２５０ｎｍ～約７００ｎｍ、約４００ｎｍ～約６００ｎｍ、約３００ｎｍ～約５００ｎｍ、または約３５０ｎｍ～約４００ｎｍの範囲の平均直径を有する。一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約２５０ｎｍ～約７００ｎｍの範囲の平均直径を有する。別の実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約３００ｎｍ～約５００ｎｍの範囲の平均直径を有する。例示的な実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約４００ｎｍの平均直径を有する。
一実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡリポプレックス粒子は、約０．５未満、約０．４未満、または約０．３未満の多分散指数を示す。例として、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約０．１～約０．３の範囲の多分散指数を示し得る。
脂質
一実施形態では、本明細書に記載の脂質溶液、リポソームおよびＲＮＡリポプレックス粒子は、カチオン性脂質を含む。本明細書で使用される場合、「カチオン性脂質」は、正味の正電荷を有する脂質を指す。カチオン性脂質は、静電相互作用によって負に帯電したＲＮＡを脂質マトリックスに結合する。一般に、カチオン性脂質は、ステロール、アシルまたはジアシル鎖などの親油性部分を有し、脂質の頭部基は、典型的には正電荷を担持する。カチオン性脂質の例には、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）；１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）；１，２－ジアシルオキシ－３－ジメチルアンモニウムプロパン；１，２－ジアルキルオキシ－３－ジメチルアンモニウムプロパン；ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、２，３－ジ（テトラデコキシ）プロピル－（２－ヒドロキシエチル）－ジメチルアザニウム（ＤＭＲＩＥ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＭＥＰＣ）、ｌ，２－ジミリストイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、１，２－ジオレイルオキシプロピル－３－ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）、および２，３－ジオレオイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－ｌ－プロパナミウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）が含まれるが、これらに限定されない。ＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＤＡＣ、およびＤＯＳＰＡが好ましい。特定の実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＯＴＭＡおよび／またはＤＯＴＡＰである。
ＲＮＡリポプレックス粒子の正電荷と負電荷の全体的な比率および物理的安定性を調整するために、さらなる脂質を組み込んでもよい。特定の実施形態では、さらなる脂質は中性脂質である。本明細書で使用される場合、「中性脂質」は、ゼロの正味電荷を有する脂質を指す。中性脂質の例には、１，２－ジ－（９Ｚ－オクタデセノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、およびセレブロシドが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、さらなる脂質は、ＤＯＰＥ、コレステロールおよび／またはＤＯＰＣである。
特定の実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、カチオン性脂質およびさらなる脂質の両方を含む。例示的な実施形態では、カチオン性脂質はＤＯＴＭＡであり、さらなる脂質はＤＯＰＥである。理論に拘束されることを望むものではないが、少なくとも１つのさらなる脂質の量と比較した少なくとも１つのカチオン性脂質の量は、電荷、粒径、安定性、組織選択性、およびＲＮＡの生物活性などの重要なＲＮＡリポプレックス粒子特性に影響を及ぼし得る。したがって、いくつかの実施形態では、少なくとも１つのカチオン性脂質と少なくとも１つのさらなる脂質とのモル比は、約１０：０～約１：９、約４：１～約１：２、または約３：１～約１：１である。特定の実施形態では、モル比は、約３：１、約２．７５：１、約２．５：１、約２．２５：１、約２：１、約１．７５：１、約１．５：１、約１．２５：１、または約１：１であり得る。例示的な実施形態では、少なくとも１つのカチオン性脂質と少なくとも１つのさらなる脂質とのモル比は、約２：１である。
電荷比
本開示のＲＮＡリポプレックス粒子の電荷は、少なくとも１つのカチオン性脂質に存在する電荷とＲＮＡに存在する電荷との合計である。電荷比は、少なくとも１つのカチオン性脂質に存在する正電荷とＲＮＡに存在する負電荷の比である。少なくとも１つのカチオン性脂質に存在する正電荷とＲＮＡに存在する負電荷の電荷比は、以下の式によって計算される：電荷比＝［（カチオン性脂質濃度（ｍｏｌ））＊（カチオン性脂質中の正電荷の総数）］／［（ＲＮＡ濃度（ｍｏｌ））＊（ＲＮＡ中の負電荷の総数）］。ＲＮＡの濃度および少なくとも１つのカチオン性脂質の量は、当業者によって日常的な方法を使用して決定され得る。
一実施形態では、生理学的ｐＨで、ＲＮＡリポプレックス粒子における正電荷と負電荷の電荷比は、約１．６：２～約１：２、または約１．６：２～約１．１：２である。特定の実施形態では、生理学的ｐＨでのＲＮＡリポプレックス粒子における正電荷と負電荷の電荷比は、約１．６：２．０、約１．５：２．０、約１．４：２．０、約１．３：２．０、約１．２：２．０、約１．１：２．０、または約１：２．０である。
そのような電荷比を有するＲＮＡリポプレックス粒子は、脾臓組織または脾臓細胞、例えば抗原提示細胞、特に樹状細胞を選択的に標的とするために使用し得ることが見出された。したがって、一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子の投与後、脾臓におけるＲＮＡ蓄積および／またはＲＮＡ発現が起こる。したがって、本開示のＲＮＡリポプレックス粒子は、脾臓においてＲＮＡを発現させるために使用され得る。一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子の投与後、肺および／または肝臓におけるＲＮＡ蓄積および／またはＲＮＡ発現は、全く起こらないかまたは本質的に起こらない。一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子の投与後、脾臓内のプロフェッショナル抗原提示細胞などの抗原提示細胞におけるＲＮＡ蓄積および／またはＲＮＡ発現が起こる。したがって、本開示のＲＮＡリポプレックス粒子は、そのような抗原提示細胞においてＲＮＡを発現させるために使用され得る。一実施形態では、抗原提示細胞は、樹状細胞および／またはマクロファージである。
Ａ．塩およびイオン強度
本開示によれば、本明細書に記載の組成物は、塩化ナトリウムなどの塩を含み得る。理論に拘束されることを望むものではないが、塩化ナトリウムは、少なくとも１つのカチオン性脂質と混合する前にＲＮＡを前処理するためのイオン性浸透圧剤として機能する。特定の実施形態は、本開示における塩化ナトリウムに代わる有機塩または無機塩を企図する。代替の塩には、限定されることなく、塩化カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一カリウム、酢酸カリウム、重炭酸カリウム、硫酸カリウム、酢酸カリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一ナトリウム、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化リチウム、塩化マグネシウム、リン酸マグネシウム、塩化カルシウム、およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のナトリウム塩が含まれる。
一般に、本明細書に記載のＲＮＡリポプレックス粒子を含む組成物は、好ましくは０ｍＭ～約５００ｍＭ、約５ｍＭ～約４００ｍＭ、または約１０ｍＭ～約３００ｍＭの範囲の濃度の塩化ナトリウムを含む。一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子を含む組成物は、そのような塩化ナトリウム濃度に対応するイオン強度を含む。
Ｂ．安定剤
本明細書に記載の組成物は、凍結、凍結乾燥、噴霧乾燥、または凍結、凍結乾燥もしくは噴霧乾燥組成物の貯蔵などの貯蔵中の製品品質の実質的な損失、特にＲＮＡ活性の実質的な損失を回避するための安定剤を含み得る。
一実施形態では、安定剤は炭水化物である。本明細書で使用される「炭水化物」という用語は、単糖、二糖、三糖、オリゴ糖、および多糖を指し、それらを包含する。
本開示の実施形態では、安定剤は、マンノース、グルコース、スクロースまたはトレハロースである。
本開示によれば、本明細書に記載のＲＮＡリポプレックス粒子組成物は、組成物の安定性、特にＲＮＡリポプレックス粒子の安定性およびＲＮＡの安定性に適した安定剤濃度を有する。
Ｃ．ｐＨおよび緩衝剤
本開示によれば、本明細書に記載のＲＮＡリポプレックス粒子組成物は、ＲＮＡリポプレックス粒子の安定性、特にＲＮＡの安定性に適したｐＨを有する。一実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡリポプレックス粒子組成物は、約５．５～約７．５のｐＨを有する。
本開示によれば、緩衝剤を含む組成物が提供される。理論に拘束されることを望むものではないが、緩衝剤の使用は、組成物の製造、貯蔵および使用の間、組成物のｐＨを維持する。本開示の特定の実施形態では、緩衝剤は、重炭酸ナトリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、２－（ビス（２－ヒドロキシエチル）アミノ）酢酸（ビシン）、２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－１，３－ジオール（トリス）、Ｎ－（２－ヒドロキシ－１，１－ビス（ヒドロキシメチル）エチル）グリシン（トリシン）、３－［［１，３－ジヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－２－イル］アミノ］－２－ヒドロキシプロパン－１－スルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２－［［１，３－ジヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－２－イル］アミノ］エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、１，４－ピペラジンジエタンスルホン酸（ＰＩＰＥＳ）、ジメチルアルシン酸、２－モルホリン－４－イルエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３－モルホリノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）であり得る。他の適切な緩衝剤は、塩中の酢酸、塩中のクエン酸、塩中のホウ酸および塩中のリン酸であり得る。
一実施形態では、緩衝剤はＨＥＰＥＳである。
一実施形態では、緩衝剤は、約２．５ｍＭ～約１５ｍＭの濃度を有する。
Ｄ．キレート剤
本開示の特定の実施形態は、キレート剤の使用を企図する。キレート剤とは、金属イオンと少なくとも２つの配位共有結合を形成し、それによって安定な水溶性の錯体を生成することができる化合物を指す。理論に拘束されることを望むものではないが、キレート剤は、さもなければ本開示において加速されたＲＮＡ分解を誘導し得る、遊離二価イオンの濃度を低下させる。適切なキレート剤の例には、限定されることなく、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ＥＤＴＡの塩、デスフェリオキサミンＢ、デフェロキサミン、ジチオカルブナトリウム、ペニシラミン、ペンテト酸カルシウム、ペンテト酸のナトリウム塩、スクシマー、トリエンチン、ニトリロ三酢酸、トランス－ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＤＣＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ビス（アミノエチル）グリコールエーテル－Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'－四酢酸、イミノ二酢酸、クエン酸、酒石酸、フマル酸、またはそれらの塩が含まれる。特定の実施形態では、キレート剤は、ＥＤＴＡまたはＥＤＴＡの塩である。例示的な実施形態では、キレート剤は、ＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物である。
いくつかの実施形態では、ＥＤＴＡは、約０．０５ｍＭ～約５ｍＭの濃度である。
Ｅ．本開示の組成物の物理的状態
実施形態では、本開示の組成物は液体または固体である。固体の非限定的な例には、凍結形態または凍結乾燥形態が含まれる。好ましい実施形態では、組成物は液体である。
本開示の医薬組成物
例えばＲＮＡリポプレックス粒子として製剤化された、本明細書に記載のＲＮＡは、治療的または予防的処置のための医薬組成物または薬剤として、またはそれらを調製するために有用である。
本開示の組成物は、任意の適切な医薬組成物の形態で投与され得る。
「医薬組成物」という用語は、好ましくは薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤と共に、治療上有効な薬剤を含む製剤に関する。前記医薬組成物は、前記医薬組成物を対象に投与することによって疾患または障害を処置する、予防する、またはその重症度を軽減するのに有用である。医薬組成物は、当技術分野では医薬製剤としても知られる。本開示の文脈において、医薬組成物は、例えばＲＮＡリポプレックス粒子として製剤化された、本明細書に記載のＲＮＡを含む。
本開示の医薬組成物は、好ましくは１つ以上のアジュバントを含むか、または１つ以上のアジュバントと共に投与され得る。「アジュバント」という用語は、免疫応答を延長、増強または加速する化合物に関する。アジュバントは、油エマルジョン（例えばフロイントアジュバント）、無機化合物（ミョウバンなど）、細菌産物（百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）毒素など）、または免疫刺激複合体などの不均一な化合物の群を含む。アジュバントの例には、限定されることなく、ＬＰＳ、ＧＰ９６、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、成長因子、およびモノカイン、リンホカイン、インターロイキン、ケモカインなどのサイトカインが含まれる。ケモカインは、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＮＦａ、ＩＮＦ－γ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＬＴ－ａであり得る。さらなる公知のアジュバントは、水酸化アルミニウム、フロイントアジュバント、またはＭｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）ＩＳＡ５１などの油である。本開示で使用するための他の適切なアジュバントには、Ｐａｍ３Ｃｙｓなどのリポペプチドが含まれる。
本開示による医薬組成物は、一般に、「薬学的に有効な量」および「薬学的に許容される製剤」で適用される。
「薬学的に許容される」という用語は、医薬組成物の活性成分の作用と相互作用しない物質の非毒性を指す。
「薬学的に有効な量」という用語は、単独でまたはさらなる用量と共に、所望の反応または所望の効果を達成する量を指す。特定の疾患の処置の場合、所望の反応は、好ましくは疾患の経過の阻害に関する。これは、疾患の進行を遅らせること、特に疾患の進行を中断または逆転させることを含む。疾患の処置における所望の反応はまた、前記疾患または前記状態の発症の遅延または発症の予防であり得る。本明細書に記載の組成物の有効量は、処置される状態、疾患の重症度、年齢、生理学的状態、サイズおよび体重を含む患者の個々のパラメータ、処置の期間、付随する治療の種類（存在する場合）、特定の投与経路ならびに同様の因子に依存する。したがって、本明細書に記載の組成物の投与量は、そのような様々なパラメータに依存し得る。患者の反応が初期用量では不十分である場合、より高い用量（または異なる、より局所的な投与経路によって達成される実質的により高い用量）を使用し得る。
いくつかの実施形態では、有効量は、腫瘍／病変を縮小させるのに十分な量を含む。いくつかの実施形態では、有効量は、腫瘍の成長速度を低下させる（例えば、腫瘍の成長を抑制する）のに十分な量である。いくつかの実施形態では、有効量は、腫瘍の発生を遅らせるのに十分な量である。いくつかの実施形態では、有効量は、腫瘍の再発を予防するまたは遅延させるのに十分な量である。いくつかの実施形態では、有効量は、腫瘍の成長および／またはサイズおよび／または転移が減少、遅延、改善および／または予防されるように、腫瘍に対する対象の免疫応答を増加させるのに十分な量である。有効量は、１回または複数回の投与で投与することができる。いくつかの実施形態では、有効量（例えば、ｍＲＮＡを含む組成物の）の投与は、（ｉ）癌細胞の数を減少させ得る；（ｉｉ）腫瘍サイズを縮小する；（ｉｉｉ）末梢器官への癌細胞浸潤を阻害し、遅延させ、ある程度減速させ、停止させ得る；（ｉｖ）転移を阻害する（例えば、ある程度減速させるおよび／またはブロックもしくは予防する）；（ｖ）腫瘍成長を阻害する；（ｖｉ）腫瘍の発生および／または再発を予防または遅延させる；ならびに／または（ｖｉｉ）癌に関連する症状の１つ以上をある程度軽減する、可能性がある。
本開示の医薬組成物は、塩、緩衝剤、防腐剤、および任意で他の治療薬を含み得る。一実施形態では、本開示の医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、および／または賦形剤を含む。
本開示の医薬組成物で使用するための適切な防腐剤には、限定されることなく、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサールが含まれる。
本明細書で使用される「賦形剤」という用語は、本開示の医薬組成物中に存在し得るが、活性成分ではない物質を指す。賦形剤の例には、限定されることなく、担体、結合剤、希釈剤、潤滑剤、増粘剤、界面活性剤、防腐剤、安定剤、乳化剤、緩衝剤、香味剤、または着色剤が含まれる。
「希釈剤」という用語は、希釈するおよび／または希薄にする薬剤に関する。さらに、「希釈剤」という用語には、流体、液体、もしくは固体の懸濁液および／または混合媒体のいずれか１つ以上が含まれる。適切な希釈剤の例には、エタノール、グリセロール、および水が含まれる。
「担体」という用語は、医薬組成物の投与を容易にする、増強するまたは可能にするために活性成分が組み合わされる、天然、合成、有機、無機であり得る成分を指す。本明細書で使用される担体は、対象への投与に適した、１つ以上の適合性の固体もしくは液体充填剤、希釈剤または封入物質であり得る。適切な担体には、限定されることなく、滅菌水、リンガー液、乳酸リンガー液、滅菌塩化ナトリウム溶液、等張食塩水、ポリアルキレングリコール、水素化ナフタレンおよび、特に生体適合性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマーまたはポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンコポリマーが含まれる。一実施形態では、本開示の医薬組成物は等張食塩水を含む。
医薬用途のための薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤は、製薬分野で周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄｉｔ．１９８５）に記載されている。
医薬担体、賦形剤または希釈剤は、意図される投与経路および標準的な製薬慣行に関して選択することができる。
本開示の医薬組成物の投与経路
一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、静脈内、動脈内、皮下、皮内、結節内または筋肉内に投与され得る。特定の実施形態では、医薬組成物は、局所投与または全身投与用に製剤化される。全身投与は、胃腸管を介した吸収を含む経腸投与、または非経口投与を含み得る。本明細書で使用される場合、「非経口投与」は、静脈内注射などによる、胃腸管を介する以外の任意の方法での投与を指す。好ましい実施形態では、医薬組成物は全身投与用に製剤化される。別の好ましい実施形態では、全身投与は静脈内投与によるものである。
本開示の医薬組成物の使用
例えばＲＮＡリポプレックス粒子として製剤化された、本明細書に記載のＲＮＡは、ＲＮＡによってコードされるアミノ酸配列を対象に提供することが治療効果または予防効果をもたらす疾患の治療的または予防的処置に使用され得る。
