KR20230144421A - 사스-코로나바이러스 2 감염증에 대한 rna 백신 - Google Patents
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Abstract
본 출원은 사스-코로나바이러스 2 감염증에 대한 RNA 백신 및 이를 위하여 제조된 폴리뉴클레오티드에 관한 것으로서, 사스-코로나바이러스-2에 대한 후천성 면역 반응을 유도하기 위한 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
Description
본 출원은 사스-코로나바이러스 2 감염증에 대한 RNA 백신 및 이를 위하여 제조된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
사스-코로나바이러스 2 감염증 (COVID-19)은 사스-코로나바이러스 2 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2: SARS-CoV-2)에 의해 일어나는 감염성 호흡기 질환으로 발열, 마른 기침, 호흡 곤란 및 폐렴 등 경증에서 중증까지 다양한 호흡기 감염증을 나타낸다. 특히, 상기 감염증은 기저질환 환자의 경우 높은 사망률을 보일 뿐만 아니라, 감염력과 전파력이 매우 강력하여, 2020년 3월 11일 세계보건기구에서는 팬데믹 선언을 하였다. SARS-CoV-2는 단일 가닥 (+) RNA 바이러스로서 약 3만 개의 염기서열로 이루어져 있고, 사람과 동물에게 감염되는 베타코로나바이러스 속으로 전자 현미경으로 관찰 시 구형을 띄며 외부 스파이크 단백질이 크라운 형태로 둘러싸여 있다.
한편, 상기 SARS-CoV-2의 감염에 필수적인 역할을 하는 스파이크 단백질은 숙주 세포의 안지오텐신-전환 효소 수용체 (Angiotensin-converting enzyme 2)와 특이적인 결합을 형성한다. 구체적으로, SARS-CoV-2의 스파이크 단백질은 SARS-CoV의 스파이크 단백질보다 인간 세포의 ACE2 수용체에 약 10-20배 더 잘 결합한다는 점, 그리고, 스파이크 단백질의 S1 영역의 수용체 결합 도메인 (Receptor binding domain : RBD)과 숙주 세포의 ACE2 수용체와 결합해 숙주 세포의 세포질 내로 침입할 수 있음이 보고된 바 있다.
사스-코로나바이러스 2 감염증의 급속한 확산에 따라 이에 대한 치료제 및 백신의 중요성이 대두되고 있고, 현재 여러 백신들이 FDA 승인되어 일부에 대하여 접종을 권장하고 있다. 한편, RNA 백신은 자연적인 mRNA 구조를 모방하여 제작된 인공적인 RNA 분자를 포함하며, 상기 RNA 분자를 이용하여 면역 계통의 후천성 면역을 강화하는 것을 주요 목표로 한다. 다만, 이러한 mRNA 백신은 RNA 분자의 불안정성으로 인해 세포질로의 전달을 위한 기술적 요소가 필수적으로 필요하다는 점, 세포질로 RNA 분자가 전달된 후, 과다한 선천성 면역반응으로 인한 RNA 분자의 손상 또는 번역 효율 저하를 최소화하여야 한다는 점에서, 상기 mRNA 백신 기술 분야에 대한 다각적인 연구가 요구된다.
이러한 기술적 배경 하에서, 본 발명자들은 전술한 종래 기술의 문제점을 해소하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, mRNA를 구성하는 특정 단위체들의 조합과 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 즉, 유전적 작제물을 디자인하였으며, 상기 유전적 작제물에 의한 우수한 후천성 면역 반응 자극 효과 및 낮은 수준의 선천성 면역 반응을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 목적은 사스-코로나바이러스-2 감염증에 대한 RNA 백신의 유효 성분으로 적용될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 사스-코로나바이러스-2 감염증을 예방하기 위한 면역원성 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 사스-코로나바이러스-2 감염증을 예방하기 위한 상기 폴리뉴클레오티드 또는 상기 면역원성 조성물의 의약적 용도를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 사스-코로나바이러스-2 (SARS-CoV-2)의 스파이크 단백질 (Spike protein: S protein) 또는 이의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 오픈 리딩 프레임 (Open reading frame: ORF); 및 상기 오픈 리딩 프레임의 양 말단에 작동 가능하게 연결된, 5’-비번역 부위 (5’-Untranslated region: 5’-UTR) 및 3’-비번역 부위 (3’-Untranslated region: 3’-UTR)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서,
상기 폴리뉴클레오티드는 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 (Chemically modified nucleotide)를 포함하며, 상기 화학적으로 변형된 뉴클레오티드는 N1-에틸-슈도우리딘 (N1-ethyl-pseudouridine), 또는 N1-메톡시메틸-슈도우리딘 (N1-methoxymethyl-pseudouridine)인 것인, 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 면역원성 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 사스-코로나바이러스-2 감염증을 예방하는 방법, 또는 사스-코로나바이러스-2에 대한 후천성 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다.
일 양상에 따른 폴리뉴클레오티드는 자연적인 mRNA 구조를 모사함과 동시에 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 도입함으로써, 체내에서 높은 수준의 후천성 면역 반응을 자극할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 폴리뉴클레오티드로부터 야기되는 선천성 면역 반응의 유도를 현격하게 낮출 수 있다. 따라서, 일 양상에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 면역원성 조성물은 사스-코로나바이러스 2 감염증을 예방하는데 활용될 수 있다.
도 1은 5' 캡, 5' -비번역 부위, 오픈 리딩 프레임, 3' -비번역 부위, 및 폴리A 테일을 포함하는 일 실시예에 따른 폴리뉴클레오티드의 구조를 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2는 일 실시예에 따른 MCX101A-02-3 또는 MCX101A-02-4를 HeLa 세포에 형질주입한 후, 스파이크 단백질의 발현 수준을 측정한 결과이다.
도 3은 일 실시예에 따른 MCX101A-02-3, MCX101A-25-3, 또는 MCX101A-27-3을 BALB/c 마우스에 복강 투여한 후, 혈청 시료 내 스파이크 단백질의 S1 영역에 결합하는 항체의 농도를 정량적으로 나타낸 결과이다.
도 4는 일 실시예에 따른 MCX101A-02-3, MCX101A-25-3, 또는 MCX101A-27-3을 BALB/c 마우스에 복강 투여한 후, 혈청 시료 내 수용체 결합 도메인에 결합하는 항체의 농도를 정량적으로 나타낸 결과이다.
도 5는 일 실시예에 따른 MCX101A-02-3, MCX101A-25-3, 또는 MCX101A-27-3을 BALB/c 마우스에 복강 투여한 후, 혈청 시료 내 생성된 중화 항체에 의한 수용체 결합 도메인(RBD)과 ACE2 수용체 간 결합 억제 수준을 정량적으로 나타낸 결과이다.
도 6은 일 실시예에 따른 MCX101A-02-3 또는 MCX101A-02-4를 BALB/c 마우스에 복강 투여한 후, 혈청 시료 내 IFN-α의 농도를 정량적으로 나타낸 결과이다.
도 7은 일 실시예에 따른 MCX101A-02-3 또는 MCX101A-02-4를 BALB/c 마우스에 복강 투여한 후, 혈청 시료 내 IFN-γ의 농도를 정량적으로 나타낸 결과이다.
도 8은 일 실시예에 따른 MCX101A-02-3 또는 MCX101A-02-4를 THP-1 세포에 형질주입한 후, 이로부터 산출한 상대적인 IRF 값을 정량적으로 나타낸 결과이다.
도 2는 일 실시예에 따른 MCX101A-02-3 또는 MCX101A-02-4를 HeLa 세포에 형질주입한 후, 스파이크 단백질의 발현 수준을 측정한 결과이다.
도 3은 일 실시예에 따른 MCX101A-02-3, MCX101A-25-3, 또는 MCX101A-27-3을 BALB/c 마우스에 복강 투여한 후, 혈청 시료 내 스파이크 단백질의 S1 영역에 결합하는 항체의 농도를 정량적으로 나타낸 결과이다.
도 4는 일 실시예에 따른 MCX101A-02-3, MCX101A-25-3, 또는 MCX101A-27-3을 BALB/c 마우스에 복강 투여한 후, 혈청 시료 내 수용체 결합 도메인에 결합하는 항체의 농도를 정량적으로 나타낸 결과이다.
도 5는 일 실시예에 따른 MCX101A-02-3, MCX101A-25-3, 또는 MCX101A-27-3을 BALB/c 마우스에 복강 투여한 후, 혈청 시료 내 생성된 중화 항체에 의한 수용체 결합 도메인(RBD)과 ACE2 수용체 간 결합 억제 수준을 정량적으로 나타낸 결과이다.