「疾患」という用語は、個体の身体に影響を及ぼす異常な状態を指す。疾患はしばしば、特定の症状および徴候に関連する医学的状態として解釈される。疾患は、感染症などの外部からの要因によって引き起こされ得るか、または自己免疫疾患などの内部機能障害によって引き起こされ得る。ヒトでは、「疾患」はしばしば、罹患した個体に疼痛、機能障害、苦痛、社会的な問題、もしくは死を引き起こすか、または個体と接触するものに対して同様の問題を引き起こす状態を指すためにより広く使用される。このより広い意味では、疾患は時に、損傷、無力、障害、症候群、感染、単発症状、逸脱した挙動、および構造と機能の非定型の変化を含むが、他の状況および他の目的では、これらは区別可能なカテゴリーと見なされ得る。多くの疾患を患い、それと共に生活することは、人生観および人格を変える可能性があるため、疾患は通常、身体的だけでなく感情的にも個体に影響を及ぼす。
本文脈において、「処置」、「処置する」または「治療的介入」という用語は、疾患または障害などの状態と闘うことを目的とした、対象の管理およびケアに関する。この用語は、症状もしくは合併症を緩和するため、疾患、障害もしくは状態の進行を遅らせるため、症状および合併症を緩和もしくは軽減するため、ならびに／または疾患、障害もしくは状態を治癒もしくは除去するため、ならびに状態を予防するための治療上有効な化合物の投与などの、対象が罹患している所与の状態に対するあらゆる範囲の処置を含むことを意図しており、ここで、予防は、疾患、状態または障害と闘うことを目的とした個体の管理およびケアとして理解されるべきであり、症状または合併症の発症を防止するための活性化合物の投与を含む。
「治療的処置」という用語は、個体の健康状態を改善する、および／または寿命を延長（増加）させる任意の処置に関する。前記処置は、個体における疾患を排除し、個体における疾患の発症を停止もしくは遅延させ、個体における疾患の発症を阻害もしくは遅延させ、個体における症状の頻度もしくは重症度を低下させ、および／または現在疾患を有しているかもしくは以前に有していたことがある個体における再発を減少させ得る。
「予防的処置」または「防止的処置」という用語は、個体において疾患が発生するのを防ぐことを意図した任意の処置に関する。「予防的処置」または「防止的処置」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
「個体」および「対象」という用語は、本明細書では互換的に使用される。これらは、疾患または障害（例えば癌）に罹患し得るかまたは罹患しやすいが、疾患または障害を有していても有していなくてもよいヒトまたは別の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、または霊長動物）を指す。多くの実施形態では、個体はヒトである。特に明記されない限り、「個体」および「対象」という用語は特定の年齢を示すものではなく、したがって成人、高齢者、子供、および新生児を包含する。本開示の実施形態では、「個体」または「対象」は「患者」である。
「患者」という用語は、処置のための個体または対象、特に罹患した個体または対象を意味する。
本開示の一実施形態では、目的は、１つ以上の腫瘍抗原を発現する癌細胞に対する免疫応答を提供すること、および１つ以上の腫瘍抗原を発現する細胞が関与する癌疾患を治療することである。一実施形態では、癌は前立腺癌である。一実施形態では、腫瘍抗原は、ＫＬＫ２、ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＨＯＸＢ１３、および／またはＮＫＸ３－１である。
ＲＮＡを含む医薬組成物を対象に投与して、治療的または部分的もしくは完全に保護的であり得る、対象のＲＮＡによってコードされる１つ以上の抗原または１つ以上のエピトープに対する免疫応答を誘発し得る。当業者は、免疫療法およびワクチン接種の原理の１つが、処置される疾患に関して免疫学的に関連する抗原またはエピトープで対象を免疫することによって疾患に対する免疫防御反応が生成されるという事実に基づくことを理解するであろう。したがって、本明細書に記載の医薬組成物は、免疫応答を誘導または増強するために適用可能である。したがって、本明細書に記載の医薬組成物は、抗原またはエピトープが関与する疾患、特に前立腺癌の予防的および／または治療的処置において有用である。
本明細書で使用される場合、「免疫応答」は、抗原または抗原を発現する細胞に対する統合された身体応答を指し、細胞性免疫応答および／または体液性免疫応答を指す。細胞性免疫応答には、限定されることなく、抗原を発現し、クラスＩまたはクラスＩＩ ＭＨＣ分子による抗原の提示を特徴とする細胞に向けられる細胞応答が含まれる。細胞応答はＴリンパ球に関連し、Ｔリンパ球は、免疫応答を制御することによって中心的な役割を果たすヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞とも称される）、または感染細胞もしくは癌細胞におけるアポトーシスを誘導するキラー細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、もしくはＣＴＬとも称される）として分類され得る。一実施形態では、本開示の医薬組成物を投与することは、１つ以上の腫瘍抗原を発現する癌細胞に対する抗腫瘍ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の刺激を含む。特定の実施形態では、腫瘍抗原は、クラスＩ ＭＨＣ分子と共に提示される。
本開示は、保護的、防御的、予防的、および／または治療的であり得る免疫応答を企図する。本明細書で使用される場合、「免疫応答を誘導する（または誘導すること）」は、誘導前に特定の抗原に対する免疫応答が存在しなかったことを示し得るか、または誘導前に特定の抗原に対する基礎レベルの免疫応答があり、これが誘導後に増強されたことを示し得る。したがって、「免疫応答を誘導する（または誘導すること）」には、「免疫応答を増強する（または増強すること）」が含まれる。
「免疫療法」という用語は、免疫応答を誘導または増強することによる疾患または状態の処置に関する。「免疫療法」という用語は、抗原免疫化または抗原ワクチン接種を含む。
「免疫化」または「ワクチン接種」という用語は、例えば治療的または予防的理由により、免疫応答を誘導する目的で個体に抗原を投与する工程を表す。
一実施形態では、本開示は、脾臓組織を標的とする本明細書に記載のＲＮＡリポプレックス粒子が投与される実施形態を想定する。ＲＮＡは、例えば本明細書に記載されるような抗原またはエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードする。ＲＮＡは、樹状細胞などの脾臓内の抗原提示細胞によって取り込まれて、ペプチドまたはタンパク質を発現する。抗原提示細胞による任意のプロセシングおよび提示に続いて、抗原またはエピトープに対する免疫応答が生成され得、抗原またはエピトープを含む疾患の予防的および／または治療的処置がもたらされ得る。一実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡリポプレックス粒子によって誘導される免疫応答は、樹状細胞および／またはマクロファージなどの抗原提示細胞による、抗原またはエピトープなどのその断片の提示、ならびにこの提示による細胞傷害性Ｔ細胞の活性化を含む。例えば、ＲＮＡによってコードされるペプチドもしくはタンパク質またはそのプロセシング産物は、抗原提示細胞上に発現される主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質によって提示され得る。次に、ＭＨＣペプチド複合体はＴ細胞またはＢ細胞などの免疫細胞によって認識され、それらの活性化をもたらすことができる。
したがって、一実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡリポプレックス粒子中のＲＮＡは、投与後、脾臓に送達され、および／または脾臓で発現される。一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、脾臓の抗原提示細胞を活性化するために脾臓に送達される。したがって、一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子の投与後、抗原提示細胞へのＲＮＡの送達および／または抗原提示細胞におけるＲＮＡの発現が起こる。抗原提示細胞は、プロフェッショナル抗原提示細胞または非プロフェッショナル抗原提示細胞であり得る。プロフェッショナル抗原提示細胞は、樹状細胞および／またはマクロファージ、さらにより好ましくは脾臓樹状細胞および／または脾臓マクロファージであり得る。
したがって、本開示は、免疫応答、好ましくは前立腺癌に対する免疫応答を誘導または増強するための、本明細書に記載のＲＮＡリポプレックス粒子またはＲＮＡリポプレックス粒子を含む医薬組成物に関する。
一実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡリポプレックス粒子またはＲＮＡリポプレックス粒子を含む医薬組成物を全身投与すると、脾臓におけるＲＮＡリポプレックス粒子またはＲＮＡの標的化および／または蓄積がもたらされ、肺および／または肝臓での標的化および／または蓄積は起こらない。一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、脾臓でＲＮＡを放出し、および／または脾臓の細胞に入る。一実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡリポプレックス粒子またはＲＮＡリポプレックス粒子を含む医薬組成物を全身投与すると、脾臓の抗原提示細胞にＲＮＡが送達される。特定の実施形態では、脾臓における抗原提示細胞は、樹状細胞またはマクロファージである。
「マクロファージ」という用語は、単球の分化によって産生される食細胞のサブグループを指す。炎症、免疫サイトカインまたは微生物産物によって活性化されるマクロファージは、マクロファージ内に外来病原体を非特異的に飲み込み、病原体の分解をもたらす加水分解および酸化攻撃によって死滅させる。分解されたタンパク質からのペプチドは、それらがＴ細胞によって認識され得るマクロファージ細胞表面に表示され、Ｂ細胞表面の抗体と直接相互作用して、Ｔ細胞およびＢ細胞の活性化と免疫応答のさらなる刺激をもたらすことができる。マクロファージは抗原提示細胞のクラスに属する。一実施形態では、マクロファージは脾臓マクロファージである。
「樹状細胞」（ＤＣ）という用語は、抗原提示細胞のクラスに属する食細胞の別のサブタイプを指す。一実施形態では、樹状細胞は造血骨髄前駆細胞に由来する。これらの前駆細胞は、最初は未成熟な樹状細胞に変化する。これらの未成熟細胞は、高い食作用活性と低いＴ細胞活性化能を特徴とする。未成熟な樹状細胞は、ウイルスおよび細菌などの病原体の周囲環境を絶えずサンプリングしている。それらは、提示可能な抗原と接触すると、活性化されて成熟樹状細胞となり、脾臓またはリンパ節に移動し始める。未成熟樹状細胞は病原体を貪食し、それらのタンパク質を小さな断片に分解し、成熟すると、ＭＨＣ分子を使用してそれらの断片を細胞表面に提示する。同時に、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＣＤ４０などのＴ細胞活性化の共受容体として機能する細胞表面受容体を上方制御し、Ｔ細胞を活性化するそれらの能力を大幅に増強する。それらはまた、樹状細胞が血流を通って脾臓に、またはリンパ系を通ってリンパ節に移動するように誘導する走化性受容体であるＣＣＲ７を上方制御する。ここで、それらは抗原提示細胞として機能し、非抗原特異的共刺激シグナルと共に、抗原を提示することによってヘルパーＴ細胞およびキラーＴ細胞ならびにＢ細胞を活性化する。したがって、樹状細胞は、Ｔ細胞またはＢ細胞関連の免疫応答を積極的に誘導することができる。一実施形態では、樹状細胞は脾臓樹状細胞である。
「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）という用語は、その細胞表面上に（またはその細胞表面で）少なくとも１つの抗原または抗原性断片を表示、獲得、および／または提示することができる様々な細胞の１つである。抗原提示細胞は、プロフェッショナル抗原提示細胞と非プロフェッショナル抗原提示細胞とに区別することができる。
「プロフェッショナル抗原提示細胞」という用語は、ナイーブＴ細胞との相互作用に必要な主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ（ＭＨＣクラスＩＩ）分子を構成的に発現する抗原提示細胞に関する。Ｔ細胞が抗原提示細胞の膜上のＭＨＣクラスＩＩ分子複合体と相互作用する場合、抗原提示細胞は、Ｔ細胞の活性化を誘導する共刺激分子を産生する。プロフェッショナル抗原提示細胞は、樹状細胞およびマクロファージを含む。
「非プロフェッショナル抗原提示細胞」という用語は、ＭＨＣクラスＩＩ分子を構成的に発現しないが、インターフェロンγなどの特定のサイトカインによる刺激時に発現する抗原提示細胞に関する。例示的な非プロフェッショナル抗原提示細胞には、線維芽細胞、胸腺上皮細胞、甲状腺上皮細胞、グリア細胞、膵臓β細胞または血管内皮細胞が含まれる。
「抗原プロセシング」とは、抗原の断片であるプロセシング産物への前記抗原の分解（例えば、タンパク質のペプチドへの分解）、および抗原提示細胞などの細胞による特定のＴ細胞への提示のためのＭＨＣ分子とこれらの断片の１つ以上との会合（例えば結合による）を指す。
「抗原が関与する疾患」または「エピトープが関与する疾患」という用語は、抗原またはエピトープが関係する任意の疾患、例えば、抗原またはエピトープの存在を特徴とする疾患を指す。抗原またはエピトープが関与する疾患は、癌疾患または単に癌であり得る。上記のように、抗原は、腫瘍関連抗原などの疾患関連抗原であり得、エピトープはそのような抗原に由来し得る。
「癌疾患」または「癌」という用語は、典型的には無秩序な細胞増殖を特徴とする個体の生理学的状態を指すかまたは表す。癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が含まれるが、これらに限定されない。より具体的には、そのような癌の例には、骨癌、血液癌、肺癌、肝臓癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚または眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌、子宮癌、性器および生殖器の癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、膀胱癌、腎臓癌、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、神経外胚葉癌、脊髄軸腫瘍、神経膠腫、髄膜腫、および下垂体腺腫が含まれる。本明細書に記載の組成物および方法によって処置することができる癌の１つの特定の形態は、前立腺癌である。本開示による「癌」という用語は、癌転移も含む。
癌処置における併用戦略は、結果として生じる相乗効果のために望ましい場合があり、これは単剤療法アプローチの影響よりもかなり強力であり得る。一実施形態では、医薬組成物は免疫療法剤と共に投与される。本明細書で使用される場合、「免疫療法剤」は、特定の免疫応答および／または免疫エフェクタ機能（１つまたは複数）の活性化に関与し得る任意の薬剤に関する。本開示は、免疫療法剤としての抗体の使用を企図する。理論に拘束されることを望むものではないが、抗体は、アポトーシスを誘導する、シグナル伝達経路の成分をブロックする、または腫瘍細胞の増殖を阻害することを含む、様々な機構を通して癌細胞に対する治療効果を達成することができる。特定の実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介して細胞死を誘導し得るか、または補体タンパク質に結合して、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）として知られる直接的な細胞毒性をもたらし得る。本開示と組み合わせて使用し得る抗癌抗体および潜在的な抗体標的（括弧内）の非限定的な例には、アバゴボマブ（ＣＡ－１２５）、アブシキシマブ（ＣＤ４１）、アデカツムマブ（ＥｐＣＡＭ）、アフツズマブ（ＣＤ２０）、アラシズマブペゴル（ＶＥＧＦＲ２）、アルツモマブペンテテート（ＣＥＡ）、アマツキシマブ（ＭＯＲＡｂ－００９）、アナツモマブマフェナトクス（ＴＡＧ－７２）、アポリズマブ（ＨＬＡ－ＤＲ）、アルシツモマブ（ＣＥＡ）、アテゾリズマブ（ＰＤ－Ｌ１）、バビツキシマブ（ホスファチジルセリン）、ベクツモマブ（ＣＤ２２）、ベリムマブ（ＢＡＦＦ）、ベバシズマブ（ＶＥＧＦ－Ａ）、ビバツズマブメルタンシン（ＣＤ４４ ｖ６）、ブリナツモマブ（ＣＤ１９）、ブレンツキシマブベドチン（ＣＤ３０ ＴＮＦＲＳＦ８）、カンツズマブメルタンシン（ムチンＣａｎＡｇ）、カンツズマブラブタンシン（ＭＵＣ１）、カプロマブペンデチド（前立腺癌細胞）、カルルマブ（ＣＮＴ０８８８）、カツマキソマブ（ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３）、セツキシマブ（ＥＧＦＲ）、シタツズマブボガトクス（ＥｐＣＡＭ）、シクスツムマブ（ＩＧＦ－１受容体）、クローディキシマブ（クローディン）、クリバツズマブテトラキセタン（ＭＵＣ１）、コナツムマブ（ＴＲＡＩＬ－Ｒ２）、ダセツズマブ（ＣＤ４０）、ダロツズマブ（インスリン様増殖因子Ｉ受容体）、デノスマブ（ＲＡＮＫＬ）、デツモマブ（Ｂリンパ腫細胞）、ドロジツマブ（ＤＲ５）、エクロメキシマブ（ＧＤ３ガングリオシド）、エドレコロマブ（ＥｐＣＡＭ）、エロツズマブ（ＳＬＡＭＦ７）、エナバツズマブ（ＰＤＬ１９２）、エンシツキシマブ（ＮＰＣ－１Ｃ）、エプラツズマブ（ＣＤ２２）、エルツマキソマブ（ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＣＤ３）、エタラシズマブ（インテグリンανβ３）、ファルレツズマブ（葉酸受容体１）、ＦＢＴＡ０５（ＣＤ２０）、フィクラツズマブ（ＳＣＨ ９００１０５）、フィギツムマブ（ＩＧＦ－１受容体）、フランボツマブ（糖タンパク質７５）、フレソリムマブ（ＴＧＦ－β）、ガリキシマブ（ＣＤ８０）、ガニツマブ（ＩＧＦ－Ｉ）、ゲムツズマブオゾガマイシン（ＣＤ３３）、ゲボキズマブ（ＩＬ－Ιβ）、ギレンツキシマブ（炭酸脱水酵素９（ＣＡ－ＩＸ））、グレムバツムマブベドチン（ＧＰＮＭＢ）、イブリツモマブチウキセタン（ＣＤ２０）、イクルクマブ（ＶＥＧＦＲ－１）、イゴボマ（ＣＡ－１２５）、インダツキシマブラブタンシン（ＳＤＣ１）、インテツムマブ（ＣＤ５１）、イノツズマブオゾガマイシン（ＣＤ２２）、イピリムマブ（ＣＤ１５２）、イラツムマブ（ＣＤ３０）、ラベツズマブ（ＣＥＡ）、レクサツムマブ（ＴＲＡＩＬ－Ｒ２）、リビビルマブ（Ｂ型肝炎表面抗原）、リンツズマブ（ＣＤ３３）、ロルボツズマブメルタンシン（ＣＤ５６）、ルカツムマブ（ＣＤ４０）、ルミリキシマブ（ＣＤ２３）、マパツムマブ（ＴＲＡＩＬ－Ｒ１）、マツズマブ（ＥＧＦＲ）、メポリズマブ（ＩＬ－５）、ミラツズマブ（ＣＤ７４）、ミツモマブ（ＧＤ３ガングリオシド）、モガムリズマブ（ＣＣＲ４）、モキセツモマブパスドトクス（ＣＤ２２）、ナコロマブタフェナトクス（Ｃ２４２抗原）、ナプツモマブエスタフェナトクス（５Ｔ４）、ナマツマブ（ＲＯＮ）、ネシツムマブ（ＥＧＦＲ）、ニモツズマブ（ＥＧＦＲ）、ニボルマブ（ＩｇＧ４）、オファツムマブ（ＣＤ２０）、オララツマブ（ＰＤＧＦ－Ｒ ａ）、オナルツズマブ（ヒト散乱因子受容体キナーゼ）、オポルツズマブモナトクス（ＥｐＣＡＭ）、オレゴボマブ（ＣＡ－１２５）、オキセルマブ（ＯＸ－４０）、パニツムマブ（ＥＧＦＲ）、パトリツマブ（ＨＥＲ３）、ペムツモマ（ＭＵＣ１）、ペルツズマ（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ピンツモマブ（腺癌抗原）、プリツムマブ（ビメンチン）、ラコツモマブ（Ｎ－グリコリルノイラミン酸）、ラドレツマブ（フィブロネクチンエクストラドメインＢ）、ラフィビルマブ（狂犬病ウイルス糖タンパク質）、ラムシルマブ（ＶＥＧＦＲ２）、リロツムマブ（ＨＧＦ）、リツキシマブ（ＣＤ２０）、ロバツムマブ（ＩＧＦ－１受容体）、サマリズマブ（ＣＤ２００）、シブロツズマブ（ＦＡＰ）、シルツキシマブ（ＩＬ－６）、タバルマブ（ＢＡＦＦ）、タカツズマブテトラキセタン（α－フェトプロテイン）、タプリツモマブパプトクス（ＣＤ１９）、テナツモマブ（テネイシンＣ）、テプロツムマブ（ＣＤ２２１）、チシリムマブ（ＣＴＬＡ－４）、ティガツズマブ（ＴＲＡＩＬ－Ｒ２）、ＴＮＸ－６５０（ＩＬ－１３）、トシツモマブ（ＣＤ２０）、トラスツズマブ（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ＴＲＢＳ０７（ＧＤ２）、トレメリムマブ（ＣＴＬＡ－４）、ツコツズマブセルモロイキン（ＥｐＣＡＭ）、ウブリツキシマブ（ＭＳ４Ａ１）、ウレルマブ（４－１ＢＢ）、ボロキシマブ（インテグリンα５β１）、ボツムマブ（腫瘍抗原ＣＴＡＡ １６．８８）、ザルツムマブ（ＥＧＦＲ）、およびザノリムマブ（ＣＤ４）が含まれる。
一実施形態では、免疫療法剤は、ＰＤ－１軸結合アンタゴニストである。ＰＤ－１軸結合アンタゴニストには、ＰＤ－１結合アンタゴニスト、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストおよびＰＤ－Ｌ２結合アンタゴニストが含まれるが、これらに限定されない。「ＰＤ－１」の別名には、ＣＤ２７９およびＳＬＥＢ２が含まれる。「ＰＤ－Ｌ１」の別名には、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－４、ＣＤ２７４、およびＢ７－Ｈが含まれる。「ＰＤ－Ｌ２」の別名には、Ｂ７－ＤＣ、Ｂｔｄｃ、およびＣＤ２７３が含まれる。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＰＤ－１がそのリガンド結合パートナーに結合するのを阻害する分子である。特定の態様では、ＰＤ－１リガンド結合パートナーは、ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２である。別の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストは、ＰＤ－Ｌ１がその結合パートナーに結合するのを阻害する分子である。特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合パートナーは、ＰＤ－１および／またはＢ７－１である。別の実施形態では、ＰＤ－Ｌ２結合アンタゴニストは、ＰＤ－Ｌ２がその結合パートナーに結合するのを阻害する分子である。特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ２結合パートナーはＰＤ－１である。ＰＤ－１結合アンタゴニストは、抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、またはオリゴペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ－１抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体）である。抗ＰＤ－１抗体の例には、限定されることなく、ＭＤＸ－１１０６（ニボルマブ、ＯＰＤＩＶＯ）、Ｍｅｒｃｋ ３４７５（ＭＫ－３４７５、ペムブロリズマブ、ＫＥＹＴＲＵＤＡ）、ＭＥＤＩ－０６８０（ＡＭＰ－５１４）、ＰＤＲ００１、ＲＥＧＮ２８１０、ＢＧＢ－１０８、およびＢＧＢ－Ａ３１７が含まれる。
一実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、定常領域に融合したＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２の細胞外部分またはＰＤ－１結合部分を含むイムノアドヘシンである。一実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、国際公開第２０１０／０２７８２７号および国際公開第２０１１／０６６３４２号に記載されている融合可溶性受容体である、ＡＭＰ－２２４（Ｂ７－ＤＣＩｇとしても知られ、ＰＤ－Ｌ２－Ｆｃである）である。
一実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、限定されることなく、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（アテゾリズマブ）、ＭＥＤＩ４７３６（デュルバルマブ）、ＭＤＸ－１１０５、およびＭＳＢ００１０７１８Ｃ（アベルマブ）を含む、抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。
一実施形態では、免疫療法剤は、ＰＤ－１結合アンタゴニストである。別の実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。例示的な実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はアテゾリズマブである。
本明細書で参照される文書および試験の引用は、前述のいずれかが関連する先行技術であることの承認を意図するものではない。これらの文書の内容に関する全ての記述は、出願人が入手できる情報に基づいており、これらの文書の内容の正確さについての承認を構成するものではない。
以下の説明は、当業者が様々な実施形態を作成および使用することを可能にするために提示される。特定の装置、技術、および用途の説明は、例としてのみ提供される。本明細書に記載される例に対する様々な修正は、当業者には容易に明らかであり、本明細書で定義される一般原理は、様々な実施形態の精神および範囲から逸脱することなく他の例および用途に適用され得る。したがって、様々な実施形態は、本明細書で説明され、示される例に限定されることを意図するものではなく、特許請求の範囲と一致する範囲を与えられるべきである。
（実施例１）
前立腺癌を処置するための静脈内ワクチン
静脈内（ＩＶ）適用のための第２世代ワクチンを本明細書で説明する。これは、前立腺癌で発現される５つの抗原を標的とするＲＮＡからなり、それらがリポソームと別々に複合体化されて血清安定性ＲＮＡリポプレックス（ＲＮＡ（ＬＩＰ））を形成する。ＲＮＡ（ＬＩＰ）は、コードされたワクチン抗原をリンパ器官の抗原提示細胞（ＡＰＣ）に送達し、抗原特異的免疫応答の効率的な誘導をもたらす。
ＩＶ注射用ワクチンは、５つの前立腺癌関連抗原を標的とする５つの異なるＲＮＡ医薬品からなる。この前立腺癌用ＲＮＡ癌ワクチンは、ＲＢＬ０３８．１、ＲＢＬ０３９．１、ＲＢＬ０４０．１、ＲＢＬ０４１．１、およびＲＢＬ０４５．１からなる。各ＲＮＡ癌ワクチンは、それぞれ、抗原カリクレイン２（ＫＬＫ２）、カリクレイン３（ＫＬＫ３、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）としても知られる）、酸性ホスファターゼ、前立腺（ＡＣＰＰ、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）としても知られる）、ホメオボックスＢ１３（ＨＯＸＢ１３）、およびＮＫ３ホメオボックス１（ＮＫＸ３－１）をコードする１つのＲＮＡ原薬で構成されており、前立腺癌におけるそれらの選択的発現に基づいて選択した。
ＲＮＡは、投与前にＲＮＡリポプレックス（ＲＮＡ（ＬＩＰ））として再構成される。
再構成用のＲＮＡ医薬品は、０．２５ｍｇ／ｍＬの濃度で１．１ｍＬのそれぞれのＲＮＡ医薬品を含有するバイアルで提供され得る。一次希釈剤としての滅菌等張ＮａＣｌ溶液（４０ｍＬ、０．９％）および再構成用の賦形剤としてのリポソーム（１．４ｍｇ／ｍＬの濃度で４．０ｍＬ）が送達され得る。
再構成用のシリンジおよびカニューレなどの専用材料、ならびにＲＮＡ（ＬＩＰ）のさらなる希釈を可能にする追加の等張食塩水が、臨床標準品として供給され得る。
原薬：
ＲＢＬ０３８．１、β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）－ｈＡｇ－コザック－ＫＬＫ２－ＧＳ－Ｐ２Ｐ１６－ＧＳ－ＭＩＴＤ－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０
コードされた抗原 ヒトカリクレイン２（対応する遺伝子ＩＤ（ＨＧ１９）：ｕｃ００２ｐｔｕ．３、ｕｃ００２ｐｔｖ．３、ｕｃ００２ｐｔｔ．３、ｕｃ０１０ｙｃｌ．２、ｕｃ０１０ｙｃｍ．２、ｕｃ０１０ｙｃｋ．２、ｕｃ０１０ｅｏｇ．３）
ＲＢＬ０３９．１、β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）－ｈＡｇ－コザック－ＫＬＫ３－ＧＳ－Ｐ２Ｐ１６－ＧＳ－ＭＩＴＤ－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０
コードされた抗原 ヒトカリクレイン３としても知られるヒト前立腺特異抗原（対応する遺伝子ＩＤ（ＨＧ１９：ｕｃ００２ｐｔｓ．１、ｕｃ００２ｐｔｒ．１、ｕｃ０２１ｕｙｉ．１、ｕｃ０１０ｅｏｆ．１）
ＲＢＬ０４０．１、β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）－ｈＡｇ－コザック－ＡＣＰＰ－ＧＳ－Ｐ２Ｐ１６－ＧＳ－ＭＩＴＤ－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０
コードされた抗原 ヒト酸性ホスファターゼ前立腺としても知られるヒト前立腺酸性ホスファターゼ（対応する遺伝子ＩＤ（ＨＧ１９）：ｕｃ００３ｅｏｐ．４）
ＲＢＬ０４１．１、β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）－ｈＡｇ－コザック－ｓｅｃ－ＧＳ－ＨＯＸＢ１３－ＧＳ－Ｐ２Ｐ１６－ＧＳ－ＭＩＴＤ－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０
コードされた抗原 ヒトホメオボックスＢ１３（対応する遺伝子ＩＤ（ＨＧ１９）：ｕｃ００２ｉｏａ．３ｒ）
ＲＢＬ０４５．１、β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）－ｈＡｇ－コザック－ｓｅｃ－ＧＳ－ＮＫＸ３１－ＧＳ－Ｐ２Ｐ１６－ＧＳ－ＭＩＴＤ－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０
コードされた抗原 ＮＫ３ホメオボックス１（対応する遺伝子ＩＤ（ＨＧ１９）：ｕｃ０１１ｋｚｘ．２）
各原薬の有効成分は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に入るとそれぞれのタンパク質に翻訳される一本鎖５'キャップｍＲＮＡである。
図１は、インビトロＲＮＡ転写の鋳型として使用される線状化プラスミドＤＮＡのそれぞれのヌクレオチド配列によって決定される、抗原をコードするＲＮＡの一般構造を図式化している。標的タンパク質をコードする野生型またはコドン最適化配列に加えて、各ＲＮＡは、最大のＲＮＡ安定性と翻訳効率を媒介するために最適化された共通の構造要素を含む（５'キャップ、５'－ＵＴＲ、３'－ＵＴＲ、ポリ（Ａ）尾部；以下参照）。さらに、ｓｅｃ（分泌シグナルペプチド）およびＭＩＴＤ（ＭＨＣクラスＩ輸送ドメイン）は、抗原コード領域に融合され、それぞれＮ末端またはＣ末端タグとして翻訳される。両方の融合タグは、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ複合体の両方で抗原プロセシングおよび提示を改善することが示された。以下に示すいくつかの抗原については、ｓｅｃ融合タグは必要とされず、したがって省略される。β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）（図２）を、ＲＮＡ原薬の５'末端における特異的キャッピング構造として利用する。
図１に表示されるようなｍＲＮＡの一般的な配列要素を以下に示す。
ＫＬＫ２、ＰＳＡ（ＫＬＫ３）、ＰＡＰ（ＡＣＰＰ）、ＨＯＸＢ１３およびＮＫＸ３－１：それぞれの標的タンパク質をコードするコドン最適化配列。
ｈＡｇ－コザック：翻訳効率を高めるための最適化された「コザック配列」を有するヒトαグロビンｍＲＮＡの５'－ＵＴＲ配列。
ｓｅｃ／ＭＩＴＤ：抗原プロセシングおよび提示を改善することが示されている、ヒトＭＨＣクラスＩ複合体（ＨＬＡ－Ｂ５１、ハプロタイプＡ２、Ｂ２７／Ｂ５１、Ｃｗ２／Ｃｗ３）をコードする配列に由来する融合タンパク質タグ。ｓｅｃは、分泌シグナルペプチドをコードする７８ｂｐ断片に対応し、これは新生ポリペプチド鎖の小胞体への移行を誘導する。ＭＩＴＤは、ＭＨＣクラスＩ輸送ドメインとも呼ばれる、ＭＨＣクラスＩ分子の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに対応する。ＫＬＫ２、ＰＳＡ（ＫＬＫ３）およびＰＡＰ（ＡＣＰＰ）は、それぞれ独自の分泌シグナルペプチドを有することに留意されたい。したがって、ｓｅｃ融合タグはこれらの抗原には付加されていない。
ＧＳ／リンカー：融合タンパク質に一般的に使用される、主にアミノ酸グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）からなる短いリンカーペプチドをコードする配列。
Ｐ２Ｐ１６：免疫寛容を破壊するための破傷風トキソイド由来ヘルパーエピトープをコードする配列。
ＦＩ要素：３'－ＵＴＲは、「スプリットのアミノ末端エンハンサ」（ＡＥＳ）ｍＲＮＡ（Ｆと呼ばれる）およびミトコンドリアにコードされた１２ＳリボソームＲＮＡ（Ｉと呼ばれる）に由来する２つの配列要素の組合せである。これらは、ＲＮＡの安定性を付与し、総タンパク質発現を増強する配列のエクスビボ選択過程によって同定された。
Ａ３０Ｌ７０：３０個のアデノシン残基のストレッチ、それに続く１０個のヌクレオチドのリンカー配列、および樹状細胞におけるＲＮＡの安定性と翻訳効率を高めるように設計された別の７０個のアデノシン残基からなる、１１０ヌクレオチド長と測定されるポリ（Ａ）尾部。
５つのＲＮＡ原薬ＲＢＬ０３８．１、ＲＢＬ０３９．１、ＲＢＬ０４０．１、ＲＢＬ０４１．１、およびＲＢＬ０４５．１の完全なヌクレオチド配列を以下に示す：
ＲＢＬ０３８．１のヌクレオチド配列。
ヌクレオチド配列は、太字で指示されているように個々の配列要素で示されている。さらに、翻訳されたタンパク質の配列は、コードヌクレオチド配列の下にイタリック体で示されている（＊＝終止コドン）。
Figure 2022525103000026
Figure 2022525103000027
Figure 2022525103000028
ＲＢＬ０３９．１のヌクレオチド配列。
ヌクレオチド配列は、太字で指示されているように個々の配列要素で示されている。さらに、翻訳されたタンパク質の配列は、コードヌクレオチド配列の下にイタリック体で示されている（＊＝終止コドン）。
Figure 2022525103000029
Figure 2022525103000030
Figure 2022525103000031
ＲＢＬ０４０．１のヌクレオチド配列。
ヌクレオチド配列は、太字で指示されているように個々の配列要素で示されている。さらに、翻訳されたタンパク質の配列は、コードヌクレオチド配列の下にイタリック体で示されている（＊＝終止コドン）。
Figure 2022525103000032
Figure 2022525103000033
Figure 2022525103000034
Figure 2022525103000035
ＲＢＬ０４１．１のヌクレオチド配列。
ヌクレオチド配列は、太字で指示されているように個々の配列要素で示されている。さらに、翻訳されたタンパク質の配列は、コードヌクレオチド配列の下にイタリック体で示されている（＊＝終止コドン）。
Figure 2022525103000036
Figure 2022525103000037
Figure 2022525103000038
ＲＢＬ０４５．１のヌクレオチド配列。
ヌクレオチド配列は、太字で指示されているように個々の配列要素で示されている。さらに、翻訳されたタンパク質の配列は、コードヌクレオチド配列の下にイタリック体で示されている（＊＝終止コドン）。
Figure 2022525103000039
Figure 2022525103000040
Figure 2022525103000041
ＲＢＬ０３８．１（ｐＳＴ４－ｈＡｇ－コザック－ＫＬＫ２－ＧＳ－Ｐ２Ｐ１６－ＧＳ－ＭＩＴＤ－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０）、ＲＢＬ０３９．１（ｐＳＴ４－ｈＡｇ－コザック－ＫＬＫ３－ＧＳ－Ｐ２Ｐ１６－ＧＳ－ＭＩＴＤ－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０）、ＲＢＬ０４０．１（ｐＳＴ４－ｈＡｇ－コザック－ＡＣＰＰ－ＧＳ－Ｐ２Ｐ１６－ＧＳ－ＭＩＴＤ－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０）、ＲＢＬ０４１．１（ｐＳＴ４－ｈＡｇ－コザック－ｓｅｃ－ＧＳ－ＨＯＸＢ１３－ＧＳ－Ｐ２Ｐ１６－ＧＳ－ＭＩＴＤ－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０）、およびＲＢＬ０４５．１（ｐＳＴ４－ｈＡｇ－コザック－ｓｅｃ－ＧＳ－ＮＫＸ３－１－ＧＳ－Ｐ２Ｐ１６－ＧＳ－ＭＩＴＤ－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０）の産生のための個々のプラスミドＤＮＡを、遺伝子合成と組換えＤＮＡ技術の組合せを用いて生成した。転写された領域をコードする配列に加えて、プラスミドＤＮＡは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのプロモータ、線状化に使用されるクラスＩＩｓエンドヌクレアーゼの認識配列、カナマイシン耐性遺伝子、および複製起点（ｏｒｉ）を含む。
プラスミドＤＮＡ ｐＳＴ４－ｈＡｇ－コザック－ｓｅｃ－ＧＳ－ＳＩＩＮＦＥＫＬ－ＧＳ－Ｏｖａ－ＧＳ－Ｐ２Ｐ１６－ＧＳ－ＭＩＴＤ－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０は、ＲＢＬ０３８．１、ＲＢＬ０３９．１、ＲＢＬ０４０．１、ＲＢＬ０４１．１、およびＲＢＬ０４５．１のＤＮＡ鋳型生成の出発点として機能した。
ベクターマップを図３～７に示す。
ＲＮＡ転写の出発物質を得るために、環状プラスミドＤＮＡを適切な制限酵素で線状化する。ここでは、酵素Ｅａｍ１１０４Ｉ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｂａｌｔｉｃｓ ＵＡＢ，Ｖｉｌｎｉｕｓ，Ｌｉｔｈｕａｎｉａ）を選択した。これは、このようなクラスＩＩｓ制限エンドヌクレアーゼで線状化すると、「自由」ポリ（Ａ）尾部をコードする、すなわち、３'末端にさらなるヌクレオチドを有さないＲＮＡの転写が可能になるからである。これがより高いタンパク質発現をもたらすことを実証することができた。
ＲＮＡ（ＬＩＰ）産物は、（ｉ）ＮａＣｌ溶液によるＲＮＡ濃縮物の希釈、および（ｉｉ）リポソームの添加によるＲＮＡリポプレックス形成を含む２段階手順で調製され得る。ＲＮＡ（ＬＩＰ）調製のために、希釈したＲＮＡにリポソームを添加し得る。脂質として、合成カチオン性脂質ＤＯＴＭＡおよび天然に存在するリン脂質ＤＯＰＥを使用し得る。ＩＶ注射用の製品は、主に脾臓に存在するＡＰＣへのＲＮＡの選択的標的化を可能にする薬学的および生理学的特性を有する製剤である。ＲＮＡリポプレックスは、最初にＲＮＡを適切なイオン環境で凝縮し、続いて正に帯電したリポソームとインキュベートすることによって形成される。
ＲＮＡ凝縮のために、様々な一価および二価イオン、ペプチド、および緩衝剤を様々な濃度で適用した。ナトリウムおよびアンモニウムのような一価イオンは、最大１．５Ｍの濃度で試験した。二価イオン、特にＣａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｚｎ２＋およびＦｅ２＋は、最大５０ｍＭの濃度で試験した。さらに、様々な市販の緩衝液を試験した。
ＲＮＡ（ＬＩＰ）形成のために、カチオン性脂質および異なる共脂質を含むリポソームを広範囲に試験した。電荷、相状態、サイズ、ラメラ性、および表面官能化が異なるリポソームを調べた。ＧＭＰグレードで入手可能であり、以前に臨床試験で試験されたか、または市場で承認された製品に使用されている脂質成分のみを考慮した（図８）。
上記のリポソーム成分を使用して、異なるカチオン性脂質：ＲＮＡおよび異なる電荷比でＲＮＡリポプレックスを構築し、ここで、電荷比は、脂質からの正電荷の数とＲＮＡヌクレオチドからの負電荷の数、すなわちＲＮＡリン酸基の数から計算した。より具体的には、電荷比の計算は以下のように実施した：
ＲＮＡは、３３０Ｄａの平均モル質量を有するヌクレオチドからなり、それぞれが１つの負電荷を有するリン酸基を担持すると仮定した。したがって、１ｍｇ／ｍＬのＲＮＡの溶液は、負電荷で約３ｍＭを占める。一方、一価のカチオン性脂質あたり１つの正電荷を考慮した。例えば、カチオン性脂質ＤＯＴＭＡは６７０Ｄａのモル質量を有し、２ｍｇ／ｍＬのＤＯＴＭＡ濃度を有するリポソームは、３ｍＭの正電荷の濃度であると考えた。したがって、この場合、（＋：－）電荷比は１：１と見なされた。ほとんどの場合に存在した非荷電共脂質の濃度は、この計算には寄与しない。
これに基づいて形成されたリポソームおよびＲＮＡリポプレックスの化学的および物理化学的特性（すなわち、化学組成、粒径、ゼータ電位に関して）を徹底的に調べた。製品品質の定期的な管理のために、化学組成をＨＰＬＣ分析によって決定し、粒径を光子相関分光法（ＰＣＳ）によって測定した。また、ゼータ電位をＰＣＳによって測定した。さらに、製剤開発の過程で、電子顕微鏡法、小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）、熱量測定、フィールドフローフラクショネーション、分析超遠心分離、および分光技術を適用した。この手順により、さらなる医薬品開発のために最適化された製剤が同定された。
適切なリポソーム製剤をインビトロおよびインビボで試験した。主に脾臓に存在するＡＰＣへの標的化を最適化するために、レポータ遺伝子としてのルシフェラーゼの発現をインビボで観察した。別々の粒径を有するコロイド状の安定なナノ粒子リポプレックス製剤が適切な電荷比（過剰な負電荷または正電荷）で形成され得ることを示すことができた。さらに、負に帯電したルシフェラーゼ－ＲＮＡリポプレックス製剤は、プロフェッショナルＡＰＣのリザーバとして機能する脾臓に対して高い選択性を示すことがインビボで示されている。電荷比を変化させることによって、図９に示すように、脾臓におけるルシフェラーゼ発現の選択性を所望に応じて調整することができ、図９では、カチオン性脂質対ＲＮＡの異なる混合比を有する同じリポソームからのＲＮＡリポプレックスの臓器選択性が示されている。負に帯電したリポプレックスが脾臓ＡＰＣを標的とするという観察結果は、多数の脂質組成物について検証することができた。カチオン性脂質ＤＯＴＭＡおよびヘルパーリン脂質ＤＯＰＥからなるリポソームは、意図される脾臓ＡＰＣ標的化に適したＲＮＡリポプレックスを形成するための粒子特性の観点から最も適切であると同定された。脾臓標的化の最適化された選択性および有効性は、過剰なＲＮＡによって構成されるわずかに過剰な負電荷で観察される。わずかにより正に帯電し、同等の有効性を示したＲＮＡリポプレックスは、コロイド的にあまりに不安定であり、これらの条件下では凝集および沈殿のリスクが高いため、医薬品の開発には適していなかった。