도 6은 일 실시예에 따른 MCX101A-02-3 또는 MCX101A-02-4를 BALB/c 마우스에 복강 투여한 후, 혈청 시료 내 IFN-α의 농도를 정량적으로 나타낸 결과이다.
도 7은 일 실시예에 따른 MCX101A-02-3 또는 MCX101A-02-4를 BALB/c 마우스에 복강 투여한 후, 혈청 시료 내 IFN-γ의 농도를 정량적으로 나타낸 결과이다.
도 8은 일 실시예에 따른 MCX101A-02-3 또는 MCX101A-02-4를 THP-1 세포에 형질주입한 후, 이로부터 산출한 상대적인 IRF 값을 정량적으로 나타낸 결과이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
일 양상은 (a) 사스-코로나바이러스-2 (SARS-CoV-2)의 스파이크 단백질 (Spike protein: S protein) 또는 이의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 오픈 리딩 프레임 (Open reading frame: ORF); 및 (b) 상기 오픈 리딩 프레임의 양 말단에 작동 가능하게 연결된, 5’-비번역 부위 (5' Untranslated region: 5’-UTR) 및 3’-비번역 부위 (3'-Untranslated region: 5’-UTR)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 우리딘에 대신하여, 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 (Chemically modified nucleotide)인, N1-에틸-슈도우리딘 (N1-ethyl-pseudouridine) 또는 N1-메톡시메틸-슈도우리딘 (N1-methoxymethyl-pseudouridine)을 포함하는, 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 명세서에서 용어, "폴리뉴클레오티드 (Polynucleotide)"는 복수의 뉴클레오티드 단위체를 포함하는 고분자 물질로서, 구체적으로, 복수의 뉴클레오티드 단위체가 당/포스페이트 기본 골격의 포스포디에스테르 결합에 의해 서로 연결되어 있는 폴리머를 지칭하며, 용어, "핵산", "핵산 분자"와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 생명체에 필수적인 생체 고분자로서, 고유의 염기 서열을 통해 유전적 정보를 코딩하는 RNA 또는 DNA일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 단리되거나 (Isolated), 인위적으로 합성되거나 (Artificially synthesized), 또는 비-천연 발생 또는 조작 (Non-naturally occurring or engineered)된 것이며, 상기 “비-천연 발생 또는 조작”은 자연 상태에서 일어나는 존재 그대로의 상태가 아닌, 인위적인 변형을 가하여 생성된 상태를 의미한다. 여기서, 상기 인위적인 변형은 자연적인 mRNA, 구체적으로, 성숙 mRNA의 구조를 모방하여 세포에서 목적 단백질 발현을 향상시키기 위한 것으로서, 상기 인위적인 변형은 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 도입하는 것을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "mRNA (Messenger RNA)"는 DNA 주형으로부터 전사되고, DNA의 유전 정보를 세포질 안의 리보솜으로 전달하는 RNA를 지칭한다. 진핵 유기체에서의 전사 과정은 세포의 핵 내에서 진행되며, 미성숙 RNA (Premature RNA)를 가공하는 과정을 포함한다. 구체적으로, 이러한 과정을 전사 후 변형(Post-transcriptional modification)이라 일컬으며, 스플라이싱 (Splicing), 5'-캡핑 (Capping), 폴리아데닐레이션(Polyadenylation), 핵 또는 미토콘드리아로부터 유출 (Export) 등의 과정을 포함한다. 이러한 과정이 진행된 결과, 특정 펩티드 또는 단백질의 아미노산 서열로 번역될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 성숙 mRNA (Mature mRNA)를 생성한다. 일반적으로, 상기 성숙 mRNA는 선택적으로, 5'-캡, 5'UTR, 오픈 리딩 프레임, 3'UTR, 및 폴리A 테일을 포함할 수 있다. 상기 mRNA는 여러 가지 공지의 방법 중 임의의 것을 따라 합성될 수 있고, 예를 들어, 상기 mRNA는 시험관내 전사(IVT)를 통해 합성될 수 있다. 상기 시험관내 전사는 일반적으로 프로모터를 함유하는 선형 또는 원형 DNA 주형, 리보뉴클레오티드 트리포스페이트의 풀, DTT 및 마그네슘 이온을 포함할 수 있는 완충액 시스템, 및 적절한 RNA 중합효소(예를 들어, T3, T7 또는 SP6 RNA 중합효소), DNAse I, 피로포스파타아제, 및/또는 RNAse 억제제를 사용하여 수행될 수 있다.
본 명세서에서 용어, "오픈 리딩 프레임 (Open reading frame)"은 일반적으로 펩티드 또는 단백질로 번역될 수 있는 여러 뉴클레오티드 트리플렛 (Triplets)의 서열일 수 있으며, 용어, "단백질 코딩 영역"과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 상기 오픈 리딩 프레임은 이의 5'-말단으로부터 시작되는 후속 영역 (Subsequent region)에 바람직하게 시작 코돈, 즉, 아미노산 메티오닌을 코딩하는 3개의 뉴클레오티드 서열의 조합 (ATG 또는 AUG)을 포함하며, 3'말단 방향의 영역에 바람직하게 번역의 종결을 지시하는 정지 코돈 (예를 들어, TAA, TAG, TGA, 또는 UAA, UAG, UGA)을 포함할 수 있다. 본 발명의 목적상, 상기 오픈 리딩 프레임은 RNA 백신 조성물의 면역원인, 사스-코로나 바이러스 2의 스파이크 단백질로 번역될 수 있는 여러 뉴클레오티드 트리플렛 (triplets)의 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "5’-비번역 부위 (5' -Untranslated region)"는 상기 오픈 리딩 프레임의 5' 말단에 위치하는 영역, 구체적으로, 개시 코돈으로부터 상류에 있는 mRNA 영역을 지칭한다. 상기 5’-비번역 부위는 mRNA의 안정성이나 번역에 영향을 미치는 하나 이상의 요소를 포함할 수 있으며, 이를 위하여, 상기 5’-비번역 부위의 뉴클레오티드 서열은 안정한 mRNA 분자 (예컨대, 글로빈, 액틴, GAPDH, 튜불린, 히스톤, 또는 시트르산 회로 효소)로부터 유래될 수 있다. 일례로서, 5’-비번역 부위 서열은 CMV 극초기(immediate-early) 1(IE1) 유전자의 부분 서열, 또는 이의 단편을 포함하여, 뉴클레아제 내성을 개선시키고/시키거나 폴리뉴클레오티드의 반감기를 개선시킬 수 있다.
본 명세서에서 용어, "3’-비번역 부위 (3'-Untranslated region: 3'-UTR)"는 상기 오픈 리딩 프레임의 3' 말단에 위치하는 영역, 구체적으로, 정지 코돈으로부터 상류에 있는 mRNA 영역을 지칭한다. 상기 3’-비번역 부위는 폴리아데닐화 신호, 세포 내 mRNA의 위치 안정성에 영향을 주는 단백질에 대한 결합 부위 중 하나 이상, 또는 mRNA에 대한 하나 이상의 결합 부위를 포함할 수 있으며, 전술한 5’-비번역 부위와 동일한 방식을 채용하여 3’-비번역 부위 서열을 설계할 수 있다. 일례로서, 3’-비번역 부위 서열은 인간 성장 호르몬(hGH)을 코딩하는 서열 또는 이의 단편의 서열을 포함하여, 폴리뉴클레오티드의 안정성 및/또는 약동학적 성질 (예컨대, 반감기)을 개선시킬 수 있다.
본 명세서에서 용어, "동일성"은 폴리머 분자들 간의, 예를 들어, 핵산(예를 들어, DNA 분자들 및/또는 RNA 분자들) 간의 및/또는 폴리펩티드 간의 전체 관련성을 지칭한다. 예를 들어, 폴리펩티드는 이들의 아미노산 서열이 적어도, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 동일하다면 서로 "실질적으로 동일한" 것으로 간주된다. 두 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 동일성 퍼센트의 계산은, 예를 들어, 최적의 비교 목적을 위해 두 서열을 정렬함으로써 수행될 수 있다(예를 들어, 최적의 정렬을 위해 제1 및 제2 서열 중 하나 또는 둘 모두에 갭이 도입될 수 있고, 비교 목적을 위해 비-동일 서열이 무시될 수 있다). 예를 들어, 비교 목적으로 정렬된 서열의 길이는 참조 서열의 길이의 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 실질적으로 100%이다. 이어서, 상응하는 위치에서의 핵산 또는 폴리펩티드 서열이 비교된다. 두 서열 간의 동일성 퍼센트의 결정 및 서열의 비교는 수학적 알고리즘을 이용하여 달성될 수 있다. 당업자에게 널리 공지된 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 서열은 뉴클레오티드 서열의 경우 BLASTN, 및 아미노산 서열의 경우 BLASTP, gapped BLAST, 및 PSIBLAST와 같이 상업적 컴퓨터 프로그램에서 입수 가능한 것들을 포함하는 임의의 다양한 알고리즘을 이용하여 비교될 수 있다.