さらに、所与のＲＮＡについて、製剤の生物学的活性がＲＮＡリポプレックスの粒径と共に増加したことを示すことができた。より具体的には、より大きなリポソーム（例えば、約４００ｎｍ）から形成されたＲＮＡリポプレックス自体が、より小さなリポソーム（例えば、約２００ｎｍ）を用いて調製されたものよりも大きく、より高い生物学的活性を示すことを示すことができた（図１０）。したがって、好ましくは、２００ｎｍより大きいリポソームがＲＮＡ（ＬＩＰ）形成のために使用される。
上記の所見に基づいて、ＲＮＡ（ＬＩＰ）調製のための堅牢で再現性のあるプロトコルが開発された。指定された成分および定義された調製プロトコルを使用することにより、ＲＮＡリポプレックスは、意図した物理化学的特性および生物学的活性への自己組織化によって形成される。一例として、様々な独立した調製物からのＲＮＡリポプレックスの粒径を図１１に示す。得られたＲＮＡリポプレックス粒径の限られた広がりは、再構成手順の堅牢性を実証する。
ＲＮＡ（ＬＩＰ）調製の限界と堅牢性を決定するために、１．０：２．０～１．９：２．０の異なる電荷比（カチオン性脂質とヌクレオチドの間の混合比）について粒径を測定した。図１２に、リポソームとＲＮＡを様々な比率で混合した後のＲＮＡリポプレックスのサイズ測定からの結果を示す。ＲＮＡ（ＬＩＰ）調製後の様々な時点で粒径を測定した。１．０：２．０～１．６：２．０の比率では、経時的に安定な同等の粒径が得られる。１．７：２．０以上の比率では、ＲＮＡリポプレックスの粒径は、最初と経時的の両方で増加する。この所見は２４時間後に最も著明である。
これらのデータに基づいて、１．０：２．０と１．６：２．０の間の電荷比が、ＲＮＡリポプレックス生成物の許容される粒子特性を得るのに適していると考えられた。より高い比率（１．７：２．０以上）では、粒径が増加し、製品品質が逸脱する可能性があった。より低い電荷比に向けて、粒子特性の変化は観察されなかったが、その範囲での潜在的に低い活性のために、より低い比率は考慮しなかった（データは示していない）。実験を１．１：２．０～１．６：２．０の範囲で繰り返し、サイズ測定（図１３Ａ）に加えて、生物学的活性を調べた（図１３Ｂ）。以前の実験と一致して、粒径は実質的に一定であった。生物学的活性（ルシフェラーゼ発現）についても同様である。要約すると、試験した全ての電荷比のＲＮＡリポプレックスは、物理化学的特性または生物学的性能の有意な変化を伴わずにＲＮＡをＡＰＣに送達した。したがって、１．１：２．０～１．６：２．０の範囲は、同等の品質のＲＮＡリポプレックスをもたらすと考えられる。
（実施例２）
非臨床データ
この実施例では、ＲＮＡ（ＬＩＰ）ワクチンの作用機序、薬力学、抗腫瘍活性、薬物動態および潜在的毒性を明らかにするために実施した非臨床試験を総説する。重要な所見を表１に要約する。
このセクションの最初の部分は、ワクチンプラットフォーム自体の開発のための科学的根拠と準備作業の概要（セクション１）、およびＷ＿ｐｒｏ１標的の標的特性の概要を提供する。
以下のセクションは、ＲＮＡ（ＬＩＰ）の一次薬力学、すなわちインビボでの抗原特異的Ｔ細胞の誘導、およびＲＮＡ（ＬＩＰ）ワクチン接種の抗腫瘍活性（セクション２）に関する試験を説明する。
二次薬力学に関する試験は、炎症性サイトカインのＲＮＡ（ＬＩＰ）媒介誘導について試験した結果を示す（セクション３）。カニクイザルにおける薬力学非ＧＬＰ試験は、サイトカイン動態データ、およびマウスで観察された血液学的変化を精緻化するために実施した。ＲＮＡ（ＬＩＰ）調製物とのインキュベーション後のヒトおよびカニクイザル血液細胞のサイトカイン分泌を分析するインビトロ試験もこのセクションで要約する。
呼吸器系および神経系の安全性薬理試験をセクション４に要約する。
インビボ生体内分布、薬物動態および代謝の概要をセクション５に示す。
免疫毒性試験を組み込んだＧＬＰ準拠反復投与毒性試験を実施し、セクション６で提示および考察する。
Figure 2022525103000042
Figure 2022525103000043
セクション１：科学的根拠
ＲＮＡ翻訳および細胞内安定性を改善する配列特徴
ＲＮＡワクチンプラットフォームは、コードされた抗原に対する抗原特異的ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞応答の安全性および効率的な誘導のために２０年間にわたって開発され、体系的に最適化されてきた。
上記で概説したように、活性成分（原薬）は、一本鎖のキャップされたメッセンジャＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であり、抗原提示細胞に入るとタンパク質抗原に翻訳される。ｍＲＮＡワクチンフォーマットは、（ｉ）翻訳活性ＲＮＡの安定化のための修飾キャップ類似体、（ｉｉ）安定性およびＲＮＡ翻訳を増加させるための最適化された５'－および３'－ＵＴＲ、（ｉｉｉ）ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ抗原プロセシングを改善するシグナルペプチドおよびＭＩＴＤ配列、（ｉｖ）非特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞ヘルプを提供することによって免疫寛容を破壊する破傷風トキソイド由来のヘルパーエピトープ、ならびに（ｖ）ＲＮＡ安定性および翻訳効率をさらに高める伸長した自由末端ポリ（Ａ）尾部によって薬理学的に最適化される（表２）。
Figure 2022525103000044
リンパ球常在抗原提示細胞への抗原コードＲＮＡの標的化
樹状細胞へのＲＮＡの全身送達のために、Ｗ＿ｐｒｏ１の個々のＲＮＡ医薬品は、ＩＶ投与を可能にするＲＮＡリポプレックス（ＲＮＡ（ＬＩＰ））を形成するように製剤化される。ＲＮＡ（ＬＩＰ）製剤は、血漿ＲＮアーゼによる分解からＲＮＡを保護するように操作され、主に脾臓（図１４）ならびに樹状細胞およびマクロファージによるＲＮＡの選択的取り込みが示されている他のリンパ器官（図１５）に存在する抗原提示細胞（ＡＰＣ）への製剤化されたＲＮＡ ＤＰの選択的送達のために最適化されている。
ＲＮＡリポプレックスが脾臓内のＡＰＣによって取り込まれると、ｍＲＮＡは発現され、プロセシングされ、ＭＨＣ分子を介して提示される。これにより、抗原特異的ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞応答ならびにＴ細胞メモリの強力な誘導がもたらされ、ＲＮＡ（ＬＩＰ）によって媒介されるＴＬＲシグナル伝達によって誘導される脾臓内の免疫刺激環境によってさらに支持される。
抗原特異的Ｔ細胞応答の誘導
ＲＮＡ（ＬＩＰ）免疫化の効力を調査し、内因的に発現された抗原に対する寛容を破壊するＲＮＡ（ＬＩＰ）の能力を調べるために、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、マウス白血病ウイルス（ｍｕＬＶ）由来のｇｐ７０タンパク質のＡＨ５エピトープをコードするＲＮＡ（ＬＩＰ）で免疫化した。ＡＨ５－ＲＮＡ（ＬＩＰ）による反復免疫化は、著しいｇｐ７０特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞拡大をもたらした（図１６Ａ）。ワクチン接種によって誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、抗原特異的にインビボで標的を溶解することができ（図１６Ｂ）、溶解能力を有する機能的な抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞がＲＮＡ（ＬＩＰ）免疫化によって誘導され得ることを示唆した。
細胞活性化プロセスの誘導
ｍＲＮＡは、ヒトＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）のリガンドであり、したがって免疫調節作用を誘発することができる。インビトロ転写（ＩＶＴ）－ＲＮＡが細胞に取り込まれると、これらの受容体が主に局在するエンドソーム区画でＴＬＲによる認識が起こる。これはシグナル伝達事象のカスケードを開始し、ＲＮＡ（ＬＩＰ）ワクチンをマウスに静脈内適用した後の脾臓ＤＣの成熟によって示されているように、最終的にＤＣの活性化と成熟をもたらす。これらの免疫調節作用のさらなる結果は、脾臓のＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞およびマクロファージのその後の活性化、ならびに炎症性サイトカインの可逆的誘導である。
最も重要なことには、インフルエンザ赤血球凝集素ＨＡをコードするモデルＲＮＡ（ＬＩＰ）の注射は、マウスにおいてＩＦＮ－αの強力な誘導を示し（図１７Ａ）、これが脾臓に由来することが脾臓摘出マウスで示された（図１７Ｂ）。特に、ＩＦＮ－αの誘導はＲＮＡ（ＬＩＰ）についてのみ示され、リポソーム単独ではマウスにおいてＩＦＮ－αの誘導をもたらさなかった。
ＲＮＡ（ＬＩＰ）ワクチンで処置したマウスで観察された一過性の細胞活性化およびサイトカインは、ＲＮＡワクチンがＴＬＲに結合し、ＴＬＲをトリガすることができるという所見と一致する。粒子として製剤化されたＲＮＡおよび水溶液に製剤化されたＲＮＡがＴＬＲを活性化できることも他の研究者によって示されている。ＴＬＲ活性化はリンパ球減少症を誘発し、白血球のＩ型インターフェロン依存性再循環事象を引き起こすことが示されている。これと一致して、樹状細胞および他の脾臓細胞集団の活性化は、ＴＬＲ７－／－マウスまたはＩＦＮＡＲ－／－マウスでは著しく妨げられた。したがって、ＲＮＡ（ＬＩＰ）を適用したＩＦＮＡＲ－／－マウスでの試験は、ＩＶ適用後に観察された一過性の血液学的変化が主にＩＦＮ－αの下流効果によって媒介されることを示した。
Ｗ＿ｐｒｏ１におけるＰ２Ｐ１６破傷風由来ヘルパーエピトープ
全てのＷ＿ｐｒｏ１ ＲＮＡ ＤＰは、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）の破傷風トキソイド（ＴＴ）由来のいわゆるＰ２Ｐ１６アミノ酸配列を含む。これらの配列は、プライミング中に腫瘍非特異的Ｔ細胞ヘルプを提供することによって、自己抗原に対する免疫応答の効率的な誘導のための自己寛容機構を克服することを支援する。
破傷風トキソイド重鎖は、ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子に無差別に結合し、破傷風ワクチン接種を受けたほぼ全ての個体でＣＤ４＋メモリＴ細胞を誘導することができるエピトープを含む。さらに、ＴＴヘルパーエピトープと腫瘍関連抗原の組合せは、プライミング中にＣＤ４＋媒介Ｔ細胞ヘルプを提供することによって、腫瘍関連抗原単独の適用と比較して免疫刺激を改善することが公知である。ＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激するリスクを低減するために、無差別に結合するヘルパーエピトープを含むことが公知の２つのペプチド配列を選択して、できるだけ多くのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子への結合を確保した。上記で引用したエクスビボ試験のデータに基づいて、周知のエピトープＰ２（ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ；ＴＴ８３０～８４４）およびＰ１６（ＭＴＮＳＶＤＤＡＬＩＮＳＴＫＩＹＳＹＦＰＳＶＩＳＫＶＮＱＧＡＱＧ；ＴＴ５７８～６０９）を選択した。
薬理学
ＲＮＡ（ＬＩＰ）ワクチン接種の作用機序は、（ｉ）プロフェッショナルＡＰＣによるＲＮＡコード化抗原に由来するペプチドの提示後の抗原特異的Ｔリンパ球の動員、ならびに（ｉｉ）細胞活性化およびＩ型インターフェロンなどの炎症性サイトカインの誘導をもたらし、それによってワクチン接種効果を高めるＴＬＲ媒介免疫調節作用に依存する。
セクション２では、癌抗原をコードするＲＮＡで免疫化したときの標的抗原特異的Ｔ細胞の活性化および拡大、ならびに抗原ＲＮＡ（ＬＩＰ）ワクチン接種の抗腫瘍効果を報告する。
ＲＮＡ（ＬＩＰ）ワクチンの投与の潜在的な二次的影響、例えばＲＮＡ（ＬＩＰ）の意図した免疫調節作用によって引き起こされる炎症性サイトカイン誘導および血液学的変化を調べるために、広範なインビトロおよびインビボ試験を実施した。
セクション３では、ヘパリン加全血中のヒト末梢血細胞（ＰＢＭＣ）および血球の細胞活性化の程度を評価する一連の試験について論じる。さらに、ヒトでの最も高い意図される臨床用量を上回る用量で処置したカニクイザルにおけるワクチン接種誘導性サイトカイン誘導および血液学的変化の程度を示す。最後に、ヒトドナーおよびカニクイザル由来の血液試料におけるインビトロサイトカイン誘導の並列比較を実施し、これらの試験で生成されたデータを使用して、悪性黒色腫での進行中の臨床試験（Ｌｉｐｏ－ＭＥＲＩＴ）およびＲＮＡ（ＬＩＰ）免疫療法を調べる他の試験のための安全な開始用量の定義を裏付けた。
ＲＮＡ（ＬＩＰ）の二次薬力学を評価するための試験系としてヒト血球、マウスおよびカニクイザルを使用した非臨床試験の概要をセクション３に示す。
リポソーム製剤化ＲＮＡで観察された二次薬力学的効果は配列依存性ではなく、したがって、提示された試験は、使用される他のＲＮＡ医薬品にも同様に適用可能であると予想される。
Figure 2022525103000045
セクション２：一次薬力学
黒色腫、乳癌、ＨＰＶ＋頭頸部癌、卵巣癌、および他の癌型に特異的な抗原をコードする多数の異なるｍＲＮＡを用いたＲＮＡ（ＬＩＰ）ワクチン接種の免疫原性を証明するために、いくつかのインビトロおよびインビボ実験を実施した。インビボ試験は、マウスにおいてＲ＆ＤおよびＧＭＰグレードの材料を用いて実施した。
Ｗ＿ｐｒｏ１ ｍＲＮＡによる抗原特異的Ｔ細胞応答の誘導
前立腺特異抗原ＫＬＫ２、ＰＳＡ（ＫＬＫ３）、ＰＡＰ（ＡＣＰＰ）、ＨＯＸＢ１３、およびＮＫＸ３－１による抗原特異的Ｔ細胞のインビボ誘導についてさらなる情報を得るために、Ｒ＆Ｄ品質のＲＮＡおよびＧＭＰ同様品質のリポソームを使用してＲＮＡ（ＬＩＰ）生成物を調製した。
ＲＮＡ（ＬＩＰ）生成物を、ヒト白血球抗原ＨＬＡ－Ａ＊０２０１およびＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１を発現するように操作されたトランスジェニックマウスに静脈内注射した。これらのマウスを使用して、ＨＬＡ拘束性エピトープに特異的なＴ細胞のプライミングおよび拡大をインビボで調べることができる。Ａ２／ＤＲ１マウスに、リポソームと複合体化した各抗原ＲＮＡ ３０μｇを注射することによって４～５回ワクチン接種し、続いて脾臓細胞を単離した（最後のワクチン接種の５日後）。それぞれのｍＲＮＡまたは無関係な対照ｍＲＮＡでエレクトロポレーションした骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）で再刺激した後、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって被験物質のプライミング効率を評価した。
全ての抗原について、ＲＮＡ（ＬＩＰ）調製物による４回のワクチン接種は、処置した動物における特異的Ｔ細胞応答をプライミングするのに十分であった（図１８）。
これらの結果は、ＲＮＡ（ＬＩＰ）ワクチンがインビボでＷ＿ｐｒｏ１抗原に対するＴ細胞応答を効率的に誘導できることを示す。
試験で使用したｍＲＮＡはＲ＆Ｄ条件下で製造された。ＧＭＰ条件下で製造されたＲＢＬ０３８．１、ＲＢＬ０３９．１、ＲＢＬ０４０．１、ＲＢＬ０４１．１、およびＲＢＬ０４５．１を用いたＡ２／ＤＲ１マウスでのさらなる免疫原性試験を実施する。免疫原性は、以前の試験からの結果に匹敵すると予想される。
モデル抗原ＲＮＡによって誘導される抗原特異的Ｔ細胞のインビボ抗腫瘍活性
マウス腫瘍モデルを同定するための公知の課題に関連して、これらの抗原のマウスホモログが存在しないため、Ｗ＿ｐｒｏ１抗原を検討するさらなる試験は実施しなかった。代わりに、オボアルブミン由来のＳＩＩＮＦＥＫＬエピトープに適した腫瘍モデル；ヒトパピローマウイルス由来のＥ６／Ｅ７抗原およびｇｐ７０をそれぞれワクチン接種のための外来抗原およびマウス自己抗原のモデルとして開発した。
ＲＮＡ（ＬＩＰ）によって誘導されるインビボ抗腫瘍効果の要約を表３に示す。
Figure 2022525103000046
セクション３：二次薬力学
ＲＮＡリポプレックスワクチンの投与による潜在的な二次的影響、例えば意図した免疫調節作用によって誘導される炎症性サイトカインおよび血液学的変化を調べるために、ヒト血球およびカニクイザルを試験系として使用して広範なインビトロおよびインビボ試験を実施した。本発明者らの知る限りでは、ＴＬＲおよび治療用ｍＲＮＡによる自然免疫活性化によって引き起こされる二次薬力学的効果は配列依存性ではないので、この章で提示される試験は、ＡＴＭ品質のリポソーム製剤化ＲＢＬ００１．１、ＲＢＬ００２．２、ＲＢＬ００３．１、およびＲＢＬ００４．１の等量の混合物を用いて実施した。これらのＲＮＡは、メラノソーム抗原をコードしており、臨床試験で使用されている。ＴＡＡをコードするＷ＿ｐｒｏ１ ＲＮＡ ＤＰを用いた試験は繰り返されていない。
以下に記載されるように、ＲＮＡ（ＬＩＰ）ワクチン接種によって誘導されるサイトカイン誘導の程度、血液学的変化、補体活性化、および臨床化学を、ヒトでの意図される用量に対応する用量で処置したカニクイザルにおいて検討した。さらに、ＲＮＡリポプレックス処置に応答したヘパリン加全血中のヒトおよびカニクイザル末梢血細胞（ＰＢＭＣ）および血球のサイトカイン放出の程度を、非ＧＬＰおよびＧＬＰ試験で調査した。
さらに、誘導されたＴ細胞の潜在的な交差反応性を排除するために、ＲＮＡワクチン配列とヒトプロテオームとのバイオインフォマティクス相同性検索を実施した。
Figure 2022525103000047
健常ヒトドナーおよびカニクイザルにおけるＰＢＭＣおよび全血のインビトロ活性化
ＲＮＡは、タンパク質抗原をコードするその特徴に加えて、ＴＬＲトリガを介して細胞活性化プロセスを誘導する能力に由来する免疫調節作用を有する。一方で、ＲＮＡワクチンの免疫調節能力は、抗原特異的Ｔ細胞応答の誘導を増強し、一次薬力学的効果と見なされるべきである。他方で、免疫細胞の強すぎるまたは非特異的な活性化は、望ましくない二次的影響をもたらす可能性があり、前臨床試験で既に対処されるべきである。
ヒト血液細胞の細胞活性化の程度を検討するために、４人の健常ドナー由来のヘパリン加全血およびＰＢＭＣ（ヘパリン加全血から単離）を、ＡＴＭ品質のメラノソーム腫瘍関連抗原（ＲＢＬ００１．１、ＲＢＬ００２．２、ＲＢＬ００３．１、およびＲＢＬ００４．１）をコードするリポソーム製剤化ＲＮＡの等量の混合物と共にインビトロでインキュベートした。ＲＮＡによるＴＬＲ活性化は配列依存性ではないので、Ｗ＿ｐｒｏ１ ＲＮＡを用いた試験は繰り返していない。
４つのＲＮＡ医薬品のそれぞれのＲＮＡ（ＬＩＰ）を、臨床製剤プロトコルに従って個別に調製した。この最初の試験（試験１、ＳＴＲ－３０２０７－０１３）では、０．０７ｍｇ～１６．６５ｍｇの総ＲＮＡのヒト用量に相当する０．０１４μｇ ＲＮＡ／ｍＬ～３．３３３μｇ ＲＮＡ／ｍＬの濃度範囲を選択した（表５）。主要評価項目として、細胞の活性化を、６時間後および２４時間後に、それぞれ細胞培養培地（ＰＢＭＣ）または血漿（全血）へのサイトカイン（ＩＰ－１０、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－６、およびＩＬ－１２）の分泌によって決定した。
Figure 2022525103000048
ＰＢＭＣをＲＮＡ（ＬＩＰ）混合物と共にインキュベートした後、濃度レベルに大きなばらつきはあるが、８つの試験した分析物全てに関して検出可能な用量依存的活性化があった。サイトカイン応答は、８つの選択したマーカーのうちの５つ、すなわちＩＰ－１０、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、およびＩＬ－６が支配的であった（要約については表４を参照）。ＩＦＮ－α、ＩＬ－２、およびＩＬ－１２は、試験した最高用量レベルでわずかな誘導しか示さなかった。
逆に、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、およびＩＬ－１２の分泌は、ＲＮＡ（ＬＩＰ）とのインキュベーション後に全血試験系では検出できなかった。ここでは、ＩＰ－１０およびＩＬ－６の用量依存的分泌の上昇が観察された。ＩＦＮ－αについては、希釈剤対照に匹敵し、ＲＮＡ（ＬＩＰ）とのインキュベーションによってさらに上昇しなかった低レベルのベースライン分泌のみが観察された（要約については表４を参照）。
要約すると、ＰＢＭＣでの所見は、全血と比較して明らかな違いを示し、ＰＢＭＣを用いた試験系のより高い感受性を示唆した。ＰＢＭＣでは８つの試験した分析物全てについてサイトカインレベルの上昇が検出されたが、全血試料を試験系として使用した場合、サイトカインの検出はＩＦＮ－α、ＩＰ－１０、およびＩＬ－６に限定された。
Figure 2022525103000049
インビトロでＲＮＡ（ＬＩＰ）に応答したヒト細胞のサイトカイン放出をさらに検討し、マウス免疫毒性試験（下記参照）およびカニクイザル試験（下記参照）からのインビボデータを比較および分類するために、さらなるＧＬＰ準拠インビトロ試験を外部ＣＲＯ（ＬＰＴ Ｎｏ．３１０３１）で実施した。この試験の主な目的は、（ｉ）カニクイザルにおける所見がヒトに匹敵するかどうか、および（ｉｉ）どの試験系がインビボでカニクイザルにおいて観察されたサイトカイン応答パターンをよりよく反映するかを確認することであった。試験ＬＰＴ Ｎｏ．３１０３１を以下のように設計した：健常ヒトドナーおよびカニクイザルにおける炎症性サイトカインのインビトロ誘導を２つの試験系、すなわちＰＢＭＣおよび全血で試験した。試験Ｎｏ．ＳＴＲ－３０２０７－０１３と同じ用量範囲および用量段階のＲＮＡ（ＬＩＰ）を試験した。被験物質は、ここでも、別々に調製したＡＴＭ品質のリポソーム製剤化ＲＢＬ００１．１、ＲＢＬ００２．２、ＲＢＬ００３．１、およびＲＢＬ００４．１ ＲＮＡの混合物であった。上述のように、これらのＩＶＴ－ＲＮＡを用いて生成されたデータはまた、ＴＬＲ活性化がＲＮＡ配列非依存性であるため、ＴＡＡをコードするＲＮＡ ＤＰを説明する。合計で、それぞれの種の４個体の試料を分析した。主要評価項目として、細胞の活性化を、６時間後、２４時間後および４８時間後に、それぞれ細胞培養培地（ＰＢＭＣ）または血漿（全血）への炎症性サイトカインの分泌によって決定した。