본 명세서에서 용어, "작동 가능하게 연결된(operatively linked)"은 하나의 기능이 다른 것에 의하여 영향을 받도록 단일 핵산 단편 상에서 뉴클레오티드 서열들이 연결된 것을 나타낼 수 있다.
본 명세서에 있어서, 뉴클레오티드 서열의 위치와 관련하여 달리 언급이 없으면, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로 연결되거나 위치하는 것을 나타낸다.
본 발명의 목적은 사스-코로나바이러스 2 감염증에 대한 RNA 백신 조성물의 유효 성분으로 사용될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 제공하기 위한 것으로, 이를 위해서는 ⅰ) 면역원/항원 단백질을 코딩하는 자연적인 mRNA의 구조를 성공적으로 모사하여 체내 세포의 번역 시스템을 활성화시킬 수 있어야 하며, 이와 함께, ⅱ) 투여되는 폴리뉴클레오티드로부터 야기되는 선천성 면역 반응이 과다하게 유도되지 않도록 조절하여야 한다. 이에, 본 발명에서는 사스-코로나바이러스 2의 스파이크 단백질로의 번역이 이루어질 수 있는 주요한 mRNA 구조를 포함하되, 우리딘 서열에 대하여 화학적으로 변형된 뉴클레오티드로 치환된, 폴리뉴클레오티드를 제작하였으며, 이러한 기술적 구성을 통해 종래의 기술적 문제점을 해결하고자 하였다.
일 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오티드는 화학적으로 변형된 뉴클레오티드가 포함되지 않은 폴리뉴클레오티드에 비해, 선천성 면역 반응의 유도 수준이 낮은 것일 수 있다. 상기 화학적으로 변형된 뉴클레오티드는 적어도 하나의 우리딘이 N1-에틸-슈도우리딘, 또는 N1-메톡시메틸-슈도우리딘으로 치환된 것일 수 있으며, 예를 들어, 상기 폴리뉴클레오티드를 구성하는 전체 우리딘 서열을 기준으로, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 우리딘이 N1-에틸-슈도우리딘, 또는 N1-메톡시메틸-슈도우리딘으로 치환된 것일 수 있고, 바람직하게는, N1-에틸-슈도우리딘으로 치환된 것일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드는 전술한 화학적 변형을 포함하지 않은 폴리뉴클레오티드에 비해 선천성 면역 반응의 유도 수준이 낮은 것 일 수 있다. 낮은 수준의 선천성 면역 반응 유도는 세포질 내 번역 효율을 증가시키는데 기여할 수 있으며, 궁극적으로는 유효한 수준의 후천성 면역 반응을 자극 하는데 기여할 수 있다. 또한, 상기 선천성 면역 반응은 전술한 화학적으로 변형된 뉴클레오티드가 포함되지 않은 폴리뉴클레오티드에 비해 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 이상 감소하는 것을 지칭할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 전술한 화학적 변형을 포함하지 않은 폴리뉴클레오티드에 비해 낮은 수준의 IRF 값을 갖는 것일 수 있다. 상기 IRF 값은 전술한 화학적으로 변형된 뉴클레오티드가 포함되지 않은 폴리뉴클레오티드에 비해 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 이상 감소하는 것을 지칭할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 코로나바이러스의 스파이크 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1 내지 서열번호 3 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열, 또는 상기 뉴클레오티드 서열과 적어도 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 상기 뉴클레오티드 서열의 변이체를 포함하는 것일 수 있다. 상기 뉴클레오티드 서열 또는 이의 변이체는 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질, 또는 퓨린-절단 부위가 제거된 코로나바이러스-2의 스파이크 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 서열로서, 상기 스파이크 단백질의 발현 수준을 증진시키고자 코돈 최적화 (Codon optimization)를 수행하여 수득한 것일 수 있다. 예를 들어, 서열번호 1 내지 3의 뉴클레오티드 서열은 각각 사스-코로나바이러스-2 USA-WA1/2020의 스파이크 단백질, 퓨린-절단부위가 제거된 코로나바이러스-2 USA-WA1/2020의 스파이크 단백질, 퓨린-절단부위가 제거된 사스-코로나바이러스-2 델타 변이의 스파이크 단백질로부터 유래하는 아미노산 서열을 코딩하는 서열로서, 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 5’-비번역 부위는 상기 오픈 리딩 프레임의 5'-말단에 작동 가능하게 연결되며, 바람직하게는 서열번호 4 또는 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열, 또는 상기 뉴클레오티드 서열과 적어도 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 상기 뉴클레오티드 서열의 변이체를 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 3'-비번역 부위는 상기 오픈 리딩 프레임의 3'-말단에 작동 가능하게 연결되며, 바람직하게는 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열, 또는 상기 뉴클레오티드 서열과 적어도 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 상기 뉴클레오티드 서열의 변이체를 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서, "변이체 (variants)"는 참조 엔터티(entity)(예컨대, 야생형 서열)와 상당한 구조적 동일성을 나타내지만 하나 이상에서 참조 엔터티와 구조적으로 상이한 엔터티를 지칭한다. 특정 엔터티가 참조 엔터티의 "변이체"로 적절하게 여겨지는지 여부는 참조 엔티티와의 구조적 또는 기능적 동일성의 정도를 기초로 한다. 임의의 생물학적 또는 화학적 참조 엔터티는 특정한 고유의 구조적 요소를 갖으며, 상기 변이체는, 정의상, 하나 이상의 그러한 고유의 구조적 요소를 공유하는 별개의 화학적 엔터티를 지칭한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 선형 또는 3-차원 공간에서 서로에 대해 지정된 위치를 갖는 복수의 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 고유의 서열 요소를 가질 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 서열의 하나 이상의 차이 및/또는 폴리뉴클레오티드 백본에 공유 결합된 화학적 모이어티(예를 들어, 탄수화물, 지질 등)의 하나 이상의 차이로 인해 참조 폴리뉴클레오티드와 상이할 수 있다. 상기 변이체는 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의, 참조 폴리뉴클레오티드와의 전체 서열 동일성을 나타낸다.
일 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 8 내지 서열번호 10 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 5’-UTR에 작동 가능하게 연결된 5'캡을 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "5'캡 (5'Cap)"은 폴리뉴클레오티드의 안정성 및 발현 효율에 영향을 미치는 5'말단 영역에 위치하는 구조물로서, 일반적으로 변형된 뉴클레오티드, 특히 구아닌 뉴클레오티드의 유도체에 의해 형성될 수 있다. 일 실시예에서, 상기 5'캡은 m7Gppp, Gppp, m7(3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeA)pG, m7(3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeG)pG, G(5')ppp(5')G, m7G(5')ppp(5')G, 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G, m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG, m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG, 또는 m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pU 중 어느 하나일 수 있으나, 상기와 동일한 기능성을 갖는 공지의 5'캡이 비제한적으로 적용될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 3’-UTR에 작동 가능하게 연결된 폴리A 테일 (PolyA tail)를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "폴리A 테일 (PolyA tail)"은 RNA exo-nuclease의 분해 과정을 지연시키고, 폴리뉴클레오티드의 안정성과 생체 내 반감기를 연장시켜 발현 효율에 영향을 미치는 3'말단 영역에 위치하는 구조물로서, 일반적으로 복수 개의 아데닌 뉴클레오티드 서열에 의해 형성될 수 있다. 일 실시예에서, 상기 폴리A 테일은 20 내지 200개의 아데닌으로 이루어질 수 있으며, 예를 들어, 20 내지 190개, 20 내지 170개, 20 내지 150개, 20 내지 130개, 20 내지 110개, 20 내지 90개, 20 내지 70개, 20 내지 50개, 20 내지 30개, 30 내지 190개, 30 내지 170개, 30 내지 150개, 30 내지 130개, 30 내지 110개, 30 내지 90개, 30 내지 70개, 또는 30 내지 50개의 반복적인 아데닌 뉴클레오티드 서열일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로 하기의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것일 수 있으며, 상기 뉴클레오티드 서열 내 우리딘은 화학적으로 변형된 뉴클레오티드인, N1-에틸-슈도우리딘일 수 있다:
(A) m7Gppp로 이루어진 5'캡; 서열번호 4의 5' -UTR; 서열번호 1의 ORF; 서열번호 6의 5' -UTR; 서열번호 7의 폴리A 테일;
(B) m7Gppp로 이루어진 5'캡; 서열번호 5의 5' -UTR; 서열번호 2의 ORF; 서열번호 6의 5' -UTR; 서열번호 7의 폴리A 테일; 및
(C) m7Gppp로 이루어진 5'캡; 서열번호 5의 5' -UTR; 서열번호 3의 ORF; 서열번호 6의 5' -UTR; 서열번호 7의 폴리A 테일.
일 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로 하기의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것일 수 있으며, 상기 뉴클레오티드 서열 내 우리딘은 화학적으로 변형된 뉴클레오티드인, N1-메톡시메틸-슈도우리딘일 수 있다:
(A) m7Gppp로 이루어진 5'캡; 서열번호 4의 5' -UTR; 서열번호 1의 ORF; 서열번호 6의 5' -UTR; 서열번호 7의 폴리A 테일.
일 실시예에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 유전적 작제물은 형질주입된 세포에서 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질을 발현시킬 수 있으며, 이를 통해, 후천성 면역 반응을 자극/유도함으로써, 스파이크 단백질의 S1 영역, 및 스파이크 단백질 내 수용체 결합 도메인에 결합하는 항체를 생성하고, 유효한 기능성, 즉, 중화 효능을 갖는 항체의 생성을 유도할 수 있음을 확인하였다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 유전적 작제물은 기존의 문제점으로 지적되어 온 인터페론에 의해 유발되는 과다한 선천성 면역 반응 유도를 현격하게 낮출 수 있었는바, 사스-코로나바이러스 2 감염증에 대한 RNA 백신 조성물의 유효 성분으로 활용될 수 있다.
따라서, RNA 백신 조성물로 적용하기 위하여, 일 실시예에 따른 폴리뉴클레오티드는 약물 전달체 시스템 (Drug Delivery System: DDS)으로 제형화된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 폴리뉴클레오티드에 대한 약물 전달 시스템으로는 당업계 공지의 지질 성분을 사용한, 지질 나노입자 (Lipid nanoparticle, LNP)로 제형화될 수 있다.
다른 양상은 상기 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는, 면역원성 조성물을 제공하는 것이다.
하기 면역원성 조성물에 언급된 용어 또는 요소 중 상기 폴리뉴클레오티드에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 상기한 바와 같다.
본 명세서에서 용어, "면역원성 조성물"은 특정 병원체 또는 질환에 대하여 대상체에서 특정한 정도의 면역성을 유도하는 데 효과적인 활성 성분, 또는 이의 유효량을 함유하는 물질을 지칭하며, 용어, "백신", "백신 제제", "백신 조성물"과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 또한, 상기 면역원성 조성물은 질환 또는 병원체에 의한 감염과 연관된 증상의 중증도, 지속 시간 또는 다른 징후의 저하를 유도하는 약제학적 조성물일 수 있다. 따라서, 상기 면역원성 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제, 완충제, 염, 계면활성제, 저온보호물질 등을 선택적으로 포함할 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 면역원성 조성물은 사스-코로나바이러스-2에 대한 후천성 면역 반응을 자극하기 위한 것 또는 사스-코로나바이러스-2 감염증을 예방하기 위한 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 투여되는 특정 조성물에 따라 부분적으로 결정될 뿐만 아니라, 조성물을 투여하는 데 사용되는 특정 방법에 따라 부분적으로 결정될 수 있다. 따라서, 상기 면역원성 조성물의 적합한 제형이 매우 다양하며, 예를 들어, 면역원성 백신 조성물은 비경구(즉, 근육내, 피내, 또는 피하) 투여 또는 비인두 (즉, 비강내) 투여를 위해 제형화될 수 있다. 일반적으로, 비경구 투여용 제형은 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 유화액을 포함한다. 비수성 용매의 예시는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물유, 및 올레산에틸과 같은 주사용 유기 에스테르이다. 수성 담체는 염수 및 완충된 매질을 비롯하여 물, 알코올/수성 용액, 유화액 또는 현탁액을 포함할 수 있다. 비경구용 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스 (Ringer's dextrose), 덱스트로스와 염화나트륨, 락테이트화 링거(lactated Ringer's), 또는 고정유를 포함할 수 있다. 방부제 및 기타 첨가물은 또한 예를 들어, 항균제, 항산화제, 킬레이트제, 및 불활성 가스 등으로 존재할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "면역원"은 면역 반응을 자극할 수 있는 물질을 지칭하며, 통상적으로 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질일 수 있다. 상기 면역원은 전술한 폴리뉴클레오티드에 대한 번역의 산물을 지칭하며, 후천적 면역 반응을 자극하는 물질일 수 있다. 본 발명의 목적상, 상기 면역원은 사스-코로나바이러스-2 (SARS-CoV-2)의 스파이크 단백질, 또는 이의 변이체일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "유효량"은 특정 병원체 또는 질환에 감염될 확률 또는 감염의 심각성을 상당히 감소시킬 수 있을 정도의 항체를 유발하는데 필요한 투여량을 말한다. 상기 투여에는 근육내, 복강내, 피내 또는 피하 경로를 통한 주사가 포함될 수 있다. 특정 백신 제제에 대한 성분의 최적량은 피험자에서 적당한 면역 반응의 관찰을 포함하는 표준 연구에 의해서 확인될 수 있다. 예를 들어 동물실험 결과를 외삽하여 사람을 대상으로 하는 백신 접종의 용량을 결정할 수 있고, 또는 경험적으로 용량을 결정할 수 있다.
일 구체예에서, 전술한 바와 같이, 상기 면역원성 조성물은 약물 전달체 시스템으로 제형화된 것일 수 있고, 예를 들어, 상기 면역원성 조성물은 지질을 사용하여, 지질 나노입자로 제형화될 수 있다.
예를 들어, 상기 제형화에 사용되는 지질로는 MC3, Lipid 319, C12-200, 5A2-SC8, 306Oi10, Moderna Lipid 5, Acuitas A9, SM-102, ALC-0315, Arcturus Lipid 2,2 (8,8) 4C CH3, Genevant CL1, 폴리라이신, 폴리오르니틴, 및/또는 폴리아르기닌과 같은 양이온성 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 면역원성 조성물은 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 1,2 디스테아로일-sn-글리세롤-3-포스포콜린(DSPC), 디팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC), 콜레스테롤과 같은 스테롤 또는 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE)과 같은 비양이온성 리피드를 포함하는 지질 나노입자로 제형화될 수 있다. 또한, 상기 면역원성 조성물은 1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000(PEG2000-DMG), 2-[(polyethylene glycol)-2000]-N,N-ditetradecylacetamide(ALC-0159), polyethylene glycol dimethacrylate(PEG-DMA)와 같은 PEG-리피드를 포함하는 지질 나노입자로 제형화될 수 있다. 또한 상기 지질 나노입자는 양이온성 지질, 인지질, 콜레스테롤과 같은 스테롤, PEG-지질, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 또한, 상기 지질 나노 입자는 PEG-변형된 리피드, 비양이온성 리피드, 스테롤, 및 이온화 가능한 리피드, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
다른 양상은 상기 면역원성 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 사스-코로나바이러스-2 감염증을 예방하는 방법 또는 사스-코로나바이러스-2에 대한 후천성 면역 반응을 자극하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 방법에 포함된 기술적 구성은 앞서 설명한 발명에 포함되는 구성과 동일하므로, 위 설명은 사스-코로나바이러스-2 감염증을 예방하는 방법 또는 사스-코로나바이러스-2에 대한 후천성 면역 반응을 자극하는 방법에도 동일하게 적용될 수 있다.