観察されたサイトカイン応答を、全血試験系については表６に、ＰＢＭＣ試験系については表７にそれぞれ要約する。
Figure 2022525103000050
Figure 2022525103000051
表８は、４匹のカニクイザルおよび４人の健常ドナー由来の全血を６つの異なる用量のＲＮＡ（ＬＩＰ）と共に６時間および２４時間インキュベートした後に分析した、試験ＬＰＴ Ｎｏ．３１０３１で生成されたデータを示す。試験Ｎｏ．ＳＴＲ－３０２０７－０１３でヒトＰＢＭＣにおいて炎症性サイトカインＴＮＦ－α、ＩＬ－６、およびＩＦＮ－γが主に上方制御されたため、分析はこれらのサイトカインに焦点を合わせた。示されるように、２つの種におけるインビトロでのサイトカイン応答は非常に同等であった。ＩＬ－６については、２４時間のインキュベーション後に、カニクイザルで１２２倍の誘導および健常ドナーで１０８倍の誘導がそれぞれ観察された。最高用量レベルで、両方の種において低レベルのＴＮＦ－αしか検出することができなかった。非常に低いＩＦＮ－γ誘導が、２４時間のインキュベーション後にカニクイザルにおいて最高用量レベルでのみ観察された。
最も重要なことには、これらの３つの炎症性サイトカインの強力な被験物質関連サイトカイン誘導は、患者における１００μｇの最高意図用量レベルを上回り、初期ワクチン接種サイクルの予定用量（＝５０μｇ ＲＮＡ）の１００倍超高い５，５００μｇ以上の用量レベルでのみ観察された。特に、健常ドナーからの結果は、インビトロ試験ＳＴＲ－３０２０７－０１３からの所見を確認し、全血試験系で観察されたカニクイザルサイトカイン応答パターンは、ＲＮＡ（ＬＩＰ）で処置したカニクイザルでＩＬ－６のみが検出できたインビボ試験ＬＰＴ Ｎｏ．２９９２８からの所見に類似していた（下記参照）。
表９は、４匹のカニクイザルおよび４人の健常ドナー由来のＰＢＭＣを６つの異なる用量のＲＮＡ（ＬＩＰ）と共に６時間および２４時間インキュベートした後に分析した、試験ＬＰＴ Ｎｏ．３１０３１で生成されたデータを示す。ＩＬ－６およびＴＮＦ－αの誘導は、（ｉ）誘導されたサイトカインの絶対量（種間で２倍未満の差）、（ｉｉ）動態（６時間後のＩＬ－６およびＴＮＦ－αの早期誘導）、ならびに（ｉｉｉ）サイトカイン誘導をもたらしたＲＮＡ（ＬＩＰ）の用量レベルに関して、ヒトおよびカニクイザルＰＢＭＣで同等であった。２４時間のＲＮＡ（ＬＩＰ）刺激後にのみ、中間用量のＲＮＡ（ＬＩＰ）で処理した両方の種由来のＰＢＭＣにおいてＩＦＮ－γが検出されたが、ヒトではより高い程度であった。要約すると、ＰＢＭＣにおいてＲＮＡ（ＬＩＰ）によって誘導されたサイトカインプロフィールは、ＩＬ－６およびＴＮＦ－αに関して種間で同等であった。この試験で得られた結果は、カニクイザルがＲＮＡ（ＬＩＰ）媒介サイトカイン誘導を評価するための関連種であり、ヒトＰＢＭＣがＩＦＮ－γ誘導を捕捉するためのより感受性の高い系を構成することを示唆する。
表８：全血試験系でのカニクイザルおよび健常ヒトドナーにおける炎症性サイトカインＩＬ－６、ＴＮＦ－α、およびＩＦＮ－γのインビトロ誘導。
表は、試験ＬＰＴ Ｎｏ．３１０３１で生成されたデータを示す：全血を異なる用量のＲＮＡ（ＬＩＰ）とインキュベートした後に検出されたＩＬ－６（上部）、ＴＮＦ－α（中央部）、およびＩＦＮ－γ（下部）のサイトカインレベル（ｐｇ／ｍＬ）。赤色のカラーコードはサイトカインレベルの高さを示し、濃い赤色はより高いサイトカインレベルを示す。最初の列は、臨床現場で適用される総用量レベルを示す。２番目の列は、５Ｌの血液量を想定したインビトロ試験系で使用されたＲＮＡの量を示す。＊＝データは収集されていない。
Figure 2022525103000052
表９：ＰＢＭＣ試験系でのカニクイザルおよび健常ヒトドナーにおける炎症性サイトカインＩＬ－６、ＴＮＦ－α、およびＩＦＮ－γのインビトロ誘導。
表は、試験ＬＰＴ Ｎｏ．３１０３１で生成されたデータを示す：ＰＢＭＣを異なる用量のＲＮＡ（ＬＩＰ）とインキュベートした後に検出されたＩＬ－６（上部）、ＴＮＦ－α（中央部）、およびＩＦＮ－γ（下部）のサイトカインレベル（ｐｇ／ｍＬ）。赤色のカラーコードはサイトカインレベルの高さを示し、濃い赤色はより高いサイトカインレベルを示す。最初の列は、臨床現場で適用される総用量レベルを示す。２番目の列は、５Ｌの血液量を想定したインビトロ試験系で使用されたＲＮＡの量を示す。＊＝データは収集されていない。
Figure 2022525103000053
全血およびＰＢＭＣ試験系で認められた結果を比較すると、ＰＢＭＣ試験系での炎症性サイトカインは、全血試験系と比較して一般により広く、より高い絶対値に達し、より低い用量レベルで開始することが明らかになった。
この最も感受性の高いインビトロ試験系では、２４時間後に測定されたサイトカインレベルの急激な上昇は、ＩＬ－６については６１５μｇ～１，８５０μｇ ＲＮＡ、ＩＦＮ－γについては１，８５０μｇ～５，５５０μｇ ＲＮＡ、およびＴＮＦ－αについては５，５５０μｇ～１６，６５０μｇ ＲＮＡの用量範囲で観察された。インビトロ系で最も感受性の高いサイトカインマーカーであったＩＬ－６でさえも、２５μｇの意図される開始用量は、強力なインビトロサイトカイン誘導の開始を示す用量レベルの２５分の１である。
ＧＬＰ試験ＬＰＴ Ｎｏ．３１０３１に加えて、同様の実験設定を用いた非ＧＬＰインビトロ試験（Ｒｅｐｏｒｔ＿ＲＢ＿１４＿００１＿Ｂ）を実施し、種ごとに３個体からの試料を試験して同様の観察を行い、ＧＬＰ試験の結果を確認した（データは示していない）。全ての試験を総合すると、所見は、（ｉ）被験物質とのインキュベーション後の細胞の刺激に関して、カニクイザルとヒトの両方の種の同等性を強調する。さらに、これらの観察は、（ｉｉ）全血試験系がＰＢＭＣよりもインビボ状況をより厳密に反映することを示した。全血試験系では、サイトカイン誘導は一般にそれほど顕著ではなく、最高用量群でのみ観察され、ＩＬ－６の主な誘導は、インビボ試験でのカニクイザルの所見に類似する（下記参照）。
本発明者らは、人工的であるが、より感受性の高いインビトロ試験系でもあると考えられるＰＢＭＣにおいてより顕著な所見を認め、したがって、安全な初期開始用量を定義する戦略にこのより感受性の高い試験系からの結果を組み入れた。
カニクイザルにおける二次薬理学のインビボ試験
ＲＮＡ（ＬＩＰ）の動態および二次的影響とサイトカイン発現との相関関係をより正確に理解するために、雄性カニクイザルにおいて非ＧＬＰ試験を実施した（処置スケジュールおよび用量については表１０、詳細な試験デザインおよび全ての製剤成分の量については表１１を参照）。群１～５の動物（用量あたり２匹の雄性）を４つのメラノソームＲＮＡ（ＬＩＰ）ワクチンＲＢＬ００１．１、ＲＢＬ００２．２、ＲＢＬ００３．１、およびＲＢＬ００４．１（ＡＴＭ品質）で処置し、その後、対照溶液をそれぞれの注射の間に３０分の間隔を置いて低速ボーラス注射（約１０秒）として投与した（すなわち、最後の注射は１．５時間後に行った。）。二次的影響は配列依存性ではないので、この試験の結果はＷ＿ｐｒｏ１注射にも当てはまるはずである。
最高臨床用量の４２倍までの用量を試験内で試験した。さらに、用量群６の動物には、１日目に４×８８．６μｇ ＲＮＡを単回投与した後、２２日目に４×３．６μｇ ＲＮＡを単回投与した。
表１０：患者における意図用量に関連した試験スケジュールおよび用量（ＬＰＴ Ｎｏ．２９９２８）。
処置：動物１～１０（群１～５）を５回処置し、その後、ＮａＣｌ（生理食塩水）（群１）、高用量動物と同じ用量のリポソーム（群２）、およびＲＮＡ（ＬＩＰ）１～４（ＡＴＭ品質、群３～５）を４回注射した。群６の動物は、試験１日目に４×８８．６μｇ（合計３５４μｇのＲＮＡ）での単回処置を受け、続いて試験２２日目に４×３．６μｇ（合計１４．４μｇのＲＮＡ）での単回処置を受けた。用量：用量は、ｍｇ／ｋｇ体重での総ＲＮＡ量および総ＲＮＡ用量（μｇ／個体、患者は７０ｋｇの体重と推定する）として示す。
Figure 2022525103000054
Figure 2022525103000055
臨床観察
全体として、処置は非常に忍容性が高かった。局所および全身忍容性の観察（行動、外観、糞便、死亡率、体重、ならびに食物および水分の摂取を含む）に関していずれの動物においても不耐性の異常な徴候は認められなかった。
サイトカイン分析
血漿中へのサイトカイン放出を、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＩＰ－１０について、１回目および５回目の注射後、投与前、処置の完了後（すなわち、４つ全てのＲＮＡ（ＬＩＰ）生成物の注射サイクルを完了した後）０．５、２、５、９、２４、および４８時間に２つの動態で検討した。
試験した用量では、ＩＬ－６のみが用量依存的および被験物質関連の誘導を示した。処置の完了後３０分でＣｍａｘレベルに達し、２４時間後に投与前レベルに戻った（図１９）。動物１１（群６）は非常に強い応答を示す外れ値であり、１，０７１ｐｇ／ｍＬのＩＬ－６ピークレベルを有し、これは同じ用量群の他の動物よりも約５倍高かった。注目すべきことに、ＩＬ－６誘導は５回目の処置後にはるかに低く、サルにおけるＩＬ－６に対する適応効果を示唆した。
ＩＦＮ－α誘導は、高用量群６の動物において非常に低いレベルでのみ観察され、５時間後に最高レベルに達し、２４時間後に投与前レベルに戻った（図１９）。培養ヒト細胞およびマウスのインビボでの観察とは対照的に、サルではＩＰ－１０誘導は観察されなかった。他の研究者によって報告されているように、ＴＬＲ活性化アゴニストの後にサルにおいてＩＰ－１０誘導が観察されているので、この試験でＩＰ－１０が観察されなかった理由は不明のままである。
他の試験したサイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－１０、およびＩＬ－１２ｐ７０）は変化しなかった。リポソーム単独ではサイトカイン放出に影響を及ぼさなかった。
血液学
標準的な血液学パラメータを、１回目および５回目の注射後、投与前、処置の完了後５、９、２４、および４８時間に試験した（５回目の投与後に２時間をさらに含めた）。さらに、血液学を試験４日目から１２日目まで毎日、ならびに最後の投与の１週間後および３週間後に試験した。
リンパ球の一過性減少および好中球の一過性増加が、用量依存的に被験物質関連所見として見出された。リンパ球は、処置完了後５時間で高用量動物において最大５分の１まで非常に急速に低下した（群６の動物で最低量約１，０００リンパ球／μＬ）。作用は一過性であり、約４８時間で回復した。注目すべきことに、リンパ球枯渇は、リポソーム群の動物でもより低い程度で観察されたが、ＮａＣｌ対照群では観察されなかった（表１２）。ＩＬ－６誘導について観察されたような適応効果はなかった。
処置に起因してＮａＣｌ対照群でも好中球の増加が観察されたが、対照と比較した場合、群３～６で有意差が観察された。最大作用は処置の１０時間後に観察され、群３、４、５、および６で対照に対してそれぞれ４４％、３４％、８９％、および９１％であった。
処置に関連する一過性の影響（ＮａＣｌ群でも）が、好酸球、白血球、および網状赤血球について観察された（おそらく一定の採血に起因する）。
Figure 2022525103000056
補体活性化
Ｃ３ａを、投与前、１回目および５回目の処置の完了後０．５、２、５、９、２４、および４８時間、最後の投与の１週間後および３週間後に測定した。被験物質に関連する変化は観察されず、全ての値は生物学的変動の正常範囲内にあると見なされた。
臨床化学
標準的なパラメータを、投与前、各投与の２４時間後、さらに３回目および４回目の投与の４日後、ならびに最後の投与の１週間後および３週間後に試験した。
被験物質に関連する影響は、対照動物および／または試験を実施するＣＲＯで入手可能なバックグラウンドデータと比較して、リポソーム処置群の動物および被験物質処置動物の生化学的パラメータに関して評価されなかった。部分的には、データは、群ごとに使用した動物の数が少ないことに起因する多少のばらつきを示す。
胆汁酸、ビリルビン、コレステロール、クレアチニン、グルコース、リン酸塩、総タンパク質、トリグリセリド、尿素、カルシウム、塩化物、カリウム、およびナトリウムの血清レベル、ならびに血清タンパク質（アルブミン、グロブリン、およびアルブミン／グロブリン比）については、被験物質関連の変化は認められなかった。
アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＡＴ）、アルカリホスファターゼ（ａＰ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＡＴ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、α－アミラーゼ、クレアチンキナーゼ（ＣＫ、アイソフォームＣＫ－ＢＢ、ＣＫ－ＭＢ、およびＣＫ－ＭＭを含む）、γ－グルタミルトランスフェラーゼ（γ－ＧＴ）、およびグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬＤＨ）の血清酵素活性は、正常な生物学的変動の範囲内であると考えられた。
試験２３日目に、試験２２日目に４×３．５μｇ ＲＮＡ／動物で処置した動物番号１１のＬＤＨ、α－アミラーゼ、およびＣＫの酵素活性について高い値が認められた。しかし、これらの変化は、被験物質に関連するものではなく、サルが注入椅子に拘束されることによるストレスに関連すると考えられる。
被験物質関連ではないと評価されたが、ＣＫのわずかな変化をより詳細に評価した。ＣＫアイソザイムＣＫ－ＢＢ、ＣＫ－ＭＢ、およびＣＫ－ＭＭの示差分析により、試験９、１６、または２３日目に対照動物と比較して群４、５、または６の個々の動物で認められたＣＫ活性の増加は、主にＣＫ－ＭＭ画分の増加によるものであることが明らかになった。一般に、ＣＫ－ＢＢおよびＣＫ－ＭＢについては増加は認められず、したがって、全体的なＣＫレベルの増加がストレス関連であることが確認された。
心血管検査
ＥＣＧおよび血圧測定は、心血管系への影響を示さなかった。
ＴＡＡをコードするＲＮＡ ＤＰとヒトプロテオームとの間の配列相同性スクリーニング
Ｗ＿ｐｒｏ１アプローチで使用される全てのｍＲＮＡ配列は、最大２つの隣接するグリシン／セリン（ＧＳ）リッチリンカー配列にインフレームで融合される。これらの融合物の縫合点は、ヒトタンパク質と相同である場合、望ましくない自己免疫応答を潜在的に引き起こす可能性がある新しい抗原性融合タンパク質またはペプチドを生成し得る。したがって、リンカー配列および抗原に関連する縫合点が公知のヒトタンパク質と配列相同性を有するかどうかを、確立されたヒトタンパク質のデータベースに対するＢＬＡＳＴｐベースの相同性検索によって決定した。
解析する融合タンパク質配列を、長さが９～１５で、１アミノ酸残基のステップサイズを有するスライディングウィンドウを使用することによって、より小さなペプチド配列に分解した。得られた全てのペプチドを、ｂｌａｓｔソフトウェアパッケージ（ｅ値カットオフ１０、ギャップなし）のＢＬＡＳＴｐコマンドを使用して参照データベースと比較した。
１００％に相同なペプチド部分配列については、ヒトタンパク質配列への有意なアラインメントは見出すことができなかった。
セクション４：安全性薬理学
ＩＣＨガイドラインＳ７Ａは、ヒトへの曝露前に医薬品に関して実施すべき呼吸器系、中枢神経系（ＣＮＳ）、および心血管系の機能の評価を含むコアバッテリー試験を記載している。したがって、ＲＮＡ（ＬＩＰ）の安全性薬理学を、以下に記載する６つのＧＬＰ毒性試験の不可欠な部分として試験した。
ＣＮＳおよび呼吸器系の機能に対する潜在的な影響を、極めて重要な反復投与毒性試験において評価し、動物への被験物質関連の影響は明らかにされなかった。
ＲＮＡ（ＬＩＰ）ワクチンの潜在的な影響に関するリスク分析を心血管系に対して実施した。全身に分布するＲＮＡは循環中で分解され、ＲＮＡ（ＬＩＰ）として製剤化されたＲＮＡは数分以内に血液から除去され、生体内分布試験に示されているように主に脾臓と肝臓に分布する（下記参照）。得られたデータは、ＲＮＡ（ＬＩＰ）が心血管系に蓄積することを示唆していない。ＲＮＡ（ＬＩＰ）ワクチン接種の潜在的な全身性副作用は、ＩＦＮ－αの一過性の増加に関連すると予想されるが、ＩＦＮ－αを投与された数千人の患者で実証されているように、心血管副作用につながるとは予想されない。その結果、ＩＣＨ Ｓ７Ａ／Ｂに準拠したＧＬＰ心血管安全性薬理試験は実施しなかった。しかしながら、ＲＮＡ（ＬＩＰ）で処置したカニクイザルにおける非ＧＬＰ薬理試験からの裏付けとなるＥＣＧおよび血圧データが利用可能であり、ＲＮＡ（ＬＩＰ）ワクチンでの処置後の心血管機能の評価に対処している。
要約すると、呼吸器系、神経系、および心血管系の被験物質または処置関連の変化は、マウス（呼吸器系およびＣＮＳ機能）ならびにカニクイザル（心血管機能）で試験したいずれの用量群でも観察されなかった。
呼吸器安全性
呼吸器安全性を、ＧＬＰに準拠したＴＡＡをコードするＲＮＡ ＤＰを使用したマウスでの反復投与毒性試験（ＬＰＴ Ｎｏ．２８８６４および３０２８３、試験デザインについては下記を参照）に含めた。例えば、プレチスモグラフィを、対照緩衝液、低用量および高用量（それぞれ９μｇおよび９０μｇのリポソームで製剤化した５μｇおよび５０μｇのＲＮＡ）のいずれかで処置した４匹の動物／性別／群でのＲＮＡ（ＬＩＰ）（ＬＰＴ Ｎｏ．３０２８３）を用いた試験で試験した。３０ｍｇのカルバミル－β－メチルコリンクロリド（ベタネコール）／ｋｇ体重で処置した動物の陽性対照も含めた。４回目～７回目の投与の１日後にプレチスモグラフィを実施した。試験には、呼吸数、一回換気量、分時拍出量、吸気時間、呼気時間、最大呼気流量および最大吸気流量、呼気時間、ならびに気道抵抗指数の評価が含まれた。試験した肺パラメータのいずれも、対照群と比較して、処置動物において被験物質関連の変化を示さなかった。陽性対照群の動物のみが予想された変化を示した。
ＣＮＳ安全性
ＣＮＳ安全性を、ＧＬＰに準拠したＴＡＡをコードするＲＮＡ ＤＰを使用したマウスでの反復投与毒性試験（ＬＰＴ Ｎｏ．２８８６４および３０２８３、試験デザインについては下記を参照）に含めた。例えば、ＲＮＡ（ＬＩＰ）（ＬＰＴ Ｎｏ．３０２８３）を用いた試験では、対照緩衝液、低用量および高用量（それぞれ９μｇおよび９０μｇのリポソームで製剤化した５μｇおよび５０μｇのＲＮＡ）の５回目の投与の約２４時間後に、５匹の動物／性別で観察スクリーニングを試験した。以下の試験を観察スクリーニングに含めた：立直り反射、体温、唾液分泌、驚愕反応、呼吸、口呼吸、排尿、痙攣、立毛、下痢、瞳孔の大きさ、瞳孔反応、流涙、歩行障害、常同症、足指ピンチ、尾ピンチ、ワイヤ操作、後肢開脚、位置受動性、振せん、正の走地性、四肢回転、および聴覚機能。さらに、握力および自発運動活性を評価するための機能試験を含めた。
神経学的スクリーニングは、神経学的毒性に起因すると考えられるマウスへの被験物質関連の影響を明らかにしなかった。これらの所見は、異なるＲＮＡを使用したＬｉｐｏ－ＭＥＲＩＴ試験のために実施されたＧＬＰ準拠反復投与毒性試験ＬＰＴ Ｎｏ．２８８６４の結果によって確認された。
心血管安全性
ＲＮＡは循環中で数秒以内に分解され、ＲＮＡ（ＬＩＰ）が心血管系に蓄積する徴候はないので、ＩＣＨ Ｓ７による心血管安全性試験は行わなかった。
しかし、Ｌｉｐｏ－ＭＥＲＩＴ試験で使用された黒色腫関連抗原を標的とするＲＮＡ（ＬＩＰ）を用いたカニクイザルにおける非ＧＬＰ薬理試験からの裏付けデータが利用可能である。この試験では、１２匹のカニクイザルを６つの群で処置し（試験デザインについては表１１を参照）、４回目の投与後に、投与前、投与の完了後５時間、および投与の２４時間後の３つの時点でＥＣＧおよび血圧測定を実施した。
ＲＮＡ（ＬＩＰ）による処置は、カニクイザルにおいて非常に忍容性が高かった（臨床所見は観察されなかった）。測定したパラメータ（血圧、心拍数、ＱＴｃ値、ＱＴ間隔、Ｐセグメント、ＰＱ、ＱＲＳ）のいずれも、被験物質に関連する影響を示さなかった。さらに、心筋組織の壊死性損傷の可能性を排除するために、ＣＫ－ＭＢおよびトロポニンＩの血清レベルを測定した。測定したパラメータは全て陰性であり、試験で試験した用量レベルで心血管系へのＲＮＡ（ＬＩＰ）の毒性作用がなかったことを裏付けた。
考察および結論
マウスおよびヒトのインビトロ試験系において、ＲＮＡ（ＬＩＰ）の作用機序および一次薬力学について広範な試験を実施した。前臨床試験は、ＲＮＡ（ＬＩＰ）ワクチンがＩＶ投与後に脾臓およびリンパ組織を標的とすることを示している。ＲＮＡ（ＬＩＰ）ワクチンは、二重の効果、すなわち抗原特異的Ｔ細胞応答と細胞活性化プロセスの誘導、およびＴＬＲトリガ後の免疫調節を誘発する。
生成されたデータは、インビボで適用された全ての抗原ＲＮＡリード構造が、破傷風トキソイドヘルパーエピトープを含む抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導することを確認する。
ＲＮＡ（ＬＩＰ）製剤の機能的特性は、（ｉ）血清中のＲＮＡ保護、および（ｉｉ）抗原ペプチドを提示することができ、ＴＬＲ７トリガ後に活性化されるＡＰＣの効率的なインビボ標的化である。ＲＮＡの免疫調節活性は、ヒト試料、マウス、およびカニクイザルにおいて用量依存的なサイトカイン誘導をもたらし、これらは全て、試験した種または適用した試験系に応じて、様々な程度でＩＦＮ－α、ＩＰ－１０、およびＩＬ－６の誘導を示した。独自のＲＮＡ試験および文献からの良好な証拠があるので、ＰＢＭＣにおけるＲＮＡ（ＬＩＰ）媒介サイトカイン誘導は予想された。これらの予想とは別に、ＩＦＮ－αの中程度の誘導およびケモカインＩＰ－１０（ＣＸＣＬ１０）の誘導は、望ましくない免疫毒性学的事象よりも意図した薬理学的効果の開始を反映している可能性が高い。
マウスで生成されたデータは、脾細胞が、ＴＬＲ７－／－マウスで減少したため、ＴＬＲ７依存性であるＩＦＮ－α分泌の主要な供給源であることを示している。観察された一過性で完全に可逆的なサイトカイン応答は、ワクチン誘導性抗腫瘍Ｔ細胞応答の効率的な誘導に寄与する意図した薬力学的効果と考えられる。好ましい免疫学的特性は、マウスおよびカニクイザルにおけるＲＮＡ（ＬＩＰ）ワクチンの良好な忍容性に結び付いた。
また、ヒト、カニクイザル、およびマウス試験系を使用したいくつかのインビトロおよびインビボ試験でＲＮＡ（ＬＩＰ）ワクチンによる処置の二次的影響も検討した。ＲＮＡ（ＬＩＰ）ワクチンの免疫調節作用は、局所的な細胞活性化およびサイトカイン誘導のみをもたらした、リンパ節に投与された非製剤化ＲＮＡワクチンで観察されたものよりも強力であるため、これに特に焦点を合わせた。
ヒトおよびカニクイザルドナーからの全血試料およびＰＢＭＣを使用した実験を実施し、ＲＮＡ（ＬＩＰ）ワクチンによるヒト免疫細胞の非特異的または制御されない細胞活性化を排除したが、予想されたようにまだ中程度のサイトカイン誘導を示した。これらの実験では、ヒト細胞およびカニクイザルを、意図した最高臨床用量コホート以上をカバーする用量で処置した。
サイトカインレベルに関して、ドナー間、異なるインビトロ試験系（培養ＰＢＭＣ対全血）間、または種間で違いが見られたが、観察されたサイトカインパターンおよびサイトカイン応答の一過性の性質は、わずかな例外を除いて、例えばカニクイザルではＩＰ－１０誘導が観察されなかったことを除いて、全ての試験にわたって類似していた。ヒトＰＢＭＣは、ＩＰ－１０の誘導、ならびにＩＬ－６およびＩＦＮ－αの低い応答を示し、これらのレベルは、全血で調べた場合にさらに低かった。カニクイザルは、非常に低いＩＦＮ－α応答を示し、試験した用量レベルでＩＰ－１０誘導を示さず、より顕著なＩＬ－６応答を示した。マウスは、ＩＦＮ－α、ＩＰ－１０、およびＩＬ－６で強い応答を示したが、サルで試験した場合の約１０倍高い用量であった（体重１ｋｇ当たりの用量に基づく）。マウスとサルの間のサイトカイン発現の違いは、一方では異なる用量を試験することによって説明され得る。他方で、マウスはＴＬＲ７／８に対して異なる活性を有しており、これもまた、異なるサイトカイン発現パターンについての妥当な説明であり得る。
インビボでカニクイザルにおいて観察されたサイトカイン応答パターンは、より低い用量レベルでより広く、より高いサイトカイン応答が観察されたＰＢＭＣ試験系と比較して、全血試験系によってより良好に反映された。それでもやはり、より感受性の高いＰＢＭＣでの所見を、患者に対する安全な開始用量を定義するための戦略に組み込んだ。ヒトおよびカニクイザル全血におけるサイトカイン分泌の並列比較により、両方の種がＲＮＡ（ＬＩＰ）処置時の炎症性サイトカイン誘導に関して非常に同等であることが明らかになり、カニクイザルが患者におけるＲＮＡ（ＬＩＰ）によるワクチン接種後に生じ得る二次薬力学的効果を予測するのに適切な動物モデルであることが示唆された。
ＲＮＡ（ＬＩＰ）への曝露後の細胞活性化プロセスおよびサイトカイン誘導に加えて、ＢｉｏＮＴｅｃｈは、マウスおよびカニクイザル試験における血液学的変化を評価した。ここで、一過性リンパ球減少症が、全ての用量レベルでマウスおよびサルにおいて等しく観察された。全体として、ＲＮＡ（ＬＩＰ）で処置したサルは、他のＴＬＲアゴニストで処置したサルで観察されたのと同様のサイトカインプロフィールおよび血液学的パラメータの反応を示す。これは、ＲＮＡ（ＬＩＰ）によるサイトカイン発現の主な活性化プロセスがＴＬＲ刺激を介して起こるという仮定と一致する。野生型、ＴＬＲ７－／－およびＩＦＮＡＲ－／－マウスにおける広範な薬力学試験は、血液学的所見がＲＮＡ（ＬＩＰ）誘導サイトカインの二次的影響であることを示唆する。ＲＮＡ（ＬＩＰ）および製剤化されていない裸のＲＮＡがＴＬＲを活性化できることが示されている。ＴＬＲ活性化は、リンパ球減少症および脾臓におけるＢ細胞蓄積を誘導することが示されている。支持的に、毒性試験で生成された組織病理学データは、一過性のリンパ過形成が脾臓に見られるが、他の臓器または組織には見られないことを示した。これは、血液中で観察されたリンパ球減少症と一致しており、ＲＮＡの意図した標的化（ＬＩＰ）、およびその後のエフェクタ細胞のリンパ器官への意図した誘引も強調する。
実施した安全性薬理試験は、ＲＮＡ（ＬＩＰ）の安全なプロフィールを示唆する。神経学的スクリーニングは、実施した試験のいずれにおいても、マウスへの被験物質関連の影響を明らかにしなかった。試験した肺パラメータのいずれも、ＲＮＡ（ＬＩＰ）で処置したマウスにおいて変化を示さなかった。カニクイザルでは、心血管作用の徴候はなかった。全体として、ＲＮＡ（ＬＩＰ）は、安全性薬理パラメータに関して非常に良好な全体的安全性プロフィールを示す。
セクション５：薬物動態
薬物動態試験は通常、癌ワクチンの開発中には実施されないが、静脈内注射したＲＮＡリポプレックスの生体内分布、および医薬品中の不純物に起因する残留プラスミド量の存在または持続性を決定するためにインビボ試験を実施した。
インビトロ転写ＲＮＡはリボヌクレオチドからなり、したがって、５'キャップ構造を除いて、人体の細胞によって合成されるＲＮＡと構造が同一である。したがって、ＲＮＡは、天然のｍＲＮＡと同じ分解プロセスを受ける。特に細胞外空間および血清では、豊富なＲＮアーゼがＲＮＡの急速な分解をもたらす。
以下に概説するように、脾臓、肝臓、および肺におけるＲＮＡの分布／性質および潜在的蓄積を薬物動態学試験で検討した。さらに、ＲＮＡ（ＬＩＰ）で処置したマウス由来の性腺における潜在的なプラスミドＤＮＡ不純物を定量化した。
合成カチオン性脂質ＤＯＴＭＡの生体内分布および持続性は、最初のインビボ試験で調査されている。合成ＤＯＰＥは、身体自身の天然リン脂質ＤＯＰＥと区別することができず、天然の代謝経路に従うはずであり、したがって、生体内分布および蓄積はさらには調査しなかった。
Figure 2022525103000057
生体内分布
ＲＮＡ
臨床試験Ｌｉｐｏ－ＭＥＲＩＴのために実施されたＧＬＰ反復投与毒性試験（ＬＰＴ Ｎｏ．２８８６４）中に臓器をサンプリングすることによって、ＲＮＡ（ＬＩＰ）の生体内分布をマウスにおいて詳細に検討した。臓器を、非ＧＬＰ条件下で、ＩＭＧＭ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＧｍｂＨ，Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙで開発された定量的リアルタイム逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）法を適用して全てのＩＶＴ－ＲＮＡの合計について分析した（試験ＩＤ：ＲＳ２９７）。要約すると、ＲＮＡは、約５分の推定半減期で血液から非常に迅速に除去された。４８時間後および７日後、ＲＮＡは血液および臓器中で限界レベルでのみ検出可能であり、急速に分解されて持続しないことを示唆した。
残留プラスミド不純物
ＲＮＡ（ＬＩＰ）ワクチン接種からの残留プラスミド不純物の生体内分布を、ＧＬＰ反復投与毒性試験（ＬＰＴ Ｎｏ．２８８６４）からの試料を使用して調査した。ＢｉｏＮＴｅｃｈ ＩＭＦＳ ＧｍｂＨ（Ｉｄａｒ－Ｏｂｅｒｓｔｅｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で、ＧＬＰに準拠して、臓器試料中の残留プラスミド不純物を分析するための方法を開発した。全ての試験試料は、検出下限（ＬＬＯＤ）を下回るか、またはわずかに上回り、プラスミドＤＮＡが性腺に蓄積または持続しないことを示唆した（試験ＩＤ：３６Ｘ１３０３１３）。
ＤＯＴＭＡ
ＲＮＡ（ＬＩＰ）製剤に使用される２つの合成脂質の生体内分布は、リポプレックス担体粒子の物理的分布への洞察を経時的に提供することができる。合成カチオン性脂質ＤＯＴＭＡは、天然に存在する分子ではなく、したがって生物学的マトリックスのバックグラウンドで容易に検出できるため、生体内分布試験のために選択した。
ＤＯＴＭＡ生体内分布の探索的調査では、マウスへのＲＮＡ（ＬＩＰ）のＩＶ注射後に収集した血液および７つの選択した臓器から脂質を抽出した。ここでは、ＡＴＭ品質のリポソーム製剤化ＩＶＴ－ＲＮＡの等量の混合物を使用した。この最初の試験には５匹のマウスが含まれ、そのうち１匹は未処置のままにし、２匹には６０μｇ ＲＮＡを単回注射し、２匹には２０日の間隔で各６０μｇのＲＮＡを２回注射した。最後の注射の時点の２４時間後に全てのマウスを犠死させた。ＬＣ／ＭＳ測定によってＤＯＴＭＡの定量化を行った。実験の目的は、抽出および定量化プロトコルの一般的な実現可能性を試験し、ＲＮＡ（ＬＩＰ）ワクチン接種後のＤＯＴＭＡの生体内分布に関する最初のヒントを得ることであった。
ＤＯＴＭＡは、調査した全ての臓器から明確に決定することができ、異なる臓器での所見間に顕著な相違を観察することができた。提案された作用機序と一致して、最も高いＤＯＴＭＡ所見は脾臓においてであった。
これらの最初の結果に基づいて、ＲＮＡ（ＬＩＰ）の単回投与による試験を実施した（Ｒｅｐｏｒｔ＿ＢＮ＿１４＿００４）。選択した臓器におけるＤＯＴＭＡ濃度を最大２８日間（ｄ０、ｄ１、ｄ４、ｄ７、ｄ１４、ｄ２１、およびｄ２８）にわたって評価した。この実験では、２０μｇのＲＮＡおよび２６μｇのＤＯＴＭＡを含む２００μＬのＲＮＡ（ＬＩＰ）を投与した（最初の試験では、注射ごとに６０μｇを投与した）。投与した生成物中のＤＯＴＭＡ濃度は１９５μＭであった。時点ごとに３匹のマウスを調査した。
明らかに、ＤＯＴＭＡは主に脾臓および肝臓で見られ、わずかに異なる蓄積動態を示した。調査した他の全ての臓器／組織（肺、心臓、腎臓、リンパ節、脂肪体、骨髄、脳）では、所見はそれよりも１０～５０倍低かった。肝臓および脾臓のデータから、ＤＯＴＭＡの薬物動態を推定することができた：最大濃度は投与の数日後に検出された。２０日以内に、ＤＯＴＭＡ濃度は最大値の約５０％に減少した。これらの所見は、ＤＯＴＭＡが許容される時間スケール内で臓器から除去され、どの臓器にも永続的に蓄積するリスクの徴候は見出せないという仮定を裏付ける。
その後の試験では、選択した臓器におけるＤＯＴＭＡの濃度を、それぞれ２０μｇのＲＮＡ（ＲＢＬ００５．２）および２６μｇのＤＯＴＭＡ（Ｒｅｐｏｒｔ＿ＲＢ＿１５＿００４＿Ｖ０２）を含む８回の毎週のＲＮＡ（ＬＩＰ）注射の前（対照群）、注射中、および注射後に評価した。最初のＲＮＡ（ＬＩＰ）投与の１時間後、次いで先の適用後１週間おきにマウスから臓器をサンプリングした。８回の適用サイクルの完了後、臓器のＤＯＴＭＡクリアランスを調べるために、さらに３、６、９、１２、および１５週間後にマウスを犠死させた。ＲＮＡ（ＬＩＰ）被験物質の反復投与および臓器サンプリングは社内で実施したが、提供された臓器試料からのＤＯＴＭＡの抽出および定量化はＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ Ｌｔｄ．によって行われた（試験Ｎｏ．３２２９１５）。結果は、本発明者らが実施した以前の試験とよく一致していた：ここでも、最も高いＤＯＴＭＡ濃度は、主要な標的臓器としての脾臓、続いて肝臓で観察された。他の全ての臓器では、脾臓試料中に存在する濃度の約５％以下が見出された（データは示していない）。ＤＯＴＭＡ濃度は、ＲＮＡ（ＬＩＰ）注射回数の増加と共に上昇し、最後の適用後の回復期に継続的に低下した。血漿（７．０７週間）、脾臓（６．７６週間）、および肝臓（６．５７週間）におけるＤＯＴＭＡの終末半減期は、８回目の投与後の回復期間に動物から得られたものと同等であった。
要約すると、脂質ビヒクルの指標としてのＤＯＴＭＡは、ＩＶ ＲＮＡ（ＬＩＰ）投与後に脾臓（および他の臓器）に迅速に（１時間未満で）送達される。脾臓に加えて、ＤＯＴＭＡは主に肝臓に蓄積するが、ＲＮＡの翻訳は観察されない。絶対数では、これらの２つの臓器で見出されたＤＯＴＭＡの量は、絶対的に注入されたＤＯＴＭＡの総累積量に近かったが、他の全ての臓器試料中のＤＯＴＭＡ量はごくわずかであった。
回復期群の動物から評価されるように、反復ＲＮＡ（ＬＩＰ）適用後の蓄積されたＤＯＴＭＡは、６～７週間程度のおおよその半減期を有する一次減衰によって合理的に表すことができる動態で臓器から除去される。そのようなクリアランス速度論はまた、一時的な蓄積が観察された反復適用からの所見と一致する。
全ての結果を総合すると、これらの所見は、ＤＯＴＭＡが許容される時間枠内で臓器から除去され、血漿、肝臓、脾臓、肺、心臓、脳、腎臓、子宮、リンパ節、および骨髄における永続的な脂質蓄積の潜在的リスクがかなり低いという仮定を裏付ける。
考察および結論
リボヌクレオチドからなるＩＶＴ－ＲＮＡは、人体の細胞によって産生されるＲＮＡと同一の構造を有し、５'キャップだけが異なる構造である。したがって、ＩＶＴ－ＲＮＡは、天然のｍＲＮＡと同じ分解プロセスを受ける。特に細胞外空間および血清では、豊富なＲＮアーゼがＲＮＡの急速な分解をもたらす。
ＲＮＡ（ＬＩＰ）の生体内分布試験の結果は、ＲＮＡ（ＬＩＰ）の注射直後の血中の高レベルのＲＮＡを示す。ＲＮＡは血液から急速に除去され、その後、はるかに低いレベルではあるが、脾臓および肝臓で見出され、肺ではごくわずかな量しか見出されなかった。肝臓に分配されたＲＮＡは、ＴＬＲトリガを介して一過性の免疫活性化をもたらし得るので、肝臓酵素は、最初の注射後および試験全体を通して患者において厳密に監視される。４８時間後および７日後、血液および臓器中には残存量のＲＮＡのみが見出され、ＲＮＡがいずれの臓器にも蓄積または持続しないことを示唆した。１回目および８回目の注射後のＣｍａｘレベルの比較も、蓄積効果を示さなかった。
性腺では、プラスミドＤＮＡが検出されなかったか、または試料がＬＬＯＤをわずかに上回っており、プラスミド残基、例えばカナマイシン耐性遺伝子が生殖細胞のゲノムに組み込まれるリスクはわずかであることが示唆された。
ＤＯＴＭＡの生体内分布は、主に脾臓および肝臓に見出されることが示されており、脾臓がＲＮＡ（ＬＩＰ）ワクチン接種の主な標的臓器であり、ＲＮＡ（ＬＩＰ）の単回投与および８回の反復投与後に血漿および他の組織での曝露が有意に低いことが確認された。ＤＯＴＭＡは、血漿、脾臓、および肝臓から６～７週間程度の同等の終末半減期で除去された。ＤＯＴＭＡの生体内分布および蓄積に関するより体系的な分析は、高度な臨床試験の前に実施される。
セクション６：毒性学
ＲＮＡワクチンプラットフォームの毒性プログラムには、様々な用量範囲にわたるＲＮＡ（ＬＩＰ）ワクチン接種を試験するためのいくつかの薬理学的試験、局所耐性および安全性薬理パラメータを含む反復投与毒性試験、ならびに免疫毒性調査が含まれた。試験は、製造工程および分析品質管理の点で臨床試験材料に匹敵するＲＮＡおよびリポソームバッチを使用して、外部ＣＲＯ（ＬＰＴ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でＧＬＰ条件に準拠して実施された。
ＧＬＰ準拠試験には、Ｃ５７ＢＬ／６マウスへの乳癌抗原をコードする８つの異なるＲＮＡ ＤＰのＩＶ投与による６週間の反復投与毒性試験が含まれた（ＬＰＴ Ｎｏ．３０２８３）。
さらに、多数の黒色腫特異的抗原を標的とするＲＮＡワクチンプラットフォームを使用して、補足的なＧＬＰ準拠６週間反復投与毒性試験を実施した（ＬＰＴ Ｎｏ．２８８６４）。様々なＲＮＡ配列を試験したが、毒性データはＴＡＡをコードするＲＮＡ ＤＰの適用にも関連しており、同じタイプのリポソームをＲＮＡ（ＬＩＰ）調製に使用したので、重要な情報を追加することができる。両方の試験における製剤化ＲＮＡの毒性プロフィールは、起こり得る副作用が、ＲＮＡ配列および長さに依存しないリポソーム製剤化ＲＮＡの固有の分子特性に関連するという事実のために、同じかまたは少なくとも同等であると考えられる。
さらに、さらなる４週間反復投与毒性試験を実施して、６週間の反復投与毒性試験で使用したリポソームと、長期安定性の理由から緩衝液条件をわずかに調整したｐＨ適合リポソーム製剤との比較可能性を評価した（ＬＰＴ Ｎｏ．３０５８６）。
Figure 2022525103000058
関連種の選択
以下の主な理由に基づいて、ＲＮＡ（ＬＩＰ）ワクチンの潜在的に毒性の直接作用を試験するための関連種としてマウスを検討する。
モデル系としてのマウスは、ＴＡＡをコードするＲＮＡ ＤＰの直接の毒性作用を特徴付けることに関連する自然免疫および適応免疫の全ての関連特徴を提供する。マウスは、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の誘導から、免疫応答を増強し、その後のＴＬＲトリガ、細胞活性化、およびサイトカイン分泌をもたらす免疫調節作用まで、全ての予想される一次および二次薬理学的効果を示す。
マウス系は、他の種での実験可能性をはるかに上回る、生物学的効果の調査のための豊富な利用可能なツールおよび技術を含む（例えば、トランスジェニックマウスモデル、ＭＨＣ四量体、抗体などの利用可能性）。これにより、全ての予期しない事象のより深い分析が可能になる。
ワクチンのオンターゲット効果は、動物種では十分に調査することができない。したがって、他の動物種の使用は追加の情報を提供せず、その結果として、高等哺乳動物の使用は考慮されるべきではない。
単回投与毒性学
用量範囲設定試験は、通常、極めて重要な毒性試験のための用量を正当化し、標的臓器および毒性の徴候についての最初の情報を得るために実施される。意図する臨床レジメンと同様のスケジュールで様々な用量範囲にわたってＲＮＡ（ＬＩＰ）を試験するために、いくつかの薬理学的試験を実施した。これらの試験中に、ＲＮＡ（ＬＩＰ）の投与は、好ましい薬力学的効果を誘導し、十分に忍容されることが見出された。
さらに、以前の毒性試験は、ＩＶ投与した裸のＲＮＡが高用量でもマウスにおいて非常に良好に忍容されることを示した。合成脂質成分としてＤＯＴＭＡまたはＤＯＰＥのいずれかを含むリポソームが多くの臨床試験で試験され、いくつかの承認されたリポソーム医薬品は非常に良好な忍容性を証明した。いくつかのリポソーム製剤は、薬物特異的毒性、例えば、高用量での核酸の腎毒性もしくは肝毒性、またはドキソルビシンもしくはクロファジミンなどの小分子の毒性を低減するために適用されてきた。
一連の社内試験および文献の研究によって生成されたデータから以下が結論付けられた：
ヒトでの使用の最初の投与に十分な安全域を提供するマウスにおける耐容用量は、実施した薬理学試験から推定することができる。
単回投与は、有意な免疫応答を誘導するのに十分ではない。少なくとも３回の適用後に最大の免疫応答が観察された。
ＲＮＡワクチンおよびリポプレックス製剤は、一般に忍容性が良好である。
これらの結論に基づいて、単回投与毒性試験をせず、直接反復投与毒性試験を実施することを決定しした。
反復投与毒性学
ＲＮＡワクチンプラットフォームのＲＮＡ（ＬＩＰ）生成物を、ＲＮＡ（ＬＩＰ）生成物のＩＶ注射に対処するいくつかのＧＬＰ準拠反復投与毒性試験において安全性および毒性について分析した。表１３は、ＲＮＡ（ＬＩＰ）ワクチンを使用した臨床第１相および第２相試験を支持するＧＬＰ反復投与毒性試験の概要を提供する。
Figure 2022525103000059
ＡＴＭ製剤
ＡＭＴの組成、製剤、および仕様は、ヒトでの使用を意図した医薬品に可能な限り近くなるように計画した。
以下の理由により、ＲＮＡ（ＬＩＰ）調製工程に小さな変更を加えなければならなかった：
潜在的な用量依存的毒性作用を捕捉する可能性を高め、それによってガイドラインＩＣＨ Ｓ６またはＭ３（Ｒ２）に概説されている毒性試験の基準を満たす高用量を得るため。
ゆっくりとしたボーラス注射で２５０μＬの容量であるマウスでの実行可能な最大容量を超える投与を防止するため。より高い注射容量は、倫理的に推奨されず、注射中にマウスを失うリスクがあった。
臨床プロトコルとの違いは次のとおりである：
患者は、様々なＲＮＡ（ＬＩＰ）生成物を連続的に摂取する。これは、体積に制限があるため、マウスでは不可能であった。マウス用のＲＮＡ（ＬＩＰ）は、個別に調製し、次いで混合し、４つ全てのＲＮＡリポプレックスを２５０μＬの総容量で同時に注射した。
患者の処置のためのＲＮＡ（ＬＩＰ）の製剤には、１５０ｍＭ ＮａＣｌが使用される。毒性試験でより高い用量を得るために、より高濃度のＮａＣｌ溶液をＲＮＡ（ＬＩＰ）形成に使用しなければならなかった。
患者の処置のためのＲＮＡ（ＬＩＰ）の調製には、０．２５ｍｇ／ｍＬの濃度のＲＮＡ医薬品が使用される。毒性試験で高用量を得るために、より高濃度のＲＮＡ、すなわち１ｍｇ／ｍＬを試験ＬＰＴ Ｎｏ．２８８６４のＲＮＡ（ＬＩＰ）生成物の調製に使用しなければならなかった。
この試験では、以前に使用された、同等に製造された酢酸安定化リポソーム（Ｌ２）に対して半分に濃縮された酢酸安定化リポソーム（Ｌ４）が適用される。Ｌ２リポソームと同じ特性が示されているので、さらなるブリッジング試験は計画されなかった。
ＡＴＭでの製剤化プロトコルに対する上記の変更は、試験の結果または実施に全くまたはほとんど影響を及ぼさないというのが本発明者らの立場である。
試験デザイン
試験デザインについては表１３を参照。ＩＣＨ Ｓ６およびＳ８に従って、標準的な毒性試験からのデータを免疫毒性の可能性の徴候について評価した。以下の調査を、ＦＤＡ、ＩＣＨ、およびＣＨＭＰのガイダンス文書に従って実施した：死亡率、組織病理学（特に脾臓）、肉眼的病理学、および臓器重量、臨床観察、眼科学、局所耐性、注射部位反応、体重、食物消費量、標準的な血液学パラメータ、ならびに臨床化学およびサイトカイン（ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＴＮＦ－α、ＩＮＦ－α、ＩＮＦ－γ、およびＩＰ－１０）。