상기 면역원성 조성물을 개체에 투여하는 단계는 백신 접종을 지칭하는 것으로서, 상기 면역원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 투여를 통해 백신을 접종하는 단계를 의미할 수 있다. 구체적으로, 상기 면역원성 조성물은 개체의 신체 또는 개체의 분리된 세포에 투여/처리될 수 있다. 신체의 특정 세포의 형질전환에 따라, 또는 분리된 세포의 형질전환에 따라, 상기 면역원은 그들 세포에 의해 발현될 수 있고 이후에 후천성 면역 반응, 즉 항원-특이적 면역 반응을 유발하는 면역 시스템에 제시될 수 있다. 따라서, 상기 백신 접종은 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 본원에 정의된 바와 같은 면역원성 조성물을 개체에, 바람직하게는 환자에게, 또는 생체 내 (in vivo)/생체 외(ex vivo) 또는 시험관 내(in vitro) 환자의 세포의 형질전환을 초래하는 개체, 바람직하게는 환자의 분리된 세포에 투여하는 것을 포함할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: RNA 백신 구성성분으로의 폴리뉴클레오티드의 합성
본 실시예에서는 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 사용하여, RNA 백신에 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드를 합성하였다. 상기 폴리뉴클레오티드는 도 1에 도시한 바와 같이, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로 ⅰ) 5' 캡, ⅱ) 5' -비번역 부위, ⅲ) 오픈 리딩 프레임, ⅳ) 3' -비번역 부위, 및 ⅴ) 폴리A 테일이 작동 가능하게 순차적으로 연결되도록 설계하였다. 이를 위하여, 하기 표 1의 폴리뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 갖는, 각각의 cDNA (Complementary DNA)를 T7 RNA 중합 효소 프로모터가 포함된 벡터 (pUC57-kan, GenScript)에 삽입하여, 원형의 DNA 플라스미드를 제작하였다. 이후, Bbs-I(NEB) 제한효소를 이용하여 상기 DNA 플라스미드를 선형화한 후, 이를 PCR purification kit(Qiagen)로 정제하여 시험관 내 전사(in vitro transcription; IVT)를 위한 DNA 주형을 수득 및 준비하였다. 이후, 상기 DNA 주형을 사용한 시험관 내 전사 과정, 즉, RNA 분자를 합성하는 과정은 당업계에서 알려진 방식을 채용하여 수행하였다(Curr Protoc . 2021 Feb;1(2):e39. 참조).
구체적으로, 튜브에 5 mM의 ATP (Thermo Fisher), 5 mM의 CTP(Thermo Fisher), 5mM의 GTP (Thermo Fisher), 5 mM의 N1-에틸-슈도우리딘 또는 N1-메톡시메틸-슈도우리딘, 그리고, 4 mM의 CleanCap® Reagent AG (3' OMe)(TriLink)를 첨가하였다. 이후, 상기 혼합물에 pH 8.0, 400 mM의 Tris·HCl(invitrogen), 165 mM의 magnesium acetate(sigma), 100 mM의 dithiothreitol (sigma), 20 mM의 spermidine, 0.2% (v/v) Triton X-100(sigma)가 포함된, 10X in vitro transcription buffer를 1X가 되도록 첨가하여 혼합한 후, 여기에, 선형화된 DNA template (25 μg/mL), murine RNase inhibitor(NEB) (1 U/μL), Inorganic pyrophosphatase(NEB) (0.002 U/μL) 및 T7 RNA 중합효소 (NEB) (8 U/μL)를 첨가하고, 37℃조건에서 1-2 시간 동안 반응시켰다. 이후, 상기 혼합물에 DNase I (NEB)를 처리하여 37℃조건에서 15분 이상 반응시켜, 시험관 내 전사 반응 후 남아있는 DNA 주형을 제거하였다. 이후, RNeasy kit (Qiagen)을 사용하여 제조사 프로토콜을 따라 정제하여, 일 실시예에 따른 RNA 분자를 최종적으로 수득하였다. 여기서, RNA 분자 내 모든 우리딘 (U)은 N1-에틸-슈도우리딘 (N1-ethyl-pseudouridine) 또는 N1-메톡시메틸-슈도우리딘 (N1-methoxymethyl-pseudouridine)으로 치환되었으며, 이들은 각각 MCX101A-02-3, MCX101A-02-4, MCX101A-25-3, 및 MCX101A-27-3으로 명명하였다.
본 실시예에서 합성한 폴리뉴클레오티드에 대한 서열 정보는 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.
한편, 상기 표 1에서, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열은 사스-코로나바이러스-2 USA-WA1/2020의 스파이크 단백질을 코딩하는 서열이고, 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열은 코로나바이러스-2 USA-WA1/2020의 스파이크 단백질에서 퓨린-절단부위(furin-cleavage site)가 제거된 단백질을 코딩하는 서열이며, 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열은 사스-코로나바이러스-2 델타 변이의 스파이크 단백질에서 퓨린-절단부위가 제거된 단백질을 코딩하는 서열을 지칭한다.
또한, 상기 표 1에서 언급된 화학적 변형은 표 2에 나타낸 바와 같다.
실시예 2: 스파이크 단백질의 발현 수준 평가
본 실시예에서는 실시예 1의 MCX101A-02-3 또는 MCX101A-02-4를 세포 내로 형질주입한 후, 이에 따른 항원 단백질, 즉, 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질에 대한 발현 수준을 평가하였다. 구체적으로, 0.5㎍/mL 농도의 MCX101A-02-3 또는 MCX101A-02-4을 Lipofectamine MessengerMax(Thermo, LMRNA015)를 이용하여 HeLa 세포에 형질주입하였다. 이로부터 24시간 경과 후, cell lysate을 수득하였고, 스파이크 단백질의 발현 수준을 웨스턴 블롯팅을 통해 확인하였다. 한편, 본 실시예에서 대조군은 우리딘에 대한 화학적으로 변형된 뉴클레오티드가 도입되지 않은 폴리뉴클레오티드를 사용한 군(unmodified mRNA)을 사용하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, MCX101A-02-3 또는 MCX101A-02-4로 형질주입된 HeLa 세포에서 높은 수준의 스파이크 단백질 발현을 확인하였으며, 이러한 발현 수준은 화학적 변형이 도입되지 않은 대조군과 유사한 것이었다. 이러한 실험 결과로부터, 일 실시예에 따른 화학적 변형이 도입된 폴리뉴클레오티드는 세포 내로 형질주입되어, 면역원인 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질을 발현시킬 수 있음을 확인하였다.
실시예 3: 동물 모델을 이용한 후천성 면역 반응 자극 효과 확인
본 실시예에서는 일 실시예에 따른 화학적 변형이 도입된 폴리뉴클레오티드를 마우스에 투여한 후, 이에 따른 후천성 면역 반응 자극 효과를 확인하고자 하였다. 이를 위하여, 상기 마우스로부터 수득한 혈청 시료를 대상으로, 스파이크 단백질에 결합하는 항체, 및 스파이크 단백질 내 수용체 결합 도메인에 결합하는 항체의 농도를 측정하였고, 생성된 중화 항체에 의한 스파이크 단백질 내 수용체 결합 도메인과 안지오텐신 전환 효소(ACE2) 수용체간 결합 억제 수준을 평가하였다.
3-1. 스파이크 단백질의 S1 영역에 결합하는 항체의 농도 측정
본 실시예에서는 10㎍/개체 농도의 MCX101A-02-3, MCX101A-25-3, 또는 MCX101A-27-3를 BALB/c 마우스에 복강 투여하였다. 이로부터 14일 경과 후, 상기 마우스의 혈청 시료를 수득하였으며, 상기 혈청 시료를 대상으로, 스파이크 단백질의 S1 영역에 결합하는 항체의 농도를 ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)를 통해 측정하였다. 한편, 본 실시예에서 대조군은 TransIT (Mirus, MIR2250)을 투여한 군 (Mock)을 사용하였으며, 동일 시험군 당 동물 수를 4 마리로 하여 그 평균값을 산출하였다.
표 3 및 도 3은 혈청 시료 내 스파이크 단백질에 결합하는 항체의 농도를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 그 결과, MCX101A-02-3, MCX101A-25-3, 또는 MCX101A-27-3가 투여된 마우스의 혈청 시료에서, 스파이크 단백질에 결합하는 항체의 농도가 증가되었음을 확인하였다.
3-2. 스파이크 단백질 내 수용체 결합 도메인에 결합하는 항체의 농도 측정
본 실시예에서는 10㎍/개체 농도의 MCX101A-02-3, MCX101A-25-3, 또는 MCX101A-27-3를 BALB/c 마우스에 복강 투여하였다. 이로부터 14일 경과 후, 상기 마우스의 혈청 시료를 수득하였으며, 상기 혈청 시료를 대상으로, 스파이크 단백질 내 수용체 결합 도메인에 결합하는 항체의 농도를 ELISA를 통해 측정하였다. 한편, 본 실시예에서 대조군은 TransIT (Mirus, MIR2250)을 투여한 군 (Mock)을 사용하였으며, 동일 시험군 당 동물 수를 4 마리로 하여 그 평균값을 산출하였다.