セクション４に概説されているように、呼吸器系および中枢神経系について試験するために安全性薬理学試験を含めた。
結果
ワクチンプラットフォームを使用した６週間の反復投与毒性試験における毒性評価は、ＲＮＡ（ＬＩＰ）の予想される薬理学的作用機序に主に起因し得るわずかな影響のみを明らかにした（表１４）。ＲＮＡ（ＬＩＰ）の望ましい免疫調節作用は、ＴＬＲ活性化およびサイトカインの放出である。マウスにおけるＩＦＮ－αの誘導は、ＩＦＮ－αで処置された患者について一般的に記載されている影響である、白血球減少症、血小板の減少、およびＡＬＡＴなどの肝臓パラメータの増加のような二次的影響をもたらす。
これと一致して、処置動物における被験物質関連の変化は主に一過性であった（表１４）。さらに、サイトカインＩＰ－１０、ＩＦＮ－α、ＩＬ－６、およびＩＦＮ－γの一過性の活性化が観察された。全ての誘導は、２４時間後に正常レベルに戻った（依然として正常レベルをわずかに上回っていたＩＰ－１０レベルは別として）。
マウスの血液学的所見には、主にリンパ球減少症ならびに全ての処置群における総白血球、好中球、網状赤血球の低い可逆的減少および血小板減少症が含まれた。これらの所見は完全に可逆的であった。組織病理学で脾臓について観察されたリンパ過形成は完全に回復し、所望の効果および脾臓への試験物質とリンパ球の意図した標的化の概要を示している。
ＧＬＤＨ、ＬＤＨ、ＡＬＡＴ、およびＡＳＡＴなどの肝臓パラメータの観察された軽度の変化は、主に高用量群に影響を及ぼし、回復群の動物では認められず、少なくとも３週間以内に作用が完全に回復したことを示唆した。組織病理学では肝臓毒性は検出されなかった。
試験ＬＰＴ Ｎｏ．３０２８３の低用量群では所見がなかったため、動物あたり５μｇの総ＲＮＡ（すなわち、マウスで約０．２ｍｇ／ｋｇ体重）の用量で無毒性量に達した。
リポソーム緩衝液の組成の変化に対処するために、さらなる４週間の反復投与毒性試験を実施した（ＬＰＴ Ｎｏ．３０５８６）。データは、新しいタイプのリポソームが、測定したパラメータにおいて、主試験で使用したものと完全に同等であることを証明している。
表１４：ＲＮＡ（ＬＩＰ）を使用した反復投与毒性試験における毒性学的所見の概要（ＬＰＴ Ｎｏ．２８８６４、３０２８３、および３０５８６）。
記載されている全ての所見は、対照群と比較して統計的に有意であった。
Figure 2022525103000060
Figure 2022525103000061
Figure 2022525103000062
遺伝毒性
ＲＮＡ（ＬＩＰ）生成物の成分（脂質およびＲＮＡ）は、遺伝毒性の可能性があるとは考えられていない。送達システムの不純物または成分に遺伝毒性試験を正当化するものはない。バイオテクノロジー由来医薬品の前臨床安全性評価に関するＩＣＨガイドラインＳ６（Ｒ１）（２０１１年６月）に示されている推奨に従って、遺伝毒性試験は計画されていない。
発癌性
ビヒクルとして使用されるＲＮＡ自体および脂質には、発癌性または腫瘍形成性の可能性はない。ＩＣＨ Ｓ１Ａに従って、実験室検査および毒性試験に由来する懸念の原因がなく、薬物の慢性適用が予想されない場合、長期発癌性試験は必要ではない。
生殖および発生毒性
雄性および雌性の生殖組織の肉眼的および顕微鏡的評価を、ＲＮＡ（ＬＩＰ）で処置したマウスにおける反復投与毒性試験に含めた。これらの試験では所見は認められず、したがって、ＲＮＡ（ＬＩＰ）ワクチンを用いた第１相試験の開始前に特定の生殖能および発生毒性試験は実施しない。生殖組織への直接的な細胞毒性作用は、生殖および発生への影響を示さない他の癌ワクチンからの経験によって裏付けられるように、ＲＮＡ（ＬＩＰ）では予想されない。生殖への影響を排除することはできないので、妊娠可能な女性は、処置中に有効な避妊法を使用しなければならない。この時点では、さらなる長期または生殖毒性試験は計画されていない。
局所耐性
ＩＣＨの推奨に従って、ＩＶ注射のためのＧＬＰ反復投与毒性試験において局所耐性の試験を評価した。試験中に局所不耐性の徴候は観察されなかった。
その他の毒性試験
抗原性
数秒から数分以内のＩＶＴ－ＲＮＡの迅速な細胞外分解のために、抗薬物抗体（ＡＤＡ）の形成は予想されない。したがって、抗体誘導に関する特異的抗原性試験は計画されていない。
免疫毒性
ＲＮＡ（ＬＩＰ）生成物によって免疫系を活性化することが意図されているので、意図しない活性化または抑制を排除するために免疫毒性パラメータに特に注意を払った。免疫毒性学の検査を、６週間の反復投与毒性試験（ＬＰＴ Ｎｏ．２８８６４および３０２８３）の両方で実施した。血清中のサイトカインレベルを監視することに加えて、免疫毒性を評価するために以下の関連パラメータを考慮した：体重、体温、リンパ器官の重量、リンパ器官の肉眼的および組織病理学、絶対的および相対的示差血球数、総血清タンパク質、アルブミン／免疫グロブリン比、骨髄中の骨髄球／赤芽球比、凝固パラメータ。
血液学
リンパ球、白血球数（主にリンパ球の減少による）および血小板の減少が、両方の試験で８回目の注射の約２４時間後の試験４４日目に全ての処置群で観察された。全ての作用が２週間後に完全に回復した。結果を、試験ＬＰＴ Ｎｏ．２８８６４および３０２８３についてそれぞれ表１５および表１６に示す。
表１５：血液学データ（ＬＰＴ Ｎｏ．２８８６４）。
血液学的測定のための試料を試験４４日目（８回目の注射の約２４時間後）に採取した。
Figure 2022525103000063
表１６：血液学データ（ＬＰＴ Ｎｏ．３０２８３）。
血液学的測定のための試料を試験４４日目（８回目の注射の約２４時間後）に採取した。
Figure 2022525103000064
サイトカインの測定
反復投与毒性試験において、以下のサイトカインの排出を分析した：免疫活性化またはＴＬＲ７シグナル伝達の感受性の高い指標であることが公知のＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ７０、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、およびＩＰ－１０。毒性試験ＬＰＴ Ｎｏ．２８８６４において、マウスは、サイトカインＩＰ－１０の用量依存的および被験物質関連の増加を示した。ＩＰ－１０レベルは一過性に増加し、４回目の注射の６時間後に最も高かった。２４時間後、レベルは対照レベルと比較して依然として有意に高かったが、既にほぼ正常レベルに戻っていた。対照群と比較して、ＩＰ－１０は、６時間後に２８倍および１６倍（それぞれ雄性および雌性）の最大誘導を示した。ＴＮＦ－α（雌性のみ、群２、３および４）、ＩＬ－１０（雌性のみ、群３および４）、ＩＬ－６（雄性、群４）、ならびにＩＦＮ－γ（雄性、群４）についても有意な増加が観察された。最大誘導は、ＴＮＦ－αでは３倍、ＩＬ－１０では４倍、ＩＬ－６では７倍および８倍、ならびにＩＦＮ－γでは６倍および２倍であった。全ての作用は、２４時間後に完全に可逆的であった（群４の雌性におけるＴＮＦ－αレベルを除く）。結果を表１７に要約する。
表１７：血漿中のサイトカインレベル（ＬＰＴ Ｎｏ．２８８６４）。
サイトカイン測定用の試料を、４回目の注射の６時間後および２４時間後に採取した。
Figure 2022525103000065
試験ＬＰＴ Ｎｏ．３０２８３におけるサイトカイン測定のために、５回目の注射の６時間後および２４時間後に血清試料を採取した。ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＰ－１０、ＩＦＮ－α、およびＩＦＮ－γの血清レベルの上昇が見られた（表１８）。明らかに用量依存的な誘導がＩＬ－６について認められた。ＩＦＮ－γについては、高用量処置後に誘導が認められ（ｐ≦０．０１で統計的に有意）、雄性動物でより顕著であった。ＩＦＮ－αについては、低用量処置後および高用量処置後に誘導が観察され（ｐ≦０．０１またはｐ≦０．０５で統計的に有意）、群５（ＲＮＡセット２、高用量）の雌性動物でより顕著であった。上記の全てのサイトカインの誘導は、投与後２４時間には治まっていた。
ＩＬ－２の比較的低いが用量に関連する誘導が、低用量または高用量処置の６時間後および２４時間後に雄性および雌性動物で認められた。
高用量処置の６時間後の対照群と比較して、顕著な用量依存作用が雄性および雌性動物の全ての用量レベルでＩＰ－１０について検出された。投与後２４時間で、ＩＰ－１０レベルは、全ての用量レベルで対照群と比較して依然として増加していた。ＩＰ－１０のこの誘導は、意図した薬理学的効果を反映しており、望ましくない免疫毒性事象とは見なされない。
表１８：血漿中のサイトカインレベル（ＬＰＴ Ｎｏ．３０２８３）。
サイトカイン測定用の試料を５回目の注射の６時間後および２４時間後に採取した。
Figure 2022525103000066
Ｌ１およびＬ２リポソームを比較する試験（ＬＰＴ Ｎｏ．３０５８６）の過程でサイトカインの測定も実施した。ここでは、４回目の免疫の６時間後および２４時間後にサイトカインを分析した。群間で被験物質関連の変化は認められなかった。
考察および結論
３つの異なる反復投与毒性試験（ＬＰＴ Ｎｏ．２８８６４、３０２８３、および３０５８６）で評価した多数の抗原コードＲＮＡについて示されているように、ＲＮＡ（ＬＩＰ）による処置はマウスにおいて良好に忍容される。全体として、最大８回のＩＶ注射による処置は、高用量群の動物においても十分に忍容性であった。試験Ｎｏ．３０２８３および３０５８６では、被験物質に関連する早期死亡は観察されなかった。試験Ｎｏ．２８８６４での被験物質の投与後、１匹の動物が早期死亡した。試験Ｎｏ．３０２８３の低用量群では所見がなかったため、動物あたり５μｇの総ＲＮＡ（すなわち、マウスでは約０．２ｍｇ／ｋｇ体重）の用量で無毒性量に達した。さらに、ＲＮＡ（ＬＩＰ）生成物によるワクチン接種も、１２匹のカニクイザルにおける非ＧＬＰ薬理試験で非常に忍容性が高かった（臨床所見なし）。
マウスでの反復投与毒性試験におけるＲＮＡ（ＬＩＰ）の毒性評価により、被験物質に起因し得るサイトカインの一過性誘導、血液学的変化、および肝臓酵素の上昇を含む作用が明らかになった。観察された作用は、主に、本明細書で報告されたインビボ試験、ならびに上記で記載および考察されたインビトロ試験におけるサイトカインＩＰ－１０、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ、およびＩＬ－６の誘導であった。
注目すべきことに、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、またはＩＬ－２などの炎症性サイトカインはいずれも、マウスにおいて過度に上方制御されなかった。しかしながら、カニクイザル試験では、少なくとも１匹の動物がＩＬ－６の高い一過性誘導（１，０７６ｐｇ／ｍＬ）を明らかにした。ＩＬ－６誘導は、マウスでも用量依存的に観察されたが、より低い程度であった。ＩＬ－６は、他のサイトカインと共に、臨床試験を通じて注意深く監視され、患者において直接分析される。
リンパ球減少症および肝臓酵素上昇などの作用も、プラスミドリポプレックスによる処置後、ならびにマウスおよびサルにおけるＴＬＲ活性化によって報告され、いくつかの腫瘍性および非腫瘍性疾患の処置のために長年にわたって市販されている組換えＩＦＮ－αで処置された患者について一般的に記載されているＩＦＮ－α分泌によって引き起こされる二次的影響として一般的に観察される。
マウスにおける高用量群の肝臓パラメータの観察された変化は、肝臓がより高用量のリポソーム製剤化ＲＮＡでの毒性の標的であり得ることを示唆する。変化には、肝臓重量の増加、血漿中のＧＬＤＨ、ＬＤＨ、ＡＳＡＴ、およびＡＬＡＴレベルの増加が含まれる。これらの変化は軽度と見なされ、回復群の動物では観察されず、少なくとも３週間以内に作用が完全に回復することを示唆した。さらに、組織病理学は肝臓毒性を明らかにしなかった。カニクイザルでは、対照動物と比較したリポソーム処置群の動物および被験物質処置動物の生化学的パラメータは、正常な生物学的変動の範囲内にあると見なされた。試験９、１６、または２３日目の対照動物と比較して、群４、５、または６の個々の動物で認められたＣＫの増加は、主にＣＫ－ＭＭ画分に起因し、ストレス関連と見なされた。
マウスにおける肝臓パラメータの軽度の上昇は、クッパー細胞などの肝臓標的細胞によるＲＮＡ（ＬＩＰ）の食作用によって引き起こされ得る免疫調節作用による反応である可能性がある。マウスの脾臓で観察される作用（リンパ過形成）とは対照的に、これは肝臓への白血球の動員をもたらさず、ＴＬＲ活性化およびリンパ球輸送などの所望の薬理学的効果がリンパ器官に限定されることを示唆する。
補体活性化は、リポソーム製剤化物質について以前に報告されている。ＲＮＡ（ＬＩＰ）ワクチン接種については、Ｃ５ａレベルのわずかな上昇が雌性マウスで観察されたが、これは生物学的関連性の低い事象と見なされた。さらに、マウスは、補体作用のヒトへの外挿のための良好なモデルとは見なされていない。
全体として、３つ全てのＲＮＡ（ＬＩＰ）反復投与毒性試験（ＬＰＴ Ｎｏ．２８８６４、３０２８３、および３０５８６）で見られた免疫学的応答は、脾臓重量の増加、サイトカイン／ケモカイン活性化、およびリンパ球輸送からの包括的な全体像を示唆する。これは、意図した薬理学的事象の誘導を反映しており、毒性試験の正しい試験モデルとしてのマウスの妥当性を強調する。ｐＨ適合Ｌ２リポソーム製剤の毒性を評価するブリッジング試験ＬＰＴ Ｎｏ．３０５８３では、２つのリポソーム製剤間で注目すべき違いは観察されなかった。この試験では、半分に濃縮したＬ２リポソームであるＬ４ ｐＨ適合リポソームを適用する。Ｌ２リポソームと同じ特性が示されているので、さらなるブリッジング試験は計画されなかった。
（実施例３）
ＫＬＫ２、ＫＬＫ３、ＡＣＰＰ、ＮＫＸ３－１およびＨＯＸＢ１３をコードするＲＮＡによる脾臓での抗原特異的Ｔ細胞の誘導
１日目、８日目、１５日目、および２２日目に、Ａ２／ＤＲ１マウスを、３０μｇ ＲＮＡ（Ｌｉｐ）に対応する２００μＬの０．１５ｍｇ／ｍＬ ＲＮＡ（Ｌｉｐ）溶液で免疫化した。
４回のＲＮＡ（Ｌｉｐ）注射の最後の５日後に、免疫化したＡ２／ＤＲ１マウスから脾細胞を得て、抗原特異的Ｔ細胞のインビボ誘導をＥＬＩＳＰＯＴ分析によって決定した。免疫原性を試験するために、単離した脾細胞を、それぞれのヒトタンパク質、ＫＬＫ２、ＫＬＫ３（ＰＳＡ）、ＡＣＰＰ（ＰＡＰ）、ＮＫＸ３－１またはＨＯＸＢ１３にわたるペプチドプール（１５量体、１１アミノ酸が重複）で再刺激した。結果を図２０に示す。ＫＬＫ２、ＡＣＰＰ、およびＨＯＸＢ１３をコードするＲＮＡ（Ｌｉｐ）によって誘導されたＩＦＮ－γ＋スポット数は、対応のないｔ検定によれば、対照ペプチドＣＭＶ ｐｐ６５での再刺激と比較して統計的に高かった（Ｐ＝０．００５６；Ｐ＞０．０００１；Ｐ＝０．００９５）。全ての免疫化マウスにおいて、対照Ｐ２／Ｐ１６／Ｐ１７ペプチドによる脾細胞の再刺激もまた、高いスポット数をもたらし、免疫化の成功を示した。全てのＥＬＩＳＰＯＴプレートで、脾細胞が由来する動物にかかわらず、陰性対照培地のみでは最小限のスポット数しか誘導されなかった。

Claims (85)

  1. 少なくとも１つのＲＮＡを含む組成物または医薬製剤であって、前記少なくとも１つのＲＮＡが、以下のアミノ酸配列：
    （ｉ）カリクレイン２（ＫＬＫ２）、その免疫原性変異体、または前記ＫＬＫ２もしくは前記その免疫原性変異体の免疫原性断片を含むアミノ酸配列；
    （ｉｉ）前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、その免疫原性変異体、または前記ＰＳＡもしくは前記その免疫原性変異体の免疫原性断片を含むアミノ酸配列；
    （ｉｉｉ）前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、その免疫原性変異体、または前記ＰＡＰもしくは前記その免疫原性変異体の免疫原性断片を含むアミノ酸配列；
    （ｉｖ）ホメオボックスＢ１３（ＨＯＸＢ１３）、その免疫原性変異体、または前記ＨＯＸＢ１３もしくは前記その免疫原性変異体の免疫原性断片を含むアミノ酸配列；および
    （ｖ）ＮＫ３ホメオボックス１（ＮＫＸ３－１）、その免疫原性変異体、または前記ＮＫＸ３－１もしくは前記その免疫原性変異体の免疫原性断片を含むアミノ酸配列
    を含む、組成物または医薬製剤。
  2. 前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、または（ｖ）のアミノ酸配列のそれぞれが、別個のＲＮＡによってコードされている、請求項１に記載の組成物または医薬製剤。
  3. （ｉ）前記（ｉ）のアミノ酸配列をコードする前記ＲＮＡが、配列番号３もしくは４のヌクレオチド配列、または配列番号３もしくは４のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む；および／または
    （ｉｉ）前記（ｉ）のアミノ酸配列が、配列番号１もしくは２のアミノ酸配列、または配列番号１もしくは２のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
    請求項１または２に記載の組成物または医薬製剤。
  4. （ｉ）前記（ｉｉ）のアミノ酸配列をコードする前記ＲＮＡが、配列番号７もしくは８のヌクレオチド配列、または配列番号７もしくは８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む；および／または
    （ｉｉ）前記（ｉｉ）のアミノ酸配列が、配列番号５もしくは６のアミノ酸配列、または配列番号５もしくは６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
    請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  5. （ｉ）前記（ｉｉｉ）のアミノ酸配列をコードする前記ＲＮＡが、配列番号１１もしくは１２のヌクレオチド配列、または配列番号１１もしくは１２のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む；および／または
    （ｉｉ）前記（ｉｉｉ）のアミノ酸配列が、配列番号９もしくは１０のアミノ酸配列、または配列番号９もしくは１０のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
    請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  6. （ｉ）前記（ｉｖ）のアミノ酸配列をコードする前記ＲＮＡが、配列番号１５もしくは１６のヌクレオチド配列、または配列番号１５もしくは１６のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む；および／または
    （ｉｉ）前記（ｉｖ）のアミノ酸配列が、配列番号１３もしくは１４のアミノ酸配列、または配列番号１３もしくは１４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
    請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  7. （ｉ）前記（ｖ）のアミノ酸配列をコードする前記ＲＮＡが、配列番号１９もしくは２０のヌクレオチド配列、または配列番号１９もしくは２０のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む；および／または
    （ｉｉ）前記（ｖ）のアミノ酸配列が、配列番号１７もしくは１８のアミノ酸配列、または配列番号１７もしくは１８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
    請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  8. 前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、または（ｖ）のアミノ酸配列の少なくとも１つが、コドン最適化された、および／またはそのＧ／Ｃ含有量が野生型コード配列と比較して増加しているコード配列によってコードされ、前記コドン最適化および／または前記Ｇ／Ｃ含有量の増加が、好ましくは前記コードされたアミノ酸配列の配列を変化させない、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  9. 前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、または（ｖ）のアミノ酸配列のそれぞれが、コドン最適化された、および／またはそのＧ／Ｃ含有量が野生型コード配列と比較して増加しているコード配列によってコードされ、前記コドン最適化および／または前記Ｇ／Ｃ含有量の増加が、好ましくは前記コードされたアミノ酸配列の配列を変化させない、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  10. 少なくとも１つのＲＮＡが５'キャップｍ２ ７，２'－ＯＧｐｐｓｐ（５'）Ｇを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  11. 各ＲＮＡが５'キャップｍ２ ７，２'－ＯＧｐｐｓｐ（５'）Ｇを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  12. 少なくとも１つのＲＮＡが、配列番号２１のヌクレオチド配列、または配列番号２１のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む５'ＵＴＲを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  13. 各ＲＮＡが、配列番号２１のヌクレオチド配列、または配列番号２１のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む５'ＵＴＲを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  14. （ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、または（ｖ）の少なくとも１つのアミノ酸配列が、抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  15. （ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、または（ｖ）の各アミノ酸配列が、抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  16. 前記抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列が、ＭＨＣ分子、好ましくはＭＨＣクラスＩ分子の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに対応するアミノ酸配列を含む、請求項１４または１５に記載の組成物または医薬製剤。