표 4 및 도 4는 혈청 시료 내 스파이크 단백질 내 수용체 결합 도메인에 결합하는 항체의 농도를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 그 결과, MCX101A-02-3, MCX101A-25-3, 또는 MCX101A-27-3가 투여된 마우스의 혈청 시료에서, 수용체 결합 도메인에 결합하는 항체의 농도가 증가되었음을 확인하였다.
3-3. 중화 항체에 의한 수용체 결합 도메인(RBD)과 안지오텐신 전환 효소 (ACE2) 수용체 간 결합 억제 수준 평가
본 실시예에서는 10㎍/개체 농도의 MCX101A-02-3, MCX101A-25-3, 또는 MCX101A-27-3를 BALB/c 마우스에 복강 투여하였다. 이로부터 14일 경과 후, 상기 마우스의 혈청 시료를 수득하였으며, 상기 혈청 시료를 대상으로, 생성된 중화 항체의 기능성, 즉, 스파이크 단백질과 그 수용체인 ACE2 수용체 간의 결합 억제 수준을 surrogate virus neutralization test(sVNT, Genescript)를 통해 평가하였다. 본 실시예에서 대조군은 TransIT (Mirus, MIR2250)을 투여한 군 (Mock)을 사용하였으며, 동일 시험군 당 동물 수를 4 마리로 하여 그 평균값을 산출하였다.
표 5 및 도 5는 혈청 시료 내 생성된 중화 항체에 의한 수용체 결합 도메인(RBD)과 ACE2 수용체 간 결합 억제 수준을 측정한 결과를 나타낸 것이다. 그 결과, MCX101A-02-3, MCX101A-25-3, 또는 MCX101A-27-3가 투여된 마우스의 혈청 시료 내 생성된 중화 항체는 수용체 결합 도메인(RBD)과와 ACE2 수용체 간의 결합을 60% 이상 억제함을 확인하였다.
이러한 실험 결과로부터, 일 실시예에 따른 화학적 변형이 도입된 폴리뉴클레오티드는 사스-코로나바이러스-2에 대한 유효한 후천성 면역 반응을 자극/유도할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 4: 감소된 선천성 면역 반응 확인
본 실시예에서는 일 실시예에 따른 화학적 변형이 도입된 폴리뉴클레오티드에 의한 선천성 면역 반응 자극 수준을 확인하고자 하였다. 이를 위하여, 상기 폴리뉴클레오티드가 투여된 마우스로부터 수득한 혈청 시료를 대상으로 선천성 면역 반응과 연관된 사이토카인의 수준을 측정하였으며, 상기 폴리뉴클레오티드가 형질주입된 THP-1 세포를 대상으로, 인터페론 시그널링의 활성화 수준을 측정하였다.
4-1. 선천성 면역 반응과 연관된 사이토카인의 수준 측정
본 실시예에서는 10㎍/개체 농도의 MCX101A-02-3 또는 MCX101A-02-4를 BALB/c 마우스에 복강 투여하였다. 이로부터 6시간 경과 후, 상기 마우스의 혈청 시료를 수득하였으며, 상기 혈청 시료를 대상으로, 선천성 면역 반응과 연관된 사이토카인인 IFN-α, 및 IFN-γ의 농도를 ELISA를 통해 측정하였다. 본 실시예에서 대조군은 PBS를 투여한 군 (PBS), 양성 대조군은 poly I:C 및 TransIT (Mirus, MIR2250)를 투여한 군 (Poly I:C, n=2)을 사용하였으며, 동일 시험군 당 동물 수를 3 마리로 하여 그 평균값을 산출하였다.
표 6 내지 표 7, 및 도 6 내지 표 7은 혈청 시료 내 IFN-α 및 IFN-γ 농도를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 그 결과, MCX101A-02-3이 투여된 마우스의 혈청 시료 내 IFN-α 및 IFN-γ 농도는 양성 대조군에 비해 현저히 낮은 수준을 나타냄을 확인하였다.
4-2. 상대적인 IRF (Interferon regulatory factor) 값 평가
본 실시예에서는 인터페론조절인자(IRF)-유도성 루시퍼레이즈(luciferase) 리포터를 포함하는 THP-1 세포(인간 단핵구, InvivoGen)를 사용하여, 인터페론 시그널링 활성화 수준을 평가하였다. 구체적으로, 1㎍/mL 농도의 MCX101A-02-3 또는 MCX101A-02-4을 Lipofectamine transfection reagent (Invitrogen, LMRNA015)를 이용하여 상기 THP-1 세포에 형질주입하였다. 이로부터 24시간 경과 후, 배양 상층액을 수득한 뒤, 인터페론조절인자(IRF)-유도서 루시퍼레이즈 리포터의 활성화 정도를 측정하여, 별도의 처리/첨가 없이 배양한 THP-1 세포의 배양 상층액 대비 상대적인 IRF 값을 산출하였다. 한편, 본 실시예에서 대조군은 Lipofectamine MessengerMax (Thermo, LMRNA015)를 처리한 군 (Mock), 양성 대조군은 Poly I:C 및 Lipofectamine MessengerMax(Thermo, LMRNA015)를 처리한 군 (Poly I:C)을 사용하였으며, 본 실험은 3회 반복 수행한 뒤, 그 평균값을 산출하였다.
표 8 및 도 8은 형질 주입된 THP-1 세포를 대상으로 산출한 상대적인 IRF 값을 나타낸 것이다. 그 결과, MCX101A-02-3가 형질주입된 군은 낮은 상대적인 IRF 값을 나타내어, 인터페론 시그널링 활성화 수준이 매우 낮음을 확인하였다.
이러한 실험 결과로부터, 일 실시예에 따른 화학적 변형이 도입된 폴리뉴클레오티드는, 상기 폴리뉴클레오티드로부터 야기되는 선천성 면역 반응을 감소시킴으로써 스파이크 단백질의 발현을 향상시키고, 이를 통해 백신 조성물의 효능을 보다 향상시킬 수 있음을 알 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> mCureX Therapeutics, Inc.
<120> RNA vaccines against SARS-Coronavirus 2 infection
<130> PN143615KR
<150> KR 10-2021-0125205
<151> 2021-09-17
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<170> KoPatentIn 3.0
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auguucgugu uccuggugcu gcugccccug gugagcagcc agugcgugaa ccugaccacc 60
aggacccagc ugccccccgc cuacaccaac agcuucacca ggggcgugua cuaccccgac 120
aagguguuca ggagcagcgu gcugcacagc acccaggacc uguuccugcc cuucuucagc 180
aacgugaccu gguuccacgc cauccacgug agcggcacca acggcaccaa gagguucgac 240
aaccccgugc ugcccuucaa cgacggcgug uacuucgcca gcaccgagaa gagcaacauc 300
aucaggggcu ggaucuucgg caccacccug gacagcaaga cccagagccu gcugaucgug 360
aacaacgcca ccaacguggu gaucaaggug ugcgaguucc aguucugcaa cgaccccuuc 420
cugggcgugu acuaccacaa gaacaacaag agcuggaugg agagcgaguu caggguguac 480
agcagcgcca acaacugcac cuucgaguac gugagccagc ccuuccugau ggaccuggag 540
ggcaagcagg gcaacuucaa gaaccugagg gaguucgugu ucaagaacau cgacggcuac 600
uucaagaucu acagcaagca cacccccauc aaccugguga gggaccugcc ccagggcuuc 660
agcgcccugg agccccuggu ggaccugccc aucggcauca acaucaccag guuccagacc 720
cugcuggccc ugcacaggag cuaccugacc cccggcgaca gcagcagcgg cuggaccgcc 780
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cccuuccagc aguucggcag ggacaucgcc gacaccaccg acgccgugag ggacccccag 1740
acccuggaga uccuggacau cacccccugc agcuucggcg gcgugagcgu gaucaccccc 1800
ggcaccaaca ccagcaacca gguggccgug cuguaccagg acgugaacug caccgaggug 1860
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aacguguucc agaccagggc cggcugccug aucggcgccg agcacgugaa caacagcuac 1980
gagugcgaca uccccaucgg cgccggcauc ugcgccagcu accagaccca gaccaacagc 2040
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cugggcgaca ucgccgccag ggaccugauc ugcgcccaga aguucaacgg ccugaccgug 2580
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acccugguga agcagcugag cagcaacuuc ggcgccauca gcagcgugcu gaacgacauc 2940
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uacaagcugc ccgacgacuu caccggcugc gugaucgccu ggaacagcaa caaccuggac 1320
agcaaggugg gcggcaacua caacuacagg uacaggcugu ucaggaagag caaccugaag 1380
cccuucgaga gggacaucag caccgagauc uaccaggccg gcagcaagcc cugcaacggc 1440
guggagggcu ucaacugcua cuucccccug cagagcuacg gcuuccagcc caccaacggc 1500
gugggcuacc agcccuacag ggugguggug cugagcuucg agcugcugca cgcccccgcc 1560
accgugugcg gccccaagaa gagcaccaac cuggugaaga acaagugcgu gaacuucaac 1620
uucaacggcc ugaccggcac cggcgugcug accgagagca acaagaaguu ccugcccuuc 1680
cagcaguucg gcagggacau cgccgacacc accgacgccg ugagggaccc ccagacccug 1740
gagauccugg acaucacccc cugcagcuuc ggcggcguga gcgugaucac ccccggcacc 1800
aacaccagca accagguggc cgugcuguac cagggcguga acugcaccga ggugcccgug 1860
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cccgacccca gcaagcccag caagaggagc uucaucgagg accugcuguu caacaaggug 2460
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accuucggcg ccggcgccgc ccugcagauc cccuucgcca ugcagauggc cuacagguuc 2700
aacggcaucg gcgugaccca gaacgugcug uacgagaacc agaagcugau cgccaaccag 2760
uucaacagcg ccaucggcaa gauccaggac agccugagca gcaccgccag cgcccugggc 2820
aagcugcaga acguggugaa ccagaacgcc caggcccuga acacccuggu gaagcagcug 2880
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<220>
<221> modified_base
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5-UTR 2
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(43)
<223> u is N1-ethyl-pseudouridine.