  17. （ｉ）前記抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列をコードする前記ＲＮＡが、配列番号２５のヌクレオチド配列、または配列番号２５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む；ならびに／または
    （ｉｉ）前記抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列が、配列番号２４のアミノ酸配列、または配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
    請求項１４～１６のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  18. （ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、または（ｖ）の少なくとも１つのアミノ酸配列が、免疫寛容を破壊するアミノ酸配列を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  19. （ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、または（ｖ）の各アミノ酸配列が、免疫寛容を破壊するアミノ酸配列を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  20. 前記免疫寛容を破壊するアミノ酸配列が、ヘルパーエピトープ、好ましくは破傷風トキソイド由来のヘルパーエピトープを含む、請求項１８または１９に記載の組成物または医薬製剤。
  21. （ｉ）前記免疫寛容を破壊するアミノ酸配列をコードする前記ＲＮＡが、配列番号２７のヌクレオチド配列、または配列番号２７のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む；および／または
    （ｉｉ）前記免疫寛容を破壊するアミノ酸配列が、配列番号２６のアミノ酸配列、または配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
    請求項１８～２０のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  22. 少なくとも１つのＲＮＡが、配列番号２８のヌクレオチド配列、または配列番号２８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む３'ＵＴＲを含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  23. 各ＲＮＡが、配列番号２８のヌクレオチド配列、または配列番号２８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む３'ＵＴＲを含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  24. 少なくとも１つのＲＮＡがポリＡ配列を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  25. 各ＲＮＡがポリＡ配列を含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  26. 前記ポリＡ配列が少なくとも１００個のヌクレオチドを含む、請求項２４または２５に記載の組成物または医薬製剤。
  27. 前記ポリＡ配列が、配列番号２９のヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる、請求項２４～２６のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  28. 前記ＲＮＡが、液体として製剤化されているか、固体として製剤化されているか、またはそれらの組合せである、請求項１～２７のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  29. 前記ＲＮＡが注射用に製剤化されている、請求項１～２８のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  30. 前記ＲＮＡが静脈内投与用に製剤化されている、請求項１～２９のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  31. 前記ＲＮＡがリポプレックス粒子として製剤化されているかまたは製剤化されることになっている、請求項１～３０のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  32. 前記ＲＮＡリポプレックス粒子が、前記ＲＮＡをリポソームと混合することによって得られる、請求項１～３１のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  33. 医薬組成物である、請求項１～３２のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  34. 前記医薬組成物が、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤をさらに含む、請求項３３に記載の組成物または医薬製剤。
  35. 前記医薬製剤がキットである、請求項１～３２のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  36. 前記ＲＮＡおよび任意で前記リポソームが別々のバイアル内にある、請求項３５に記載の組成物または医薬製剤。
  37. 前立腺癌を処置または予防するための前記ＲＮＡおよび任意で前記リポソームの使用説明書をさらに含む、請求項３５または３６に記載の組成物または医薬製剤。
  38. 医薬用途のための、請求項１～３７のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  39. 前記医薬用途が、疾患または障害の治療的または予防的処置を含む、請求項３８に記載の組成物または医薬製剤。
  40. 疾患または障害の前記治療的または予防的処置が、前立腺癌を処置または予防することを含む、請求項３９に記載の組成物または医薬製剤。
  41. ヒトへの投与用である、請求項１～４０のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  42. 疾患または障害の前記治療的または予防的処置が、さらなる療法を投与することをさらに含む、請求項３９～４１のいずれか一項に記載の組成物または医薬製剤。
  43. 前記さらなる療法が、（ｉ）腫瘍を摘出、切除、または減量する手術、（ｉｉ）放射線療法、および（ｉｉｉ）化学療法からなる群より選択される１つ以上を含む、請求項４２に記載の組成物または医薬製剤。
  44. 前記さらなる療法が、さらなる治療薬を投与することを含む、請求項４２または４３に記載の組成物または医薬製剤。
  45. 前記さらなる治療薬が抗癌治療薬を含む、請求項４４に記載の組成物または医薬製剤。
  46. 前記さらなる治療薬がチェックポイント調節剤である、請求項４４または４５に記載の組成物または医薬製剤。
  47. 前記チェックポイント調節剤が、抗ＰＤ１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、または抗ＰＤ１抗体と抗ＣＴＬＡ－４抗体の組合せである、請求項４６に記載の組成物または医薬製剤。
  48. 対象に少なくとも１つのＲＮＡを投与することを含む、前記対象における前立腺癌を処置する方法であって、前記少なくとも１つのＲＮＡが、以下のアミノ酸配列：
    （ｉ）カリクレイン２（ＫＬＫ２）、その免疫原性変異体、または前記ＫＬＫ２もしくは前記その免疫原性変異体の免疫原性断片を含むアミノ酸配列；
    （ｉｉ）前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、その免疫原性変異体、または前記ＰＳＡもしくは前記その免疫原性変異体の免疫原性断片を含むアミノ酸配列；
    （ｉｉｉ）前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、その免疫原性変異体、または前記ＰＡＰもしくは前記その免疫原性変異体の免疫原性断片を含むアミノ酸配列；
    （ｉｖ）ホメオボックスＢ１３（ＨＯＸＢ１３）、その免疫原性変異体、または前記ＨＯＸＢ１３もしくは前記その免疫原性変異体の免疫原性断片を含むアミノ酸配列；および
    （ｖ）ＮＫ３ホメオボックス１（ＮＫＸ３－１）、その免疫原性変異体、または前記ＮＫＸ３－１もしくは前記その免疫原性変異体の免疫原性断片を含むアミノ酸配列
    をコードする、方法。
  49. 前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、または（ｖ）のアミノ酸配列のそれぞれが、別個のＲＮＡによってコードされている、請求項４８に記載の方法。
  50. （ｉ）前記（ｉ）のアミノ酸配列をコードする前記ＲＮＡが、配列番号３もしくは４のヌクレオチド配列、または配列番号３もしくは４のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む；および／または
    （ｉｉ）前記（ｉ）のアミノ酸配列が、配列番号１もしくは２のアミノ酸配列、または配列番号１もしくは２のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
    請求項４８または４９に記載の方法。
  51. （ｉ）前記（ｉｉ）のアミノ酸配列をコードする前記ＲＮＡが、配列番号７もしくは８のヌクレオチド配列、または配列番号７もしくは８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む；および／または
    （ｉｉ）前記（ｉｉ）のアミノ酸配列が、配列番号５もしくは６のアミノ酸配列、または配列番号５もしくは６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
    請求項４８～５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. （ｉ）前記（ｉｉｉ）のアミノ酸配列をコードする前記ＲＮＡが、配列番号１１もしくは１２のヌクレオチド配列、または配列番号１１もしくは１２のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む；および／または
    （ｉｉ）前記（ｉｉｉ）のアミノ酸配列が、配列番号９もしくは１０のアミノ酸配列、または配列番号９もしくは１０のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
    請求項４８～５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. （ｉ）前記（ｉｖ）のアミノ酸配列をコードする前記ＲＮＡが、配列番号１５もしくは１６のヌクレオチド配列、または配列番号１５もしくは１６のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む；および／または
    （ｉｉ）前記（ｉｖ）のアミノ酸配列が、配列番号１３もしくは１４のアミノ酸配列、または配列番号１３もしくは１４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
    請求項４８～５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. （ｉ）前記（ｖ）のアミノ酸配列をコードする前記ＲＮＡが、配列番号１９もしくは２０のヌクレオチド配列、または配列番号１９もしくは２０のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む；および／または
    （ｉｉ）前記（ｖ）のアミノ酸配列が、配列番号１７もしくは１８のアミノ酸配列、または配列番号１７もしくは１８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
    請求項４８～５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、または（ｖ）のアミノ酸配列の少なくとも１つが、コドン最適化された、および／またはそのＧ／Ｃ含有量が野生型コード配列と比較して増加しているコード配列によってコードされ、前記コドン最適化および／または前記Ｇ／Ｃ含有量の増加が、好ましくは前記コードされたアミノ酸配列の配列を変化させない、請求項４８～５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、または（ｖ）のアミノ酸配列のそれぞれが、コドン最適化された、および／またはそのＧ／Ｃ含有量が野生型コード配列と比較して増加しているコード配列によってコードされ、前記コドン最適化および／または前記Ｇ／Ｃ含有量の増加が、好ましくは前記コードされたアミノ酸配列の配列を変化させない、請求項４８～５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 少なくとも１つのＲＮＡが５'キャップｍ２ ７，２'－ＯＧｐｐｓｐ（５'）Ｇを含む、請求項４８～５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 各ＲＮＡが５'キャップｍ２ ７，２'－ＯＧｐｐｓｐ（５'）Ｇを含む、請求項４８～５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 少なくとも１つのＲＮＡが、配列番号２１のヌクレオチド配列、または配列番号２１のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む５'ＵＴＲを含む、請求項４８～５８のいずれか一項に記載の方法。
  60. 各ＲＮＡが、配列番号２１のヌクレオチド配列、または配列番号２１のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む５'ＵＴＲを含む、請求項４８～５９のいずれか一項に記載の方法。
  61. （ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、または（ｖ）の少なくとも１つのアミノ酸配列が、抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列を含む、請求項４８～６０のいずれか一項に記載の方法。
  62. （ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、または（ｖ）の各アミノ酸配列が、抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列を含む、請求項４８～６１のいずれか一項に記載の方法。
  63. 前記抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列が、ＭＨＣ分子、好ましくはＭＨＣクラスＩ分子の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに対応するアミノ酸配列を含む、請求項６１または６２に記載の方法。
  64. （ｉ）前記抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列をコードする前記ＲＮＡが、配列番号２５のヌクレオチド配列、または配列番号２５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む；ならびに／または
    （ｉｉ）前記抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列が、配列番号２４のアミノ酸配列、または配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
    請求項６１～６３のいずれか一項に記載の方法。
  65. （ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、または（ｖ）の少なくとも１つのアミノ酸配列が、免疫寛容を破壊するアミノ酸配列を含む、請求項４８～６４のいずれか一項に記載の方法。
  66. （ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、または（ｖ）の各アミノ酸配列が、免疫寛容を破壊するアミノ酸配列を含む、請求項４８～６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. 前記免疫寛容を破壊するアミノ酸配列が、ヘルパーエピトープ、好ましくは破傷風トキソイド由来のヘルパーエピトープを含む、請求項６５または６６に記載の方法。
  68. （ｉ）前記免疫寛容を破壊するアミノ酸配列をコードする前記ＲＮＡが、配列番号２７のヌクレオチド配列、または配列番号２７のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む；および／または
    （ｉｉ）前記免疫寛容を破壊するアミノ酸配列が、配列番号２６のアミノ酸配列、または配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
    請求項６５～６７のいずれか一項に記載の方法。
  69. 少なくとも１つのＲＮＡが、配列番号２８のヌクレオチド配列、または配列番号２８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む３'ＵＴＲを含む、請求項４８～６８のいずれか一項に記載の方法。
  70. 各ＲＮＡが、配列番号２８のヌクレオチド配列、または配列番号２８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む３'ＵＴＲを含む、請求項４８～６９のいずれか一項に記載の方法。
  71. 少なくとも１つのＲＮＡがポリＡ配列を含む、請求項４８～７０のいずれか一項に記載の方法。
  72. 各ＲＮＡがポリＡ配列を含む、請求項４８～７１のいずれか一項に記載の方法。
  73. 前記ポリＡ配列が少なくとも１００個のヌクレオチドを含む、請求項７１または７２に記載の方法。
  74. 前記ポリＡ配列が、配列番号２９のヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる、請求項７１～７３のいずれか一項に記載の方法。
  75. 前記ＲＮＡが注射によって投与される、請求項４８～７４のいずれか一項に記載の方法。
  76. 前記ＲＮＡが静脈内投与によって投与される、請求項４８～７５のいずれか一項に記載の方法。
  77. 前記ＲＮＡがリポプレックス粒子として製剤化される、請求項４８～７６のいずれか一項に記載の方法。
  78. 前記ＲＮＡリポプレックス粒子が、前記ＲＮＡをリポソームと混合することによって得られる、請求項４８～７７のいずれか一項に記載の方法。
  79. 前記対象がヒトである、請求項４８～７８のいずれか一項に記載の方法。
  80. さらなる療法を投与することをさらに含む、請求項４８～７９のいずれか一項に記載の方法。
  81. 前記さらなる療法が、（ｉ）腫瘍を摘出、切除、または減量する手術、（ｉｉ）放射線療法、および（ｉｉｉ）化学療法からなる群より選択される１つ以上を含む、請求項８０に記載の方法。
  82. 前記さらなる療法が、さらなる治療薬を投与することを含む、請求項８０または８１に記載の方法。
  83. 前記さらなる治療薬が抗癌治療薬を含む、請求項８２に記載の方法。
  84. 前記さらなる治療薬がチェックポイント調節剤である、請求項８２または８３に記載の方法。
  85. 前記チェックポイント調節剤が、抗ＰＤ１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、または抗ＰＤ１抗体と抗ＣＴＬＡ－４抗体の組合せである、請求項８４に記載の方法。
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