<400> 5
aggacucuuc ugguccccac agacucagag agaacccgcc acc 43
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3-UTR
<220>
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<222> (1)..(95)
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 80
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<220>
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<400> 8
agaauaaacu aguauucuuc ugguccccac agacucagag agaacccgcc accauguucg 60
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ugggcuacca gcccuacagg gugguggugc ugagcuucga gcugcugcac gcccccgcca 1620
ccgugugcgg ccccaagaag agcaccaacc uggugaagaa caagugcgug aacuucaacu 1680
ucaacggccu gaccggcacc ggcgugcuga ccgagagcaa caagaaguuc cugcccuucc 1740
agcaguucgg cagggacauc gccgacacca ccgacgccgu gagggacccc cagacccugg 1800
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gggccaggag cguggccagc cagagcauca ucgccuacac caugagccug ggcgccgaga 2160
acagcguggc cuacagcaac aacagcaucg ccauccccac caacuucacc aucagcguga 2220
ccaccgagau ccugcccgug agcaugacca agaccagcgu ggacugcacc auguacaucu 2280
gcggcgacag caccgagugc agcaaccugc ugcugcagua cggcagcuuc ugcacccagc 2340
ugaacagggc ccugaccggc aucgccgugg agcaggacaa gaacacccag gagguguucg 2400
cccaggugaa gcagaucuac aagacccccc ccaucaagga cuucggcggc uucaacuuca 2460
gccagauccu gcccgacccc agcaagccca gcaagaggag cuucaucgag gaccugcugu 2520
ucaacaaggu gacccuggcc gacgccggcu ucaucaagca guacggcgac ugccugggcg 2580
acaucgccgc cagggaccug aucugcgccc agaaguucaa cggccugacc gugcugcccc 2640
cccugcugac cgacgagaug aucgcccagu acaccagcgc ccugcuggcc ggcaccauca 2700
ccagcggcug gaccuucggc gccggcgccg cccugcagau ccccuucgcc augcagaugg 2760
ccuacagguu caacggcauc ggcgugaccc agaacgugcu guacgagaac cagaagcuga 2820
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accuggccgc caccaagaug agcgagugcg ugcugggcca gagcaagagg guggacuucu 3180
gcggcaaggg cuaccaccug augagcuucc cccagagcgc cccccacggc gugguguucc 3240
ugcacgugac cuacgugccc gcccaggaga agaacuucac caccgccccc gccaucugcc 3300
acgacggcaa ggcccacuuc cccagggagg gcguguucgu gagcaacggc acccacuggu 3360
ucgugaccca gaggaacuuc uacgagcccc agaucaucac caccgacaac accuucguga 3420
gcggcaacug cgacguggug aucggcaucg ugaacaacac cguguacgac ccccugcagc 3480
ccgagcugga cagcuucaag gaggagcugg acaaguacuu caagaaccac accagccccg 3540
acguggaccu gggcgacauc agcggcauca acgccagcgu ggugaacauc cagaaggaga 3600
ucgacaggcu gaacgaggug gccaagaacc ugaacgagag ccugaucgac cugcaggagc 3660
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<220>
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<400> 9
aggacucuuc ugguccccac agacucagag agaacccgcc accauguucg uguuccuggu 60
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cgccuacacc aacagcuuca ccaggggcgu guacuacccc gacaaggugu ucaggagcag 180
cgugcugcac agcacccagg accuguuccu gcccuucuuc agcaacguga ccugguucca 240
cgccauccac gugagcggca ccaacggcac caagagguuc gacaaccccg ugcugcccuu 300
caacgacggc guguacuucg ccagcaccga gaagagcaac aucaucaggg gcuggaucuu 360
cggcaccacc cuggacagca agacccagag ccugcugauc gugaacaacg ccaccaacgu 420
ggugaucaag gugugcgagu uccaguucug caacgacccc uuccugggcg uguacuacca 480
caagaacaac aagagcugga uggagagcga guucagggug uacagcagcg ccaacaacug 540
caccuucgag uacgugagcc agcccuuccu gauggaccug gagggcaagc agggcaacuu 600
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cgacgccgug gacugcgccc uggauccccu gagcgagacc aagugcaccc ugaagagcuu 960
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cagcaucgcc auccccacca acuucaccau cagcgugacc accgagaucc ugcccgugag 2220
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cgccguggag caggacaaga acacccagga gguguucgcc caggugaagc agaucuacaa 2400
gacccccccc aucaaggacu ucggcggcuu caacuucagc cagauccugc ccgaccccag 2460
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cgagccccag aucaucacca ccgacaacac cuucgugagc ggcaacugcg acguggugau 3420
cggcaucgug aacaacaccg uguacgaccc ccugcagccc gagcuggaca gcuucaagga 3480
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caagaaccug aacgagagcc ugaucgaccu gcaggagcug ggcaaguacg agcaguacau 3660
caaguggccc ugguacaucu ggcugggcuu caucgccggc cugaucgcca ucgugauggu 3720
gaccaucaug cugugcugca ugaccagcug cugcagcugc cugaagggcu gcugcagcug 3780
cggcagcugc ugcaaguucg acgaggacga cagcgagccc gugcugaagg gcgugaagcu 3840
gcacuacacc ugaugacucg aggcuggagc cucgguggcc augcuucuug ccccuugggc 3900
cuccccccag ccccuccucc ccuuccugca cccguacccc cguggucuuu g 3951
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5-UTR_ORF_3-UTR 3
<220>
<221> modified_base
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<400> 10
aggacucuuc ugguccccac agacucagag agaacccgcc accauguucg uguuccuggu 60
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cgccuacacc aacagcuuca ccaggggcgu guacuacccc gacaaggugu ucaggagcag 180
cgugcugcac agcacccagg accuguuccu gcccuucuuc agcaacguga ccugguucca 240
cgccauccac gugagcggca ccaacggcac caagagguuc gacaaccccg ugcugcccuu 300
caacgacggc guguacuucg ccagcaccga gaagagcaac aucaucaggg gcuggaucuu 360
cggcaccacc cuggacagca agacccagag ccugcugauc gugaacaacg ccaccaacgu 420
ggugaucaag gugugcgagu uccaguucug caacgacccc uuccugggcg uguacuacca 480
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ccugcccauc ggcaucaaca ucaccagguu ccagacccug cuggcccugc acaggagcua 780
ccugaccccc ggcgacagca gcagcggcug gaccgccggc gccgccgccu acuacguggg 840
cuaccugcag cccaggaccu uccugcugaa guacaacgag aacggcacca ucaccgacgc 900
cguggacugc gcccuggacc cccugagcga gaccaagugc acccugaaga gcuucaccgu 960
ggagaagggc aucuaccaga ccagcaacuu cagggugcag cccaccgaga gcaucgugag 1020
guuccccaac aucaccaacc ugugccccuu cggcgaggug uucaacgcca ccagguucgc 1080
cagcguguac gccuggaaca ggaagaggau cagcaacugc guggccgacu acagcgugcu 1140
guacaacagc gccagcuuca gcaccuucaa gugcuacggc gugagcccca ccaagcugaa 1200
cgaccugugc uucaccaacg uguacgccga cagcuucgug aucaggggcg acgaggugag 1260
gcagaucgcc cccggccaga ccggcaagau cgccgacuac aacuacaagc ugcccgacga 1320
cuucaccggc ugcgugaucg ccuggaacag caacaaccug gacagcaagg ugggcggcaa 1380
cuacaacuac agguacaggc uguucaggaa gagcaaccug aagcccuucg agagggacau 1440
cagcaccgag aucuaccagg ccggcagcaa gcccugcaac ggcguggagg gcuucaacug 1500
cuacuucccc cugcagagcu acggcuucca gcccaccaac ggcgugggcu accagcccua 1560
caggguggug gugcugagcu ucgagcugcu gcacgccccc gccaccgugu gcggccccaa 1620
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caucgccgac accaccgacg ccgugaggga cccccagacc cuggagaucc uggacaucac 1800
ccccugcagc uucggcggcg ugagcgugau cacccccggc accaacacca gcaaccaggu 1860
ggccgugcug uaccagggcg ugaacugcac cgaggugccc guggccaucc acgccgacca 1920
gcugaccccc accuggaggg uguacagcac cggcagcaac guguuccaga ccagggccgg 1980
cugccugauc ggcgccgagc acgugaacaa cagcuacgag ugcgacaucc ccaucggcgc 2040
cggcaucugc gccagcuacc agacccagac caacagcagg agcguggcca gccagagcau 2100
caucgccuac accaugagcc ugggcgccga gaacagcgug gccuacagca acaacagcau 2160
cgccaucccc accaacuuca ccaucagcgu gaccaccgag auccugcccg ugagcaugac 2220
caagaccagc guggacugca ccauguacau cugcggcgac agcaccgagu gcagcaaccu 2280
gcugcugcag uacggcagcu ucugcaccca gcugaacagg gcccugaccg gcaucgccgu 2340
ggagcaggac aagaacaccc aggagguguu cgcccaggug aagcagaucu acaagacccc 2400
ccccaucaag gacuucggcg gcuucaacuu cagccagauc cugcccgacc ccagcaagcc 2460
cagcaagagg agcuucaucg aggaccugcu guucaacaag gugacccugg ccgacgccgg 2520
cuucaucaag caguacggcg acugccuggg cgacaucgcc gccagggacc ugaucugcgc 2580
ccagaaguuc aacggccuga ccgugcugcc cccccugcug accgacgaga ugaucgccca 2640
guacaccagc gcccugcugg ccggcaccau caccagcggc uggaccuucg gcgccggcgc 2700
cgcccugcag auccccuucg ccaugcagau ggccuacagg uucaacggca ucggcgugac 2760
ccagaacgug cuguacgaga accagaagcu gaucgccaac caguucaaca gcgccaucgg 2820
caagauccag gacagccuga gcagcaccgc cagcgcccug ggcaagcugc agaacguggu 2880
gaaccagaac gcccaggccc ugaacacccu ggugaagcag cugagcagca acuucggcgc 2940
caucagcagc gugcugaacg acauccugag caggcuggac ccccccgagg ccgaggugca 3000
gaucgacagg cugaucaccg gcaggcugca gagccugcag accuacguga cccagcagcu 3060
gaucagggcc gccgagauca gggccagcgc caaccuggcc gccaccaaga ugagcgagug 3120
cgugcugggc cagagcaaga ggguggacuu cugcggcaag ggcuaccacc ugaugagcuu 3180
cccccagagc gccccccacg gcgugguguu ccugcacgug accuacgugc ccgcccagga 3240
gaagaacuuc accaccgccc ccgccaucug ccacgacggc aaggcccacu uccccaggga 3300
gggcguguuc gugagcaacg gcacccacug guucgugacc cagaggaacu ucuacgagcc 3360
ccagaucauc accaccgaca acaccuucgu gagcggcaac ugcgacgugg ugaucggcau 3420
cgugaacaac accguguacg acccccugca gcccgagcug gacagcuuca aggaggagcu 3480
ggacaaguac uucaagaacc acaccagccc cgacguggac cugggcgaca ucagcggcau 3540
caacgccagc guggugaaca uccagaagga gaucgacagg cugaacgagg uggccaagaa 3600
ccugaacgag agccugaucg accugcagga gcugggcaag uacgagcagu acaucaagug 3660
gcccugguac aucuggcugg gcuucaucgc cggccugauc gccaucguga uggugaccau 3720
caugcugugc ugcaugacca gcugcugcag cugccugaag ggcugcugca gcugcggcag 3780
cugcugcaag uucgacgagg acgacagcga gcccgugcug aagggcguga agcugcacua 3840
caccugauga cucgaggcug gagccucggu ggccaugcuu cuugccccuu gggccucccc 3900
ccagccccuc cuccccuucc ugcacccgua cccccguggu cuuug 3945
Claims (15)
- (a) 사스-코로나바이러스-2 (SARS-CoV-2)의 스파이크 단백질 (Spike protein: S protein) 또는 이의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 오픈 리딩 프레임 (Open reading frame: ORF); 및
(b) 상기 오픈 리딩 프레임의 양 말단에 작동 가능하게 연결된, 5’-비번역 부위 (5’-Untranslated region: 5’-UTR) 및 3’-비번역 부위 (3’-Untranslated region: 3’-UTR)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서,
상기 폴리뉴클레오티드는 우리딘에 대신하여, 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 (Chemically modified nucleotide)인, N1-에틸-슈도우리딘 (N1-ethyl-pseudouridine) 또는 N1-메톡시메틸-슈도우리딘 (N1-methoxymethyl-pseudouridine)을 포함하는, 폴리뉴클레오티드. - 청구항 1에 있어서, 상기 코로나바이러스의 스파이크 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1 내지 서열번호 3 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열, 또는 상기 뉴클레오티드 서열과 적어도 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 상기 뉴클레오티드 서열의 변이체를 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드.
- 청구항 1에 있어서, 상기 5’-비번역 부위는 서열번호 4 또는 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열, 또는 상기 뉴클레오티드 서열과 적어도 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 상기 뉴클레오티드 서열의 변이체를 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드.
- 청구항 1에 있어서, 상기 3'-비번역 부위는 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열, 또는 상기 뉴클레오티드 서열과 적어도 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 상기 뉴클레오티드 서열의 변이체를 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드.
- 청구항 1에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 8 내지 서열번호 10 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것인, 폴리뉴클레오티드.
- 청구항 5에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 우리딘에 대신하여, N1-에틸-슈도우리딘을 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드.
- 청구항 1에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 5’-UTR에 작동 가능하게 연결된 5'캡 (5'Cap)을 추가로 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 청구항 7에 있어서, 상기 5′캡은 m7Gppp, Gppp, m7(3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeA)pG, m7(3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeG)pG, G(5')ppp(5')G, m7G(5')ppp(5')G, 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G, m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG, m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG, 또는 m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pU 중 어느 하나인 것인, 폴리뉴클레오티드.
- 청구항 1에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 3’-UTR에 작동 가능하게 연결된 폴리A 테일 (PolyA tail)를 추가로 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 청구항 9에 있어서, 상기 폴리A 테일은 20 내지 200개의 아데닌으로 이루어진 것인, 폴리뉴클레오티드.
- 청구항 1에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 화학적으로 변형된 뉴클레오티드가 포함되지 않은 폴리뉴클레오티드에 비해, 선천성 면역 반응의 유도 수준이 낮은 것인, 폴리뉴클레오티드.
- 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는, 면역원성 조성물.
- 청구항 12에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 약물 전달체 시스템 (Drug Delivery System: DDS)으로 제형화된 것인, 면역원성 조성물.
- 청구항 12에 있어서, 상기 면역원성 조성물은 SARS-CoV-2 감염증을 예방하기 위한 것인, 면역원성 조성물.
- 청구항 12에 있어서, 상기 면역원성 조성물은 근육 또는 피하 투여되는 것인, 면역원성 조성물.
Priority Applications (2)
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|---|---|---|---|
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Applications Claiming Priority (1)
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Family Applications (1)
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